BENJAMIN LEWIN

un
Cuando se public la primera edicin de GENES, Benjamn
Lewin estableci el estndar de la enseanza de la biologa
y gentica moleculares con un abordaje unificado. La
novena edicin de este libro clsico contina con dicha
tradicin, presenta la estructura y funcin de los genes en
organismos eucariotos y procariotos. El Dr. Lewin mantiene
el compromiso de proporcionar a los estudiantes, investigadores y
educadores los conceptos actuales en este campo que cambia en forma
constante. La novena edicin de Gf/VfS incluye contenido actualizado
y una cobertura ms amplia de temas fundamentales con una nueva
organizacin que le permite al estudiante enfocarse con mayor precisin en los
genes y en su expresin. GENES /Xtambin ostenta un diseo moderno, nuevo
y un programa contemporneo.
Caractersticas nuevas y principales de GENES IX
.
Mayor cobertura en numerosas reas, que incluye:
-
Replicacin del DNA - Regulacin de la cromatina y regulacin gnica
-
Recombinacin y reparacin - Evolucin de los genes
-
El replicn - El cromosoma Y
.
Reorganizacin para permitir a los instructores construir conceptos crticos a lo largo
del curso.
.
Nuevo diseo contemporneo y un impactante programa de arte de cuatro colores.
.
Nuevas actualizaciones de principio a fin, que incluyen informacin actual referente
a la organizacin del genoma, replicacin del DNA, regulacin gnica y mucho ms.
Educacin
ISBN-13: 978-970-10-6685-0
ISBN-10: 970-10-6685-5
0 1 0 6 6 b
The McGrawHHI Companies
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www.mcgraw-hill-educacion.com
mm
Editado por
Benjamn Lewin, PhD
Geneticist
Cambridge University
Novena edicin
Traduccin:
Hctor Barrera VULa ZevaLLos
FLix Garca Roig
Me
Graw
[11
MEXICO . BOGOTA . BUENOS AIRES . CARACAS . GUATEMALA
LISBOA . MADRID . NUEVA YORK . SAN JUAN . SANTIAGO . SAO PAULO
AUCKLAND . LONDRES . MILN . MONTREAL . NUEVA DELHI
SAN FRANCISCO . SIDNEY . SINGAPUR . ST. LOUIS . TORONTO
Editorsponsor: Camilo Heras Martnez
Correccin de estilo: Guillermina Cuevas Meza y Elia Olvera Martnez
Supervisin de edicin: Leonora Vliz Salazar
Supervisin de produccin: Jos Luis Gonzlez Huerta
Composicin y formacin: By Color Soluciones Grficas
NOTA
La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se requerirn cam-
bios de la teraputica. El (los) autor(es) y los editores se han esforzado para que los cuadras de dosificacin
medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la fecha de publicacin. Sin embargo, ante los
posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los editores ni cualquier otra persona que haya parti-
cipado en la preparacin de la obra garantizan que la informacin contenida en ella sea precisa o completa,
tampoco son responsables de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha informacin se obtengan.
Convendra recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habr que consultar la hoja
informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la informacin de esta obra es
precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones para su admi-
nistracin. Esto es de particular importancia con respecto a frmacos nuevos o de uso no frecuente. Tambin
deber consultarse a los laboratorios para recabar informacin sobre los valores normales.
GENES IX
Prohibida la reproduccin total o pardal de esta obra,
por cualquier medio, sin autorizacin escrita del editor.
1
i
Educacin
DERECHOS RESERVADOS 2008 respecto a la primera edicin en espaol por
McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S.A. de C.V.
A subsidiary of The McGraw-Hill Companies.
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Prolongacin Paseo de la Reforma 1015, Torre A, Piso 17, Col. Desarrollo Santa Fe,
Delegacin Alvaro Obregn
CP. 01376, Mxico, D.F.
Miembro de la Cmara Nacional de la Industria Editorial Mexicana
, Reg. nm. 736
ISBN 10: 970-10-6685-5
ISBN I3: 978-970-10-6685-0
Translated from the ninth English edition of: Genes IX
Edited by Benjamn Lewin
Copyright 2008 by Jones & Bartlett Publishers, Inc, 40 Tall Pine Drive, Sudbury,
MA 01776
All Rights Rescrved
ISBN 10: 0763740632
ISBN 13: 9780763740634
1234567890 09765432108
Impreso en Mxico Printed in Mxico
Impreso en Mxico en Abril del 2008 Printed in Mxico in April 2008
Impreso por Editorial Impresora Apolo Printed by Editorial Impresora Apolo
The McGrawHHI Companies
Contenido abreviado
Contenido vi
Prefacio xvi
La repLicacin bacteriana est conectada
con el ciclo celular 408
| Los genes son DNA 1
RepLicacin del DNA 428
Los genes codifican protenas
23
Recombinacin homologa y especfica
de sitio 457
EL gen interrumpido 37
Sistemas de reparacin 499
EL contenido deL genoma 55
Transposones 521
j p Secuencias genmicas y nmeros de genes 76
Retrovirus y retroposones 550
Agrupamientos y repeticiones
98
Diversidad inmunitaria 570
El RNA mensajero 127
Promotores y potenciadores 609
Sntesis protem'ca 151
Activacin de La transcripcin 640
UtiLizacin deL cdigo gentico
189
Corte, empalme y procesamiento del RNA
667
LocaLizacin de Las protenas
218
RNA cataltico 706
Transcripcin 256 Cromosomas 729
EL opern 300 NucLeosomas 757
RNA regulador 331 Control de La estructura de La cromatina 796
Estrategias de Los fagos 349 Los efectos epigenticos son heredados
818
Q EL replicn 376
Glosario 845
ify Replicones extracromosmicos
392 ndice alfabtico 867
Contenido
Prefacio xvi
na
Los genes son DNA 1
Introduccin 2
El DNA es el material gentico de las bacterias 3
El DNA es el material gentico de los virus 4
El DNA es el material gentico de las clulas
animales 5
Los poLinudetidos tienen bases nitrogenadas ligadas a
un esqueleto de azcar-fosfato 5
El DNA es una hlice dplex 6
La duplicacin del DNA es semiconservadora 8
Las cadenas de DNA se separan en la horquilla de
duplicacin 9
La informacin gentica puede ser proporcionada por el
DNA o por el RNA 10
Los cidos nucleicos se hibridan por apareamiento de
bases 12
Las mutaciones cambian la secuencia del DNA 14
Las mutaciones pueden afectar a pares de bases
individuales o a secuencias ms largas 15
Los efectos de las mutaciones pueden ser
revertidos 15
Las mutaciones se concentran en puntos calientes 17
Numerosos puntos calientes son resultado de bases
modificadas 18
Algunos agentes hereditarios son extremadamente
pequeos 19
Resumen 20
Los genes codil'can protenas 23
Introduccin 24
Un gen codifica a un solo polipptido 24
Las mutaciones que se presentan en el mismo gen no
se pueden complementar 25
Las mutaciones pueden provocar prdida o ganancia de
funcin 26
roa
Un locus puede tener numerosos aleLos mutantes
diferentes 27
Un locus puede tener ms de un alelo de tipo
silvestre 28
La recombinacin ocurre por al intercambio fsico de
DNA 28
El cdigo gentico se lee en tripletes 30
Cada secuencia tiene tres marcos de lectura
posibles 31
Los genes procariticos son colineales con sus
proteinas 32
Numerosos procesos son necesarios para expresar el
producto proteinico de un gen 33
Las protenas actan en trans, pero los sitios del DNA,
en as 35
Resumen 36
3 EL gen interrumpido 37
43
Introduccin 38
Un gen interrumpido est formado por intrones y
exones 38
Las endonucleasas de restriccin son una herramienta
esencial en el mapeo del DNA 39
La organizacin de los genes interrumpidos puede
conservarse 40
Las secuencias de los exones se conservan, pero las de
los intrones varan 42
La distribucin de tamaos de los genes es amplia
Algunas secuencias de DNA codifican a ms de una
protena 45
Cmo evolucionaron los genes interrumpidos? 47
Algunos exones pueden equipararse con fundones
protenicas 49
Los miembros de una familia de genes tienen una
organizacin comn 51
Se encuentra toda la informacin gentica contenida
en el DNA? 53
Resumen 53
vi
4 EL contenido deL genoma 55
- Introduccin 55
MWM Pueden trazarse mapas de los genomas por Ligamiento,
por restriccin, por divisin o por secuencia de DNA 56
Los genomas individuales son muy variables 57
MM Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo
gentico 58
M&M Por qu Los genomas son tan grandes? 50
HM Los genomas eucariticos contienen secuencias de DNA
repetitivas y no repetitivas 61
MWM Los genes pueden ser aislados por la consen/acin de
los exones 63
KSifl La conservacin de la organizacin del genoma ayuda a
identificar genes 65
waum Los organelos contienen DNA 57
ESUI Los genomas de los organelos son molculas circulares
de DNA que codifican protenas de los organelos 69
KSI1 La organizacin del DNA mitocondrial es variable 70
MMirM El genoma de los doroplastos codifica a numerosas
protenas y molculas de RNA 71
wmt* Las mitocondrias evolucionaron por endosimbiosis 72
mmim Resumen 73
5 Secuencias genmicas y nmeros
de genes 76
a>M Introduccin 77
KSfl El nmero de genes bacterianos abarca un rango
superior de un orden de magnitud 77
En numerosas eucariotas se conoce el nmero total de
genes 79
mmm Cuntos tipos diferentes de genes hay? 81
EES El genoma humano tiene menos genes que los
esperados 83
mKM Cmo se distribuyen los genes y otras secuencias en el
genoma? 85
aM El cromosoma Y tiene varios genes especficos de la
masculinidad 86
MaiiM Las especies ms complejas evolucionan agregando
nuevas funciones gnicas 87
U!KM Cuntos genes son esenciales? 89
KBJl Los genes se expresan en niveles muy diferentes 92
vmtm Cuntos genes se expresan? 93
aira El nmero de genes expresados puede medirse en
masa 93
aiM Resumen 94
6 Agrupamientos y repeticiones 98
KSS Introduccin 99
KSfl La duplicacin de los genes es una fuerza importante
en la evolucin 100
KSfl Los agrupamientos de las globinas son formados por
duplicacin y por divergencia 101
XB La divergencia secuencial es la base del reloj
evolutivo 104
EEfl La velocidad de sustitucin neutral puede ser medida a
partir de la divergencia de secuencias repetidas 107
KKB Los seudogenes son callejones sin salida de la
evolucin 108
MSM Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran
los agrupamientos de genes 109
KS-fl Los genes del RNAr forman repeticiones en
tndem 112
KS9 Los genes repetidos de RNAr mantienen una secuencia
constante 114
EBEI La fijacin entrecruzada podria mantener repeticiones
idnticas 115
liSU Los DNA satlite a menudo se encuentran en la
heterocromatina 117
E8E9 Los satlites de los artrpodos tienen repeticiones
idnticas muy cortas 119
ESO Los satlites de los mamferos consisten de
repeticiones jerrquicas 120
ESEI Los minisatlites facilitan el mapeo gentico 123
Eill Resumen 125
7 EL RNA mensajero 127
mitM Introduccin 128
UBM El RNAm se produce por transcripcin y se
traduce 129
MMM El RNA de transferencia forma una hoja de trbol 130
9 El tallo aceptor y el anticodn se encuentran en los
extremos de la estructura terciaria 131
B9 El RNA mensajero es traducido por los ribosomas 132
MESM A una molcula de RNAm se unen numerosos
ribosomas 133
WMM El ciclo vital del RNA mensajero de las bacterias 135
WEM El RNAm eucaritico es modificado durante su
transcripcin o despus de sta 137
El extremo 5' del RNAm eucaritico posee un
casquete 138
KAI El extremo 3' est poliadenilado 139
KAU La degradacin del RNAm bacteriano involucra a
mltiples enzimas 140
CSEI La estabilidad del RNAm depende de su estructura y de
su secuencia 141
Contenido vil
KB9 La degradacin del RNAm involucra a mltiples
actividades 143
BA1 Las mutaciones sin sentido activan un sistema de
vigilancia 144
KAJ Las molculas de RNA eucaritico se transportan 145
MtSM El RNAm puede localizarse especficamente 146
KAU Resumen 147
8 Sntesis protenica 151
BSB Introduccin 151
KB La sntesis protenica ocurre por iniciacin, elongacin
y terminacin 153
ESB La precisin de la sntesis protenica es controlada por
mecanismos especiales 156
W-KM La iniciacin en las bacterias requiere de subunidades
30S y de factores accesorios 157
K89 Un RNAt iniciador especial comienza la cadena
polipeptdica 158
MSM El uso del fMet-RNAtf est controlado por el IF-2 y por
el ribosoma 160
fESM La iniciacin implica el apareamiento de bases entre el
RNAm y el RNAr 161
EEB Las subunidades pequeas buscan sitios de iniciacin
en el RNAm eucaritico 162
EEB Las eucariotas utilizan un complejo formado por
numerosos factores de iniciacin 164
EBI!I El factor de elongacin Tu carga al aminoadl-RNAt en
el sitio A 167
W
-mM La cadena polipeptdica se transfiere ai
aminoadl-RNAt 168
nnva La translocacin mueve al ribosoma 169
ESO Los factores de elongacin se unen alternativamente al
ribosoma 170
ESEI La sntesis protenica termina con tres codones 172
liBEl Los codones de terminacin son reconocidos por
factores protenicos 173
EBU El RNA ribosmico se extiende en ambas subunidades
ribosmicas 175
ESB Los ribosomas tienen numerosos centros activos 177
EBl El RNAr 16S desempea un papel activo en la sntesis
protenica 179
ESEI El RNAr 23S tiene actividad peptidil transferasa 182
CBSI Las estructuras ribosmicas cambian cuando se unen
las subunidades 183
Cm Resumen 183
9 UtiLizacin del cdigo gentico 189
Introduccin 190
KB9 Los codones relacionados representan a aminocidos
relacionados 190
miKM El reconocimiento codn-anticodn involucra
balanceo 192
KEM Los RNAt son procesados a partir de precursores ms
largos 194
KSB El RNAt contiene bases modificadas 194
KSB Las bases modificadas afectan el apareamiento codn-
anticodn 196
ESB El cdigo universal tiene alteraciones
espordicas 197
M-
'
IBM En ciertos codones de terminacin pueden insertarse
aminocidos nuevos 199
USBIM Los RNAt son cargados con aminocidos por medio de
sintetasas 200
EBI Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos
grupos 201
ESQ Las sintetasas utilizan mecanismos de correccin para
incrementar la precisin 203
aiLos RNAt supresores tienen anticodones mutados que
leen a codones nuevos 206
WMn Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada
codn de terminacin 207
ESEI Los supresores pueden competir con la lectura de tipo
silvestre del cdigo 208
M-
'
IIUl El ribosoma influye en la precisin de la
traduccin 209
ESEI La modificacin de La codificacin cambia el significado
de los codones 211
ESEI Los cambios del marco de lectura ocurren en las
secuencias resbaladizas 213
ESEI La evasin implica el movimiento del ribosoma 214
ESEI Resumen 215
10 Localizacin de Las protenas 218
SEO Introduccin 220
JSHB El desplazamiento a travs de una membrana requiere
de un mecanismo especial 220
U!SI La translocacin de las protenas puede ser posterior a
la traduccin o durante sta 221
SEO Los chaperones pueden ser necesarios para el
plegamiento de las protenas 223
SEEI Las protenas desnaturalizadas y las recin sintetizadas
necesitan chaperones 224
U!Sa La familia Hsp70 es ubicua 226
WESM Las secuencias de seal inician la translocacin 227
SEO La secuencia de seal interacta con la SRP 228
SEEI La SRP interacta con el receptor de SRP 229
fESEl El traslocn forma un poro 231
viii Contenido
mmi La translocacin requiere de insercin en el traslocn y
(en ocasiones) de un trinquete en el ER 233
BUtil La translocacin inversa enva protenas al citosol para
que sean degradadas 234 MMM
mmn Las protenas residen en las membranas por medio de
regiones hidrfobas 235 Kt
II!BE9 Las secuencias de anclaje determinan la orientacin de
las protenas 236
iPma Cmo se insertan Las protenas en las
membranas? 238
UiaU La insercin en la membrana despus de la traduccin
depende de las secuencias lder 240
ICBU Una jerarqua de secuencias determina la localizacin
dentro de Los organeLos 241
IPHM Las membranas mitocondriales interna y externa tienen
traslocones distintos 243
iPHM Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de
translocacin 245
iOlWtl Las bacterias utilizan tanto translocacin
cotraduccional como translocacin
postraduccional 245
ICEil El sistema Sec transporta protenas al interior de la
membrana interna y a travs de ella 247
IMW Sistemas de translocacin independientes de Sec
en E. coli 249
OI! Resumen 250
11 Transcripcin 256
UBI Introduccin 258
183 La transcripcin ocurre por medio de apareamiento de
bases en una "burbuja" de DNA no apareado 259
UBI La reaccin de la transcripcin consiste en tres
etapas 260 EEO
US! La polimerasa de RNA del fago T7 es un sistema de
modelos til 261 133
USl La estructura cristalina sugiere un modelo de
desplazamiento enzimtico 262
KiM La polimerasa de RNA bacteriana est formada por
mltiples subunidades 265
UBI La polimerasa de RNA est formada por la enzima
central y por un factor o 267
UEI La asociacin con el factor a cambia en la
iniciacin 267
UKI Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la
transcripcin 269
IUIQ Cmo encuentra una polimerasa de RNA las secuencias
promotoras? 270 FKtl
fHD El factor o controla la unin al DNA 271 HSKll
DHB El reconocimiento del promotor depende de las
secuencias de consenso 272 EESH
La eficiencia de los promotores puede incrementar o
disminuir por medio de mutaciones 274
La polimerasa de RNA se une a una cara del DNA 275
El superenrollamiento es una caracterstica importante
de la transcripcin 277
La sustitucin de los factores o puede controlar la
iniciacin 278
Los factores a entran en contacto de manera directa
con el DNA 280
Los factores o pueden organizarse en cascadas 282
La esporulacin es controlada por factores o 283
La polimerasa de RNA bacteriana termina en sitios
discretos 286
Hay dos tipos de terminadores en E. coli 287
Cmo funciona el factor p? 288
La antiterminacin es un episodio regulador 291
La antiterminacin requiere sitios que son
independientes de los terminadores 292
Los factores de terminacin y de antiterminacin
interactan con la polimerasa de RNA 293
Resumen 295
EL opern 300
/ntroduccin 302
La regulacin puede ser positiva o negativa 303
Los agrupamientos de genes estructurales son
controlados de manera coordinada 304
Los genes lac son controlados por un represor 305
El opern lac puede ser inducido 305
El represor es controlado por una pequea molcula
inductora 307
Las mutaciones constitutivas de actuacin en cis
identifican al operador 308
Las mutaciones de actuacin en trans identifican al gen
regulador 309
Las protenas multimricas tienen propiedades
genticas especiales 309
El monmero represor tiene numerosos dominios 310
Un represor es un tetrmero formado por dos
dmeros 311
La unin al DNA es regulada por una cambio alostrico
en la conformacin 312
Los fenotipos mutantes se correlacionan con la
estructura del dominio 312
La protena represora se une al operador 313
La unin del inductor libera al represor del operador 314
El represor se une a tres operadores e interacta con la
polimerasa de RNA 315
El represor siempre est unido al DNA 316
Contenido ix
El operador compite con los sitios de baja afinidad para
unirse al represor 317
IMIM La represin puede suceden en mltiples loci 319
ttmaa El AMP cclico es un efector que activa al factor CRP
para que acte en mltiples operones 320
lt*!*l El factor CRP funciona de formas diferentes en operones
diana distintos 321
itilWJ La traduccin puede ser regulada 323
IWWel La sntesis de las protenas r es controlada por medio
de regulacin autgena 325
iWMI La p32 del fago T4 es controlada por un circuito
autgeno 326
iWWa La regulacin autgena se utiliza frecuentemente
para controlar la sntesis de ensambles
macromoleculares 327
raga Resumen 328
13 RNA regulador 331
Efl Introduccin 332
WSB Las estructuras secundarias alternativas controlan la
atenuacin 333
fEB La terminacin de los genes trp de Badllus subtilis es
controlada por el triptfano y por el RNAtT,p 333
WBE El opern triptfano de Escherchia coli es controlado
por medio de atenuacin 335
BM La atenuacin puede ser controlada por la
traduccin 335
S1 El RNA antisentido puede ser utilizado para desactivar
la expresin gnica 338
Sfl Las molculas pequeas de RNA son capaces de regular
la traduccin 339
BO Las bacterias contiene RNA reguladores 341
MW-'l Los microRNA son reguladores en numerosas
eucariotas 342
KWBI La interferencia de RNA est relacionada con el
silenciamlento de los genes 343
Mili Resumen 345
14 Estrategias de Los fagos 349
EU Introduccin 350
EEI El desarrollo ltico se divide en dos periodos 352
EM El desarrollo ltico es controlado por una cascada 353
mVKm La cascada ltica es controlada por dos tipos de sucesos
reguladores 354
mt/KU Los genomas de los fagos T4 y T7 presentan agrupacin
funcional 355
mcum Los genes X tempranos inmediatos y tempranos
retrasados son indispensables para la lisogenia y para
el ciclo ltico 356
DB El ciclo ltico depende de la antiterminacin 357
KSi| La lisogenia la mantiene una protena represora 359
S1 El represor y sus operadores definen la regin de
Inmunidad 360
USIU La forma de unin al DNA del represor es un dmero 361
UBU El represor utiliza un elemento hlice-giro-hlice para
unirse al ONA 362
IEBEI La hlice de reconocimiento determina la especificidad
por el DNA 363
IEBEI Los dmeros represores se unen en colaboracin al
operador 364
IEBEI EL represor en 0 interacta con la polimerasa de RNA
en el P
m
365
pEUUl El represor mantiene un circuito autgeno 366
iCPI Las interacciones en colaboracin incrementan la
sensibilidad de la regulacin 367
iCWM Los genes di y cIII son necesarios para establecer la
lisogenia 368
Un mal promotor requiere protena di 369
IEBEI La lisogenia requiere numerosos sucesos 369
lESfil El represor Cro es necesario para la infeccin
ltica 371
IESU Qu determina el balance entre la lisogenia y el ciclo
ltico? 373
fE] Resumen 374
15 EL replicn 376
IkBI Introduccin 377
WUWM Los replicones pueden ser lineales o circulares 378
BMM Es posible elaborar el mapa de los orgenes con
autorradiografa y electroforesis 379
BVKM Regula la metiladn del origen la Iniciacin? 380
ESI Los orgenes pueden ser secuestrados despus de la
replicacin 381
BUira Cada cromosoma eucaritico contiene numerosos
replicones 383
BEM En las levaduras pueden aislarse los orgenes de
replicacin 384
USil El factor de competencia controla a la replicacin
eucaritica 385
ESI El factor de competencia est formado por protenas
MCM 386
lEBUl Los lazos D mantienen a los orgenes
mtocondriales 388
Resumen 389
16 Replicones extracromosmicos 392
UiBl Introduccin 393
x Contenido
mimm Los extremos deL DNA Lineal representan un problema
para la replicacin 393
BM Las protenas terminales permiten la iniciacin en los
extremos de los DNA vricos 394
at.TM Los crculos rodantes producen multmeros de un
replicn 396
BM Los crculos rodantes se utilizan para replicar los
genomas de los fagos 397
I.H.1 El plsmido F es transferido por conjugacin entre
bacterias 398
I.TM La conjugacin transfiere DNA de cadena
individual 400
tata El plsmido bacteriano Ti provoca la enfermedad de
agalla de Crown en las plantas 401
B3E1 El T-DNA porta los genes necesarios para la
infeccin 402
natBl La transferencia del T-DNA es semejante a la
conjugacin bacteriana 405
naill Resumen 407
17 La repLicacin bacteriana est
conectada con eL ciclo celular 408
mwmm Introduccin 409
mwnrM La replicacin est conectada con el ciclo celular 410
kWMm El septo divide a una bacteria en bacterias hijas que
contienen cada una un cromosoma 411
mWKM Las mutaciones de la divisin o la segregacin alteran
la forma de la clula 412
ME El producto FtsZ es necesario para la formacin del
septo 413
EfUI Los genes min regulan la localizacin del septo 415
MWMM La segregacin cromosmica puede requerir de
recombinacin especfica de sitio 415
Hta La particin implica a la separacin de los
cromosomas 417
BMM Los plsmidos de una sola copia tienen un sistema de
particin 419
UA!*j La incompatibilidad de los plsmidos depende del
replicn 421
rmi El sistema de compatibilidad ColEl es controlado por
un regulador de RNA 422
iMti Cmo se replican y segregan las mitocondrias? 424
1M1B1 Resumen 425
18 RepLicacin deL DNA 428
mr.mm Introduccin 429
tara las polimerasas de DNA son enzimas que sintetizan
DNA 430
KIKM Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de
nucleasa 431
mima Las polimerasas de DNA controlan la fidelidad de la
replicacin 432
mim Las polimerasas de DNA tienen una estructura
comn 433
mr.W!U La sntesis de DNA es semidiscontinua 434
mv.WM El modelo cpX muestra cmo se genera el DNA de cadena
individual para la replicacin 435
mr.W.m La actividad cebadora es necesaria para iniciar la
sntesis de DNA 437
mv.KM La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres
subcomplejos 439
lt;mil La pinza controla la asociacin de la enzima central
con el DNA 440
IMlll Coordinacin de la sntesis de la cadena lder y de la
cadena retrasada 442
itaii Los fragmentos de Okazaki estn unidos por la
ligasa 443
Itmiti Polimerasas de DNA eucariticas independientes
realizan la iniciacin y la elongacin 444
mma El fago T4 proporciona su propio mecanismo de
replicacin 445
Italia Creacin de las horquillas de replicacin en el
origen 448
Italia Sucesos comunes en el cebamiento de la replicacin en
el origen 450
Itairj El primosoma es necesario para reiniciar la
replicacin 451
UMtt Resumen 453
19 Recombinacin homLoga
y especfica de sitio 457
mumm Introduccin 459
mvWM Ocurre recombinacin homologa entre cromosomas en
sinapsis 460
BM Rotura y reunin afectan el DNA heterodplex 462
BM Las roturas de la doble cadena inician la
recombinacin 464
Ma Los cromosomas en recombinacin se conectan por el
complejo sinaptonmico 465
MEM El complejo sinaptonmico se forma despus de roturas
de la doble cadena 467
mvwm El apareamiento y la formacin del complejo
sinaptonmico son independientes 459
Cita Las secuencias chi estimulan el sistema RecBCD
bacteriano 470
miKM Las protenas de transferencia de cadena catalizan la
asimilacin de una sola cadena 471
Contenido xi
liaiPl El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday 473
lmi La conversin gnica contribuye a la recombinacin
interallica 475
iimm El superenrollamiento afecta la estructura del DNA 476
IEBE1 Las topoisomerasas relajan o introducen superhlices
en el DNA 478
lEBES Las topoisomerasa rompen y resellan cadenas 480
D0D3 La girasa funciona por la inversin de hlice 481
ISBI3 La recombinacin especializada involucra sitios
especificos 482
fEBB La recombinacin especfica de sitio comprende rotura
y reunin 484
|B!il La recombinacin especfica de sitio simula la actividad
de la topoisomerasa 484
USBEI La recombinacin X ocurre en un intasoma 486
EBSfil Las levaduras pueden cambiar loci silentes y activos
por el tipo de apareamiento 488
iPUiil El locus MAT codifica protenas reguladoras 490
IBJWii Se reprimen los cartuchos silentes en HML y HMR 492
WWti El ocus MAT receptor inicia la transposicin
unidireccional 493
IPIMl La regulacin de la expresin de H0 controla
el cambio 494
liawa Resumen 496
20 Sistemas de reparacin 499
Will Introduccin 500
WHWM Los sistemas de reparacin corrigen el dao
del DNA 502
KilUM Sistemas de reparacin por escisin en f. coli 503
Wi*KU Vas de reparacin por escisin en clulas
de mamferos 504
EH Las metilasas y las glucosilasas "lanzan" las
bases 506
EO Reparacin susceptible de error y fenotipos
mutadores 507
WtWM Control de la direccin de la reparacin de
apareamientos errneos 507
BfiKil Sistemas de reparacin por recombinacin
en f. coli 510
BDEI La recombinacin es un mecanismo importante de
recuperacin ante errores de replicacin 511
KHmil La protena RecA desencadena el sistema SOS 513
tawtl Las clulas eucariticas tienen sistemas de reparacin
conservados 515
EBEI Un sistema comn repara roturas de la doble
cadena 516
fXUSa Resumen 518
21 Transposones 521
V*mm Introduccin 522
W*WM Las secuencias de insercin son simples mdulos de
transposicin sencillos 524
aw Los transposones compuestos tienen mdulos IS 525
m*wm La transposicin ocurre por mecanismos replicativos y
no replicativos 527
mi Los transposones causan reestructuracin
del DNA 528
wnWiW Intermediarios comunes para la transposicin 530
WtWM La transposicin replicativa avanza a travs de un
cointegrado 531
ana La transposicin no replicativa avanza por rotura y
reunin 533
m*m!U La transposicin de TnA requiere transposasa y
resolvasa 534
MHU La transposicin de TnlO tiene mltiples controles 534
Mmi Los elementos de control en el maz causan roturas y
reestructuraciones 538
tama Los elementos de control forman familias de
transposones 540
tama Los elementos Spm influyen en la expresin
gnica 542
MllH Intervencin de los elementos susceptibles de
transposicin en la disgenesia hbrida 544
lama Los elementos P se activan en la lnea germinal 545
tama Resumen 546
22 Retrovirus y retroposones 550
mtfJtm Introduccin 551
WMfM El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos
similares a la transposicin 551
WJtatm Los genes retrovricos codifican poliprotenas 552
KMM El DNA vrico se genera por transcripcin inversa 554
W El DNA vrico se integra al cromosoma 556
aati Los retrovirus pueden hacer transduccin de secuencias
celulares 558
mntM Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los
retrovirus 559
WifMiU Muchos elementos susceptibles de transposicin residen
en la Drosophila melanogaster 561
WJ/iMM Los retroposones son de tres clases 562
watni La familia Alu tiene muchos miembros muy
dispersos 564
Bmn Los seudogenes procesados se originaron como
sustratos para la transposicin 555
EWlia Las LINES utilizan una endonucleasa para generar
un extremo con actividad cebadora 566
WillM Resumen 567
xii Contenido
23 Diversidad inmunitaria 570
WtM Introduccin 572
WJtWM La seleccin clonal amplifica linfocitos que responden a
antgenos individuales 574
WWM Los genes de las inmunoglobulinas se ensamblan en los
linfocitos a partir de sus constituyentes 575
WJtwm Las cadenas ligeras se ensamblan por recombinacin
simple 577
*
M Las cadenas pesadas se ensamblan mediante dos
recombinaciones 579
BKWa La recombinacin genera una gran diversidad 580
KMM La recombinacin inmunitaria utiliza dos tipos de
secuencias de consenso 581
BO La recombinacin genera deleciones o inversiones 582
WJtUtm La exclusin allica es desencadenada por rearreglo
productivo 582
WWPl Las protenas RAG catalizan la rotura y la nueva
unin 584
Haill La expresin temprana de las cadenas pesadas puede
cambiar por procesamiento del RNA 586
HMtlil El cambio de clase es producto de la recombinacin del
DNA 587
KM El cambio se debe a una nueva reaccin de
recombinacin 589
rama La mutacin somtica genera otras diferencias entre el
ratn y el ser humano 590
YJtma La desaminasa de citidina y la glucosilasa de uracilo
inducen la mutacin somtica 591
Vtmta Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de
seudogenes 593
tiHIM La clula B de memoria permite una respuesta
secundaria rpida 594
WIH Los receptores de las clulas T tienen relacin con las
inmunoglobulinas 595
EMIlil El receptor de la clula T acta en unin con el MHC 597
NtWil El locus de histocompatibilidad mayor codifica muchos
genes del sistema inmunitario 599
BMBil La inmunidad innata hace uso de vas de seal
conservadas 502
mm Resumen 604
24 Promotores y potenciadores 609
mrnmM Introduccin 610
WOiWM Las polimerasas de RNA eucariticas constan de muchas
subunidades 612
Bituei Los elementos del promotor se definen por mutaciones
y vestigios 613
ESS La polimerasa de RNA I tiene un promotor
bipartido 614
83 La polimerasa de RNA III utiliza promotores en flujo
ascendente y descendente 615
UMil TF
in
B es el factor de encargo de los promotores de Pol
III 616
CED El punto de inicio de la polimerasa de RNA II 618
BS La TBP es un factor universal 619
WH-'T. La TBP se une al DNA de forma inusual 620
MU01 El aparato basal se ensambla en el promotor 621
MUtl El inicio va seguido de la depuracin del
promotor 623
Una conexin entre transcripcin y reparacin 625
KHM Los elementos de secuencia corta se unen a
activadores 627
rata La estructura del promotor es flexible, pero el contexto
puede ser importante 628
KtUM Los potenciadores contienen elementos bidireccionales
que facilitan el inicio 629
KCm! Los potenciadores contienen los mismos elementos
encontrados en los promotores 630
MHM Los potenciadores actan aumentando la concentracin
de activadores cerca del promotor 631
EB] La expresin gentica se vincula con la
desmetilacin 632
ECBU Los islotes CpG son dianas reguladoras 634
fZWH Resumen 635
25 Activacin de La transcripcin 640
Wi&W Introduccin 641
WWM Hay varios tipos de factores de transcripcin 642
WJmtm Dominios independientes se unen con el DNA y activan
la transcripcin 643
EEO El anlisis de dos hbridos detecta interacciones
protena-protena 645
WflUl Los activadores interactan con el aparato basal 646
WtVKM Algunas protenas de unin con promotor corresponden
a represores 648
WiWJ Los elementos de respuesta son reconocidos por los
activadores 649
WiVKM Hay muchos tipos de dominios de unin con DNA 651
WHKM El segmento de dedo de zinc es un dominio de unin
con DNA 652
MtUM Los receptores de esferoides son activadores 653
KWItl Los receptores de esferoides tienen dedos de zinc 655
Hami La unin con el elemento de respuesta se activa por
unin con un ligando 656
Hfcum Los receptores de esferoides reconocen a los elementos
de respuesta por un cdigo combinatorio 657
miiCl Los homeodominos se unen con dianas relacionadas en
el DNA 658
Contenido xiii
EBEl Las protenas hlice-asa-hLice interactan por vnculo
combinatorio 658
EBEl Las cremalleras de Levana participan en la formacin de
dmeros 658
EBII Resumen 658
26 Corte, empalme y procesamiento
del RNA 667
B3H Introduccin 669
E-HI Las uniones de corte y empalme nuclear son secuencias
cortas 670
ESI Las uniones de corte y empalme se leen
por pares 671
EEl El corte y empalme del pre-RNAm procede a travs de
un lazo 673
BSl Se requieren RNAsn para el corte y empalme 674
WKM La RNPsn Ul inicia el corte y empalme 676
WntM El complejo E puede formarse por definicin de intrn
o exn 678
WStum Cinco RNPsn forman el empalmosoma 679
wannm Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza
diferentes RNPsn 681
W
.HB1 El corte y empalme est relacionado con la exportacin
del RNAm 682
wam Los intrones del grupo II se cortan y empalman a s
mismos por la formacin de un lazo 683
nmn El proceso de corte y empalme alternativo implica el
uso diferencial de uniones de corte y empalme 865
waiia Las reacciones de corte y empalme en configuracin
trans utilizan RNA pequeos 588
B3B El corte y empalme del RNAt de las levaduras implica
escisin y reunin 690
WiUM La endonucleasa de corte y empalme reconoce al
RNAt 691
tBI La escisin y ligadura del RNAt son reacciones
separadas 692
WlM La respuesta de la protena no plegada tiene relacin
con el corte y empalme del RNAt 693
W'HM Los extremos 3
'
de los productos de transcripcin pol I
y pol III se generan por terminacin 694
EBEI Los extremos 3' del RNAm se generan por escisin y
poliadenilacin 695
WlWil La escisin del extremo 3' del RNAm de histonas puede
requerir de un RNA pequeo 697
wawi La produccin de RNAr requiere de sucesos de
escisin 597
wawa Se requieren RNA pequeos para el procesamiento del
RNAr 699
wawei Resumen 700
27 RNA cataltico 706
WKU Introduccin 707
Witmm Los intrones del grupo I realizan el autocorte y
empalme por transesterificacin 707
matm Los intrones del grupo I forman una estructura
secundaria caracterstica 709
mmim Las ribozimas tienen varias actividades catalticas 711
Wiuum Algunos intrones del grupo I codifican a endonucleasas
que fomentan la movilidad 715
Wtmm Los intrones del grupo II pueden codificar protenas
multifuncionales 716
WiltM Algunos intrones de autocorte y empalme requieren de
madurasas 717
WW.9 La actividad cataltica de la ribonucleasa P se debe al
RNA 718
mtMlU Los viroides tienen actividad cataltica 718
nmi La edicin del RNA ocurre en bases individuales 720
tiHitl La edicin del RNA puede ser dirigida por RNA guas 721
nmn El corte y empalme de las protenas son
autocatalticos 724
tiMIM Resumen 725
28 Cromosomas 729
mamm Introduccin 730
WHWM Los genomas vricos estn empaquetados en sus
cubiertas 731
KM El genoma bacteriano es un nucleoide 734
WiiW El genoma bacteriano est superenrollado 735
WHIIiM EL DNA eucaritico tiene asas y dominios unidos a un
bastidor 736
WilW Secuencias especficas unen el DNA a una matriz de
interfase 737
WfiiWM La cromatina se divide en eucromatina y
heterocromatna 738
MBl Los cromosomas tienen patrones de bandas 740
WiiKM Los cromosomas en escobilln se extienden 741
waiBl Los cromosomas politnicos forman bandas 742
nmn Los cromosomas politnicos se expanden en sitios de
expresin gnica 743
mmn El cromosoma eucaritico es un dispositivo de
segregacin 744
Vimn Los centrmeros pueden contener DNA repetitivo 746
Viima Las secuencias de DNA de los centrmeros
de S. cerevisiae son cortas 747
nma El centrmero se une a un complejo protenico 748
nmvt Los telmeros tienen secuencias de repeticin
sencillas 748
laaiM Los telmeros sellan los extremos de los cromosomas 749
xiv Contenido
B3B3
29
En
ECTO
Rara
30
Los telmeros se sintetizan mediante una enzima
ribonucleoprotenica 750
Los telmeros son esenciales para la supervivencia 752
Resumen 753
NucLeosomas 757
Introduccin 758
El nudeosoma es la subunidad de la cromatina 759
EL DNA est enrollado en la estructura de los
nudeosomas 751
Los nudeosomas tienen una estructura comn 762
La estructura del DNA vara en la superficie del
nudeosoma 763
La periodicidad del DNA cambia en el nudeosoma 755
Organizacin del octmero de histonas 767
La via de los nudeosomas en la fibra de cromatina 759
La replicacin de la cromatina implica el ensamblaje de
los nudeosomas 771
Los nudeosomas yacen en posiciones especficas? 774
Los genes transcritos se organizan en
nudeosomas? 777
Los octmeros de histonas son desplazados por la
transcripcin 779
El desplazamiento del nudeosoma y su reensamblado
requieren factores especiales 781
Los aislantes impiden la accin de los potenciadores y
de la heterocromatina 781
Los aislantes pueden definir un dominio 783
los aislantes pueden actuar en una direccin 784
Los aislantes puede variar en potencia 785
Los sitios hipersensibles a la desoxirribonudeasa
reflejan cambios en la estructura de la cromatina 786
Los dominios definen regiones que contienen genes
activos 788
Una LCR puede controlar a un dominio 789
Qu constituye un dominio regulador? 790
Resumen 791
Control de la estructura
de La cromatina 796
Introduccin 797
La cromatina puede tener estados alternativos 797
El remodelado de la cromatina es un proceso
activo 798
La organizacin de los nudeosomas puede cambiar en
el promotor 801
BD
EO
-
Bn
Esa
ma
bih
31
BO
La modificacin de las histonas es un episodio
clave 802
Ocurre acetilacin de histonas en dos
circunstancias 805
Las acetilasas se relacionan con activadores 806
Las desacetilasas se relacionan con los represores 808
Las metilaciones de histonas y de DNA estn
relacionadas 808
Los estados de la cromatina se interconvierten por
modificacin 809
La activacin del promotor comprende una serie
ordenada de episodios 809
La fosforilacin de las histonas afecta la estructura de
la cromatina 810
Se encuentran algunos segmentos comunes en las
protenas que modifican a la cromatina 811
Resumen 812
Los efectos epigenticos
son heredados 818
Introduccin 819
La heterocromatina se propaga a partir de un episodio
de nucleacin 820
La heterocromatina depende de interacciones con las
histonas 822
Polycomb y Trithorax son represores y activadores
antagonistas 824
Los cromosomas X experimentan cambios
globales 826
Las condensinas producen la condensacin de los
cromosomas 828
Una metilasa de mantenimiento perpeta la metilacin
del DNA 830
La metilacin del DNA se encarga de la impresin 832
Un solo centro puede controlar los genes con impresin
opuesta 834
Los efectos epigenticos pueden heredarse 835
Los priones de levaduras muestran herencia
desusada 836
Los priones causan enfermedades en los
mamferos 839
Resumen 840
Glosario 845
ndice alfabtico 867
Contenido xv
Prefacio
La ciencia es una aventura extraordinariamente dif-
cil. En cada revisin de esta obra hay nuevos e intere-
santes acontecimientos de qu reportar, de modo que
sta incluye mucho material actualizado que da cuen-
ta de nuevos hallazgos de la investigacin molecular.
La organizacin general del material de esta edicin
ha sido revisada segn los criterios de Genes esenciales
para facilitar el uso conjunto de las dos obras. Como
el aumento de tamao representaba un problema, el
contenido se ha enfocado con mayor precisin en
los genes y su expresin, de modo que se eliminaron los
captulos que tratan de las consecuencias de la expre-
sin gnica en la biologa celular. La primera parte del
libro incluye cambios sobresalientes relacionados con
el genoma derivados de exitosos proyectos de secuen-
ciacin genmica; resalta la importancia del RNA como
regulador, y ahora es evidente que cubre todos los ni-
veles de expresin gnica, tanto en procariotas como en
eucariotas. Algo as como un
"
eslabn perdido
"
, arroja
ms luz sobre la forma en que el mecanismo actual de
la expresin gnica debi haber evolucionado desde el
mundo primitivo regido por el RNA.
En esta obra me he propuesto citar artculos de
revisin y de investigacin, que creo que sern de fcil
acceso para los lectores; prefer aquellos que despus
de seis meses no representan ningn costo, y cuando
no fue posible, la publicacin debera ser de amplia
difusin.
Agradezco a las siguientes personas el haber ledo
las pruebas y el haberme asesorado en esta revisin:
Elliott Goldstein University of Arizona, Tempe
Jocelyn Krebs University of Alaska,
Anchorage
Kathleen Matthews Rice University, Houston
Benjamn Lewin
Enero de 2007
Organizacin
La nueva organizacin de GENES IXpermite a instruc-
tores y estudiantes enfocarse con mayor especificidad
en los genes y su expresin, con nfasis en los temas
principales. El nmero de captulos y el orden de los
temas permanecen igual; sin embargo, numerosos ca-
ptulos se convirtieron en dos o ms. Los cambios son
ios siguientes:
El captulo 1 de GENES VIII, Los genes son DNA, se
convirti en dos captulos en GENES IX. La informacin
bsica de la estructura del DNA, la replicacin y las mu-
taciones permanecen en el captulo 1, mientras que la
descripcin de la funcin de los genes como unidad de
la herencia constituyen el nuevo captulo 2, Los genes
codifican protenas.
El captulo 3 de GENES VIII, El contenido del geno-
ma, se divide en dos captulos en GENES IX.
El captulo 4, El contenido del genoma, incluye in-
formacin sobre secuencias de DNA, mapeo genmico
y DNA de organelos.
El captulo 5, Secuencias genmicas y nmeros de
genes, ahora contiene informacin sobre las dimensio-
nes y la expresin de los genomas de gran nmero de
organismos, as como material nuevo sobre los genes
del cromosoma Y.
El nuevo captulo 12, El opern, incluye el captulo
10 de GENES VIII, as como informacin sobre la regu-
lacin de la transcripcin y de la traduccin del captulo
11 de GENES VIII, Circuitos reguladores. El material
que corresponde al RNA regulador se encuentra ahora
en el captulo 13.
El material del captulo 13 de GENES VIII, El repli-
cn, en GENES IX se encuentra en tres captulos. El ca-
ptulo 15, El replicn, abarca la estructura y la funcin
del replicn, as como los orgenes de la replicacin. El
captulo 16, Replicones extracromosmicos, contiene
material sobre las protenas terminales, el crculo de re-
xvi
plicacin, los plsmidos y el T-DNA. La informacin so-
bre la forma en que la replicacin bacteriana se vincula
con el ciclo celular se encuentra en el captulo 17.
Recombinacin y reparacin, captulo 15 de GE-
NES VIH, son dos captulos de GENES IX. El captulo 19
cubre la recombinacin homloga y especfica de sitio,
y el 20, Sistemas de reparacin, incluye informacin
novedosa sobre las rutas de reparacin por escisin en
las clulas de mamferos.
El captulo 23, Control de la estructura de la croma-
tina, de GENES VIII ahora es el captulo 30, en el cual
se analiza la relacin entre la estructura de la cromatina
y la expresin gnica.
El captulo 31, Los efectos epigenticos son hereda-
dos, detalla las causas y los mecanismos de la herencia
epigentica.
Programa de arte y diseo
GENES LYluce ahora ms moderno. El diseo y la parte
artstica de esta edicin se actualizaron y revisaron para
facilitar el aprendizaje de los estudiantes.
Prefacio xvii
Los genes son DNA
ESQUEMA DEL CAPTULO
.
J
mmm Introduccin
mwm El cido desoxirribonucleico (DNA,
deoxyrbonuclec acid) es el material gentico de
las bacterias
.
La transformacin bacteriana proporcion la primera prueba
de aue el DNA es el material gentico de las bacterias. Las
propiedades genticas pueden ser transferidas de una cepa
bacteriana a otra extrayendo el DNA de la primera cepa y
aadindolo a la segunda.
w El DNA es el material gentico de los virus
.
La infeccin por fagos demostr que el DNA es el
materia; gentico de los virus. Cuando el DNA y los
componentes protenicos de los bacterifagos son
marcados con istopos radioactivos diferentes, slo el DNA
es transmitido a la progenie de fagos producida por las
bacterias infecciosas.
MWM El DNA es el material gentico de las clulas
animales
.
El DNA puede ser utilizado para introducir nuevas
caractersticas genticas en clulas animales o en animales
completos.
.
En algunos virus, el material gentico es el RNA.
mmsm Los polinucletidos tienen bases nitrogenadas
ligadas a un esqueleto de azcar-fosfato
.
Un nuclesido est formado por una base prica o
pirimidica ligada a una pentosa (azcar de cinco carbonos)
en la posicin 1.
.
Las posiciones en el anillo de ribosa se describen con el
smbolo matemtico de primo (
'
), para distinguirlas.
.
La diferencia entre el DNA y el RNA radica en el grupo
localizado en la posic'n 2' del azcar. El DNA tiene un azcar
desoxirriboso (2'-H); el RNA tiene un azcar riboso (2'-0H).
.
Un nucletido consiste en un nuclesido ligado a un grupo
fosfato en la posicin 5' o 3' de la (desoxi)r)bosa.
.
Los residuos sucesivos ce (desoxi)ribosa de una cadena de
polinuclotidos estn unidos por un grupo fosfato entre la
posicin 3
'
de un azcar y la 5' del siguiente.
.
Un extremo de la cadena (convencionalmente el izquierdo)
tiene una punta 5' libre y, en el otro, la punta libre es 3'.
.
El DNA contiene las cuatro bases, adenina, guanina,
citosina y timina; el RNA posee uracilo en vez de timina.
MSM El DNA es una hlice dplex
.
La forma B del DNA es una hlice dplex formada por dos
cadenas polinucleotdicas que corren de forma antiparalela.
.
Las bases nit'ogenadas de cada cadena son anillos planos
de purina o de pirimidina orientados hacia el interior que
se aparean uno a otro a travs ae puentes de hid-geno
para formar nicamente pares de A-T o G-C.
.
El dimetro de la hlice dplex es de 20 . adems de una
vuelta completa cada 34 , con diez pares de bases por vuelta.
.
La hlice dplex forma un surco profundo (ancho) y un
surco superficial (angosto).
MSM La duplicacin del DNA es semiconservadora
.
En el experimento de Meselson-Stahl se utiliz mareaje de
densidad para demostrar que la cadena polinucleotidica
individual es la unidao del DNA que se conse-va durante la
duplicacin.
.
Cada cadena de un DNA dplex acta como molde para
sintetizar a una cadena hija.
.
Las secuencias de las cadenas hitas estn determinadas por
apareamiento complementario de bases con las cadenas
progenitoras separadas.
: Las caderas de DNA se separan cr la horquilla de
duplicacin
.
La duplicacin de DNA es emprencida por un complejo
de enzimas que separar a las cadenas progenitoras y que
sintetizan a las cadenas hijas.
.
l a horquilla de duplicacin es el punto en el cual las
cadenas progenitoras se separan.
.
La enzimas que sintetizan DNA se denominan DNA
polimerasas; las enzimas que sintetizan RNA son conocidas
como RNA polimerasas.
.
Las nucleasas son enzitias que degradan a los cidos
nucleicos; entre otras, DNAsas y RNAsas, que pueden
dividirse en endonucleasas y en exonucleasas.
mmsm La informacin gentica puede ser proporcionada
por el DNA o el RNA
.
Los genes celulares son DNA, pero los virus y los viroides
pueden tener genomas de RNA.
.
El NA se convierte en RNA por transcripcin, y el RNA
puede convertirse en DNA oor transcripcin inversa.
.
La traduccin del RNA a oroteinas es unidireccional.
mil Los cidos nucleicos se hibridan por apareamiento
de bases
.
El calentamiento provoca que las dos cadenas de un DNA
dplex se separen.
.
La r
m
es el punto medio del rango de temaeratura para la
desnaturalizacin.
.
Las cadenas complementarias ricas pueden renaturalizarse
cuando se reduce la temperatura.
Contina en ta siguiente pgina
1
.
La desnaturalizacin y la renaturalizacin/hibridacin
pueden ocurrir con combinaciones de DNA-DNA, de
DNA-RMA o de RNA-RNA y pueden ser intermoleculares
o intramoleculares.
.
La capacidad de dos preparaciones de cidos nucleicos
de una sola cadena para hibridarse es indicio de su
complementa riedad.
HUI Las mutaciones cambian la secuencia del ONA
.
Todas las mutaciones consisten en cambios de la
secuencia del DNA.
.
Las mutaciones oueden ser espontneas o inducidas
por mutgenos.
mmvM Las mutaciones pueden afectar a pares de
bases individuales o a secuencias ms largas
.
Una mutacin puntual cambia a un solo par de bases.
.
Las mutaciones puntuales pueden ser provocadas
por la conversin quimica de una base en otra o por
errores durante la duplicacin.
.
Una transicin remplaza a un par de bases C-C por un
par oe bases A-T o viceversa.
.
Una transversin remplaza a una purina por una
pirimidina. por ejemplo, cambiando A-T a T-A.
.
Las inserciones son el tipo ms comn de mutacin,
y son resultado del movimiento de elementos
transponibles.
KO Los efectos de las mutaciones pueden
ser revertidos
.
Las mutaciones primarias desactivan a un gen,
mientras que las inversas (o retromutaciones) revierten
sus efectos.
WWW Introduccin
La naturaleza hereditaria de todo organismo viviente
es definida por su genoma, el cual consiste en una
secuencia larga de cido nucleico que proporciona
la informacin necesaria para construir el organismo.
Se utiliza el termino "informacin" debido a que el
genoma por s mismo no desempea ninguna fun-
cin activa en la construccin del organismo, ms
bien es la secuencia de las subunidades individuales
(bases) del cido nucleico la que determina las ca-
ractersticas hereditarias. Por una compleja serie de
interacciones, esta secuencia se utiliza para producir
todas las protenas del organismo en el momento y
el lugar apropiados. Las protenas forman parte de
la estructura del organismo o tienen la capacidad
de construir estructuras o llevar a cabo las reaccio-
nes metablicas necesarias para la vida.
El genoma contiene el conjunto completo de
informacin hereditaria para cualquier organismo.
Fsicamente, el genoma puede ser dividido en va-
rias molculas diferentes de cido nucleico y fun-
cionalmente, en genes. Cada gen es una secuencia
que dentro del cido nucleico representa a una sola
protena. Cada una de las molculas de cido nu-
cleico que componen el genoma puede contener
.
Las inserciones pueden revertirse por delecin del
material insertado, pero las deleciones no pueden
revertirse.
.
La supresin ocurre cuando una mutacin de un
segundo gen anula el efecto de la mutacin del primer
gen.
mmim Las mutaciones se concentran en puntos
calientes
.
La frecuencia de la mutacin en cualquier par de bases
en particular depende de fluctuaciones estadsticas,
excepto en los puntos calientes, en los cuales la
frecuencia se incrementa cuando menos en un orden
de magnitud.
UU Numerosos puntos calientes son resultado
de bases modificadas
.
Una causa comn de los puntos calientes es la base
modificada B metilcitosina, la cual experimenta
desaminacin espontnea y se convierte en timina.
mil Algunos agentes hereditarios
son extremadamente pequeos
.
Algunos agentes hereditarios muy pequeos no
codifican protenas, sino que constan de RNA o
protenas que poseen propiedades hereditarias.
mmtm Resumen
gran nmero de genes. Los genomas de los orga-
nismos vivos pueden contener incluso <500 genes
(como un micoplasma, que es un tipo de bacteria)
o >25 000 en el ser humano.
En este captulo se analizan las propiedades del
gen en cuanto a su construccin molecular bsica.
En la MGURA l.t se resumen las etapas de transicin
del concepto histrico del gen a la definicin mo-
derna del genoma.
Un genoma consiste en el conjunto completo
de cromosomas de cualquier organismo especfico, de
modo que comprende una serie de molculas de ci-
do desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)
(una para cada cromosoma), cada una de las cuales
contiene numerosos genes. La principal definicin
de un genoma es determinar la secuencia del DNA de
cada cromosoma.
La primera definicin del gen c omo unidad fun-
cional se deriv del descubrimiento de que cada gen
es responsable de la produccin de protenas espe-
cficas. La diferencia en las caractersticas qumicas
del DNA del gen y su producto protenico condujo
al concepto de que un gen codifica a una protena.
A su vez, esto llev al descubrimiento del aparato
complejo que permite que la secuencia de DNA de
un gen genere la secuencia de aminocidos de una
protena.
2
CAPTULO 1 Los genes son DNA
Hechos principales del siglo de la gentica
1850 i
1900
Los genes son factores particulados
Descubrimiento de los cidos nucleicos
Los cromosomas son las unidades hereditarias
Los genes residen en ios cromosomas
i/z-iyid Los cromosomas son secuencias lineales
/ de genes
C
1950
2000
1927
1931
1944
1945
1951
1953
1958
961
1977
977
N
-1995
F
S
V
-1
-
2001
Las mutaciones son camoios fsicos en
los genes
La recombinacin ocurre por entrecruzamiento
El DNA es el material gentico
Un gen codifica a una protena
La primera secuencia proteinica
El DNA es una hlice dplex
El DNA se replica de forma semiconservadora
El cdigo gentico est determinado por tripletes
Los genes de las eucariotas son interrumpidos
Posible secuenciacin del DNA
Secuenciacin de los genomas bacterianos
Secuenciacin del genoma humano
FIGURA 1 Breve historia de la gentica.
Un gen es una unidad codificadora
Gen
Naturaleza qumica
DNA
i
Secuencia de nucletidos
RNA
vw
1
Secuencia de nucletidos
Secuencia de aminocidos
FI6UR; Un gen codifica una molcula de RNA, la cual
codifica una protena.
Entendiendo el proceso por medio del cual un
gen se expresa, permite una definicin ms rigu-
rosa de su naturaleza. En la FIGURA 1.2 se ilustra el
tema bsico de esta obra. Un gen es una secuencia
de DNA que produce otro cido nucleico, el cido
ribonucleico (RNA, ribomideicacid), que cuenta con
dos cadenas de cido nucleico, mientras que el RXA
tiene una sola. La secuencia del RNA es determina-
da por la secuencia del DNA. (De hecho, es idntica
a una de las cadenas de DNA.) En muchos casos,
pero no en lodos, el RNA se utiliza a su vez para
dirigir la produccin de una protena. Por lo tanto,
un gen es una secuencia de DNA que codifica a un RNA:
en los genes codificadores de protenas, el RNA a su vez
codifica a una protena.
A partir de la demostracin de que un gen con-
siste en DNA, y de que un cromosoma consiste en
un tramo largo de DNA que representa a numerosos
genes, se llega a la organizacin global del genoma
en funcin de su secuencia de DNA. En el Captulo 3,
El gen interrumpido, se retoma en ms detalle
la organizacin del gen y su representacin en pro-
tenas. En el Captulo 4, El contenido del genoma, se
analiza el nmero total de genes, y en el Captulo 6,
Agrupamientos y repeticiones, se describen otros
componentes del genoma y el mantenimiento de
su organizacin.
EL DNA es el material gentico
de las bacterias
Concepto principal
.
La transformacin bacteriana proporcion la primera
prueba de que el DNA es el material gentico de
las bacterias. Las propiedades genticas pueden ser
transferidas de una cepa bacteriana a otra extrayendo
el DNA de la primera cepa y sumndolo a la segunda.
La idea de que el material gentico es cido nucleico
tiene sus races en el descubrimiento de la transfor-
macin, en 1928. La bacteria Pneumococcus mata de
neumona a los ratones. La virulencia de la bacteria
depende de su polisacrido capsular, componente de
la superficie que permite que la bacteria escape de la
destruccin provocada por su hospedador. Diversos
tipos de Pneumococcus (1,11 y IIT) tienen polisacridos
capsulares diferentes; su aspecto es liso (S, smooth).
Todos los tipos de Pneumococcus lisos puede dar
lugar a variantes incapaces de producir el polisac-
rido capsular, en cuyo caso, la superficie de la bac-
teria es rugosa (R, rough) (formada por el material
que estaba debajo del polisacrido capsular). Estas
bacterias son avirulcntas, no matan a los ratones
porque la ausencia del polisacrido permite que el
animal destruya a la bacteria.
Cuando por medio de tratamiento calrico se
matan bacterias lisas, pierden la capacidad de daar
al animal, sin embargo, la combinacin de bacte-
rias S desactivadas con calor y la variante ineficaz R
produce un efecto considerablemente diferente del
de cada bacteria por separado. En la FIGURA 1.3 se
muestra que cuando se inyectan conjuntamente en
un animal, el ratn muere como resultado de una
infeccin por Pneumococcus. Las bacterias S virulen-
tas pueden ser recuperadas del ratn muerto.
1.2 El DNA es el material gentico de las bacterias
Transtormacion de bacterias
Inyeccin
Tipos de Pneumococcus
de c|u|as Resultado
Con cpsula,
de aspecto
liso (S)
\
Bacteria S viva
Bacteria S muerta
/
Sin cpsula,
de aspecto
rugoso (R)
Bacteria R viva
v,ve
Qi
Bacteria S muerta
y bacteria R viva
Ni las bacterias tipo S asesinadas con calor ni las
bacterias tipo R vivas pueden matar a los ratones, pero la inyec-
cin simultnea de ambos tipos de bacterias pueoe matar a los
ratones de forma tan efectiva como la oacteria tipo S viva.
El pnnctpio transformante es el DNA
1
Ratn inyectado con
bacterias S muertas
y R vivas
Bacterias S vivas
recuperadas del
ratn muerto
Se extrae
el DNA
Bacteria R
Transformacin
Bacteria S
El DNA de la bacteria de tipo S puede transformar
a la bacteria de tipo R en el mismo tipo S.
En este experimento, las bacterias S muertas
fueron de tipo III y las R vivas, de tipo II. La cu-
bierta de las bacterias virulentas recuperadas de la
infeccin mixta era lisa, de tipo III, por lo tanto,
alguna propiedad de las bacterias S tipo III, muertas,
puede transformar a las bacterias R, induciendo la
formacin del polisacrido capsular tipo III, que las
torna virulentas.
En la se muestra la identificacin del
componente de las bacterias muertas responsable de
la transformacin, el cual se denomin principio
transformante, que se purific desarrollando un
sistema libre de clulas, en donde los extractos de
las bacterias S muertas podan agregarse a las bac-
terias R vivas antes de ser inyectadas al animal. En
1994, mediante la purificacin del principio trans-
formante, se demostr que ste es cido desoxirri-
bonucleico (DNA. deoxyribonudeic acid).
Itl EL DNA es eL materiaL gentico
de Los virus
Concepto principal
La infeccin por fagos demostr que el DNA es el
material gentico de los virus. Cuando el DNA y los
componentes protenicos de los bacterifagos sor
marcados con diferentes istopos radioactivos, slo el
DNA es transmitido a la progenie de fagos producida
por las bacterias infecciosas.
Una vez que se comprob que el DNA es el mate-
rial gentico de las bacterias, el siguiente paso fue
demostrar que el DNA proporciona el material ge-
ntico en un sistema bastante diferente. El fago 12
es un virus que infecta a la bacteria Escherichia coli.
Cuando las partculas del fago (virus) se agregan
a las bacterias, stas se adsorben en la superficie
exterior, parte del material entra en la bacteria y, al
cabo de -20 min, cada bacteria explota (se lisa) para
liberar una numerosa progenie de fagos.
En la FIGURA i.5 se ilustran los resultados de un
experimento realizado en 1952 en el cual se infec-
taron bacterias con fagos T2, los cuales haban sido
marcados radioactivamente en su componente de
DNA (con "P) o en su componente protenico (con
5,S). Las bacterias infectadas se mezclaron en una
licuadora y dos fracciones se separaron por centrifu-
gacin. Una de stas contena las cubiertas de fagos
vacas liberadas de la superficial de la bacteria, en
tanto que la otra estaba formada por las bacterias
infectadas.
*
Gran parte del marcador 32P se encontr en las
bacterias infectadas. Las partculas de la progenie de
fagos producidas por la infeccin contenan -30%
del marcador 32P original. La progenie recibi una
cantidad muy pequea, menos del 1 %, de la prote-
na contenida en la poblacin original de fagos. Las
cubiertas de fago estaban formadas por protenas, y
por lo tanto portaban el marcador radioactivo 35S.
As pues, con este experimento se demostr direc-
tamente que slo el DNA de los fagos progenitores
entra en las bacterias y que despus formar parte
de los fagos de la progenie, exactamente el patrn de
herencia que se espera del material gentico.
N del T: este prrafo implica que los virus fueron marcados en
un componente o en otro (pero no en los dos), mientras que la
descripcin de los resultados sugiere que tanto un componente
como el otro fueron marcados.
CAPTULO 1 Los genes son DNA
Slo el DNA es heredado por la progenie de fagos
La transfeccion Induce DNA nuevo en las clulas
Se infecta a la bacteria con
fagos marcados DNA marcado
conKP W
II
Proteina -T
marcada con ,5S
Se separan las cubiertas de los
fagos de la bacteria infectada
Las cubiertas de .
los fagos contienen I
80% riel marcador Se aislan las partculas
KS de la progenie de fagos
Las bacterias
infectadas
contienen
70% del
marcador
Los fagos de la
progenie
tienen 30% del
marcador MP
y<l%del
marcador 35S
FIGURA 1.5 El material gentico del fago T2 es el DNA.
Las clulas que carecen del gen TK no pueden
producir timidlna clnasa y mueren sin timidina
Clulas muertas
Adicin de DNA TK
Clulas vivas
Colonia
de clulas TK
Algunas clulas incorporan al gen TK; los descendientes
de una clula sometida a transfeccin se agrupan en una colonia
FIGURA 1.6 Las clulas eucariotas pueden adquirir un fenotipo
nuevo como resultado de la transfeccin por adicin de DNA.
Un fago se reproduce ordenando a la maquina-
ria de una clula hospedadora infectada que pro-
duzca ms copias de s misma. El fago posee ma-
terial gentico cuyo comporiamicnio es anlogo al
de los genomas celulares: sus rasgos son fielmente
reproducidos y estn sujetos a las mismas reglas que
gobiernan la herencia. El caso de los T2 refuerza la
conclusin general de que el material gentico es
el DNA, ya sea que forme parte del genoma de una
clula o de un virus.
WM EL DNA es el material gentico
de Las cLulas animaLes
Conceptos principales
.
El DNA puede ser utilizado para introducir nuevas
caractersticas genticas en clulas animales o en
animales completos.
.
En algunos virus, el material gentico es RNA.
Cuando se agrega DXA a poblaciones de clulas eu-
cariotas individuales en cultivo, el cido nucleico
entra a las clulas, lo cual, en algunas, resulta en la
produccin de protenas nuevas. Cuando se utiliza
DNA purificado, su incorporacin da lugar a la pro-
duccin de una protena en particular. En la FIGURA
1.6 se representa uno de los sistemas estndar.
Aunque por razones histricas estos experi-
mentos se describen como transfeccin cuando
son realizados con clulas eucariotas, constituyen
una contraparte directa de la transformacin bacte-
riana. El DNA introducido en la clula receptora se
incorpora a su material gentico y es heredado en la
misma forma que cualquier otra parte. Su expresin
confiere un nuevo rasgo a las clulas (sntesis de
timidina-cinasa en el ejemplo de la Figura 1.6). En
un principio, estos experimentos slo tuvieron xito
con clulas individuales adaptadas para crecer en un
medio de cultivo, pero desde entonces, el DNA ha
sido introducido en vulos de ratn por microin-
yeccin, y puede llegar a ser una pane estable del
material gentico del animal.
Dichos experimentos muestran directamente
no slo que el DNA es el material gentico de las
eucariotas, sino tambin, que puede ser transferido
entre especies diferentes y seguir siendo funcional.
El material gentico de todos los organismos
conocidos y de numerosos virus es el DXA. No
obstante, algunos virus usan un tipo alternativo de
cido nucleico, el ribonucleico (RNA, ribonucleic acid),
como material gentico. El principio general de la
naturaleza del material gentico, por lo tanto, es
que siempre es cido nucleico; de hecho, es DNA,
excepto en los virus do RNA.
1.
4 El DNA es el material gentico de las clulas animales
BU Los poLinucLetidos tienen
bases nitrogenadas Ligadas a
un esqueleto de azcar-fosfato
Conceptos principales
.
Un nuclesido est formado por una base prica o
pirimdica ligada a un azcar pentosa en la posicin 1.
.
Las posiciones en el anillo de ribosa se describen con
el smbolo (
'
) para distinguirlas.
.
La diferencia entre el DNA y el RNA radica en el gruoo
localizado en la posicin 2' del azcar. El DNA tiene un
azcar desoxirribosa (2
'
-
H) y el RNA, un azcar ribosa
(2'-0H).
.
Un nucletido consta de un nuclesido ligado
a un grupo fosfato en la posicin 5
'
o 3' de la
(desoxi)ribosa.
.
Los residuos sucesivos de (desoxi)ribosa de un
polinucletido estn unidos por un grupo fosfato
entre la posicin 3
'
de un azcar y la posicin 5' de la
siguiente.
.
Un extremo de la cadena (convencionalmente el
izquierdo) tiene una punta 5' libre y en el otro, una
punta 3
'
libre.
.
El DNA contiene las cuatro bases, adenina, guanina,
citosina y timina; el RNA posee uracilo en vez de
timina.
El componente bsico de los cidos nucleicos es el
nucletido, que tiene tres componentes:
.
una base nitrogenada,
.
un azcar y
.
un fosfato.
La base nitrogenada es un anillo de purina o de
pirimidina. La base est ligada a la posicin 1 en una
pentosa por medio de un enlace glucosdico del N,
de las pirimidinas o el N
9
de la purinas. Para evitar
ambigedades entre los sistemas de numeracin de
los anillos heterocclicos y del azcar, a las posicio-
nes de la pentosa se agrega un smbolo (
'
).
Los cidos nucleicos son nombrados segn el
tipo de azcar que contienen; el DNA posee 2'-des-
oxirribosa, mientras que el RNA tiene ribosa. La di-
ferencia radica en que el azcar del RNA tiene un
grupo 011 en la posicin 2
'
del anillo de pentosa. El
azcar puede ligarse en las posiciones 5
'
o 3' a un
grupo fosfato.
Un cido nucleico consiste en una cadena larga
de nucletidos. En la FIGURA 1.7 se muestra que el
esqueleto de la cadena polinucleotdica consta de
series alternas de residuos de fosfato y de pemosa
(azcar) a travs de la unin de la posicin 5' de
un anillo de pentosa con la posicin 3
'
del siguiente
anillo de pentosa mediante un grupo fosfato. Por
eso se dice que el esqueleto de azcar-fosfato con-
siste en enlaces 5
'
-3' fosodister. Las bases nitro-
genadas "sobresalen
"
del esqueleto.
Cada cido nudeico contiene cuatro tipos de ba-
ses. I-as mismas dos purinas, adenina y guanina, estn
presentes tanto en el DNA como en el RNA. Las dos
pirimidinas del DNA son citosina y timina; en el RNA
se encuentra uracilo, en vez de timina. La nica dife-
rencia entre el uracilo y la timina es un grupo metilo
suplantador en la posicin C
,
.
Las bases suelen nom-
brarse por sus iniciales. El DNA contiene A, G, C y T;
el RNA contiene A, G, C y U.
El nucletido terminal de un extremo de la ca-
dena tiene un grupo 5' libre; el nucletido terminal
del otro extremo tiene un grupo 3' libre. Se ha con-
venido en escribir las secuencias de cido nucleico
en direccin 5
'
a 3', es decir, del extremo 5' de la
izquierda al extremo 3' de la derecha.
ID EL DNA es una hlice dplex
Conceptos principales
.
La forma B del DNA es una hlice dplex formada por
dos cadenas polinucleotdicas antiparalelas.
.
Las bases nitrogenadas de cada una son anillos planos
de purina o pirimidina orientados hacia el interior y
que se aparean mediante puentes de hidrgeno para
formar nicamente pares de A-T y G-C.
.
El dimetro de la hlice dplex es de 20 , y cada 34
hay una vuelta completa, con diez pares de bases por
vuelta.
.
La hlice dplex forma un surco principal profundo
(ancho) y uno menor (angosto).
La observacin de que las cantidades de bases pre-
sentes en los DNA vara segn la especie, condujo
al concepto de que la secuencia de bases es la forma en
que se pona la informacin gentica. Hacia la dcada de
1950, el concepto de informacin gentica era co-
mn: el par de problemas que planteaba era determi-
nar la estructura del cido nucleico y explicar cmo
una secuencia de bases del DNA poda representar la
secuencia de aminocidos de una protena.
Tres nociones convergieron en la construccin
de un modelo de hlice dplex del DNA, desarro-
llado por Wat son y Crick en 1953:
.
Los dalos de la difraccin de los rayos X de-
mostraron que el DNA tiene la forma de una
hlice regular que da un giro completo cada
34 (3.4 nm), con un dimetro de -20
(2 nm). Como la distancia entre nucletidos
adyacentes es de 3.4 A, debe haber 10 nu-
cletidos por vuelta.
CAPTULO 1 Los genes son DNA
.
La densidad del DNA sugiere que la hlice
debe contener dos cadenas de polinucle-
tidos. El dimetro constante de la hlice
puede explicarse si las bases de cada cadena
apuntan hacia adentro y son restringidas de
manera que una purina siempre se oponga
a una pirimidina, evitando asociaciones pu-
rina-purina (demasiado ancha) o pirimidi-
na-pirimidina (demasiado angosta).
.
Independientemente de las cantidades ab-
solutas de cada base, la proporcin de G es
siempre igual a la de C en el DNA, y la pro-
porcin de A siempre es la misma que la de
T
, de manera que la composicin de cual-
quier DNA puede describirse por la propor-
cin de sus bases, es decir, G + C, que flucta
entre 26 y 74% en diferentes especies.
Watson y Crick propusieron que las dos cadenas
polinucleotdicas de la hlice dplex se relacionan
mediante puentes de hidrgeno entre as bases nitroge-
nadas. La G puede formar puentes de hidrgeno
especficamente slo con la C, y la A, slo con la T.
Estas reacciones se describen como apareamiento
de bases, y se dice que las bases apareadas (G con
C o A con T)
'
son complementarias.
El modelo propona que las dos cadenas polinu-
cleotdicas corren en direcciones opuestas (antipa-
ralelas), como se ilustra en la FIGURA 1.8. Observan-
do a lo largo de la hlice, una cadena va en direccin
5' a 3
'
, mientras que su pareja corre de 3' a 5'.
El esqueleto de azcar-fosfato est en la parte
exterior y porta cargas negativas en los grupos fos-
fato. En solucin in vitro, las cargas del DNA se neu-
tralizan por la unin de iones metlicos, tpicamente
Na*. En la clula, las protenas con carga positiva
proporcionan parte de la fuerza neutralizante. Estas
protenas desempean una funcin importante en
la determinacin de la organizacin del DNA en la
clula.
Las bases se encuentran en el interior; son es-
tructuras planas, en pares perpendiculares al eje de
la hlice. Considrese la hlice dplex como una
escalera espiral: los pares de bases forman los es-
calones, como se ilustra esquemticamente en la
FIGURA 1.9. Al ir avanzando por la hlice, las bases
estn una sobre otra, como una pila de platos.
Cada par de bases gira -36 en tomo al eje de la
hlice, respecto del siguiente par de bases, de modo
que ~ 10 pares de bases forman una vuelta completa
de 360. La torsin de las cadenas sobre s mismas
forma una hlice dplex con un surco menor (-12
A de ancho) y un surco mayor (-22 de ancho),
como puede observarse en el modelo a escala de
la FIGURA 1.10. La hlice dplex es dextrgira, es
decir, que gira en la direccin de las manecillas del
Un polinucleolido tiene una estructura repetitiva
Nucletido
Esque eto de

