Caso 1

Hombre de 32 aos con HIV + sometido a biopsia de medula sea.

Cul es el diagnstico

Reaccin de PAS 100 X

Impregnacin argntica de Grocott 40 X

Laboratorio Clnico y de Anatoma Patolgica

TECNOLOGA MDICA

Histoqumica: Biopsia de mdula sea

Prof. Eduardo Sedano Gelvet

Estructura de la Mdula sea

Clulas reticulares y fibras de reticulina, que forman una malla de soporte; Vasos sanguneos y nervios, que dan origen al sistema de sinusoides encargados de recibir las clulas sanguneas recin producidas y llevarlas a circulacin; Tejido hematopoytico maduro y precursores (mdula roja), donde se produce la hematopoyesis propiamente dicha y Grasa (mdula amarilla), que acta como soporte del tejido hematopoytico y como reserva frente a una necesidad de mayor hematopoyesis.

Biopsia de mdula sea

Es una biopsia por trepanacin y consiste en la obtencin de muestras de hueso para el estudio de enfermedades de la medula sea en los trastornos hematolgicos.

Este proceso se realiza:

Infecciones (bacterias, micobacterias, hongos). Anemias. Leucemias. Sndromes mielodisplsicos. Valorar la eficacia del tratamiento de leucemias y linfomas. Diagnosticar recidivas.

Toma de muestra
Aspirado
(lquida)

Porcin slida (hueso)

Aspirado (coagulo))

Fijacin Frotis

Fijacin

Descalcificacin
Inclusin en parafina Inclusin en parafina

Fijacin Microtoma Microtoma

Colorantes hematolgicos

Histoqumica

Inmunohistoqumica

Citogentica

Frotis
Coloracin de Wright. Histoqumica enzimtica:
Peroxidasa Fosfatasa alcalina Fosfatasa cida Reaccin de PAS Reaccin de Perls

Inmunohistoqumica

Coloracin de Wright

Reaccin de la peroxidasa

Porcin slida
Hueso

Fijacin
La mayor parte de las dificultades de interpretacin de las biopsias se deben a problemas de fijacin. Fijadores:
Formol tamponado B5 Lquido de Bouin

Formol tamponado
Ventajas:
Aplicacin de reacciones histoqumicas. Aplicacin de reacciones inmunohistoqumicas.

Desventajas:
No se puede hacer una buena evaluacin morfolgica.

B5
Ventajas:
Buena evaluacin morfolgica.

Desventajas:
Endurece demasiado el tejido. Dificulta la inmunohistoqumica No procedimientos moleculares para ADN.

Lquido de Bouin
Ventajas:
Fijacin rpida (2 a 4 horas) Aplicacin de reacciones histoqumicas. Aplicacin de reacciones inmunohistoqumicas.

Desventajas:
No procedimientos moleculares para ADN.

Descalcificacin:
Evitar el formol ntrico:
Altera la morfologa. Dificulta la inmunohistoqumica

Algunos usan el EDTA:

Descalcificacin lenta.

Usar formol-cido frmico:

Despus de fijar con lquido de Bouin Buenos resultados

Secciones de tejidos fijados en formol e incluidos por el mtodo de la parafina

Coloracin de hematoxilina-eosina. Coloracin de Giemsa. Histoqumica. Inmunohistoqumica

Colorantes neutros o hematolgicos o de Romanovsky

Sales neutras complejas que se obtienen mezclando un colorante de naturaleza cida (eosina) con otro de tipo bsico (azul de metileno). La oxidacin del azul de metileno produce los azures de metileno.

Caractersticas
Propiedades colorantes van unidas a los componentes cido y bsico de la molcula. Poco solubles en el agua Deben disolverse en alcohol metlico o en glicerina para evitar la formacin de precipitados.

 Disueltos en alcohol o en glicerina no actan como colorantes. El colorante disuelto en alcohol o en glicerina se disocia en agua destilada o en buffer fosfato pH=6.4-6.6 Disociacin de la molcula en aniones y cationes, ambos portadores de color y con afinidad por elementos celulares de carga opuesta.