azcar-fosfato H2
Enlaces
fosfodlster 5'-3'
Base pirimdlca
Base prica
Una cadena polinucLeotdica est formada por una
serie de enlaces azcar-fosfato 5
'
-
3
'
que forman un esqueleto
con las bases promirertes.
La hlice dplex tiene un grosor constante
Puentes de hidrgeno
H
H,C ,Q H-N
-
H O
H-NG V
N
EnuaMa
Bzear-ramdo
H N
Los (slalos
tienen cargas
negativas
O-H-N H
S
H
El interior es hidrfobo
I La hlice dplex mantiene un grosor constante porque las
purinas siempre enfrentan a la pirimidinas en los pares de bases com-
plementarios A-T y G-C. La secuencia que se ilustra en la figura es T-A,
C-G
,
A-T, G-C.
1.6 El DNA es una hlice dplex
7
Los pares de bases planos conectan
a las cadenas del DNA
\
e2
Azcar Base Fosfato
Los pares de bases planos yacen perpendicular-
mente al esqueleto de azcar-fosfato.
FIGURA 1.1: Las dos cadenas del DNA forman una hlice d-
plex. Fotografa * Photodisc.
reloj observada a lo largo del eje helicoidal. Estas
caractersticas representan el modelo aceptado para
lo que se conoce como forma B del DIS'A.
Es importante percatarse de que la forma B re-
presenta un promedio, no una estructura especifica-
da con toda precisin, pues la estructura del DNA
puede cambiar localmcnte. Si tiene ms pares de
bases por vuelta se dice que est sohregirada, de lo
contrario, ser laxa. La torcin local puede ser afec-
tada por la conformacin global de la hlice dplex
del DNA en el espacio o por la unin de protenas
en sitios especficos.
BW1 La duplicacin del DNA
es semiconservadora
Conceptos principales
.
En el experimento de Meselson-Stahl se utiliz
mareaje de densidad para demostrar que la cadena
polinucleotdica individual es la unidad del DNA que se
conserva durante La duplicacin.
.
Cada cadena de un DNA dplex (o DNA duplohelicoidal,
DNA de doble cadena o DNA de doble banda) hace las
veces de molde para sintetizar una cadena hija.
.
Las secuencias de las cadenas hijas dependen del
apareamiento complementario de las bases con las
cadenas progenitoras separadas.
Es crucial que el material gentico se reproduzca
con exactitud. Las dos cadenas polinucleotdicas es-
tn unidas slo por puentes de hidrgeno, de modo
que pueden separarse sin necesidad de romper en-
laces covalentes. La especificidad del apareamien-
to de bases sugiere que cada una de las cadenas
progenitoras separadas puede hacer las veces de
cadena molde para la sntesis de una cadena hija
complementaria. En la FIC se representa el
principio de que una nueva cadena hija es ensam-
blada en cada cadena progenitora. La secuencia de
la cadena hija es dictada por la cadena progenitora;
una A en la cadena progenitora ocasiona la coloca-
cin de una Ten la cadena hija, en tanto que una G
progenitora provoca la incorporacin de una Chija,
y as sucesivamente.
En la parte superior de la Figura 1.11 se mues-
tra un dplex progenitor (no replicado) formado
por las dos cadenas progenitoras originales. La parte
inferior muestra las dos dplex hijas que estn sien-
do producidas por el apareamiento complementario
de bases. Cada una de las dplex hijas es idntica
en secuencia original y contiene una cadena proge-
nitora y una cadena recientemente sintetizada. La
CAPTULO 1 Los genes son DNA
El apareamiento de bases determina la especificidad
de la duplicacin
Las cadenas Individuales del DNA son las unidades conservadas
Cadena hija
Las cadenas
-progenitoras
se desenrollan
\
Cadena hija
FISURA 1.1 El apareamiento de bases proporciona el meca-
-
mo necesario para la duplicacin del DNA.
csTructura del DNA porta la informacin necesaria para
perpetuar su secuencia.
Las consecuencias de este modo de duplicacin
se ilustran en la FIGURA l.l. . El dplex progenitor
te replica para formar dos dplex hijos, cada uno de
s cuales est formado por una cadena progenitora
y una cadena hija (de sntesis reciente). La unidad
fue se conserva de una generacin a la siguiente es una de
-r
.
-
.
ios cadenas individuales que forman el dplex proge-
. Oste comportamiento se conoce como dupli-
cacin semiconservadora.
En la Figura 1.12 se ilustra una prediccin de
rste modelo. Si el DNA progenitor porta un mar-
eaje de densidad "pesada" porque el organismo ha
-
i" cultivado en un medio que contiene un istopo
adecuado (como 15N) (N del T: en otras bibliogra-
fas aparece como N15,
el resto de los marcadores
-
endonados en este captulo tambin aparecen con
el nmero despus de la letra p. ej., P52 y S"), sus
cadenas pueden ser distinguidas de las sintetizadas
cuando el organismo es transferido a un medio que
enmenga istopos "ligeros" normales.
El DNA progenitor consiste en un dplex de dos
i denas pesadas (rojas). Despus de una generacin
i- crecimiento en medio li
gero, el DNA dplex es
'
hbrido" en cuanto densidad, o sea que est forma-
do por una cadena progenitora pesada (roja) y por
--
-
cadena hija ligera (azul). Despus de la segunda
generacin, las dos cadenas de cada dplex hbrido
se han separado. Cada una adquiere a una pareja
igera. de tal forma que la mitad de los DNA dplex
DNA progenitor
Generacin 1
Duplicacin
en medio
de densidad
ligera
PESADO
HBRIDO
HBRIDO
Anlisis de densidad
Generacin 2
HBRIDO
LIGERO
LIGERO
HBRIDO
--
Ligero
Hbrido Hbrido Hbrido
Pesado Pesado
-
Pesado
La duplicacin del DNA es semiconservadora.
siguen siendo hbridos y la otra mitad es completa-
mente ligera (ambas cadenas son azules).
Las cadenas individuales de estos dplex son comple-
tamente pesadas o completamente ligeras. Este patrn se
confirm experimentalmente en la prueba de Me-
selson-Stahl en 1958, que sigui a la duplicacin
semiconservadora del DNA a travs de tres genera-
ciones de crecimiento de E. coli. Cuando el DNA fue
extrado de las bacterias y su densidad se midi por
centrifugacin, el DNA form bandas correspon-
dientes a su densidad, pesada en las progenitoras,
hbrida en la primera generacin, y mitad hbrida y
mitad ligera en la segunda generacin.
Las cadenas deL DNA se separan
en la horquilla de duplicacin
Conceptos principales
.
La duplicacin del DNA es llevada a cabo por un
complejo de enzimas que separan las cadenas
progenitoras y sintetizan las cadenas hijas.
.
La horquilla de duplicacin es el punto en que se
separan las cadenas progenitoras.
.
Las enzimas que sintetizan el DNA se llaman DNA
polimerasas; las enzimas que sintetizan el RNA se
conocen como RNA polimerasas.
.
Las nucleasas son enzimas que degradan a los cidos
nucleicos; incluyen DNAsas y RNAsas, y pueden
dividirse en endonucleasas y en exonucleasas.
La duplicacin exige la separacin de las dos cade-
nas de un dplex progenitor; sin embargo, el rom-
pimiento de la estructura es transitorio, y se revierte
conforme se forma el dplex hijo. En algn mo-
1.8 Las cadenas del DNA se separan en la horquilla de duDlicacin
Una horquilla de duplicacin se mueve a lo largo del DNA
Molculas de DNA replicadas
Horquilla de duplicacin
DNA progenitor
La horquilla de duplicacin es la regin del DNA
en la cual hay una Iransicin del dplex progenitor desenrolla-
do a los dplex hijos recientemente replicados.
Las endonucleasas atacan a los enlaces internos
Enlace roto
FIGURA 1.1 Una endonucleasa divide a un enlace en un cido
nucleico. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca a
una cadena de un DNA dplex.
Las exonucleasas mordisquean desde los extremos
RGURA l.i Una exonucleasa elimina bases
,
una a la vez,
dividiendo el ltimo enlace de una cadena pol:nucleotdica.
ment, slo un tramo pequeo del DNA dplex se
separa en cadenas individuales.
La estructura helicoidal de una molcula de
DNA dedicada a la duplicacin se ilustra en la FIGU-
RA l.i . La regin no replicada es el dplex proge-
nitor que se abre hada la regin replicada, donde
se han formado los dos dplex hijos. La estructura
helicoidal doble se rompe en la unin entre las dos
regiones, llamada horquilla de duplicacin. La
duplicacin implica el movimiento de la horqui-
lla de duplicacin a lo largo del DNA progenitor, de
modo que hay un desenrollamiento continuo de las
cadenas progenitoras y un enrollamiento de los d-
plex hijos.
La sntesis de cidos nucleicos es catalizada por
enzimas especficas, las cuales reconocen el molde
y emprenden la tarea de catalizar la adicin de sub-
unidades a la cadena poliniuieotdica que est sien-
do sintetizada. Las enzimas se nombran segn el
tipo de cadena que sintetizan: las DNA polimera-
sas sintetizan DNA, las RNA polimerasas, RNA.
La degradacin de los cidos nucleicos tambin re-
quiere de enzimas especficas: las desoxirribo-
nucleasas (DNAsas) degradan al DNA y las ribonu-
cleasas (RNAsas) degradan al RNA. Las nucleasas
se incluyen en las clases generales de exonuclca-
sas y endonucleasas:
. Las endonucleasas cortan enlaces individua-
les en el interior de las molculas de DNA y
de RNA y generan fragmentos discretos. Al-
gunas DNAsas dividen ambas cadenas de un
DNA dplex en el sitio diana, mientras que
otras dividen slo una de ellas. Las endo-
nucleasas participan en reacciones de corte,
como se observa en la RGURA L14.
.
Las cxonucleasas eliminan los residuos, uno
a uno, a partir del extremo de la molcula, y
generan mononucletidos. Siempre actan
en una sola cadena de cido nucleico, y cada
exonucleasa avanza en una direccin espec-
fica, es decir, empieza en un extremo 5' o 3'
para dirigirse hacia el otro. Estn involucra-
das en reacc iones de ajuste, como se muestra
en la FIGURA 1.15.
La informacin gentica puede
ser proporcionada por eL DNA
o el RNA
Conceptos principales
.
Los genes celulares son DNA, pero los virus y los
viroides pueden tener genomas de RNA.
.
El DNA se convierte en RNA por transcripcin, y el RNA
puede convertirse en DNA por transcripcin inversa.
.
La traduccin del RNA a protena es unidireccional.
El dogma central define el paradigma de la biologa
molecular. Los genes se perpetan como secuencias
de cido nucleico, si bien actan al ser expresados
en forma de protenas. La duplicacin es respon-
sable (Ir la herencia de la informacin gentica. La
transcripcin y la traduccin son responsables de la
conversin de una forma a otra.
En la flGURA 1.16 se ilustran las funciones de la
duplicacin, la transcripcin y la traduccin desde
la perspectiva del dogma central:
.
!.a perpetuacin del cido nucleico suele implicar
al DNA o el RNA como el material gentico. Las
clulas utilizan nicamente DNA, en tanto
que algunos virus usan RNA, y la duplica-
CAPTULO 1 Los genes son DNA
El dogma central describe el flujo de la informacin
Duplicacin
[Transcripcin)
V/X/ "NA ...
Duplicacin |
[ Traduccin]
Protena
Transcripcin
inversa
Los cidos nucleicos se replican por medio
de cadenas complementarias
FIGURA 1.16 El dogma central manifiesta que la informa-
cin del cido nucleico puede ser perpetuada o transferida,
s;n embargo la transferencia de la informacin a protenas es
.
reversible.
cin del RNA vrico ocurre en la clula in-
fectada.
.
La expresin de a informacin gentica celular
suele ser unidireccional. La transcripcin del
DNA genera molculas de RNA que nica-
mente pueden ser utilizadas otra vez para
generar secuencias de protenas; en general
no pueden recuperarse para usarlas como
fuente de informacin gentica. La traduc-
cin del RNA a protena siempre es irrever-
sible.
Estos mecanismos son igualmente efectivos
para la informacin geniica celular de procario-
tas o eucariotas y para la informacin transportada
por los virus. Los genomas de todos los organismos
vivos estn formados por DNA dplex. Los virus
poseen genomas de DNA o RNA, y de cada tipo hay
ejemplos de doble cadena (ds, double stranded) o de
cadena nica (ss, single stranded). Los detalles del
mecanismo de replicacin del cido nucleico varan
entre los diferentes sistemas vricos, pero el princi-
pio de duplicacin por sntesis de cadenas comple-
mentarias sigue siendo el mismo, segn se ilustra
en la FIGURA 1.17.
Los genomas celulares reproducen el DNA por
el mecanismo de duplicacin semiconservadora. Los
genomas vricos de doble cadena, sean de DNA o
RNA, tambin se replican utilizando como molde
5 cadenas individuales del dplex para sintetizar
as las cadenas complementarias.
Los virus con genomas de una sola cadena la
utilizan como molde para sintetizar una cadena
complementaria, la cual, a su vez, es utilizada para
Molde de doble
cadena
<
Cadena antigua
\yv/v
-
Cadenas nuevas
Cadena antigua
La duplicacin genera dos dplex hijos, cada uno de los
cuales contiene una cadena progenitora y una cadena
fabricada recientemente
Molde de cadena
individual
A/V W\
La cadena progenitora individual La cadena complementaria es
es utilizada para sintetizar una utilizada para sintetizar una copia
cadena complementaria de la cadena progenitora
FIGURA 1.1 Los cidos nucleicos, tanto los de doble cadena
como los de cadena individual, se reolican por la sntesis de
cadenas complementarias regida por las reglas del apareamien-
to de bases.
sintetizar a su complemento, que, por supuesto, es
idntico a la cadena original inicial. La duplicacin
puede implicar la formacin de intermediarios es-
tables de doble cadena o utilizar cido nucleico de
doble cadena slo como una lase transitoria.
La restriccin de la transferencia unidireccional
de DNA a RNA no es absoluta, ha sido superada por
los retrovirus, cuyos genomas estn formados por
molculas de RNA de una sola cadena. Durante el
ciclo infeccioso, el RNA se convierte en una cadena
nica de DNA por el proceso de transcripcin in-
versa; dicha cadena, a su vez, es convertida en un
DNA de doble banda. Este DNA dplex se convier-
te en parte del genoma de la clula y es heredado
como cualquier otro gen, de manera que la transcrip-
cin inversa permite que una secuencia de RNA sea recu-
perada y utilizada como informacin gentica.
La existencia de la duplicacin del RNA y de la
transcripcin inversa establece el principio general
de que la informacin en cualquier tipo de secuencia de
cido nucleico puede convertirse en el otro tipo. Sin em-
bargo, en el curso normal de los hechos, la clula
depende de los procesos de duplicacin, transcrip-
cin y traduccin del DNA. No obstante, alguna
vez la informacin de un RNA celular se convierte
en DNA y se inserta en el genoma (evento posi-
blemente mediado por un virus RNA). Aunque la
transcripcin inversa no participa en las operaciones
regulares de la clula, llega a ser un mecanismo po-
tencialmente importante cuando se analiza la evo-
lucin del genoma.
1.9 La informacin gentica puede ser proporcionada por el DNA o el RNA
Una horquilla de duplicacin se mueve a lo largo del ONA
DNArephcadasI
DNA progeml
DNA progenitor
Molculas de DNA replicadas
Horquilla de duplicacin
FIGURA 1.1 La horquilla de duDlicacin es la regin del DNA
en la cual hay una transicin del dplex progenitor desenrolla-
do a los dplex hijos recientemente replicados.
Las endonucleasas atacan a los enlaces internos
Enlace roto
1.14 Una endonucleasa divide a un enlace en un cido
nucleico. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca a
una cadena de un DNA dplex.
Las exonucleasas mordisquean desde los extremos
FIGURA 1.1 Una exonucleasa elimina bases
,
una a la vez,
dividiendo el ltimo enlace de una cadena polinucleotdica.
ment, slo un tramo pequeo del DNA dplex se
separa en cadenas individuales.
La estructura helicoidal de una molcula de
DNA dedicada a la duplicacin se ilustra en la FIGU-
RA i.i . La regin no replicada es el dplex proge-
nitor que se abre hacia la regin replicada, donde
se han formado los dos dplex hijos. La estructura
helicoidal doble se rompe en la unin entre las dos
regiones, llamada horquilla de duplicacin. La
duplicacin implica el movimiento de la horqui-
lla de duplicacin a lo largo del DNA progenitor, de
modo que hay un desenrollamiento continuo de las
cadenas progenitoras y un enrollamiento de los d-
plex hijos.
La sntesis de cidos nucleicos es catalizada por
enzimas especficas, las cuales reconocen el molde
y emprenden la tarea de catalizar la adicin de sub-
unidades a la cadena polinucleotdica que est sien-
do sintetizada. Las enzimas se nombran segn el
tipo de cadena que sintetizan: las DNA polimera-
sas sintetizan DNA, las RNA polimerasas, RNA.
La degradacin de los cidos nucleicos tambin re-
quiere de enzimas especficas: las desoxirrlbo-
nucleasas (DNAsas) degradan al DNA y las ribonu-
cleasas (RNAsas) degradan al RNA. Las nucleasas
se incluyen en las clases generales de exonuclea-
sas y endonucleasas:
.
Las endonucleasas cortan enlaces individua-
les en el interior de las molculas de DNA y
de RNA y generan fragmentos discretos. Al-
gunas DNAsas dividen ambas cadenas de un
DNA dplex en el sitio diana, mientras que
otras dividen slo una de ellas. Las endo-
nucleasas participan en reacciones de corte,
como se observa en la FIGURA i.u.
.
Las exonucleasas eliminan los residuos, uno
a uno, a partir del extremo de la molcula, y
generan mononucletidos. Siempre actan
en una sola cadena de cido nucleico, y cada
exonucleasa avanza en una direccin espec-
fica, es decir, empieza en un extremo 5' o ?'
para dirigirse hacia el otro. Estn involucra-
das en reacciones de ajuste, como se muestra
en la FIGURA 1.15.
La informacin gentica puede
ser proporcionada por el DNA
o el RNA
Conceptos principales
.
Los genes celulares son DNA, pero los virus y los
viroides pueden tener genomas de RNA.
.
El DNA se convierte en RNA por transcripcin, y el RNA
puede convertirse en DNA por transcripcin inversa.
.
La traduccin del RNA a protena es unidireccional.
El dogma central define el paradigma de la biologa
molecular. Los genes se perpetan corno secuencias
de cido nucleico, si bien actan al ser expresados
en forma de protenas. La duplicacin es respon-
sable de la herencia de la informacin gentica. La
transcripcin y la traduccin son responsables de la
conversin de una forma a otra.
En la ' IGURA 1.16 se ilustran las funciones de la
duplicacin, la transcripcin y la traduccin desde-
la perspectiva del dogma central:
.
La perpetuacin del cido nucleico suele implicar
al DNA o el RNA como el material gentico. Las
clulas utilizan nicamente DNA, en tanto
que algunos virus usan RNA, y la duplica-
CAPTULO 1 Los genes son DNA
El dogma central describe el flujo de la Informacin
DNA <
Duplicacin L
[Transcripcin]
Duplicacin
T
RNA
1
Transcripcin
Inversa
[Traduccin]
I
ffifc? Protena
FIGURA 1.16 El dogma central manifiesta que la informa-
ron del cido nucleico puede ser perpetuada o transferida,
rn embargo la transferencia de la informacin a protenas es
Reversible
.
cin del RNA vrico ocurre en la clula in-
fectada.
.
La expresin de la informacin gentica celular
suele ser unidireccional. La transcripcin del
DNA genera molculas de UNA que nica
mente pueden ser utilizadas otra vez para
generar secuencias de protenas; en general
no pueden recuperarse para usarlas como
fuente de informacin gentica. La traduc-
cin del RNA a protena siempre es irrever-
sible.
Estos mecanismos son igualmente efectivos
para la informacin gentica celular de procario-
B 0 eucariotas y para la informacin transportada
por los virus. Los genomas de rodos los organismos
vivos estn formados por DNA dplex. Los virus
poseen genomas de DNA o RNA, y de cada tipo hay
ejemplos de doble cadena (ds, double slranded) o de
cadena nica (ss, single stranded). Los detalles del
mecanismo de replicacin del cido nucleico varan
entre los diferentes sistemas vricos, pero el princi-
pio de duplicacin por sntesis de cadenas comple-
mentarias sigue siendo el mismo, segn se ilustra
en la FIGURA 1.17.
Los genomas celulares reproducen el DNA por
el mecanismo de duplicacin semiconservadora. Los
genomas vricos de doble cadena, sean de DNA o
RNA, tambin se replican utilizando como molde
:
cadenas individuales del dplex para sintetizar
as las cadenas complementarias.
Los virus con genomas de una sola cadena la
utilizan como molde para sintetizar una cadena
complementaria, la cual, a su vez, es utilizada para
Los cidos nucleicos se replican por medio
de cadenas complementarias
Molde de doble _
cadena //\Ji/\/ Cadena antigua
W&W-% } Cadenasnuevas
\y \/ * Cadena antigua
La duplicacin genera dos dplex hijos, cada uno de los
cuales contiene una cadena progenltora y una cadena
fabricada recientemente
Molde de cadena
individual
\AA-
v
A/V -W\
La cadena progenilora individual La cadena complementarla es
es utilizada para sintetizar una utilizada para sintetizar una copia
cadena complementaria de la cadena progenltora
FIGURA 1.17 Los cidos nucleicos, tanto los de doble cadena
como los de cadena indiv
'
dual, se replican por la sntesis de
cadenas complementarias regida por las reg
'
as del apareamien-
to de bases.
sintetizar a su complemento, que, por supuesto, es
idntico a la cadena original inicial. La duplicacin
puede implicar la formacin de intermediarios es-
tables de doble cadena o utilizar cido nucleico de
doble cadena slo como una lase transitoria.
La restriccin de la transferencia unidireccional
de DNA a RNA no es absoluta, ha sido superada pol-
los retrovirus, cuyos genomas estn formados por
molculas de RNA de una sola cadena. Durante el
ciclo infeccioso, el RNA se conviene en una cadena
nica de DNA por el proceso de transcripcin in-
versa; dicha cadena, a su vez, es convertida en un
DNA de doble banda. Este DNA dplex se convier-
te en pane del genoma de la clula y es heredado
como cualquier otro gen, de manera que la transcrip-
cin inversa permite que una secuencia de RNA sea recu-
perada y utilizada como informacin gentica.
La existencia de la duplicacin del RNA y de la
transcripcin inversa establece el principio general
de que la informacin en cualquier tipo de secuencia de
cido nucleico puede convertirse en el otro tipo. Sin em-
bargo, en el curso normal de los hechos, la clula
depende de los procesos de duplicacin, transcrip-
cin y traduccin del DNA. No obstante, alguna
vez la informacin de un RNA celular se convierte
en DNA y se inserta en el genoma (evento posi-
blemente mediado por un virus RNA). Aunque la
transcripcin inversa no participa en las operaciones
regulares de la clula, llega a ser un mecanismo po-
tencialmente importante cuando se analiza la evo-
lucin del genoma.
1.9 La informacin gentica puede ser proporcionada por el DNA o el RNA
11
Los genomas varan enormemente en cuanto a tamao
Genoma Nmero de genes Pares de bases
Organismos
Plantas <50 000 clO
11
Mamferos 30 000 ~3x 109
Gusanos 14 000 -108
Moscas 12 000 1.
6 x 108
Hongos
6 000 1
.
3 x 107
Bacterias 2 1 000 <10
7
Micoplasma 500 <10
6
Virus DNAds
Vaccinia <300 187 000
Papova (SV40)
-6 5 226
Fago T4
-200 165 000
Virus DNAss
Parvovirus 5 5 000
FagofX174
11 5 387
Virus RNAds
Reovirus 22 23 000
Virus RNAss
Coronavirus 7 20 000
Influenza 1 13 500
TMV 4 6 400
Fago MS2
STNV
4 3 569
1 1 300
Viroidcs
PSTV RNA 0 359
FIGURA 1.11 La cantidad de cido nucleico del genoma varia
en un rango enorme, ds, doble cadena; ss, cadera nica.
Los mismos principios se aplican a la perpetua-
cin de la informacin gentica tamo en los geno-
mas enormes de plantas o anfibios como en los ge-
nomas diminutos del micoplasma y en la informa-
cin gentica an ms pequea de los virus de DNA
o RNA. En la FIGURA i.is se resumen algunos ejem-
plos de la gama de tipos y tamaos de los genomas.
En toda la gama de organismos, cuyo conteni-
do total de genomas vara en un rango superior a
las 100 000 veces, prevalece un principio comn:
el DNA codifica a todas las protenas que la(s) clula(s)
del organismo debe(n) sintetizar, y las protenas, a su vez
(directa o indirectamente), proporcionan las funciones
necesarias para la supervivencia. Mediante un princi-
pio similar se describe la funcin de la informacin
gentica de los virus, ya sea de DNA o RNA: el cido
nucleico codifica a la(s) protena(s) necesaria(s) para em-
paquetar al genoma y tambin para cualquier funcin
adicional a las proporcionadas por la clula hospedadora
necesaria para la reproduccin del virus durante su ciclo
infeccioso. (El virus ms pequeo, el virus satlite de
la necrosis del tabaco [STNV, satellite tobceo necrosis
virus], no puede replicarse de forma independiente,
requiere de la presencia simultnea de un virus
"
co-
operador
"
, el virus de la necrosis del tabaco (TNV,
tobceo necrosis virus], que por s mismo es un virus
normalmente infeccioso.)
Los cidos nucleicos
se hibridan por apareamiento
de bases
Conceptos principales
.
El calentamiento provoca que las dos cadenas de un
DNA dplex se separen.
.
La T
m
es el punto medio del rango de temperatura de
desnaturalizacin.
.
Las cadenas complementarias nicas pueden
renaturalizarse cuando se reduce la temperatura.
.
Puede haber desnaturalizacin y renaturalizacin/
hibridacin con combinaciones de ONA-DNA, DNA-
RNA o RNA-RNA, y pueden ser intermoleculares o
intramoleculares.
.
La capacidad de dos preparaciones de cido nucleico
de una sola cadena para hibridarse demuestra su
complementariedad.
Una propiedad clave de la hlice dplex es su ca-
pacidad para separar las dos cadenas sin afectar los
enlaces covalentes; esto hace posible dicha separa-
cin, y que se reformen en condiciones fisiolgicas a
la velocidad necesaria (muy rpida) para mantener
las funciones genticas. La especificidad del proceso
depende del apareamiento complementario de las
bases.
El concepto de apareamiento de las bases esfundamen-
tal para lodos los procesos relacionados con los cidos nuclei-
cos. La separacin de los pares de bases es un aspecto crucial
de la funcin de una molcula de doble cadena, mientras
que la capacidad para formar pares de bases lo es para
la actividad de un cido nucleico de cadena nica. En la
FIGURA 1.19 se muestra que el apareamiento de bases
permite que los cidos nucleicos complementarios de
cadena nica formen una estructura dplex.
.
Una regin dplex intramolecular puede
formarse por apareamiento de las bases
entre dos secuencias complementarias que
forman parte de una molcula de cadena
nica.
.
Una molcula de cadena nica puede apa-
rearse a travs de las bases con una molcula
de cadena nica, complementaria e inde-
pendiente, para formar un dplex intermo-
lecular.
La formacin de dominios dplex a partir de
cidos nucleicos de cadena nica es ms importante
para el RNA, pero tambin existe un DNA de cade-
na nica (en forma de genomas vricos). El aparea-
miento de las bases entre cadenas complementarias
nicas e independientes no est restringido a com-
binaciones DNA-DNA o RNA-RNA, tambin puede
ocurrir entre una molcula de DNA y una de RNA.
CAPTULO 1 Los genes son DNA
Tanto el DNA como el RNA pueden formar dplex El DNA puede desnaturalizarse y renaturallzarse
:
-
.a
Apareamiento
-
:ramolecjlar
aei RNA
DNA
RNA
Apareamiento \/\/\/\/ RNA lar90
termolecular entre \/\/ RNA corto
molculas cortas
y largas de RNA
.URA 1.19 El apareamiento de bases ocurre en los DNA
z.*. e incluso en las interacciones intermoleculares e intra-
.eculares del RNA (o del DNA) de cadena individual.
La carencia de enlaces covalentes entre cadenas
:
mplementarias permite manipular al DNA in vitro.
Las fuerzas no covalentes que estabilizan a la hlice
dplex se interrumpen por calentamiento o exposi-
cin a concentraciones bajas de sales. Las dos cade-
nas de la hlice dplex se separan completamente
-an
do se rompen todos los puentes de hidrgeno
que las unen.
El proceso de separacin de cadenas se llama
desnaturalizacin o (coloquialmcme) fusin. (El
trmino "desnaturalizacin" tambin se utiliza para
escribir la prdida de la estructura autntica de una
protena; es un trmino general que implica que la
p nfonnacin natural de una macromolcula se ha
transformado.)
La desnaturalizacin del DNA se presenta en un
rango limitado de temperatura y da lugar a cambios
'
.
.
rprendentes en muchas de sus propiedades fsicas.
El punto medio del rango de temperatura en que las
cadenas del DNA se separan se conoce como rempe-
raiura de fusin (T
m
, melting temperature), la cual de-
pende de la proporcin de pares de bases G-C. Como
cada uno de estos pares tiene tres puentes de hidr-
geno, es ms estable que un par de bases formado
por A-T, el cual slo cuenta con dos de dichos puen-
tes. Entre ms pares de G-C contenga el DNA, mayor
ser la cantidad de energa necesaria para separarlas
cadenas. En solucin y en condiciones fisiolgicas,
un DNA con 40% de puentes G-C, valor tpico de los
genomas de los mamferos, se desnaturaliza a una
aproximada de 870C, de modo que el DNA dplex
es estable a la temperatura de la clula.
La desnaturalizacin del DNA es reversible en
condiciones apropiadas. La capacidad de las dos
cadenas complementarias separadas para volver a
formar una hlice dplex se llama renaturaliza-
cin, la cual depende del apareamiento especfico
de las bases entre las cadenas complementarias. En
la FIGURA 1.20 se observa que la reaccin tiene lugar
A/A/A/A/
DNA de doble
cadena
[DesnaluraiizacinJ
ww
/wy\
DNA de cadena
individual
A/A/A/A/
-
[Renaturalizacin]
DNA
renaturalizado
FIGURA 1.20 Las caderas individuales de DNA desnaturaliza-
das pueden renaturalizarse para formar una estructura dplex.
en dos etapas. Primero, las cadenas individuales de
DNA que estn en la solucin se encuentran por
casualidad; si sus secuencias son complementarias,
aparearn sus bases para generar una regin corta
de hlice dplex. Posteriormente, dicha regin se
extiende a lo largo de la molcula como una cre-
mallera para formar una molcula dplex larga.
La renaturalizacin de la hlice dplex restaura las
propiedades originales perdidas con la desnaturali-
zacin del DNA.
La renaturalizacin describe la reaccin entre dos
secuencias complementarias separadas por desnatu-
ralizacin. Sin embargo, la tcnica puede ampliarse
para permitir que cualesquiera dos secuencias com-
plementarias de cidos nucleicos reaccionen entre s
para formar una estructura dplex. A este proceso
se le llama asociacin, si bien la reaccin se descri-
be de forma ms general como hibridacin cuando
participan cidos nucleicos de diferentes orgenes,
como sucede cuando una preparacin es DNA y la
otra, RNA. La capacidad de dos preparaciones de cidos
nucleicos para hihridarse demuestra con precisin su com-
plementariedad. pues slo las secuencias complementarias
pueden formar una estructura dplex.
El principio de la reaccin de la hibridacin es
poner frente a frente dos preparaciones de cidos
nucleicos de cadena individual y despus calcular la
cantidad de materia de doble cadena que se forma.
En la figura 1.21 se ilustra un procedimiento por
el cual se desnaturaliza una preparacin de DNA y
se adsorben en un filtro las cadenas unitarias. Pos-
teriormente se aade una segunda preparacin de
DNA (o de RNA) desnaturalizado. El filtro es tratado
de tal forma que la segunda preparacin se adsor-
ba slo si puede formar pares de bases con el DNA
adsorbido en un principio. Usualmcmc la segunda
1.10 Los cidos nucleicos se hibridan por apareamiento de bases
13
El experimento del filtro evala la complementariedad
Se desnaturaliza el DNA
y se adsorbe en un filtro
Se desnaturaliza
el DNA en solucin
Se sumerge el filtro en la solucin
i
Se determina el DNA unido al filtro
FIGURA 1.21 La hibridacin en filtro establece si la solucin
de DNA (o RNA) desnaturalizado corliene secuencias comple-
mentarias a las cadenas inmovilizadas en el filtro.
preparacin se marca radioactivamente, de manera
que se pueda medir la reaccin como la caniidad de
marcador radioactivo retenido por el filtro.
La extensin de la hibridacin entre dos cidos
nucleicos de cadena individual depende de su com-
plementariedad. No es necesario que dos secuencias
sean perfectamente complementarias para hibridar-
se. Si estn estrechamente relacionadas, pero no
son idnticas, se forma un dplex imperfecto en el
cual el apareamiento de bases se interrumpe en las
posiciones en que las cadenas individuales no co-
rresponden.
rwn Las mutaciones cambian
la secuencia del DNA
Conceptos principales
.
Todas las mutaciones consisten en cambios en la
secuencia del DNA.
.
Las mutaciones pueden ser espontneas o inducidas
por mutgenos.
Las mutaciones proporcionan evidencias determi-
nantes de que el DNA es el material gentico. Cuando
un cambio en la secuencia del DNA provoca una mo-
dificacin en la secuencia de una protena, se puede
concluir que el DNA codifica a dicha protena. Ade-
ms, un cambio en el fenotipo del organismo puede
permitir que se identifique la funcin de la protena.
La existencia de numerosas mutaciones en un gen
permite que se comparen numerosas variantes de
una protena, y mediante un anlisis detallado se
identificarn las regiones de la protena responsables
de una funcin enzimtica o de otras funciones.
Todos los organismos experimentan cierto n-
mero de mutaciones como resultado de las ope-
raciones celulares normales o de las interacciones
aleatorias con el ambiente a las cuales se les llama
imiiaciones espontneas; la velocidad a la que se
producen es caracterstica del organismo especfico,
y en ocasiones se le llama nivel de fondo. Las mu-
taciones son eventos raros y, por supuesto, las que
daan a un gen son descartadas con la evolucin,
de modo que es difcil obtener grandes cantidades
de mulantes espontneos para estudiarlos en las po-
blaciones naturales.
La incidencia de las mutaciones suele incremen-
tarse mediante tratamientos con ciertos compuestos;
se les llama mutgenos, y los cambios que provo-
can se conocen como mutaciones inducidas. La
mayora de los mutgenos actan directamente en
virtud de su capacidad para modificar una base es-
pecfica del DNA o para incorporarse en el cido nu-
cleico. La efectividad de un mutgeno se juzga por
la medida en que incrementa la tasa de mutaciones
respec to del nivel de fondo. Utilizando mutgenos se
pueden inducir numerosos cambios en un gen.
Las mutaciones espontneas que desactivan
el funcionamiento de un gen tienen lugar en los
bacterifagos y en las bacterias a una tasa relativa-
mente constante de 3 a 4 x 10 3 por genoma, por
generacin. Dada la gran variacin en el tamao
de los genomas entre bacterifagos y bacterias, esta
tasa corresponde a amplias diferencias en el ritmo
de las mutaciones por par de bases, lo cual sugiere
que la tasa global de mutacin ha estado sujeta a
fuerzas selectivas, que han equilibrado los efectos
nocivos de la mayora de las mutaciones respecto
de los favorables de algunas mutaciones. Esta con-
clusin se refuerza por la observacin de que una
arqueobacteria que vive en condiciones adversas
de altas temperaturas y acidez (que supuestamen-
te daan el DNA) no muestra una lasa elevada de
mutaciones, de hecho la tasa de mutacin global
apenas es menor al rango promedio.
En la FIGURA 1.22 se muestra que en las bacterias,
la tasa de mutaciones corresponde a -10"* eventos
por locus por generacin, o a una tasa promedio de
cambio por par de bases de lO a 10"10 por genera-
cin. La tasa en pares de bases individuales vara
considerablemente, en un rango de 10 000 veces. No
hay un clculo preciso de la tasa de mutaciones en
CAPTULO 1 Los genes son DNA
Las tasas de mutacin se incrementan
con el tamao de la diana
El cido nitroso desamina a la citosma formando uracilo
1 I
H-N
Tasa de mutacin
Cualquier par de
bases, 1 en lOMO10
generaciones
-ATCGGACTTACCGGTTA...
MI 'In'l 1 n"
_
TAG C CTGAATGGCCAAT...
Cualquier gen,
1 en 105-106
generaciones
-
El genoma,
1 en 300
generaciones
HUIRA 1.22 Un par de bases muta a una tasa de IC-'a lO"10
wgeneracin, un gen de 1 000 pares de bases muta a una lasa
x -10"* por generacin, en tanto que un genoma bacteriano
-
a una tasa de 3 x lO"1 por generacin.
eucariotas, aunque en general se piensa que hasta
ceno punto es similar a la de las bacterias, calculada
por locus y por generacin.
Las mutaciones pueden afectar
a pares de bases individuales
o a secuencias ms Largas
Conceptos principales
.
Una mutacin puntual modifica a un solo par de bases.
.
Las mutaciones puntuales pueden ser provocadas por la
conversin qumica de una base en otra o por errores
durante la duplicacin.
.
Una transicin remplaza un par de bases G-C con un
par de bases A-T, o viceversa.
.
Una transversin remplaza una purina con una
pirimidina, por ejemplo, A-T a T-A.
.
Las inserciones son el tipo ms comn de mutacin,
son resultado del movimiento de elementos
transponibles.
Cualquier par de bases del DNA puede mutar. Una
mutacin puntual cambia slo un par de bases, y
puede ser provocada por dos tipos de eventos:
.
La modificacin qumica del DNA convierte
directamente una base en otra diferente.
.
Un mal funcionamiemo durante la duplica-
cin del DNA provoca la insercin de una
base equivocada en una cadena polinucleo-
tdica durante la sntesis del DNA.
G
cido
nitroso
H
CITOSINA '
O
G
Duplicador
URACILO n
Y H
O
mulante
\ AJMA// 'p0 silves,re
G
FIGURA 1.23 Las mutaciones pueden ser inducidas por modi-
ficacin qumica de una base.
Las mutaciones puntuales pueden ser de dos ti-
pos, dependiendo de la naturaleza del cambio cuan-
do una base es sustituida por otra:
.
La clase ms comn es la transicin, que
consiste en la sustitucin de una pirimidina
por la otra, o de una purina por la otra, en
cuyo caso, un par G-C es remplazado por un
par A-T, o viceversa.
.
La clase menos comn es la trajisversin,
en la cual una purina es remplazada por una
pirimidina o viceversa, de tal forma que un
par A-T se convierte en T-A o en C-G.
Los efectos del cido nitroso constituyen un
ejemplo clsico de transicin por la conversin
qumica de una base en otra. En la FIGURA 1.23 se
muestra que el cido nitroso lleva a cabo una des-
animacin oxidativa que convierte a la citosina en
uracilo. En el ciclo de duplicacin que sigue a la
transicin, el U se aparea con una A, y no con la G,
con la cual la C original se habra apareado. De esta
manera, el par C-G es remplazado por un par T-A
cuando la A se aparea con !a T en el siguiente ciclo
de duplicacin. (El cido nitroso tambin desamina
a la adenina, provocando la transicin inversa de
A-T a G-C
.)
Las transiciones tambin son provocadas por
apareamiento errneo de bases, cuando pare-
jas inusuales se aparean desafiando la restriccin
usual de los pares de Watson y Crick. En general, el
apareamiento errneo de bases es una aberracin,
resultado de la incorporacin en el DNA de una base
anormal que tiene propiedades ambiguas de aparea-
miento. En la FIGURA U se muestra el ejemplo del
bromouracilo (BrdU), molcula anloga a la timina
1.12 Las mutaciones pueden afectar a pares de bases individuales o a secuencias ms largas
.. -..
l ... '.J -.:rc.- . ;II - L.,.. ._.......,. -....
... .'.
-, ,.. .;'.- '." -.
. , ...
El BrdU provoca que los pares A-T sean
remplazados por pares G-C
CH,
HC C
*0-
-
.
A car O
"
Y CH
ParA-T
H
n
A
n
El BrdU se aparea con .
car
ia A en la duplicacin X
Br
hcAt-
0
-
.
.
Azcar O 7 g YH
HCVC
CH
Par BrdU-A Azcar
El cambio ceto-enol permite que el BrdU se aparee con la G
Br
HC' VnN cambio ceto-enol
y K
? " % '
T o
Azcar
H9-
Azcar O
Bi

.
v,.OH
i
El BrdU se aparea
con la G en la duplicacin
HG
1
Bi
i
Par BrdU-G
Azcar

, ny
H >
Azcar
FIGURA 1.2. Se pueden inducir mutaciones al incorporar an-
logos de bases en el DNA.
en genes individuales, pero ahora sabemos que las
inserciones de fragmentos de material adicional
son muy frecuentes. La fuente del material inser-
tado yace en los elementos transponibles, que
son secuencias de DNA susceptibles de cambiar de
lugar (vase Captulo 21, Transposones, y Captulo
22, Ketrovirus y retroposones). Normalmente, una
insercin suprime la actividad de un gen, y donde
han ocurrido dichas inserciones, despus pueden
producirse deleciones de una parte o todo el mate-
rial insertado, y hasta de los dominios adyacentes.
Una diferencia signicativa entre las mutacio-
nes puntuales y las inserciones/deleciones es que
la freaienda de las primeras puede im remenlarse
por los mutgenos, mientras que la incidencia de
los cambios provocados por elementos transponi-
bles no se ve afectada. Sin embargo, las insercio-
nes y deleciones tambin pueden ser producto de
mecanismos, por ejemplo, los que implican errores
cometidos durante la duplicacin o la recombina-
cin, aunque probablemente sean menos comunes.
Por otra parte, una clase de mutgenos, las acri-
dinas, dan lugar a inserciones y deleciones (muy
pequeas).
WH Los efectos de las mutaciones
pueden ser revertidos
Conceptos principales
.
Las mutaciones directas desactivan a un gen, en tanto
que inversas (o revertientes) revierten sus efectos.
.
Las inserciones pueden revertir por delecin del
material insertado, pero las deleciones no pueden
revertirse.
.
La supresin ocurre cuando una mutacin de un segundo
gen anula el efecto de la mutacin del primero.
que contiene un tomo de bromina en lugar del gru-
po metilo de la timina. El BrdU se incorpora al DNA
en lugar de la timina. No obstante, sus propiedades
de apareamiento son ambiguas porque e! tomo de
bromina permite que se realice un cambio en el cual
la base modifica su estructura, de una forma ceto
(=0) a una forma eno! (-OH). Esta ltima puede
aparearse con la guanina, lo cual conduce a la sus-
lilLicin del par original A-T por un par G-C.
El apareamiento errneo puede ocurrir durante
la incorporacin original de la base o en un ciclo
subsiguiente de duplicacin. La iransicin es indu-
cida con cierta probabilidad en cada ciclo de dupli-
cacin, de modo que la incorporacin de BrdU tiene
efectos continuos en la secuencia del DNA.
Durante mucho tiempo se pens que las nu-
taciones puntuales eran !a va principal de cambio
En la FIGURA 1.25 se muestra que el aislamiento de
los revertientes es una caracterstica importante
que distingue las mutaciones puntuales y las inser-
ciones de las deleciones:
.
Una mutacin puntual puede revertirse al
restaurar la secuencia original o al adquirir
una mutacin compensadora en alguna otra
parte del gen.
.
Una insercin de material adicional puede
ser revertida por delecin del material inser-
tado.
.
Una delecin de una parte de un gen no
puede revertirse.
Las mutaciones que desactivan a un gen son lla-
madas mutaciones directas, y sus efectos son re-
vertidos por mutaciones inversas, las cuales son
de dos tipos, reversin verdadera y reversin supre-
sora intragnica.
CAPTULO 1 Los genes son DNA
Algunas mutaciones son reversibles
ATCGGACTTACCGGTTA
TAGGCTGAATGGCCAAT
Mutacin
puntual \
ATCGGACOACCGGTTA
TAGCCTGAGTGGCCAAT
Reversin
ATCGGACTTACCGGTTA
TAGCCTGAATGGCCAAT
ATCGGACTTACCGGTTA
TAGCCTGAATGGCCAAT
Insercin |
ATCGGACTTXXXXXACCGGTTA
TAGCCTGAAYYYYYTGGCCAAT
Reversin
por delecin
*
ATCGGACTTACCGGTTA
TAGCCTGAATGGCCAAT
ATCGGACTTACCGGTTA
TAGCCTGAATGGCCAAT
i
ATCGGACGGTTA
TAGCCTGCCAAT
Reversin imposible
FIGURA I.'j Las mutaciones puntuales y las inserciones pue-
den ser revertidas, pero las deleciones son irreversibles.
Una reversin exacta de la mutacin original
se llama reversin verdadera, de tal manera que
si un par A-T ha sido remplazado por un par G-C,
otra mutacin que restituya el par A-T regenerar
exactamente la secuencia de tipo silvestre.
El segundo tipo de mutacin inversa, la rever-
sin supresora intragnica, puede tener lugar
en otro sillo del gen, y sus efectos compensan a
la primera mutacin. Por ejemplo, un cambio de
aminocido en una protena puede abolir la fun-
cin del gen, pero una segunda alteracin puede
compensar por la primera y restaurar la actividad
de la protena.
Una mutacin directa resulta de cualquier cam-
bio que desactive un gen, mientras que una muta-
cin inversa debe restaurar la funcin de una prote-
na daada por una mutacin directa en particular,
de modo que las demandas de una mutacin inversa
son mucho ms especficas que las de una muiacin
directa. En proporcin, la tasa de retromutacin es
menor que la de mutacin directa, normalmente por
un factor de -10 veces.
Las mutaciones tambin pueden ocurrir en
otros genes para contrarrestar los efectos de una
mutacin en el gen original, efecto que se conoce
como supresin. Se llama supresor al locus en
que una mutacin suprime el efecto de una muta-
cin en otro.
Fifi Las mutaciones se concentran
en puntos calientes
Concepto principal
.
La frecuencia de las mutaciones en cualquier par
de bases en particular depende de una fluctuacin
estadstica, excepto en los puntos calientes, en los
cuales ta frecuencia se incrementa cuando menos en un
orden de magnitud.
Hasta ahora se han descrito las mutaciones en fun-
cin de los cambios individuales en la secuencia
del DNA que influyen en la actividad de ia unidad
gentica en la cual ocurren. Cuando se analizan
las mutaciones desde a perspectiva de la desac-
tivacin del gen, la mayora de los genes de una
especie muestran tasas ms o menos similares de
mutacin respecto de su tamao, lo cual sugiere
que el gen puede ser considerado como un objetivo
de la mutacin, y que un dao en cualquiera de sus
parles puede abolir su funcin, por consiguiente, la
susceptibilidad a la mutacin es aproximadamente
proporcional al tamao del gen. Pero consideran-
do los sitios de mutacin de la secuencia del DNA,
todos los pares de bases de un gen son Igualmente
susceptibles o algunos son ms propensos que otros
a sufrir mutaciones?
Qu sucede cuando se aisla un nmero im-
portante de mutaciones independientes del mismo
gen? Se obtienen numerosos minantes, cada uno
de los cuales es resultado de un evento mutacional
individual. Posteriormente se determina el sitio de
cada mutacin. La mayora de las mutaciones ra-
dicarn en sitios diferentes, si bien algunas estarn
en la misma posicin. Dos mutaciones aisladas de
manera independiente en el mismo sitio pueden
constituir exactamente el mismo cambio en el DNA
(en cuyo caso el mismo evento mutacional ha su-
cedido en ms de una ocasin), o pueden constituir
cambios diferentes (en cada par de bases son posi-
bles tres mutaciones puntuales diferentes).
En el histograma de la 1GURA 1.26 se muestra
la frecuencia con la cual se encuentran mutacio-
nes en cada par de bases del gen lacl de E. coli. La
probabilidad estadstica de que ocurra ms de una
mutacin en un sitio particular se determina por
cintica de impactos aleatorios (como se observa en
1.14 Las mutaciones se concentrar er puntos calientes
Un punto caliente tiene 10 veces ms mutaciones
de las esperadas
3
E
8
9
S
b
-
40
30
20
id
- -
l
-i
50 100 150 200 250
Distancia a lo largo del gen
300 bp
FIGURA 1.2; Las mutaciones espontneas ocurren a lo Largo
del gen lacl de la bacteria E. coli, pero estn concentradas en
un punto caliente.
La desaminacin espontnea transforma a una base
Citosina H
O
O
Uracllo
O
/
5-metilcitosina CH
3
H
o
CH3
Tirnina
n
-
Y H
o
FIGURA l.r La desaminacin de la citosina produce uracilo,
y la de 5-metilcitosina, timina.
la distribucin de Poisson). Por lo tanto, algunos
sitios adquirirn una, dos o tres mutaciones, mien-
tras que otros no obtendrn ninguna. Algunos sitios
adquieren muchas ms mutaciones de las esperadas
en una distribucin aleatoria; pueden presentar 10 e
incluso 100 veces ms mutaciones que las predichas
por los impactos aleatorios. Estos sitios se llaman
puntos calientes. F.n los puntos calientes pueden
ocurrir mutaciones espontneas, y mutgenos dife-
rentes pueden tener diferentes puntos calientes.
BE) Numerosos puntos calientes son
resultado de bases modificadas
Concepto principal
.
Una causa comn de puntos calientes es la base
modificada 5-metilcitosina, La cual sufre desaminacin
espontnea y se convierte en timina.
Una causa importante de mutacin espontnea re-
sulta de la presencia de una base inusual en el DNA.
Adems de las cuatro bases que se insertan en ste
cuando es sintetizado, en ocasiones se pueden ob-
servar bases modificadas cuyo nombre refleja su
origen; son producidas al modificarse qumicamente
una de las cuatro bases ya presentes en el DNA. La
base modificada ms comn es la 5-metilcitosina,
generada por una enzima metilasa que agrega un
grupo metilo a ciertos residuos de citosina en sitios
especficos del DNA.
Los sitios que contienen 5-metilcitosina propor-
cionan puntos calientes para que se desarrollen mu-
taciones puntuales espontneas en E. coli. En cada
caso, la mutacin adquiere la forma de una transi-
cin de G-C a A-T. Las cepas de E. coli incapaces de
metilar la citosina carecen de puntos calientes.
La razn de la existencia de los puntos calientes
es que las bases de citosina sufren desaminacin
espontnea con frecuencia considerable. En esta re-
accin, el grupo amino es remplazado por un grupo
ceto. Recurdese que la desaminacin de la citosina
genera uracilo (vase Figura 1.23). En la 'IGURA 1.27
se compara esta reaccin con la desaminacin de
5-metilcitosina
, en donde la desaminacin genera
timina. El efecto en el DNA es la generacin de pa-
res de bases G-U y G-T, respectivamente, donde hay
un apareamiento errneo entre parejas.
Todos los organismos cuentan con sistemas de
reparacin que corrigen pares de base apareados
errneamente eliminando y remplazando una de
las bases. La operacin de estos sistemas determina
si los pares apareados errneamente, como G-U y
G-T
,
resultan en mutaciones.
En la FIGURA 1.28 se muestra que las conse-
cuencias de la desaminacin son diferentes para la
5
-metilcitosina y para la citosina.
La desaminacin
(poco frecuente) de la 5-metilcitosina provoca una
mutacin, en tanto que la desaminacin de la cito-
sina ms comn no tiene este efecto porque los sis-
temas de reparacin son mucho ms efectivos para
reconocer G-U que G-T.
La E. coli contiene una enzima, uracilo-DNA-
glucosidasa, que elimina los residuos de uracilo del
DNA (vase la seccin 20.5, La inversin de bases
es utilizada por las metilasas y las glucosilasas). Esta
accin deja sin aparear un residuo de G, y posterior-
mente
"
un sistema de reparacin
"
inserta una base C
para aparearlo. El resultado final de estas reacciones
es la restauracin de la secuencia original del DNA.
Este sistema protege al DNA de las consecuencias
de la desaminacin espontnea de la citosina (pero
no es lo suficientemente activo como para prevenir-
los efectos del alto nivel de desaminacin provocado
por el cido nitroso; vase la Figura 1.23).
Ntese que la desaminacin de la 5-metilcitosi-
na produce timina, lo cual da lugar a un par de bases
apareadas errneamente, G-T. Si el apareamiento
CAPTULO 1 Los genes son DNA
La remocin del uraclo evita las mutaciones
G G
Desaminacin oxidativa
La T remplaza a la Me-C El U remplaza a la C
T Eliminacin del uracilo
G G
i
Insercin de citosina
G G
Duplicacin
c c
G G
T y
C
A G
la T se aparea con la A
Mutacin Sin mutacin
FIGURA 1.28 La tesaminacin de la 5-me:ilcitosina oroduce
timina (por Iransiciones de C-G a T-A), en lano que la desami-
nacin de la citosina produce uracilo (que suele ser eliminado
y posteriormente remplazado por citosina).
errneo no se corrige antes del siguiente ciclo de
duplicacin, resulta una mutacin. En la siguien-
te duplicacin, las bases del apareamiento errneo
entre G y T se separan y posteriormente se aparean
con nuevas parejas para producir un par G-C de tipo
silvestre y un par A-T mulante.
La desaminacin de la 5-metilciiosina es la cau-
sa ms comn de la produccin de pares errneos
de G-T en el DNA. Los sistemas de reparacin que
actan en dichos pares tienden a remplazar T por C
(en vez de la alternativa de remplazar G por A), lo
cual ayuda a reducir la tasa de mutacin (vase la
seccin 20.7, Control de la direccin de la repara-
cin del apareamiento errneo). No obstante, estos
sistemas no son tan efectivos como la remocin de
U de los pares errneos G-U, de modo que la des-
aminacin de la 5-meiilcitosina provoca mutaciones
con mucha mayor frecuencia que la desaminacin
de la citosina.
La 5-metilcitosina tambin crea puntos calien-
tes en el DNA de eucariotas, fenmeno comn en
dinudetidos CpG concentrados en regiones de-
nominadas islas CpG (vase la seccin 24.19,
Los
islotes CpG son dianas reguladoras). Si bien la 5-
metilcitosina representa -1% de las bases del DNA
humano, ios sitios que contienen la base modifica-
da representan -30% de las mutaciones puntuales;
esto hace del estado de la 5-menlcitosina un factor
determinante de mutacin muy importante en las
clulas animales.
Los efectos de la eliminacin de la enzima del
ratn MBD4, giucosilasa susceptible de eliminar T
(o U) de pares errneos con G, subrayan la impor-
tancia de los sistemas de reparacin para reducir
la tasa de mutaciones; el resultado es una tasa de
mutacin tres veces mayor en los sitios CpG. (La
razn de que el efecto no sea mayor es que la MRD4
constituye slo uno de los numerosos sistemas que
inciden en los pares errneos G-T; es de imaginar
que la eliminacin de todos los sistemas incremen-
tar mucho ms la tasa de mutacin.)
La operacin de esios sistemas proyecta una luz
interesante en el uso de la T en el DNA respecto de
Ja U en el RNA que quiz se relacione con la nece-
sidad de estabilidad de la secuencia del DNA; el uso
de T significa que cualquier desaminacin de C se
detecta de inmediato debido a que genera una base
(U) que suele estar ausente del DNA, lo cual incre-
menta en gran medida la eficiencia con que pueden
funcionar los sistemas de reparacin (comparados
con la situacin en que tienen que detectar aparea-
mientos errneos G-T, los cuales tambin pueden
ser producidos por situaciones en que la eliminacin
de la T no sera la respuesta apropiada). Asimis-
mo, el enlace fosfodister del esqueleto es ms lbil
cuando ta base es U.
in Algunos agentes hereditarios
son extremadamente pequeos
Concepto principal
.
Algunos agentes hereditarios muy pequeos no
codifican protenas, pero constan de RNA o de
protenas que tienen propiedades hereditarias.
Los viroides son agentes infecciosos que producen
enfermedades en plantas superiores; son molcu-
las circulares de RNA muy pequeas. A diferencia
de los virus, en los cuales el agente infeccioso es
un virin, genoma cncapsulado en una cubierta
de protena, el RNA viroide es el agente infeccioso. El
viroide est formado nicamente por RNA, cuyas
bases estn extensamente apareadas pero de forma
imperfecta, de modo que forman una barra carac-
terstica, como la ilustrada en la figura i.29. Las
mutaciones que interfieren con la estructura de esta
barra reducen su capacidad infecciosa.
Un RNA viroide consiste en una especie mole-
cular individual que se replica de forma autnoma
en clulas infectadas y cuya secuencia se perpeta
1.15 Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequeos
Los genomas de los viroides son molculas de RNA
u CC e u
PSTV grave *
J 'i T T
m m t o - U
PSTV leve
/
oj
*
A*
iw
AO 30 0*
,?A* JJ *C lJU .J& *l..-0--*-
+U A- U
El RNA del PSTV es una molcula circular que forma una estructura extensa de doble cadena inte-
rrumpida por numerosos lazos interiores. La forma leve difiere de la grave en tres sitios.
fielmente en sus descendientes. Los viroides pue-
den clasificarse en numerosos grupos. Un viroide
dado se identifica con un grupo por la similitud de
su secuencia con la de otros miembros del grupo.
Por ejemplo, cuatro viroides relacionados con el del
tubrculo ahusado de la papa (PSTV, patato spindle
tuberviroid), muestran similitudes de secuencia del
70 al 83 por ciento. Los diferentes aislamientos de
una cepa de un viroide en particular pueden variar
entre ellos, y el cambio puede afectar al fenotipo
de clulas infectadas. Por ejemplo, las cepas leves
y severas de PSTV difieren por tres sustituciones de
nucletidos.
Los viroides se asemejan a los virus en que sus
genomas de cido nucleico son heredables porque
cumplen con todos ios requisitos de la informacin
gentica, aunque los viroides, llamados en ocasio-
nes patgenos subvricos, difieren de los virus en
estructura y funcin. El RNA viroide no parece ser
traducido a protenas, por lo tanto no puede codifi-
car por s mismo las funciones necesarias para su su-
pervivencia, fenmeno que genera dos interrogan-
tes: Cmo se replica el RNA viroide? Cmo afecta
al fenotipo de la clula de la planta infectada?
La duplicacin debe ser realizada por enzimas
de la clula hospedadora, subvertidas de su funcin
normal. La heredabilidad de la secuencia del viroide
indica que el RNA viroide proporciona el molde.
Presumiblemcnie, los viroides son patognicos
porque interfieren con los procesos celulares nor-
males, quiz de forma relativamente aleatoria, por
ejemplo, secuestrando una enzima esencial para su
propia duplicacin o interfiriendo con la produc-
cin de molculas necesarias de RNA celular, o bien,
pueden comportarse como molculas reguladoras
anormales con efectos particulares en la expresin
de genes individuales.
Un agente an menos comn es la encefalo-
pata espongiforme de ovejas y cabras (sera-
pie), enfermedad neurolgica degenerativa de ove-
jas y cabras que se relaciona con kuru y sndrome
de Creutzfeldt-Jakob, enfermedades humanas que
afectan la funcin cerebral.
El agente infeccioso del scrapie no contiene cido
nucleico. Este agente extraordinario llamado prin
(agente infeccioso proteinceo) es una glicoprote-
na hidrfoba de 28 kD, o PrP, codificada por un
gen celular (conservado entre los mamferos) que
se expresa en el cerebro normal. La protena existe
en dos formas, el producto que se encuentra en el
cerebro normal conocido como PrP*, que es comple-
tamente degradado por proteasas. La protena en-
contrada en los cerebros infectados se conoce como
PrPsc y es extremadamenic resistente a la degrada-
cin por proteasas. La PrPr se convierte en PrP5t por
una modificacin o cambio conformacional que
confiere resistencia a las proteasas y que an no ha
sido descrita por completo.
Como agente infeccioso del scrapie, el PrP" debe
modificar de alguna manera la sntesis de su contra-
parte celular normal, de tal forma que, de ser inocuo
se torne en infeccioso (vase la seccin 31.12, Los
priones provocan enfermedades en los mamferos).
Los ratones que carecen del gen PrP no pueden ser
infectados para que en ellos se desarrolle scrapie, lo
cual demuestra que el PrP es esencial para el desa-
rrollo de la enfermedad.
ffn Resumen
Mediante dos experimentos clsicos se demostr
que el DNA es el material gentico. El DNA aisla-
do de una cepa de la bacteria Pneumococcus puede
conferir propiedades de dicha cepa a otra. Adems,
el DNA es el nico componente heredado por la
progenie de los fagos progenitores. El DNA puede
uiilizarse para transferir nuevas propiedades a c-
lulas eucariotas.
20
LAPTULO 1 Los genes son DNA
El DNA es una hlice dplex formada por cade-
nas antiparalelas en las cuales los nucietidos estn
unidos por enlaces fosfodister 5
'
a -3
'
. El esqueleto
iorma la parte exterior; las bases de purina y de piri-
-
idina estn apiladas en el interior formando pares,
en los cuales la A es complementaria de la T, y la G,
de la C. Las cadenas se separan y recurren al apa-
reamiento complementario de bases para ensamblar
cadenas hijas siguiendo un patrn de duplicacin
semiconservadora. El apareamiento complementa-
rio de bases tambin se utiliza para transcribir un
RNA que representa una sola cadena de un DNA
dplex.
Un fragmento de DNA puede codificar a una
protena. El cdigo gentico describe la relacin en-
tre la secuencia del DNA y la secuencia de la prote-
na. Slo una de las dos cadenas del DNA codifica a
una protena. Un codn est formado por tres nu-
cietidos que representan un solo aminocido. Una
secuencia codificadora de DNA consiste en una serie
de codones, los cuales son ledos desde un punto de
inicio predeterminado. En general, uno de los tres
marcos de lectura posibles puede ser traducido en
protenas.
Una mutacin es un cambio en la secuencia de
.os pares de bases A-T y G-C del DNA que, en una
majencia codificadora, puede cambiar la secuencia
ie aminocidos de la protena correspondiente. Una
mutacin por desplazamiento del marco de lectura
modifica el marco de lectura subsiguiente insertando
'
eliminando una base, de modo que se produce una
serie completamente nueva de aminocidos a partir
del sitio de la mutacin. Una mutacin puntual cam-
bia slo al aminocido representado por el condn en
el cual sucede la mutacin. Las mutaciones puntua-
les pueden ser revertidas por mutacin inversa de la
mutacin original. Las inserciones pueden revertirse
por la prdida del material insertado, pero las de-
Icciones son irreversibles. Las mutaciones tambin
pueden ser suprimidas de manera indirecta cuando
-na mutacin de un gen diferente antagoniza al de-
fecto original.
La incidencia natural de las mutaciones se in-
crementa por medio de mutgenos. Las mutacio-
nes pueden concentrarse en puntos calientes. Una
riedad de punto caliente responsable de algunas
mutaciones puntuales es provocada por la desami-
nacin de la base modificada 5-inetiIcitosina.
Las mutaciones directas ocurren a una tasa de
-
ICT4 por locus por generacin; las retromutaciones
to mutaciones inversas) son menos comunes. No
todas las mutaciones inciden en el fenotipo.
Aunque toda la informacin gentica de las c-
lulas es transportada por el DNA, los virus tienen
enomas de doble cadena o de una sola cadena de
DNA o de RNA. Los viroides son patgenos subvri-
cos formados nicamente por molculas circulares
pequeas de RXA, sin cubierta protectora. El RNA
no codifica protenas; se desconoce su forma de per-
petuacin y de patognesis. El scrapie es un agente
protenico infeccioso.
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CAPTULO 1 Los genes son DNA
Los genes codifican protenas
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
Un gen codifica a un solo polipptido
.
La hiptesis de un gen : una enzima resume las bases de la
gentica moderna: que un gen es un fragmento de DNA que
codifica a una sola cadena polipeptidica.
.
La mayoria de las mutaciones deterioran la funcin del gen
en el cual se producen.
Las mutaciones que se presentan en el mismo gen
no se pueden complementar
.
Una mutacin en un gen afecta slo a la proteina
codificada por la copia mutante del gen y ro a las
protenas codificadas por algn otro alelo.
.
La incapacidad de oos mutaciones para complementarse
(producir un fenotioo silvestre cuando se presentan en
configuracin trans en un heterocigoto) significa que
forman parte del mismo gen.
Las mutaciones pueden provocar prdida
o ganancia de funcin
.
Las mutaciones recesivas son provocadas por ordida de
funcin del producto proteinico.
.
Las mutaciones dominantes son resultado de una ganancia
de funcin.
.
La evaluacin de la esencialidad de un gen requiere de una
mutacin nula (que elimine por completo su funcin).
.
Las mutaciones silenciosas no tienen ningn efecto porque
el cambio de base no artera la secuencia ni la cantidad de
proteina, o porque el cambio de la secuencia de la proteina
no tiene ningn efecto.
.
Las mutaciones rezumantes (o hipomorfas) inciden en la
funcin del producto del gen, pero no se observan en el
fenotipo debido a que prevalece la actividad suficiente.
Un locus puede tener numerosos alelos mutantes
diferentes
.
La existencia de varios alelos permite ocurrencia de
heterocigotos con cualquier combinacin en pares de alelos.
Un locus puede tener ms de un alelo de tipo
silvestre
.
Un locus puede tener una distribucin polimrfica de alelos
sin un alelo individual que pueda ser considerado como el
nico de tipo silvestre.
La recombinacin ocurre por el intercambio fisico
de DNA
.
La recombinacin es resultado del enlrecruzamiento que
ocurre en los quiasmas e involucra a dos de las cuatro
cromtidas.
BO
.
La recombinacin se debe a un rompimiento y una reunin
que tiener lugar a travs de un intermediario de DNA hbrido.
EL cdigo gentico se lee en tripletes
.
El cdigo gentico se lee en tripletes de nucletidos
denominados codones.
.
Los tripletes no estn superpuestos y se leen a partir de un
punto fijo de inicio.
.
Las mutaciones que insertan o eliminan oases
"
ndividuales
provocan un cambio en los grupos de tripletes despus del
sitio de la mutacin.
.
Las combinaciones de mutaciones que insertan o eliminan
tres bases (o mltiplos de tres), insertan o eliminan
aminocidos, pero no cambian la lectura de los tripletes
ms all del ltimo sitio de mutacin.
Cada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles
.
Usualmente slo un marco de lectura es traducido y
los otros eos son bloqueados oor seales frecuentes de
terminacin.
Los genes procariticos son colineales
con sus protenas
.
Un gen procaritico es un fragmento constante de 3W
nucletidos que codifica a N aminocidos.
.
El gen, el RNAn y la proteina son todos colineales.
Numerosos procesos son necesarios para expresar
el producto proteinico de un gen
.
Un gen procaritico se expresa por transcripcin en RNAm
y posteriormente por traduccin del RNAm en una protena.
.
En las eucariotas, un gen puede contener regiones internas
no representadas en la protena.
.
Las regiones internas son eliminadas del transcrito de RNA
por el corte y empalme de ste para dar origen a un RNAm
colineal resoecto del producto proteinico.
.
Cada RNAm est formado por una regin lder 5' no
traducida, una regin codificadora y una regin posterior 3'
no traducida.
Las protenas actan en trans, pero los sitios del
DNA, en ds
.
Todos los productos de los genes (RNA o protenas) actan
en trans: pueden actuar er cualquier copia de un gen en la
clula.
.
Las mutaciones de actuacin en dJ identifican a las
secuencias de DNA que son el objetivo de reconocimiento
Ce los productos de actuacin en trans. No se expresan
como RNA ni como protenas, y afectan slo al fragmento
contiguo de DNA.
Resumen
23
Introduccin
El gen es la unidad funcional de la herencia que
consiiluye una secuencia del genoma cuya funcin
es dar origen a un producto discreto (ya sea una
protena o un RNA); su comportamiento bsico fue
definido por Mendel hace ms de un siglo. Resumi-
do en sus dos leyes, el gen fue reconocido como un
"
factor de partculas" que se transmite sin cambios
del progenitor a su progenie. Un gen puede existir
en formas alternas que se conocen como alelos.
En los organismos diploides, los cuales tienen
dos conjuntos de cromosomas, una copia de cada
uno de ellos se hereda de cada progenitor, mismo
comportamiento exhibido por los genes. Una de las
dos copias de cada gen es el alelo paterno (heredado
del padre), el otro es el materno (heredado de la ma-
dre). La equivalencia condujo al descubrimiento de
que, de hecho, los cromosomas portan a los genes.
Cada cromosoma consiste en una estructura li-
neal de genes. Cada gen reside en una localizacin
particular del cromosoma. La localizacin se conoce
de manera ms formal como locus. Los alelos de un
Cada cromosoma posee un ONA que contiene numerosos genes
Un cromosoma es una molcula de DNA muy larga oc
El cromosoma contiene
numerosos genes
Cada gen es parle de
una secuencia
continua de DNA
m m
Inicio del gen Final del gen
CATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACAATGC
GTATATTCCACTCCATCCTAGTCAAOGAGGAGTGTTACG
FIGURA 2.1 Cada cromosoma tiene una sola molcula larga de
DNA dentro de la cual se encuentran las secuencias de genes
individuales.
gen son las diferentes formas que se encuentran en
su locus.
La clave para comprender la organizacin de los
genes en los cromosomas fue el descubrimiento del
ligamiento gentico, o tendencia de los genes de un
mismo cromosoma a mantenerse juntos en la pro-
genie, en lugar de ordenarse de manera indepen-
diente, como pronostican las leyes de Mendel. Una
vez que se introdujo la unidad de recombinacin
(reordenamiento) como medida de vinculacin, fue
posible construir mapas genticos.
La resolucin del mapa de recombinacin de
una eucariota superior est restringida por lo re-
ducido de la progenie que puede obtenerse de cada
cruza. La recombinacin es tan poco frecuente en-
tre puntos cercanos, que se observa rara vez entre
mutaciones diferentes del mismo gen. Por ello, en
los mapas de ligamiento clsico de las eucariotas se
puede colocar a los genes en orden, pero no es posi-
ble determinar las relaciones en un gen. Al cambiar
a un sistema microbiano en el cual se puede obtener
una progenie muy numerosa de cada cruza gen-
tica, los investigadores pudieron demostrar que la
recombinacin ocurre dentro de los genes y que si-
gue las mismas reglas que se dedujeron previamente
para la recombinacin entre genes.
En un gen, las mutaciones pueden estar organi-
zadas de forma lineal, con lo cual se demuestra que
el gen mismo posee la misma construccin lineal
que el ordenamiento de genes en un cromosoma, de
modo que el mapa gentico es lineal en los loci y en-
tre stos: est formado por una secuencia continua
dentro de la cual residen los genes. Esta conclusin
condujo naturalmente a la perspectiva moderna
que se resume en la FIGURA 2.1, en la cual se consi-
dera que el material gentico de un cromosoma est
formado por una molcula ininterrumpida de UNA
que representa a numerosos genes.
Un gen codifica a un solo
polipptido
Conceptos principales
.
La hiptesis de un gen : una enzima resume las bases
de la gentica moderna: que un gen es un fragmento
de DNA que codifica a una sola cadena polipeptdica.
.
La mayora de las mutaciones deterioran la funcin del
gen en el cual se producen.
Mediante el primer intento sistemtico de relacionar
a los genes con las enzimas se demostr que cada
etapa de la rula metablica es catalizada por una sola
enzima y que puede ser bloqueada por mutaciones en
un gen diferente. Esto condujo a la hiptesis de un gen:
24 CAPTULO 2 Los genes codifican protenas
una enzima. Cada paso metablco es catalizado por
una enzima especfica cuya produccin es responsabi-
lidad de un solo gen. Una mutacin en el gen altera la
actividad de la prolena de la cual es responsable.
Para incluir a las protenas formadas por ms de
una subunidad, es necesario modificar la hiptesis. Si
las subunidades son todas iguales, la protena es un ho-
momultmero, y est representada por un solo gen.
Si las subunidades son diferentes, la protena es un he-
leromultmero. Expresada como una regla ms ge-
nera] aplicable a cualquier protena homomuliimci ica,
la hiptesis de un gen : una enzima se manifiesta con
mayor precisin como ungen: una cadena polipeptdka.
Identificar qu protena representa a un gen en
particular puede ser tardado La mutacin que dio
lugar a los chcharos rugosos murantes de Mendel
no se identific sino hasta 1990, como una altera-
cin que inactiva al gen que codifica a una enzima
ramificadora del almidn!
Es importante recordar que un gen no produce
directamente una protena. Como se mostr previa-
mente en la Figura 1.2, un gen codifica a un RNA,
que a su vez puede codificar a una protena. La ma-
yor parte de los genes codifica a las protenas, pero
algunos codifican molculas de RNA que no produ-
cen protenas. Dichas molculas de RNApueden ser
componentes estructurales del aparato responsable
de la sntesis de protenas, o bien, regular la expre-
sin gentica. Ll principio bsico consiste en que
el gen es una secuencia de DNA que especifica la
secuencia de un producto independiente. Bl proceso
Los alelos recesivos no producen protenas activas
Homocigoto
de tipo silvestre
Helerocigoto de
tipo silvestre/mutante
Homocigoto
mulante
Ambos alelos
producen
protenas activas
t
Un alelo (dominante)
produce una protena
activa
Ninguno de los
alelos produce
protenas
1
tipo silvestre tipo silvestre
mulante
tipo silvestre
1
mulante mulante
l
Fenotipo
silvestre
Fenotipo
silvestre
Fenotipo
mulante
de la expresin de los genes puede terminar en un
producto que ser RNA o protena.
Una mutacin es un evento aleatorio respecto de
la estructura del gen en el cual es muy probable que
se dae, o incluso que se suprima, la funcin del gen.
Casi todas las mutaciones que afectan el funciona-
miento de un gen son recesivas; representan ausencia
defuncin, pues al gen mulante se le ha impedido producir
su protena usual. En la FIGURA 2.2 se ilustra la relacin
entre alelos de tipo recesivo y alelos de tipo silvestre.
Cuando un heterocigoto contiene un alelo de tipo
silvestre y un alelo de tipo mulante, este ltimo es
susceptible de regir la produccin de la enzima, y pol-
lo tanto, es dominante. (Esto implica que el nico
alelo de tipo silvestre produce una cantidad adecuada
de protena. Cuando esto es falso, la menor cantidad
producida por un alelo, comparada con la de dos
alelos, resulta en el fenotipo intermedio de un alelo
parcialmente dominante en un heterocigoto.)
Las mutaciones que
se presentan en el mismo gen
no se pueden complementar
FIGURA 2.2 Los genes codifican protenas; la dominancia se
explica por las propiedades de las protenas mulantes. Un alelo
recesivo no contribuye al fenotipo debido a que no produce nin-
guna protena (o produce una protena que no es funcional).
Conceptos principales
.
Una mutacin en un gen afecta slo a la protena
codificada por la copia mulante del gen y no a las
protenas codificadas por algn otro alelo.
.
La incapacidad de dos mutaciones para complementarse
(producir un fenotipo silvestre cuando se presentan en
configuracin trans en un heterocigoto) significa que
forman parte del mismo gen.
Cmo determinamos si dos mutaciones que provo-
can un fenotipo similar se encuentran en el mismo
gen? Si en el mapa estn muy cerca, pueden ser ale-
los. Pero tambin podran representar mutaciones
de dos genes diferentes cuyas protenas estn impli-
cadas en la misma funcin. La prueba de comple-
mentacin permite determinar si dos mutaciones
yacen en el mismo gen o en genes diferentes. La
prueba consiste en hacer un heterocigoto para las dos
mutaciones (apareando a progenitores homocigti-
cos para cada mutacin).
Si las mutaciones se encuentran en el mismo
gen, los genotipos progenitores pueden represen-
tarse como:
El primer progenitor proporciona un alelo mu-
lante m
y
el segundo, un alelo ni,, por lo lauto, el
heterocigoto tendr la constitucin:
m,
2.3 Las mutaciones que se presentan en el mismo gen no se pueden complementar
No se observa ningn gen de tipo silvestre, por lo
tamo, el heterocigoto tiene un fenotipo mulante.
Si la mutacin yace en genes diferentes, los ge-
notipos progenitores pueden representarse como:
m
,+ +m,
y
+m
,
Cada cromosoma tiene una copia tipo silvestre
de un gen (representada por el signo ms) y una
copia mutante del otro, de modo que la constitucin
del heterocigoto ser:
uvh
+ m
2
en la cual los dos progenitores han proporcionado
una copia de tipo silvestre de cada gen. El heteroci-
goto tiene el fenotipo silvestre, de modo que se dice
que los dos genes se complementan.
La prueba de la complcmentacin se describe
ms ampliamente en la FIGURA 2.3. La bsica consiste
en la comparacin que se muestra en la parte supe-
rior de la figura. Si dos mutaciones se encuentran
en el mismo gen, se observa una diferencia en los
fenotipos de la configuracin tram y de la configura-
cin as. La configuracin trans es mutante, pues cada
alelo tiene una mutacin (diferente). Sin embargo,
la configuracin cis es de tipo silvestre, debido a que
un alelo tiene dos mutaciones y el otro, ninguna.
En la parte inferior de la figura se muestra que si las
dos mutaciones se encuentran en genes diferentes,
La prueba cisltrans asigna mutaciones a los genes
MUTACIONES EN EL MISMO GEN
configuracin rans
mutante 1
configuracin cis
mutante doble

Sin compiementacin */ ,/,/ ,/

Fenotipo mutante \/ v//\/
v/ J*y yj Un gen es de
Vv/v/v/,iP0 silvestre
mutante 2
MUTACIONES EN GENES DIFERENTES (configuracin trans)
mutante 1 tipo s'lvestre

Complementacin
(fenotipo silvestre) >A/v/v/
Una copia de cada
gen es de tipo silvestre

vyyv
ww
tipo silvestre mutante 2
FIGURA 2.3 El cistrn se define mediante la prueba de complcmen-
tacin. Los genes estn representados por espirales; los asteriscos
rojos identifican a los sitios de mutacin.
siempre se observar un fenotipo silvestre. Siempre
hay un alelo de tipo silvestre y un alelo mutante de
cada gen, y la configuracin no tiene importancia.
La incapacidad para complementar significa que dos
mutaciones son parte de la misma unidad gentica.
Se dice que las mutaciones que no se complementan
forman parle del mismo grupo de complementa-
cin. Otro trmino utilizado para describir a la uni-
dad definida por la prueba de complementacin es
cistrn, qtie significa lo mismo que gen. Bsicamen-
te estos tres trminos describen a un fragmento de
DNA que funciona como una unidad que dar lugar
a un RNA o un producto protenico. Las propiedades
del gen respecto de la complementacin se explican
por el hecho de que este producto es una molcula
nica que se comporta como una unidad funcional.
Las mutaciones pueden
provocar prdida o ganancia
de funcin
Conceptos principales
.
Las mutaciones recesivas son provocadas por prdida
de funcin del producto protenico.
.
Las mutaciones dominantes son resultado de una
ganancia de funcin.
.
La evaluacin de la esencialidad de un gen requiere de una
mutacin nula (que elimine por completo su fundn).
.
Las mutaciones silenciosas no tienen ningn efecto
porque el cambio de base no altera la secuencia ni
la cantidad de protena, o porque el cambio de la
secuencia de la protena no tiene ningn efecto.
.
Las mutaciones rezumantes (o hipomorfas) afectan a la
funcin del producto del gen, pero no se observan en
el fenotipo porque queda actividad suficiente.
Los diversos efectos posibles de las mutaciones
en un gen se resumen en la figura 2.4.
Cuando un gen ha sido identificado, en principio
se puede llegar a conocer su funcin produciendo
un organismo mutante que carezca completamente
del gen. Una mutacin que elimina por completo la
funcin de un gen, normalmente porque el gen ha
sido eliminado, se llama mutacin nula, y si el gen
es esencial, la mutacin nula es letal.
Para determinar el efecto del gen en el fenoti-
po, es fundamental caracterizar a un mutante nulo.
Cuando una mutacin no afecta al fenotipo, siem-
pre cabe la posibilidad de que se trate de una muta-
cin rezumante, es decir, se produce una cantidad
suficiente de producto activo para que cumpla con
su funcin, aunque la actividad se reduce cuantita-
tivamente o es cualitativamente diferente del tipo
silvestre. Sin embargo, si una mulacin nula no
afecta al fenotipo, se puede concluir con toda segu-
ridad que la funcin del gen no es necesaria.
26
CAPTULO 2 Los genes codifican protenas
Las mutaciones varan de silenciosas a de funcin nula
El gen de tipo silvestre codifica a una protena
Una mutacin silenciosa
no afecta a la proteina
Una mutacin nula no
produce protenas
Una mutacin puntual
puede daar la funcin
Una mutacin puntual puede
crear una nueva funcin
FIGURA 2.-4 Las mutaciones que no afectan a la secuencia o
a la funcin de la protena son silenciosas, en tanto que las
mutaciones que eliminan toda la actividad de la protena son
nulas. Las mutaciones puntuales que provocan prdida de la
funcin son recesivas, a diferencia de las que provocan ganan-
cia de la funcin, que son dominantes.
Las mutaciones nulas, u otras mutaciones que
impiden la funcin del gen (pero que no necesa-
riamente la eliminan por completo) se denominan
mutaciones de prdida de funcin (o amorfas).
Una mutacin de perdida de funcin es recesiva
(como en el ejemplo de la Figura 2.2). En ocasiones,
una mutacin tiene el efecto opuesto y provoca que
una proteina adquiera una nueva funcin; dicho
cambio es conocido como mutacin de ganancia
de funcin, la cual es dominante.
No todas las mutaciones del DNA provocan
cambios detectables en el fenotipo; aquellas sin un
efecto aparente se conocen como mutaciones si-
lenciosas, las cuales pueden ser de dos tipos; uno
de ellos implica cambios de bases en el DNA que
no provocan ningn cambio en el aminocido de la
protena correspondiente, en tanto que el segundo,
cambia al aminocido, pero el remplazo en la pro-
tena no afecta a su actividad; a estas sustituciones
se les llama neutrales.
3 Un Locus puede tener numerosos
alelos mutantes diferentes
Concepto principal
.
La existencia de alelos mltiples permite que los heterocigotos
representen cualquier combinadn en pares de alelos.
Si se produce una mutacin recesiva por cada cambio
que impide la produccin de una protena activa en
un gen, debe haber gran nmero de dichas mutacio-
nes en cualquier gen. Numerosos remplazos de ami-
nocidos pueden cambiar la estruaura de la protena
lo suficiente como para impedir su funcin.
Las diferentes vanantes del mismo gen se lla-
man alelos mltiples, y su existencia permite la
creacin de un heterocigoto entre alelos mutantes.
La relacin entre estos alelos mltiples asume di-
versas formas.
En el caso ms sencillo, un gen de tipo silvestre
codifica a un producto protenico funcional. El alelo
mutante, o los alelos mutantes, codifica(n) prote-
nas que no son funcionales.
Sin embargo, con frecuencia se presentan casos
en que una serie de alelos mutantes tiene fenotipos
diferentes. Por ejemplo, la funcin de tipo silvestre del
locus blanco de la Drosophila rmhmogasier es necesaria
para desarrollo del color rojo normal de los ojos. El
locus recibe su nombre segn el efecto de mutaciones
(nulas) extremas, las cuales provocan que la mosca
tenga ojos blancos en homocigotos mutantes.
Para describir a los alelos mutantes y a los de tipo
silvestre, el genotipo silvestre se indica mediante un
superndice
"
ms
"
(+) despus del nombre del locus
(w* es el alelo silvestre para los ojos [rojos] de la D.
melmiogaster). En algunos casos se utiliza el smbolo
+ para describir el alelo de tipo silvestre, y slo los
alelos mutantes se indican con el nombre del locus.
Una forma completamente defectuosa del gen (o
ausencia de fenotipo) suele indicarse mediante un su-
perndice "menos
"
(-). Para poder disringuir entre una
variedad de alelos mutantes con efectos diferentes,
pueden utilizarse otros superndices, como w' o w*.
El alelo u'* es dominante respecto de cualquiera
otro en los heterocigotos. Hay muchos alelos mutan-
tes diferentes; una muestra (pequea) se ilustra en la
FIGURA 2.5. Si bien algunos alelos carecen de color de
ojos, muchos otros producen algn color, de modo
que cada uno de estos alelos mutantes representar
una mutacin diferente del gen, la cual no elimina
por completo su funcin, sino que deja una actividad
residual que produce un fenotipo caracterstico. En
un homocigoto, estos alelos son denominados por el
color de los ojos. (La mayora de los alelos w afectan
la cantidad de pigmento del ojo. Los ejemplos de la
figura estn organizados [ms o menos] en orden
descendente de cantidad de color, pero otros, como
el w5", afectan el patrn en el cual es depositado.)
Cuando existen muchos alelos, un animal pue-
de ser un heterocigoto que porte dos alelos mutantes
diferemes, y su fenotipo depender de la naturaleza
de la actividad residual de cada alelo. En principio,
la relacin entre dos alelos mulantes no difiere de la
que se observa entre los alelos mutantes y los de
2.5 Un locus puede tener numerosos alelos mutantes diferentes
Cada alelo llene un fenotipo diferente
Alelo
Fenotipo del homocigoto
ojos rojos (fenotipo silvestre)
sangre
vf
*
cereza
w
"1
gamuza
w
h
miel
wa
albaricoque
w
e
eosina
w
'
marfil
cscara de limn (amarillo limn)
moteado, el color varia
W
1
blanco (sin color)
FIGURA 2.5 El locus w tiene una serie extensa de alelos cuyos
fenotipos van del color de tipo silvestre (rojo) a la ausencia
total de pigmento.
tipo silvestre: un alelo puede ser dominante, puede
haber dominancia parcial, o codominancia.
WfM Un locus puede tener ms
de un alelo de tipo silvestre
Concepto principal
.
Un locus puede tener una distribucin polimrfica de
alelos sin un alelo individual que pueda ser considerado
como el nico de tipo silvestre.
No necesariamente hay un solo tipo de alelo silves-
tre en un locus especfico, por ejemplo, el control
del sistema del grupo sanguneo. La falta de fun-
cin es representada por el tipo nulo, o grupo O. No
obstante, los alelos funcionales Ay B proporcionan
actividades codominantes entre s y dominantes
respecto del grupo O. Las bases de esta relacin se
ilustran en la FIGURA 2.6.
El antgeno O (o H) se genera en todos los indivi-
duos, y consiste de un grupo carbohidrato particular
que se agrega a las protenas. El locus ABO codifica
a una enzima galactosil-transferasa que agrega otro
grupo de azcar al antgeno O. La especificidad de
esta enzima determina el grupo sanguneo. El alelo 4
da lugar a una enzima que utiliza el cofactor UDP-N-
acetilgalactosa y crea el antgeno A. El alelo B produ-
ce una enzima que utiliza el cofactor UD'-galactosa
y crea el antgeno B. Las versiones A y B de la pro-
tena transferasa difieren en cuatro aminocidos que
presumihlemente afectan su reconocimiento del tipo
de cofactor. El alelo 0 tiene una mutacin (delecin
pequea) que elimina la actividad, de modo que en
el antgeno O no hay modificaciones.
Esto explica porqu los alelos A y B son domi-
nantes en los heterocigolos AO y BO: la actividad
La galactoslltransferasa crea a los antigenos A y B
GalNAcal
l
:
antgeno A qUB
: 2
: t
Fucat
transferasa A j
: \/MAm(/ 1
gen A
GalBl-R
2 Delecin 4 cambios de aminocidos
Fucaj
antgeno O
gen B
; transferasa B f
.
Galal
i
.
antgeno B
Ga'P1""
T
Fucal
Fenotipo Genotipo
Actividad
0 OO
Ninguna
A AOoAA N
-Ac-gal transferasa
B BOo BB Gal transferasa
AB AB GalN-Ac-Gal-transferasa
FIGURA 2.6 El locus del grupo sanguneo ABO codifica a la
galactoslltransferasa cuya especificidad determina el grupo
sanguneo.
transferasa correspondiente crea el antgeno A o el
B. Los alelos A y B son codominantes en los hete-
rocigotos AB debido a que ambas actividades trans-
ferasa estn expresadas. El homocigoto OO es nulo
y no tiene ninguna actividad, por lo tanto, carece-
de ambos antgenos.
Ni A ni B pueden ser considerados nicamente
como de tipo silvestre porque representan actividades
alternativas, ms que prdida o ganancia de funcin.
Una situacin como sta, en la que hay mltiples ale-
los funcionales en una poblacin, se describe como
polimorfismo (vase la seccin 4.3, Los genomas
individuales muestran una variacin extensa).
WWM La recombinacin ocurre
por intercambio fsico de DNA
Conceptos principales
. La recombinacin es resultado del entrecruzamiento
en los quiasmas e involucra a dos de las cuatro
cromtidas.
.
La recombinacin ocurre por rompimiento y reunin,
que tienen lugar a travs de un intermediario de DNA
hbrido.
CAPTULO 2 Los genes codifican protenas
i entrecruzamlenlo ocurre en la etapa de cuatro cadenas
Jn bivalente
-
ontiene 4 cromtidas,
2 de cada progenitor
A:
A
a
a
B
B
b
b
El quiasma
es provocado por
entrecruzamiento entre dos
39 las cromtidas
Dos cromosomas siguen siendo
os progenitores ( S y ab).
Los cromosomas recombinantes
contienen material de cada
orogenitor y tienen nuevas
combinaciones genticas {Ab y aS).
A.
A:
a i
a
= B
= b
= B
b
FIGURA 2.7 La formacin dei quiasma es responsable de la
i
'
oduccin de recombinantes.
La recombinacion gentica describe la generacin
de combinaciones nuevas de alelos en cada gene-
racin de organismos diploides. Las dos copias de
cada cromosoma pueden tener diferentes alelos en
algunos loci. Intercambiando las partes correspon-
dientes entre los cromosomas, se pueden generar
cromosomas recombinantes diferentes de los cro-
mosomas progenitores.
La recombinacin resulta de un intercambio f-
sico de material cromosrnico, fenmeno visible en
el entrecruzamiento que ocurre durante la meiosis
i divisin especializada por la que se producen las c-
lulas germinales haploides). La meiosis empieza con
una clula que ha duplicado sus cromosomas, de tal
forma que posee cuatro copias de cada uno. En las
primeras etapas de la meiosis, esas cuatro copias estn
ntimamente relacionadas (en sinapsis) en una estruc-
tura llamada bivalente. En esta etapa, cada unidad
cromosmica se denomina cromtida. Los intercam-
bios en pares de material ocurren entre cromtidas.
El resultado visible de un evento de entrecruza-
miento se denomina quiasma, y se ilustra a manera
de diagrama en la FIGURA 2.7. Un quiasma es un sitio
en el que dos de las cromtidas de un bivalente se
han roto en los puntos correspondientes. Los extre-
mos rotos se han reunido de forma entrecruzada, ge-
nerando nuevas cromtidas. Cada cromtida nueva
est formada por material proveniente de una cro-
mtida de un lado del punto de unin y por material
proveniente de la otra cromtida en el lado opuesto.
Las dos cromtidas recombinantes poseen estructuras
recprocas. El evento se define como rotura y re-
unin. Su naturaleza explica porqu un solo evento
de recombinacin puede producir slo el 50% de re-
combinantes: cada evento de recombinacin involu-
cra slo dos de las cuatro cromtidas asociadas.
s recombinantes tienen ONA hbrido
Molculas de DNA progenitor
iiiimmmmmr
mrimmmrtmi
i
Recombinacin intermedia
1 -L
i
-ULL
Recombinantes
iiiimiiimimiii
nmmmmiiiii
FIGURA 2.8 La recombinacin implica el apareamiento entre las
caderas complementarias de dos dplex de DNA progenitores.
La complementariedad de las dos cadenas de
DNA es esencial para el proceso de recombinacin.
Cada una de las cromtidas que se muestran en
la Figura 2.7 consiste en un largusimo dplex de
DNA. Para que stas se rompan y reconecten sin
prdida de material, se requiere de un mecanismo
que reconozca exactamente as posiciones corres-
pondientes, lo cual sucede gracias al apareamiento
complementario de bases.
La recombinacin implica un proceso en el cual
las cadenas individuales de la regin de entrecru-
zamiento intercambian parejas. En la iURA 2.8 se
muestra que este evento da lugar a un fragmento
de DNA hbrido, en el cual la cadena individual
de un dplex se aparea con su complemento prove-
niente del otro dplex. Por supuesto, el mecanismo
involucra otras etapas (las cadenas deben romperse
y resellarse) que se analizarn en detalle en el Cap-
tulo 20, Sistemas de reparacin, pero la caracterstica
crucial que hace posible ia recombinacin exacta es
la complementariedad de las cadenas de DNA. La
figura muestra slo algunas etapas de la reaccin,
pero podemos observar que en la recombinacin
intermedia se forma un fragmento de DNA hbrido
cuando una sola cadena cruza de un dplex a otro.
Cada recombinante est formado por un dplex de
DNA progenitor del lado izquierdo, el cual est co-
nectado por un fragmento de DNA hbrido al otro
dplex progenitor del lado derecho. Cada dplex de
2.7 La recombinacin ocurre por intercambio fsico de DNA
DNA corresponde a una de las cromtidas implicadas
en el proceso de recombinacin de la Figura 2.7.
La formacin del DNA hbrido exige que las se-
cuencias de los dplex recombinantes se encuentren
lo suficientemente cerca como para lograr el aparea-
miento entre las cadenas complementarias. Si no hay
diferencias entre los dos genomas progenitores en
esta regin, la formacin de DNA hbrido ser perfec-
ta. Sin embargo, la reaccin puede ser tolerada aun
cuando haya diferencias diminutas, en cuyo caso, el
DNA hbrido tiene puntos de apareamiento errneo,
en los cuales una base de una cadena confronta a una
base de la otra cadena que no es complementaria.
La correccin de dichos errores de apareamiento es
otra caracterstica de la recombinacin gentica (va-
se Captulo 20, Sistemas de reparacin).
El EL cdigo gentico se Lee
en triptetes
Conceptos principales
.
El cdigo gentico se lee en tripletos de rucletidos
denominados codones.
.
Los tripletes no estn superpuestos y se leen a partir
de un punto fijo de inicio.
.
Las mutaciones que insertan o eliminan bases
individuales provocan un cambio en los grupos de
tripletes despus del sitio de la mutacin.
.
Las combinaciones de mutaciones que insertan o
eliminan a tres bases en conjunto (o en mltiplos
de tres) insertan o eliminan aminocidos, pero no
cambian la lectura de los tripletes ms all del ltimo
sitio de mutacin.
Cada gen representa una cadena protenica espec-
fica. El concepto de que cada protena est formada
por una serie de aminocidos en particular, data de la
caracterizacin de Sangerdc la insulina, de la dcada
de 1950. El descubrimiento de que un gen est for-
mado por DNA dio lugar a la interrogante de cmo
una secuencia de nucletidos del DNA represen-
ta una secuencia de aminocidos en las protenas.
Una caracterstica clave de la estructura general
de! DNA es que es independiente de la secuencia parti-
cular de los nucletidos que la componen. La secuencia
de nucletidos del DNA es importante no por su
esiruciura per se. sino porque codifica a la secuencia
de aminocidos que constituye al poiipptido co-
rrespondiente. La relacin entre una secuencia de
DNA y la secuencia de la protena correspondiente
se denomina cdigo gentico.
La estructura y la actividad enzimtica de las
protenas se deben a su secuencia primaria de ami-
nocidos, que al ser determinada en cada una, el
gen puede transportar toda la informacin necesa-
ria para especificar una cadena polipeptdica acti-
va. De esta manera, un slo tipo de estructura -el
gen-es susceptible de representarse a s mismo en
innumerables formas de polipptidos.
En conjunto, los diversos productos protenicos
de una clula asumen las actividades catalticas y
estructurales responsables de establecer su fenoti-
po. Obviamente, adems de las secuencias que co-
difican a las protenas, el DNA tambin contiene
ciertas secuencias cuya funcin es ser reconocidas
por molculas reguladoras, usuaimente protenas.
En este caso, la funcin del DNA es determinada
directamente por su secuencia, no a ira vs de un
cdigo intermediario. Ambos tipos de regin, los
genes expresados como protenas y las secuencias
reconocidas como tales, constituyen la informacin
gentica.
El cdigo gentico es descifrado por un meca-
nismo complejo que imerpreta las secuencias de los
cidos nucleicos, el cual es esencial si la informacin
transportada en el DNA tiene que tener algn signi-
ficado. En una regin dada, slo una de las dos ca-
denas de DNA codifica a una protena, por lo tanto,
el cdigo gentico se representa como una secuen-
cia de bases (ms que como pares de bases).
El cdigo gentico se lee en grupos de tres nu-
cletidos, cada uno de los cuales representa a un
aminocido; cada secuencia de tres nucletidos se
denomina codn. Un gen incluye una serie de co-
dones que se lee de forma secuencial desde un pun-
to de partida de un extremo hasta un pumo final, en
el otro extremo. Escrita en la direccin convencio-
nal 5
'
a 3'. la secuencia de nucletidos de la cadena
de DNA que codifica a la protena corresponde a la
secuencia de aminocidos de la protena escrita de
terminal N hasta terminal C.
El cdigo gentico se lee en tripletes no superpues-
tos a partir de un punto fijo de inicio:
.
No superpuestos implica que cada codn
est formado por tres nucletidos y que los
codones sucesivos estn representados por
trinucletidos sucesivos.
.
El uso de un punto fijo de iniciacin significa
que el ensamblaje de una protena debe co-
menzar en un extremo y avanzar hacia el
otro, de manera que las diferentes partes
de la secuencia codificadora no puedan ser
ledas de manera independiente.
La naturaleza del cdigo pronostica que dos tipos de
mutaciones tendrn efectos diferentes. Si una secuen-
cia en particular se lee de forma secuencial como:
UUU AAA GGG CCC (codones)
aal aa2 aa3 aa4 (aminocidos)
entonces una mutacin puntual afectar slo a un
aminocido. Por ejemplo, la sustitucin de una A
por cualquier otra base (X) provoca que aa2 sea
remplazado por aa5:
CAPTULO 2 Los genes codifican protenas
UUU AAX GGG CCC
aal aa5 aa3 aa4
porque slo el segundo codn ha sufrido cambios.
Sin embargo, una muiadn que inserta o elimina
una sola base cambiar a los grupos de tripletes de toda la
secuencia subsiguiente. Un cambio de este tipo se lla-
ma desplazamiento del marco de lectura. Una
insercin puede asumir la siguiente forma:
UUU AAX AGG GCC C
aal aa5 aa6 aa7
Debido a que la nueva secuencia de tripletes
es completamente diferente a la antigua, la secuencia
completa de aminocidos de la protena se modiea
a partir del sitio de la mutacin, de modo que es
probable que la funcin de la proicna se pierda por
completo. Las mutaciones de cambio del marco de
lectura son inducidas por las acridinas, compuestos
que se unen al DNA y que distorsionan la estructu-
ra de la doble hlice, provocando la incorporacin
de bases adicionales o la omisin de bases durante
el proceso de replicadn. Cada evento mutagnico
provocado por una acridina resulta en la adicin o
eliminacin de un solo par de bases.
Si se produce un mutante de acridina por, diga-
mos, la adicin de un nucleotido, ste debe regresar
al tipo silvestre por la delecin de dicho nucletido.
Sin embargo, la reversin tambin puede ser provo-
cada por delecin de una base diferente en un sitio
cercano al primero. Las combinaciones de dichas
Tipo silvestre
gentico se lee en tripletes
GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU
'
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
Insercin
~~
\ GCU GCU AGC UGC UGC UGC UGC UGCU
Ala Ala Ser Cys Cys Cys Cys Cys
Delecin 5
~
) GCU GCU GCU GCU GCU CUG CUG CUG
Ala Ala Ala Ala Ata Leu Leu Leu
Mutante doble A G
~
nQCU GCU AGC UGC UGCUCU GCU GCU G-
Ala Ala Ser Cys Cys Ser Ala Ala
Mutante triple
IGCU GCA UGC UGC AUG CAU GCU GCUI
Ala Ala Cys Cys Met His Ala Ala
Secuencia de tipo silvestre Secuencia mutante
mutaciones proporcionan evidencias reveladoras
referentes a la naturaleza del cdigo gentico.
En la FIGURA 2.1 se ilustran las propiedades de
las mutaciones de cambio del marco de lectura. Una
insercin o una delecin cambia la secuencia com-
pleta de la protena despus del sitio de la mutacin,
pero la combinacin de una insercin y una delecin
hace que el cdigo se lea de forma incorrecta slo
entre los dos sitios de mutacin; la lectura correcta
se restablece despus del segundo sitio.
En 1961, mediante el anlisis gentico de las mu-
taciones por acridina en la regin rll del fago T6 so
demostr que todas las mutaciones podran ser cla-
sificadas en uno de dos grupos descritos como (+) o
(-). Cada tipo de mutacin provoca por s misma un
cambio en el marco de lectura: el tipo (4-) por adicin
de una base y el tipo (-) por delecin de una base. Las
combinaciones de minantes dobles de los tipos (++) y
{--) siguen mostrando un comportamiento mutan-
te, pero las combinaciones de los tipos (+ -) o (- +)
se suprimen una a la otra. En este caso, la segunda
mutacin se describe como supresora del cambio
en el marco de lectura de la primera imiuuiii.
(En el contexto de este trabajo, la palabra "supresor"
se utiliza en un sentido inusual porque la segunda
mutacin est en el mismo gen que la primera.)
Estos resultados muestran que el cdigo gentico
debe ser ledo como una secuencia establecida por el
punto de iniciacin, de modo que las adiciones o las
deleciones se compensan mutuamente, mientras que
las adiciones o las deleciones dobles siguen siendo
imitantes. De cualquier forma, estos hallazgos no re-
velan cuntos nucletidos constituyen cada codn.
Cuando se construyen imitantes triples, slo las
combinaciones (+++) y ( ) muestran el fenoti-
po silvestre, mientras que las otras siguen siendo
minantes. Si se considera que tres adiciones o tres
deleciones corresponden respectivamente a la adi-
cin o la omisin global de un solo aminocido, esto
implica que el cdigo se lee en tripletes. Entre los
dos sitios de mutacin hay una secuencia incorrecta
de aminocidos, mientras que a cada lado de los
sitios de mutacin las secuencias siguen siendo de
tipo silvestre, como se indica en la Figura 2.9.
Cada secuencia tiene tres
marcos de Lectura posibles
FIGURA ?.9 Las mutaciones de cambio del marco de lectura
muestran que el cdigo gentico se lee en tripletes desde un
punto fijo de inicio.
Concepto principal
.
En general, slo un marco do lectura es traducido, los otros
dos son bloqueados por seales frecuentes de terminacin.
Si el cdigo gentico se lee en tripletes no superpues-
tos, son tres las formas posibles de traducir cualquier
'
.
' Cada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles
secuencia de nucletidos en protenas, dependiendo
del punto de iniciacin; a dichas secuencias se les
llama marcos de lectura. Para la secuencia
ACGACGACGACGACGACG
los tres marcos de lectura posibles son
ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG
CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA
GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC
Un marco de lectura que consta exclusivamente
de tripletes que representan a aminocidos, se llama
marco de lectura abierto u ORF (open readingfra-
me). Una secuencia que se traduce en una protefna
tiene un marco de lectura que empieza con un co-
dn de iniciacin especial (AUG) y que posterior-
mente se extiende a travs de una serie de tripletes
que representan a aminocidos, hasta terminar en
uno de los tres tipos de codones de terminacin
(vase el Captulo 7, El RNA mensajero).
Cuando un marco de lectura no puede ser tra-
ducido en protena porque con recuencia se pre-
sentan codones de terminacin, se dice que est
bloqueado. Si una secuencia est bloqueada en los
tres marcos de lectura, no puede tener la funcin de
codilicara una protena.
Cuando se obtiene la secuencia de una regin de
DNA de funcin desconocida, se analiza cada marco
de lectura posible para determinar si est abierto o
bloqueado. Normalmente, no ms de uno de los tres
marcos de lectura posibles est abierto en un solo
fragmento de DNA. En la M n se muestra el
ejemplo de una secuencia que puede leerse en solo
un marco de lectura debido a que los marcos de lec-
tura alternativos estn bloqueados por codones de
terminacin frecuentes. Es poco probable que por
casualidad exista un marco de lectura largo y abier-
to; si no se tradujera en una protena, no habra pre-
sin selectiva para evitar la acumulacin de codones
de terminacin, de modo que la identificacin de un
marco de lectura largo y abierto se considera como
evidencia en primera instancia de que la secuencia se
traduce en protena en dicho marco. Un ORF para
el cual no se ha identificado un producto protenico
suele denominarse marco de lectura no identificado
(URF, unidentified reading frame).
Una secuencia de DNA usualmente contiene
un marco de lectura abierto
Los genes procariticos son
coLineales con sus protenas
Iniciacin
J
Slo un marco de lectura abierto Terminacin
AUQAGCAUAAAAAUAGAGAGA, UUCQCUAGAQUUAAUGAAGCAUA .
El segundo marco de lectura
est bloqueado
V
El tercer marco de lectura
est bloqueado
FIGURA 2.10 Un marco de lectura abierto empieza con AUG y contina
en tripletes hasta ur codn de terminacin. Los marcos de lectura
bloqueados pueden ser interrumpidos con frecuencia por codones de
terminacin.
Conceptos principales
Un gen procaritico es un fragmento constante de 3N
nucletidos que codifica a iV aminocidos.
El gen, el RNAm y la protena son todos colineales.
Comparando la secuencia de nucletidos de un gen
con la secuencia de aminocidos de una protena,
podemos determinar directamente si el gen y la
protena son colineales; esto es, si la secuencia de
nucletidos del gen corresponde exactamente a la
secuencia de aminocidos de la protena. En las bac-
terias y sus virus hay una equivalencia exacta, cada
gen contiene un fragmento continuo de DNA cuya
longitud es directamente proporcional al nmero de
aminocidos de la protena que representa. Es ne-
cesario un gen de 3A/ pares de bases (bp, base pairs)
para codificar una protena de N aminocidos, de
acuerdo con el cdigo gentico.
La equivalencia del gen bacteriano y su produc-
to significa que un mapa fsico de DNA correspon-
der exactamente aun mapa de aminocidos de la
protena. Qu tan bien se acoplan estos mapas con
el mapa de recombinacin?
El paralelismo del gen y la protena se investig
originalmente en el gen de la triptfano sintetasa
de E. coli. La distancia gentica se valor a travs del
porcentaje de recombinacin entre mutaciones, en
tanto que la distancia de la protena se midi por
medio del nmero de aminocidos que separaban a
los sitios de remplazo. En la FIGURA 2.11 se comparan
ambos mapas. El orden de siete sitios de mutacin es
el mismo que el orden de los sitios correspondien-
tes a los remplazos de aminocidos, y las distancias
de recombinacin son relativamente similares a las
distancias reales de la protena. El mapa de recom-
binacin ampla las distancias entre algunas muta-
ciones, pero por lo dems, la distorsin del mapa de
recombmacin es escasa, respecto del mapa fsico.
El mapa de recombinacin hace ver dos puntos
generales acerca de la organizacin del gen. Muta-
ciones diferentes pueden provocar que un amino-
cido de tipo silvestre sea remplazado por sustitutos
diferentes. Si dos de estas mutaciones no pueden
recombinarse, deben involucrar mutaciones pun-
tuales diferentes en la misma posicin del DNA. Si
las mutaciones pueden separarse en el mapa gen-
tico, pero afectan al mismo aminocido en el mapa
superior (las lneas comunicantes convergen en la
figura), deben implicar a mutaciones puntuales en
posiciones diferentes que afectan al mismo amino-
cido debido a que la unidad de recombinacin ge-
32
CAPTULO 2 Los genes codifican protenas
El gen y la proteina son colineales
Gl.
Gli GU
(gfr Proteina | &j;
de tipo silvestre ;!
1
Mapa de aminoci
do e la |rot na
'-
Distancia entre mtaciones -
I " i Mi hi
X/ Mapa de recombin l| de H V
i Protena mutante; Ci' (jfr ]
.di m
os
Mutaciones diferentes Las mutaciones pueden
en la misma posicin
estar separadas, pero afectan
a la misma posicin
FIGURA 2.11 El mapa de recombinacin del gen de la tript-
fano sintetasa corresponde a la secuencia de aminocidos de
la protena.
nlica (en realidad 1 bp) es ms pequea que la uni-
dad que codifica al aminocido (en realidad 3 bp).
Numerosos procesos son
necesarios para expresar el
producto protenico de un gen
Conceptos principales
.
Un gen procaritico se expresa por transcripcin en
RNAm y posteriormente por traduccin del RNAm en
una protena.
.
En las eucariotas, un gen puede contener regiones
internas no representadas en la protena.
.
Las regiones internas son eliminadas del transcrito de
RNA por el corte y empalme de ste para dar origen a
un RNAm colineal respecto del producto protenico.
.
Cada RNAm est formado por una regin lder 5'
no traducida, una regin codificadora y una regin
posterior 3
'
no traducida.
Al comparar un gen y una protena se trata slo
con la secuencia de DNA ubicada entre los puntos
correspondientes a los extremos de la proteina. Sin
embargo, un gen no se traduce directamente a una
protena, se expresa mediante la produccin de un
RNA mensajero (RNAm. messenger RNA), que es
un cido nucleico intermedio utilizado, efeaiva-
El RNA es complementario de una cadena de DNA
El DNA est formado por dos cadenas apareadas por medio de bases
cadena superior
5' ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC
3' TACGGCAATCTGGCAATGGCCTGGACTG
cadena inferior
I Sntesis
|
de RNA
5' AUGCCGUUAGACCGUUAGCGGACCUGAC 3
El RNA tiene la misma secuencia que la cadena superior de DNA;
es complementara a la cadena inferior de DNA
FIGURA 2.1 ] El RNA se sintetira utilizando una cadena de DNA
como molde para el apareamiento complementario ce las bases.
mente, para sintetizar proteina (como se observa
en detalle en el Captulo 7, El RNA mensajero).

.1 RNA mensajero se sintetiza por el mismo

proceso de apareamiento complementario de bases
utilizado para replicar el DNA, con la importante
diferencia de que corresponde slo a una cadena del
DNA de doble hlice. En la figura 2.12 se muestra
que la secuencia del RNAm es complementaria de
la secuencia de una cadena de DNA y que es idn-
tica (excepto por el remplazo de T por U) a la otra
cadena de DNA. La forma convencional de escribir
las secuencias del DNA implica que la cadena de
arriba vaya en direccin 5
'
-
> 3
'
,
con la secuencia
igual a la del RNA.
El proceso por el cual un gen da lugar a una
protena se llama expresin gnica, que en las
bacterias consta de dos etapas. La primera etapa
es la transcripcin, durante la cual se produce
una copia de RNAm de una cadena del DNA, en
tanto que la segunda es la traduccin del RNAm
en una protena. Mediante este proceso se lee en
tripletcs la secuencia de un RNAm para originar
la serie de aminocidos que crea a la proteina co-
rrespondiente.
Un RNAm incluye a una secuencia de nucle-
tidos que corresponde a la secuencia de aminoci-
dos de la protena; esta parte del cido nucleico se
conoce como regin codificaclora. Sin embargo,
el RNAm incluye secuencias adicionales en ambos
extremos, las cuales no representan directamente
a una proteina. l a regin 5
'
no traducida se llama
lder, en tanto que a la regin 3' no traducida se le
conoce como remolque.
El gen incluye la secuencia completa represen-
tada en el RNA mensajero. Ocasionalmente, las
mutaciones que impiden la funcin del gen se en-
cuentran en las regiones adicionales no codificado
ras, con lo cual se confirma la perspectiva de que
dichas regiones comprenden una parte legtima de
la unidad gentica.
2
.11 Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto protenico de un gen
33
Un gen corresponde a un transcrito de RNA
i
Regin lder Remolque
/\y\ v rv sy\/3' RNA
1
1
1
La longitud del RNA define a la regin del gen
1
N t W W'c Protena
,
1
La protena define a la regin codificadora
FIGURA 2. El gen puede ser ms Largo que la secuencia que
codifica a la proteina.
La transcripcin y la traduccin bacterianas
ocurren de manera simultnea
Transcripcin
DNA RNA
Traduccin
El ribosoma traduce al RNAm
En las bacterias, la transcripcin y la traduccin ocurren
en el mismo compartimiento.
En la FIGURA 2.13 se ilustra esta situacin, en la
cual se considera que el gen comprende un frag-
inenlo continuo de DNA necesario para producir
una protena en particular; incluye la secuencia
codificadora para dicha protena, pero tambin se-
cuencias a ambos lados de la regin codificadora.
Una bacteria est formada por un solo compar-
timiento, de modo que la transcripcin y la traduc-
cin ocurren en el mismo lugar, como se ilustra en
la FIGURA 2.u. En las eucariotas, la transcripcin
llene lutdr cu el ncleo, no obstante
, el producto
de RNA debe ser transportado al citoplasma para ser
traducido. En los genes ms simples de las eucario-
tas (igual que en las bacterias), el RNA transcrito
es de hecho el RNAm. Sin embargo, para los genes
ms complejos, el transcrito inmediato del gen es
el pre-RNAm, que requiere de cierto procesa-
miento para generar al RNAm maduro. Las etapas
bsicas de la expresin genica de una eucariota se
bosquejan en la n 2.15 Este proceso resulla en
El RNA de las eucariotas es procesado y exportado
EXN 1 EXN 2
DNA \/\ 7VT \/\/;r
NCLEO Tra'1SCnPCIOn .
pre-RNAm
"
] INTRN f - [Corte y empalme]
Transporte J
(
Ribosoma
[ Traduccin ]
Proteina
CITOPLASMA
IGURA 2.Ir La expresin de un gen es un proceso que sucede
en m'tiples etapas.
una separacin espacial entre la transcripcin (en el
ncleo) y la traduccin (en el citoplasma).
La etapa ms importante del procesamiento es el
corte y empalme del RNA. Numerosos genes de las
eucariotas (y casi todos los de las eucariotas superio-
res) contienen regiones internas que no codifican pro-
tenas. En el proceso de corte y empalme se eliminan
estas regiones del pre-RNAm para generar un RNA
con un marco de lectura abierto y continuo (vase la
Figura 3.1). Otros eventos procesadores que ocurren
en esta etapa implican la modificacin de los exiremos
5
'
y 3' del pre-RNAm (vase la Figura 7.16).
La traduccin tiene lugar mediante un complejo
mecanismo que incluye tanto protenas como com-
ponentes de RNA. La
"
mquina
"
que se encarga del
proceso es el rihosoma, un gran complejo que incluye
algunas molculas extensas de RNA (RNA rihosmico,
o RNAr) y numerosas protenas pequeas. El proceso
por el cual se reconoce qu aminocido corresponde
a un triplete de nucletidos en particular implica un
RNA ci transferencia intermedio (o RNAt); hay cuan-
do menos una especie de RNAt para cada aminoci-
do. Numerosas protenas accesorias estn implicadas.
La traduccin se describe en el Captulo 7, El RNA
34 CAPTULO 2 Los genes codifican protenas
Las protenas se unen a ios sitios
de control de actuacin en cis
mensajero, pero considrese por ahora que los ribo-
somas son las grandes estructuras que se mueven a
lo largo del RNAm en la Figura 2.14.
El punto importante de esta etapa es que el pro-
ceso de la expresin gnica implica al RNA no slo
como sustrato esencial, tambin como proveedor
de componentes para el mecanismo. Los compo-
nentes RNAr y RNAt son codificados por genes y
generados por el proceso de transcripcin (como el
RNAm, excepto que no hay una etapa de traduccin
subsiguiente).
un Las protenas actan en trans,
pero Los sitios del DNA, en cis
Conceptos principales
.
Todos los productos de los genes (RNA o protenas)
actan en trans: pueden actuar en cualquier copia de
un gen de la clula.
.
Las mutaciones de actuacin en cis identifican
a las secuencias de DNA que son el objetivo de
reconocimiento de los productos de. actuacin en trans.
No se expresan como RNA ni como protenas, y afectan
slo al fragmento contiguo de DNA.
Una etapa clave para la definicin del gen fue el
descubrimiento de que todas sus partes deben estar
presentes en un fragmento contiguo de DNA. En la
terminologa gentica, se dice que la configuracin
de los sitios localizados en el mismo DNA est en cis,
mientras que de la configuracin de los localizados
en dos molculas diferentes de DNA, se dice que
est en trans, de modo que dos mutaciones pueden
presentarse en cis (en el mismo DNA) o en trans (en
molculas diferentes de DNA). La prueba de com-
plementacin recurre a este concepto para determi-
nar si dos mutaciones estn en el mismo gen (vase
la Figura 2.3 de la Seccin 2.3. Las mutaciones que
se presentan en el mismo gen no se pueden comple-
mentar), y ahora podemos ampliar el concepto de
la diferencia entre los efectos cis y trans de la de-
finicin de la regin codificadora de un gen a la
descripcin de la interaccin entre los elementos
reguladores y un gen.
Supongamos que la capacidad de un gen para
ser expresado depende de una protena que se une
al DNA cerca de la regin codificadora. En el ejem-
plo representado en la FIGURA 2.16, el RNAm puede
ser sintetizado slo cuando la protena est unida al
DNA, pero supngase que en la secuencia del DNA
en la cual se une esta protena ocurre una mutacin
y la protena ya no reconoce al DNA: el DNA ya no
podra expresarse.
Por lo tanto, un gen puede ser desactivado tanto por
una mutacin en un sitio de control, como por una mutacin
en una regin codificadora. Las mutaciones no pueden
La proteina se une
al sitio de control
\ Sitio de control Regin codificadora f$Hk
Dos tipos do
secuencias de DNA
El RNA
se sintetiza
\/\/\/\/\/
RNA
FIGURA 2.16 Los sitos de centro; del DNA proporcionan sitios
de unin para protenas; las regiones codificadoras se expresan
a travs de la sntesis de RNA.
Las mutaciones en los sitios de control son de actuacin en cis
Ambos alelos sintetizan RNA en el tipo silvestre
i
\AAAA

La mutacin en el sitio de control afecta slo al DNA contiguo

Mutacin
NO HAY SNTESIS DE RNA MEDIADA POR EL ALELO 1
La sntesis de RNA
contina a partir del alelo 2 1
wwx
FIGURA 2.17 Un sitio de actuacin en cis controla al DNA
adyacente, pero no influye en el otro alelo.
distinguirse genticamente porque ambos tienen la
propiedad de actuar slo en la secuencia del DNA del
alelo individual en el cual ocurren, sus propiedades
son idnticas en la prueba de complementacin, de
modo que una mutacin en una regin de control
se define como parte integrante del gen, de la misma
forma que una mutacin en la regin codificadora.
La FIGURA 2.17 muestra que una deficiencia en
el sitio de control afecta slo a la regin codificadora a
la cual est conectada; no afecta la capacidad del otro alelo
2
.12 Las protenas actan en trans, oero los sitios del DNA,
en cis 35
Una protema se une a todas las copias de la secuencia diana
La proteina activa acta en ambos alelos
i
jll VAAAA
1
vvvvx
La protena mulante no puede unirse a ninguno de los alelos
NO HAY SNTESIS DE RNA A PARTIR DEL ALELO 1
-
Protena mulante
NO HAY SINTESIS DE RNA A PARTIR DEL ALELO 2
Una mutacin de actuacin en trans de una protena
afecta a los dos alelos del gen que controla.
gen (o cistron) se transcribe en un producto de
RNA, el cual a su vez es traducido en una secuen-
cia polipeptdica si el gen codifica a una protena.
Se dice que un RNA o un producto protenico de
un gen son de actuacin en trans. Un gen se define
mediante la prueba de complementadn como una
unidad de un fragincmo individual de DNA. Se dice
que un sitio del DNA que regula la actividad de un
gen adyacente es de actuacin en cis.
Cuando un gen codifica a una protena, la re-
lacin entre la secuencia de DNA y la secuencia de
la protena depende del cdigo gentico. Slo una
de las dos cadenas de DNA codifica a una protena.
Un codn est formado por tres nucletidos que
representan un solo aminocido. Una secuencia
codificadora de DNA consiste en una serie de co-
dones, los cuales son ledos desde un punto fijo
de inicio. ln general, slo uno de los tres marcos
de lectura posibles puede ser traducido en pro-
tenas.
Un gen puede tener mltiples alelos; los rece-
sivos son provocados por mutaciones de perdida de
funcin que interfieren con la funcin de la prote-
na. Un alelo nulo tiene prdida total de la funcin.
Los alelos dominantes son provocados por mutacio-
nes de ganancia de funcin que crean una nueva
propiedad en la protena.
para expresarse. Una mutacin que acta exclusiva-
mente afectando las propiedades de la secuencia con-
tigua del DNA se denomina de actuacin en cis.
El comportamiento de la mutacin de actua-
cin en cis que se muestra en la Figura 2.17 se pue-
de comparar con el resultado de una mutacin en
el gen que codifica a la protena reguladora. En la
se muestra que la ausencia de protena
reguladora evitar que ambos alelos se expresen; se
dice que una mutacin de este tipo es de actuacin
en trans.
Revirtiendo el argumento, se sabe que si una
mutacin es de actuacin en trans. su efecto debe-
r ser ejercido a travs de algn producto difusible
(tpicamente una protena) que acte en mltiples
dianas en una clula. Sin embargo, si una mutacin
es de actuacin en cis. su funcin afectar directa-
mente a las propiedades del DNA contiguo, lo cual
significa que no se expresa en la forma de RNA o de una
protena.
QQ Resumen
Un cromosoma es un fragmento ininterrumpido de
DNA dplex que contiene numerosos genes. Cada
Referencias
El cdigo gentico se lee en tripletes
Revisiones
Roth, J. R. (1974). Frameshifi mutations. Annu. Rev. Cenet.
8
,
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Artculos de investigacin
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403 16.
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R. J. (1961). General nature of the genetic code for
proteins. Nature 192, 1227-1232.
Los genes procariticos son colineales
con sus protenas
Artculos de investigacin
Yanofsky, C, Drapeau, G.R., Guesl, J.R., and Garitn, B.C.
(1967). The complete amino acid seqnence of the
tryptophan synthetase A protein (subunit) and its coli-
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Yanofsky, C. et al. (1964). On the colincarity of gene struc-
ture and protein structure. Proc. Nati. Acad. Sci. USA,
51, 266-272.
CAPTULO 2 Los genes codifican protenas
El gen interrumpido
r
ESQUEMA DEL CAPTULO
mmm Introduccin
mwm Un gen interrumpido est formado por intrones y exones
.
Los intrones se eliminan mediante el proceso de corte y
empalme de RNA, el cual ocurre slo en configuracin ds
en una molcula individual de RNA.
.
Slo las mutaciones que ocurren en los exones pueden
influir en la secuencia de las proteinas; sin embargo,
las mutaciones de los intrones pueden afectar el
procesamiento del RNA y, por lo tanto, evitar la produccin
de proteinas
mitm Las endonudeasas de restriccin son una
herramienta esencial en el mapeo del DNA
.
Las endonudeasas de restriccin pueden utilizarse para
dividir al DNA en fragmentos definidos.
Un mapa se genera utilizando las superposiciones de
los fragmentos generados por diferentes enzimas de
restriccin.
mwm La organizacin de los genes interrumpidos puede
conservarse
.
Los intrones suelen detectarse por la presencia ae regiones
adicionales al comparar los genes con sus productos de
RNA mediante mapeo de restriccin o por microscopa
electrnica, sin embargo, la definicin definitiva se basa
en la comparacin de secuencias.
.
Los intrones normalmente conservan su posicin respecto
de genes homlogos cuando se comparan organismos
diferentes. Las longitudes de los intrones correspondientes
pueden variar mucho.
.
Normalmente los intrones no codifican protenas.
maum Las secuencias de Los exones se mantienen, no asi
las de los intrones
.
La comparacin entre genes relacionados de diferentes
especies muestra que las secuencias de los exones
correspondientes usualmente se conservan, pero la relacin
entre secuencias de intrones no es tan buena.
.
Los intrones evolucionan mucho ms rpidamente que los
exones debido a la falta de presin selectiva para producir
una protena con una secuencia til.
hbm La distribucin de tamaos de los genes es amplia
.
La mayoria de los genes de las levaduras son continuos, no
as los de las eucariotas superiores.
.
Los exones suelen ser cortos y codificar menos de 100
aminocidos.
.
Los intrones son cortos en las eucariotas inferiores, pero en
las superiores pueden llegar a tener varias decenas de kb
(kilobases) de longitud.
'.
La longitud total de un gen se determina principalmente
por sus intrones.
tM Algunas secuencias de DNA codifican a ms de
una proteina
.
El uso de codones alternativos de iniciacin o de
terminacin permite que se produzcan dos protenas
cuando una es equivalente a un fragmento de la otra.
.
Se pueden producir secuencias no homlogas de protenas a
partir de la misma secuencia de DNA cuando sta es leda en
marcos de lectura diferentes por dos genes (superpuestos).
.
Las protenas homlogas que difieren por la presencia
o ausencia de ciertas regiones se deben a un corte y
empalme diferencial (alternativo) en el cual se incluyen o
excluyen ciertos exones, ya sea por la inclusin o exclusin
de exones especficos o al optar por exones alternativos.
mw.m Cmo evolucionaron los genes interrumpidos?
.
La interrogante principal al respecto es si los genes se
originaron como secuencias interrumpidas por intrones o si
originalmente eran molculas ininterrumpidas.
.
Probablemente la forma original de la mayora de los genes
codificadores de protenas fue la interrumpida, si bien en
un principio los genes interrumpidos que codifican al RNA
pudieron haber sido molculas ininterrumpidas.
.
Una clase especial de intrones es mvil y puede insertarse
en los genes.
BSM Algunos exones pueden equipararse con funciones
protenicas
.
Lo que sugiere que los exones fueron las unidades
bsicas de la evolucin y que los primeros genes fueron
interrumpidos en lo siguiente:
.
La estructura gnica es igual entre genes de especies
muy distantes.
.
Muchos exones pueden ser equiparados con secuencias
codificadoras de protenas que tienen funciones
especficas.
.
En genes diferentes se encuentran exones relacionados.
KBI Los miembros de una familia de genes tienen una
organizacin comn
.
Se supone que una caracterstica comn de una agrupacin
de genes identifica una propiedad que antecede a la
separacin durante la evolucin.
.
La forma comn de organizacin de todos los genes de
globina, tres exones y dos intrones, sugiere que descienden
de un solo gen ancestral.
BII Se encuentra toda La informacin gentica
contenida en el DNA?
.
La definicin del gen se ha invertido, de "un gen : una
protena
"
a "una protena ; un gen".
.
La informacin sobre la posicin tambin es importante en
el desarrollo.
WfSM Resumen
37
Introduccin
La forma ms sencilla de un gen es un fragmento
de DNA colineal con su producto protenico. Los
genes bacterianos casi siempre son de este tipo, una
secuencia codificadora continua de 3iV pares de ba-
ses representa una protena de N aminocidos. Sin
embargo, en las eucariotas, un gen puede incluir
secuencias adicionales en la regin codificadora, las
cuales interrumpen a la secuencia que representa
a la protena. Estas secuencias se eliminan del pro-
ducto de RNA durante la expresin del gen, con lo
cual se genera un RNAm que incluye una secuen-
cia de nucletidos que corresponde exactamente al
producto protenico, de acuerdo con las reglas del
cdigo gentico.
Las secuencias de DNA que forman un gen in-
terrumpido se dividen en las dos categoras descritas
en la FIGURA 3.1;
.
Los exones son las secuencias representa-
das en el RNA maduro. Por definicin, un
gen comienza y termina con exones que co-
rresponden a los extremos 5
'
y 3' del RNA.
.
Los intrones son secuencias interpuestas
que se eliminan cuando el transcrito pri-
mario es procesado para dar lugar al RNA
maduro.
Las secuencias de exones siguen el mismo or-
den en el gen y el RNA, sin embargo, un gen in-
terrumpido es ms largo que su producto final de
RNA debido a la presencia de los intrones.
Los intrones son eliminados para formar RNAm
a partir de un gen interrumpido
EXNJ
EXN 2
_
EXN 3
DNA jSBBBB(TNTRON A/ i'NTBN
| Sntesis de RNA
pre-RNAm
jlN'T.RN 2j/\y\
Por corte y empalme
se eliminan los intrones
RNAm
Protena
Sntesis protenica
La longitud del RNA precursor (no RNAm) define la regin del gen
En el gen estn separadas las regiones codificadoras individuales
FIGURA 3.1 Los genes interrumpidos se expresan a travs de
un precursor del RNA. Los intrones se eliminan cuando se cor-
tan y empalman los exones. El RNAm tiene slo las secuencias
de los exones.
La expresin de los genes interrumpidos requie-
re de un paso adicional que no es necesario en los
continuos. El DNA de un gen interrumpido origina
una copia de RNA (un transcrito) que representa
exactamente a la secuencia del genoma. Sin embar-
go, este RNA slo es un precursor, no puede utilizar-
se para producir protenas; deben eliminarse primero
los intrones del RNA para dar lugar a un RNA men-
sajero formado solamente por una serie de exones.
Este proceso se conoce como corte y empalme (vase
la seccin 2.11, Para expresar el producto proteni-
co de un gen son necesarios numerosos procesos) e
implica precisamente la delecin de un intrn del
transcrito primario y el empalme de los extremos
del RNA en ambos lados para formar una molcula
con enlaces covalentes intactos (vase Captulo 26,
Corte, empalme y procesamiento del RNA).
El gen comprende la regin del genoma locali-
zada entre los puntos correspondientes a las bases
terminales 5' y 3' del RNAm maduro. Se sabe que
la transcripcin se inicia en el extremo 5' del RNAm
y que suele ir ms all del extremo 3
'
, formado por
divisin del RNA (vase la seccin 26.19, Los ex-
tremos 3' de los RNAm son formados por divisin
y poliadenilacin). Se considera que el gen incluye
las regiones reguladoras de ambos lados, las cuales
son necesarias para iniciar y (en ocasiones) terminar
la expresin gnica.
un Un gen interrumpido est
formado por intrones y exones
Conceptos principales
.
Los intrones son eliminados por el proceso de corte y
empalme del RNA, el cual ocurre slo en configuracin
ds en una molcula individual de RNA.
.
Slo las mutaciones ocurridas en los exones pueden
afectar la secuencia de las protenas, pero las que
se presentan en los intrones suelen incidir en el
procesamiento del RNA y, por lo tanto, evitar la
produccin de protenas.
Cmo cambia la existencia de los intrones nuestra
visin del gen? Despus del corte y empalme, los
exones siempre se unen en el orden que ocupan en
el DNA, de modo de conservar la colinealidad del
gen y la protena entre cada exn y las partes corres-
pondientes de la cadena protenica. En la FIGURA 3.2
se muestra que, en el gen, el orden de las mutaciones
sigue siendo el mismo que el de los remplazos de
aminocidos en la protena. Sin embargo, las dis-
tancias en el gen no corresponden en absoluto a las
distancias en la protena. Como se observa en un
mapa de recombinacin, las distancias genticas no
38
CAPTULO 3 El gen interrumpido
El orden de los exones no cambia entre DNA y RNA
DNA genomico
Exn 1 Intrn 1 Exn 2 Intrn 2 Exn 3
RNAm
Exn 1 Exn 2 Exn 3
FIGURA 3.. En el RNAm Los exones permanecen en eL mismo orden que en el DNA, pero las distancias a lo largo del gen
no corresponden a las distancias a lo largo del RNAm o de los productos protenicos. La distancia de A a B en el gen es
ms corta que de B a C; sin embargo, la distancia de A a B en el RNAm (y en la protena) es mayor que de B a C.
tienen relacin con las observadas entre los puntos
correspondientes de la protena. La longitud del gen
depende de la longitud del RNA inicial (precursor) y
no de la longitud del RNA mensajero (RNAm).
Todos los exones estn representados en la mis-
ma molcula de RNA, y su empalme ocurre slo
como reaccin i
'
nramolecular. Usualmente los exo-
nes provenientes de molculas diferentes de RNA no
se unen, por lo tanto, el mecanismo excluye cual-
quier empalme de secuencias que representen ale-
los diferentes. Las mutaciones localizadas en exones
diferentes de un gen no pueden complementarse,
as, siguen siendo definidas como miembros del
mismo grupo de complementacin.
Las mutaciones que afectan directamente a la
secuencia de una protena deben localizarse en los
exones. Cules son los efectos de las mutaciones
en los intrones? Estos ltimos no forman parte del
RNA mensajero, por lo tanto, las mutaciones ocu-
rridas en ellos no pueden afectar directamente a la
estructura de la protena, pero s evitar la produc-
cin del RNA mensajero, por ejemplo, inhibiendo
el corte y empalme de los exones. Una mutacin de
este tipo acta slo en el alelo que la porta, de modo
que no es susceptible de complementar cualquiera
otra mutacin en ese alelo y forma parte del mismo
grupo de complementacin que los exones.
Las mutaciones que afectan al corte y empalme
en general son nocivas; la mayora sustituye a una
sola base en la unin entre intrones y exones, y pue-
den hacer que un exn sea eliminado del producto,
que se incluya a un intrn o que los cortes y empal-
mes sucedan en sitios aberrantes. El resultado ms co-
mn es la introduccin de un codn de terminacin,
el cual resulta en el truncamiento de la secuencia pro-
tenica. Aproximadamente el 15% de las mutaciones
puntuales que provocan enfermedades humanas son
ocasionadas por interrupcin del corte y empalme.
Los genes de las eucariotas no necesariamen-
te estn interrumpidos, algunos corresponden de
manera directa al producto protenico, igual que
los genes procariticos. En las levaduras, la mayo-
ra de los genes son continuos, en tanto que en las
eucariotas superiores casi todos son interrumpidos,
y los intrones suelen ser mucho ms largos que los
exones, lo cual da lugar a genes notablemente ms
largos que sus regiones codificadoras.
IB Las endonucleasas de
restriccin son una herramienta
esencial para el mapeo deL DNA
Conceptos principales
.
Las endonucleasas de restriccin pueden utilizarse para
dividir al DNA en fragmentos definidos.
.
Un mapa puede ser generado utilizando las
superposiciones entre los fragmentos generados por
diferentes enzimas de restriccin.
La caracterizacin de los genes eucariticos fue po-
sible gracias al desarrollo de tcnicas para mapear
fsicamente el DNA, tcnicas que pueden aplicarse
al RNA (de una sola cadena) haciendo una copia de
DNA (de doble cadena) del RNA. Se puede obtener
un mapa fsico de cualquier molcula de DNA rom-
pindola en puntos definidos cuya distancia puede
ser determinada con precisin. La capacidad de las
endonucleasas de restriccin de reconocer como
objetivos de corte a secuencias cortas de DNA de
doble cadena permite cortes especficos.
Cada enzima de restriccin tiene una diana espe-
cfica en el dplex de DNA, usualmente una secuen-
cia especfica de cuatro o seis pares de bases. La enzi-
ma corta el DNA en cada punto en que se presenta su
secuencia diana. Las diferentes enzimas de restriccin
tienen secuencias diana diferentes, y actualmente se
dispone de un amplio rango de estas actividades (ob-
tenidas de una amplia variedad de bacterias).
3.3 Las endonucleasas de restriccin son una herramienta esencial para el mapeo del DNA
39
Medante electroforesis se separan
por tamao los fragmentos
XSX/A/A/A&i/X/A//
Dividir con
endonucleasa
de restriccin
//VA
Hacer electroforesis
y comparar con el
DNA control
2100
1400
1000
500
-
2500
2000
1500
1000
500
Tamaos de los
fragmentos comparados
con el control
El control consiste
en fragmentos de
tamao conocido
Los fragmentos generados al dividir al DNA con
una endonucleasa de restriccin pueden ser separados en fun-
cin del tamao.
Un mapa de restriccin representa una se-
cuencia lineal de los sitios en los cuales enzimas
de restriccin especficas encuentran a sus secuen-
cias diana. En dichos mapas, las distancias cortas se
miden directamente en pares de bases (bp,
base
pairs), en tanto que las ms largas se expresan en
kilobases (kb), que corresponden a pares de kilo-
bases (103) en el DNA o a kilobases en el RNA. En
el mbito de los cromosomas
, un mapa se describe
en pares de megabases (1 Mb = 106 bp).
Cuando se corta una molcula de DNA con una
enzima de restriccin adecuada
,
se divide en distintos
fragmentos, que pueden ser separados en funcin de
su tamao por electroforesis en gel, como se muestra
en la rIGURA 3. . El DNA dividido se coloca sobre un
gel fabricado con agarosa o poliacrilamida. Cuando
se pasa corriente elctrica a travs del gel, cada frag-
mento se mueve hacia abajo a una velocidad inversa-
mente proporcional al logaritmo de su peso molecu-
lar, movimiento que produce una serie de bandas,
cada una de las cuales corresponde a un fragmento
de un tamao especfico que disminuye el gel.
Analizando los fragmentos de restriccin del
DNA es posible crear un mapa de la molcula ori-
Un mapa de restriccin
A B A B A
1 000 200 1900 600 800 500
FIGURA 3.4 Un mapa de restriccin es una secuencia lineal
de sitios separados por distancias definidas en el DNA. En el
mapa se identifican los sitios divididos por las enzimas A y B,
segn se definen los fragmentos individuales producidos por
las digestiones dobles e individuales.
ginal tal como se muestra en la FIGURA 3.4. En el
mapa aparecen las posiciones en que las enzimas de
restriccin especficas cortan el DNA; las distancias
entre los sitios de corte se miden en pares de bases,
de modo que el DNA se divide en una serie de regiones de
longitudes definidas que yacen entre sitios reconocidos por
las enzimas de restriccin. Una caracterstica importan-
te es que se puede obtener un mapa de restriccin
de cualquier secuencia de DNA, a pesar de que se
hayan identificado mutaciones en ella, o de hecho, que
se conozca, o no, algo de su funcin.
La organizacin
de Los genes interrumpidos
puede consei-varse
Conceptos principales
.
Los intrones pueden ser detectados por la presencia de
regiones adicionales cuando los genes son comparados
con sus productos de RNA por mapeo de restriccin o
por microscopia electrnica, sin embargo, la ltima
definicin se basa en la comparacin de secuencias.
.
Los intrones normalmente conservan su posicin
respecto de genes homlogos cuando se comparan
organismos diferentes. Las Longitudes de los intrones
correspondientes pueden variar mucho.
.
Los intrones usualmente no codifican protenas.
Cuando un gen es continuo, el mapa de restriccin
de su DNA corresponde exactamente al mapa de
su RNAm.
Cuando un gen posee un intrn, el mapa de
cada extremo corresponde al mapa de cada extremo
de la secuencia mensajera. Sin embargo, en el gen,
los mapas difieren porque las regiones adicionales
no estn representadas en el mensaje. Cada una
de dichas regiones corresponde a un intrn. En el
ejemplo de la FIGURA 3.5 se comparan los mapas de
restriccin del gen de la p-globina y del RNAm. Hay
dos intrones, cada uno de los cuales contiene una
serie de sitios de restriccin que estn ausentes en
CAPTULO 3 El gen interrumpido
Los sitios de restriccin de los intrones estn ausentes del DNAc
DNA genmico Sitios divididos por las enzimas de restriccin
Exn 1 Intrn 1 Exn 2 Intrn 2 Exn 3
DNAc
L
El mapa de DNAc corresponde a
exnl + exn2 + exnS del mapa genmico
La comparacin de Los mapas de restriccin deL DNAc y deL DNA
genmico de La |3-gLobina deL ratn muestra que eL gen tiene dos intrones que
no estn en eL DNAc. Los exones pueden ser aLineados exactamente entre eL
DNAc y eL gen.
Los marcos de lectura continuos y abiertos se crean cuando
los intrones son eliminados del RNA
Exn Intrn Exn
Bloqueado Bloqueado
Secuencia del gen
., .TCCTTATTGTGCCGTBATA(3|tAGTA/fAAl
Bloqueado
iTCATAATASMCC AAATCGTGGTGTTTT.,,
Secuencia del RNAm ....TCCrrATTGTGCCGTAMTCGTGGTGTTTT....
Ser Leu Leu Ser Arg Asn Ser Trp Gis Phe
Un intrn es una secuencia presente en eL gen pero no en eL RNAm (mostrado aqu de acuerde
con La secuencia deL DNAc). EL marco de Lectura est indicado por Los bLoques aLternos, abiertos y sombreados;
ntese que Los tres marcos de Lectura posibLes estn bLoqueados por codones de terminacin en el intrn.
el DNAc. El patrn de los sitios de restriccin de los
exones es el mismo en el DNAc y en el gen.
En ltima instancia, la comparacin de las se-
cuencias nucleotdicas de la secuencia genmica y
la RNAm define precisamente a los intrones. Como
se indica en la ;URA , en general los intrones
carecen de un marco de lectura abierto. Al eliminar
los intrones, en la secuencia del RNAm se crea un
marco de lectura intacto.
Las estructuras de los genes eucariticos mues-
tran amplias variaciones. Algunos genes son con-
tinuos, de tal manera que la secuencia genmica
es colineal a la del RNAm. La mayora de los genes
eucariontes superiores son interrumpidos, pero los
intrones varan enormemente tanto en nmero
como en tamao.
Todas las clases de genes pueden ser interrum-
pidas, los genes nucleares que codifican protenas,
los nucleolares que codifican RNAr, y los que co-
difican RNAt. Tambin en los genes mitocondriales
se encuentran interrupciones, as como en las euca-
riotas inferiores y los genes de los cloroplastos. Los
genes interrumpidos no parecen ser excluidos de
ninguna clase de eucariotas y se han encontrado en
bacterias y en bacterifagos, aunque son extrema-
damente raros en genomas procariticos.
Algunos genes interrumpidos cuentan slo con
un intrn, o con unos cuantos, de los cuales
,
los
genes de la globina constituyen un ejemplo muy
estudiado (vase la seccin 3.10, La organizacin de
los miembros de una familia de genes es comn).
Los dos tipos generales de genes de globina, a y p,
comparten un tipo comn de estructura, y la co-
herencia de su organizacin en los mamferos es
evidente a partir de la estructura del gen "genrico"
de la globina, la cual se resume en la FIGURA 3.7.
Las interrupciones ocurren en posiciones homo-
logas (respecto de la secuencia codificadora) en to-
dos los genes de la globina activos, conocidos,
in-
cluidos los mamferos, aves y ranas. El primer intrn
siempre es bastante corto y el segundo suele ser ms
largo, pero la longitud en s puede variar. La mayora
de las variaciones en cuanto a longitud total entre los
diferentes genes de la globina resulta de la variacin
en el segundo intrn. En el ratn, el segundo intrn
del gen de la a-globina tiene una longitud de slo
3.4 La organizacin de los genes interrumpidos puede conservarse
Los genes de la globina varan en cuanto a
pero tienen la misma esti
longitud de los intrones,
-
uctura
Longitud de 116-130
573-904
!os intrones Exn ! |ntrn 1 Exn 2 Intrn 2 Exn 3
Longitud 142-145
222 216-255
de los exones J
1
i
Contenido UTR 5'
T
Aminocidos
t
Codificadores
+ codificadores
31-104
105 -extremo + UTR 3'
1-30
FIGURA 3.7 Todos los genes funcionales de globina tienen una estructura interrumpida con tres exo-
nes. Las longitudes indicadas en la figura aplican a los genes de la globina-P de los mamiferos.
Los genes de la DHFR tienen
una estructura constante
i i i
5 1 B
f . i
n i
II i
1 2 3 4 5 6 Exones
0 5 10 15 20 25 30
kb
Los genes de la DHFR de los mamiferos tienen
la misma organizacin relativa de exones ms bien cortos e
intrones muy largos, pero vara ampliamente en las longitudes
de los intrones.
150 bp, por lo tanto, la longitud total del gen es de
850 bp, respecto del gen mayor de la p-globina, en
el cual, los 585 bp del intrn resultan en un gen
cuya longitud total es de 1382 bp. La variacin en la
longitud de los genes es mucho mayor que el rango
de longitudes de los RNAm (el de la a-globina tiene
585 bases y el de la P-globina, 620 bases).
El ejemplo de la DHFR, un gen un tanto ms
grande, se muestra en la FIGURA 3 ..c. Dicho gen (dihi-
drofolato reductasa) de los mamferos est organizado
en seis exones que corresponden al RNAm de 2 000
bases con una longitud mucho mayor de DNA debido
a que los intrones son muy largos. En tres mamferos,
los exones son esencialmente iguales y las posiciones
relativas de los intrones no cambian, a diferencia de la
longitud de cada intrn; no obstante, el resultado de
la variacin en la longitud del gen es de 25 a 31 kb.
Los genes de la globina y de la DHFR son ejem-
plos de un fenmeno general: los genes relacionados
por evolucin tienen organizaciones relacionadas con el
mantenimiento de la posicin de los intrones (al menos
de algunos de ellos). Las variaciones en la longitud de los
genes son determinadas principalmente por la longitud
de los intrones.
Las secuencias de los exones
se mantienen,
no asi Las de Los intrones
Conceptos principales
*
La comparacin de genes relacionados de diferentes
especies muestra que las secuencias de los exones
correspondientes usualmente se conservan, pero
las secuencias de los intrones estn mucho menos
relacionadas.
*
Los intrones evolucionan mucho ms rpidamente
que Los exones por la falta de presin selectiva para
producir una proteina con una secuencia til.
Un gen estructural es nico en su genoma? La res-
puesta puede ser ambigua. La longitud completa del
gen es nica, pero con frecuencia sus exones estn
relacionados con los exones de otros genes. Como
regla general, cuando dos genes estn relacionados,
la relacin entre sus exones es ms cercana que la
relacin entre sus intrones. En un caso extremo, los
exones de dos genes pueden codificar a la misma
secuencia protenica, mientras que los intrones pue-
den ser diferentes, lo cual implica que ambos genes
fueron originados por una duplicacin de algn gen
ancestral comn. Posteriormente, se acumularon
diferencias entre una y otra copia, pero en los exo-
nes se vieron restringidas por la necesidad de codi-
ficar funciones protenicas.
Como se ver ms adelante, al analizar la evo-
lucin del gen, los exones pueden ser considerados
como las unidades bsicas ensambladas en varias
combinaciones. Un gen puede tener algunos exones
relacionados con los exones de otro gen, pero otros
pueden no tener relacin. En general, los intrones
no tienen ninguna relacin en dichos casos, pueden
surgir por duplicacin y translocacin de exones in-
dividuales.
La relacin entre dos genes puede representarse
como una comparacin de matriz de puntos, como en
la ' . . Un punto indica la posicin de la misma
CAPTULO 3 El gen interrumpido
Los genes relacionados difieren en los intrones
Globina |3 mayor
5
'
Exn Exn Exn 3'
Exn 1
\
\
Exn
\
\
03
/
Exn
\
3
'
FIGURA 3.9 Las secuencias de los genes de la globina |3may0, y
de La globina [3me,'or del ratn estn intimamente relacionadas
en las regiones codificadoras, pero difieren en las regiones flan-
queantes y en elintrn largo. Datos proporcionados por Philip
Leder, Harvard Medical School.
secuencia en cada gen. Si dos secuencias son idnti-
cas, los puntos forman una lnea en ngulo de 45