 Despus de la disociacin de la molcula colorante, sobre el tejido se observa tres colores:

Azul por el azul de metileno. Rosado por la eosina. Prpura por metacromasia de los azures y del azul de metileno.

 Giemsa Wright Leishman May-Grnwald

The granules in eosinophils stain bright red

with the giemsa stain in this case of acute esophagitis

The granules in eosinophils stain bright red with the giemsa stain in this case of acute esophagitis.

Reacciones histoqumicas

Reaccin para demostrar actividad de peroxidasa

La enzima peroxidasa de las clulas mieloides acta sobre su substrato el perxido de hidrgeno produciendo oxigeno, este oxida la bencidina la cual se deposita en el citoplasma.

Clulas perxidasa positivo

Neutrfilos.
Eosinfilos Mielocitos.

Clulas perxidasa negativo

Linfocitos.

Clulas plasmticas.

Reaccin de Feulgen

La hidrlisis con HCl 1 N a 60C, permite la liberacin de las bases purnicas del ADN con la consiguiente formacin de grupos aldehdos (CHO). Estos son reconocidos por el reactivo de Schiff produciendose un color rojo magenta que denota la presencia de ADN.

Reaccin de P.A.S.
La oxidacin con cido perydico permite la ruptura y oxidacin de los grupos alfa glicol, con la consiguiente formacin de grupos aldehdos (-CHO). Estos son reconocidos por el reactivo de Schiff produciendose un color rojo magenta.

 Leucemia aguda linfoblastica (LAL) es P.A.S. positiva. Leucemia aguda mieloblastica (LAM) es P.A.S. negativa.

Coloracin con verde de metilo pironina (Unna-pappenhein)

Colorantes bsicos, cuando la mezcla de ambos se aplica a pH=4.8 se produce una coloracin selectiva, el verde de metilo (trifenil metano) colorea el ADN mientras que la pironina (xanteno) colorea el ARN.

Verde metil

Cristal violeta

Pironina

 Cuerpos de inclusin de Dhle.

Hemates policromatfilos.

Clulas plasmticas malignas

Reaccin de Perls (azul de Prusia o azul de Berlin)

Hidrlisis con HCl, permite la liberacin del hierro, que esta almacenado en las clulas unido a las protenas del citoplasma. El hierro al enfrentarse al ferrocianuro de potasio forma in situ ferrocianuro frrico de color azul de Prusia.

El contenido de hierro determina observando precursores eritroides:

medular se en 100X

No se identifican grnulos intracelulares: 0 Se identifican grnulos ocasionalmente: + Se considera como normal, cuando se observan grnulos en el 10% de las clulas observadas: ++ Cuando estn moderadamente aumentados: +++ Cuando es evidente el exceso de hierro tanto en los precursores celulares como extracelularmente: ++++

Reacciones inmunohistoqumicas

Nomenclatura unificada CD

CD significa grupos de diferenciacin(del ingles cluster of differentiation), son molculas de protenas reconocidas por un grupo de anticuerpos monoclonales.

Estas protenas sirven como marcadores fentipicos de las diferentes poblaciones leucocitarias. Por ejemplo, la mayora de las clulas T colaboradoras expresan una

protena de superficie llamada CD4

Identificacin de clulas en:

Respuesta inflamatoria. Respuesta inmunitara. Linfomas. Leucemias

Marcador general

Antgeno comn leucocitario (CD 45)

Este antgeno (protena) se encuentra localizado en la superficie de la membrana de las clulas linfoides y de los polimorfonucleares.

Marcadores especficos

Linfocito Th y Tc

UNIDAD DE ANATOMIA PATOLO GICA

Linfocito B

UNIDAD DE ANATO MIA P ATOLOGICA

CLULA CITOLITICA NATURAL (NK)

UNIDAD DE ANATO MIA P ATOLOGICA

CD 15

CD 30