. La
lnea es interrumpida por regiones no similares y se
desplaza de forma lateral o vertical por deleciones o
inserciones en una secuencia respecto de la otra.
Cuando se comparan los dos genes de la globina-
P del ratn, dicha lnea abarca los tres exones y el
intrn pequeo para luego desvanecerse en las re-
giones flanqueantes y el intrn largo; es un patrn
tpico en el cual las secuencias codificadoras estn
bien relacionadas y la relacin puede ir ms all de
las fronteras de los exones; sin embargo, el patrn
se pierde en los intrones ms largos y en las regiones
de ambos lados del gen.
El grado total de divergencia entre dos exones
depende de las diferencias entre las protenas, pro-
vocadas principalmente por sustituciones de bases,
En las regiones traducidas, los exones se ven res-
tringidos por la necesidad de codificar secuencias de
aminocidos, de modo que su potencial de cambio
de secuencia es limitado. Muchos de los cambios no
afectan el significado de los codones porque se cam-
bia un codn por otro que representa al mismo ami-
nocido. Los cambios ocurren con mayor libertad en
las regiones no traducidas (las cuales corresponden
al lder 5
'
y al remolque 3' del RNAm).
En los intrones correspondientes, el patrn de di-
vergencia implica cambios tanto de tamao (por de-
leciones e inserciones) como sustituciones de bases.
Los intrones evolucionan mucho ms rpidamente
que los exones. Cuando se compara un gen en dife-
rentes especies, en ocasiones, los exones son hom-
logos, pero los intrones han cambiado tanto, que no
se reconocen las secuencias correspondientes.
Las mutaciones ocurren a la misma velocidad
en exones e intrones, pero son eliminadas ms efi-
cientemente de los exones por seleccin adversa.
Sin embargo, en ausencia de restricciones impuestas
por una funcin codificadora, un intrn es suscepti-
ble de acumular libremente sustituciones puntuales
y otros cambios, los cuales implican que el intrn
no tenga una funcin regida por una secuencia es-
pecfica; an no se sabe si su presencia es necesaria
para la funcin del gen.
La distribucin de tamaos
de Los genes es amplia
Conceptos principales
La mayora de los genes de las levaduras son continuos,
no as los de las eucariotas superiores.
Los exones suelen ser cortos y codificar menos de 100
aminocidos.
.
Los intrones son cortos en las eucariotas inferiores,
pero en las superiores pueden llegar a tener varias
decenas de kb (kilobases) de longitud.
La longitud total de un gen se determina
principalmente por sus intrones.
En la FIGURA 3,10 se muestra la organizacin glo-
bal de los genes en las levaduras, los insectos y los
mamferos. En Saccharomyces cerevisiae, la gran ma-
yora de los genes (>96%) son continuos, y los que
tienen exones suelen mantenerse razonablemente
compactos; virtualmente ninguno de sus genes tie-
ne ms de cuatro exones.
En insectos y mamferos sucede lo contrario,
slo algunos genes tienen secuencias codificadoras
ininterrumpidas (6% en los mamferos). Los genes
de los insectos tienden a presentar un nmero bas-
tante reducido de exones, en general menos de 10.
Los genes de los mamferos estn divididos en ms
fracciones y algunas tienen varias decenas de exo-
nes. Aproximadamente el 50% de los genes de los
mamferos tienen >10 intrones.
Al examinar las consecuencias de este tipo de
organizacin para el tamao total del gen, en la
FIGURA 3.11 se observa que entre las levaduras y las
eucariotas superiores hay una diferencia notable. La
longitud del gen promedio de una levadura es de
1
.4 kb, y en muy pocos es superior a los 5 kb. Sin
embargo, la predominancia de genes interrumpidos
3.6 La distribucin de tamaos de los genes es amplia
Los genes interrumpidos predominan en las eucariotas superiores
96%
5 30
20
S. cerevisiae
D. melanogaster
15 Mamferos
-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16 18 20 <40 >60
Nmero de exones
FIGURA 3.1 La mayora de los genes de las levaduras son
continuos, pero en las moscas y los mamferos, casi todos son
interrumpidos. (Los genes continuos tienen un solo exn y se
suman en la columna de la extrema izquierda.)
en las eucariotas superiores significa que el gen pue-
de ser mucho ms largo que la unidad que codifica
una protena. Relativamente pocos genes de mosca
o de mamfero presentan una longitud inferior a
2 kb, y en muchos casos es de entre 5 kb y 100 kb. El
gen humano promedio tiene 27 kb de largo (vase
la Figura 5.11).
El cambio de genes en buena parte continuos
a genes en gran medida interrumpidos ocurre en
las eucariotas inferiores. En los hongos (excepto las
levaduras), la mayora de los genes son interrumpi-
dos, pero tienen un nmero relativamente pequeo
de exones (<6) y son bastante cortos (<5 kb). El
cambio a genes largos tiene lugar en las eucariotas
superiores, y los genes se hacen significativamente
ms largos en los insectos. Con este incremento en
la longitud del gen, se pierde la relacin entre el
tamao del genoma y la complejidad de los orga-
nismos (vase la Figura 4.5).
Conforme se incrementa el tamao del geno-
ma, la tendencia es a intrones ms largos, mientras
que los exones siguen siendo bastante pequeos.
En la FIGURA 3.1 se observa que los exones que
codifican a los fragmentos de una protena tienden
a ser bastante pequeos, de modo que en las euca-
riotas superiores, el exn promedio codifica a -50
aminocidos y la distribucin general encaja bien
amaos de los genes es amplia
50
40
30
20
10
S. cerevisiae
0)
S
S 40
S 50
30
20
10
50
40
30
20
10
D. melanogastei
ttm
WMmM,
Mamferos
<0.5 <1 <2 <5 <10<25<50<100>100
Tamao de los genes (kb)
FIGURA 3.11 Los genes de las levaduras son cortos, pero los
de las moscas y los mamferos tiene una distribucin dispersa
que se extienden a longitudes muy amplias.
Normalmente, los exones miden de 100 a 200 bp
Levadura
Mosca
Humano
100 300 500 700 900
Longitud de los exones en nucletidos
FIGURA 3.12 Los exones que codifican protenas usualmente
son cortos.
44 CAPTULO 3 EL gen interrumpido
con la idea de que los genes han evolucionado por la
adicin lenta de unidades que codifican a dominios
pequeos e individuales de protenas (vase la sec-
cin 3.8, Cmo evolucionaron los genes interrum-
pidos?). No hay una diferencia significativa en el ta-
mao de los exones de tipos diferentes de eucariotas
superiores, aunque la distribucin es ms compacta
en los vertebrados en que hay pocos exones cuya
longitud rebase los 200 bp. En las levaduras, hay
algunos exones ms largos que representan a genes
continuos en los cuales la secuencia codificadora
est intacta. Los exones que codifican a regiones 5
'
y 3
'
no traducidas tienden a ser ms largos que los
que codifican protenas.
La FIGURA 3.13 muestra que el tamao de los
intrones vara ampliamente. En los gusanos y las
moscas, el intrn promedio no es mucho ms largo
que los exones. En el primer caso no hay intrones
muy largos, sin embargo las moscas contienen una
proporcin significativa de ellos. En los vertebrados,
la distribucin de tamao es mucho ms amplia,
desde aproximadamente la misma longitud que los
exones (<200 bp) hasta longitudes medidas en de-
cenas de kb, incluso 50 a 60 kb en casos extremos.
Los genes muy largos son resultado de intro-
nes muy largos, no de secuencias codificadoras de
productos de gran longitud. No hay una correlacin
La longitud de los intrones vara ampliamente
20
15
Gusano
10
20
2 15
Mosca
10
20
15
Humano
10
15 10 15 20 25
Longitud de los intrones en kb
FIGURA 3.13 Los intrones varan de muy cortos a muy largos.
entre el tamao del gen y el tamao del RNAm en
las eucariotas superiores, tampoco una buena co-
rrelacin entre el tamao del gen y el nmero de
exones, de modo que el tamao de un gen depende
principalmente de las longitudes de cada uno de sus
intrones. En los mamferos, los insectos y las aves,
la longitud del gen "promedio" es de aproximada-
mente cinco veces la de su RNAm.
WW1 Algunas secuencias
de DNA codifican
a ms de una protena
Conceptos principales
.
El uso de codones alternativos de iniciacin o de
terminacin permite que se produzcan dos protenas
cuando una es equivalente a un fragmento de la otra.
.
Se pueden producir secuencias no homlogas de
protenas a partir de la misma secuencia de DNA
cuando sta es leda en marcos de lectura diferentes
por dos genes (superpuestos).
.
Las protenas homlogas que difieren por la presencia
o ausencia de ciertas regiones se deben a un corte y
empalme diferencial (alternativo) en el cual se incluyen
o excluyen ciertos exones, ya sea por la inclusin o
exclusin de exones especficos o al optar por exones
alternativos.
La mayora de los genes consta de una secuencia
de DNA dedicada nicamente a codificar a una
protena (aunque el gen puede incluir regiones no
codificadoras en cualquier extremo e intrones en
la regin codificadora), aunque en algunos casos
una sola secuencia de DNA codifica a ms de una
protena.
Los genes superpuestos se presentan en una situa-
cin relativamente sencilla en la cual un gen es parte
del otro. La primera mitad de un gen (o la segunda)
es utilizada de manera independiente para especificar
una protena que representa a la primera mitad (o
a la segunda) de la protena especificada por el gen
completo. Esta relacin se ilustra en la . IGURA . El
resultado final es muy similar a una divisin parcial
del producto protenico para generar formas tanto de
tamao parcial como de tamao total.
Dos genes pueden superponerse de manera ms
sutil cuando la misma secuencia de DNA es compar-
tida por dos protenas no homlogas, situacin que
se presenta cuando la misma secuencia de DNA se
traduce en ms de un marco de lectura. En los genes
celulares, una secuencia de DNA suele leerse slo
en uno de los tres marcos de lectura potenciales. Sin
embargo, en algunos genes vricos y mitocondriales
hay superposicin entre dos genes adyacentes que
3
.7 Algunas secuencias de DNA codifican a ms de una protena
Los inicios (o terminaciones) alternos generan protenas relacionadas
Protena de tamao total
Protena de tamao parcial
INICIO Codones formados
portnpletes INIC|0
a|terno
TERMINACION
FIGURA 3.14 A partir de un slo gen se pueden formar dos protenas que
inician (o terminan) su expresin en puntos diferentes.
INICIO
tripletas superpuestos pueden ser utilizados
en marcos de lectura diferentes
Codones utilizados para
la protena 1
.
m
Bases I
UJammiajaJUJUiD
INICIO
Codones utilizados para
la protena 2
FIGURA 3.1 Dos genes pueden compartir la misma secuencia leyendo el
DNA en diferentes marcos de lectura.
se leen en marcos de lectura diferentes, situacin
ilustrada en la FIGURA 3.15. La distancia de la su-
perposicin es por lo general relativamente corta,
de tal forma que la mayor parte de la secuencia
que representa a la protena conserva una funcin
codificadora nica.
En algunos genes, los patrones alternativos de
la expresin gnica crean cambios en la ruta utili-
zada para conectar los exones. Un slo gen puede
generar diversos productos de RNAm diferentes en
cuanto a contenido de exones, y la diferencia pue-
de ser que ciertos exones son opcionales, es decir,
pueden ser incluidos o desempalmados. Asimismo,
puede haber exones que se excluyan mutuamente,
se incluye uno u otro, pero no ambos. Las formas
alternas producen protenas en las cuales una parte
es comn y la otra es diferente.
En algunos casos, los medios alteraos de expre-
sin no afectan a la secuencia de la protena, por
ejemplo, los que inciden en el lder 5
'
no traduci-
El empalme alterno puede
sustituir exones
W **.>> <x Z
Un RNAm tiene el exn a
a

Exones W X a (5 Z
Un RNAm tiene el exn p
W X (3 Z
FIGURA 3.1 El corte y empalme alternativo genera las va-
riantes a y [3 de La troponina T.
do o en el remolque 3' no traducido pueden tener
consecuencias reguladoras, pero se crea la misma
protena. En otros casos, un exn es sustituido por
otro, como se indica en la FIGURA 3.16.
En este ejemplo, las protenas producidas por los
dos RNAm contienen secuencias que se superponen
extensamente pero que son diferentes en la regin
alterna de corte y empalme. La mitad 3
'
del gen de
la troponina T del msculo de la rata contiene cinco
exones, pero slo cuatro se utilizan para constituir
un RNAm individual y tres, WXZ, son los mismos
en ambos patrones de expresin. No obstante, en
uno de stos, el exn a es empalmado entre Xy Zy
en el otro se utiliza el exn (3, de modo que las for-
mas a y [3 de la troponina T difieren en la secuencia
de aminocidos presente entre las secuencias W y
Z
, dependiendo del exn alterno utilizado, a o p;
cualquiera de ellos puede usarse para formar un
RNAm individual, pero ambos no pueden estar en
el mismo.
En la FIGURA 3.17 es un ejemplo en el cual el
empalme alternativo provoca la inclusin de un
exn en algunos RNAm, mientras que lo deja fue-
ra de otros. A partir del gen se forma un solo tipo
de transcrito, pero ste puede ser empalmado en
cualquiera de las dos formas. En la primera ruta,
se desempalman dos intrones y los tres exones se
unen entre s, en tanto que en la segunda, el se-
gundo exn no es reconocido, de tal forma que un
solo intrn largo es desempalmado. Este intrn est
formado por el intrn 1 + el exn 2 + el intrn 2. En
efecto, el exn 2 ha sido tratado en esta ruta como
parte del intrn individual. Estas rutas producen dos
protenas iguales en los extremos, pero una tiene
una secuencia adicional en la mitad, por lo tanto,
la regin del DNA codifica a ms de una protena.
(Otros tipos de combinaciones producidas por em-
palme alternativo se analizan en la seccin 26.12,
46
CAPTULO 3 El gen interrumpido
Exn 1
e alterno se utilizan diferentes combinaciones de exones I
Intrn Exn 2 Intrn Exn 3
I Sntesis de RNA
Slo los intrones son desempalmados
5
'
3
'
F,
'
3
'
RNAm
Los tres exones estn en la protena larga
Los intrones + exn 2 son desempaimados
5
'
5' , 3
'
RNAm
i
N
1
"
C
En la protena corta slo estn exn 1 + exn 3
7 El corte y empalme alternativo utiliza el mismo pre-RNAm para
generar molculas de RNA con combinaciones diferentes de exones.
El empalme alternativo involucra el uso diferencial
de uniones de empalme.)
En ocasiones dos rutas operan simultneamen-
te, en cuyo caso, cierta porcin de RNA es empal-
mada en cada ruta, y en otras, las rutas son alter-
nativas expresadas en condiciones diferentes, una
en un tipo de clula y otra en otro.
As pues, el empalme alternativo o (dife-
rencial) puede generar protenas con secuencias
superpuestas de un solo fragmento de DNA. Es
curioso que el genoma eucaritico superior sea
extremadamente espacioso y tenga genes grandes
que con frecuencia estn muy dispersos y que al
mismo tiempo forme mltiples productos a partir
de un locus individual. El empalme alternativo ex-
pande el nmero de protenas relativo al nmero
de genes por ~ 15 % en las moscas y en los gusanos,
pero tiene efectos mucho mayores en el hombre,
en el cual, -60% de los genes puede tener formas
alternas de expresin (vase la Seccin 5.5, El ge-
noma humano tiene menos genes que los espe-
rados). Aproximadamente el 80% de los eventos
de empalme alternativo resultan en cambios de la
secuencia protenica.
Cmo evo Luc o n aro n los genes
interrumpidos?
Conceptos principales
.
La interrogante principal al respecto es si Los genes se
originaron como secuencias interrumpidas por intrones
o si originalmente eran molculas ininterrumpidas.
.
Probablemente la forma original de la mayoria de Los
genes codificadores de protenas fue la interrumpida,
si bien en un principio los genes interrumpidos que
codifican al RNA pudieron haber sido molculas
ininterrumpidas.
.
Una clase especial de intrones es mvil y puede
insertarse en los genes.
La estructura ampliamente interrumpida de los ge-
nes de las eucariotas sugiere una imagen similar a un
mar de intrones (casi todos nicos en secuencia, pero
no exclusivamente), en el que las islas de exones (en
ocasiones muy cortos) estn esparcidas en archipila-
gos individuales que representan a los genes.
Cul era la forma original de los genes que
actualmente estn interrumpidos?
3
.8 Cmo evolucionaron Los genes interrumpidos?
.
En el modelo de los "intrones ancestrales" se
propone que los intrones siempre han for-
mado parte del gen. Los genes se originaron
como estructuras interrumpidas, y los que
carecen de intrones los han perdido en el
curso de la evolucin.
.
En el modelo de los "intrones adquiridos"
se propone que las unidades ancestrales co-
dificadoras de protenas estaban formadas
por secuencias continuas de DNA y que los
intrones fueron insertados posteriormente.
Para poner a prueba los modelos se debe pre-
guntar si la diferencia entre los genes eucariticos y
los procariticos puede ser explicada por la adquisi-
cin de intrones en el primer caso o por la prdida
de los mismos en el segundo.
El modelo de los "intrones ancestrales" sugiere
que la estructura de mosaico de los genes es un re-
manente del antiguo enfoque de la reconstruccin
de stos para crear nuevas protenas. Supngase
que una clula ancestral tena cierto nmero de
secuencias codificadoras de protenas separadas: es
probable que un aspecto de su evolucin haya sido
la reorganizacin y yuxtaposicin de unidades poli-
peptdicas diferentes para crear nuevas protenas.
Si la unidad codificadora de protenas debe ser
una serie continua de codones, cada reconstruccin
requerir de una recombinacin precisa de DNApara
colocar ambas unidades codificadoras de protenas en
registro, extremo con extremo, en el mismo marco
de lectura. Adems, si esta combinacin no es exito-
sa, la clula ha sufrido algn dao por la prdida de
las unidades originales codificadoras de protenas.
Si en una recombinacin aproximada del DNA
se pudiera colocar a las dos unidades codificadoras
de protenas en la misma unidad de transcripcin,
se podran probar patrones de corte y empalme
en el nivel del RNApara combinar las dos protenas en
una sola cadena polipeptdica. Si estas combinacio-
nes no tienen xito, las unidades originales de codifi-
cacin de protenas siguen disponibles para pruebas
posteriores. Dicho enfoque permite esencialmente
que la clula intente deleciones controladas en el
RNA sin sufrir la posible inestabilidad daina de
aplicar el procedimiento al DNA. Este argumento se
apoya en el hecho de que podemos encontrar exo-
nes relacionados en genes diferentes, como si el gen
hubiera sido ensamblado mezclando y apareando
exones (vase la seccin 3.9, Algunos exones pue-
den equipararse con funciones protenicas).
En la FIGURA 3.18 se ilustra lo que sucede cuan-
do en el genoma una secuencia aleatoria que inclu-
ye a exn es translocada a una nueva posicin. Los
exones son muy pequeos respecto de los intrones,
de modo que es probable encontrar el exn dentro
de un intrn. Para el corte y empalme slo se ne-
cesitan las secuencias de las uniones entre exn e
intrn, de modo que es probable que el exn sea
flanqueado por zonas de unin 3' y 5' funcionales,
respectivamente. Las zonas de unin son reconoci-
das en pares, por lo tanto, es probable que la zona
de unin 5' del intrn original interacte con la
Las translocaciones aleatorias pueden producir genes funcionales
Los intrones son mucho ms largos que los exones
Zona de unin 5' Zona de unin 3'
exn Qxn
intrn Intrn intrn
i
La secuencia que incluye a un exn se transloca a un sitio diana aleatorio
intrn exn intrn
I
intrn intrn Intrn intrn
f
RNA Bi MnM
3.18 Un exn rodeado de secuencias flanqueantes, translocado en el
interior de un intrn, puede ser empalmado en el producto de RNA.
CAPTULO 3 EL gen interrumpido
zona de unin 3
'
introducida por el exn nuevo, y
no con su compaero original. De forma similar, la
zona de unin 5
'
del nuevo exn interactuar con
la zona de unin 3' del intrn original. El resulta-
do es la insercin del nuevo exn en el producto
de RNA entre los dos exones originales. Siempre
y cuando el nuevo exn se encuentre en el mis-
mo marco
,
de lectura que los exones originales, se
producir una nueva secuencia protenica. Este tipo
de evento pudo haber generado nuevas combina-
ciones de exones durante la evolucin. Ntese que
su principio es imitado por la tcnica de captura de
exones que se utiliza para identificar a los exones
funcionales (vase la Figura 4.11),
En ocasiones se encuentran formas alternas de
genes de RNAr y RNAt, con y sin intrones. En el
caso de los RNAt, en los cuales todas las molculas
estn conformadas por la misma estructura general,
parece poco probable que la evolucin haya reunido
a las dos regiones del gen, despus de todo, las di-
ferentes regiones participan en el apareamiento de
bases que da importancia a la estructura, de modo
que, en este caso, los intrones debieron haber sido
insertados en genes continuos.
Los genomas de los organelos proporcionan
algunas conexiones notables entre el mundo de
las procariotas y el de las eucariotas. Hay muchas
similitudes generales entre las mitocondrias o los
cloroplastos y las bacterias, por ello, parece probable
que los organelos se originaron en una endosimhiosis
en la cual un prototipo bacteriano ancestral fue in-
sertado en el citoplasma eucaritico. Sin embargo,
a diferencia de las similitudes con la bacteria, por
ejemplo, cmo se conserva en la sntesis proteni-
ca o del RNA, algunos genes de organelos poseen
intrones y por lo tanto se asemejan a los genes nu-
cleares eucariticos.
En muchos genes de los cloroplastos se encuen-
tran intrones, incluidos algunos homlogos de los
genes de la E. coli, lo cual sugiere que el evento
endosimbitico ocurri antes de que la lnea pro-
caritica perdiera los intrones. Si se encuentra un
gen adecuado, sera posible rastrear el linaje gnico
hasta al periodo en que ocurri la endosimbiosis,
El genoma mitocondrial es un caso particular-
mente sorprendente. Los genes de las mitocondrias
de las levaduras y de los mamferos codifican pro-
tenas mitocondriales virtualmente idnticas, pese a
una diferencia considerable en la organizacin gni-
ca. Los genomas mitocondriales de los vertebrados
son muy pequeos, con una organizacin de genes
continuos extremadamente compacta, mientras
que los genomas mitocondriales de las levaduras
son ms grandes y tienen algunos genes complejos
interrumpidos Cul es la forma ancestral? Los in-
trones mitocondriales de las levaduras (y algunos
otros intrones) pueden tener como propiedad la
movilidad, son secuencias autnomas que pueden
desempalmarse del RNA e insertar copias de DNA
en cualquier otra parte, lo cual sugiere que podran
haber surgido por inserciones en el genoma (vase
la seccin 27.5, Algunos intrones del grupo I codi-
fican a endonucleasas que promueven la movilidad
y la 27.6, Los intrones del grupo II pueden codificar
protenas multifuncionales).
Algunos exones pueden
equipararse con funciones
protenicas
Conceptos principales
Lo que sugiere que Los exones fueron las unidades
bsicas de la evolucin y que los primeros genes fueron
interrumpidos en lo siguiente;
.
La estructura gnica es igual entre genes de especies
muy distantes.
.
Muchos exones pueden ser equiparados con secuencias
codificadoras de protenas que tienen funciones
especficas.
.
En genes diferentes se encuentran exones relacionados.
Si las protenas actuales evolucionaron al combinar
protenas ancestrales que originalmente fueron in-
dependientes, es probable que la acrecin de uni-
dades haya ocurrido de manera secuencial en algn
periodo, agregndose un exn a la vez Es posible
ver las diferentes funciones por las que estos genes
fueron incrustados en sus estructuras presentes?
En otras palabras, podemos equiparar funciones
especficas de protenas actuales con determinados
exones?
En algunos casos hay una clara relacin entre
las estructuras del gen y de la protena; el ejemplo
por excelencia es el de las protenas inmunoglobu-
linas, las cuales son codificadas por genes en los
cuales cada exn corresponde exactamente a un
dominio funcional conocido de la protena. En la
FIGURA 3.19 se compara la estructura de una inmu-
noglobulina con su gen.
Una inmunoglobulina es un tetrmero forma-
do por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas
unidas para formar una protena con numerosos
dominios distintos. Las cadenas ligeras y las pesadas
difieren en cuanto a estructura, y hay numerosos
tipos de cadenas pesadas, y cada tipo es expresado
desde un gen cuya serie de exones corresponde a
los dominios estructurales de la protena.
3
.9 Algunos exones pueden equiparse con funciones protenicas
es de la inmunoglobulina codifican dominios de protenas
exn L exn V-J exn C
Cadena ligera
Lder Variable Constante Bisagra Constante 2 Constante 3 Dominios protenicos
Cadena pesada
exnL exnV-D-J exn C1 exn bisagra exn C2 exn C3
FIGURA 3.19 Las cadenas Ligeras y Las cadenas pesadas de La inmunoglobuLina son codificadas por
genes cuyas estructuras (en sus formas expresadas) corresponden a Los distintos dominios de La
protena. Cada dominio protenico corresponde a un exn; Los intrones van numerados del 1 al 5.
En muchos casos, algunos de los exones de un
gen pueden identificarse con funciones especficas.
En protenas secretoras, el primer exn, que codifica
a la regin terminal N del polipptido,
con frecuen-
cia especfica a la secuencia seal implicada en la se-
crecin membranosa, por ejemplo en la insulina.
La perspectiva de que los exones son las unida-
des bsicas funcionales de los genes est respaldada
por casos en que dos genes pueden tener exones
relacionados entre s, mientras que otros se encuen-
tran slo en uno de los genes. En la GURA se re-
sume la relacin entre el receptor de la lipoprotena
de baja densidad (LDL, plasma low density lipoprotein)
y otras protenas. En el centro del gen receptor de la
LDL se encuentra una serie de exones relacionados
con los exones del gen para el precursor del factor
de crecimiento epidrmico (EGF, epidemial growth
factor). En la regin terminal N de la protena, una
serie de exones codifica a una secuencia relaciona-
da con la protena sangunea del factor del comple-
mento C9, de modo que el gen del receptor de la
LDL se cre ensamblando mdulos para sus diversas
funciones. Estos mdulos tambin son utilizados en
combinaciones diferentes en otras protenas.
Los exones tienden a ser bastante pequeos
(vase la Figura 4.11), aproximadamente del tamao
del polipptido ms pequeo susceptible de asumir
una estructura plegada estable (-20 a 40 residuos).
Quiz las protenas fueron ensambladas original-
mente a partir de mdulos ms bien pequeos. Cada
mdulo no necesariamente debe corresponder a una
funcin actual, varios podran haberse combinado
para generar una funcin. El nmero de exones de
Los exones de dos protenas puede
estar relacionados
Receptor de LDL
Homologa
del complemento C9
Homologa del
precursor del EGF
fflffl

Precurso- del EGF

FIGURA 3.20 EL gen del receptor de La LDL est formado por
18 exones, algunos de los cuales estn relacionados con Los
exones del precursor del EGF y otros con eL gen del comple-
mento sanguneo C9. Los tringulos marcan las posiciones de
los intrones.
un gen tiende a incrementarse con la longitud de
su protena, lo cual concuerda con la perspectiva
de que las protenas adquieren mltiples funciones
agregando sucesivamente los mdulos apropiados.
Esta idea explicara otra caracterstica de la es-
tructura de las protenas. Aparentemente los sitios
representados en las fronteras exn-intrn con fre-
cuencia se localizan en la superficie de una protena.
Conforme se agregan mdulos a una protena, las
conexiones, cuando menos las de los mdulos agre-
gados ms recientemente, suelen tener la tendencia
a localizarse en la superficie.
CAPTULO 3 El gen interrumpido
Los miembros de una famUia
de genes tienen
una organizacin comn
Conceptos principales
Se supone que una caracterstica comn de una
agrupacin de genes identifica una propiedad que
antecede a la separacin durante la evolucin.
La forma comn de organizacin de todos los genes
de globina, tres exones y dos intrones, sugiere que
descienden de un solo gen ancestral.
Muchos de los genes de un genoma eucaritico su-
perior estn relacionados con otros del mismo ge-
noma. Una familia de genes puede definirse como
un grupo de genes que codifican a protenas idnti-
cas o relacionadas; la familia se origina al duplicarse
un gen. Inicialmente, las dos copias son idnticas,
pero despus divergen, conforme se acumulan mu-
taciones en ellas. Las duplicaciones posteriores y la
divergencia hacen an ms extensa la familia. Los
genes de la globina son un ejemplo de una familia
que puede dividirse en dos subfamilias (globina a
y globina P), aunque todos sus miembros tienen
la misma estructura bsica y la misma funcin. El
concepto puede ampliarse ms cuando se encuen-
tran genes relacionados de forma ms distante pero
cuyo ancestro comn an puede reconocerse; en
este caso, se considera que un grupo de familias de
genes forma una superfamilia.
Las globinas a y (3, y otras dos protenas rela-
cionadas con ellas, constituyen un caso fascinante
de conservacin evolutiva. La mioglobina es una
protena monomrica que se liga al oxgeno, est
presente en los animales y su secuencia de amino-
cidos sugiere un origen comn (aunque antiguo)
con las subunidades de la globina. Las leghemoglo-
binas son protenas que se unen al oxgeno y que se
encuentran en las legumbres; igual que la mioglobi-
na, sonmonomricas. Adems, tambin comparten
un origen comn con las otras protenas de unin
al grupo hemo. Juntas, las globinas, la mioglobina
y la leghemoglobina constituyen la superfamilia de
la globina, grupo de familias de genes descendientes
de algn ancestro (distante) comn.
Los genes de la globina a y de la globina p tienen
tres exones (vase la Figura 3.7). Los dos intrones es-
tn en posiciones constantes respecto de la secuencia
codificadora. El exn central representa al dominio
de unin al grupo hemo de la cadena de globina.
En el genoma humano, la mioglobina est re-
presentada por un solo gen cuya estructura es esen-
cialmente la misma que la de los genes de la globina,
de modo que la estructura de tres exones antecede
La leghemoglobina tiene un intrn extra
Dominio de unin al grupo hemo
Globina
i
Intrn extra Leghemoglobina
El dominio est dividido
1 La estructura de los exones de los genes de globi-
na corresponde a la funcin protenica, pero la leghemoglobina
tiene un intrn extra en el dominio central.
a la evolucin de las funciones separadas de la mio-
globina y de la globina.
Los genes de la leghemoglobina contienen tres
intrones, de los cuales, el primero y el ltimo se
presentan en puntos de la secuencia codificadora
homlogos a las localizaciones de los dos intrones de
los genes de globina. Esta notable similitud sugiere
un origen extremadamente antiguo de las protenas
de unin al grupo hemo en forma de un gen dividi-
do, como se ilustra en la FIGURA 3.21.
El intrn central de la leghemoglobina separa dos
exones que juntos codifican a la secuencia correspon-
diente al exn central individual de la globina Pudo
el exn central del gen de la globina haber sido deri-
vado de una fusin de dos exones centrales del gen
ancestral? O es el exn individual central la forma
ancestral, en este caso, un intrn que debi haber sido
insertado en l al inicio de la evolucin de la planta?
Los casos en que la estructura de genes homlo-
gos difiere, podran proporcionar informacin acerca
de su evolucin, por ejemplo, la insulina. Los ma-
mferos y las aves tienen slo un gen para codificar
insulina, excepto los roedores, que tienen dos. En la
se ilustran las estructuras de estos genes.
El principio que se utiliza para comparar la orga-
nizacin de genes relacionados en especies diferen-
tes consiste en que una caracterstica comn identifica
a una estructura que precedi a la separacin evolutiva
de las dos especies. En los pollos, el gen nico de la
insulina tiene dos intrones; uno de los dos genes
de la rata tiene la misma estructura. La estructura
comn implica que el gen ancestral de la insulina
tena dos intrones, sin embargo, el segundo gen de
las ratas tiene slo uno, de modo que debe haber
evolucionado por una duplicacin gnica en los roe-
dores seguida de la eliminacin precisa de un intrn
de una de las copias.
La organizacin de algunos genes muestra dis-
crepancias considerables entre especies, en cuyo
3
.10 Los miembros de una familia de genes tienen una organizacin comn
caso, la eliminacin o insercin de intrones durante
la evolucin debi haber sido intensa.
Un caso bien caracterizado son los genes de la ac-
tina. El tpico gen de la actina tiene un lder no tradu-
cido de < 100 bases, una regin codificadora de -1200
bases y un remolque de -200 bases. La mayora de los
genes de la actina son interrumpidos; las posiciones
de los intrones pueden alinearse de acuerdo con la
secuencia codificadora (excepto por un nico intrn
que en ocasiones se encuentra en el lder).
En la FIGURA se observa que el patrn de
interrupciones de casi todos los genes de la actina
es diferente, y agrupando a todos los genes, los in-
trones ocurren en 19 sitios diferentes. Sin embargo,
ningn gen tiene ms de seis intrones, algunos slo
tienen uno y uno de ellos es completamente con-
tinuo Cmo surgi esta situacin? Si suponemos
que el gen primordial de la actina era interrumpido,
III.|J.I.|JI.I:!IIII.1.MUI.LIJJ.UM.MI!,I1,IJ.1M
Gen comn de la insulina (pollos y ratas)
Exn Exn Exn
lder Intrn codificador Intrn codificador
vDelecion del intrcn
lder Intrn Exn codificador
Segundo gen de insulina de la rata
GURA 3.22 El gen de la insulina de la rata, el cual cuenta
con un intrn, evolucion por la prdida de un intrn de un
ancestro con dos intrones.
y que todos los genes de la actina estn relaciona-
dos con l por prdida de intrones, en cada rama
evolutiva se han perdido intrones diferentes. Proba-
blemente algunos se han perdido por completo, de
modo que el gen primordial pudo bien haber tenido
20 o ms. La alternativa es suponer que un proceso
de insercin de intrones continu de manera inde-
pendiente en las diferentes lneas de evolucin. En
ltima instancia, la relacin entre las localizaciones
de los intrones en diferentes especies puede utilizar-
se para construir un rbol de la evolucin del gen.
La relacin entre los exones y los dominios de
protenas es un tanto errtica; en ciertos casos es
claramente de 1:1 y, en otros, no es posible discernir
un patrn. Una posibilidad es que por la eliminacin
de intrones se han fusionado los exones adyacen-
tes, lo cual significa que el intrn debi haber sido
eliminado de forma precisa, sin modificacin de la
integridad de la regin codificadora. Una alternativa
es que algunos intrones surgieron por insercin en
un dominio coherente. Adems de las variaciones
observadas en la colocacin de los exones en casos
como el de los genes de la actina, esto sugiere que
las posiciones de los intrones pueden ser ajustadas
en el curso de la evolucin.
La ecuacin de cuando menos algunos exones con
los dominios de protenas y la aparicin de exones
relacionados en protenas diferentes, no deja duda de
que la duplicacin y la yuxtaposicin de exones ha
desempeado un papel importante en la evolucin.
Es posible que el nmero de exones ancestrales, de
los cuales se han derivado todas las protenas por
duplicacin, variacin y recombinacin, sea relativa-
mente pequeo (algunos miles o decenas de miles).
Considerando al exn como unidad fundamental de
la evolucin, desde esta perspectiva se acepta impb'-
tina han oc
S
.p
omfae
S
,
cerevisiae
Acanthamoeba
Thermomyces
C. elegans
D. melanogaster A6
A1
A4 E
A2 --
Erizo de mar C
J -
Msculo de pollo
Msculo de rata
Citoplasma de rata
Msculo liso humano
Msculo cardiaco humano
Frijol de soya
Los genes de la actina varan ampliamente en cuanto a organizacin. Los sitios de
los intrones se indican en tono ms oscuro.
CAPTULO 3 El gen interrumpido
citamente el modelo de los intrones ancestrales como
origen de los genes que codifican protenas.
BCTl Se encuentra toda
La informacin gentica
contenida en el DNA?
Conceptos principales
.
La definicin del gen se ha invertido, de "un
gen ; una protena
"
a "una protena : un gen".
.
La informacin sobre La posicin tambin es
importante en el desarrollo.
El concepto del gen ha evolucionado significati-
vamente en los ltimos aos. La interrogante res-
pecto de qu hay en un nombre es especialmente
apropiada para el gen. Ya no podemos aseverar que
ste sea una secuencia de DNA que codifica con-
tinua y nicamente a una protena en particular.
En situaciones en las que un fragmento de DNA es
responsable de la produccin de una protena espe-
cfica, hoy da se considera que la secuencia entera
de DNA -desde el primer punto representado en
el RNA mensajero hasta el ltimo correspondiente
a su extremo-comprende al
"
gen
"
,
los exones, los
intrones y todo lo dems.
Cuando las secuencias que representan a pro-
tenas se superponen o tienen formas alternas de
expresin, es posible revertir la descripcin comn
del gen, y en vez de decir "un gen-un polippti-
do", podemos describir a la relacin como "un po-
lipptido-un gen", de modo que se considera a la
secuencia responsable de hecho de la produccin
del polipptido (incluidos intrones y exones) como
productora del gen, al mismo tiempo que se acepta
que desde la perspectiva de otra protena, parte de
esta misma secuencia tambin pertenece a su gen.
Esto permite el uso de descripciones como genes
"
superpuestos
"
o "alternativos".
Ahora podemos ver qu tan lejos se ha llegado
desde la hiptesis original de un gen:una enzima.
Hasta ese momento, la pregunta fundamental se
relacionaba con la naturaleza del gen, pero una vez
que se descubri que los genes representan a pro-
tenas, el paradigma se estableci como el concepto
de que cada unidad gentica funciona a travs de la
sntesis de una protena especfica.
Este punto de vista sigue siendo el paradigma
central de la biologa molecular: una secuencia de
DNA funciona codificando directamente a una pro-
tena en particular o porque es necesaria para el uso
de un segmento adyacente que codifica realmente a
la protena Qu tan lejos nos lleva este paradigma
aparte de explicar la relacin bsica entre los genes
y las protenas?
El desarrollo de organismos multicelulares se
sustenta en el uso de genes diferentes para generar
los diversos fenotipos celulares de cada tejido. La ex-
presin de los genes depende de una red reguladora
que asume la forma de una cascada. La expresin
del primer conjunto de genes al principio del de-
sarrollo embrionario conduce a la expresin de los
genes implicados en la siguiente etapa de desarrollo,
y as sucesivamente, hasta que todos los tejidos del
adulto son funcionales. La naturaleza molecular de
esta red reguladora es en gran medida desconocida,
pero suponemos que consiste en genes que codifi-
can a productos (probablemente protenas, quiz en
ocasiones RNA) que actan sobre otros genes.
Si bien es casi seguro que dicha serie de interac-
ciones es el medio por el cual se ejecuta el programa
de desarrollo, es posible preguntarse si es suficiente.
Una pregunta especfica concierne a la naturaleza y
la funcin de la informacin posicionaJ. Sabemos
que no todas las partes de un vulo fertilizado son
iguales; una de las caractersticas responsables del
desarrollo de diferentes partes de tejidos de distintas
regiones del vulo es la localizacin de la informa-
cin (presumiblemente macromolculas especficas)
dentro de la clula.
Desconocemos cmo se forman esas regiones
particulares, pero se puede especular que la existen-
cia de la informacin posicional en el vulo conduce
a la expresin diferencial de los genes en las clulas
formadas despus en estas regiones. Esto conduce al
desarrollo del organismo adulto, lo cual a su vez da
lugar al desarrollo de un vulo con la informacin
posicional apropiada.
Esta posibilidad incita a preguntar si informa-
cin necesaria para el desarrollo de organismos est
contenida en una forma que no pueda ser atribuida
directamente a una secuencia de DNA (aunque la
expresin de secuencias particulares puede ser ne-
cesaria para perpetuar la informacin posicional).
De una manera ms general, es posible preguntar
lo siguiente: cuando leemos la secuencia completa
de DNA que comprende al genoma de algn orga-
nismo y la interpretamos en funcin de protenas
y regiones reguladoras, se podra, en principio,
construir un organismo (o incluso una sola clula
viviente) por medio de la expresin controlada de
los genes adecuados?
Ug Resumen
Todos los tipos de genomas eucariticos contienen
genes interrumpidos. La proporcin de stos es baja
3
.
12 Resumen
en las levaduras y se incrementa en las eucariotas
inferiores; en las eucariotas superiores son pocos los
genes continuos.
Los intrones se encuentran en todas las clases
de genes eucariticos. La estructura del gen inte-
rrumpido es la misma en todos los tejidos: en el
RNA, los exones se unen en el mismo orden en que
estn organizados en el DNA y los intrones usual-
mente carecen de funcin codificadora. Los intrones
se eliminan del RNA por corte y empalme. Algunos
genes se expresan mediante patrones alternos de
corte y empalme, en los cuales una secuencia espe-
cfica es eliminada como intrn en algunas situacio-
nes, pero retenida como exn en otras.
Las posiciones de los intrones suelen conser-
varse cuando se compara la organizacin de genes
homlogos entre especies. Las secuencias de intro-
nes varan, incluso pueden no estar relacionadas,
aunque las secuencias de exones se mantienen bien
relacionadas. La conservacin de los exones puede
utilizarse para aislar genes relacionados en especies
diferentes.
El tamao de un gen depende sobre todo de
las longitudes de sus intrones, que en las eucario-
tas superiores se alargaron en las primeras etapas,
cuando, por lo tanto, las dimensiones de los genes
se incrementaron significativamente. La gama de
dimensiones de los genes de los mamferos suele
fluctuar entre 1 y 100 kb, pero es posible que sean
an ms largos: el caso conocido es el de la distro-
fina, que mide 2 000 kb.
Algunos genes comparten slo algunos de sus
exones con otros genes, lo cual sugiere que han sido
ensamblados por adicin de exones que represen-
tan a mdulos individuales de la protena. Dichos
mdulos podran haber sido incorporados en una
gran variedad de protenas diferentes. La idea de
que los genes se han ensamblado por acrecin
de exones implica que en los genes de organismos
primitivos hubo intrones. Algunas de las relacio-
nes entre genes homlogos pueden explicarse por
la prdida de intrones de los genes primordiales, con
prdida de intrones diferentes en lneas de ascen-
dencia diferentes.
Faustino, N. A. and Cooper, T. A. (2003). Pre-mRNA splicing
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CAPTULO 3 El gen interrumpido
El contenido del genoma
ESQUEMA DEL CAPITULO
Introduccin
Pueden trazarse mapas de Los genonnas por
Ligamiento, restriccin, divisin o secuencia de
DNA
Los genomas individuales son muy variables
.
El polimorfismo puede ser detectado en el nivel fenotpico
cuando una secuencia afecta a la funcin gnica, en el
de los fragmentos de restriccin cuando afecta a un sitio
diana de una enzima de restriccin y en el secuencial por
anlisis directo del DNA.
.
Los alelos de un gen muestran un amplio polimorfismo en
el nivel secuencial, pero muchos cambios de secuencia no
inciden en la funcin,
Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el
mapeo gentico
.
Los RFLP y los SNP pueden constituir la base de los mapas
de ligamiento; permiten establecer relaciones entre
progenitores y su progenie.
Por qu los genomas son tan grandes?
.
No hay una buena correlacin entre el tamao del genoma
y la complejidad gentica.
.
Hay un incremento en el tamao mnimo del genoma
necesario para formar organismos de mayor complejidad.
.
En numerosos filos, las dimensiones de los genomas de los
organismos varan ampliamente.
Los genomas eucariticos contienen secuencias
de DNA repetitivas y no repetitivas
.
La cintica de la reasociacin del DNA despus de que un
genoma ha sido desnaturalizado distingue a las secuencias
por la frecuencia con se repiten en el genoma.
.
En el DNA no repetitivo, los genes generalmente son
codificados por secuencias localizadas.
.
Los genomas ms grandes de un filo no contienen ms
genes, pero tienen cantidades mayores de DNA repetitivo.
.
Gran parte del DNA repetitivo puede estar formada por
transposones.
Los genes pueden ser aislados por la conservacin
de los exones
.
La conservacin de los exones puede ser utilizada como
base para localizar regiones codificadoras al identificar
fragmentos cuyas secuencias estn presentes en mltiples
organismos.
La conservacin de la organizacin del genoma
ayuda a identificar genes
.
Los algoritmos para identificar genes no son perfectos,
de modo que son necesarias numerosas correcciones al
conjunto inicial de datos.
.
Los seudogenes deben distinguirse de los genes activos.
.
Hay amplias relaciones sintnicas entre los genomas del
ratn y los del humano, y la mayora de los genes activos
se encuentran en una regin sintnica.
Los organelos contienen DNA
.
Las mitocondrias y los cloroplastos tienen genomas cuya
herencia es no mendeliana; tpicamente son heredados de
la madre.
.
Los genomas de los organelos pueden ser sometidos a
segregacin somtica en las plantas.
.
Las comparaciones del DNA mitocondrial sugieren que los
humanos descienden de una sola hembra, la cual vivi hace
200000 aos en frica.
Los genomas de los organelos son molculas
circulares de DNA que codifican protenas de los
organelos
.
Los genomas de los organelos suelen ser molculas
circulares de DNA (pero no siempre).
.
Los genomas de los organelos codifican algunas de las
protenas que se encuentran en el organelo, pero no a
todas.
La organizacin del DNA mitocondrial es variable
.
El DNA mitocondrial de las clulas animales es
extremadamente compacto y suele codificar a 13 protenas,
dos molculas de RNAr y 22 de RNAt.
. El DNA mitocondrial de las levaduras es cinco veces ms
largo que el DNAmt de las clulas animales por la presencia
de intrones largos.
El genoma de los cloroplastos codifica a
numerosas protenas y molculas de RNA
.
Los genomas de los cloroplastos varan en cuanto a
tamao, pero son lo suficientemente grandes como para
codificar de 50 a 100 protenas, as como a los RNAr y a los
RNAt.
Las mitocondrias evolucionaron por endosimbiosis
Resumen
55
Introduccin
La pregunta crucial sobre el genoma es cuntos ge-
nes contiene. Se puede pensar acerca del nmero
total de genes en cuatro niveles, los cuales corres-
ponden a etapas sucesivas de la expresin gnica:
.
El genoma es el conjunto completo de los
genes de un organismo. En ltima instancia
se define por la secuencia completa de DNA,
aunque por una cuestin prctica podra no
ser posible identificar cada gen inequvoca-
mente slo con base en la secuencia.
.
El transcriptoma es el conjunto comple-
to de los genes expresados en determina-
das condiciones. Se define en funcin del
conjunto de molculas de RNA presente y
puede referirse a un solo tipo de clula, a
cualquier ensamble de clulas ms complejo
o al organismo completo. Debido a que al-
gunos genes generan mltiples molculas de
RNAm, es probable que el transcriptoma sea
mayor que el nmero de genes definidos di-
rectamente en el genoma. El transcriptoma
incluye a las molculas de RNA no codifica-
doras, as como a las molculas de RNAm.
.
El proteoma es el conjunto completo de
protenas. Debe corresponder a las mol-
culas de RNAm del transcriptoma, aunque
puede haber diferencias de detalle que re-
flejen cambios de la abundancia relativa o
la estabilidad de las molculas de RNAm y
de las protenas. Puede ser utilizado para re-
ferirse al conjunto de protenas codificadas
por todo el genoma o producidas en cual-
quier clula o tejido especficos.
.
Las protenas pueden funcionar de manera
independiente o como parte de ensambles
de mltiples protenas. Si fuera posible iden-
tificar todas las interacciones entre protena
y protena, se podra definir el nmero total
de ensambles independientes de protenas.
El nmero de genes del genoma puede ser identi-
ficado directamente al definir marcos de lectura abier-
tos. El mapeo de esta naturaleza a gran escala es com-
plicado porque los genes interrumpidos pueden estar
formados por numerosos marcos de lectura abiertos
separados. No necesariamente tenemos informacin
acerca de las fundones de los productos protenicos,
o de hecho, una prueba de que lleguen a expresarse,
de modo que este abordaje se restringe a la definicin
del potencial del genoma. Sin embargo, se presume con
relativa certeza que cualquier marco de lectura abierto
conservado probablemente llegue a expresarse.
Otro abordaje consiste en definir el nmero de
genes directamente en funcin del transcriptoma
(identificando directamente todas las molculas de
RNAm) o del proteoma (identificando directamente
todas las protenas). Esto proporciona la seguridad de
que se trata con genes autnticos que se expresan en
circunstancias conocidas y permite investigar cuntos
genes son expresados en un tipo de clula o un tejido
particular, qu variacin existe en los niveles relati-
vos de expresin y cuntos de los genes expresados
en una clula particular son nicos de esa clula o
tambin son expresados en alguna otra parte.
Respecto de los tipos de genes, podemos pre-
guntar si alguno en particular es esencial: qu le
sucede a un mutante nulo? Si una mutacin nula
es letal, o el organismo presenta un defecto visi-
ble, podemos concluir que el gen es esencial o que
al menos transfiere una ventaja selectiva, pero al-
gunos genes pueden ser suprimidos sin un efecto
aparente en el fenotipo Son estos genes realmente
prescindibles, o resulta una desventaja selectiva por
la ausencia del gen, quizs en otras circunstancias,
o en periodos ms largos?
WW1 Pueden trazarse mapas
de los genarnas por Ligamiento,
por restriccin, por divisin
o por secuencia de DNA
Definir esencialmente el contenido de un genoma
significa trazar un mapa de genes y genomas en
muchos niveles de resolucin:
.
Mediante un mapa gentico (o de ligamien-
to) se identifica la distancia entre mutaciones
en cuanto a frecuencias de recombinadn.
Lo limita su dependencia en la ocurrencia
de mutaciones que afectan al fenotipo. De-
bido a que las frecuencias de recombinacin
pueden distorsionarse respecto de la distan-
cia fsica entre los sitios, no representa con
precisin distancias fsicas a lo largo del ma-
terial gentico.
.
Un mapa de ligamiento puede construirse
midiendo la recombinacin entre sitios en el
DNA genmico. Estos sitios tienen variacio-
nes secuenciales que generan diferencias en
la susceptibilidad de divisin por ciertas en-
zimas (de restriccin); como dichas variacio-
nes son comunes, es posible hacer un mapa
de ligamiento para cualquier organismo, a
pesar de la ocurrencia de mutantes. Su des-
ventaja es la misma para cualquier mapa
de ligamiento, es decir, que las distancias
relativas se basan en la recombinacin.
.
Un mapa de restriccin se construye divi-
dendo el DNA en fragmentos con enzimas
de restriccin y midiendo las distancias entre
los sitios de divisin. Este mapa representa
distancias en cuanto a longitud del DNA,
por lo tanto, proporciona un mapa fsico del
CAPTULO 4 EL contenido del genoma
material gentico. Con un mapa de restric-
cin no se identifican intrnsecamente los
sitios de inters gentico, para relacionarlo
con el mapa gentico, las mutaciones deben
ser caracterizadas en funcin de sus efectos
en los sitios de restriccin. Pueden recono-
cerse grandes cambios en el genoma por-
que afectan a dimensiones o el nmero de
fragmentos de restriccin. Las mutaciones
puntuales son ms difciles de detectar.
.
El ltimo mapa permite determinar la se-
cuencia del DNA. A partir de la secuencia
se identifican los genes y las distancias entre
ellos. Al analizar el potencial de codificacin
de protenas de una secuencia de DNA se
puede deducir si representa a una protena,
en cuyo caso, la conjetura bsica es que la
seleccin natural impide la acumulacin de
mutaciones dainas en las secuencias que
codifican protenas. Invirtiendo el argumen-
to, se puede suponer que es probable que
una secuencia codificadora intacta sea uti-
lizada para formar protena.
Al comparar la secuencia de un DNA de tipo sil-
vestre con la de un alelo mutante, es factible determi-
nar la naturaleza de una mutacin y el sitio exacto en
que aparecer. Esto define la relacin entre el mapa
gentico (el cual se basa completamente en los sitios
de mutacin) y el mapa fsico (basado en la secuencia
del DNA, incluso puede estar formado por sta).
Tcnicas similares son utilizadas para identificar
y secuenciar genes y para trazar mapas del genoma,
aunque por supuesto hay una diferencia de escala.
En cada caso, el principio consiste en obtener una
serie de fragmentos superpuestos de DNA que pue-
dan ser conectados en un mapa continuo. La carac-
terstica clave consiste en que cada segmento est
relacionado con el siguiente segmento en el mapa
caracterizando la superposicin entre ellos, de tal
forma que podemos estar seguros de que no faltan
segmentos. Este principio es aplicado para ordenar
grandes fragmentos en un mapa y para conectar las
secuencias que constituyen a los fragmentos.
Ifl Los genomas individuaLes
son muy variables
EL polimorfismo puede ser detectado en el nivel
fenotpico cuando una secuencia afecta a La funcin
gnica, en eL de Los fragmentos de restriccin cuando
afecta a un sitio diana de una enzima de restriccin y
en el secuencial por anlisis directo del DNA.
Los alelos de un gen muestran un amplio polimorfismo
en el nivel secuencial, pero muchos cambios de
secuencia no inciden en La funcin.
En la perspectiva mendeliana original del genoma,
los alelos se clasificaban como silvestres o mutantes;
posteriormente se acept la existencia de alelos ml-
tiples, cada uno con un efecto diferente en el fenoti-
po. En algunos casos, incluso podra no ser apropia-
do definir algn alelo como de "tipo silvestre".
La coexistencia de alelos mltiples en un locus
se denomina polimorfismo gentico. Por defini-
cin, cualquier sitio en el cual existen alelos ml-
tiples como componentes estables de la poblacin
es polimrfico. Un alelo suele ser definido como
polimrfico si su frecuencia en la poblacin es de
>1 por ciento.
Cul es la base del polimorfismo entre los alelos
mutantes? Poseen diferentes mutaciones que modifi-
can la funcin protenica, produciendo cambios en el
fenotipo. Si se comparan los mapas de restriccin de
las secuencias de DNA de estos alelos, stos tambin
sern polimrficos, en el sentido de que cada mapa
o secuencia ser diferente de los otros.
Aunque no es evidente a partir del fenotipo,
el tipo silvestre mismo puede ser polimrfico. Las
versiones mltiples del alelo de tipo silvestre pue-
den distinguirse por diferencias secuenciales que no
afectan a su funcin y que, por lo tanto, no pro-
ducen variantes fenotpicas. Una poblacin puede
tener gran polimorfismo en el nivel del genotipo.
En un locus determinado pueden existir muchas
variantes de secuencia diferentes; algunas son evi-
dentes porque afectan al fenotipo, pero otras estn
ocultas porque su efecto no es visible,
De manera que puede haber una sucesin de
cambios en un locus, incluidos los que cambian la
secuencia del DNA pero que no alteran la secuencia
de la protena, los que transforman la secuencia de
la protena sin afectar su funcin, los que crean pro-
tenas con actividades diferentes y los que producen
protenas mutantes no funcionales.
Cuando se comparan los alelos, un cambio en
un solo nucletido se denomina polimorfismo
de un solo nucletido (SNP, single nudeotide po-
lymorphism). Uno de estos cambios se presenta cada
~
1 300 bases en el genoma humano. Definido por
sus SNP, cada ser humano es nico. Los SNP pueden
ser detectados por diversos medios, desde compara-
ciones directas de secuencia hasta mtodos bioqu-
micos o de espectroscopia de masas que producen
diferencias basadas en variaciones de secuencia en
una regin definida,
Un objetivo del mapeo gentico es obtener un
catlogo de variantes comunes. La frecuencia obser-
vaaa de SNP por genoma pronostica que, respecto
de la poblacin humana en general (considerando
la suma de todos los genomas humanos de todos los
individuos vivientes), debe haber >10 millones de
SNP que ocurren a una frecuencia de >1 por ciento;
ya se ha identificado >1 milln.
4
.3 Los genomas individuales son muy variables
Algunas mutaciones puntuales modifican el mapa de restriccin
El DNA tiene 3 sitios
diana en la regin
I \ \
La divisin genera
dos fragmentos
internos
fragmento A fragmento B
i
La mutacin elimina
un sitio diana
\ I I
La divisin genera I
un fragmento y
interno
fragmento C
Electroforesis
i
D
Fragmentos A + B combinados = C
4.1 Una mutacin puntual que afecta a un sitio de restriccin se
detecta por una diferencia en los fragmentos de restriccin.
Los sitios de restriccin muestran herencia mendelana
A
B
Progenitores
3 son heterocigotos
1 es homocigoto para C
C
F1
A
D
F2 hereda A o D de un
progenitor, B o C del
otro progenitor
C
D
A
C
A
B
A
C
B
D
A
B
Alelo A
Alelo B
Alelo C
Alelo D
4
2 Los polimorfismos de Los sitios de restriccin se heredan segn
las leyes de Mendel. Hay cuatro aleLos para un marcador de restriccin en
todas Las combinaciones de pares posibles; se segregan de forma indepen-
diente en cada generacin. La fotografa es cortesa de Ray White,
Ernest
Gallo Clinic and Research Center, University of California,
San Francisco.
Algunos polimorfismos del genoma pueden
detectarse al comparar los mapas de restriccin de
individuos diferentes. El criterio es un cambio en el
patrn de fragmentos producidos por divisin con
una enzima de restriccin. En la FIGURA se mues-
tra que cuando en el genoma de un individuo hay
un sitio diana y en el de otro no,
la divisin extra
en el primer genoma generar dos fragmentos que
corresponden al fragmento individual del segundo
genoma.
El mapa de restriccin es independiente de la
funcin gnica, de modo que en este nivel, un po-
limorfismo puede ser detectado a pesar de que el cam-
bio de secuencia afecte al fenotipo. Probablemente muy
pocos de los polimorfismos de los sitios de restric-
cin de un genoma realmente afecten al fenotipo, la
mayora implican cambios de secuencia que pueden
no tener efecto en la produccin de protenas (por
ejemplo, debido a que se encuentran entre genes).
Una diferencia en los mapas de restriccin de
dos individuos es denominado polimorfismo de
la longitud de los fragmentos de restriccin
(RFLP, restriction fragment length polymorphism). B-
sicamente, un RFLP es un SNP localizado en el sitio
diana de una enzima de restriccin que puede uti-
lizarse como marcador gentico exactamente de la
misma manera que cualquiera otro marcador. En
vez de examinar alguna caracterstica del fenotipo,
se evala directamente el genotipo, como lo revela
el mapa de restriccin. En la FIGURA 4.2 se observa la
genealoga de un polimorfismo de restriccin a tra-
vs de tres generaciones; exhibe segregacin men-
delana en los fragmentos de marcadores de DNA.
Los RFLP y Los SNP
pueden ser utilizados
para eL mapeo gentico
Concepto principal
.
Los RFLP y Los SNP pueden constituir la base de Los
mapas de Ligamiento; permiten establecer relaciones
entre progenitores y su progenie.
La frecuencia de recombnacin puede medirse en-
tre un marcador de restriccin y un marcador feno-
tpico visible, como se ilustra en la FIGURA 4.3, de tal
manera que un mapa gentico puede incluir mar-
cadores genotpicos y fenotpicos.
Los marcadores de restriccin no se limitan a
los cambios del genoma que afectan al fenotipo, de
modo que proporcionan las bases para una tcnica
extremadamente poderosa de identificacin de loci
genticos en el mbito molecular. Un problema tpi-
co concierne a una mutacin con efectos conocidos
en el fenotipo, en el cual el locus gentico pertinen-
te puede ser colocado en un mapa gentico, pero de
la cual se desconoce el gen o la protena correspon-
diente. Muchas enfermedades humanas dainas o
fatales pertenecen a esta categora. Por ejemplo, la
fibrosis qustica muestra herencia mendelana, pero
se desconoca la naturaleza molecular de la funcin
mutante hasta que se pudo identificar como resul-
tado de la caracterizacin del gen.
Si los polimorfismos de restriccin son aleatorios
en el genoma, algunos deben ocurrir cerca de un gen
diana especfico. Dichos marcadores de restriccin se
58
CAPTULO 4 El contenido del genoma
Los RFLP son marcadores genticos
Cruza gentica
Los RFLP pueden relacionarse con genes de enfermedad
35%
Tipos de progenitores
15%
Recombinantes
15%
El marcador de restriccin est a 30 unidades de
mapeo del marcador de color de ojos
:
- Un polimorfismo de restriccin puede ser utilizado
como marcador gentico para medir la distancia de recombi-
nacin a partir de un marcador fenotpico (como el color de
los ojos). En la figura se simplifica la situacin mostrando slo
las bandas de DNA que corresponden al alelo de un genoma
en un diploide.
identifican gracias a su estrecha vinculacin con el fe-
notipo mulante. Si se compara el mapa de restriccin
del DNA de pacientes que padecen una enfermedad
con el DNA de personas sanas, podra encontrarse
que, en los pacientes, siempre hay un sitio de restric-
cin en particular (o siempre est ausente).
En la 1IGURA 4.4 se muestra un ejemplo hipo-
ttico que corresponde al descubrimiento de una
vinculacin de 100% entre el marcador de restric-
cin y el fenotipo, lo cual implicara que el marcador
de restriccin est tan cerca del gen mutante, que
nunca se separa de l por recombinacin.
La identificacin de un marcador de tales carac-
tersticas tiene dos consecuencias importantes:
.
Puede ofrecer un procedimiento diagnsti-
co para detectar la enfermedad. Algunas de
las enfermedades humanas bien caracteri-
zadas genticamente pero mal definidas en
funcin de las molculas, no son fciles de
diagnosticar. Si un marcador de restriccin
est ligado confiablemente al fenotipo, pue-
de servir para diagnosticar la enfermedad.
.
Puede conducir al aislamiento del gen. El
marcador de restriccin debe encontrarse
Investigacin de los patrones de DNA
de los pacientes con la enfermedad
Investigacin de control de
los patrones de DNA
de las personas
no afectadas
nn
-
La banda es la misma en el paciente
y en la persona sana
_
El polimorfismo no ligado vara
en todas las muestras
HHr
-
La banda es comn a los pacientes
La banda es comn a todas _
las personas no afectadas
1 1
H
-
-
H
FIGURA 4. Si un marcador de restriccin es asociado con
una caracterstica fenotpica, el sitio de restriccin debe estar
localizado cerca del gen responsable del fenotipo. La mutacin
que cambia la banda comn a las personas sanas en la banda
comn a los pacientes, est muy ntimamente relacionada con
el gen de La enfermedad.
relativamente cerca del gen en el mapa ge-
ntico si ambos loci rara vez se recombinan,
o nunca. Lo que se considera
"
relativamente
cerca
"
en gentica puede ser una distancia
sustancial entre pares de bases de DNA; no
obstante, el marcador de restriccin propor-
ciona un punto de inicio del cual partir en
el DNA para localizar el gen.
La frecuente presencia de SNP en el genoma hu-
mano los hace tiles para el mapeo gentico. De los
1.5 x 106 SNP que hasta ahora han sido identificados,
en promedio hay uno cada 1 a 2 kb, lo cual debe per-
mitir la localizacin rpida de genes de enfermedades
nuevas al ubicarlos entre los SNP ms cercanos.
Segn el mismo principio, el mapeo por RFLP
ha sido utilizado durante algn tiempo. Una vez que
se asigna uno de ellos a un grupo de ligamiento,
puede colocarse en el mapa gentico. En el hom-
bre y en el ratn, este mapeo ha conducido a la
construccin de mapas de ligamiento para ambos
genomas. El ligamiento de un sitio desconocido se
prueba con estos sitios y puede ser colocado rpi-
damente en el mapa. Hay menos RFLP que SNP, as
que, en principio, la resolucin del mapa de RFLP
es ms limitada.
La frecuencia del polimorfismo significa que
cada individuo tiene una constelacin nica de SNP
o de RFLP. La combinacin especfica de los sitios
encontrados en una regin especfica se denomina
haplotipo, un genotipo en miniatura. Si bien el
concepto de haplotipo fue introducido originalmen-
A.
Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo gentico
59
El contenido de ONA se relaciona
con la complejidad morfolgica?
Plantas con flores
Aves II
Mamferos 1
Reptiles
Anfibios
Peces seos
mmm
Peces cartilaginosos
Equinodermos mm
Crustceos
Insectos mmm
Moluscos mm
Gusanos ii
Mohos
Algas
Hongos
Bacterias gram (+)
Bacterias gram (-)
Micoplasma
106 107 108 109 1010 1011
te para describir la constitucin gentica del locus
mayor de histocompatibilidad, regin que especi-
fica protenas considerablemente importantes del
sistema inmunolgico (vase Cap. 23, Diversidad
inmunitaria), ahora se ha extendido a la descrip-
cin de combinaciones particulares de alelos o sitios
de restriccin (o cualquier otro marcador gentico)
de algn rea definida del genoma. Mediante los
SNP se cre un detallado mapa de haplotipos del
genoma humano que facilita el trazado de los mapas
de los genes provocadores de enfermedades.
La existencia de RFLP constituye la base de una
tcnica que permite establecer relaciones inequvo-
cas entre los progenitores y su progenie. Cuando
se duda de la paternidad, la comparacin del mapa
RFLP de una regin cromosmica adecuada de los
progenitores potenciales y del hijo permite asignar
de manera absoluta el parentesco. El uso del anli-
sis de restriccin del DNA para la identificacin de
individuos se ha denominado huella digital del
DNA. El anlisis de secuencias "minisatlite" espe-
cialmente variables se utiliza en el mapeo del geno-
ma humano (vase la seccin 6.14, Los minisatlites
facilitan el mapeo gentico).
Por qu Los genomas
son tan grandes?
Conceptos principales
.
No hay una buena correlacin entre el tamao del
genoma y la complejidad gentica.
.
Hay un incremento en el tamao mnimo del
genoma necesario para formar organismos de mayor
complejidad.
.
En numerosos filos, las dimensiones de los genomas de
los organismos varan ampliamente.
La cantidad total de DNA del genoma (haploide) es
una caracterstica de cada especie viviente conocida
como su valor C. Hay una variacin enorme en el
rango de los valores C, desde <106 bp en un mico-
plasma hasta >10" bp en algunas plantas y algunos
anfibios.
En la FIGURA 4.5 se resume el rango de valores
C encontrados en diferentes filos evolutivos. Con-
forme se incrementa la complejidad, aumenta el
tamao mnimo del genoma encontrado en cada
grupo. Sin embargo, al incrementarse las cantidades
absolutas de DNA en las eucariotas superiores, se
observan amplias variaciones en las dimensiones de
los genomas de algunos filos.
En la FIGURA 4.;, el diagrama de la cantidad m-
nima de DNA requerida por un miembro de cada
'
El contenido de DNA del genoma haploide se
incrementa con la complejidad morfolgica de las eucariotas
inferiores, pero vara ampliamente en algunos grupos de euca-
riotas superiores. El rango de los valores de DNA de cada grupo
se indica mediante reas sombreadas.
l#l.,--li!iillilli.lilll#liiWI
1010|
.
.
mili
109
ra
0)
en
108
ra
i 10
ra
106
;
s
v
FIGURA 4.6 El genoma mnimo encontrado en cada filo se
incrementa de las procariotas a los mamferos.
grupo sugiere que para formar procariotas ms
complejas y eucariotas inferiores, es necesario que
el genoma aumente de tamao.
Los micoplasmas son las procariotas ms peque-
as, y sus genomas son slo ~3 veces el tamao de
un bacterifago grande. El tamao de las bacterias
parte de ~2 x 106 bp. Las eucariotas unicelulares
(cuyos estilos de vida pueden parecerse a los de las
CAPTULO 4 EL contenido del genoma
Tamaos de genomas tiles
Filo
Especies Genoma (bp)
Alga Pyrenomas salina 6.6 x 105
Micoplasma
M. pneumoniae 1.0 x 106
Bacteria E.
coli 4.2 x 106
Levadura S. cerevisiae 1.3 x 107
Moho limoso D.
discoideum 5.4 x 107
Nematodo C
. elegans 8.0 x 107
Insecto D. melanogaster 1.4 x 108
Ave G. domesticus 1.2 x 109
Anfibio X
.
laevis 3.1 x 109
Mamfero H. sapiens 3.3 x 109
Dimensiones de Los genomas de algunos organis-
mos experimentales comunes.
procariotas) tambin subsisten con genomas peque-
os, aunque son ms grandes que los de las bacte-
rias. El hecho de que un organismo sea eucaritico
en s, no implica un gran incremento en cuanto al
tamao del genoma; una levadura puede tener un
genoma de ~ 1.3 x 107 bp, el cual es apenas dos veces
el tamao de un genoma bacteriano promedio.
Otro doble incremento en el tamao del ge-
noma es adecuado para respaldar al moho limoso
Dictyostelium discoideum, que puede vivir tanto en la
modalidad unicelular como en la multicelular. Es
necesario otro incremento en la complejidad para
dar lugar a los primeros organismos completamente
multicelulares; el nematodo Caenorhabditis elegans
tiene un DNA de 8 x 107 bp.
Asimismo, en el listado de la se ob-
serva el incremento constante del tamao del ge-
noma de acuerdo con la complejidad de algunos
de los organismos ms comnmente analizados. Es
necesario que aumente el tamao del genoma para
que se formen insectos, aves, anfibios y mamferos.
Sin embargo, despus de este punto no hay una
buena relacin entre las dimensiones del genoma y
la complejidad morfolgica del organismo.
Se sabe que los genes son mucho ms grandes
que las secuencias necesarias para codificar protenas
porque los exones (regiones codificadoras) pueden
incluir slo una pequea parte de la longitud total de
un gen, lo cual explica la razn de que haya mucho
ms DNA del necesario para proporcionar marcos de
lectura para todas las protenas del organismo, pues
grandes segmentos de un gen interrumpido pueden
no estar relacionados con la codificacin de prote-
nas. Adicionalmente puede haber fragmentos signi-
ficativos de DNA entre los genes, de modo que no es
posible hacer deducciones respecto del nmero de
genes a partir del tamao total del genoma.
La paradoja del valor C se refiere a la falta de
correlacin entre el tamao del genoma y la comple-
jidad gentica. Hay algunas variaciones muy curiosas
respecto del tamao del genoma. En el sapo Xenopus
y el hombre, los genomas son esencialmente del mis-
mo tamao, sin embargo, se supone que el hombre
es ms complejo en cuanto a desarrollo gentico! En
algunos filos, las variaciones en contenido de DNA
entre organismos que no difieren mucho en cuan-
to a complejidad extremadamente grandes (vase la
Fig. 4.5). (Esto es especialmente notable en insectos,
anfibios y plantas, no as en aves, reptiles ni mamfe-
ros, los cuales muestran pocas variaciones dentro del
grupo, con un rango de dimensiones de genoma de
-
2 veces). Un grillo tiene un genoma 11 veces mayor
que el de una mosca de la fruta. En los anfibios, los
genomas ms pequeos son de <109bp, mientras que
los ms grandes son de -lO11 bp. Es poco probable
que se necesite una gran diferencia en el nmero de
genes para especificar a estos anfibios. No se sabe por
qu la seleccin natural permite esta variacin, ni si
tiene consecuencias evolutivas.
gyi Los genomas eucariticos
contienen secuencias de DNA
repetitivas y no repetitivas
Conceptos principales
.
La cintica de la reasociacin del DNA despus de que
un genoma ha sido desnaturalizado distingue a las
secuencias por la frecuencia con se repiten en el genoma.
.
En el DNA no repetitivo, los genes generalmente son
codificados por secuencias Localizadas.
.
Los genomas ms grandes de un filo no contienen ms
genes, pero tienen cantidades mayores de DNA repetitivo.
.
Gran parte del DNA repetitivo puede estar formada por
transposones.
Las caractersticas generales del genoma eucaritico
pueden evaluarse por la cintica de reasociacin del
DNA desnaturalizado, tcnica ampliamente utiliza-
da antes de que fuera posible la secuenciacin del
DNA a gran escala.
Con la cintica de reasociacin se identifican
dos tipos generales de secuencias genmicas:
.
El DNA no repetitivo consta de secuen-
cias nicas: slo hay una copia en un geno-
ma haploide.
.
El DNA repetitivo consta de secuencias
presentes en ms de una copia en cada ge-
noma.
El DNA repetitivo con frecuencia se divide en
dos tipos generales:
.
El DNA moderadamente repetitivo consiste
en secuencias relativamente cortas que se
repiten tpicamente de 10-1000 veces en
el genoma, dispersas a lo largo de ste; son
4
.6 Los genomas eucariticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas
El DNA no repetitivo slo es parte del genoma
10
10
109
E
o
c
0)
O)
"
S
D
o
1C
E
107
58% 54%
41
25%
10%
70%
100%
106
14%
3%
17%
2%
65%
331"-
5%
7%
o
-
6a #
M No repetitivo Moderadamente Muy
repetitivo repetitivo
Las proporciones de los diferentes componentes
secuenciales varan en los genomas eucariticos. El contenido
absoluto de DNA no repetitivo se incrementa con el tamao del
genoma, pero alcanza una meseta a ~2 x 109 bp.
responsables del alto grado de formacin de
la estructura secundaria en el pre-RNAm,
cuando repeticiones (invertidas) en los in-
trones se aparean para formar regiones d-
plex.
.
El DNA altamente repetitivo est formado
por secuencias muy cortas (tpicamente
<100 bp) presentes muchos miles de veces
en el genoma, frecuentemente organizadas
en forma de repeticiones en tndem (vase
la seccin 6.II
,
Los DNA satlite frecuente-
mente se encuentran en la heterocromati-
na). Ninguna clase representa a protenas.
La proporcin del genoma ocupado por DNA no
repetitivo vara mucho. En la se resume
la organizacin genmica de algunos organismos
representativos. Las procariotas contienen slo DNA
no repetitivo. En las eucariotas inferiores, la mayor
parte del DNA es no repetitivo; <20% forma parte
de uno o ms componentes moderadamente repe-
titivos. En las clulas animales, a menudo hasta la
mitad del DNA es ocupado por componentes mo-
derada y altamente repetitivos. En las plantas y en
los anfibios, los componentes moderada y altamen-
te repetitivos pueden representar hasta el 80% del
genoma, de tal manera que el DNA no repetitivo se
reduce a un componente minoritario.
Una parte significativa del DNA moderadamen-
te repetitivo consiste en transposones, secuencias
cortas de DNA (de ~1 kb) susceptibles de moverse
a localizaciones nuevas en el genoma y de crear
copias adicionales de s mismos (vanse Cap. 21,
Transposones, y Cap. 22, Retrovirus y retroposo-
nes). En algunos genomas eucariticos superiores
pueden ocupar incluso ms de la mitad del genoma
(vase la seccin 5.5, El genoma humano tiene me-
nos genes de los esperados).
En ocasiones se considera que los transposones
se adaptan al concepto de DNA redundante, el
cual se define como secuencias que se propagan por
s mismas en un genoma sin contribuir al desarrollo
del organismo. Los transposones suelen fomentar
las reestructuraciones genmicas, y stas podran
conferir ventajas selectivas. Sin embargo, es justo
decir que en realidad no se sabe porqu las fuer-
zas selectivas no contrarrestan el que los transpo-
sones se conviertan en una proporcin tan grande
del genoma. Otro trmino que se utiliza para des-
cribir el exceso aparente de DNA es
"
DNA basura",
que define a secuencias genmicas sin una funcin
aparente. Obviamente, es probable que en el ge-
noma haya un equilibrio entre la generacin de
secuencias nuevas y la eliminacin de secuencias
indeseables, y que cierta proporcin del DNA que
aparentemente carece de funcin, est en proceso
de ser eliminada.
La longitud del componente no repetitivo de
DNA tiende a incrementarse con el tamao total
del genoma conforme se procede a un tamao to-
tal del genoma de ~3 x 109 (caracterstico de los
mamferos). Sin embargo, incrementos posteriores
generalmente reflejan un aumento de la cantidad
y la proporcin de componentes repetitivos, de tal
forma que es raro que un organismo tenga un com-
ponente de DNA no repetitivo >2 x I09. Por lo tanto,
el contenido de DNA no repetitivo de los genomas
concuerda con nuestra percepcin de la compleji-
dad relativa del organismo. E. coli tiene 4.2 x 106 bp;
C
. elegans se incrementa en un orden de magnitud, a
6
.6 x 107 bp; D. melanogaster se incrementa an ms,
a ~10s bp, y en los mamferos, el incremento es de
otro orden de magnitud, a ~2 x 10
9 b
p
.
Qu tipo de DNA corresponde a los genes co-
dificadores de protenas? La cintica de reasociacin
suele mostrar que el RNAm es derivado del DNA
no repetitivo, de modo que la cantidad de ste es
un mejor indicador del potencial codificador que el
DNA total. (No obstante, un anlisis ms detallado
basado en las secuencias genmicas muestra que
numerosos exones tienen secuencias relacionadas
en otros exones [vase la seccin 3.5, Las secuencias
de los exones se conservan, pero las de los intrones
varan]. Dichos exones evolucionan por duplicacin
CAPTULO 4 El contenido del genoma
para formar copias que inicialmente son idnticas,
pero que despus difieren en secuencia durante la
volucin.)
Los genes pueden ser aislados
por La conservacin
de Los exones
Concepto principal
.
La conservacin de los exones puede ser utilizada como
base para localizar regiones codificadoras al identificar
fragmentos cuyas secuencias estn presentes en
mltiples organismos.
Algunas estrategias importantes para la identifi-
cacin de genes se basan en el contraste entre la
conservacin de los exones y la variacin de los in-
:
rones. En una regin que contiene un gen cuya
iuncin se ha conservado en un rango de especies,
la secuencia que representa a la protena debe tener
dos propiedades distintivas:
.
Un marco de lectura abierto,
.
y es probable que tenga una secuencia rela-
cionada en otras especies.
Estas caractersticas pueden utilizarse para aislar
genes.
Supngase que por datos genticos se sabe que
un rasgo gentico especfico se localiza en determi-
nada regin cromosmica. Si se desconoce la natura-
leza del producto del gen, cmo se identifica al gen
en una regin que puede ser, por ejemplo, >1 Mb?
Una estrategia colosal cuya eficacia ha sido de-
mostrada con algunos genes de importancia mdica,
consiste en detectar en fragmentos relativamente
cortos de la regin las dos propiedades esperadas de
un gen conservado. Primero se intenta identificar
fragmentos sometidos a hibridacin cruzada con los
genomas de otras especies y despus se examinan
dichos fragmentos para detectar marcos de lectura
abiertos.
El primer criterio se aplica al realizar una zoo-
transferencia, para lo cual se utilizan fragmentos
cortos de la regin como sondas (radioactivas) para
evaluar la presencia de DNA relacionado en una
variedad de especies a travs de la hibridacin de
Southern. Si se encuentran fragmentos de hibrida-
cin relacionados con el de la sonda en numerosas
especies -la sonda suele ser humana-, sta se con-
vierte en candidato para un exn del gen.
Los candidatos van en secuencia y, si contienen
marcos de lectura abiertos, se utilizan para aislar
a las regiones genmicas circundantes. Si parecen
ser parte de un exn, posteriormente podrn ser
utilizados para identificar al gen completo, aislar al
Los genes pueden ser identificados
por deleciones
_
Las translocaciones cromosmicas
'
identifican a la banda Xp21 como
fuente de la DMD
n
Mediante el DNA clonado de X
<
humano se identifican las
deleciones en esta regin
Mapa de restriccin construido
mediante caminata cromosmica
a partir de la sonda
-70 kb f 0
+70 kb
I]
Las molculas de DNA de pacientes con DMD
presentan deleciones en la regin de la caminata
i
El DNA hacia la derecha
se elimina
O
El DNA hacia la
izquierda se elimina
Delecin interna
El gen implicado en la distrofia muscular de Du-
chenne fue detectado mediante un mapeo cromosmico y
"
ca-
minando
"
hacia una regin en la cual se pueden identificar
deleciones cuando se presenta la enfermedad.
DNAc o al RNAm correspondiente y, por ltimo,
para identificar a la protena.
Esta estrategia es particularmente importante
cuando el gen diana est disperso porque posee nu-
merosos intrones prominentes, como en el caso de
la distrofia muscular de Duchenne (DMD, Duchenne
muscular dystrophy), trastorno degenerativo de los
msculos ligado al cromosoma X, presente en uno
de cada 3 500 nacimientos de varones. Los pasos
para identificar el gen se resumen en la
Mediante el anlisis del ligamiento se localiz
el locus correspondiente en la banda cromosmica
Xp21. Los afectados por la enfermedad con frecuen-
cia presentan reestructuraciones cromosmicas en
dicha banda. Al comparar la capacidad de las son-
das de DNA ligadas al cromosoma X para hibridar-
se con el DNA de pacientes con DNA normal, se
obtuvieron fragmentos clonados correspondientes
a la regin reestructurada o eliminada del DNA de
los pacientes.
4
.7 Los genes pueden ser aislados por la conservacin de los exones
El gen de la DMD codifica a una protena muscular
4
Humano
Murina
i
DNAc
50 clones de la regin
hibridada al DNA de otras
especies; 2 clones se hibridan
con todos los mamferos
La secuencia del fragmento
proveniente del hombre y del ratn
es 95% idntica y tiene un marco
de lectura abierto
....GCCATAGAGCGAGAA-
....GGCATAGCACGAGAA--
Utilizar el fragmento para identificar
RNAm de 14 kb; exones del mapa
correspondientes al DNAc
0 2
MI!
0 250
-
1 1 1
-
4 6
I I
-
i
-
10 12 kb
I
500
I I I
750 1 000
1 500 Kb en el genome
Los anticuerpos contra la secuencia
| peptdica corta del DNAc identifican
a b c d a la protena distrofina
200
100
50
25
La distrofina tiene -500 kD:
est presente en
(a) msculo esqueltico
(b) msculo cardaco
y est ausente! en
(c) otros tejidos
(d) msculo con DMD
El gen de la distrofia muscular de Duchenne
se caracteriz por medio de hibridacin inespecfica, hibri-
dacin de DNAc, hibridacin genmica e identificacin de la
protena.
Una vez que se ha obtenido un poco del DNA
localizado en la vecindad general del gen diana, es
posible
"
caminar
"
a lo largo del cromosoma hasta
llegar al gen. Mediante una caminata cromosmica
se construy un mapa de restriccin de las regiones
que flanquean a la sonda, el cual cubri una regin
de >100 kb. Mediante el anlisis del DNA de una
serie de pacientes, en esta regin se identificaron
deleciones extensas en ambas direcciones; la ms
contundente est totalmente dentro de la regin
porque delinea un segmento importante para la
funcin del gen e indica que ste, o cuando menos
parte de l, yace en dicha regin.
Una vez en la regin del gen, se deben identifi-
car los exones y los intrones. Mediante un anlisis de
hibridacin inespecfica se identificaron fragmentos
que presentan hibridacin cruzada con el cromoso-
ma X del ratn y con otras molculas de DNA de
mamfero. Como se resume en la FIGURA 4.10, stos
se examinaron detalladamente para detectar mar-
cos de lectura abiertos y las secuencias tpicas de las
uniones exn-intrn. Los fragmentos que cumplan
con estos criterios se utilizaron como sondas para
identificar secuencias homlogas en una biblioteca
de DNAc preparada a partir de RNAm muscular.
El DNAc correspondiente al gen identifica a un
RNAm inusualmente largo, de aproximadamente
14 kb. La hibridacin revertida hacia el genoma
muestra que el RNAm est representado en >60
exones esparcidos en -2 000 kb de DNA, lo cual
hace del gen de la DMD el ms largo identificado
hasta ahora.
El gen codifica a una protena de -500 kD deno-
minada distrofina, que es uno de los componentes
del msculo, ms bien escaso. Todos los afectados
por la enfermedad presentan deleciones en este lo-
cus y carecen de distrofina (o es deficiente).
El msculo tambin se distingue por tener la
protena ms grande conocida, la titina, formada
por aproximadamente 27 000 aminocidos. El gen
correspondiente contiene el nmero mayor de exo-
nes (178) y el exn ms largo del genoma humano
(17000 bp).
Otra tcnica que permite examinar rpidamen-
te los fragmentos genmicos para detectar los exo-
nes se denomina tcnica de captura de exones.
En la A. 11 se muestra que empieza con un
vector que contiene un promotor fuerte y un solo
intrn localizado entre los dos exones. Cuando este
vector es introducido a las clulas por transfeccin,
la transcripcin del mismo genera grandes cantida-
des de RNA que contiene las secuencias de los dos
exones. Dentro del intrn hay un sitio de restric-
cin-clonacin que se utiliza para insertar fragmen-
tos genmicos de una regin de inters. Si un frag-
mento no tiene exn, no hay cambios en el patrn
de corte y empalme, y el RNA contendr slo las
mismas secuencias que el vector progenitor. No obs-
tante, si el fragmento genmico contiene un exn
flanqueado por dos secuencias intrnicas parciales,
se reconocen los sitios de corte y empalme a uno y
otro lado de este exn y su secuencia es insertada
en el RNA, entre los dos exones del vector. No es
difcil detectar este proceso mediante transcripcin
inversa del RNA citoplsmico a DNAc utilizando la
reaccin en cadena de polimerasa (PCR, polymerase
chain reaction) para amplificar las secuencias loca-
lizadas entre los dos exones del vector. Por ello, la
aparicin de secuencias del fragmento genmico
en la poblacin amplificada indica que un exn ha
sido capturado. Como en las clulas animales los
intrones suelen ser grandes y los exones pequeos,
hay muchas probabilidades de que un fragmento
CAPTULO 4 El contenido del genoma
Para la captura de exones se utiliza un vector especial
El vector contiene dos exones empalmados en el transcrito
Promotor Unin de empalme 5' Unin de empalme 3'
exon
T
.
exn
intrn
Transcripcin y corte I
y empalme para T
eliminar el intrn ........i
Fragmento genmico
intrn intrn exn
Insercin del fragmento
genmico en el intrn
exn l exn l
intrn
Transcripcin y corte y empalme I
para eliminar el intrn T
I
intrn
jexon
Para La captura de exones se utiliza un vector especial de corte y empalme.
Si un exn est presente en el fragmento genmico, su secuencia ser recuperada en el RNA
citoplsmico, pero si el fragmento genmico est formado nicamente por secuencias de dentro
de un intrn, no ocurre el corte y empalme y el RNAm no es exportado al citoplasma.
aleatorio de DNA genmico contenga la estructura
requerida de un exn rodeado de intrones parciales.
De hecho, la captura de exones puede parecerse a
los eventos ocurridos de forma natural durante la
evolucin de los genes (vase la seccin 3.8, Cmo
evolucionaron los genes interrumpidos?)
Q| La conservacin
de la organizacin del genoma
ayuda a identificar genes
Conceptos principales
.
Los algoritmos para identificar genes no son perfectos,
de modo que son necesarias numerosas correcciones al
conjunte inicial de datos.
.
Los seudogenes deben distinguirse de los genes
activos.
.
Hay amplias relaciones sintnicas entre los genomas
del ratn y los del humano, y la mayora de los genes
activos se encuentran en una regin sintnica.
Vna vez ensamblada la secuencia de un genoma,
:
odava se tienen que identificar los genes que con-
tiene. Las secuencias codificadoras representan
una fraccin muy pequea. Los exones pueden
ser identificados como marcos de lectura abiertos e
ininterrumpidos, flanqueados por secuencias apro-
piadas. Cules son los criterios para identificar un
gen activo en una serie de exones?
En la se muestra que un gen acti-
vo debe estar formado por una serie de exones en
la cual el primero de ellos sigue inmediatamente a
un promotor; los exones internos son flanqueados
por uniones apropiadas de corte y empalme, y el
ltimo va seguido de seales de procesamiento 3';
uniendo a los exones puede deducirse un solo mar-
co de lectura abierto que empieza con un codn de
iniciacin y termina con uno de terminacin. Los
exones internos pueden identificarse como marcos
de lectura abiertos flanqueados por uniones de corte
y empalme. En los casos ms sencillos, el primero y
el ltimo exn inician y terminan la regin codifi-
cadora, respectivamente (as como las regiones no
traducidas 5' y 3'). En casos ms complejos,
dichos
exones pueden tener slo regiones no traducidas y,
por lo tanto, ser ms difciles de identificar.
Los algoritmos utilizados para conectar los exo-
nes no son realmente efectivos cuando el genoma es
4.
8 La conservacin de la organizacin del genoma ayuda a identificar genes
Los exones son identificados por secuencias flanqueantes y marcos de lectura abiertos
Secuencia
promotora
Unin de
empalme
GT
Primer exn
UTR 5' + ORF
Unin de Unin de
empalme empalme
AG GT
Exones internos
Unin de Seales
empalme procesadoras
AG 3'
ltimo exn
+ UTR 3
'
Los exones forman un marco de lectura abierto continuo
4.12 Los exones de los genes codificadores de protenas son identificados como se-
cuencias codificadoras flanqueadas por seales apropiadas (con regiones no traducidas en ambos
extremos). La serie de exones debe generar un marco de lectura abierto con codones adecuados
de inicio y final. ORF, marco de lectura abierto; UTR, regiones no traducidas; GT y AG se refieren
a las bases nitrogenadas de las secuencias.
muy grande y los exones estn muy separados. Por
ejemplo, en el anlisis inicial del genoma humano
se mapearon 170 000 exones en 32 000 genes. No
es difcil que estas cifras sean incorrectas porque
resultan en un promedio de 5.3 exones por gen,
mientras que la media de los genes caracterizados
completamente es de 10.2, de modo que, o se han
omitido muchos exones o deben conectarse de for-
ma diferente en un nmero ms pequeo de genes
en toda la secuencia genmica.
Aun cuando la organizacin de un gen sea iden-
tificada correctamente, surge el problema de distin-
guir entre genes activos y seudogenes. Muchos de
estos ltimos se reconocen por defectos obvios que
dan lugar a mutaciones mltiples que resultan en
una secuencia codificadora inactiva. Los seudogenes
que han surgido ms recientemente no acumulan
tantas mutaciones, de modo que pueden ser ms
difciles de reconocer. En un ejemplo extremo, el
ratn tiene slo un gen Gapdh activo (que codifica
a la deshidrogenasa de gliceraldehdo fosfato), pero
-
400 seudogenes. De stos, en un principio pare-
ci que aproximadamente 100 estaban activos en
la secuencia del genoma del ratn y fue necesario
examinarlos uno por uno para excluirlos de la lista
de genes activos.
La certeza de que un gen est activo se puede
incrementar comparando regiones de los genomas
de especies diferentes. Ha habido una reorganiza-
cin general muy amplia de las secuencias entre los
genomas de ratn y de humano, como se observa
en el simple hecho de que el genoma haploide del
humano tiene 23 cromosomas y el del ratn, 20. No
obstante, localmente, el orden de los genes suele ser
el mismo: cuando se comparan pares de homlogos
de humano y de ratn, los genes localizados a am-
bos lados tambin tienden a ser homlogos. A esta
relacin se le denomina sintenia.
En la f IGURi se muestra la relacin entre el
cromosoma 1 del ratn y el conjunto cromosmico
humano; se observa que 21 segmentos de este cro-
mosoma de ratn tienen contrapartes sintnicas en
los cromosomas humanos. La extensin de la reor-
ganizacin ocurrida entre los genomas se demues-
tra porque los segmentos estn esparcidos en seis
cromosomas humanos diferentes. El mismo tipo de
relacin se ha detectado en todos los cromosomas
del ratn, excepto en el X, sintnico slo con el cro-
mosoma humano X, lo cual se explica por el hecho
de que el cromosoma X constituye un caso especial,
sujeto a compensacin de dosis para ajustar las di-
ferencias entre machos (una copia) y hembras (dos
copias) (vase la seccin 31.5, Los cromosomas X
experimentan cambios globales). Esto puede ejercer
presin selectiva contra la translocacin de genes
desde y hacia el cromosoma X.
La comparacin de las secuencias de los genomas
del ratn y del humano revela que >90% de cada
genoma se encuentra en bloques sintnicos cuyo ta-
mao vara (de 300 kb a 65 iMb). Hay un total de 342
segmentos sintnicos, con una longitud promedio de
7 Mb (0.3% del genoma). El 99% por ciento de los
genes del ratn tiene un homlogo en el genoma
humano; para el 96% de dichos genes, ese homlo-
go se encuentra en una regin sintnica.
La comparacin de los genomas proporciona
informacin interesante con respecto de la evo-
lucin de las especies. El nmero de familias de
66 CAPTULO 4 El contenido del genoma
La longitud de los bloques sintnicos es variable
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Mb
Cromosoma 1 del ratn
II !!!
1 2 14 5 2 6 8
Cromosomas humanos correspondientes
FIGURA 4.13 El cromosoma 1 del ratn tiene 21
segmentos de 1 a 25 Mb que son sintnicos con
regiones que corresponden a partes de seis cromo-
somas humanos.
=:enes
de los genomas del ratn y del humano es
el mismo, y una diferencia importante entre las
especies es la expansin diferencial de familias es-
pecficas en uno de los genomas, lo cual es par-
cularmente notable en los genes que afectan a
caractersticas fenotpicas nicas de las especies. En
el ratn, de las 25 familias en las cuales se ha ob-
servado aumento de tamao, 14 contienen genes
especficamente implicados en la reproduccin de
fs roedores y cinco, genes especficos del sistema
.nmunolgico.
Una validacin de la importancia de los bloques
sintnicos proviene de comparaciones de pares de
los genes contenidos en ellos. Al buscar seudogenes
;
imilares sobre la base de comparaciones de secuen-
:
ias, para un gen que no est en una localizacin
sintnica (esto es, su contexto es diferente en las
Jos especies) hay el doble de probabilidades de que
ea un seudogn. En otras palabras, la transloca-
cin lejos del locus original tiende a asociarse con la
creacin de seudogenes, por lo tanto, la falta de un
gen relacionado en una posicin sintnica despierta
sospechas de que un supuesto gen puede realmen-
te ser un seudogn. En total, >10% de los genes
-ientificados inicialmente en el anlisis del genoma
probablemente resulten seudogenes.
Como regla general, las comparaciones entre
genomas incrementan significativamente la certe-
za del pronstico gnico. Cuando se conservan ca-
ractersticas de la secuencia que conducen a genes
ctivos, por ejemplo, entre el hombre y el ratn, se
incrementan las probabilidades de que identifiquen
I homlogos activos.
La identificacin de genes que codifican RNA
es ms complicada porque no es posible utilizar el
criterio del marco de lectura abierto. Tambin es
erdad que con el anlisis comparativo del genoma
se increment el rigor del anlisis. Por ejemplo, al
snalizar el genoma del humano o del ratn se iden-
rifican -500 genes que codifican RNAt, pero la com-
paracin de caractersticas sugiere que <350 de estos
enes estn realmente activos en cada genoma.
PTM Los organeLos contienen DNA
Conceptos principales
.
Las mitocondrias y los cloroplastos tienen genomas
que muestran herencia no mendeliana. Tpicamente son
heredados de la madre.
.
Los genomas de los organelos pueden ser sometidos a
segregacin somtica en las plantas.
.
Las comparaciones del DNA mitocondrial sugieren que
los humanos descienden de una sola hembra, la cual
vivi hace 200 000 aos en frica.
La primera evidencia de genes fuera del ncleo
provino de la herencia no mendeliana detectada en
plantas (en los primeros aos del siglo xx, despus
del redescubrimiento de la herencia mendeliana).
En ocasiones, dicha herencia est relacionada con
el fenmeno de la segregacin somtica, en ambos
casos la causa es similar:
. La herencia no mendeliana se define como
la incapacidad de la progenie de un aparea-
miento de mostrar la segregacin mendelia-
na de los caracteres de los progenitores. Esta
limitante refleja que falta la asociacin entre
el carcter segregante y el huso meitico.
La segregacin somtica describe un fen-
meno en el cual los caracteres de los proge-
nitores se segregan en las clulas somticas,
de modo que exhiben la heterogeneidad del
organismo. sta es una caracterstica nota-
ble del desarrollo de las plantas porque re-
fleja la falta de asociacin entre el carcter
segregante y el huso mittico.
Por lo tanto, se considera que la herencia no mende-
liana y la segregacin somtica indican la presencia de
genes que residen fuera del ncleo y que no recurren a la
segregacin en el huso mittico y el meitico para distri-
buir rplicas a los gametos o a las clulas hijas, respectiva-
mente. En la JRA 4.1 se muestra que esto sucede
cuando las mitocondrias heredadas de los progeni-
tores macho y hembra tienen alelos diferentes, y
por casualidad, una clula hija recibe una distribu-
cin desequilibrada de mitocondrias que representa
slo a un progenitor (vase la seccin 17.12, Cmo
se replican y segregan las mitocondrias?).
La forma extrema de la herencia no mende-
liana es la herencia uniparental, cuando se here-
da el genotipo de slo uno de los progenitores y
el del otro progenitor se pierde permanentemente.
En ejemplos menos extremos, la progenie de un
genotipo progenitor excede a la del otro genotipo;
por lo general, es el genotipo de la madre el que se
hereda preferentemente (o nicamente). Este efec-
to se define en ocasiones como herencia materna.
4.y Los organelos contienen DNA
jl tbMliliMjM
La clula tiene mitooondrias de ambos progenitores
Mitocondria
..ao
'
55*
paterna 0
'
Mitocondria
materna
Ncleo
Posibles resultados de la segregacin estocstica
Las clulas suelen tener ambos tipos de mitocondrias
l
>
5
:
V
La distribucin asimtrica proporciona clulas de un slo tipo
7
Cuando los aLelos mitocondriales paternos y
maternos difieren, una clula tiene dos conjuntos de DNA mi-
tocondrial. La mitosis suele generar clulas hijas con ambos
conjuntos. La variacin somtica resulta de una segregacin
desigual que genera clulas hijas con slo un conjunto.
El punto importante es que predomina el genotipo
proporcionado por el progenitor de determinado
gnero, como se observa en los ndices de segrega-
cin anormales cuando se realiza una cruza entre un
murante y un tipo silvestre, lo cual contrasta con el
comportamiento de la gentica mendeliana, que se
presenta cuando cruzas recprocas muestran que las
contribuciones de ambos padres son heredadas de
forma equivalente.
El sesgo en los genomas progenitores se esta-
blece al formarse un cigoto, o poco despus, por
varias causas posibles. La aportacin de informacin
paterna o materna a los organelos del cigoto puede
ser desigual; en el caso ms extremo, slo contribu-
ye un progenitor. En otros casos, las aportaciones
son equivalentes, pero la informacin provista por
un progenitor no sobrevive. Es posible que se com-
binen ambos efectos, pero independientemente de
la causa, la representacin desigual de la informa-
cin proveniente de los progenitores contrasta con
la informacin gentica nuclear, que se deriva de
manera equivalente de uno y otro progenitor.
La herencia no mendeliana resulta de la pre-
sencia de genomas de DNA en mitocondrias y clo-
roplastos, heredados independientemente de los ge-
nes nucleares. En efecto, el genoma de los organelos
es un fragmento de DNA fsicamente secuestrado ea
una parte definida de la clula y sujeto a su propia
forma de expresin y regulacin. Un genoma de or-
ganelo puede codificar algunas o todas las molculas
de RNA, pero slo algunas de las protenas necesa-
rias para perpetuar al organelo. Las otras protenas
son codificadas en el ncleo, expresadas a travs del
mecanismo citoplsmico de sntesis de protenas e
importadas al interior del organelo.
Los genes que no residen dentro del ncleo
generalmente se describen como genes extranu-
cleares que se transcriben y traducen en el mismo
compartimiento del organelo (mitocondria o clo-
roplasto) en el cual residen. Por el contrario, los
genes nucleares son expresados a travs de la snte-
sis citoplsmica de protenas. (El trmino herencia
citoplsmica suele utilizarse para describir el com-
portamiento de los genes en los organelos, pero esta
descripcin no debe utilizarse porque es importante
poder distinguir entre lo que sucede en el citosol ge-
neral y lo que acontece en organelos especficos.)
Los animales superiores muestran herencia ma-
terna, que se explica si las mitocondrias provienen
todas del vulo y en absoluto del esperma. En la
4.15 se muestra que el esperma contribuye
slo con una copia de DNA nuclear, de modo que
los genes mitocondriales son derivados exclusiva-
mente de la madre, y en los machos, son desechados
en cada generacin.
Las condiciones del organelo son diferentes de
las observadas en el ncleo, y por lo tanto, el DNA
de los organelos evoluciona a su propia velocidad. Si
la herencia es uniparental, puede no haber recom-
binacin entre los genomas progenitores. De hecho,
la recombinacin suele no presentarse cuando los
genomas de los organelos son heredados de ambos
progenitores. El DNA de los organelos tiene un sis-
tema de replicacin diferente al del ncleo, por lo
que la tasa de error durante la replicacin puede
ser diferente. El DNA mitocondrial acumula muta-
ciones ms rpidamente que el DNA nuclear en los
mamferos, sin embargo, en las plantas, la acumula-
cin en la mitocondria es ms lenta que en el ncleo
(en el cloroplasto la velocidad es intermedia).
Una consecuencia de la herencia materna es
que la secuencia del DNA mitocondrial es ms sen-
sible a reducciones en el tamao de la poblacin de
reproduccin que la del DNA nuclear. La compara-
cin de las secuencias de DNA mitocondrial en un
rango de poblaciones humanas permite construir
un rbol evolutivo. La divergencia entre las molcu-
las de DNA mitocondrial humano cubre el 0.57%.
Es posible elaborar un rbol en el cual las variantes
mitocondriales se derivaron de un ancestro (africa-
no) comn. La tasa a la cual el DNA mitocondrial
CAPTULO 4 El contenido del genoma
mi animal es heredado de la madre
Ncleo
del
ovocito
Mitocondnas
Espermatozoide
Pronucleo
masculino
: . EL DNA deL esperma entra aL ovocito para formar
eL proncleo mascuLino en eL vuLo fertiLizado, sin embargo,
todas Las mitocondrias son proporcionadas por eL ovocito.
de los mamferos acumula mutaciones es de 2 a 4%
por cada milln de aos, es decir, >10 veces ms
rpida que la tasa de la globina. Dicha tasa generar
la divergencia observada en un periodo evolutivo de
140 000 a 280 000 aos, lo cual implica que la raza
humana desciende de una sola hembra que vivi en
frica hace -200 000 aos.
Los gercomas de Los organeLos
son moUkuLas circuiares
de DNA que codifican
protenas de Los organeLos
Conceptos principales
Los genomas de Los organeLos suelen ser molculas
circulares de DNA (pero no siempre).
Los genomas de Los organeLos codifican algunas de las
protenas que se encuentran en el organelo, pero no a
todas.
La mayora de los genomas de los organelos asumen
la forma de una sola molcula circular de DNA de
secuencia nica (llamada DNAmt en la mitocon-
dria y DNAct en el cloroplasto). Hay pocas excep-
ciones en las que el DNA de la mitocondria es una
molcula lineal; estas estructuras generalmente se
presentan en las eucariotas inferiores.
En general, en un organelo hay numerosas
copias del genoma, y en cada clula hay mltiples
organelos, de modo que son numerosos los geno-
mas de organelos por clula. Aunque el genoma
de los organelos es nico, constituye una secuencia
repetitiva respecto de cualquier secuencia nuclear
no repetitiva.
Los genomas de los cloroplastos son relativa-
mente grandes, casi siempre -140 kb en las plantas
superiores y <200 kb en las eucariotas inferiores, di-
mensiones comparables con las de un bacterifago
grande, el T4, por ejemplo, mide -165 kb. Son varias
las copias del genoma por organelo, tpicamente de
20 a 40 en una planta superior, y mltiples copias del
organelo en cada clula, por lo general, de 20 a 40.
El tamao total de los genomas mitocondriales
vara en ms de un orden de magnitud. As, los ge-
nomas mitocondriales de las clulas animales son
pequeos, aproximadamente de 16.5 kb en los ma-
mferos. Hay muchos cientos de mitocondrias por
clula, y cada mitocondria tiene mltiples copias de
DNA. La cantidad total de DNA mitocondrial res-
pecto del DNA del ncleo es pequea, se estima
en <1%.
Por el contrario, en las levaduras, el genoma
mitocondrial es mucho ms grande, por ejemplo,
en Saccharomyces cerevisiae el tamao exacto vara
de una cepa a otra, pero en promedio es de -80 kb.
Hay -22 mitocondrias por clula, que corresponden
a -4 genomas por organelo. En clulas de cultivo,
la proporcin de DNA mitocondrial puede llegar al
18 por ciento.
En las plantas, el rango de dimensiones del
DNA mitocondrial es extremadamente amplio, con
un mnimo de -100 kb. Las dimensiones del ge-
noma hacen difcil aislarlo intacto, pero el mapeo
de restriccin de muchas plantas sugiere que el
genoma mitocondrial suele ser una secuencia in-
dividual organizada en un crculo, dentro del cual
hay secuencias homologas cortas. La recombinacin
entre estos elementos genera molculas circulares
subgenmicas ms pequeas que coexisten con el
genoma
"
maestro
"
completo, buen ejemplo de la
complejidad aparente de las molculas de DNA mi-
tocondrial de las plantas.
Ahora que se cuenta con la secuencia de los
genomas mitocondriales de numerosos organismos,
es posible observar algunos patrones generales en la
representacin de las funciones del DNA mitocon-
drial. En la FIGURA .16 se resume la distribucin de
los genes de ese tipo de genomas. El nmero total
de genes codificadores de protenas es bastante pe-
queo y no se correlaciona con el tamao del geno-
4.10. Los genomas de los organeLos son molculas circulares de DNA que codifican protenas de Los organelos
Las mitocondrias codifican a molcula
de RNA y protenas
Todo el DNAmt humano se expresa
Especie
Tamao
(en kb)
Genes Genes
codificadores codificadores
de protenas de RNA
Hongos
19-100 8-14 10-28
Protistas 6-100 3-62 2-29
Plantas 186-366 27-34 21-30
Animales 16-17 13 4-24
4.
16 Los genomas mitocondriales tiene genes (prin-
cipalmente de [os complejos I-IV) que codifican protenas,
molculas de RNAry molculas de RNAt.
ma. Las mitocondrias de los mamferos utilizan sus
genomas de 16 kb para codificar a 13 protenas, en
tanto que las mitocondrias de las levaduras utilizan
los de 60 a 80 kb para codificar a slo ocho prote-
nas. Las plantas, cuyos genomas mitocondriales son
mucho ms grandes, codifican a ms protenas. En
la mayora de los genomas mitocondriales se en-
cuentran intrones, aunque no en los genomas muy
pequeos de mamfero.
Los dos RNAr principales siempre son codifi-
cados por el genoma mitocondrial. El nmero de
molculas de RNAt codificado por el genoma mi-
tocondrial flucta entre ninguno y todo el comple-
mento (25 a 26 en las mitocondrias), lo cual justifica
la variacin en la Figura 4.16.
La parte principal de la actividad codificadora
de protenas est dedicada a los componentes de
los ensambles de mltiples subunidades de los com-
plejos de respiracin I-IV. Muchas protenas ribo-
smicas son codificadas en los genomas protistas
y mitocondriales de las plantas, sin embargo, muy
pocas o ninguna se codifican en los genomas de
hongos y animales. En muchos genomas mitocon-
driales protistas hay genes que codifican protenas
y que estn implicados en la importacin.
La organizacin del. DNA
mitocondrial. es variable
Conceptos principales
.
El DNA mitocondrial de las clulas animales es
extremadamente compacto y suele codificar a 13
protenas, dos molculas de RNAr y 22 de RNAt.
.
El DNA mitocondrial de las levaduras es cinco veces
ms largo que el DNAmt de las clulas animales por la
presencia de intrones largos.
El DNA mitocondrial de los animales es extrema-
damente compacto. En diferentes filos animales se
observan diferencias notables en la organizacin g-
nica detallada, pero se conserva el principio general
de un genoma pequeo que codifica a un nmero
Citb
ND6
O
.
RNAr12S
RNAr16S \
16.6 kb
< ND4L
ND3
N
'
C03 V
v
ATPasa 6 z -
ATPasaS
C02
COI
I Genes de RNAt
Regiones codificadoras
Indica la direccin del gen,
de 5' a 3'
CO: citocromo oxidasa
ND: NADH deshidrogenase
El DNA mitocondrial humano tiene 22 genes de
RNAt y 13 regiones codificadoras de protenas. Catorce de las
15 regiones codificadoras de protenas o codificadoras de RNA
se transcriben en la misma direccin. Catorce de los genes de
RNAt se expresan en la direccin de las manecillas del reloj y
ocho en direccin contraria.
restringido de funciones. En los genomas mitocon-
driales de los mamferos, la organizacin es extre-
madamente compacta, no hay intrones, de hecho,
algunos genes se superponen, y casi cada par de ba-
ses puede ser asignado a un gen. Con excepcin del
lazo D, regin implicada en el inicio de la replicacin
del DNA, no puede considerarse que ms de 87 de
los 16 569 bp del genoma mitocondrial humano se
encuentren en regiones intercistrnicas.
Las secuencias de nucletidos completas de
los genomas mitocondriales de las clulas anima-
les muestran una homologa extensa en cuanto a
organizacin. El mapa del genoma mitocondrial
humano se resume en la FIGURA 4.17. Hay 13 regio-
nes codificadoras de protenas; todas stas forman
parte del mecanismo implicado en la respiracin,
entre otras, el citocromo b, las tres subunidades de
la citocromo oxidasa, una de las subunidades de la
ATPasa y siete unidades (o protenas asociadas) de
la NADH deshidrogenasa.
La discrepancia en el tamao de los genomas
mitocondriales de S. cerevisiae (84 kb), cinco veces
ms grandes que los de los mamferos (16 kb), alerta
ante el hecho de que debe haber una gran diferencia
en su organizacin gentica, a pesar de su funcin
comn. El nmero de productos relacionados con
las funciones enzimticas mitocondriales y sinte-
tizados de forma endgena parece ser similar. El
CAPTULO 4 EL contenido del genoma
DNAmt de las levaduras tiene los mism
hombre
RNAr 21S
ATPasa
84 kb
RNAr15S
ox/3
C03
ATPasa 6
ATPasa 8
iExones
COI
. Intrones
Productos
oli
aap
oxi
= subunidades de ATPasa sensible a la
oligomicina
= subunidades del citocromo c
box = citocromo b
par = funciones desconocidas
var = subunidad protenica ribosmica pequea
loroplastos tienen >100 genes
El genoma mitocondrial de S. cerevisiae contiene
genes codificadores de protenas, genes de RNAr y genes de
NAt interrumpidos y continuos (no se indican las posiciones).
-as flechas indican la direccin de la transcripcin.
znaterial gentico adicional de las levaduras mito-
condriales representa a otras protenas, quiz rela-
cionadas con la regulacin, o no se expresa?
El mapa de la FIGURA 4.18 representa al RNA
Principal y los productos protenicos de la mitocon-
diia de la levadura, en el cual la caracterstica ms
notable es la dispersin de los loci.
Los dos ms prominentes son los genes inte-
rrum
pidos box (que codifican al citocromo b) y oxi3
ique codifica a la subunidad 1 de la citocromo oxi-
asa), que juntos son casi tan largos como el geno-
ma mitocondrial entero de los mamferos! Muchos
p
e los intrones largos de estos genes tienen marcos de
lectura abiertos en registro con el exn precedente
vase la seccin 27.5
, Algunos intrones del grupo
I codifican endonucleasas que promueven la movi-
-:
aad), fenmeno que agrega numerosas protenas,
::
das sintetizadas en cantidades bajas, al comple-
mento de la mitocondria de la levadura.
Los genes restantes son ininterrumpidos y co-
ccesponden a otras dos subunidades de la citocro-
m
o oxidasa codificadas por la mitocondria, a la(s)
5ubunidad(es) de la ATPasa y (en el caso del gen
mrl) a una protena ribosmica mitocondrial. Es
coco probable que el nmero total de genes mito-
::ndriales de las levaduras exceda de -25.
Genes
Tipos
Codificadores de RNA
RNAr16S 1
RNAr 23S 1
RNAr 4.5S 1
RNAr 5S 1
RNAt 30-32
Expresin gnica
Protenas r 20-21
RNA polimerasa
3
Otras 2
Funciones del cioropiasto
Rubisco y tilacoides
31-32
NADH deshidrogenasa
11
Total 105-113
FIGURA 4.19 El genoma de los cloroplastos de las plantas
terrestres codifica a cuatro molculas de RNAr, 30 molculas
de RNAt y -60 protenas.
EL genoma de Los cLorcpLastos
codifica a numerosas protenas
y moLcuLas de RNA
Concepto principal
Los genomas de los cloroplastos varan en cuanto a
tamao, pero son lo suficientemente grandes como
para codificar de 50 a 100 protenas, as como a los
RNAr y los RNAt.
Qu genes portan los cloroplastos? Las molculas
de DNA de los cloroplastos varan en longitud de
120 a 190 kb. Los genomas secuenciados de cloro-
plastos (>10 en total) tienen de 87 a 183 genes. En
la FIGURA 4.19 se resumen las funciones codificadas
por el genoma de los cloroplastos de las plantas te-
rrestres. Hay ms variaciones en los genomas de los
cloroplastos de las algas.
En general, la situacin es similar a la de las mi-
tocondrias, excepto que hay ms genes implicados.
El genoma del cioropiasto codifica a todas las espe-
cies de RNAr y de RNAt necesarias para la sntesis
de protenas. El ribosoma incluye dos molculas de
RNAr pequeas, adems de las especies principales.
El conjunto de RNAt puede incluir todos los genes
necesarios. El genoma de los cloroplastos codifica
a -50 protenas, incluidas la RNA polimerasa y las
protenas ribosmicas. Tambin en este caso, la re-
gla es que los genes de los organelos son transcritos
y traducidos por el mecanismo del organelo.
Cerca de la mitad de los genes de los cloroplas-
tos codifican a protenas implicadas en la sntesis de
protenas. El origen endosimbitico de los cloroplas-
tos resalta por las relaciones entre estos genes y sus
4
.12 El genoma de los cloroplastos codifica a numerosas protenas y molculas de RNA
contrapartes en las bacterias. La organizacin de los
genes de RNAr en particular est ntimamente rela-
cionada con la de una cianobacteria, la cual define con
mayor precisin al ltimo ancestro comn de clo-
roplastos y bacterias.
Intrones y cloroplastos caben en dos clases ge-
nerales; los que se encuentran en los genes de RNAt
suelen estar en el lazo anticodn (aunque no ine-
vitablemente), como los intrones localizados en los
genes de RNAt nucleares de las levaduras (vase la
seccin 26.14, El corte y empalme del RNAt de las
levaduras implica procedimientos de corte y empal-
me). Los intrones localizados en los genes codifica-
dores de protenas se asemejan a los de los genes
mitocondriales (vase Cap. 27, El RNA cataltico),
por lo que el evento endosimbitico se ubica en un
periodo de la evolucin anterior a la separacin de
las procariotas con genes ininterrumpidos.
La funcin de los cloroplastos es la fotosntesis.
Muchos de sus genes codifican a protenas de los com-
plejos localizados en las membranas de los tilacoides,
cuya constitucin muestra un balance diferente del
de los complejos mitocondriales. Si bien algunos de
estos complejos son similares a los mitocondriales de-
bido a que algunas subunidades son codificadas por el
genoma de los organelos y otras por el nuclear, otros
complejos de cloroplastos son codificados completa-
mente por un genoma.
BgJ Las mitocondrias
evoLucionaron
por endosimbiosis
Cmo evolucion una situacin en la cual un or-
ganelo contiene informacin gentica para algunas
de sus funciones, mientras que otras son codificadas
en el ncleo? En la FIGURA 4.20 se ilustra el modelo
de la endosimbiosis de la evolucin de las mitocon-
drias, durante la cual, clulas primitivas capturaron
a bacterias que proporcionaron las funciones y las
estructuras que evolucionaron hacia mitocondrias
y cloroplastos. En ese momento, el proto-organelo
debe haber contenido todos los genes necesarios
para especificar sus funciones.
Las homologas secuenciales sugieren que mi-
tocondrias y cloroplastos evolucionaron separada-
mente a partir de linajes comunes a las eubacterias,
pero las mitocondrias comparten su origen con las
bacterias prpura a y los cloroplastos, con las cia-
nobacterias. Entre las bacterias, el pariente de las
mitocondrias ms cercano que se conoce es Rkkettsia
(agente causal de tifus), parsito intracelular obli-
gado que probablemente desciende de bacterias de
vida libre, hiptesis que refuerza la idea de que las
mitocondrias se originaron en un evento endosim-
La endosimbiosis resulta de la captura de la clula
Bacteria
Clula primitiva
Endosimbiosis
O
V
La bacteria evoluciona y se transforma
en una mitocondria, de modo que pierde
genes necesarios para la vida independiente
Los genes son
transferidos de la /A/A/.
mitocondria al nucieo
V
GURA 4.20 Las mitocondrias se originaron por un evento
endosimbitico en el cual una bacteria fue capturada por una
clula eucaritica.
bitico en que tambin estuvo involucrado un an-
cestro comn.
Deben haber ocurrido dos cambios, conforme
las bacterias se integraron en la clula recipiente y
evolucionaron hacia mitocondrias (o cloroplastos).
Los organelos tienen mucho menos genes que una
bacteria independiente y han perdido muchas de las
funciones gnicas necesarias para la vida indepen-
diente (como las rutas metablicas). La mayora de
los genes que codifican funciones de los organelos
se localizan de hecho en el ncleo, por lo tanto,
estos genes deben haber sido transferidos ah desde
el organelo.
La transferencia de DNA entre organelo y n-
cleo ha ocurrido a lo largo de la evolucin, y an
contina. La velocidad de transferencia puede me-
dirse directamente al introducir en un organelo un
gen que slo puede funcionar en el ncleo, porque,
por ejemplo, contiene un intrn nuclear o la pro-
tena debe funcionar en el citosol. Respecto de la
provisin del material necesario para la evolucin,
la velocidad de transferencia del organelo al ncleo
equivale aproximadamente a la de una mutacin g-
nica nica. El DNA introducido en las mitocondrias
CAPTULO 4 El contenido del genoma
es transferido al ncleo a una tasa de 2 x lO
-
5
por
generacin. Los experimentos para medir la transfe-
rencia en direccin opuesta, del ncleo a la mitocon-
tia, sugieren que la tasa es mucho ms baja, lO-'0.
Cuando se introduce un gen nuclear especfico de
resistencia a antibiticos en un cloroplasto, la trans-
fetencia al ncleo y el xito de la expresin suelen
.
igilarse mediante el anlisis de plntulas, de modo
Je evaluar la resistencia al antibitico; este proceso
muestra que la transferencia ocurre a una velocidad
fe 1 en 16 000 plntulas, o 6 x lO"5.
Obviamente, la transferencia de un gen de un
Tganelo al ncleo requiere de movimiento fsico
del DNA, pero la expresin exitosa tambin implica
cambios en la secuencia codificadora. Las protenas
de organelos codificadas por genes nucleares tienen
cuencias especiales que les permiten ser importa-
das al interior del organelo despus de haber sido
sintetizadas en el citoplasma (vase la seccin 10.16,
Is insercin postransduccional de la membrana de-
pende de secuencias lder). Estas secuencias no son
aecesarias para las protenas sintetizadas dentro del
organelo. Quiz el proceso de transferencia efec-
::
va de genes tuvo lugar en un periodo en el cual
. s compartimientos se definan de forma menos
feida, de modo que era ms fcil que se reubicara
el DNA y que las protenas se incorporaran en el
organelo, independientemente del sitio en que se
sintetizaran.
Los mapas filogenticos muestran que las trans-
ferencias de genes han sido independientes en mu-
chos linajes diferentes. Parece que las transferencias
de genes mitocondriales al ncleo ocurrieron slo
al principio de la evolucin de las clulas animales,
I ero es posible que el proceso todava contine en
Las clulas de las plantas. El nmero de transferen-
::
as puede ser alto; en el organismo Arabidopsis hay
>300 genes nucleares cuyas secuencias estn relacio-
-
adas con las de genes ubicados en los cloroplastos
le otras plantas, los cuales podran haber evolucio-
.ado a partir de genes originados en el cloroplasto.
Resumen
has secuencias de DNA que componen a un genoma
eucaritico pueden ser clasificadas en tres grupos:
.
secuencias no repetitivas nicas;
.
secuencias moderadamente repetitivas que
se dispersan y repiten pocas veces respecto
de copias no idnticas;
.
secuencias muy repetitivas, que son cortas y
suelen repetirse en forma de secuencias en
tndem.
Las proporciones de los tipos de secuencias son
:-r:-actersticas de cada genoma, aunque ms exten-
sos tienden a tener una proporcin menor de DNA
no repetitivo. Aproximadamente el 50% del geno-
ma humano consta de secuencias repetitivas, y la
vasta mayora corresponde a secuencias de transpo-
sones. La mayora de los genes estructurales se lo-
caliza en el DNA no repetitivo. La cantidad de DNA
no repetitivo refleja mucho mejor la complejidad
del organismo que el tamao total del genoma; la
mayor cantidad de DNA no repetitivo en los geno-
mas es ~2 x 109 bp.
La herencia no mendeliana se explica por la
presencia de DNA en organelos del citoplasma. Las
mitocondrias y los cloroplastos son sistemas delimi-
tados por membranas en los cuales algunas prote-
nas son sintetizadas en el organelo, mientras que
otras son importadas. En general, el genoma de los
organelos es una molcula circular de DNA que co-
difica a todas las molculas de RNA y a algunas de
las protenas requeridas por el organelo.
Los genomas mitocondriales varan enorme-
mente de tamao, de 16 kb en el genoma mini-
malista de los mamferos, a 570 kb en el de plan-
tas superiores. Los genomas ms grandes pueden
codificar funciones adicionales. Los genomas de
los cloroplastos fluctan entre 120 y 200 kb; en los
secuenciados, la organizacin y las funciones codi-
ficadoras son similares. En las mitocondrias y los
cloroplastos, muchas de las protenas principales
contienen algunas subunidades sintetizadas en el
organelo y otras importadas del citosol.
En las levaduras, las reestructuraciones son
muy frecuentes en el DNA mitocondrial, y se ha
encontrado recombinacin entre los genomas mi-
tocondriales o los genomas de los cloroplastos. Se
han observado transferencias de DNA entre los ge-
nomas de los cloroplastos o de las mitocondrias y
los genomas nucleares.
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extensa
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Referencias
Secuencias genmicas
y nmeros de genes
ESQUEMA DEL CAPITULO
Introduccin
El nmero de genes bacterianos abarca un rango
de un orden de magnitud
Se conoce el nmero total de genes de numerosas
eucariotas
.
Hay 6 000 genes en una levadura; 18 500 en un gusano;
13 600 en una mosca; 25 000 en la pequea planta
Arabidopsis y, probablemente de 20 000 a 25 000 en el
ratn y el hombre.
Cuntos tipos diferentes de genes hay?
EL genoma humano tiene menos genes de los
esperados
.
Slo 1% del genoma humano est formado por regiones
codificadoras.
.
Los exones forman ~5% de cada gen, por lo tanto, los
genes (exones ms intrones) constituyen ~25% del
genoma.
.
El genoma humano tiene de 20 000 a 25 000 genes.
.
~60% de los genes humanos son sometidos a corte y
empalme alternativo.
Hasta el 80% de los cortes y empalmes alternativos
cambian la secuencia proteinica, de manera que el
proteoma tiene ~50 000 a 50 000 miembros.
Cmo se distribuyen Los genes y otras secuencias
en el genoma?
.
Las secuencias repetidas (presentes en ms de una copia)
representan >50% del genoma humano.
.
La mayor parte de las secuencias repetidas est formada
por copias de transposones no funcionales.
.
Hay numerosas duplicaciones de extensas regiones
cromosmicas.
EL cromosoma Y tiene varios genes especficos de
la masculinidad
.
El cromosoma Y tiene ~60 genes que se expresan
especficamente en los testiculos.
.
Los genes especficos de la masculinidad estn en mltiples
copias de segmentos cromosmicos repetidos.
.
La conversin gnica entre copias mltiples permite el
mantenimiento de los genes activos durante la evolucin.
Las especies ms complejas evolucionan
agregando nuevas funciones gnicas
La comparacin de diferentes genomas muestra un
incremento constante en el nmero de genes conforme
se aaden genes adicionales para formar eucariotas,
organismos multicelulares, animales y vertebrados.
.
La mayora de los genes nicos de los vertebrados estn
relacionados con el sistema nervioso o el inmunolgico.
Cuntos genes son esenciales?
.
No todos los genes son esenciales. En las levaduras y las
moscas, las deledones de <50% de los genes tienen efectos
detectables.
.
Cuando dos o ms genes son redundantes, una mutacin en
cualquiera de ellos puede no tener efectos detectables.
.
No se sabe porqu sobreviven los genes que aparentemente
son prescindibles en el genoma.
Los genes se expresan en niveles muy diferentes
.
En una clula dada, la mayora de los genes se expresa en
niveles bajos.
.
Slo un pequeo nmero de genes, cuyos productos son
especializados para un tipo celular especifico, se expresan
ampliamente.
Cuntos genes se expresan?
.
Los RNAm expresados en niveles bajos se superponen
ampliamente en comparaciones de tipos de clulas.
.
Las molculas de RNAm abundantemente expresadas suelen
ser especficas del tipo de clula.
.
-10 000 genes expresados pueden ser comunes a la
mayora de los tipos celulares de una eucariota superior.
El nmero de genes expresados puede medirse en
masa
.
La tecnologa del chip permite tomar una instantnea de
la expresin del genoma completo de una unidad celular de
levadura.
.
~-75% (~4 500 genes) del genoma de las levaduras se
expresa en condiciones de cultivo normales.
.
La tecnologa del chip permite comparar detalladamente
clulas animales relacionadas para determinar (por
ejemplo) las diferencias de expresin entre una clula
normal y una cancergena.
Resumen
76
El numero mnimo de genes oscila entre 500 y 30 000
500 genes
Bacteria extracelular
(parasitaria)
1500 genes
Bacteria de vida libre
5000 genes
Eucariota unicelular
13 000 genes
Eucariota multicelular
25 000 genes
Plantas superiores
25 000 genes
Mamferos
PEI Introduccin
Desde que en 1995 se secuenciaron los primeros
genomas, la velocidad y el rango de secuenciacin
han mejorado extraordinariamente. Los primeros
genomas secuenciados fueron genomas bacteria-
nos pequeos, de <2 Mb, hada 2002, el genoma
humano de 3 000 Mb haba sido secuenciado. A la
fecha se han secuenciado los genomas de una gran
variedad de organismos,
entre otros, las bacterias,
las arqueobacterias, las levaduras, las eucariotas in-
feriores, las plantas y los animales, incluidos, en este
ltimo caso, gusanos, moscas, roedores y algunos
mamferos.
Quiz la informacin ms importante derivada
de la secuencia de un genoma sea el nmero de
genes. Mycoplasma genitalium, bacteria intracelular
obligada, tiene el genoma ms pequeo conocido de
cualquier organismo, de slo -470 genes; el genoma
de las bacterias de vida libre oscila entre 1 700 y
7 500. Los genomas de las arqueobacterias abarcan
un rango similar; los de las eucariotas unicelulares
empiezan en aproximadamente 5 300 genes, en tan-
to que los de gusanos y moscas tienen unos 18 500
| 13 500 genes, respectivamente; sin embargo, ese
nmero se incrementa slo a -25 000 en el ratn
y el hombre.
En la 'URA se resume el nmero mnimo
ie genes encontrado en seis grupos de organismos.
Para formar una clula se necesitan -500 genes;
~
1 500 para una clula de vida libre; >5 000 para
una clula con ncleo; >10 000 para un organismo
multicelular y >13 000 para un organismo con sis-
tema nervioso
, pero obviamente muchas especies
pueden tener ms del nmero mnimo necesario
ara su tipo, por lo que el nmero de genes vara
enormemente, aun entre especies ntimamente re-
.acionadas.
En las bacterias y las eucariotas inferiores, la
mayora de los genes son nicos, sin embargo, en
los genomas de las eucariotas superiores, los genes
pueden dividirse en familias de miembros relaciona-
dos. No hay duda de que algunos genes son nicos
formalmente la familia tiene un solo miembro),
7 ero muchos pertenecen a familias de diez o ms
miembros. El nmero de familias puede estar mejor
relacionado con la complejidad global del organis-
mo que el nmero de genes.
Parte de la informacin ms reveladora provie-
ne de la comparacin de secuencias de genomas.
I m las secuencias del genoma humano y del geno-
na del chimpanc de que se dispone actualmente,
es posible empezar a abordar algunos de los aspec-
;
s de la interrogante sobre qu hace nicos a los
taunanos.
El nmero mnimo de genes requerido por cualquier
tipo de organismo incrementa con su complejidad. Fotografa
de bacteria extracelular cortesa de Gregory P. Henderson and
Grant J. Jensen, California Institute of Technology. Fotografa
de clula de vida libre cortesa de Karl 0. Stetter, Universitat
Regensburg. Fotografa de eucariota unicelular cortesa de Eishi
Noguchi, Drexel University College of Medicine. Fotografa de
eucariota multicelular cortesa de Carolyn B. Marks and David H.
Hall, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Fotografa
de planta superior cortesa de Keith Weller/USDA. Fotografa de
mamfero Photodsc.
BTl EL nmero de genes
bacterianos abarca un rango
de un orden de magnituc
Los intensos estudios actuales han permitido la se-
cuenciacin de numerosos genomas, entre otros, los
incluidos en la , en la cual se describe el
tamao de algunos de ellos, que va de 0.6 x 106 bp
del micoplasma a 3.3 x 109 bp del genoma humano;
se incluyen numerosos animales experimentales im-
portantes, como las levaduras, la mosca de la fruta y
un gusano nematodo.
5
.2 El nmero de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud
nomas secuenciados
000 genes
Especies
Genomas
(Mb) Genes
Loci
letales
Mycoplasma
genitalium
0.58 470 -
300
Rickettsia
prowazekii
1.11 834
Haemophilus
influenzae
1.83 1 743
Methanococcus
jannaschii
1.66 1 738
B.
subtilis 4.2 4 100
E. coli 4,6 4 288 1 800
S
. cerevisiae 13.5 6 034 1 090
S
. pombe 12.5 4 929
A. thaliana 119 25 498
0
. sativa (arroz)
466
-
30 000
D. melanogaster
165
13 601 3 100
C
. elegans 97 18 424
H. sapiens
3 300 -25 000
i En numerosos organismos se conocen los tamaos
de los genomas y los nmeros de genes a partir de secuencias
completas. Los loci letales se estiman a partir de bases de
datos genticos.
El tamao del genoma bacteriano se relaciona
con el nmero de genes
8 000
.
6 000
O 4 000
Promedio: 950 genes/Mb/<
2 000
1 2 3 4 5 6 7!
Tamao del genoma (Mb)
"
Bacterias parasitarias obligadas
Otras bacterias
Archaea
El nmero de genes de los genomas de las bac
tenas y de las archaea es proporcional al tamao del genoma
Las secuencias de los genomas de las bacterias y
de las arqueobacterias demuestran que virtualmente
todo el DNA (tpicamente del 85 al 90%) codifica a
molculas de RNA o a protenas. En la FIGURA .3 se
observa que el rango de dimensiones de los genomas
es aproximadamente de un orden de magnitud y
que las del genoma son proporcionales al nmero de
genes, que suele tener una longitud aproximada
de 1 000 bp.
Todas las bacterias con genomas de menos de
1
.5 Mb son parsitos intracelulares obligados, es de-
cir, viven en un hospedador eucatico que les pro-
porciona molculas pequeas. Sus genomas corres-
ponden al nmero mnimo de funciones necesarias
para construir una clula. El nmero de todas las
clases de genes es ms reducido respecto de las bac-
terias con genomas ms grandes, pero la reduccin
ms significativa se observa en los loci que codifican
a enzimas relacionadas con funciones metablicas
(que dependen principalmente de la clula hospe-
dadora) y con la regulacin de la expresin gnica.
Mycoplasma genitalium tiene el genoma ms peque-
o, formado por -470 genes.
Las propiedades biolgicas de las archaea estn
entre las de las procariotas y las de las eucariotas, no
obstante, el tamao de su genoma y el nmero de
genes estn en el mismo rango que el de las bacte-
rias. Dichas dimensiones fluctan entre 1.5 y 3 Mb,
que corresponde a 1 500 a 2 700 genes. Methanococ-
cus jannaschii es una especie productora de metano
que vive en condiciones de alta presin y alta tem-
peratura, y el nmero total de genes que contiene es
similar al de Haemophilus influenzae, aunque apenas
unos cuantos pueden ser identificados comparn-
dolos con genes conocidos de otros organismos. Sus
mecanismos de expresin gnica son ms parecidos
a los de las eucariotas que a los de las procariotas,
pero el mecanismo de divisin celular se asemeja
ms al de estas ltimas.
En las archaea y las bacterias de vida libre ms
pequeas se identifica el nmero mnimo de genes
necesarios para formar una clula susceptible de
funcionar de manera independiente en el entorno;
su genoma ms pequeo tiene ~ 1 500 genes. La bac-
teria de vida libre con el genoma ms pequeo co-
nocido es el termfilo Aquifex aeolicus, que mide 1.5
Mb y tiene 1512 genes. Una bacteria gramnegativa
"
tpica", H. influenzae, tiene 1 743 genes, cada uno de
-
900 bp. Por ello, se puede concluir que el nmero
de genes necesarios para formar un organismo de
vida libre es de ~1 500.
Las dimensiones de los genomas bacterianos cu-
bren ms o menos un orden de magnitud, de 0.6 Mb
a <8 Mb, y los ms grandes contienen ms genes.
Las bacterias cuyos genomas son los ms grandes,
Sinorhizobium meliloti y Mesorhizobium loti, son bac-
terias fijadoras de nitrgeno que viven en las races
de las plantas. El tamao de sus genomas (-7 Mb)
y el nmero total de genes (>7 500) son similares a
los de las levaduras.
El tamao del genoma de E. coli es intermedio; la
cepa comn de laboratorio tiene 4288 genes y una
longitud promedio de -950 bp; la separacin pro-
medio entre genes es de 118 bp. No obstante, puede
haber diferencias muy significativas entre cepas: los
CAPTULO 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
extremos conocidos van de 4.6 Mb y 4 249 genes
de la cepa ms pequea, a 5.5 Mb y 5 361 genes de
la ms grande.
Todava se desconocen las funciones de todos
los genes. En la mayora de estos genomas, -60%
de los genes pueden ser identificados con base en la
homologacin con genes conocidos de otras especies,
los cuales se distribuyen ms o menos de manera
equivalente en clases cuyos productos se relacionan
con el metabolismo, la estructura celular y el trans-
porte de componentes, as como con la expresin
gnica y su regulacin, si bien virtualmente a >25%
de los genes es imposible atribuirle una funcin; mu-
chos se encuentran en organismos relacionados, lo
cual implica que se ha conservado la funcin.
Por su importancia mdica, se ha hecho nfasis
en la secuenciacin de los genomas de las bacterias
patgenas, y una perspectiva importante de la natu-
raleza de la patogenia proviene de la demostracin
de que las "islas de patogenicidad" son un rasgo
caracterstico de sus genomas. Dichas
"
islas" son
regiones extensas, de -10 a 200 kb, presentes en
los genomas de especies patgenas, pero no en los
genomas de las variantes no patgenas de la misma
especie o de una especie relacionada. Su conteni-
do de G-C suele diferir del contenido del resto del
genoma, y es probable que estas bases migren en-
tre bacterias merced a un proceso de transferencia
horizontal. Por ejemplo, la bacteria que provoca el
ntrax (Bacillus anthracis) tiene dos plsmidos (DNA
extracromosmico) grandes, uno de los cuales tiene
una isla de patogenicidad que incluye el gen codifi-
;ador de la toxina del ntrax.
En numerosas eucariotas se
conoce el nmero total de genes
El nmero de genes de las eucariotas es muy variable
Concepto principal
Hay 6 000 genes en una levadura; 18 500 en un
gusano; 13 600 en una mosca; 25 000 en la pequea
planta Arabidopsis y, probablemente -25 000 en el
ratn y el hombre.
r
,in pronto como se observan los genomas euca-
iticos, se pierde la relacin entre su tamao y el
.mero de genes. Los genomas de las eucariotas
unicelulares estn en el mismo rango de tamao
4ue los genomas bacterianos ms grandes. Las euca-
riotas superiores tienen ms genes, pero el nmero
ao se correlaciona con el tamao del genoma, como
?uede observarse en la IGURA 5.4.
La informacin ms amplia sobre las eucario-
s inferiores se relaciona con las secuencias de los
pcnomas de las levaduras Saccharomyces cerevisiae y
40 000
30 000
0)
c
& 20 000
10 000
Arroz
.
Arabidopsis
C. elegans
.
D. melanogaster
Ratn .
Humano
S. cerevisiae
S
. pombe
100 200 300 400 500
Tamao del genoma (Mb)
3000
El nmero de genes de una eucariota varia de 6 000 a
40 000, pero no se correlaciona con el tamao del genoma ni con
la complejidad del organismo.
de las levaduras son
5% de los genes de S. cerevisiae tiene en promedio un intrn
200 bp mugg ii&iiSBfl l
t '. \
sn Espacio ntergnico Intrones
1
\ \
Gen
1 426 bp 500 bp
43% de los genes de S. pombe tienen intrones
El gen interrumpido promedio tiene 2 intrones
El genoma de S. cerevisiae, de 13.5 Mb, tiene 6 000 genes,
casi todos interrumpidos. El genoma de 5. pombe, de 12.5 Mb, tiene 5 000,
de los cuales, casi la mitad tiene intrones. Las dimensiones de los genes y
el espaciamiento son bastante similares.
Schizosaccharomyces pombe, cuyas caractersticas ms
importantes se resumen en la . Los geno-
mas de las levaduras de 12.5 Mb y 13.5 Mb tienen
-
5 000 y -6 000 genes, respectivamente. El marco
de lectura abierto (ORE, open reading frame) prome-
dio mide ~ 1.4 kb, de manera que -70% del genoma
lo ocupan regiones codificadoras. La diferencia prin-
cipal entre estas cepas es que slo el 5% de los ge-
nes de S. cerevisiae tiene intrones, respecto del 43%
de los genes de S. pombe. La densidad de genes es
alta, y la organizacin suele ser similar, aunque los
espacios entre los genes son un poco ms cortos en
5
. cerevisiae. Cerca de la mitad de los genes identifi-
cados por secuenciacin ya se conocan o estaban
relacionados con genes conocidos, los dems son
nuevos, indicio del nmero de tipos nuevos que
pueden ser descubiertos.
La identificacin de marcos de lectura extensos
con base en la secuencia es muy precisa, pero los
ORF que codifican a <100 aminocidos no pueden
ser identificados nicamente mediante secuencia-
cin por la elevada incidencia de falsos positivos. El
En numerosas eucariotas se conoce el nmero total de genes
7 y
i
Manipulacin del DNA
H Transcripcin
: 1 Traduccin
Estructura protenica
Ciclo y muerte celular
Citoesqueleto
13 Enzimas
Transduccin de seal
Adhesin celular
Transportadores/
canales
Desconocida
-
20% de Los genes de Drosophila codifican a pro-
tenas implicadas en el mantenimiento o la expresin de los
genes; -20% codifican a enzimas y <10% a protenas relacio-
nadas con el ciclo celular o con la transduccin de seal. La
mitad de los genes de Drosophila codifican a productos cuya
funcin se desconoce.
anlisis de la expresin gnica sugiere que de -300
a 600 de dichos ORF en S. cerevisiae tienden a ser
genes genuinos.
Una forma eficaz de validar la estructura gnica
consiste en comparar secuencias de especies ntima-
mente relacionadas; si un gen est activo, es probable
que se conserve. La comparacin de las secuencias
de cuatro especies de levaduras ntimamente rela-
cionadas sugiere que 503 de los genes originalmente
identificados en S. cerevisiae no tienen contraparte en
las otras especies y, por lo tanto, deberan ser elimi-
nadas del catlogo, con lo cual, el nmero total de
genes para S. cerevisiae se reduce a 5 726.
El genoma del DNA de Caenorhabditis elegans va-
ra entre regiones ricas en genes y otras en las cuales
escasean. La secuencia total contiene -18 500, pero
slo -42% tiene contrapartes putativas fuera de los
nematodos.
Aunque el genoma de la mosca es ms grande
que el del gusano, D. melanogaster tiene menos genes
(13 600), y como resultado del corte y empalme alter-
nativo, el nmero de transcritos diferentes es ligera-
mente mayor (14 100). No se sabe porqu la mosca,
que es un organismo mucho ms complejo, tiene slo
el 70% de genes del gusano, lo cual subraya enftica-
mente la falta de una relacin exacta entre el nmero
de genes y la complejidad del organismo.
El tamao del genoma de la planta Arabidopsis
thaliana est entre el del gusano y el de la mosca,
pero su nmero de genes es mayor (25 000), fe-
nmeno que demuestra nuevamente que no hay
una relacin clara y subraya tambin la calidad es-
pecial de las plantas, que pueden tener ms genes
(debido a duplicaciones ancestrales) que las clulas
animales. Gran parte del genoma de Arabidopsis se
encuentra en segmentos duplicados, lo cual sugie-
re que hubo una duplicacin ancestral del genoma
(para dar lugar a un tetraploide); slo el 35% de los
genes de Arabidopsis son copias individuales.
El genoma del arroz {Oryza sativa) es -4 veces
ms grande que el de Arabidopsis, pero el nmero
de sus genes es slo -50% mayor, probablemente
-
40 000. El DNA repetitivo ocupa del 42 al 45%
del genoma. Ms del 80% de los genes encontra-
dos en Arabidopsis estn representados en el arroz,
y de estos genes comunes, -8 000 se encuentran en
Arabidopsis y en el arroz, pero no en los genomas
bacterianos o animales que han sido secuenciados.
ste es probablemente el conjunto de genes que
codifica funciones especficas de las plantas, como
la fotosntesis.
A partir del genoma de la mosca es posible
darse una idea de cuantos genes estn dedicados a
cada tipo de funcin. En la FIGl se dividen las
funciones en categoras diferentes. Entre los genes
identificados, se encuentran 2 500 enzimas, -750
factores de transcripcin, -700 transportadores y
canales de iones y -700 protenas implicadas en la
transduccin de seales. Poco ms de la mitad de los
genes codifica a productos de funcin desconocida.
Aproximadamente el 20% de las protenas reside
en las membranas.
El tamao de las protenas se incrementa de las
procariotas y las archaea, a las eucariotas. El tamao
promedio de las protenas de la archaea M. jannas-
chii y la bacteria E. coli flucta entre 287 y 317 ami-
nocidos, respectivamente, mientras que S. cerevisiae
y C. elegans tienen longitudes promedio de 484 y 442
aminocidos, respectivamente. Las protenas gran-
des (de 500 aminocidos) son raras en las bacterias,
pero constituyen un elemento importante (-1/3) de
las eucariotas. El incremento de longitud se debe a
la agregacin de dominios adicionales, cada uno de
los cuales constituye de 100 a 300 aminocidos; no
obstante, el mayor tamao de las protenas causa
slo una parte muy pequea del incremento del
tamao del genoma.
Otra perspectiva del nmero de genes se obtie-
ne al contar el nmero de genes expresados. Basn-
dose en las estimaciones del nmero de especies de
RNAm que pueden contarse en una clula, se puede
concluir que una clula promedio de un organismo
vertebrado expresa de -10 000 a 20 000 genes. Las
significativas superposiciones entre poblaciones de
mensajeros en diferentes tipos de clulas sugeriran
que el nmero total de genes expresados en el or-
ganismo debera rebasar por poco esa cantidad. La
estimacin de 20 a 25 000 para el total del genoma
humano (vase la seccin 5.5, El genoma humano
tiene menos genes de los esperados) implicara que
una proporcin significativa del nmero total de ge-
nes de hecho se expresa en cualquier clula dada.
CAPTULO 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
Los genes eucariticos se transcriben de manera
individual, y cada uno produce un mensajero mono-
cistrnico, y slo hay una excepcin general a esta
regla: en el genoma de C. elegans, -15% de los genes
estn organizados en unidades policistrnicas (aso-
ciadas con el uso del empalme en trans para permitir
"
.
a expresin de los genes en cascada en estas unida-
des; vase la seccin 26.13, Las reacciones de empal-
me en trans utilizan molculas pequeas de RNA).
Cuntos tipos diferentes
de genes hay?
Algunos genes son nicos, en tanto que otros perte-
necen a familias cuyos miembros estn relacionados
pero usuaJmente no son idnticos). La proporcin
e genes nicos se reduce con el tamao del ge-
"
oma y la proporcin de genes en familia se in-
crementa. El nmero mnimo de familias de genes
necesario para codicar a una bacteria es >1 000,
una levadura, >4000 y una eucariota superior, de
11000 a 14000.
Algunos genes estn presentes ms de una vez
se relacionan entre s, de modo que el nmero
K tipos de genes es menor que el nmero total de
enes. El nmero total de genes se puede dividir
m conjuntos cuyos miembros estn relacionados,
>egn se dene al comparar sus exones. (Una fa-
ptlia de genes surge por la duplicacin de un gen
ancestral seguida de la acumulacin de cambios de
secuencia entre copias. Es muy frecuente que los
""
-iembros de una familia estn relacionados, pero
o son idnticos.) El nmero de tipos de genes se
:
alcula sumando el nmero de genes nicos (para
s cuales no hay otro gen relacionado) al nmero
;
e familias que tienen dos o ms miembros.
En la se compara el nmero total de
genes con el nmero de familias distintas de cada
:;:
o de seis genomas. En las bacterias, la mayora de
-5 genes son nicos, as que el nmero de familias
distintas se acerca al nmero total de genes. La si-
dacin es diferente incluso en la eucariota inferior
I cerevisiae, en la cual hay una proporcin significa-
v a de genes repetidos. El efecto ms sobresaliente
que el nmero de genes se incrementa abrup-
:
amente en las eucariotas superiores,
no as el de
:milias
, que no cambia considerablemente.
En la se demuestra que la proporcin
-
-
genes nicos disminuye bruscamente con el ta-
r.
ao del genoma. Cuando los genes se presentan
-
7. familias, el nmero de miembros de una familia
r * reducido en las bacterias y las eucariotas inferio-
.
-
. pero aumenta en las eucariotas superiores. Gran
:
.le del tamao adicional del genoma de Arabidop-
- se debe a familias de >4 miembros.
El nmero de familias de genes alcanza
una meseta con el tamao del genoma
Genes
tota es
25 000
Familias
distintas
20 000
O)
15 000
i 10 000
5 000
6 2>
.
o
.
o
0
7 Numerosos genes estn duplicados, de modo que
el nmero de familias es mucho menor que el nmero total de
genes. En el histograma se compara el nmero total de genes
con el nmero de familias de genes
El tamao de las familias
con el tamao del
se Incrementa
genoma
Genes
nicos
Familias
de 2-4
miembros
Familias
de >4
miembros
H
,
influenzas 89% 10% 1%
i
|
S
. cerevisiae 72% 19% 9%
D
. meianogaster
72% 14% 14%
C
. eiegans
55% 20% 26%
A
. thaiiana 35% 24% 41%
La proporcin de los genes presentes en mltiples
copias se incrementa con el tamao del genoma en las euca-
riotas superiores.
Si todos los genes se expresan, el nmero total
representara el nmero total de protenas necesa-
rias para constituir el organismo (proteoma), sin
embrago, dos efectos significan que el proteoma es
diferente del nmero total de genes. Por una par-
te, los genes estn duplicados, y como resultado,
algunos codifican a la misma protena (aunque
puede expresarse en un tiempo o lugar diferente) y
otros pueden codificar a protenas relacionadas que,
nuevamente, tienen la misma funcin en diferentes
tiempos y lugares. El proteoma puede ser ms gran-
de que el nmero de genes porque algunos pueden
producir ms de una protena mediante corte y em-
palme alternativo.
Qu es el proteoma fundamental, el nmero
bsico de tipos diferentes de protenas del organis-
mo? El nmero de familias de genes proporciona
5
.4 Cuntos tipos diferentes de genes hay?
80%
60/
40/
20%
I
Comunes Adicional en Especficas
a todas las eucariotas del gnero
eucariotas multicelulares
'
:
El genoma de La mosca puede dividirse en ge-
nes que podran estar presentes en todas las eucariotas, en
genes adicionales que probablemente estn en todas las euca-
riotas multicelulares y en genes ms especficos de subgrupos
de especies incluidas las moscas.
un mnimo estimado, 1400 en las bacterias, >4000
en las levaduras y 11 000 a 14000 en la mosca y el
gusano.
Cul es la distribucin del proteoma entre ti-
pos de protenas? Las 6 000 protenas del proteoma
de las levaduras incluyen 5 000 protenas solubles y
1 000 transmembrana; aproximadamente la mitad
son citoplsmicas, un cuarto se encuentran en el
nuclolo y el resto se dividen entre las mitocondrias
y el retculo endoplsmico (ER, endoplasmic reticu-
lum) /aparato de Golgi.
Cuntos genes son comunes a todos los orga-
nismos (o a grupos como las bacterias o las euca-
riotas superiores) y cuntos son especficos de cada
tipo de organismo? En la se resume la
comparacin entre levaduras, gusanos y moscas.
Los genes que codifican a protenas correspondien-
tes en diferentes organismos se denominan ort-
logos. Funcionalmente, suele considerarse que dos
genes que se encuentran en organismos diferentes
pueden realizar funciones correspondientes si sus
secuencias son similares en >80% de la longitud.
Con base en este criterio, -20% de los genes de la
mosca tienen ortlogos en las levaduras y los gu-
sanos, genes que probablemente sean necesarios
para todas las eucariotas. La proporcin se incre-
menta a 30% cuando se compara a moscas y gu-
sanos, lo cual probablemente representa la suma
de las funciones gnicas comunes a las eucariotas
multicelulares. Esto an deja una gran proporcin
de genes como codificadores de protenas necesa-
rias especficamente para las moscas o los gusanos,
respectivamente.
El proteoma puede deducirse a partir del nme-
ro y las estructuras de los genes, y tambin medir-
se directamente al analizar el contenido protenico
total de una clula o un organismo. Mediante di-
chas metodologas se ha identificado a algunas pro-
tenas no sospechadas con base en el anlisis del
genoma, lo cual ha conducido a la identificacin
de genes nuevos. Para el anlisis a gran escala de
las protenas se utilizan numerosos mtodos. La es-
pectrometra de masas permite separar e identificar
protenas en una mezcla obtenida directamente de
clulas o tejidos. Las protenas hbridas etiquetadas
pueden obtenerse por expresin de molculas de
DNAc creadas al ligar las secuencias de los ORE con
vectores de expresin apropiados que incorporan
a las secuencias por etiquetas de afinidad, lo cual
permite utilizar el anlisis de matriz para evaluar
los productos. Estos mtodos tambin pueden ser
efectivos para comparar protenas provenientes de
dos tejidos, por ejemplo, un tejido de un individuo
sano y el de un enfermo, para determinar con pre-
cisin las diferencias.
Una vez que se conoce el nmero total de pro-
tenas, entonces se puede preguntar cmo interac-
tan. Por definicin, las protenas que se encuentran
en ensambles estructurales de protenas mltiples
deben formar interacciones estables entre ellas,
pero las protenas de las rutas de sealizacin in-
teractan de manera transitoria. En ambos casos,
dichas interacciones pueden detectarse en sistemas
experimentales en que un sistema de lectura ampla
esencialmente el efecto de la interaccin. Un siste-
ma popular es el de dos hbridos, analizado en la
seccin 25.3, Los dominios independientes se unen
al DNA y activan la transcripcin. Dichos sistemas
no detectan a todas las interacciones: por ejemplo,
si en una ruta metablica una enzima libera a un
metabolito soluble que interacta posteriormente
con la siguiente enzima, las protenas pueden no
interactuar de forma directa.
En trminos prcticos, los anlisis de interac-
ciones en pares pueden indicar el nmero mnimo
de estructuras independientes o rutas. Un anlisis
de la capacidad de las 6 000 protenas (pronosti-
cadas) de las levaduras para interactuar en pares
muestra que ~1 000 pueden unirse cuando menos
a otra protena. Mediante anlisis directos de forma-
cin de complejos se han identificado 1 440 prote-
nas diferentes en 232 complejos multiprotenicos.
ste es el principio de un anlisis que conducir a la
definicin del nmero de ensambles funcionales o
rutas. En un anlisis comparable de 8 100 protenas
humanas se identificaron 2 800 interacciones, pero
es ms difcil de interpretar debido a las mayores
dimensiones del proteoma.
Adems de los genes funcionales, hay copias de
genes que se han tornado no funcionales (identifica-
dos como tales por interrupciones de sus secuencias
CAPTULO 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
codificadoras de protenas) y que se conocen como
seudogenes (vase la seccin 6.6, Los seudogenes
son callejones sin salida de la evolucin), cuyo n-
mero puede ser alto. En el genoma del ratn y el
humano, el nmero de seudogenes es -10% del
nmero de genes (potencialmente) activos (vase
B seccin 4.8, La conservacin de la organizacin
del genoma ayuda a identificar genes).
Adems de la necesidad de conocer la densidad
K los genes para estimar el nmero total de stos,
se impone preguntar cul es su importancia?; qu
restricciones estructurales hacen necesario que es-
tn espaciados, y si esto contribuye al gran tamao
de los genomas eucariticos?
EL genoma humano tiene
menos genes de Los esperados
Conceptos principales
.
Slo 1% del genoma humano est formado por regiones
codificadoras.
.
Los exones forman ~5% de cada gen, por lo tanto, los
genes (exones ms intrones) constituyen -25% del
genoma.
.
El genoma humano tiene de 20 000 a 25 000 genes.
.
-60% de los genes humanos son sometidos a corte y
empalme alternativo.
.
Hasta el 80% de los cortes y empalmes alternativos
cambian la secuencia protenica, de manera que el
proteoma tiene -50 000 a 60 000 miembros.
H
- genoma humano fue el primer genoma de los
nanismos vertebrados en ser secuenciado. Esta
-
. ume tarea ha revelado informacin valiosa res-
rao de la composicin gentica de nuestra especie
:
e la evolucin del genoma en general, adems
- r que los conocimientos se han profundizado por
bcapacidad de comparar la secuencia del genoma
mnano con el genoma del ratn, secuenciado ms
-;:entemente.
El genoma de los mamferos y el de los roe-
- res generalmente se encuentran en un rango de
-
.
ensiones estrecho, ~3 x 109b
p (vase la seccin
-
5 Por qu los genomas son tan grandes?). El
- .
-
noma del ratn es ~ 14% ms pequeo que el hu-
:r
.o
, probablemente porque ha tenido una tasa de
r
'
dn ms alta. Los genomas contienen familias
-:
ienes y genes similares, y de stos, la mayora
ene un ortlogo en el otro genoma, pero con dife-
imcias en el nmero de miembros de una familia,
r recialmente en los casos en que las funciones son
r
-
-
cficas de cada especie (vase la seccin 4.8, La
conservacin de la organizacin del genoma ayuda
.
lentificar genes). Ahora se cree que el genoma
30 000
25 000
20 000
15 000
10 000
5 000
El genoma del ratn tiene genes y seudogenes
Todos los genes Codificadores de RNA
a Genes
Seudogenes
1
1000
800
600
400
200
El genoma del ratn tiene -30 000 genes codificado-
res de protenas, los cuales tienen -4000 seudogenes. Hay -1600
genes codificadores de RNA. Los datos de los genes codificadores
de RNA se esquematizan a la derecha, en una escala ampliada, para
demostrar que hay -800 genes de RNAr, -450 genes de RNAt, -150
seudogenes y ~350 genes miscelneos no codificadores de RNA,
incluidos RNAsn y RNAmi.
del ratn, del cual originalmente se pens que te-
na -30 000 genes, tiene casi el mismo nmero de
genes que el genoma humano, de 20 000 a 25 000.
En la ti' se representa la distribucin de los
genes del ratn. Los 30 000 genes codificadores de
protenas estn acompaados por -4000 seudoge-
nes. Hay -800 genes que representan a molculas
de RNA que no codifican protenas, los cuales ge-
neralmente son pequeos (excepto las molculas
de RNA ribosmico). Aproximadamente la mitad de
estos genes codifican a RNA de transferencia, para
los cuales tambin ha sido identificado un nmero
importante de seudogenes.
El genoma humano (haploide) contiene 22
autosomas ms el cromosoma X y el Y. El tamao
de los cromosomas vara de 45 a 279 Mb de DNA,
que resulta en un contenido total del genoma de
3 286 Mb (-3.3 x 109 bp). Con base en la estructura
cromosmica, el genoma total puede dividirse en
regiones de eucromatina (que contienen potencial-
mente genes activos) y de heterocromatina (vase
la seccin 28.7, La cromatina se divide en eucroma-
tina y en heterocromatina). La eucromatina com-
prende la mayor parte del genoma, -2.9 x 109 bp.
La secuencia identificada del genoma representa
-
90% de la eucromatina. Adems de proporcionar
informacin sobre el contenido gentico del geno-
ma, la secuencia tambin identifica caractersticas
que pueden ser de importancia estructural (vase
la seccin 28.8, Los cromosomas tienen patrones de
distribucin en bandas).
5.5 El genoma humano tiene menos genes de los esperados
En la se muestra que una pequea
proporcin (~ 1 %) del genoma humano es represen-
tada por exones que, de hecho, codifican a protenas.
Los intrones que constituyen las secuencias restantes
en los genes llevan el total del DNA implicado en la
produccin de protenas a -25 por ciento. Como se
observa en la , el gen humano promedio
tiene una longitud de 27 kb, con nueve exones que
incluyen una secuencia codificadora total de 1 340 bp.
La secuencia codificadora promedio representa, por
lo tanto, slo el 5% de la longitud del gen.
Dos esfuerzos independientes de secuenciar
el genoma humano resultaron en estimados de
-
30 000 y 40 000 genes, respectivamente. Una for-
ma de determinar la precisin de los anlisis consiste
en averiguar si identifican a los mismos genes, y la
sorprendente respuesta es que la superposicin en-
tre uno y otro conjunto de genes es de slo -50%,
como se resume en la . En un anlisis
anterior del conjunto de genes humanos, basado en
transcritos de RNA, se identificaron -11 000 genes,
DNA repetitivo
Otro DNA
intergnico
Exones = 1%
Intrones = 24%
Los genes ocupan eL 25% del genoma humano,
si bien las secuencias codificadoras de protenas son slo una
pequea parte de esta fraccin.
de los cuales casi todos estn en los dos grandes
conjuntos de genes humanos y representan la ma-
yor parte de la superposicin entre ellos. As pues,
no hay duda de la autenticidad de la mitad de cada
conjunto de genes humanos, pero todava se tiene
que establecer la relacin entre la mitad restante
de cada uno de los conjuntos. Las discrepancias
ilustran los riesgos del anlisis de secuencias a gran
escala! Conforme se analiza la secuencia (y confor-
me son secuenciados otros genomas con los que
puede ser comparada), el nmero de genes vlidos
parece declinar, de modo que ahora suele pensarse
que son -20 000 a 25 000.
Sea como sea, el nmero total de genes huma-
nos es mucho menor de lo esperado; la mayor parte
de las estimaciones anteriores a la secuenciacin del
genoma fueron de -100 000. El nmero total de
genes muestra un incremento relativamente peque-
o respecto de las moscas y los gusanos (13 600 y
18 500, respectivamente), sin mencionar a la planta
Arabidopsis (25 000) (vase laFig. 5.2). Sin embargo,
no debe sorprender la nocin de que no se necesita
un gran nmero de genes adicionales para formar
un organismo ms complejo. La diferencia de las
secuencias de DNA del hombre y el chimpanc es
extremadamente pequea (la similitud es >99%),
de modo que es obvio que las funciones y las inter-
acciones entre un conjunto similar de genes pueden
producir resultados muy diferentes. Las fundones de
grupos especficos de genes pueden ser especialmen-
te importantes, debido a que comparaciones detalla-
das de genes ortlogos en el hombre y el chimpanc
sugieren una evolucin acelerada de ciertas clases de
genes, incluidas algunas implicadas en el desarrollo
temprano, el olfato, la audicin, todas funciones re-
lativamente especficas de las especies.
El nmero de genes es menor que el nmero
de protenas potenciales debido al corte y empalme
alternativo, cuya extensin es mayor en el hombre
que en las moscas o los gusanos y puede afectar has-
ta el 60% de los genes, de manera que el incremen-
7 exones internos de una longitud promedio de 145 bp
i I I i \ \ \
7 8 9
1
-5
'
UTR = 300 bp Intrn promedio = 3 365 bp -1
3'
UTR = 770 bp -J
El gen humano promedio tiene una longitud de 27 kb y nueve exones, de los
cuales, dos suelen ser ms largos y estar en cada extremo, y siete exones internos. Las UTR
de los exones terminales son regiones no traducidas (no codificadoras) localizadas en cada
extremo del gen. (Estos datos se basan en el promedio. Algunos genes son extremadamente
largos, de modo que la mediana de la longitud es de 14 kb, con siete exones.)
CAPTULO 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
injuntos de genes humanos tienen
una superposicin de -50%
Totales
39 114
Superpuestos
15 852
Genes ya
conocidos
Totales
29 691
FIGURA 5.1i Los dos conjuntos de genes identificados en
el genoma humano se superponen slo parcialmente, como
se muestra en Los dos crculos grandes de la parte superior,
ic obstante, stos incluyen casi todos los genes previamente
conocidos, como lo demuestra La superposicin con el crculo
:
nferior ms pequeo.
La mayor parte del genoma huma
es DNA repetitivo
Transposones = 45%
Duplicaciones grandes = 5%
Repeticiones simples = 3%
Exones = 1%
Otro DNA
ntergnlco = 22%
Intrones = 24%
El componente ms grande del genoma est for-
mado por transposones. Otras secuencias repetitivas incluyen
duplicaciones extensas y repeticiones sencillas.
to de tamao del proteoma humano en relacin
con el de otras eucariotas puede ser mayor que el
incremento en el nmero de genes. Una muestra de
genes provenientes de dos cromosomas sugiere que
la proporcin de cortes y empalmes alternativos,
que de hecho resultan en cambios en las secuencias
de las protenas, puede ser hasta del 80 por ciento,
lo cual puede incrementar el tamao del proteoma
a 50 000 a 60 000 miembros.
Sin embargo, en cuanto a la diversidad del n-
mero de familias de genes, la discrepancia entre el
hombre y otras eucariotas puede no ser tan grande.
Muchos de los genes humanos pertenecen a fami-
lias: en un anlisis de -25 000 genes se identificaron
3 500 nicos y 10 300 pares. Como puede observar-
se en la Figura 5.7, esto se extrapola a un nmero
Je familias de genes slo un poco mayor que en los
gusanos o las moscas.
ITl Cmo se distribuyen
los genes y otras secuencias
en el genoma?
Conceptos principales
.
Las secuencias repetidas (presentes en ms de una
copia) representan >50% del genoma humano.
.
La mayor parte de las secuencias repetidas est
formada por copias de transposones no funcionales.
.
Hay numerosas duplicaciones de extensas regiones
cromosmcas.
Los genes se distribuyen uniformemente en el ge-
noma? Algunos cromosomas cuentan con pocos
genes y >25% de sus secuencias son
"
desiertos", o
regiones de ms de 500 kb en las que no hay genes,
hasta > 10% de las secuencias de los cromosomas con
ms genes lo son. As, en total, -20% del genoma
humano consiste en desiertos carentes de genes.
Las secuencias repetitivas representan a >50%
del genoma humano, como se observa en la IGURA
. Las secuencias repetitivas se agrupan en cinco
clases:
.
Los transposones (activos o inactivos) cons-
tituyen la gran mayora (45% del genoma);
todos se encuentran en mltiples copias.
.
Los seudogenes procesados (-3 000, consti-
tuyen -0.1% del DNA total). (Son secuen-
cias que surgen por insercin de una copia
de una secuencia de RNAm en el genoma;
vase la seccin 6.6, Los seudogenes son los
callejones sin salida de la evolucin.)
.
Repeticiones de secuencias simples (DNA
muy repetitivo, como el (CA)n que repre-
senta -3%).
.
Las duplicaciones segmentarias (bloques de
10 a 300 kb duplicados en una nueva regin)
representan a -5%. Slo una minora de es-
tas duplicaciones se encuentra en el mismo
cromosoma; en los otros casos, las duplica-
ciones estn en cromosomas diferentes.
.
Las repeticiones en tndem forman bloques
de un tipo de secuencia (especialmente en
los centrmeros y los telmeros).
La secuencia del genoma humano subraya la
importancia de los transposones (que tienen la ca-
pacidad de replicarse a s mismos e insertarse en una
ubicacin diferente, adems de que pueden funcio-
nar exclusivamente como elementos del DNA [vase
5
.6 Cmo se distribuyen los genes y otras secuencias en el genoma?
85
Cap. 21, Los transposones] o tener una forma activa
RNA [vase Cap. 22, Retrovirus y retroposones].
Su distribucin en el genoma humano se resume
en la Fig. 22.18). La mayora de los transposones
que se encuentran en el genoma humano no son
funcionales; muy pocos estn realmente activos, sin
embargo, la gran proporcin del genoma ocupada
por estos elementos indica que han participado ac-
tivamente en el moldeo del genoma. Una caracte-
rstica importante es que algunos genes presentes
se originaron como transposones y evolucionaron
hasta llegar a su condicin actual despus de perder
la capacidad de transponerse. Cerca de 50 genes pa-
recen haberse originado de esta manera.
La duplicacin de segmentos en su forma ms
sencilla implica la duplicacin en tndem de algu-
na regin de un cromosoma (habitualmente debido
a un evento de recombinadn aberrante durante la
meiosis; vase la seccin 6.7, El entrecruzamiento
desigual reorganiza a los agrupamientos de genes).
Sin embargo, en muchos casos, las regiones duplica-
das se encuentran en cromosomas diferentes, lo cual
implica que originalmente hubo una duplicacin en
tndem seguida de la translocadn de una copia a
un sitio nuevo, o que la duplicacin se debi a me-
canismos totalmente diferentes. El caso extremo de
la duplicacin de segmentos se observa cuando se
duplica todo el genoma, en cuyo caso, el genoma di-
ploide inicialmente se convierte en tetraploide. Con-
forme las copias duplicadas desarrollan diferencias, el
genoma puede convertirse en diploide nuevamente
de forma gradual y efectiva, no obstante que las ho-
mologas entre las copias divergentes dejan eviden-
cias del evento, fenmeno particularmente comn
en los genomas de las plantas. El estado actual del
anlisis del genoma humano identifica numerosas
regiones duplicadas, pero no indica si hubo una du-
plicacin completa del genoma en el linaje de los
vertebrados.
Una caracterstica intrigante del genoma huma-
no es la presencia de secuencias que parecen no te-
ner funciones codificadoras, pero que muestran una
conservacin evolutiva superior a la del nivel de
fondo. Como se detect mediante la comparacin
con otros genomas (inicialmente con el del ratn),
dichas secuencias representan aproximadamente el
5% del genoma total. Estn conectadas funcional-
mente con las secuencias codificadoras de prote-
nas? Su densidad en el cromosoma 18 es la misma
que en cualquier otra regin del genoma, aunque
el cromosoma 18 tiene una concentracin de genes
codificadores de protenas significativamente me-
nor, lo cual sugiere indirectamente que su funcin
no est relacionada con la estructura ni con la ex-
presin de los genes codificadores de protenas.
PTl EL cromosoma Y tiene
varios genes especficos
de la masculinidad
Conceptos principales
.
EL cromosoma Y tiene ~60 genes que se expresan
especficamente en los testculos.
.
Los genes especficos de la masculinidad estn en
mltiples copias de segmentos cromosmicos repetidos.
.
La conversin gnica entre copias mltiples permite
el mantenimiento de Los genes activos durante La
evolucin.
La secuenciacin del genoma humano ha amplia-
do significativamente los conocimientos sobre la
funcin de los cromosomas sexuales. En general se
piensa que los cromosomas X y Y descienden de un
autosoma comn (muy antiguo). Su desarrollo ka
implicado un proceso en el cual el cromosoma X
ha retenido la mayor parte de los genes originales,
mientras que el Y, ha perdido casi todos.
El cromosoma X se comporta como los auto-
somas en la medida en que las hembras tienen dos
copias, y entre ellas puede tener lugar la recombina-
cin. La densidad de genes localizados en el cromo-
soma X es comparable a la de otros cromosomas.
El cromosoma Y es mucho ms pequeo que el
X y tiene muchos menos genes. Su nica funcin
resulta de que slo los machos portan el cromosoma
Y
, del cual slo hay una copia, por lo tanto, los lod
ligados a este ltimo son efectivamente haploides y
no diploides, como el resto de los genes humanos.
Durante muchos aos se pens que el cromo-
soma Y casi no portaba genes, excepto uno (o ms)
de los que determinan el sexo y definen la mascu-
linidad. Gran parte del cromosoma Y (>95% de su
secuencia) no experimenta entrecruzamiento con
el cromosoma X, lo cual condujo a la perspectiva
de que poda no contener genes activos porque no
habra manera de evitar la acumulacin de muta-
ciones deletreas. Esta regin est flanqueada por
regiones seudoautosmicas cortas que se intercam-
bian frecuentemente con el cromosoma X durante
la meiosis masculina. Originalmente, a esta regin
se le llam no recombinante, pero ahora se le co-
noce como regin especfica determinante de la
masculinidad.
La secuenciacin detallada del cromosoma Y
muestra que dicha regin contiene tres tipos de re-
giones, como se ilustra en la FIGURA 5.15:
.
Las secuencias X transpuestas estn for-
madas por un total de 3.4 Mb que forman
bloques grandes resultado de una transpo-
sicin de la banda q21 en el cromosoma
CAPTULO 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
El cromosoma Y tiene -70 genes activos
Yp
Centrmero P8 P7 P6 P5 P4
P3 P2 P1 Yq
Regiones amplicnicas
Regiones X
transpuestas
Regiones X
degeneradas
II
Palndromos de las
regiones amplicnicas
Regiones
seudoautosmicas
Centrmero
y heterocromatina
Genes de muchas
copias
Genes de una
soia copia
5.15 EL cromosoma Y est formado por regiones X transpuestas, regiones X degeneradas y
amplicones. Las regiones X transpuestas y degeneradas tienen dos y 14 genes nicos, respectivamente.
Los amplicones tienen ocho palndromos extensos (P1-P8), los cuales contienen a nueve familias de
genes. Cada familia contiene por lo menos dos copias.
X hace aproximadamente tres o cuatro mi-
llones de aos, lo cual es especfico del linaje
humano. Estas secuencias no se recombinan
con el cromosoma X y prcticamente se han
desactivado, ahora contienen slo dos genes
activos.
.
Los segmentos X degenerados del cromosoma
Y son secuencias que comparten un ori-
gen comn con el cromosoma X (retorno
al autosoma comn del cual descienden los
cromosomas X y Y) y contienen genes o
seudogenes relacionados con el cromosoma
X
, Hay 14 genes activos y 13 seudogenes.
En cierta forma, los activos han desafiado la
tendencia a ser eliminados de las regiones
cromosmicas que no pueden recombinarse
durante la meiosis.
.
Los segmentos amplicnicas tienen una lon-
gitud total de 10.2 Mb y se repiten inter-
namente en el cromosoma Y. Hay ocho
bloques palndromos grandes que incluyen
a nueve familias de genes codificadores de
protenas; el nmero de copias por familia
flucta entre 2 y 35. El nombre "amplicn"
refleja el hecho de que las secuencias han
sido amplificadas internamente en el cro-
mosoma Y.
Sumando los genes que se encuentran en estas
e5 regiones, el cromosoma Y contiene muchos ms
lo que se hubiera esperado, hay 156 unidades de
inscripcin, de las cuales la mitad representa a ge-
'
s codificadores de protenas y la mitad representa
ieudogenes.
La presencia de los genes activos se explica por
hecho de que la existencia de copias de genes
mamente relacionados en los segmentos ampli-
nicos permite que la conversin gnica entre las
copias mltiples de un gen sea usada para regene-
rar copias activas. Las necesidades ms comunes
de las copias mltiples de un gen son cuantitativas
(proporcionar ms producto protenico) o cualita-
tivas (codificar protenas con propiedades ligera-
mente distintas o expresadas en tiempos o lugares
diferentes), aunque en este caso, la funcin esen-
cial es evolutiva. De hecho, la existencia de copias
mltiples permite la recombinacin en el mismo
cromosoma Y para sustituir a la diversidad evoluti-
va que suele ser proporcionada por recombinacin
entre los cromosomas allicos.
La mayora de los genes codificadores de pro-
tenas en los segmentos amplicnicos se expresa
especficamente en los testculos, y probablemente
estn implicados en el desarrollo de la masculinidad.
Si hay -60 de dichos genes en un conjunto total
de -25 000 genes humanos, la diferencia gentica
entre varones y mujeres es de -0.2%.
BEi Las especies ms complejas;
evoidonan ai. agregar nuevas
fundones gnicas
Conceptos principales
La comparacin de diferentes genomas muestra un
incremento constante en el nmero de genes conforme
se aaden genes adicionales para formar eucariotas,
organismos multicelulares, animales y vertebrados.
La mayora de los genes nicos de los vertebrados
estn relacionados con el sistema nervioso o el
inmunolgico.
La comparacin de la secuencia del genoma huma-
no con secuencias encontradas en otras especies es
reveladora respecto del proceso de evolucin. En
5.8 Las especies ms complejas evolucionan al agregar nuevas funciones gnicas
as se agregan durante la evoluci
.i
Incremento de
la complejidad
Sistema
nervioso
Sistema
nmunologi
Todas las
procariotas y
vertebrados las eucariotas
Slo
vertebrados
animales
Slo
eucariotas
Funciones necesarias
para la vida
Compartimientos
celulares
Multicelularidad
Desarrollo
Los genes humanos pueden dasifcarse segn la am-
plitud de La distribucin de sus homlogos en otras especies.
1 300 funciones comunes son esenciales
Transcripcin/
traduccin
m Plegamiento
protenico
Replicacin
Transporte
C Metabolismo
Las protenas eucariticas comunes estn rela-
cionadas con funciones celulares esenciales.
la FIGURA 5.16 se analizan los genomas humanos de
acuerdo con la amplitud de su distribucin en la
naturaleza. Partiendo del ms comn (esquina su-
perior derecha de la figura), el 21 % de los genes es
comn a eucariotas y procariotas, y tienden a codifi-
car protenas esenciales para todas las formas vivas,
tpicamente para el metabolismo bsico, la replica-
cin, la transcripcin y la traduccin. Avanzando
en el sentido de las manecillas del reloj, se agrega
otro 32% de los genes a las eucariotas en general,
por ejemplo, pueden encontrarse en las levaduras.
Estos genes tienden a codificar protenas implica-
das en funciones generales de las clulas eucariti-
cas, pero no de las bacterias; podran relacionarse,
por ejemplo, con la especificacin de organelos o
con los componentes del citoesqueleto. Otro 24% de
los genes son necesarios para la especificacin de los
animales, entre otros, los genes para la multicelu-
laridad y el desarrollo de diferentes tipos de tejidos.
Veintids por ciento de los genes son nicos de ver-
tebrados, y codifican principalmente a protenas del
complejidad requiere de funciones extracelulares
1 500
1 000
5 00
Extracelular
l Transmembrana
n Intracelular
fIGURA 5.1 El incremento de la complejidad de las eucario-
tas se acompaa de la acumulacin de protenas nuevas para
desempear funciones transmembrana y extracelulares.
sistema inmunolgico y del nervioso, pero a muy
pocas enzimas, lo cual coincide con la idea de que el
origen de las enzimas es muy antiguo y que las rutas
metablicas se originaron al principio de la evolu-
cin. Por lo tanto, se observa que el avance de las
bacterias a los vertebrados implica agregar grupos
de genes que representan a las nuevas funciones
necesarias en cada etapa.
Una manera de definir las protenas comnmen-
te necesarias es identificar las que se encuentran en
todos los proteomas. Comparando detalladamente
el proteoma humano con los proteomas de otros
organismos, 46% del de las levaduras, 43% del de
los gusanos y 61% del de las moscas estn repre-
sentados en el humano; un grupo clave de ~1 300
protenas est presente en los cuatro proteomas.
Las protenas comunes son protenas domsticas
bsicas necesarias para funciones esenciales que
corresponden a los tipos resumidos en la IGURA
. Las funciones principales estn relacionadas
con la transcripcin y la traduccin (35%), el meta-
bolismo (22%), el transporte (12%), la replicacin
y modificacin del DNA (10%), el plegamiento y la
degradacin de protenas (8%) y los procesos celu-
lares (6%).
Una de las sorprendentes caractersticas del pro-
teoma humano es que tiene muchas protenas nue-
vas respecto de otras eucariotas, pero relativamente
pocos dominios protenicos nuevos. La mayora de
los dominios protenicos parecen ser comunes al rei-
88
CAPTULO 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
animal. Sin embargo, hay muchas arquitecturas
tenicas recientes definidas como combinaciones
ras de dominios. En la se muestra
-
r el mayor incremento tiene lugar en las prote-
r transmembrana
y las extracelulares. En las le-
;
-
uras, la vasta mayora de las arquitecturas tiene
.
z ver con las protenas intracelulares. En las mos-
is 10 los gusanos) hay aproximadamente el doble
-
-
arquitecturas intracelulares, pero hay un incre-
mento sorprendente de protenas transmembrana y
-
.
racelulares, como es de esperar de la adicin de
_
aciones necesarias para las interacciones entre las
:/
.ilas de un organismo multicelular. El incremen-
rn las arquitecturas intracelulares necesario para
~
iar un vertebrado (hombre) es relativamente
-
;ueo, pero tambin en este caso se incrementan
ran medida la arquitectura transmembrana y la
-
/.racelular.
Desde hace mucho tiempo se sabe que la di-
r.
-
encia gentica entre el hombre y el chimpanc
v
.
;
estro pariente ms cercano) es muy pequea,
-
99% de los genomas son idnticos. Hoy da, la se-
-
rucia del genoma del chimpanc permite investi-
con ms detalle ese 1 % de diferencias y detectar
-
!as caractersticas responsables de "lo humano"
- .den ser identificadas. La comparacin muestra
5 < 106 sustituciones de nucletidos (1.2% de di-
r:encia global en la secuencia),
5 x 106 deleciones
inserciones (dejando en -1.5% de la secuencia
:
acromtica, especfica de cada especie) y muchas
rtructuraciones cromosmicas. Las protenas co-
iespondientes suelen ser muy similares; 29% son
;
nticas y entre especies, en la mayora de los casos
ay slo una o dos diferencias en los aminocidos
:
r la protena. De hecho, las sustituciones de nu-
e 3tidos son menos frecuentes en los genes codifi-
;
iores de protenas que en los que tienden a estar
Hvolucrados en rasgos especficamente humanos,
o cual sugiere que la evolucin de las protenas
es un efecto importante en las diferencias entre
-
humano y el chimpanc, lo cual deja como po-
;:
Iidades principales a los cambios de estructura
-
-
.r
.ica en gran escala y los de la regulacin. El 25%
r .as sustituciones de nucletidos ocurre en los di-
"
-idetidos CpG (entre los cuales hay muchos sitios
guiadores potenciales).
m Cuntos genes
son esenciales?
Zonceptos principales
.
No todos los genes son esenciales. En las levaduras y
.as moscas, las deleciones de <50% de los genes tienen
efectos detectables.
.
Cuando dos o ms genes son redundantes, una
mutacin en cualquiera de ellos puede no tener efectos
detectables.
.
No se sabe porqu sobreviven los genes que
aparentemente son prescindibles en el genoma.
La seleccin natural es la fuerza que garantiza que
los genes tiles sean retenidos en el genoma; las mu-
taciones son aleatorias y su efecto ms comn en un
ORF sera daar al producto protenico. Un organis-
mo con mutaciones nocivas estara en desventaja
en la evolucin, y en ltima instancia, la mutacin
sera eliminada por deficiencias de competitividad de
los organismos que la portan. La frecuencia de un
alelo deficiente en la poblacin se equilibra entre la
generacin de mutaciones nuevas y la eliminacin
de mutaciones antiguas. Invirtiendo este argumento,
siempre que se ve un ORF intacto en el genoma, se
supone que su producto desempea una funcin til
en el organismo. La seleccin natural debe haber im-
pedido la acumulacin de mutaciones en el gen. El
destino final de un gen que deja de ser til es acumu-
lar mutaciones hasta que deja de ser reconocible.
El mantenimiento de un gen implica que confie-
re una ventaja selectiva al organismo. Sin embargo,
en el curso de la evolucin, incluso una ventaja rela-
tiva pequea puede ser objeto de la seleccin natural
y un defecto fenotpico no ser necesariamente detec-
table de inmediato como resultado de una mutacin.
No obstante, sera importante saber cuntos genes
son realmente esenciales, lo cual significa que su au-
sencia es letal para el organismo, lo cual, en el caso
de los organismos diploides, significa por supuesto
que la mutacin nula homocigtica es letal.
Se puede suponer que la proporcin de genes
esenciales declinar con el incremento de tamao
del genoma porque los genomas ms grandes pue-
den tener mltiples copias relacionadas con fun-
ciones gnicas particulares, pero hasta ahora esta
expectativa no ha sido confirmada por los datos
(vase la Fig. 5.2).
Una forma de abordar el tema del nmero de
genes es determinar-mediante anlisis mutacional el
nmero de los que son esenciales. Si saturamos una
regin especfica del cromosoma con mutaciones le-
tales, las mutaciones deben mapearse en un nmero
de grupos de complementacin que corresponda al
nmero de loci letales en dicha regin. Al extrapolar
este mtodo al genoma como unidad global, se po-
dr calcular el nmero total de genes esenciales.
En el organismo que tiene el genoma ms pe-
queo conocido (M.genitalium), las inserciones alea-
torias tienen efectos detectables slo en aproxima-
damente dos tercios de los genes; asimismo,
menos
5
,9 Cuntos genes son esenciales?
de la mitad de los genes de la bacteria E. coli parecen
ser esenciales. La proporcin es incluso ms baja en
la levadura S. cerevisiae. Cuando las inserciones se
introdujeron aleatoriamente en el genoma en un
<20% de los genes de las levaduras son esenciales
E
o
c
O)
20
15
10
5
2.5
Genoma total
Crecimiento lento
slructura y funcin
Expresin genica
i
Desc pcida
i
# # /
0
;/
FIGURA 5.1 Los genes esenciales de las levaduras se encuentran
en todas las clases. Las barras azules muestran la proporcin total
de cada clase de genes, en tanto que las rojas muestran a los esen-
ciales.
La mayora de los genes del gusano no son esenciales
D 90% efectos
no detectables
70%
no viables
O 1.6% fenotipos
posembrionarlos
1.6% defectos
del desarrollo
JURA 5.20 En un anlisis sistemtico de prdida de funcin
que se realiz en 86% de los genes del gusano se demostr que
slo el 10% tiene efectos detectables en el fenotipo.
anlisis previo, slo 12% fueron letales y otro 14?c
impeda el crecimiento. La mayor parte de las inser-
ciones (70%) no tuvo ningn efecto. En un sonde'
ms sistemtico, basado en la delecin completa de
cada uno de los 5 916 genes (>96% de los identi-
ficados), se muestra que slo el 18.7% es esencia;
para el crecimiento en un medio de cultivo rico er.
nutrientes. En la se observa que las le-
vaduras incluyen genes en todas las categoras. La
nica concentracin notable de defectos est en los
que codifican a productos implicados en la sntesis
protenica, en cuyo caso, -50% son esenciales. Ob-
viamente, en este mtodo se subestima el nmerc
de genes esenciales para que la levadura viva en su
hbitat natural, cuando no est tan bien provista
de nutrientes.
En la FIGURA 5.20 se resumen los resultados de
un anlisis sistemtico de los efectos de la prdida
de funcin gnica en el gusano C. elegans. Las se-
cuencias de genes individuales fueron pronostica-
das a partir de la secuencia del genoma, y al dirigir
un RNA inhibidor contra estas secuencias (vase
la seccin 13.10, La interferencia de RNA est re-
lacionada con el silenciamiento de genes), se cre
un conjunto grande de gusanos en el cual se impi-
di el funcionamiento de un gen (pronosticado) en
cada gusano. Los efectos detectables en el fenotipo
se observaron slo en 10% de estos organismos con
genes desactivados, lo cual sugiere que la mayora
de los genes no tiene fundones esenciales.
La proporcin de genes esenciales es mayor
(21%) entre los genes de gusanos que tienen con-
trapartes en otras eucariotas, lo cual sugiere que los
genes ampliamente conservados tienden a desem-
pear funciones ms bsicas. Tambin se incremen-
ta la proporcin de genes esenciales entre ios que
se presentan individualmente en cada genoma ha-
ploide, respecto de los genomas que tienen muchas
copias de genes relacionados o idnticos, lo cual su-
giere que muchos de los genes mltiples pueden ser
duplicaciones relativamente recientes que pueden
sustituir mutuamente sus funciones.
En Drosophila se han realizado anlisis extensos
del nmero de genes esenciales en una eucariota
superior mediante intentos de correlacionar los as-
pectos visibles de la estructura cromosmica con el
nmero de unidades genticas funcionales. La idea
de que esto pueda ser posible provino originalmente
de la presencia de bandas en los cromosomas po-
litnicos de D. melanogaster. (Estos cromosomas se
encuentran en determinadas etapas del desarrollo y
representan una forma fsica inusualmente amplia,
en la cual son evidentes una serie de bandas [de-
nominadas ms formalmente crommeros]; vase
la seccin 28.10, Los cromosomas politnicos for-
man bandas.) A partir del concepto anterior de que
90
CAPTULO 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
s bandas pueden representar un orden lineal de
-enes
, se ha llegado al intento de correlacionar la
rganizacin de los genes con la organizacin de las
:;
ndas. En el conjunto haploide de D. melanogaster
-
3y ~5 000 bandas cuyo tamao vara en ms de
.r.
orden de magnitud, pero en promedio hay -20
:
de DNA por banda.
El mtodo bsico consiste en saturar una regin
I mosmica con mutaciones, las cuales suelen ser
::icillamente reunidas como letales, sin analizar
I causa de ello. Cualquier mutacin letal se toma
Mra identificar a un locus que esencial para el or-
jinismo. En ocasiones, las mutaciones provocan
::
ctos deletreos visibles pero no letales, en cuyo
;
i ;o, tambin se toman en consideracin para iden-
. car un locus esencial. Cuando las mutaciones se
colocan en grupos de complementacin,
el nmero
'
uede ser comparado con el nmero de bandas de la
"
rjon, o incluso, cada grupo de complementacin
_ede ser asignado a bandas individuales. El prop-
:
de estos experimentos ha sido determinar si hay
ana relacin coherente entre las bandas y los genes,
:
r ejemplo, cada banda tiene un solo gen?
Agrupando los anlisis realizados en los ulti-
_
s 30 aos, el nmero de grupos de complemen-
acin letales es -70% del nmero de bandas; an
desconoce si esta relacin tiene algn significa-
.
funcional. Independientemente de la causa, la
-: bivalencia constituye un estimado razonable de
-
3 600 genes letales; desde cualquier punto de vista,
-
: Drosophila, el nmero de loci letales es significati-
;
mente menor que el nmero total de genes.
Si la proporcin de genes esenciales humanos
similar a la observada en otras eucariotas, se
::
nosticara un rango de 4000 a 8 000 genes en
"
que las mutaciones seran letales o produciran
z r ros evidentemente dainos. Actualmente se han
;
L-ntificado 1300 genes en los cuales las mutaciones
:
vocan defectos evidentes, proporcin sustancial
-. . total esperado, particularmente en vista de que
uchos genes letales pueden actuar tan precoz-
-
nte que nunca veramos sus efectos. Este tipo de
esgos tambin suele explicar los resultados de la
KURA 5.21, en la cual se observa que la mayora de
defectos genticos conocidos se debe a mutacio-
puntuales (en donde es ms probable que haya
oiando menos alguna funcin residual del gen).
Cmo se explica la supervivencia de genes
- a delecin parece no tener efecto alguno? La
explicacin ms probable es que el organismo tiene
-as alternas de cumplir con la misma funcin.
posibilidad ms sencilla es la redundancia, y
M hay muchas copias de algunos genes, lo cual
erto en algunos casos, cuando muchos genes
:;
acionados) deben ser desactivados para producir
_
"
efecto. En un escenario un poco ms complejo,
un organismo puede tener dos rutas independien-
tes susceptibles de proporcionar cierta actividad. La
desactivacin de cualquiera de ellas no sera daina,
pero la ocurrencia simultnea de mutaciones en los
genes de ambas sera deletrea.
Este tipo de situaciones puede evaluarse combi-
nando mutaciones. Para empezar, en la misma cepa
se introducen deleciones en dos genes, ninguna letal
de por s, pero si el mutante doble muere, la cepa se
denomina letal sinttica. Esta tcnica ha resultado
muy efectiva en las levaduras, en las cuales puede
automatizarse el aislamiento de mutantes dobles,
procedimiento denominado anlisis de matriz ge-
ntica sinttica (SGA, syntheticgenetic array anli-
sis). En la FIGURA 5. se resume el resultado de un
ansis en el cual se realiz una SGA en cada una
de las 132 deleciones viables para detectar si pue-
de sobrevivir en combinacin con cualquiera de las
4700 deleciones viables. Cada uno de los genes de
prueba tuvo por lo menos un compaero con el cual
la combinacin fue letal, y en la mayor parte de los
genes de prueba fue ese el caso; la mediana es de
-
25 compaeros, y el nmero mayor se observ en
un gen de prueba que tuvo 146 compaeros letales.
La mayora de las mutaciones humanas que
provocan defectos son pequeas
Sentido errneo/sin sentido 58%
Corte y empalme 10%
Reguiadoras <1%
Deleciones pequeas
16%
Inserciones pequeas
6%
Deleciones grandes
5%
Reestructuraciones grandes
2%
La mayor parte de los defectos genticos cono-
cidos de los genes humanos se debe a mutaciones puntuales;
casi todos afectan directamente a la secuencia protenica. El
resto se debe a inserciones, deleciones o reestructuraciones de
diferentes tamaos.
Las mutaciones no letales pueden ser letales en combinaciones
B
le
Ulil
Jim
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
Nmero de genes letales interrelacionados (de 4 700)
Los 132 genes mutantes de prueba presentan algunas com-
binaciones letales si se combinan con alguna de las 4700 mutaciones no
letales. En la grfica se ilustra cuntos genes letales interrelacionados hay
por cada gen de prueba.
5
.9 Cuntos genes son esenciales?
91
Una pequea proporcin (-10%) de los pares mu-
rantes interrelacionados codificaron protenas que
interactan fsicamente.
Este resultado de alguna manera apunta hacia
la explicacin de la falta aparente de efecto de tantas
deleciones. La seleccin natural actuar contra es-
tas deleciones cuando se encuentren a s mismas en
combinaciones de pares letales. Hasta cierto punto,
el organismo ha sido protegido contra los efectos
dainos de las mutaciones merced a la redundancia
,
pero paga el precio al acumular la "carga gentica"
de mutaciones que no son deletreas por s mismas,
pero que pueden causar problemas serios cuando
se combinen con otras mutaciones semejantes en
generaciones futuras. La teora de la seleccin na-
tural sugerira que la prdida de genes individuales
en dichas circunstancias produce una desventaja lo
suficientemente grande como para mantener al gen
activo durante la evolucin.
Los genes se expresan
en niveles rnuy diferentes
Conceptos principales
.
En una clula dada, la mayora de los genes se expresa
en niveles bajos.
.
Slo un pequeo nmero de genes, cuyos productos
son especializados para un tipo celular especfico, se
expresan ampliamente.
La proporcin de DNA representada en una pobla-
cin de RNAm puede determinarse por la cantidad
de DNA susceptible de hibridarse con el RNA. Di-
cho anlisis de saturacin habitualmente identifica
a ~ 1 % del DNA como proveedor de un molde para
el RNAm. A partir de este descubrimiento es posible
calcular el nmero de genes, siempre y cuando se
conozca la longitud promedio de un RNAm. En una
eucariota inferior, como una levadura, el nmero
total de genes expresados es ~4 000, mientras que
en los tejidos somticos de las eucariotas superiores,
suele ser de 10 000 a 15 000; el valor es similar en
las plantas y los vertebrados. (La nica excepcin
que coincide con este tipo de valor es el cerebro de
los mamferos, en el cual aparentemente se expre-
san nmeros mucho mayores de genes, aunque no
se ha confirmado la cantidad exacta.)
El anlisis cintico de la reasociacin de una po-
blacin de RNA permite determinar la complejidad
de su secuencia. Este tipo de anlisis suele identi-
ficar a tres componentes de una clula eucaritica.
Igual que en una curva de reasociacin de DNA,
un
solo componente se hbrida en cerca de dos dcadas
de valores Rot (concentracin de RNA x tiempo),
y una reaccin que abarque un rango ms ample
debe resolverse por ajuste computarizado de curvas
en componentes individuales. Tambin aqu, este
representa lo que realmente es un espectro conti-
nuo de secuencias.
Un ejemplo de una reaccin RNAm excesivo I
DNAc que genera tres componentes se muestra er
la FIGURA 5.23:
.
El primer componente tiene las mismas
caractersticas que una reaccin de control
de RNAm de ovoalbmina con su copia de
DNA, lo cual sugiere que el primer compo-
nente es de hecho slo RNAm de ovoalb-
mina (que ciertamente ocupa aproximada-
mente la mitad de la masa de mensajero de
tejido del oviducto).
.
El siguiente componente proporciona 15:
de la reaccin, con una complejidad tota,
de 15 kb; corresponde a 7 a 8 especies de
RNAm con una longitud promedio de 2 001
bases.
.
El ltimo componente proporciona 35% de
la reaccin, que corresponde a una comple-
jidad de 26 Mb, lo cual equivale a -13 000
especies de RNAm con una longitud prome-
dio de 2 000 bases.
A partir de este anlisis se observa que aproxi-
madamente la mitad de la masa del RNAm de \e
itBmiffgB:l.l,l.l-lll.l.ll.l.lJ!.ll.ll.ll:|im
Primer
componente
50% a
Rot
n
0.0015
Segundo
componente
15% a
Rot
n
0.04
Ultimo
componente
35% a
Rot
0
30
100
i
O
1
$ 50
0)
=i
cr
(D
i
25
o
Q_
.
y
J
k
10-4 lO"3 10-2 10-r
Rot
1 10 102
La hibridacin entre RNAm excesivo y DNAc iden-
tifica a numerosos componentes de las clulas del oviducto de
pollo caracterizadas por el Rot1/2de reaccin.
CAPTULO 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
aflua representa un solo RNAm, -15% de la masa
es proporcionada por slo 7 a 8 molculas de RNAm
-
35% de la masa se divide en la enorme cifra de
13 000 especies de RNAm, por lo tanto, es obvio
- -:
e las molculas de RNAm que comprenden cada
componente deben estar presentes en cantidades
-
.uy diferentes.
Al nmero promedio de molculas de cada
-
rNAm por clula se le denomina abundancia, que
:
:ede calcularse de forma muy sencilla si se conoce
masa total de RNA de la clula. En el ejemplo de la
-
.uva 5.23, el RNAm total puede representarse
-
mo 100 000 copias del primer componente (RNAm
;
c ovoalbmina) y 4 000 de cada una de las 7 a 8
lculas de RNAm del segundo componente, pero
;
oo ~5 copias de cada una de las 13 000 molculas de
RXAm que constituyen el ltimo componente.
La poblacin de RNAm se puede dividir en dos
;
:ses generales, de acuerdo a su abundancia:
.
El oviducto es un caso extremo, con gran
parte del RNAm representada en una sola
especie, pero la mayor parte de las clulas
contiene un nmero pequeo de molculas
de RNA en numerosas copias. Este RNAm
abundante suele estar formado por <100
molculas diferentes de RNAm en 1 000 a
10 000 copias por clula. Con frecuencia co-
rresponde a gran parte de la masa, cerca de
50% del RNAm total.
.
Aproximadamente la mitad de la masa de
RNAm consiste en un nmero importante
de secuencias, cerca de 10 000, cada una
representada por slo un pequeo nmero
de copias en el RNAm, unas <10, que es la
clase de RNAm escaso o RNAm comple-
jo; es esta clase la que lleva a reacciones por
saturacin.
Cuntos genes se expresan?
Iflncep:os principales
.
Los RNAm expresados en niveles bajos se superponen
ampliamente en comparaciones de tipos de clulas.
.
Las molculas de RNAm abundantemente expresadas
z elen ser especficas del tipo de clula.
.
-10 000 genes expresados pueden ser comunes a la
-
ayora de los tipos celulares de una eucariota superior.
B rango de genes expresados de muchos tejidos
.ricos de eucariotas superiores es de 10 000 a
-
: ;0. Qu tanta es la superposicin entre genes

-
rresados en tejidos diferentes? Por ejemplo,
el
Mgado de pollo se expresan de -11 000 a 17 000
-
recto del valor que se observa en el oviducto de
-
13 000 a 15 000. Cuntos de estos dos conjuntos
de genes son idnticos? Cuntos son especficos de
cada tejido? Estas interrogantes suelen responderse
al analizar el transcriptoma, o conjunto de secuen-
cias representadas en el RNA.
De inmediato se observa que es probable que
haya diferencias sustanciales entre los genes expre-
sados en la clase abundante. La ovoalbmina, por
ejemplo, se sintetiza slo en el oviducto y para nada
en el hgado, lo cual significa que el 50% de la masa
de RNAm del oviducto es especfica de dicho tejido.
Sin embargo, las molculas de RNAm abun-
dante representan slo una pequea porcin del
nmero de genes expresados. Desde la perspectiva
del nmero total de genes del organismo y del n-
mero de cambios que deben darse en la transcrip-
cin entre diferentes tipos de clulas, se necesita
conocer la extensin de la superposicin entre los
genes representados en las clases de RNAm escaso
de diferentes fenotipos celulares.
Las comparaciones entre tejidos diferentes mues-
tran que, por ejemplo, -75% de las secuencias expre-
sadas en el hgado y en el oviducto son las mismas,
en otras palabras, -12 000 son expresados en el h-
gado y en el oviducto, -5 000 genes adicionales slo
en el hgado y otros -3 000 se expresan slo en el
oviducto.
Las molculas de RNAm escaso se superponen
ampliamente. Entre el rin y el hgado del ratn,
-
90% de las molculas de RNAm escaso son idn-
ticas, en funcin del nmero de genes expresados,
una diferencia de slo 1 000 a 2 000 entre tejido y
tejido. El resultado general obtenido en varias com-
paraciones de este tipo revela que slo -10% de las
secuencias de RNAm de una clula son nicas en
ella. La mayora de las secuencias son comunes
en numerosos tipos celulares, quiz en todos.
Esto sugiere que el conjunto comn de fun-
ciones de los genes expresados, tal vez -10 000 en
los mamferos, comprende funciones necesarias en
todos los tipos de clulas. En ocasiones, este tipo de
genes se conoce como genes de mantenimiento
o genes constitutivos; sus actividades contrastan
con las representadas por funciones especializadas
(como la ovoalbmina o la globina), necesarias slo
para fenotipos celulares especficos. En ocasiones, a
estos genes se les llama genes especializados.
ITO El nmero de genes expresados
puede medirse en masa
Conceptos principales
.
La tecnologa del chip permite tomar una instantnea
de la expresin del genoma completo de una unidad
celular de levadura.
5.12 El nmero de genes expresados puede medirse en masa
Las molculas de RNAm de las levaduras
varan ampliamente en abundancia
| 2 000
40%
0)
m 1 500
05
0)
E 1 000
18% 0)
E 500
8%
<1 1-10 10-100 >100
Copias de RNAm por clulas de levadura
La abundancia de las molculas de RNAm de
Las levaduras flucta entre <1 por clula (o sea que no todas
las clulas tienen una copia de RNAm) y >100 por clula (que
codifican a las protenas ms abundantes).
Las molculas de RNAm individuales pueden medirse
Cambio
RPB1 (nmero de veces) SRB10
-
4 -2 +2 +4 -4 -2 +2 +4
5 El anlisis de HDA permite medir los cambios
en la expresin de cada gen (la parte superior izquierda es el
primer gen del cromosoma I y la inferior derecha, el ltimo gen
del cromosoma XVI). Los cambios en la expresin relativos a
Los tipos silvestres se indican en Los colores rojo (reduccin),
blanco (sin cambios) o azul (incremento). Fotografas cortesa
de Rick A. Young, Whitehead Institute, Massachusetts Institute
of Technology.
.
-75% (~4 500 genes) del genoma de las Levaduras se
expresa en condiciones de cultivo normales.
*
La tecnologa del chip permite comparar
detalladamente clulas animales relacionadas para
determinar (por ejemplo) las diferencias de expresin
entre una clula normal y una cancergena.
La tecnologa reciente permite estimar de manera
ms sistemtica y precisa el nmero de genes ex-
presados. Un mtodo (anlisis serial de la expre-
sin gnica o SAGE, serial analysis ofgene expression)
permite utilizar una etiqueta secuencial nica para
identificar a cada RNAm. La tecnologa permite me-
dir posteriormente la abundancia de cada etiquis
Mediante este mtodo se identifican 4665 genes ex-
presados en S. cerevisiae cuando crece en condiciones
normales, con abundancias que fluctan entre 0.-
y >200 transcritos/clula, es decir, que -75% dei
nmero total de genes (~6 000) se expresa en dicha;
condiciones. En la Fl . se resume el nmerc
de molculas diferentes de RNAm que se encuen-
tran en cada nivel de abundancia.
La tecnologa ms poderosa utiliza chips que
contienen matrices de oligonucletidos de alta den-
sidad (HDA, high-density oligonucleotide arrays) cuy;
construccin es posible porque se conoce la secuen-
cia del genoma completo. En el caso de S. cerevisiae.
cada uno de los 6 181 ORF estn representados en le
HDA por oligonucletidos de 20 25-mer que corres-
ponden perfectamente a la secuencia del mensaje y
20 oligonucletidos no correspondientes que difieren
en una posicin de base. El nivel de expresin de
cualquier gen se calcula sustrayendo la seal pro-
medio de un apareamiento errneo de su compa-
ero perfecto. El genoma completo de las levadura?
puede representarse en cuatro chips. Esta tecnologa
es lo suficientemente sensible como para detectar
los transcritos de 5 460 genes (-90% del genoma) y
mostrar que numerosos genes se expresan en niveles
bajos, con abundancias de 0.1 a 0.2 trascritos/clula.
Una abundancia de <1 transcrito/clula significa que
no todas las clulas tienen una copia del transcrito en
un momento dado.
La tecnologa permite no slo la medicin de los
niveles de expresin gnica, sino tambin la detec-
cin de diferencias de expresin en clulas mutantes
respecto de clulas de tipo silvestre que crecen en
condiciones de cultivo diferentes, etctera. Los resul-
tados de la comparacin de dos estados se expresan
en una cuadrcula en la cual cada cuadro representa
un gen especfico y el cambio relativo en la expre-
sin se indica mediante un color. La parte izquierda
de la ' ' ' muestra el efecto de una mutacin
en la RNA polimerasa 11, la enzima que produce al
RNAm, la cual, como puede esperarse, provoca que
la expresin de la mayora de los genes se reduzca
mucho. La parte derecha de la figura, por el contra-
rio, muestra que una mutacin en un componente
accesorio del mecanismo de transcripcin (SRBW)
tiene efectos mucho ms restringidos y provoca in-
crementos en la expresin de algunos genes.
La extensin de esta tecnologa a las clulas
animales permitir que las descripciones generales
basadas en el anlisis de hibridacin del RNA sean
remplazadas por descripciones exactas de los genes
expresados y de las abundancias de sus productos,
en cualquier tipo de clula dado. Un mapa de expre-
sin gnica de D. melanogster detecta actividad de
transcripcin en alguna etapa del ciclo vital en casi
CAPTULO, 5 Secuencias genmicas y nmeros de genes
Idos (93%) los genes pronosticados y muestra que
140% tiene formas alternas de corte y empalme.
Resumen
los genomas secuendados incluyen numerosas hac-
erlas y archaea, levaduras y un gusano, una mosca,
un ratn y al homhre. El nmero mnimo de genes
-
lecesarios para formar una clula viviente (un pa-
sito intracelular obligado) es -470; para una clu-
a de vida libre, ~1 700. Una bacteria gramnegativa
ipica tiene ~1 500 genes. El contenido gnico de las
cepas de E. coli flucta entre 4300 y 5400 genes. El
en bacteriano promedio tiene -1 000 hp de longi-
ud y se separa del siguiente por un espado de ~ 100
p
. Las levaduras S. pombe y S. cerevisiae tienen 5 000
6 000 genes, respectivamente.
Aunque la mosca D. melanogaster es un organis-
mo ms complejo y tiene un genoma ms grande
que el del gusano C. elegans, la mosca tiene menos
genes (13 600) que el gusano (18 500). La plan-
a Arabidopsis tiene 25 000 genes y que no hay una
-
elacin clara entre el tamao del genoma y el n-
nero de genes se demuestra porque el genoma del
arroz es cuatro veces ms grande, pero contiene slo
un incremento de 50% en el nmero de genes, a
-
40 000. El ratn y el hombre tienen de 20 000 a
h) 000 genes, cantidades mucho menores de lo espe-
jado
. La complejidad del desarrollo de un organismo
j uede depender de la naturaleza de las interacciones
entre los genes, as como de su nmero total.
En las procariotas y en las eucariotas, aproxima-
lamente 8 000 genes son comunes, y probablemen-
E estn implicados en funciones bsicas. En otros
rganismos multicelulares se pueden encontrar
12 000 genes. Para formar un animal, se agregan
:
ros 8 000, y 8 000 ms (profundamente relacio-
pados con el sistema nervioso y el inmunolgico) se
encuentran en los vertebrados. En los organismos
rayo genoma ha sido secuenciado, slo el 50% de
os genes tiene funciones definidas. El anlisis de
enes letales siguiere que slo una minora de genes
es esencial para cada organismo.
Las secuencias que constituyen un genoma
eucaritico pueden clasificarse en tres grupos: las
secuencias no repetitivas son nicas; las secuencias
Boderadamente repetitivas estn dispersas y se re-
piten pocas veces como copias relacionadas, pero
I ' idnticas, y las secuencias muy repetitivas son
cortas
, y se repiten como matrices en tndem. Las
rroporciones de los tipos de secuencias son caracte-
-
sticas de cada genoma, aunque los genomas ms
randes tienden a presentar una proporcin menor
|e DNA no repetitivo. Aproximadamente el 50%
del genoma humano consta de secuencias repeti-
.
as, de las cuales, la gran mayora corresponde
a secuencias de transposones. La mayor parte de
los genes estructurales se localiza en el DNA no re-
petitivo, cuya complejidad es mejor indicador de la
complejidad del organismo que la complejidad total
del genoma; el DNA no repetitivo llega a tener una
complejidad mxima de ~2 x 10
9 b
p
.
Los genes se expresan en muy diversos nive-
les, de modo que puede haber 105 copias de RNAm
de un gen abundante cuya protena es el producto
principal de la clula; 103 copias de cada RNAm de
<10 mensajes moderadamente abundantes, y <10
copias de cada RNAm de >10 000 genes escasamen-
te expresados. Las superposiciones entre poblacio-
nes de RNAm de clulas con diferentes fenotipos
son frecuentes; la gran mayora de las molculas de
RNAm se encuentran en la mayora de las clulas.
La herencia no mendeliana se explica por la
presencia de DNA en organelos localizados en el
citoplasma. Las mitocondrias y los cloroplastos re-
presentan a sistemas delimitados por membranas
en los cuales algunas protenas son sintetizadas en
el organelo, mientras que otras son importadas. El
genoma de los organelos suele ser un DNA circular
que codifica a todos los RNA y a algunas de las pro-
tenas que necesita.
El tamao de los genomas mitocondriales vara
mucho, desde el genoma minimalista de los mam-
feros, de 16 kb hasta el de 570 kb de las plantas su-
periores. Se supone que los genomas ms grandes
codifican funciones adicionales. Los genomas de los
cloroplastos oscilan entre 120 y 200 kb; los que han
sido secuendados, tienen una organizacin y funcio-
nes codificadoras similares. Tanto en las mitocondrias
como en los cloroplastos, muchas de las protenas
mayores contienen algunas subunidades sintetizadas
en el organelo y otras importadas del citosol.
Las molculas de DNA de los mamferos se trans-
criben a un solo transcrito de la banda codificadora
principal, en tanto que los productos individuales se
generan por procesamiento de RNA. En las levadu-
ras, las reestructuraciones son bastante frecuentes
en el DNA mitocondrial, adems de que se han en-
contrado recombinaciones entre genomas mitocon-
driales o genomas de cloroplastos. Las transferencias
de DNA han tenido lugar de los cloroplastos o las
mitocondrias a los genomas nucleares.
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Referencias
Agrupamientos y repeticiones
ESQUEMA DEL CAPTULO
hm Introduccin
aa La duplicacin de Los genes es una fuerza
importante en la evolucin
.
Los genes duplicados suelen separarse para dar lugar a
genes diferentes o bien una de las copias se torna inactiva
MXM Los agrupamientos de globinas se forman por
duplicacin y por divergencia
.
Todos los genes de las globinas descienden por duplicacin
y mutacin de un gen ancestral que tena tres exones.
.
El gen ancestral dio origen a la mioglobina, la
leghemoglobina y las globinas a y P
.
Los genes de las globinas a y P se separaron al principio
del periodo de evolucin de los vertebrados; despus, las
duplicaciones generaron agrupamientos individuales de
genes similares a los genes a y p.
.
Una vez que un gen ha sido desactivado por una mutacin,
puede acumular ms mutaciones y convertirse en un
seudogn homlogo al gen activo o los genes activos, pero
que no tiene actividad funcional.
WMM La divergencia secuencial es la base del reloj
evolutivo
.
Las secuencias de genes homlogos en especies diferentes
varan en los sitios de remplazo (donde las mutaciones
causan sustituciones de aminocidos) y en los silenciosos
(donde una mutacin no afecta a la secuencia protenica).
.
Las mutaciones se acumulan en los sitios silenciosos ~10
veces ms rpido que en los de remplazo.
.
La divergencia evolutiva entre dos protenas es medida por
el porcentaje de posiciones en que difieren los aminocidos
correspondientes.
.
Las mutaciones se acumulan ms o menos a una misma
velocidad despus de que los genes se separan, de manera
que la divergencia entre cualquier par de secuencias de
globina es proporcional al tiempo transcurrido desde la
separacin de sus genes.
ilUM La velocidad de sustitucin neutral puede ser medida
a partir de la divergencia de secuencias repetidas
.
La velocidad de sustitucin por ao en sitios neutrales es
mayor en el genoma del ratn que en el humano.
USEM Los seudogenes son callejones sin salida de la
evolucin
.
Los seudogenes carecen de funcin codificadora, sin embargo,
pueden ser reconocidos por similitudes secuendales con los
genes funcionales existentes. Surgen de la acumulacin de
mutaciones en genes (anteriormente) funcionales.
ESfl Mediante entrecruzamiento desigual se
reestructuran los agrupamientos de genes
.
Cuando un genoma contiene un agrupamiento de genes
con secuencias relacionadas, el apareamiento errneo
entre genes no allicos puede causar un entrecruzamiento
desigual, de modo que se produce una delecin
en un cromosoma recombinante y una duplicacin
correspondiente en el otro,
.
Las talasemias diferentes son causadas por varias deleciones
en que se elimina el gen de la globina a o el de la p. La
gravedad de la enfermedad depende de cada delecin.
Los genes del RNAr forman repeticiones en tndem
.
El RNA ribosmico es codificado por un nmero
considerable de genes idnticos que se repiten en tndem
para formar uno o ms agrupamientos.
.
Los agrupamientos de DIMAr se organizan de manera
tal, que las unidades de transcripcin que resultan en
un precursor unido a los RNAr principales alternan con
espaciadores no transcritos.
ana Los genes repetidos de RNAr mantienen una
secuencia constante
.
Todos los genes de un agrupamiento de DNAr tienen
secuencias idnticas.
Los espaciadores no transcritos consisten en unidades
repetidoras ms cortas cuyo nmero vara, de modo que la
longitud de cada esoaciador es diferente.
mmum La fijacin entrecruzada podra mantener
repeticiones idnticas
.
Un entrecruzamiento desigual cambia el tamao de un
agrupamiento de repeticiones en tndem.
.
Las unidades de repeticin pueden eliminarse o repartirse
entre los agrupamientos.
uimtm Los DNA satlite a menudo estn en La
heterocromatina
.
La secuencia de repeticin del DNA altamente repetitivo es
muy corta y no tiene funcin codificadora.
.
Se presenta en grandes bloques que pueden tener
propiedades fsicas diferentes.
.
Suele ser el constituyente principal de la heterocromatina
centromrica.
wmtm Los satlites de los artrpodos tienen repeticiones
idnticas muy cortas
.
La longitud de las unidades de repeticin de los DNA satlite
de los artrpodos es de slo unos cuantos nucletidos. La
mayoria de las copias de la secuencia son idnticas.
.UBI Los satlites de Los mamferos constan de
repeticiones jerrquicas
.
El DNA satlite del ratn ha evolucionado por duplicacin y
mutacin de una unidad de repeticin corta para dar origen
a una unidad de repeticin bsica de 234 bp en la que
pueden ser reconocidas la mitad, la cuarta parte y la octava
parte de la repeticin original.
mmum Los minisatlites facilitan el mapeo gentico
.
La variacin entre los microsatlites o minisatlites de los
genomas permite identificar la herencia inequvocamente, pues
demuestra que el 50% de las bandas de un individuo derivan
de un progenitor especifico,
mmvm Resumen
Introduccin
la familia de genes es un agrupamiento consti-
tuido por descendientes por duplicacin y variacin
de algn gen ancestral cuyos miembros se agrupan
O dispersan en diferentes cromosomas (o ambos).
El anlisis del genoma muestra que muchos genes
pertenecen a familias, por ejemplo, los 25 000 del
genoma humano identificados estn en -15 000 fa-
milias, as que el gen promedio tiene varios parientes
en el genoma (vase la Fig. 5.7). Las familias de genes
varan mucho en cuanto a grado de relacin entre
sus miembros, desde las que constan de mltiples
miembros idnticos hasta aquellas en que la relacin
es bastante lejana. En general, los genes se relacionan
nicamente por sus exones, pues sus intrones se han
separado (vase la seccin 3.5, Las secuencias de los
exones se conservan, pero las de los intrones varan).
Los genes tambin pueden estar relacionados slo
por algunos de sus exones, mientras que otros son
nicos (vase la seccin 3.9, Algunos exones pueden
equipararse con funciones protenicas).
El evento inicial que permite que los exones o
los genes relacionados se desarrollen es una dupli-
cacin
, es decir, que de alguna secuencia del geno-
ma se genera una copia. La duplicacin en tndem
i cuando las duplicaciones permanecenjuntas) pue-
de provocar algunos errores de duplicacin o de re-
combinacin. La separacin de los duplicados puede
tener lugar por una translocacin que transfiere
material de un cromosoma a otro. Un duplicado
en una ubicacin nueva tambin puede ser produ-
cido directamente por un evento de transposicin
asociado con la copia de una regin de DNA de los
alrededores del transposn. La duplicacin se aplica
tanto a genes intactos como a colecciones de exo-
nes, incluso a exones individuales. Cuando se trata
de un gen intacto, la duplicacin genera dos co-
pias cuyas actividades son indistinguibles, en cuyo
caso, normalmente las copias difieren a medida que
van acumulando mutaciones diferentes
.
Los miembros de una familia de genes estructu-
rales bien relacionados suelen tener funciones rela-
cionadas, incluso idnticas, a pesar de que pueden
ser expresadas en diferentes momentos o en dife-
rentes tipos de clulas. As pues, en los eritrocitos
de embriones y en los eritrocitos adultos se expre-
san protenas diferentes de globina, mientras que
en las clulas musculares y en las no musculares se
utilizan diferentes actinas. Cuando los genes se se-
paran significativamente, o cuando slo algunos de
los exones estn relacionados, las protenas pueden
:ener diferentes funciones.
Algunas familias de genes estn formadas por
miembros idnticos, y el agrupamiento es un re-
quisito previo para que lo sigan siendo, a pesar de
que los genes agrupados no son necesariamente
idnticos. Los agrupamientos de genes van del
caso en que una duplicacin ha generado dos genes
relacionados adyacentes hasta casos en que cientos
de genes idnticos yacen en una matriz en tndem;
esta ltima puede ser frecuentsima si se necesitan
cantidades inusualmente grandes del producto, por
ejemplo, los genes de los RNAr o de las histonas.
Este fenmeno da lugar a una situacin especial
respecto del mantenimiento de la identidad y los
efectos de la presin selectiva.
Los agrupamientos de genes representan una
oportunidad para examinar a las fuerzas implica-
das en la evolucin del genoma en regiones ms
amplias que un gen. Las secuencias duplicadas, es-
pecialmente las que permanecen en la misma rea,
proporcionan el sustrato para una evolucin poste-
rior por recombinacin. Una poblacin evoluciona
mediante la recombinacin clsica ilustrada en las
y , en las cuales tiene lugar un entre-
cruzamiento exacto. Los cromosomas recombinan-
tes estn organizados de la misma manera que el
cromosoma progenitor, contienen exactamente los
mismos loci, en el mismo orden, pero las combina-
ciones de alelos difieren y proporcionan la materia
prima para la seleccin natural. De cualquier for-
ma, la existencia de secuencias duplicadas permite
eventos aberrantes ocasionales que modifican el
contenido de los genes y no slo la combinacin
de los alelos.
El entrecruzamiento desigual (o recombina-
cin no recproca) describe un evento de recombi-
nacin entre dos sitios no homlogos. La caracters-
tica que hace posible estos eventos es la existencia de
secuencias repetidas. En la .3 se observa que
esto permite que, en un cromosoma, la copia de una
El entrecruzamiento ocurre en la etapa
de cuatro cadenas
Bivalente
contiene 4 cromtidas,
2 de cada progenitor
Quiasma
es provocado por
entrecruzamiento entre
dos de las cromtidas
A
a
a
B
mB
= b
b
i
A
Ai
a
a
Dos cromosomas siguen
siendo progenitores (AB y ab).
Los cromosomas recombinantes
contienen material de cada
progenitor y nuevas
combinaciones genticas (Ab y aB]
a
i
A
A,
B
b
.
B
. La formacin del quiasma representa ia generacin
de recombinantes.
5.
1 Introduccin
Los recombinantes tienen DNA hbrido
Molculas de DNA progenitor
rmmimimimi
I
Recombinacin intermedia
LLL
liiTi.iii..
i
Recombinantes
irrrtrHRHiiiiii
nmilili
La recombinacin implica apareamientos entre
las cadenas complementarias de los dos DNA dplex proge-
nitores.
o desigual cambia
el nmero de repeticiones
ABCA
ABCBCBEABS
ABCABCABCABCAB CABCABCABCABCABC
ABCABCAB CABCABCABC
El entrecruzamiento desigual resulta del apa-
reamiento entre repeticiones no equivalentes en regiones de
DNA formadas por unidades de repeticin. Aqu la unidad
de repeti-cin es la secuencia ABC, y la tercera repeticin
del cromosoma azul se ha alineado con la primera repeticin del
cromosoma negro. En toda la regin de apareamiento,
las uni-
dades ABC de un cromosoma estn alineadas con las del otro. El
entrecruzamiento genera cromosomas con diecisis repeticiones
cada uno, y no ocho de cada progenitor.
repeticin se desalinee y se recombine con una copia
diferente de la repeticin en el cromosoma homlogo
y no con la copia correspondiente. Cuando sucede la
recombinacin, aumenta el nmero de repeticiones en
un cromosoma y disminuye en el otro. De hecho,
un cromosoma recombinante sufre una deledn y el
otro una insercin. Este mecanismo es responsable
de la evolucin de los agrupamientos de secuencias
relacionadas, y es posible rastrear su operacin con-
trayendo o expandiendo el tamao de una matriz
en los agrupamientos de genes y en las regiones de
DNA muy repetido.
La fraccin del genoma que se repite mucho
est formada por mltiples copias en tndem de
unidades de repeticin muy cortas, que suelen tener
propiedades inusuales, una de las cuales es que en
un anlisis de gradiente de densidad de DNA pue-
den ser identificadas como un pico independien-
te, lo cual da lugar al nombre de DNA satlite. A
menudo se relacionan con regiones inertes de los
cromosomas, en particular los centrmeros (que
contienen los puntos de unin para la segregacin
en un huso mittico o meitico). Como resultado
de su organizacin repetitiva, presentan parte del
mismo comportamiento respecto de la evolucin
que los agrupamientos de genes en tndem. Ade-
ms de las secuencias satlites
, fragmentos ms pe-
queos de DNA, llamados minisatlites, muestran
un comportamiento similar, y permiten mostrar un
alto grado de divergencia entre genomas especficos
que pueden ser usados con fines de mapeo.
Estos eventos que modifican la constitucin
del genoma son raros, pero importantes, durante
la evolucin.
WTi La duplicacin de los genes
es una fuerza importante
en la evolucin
Concepto principal
Los genes duplicados suelen separarse para dar lugar
a genes diferentes o bien una de las copias se torna
inactiva.
Los exones se comportan como mdulos para cons-
truir genes probados en varias combinaciones en el
curso de la evolucin. En un extremo
,
un exn in-
dividual de un gen puede ser copiado y utilizado en
otro; en el otro extremo, un gen completo, incluidos
exones e intrones, puede ser duplicado. En tal caso,
las mutaciones suelen acumularse en una copia sin
atraer la atencin adversa de la seleccin natural
,
de modo que esta copia puede evolucionar a una
nueva funcin, expresarse en un lugar o tiempo
distintos a los de la primera copia, o bien, asumir
actividades diferentes.
En la FIGURA 6. : se resume la visin actual del
ritmo a que ocurren estos procesos. La probabilidad
de que determinado gen sea incluido en una dupli-
cacin en un periodo de un milln de aos es de
-
1%, y despus de que el gen se ha duplicado, las
diferencias desarrolladas son resultado de las mu-
taciones ocurridas en cada copia, las cuales se acu-
mulan a una velocidad de -0.1% en un milln de
CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
Los genes duplicados pueden divergir
o ser silenciados
La duplicacin ocurre a 1%/gen/milln de aos
La divergencia se acumula a 0.1%/milln de anos
El silenciamiento de una copia toma ~4 millones de aos
Activo Silencioso
FIGURA 6.4 Despus de que un gen ha sido duplicado, las
diferencias pueden acumularse entre las copias. Los genes pue-
z=n adquirir funciones diferentes, o una de las copias tornarse
'-
activa.
;
os (vase la seccin 6.4, La divergencia secuencial
es la base del reloj evolutivo).
No es probable que el organismo necesite re-
tener dos copias idnticas del gen, de modo que
a medida que se desarrollan diferencias entre los
enes duplicados, es probable que suceda uno de
estos dos eventos:
.
Ambos genes se vuelven necesarios porque
las diferencias entre ellos generan protenas
con diferentes funciones o porque se expre-
san especficamente en lugares y momentos
distintos.
.
De no ser as, es probable que uno de los
genes sea eliminado porque haya adquiri-
do una mutacin deletrea y no habr una
seleccin adversa para eliminar dicha copia,
fenmeno que habitualmente toma ~4 mi-
llones de aos. En dicha situacin, es mera-
mente una cuestin de probabilidad cul de
las copias se desactiva (lo cual puede contri-
buir a la incompatibilidad entre individuos,
y,
en ltima instancia, a la evolucin de las
especies, si diferentes copias se tornan inac-
tivas en distintas poblaciones).
El anlisis de la secuencia del genoma huma-
no muestra que -5% comprende duplicaciones de
segmentos identificables cuya longitud oscila entre
10 y 300 kb. El nmero de dichas duplicaciones se
ha elevado recientemente porque no ha habido su-
ficiente tiempo como para que la divergencia entre
-
ellas elimine su relacin; incluyen una parte propor-
cional (de -6%) de los exones expresados, lo cual
demuestra que las duplicaciones estn sucediendo
ms o menos a pesar del contenido gentico. Los ge-
nes de estas duplicaciones pueden ser especialmente
interesantes por la implicacin de que su evolucin
es reciente y, por lo tanto, pueden ser importantes
para desarrollos evolutivos no demasiado lejanos
(como la separacin del hombre del mono).
Los agrupamientos de Las
globinas son formados por
d
uplicacin y por divergencia
Conceptos principales
Todos los genes de las globinas descienden por
duplicacin y mutacin de un gen ancestral que tena
tres exones.
El gen ancestral dio origen a la mioglobina, la
leghemoglobina y las globinas a y (3.
Los genes de las globinas a y (3 se separaron al
principio del periodo de evolucin de los vertebrados;
despus, las duplicaciones generaron agrupamientos
individuales de genes similares a los genes a y [3.
Una vez que un gen ha sido desactivado por una
mutacin, puede acumular ms mutaciones y
convertirse en un seudogn homlogo al gen activo
o los genes activos, pero que no tiene actividad
funcional.
El tipo ms comn de duplicacin genera una segunda
copia del gen cerca de la primera. En algunos casos,
ambas copias permanecen asociadas y la duplicacin
posterior puede generar un agrupamiento de genes
relacionados. El ejemplo mejor caracterizado de un
agrupamiento de genes es el de los genes de globina,
que constituyen una familia de genes antigua impli-
cada en una funcin clave para el reino animal, el
transporte de oxgeno por el torrente sanguneo.
El constituyente mayor de los eritrocitos es el
tetrmero de globina que se asocia con su grupo
hem (de unin al hierro) en forma de hemoglobina.
Los genes funcionales de globina tienen la misma
estructura general en todas las especies, estn di-
vididos en tres exones ya ilustrados en la Figura
3
.
7
. Se llega a la conclusin de que todos los genes
de las globinas derivan de un solo gen ancestral, y
siguiendo el desarrollo de los genes individuales de
globina en una especie, o en especies diferentes, se
llegan a conocer los mecanismos involucrados en la
evolucin de las familias de genes.
En las clulas adultas, el tetrmero de globina
consiste en dos cadenas a idnticas y dos cadenas (3
idnticas. Las clulas sanguneas de los embriones
contienen tetrmeros de hemoglobina distintos de
6
.3 Los agrupamientos de las globinas son formados por duplicacin y por divergencia
Los genes de globna estn organizado
en dos agrupamientos
Civo aoj a,
e G
y
\|/p 5 p
Agrupamiento a
Agrupamiento (5
10 20 30 40 50 kb
Gen funcional
"
Seudogn
FIGURA 6.5 Cada una de las familias de genes de globina
tipo a y tipo [3, est organizada en un solo agrupamiento que
incluye genes funcionales y seudogenes (\|/).
La expresin de la hemoglobina cambia
durante el desarrollo
Embrionario (<8 semanas): protenas e 2 2 C2Y2 a2e 2
5 a a.
y y
Fetal (3-9 meses): protenas 0 72
a a
I D D
T Y
Aduito (desde ei nacimiento): protenas a S, a2p2
a a
5 P
Gen funcional
Gen activo
Seudogn
FIGURA 6.6 Durante el periodo embrionario, el fetal y el adul-
to del desarrollo humano se expresan genes de hemoglobina
diferentes.
los de la forma adulta, pues cada tetrmero consta
de dos cadenas idnticas tipo a y dos cadenas idn-
ticas tipo (3 , cada una de las cuales est relacionada
con el polipptido adulto y posteriormente es rem-
plazada por l. ste es un ejemplo del control del
desarrollo, en el cual diferentes genes se activan y
desactivan sucesivamente para proporcionar pro-
ductos alternos que realicen las mismas funciones
en momentos diferentes.
La divisin de las cadenas de globina en tipo a
y tipo P refleja la organizacin de los genes; cada
tipo de globina es codificado por genes organizados
en un solo agrupamiento. Las estructuras de los dos
agrupamientos del genoma de los primates superio-
res se ilustran en la TIGURA 6.5.
Con una extensin de ms de 50 kb, el agrupa-
miento p contiene cinco genes funcionales (e, dos y,
5 y p) y un gen no funcional (VP)- La secuencia co-
dificadora de los dos genes y difiere en slo un ami-
nocido, la variante G tiene glicina en la posicin
136, mientras que la variante A tiene alanina.
La longitud del agrupamiento a ms compacto
tiene ms de 28 kb e incluye un gen activo , un
gen no funcional, dos genes a, dos genes a no
funcionales y el gen 0, cuya funcin se desconoce.
Los dos genes a codifican a la misma protena. Dos
(o ms) genes idnticos en el mismo cromosoma se
describen como copias no allicas.
Los detalles de la relacin entre la hemoglobina
embrionaria y la adulta varan en funcin del or-
ganismo. En el humano, la ruta tiene tres etapas,
embrionaria, fetal y adulta. La distincin entre em-
brionaria y adulta es comn en todos los mamferos,
pero vara el nmero de etapas previas a la adultez.
En el hombre, y a son dos cadenas tipo a, en tanto
que e, y, 8 y P son tipo p. En la ' GURA 6.6 se muestra
cmo se expresan las cadenas en diferentes etapas
del desarrollo.
En la ruta del humano, es la primera cade-
na tipo a en ser expresada, pero es rpidamente
remplazada por a. En la ruta p, e y y se expresan
primero y 5 y P los remplazan despus. En el adulto,
la forma a
2
p
2
proporciona 97% de la hemoglobina
y a252, -2%, en tanto que -1% es aportado por la
persistencia de la forma fetal a2j2.
Qu importancia tienen las diferencias entre la
globina embrionaria y del adulto? Las formas em-
brionaria y fetal tienen mayor afinidad con el oxge-
no para obtenerlo de la sangre de la madre, lo cual
explica que no haya un equivalente en el pollo, por
ejemplo, dado que las etapas embrionarias tienen
lugar fuera del cuerpo (es decir, en el huevo).
Los genes funcionales se definen por su expre-
sin en RNA y, en ltima instancia, por las protenas
a las cuales codifican. Los genes no funcionales se
definen como tales por su incapacidad para codifi-
car protenas por diferentes razones; las deficiencias
pueden estar en la transcripcin o la traduccin (o
en ambas). A estos genes se les denomina seudo-
genes y se indican mediante el smbolo V)/. Una
organizacin general similar se encuentra en otros
agrupamientos de genes de globina de vertebrados,
pero los detalles en cuanto a tipo, nmero y orden
de los genes vara como se ilustra en la FIGURA 6.7.
Cada agrupamiento contiene genes tanto embrio-
narios como adultos, y su longitud total vara am-
pliamente. El ms largo se encuentra en la cabra, en
donde un agrupamiento bsico de 4 genes se ha du-
plicado 2 veces. La distribucin de los genes activos
y los seudogenes difiere en cada caso, lo cual ilustra
la naturaleza fortuita de la conversin de una copia
de un gen duplicado al estado de inactividad.
La caracterizacin de estos agrupamientos de
genes conduce a un punto general importante: una
102
CAPTULO 5 Agrupamientos y repeticiones
Los agrupamiento de globina varan entre especies
Cabra
el e
I"

IV
X|/PPA E
V
VVPPB
0 ' ' n ' ri' n t t) U
~
U "U Ll D '
Ratn
vPho Phl Vh2 Vhj p
maj
3mn
Conejo O
(
T
I
7 VP
D.
P
Genes embrionarios: e/y
Genes adultos: p
Pollo
p PH p e
- - "
'
-
!
10 20 30 40 50
60 70 80 90 100
FIGURA 6,7 En los vertebrados se encuentran agrupamientos de genes de globina (3 y
seudogenes. Siete genes de ratn incluyen dos genes embrionarios tempranos, un gen
embrionario tardo, dos genes adultos y dos seudogenes. El conejo y el pollo tienen
cuatro genes cada uno.
-
.ilia de genes puede tener ms miembros, tanto fundo-
males como no funcionales, de lo que sospecharamos con
. .se en el anlisis protenico. Los genes funcionales
iiicionales pueden representar duplicaciones que
-
edifican a polipptidos idnticos o estar relaciona-
dos con las protenas conocidas, pero de diferente
:
nina (y presumiblemente se expresan slo de for-
~
.a breve o en cantidades bajas).
Respecto de la interrogante sobre cunto DNA
:
g necesita para codificar a una funcin en parti-
cular, se observa que la codificacin de las globi-
nas tipo p requiere de un rango de 20 a 120 kb
;
n distintos mamferos, mucho ms de lo que se
esperara slo de analizar las protenas conocidas
de la globina p, incluso del anlisis de cada gen. De
palquier forma, los agrupamientos de este tipo no
ion comunes; la mayora de los genes se encuentran
como loci individuales.
A partir de la organizacin de los genes de la
globina en una variedad de especies, debera ser
posible rastrear la evolucin de los actuales agru-
pamientos de genes de globina partir de un solo
gen ancestral de globina. La perspectiva actual de la
ascendencia evolutiva se ilustra en la FIGURA 6.8.
El gen de leghemoglobina de las plantas, rela-
cionado con los genes de la globina, podra repre-
sentar a la forma ancestral. Lo ms que es posible
remontarse en cuanto a un gen de globina en su
forma moderna depende de la secuencia de la ca-
dena individual de la mioglobina de los mamferos,
m cual se separ de la lnea de ascendencia de la
lobina hace -800 millones de aos. El gen de la
mioglobina tiene la misma organizacin que los
genes de globina, de modo que es posible tomar
fe estructura de tres exones para representar a su
ancestro comn.
Los genes de globina se han duplicado
y han di
Agrupamientos separados
(mamferos y aves)
Pl P2
! ! !1 !
Expansin de (os
sgrupamientos
Separacin de
los genes
1111*1
al > 0.2
7
a m I
/
Duplicacin y
divergencia
0E
/
i a i
Fusin de
exones
lili
Genes a, p
ligados
(anfibios y peces)
Gen de globina
individual
(lamprea y mixino)
Globina ancestral
(mioglobina)
Leghemogiobina
700 600 500 400 300 200 100
Millones de aos
FIGURA 6.& Todos los genes de globina han evolucionado por
una serie de duplicaciones, transposiciones y mutaciones de
un solo gen ancestral.
Algunos "peces primitivos" tienen slo un tipo
de cadena de globina, as que deben haberse sepa-
rado de la lnea de la evolucin antes de que el gen
6
.3 Los agrupamientos de las globinas son formados por duplicacin y por divergencia
103
de globina ancestral se duplicara para dar lugar a
las variantes a y (3, lo cual aparentemente ocurri
hace -500 millones de aos, durante la evolucin
de los osteictios.
La siguiente etapa de la evolucin est repre-
sentada por el estado de los genes de globina de la
rana Xenopus laevis, que tiene dos agrupamientos de
genes de globina. No obstante, cada agrupamiento
tiene ambos genes, a y p, tanto de tipo larvario como
adulto, de modo que el agrupamiento debe haber
evolucionado por duplicacin de un par aP ligado,
seguida de la divergencia entre cada copia. Ms tar-
de, el agrupamiento entero se duplic.
Los anfibios se separaron de la lnea de mam-
feros/aves hace -350 millones de aos, as que la
separacin de los genes de globina a y p debe haber
resultado de una transposicin en la lnea predece-
sora de mamferos/aves despus de dicho periodo,
lo cual probablemente ocurri en las primeras eta-
pas de la evolucin de los vertebrados. Tanto en
aves como en mamferos hay agrupamientos inde-
pendientes de globinas a y p, de modo que los ge-
nes alfa y beta deben haberse separado fsicamente
antes de que mamferos y aves divergieran de su
ancestro comn, evento ocurrido probablemente
hace -270 millones de aos.
Los cambios sucedidos en los agrupamientos a
y |3 son ms recientes, como se ver a partir de la
descripcin de la divergencia de cada gen en la si-
guiente seccin.
H La divergencia secuenciat
es La base del reloj evolutivo
Conceptos principales
.
Las secuencias de genes homlogos en especies
diferentes varan en Los sitios de remplazo (donde las
mutaciones causan sustituciones de aminocidos) y
en los silenciosos (donde una mutacin no afecta a la
secuencia proteinica).
.
Las mutaciones se acumulan en los sitios silenciosos
~
10 veces ms rpido que en los de remplazo.
.
La divergencia evolutiva entre dos protenas es medida
por el porcentaje de posiciones en que difieren los
aminocidos correspondientes.
.
Las mutaciones se acumulan ms o menos a una
misma velocidad despus de que los genes se separan,
de manera que la divergencia entre cualquier par
de secuencias de globina es proporcional al tiempo
transcurrido desde la separacin de sus genes.
La mayor parte de los cambios de las secuencias
protenicas se debe a mutaciones pequeas que se
acumulan lentamente con el tiempo. Las mutacio-
nes puntuales y las inserciones y deleciones peque-
as son aleatorias, quiz ms o menos con la misma
probabilidad en todas las regiones del genoma. Las
excepciones son los puntos calientes, en los que las
mutaciones suceden con mucha mayor frecuencia.
Casi todas las mutaciones que modifican la secuen-
cia de aminocidos son deletreas y sern elimina-
das por seleccin natural.
Pocas mutaciones son provechosas, y cuando
ocurre una inusual, es muy probable que se ex-
tienda entre la poblacin, remplazando de modo
eventual a la secuencia anterior. Cuando una nueva
variante remplaza a la versin previa del gen, se dice
que se ha fijado en la poblacin.
Un aspecto controvertido es qu proporcin
de mutaciones de una secuencia de aminocidos
es neutral, es decir, sin efecto en la funcin de las
protenas y, por lo tanto, susceptible de acumularse
como resultado del flujo aleatorio y de la fija-
cin.
La velocidad a la cual se acumulan los cam-
bios derivados de mutaciones es caracterstica de
cada protena, y presumiblemente depende, por lo
menos en parte, de su flexibilidad respecto del cam-
bio. En una especie, una protena evoluciona por
sustitucin de mutaciones, seguida de delecin o
de fijacin en el acervo de reproduccin individual.
Cabe recordar que cuando se escudria el acervo
gentico de una especie, se ven slo las variantes que
han sobrevivido. Cuando mltiples variantes estn
presentes, puede que sean estables (porque ningu-
na tiene una ventaja selectiva), o de hecho, una
podra ser transitoria porque est en proceso de ser
desplazada.
Cuando una especie se divide en dos nuevas
especies, cada una de las resultantes constituye un
acervo independiente para la evolucin. Al compa-
rarse las protenas correspondientes de dos especies,
se ven las diferencias acumuladas desde el momento
en que sus ancestros dejaron de hibridarse. Algunas es-
tn muy conservadas y muestran pocos cambios,
o ninguno, de especie a especie, lo cual indica que
casi cualquier cambio es deletreo y, por lo tanto,
no seleccionado.
La diferencia entre dos protenas se expresa
como su divergencia, el porcentaje de posiciones
en que difieren los aminocidos. La divergencia en-
tre protenas puede ser diferente de la divergencia
entre las secuencias de cido nucleico correspon-
dientes, debido a la representacin de cada amino-
cido en un codn formado por tres bases, en el cual,
a menudo la tercera no incide en el significado.
La secuencia nucleotdica de una regin codi-
ficadora puede dividirse en sitios de remplazo y
sitios silenciosos potenciales:
104
CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
.
En los sitios de remplazo, una mutacin mo-
difica al aminocido codificado. El efecto de
la mutacin (deletreo, neutral o beneficio-
so) depende del resultado del remplazo del
aminocido.
.
En los sitios silenciosos, la mutacin slo
sustituye a un codn sinnimo por otro, de
modo que la protena no se modifica. En
general, los sitios de remplazo representan
el 75% de una secuencia codificadora y los
silenciosos, el 25 por ciento.
Adems de la secuencia codificadora, un gen
contiene regiones no traducidas, en cuyo caso, las
mutaciones son tambin potencialmente neutras,
aparte de sus efectos en la estructura secundaria
en general, ms bien corta) o en las seales regu-
-doras.
A pesar de que las mutaciones silenciosas son
neutrales respecto de la protena, pueden afectar
!a expresin gnica por el cambio de secuencia del
?
.NA. Por ejemplo, un cambio en la estructura se-
cundaria puede influir en la transcripcin, el pro-
cesamiento o la traduccin. Otra posibilidad es que
un cambio en codones sinnimos requiera de la res-
puesta de un RNAt diferente, de modo que influye
en la eficiencia de la traduccin.
Las mutaciones en los sitios de remplazo de-
jen corresponder a la divergencia de aminocidos
determinada por el porcentaje de cambios en la
secuencia de la protena). Una divergencia de ci-
do nucleico de 0.45% en sitios de remplazo corres-
ponde a una divergencia de aminocidos del 1 %
suponiendo que el nmero promedio de sitios de
remplazo por codn sea de 2.25). De hecho,
la di-
vergencia medida subestima las diferencias ocurri-
das durante la evolucin porque en un codn han
ocurrido muchos eventos, en cuyo caso, normal-
mente se hace una correccin.
Tomando el ejemplo de las cadenas de globina
3y 5 humanas, en 146 residuos hay 10 diferencias,
es decir, una divergencia de 6.9 por ciento. La se-
cuencia de DNA tiene 31 cambios en 441 residuos.
Xo obstante, estos cambios se distribuyen de ma-
nera muy diferente en los sitios de remplazo y los
silenciosos: 11 en 330 sitios de remplazo, pero 20 en
slo 111 silenciosos, lo cual resulta en velocidades
de divergencia (corregidas) de 3.7% en los sitios de
remplazo y de 32% en los silenciosos,
una diferen-
cia de casi un orden de magnitud.
La asombrosa diferencia en la divergencia de
los sitios de remplazo y los silenciosos demuestra
la existencia de coacciones mucho mayores en las
posiciones de los nucletidos que influyen en la
constitucin protenica respecto de aquellos en que
p, de modo que probablemente muy pocos de los
rambios de aminocidos son neutrales.
Supngase que se toma el rango de mutacin
en sitios silenciosos para indicar el rango subyacen-
te de fijacin por mutacin (lo cual supone que no
hay seleccin en los sitios silenciosos), de modo que
en el periodo transcurrido desde la divergencia de
los genes P y 5, debera haber cambios en 32% de los
330 sitios de remplazo, para un total de 105. Todos,
menos 11, han sido eliminados, lo cual significa que
-
90% de las mutaciones no sobrevivieron.
La divergencia entre cualquier par de secuen-
cias de globina es (ms o menos) proporcional al
tiempo que llevan separadas, lo cual proporciona
un reloj evolutivo que mide la acumulacin de
mutaciones a un ritmo aparentemente constante
durante la evolucin de una protena dada.
La velocidad de divergencia puede ser medida
como la diferencia porcentual por milln de aos,
o
como su recproco, la unidad de periodo evolutivo
(UEP, unit evolutionary period), el tiempo en millo-
nes de aos que tarda en desarrollarse el 1% de
divergencia. Una vez establecido el reloj por com-
paraciones pareadas entre especies (recurdense las
dificultades prcticas para establecer el tiempo real
de la evolucin de las especies), puede aplicarse a
genes relacionados dentro de una especie. A partir
de su divergencia se podr calcular el tiempo trans-
currido desde la duplicacin que los gener.
Comparando las secuencias de genes homlogos
en diferentes especies, podr determinarse la veloci-
dad de divergencia tanto en sitios de remplazo como
en sitios silenciosos, segn se ilustra en la FIGURA 6.9,
En las comparaciones pareadas, hay una diver-
gencia promedio de 10% en los sitios de remplazo
de cualquiera de los genes de globina a o P de los
mamferos separados desde la radiacin de los ma-
mferos, ocurrida hace -85 millones de aos
, que
Q 100
o 80
Sitios silenciosos
o 60
a:
40
0)
20
Sitios de remplazo
<D
100 200 300 400 500
Millones de aos de separacin
;
:
La divergencia de Las secuencias de DNA depende
de la separacin evolutiva. Cada punto de la grfica representa
una comparacin de pares.
6
.4 La divergencia secuencial es la base del reloj evolutivo
105
-
a
al
100 50n
200
4C
600 500 400 300 200 100 0
Millones de aos
10 Las divergencias en Los sitios de remplazo entre
pares de genes de gLobina (3 permiten La reconstruccin de la
historia del agrupamiento humano. Este rbol representa
la separacin de las clases de genes de globina.
corresponde a una velocidad de divergencia de rem-
plazo de 0.12% por milln de aos.
La velocidad es estable cuando la comparacin
incluye los genes que se separaron en pocas ms
distantes. Por ejemplo, el promedio de divergencia
de remplazo entre los genes de globina correspon-
dientes de mamferos y pollos es de 23%, que re-
lacionado con una separacin ocurrida hace -270
millones de aos, resulta en 0.09% por milln de
aos.
Remontndose an ms, es posible comparar
los genes de las globinas a y (3 de una especie, los
cuales no han dejado de divergir desde que los ti-
pos de genes individuales se separaron hace 500
millones de aos (vase la Fig. 6.8), de modo que el
promedio de divergencia de remplazo es de -50%,
que resulta en una velocidad de 0.1% por milln
de aos.
En el resumen de estos datos que aparece en la
Figura 6.9, resalta que la divergencia de remplazo
en los genes de globina tiene lugar a una velocidad
promedio de -0.096% por milln de aos (o una
UEP de 10.4). Considerando la incertidumbre en
la estimacin del momento en que las especies se
separaron, los resultados proporcionan un buen res-
paldo a la idea de que existe un reloj lineal.
La informacin sobre la divergencia en los sitios
silenciosos es mucho menos clara. En cada caso es
evidente que es mucho mayor que la divergencia
en los sitios de remplazo, por un factor que flucta
entre 2 y 10. No obstante, la difusin de las diver-
gencias en los sitios silenciosos en comparaciones
pareadas es demasiado grande como para mostrar
si el reloj es aplicable (de modo que las compara-
ciones temporales tienen que basarse en los sitios
de remplazo).
A partir de la Figura 6.9 resulta obvio que la
velocidad de los sitios silenciosos no es lineal res-
pecto del tiempo. Si se supone que la divergencia debe
ser cero a los cero aos de separacin, se observa que la
velocidad de divergencia en los sitios silenciosos es
mucho mayor para los primeros -100 millones de
aos de separacin. Una interpretacin es que una
fraccin de aproximadamente la mitad de los sitios
silenciosos se satura rpidamente de mutaciones (en
unos 100 millones de aos) y se comporta como
los sitios neutrales. La otra fraccin acumula mu-
taciones ms lentamente, a una velocidad aproxi-
madamente igual a la de los sitios de remplazo; esta
fraccin identifica a los sitios silenciosos respecto de
la protena, pero por alguna otra razn, eso sucede
por presin selectiva.
Ahora es posible revertir el clculo de las ve-
locidades de divergencia para estimar el momento
en que los genes de una especie se separaron. La
diferencia entre los genes (3 y 5 humanos es de 3.7%
para los sitios de remplazo. En una UEP de 10.4, es-
tos genes deben haberse separado hace 10.4 x 3.7 =
40 millones de aos, ms o menos en la poca de la
separacin de las lneas que dieron lugar a los mo-
nos del Nuevo Mundo y a los del Viejo Mundo, los
grandes simios, y al hombre. Todos estos primates
superiores tienen tanto genes [3 como 5, lo cual su-
giere que la divergencia gnica comenz justo antes
de este punto de la evolucin.
Remontndose an ms, la divergencia entre
los sitios de remplazo de los genes y y e es de 10%,
lo cual corresponde a un momento de separacin
de hace -100 millones de aos. La separacin en-
tre los genes de globina embrionarios y fetales, pol-
lo tanto, puede haber precedido o acompaado la
radiacin de los mamferos.
En la FIGURA 6.10 se construye un rbol evoluti-
vo de los genes de globina humanos. Las caracters-
ticas que evolucionaron antes de la radiacin de los
mamferos, como la separacin de p/5 de y, deben
encontrarse en todos los mamferos, en tanto que
las que evolucionaron despus, como la separacin
de los genes de las globinas p y 5, deben encontrarse
en lneas especficas de mamferos.
En cada especie han existido cambios compara-
tivamente recientes en cuanto a las estructuras de
los agrupamientos, lo cual se sabe por las diferen-
cias observadas en el nmero (un gen de globina P
adulto en el hombre, dos en el ratn) o el tipo (casi
siempre en funcin de genes embrionarios y fetales
independientes) de los genes.
Cuando se ha reunido suficiente informacin
sobre las secuencias de un gen en particular, pueden
106
CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
r ertirse los argumentos y usar las comparaciones
Bre genes de diferentes especies para evaluar re-
giones taxonmicas.
La velocidad de sustitucin
neutral puede ser medida
a partir de la divergencia
de secuencias repetidas
Concepto principal
La velocidad de sustitucin por ao en sitios neutrales
es mayor en el genoma del ratn que en el genoma
humano.
miembros de una familia repetioa divergen
La mejor manera de estimar la velocidad de sus-
tucin en los sitios neutrales es examinar las se-
uendas que no codifican protenas. (En este caso
7 utiliza el trmino neutral y no silencioso porque
ao hay potencial codificador.) Se obtiene una com-
paracin informativa comparando a los miembros
feuna familia repetitiva comn en los genomas del
~
umano y del ratn.
El principio del anlisis se resume en la
partiendo de una familia de secuencias rela-
cionadas que han evolucionado por duplicacin y
;
:
istitucin de un miembro original de la misma
suponiendo que la secuencia ancestral comn
ruede deducirse tomando la base ms comn en
rada posicin. A partir de ah se puede calcular la
lvergenda de cada miembro especfico de la fami-
Bt como la proporcin de bases que difieren de la
secuencia ancestral deducida. En este ejemplo, la
iivergencia entre miembros individuales va de 0.13
;
0.18, y el promedio es 0.16.
Una familia utilizada para este anlisis en el ge-
. - ma humano y el de ratn deriva de una secuencia
pie supuestamente dej de estar activa por la poca
fe la divergencia entre el hombre y los roedores (la
felmilia LINES [long interspersed repeated sequences];
ase la seccin 22.9, Los retroposones se dividen
Bi tres clases). Esto significa que durante todo ese
'
iempo no ha dejado de divergir sin presin selecti-
\ en ambas especies. La divergencia promedio en
a hombre es de ~0.17 sustituciones por sitio, lo cual
corresponde a un ndice de 2.2 x lO-9 sustituciones
por base por ao en los 75 millones de aos desde
I separacin. Sin embargo, en el genoma del ratn
tiaun ocurrido sustituciones neutrales al doble de esta
velocidad
, es decir, a 0.34 sustituciones por sitio en
Li familia, o a una velocidad de 4.5 x lO-9. Ntese,
sin embargo, que si se calcula la velocidad por gene-
racin y no por ao, sera mayor en el hombre que
r:r el ratn (-2.2 x lO
"
8 f
rente a -lO"9).
gc ;agc tagctt; c-.ttacc gtacgtcat .ttcgg
GCTGGCGTAGGCTACGTTAGCGGTACGTGCATATTGGG
G-TAGGCTAv CTTA G TACCGGT CGTGC iGTTCGG
GGTAGCGTAGCTTGGTTAT-GGTA3GTGGATGTCCGG
GCTArCGTAGi TTACGTTA 'CGGTACGTG I ; IGTTCGG
gc ;a::cc ;agct ;acgttaccgg rACGTGCAm tcg .
CCTAGCCTGGCTTTCGTTAGCGGTACCTGCATGTTCCG
GCT 'GCCTAG" TTACGTTAC GGTACG1 GCATGTTGGG
GC rAGnCTAGGTTACGCGACCGGTACGTGr ATGTc-CGG
7/38 = 0.18
6/38 = 0.16
6/38 = 0.16
6/38 = 0.16
6/38 = 0.16
7/38 = 0.18
7/38 = 0.18
5/38 = 0.13
6/38 = 0.16
Calcula secuencia de consenso
GCTAGCCTAGCTTACGTTACCGGTACGTGCATGTTCGG
Calcula
divergencia
a partir de
la secuencia
de consenso
FIGURA 6. Una secuencia de consenso ancestral para una fa-
milia se calcula tomando la base ms comn de cada posicin.
La divergencia de cada miembro actual existente de la familia
es calculada como la proporcin de bases en que difiere de la
secuencia ancestral.
Probablemente en estas cifras se subestima la
velocidad de sustitucin en el ratn; en el momen-
to de la divergencia, ambas tasas deben haber sido
las mismas y la diferencia debe haber evolucionado
desde entonces. La velocidad actual de sustitucin
neutral por ao en el ratn es probablemente 2 a 3
veces mayor que el promedio histrico. Estas tasas
reflejan el equilibrio entre la ocurrencia de muta-
ciones y la capacidad del sistema gentico del orga-
nismo para corregirlas. La diferencia entre especies
demuestra que cada especie tiene sistemas que fun-
cionan con una eficiencia caracterstica.
Comparar los genomas del humano y del ratn
permite evaluar si las secuencias sintnicas (corres-
pondientes) muestran signos de conservado o han
diferido de la velocidad esperada de acumulacin de
sustituciones neutrales. La proporcin de sitios que
muestra signos de seleccin es -5%, mucho ms
elevada que la proporcin que codifica a protenas
o a RNA (-1%), lo cual implica que el genoma in-
cluye muchos ms fragmentos cuya secuencia es
importante para las funciones no codificadoras, no
para las codificadoras. Los elementos reguladores
conocidos tienden a representar slo una pequea
parte de esta proporcin. Esta cifra tambin sugiere
que la mayor parte de las secuencias del genoma
(es decir, el resto), no tiene ninguna funcin que
dependa de la secuencia exacta.
6.5 La velocidad de sustitucin neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas
107
Los seudogenes son callejones
sin salida de la evolucin
Concepto principal
Los seudogenes no tienen funcin codificadora,
sin
embargo, pueden ser reconocidos por similitudes
secuenciales con los genes funcionales existentes.
Surgen de la acumulacin de mutaciones en genes
(anteriormente) funcionales.
Los seudogenes ( F) se definen por su posesin de
secuencias relacionadas con las de los genes funcio-
nales, pero que no pueden ser traducidas en una
protena funcional.
Algunos tienen la misma estructura general que
los genes funcionales, con secuencias que corres-
ponden a los exones y los intrones en las ubicacio-
nes habituales, pero pueden haberse tornado inac-
tivos por mutaciones que inhibieron una o todas las
etapas de la expresin gnica. Los cambios pueden
abolir las seales de inicio de la transcripcin al im-
pedir el corte y empalme en las uniones exn-in-
trn o terminar la traduccin prematuramente.
En general, un seudogn tiene numerosas mu-
taciones deletreas, pues, presumiblemente, una vez
que dej de estar activo, ya no hubo impedimento
para la acumulacin de mutaciones adicionales. En
varios sistemas se han encontrado seudogenes que
representan versiones inactivas de genes activos ac-
tualmente, entre otros, los de la globina, los de las
inmunoglobulinas y los de los antgenos de histo-
compatibilidad, en los cuales se localizan cerca del
agrupamiento de genes, a menudo intercalados con
los genes activos.
Un seudogn acumula mutaciones desactivadoras
L
-ffExn 1 ! Intrn 1 Exn 2
Intrn 2 EExon 3
Caractersticas del gen activo Cambios en el seudogn
Promotor
r
Mutaciones del promotor D
Empalmes
M
Prdida de los empalmes
Marcos de lectura
Mutacin sin sentido
abiertos
Mutaciones de cambio
de sentido
*
* *
fIGURA 6,12 Desde que un gen de globina (3 se convirti en seudogn,
han ocurrido muchos cambios.
Un ejemplo tpico es el seudogn 2 del co-
nejo, que presenta la organizacin usual de exones
e intrones y se relaciona muy ntimamente con el
gen funcional de globina pl, pero no es funcional.
En la FIGURA 6. i se resumen los mltiples cambios
ocurridos en dicho seudogn. La delecin de un par
de bases en el codn 20 de x,p2 ha dado lugar a un
cambio del marco de lectura que poco despus lle-
var a la terminacin. Numerosas mutaciones pun-
tuales han modificado a codones posteriores que
representan a aminocidos muy conservados en las
globinas p. Ninguno de los dos intrones tiene ya
fronteras reconocibles con los exones, as que pro-
bablemente los intrones no podran ser cortados,
ni siquiera si el gen fuera transcrito. De cualquier
forma, no hay transcritos que correspondan al
gen, quiz porque ha habido cambios en la regin
flanqueante 5'.
Esta lista de defectos incluye mutaciones que
podran impedir cada etapa de la expresin gnica,
por lo tanto, no se cuenta con medios para decir qu
evento desactiv originalmente a dicho gen. Ahora
bien, si se mide la divergencia entre el seudogn y el
gen funcional, ser posible estimar el momento en
que se origin el seudogn y cundo se empezaron
a acumular sus mutaciones.
Si el seudogn se desactiv en cuanto fue ge-
nerado por la duplicacin de pi, se debe esperar
que la velocidad de divergencia tanto en sitios de
remplazo como en sitios silenciosos sea la misma
(diferirn slo si el gen es traducido para crear pre-
sin selectiva en los sitios de remplazo). De hecho,
hay menos sustituciones en los sitios de remplazo
que en los silenciosos, lo cual sugiere que, al princi-
pio (mientras el gen era expresado), hubo seleccin
contra la sustitucin en el sitio de remplazo. A partir
de la extensin relativa de la sustitucin en los dos
tipos de sitio, podemos calcular que lI/p2 se separ
de pl hace -55 millones de aos y sigui siendo un
gen funcional durante 22 millones de aos, pero ha
sido un seudogn durante los ltimos 33 millones
de aos.
Es posible hacer clculos similares para otros
seudogenes. Algunos parecen haber estado activos
por algn tiempo antes de convertirse en seudoge-
nes, en tanto que otros parecen haber estado inac-
tivos desde el momento mismo de su generacin.
El punto general manifestado por las estructuras
de estos seudogenes es que cada uno evolucion
de manera independiente durante el desarrollo del
agrupamiento de genes de globina de cada espe-
cie, fenmeno que refuerza la conclusin de que
la creacin de nuevos genes, seguida de su acepta-
cin como duplicados funcionales, de la variacin
para convertirse en nuevos genes funcionales o de
108 CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
- inactivacin como seudogenes, es un proceso
-::
inuo en el agrupamiento de genes. La mayora
- .as familias de genes tienen miembros que son
-
.:
dogenes, los cuales suelen constituir una mino-
i reducida del nmero total de genes,
El gen de globina a3 del ratn tiene una pro-
. .iad interesante, precisamente carece de ambos
orones. Su secuencia puede ser alineada (permi-
:;:
do la acumulacin de mutaciones) con la del
7 'A
m de la globina a. El momento aparente de la
rsactivacin coincide con la duplicacin original,
mal sugiere que el evento desactivador original
stuvo asociado con la prdida de los intrones.
Las secuencias genmicas inactivas similares al
tanscrito de RNA se llaman seudogenes proce-
ados
, que despus de un evento de transposicin
r
'
jrgrada se originan por insercin en algn sitio
aleatorio de un producto derivado del RNA, como
r describe en el Captulo 22, Retrovirus y retropo-
. nes. Sus rasgos caractersticos se resumen en la
r
;
gura 22.19.
Si los seudogenes son callejones sin salida de la
- .
olucin, simples compaas no deseadas de la re-
;
Structuracin de genes funcionales, por qu an
estn presentes en el genoma? Llevan a cabo algu-
na funcin o no tienen ningn fin, en cuyo caso, no
debera existir presin selectiva para su retencin?
Cabe recordar que se ven los genes que han
sobrevivido en poblaciones presentes, pero en el pa-
gado puede haber sido eliminado un nmero inde-
terminado de ellos. Dicha eliminacin pudo ocurrir
por delecin de la secuencia como evento repentino
o por la acumulacin de mutaciones hasta el punto
de que el seudogn ya no fuera reconocido como
miembro de su familia de secuencia original (pro-
bablemente el destino final de cualquier seudogn
no eliminado repentinamente).
Incluso las reliquias de la evolucin pueden ser
duplicadas. En los genes de globina [5 de la cabra hay
tres especies adultas, PA, (36 y [3C (vase la Fig. 6.7),
cada una con seudogn localizado algunas kiloba-
ses en flujo ascendente. Los seudogenes se relacio-
nan mejor entre s que con los genes de globina |3
adultos; en particular, comparten varias mutaciones
desactivadoras. Adems, estos ltimos se relacionan
mejor entre s que con los seudogenes, lo cual im-
plica que se duplic una estructura original Ppp y
se originaron genes p funcionales (que despus se
separaron) y dos genes no funcionales (que diver-
I gieron hacia los seudogenes actuales).
Los mecanismos que causan la duplicacin, la dele-
cin y la reorganizacin de los genes actan en todas las
secuencias reconocidas como miembros del agrupamiento,
sean o no funcionales. Se deja a la seleccin la tarea de
I discriminar entre los productos.
Por definicin, los seudogenes no codifican pro-
tenas y en general, carecen de funcin. Empero,
cuando menos en un caso excepcional, un seudo-
gn desempea una funcin reguladora. La trans-
cripcin de un seudogn inhibe la degradacin del
RNAm producido por su gen activo homlogo. Muy
probablemente hay una protena responsable de
esta degradacin que une a una secuencia especfica
en el RNAm. Si esta secuencia est tambin presen-
te en el RNA transcrito del seudogn, el efecto de la
protena se diluir cuando el seudogn sea transcri-
to. No est claro qu tan comunes puedan ser tales
efectos, pero como regla general, podemos esperar
que los efectos de dilucin de este tipo sean posibles
siempre que los seudogenes se transcriban.
111 Mediante entrecruzamiento
desigual se reestructuran
los agrupamientos de genes
Conceptos principales
Cuando un genoma contiene un agrupamiento de
genes con secuencias relacionadas, el apareamiento
errneo entre genes no allicos puede causar un
entrecruzamiento desigual, de modo que se produce
una delecin en un cromosoma recombinante y una
duplicacin correspondiente en el otro.
e Las talasemias diferentes son causadas por varias
deleciones en que se elimina el gen de la globina a o
el de la [3. La gravedad de la enfermedad depende de
cada delecin.
En un agrupamiento de genes idnticos o relacio-
nados hay oportunidades frecuentes de reorganiza-
cin, cuyos resultados se aprecian al comparar los
agrupamientos p de los mamferos incluidos en la
Figura 6.7. A pesar de que los agrupamientos cum-
plen la misma funcin y todos tienen la misma or-
ganizacin general, difieren en tamao y vara el
nmero total y el tipo de genes de globina p, as
como los nmeros y las estructuras de los seudo-
genes. Todos estos cambios deben haber ocurrido
desde la radiacin de los mamferos, hace -85 mi-
llones de aos (ltimo punto de la evolucin comn
a todos los mamferos),
La comparacin resalta el punto general de que
la duplicacin, la reorganizacin y la variacin de
los genes son factores tan importantes en la evolu-
cin como la acumulacin lenta de mutaciones en
genes individuales. Qu tipos de mecanismos son
responsables de la reorganizacin gnica?
Como se describi en la introduccin de este
captulo, el entrecruzamiento desigual puede ser re-
sultado del apareamiento entre dos sitios no hom-
6
.7 Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes
109
El entrecruzamiento desigual crea una duplicacin y una delacin
Entrecruzamiento normal
Gen 1 Gen 2
Cromosoma 1
Entrecruzamiento
Cromosoma 2
"
l
_
Cromosomas
recombinantes
recprocos - , -r
Entrecruzamiento desigual
Cromosomas
progenitores apareados
Entrecruzamiento Ir errneamente
Cromosomas
recombinantes
no recprocos
6
.13 El nmero de genes puede ser modificado por entrecru-
zamiento desigual. Si el gen 1 de un cromosoma se aparea con el 2 del
otro, las otras copias del gen quedan excluidas del apareamiento. La
recombinacin entre genes apareados errneamente produce un cromo-
soma con un sola copia (recombinante) del gen y un cromosoma con tres
copias del gen (una de cada progenitor y una recombinante).
logos. Normalmente, la recombinacin involucra a
secuencias de DNA correspondientes situadas en ali-
neacin exacta entre los dos cromosomas homlo-
gos. Sin embargo, cuando hay dos copias de un gen
en cada cromosoma, un desalineamiento ocasional
permite que se apareen entre s (lo cual implica que
algunas de las regiones adyacentes se desapareen).
Esto puede suceder en una regin de repeticiones
cortas (vase la Fig. 6.3) o en un agrupamiento de
genes. En la GURA se observa que el entrecru-
zamiento desigual en un agrupamiento de genes
puede tener dos consecuencias, una cuantitativa y
otra cualitativa:
.
El nmero de repeticiones aumenta en un
cromosoma y disminuye en el otro, de tal
forma que un cromosoma recombinante
sufre una delecin y el otro una insercin,
independientemente de la localizacin exac-
ta del entrecruzamiento. En la figura, en el
primer recombinante aumenta el nmero de
copias del gen, de dos a tres, en tanto que en
el segundo recombinante se reduce de dos
a una.
.
Si el evento de recombinacin sucede en
un gen (y no entre genes), el resultado de-
pende de que los genes recombinados sean
idnticos o slo estn relacionados. Si las
copias uno y dos del gen no correspondien-
te son completamente homologas, no hay
cambios en la secuencia de ninguno de los
genes. Sin embargo, tambin puede ocurrir
un entrecruzamiento no equivalente cuan-
do los genes adyacentes estn bien relacio-
nados (aunque la posibilidad es menor que
cuando son idnticos). En este caso, cada
uno de los genes recombinantes tiene una
secuencia diferente de la de cualquiera de
los progenitores.
Que el cromosoma tenga una ventaja o una des-
ventaja selectiva, depender de la consecuencia de
cualquier cambio en la secuencia del producto del
gen, as como del cambio en el nmero de copias.
Un obstculo para el entrecruzamiento desigual
es representado por la estructura interrumpida de
los genes. En un caso como el de las globinas, los
exones correspondientes de las copias adyacentes
del gen tienden a estar lo suficientemente bien re-
lacionadas como para sostener el apareamiento,
pero las secuencias de los intrones han divergido
de manera notoria. La restriccin de aparearse con
los exones reduce considerablemente el fragmento
continuo del DNA potencialmente involucrado, con
lo cual se reduce la posibilidad de un entrecruza-
miento desigual, por lo tanto, la divergencia entre
intrones potenciara la estabilidad de los agrupa-
mientos de genes y disminuira la posibilidad de un
entrecruzamiento desigual.
Las talasemias son resultado de mutaciones
que reducen o inhiben la sntesis de la globina a o
la (3. La incidencia de entrecruzamiento desigual en
los agrupamientos de genes de la globina humana es
revelada por la naturaleza de ciertas talasemias.
Muchas de las talasemias ms severas resul-
tan de deleciones de una parte del agrupamiento.
Cuando menos en algunos casos, los extremos de
la delecin se encuentran en regiones homlogas,
que es exactamente lo que se esperara si se hubiera
generado por un entrecruzamiento desigual.
En la 1 se resumen las deleciones que
causan talasemias a; las de a-tal-1 son largas y su
localizacin vara en el extremo izquierdo, en tanto
que las posiciones del extremo derecho se localizan
ms all de los genes conocidos y eliminan a los
dos genes a. Las deleciones de a-tal-2 son cortas y
eliminan slo a uno de los dos genes a. La delecin
L elimina 4.2 kb de DNA, incluido el gen al; proba-
blemente resulta de un entrecruzamiento desigual,
porque los extremos de la delecin estn en regio-
nes homlogas, justo a la derecha de los genes \|/a y
a2, respectivamente. La delecin R resulta de la eli-
minacin de exactamente 3.7 kb de DNA, distancia
exacta entre los genes al y a2. Esta delecin parece
haber sido generada por un entrecruzamiento des-
lio CAPTULOS Agrupamientos y repeticiones
igual entre los mismos genes al y a2, precisamente
la situacin que se ilustra en la Figura 6.13.
Dependiendo de la combinacin diploide de
cromosomas talasmicos, un individuo afectado
puede tener de cero a tres cadenas a. Hay algunas
diferencias entre el tipo silvestre (cuatro genes a)
en individuos con dos o tres genes a, pero si un
individuo tiene slo un gen a, el exceso de cade-
nas P forma el inusual tetrmero P
4/
que provoca la
enfermedad de hemoglobina H (HbH). La carencia
total de genes a resulta en hidrops fetalis (o hi-
dropesa fetal), que es fatal al nacer o despus del
nacimiento.
El mismo entrecruzamiento desigual que gene-
r el cromosoma talasmico debe haber generado
tambin un cromosoma con tres genes a. En ciertos
casos se han identificado individuos con dicha ca-
racterstica, y en algunas poblaciones, la frecuencia
del locus a triple es casi la misma que la del locus
a sencillo, mientras que en otras, los genes a tri-
ples son mucho menos comunes que los sencillos,
lo cual sugiere que en diversas poblaciones operan
factores selectivos (desconocidos) que ajusta los ni-
veles gnicos.
Las variaciones en el nmero de genes a son re-
lativamente frecuentes, lo cual permite argumentar
que el entrecruzamiento desigual en el agrupamien-
to debe ser bastante comn, si bien se observa con
ms frecuencia en el agrupamiento a que en el [3,
posiblemente porque los intrones de los genes a son
mucho ms cortos y por lo tanto presentan menos
impedimentos para el apareamiento errneo entre
genes no homlogos.
Las deleciones que provocan las talasemias |3 se
resumen en la FIGURA . En algunos casos (raros),
slo el gen (i resulta afectado, con una delecin de
600 bp, a partir del segundo intrn, pasando por las
regiones flanqueantes 3
'
.
En los otros casos, muchas
de las deleciones son muy largas, del extremo 5', in-
dicado en el mapa, hasta >50 kb hacia la derecha.
El tipo Hb Lepore proporciona la clsica evi-
dencia de que la delecin puede resultar de un en-
trecruzamiento desigual entre genes ligados. Los
genes P y 5 difieren nicamente -7% en sus se-
cuencias. La recombinacin desigual elimina mate-
rial entre los genes, fusionndolos (vase Fig. 6.13).
El gen fusionado produce una cadena individual
tipo P formada por la secuencia terminal N de 6,
unida a la secuencia terminal C de p.
Actualmente se conocen numerosos tipos de Hb
lepore, y la diferencia radica en el punto de transi-
cin de las secuencias de 6 a p, as que cuando los
genes 5 a P se aparean por entrecruzamiento des-
igual, el punto exacto de recombinacin determina
.a posicin en que sucede cambio de secuencia 5 a
P en la cadena de aminocidos.
Las talasemias a son provocadas por deleciones
yi; w tya al al
a-tal-2L
a-tal-2R
a-tal-1-Tailandesa
a
-tal-1-Griega
Restante Borrado
Las talasemias a resultan de varias deleciones
en el agrupamiento de genes de globina a.
Les talasemias f) son provocadas
por deleciones
ta!
Hb Lepore
GAsp tal
GA HPFH
GAHPFH Hb Kenia
GAtal
yptal
Las deleciones del agrupamiento del gen de glo-
bina |3 causan varios tipos de talasemias.
El recproco de este evento ha sido encontrado
en la forma de Hb anti-Lepore, producida por un
gen que tiene la parte terminal N de p y la parte
terminal C de 5. EL gen fusionado est entre los
genes 5 y p normales.
La evidencia de que pueden presentarse entre-
cruzamientos desiguales entre genes cuya relacin
es lejana proviene de la identificacin de la Hb Ke-
nia, otra hemoglobina fusionada, la cual contiene
la secuencia terminal N del gen y la secuencia
terminal C del gen p. La fusin debe haber resultado
del entrecruzamiento desigual entre y P, cuyas
secuencias difieren -20%.
6
.7 Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes
111
A partir de las diferencias entre los agrupamien-
tos de genes de globina de varios mamferos se ob-
serva que la duplicacin seguida (algunas veces) de
la variacin ha sido un elemento importante en la
evolucin de cada agrupamiento. Las deleciones
talasmicas humanas demuestran que el entrecru-
zamiento desigual sigue ocurriendo en ambos agru-
pamientos de genes de globinas. Cada vez que un
evento de esta naturaleza genera una duplicacin
y una delecin, debe tomarse en cuenta el futuro
de los loci recombinantes de la poblacin. Las de-
leciones tambin pueden ocurrir (en principio) por
recombinacin entre secuencias homlogas que se
encuentran en el mismo cromosoma, fenmeno que
no genera una duplicacin correspondiente.
Es difcil calcular la frecuencia natural de estos
eventos porque las fuerzas selectivas ajustan rpi-
damente los niveles de los diversos agrupamientos
de la poblacin. En general, una contraccin en el
nmero de genes tiende a ser nociva y descartada
a favor de otra, sin embargo, algunas poblaciones
pueden tener una ventaja compensadora que man-
tenga a la forma eliminada en una frecuencia baja.
Las estructuras de los agrupamientos huma-
nos actuales muestran varias duplicaciones que dan
testimonio de la importancia de tales mecanismos.
Las secuencias funcionales incluyen dos genes a que
codifican a la misma protena, bastante bien re-
lacionados con los genes [3 y 5, y dos genes y casi
idnticos. Estas duplicaciones independientes com-
parativamente recientes han sobrevivido en la pobla-
cin, sin mencionar a las duplicaciones ms distantes
que originalmente generaron los diversos tipos de
genes de globina. Otras duplicaciones pueden haber
dado lugar a seudogenes o se han perdido. Es de es-
perar que la duplicacin y la delecin continuas sean
caractersticas de todos los agrupamientos de genes.
El Los genes del RNAr forman
repeticiones en tndem
Conceptos principales
.
El RNA ribosmico es codificado por un nmero
considerable de genes idnticos que se repiten en
tndem para formar uno o ms agrupamientos.
.
Los agrupamientos de DNAr se organizan de manera
tal, que Las unidades de transcripcin que resultan en
un precursor unido a los RNAr principales alternan con
espaciadores no transcritos.
En los casos descritos hasta ahora, hay diferencias
entre los miembros individuales de un agrupamien-
to de genes que permiten que la presin selectiva
acte de manera independiente en cada gen, y hay,
por el contrario, dos casos de agrupamientos gran-
des de genes que contienen varias copias idnticas
del mismo gen o genes. La mayora de los organis-
mos contienen mltiples copias de los genes para
las histonas, que son un componente fundamental
de los cromosomas, y casi siempre hay varias copias
de los genes que codifican a los RNA ribosmicos; lo
que plantean interrogantes evolutivas de inters.
El RNA ribosmico es el producto predominan-
te de la transcripcin, pues constituye del 80 al 90%
de la masa total del RNA celular de las eucariotas
y las procariotas. El nmero de genes mayores de
RNAr flucta entre 7 de E. coli, 100 a 200 de las eu-
cariotas inferiores y varios cientos en las eucariotas
superiores. Los genes que codifican al RNAr gran-
de y al pequeo (encontrados en las subunidades
grandes y pequeas del ribosoma, respectivamente)
suelen formar un par en tndem (la nica excep-
cin son las mitocondrias de las levaduras).
La ausencia de una variacin detectable en las
secuencias de las molculas de RNAr implica que
todas las copias de cada gen deben ser idnticas,
o cuando menos sus diferencias debern estar por
debajo del nivel de deteccin del RNAr (-1%). Un
punto de gran inters son los mecanismos utilizados
para evitar que las variaciones se acumulen en las
secuencias individuales.
En las bacterias, los mltiples pares de genes de
RNAr estn dispersos, mientras que en la mayora de
los ncleos eucariticos estn contenidos en agru-
pamientos en tndem, regiones que suelen llamarse
DNAr. (En algunos casos, la proporcin de DNAr
en el total del DNA aunada a su composicin bsica
atpica, es lo suficientemente importante como para
aislarse como fraccin independiente, directamen-
te del DNA genmico cortado.) Una caracterstica
diagnstica importante de un agrupamiento en tn-
dem es que genera un mapa de restriccin circular,
como se muestra en la FIGURA 6.16.
Supongamos que cada unidad de repeticin
tiene tres sitios de restriccin. Cuando se mapean
estos fragmentos por medios convencionales, se ob-
serva que A est junto a B, que est junto a C, que
est junto a A, generando un mapa circular. Si el
agrupamiento es grande, los fragmentos internos
(A, B y C) estarn presentes en cantidades mucho
mayores que los terminales (X y Y), mismos que
conectan al agrupamiento con el DNA adyacente.
En un agrupamiento de 100 repeticiones, X y Y es-
taran presentes al 1% del nivel de A, B y C, lo cual
puede dificultar la obtencin de los extremos de un
agrupamiento de genes con fines de mapeo.
La regin del ncleo donde sucede la sntesis del
RNAr tiene un aspecto caracterstico, con un ncleo
112 CAPTULO 5 Agrupamientos y repeticiones
Un agrupamiento de repeticiones genera un mapa de restriccin circular
Organizacin lineal del agrupamiento
Repeticin 1 Repeticin 2 Repeticin 3 Repeticin 4
Espaciador no transcrito Unidad de transcripcin
Sitios de divisin por restriccin
X ABC ABC ABC ABY
Mapa de restriccin
C
A
R
Un agrupamiento de genes en tndem presenta alternancias
en las unidades de transcripcin y los espaciadores no transcritos y genera
un mapa de restriccin circular.
El nuclolo es una estructura granular densa
1
. .
>
de naturaleza fibrilar rodeado de una corteza granu-
lar. El ncleo fibrilar es donde se transcribe el RNAr
a partir del molde de DNA, y la corteza granular
est formada por partculas ribonucleoprotenicas
en las cuales se ensambla el RNAr. El rea completa
se llama nuclolo, y su morfologa caracterstica es
obvia en la FIGURA 6.17.
Las regiones cromosmicas particulares aso-
ciadas con un nuclolo se llaman organizadores
nucleolares, cada uno de los cuales corresponde
a un agrupamiento de genes de RNAr repetidos en
tndem en un cromosoma. La concentracin de
dichos genes, aunada a su muy intensa transcrip-
cin, es la causa de la morfologa caracterstica de
los nuclolos.
El par de RNAr mayores es transcrito como el
nico precursor, tanto en los ncleos de las bacterias
como de las eucariotas. Despus de la transcripcin,
el precursor se divide para liberar a las molculas
individuales de RNAr. La unidad de transcripcin
es ms pequea en las bacterias y ms larga en los
mamferos (en cuyo caso se conoce como RNA 45S,
segn su velocidad de sedimentacin). Un agru-
pamiento de DNAr contiene muchas unidades de
transcripcin, cada una separada de la siguiente
por un espaciador no transcrito. La alternancia
de una unidad de transcripcin y el espaciador no
transcrito es observable directamente en microgra-
fas electrnicas. El ejemplo de la URA 6.U pro-
viene del tritn Notopthalmus viridescens, en el que
cada unidad de transcripcin se expresa intensa-
El centro nucleolar identifica a los DNAr en pro-
ceso de transcripcin, y la corteza granular circundante consta
de unidades ribosmicas ensambladas. Esta seccin delgada
muestra el nuclolo de la nutria Notopthalmus viridescens. Ima-
gen cortesa de Oscar Miller.
mente, de manera que varias polimerasas de RNA
participan simultneamente en la transcripcin de
una unidad de repeticin. Las polimerasas estn tan
cercanas que los transcritos de RNA forman una
matriz caracterstica que muestra una longitud cre-
ciente a lo largo de la unidad de transcripcin.
6.8 Los genes del RNAr forman repeticiones en tndem
113
El espaciador y el transcrito alternan en el DNAr
Espaciador
:i
'
pm
Matriz
La transcripcin de agrupamientos de DNAr ge-
nera una serie de matrices, cada una de las cuales corresponde
a una unidad de transcripcin separada de la siguiente por el
espaciador no transcrito. Imagen cortesa de Oscar Miller.
El promotor de DNAr tiene regiones repetitivas
Regin
repetitiva 1
Regin Regin Transcripcin
repetitiva 2 repetitiva 3
Islote Islote Islote
Bam Bam Bam
-
500 bp -300 bp -300 bp
Longitud variable Longitud variable
repeticiones de 97 bp repeticiones de 60/81 bp
2 300 - 5 300 bp
Longitud variable
repeticiones de
60/81 bp
El espaciador no transcrito del DNAr de X. laevis tiene una
estructura que se repite internamente y es la causa de sus variaciones de
longitud. Los islotes Bam son secuencias constantes cortas que separan a
[as regiones repetitivas.
Los genes repetidos de RNAr
mantieien una secuencia
constante
Conceptos principales
Todos los genes de un agrupamiento de DNAr tienen
secuencias idnticas.
Los espaciadores no transcritos consisten en unidades
repetidoras ms cortas cuyo nmero varia, de modo que
la longitud de cada espaciador es diferentes.
La longitud del espaciador no transcrito vara mu-
cho entre especies y (en ocasiones) dentro de una
misma especie. Las levaduras tienen un espaciador
no transcrito corto cuya longitud es relativamente
constante. En D. melanogaster se observa una varia-
cin casi del doble entre diferentes copias de la uni-
dad de repeticin. En X. laevis la situacin es similar.
En cada uno de estos casos, todas las unidades de re-
peticin estn presentes a manera de un solo agru-
pamiento en tndem individual en un cromosoma
especfico. (En el ejemplo de D. melanogaster, ste re-
sulta ser el cromosoma sexual. El agrupamiento del
cromosoma X es ms grande que el del cromosoma
Y
, as que las moscas hembra tienen ms copias de
los genes de RNAr que las moscas macho.)
En los mamferos, la unidad de repeticin es
mucho ms extensa, y comprende la unidad de
transcripcin de ~ 13 kb y un espaciador no trans-
crito de -30 kb. Normalmente, los genes forman
numerosos agrupamientos dispersos, en el caso del
hombre y del ratn, los agrupamientos residen en
cinco y seis cromosomas, respectivamente. Una
pregunta interesante (pero sin respuesta) es cmo
puede funcionar el mecanismo corrector que, pre-
sumiblemente funciona en un solo agrupamiento
y garantiza la constancia de la secuencia del RNAr,
cuando hay varios agrupamientos.
Las diferencias de longitud del espaciador
no transcrito de un solo agrupamiento de genes
contrasta con la conservacin de la secuencia de la
unidad de transcripcin. A pesar de esta variacin,
las secuencias de los espaciadores no transcritos ms
extensos siguen siendo iguales a las de los espacia-
dores no transcritos ms cortos, lo cual implica que
cada espaciador no transcrito es iniernamente repetiti-
vo, de modo que la variacin en longitud resulta de
los cambios en el nmero de repeticiones de alguna
subunidad.
Las caractersticas generales de los espaciado-
res no transcritos se ilustran con el ejemplo de X.
laevis en la FIGUR 6.19, Las regiones cuya longitud
es fija, alternan con las de longitud variable. Cada
una de las tres regiones repetitivas comprende un
nmero variable de repeticiones de una secuencia
ms bien corta. Un tipo de regin repetitiva tiene re-
peticiones de una secuencia de 97 bp; el otro, presente
en dos ubicaciones, tiene una unidad de repeticin en
dos formas, de 60 bp y de 81 bp de largo. La varia-
cin en el nmero de unidades de repeticin en
las regiones repetitivas representa la variacin total
en la longitud de los espaciadores. Las regiones re-
petitivas estn separadas por secuencias constantes
ms cortas, llamadas islotes Bam. (Su nombre se
debe a que para el aislamiento se utiliz la enzi-
ma de restriccin BamHI.) A partir de este tipo de
organizacin, se observa que el agrupamiento ha
evolucionado por duplicaciones en que est impli-
cada la regin promotora.
Es necesario explicar la falta de variaciones en
las copias expresadas de los genes repetidos. Un mo-
delo supondra la demanda cuantitativa de deter-
minado nmero de secuencias
"
buenas", pero esto
permitira que las secuencias mutadas se acumula-
ran a tal punto, que su porcin en el agrupamien-
to sera lo suficientemente grande como para que
fuera ejercida la presin selectiva. Es posible excluir
114 CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
estos modelos por la ausencia de dicha variacin en
el agrupamiento.
La falta de variacin implica una presin se-
lectiva insensible, en cierta forma
,
a las variaciones
individuales. Un modelo supondra que el agru-
pamiento entero es regenerado peridicamente a
partir de uno o de varios miembros. De hecho, en
cada generacin, prcticamente en cualquier me-
canismo necesita estar involucrada la regeneracin.
Este tipo de modelos puede ser excluido porque un
agrupamiento regenerado no mostrara variaciones
en las regiones no transcritas de las repeticiones in-
dividuales.
Lo cual plantea un dilema. La variacin en las
regiones no transcritas sugiere frecuentes entrecru-
zamientos desiguales, con lo cual cambiar el tama-
o del agrupamiento, pero no las propiedades de las
repeticiones individuales. Entonces cmo se evita
la acumulacin de mutaciones? En la prxima sec-
cin se ver que la contraccin y la expansin con-
nuas de un agrupamiento suelen proporcionar un
mecanismo para la homogenizacin de sus copias.
| La fijacin entrecruzada
podra mantener repeticiones
idnticas
Conceptos principales
.
Un entrecruzamiento desigual cambia el tamao de un
agrupamiento de repeticiones en tndem.
.
Las unidades de repeticin pueden eliminarse o
repartirse entre los agrupamientos.
El mismo problema se encuentra siempre que un
sen ha sido duplicado. Cmo imponer la seleccin
para evitar la acumulacin de mutaciones delet-
reas?
La duplicacin de un gen probablemente resulte
en una relajacin inmediata de la presin evolutiva
sobre su secuencia. Ahora que hay dos copias idn-
ticas
, un cambio en la secuencia de una no privar
organismo de una protena funcional, porque la
secuencia original de los aminocidos sigue siendo
:
"
'
dificada por la otra copia. Despus, la presin se-
lectiva se difunde en ambos genes, hasta que uno
ie ellos muta lo suficientemente lejos de su funcin
riginal como para enfocar toda la presin selectiva
ta el otro.
Inmediatamente despus de la duplicacin de
un gen, los cambios pueden acumularse ms rpida-
"
ente en una de las copias, llevando eventualmente
3 una nueva funcin (o a la obsolescencia en forma
e seudogn). Si se desarrolla una nueva funcin,
.
ronces el gen evoluciona a la misma velocidad,
ms lenta, caracterstica de la funcin original. Pro-
bablemente ste sea el tipo de mecanismo causante
de la separacin de las funciones entre los genes de
globina embrionarios y los adultos.
An as, hay instancias en que los genes duplica-
dos conservan la misma funcin, codificando prote-
nas idnticas o casi idnticas. Las protenas idnticas
son codificadas por dos genes de globina a humanos
y slo difiere un aminocido entre las dos protenas
de globina y. Cmo se ejerce la presin selectiva
para mantener la identidad de la secuencia?
La posibilidad ms obvia es que, de hecho, dos
genes no tienen funciones idnticas, sino que difie-
ren en algunas propiedades (no detectadas), como
el tiempo o el lugar de expresin. Otra posibilidad
es que la necesidad de dos copias sea cuantitativa,
dado que ninguna produce, de por s, suficiente
cantidad de protena.
De cualquier forma, en casos ms extremos de
repeticin es imposible evitar la conclusin de que
ninguna de las copias del gen es esencial. Cuando
hay varias, los efectos inmediatos de la mutacin en
cualquiera de ellas deben ser muy leves. Las con-
secuencias de una mutacin individual se diluyen
por el gran nmero de copias del gen que conservan
la secuencia de tipo silvestre, pueden acumularse
muchas copias mutantes antes de que se genere un
efecto letal.
La letalidad se torna cuantitativa, conclusin
que se refuerza por la observacin de que la mitad
de las unidades del agrupamiento de DNAr de X.
laevis o de D. melanogaster pueden ser borradas sin
efectos adversos. Cmo se impide, entonces, que
estas unidades acumulen gradualmente mutacio-
nes deletreas? Qu posibilidades hay de que la
rara mutacin favorable muestre sus ventajas en el
agrupamiento?
El principio bsico de los modelos para explicar
la conservacin de la identidad entre copias repeti-
das es suponer que los genes no allicos no se here-
dan de manera independiente, sino que deben ser
regenerados continuamente de una de las copias de
una generacin precedente. En el caso ms sencillo
de dos genes idnticos, cuando en una copia ocurre
una mutacin, o es eliminada de forma aleatoria
(porque la secuencia de la otra copia toma el con-
trol), o se extiende a ambos duplicados (porque la
copia mutante se convierte en la versin dominan-
te). La dispersin expone a la mutacin a la selec-
cin. El resultado es que los dos genes evolucionan
juntos, como si existiera un solo locus, fenmeno
conocido como evolucin coincidental o evolu-
cin concertada (ocasionalmente, coevolucin),
que puede aplicarse a un par de genes idnticos (con
suposiciones posteriores) o a un agrupamiento que
contenga numerosos genes.
6
.
10 La fijacin entrecruzada podra mantener repeticiones idnticas
Un mecanismo supone que las secuencias de
los genes no allicos se comparan directamente y
son homogeneizadas por las enzimas que detectan
cualquier diferencia. Esto se logra por el intercam-
bio de cadenas individuales para formar genes, una
de cuyas cadenas deriva de una copia y la otra, de
la otra copia. Cualesquiera diferencias se revelan
como bases apareadas impropiamente, lo cual atrae
la atencin de las enzimas susceptibles de escindir y
remplazar una base, de modo que slo los pares A-T
y G-C sobreviven. A este tipo de evento se le llama
conversin gnica y se relaciona con la recom-
binacin gentica. Debera ser posible comprobar
el alcance de tales eventos al comparar las secuen-
cias de genes duplicados, pero si estn sujetos a la
evolucin concertada, no debera verse la acumu-
lacin de sustituciones de sitios silenciosos (porque
el proceso de homogeneizacin se aplica tanto para
stos como para los sitios de remplazo). Se sabe que
la extensin del mecanismo de mantenimiento no
debe rebasar al gen mismo, puesto que hay casos
de genes duplicados cuyas secuencias flanquean-
tes son enteramente distintas. De hecho, podran
verse lmites abruptos que marcan los extremos de
las secuencias homogeneizadas.
Cabe recordar que la existencia de dichos me-
canismos puede invalidar la determinacin de la
historia de genes de ese tipo a travs de su diver-
gencia, puesto que la divergencia refleja slo el tiempo
transcurrido desde el ltimo evento de homogeneizacin/
regeneracin, no la duplicacin original.
El modelo de fijacin cruzada supone que un
agrupamiento entero est sujeto a reestructuracin
continua por el mecanismo de entrecruzamiento
desigual. Dichos eventos suelen explicar la evolu-
cin concertada de mltiples genes si el entrecruza-
miento desigual provoca que todas las copias sean
regeneradas fsicamente a partir de una copia.
Siguiendo el tipo de evento ilustrado en la Fi-
gura 6.13, por ejemplo, el cromosoma que porta
un locus triple podra sufrir la delecin de uno de
los genes. De los dos restantes, VA representa la
secuencia de una de las copias originales; slo la
mitad de la secuencia de la otra copia original ha
sobrevivido. Cualquier mutacin de la primera re-
gin ahora existe en ambos genes y est sujeta a la
presin selectiva.
El agrupamiento en tndem proporciona opor-
tunidades frecuentes de "apareamiento errneo
"
de
genes cuyas secuencias son las mismas, pero que
ocupan diferentes posiciones en sus agrupamien-
tos. Mediante la expansin y contraccin constantes
del nmero de unidades por entrecruzamiento des-
igual, es posible que todas las unidades de un agru-
pamiento sean derivadas de una proporcin bas-
tante pequea de las de un agrupamiento ancestral.
Las variaciones en la longitud de los espaciadores
coinciden con la idea de que los eventos de entre-
cruzamiento desigual suceden en los espaciadores
apareados internamente de manera errnea, lo cual
explicara la homogeneidad de los genes comparada
con la variabilidad de los espaciadores. Los genes
son expuestos a la seleccin cuando unidades de
repeticin especficas son amplificadas en el agru-
pamiento, pero los espaciadores son irrelevantes y
pueden acumular cambios.
En una regin de DNA no repetitivo, la recombi-
nacin ocurre entre puntos coincidentes precisos de
dos cromosomas homlogos, generando as recom-
binantes recprocos. La base de esta precisin es la
capacidad que tienen dos secuencias de DNA dplex
para alinearse exactamente. Se sabe que la recombi-
nacin desigual puede ocurrir cuando hay mltiples
copias de un gen cuyos exones estn relacionados,
incluso si sus secuencias flanqueadoras e interven-
toras difieren, y esto por el apareamiento errneo
entre exones correspondientes en genes no allicos.
Imagnese qu tan frecuente debe ser la desali-
neacin de un agrupamiento en tndem de repeti-
ciones idnticas o casi idnticas. Excepto en los me-
ros extremos del agrupamiento, la cercana relacin
entre repeticiones sucesivas imposibilita incluso la
definicin de las repeticiones exactamente corres-
pondientes! Esto tiene dos consecuencias: ajuste
continuo del tamao del agrupamiento y homoge-
neizacin de la unidad de repeticin.
Considrese una secuencia formada por la uni-
dad de repeticin "ab" con extremos "x" y "y". Si se
representa un cromosoma de color negro y el otro
de distinto color, el alineamiento exacto entre las
secuencias allicas sera:
xababababababababababababababababy
xababababababababababababababababy
Sin embargo, es probable que cualquier secuen-
cia ab del cromosoma se apare con cualquier se-
cuencia ah del otro cromosoma, en una desalinea-
cin del tipo de:
xababababababababababababababababy
xababababababababababababababababy
la regin de apareamiento no es menos estable que
en el par alineado, a pesar de ser ms corta. No se
sabe mucho acerca de cmo se inicia el apareamien-
to antes de la recombinacin, pero es muy probable
que empiece entre regiones cortas correspondientes
y luego se difunda. Si empieza en el DNA satli-
te, es ms probable que no implique unidades de
repeticin que no tengan ubicaciones exactamente
correspondientes en sus agrupamientos.
Ahora supngase que un evento de recombina-
cin tiene lugar en la regin apareada desigualmente.
CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
Los recombinantes tendrn un nmero diferente de
unidades de repeticin. En un caso, el agrupamiento
ser ms largo y en el otro, se habr acortado,
xababababababababababababababababy
x
xababababababababababababababababy
i
xababababababababababababababababababy
+
xababababababababababababababy
donde "x" indica el sitio del entrecruzamiento.
Si este tipo de evento es comn, los agrupamien-
tos de repeticiones en tndem estarn sometidos a
expansin y contraccin continuas, lo cual puede
llevar a que una unidad de repeticin en particu-
lar se disperse en el agrupamiento, segn se ilustra
en la FIGURA 6.20. Supngase que el agrupamiento
consiste inicialmente en una secuencia ahcde, en la
Las repeticiones son establecidas
por recombinacin desigual
5
abade
abcde t
6
abbcde
_
abbcde ,
7
abbbcde
abbbcde \
9
abbbcdcde
abbbcdcde
1
abbbbbcdcde
abbbbbcdcde
10
bbbbbcdcde
bbbbbcdcde
8
bbbbbcde
bbbbbcde
10
bbbbbbbcd'e
_
bbbbbbbcde
7
bbbbbbb
FIGURA 6.20 La recombinacin desigual permite que una uni-
oad de repeticin especfica ocupe el agrupamiento entero.
.
os nmeros indican la longitud de la unidad de repeticin en
ra a etapa.
cual cada letra representa una unidad de repeticin.
La relacin entre las diferentes unidades de repeti-
cin es lo suficientemente estrecha como para que se
apareen errneamente por recombinacin, de modo
que por una serie de eventos recombinantes des-
iguales, el tamao de la regin repetitiva aumenta o
disminuye, y una unidad se extiende para remplazar
a todas las otras.
El modelo de fijacin cruzada pronostica que
cualquier secuencia de DNA no sometida a presin selecti-
va, seguramente ser sometida por una serie de repeticiones
en tndem idnticas generadas de esta manera. La supo-
sicin critica es que el proceso de fijacin cruzada es
bastante rpido respecto de la mutacin, de manera
que las mutaciones nuevas son eliminadas (se pier-
den sus repeticiones) o llegan a tomar el control de
todo el agrupamiento. Obviamente, en el caso del
agrupamiento del DNAr, la seleccin impone un fac-
tor posterior para una secuencia transcrita efectiva.
E Los DNA satlite a menudo
se encuentran
en La heterocromatina
Conceptos principales
.
La secuencia de repeticin del DNA altamente
repetitivo es muy corta y no tiene funcin codificadora.
.
Se presenta en grandes bloques que pueden tener
propiedades fsicas diferentes.
.
Suele ser el constituyente principal de la
heterocromatina centromrica.
El DNA repetitivo se define por su (relativamente)
rpido ndice de renaturalizacin. El componente
que se renaturaliza ms rpidamente en el genoma
eucaritico se llama DNA altamente repetitivo y con-
siste en secuencias muy cortas repetidas en tndem,
varias veces, en agrupamientos grandes. Como su
unidad de repeticin es corta, suele describirse como
DNA de secuencia simple. Este tipo de compo-
nente se encuentra en casi todos los genomas eu-
cariticos superiores, pero, en general, la cantidad
es muy variable. En los genomas de los mamferos
es tpicamente <10%/ pero en Drosophila virlis, por
ejemplo, llega a -50%. Adems de los agrupamien-
tos extensos en que este tipo de secuencia se descu-
bri originalmente, hay otros ms pequeos inter-
calados con DNA no repetitivo, que suele constar
de secuencias cortas repetidas en copias idnticas o
relacionadas en el genoma.
La repeticin en tndem de una secuencia corta
crea una fraccin con propiedades fsicas distintivas
que permiten aislarla. En algunos casos, la compo-
sicin bsica de la secuencia repetitiva es distinta de
6
.11 Los ONA satlite a menudo se encuentran en la heterocromatina 117
El DNA satlite forma una banda distinta
Banda principal
Satlite
ra
o
ra
1.690
Densidad boyante
Por centrifugacin, el DNA de ratn se separa
en una banda principal y un satlite a travs de un gradiente
de densidad de CsCl.
la del genoma promedio, lo cual le permite formar
una fraccin independiente en virtud de su densi-
dad boyante diferente. Una fraccin de este tipo se
llama DNA satlite, trmino que, en esencia, es si-
nnimo de DNA de secuencia simple. Coincidiendo
con su secuencia simple, este DNA ni se transcribe
ni se traduce.
Las secuencias repetidas en tndem estn espe-
cialmente obligadas a experimentar alineamientos
errneos durante el apareamiento cromosmico, de
modo que sus dimensiones tienden a ser polimr-
ficas, con amplias variaciones entre individuos. De
hecho, los agrupamientos ms pequeos de tales
secuencias pueden usarse para caracterizar genomas
individuales mediante la tcnica de huella digital
del DNA (vase la seccin 6.14, Los minisatlites
facilitan el mapeo gentico).
La densidad boyante de un DNA dplex depen-
de de su contenido G-C segn la frmula emprica
p
= 1
.660 + 0.00098 (%G-C) g-cirr3
Normalmente, la densidad boyante se determi-
na centrifugando el DNA a travs de un gradiente
de densidad de CsCl. EL DNA forma una banda en
la posicin correspondiente a su propia densidad.
Las fracciones de DNA que difieren en contenido
G
-C por >5%, usualmente pueden ser separadas en
un gradiente de densidad.
Cuando un DNA eucaritico es centrifugado en
gradiente de densidad, pueden distinguirse dos tipos
de materiales:
.
La mayor parte del genoma forma un con-
tinuo de fragmentos observables como un
pico ms bien ancho centrado en la densi-
dad boyante que corresponde al promedio
de contenido de G-C del genoma. A esto se
le denomina banda principal,
.
En ocasiones, un pico adicional, ms pe-
queo (o varios picos), se observa en un
valor diferente. Este material es el DNA sa-
tlite.
En muchos genomas eucariticos hay satlites,
los cuales pueden ser ms pesados o ms ligeros que
la banda principal, pero casi nunca representan >5%
del DNA total. Un ejemplo claro es el DNA de ratn
que se ilustra en la IGURA 6.21. La grfica es una ex-
ploracin cuantitativa de las bandas que se forman
cuando dicho DNA es centrifugado a travs de un
gradiente de densidad de CsCl. La banda principal
contiene 92% del genoma y est centrada en una
densidad boyante de 1.701 g-cnr3 (que corresponde
a su promedio de G-C de 42%, tpico de los mam-
feros). El pico ms pequeo representa el 8% del
genoma y tiene una densidad boyante distinta de
1
.690 g-cnr3; en l se encuentra el DNA satlite del
ratn, cuyo contenido de G-C (30%) es mucho ms
bajo que en cualquiera otra parte del genoma.
El comportamiento del DNA satlite en gradien-
tes de densidad suele ser anmalo. Cuando se de-
termina la composicin de bases real de un satlite,
difiere del pronstico basado en su densidad boyante
porque p es una funcin no slo de la composicin
de bases, sino de la constitucin en cuanto a pares
de vecinos ms cercanos. Para las secuencias sim-
ples, tienden a desviarse de las relaciones de aparea-
miento aleatorio necesarias para que se cumpla la
ecuacin de densidad boyante. Adems, el DNA
satlite puede estar metilado, lo cual cambia su
densidad.
A menudo, la mayor parte del DNA altamente
repetitivo de un genoma puede ser aislado en forma
de satlites. Cuando un componente de estas carac-
tersticas no se separa de esa manera, en aislamiento,
sus propiedades a menudo demuestran su similitud
con las del DNA satlite, es decir, el DNA altamente
repetitivo est formado por mltiples repeticiones
en tndem con centrifugacin anmala. Al material
aislado de esta forma suele llamrsele satlite crp-
tico. Juntos, los satlites crpticos y los aparentes
representan, en general, a todos los grandes bloques
repetidos en tndem del DNA altamente repetitivo.
Cuando un genoma tiene ms de un tipo de DNA
altamente repetitivo, cada uno est en su propio blo-
que satlite (aunque, en ocasiones, bloques diferen-
tes ocupan posiciones adyacentes).
En qu parte del genoma se localizan los blo-
ques de DNA altamente repetitivo? Una extensin
de las tcnicas de hibridacin de cido nucleico
permite determinar directamente la localizacin de
secuencias satlite en el complemento del cromo-
soma. En las tcnicas de hibridacin in situ, el
DNA cromosmico se desnaturaliza tratando clulas
aplastadas en un cubreobjetos. A continuacin, se
118 CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
Los cenlrmeros del ratn contienen DNA satlite
FIGURA 6.2? La hibridacin citoLgica muestra que el DNA
satlite del ratn est Localizado en los centrmeros. Imagen
rortesa de Mary Lou Pardue and Joseph G. Gall, Carnegie Ins-
rtution.
aplica una solucin que contenga DNA o RNA mar-
cado radioactivamente. La sonda se hbrida con sus
complementos en el genoma desnaturalizado. La
- Realizacin de los sitios de hibridacin puede deter-
minarse por autorradiografa (vase la Fig. 28.19).
Los DNA satlite se encuentran en regiones de
heterocromatina, trmino, este ltimo, utilizado
para describir a las regiones de los cromosomas per-
manentemente enrolladas con firmeza y que son
inertes
, a diferencia de la eucromatina, que repre-
senta la mayor parte del genoma (vase la seccin
28.7, La cromatina se divide en eucromatina y he-
terocromatina). La heterocromatina se encuentra
comnmente en los centrmeros (regiones en que
fe forman los cinetocoros durante la mitosis y la
rneiosis para controlar el desplazamiento del cro-
rjosoma). La locacin centromrica del DNA sat-
e sugiere que tiene alguna funcin estructural
rn el cromosoma, la cual podra estar relacionada
:
m el proceso de segregacin del mismo.
En la -GURA 6.2 se muestra un ejemplo de lo-
ralizacin del DNA satlite para el complemento
rromosmico del ratn. En este caso, un extremo
de cada cromosoma est etiquetado porque es donde
'
.os centrmeros se localizan en los cromosomas Mus
"
Hsculus.
rm Los satlites de los artrpodos
tienen repeticiones idnticas
muy cortas
Concepta principal
.
La longitud de las unidades de repeticin de los DNA
satlite de los artrpodos es de slo unos cuantos
nucletidos. La mayora de las copias de la secuencia
son idnticas.
D. wilis tiene cuatro satlites relacionados
Satlite
Secuencia
predominante
Longitud
total
Proporcin
del genoma
1 ACAAACT
TGTTTGA
1.
1 x 107 25%
II AT AAACT
TATTTGA
3.
6x106 8%
III ACAAATT
TGTTTA A
3.
6x106 8%
Crptico
AATATAG
TT ATAT C
Los DNA satlites de D. virilis estn relacionados.
Ms del 95% de cada satlite consiste en una repeticin en
tndem de la secuencia predominante.
En los artrpodos, tipificados por insectos y cangre-
jos, cada DNA satlite parece bastante homogneo.
Normalmente, una unidad de repeticin individual
muy corta representa a >90% de los satlites, lo
cual hace relativamente sencilla la determinacin
de la secuencia.
Drosophila virilis tiene tres satlites principales y
un satlite crptico, que juntos representan >40% del
genoma. Las secuencias de los satlites se resumen
en la FIGURA ( . Las secuencias de los tres satlites
principales estn ntimamente relacionadas. La susti-
tucin de una sola base es suficiente para generar el
satlite n o el Etl de la secuencia del satlite I.
La secuencia de este ltimo se encuentra en
otras especies de Drosophila relacionadas con virilis,
de modo que pueden haber precedido a la evolu-
cin de las especies. Las secuencias de los satlites
II y III parecen especficas de D. virilis, as que pue-
den haber evolucionado del satlite I despus de la
evolucin de las especies.
La caracterstica principal de estos satlites es
su unidad de repeticin tan corta, de slo 7 bp. En
otras especies se encuentran satlites similares. D.
melanogaster tiene varios satlites, muchos de los
cuales tienen unidades de repeticin muy cortas (de
5
, 7, 10 o 12 bp). En los cangrejos se encuentran
satlites comparables.
La estrecha relacin entre las secuencias de
los satlites de D. virilis no es necesariamente una
caracterstica de otros genomas, en los cuales, las
secuencias de los satlites podran no estar relacio-
nadas. Cada satlite surge de una ampliacin lateral de
una secuencia muy corta, la cual podra representar
una variante de un satlite ya existente (como en
D
. virilis), o tener otro origen.
Los satlites se generar y eliminan continua-
mente del genoma, lo cual dificulta establecer las
relaciones evolutivas, ya que un satlite actual pue-
de haber evolucionado de uno anterior
, ya perdido.
La caracterstica importante de estos satlites es que
representan fragmentos muy largos de DNA con secuen-
6
.
1 Los satlites de los artrpodos tienen repeticiones idnticas muy cortas
119
das poco complejas, dentro de los cuales se puede mantener
una secuenda constante.
Una de las caractersticas de muchos de estos
satlites es una pronunciada asimetra en la orien-
tacin de los pares de bases de las dos cadenas. En el
ejemplo de los satlites de D. virilis que se muestra en
la Figura 6.22, una de las cadenas es mucho ms rica
en bases T y G en cada uno de los satlites mayores,
con lo cual aumenta su densidad boyante, de mane-
ra que en la desnaturalizacin, esta cadena pesada
(H, heavy) puede ser separada de la cadena ligera (L,
light) complementaria, procedimiento que facilita la
determinacin de la secuencia del satlite.
CTCT Los satlites de Los mamferos
constan de repeticiones
jerrquicas
Concepto principal
.
El DNA satlite del ratn ha evolucionado por
duplicacin y mutacin de una unidad de repeticin
corta para dar origen a una unidad de repeticin bsica
de 234 bp en la que pueden ser reconocidas la mitad, la
cuarta parte y la octava parte de la repeticin original.
En los mamferos, tipificados por varios roedores,
las secuencias que componen cada satlite mues-
tran divergencias apreciables en las repeticiones en
tndem. Las secuencias cortas comunes se recono-
cen por su preponderancia entre los fragmentos de
oligonucletidos liberados por tratamiento qumico
o enzimtico, si bien la predominante suele cons-
tituir una escasa minora de las copias. Las secuen-
cias cortas restantes se relacionan con la secuencia
predominante por una variedad de sustituciones,
deleciones e inserciones.
Sin embargo, una serie de las variantes de la
unidad corta puede constituir una unidad de repe-
ticin ms larga, que a su vez se repite en tndem
con ciertas variaciones, de modo que los DNA sat-
lite de los mamferos se construyen a partir de una
jerarqua de unidades de repeticin. Estas unidades
de repeticin ms largas constituyen las secuencias
que se renaturalizan en el anlisis de reasociacin,
las cuales tambin pueden ser reconocidas mediante
digestin con enzimas de restriccin.
Cuando un DNA satlite es digerido con una
enzima que tiene un sitio de reconocimiento en su
unidad de repeticin, se obtendr un fragmento
para cada unidad de repeticin en la que se presen-
te el sitio. De hecho, cuando el DNA de un genoma
eucaritico es digerido con una enzima de restric-
cin, la mayor parte de l produce una mancha
generalizada debido a la distribucin aleatoria de
los sitios de divisin. No obstante, el DNA satlite
genera bandas agudas porque un gran nmero de
fragmentos del mismo tamao, o casi, son creados
por divisin en los sitios de restriccin separados por
una distancia regular.
La determinacin de la secuenda del DNA sa-
tlite puede ser difcil. Usando las bandas discretas
generadas por la divisin por restriccin, se puede
intentar directamente la obtencin de una secuen-
cia, pero si hay una divergencia apreciable entre las
unidades de repeticin, en la misma posicin, pero
en repeticiones distintas, se presentarn diferentes
nucletidos, de manera que los geles de secuencia-
cin sern oscuros. Si la divergencia no es consi-
derable, digamos en el rango del -2%, ser posible
determinar una secuencia de repeticin promedio.
Se pueden insertar segmentos individuales del
satlite en plsmidos, para su clonacin, aunque un
problema es que, en el hospedador bacteriano, las
secuencias satlite tienden a ser escindidas del pls-
mido quimrico por recombinacin. No obstante,
cuando la clonacin es exitosa, permite determinar
sin ambigedades la secuencia del segmento clona-
do. A pesar de que as se obtiene la secuencia de la
unidad de repeticin, o de las unidades, se necesitan
varias de estas secuencias individuales para recons-
truir como un todo el tipo de divergencia tpico de
los satlites.
Mediante cualquier mtodo de secuenciacin, la
informacin que se puede obtener depende de la dis-
tancia analizable en un conjunto de geles de secuen-
cia. La repeticin de copias en tndem divergentes
hace imposible la reconstruccin de secuencias ms
largas mediante superposiciones de fragmentos de
restriccin individuales.
El DNA satlite del ratn M. musculus es dividido
por la enzima EcoRII en una serie de bandas, in-
cluido un fragmento monomrico predominante de
234 bp. Esta secuencia debe repetirse con pocas va-
riantes en el 60% a 70% del satlite, que es dividido
en la banda monomrica. Esta secuencia se puede
analizar en funcin de las unidades de repeticin
constituyentes, cada vez ms pequeas.
En la IGURA 6.24 se ilustra la secuencia en cuan-
to a dos medias repeticiones. Al escribir la secuen-
cia de 234 bp de manera que los primeros 117 bp
se alineen con los segundos, se observa que ambas
mitades estn bastante bien relacionadas, aunque
difieren en 22 posiciones, lo cual corresponde a una
divergencia del 19%, es decir, que la unidad de re-
peticin actual de 234 bp debe haberse generado
en algn momento del pasado por duplicacin de
una unidad de repeticin de 117 bp, y despus se
acumularon diferencias entre los duplicados.
En la unidad de 117 bp se identifican dos sub-
unidades ms, cada una de las cuales corresponde a
120
CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
Las mitades de repeticin del DNA satlite del ratn estn estrechamente relacionadas
10 20 30 40 50 60 70
G
80 90 100 110
sacctggaatatggcgagaaaactgaaaatcacggaaaatgagaaatacacactttaggacgtgaaatatggcgagaaaactgaaaaaggtggaaaattIagaaatgtccactgta
33ACGTGGAATATGGCAAGAAAACTGAAAATCATGGAAAATGAGAAACATGCACTTGACGACTTQAAAAATGACGAAATCACTAAAAAAGGTGAAAAATGAGAAATGCACACTGAA
100 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230
KURA 6.2A La unidad de repeticin del DNA satlite del ratn contiene dos mitades de repeticin, alienadas para mostrar las identi
"
-;:
s (en color azul).
I DNA satlite del ratn puede se
10 20 30 40 50
GGACCTGGAATATGGCGAGAAAACTGAAAATCACGGAAAATGAGAAATACACACTTTA
60 70 80 90 110 100
G T
GGACGTGAAATATGGCGAGAAAAGTGAAAAAGGTGGAAAATTAGAAATGTCGACTGTA
120 130 140 | 150 | 160 170
GGACGTGGAATATGGCAAGAAAACTGAAAATCATGGAAAATGAGAAACATCCACTTGA
180 190 200 210 220 230
CGAGTTGAAAAATGACGAAATCACTAAAAAACGTGAAAAATGAGAAATGCACACTGAA
FIGURA 6.25 El alineamiento de los cuartos de repeticin identifica homologas entre la
primera y la segunda mitad de cada mitad de repeticin. Las posiciones que son las mismas
en todos los cuartos de repeticin se muestran en color gris; las identidades que abarcan slo
tres de los cuartos de repeticin se indican con letras negras en el rea verde.
I cuarto de repeticin, respecto del satlite ente-
los cuatro cuartos de repeticin aparecen ali-
ados en la FIGURA 6.2 . Las dos lneas superiores
presentan a la primera mitad de repeticin de la
ptra 6.24, las dos ineriores, a la segunda mitad
repeticin; es obvio que la divergencia entre los
"
to cuartos de repeticin ha aumentado a 23 de
> posiciones, o 40 por ciento. En cierta forma, los
teeros tres cuartos de repeticin estn mejor re-
roados, y gran parte de la divergencia se debe a
rabios en el ltimo cuarto de repeticin.
Observando cada cuarto de repeticin, se ve
i cada uno consta de dos subunidades relaciona-
s mn octavo de repeticin), marcadas como se-
encias a y [3 en la FI i 6.26. Todas las secuencias
v enen una insercin de C
, en tanto que las [3 in-
i yen la insercin de un trinucletido, respecto de
ta secuencia de consenso comn. Esto sugiere que
;
uarto de repeticin se origin por duplicacin
una secuencia como la secuencia de consenso,
pus de lo cual ocurrieron cambios para gene-
los componentes que ahora observamos como
| 3. Entre las secuencias a|3 repetidas en tndem
leron lugar cambios posteriores para generar los
;
rtos y las mitades de la repeticin original que
isten hoy. Entre los octavos de repeticin, la di-
-
-
encia actual es de 19/31=61%.
la secuencia de consenso se analiza directamen-
i*n la FIGURA 6.27, en la cual se demuestra que la
mencia satlite actual puede ser considerada como
un derivado de una secuencia de 9 bp. En el satlite
se identifican tres variantes de esta secuencia, segn
se indica en la parte Inferior de la figura. Si en una
de las repeticiones se toma la siguiente base ms fre-
cuente en dos posiciones, y no la ms frecuente, se
obtienen tres secuencias de 9 bp bien relacionadas:
GAAAAACGT
GAAAAATGA
GAAAAAACT
El origen del satlite muy bien podra estar en
una amplificacin de uno de estos tres nonmeros.
La secuencia de consenso general del satlite actual
es GAAAAA T, que efectivamente es una amalga-
ma de las tres repeticiones de 9 bp.
La secuencia promedio del fragmento mono-
mrico del DNA satlite del ratn explica sus pro-
piedades. La unidad de repeticin ms larga, de 234
bp, se identifica mediante divisin por restriccin.
La unidad de reasociacin entre las cadenas indi-
viduales del DNA satlite desnaturalizado es pro-
bablemente la mitad de la unidad de repeticin de
117 bp porque los fragmentos de 234 bp pueden
asociarse ambos en un registro y en medio registro
(en el ltimo caso, la primera mitad de repeticin
de una cadena se renaturaliza con la segunda mitad
de repeticin de la otra).
Hasta aqu se ha tratado al satlite presente
como formado por copias idnticas de la unidad de
repeticin de 234 bp, y si bien esta unidad represen-
6
.13 Los satlites de los mamferos constan de repeticiones jerrquicas 121
al
P1
a2
p2
a3
p3
a4
P4
Consenso
vos de repeticin identifican a la unidad satlite ancestral del ratn
GGACCTGGA ATATGGCGAGA A AACTGAA
A ATCAGGGAA AATGA GA A A T A 0 A 0ACTTTA
GGACGTGAAATATGGCGAGAGA AACTGAA
AAAGGTGGAAAATTTA GAAATGTCCACTGTA
GGACGTGGAATATGGCAAGAA AACTGAA
AATCATGGAAAATGA GA AACATCCACTTGA
CGACTTGAA A AATGACGA AAT CACTAAA
AAACGTGAAAAATGA GAAATGCACACTGAA
AAACGTGAAAAATGA G A A A T CACTGAA-..
Ancestral? AAACGTGAAAAATGA GAAATGCACACTGAA
FIGURA 6.l El alineamiento de los octavos de repeticin muestra que cada cuarto de repeticin
consiste en una mitad a y una [i La secuencia consenso proporciona La base ms comn en cada
posicin. La secuencia
"
ancestral
"
muestra una secuencia muy estrechamente relacionada con la
secuencia consenso, que pudo haber sido el predecesor de Las unidades ay p. (La secuencia sat-
lite es continua, de manera que con el fin de deducir la secuencia consenso, se puede tratar como
permutacin circular, segn indica la unin del ltimo triplete GAA con Los primeros 6 bp.)
ta la mayor parte del satlite, tambin hay variantes
de ste, algunas de las cuales estn distribuidas alea-
toriamente en el satlite y otras estn agrupadas.
La existencia de variantes se deriva de que el
material inicial para el anlisis de secuencia haya
sido descrito como fragmento
"
monomrico
"
. Cuan-
do el satlite es digerido por una enzima que tiene un
sitio de divisin en la secuencia de 234 bp, tambin
genera dmeros, trmeros y tetrmeros relativos al
fragmento de 234 bp, los cuales surgen cuando una
unidad de repeticin ha perdido el sitio de divisin
de la enzima como resultado de una mutacin.
La unidad monomrica de 234 bp es gene-
rada cuando dos repeticiones adyacentes tienen
cada una un sitio de reconocimiento. El dmero se
crea cuando una unidad ha perdido al sitio, un tr-
mero cuando dos unidades adyacentes han perdido
dicho sitio, y as sucesivamente. Con algunas en-
zimas de restriccin, la mayor parte del satlite se
divide en un miembro de sus series de repeticin,
como se muestra en el ejemplo de laFIGURA 6.28. La
declinacin del nmero de dmeros, trmeros, etc.,
muestra que hay una distribucin aleatoria de las
repeticiones en la cual el sitio de reconocimiento de
la enzima ha sido eliminado por mutacin.
En otras enzimas de restriccin se observa un
tipo diferente de comportamiento con el DNA sa-
tlite, pues siguen generando las mismas series de
bandas. De cualquier forma, dividen slo una pe-
quea proporcin del DNA, digamos de 5% a 10%,
lo cual implica que determinada regin del satlite
contiene una concentracin de unidades de repeti-
cin con este sitio de restriccin particular. Presu-
miblemente, todas las series de repeticiones de este
dominio se derivan de una variante ancestral que
posey a este sitio de reconocimiento (si bien en
el modo comn, algunos miembros lo han perdido
desde entonces, por mutacin).
Un DNA satlite experimenta una recombina-
cin desigual que tiene otras consecuencias cuando
en la unidad de repeticin hay una repeticin inter-
na. Volviendo al agrupamiento formado por repeti-
ciones
"
ab
"
, y suponiendo que los componentes "a"
y
"
b" d
e la unidad de repeticin tienen una relacin
suficientemente estrecha como para aparearse, los
dos agrupamientos podrn alinearse en medio regis-
tro, con la secuencia "a" de un grupo alineada con
la secuencia "b" del otro. La frecuencia con que esto
ocurra, depender de la cercana de la relacin entre
ambas mitades de la unidad de repeticin. In vitro,
en el DNA satlite del ratn, la reasociacin entre
las cadenas de DNA satlite desnaturalizado suele
tener lugar en el medio registro.
Cuando un evento de recombinacin sucede
fuera de registro, cambia la longitud de las unidades
de repeticin involucradas en la reaccin:
xababababababababababababababababy
x
xababababababababababababababababy
i
xababababababababaababababababababy
+
xabababababababab babababababababy
122
CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
El consenso del DNA satlite del ratn
est formado por 9 bp
G G A C C T
G G A A T A T G G C
G A G A A A A C T
G A A A A T C A C
G G A A A A T G A
G A A A T C A 0 T
T T A G G A C G T
G A A A T A T G G 0
G A G AG A A A C T
G A A A A A G G T
G G A A A A TTT A
G A A A T
*
C A C T
G T A G G A C G T
G G A A T A T G G c
A A G A A A A C T
G A A A A T C A T
G G A A A A T G A
G A A A 0
'
C A C T
T G A C G A 0 T T
G A A A A A T G A c
G A A A T C A C T
A A A A A A C G T
G A A A A A T G A
G A A A r C A C T
G A A
G20A16A21 A20A12A17T8 G11A5
T/ C5 Ag Cg Jf5
*
indica un tripiete insertado en la secuencia p
0 en la posicin 10 es una base extra en la secuencia o;
FIGURA 6.27 La existencia de una secuencia de consenso ge-
neral se muestra al escribir La secuencia satlite segn una
'
epeticin de 9 bp.
En el agrupamiento recombinante superior,
una unidad
"
ab
"
ha sido remplazada por una unidad
"
aab
"
, en tanto que en el inferior, la unidad "ab" ha
do remplazada por una unidad "b".
Este tipo de evento explica una caracterstica
fa extracto, digerido por enzimas de restriccin,
:
el DNA satlite del ratn. En la Figura 6.28 se ob-
ferva una serie desvanecida de bandas en los frag-
mentos de Vz, IV2, 2V2 y 2 unidades de repeticin,
adems de las repeticiones de fragmentos integrales
-
s fuertes. Supngase que en el ejemplo prece-
dente
,
"
ab
"
representa a la repeticin de 234 bp del
I NA satlite del ratn
, generada por divisin en
un sitio del segmento
"
b
"
. Los segmentos "a" y "b"
corresponden a las mitades de 117 bp de medias
repeticiones.
As pues, en el agrupamiento recombinante su-
perior, la unidad "aab
"
genera un fragmento de IV2
veces la longitud usual de la unidad de repeticin,
El DNA satlite del ratn tiene repeticiones
y mitades de repeticin
1
>
k
Tamao
FIGURA 6.28 La digestin del DNA satlite del ratn con la
enzima de restriccin EcoRII identifica una serie de unidades de
repeticin (1, 2 y 3) que son multmeros de 234 bp y tambin
una serie menor [Vi, Vk y ZVz) que incluye mitades de repeti-
ciones (vase el texto de esta pgina). La banda del extremo
izquierdo es una fraccin resistente a la digestin.
en tanto que, en el inferior, la unidad
"
b"
genera
un fragmento de la mitad de la longitud usual. (Los
mltiples fragmentos de la serie de la mitad de la
repeticin se generan del mismo modo que los ms
largos de la serie integral, en cuyo caso, algunas
unidades de repeticin han perdido el sitio de res-
triccin por mutacin.)
Invirtiendo el argumento, la identificacin de la
serie de la mitad de la repeticin en el gel muestra
que la unidad de repeticin de 234 bp est formada
por dos mitades de repeticin relacionadas lo sufi-
cientemente bien como para aparearse, en ocasio-
nes por recombinacin. En la Figura 6.28 tambin
pueden identificarse otras bandas bastante desvane-
cidas que corresponden a espaciamientos de V4 y %
de longitud, los cuales sern generados del mismo
modo que los espaciamientos de la mitad de la lon-
gitud, en los cuales la recombinacin ocurre entre
agrupamientos alineados en un cuarto de registro.
La relacin decreciente entre los cuartos de repeti-
ciones, comparada con las mitades de repeticiones,
explica la reduccin en la frecuencia de las bandas
de 1 y de M, respecto de las bandas de V2.
Bffl Los minisatLites facUitan
el mapeo gentico
Concepto principal
La variacin entre los microsatlites o minisatlites
de los genomas permite identificar la herencia
inequvocamente, pues demuestra que el 50% de las
bandas de un individuo derivan de un progenitor
especifico.
6.14 Los minisatlites facilitan el mapeo gentico
123
El nmero d
Progenitores
GGGCAGGAXG
CCCGTCC TXC
Divisin
iere entre genomas
No, de .epeticin
Divisin
Progenitor 1
Progenie
Progenitor 2-
5
7
:::
6
,
7
6
<
5
v v t y
FIGURA 6.29 Los alelos pueden diferir en cuanto al nmero de repeti-
ciones en el locus de un minisatlite, de modo que la divisin de cada
lado genera fragmentos de restriccin que difieren en longitud. Se puede
seguir el patrn de herencia utilizando un minisatlite con alelos que
difieren entre los progenitores.
Las secuencias que parecen satlites por su cons-
titucin de repeticiones en tndem de una unidad
corta, pero que en general son mucho ms cortas,
por ejemplo, de 5 a 50 repeticiones, son comunes en
los genomas de los mamferos y fueron descubiertas
por casualidad como fragmentos cuyas dimensiones
son muy variables en las genotecas del DNA huma-
no. La variabilidad resalta cuando una poblacin
contiene fragmentos de muchos tamaos diferen-
tes que representan la misma regin genmica, y
al examinar a los individuos, resulta que hay gran
polimorfismo y que pueden encontrarse muchos
alelos diferentes.
El apelativo de microsatlite se utiliza en ge-
neral cuando la longitud de la unidad de repeticin
es <10 bp, en tanto la longitud de la unidad de repe-
ticin del minisatlite es de ~ 10 a 100 bp, aunque la
terminologa no ha sido definida con precisin. Este
tipo de secuencias tambin se llaman regiones de re-
peticiones en tndem de nmero variable (VNTR,
variable number tndem repeat).
La causa de la variacin entre genomas en los
microsatlites o minisatlites es que cada alelo tie-
ne un nmero diferente de unidades de repeticin.
Por ejemplo, un minisatlite tiene una longitud de
repeticin de 64 bp y se distribuye en la poblacin
de la manera siguiente:
7% de 18 repeticiones
11% de 16 repeticiones
43% de 14 repeticiones
36% de 13 repeticiones
4% de 10 repeticiones
La velocidad de intercambio gentico en las se-
cuencias de los minisatlites es alta, de ~10
"
4
por
kb de DNA. (Se supone que la frecuencia de los
intercambios por locus es proporcional a la longitud
del minisatlite.) Esta velocidad es -10 veces mayor
que la velocidad de recombinacin homloga en la
meiosis, es decir, en cualquier secuencia de DNA
aleatoria.
La gran variabilidad de los minisatlites los hace
especialmente tiles para el mapeo gentico, pues es
alta la probabilidad de que los alelos de un individuo
varen en un locus determinado. En la FIGURA 6.29 se
muestra un ejemplo de mapeo por minisatlites que
constituye un caso extremo en que dos individuos
son heterocigotos en el locus de un minisatlite y,
de hecho, los cuatro alelos son diferentes. Toda la
progenie obtiene un alelo de cada progenitor del
modo usual y es posible determinar sin ambigedad
la fuente de cada alelo de la progenie. En la termi-
nologa de la gentica humana, las meiosis descritas
en esta figura proporcionan gran cantidad de infor-
macin por la variacin entre alelos.
Una familia de minisatlites del genoma huma-
no comparte una secuencia
"
nuclear
"
comn. El
ncleo es una secuencia rica en G-C de 10 a 15 bp
que muestra asimetra en la distribucin de puri-
nas/pirimidinas en ambas dos cadenas. Cada mini-
satlite tiene una variante de la secuencia nuclear,
pero ~1 000 minisatlites pueden ser detectados en
la hibridacin por el mtodo de Southern mediante
una sonda formada por la secuencia nuclear.
Considrese la situacin mostrada en la Figura
6
.29, pero multiplicada varias veces por la existen-
cia de muchas de estas secuencias. El efecto de la
variacin en los loci individuales es la creacin de
un patrn nico para cada individuo, lo cual hace
posible asignar sin ambigedad la herencia entre los
progenitores y la progenie al demostrar que 50%
de las bandas de cualquier individuo derivan de un
progenitor en particular. Esto constituye la base de
la tcnica conocida como "huella digital del DNA".
Tanto los microsatlites como los minisatlites
son inestables, aunque por diferentes razones. Los
primeros experimentan un apareamiento errneo
intracatenario cuando el deslizamiento durante la
replicacin conduce a la expansin de la repeticin,
como se muestra en la FIGURA 6.30. Los sistemas que
reparan los daos que sufre el DNA, en particular
124
CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
k que detectan pares de bases apareados errnea-
nente, son importantes para la reversin de tales
arabios
, como se muestra por un gran incremen-
en la frecuencia cuando los genes reparadores
D desactivados. Las mutaciones de los sistemas
e reparacin contribuyen de manera importante
- desarrollo del cncer, pues las clulas tumora-
B suelen mostrar variaciones en las secuencias de
\ microsatlites. Los minisatlites experimentan
mismo tipo de entrecruzamiento desigual entre
-peticiones descrito para los satlites (vase Fig.
3). Un caso contundente es que el incremento en
nmero de variaciones se relaciona con un pun-
caliente meitico. El evento de recombinacin
; suele relacionarse con la recombinacin entre
arcadores flanqueantes, pero presenta una forma
ompleja en la cual el nuevo alelo mutante obtiene
"
ormacin tanto de la cromtida hermana como
id otro cromosoma (homlogo).
No es obvio en qu fragmento de repeticin la
;::sa de la variacin cambia de deslizamiento de
rolicacin a recombinacin.
Resumen
i>i todos los genes pertenecen a familias, defini-
-
stas por secuencias relacionadas en los exones
:
cada miembro. Las familias evolucionan por la
iplicacin de un gen (o genes) seguida de diver-
rxia entre las copias, algunas de las cuales su-
?n mutaciones desactivadoras y se transforman
-
seudogenes que ya no tienen ninguna funcin.
;
seudogenes tambin pueden ser generados como
pas de DNA de las secuencias de RNAm.
Un sistema de genes en proceso de evolucin
:
rde mantenerse unido en un agrupamiento o
spersarse en nuevas ubicaciones por reestructu-
;:
n cromosmica. En ocasiones, la organizacin
:
los agmpamientos existentes puede ser usada
::
-
inferir la serie de eventos ocurridos, los cuales
:
an respecto de la secuencia y no de la funcin,
:
modo que incluyen tanto a seudogenes como a
"
es activos.
Las mutaciones se acumulan ms rpidamente
los sitios silenciosos que en los de remplazo (que
;;:
an la secuencia de aminocidos). El rango de
'
.
ergencia en los sitios de remplazo puede utilizar-
para establecer un reloj calibrable en porcentaje
1 diver
gencia por milln de aos que se utilizara
-
?. calcular el tiempo de divergencia entre dos
iembros cualesquiera de la familia.
Un agrupamiento en tndem est formado por
:
has copias de una unidad de repeticin que
duye la(s) secuenda(s) transcrita(s) y a un(os)
idador(es) no transcrito(s). Los agmpamientos
El deslizamiento en la replicacin cambia la longitud de la repeticin
TCAGTGTGTGTGTGTG
AGTCAGACACACAC.AC.
TCAGTGTGTGTGTq
tg
gtcacacacagac ac
tcagtgtgtgtgt g
tg.
CAC
r
Deslizamiento TCAGTGTGTGTGTq,
de una TG
AGTCACACACACA1
repeticin
"
. AC
AGTCAOACACACAC
Deslizamiento TCAGTGTGTGTGTq,
de una Tq
repeticin
AGTCACACACACA
TCAGTGTGTGTGT
q
T
AC
Siguiente
.
ciclo de
repeticin
TCAGTGTGTGTGTGTG
+
jTQTeTG
'
lACACAC
AGTCACACACACA
O EL deslizamiento en la replicacin sucede cuando la cadena
hija se desliza hacia atrs una unidad de repeticin al aparearse con la ca-
dena molde. Cada evento de deslizamiento agrega una unidad de repeticin
a la cadena hija. Las repeticiones extra se extraen como un lazo de cadena
individual. La duplicacin de esta cadena hija en el siguiente ciclo genera
un DNA dplex con un nmero mayor de repeticiones.
de genes de RNAr codifican a un solo precursor de
RNAr. La conservacin de los genes activos en los
agrupamientos depende de mecanismos como la
conversin gnica o el entrecruzamiento desigual,
que hacen que las mutaciones se esparzan por todo
el agrupamiento y queden expuestas a la presin
evolutiva.
El DNA satlite consta de secuencias muy cor-
tas repetidas muchas veces en tndem. Sus distintas
propiedades de centrifugacin reflejan su composi-
cin de bases sesgada. El DNA satlite se concentra
en la heterocromatina centromrica, pero se desco-
noce su funcin (si la tiene). Las unidades de repeti-
cin de los satlites de los artrpodos son idnticas,
en tanto que las de los satlites de los mamferos
estn relacionadas y pueden organizarse en una je-
rarqua que refleje la evolucin del satlite por la
ampliacin y divergencia de secuencias elegidas de
forma aleatoria.
El entrecruzamiento desigual parece haber sido
un determinante importante en la organizacin del
DNA satlite. La fijacin cruzada explica la capaci-
6.
15 Resumen 125
dad de las variantes para distribuirse por el agru-
pamiento.
Los minisatlites y los microsatlites consisten
en secuencias de repeticin an ms cortas que las
de los satlites, <10 bp para los microsatlites y de
10 a 50 bp para los minisatlites. El nmero de uni-
dades de repeticin suele ser de 5 a 50, con variacio-
nes considerables en el nmero de repeticiones de
un genoma a otro. El nmero de repeticiones de un
microsatlite vara como resultado del deslizamiento
durante la replicacin; la frecuencia es afectada por
sistemas que detectan y reparan daos en el DNA.
El nmero de repeticiones de un minisatlite vara
como resultado de eventos similares a la recombi-
nacin. La variacin en el nmero de repeticiones
puede ser usada para determinar relaciones heredi-
tarias por medio de la tcnica conocida como "hue-
lla digital del DNA".
Referencias
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importante en La evolucin
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La velocidad de sustitucin neutral puede ser
medida a partir de La divergencia de secuencias
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Artculo de investigacin
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126 CAPTULO 6 Agrupamientos y repeticiones
El RNA mensajero
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
El RNAm se produce por transcripcin y se traduce
.
Slo una de las dos cadenas de DNA se transcribe en RNA.
El RNA de transferencia forma una hoja de trbol
.
Un RNAt tiene una secuencia de 74 a 95 bases que se dobla
para formar una estructura secundaria de hoja de trbol
con cuatro brazos constantes (y un brazo adicional en los
RNAt ms largos).
.
El RNAt se carga para formar un aminoacil-RNAt y da lugar
a un enlace ster del grupo OH 2
'
o 3' del cido adenilico
en el extremo del brazo aceptor del grupo COOH del
aminocido.
.
La secuencia del anticodn mada ms es responsable de la
especificidad del aminoacil-RNAt.
El tallo aceptor y el anticodn se encuentran en
los extremos de la estructura terciaria
.
La hoja de trbol constituye una estructura terciaria en
forma de L con el brazo aceptor en un extremo y el brazo
anticodn en el otro.
El RNA mensajero es traducido por los ribosomas
.
Los ribosomas se caracterizan por su velocidad de
sedimentacin {70S en los bacterianos y SOS en los
eucariticos).
.
Un ribosoma est formado por una unidad grande (de 505
o 60S en bacterias y eucariotas) y una subunidad pequea
(de SOS o 40S).
.
El ribosoma proporciona el ambiente en el cual el
aminoacil-RNAt agrega aminocidos a la cadena
polipeptidica creciente en respuesta a los codones
correspondientes.
.
Un ribosoma se desplaza a lo largo de una molcula de
RNAm en direccin 5' a 3'.
A una molcula de RNAm se unen numerosos
ribosomas
.
Una molcula de RNAm es traducida simultneamente por
numerosos ribosomas. Cada ribosoma se encuentra en una
etapa diferente de progresin a lo largo del RNAm.
El ciclo vital del RNA mensajero de Las bacterias
.
En las bacterias, la transcripcin y la traduccin ocurren
simultneamente, pues los ribosomas empiezan a traducir
un RNAm antes de que su sntesis est completa.
.
El RNAm bacteriano es inestable y su vida media es de slo
unos cuantos minutos.
.
Un RNAm bacteriano puede ser policistrnico, con varias
regiones codificadoras que representan a diferentes genes.
WBM
El RNAm eucaritico es modificado durante su
transcripcin o despus de sta
.
Un transcrito de RNAm eucaritico es modificado en el
ncleo durante o poco despus de su transcripcin.
.
Las modificaciones incluyen la adicin de un casquete
metilado en el extremo 5
'
y una secuencia de poli(A) en el
extremo 3
'
.
.
El RNAm no es exportado del ncleo al citoplasma hasta
que todas las modificaciones estn completas.
El extremo 5' del RNAm eucaritico posee un
casquete
.
Un casquete 5' se forma al agregar una G a la base terminal
del transcrito a travs de una ligadura 5'-5'. A la base o
ribosa de la guanosina terminal nueva se agregan de uno a
tres grupos metilo.
El extremo 3' est poliadenilado
.
Despus de la transcripcin se agrega un fragmento de
poli(A) de ~200 nucletidos a un transcrito nuclear.
.
El poli(A) est unido a una protena especfica (PABP).
.
El poli(A) estabiliza al RNAm contra la degradacin.
La degradacin del RNAm bacteriano involucra a
mltiples enzimas
.
La direccin global de la degradacin del RNAm bacteriano
es de 5
'
a 3'.
La degradacin es resultado de la combinacin de
divisiones endonucleolticas seguidas de la degradacin
exonucleoltica del fragmento de 3
'
->5
'
.
La estabilidad del RNAm depende de su estructura
y su secuencia
.
Las modificaciones de ambos extremos del RNAm
lo protegen contra la degradacin mediada por las
exonucleasas.
.
Las secuencias especficas de un RNAm pueden producir
efectos estabilizadores o desestabilizadores.
*
La desestabilizacin puede ser activada por la prdida de
poli (A).
La degradacin del RNAm implica mltiples
actividades
.
Para la degradacin del RNAm de las levaduras se requiere
de la eliminacin del casquete 5' y del poli(A) 3'.
.
Una ruta de las levaduras implica la degradacin
exonucleoltica en direccin 5
'
->3
'
.
*
Otra ruta de las levaduras utiliza un complejo de numerosas
exonucleasas que funcionan en direccin 3
'
->5
'
.
.
La desadenilasa de las clulas animales puede unirse
directamente con el casquete 5'.
Contina en la siguiente pgina
127
Las mutaciones sin sentido activan un sistema
de vigilancia
Las mutaciones sin sentido provocan la degradacin
del RNAm.
.
En [as levaduras y [os gusanos se han encontrado
genes que codifican a[ sistema de degradacin.
Las molculas de RNA eucaritico se
transportan
E[ RNA es transportado a travs de una membrana a
manera de partieras ribonudeoprotenicas.
.
Todas [as mo[cu[as de RNA eucaritico que funcionan
en e[ citopiasma deben exportarse desde e[ ndeo.
.
Las mo[cu[as de RNAt y e[ componente de RNA
de una ribonudeasa se importan a[ interior de [as
mitocondrias.
.
Las mo[cu[as de RNAm pueden recorrer grandes
distancias entre [as cUas de las p[antas.
EL RNAm puede localizarse especficamente
.
El RNAm del Ashl de ta levadura forma una
ribonudeoprotena que se une a un motor de miosina,
.
Un motor [o transporta a [o [argo de [os famentos de
actina en e[ brote germinal
.
Se anda y se traduce en e[ brote, de manera que la
protena se encuentra slo en el brote.
Resumen
WKM Introduccin
El RNA es uno de los participantes principales de la
expresin gnica que en un principio se caracteriz
como intermediario en la sntesis de protenas, pero
desde entonces se han descubierto muchas otras
molculas de RNA que desempean un papel es-
tructural o funcional en otras etapas de la expresin
gnica. La implicacin del RNA en muchas funcio-
La sntesis protenica utiliza tres tipos de RNA
El RNAm tiene una secuencia de bases que representa a una protena
*3t L
Rango de dimensiones de 500-10 000 bases
El RNAt es una molcula
pequea de RNA con
estructura secundaria extensa:
Rango de dimensiones de
74-95 bases
os RNAr principales tienen una
se asocian con protenas para
formar el nbosoma: Rango de
dimensiones de 1 500-1 900
(RNAr pequeo) y de 2 900-4 700
(RNAr grande)
Los tres tipos de RNA umversalmente necesarios
para La expresin gnica son RNAm (que porta [a secuencia
codificadora), RNAt (que proporciona Los aminocidos corres-
pondientes a cada codn) y RNAr (componente importante
del ribosoma que proporciona el ambiente necesario para la
sntesis protenica).
nes relacionadas con la expresin gnica respale:
la perspectiva general de que todo el proceso puc
haber evolucionado en un "mundo de RNA" en |
cual ste fue originalmente el componente activo
responsable de conservar y expresar la informacin
gentica. Muchas de estas funciones fueron sut-
secuentemente asumidas por las protenas, con i
consiguiente incremento de la versatilidad y, prc
bablemente, la eficiencia.
Como se resume en la iGURA 7.i, en la produc-
cin de las protenas participan directamente tre;
clases principales de RNA:
.
El RNA mensajero (RNAm, messenger RNA
constituye un intermediario que porta i
copia de una secuencia de DNA que repre-J
senta protenas.
.
Los RNA de transferencia (RNAt, transm
RNA) son molculas pequeas de RNA uti-
lizadas para suministrar los aminocidos co-
rrespondientes a cada codn especfico dt\
RNAm.
.
Los RNA ribosmicos (RNAr, ribosoma.
RNA) son componentes del ribosoma, com-
plejo ribonucleoprotenico de gran tamao
que contiene numerosas protenas y sus
componentes de RNA, los cuales propor-
cionan el mecanismo para polimerizar a los
aminocidos en una cadena polipeptdica.
El tipo de funcin del RNA en cada caso es dis-
tinto. En el RNA mensajero, su secuencia es la ca-
racterstica importante: cada triplete de nucletidos
de la regin codificadora del RNAm representa a
un aminocido en la protena correspondiente. Sin
embargo, la estructura del RNAm, en particular las
secuencias localizadas a ambos lados de la regin
codificadora, puede ser importante para el control
de su actividad y, por lo tanto, de la cantidad de
protena producida a partir de l.
En el RNAt se observan dos de los temas co-
munes que rigen el uso del RNA: su estructura
tridimensional es importante y tiene la capacidac
de aparearse con otro RNA (RNAm). La estructura
128
CAPTULO 7 EL RNA mensajero
dimensional se reconoce primero por una enzima
- e constituye una diana apropiada para el vncu-
;
on un aminocido especfico que crea un ami-
acil-RNAt, identificado como la estructura que
;
utiliza para la sntesis protenica. La especifici-
;
z de uso de un aminoacil-RNAt se controla por
apareamiento de las bases,
cuando una secuencia
'
?!ete corta (anticodn) se aparea con el triplete de
-detidos que representa a su aminocido.
En el RNAr se observa otro tipo de actividad;
-
-
a de sus funciones es estructural, de manera que
:
-porcionando un marco en el que se adhieren
- protenas ribosmicas, adems de que participa
rectamente en las actividades del ribosoma. Una
-
las actividades principales de este ltimo es su
acidad para catalizar la formacin de un enlace
t .. adico mediante el cual se incorpora un amino-
ado a una protena. Esta actividad reside en uno
7 los RNAr.
Lo importante de este antecedente es que, al
-templar la funcin del RNA en la sntesis pro-
:
nica, se debe analizar como un componente que
:;
:
empea una funcin activa y que puede ser
r eto de regulacin tanto por protenas como por
ras molculas de RNA; no se debe olvidar, por otra
are
, que los RNA pueden haber sido las bases del
:
arato original. El tema constante en todas las ac-
tividades del RNA, tanto en la sntesis de protenas
mo en otras partes, es que sus funciones depen-
- ?n fundamentalmente del apareamiento de bases
:
:a formar su estructura secundaria y para interac-
-
ar especficamente con otras molculas de RNA.
U funcin codificadora del RNAm es nica, si bien
:
RNAt y el RNAr son ejemplos de una clase mucho
as amplia de molculas de RNA no codificadoras
- n diversas funciones en la expresin gnica.
m EL RNAm se produce por
transcripcin y se traduce
Concepto principal
.
Slo una de Las dos cadenas de DNA se transcribe en
RNA.
-a expresin gnica tiene lugar mediante un pro-
Eeso de dos etapas.
La transcripcin genera un RNA de cadena
nica con una secuencia idntica a la de una
de las cadenas del dplex de DNA.
n: La traduccin convierte a la secuencia de
nucletidos del RNAm en una secuencia
de aminocidos que forman una protena.
No todo el RNAm se traduce, pero cada
RNAm contiene por lo menos una regin
codificadora relacionada con una secuencia
protenica a travs del cdigo gentico: cada
triplete de nucletidos (codn) de la regin
codificadora representa a un aminocido.
Slo una de las cadenas de un DNA dplex se
transcribe en un RNA mensajero. Las dos cadenas de
DNA se distinguen segn se ilustra en la FIGUR/> :
.
La cadena de DNA que dirige la sntesis de
RNAm por el apareamiento complementa-
rio de bases se denomina cadena molde o
cadena anticodificadora. {Antisentido es el
trmino general para describir una secuen-
cia de DNA o de RNA complementaria al
RNAm).
.
La otra cadena de DNA tiene la misma se-
cuencia que el RNAm (excepto por T, en
lugar de U) y se le denomina cadena codi-
ficadora o cadena con sentido.
En este captulo se describe el RNAm y su fun-
cin de molde para la sntesis protenica. En el Ca-
ptulo 8, Sntesis protenica, se analizar el proceso
por el cual se sintetiza una protena, en tanto que en
el 9, Utilizacin del cdigo gentico, se describir la
forma en que se utiliza el cdigo gentico para inter-
pretar el significado de una secuencia de RNAm. En
el Captulo 10, Localizacin de las protenas, el en-
foque est en la interrogante sobre cmo encuentra
una protena su localizacin apropiada en la clula
durante la sntesis o despus de ser sintetizada.
Expresin gnica = transcripcin -4- traduccin
Cadena coditicadora = de sentido
Cadena molde = de antisentido
Transcripcin
Traduccin
2 La transcripcin genera un RNA complementario
a la cadena molde del DNA y tiene la misma secuencia que la
cadena codificadora del DNA. La traduccin interpreta cada
triplete de bases y le asigna un aminocido. Tres vueltas de
una molcula de DNA duplohelicoidal contienen 30 bp, que
codifican a 10 aminocidos.
7.2 EL RNAm se produce por transcripcin y se traduce
129
El RNAt es un adaptador
Aminocido
ligado al extremo
3' del RNAt
-Aminocido
Base 3'
del RNAt
Aminocido
XTOOO RNAm
El brazo est
formado por:
.
Tallo de bases
apareadas
.
Lazo de cadena
individual
Apareamiento
codn-anticodn
Un RNAt tiene Las propiedades duales de un adap-
tador que reconoce al aminocido y al anticodn. La adenosina
3
'
est ligada de forma covalente a un aminocido. El anticodn
se aparea con el codn del RNAm.
La estructura del RNAt secundario
es una hoja de trbol
73
72
71
70
69
68
"
67
66
Brazo aceptor-
Brazo D-
16 Pu
u
-
r Brazo
"
I>C
17
G
-
G
py59
65646362 0 A
A 1312Py10
20 A
22 23Pu25
44 45
26
27 43
28 42
29 41
30 40
31 39
py 38
U Ru-
34 36
35
49 50 51 52 G
Py
Pu
47
46
L Brazo extra
Anticodn J
La hoja de trbol de RNAt tiene bases invariables,
bases semiinvariables y un conjunto conservado de interaccio-
nes de apareamiento de bases.
EL RNA de transferencia forma
una hoja de trbol
Conceptos principales
.
Un RNAt tiene una secuencia de 74 a 95 bases que se
dobla para formar una estructura secundaria de hoja
de trbol con cuatro brazos constantes (y un brazo
adicional en los RNAt ms largos).
.
El RNAt se carga para formar un aminoacil-RNAt y da
lugar a un enlace ster del grupo OH 2' o 3' del cido
adenlico en el extremo del brazo aceptor del grupo
COOH del aminocido.
.
La secuencia del anticodn nada ms es responsable de
la especificidad del aminoacil-RNAt.
El RNA mensajero se distingue del mecanismo res-
ponsable de su traduccin mediante sistemas sin c-
lulas para sintetizar protenas in vitro. Con un sistema
de sntesis de protenas a partir de un tipo de clulas se pue-
de traducir el RNAm de otro para demostrar que el cdig:
gentico y el mecanismo de traduccin son universales.
Cada triplete de nucletidos del RNAm repre-
senta un aminocido. La incongruencia estructura]
entre un trinucletido y un aminocido conduce
inmediatamente a preguntarse cmo se aparea cada
codn con su aminocido especfico. El
"
adaptador
'
es el RNA de transferencia (RNAt), que tiene do
propiedades clave;
.
Representa a un solo aminocido, al cual se
une deforma covalente.
.
Contiene una secuencia de tres nucletidos,
el anticodn, que es complementaria del co-
dn que representa a su aminocido. El antico-
dn permite al RNAt reconocer el codn por
el apareamiento de bases complementarias.
Todas las molculas de RNAt tienen estructuras
secundarias y terciarias comunes. La estructura se-
cundaria del RNAt puede describirse como una hoja
de trbol, ilustrada en la , en la cual ei
apareamiento de bases complementarias forma lea
tallos de los lazos de cadena nica. Las estructuras
tallo-lazo se denominan brazos de RNAt, y sus se-
cuencias incluyen bases
"
inusuales" generadas por
la modificacin de las cuatro bases estndar despus
de la sntesis de la cadena polinucleotdica.
La construccin de la hoja de trbol se ilustra
en ms detalle en la . Los cuatro brazos
mayores reciben su nombre de acuerdo con su es-
tructura o funcin:
.
El brazo aceptor consta de un tallo for-
mado por bases apareadas que termina en
una secuencia no apareada cuyo grupo 2
'
-
o
3
'
-
OH puede ligarse a un aminocido.
.
El brazo TyC se llama as por ese triplete.
(\|/ representa a la seudouridina, una base
modificada).
130
CAPTULO 7 El RNA mensajero
.
En el brazo anticodn, el anticodn siem-
pre est en el centro del lazo.
.
El brazo D debe su nombre a que contie-
ne la base dihidrouridina (otra de las bases
modificadas del RNAt).
.
El brazo extra yace entre el T\\C y el an-
ticodn, y su extensin flucta entre tres y
21 bases.
El sistema de numeracin del RNAt ilustra la
constancia de su estructura. Las posiciones se nu-
meran de 5' a 3' de acuerdo con la estructura del
RNAt ms comn, el cual tiene 76 residuos. El ran-
-
total de longitud de sus molculas es de 74 a 95
'
.
aes, y la variacin se debe a diferencias estructu-
res en el brazo D y en el extra.
El apareamiento de bases que mantiene la es-
ructura secundaria se muestra en la Figura 7.4. En
zn RNAt dado, la mayora de los apareamientos de
:
-
5es son asociaciones convencionales de A-U y
r
-C aunque tambin se encuentran pares ocasio-
nales de G-U
, G-\\f o A-y. Los tipos adicionales de
;res de bases son menos estables que los regulares,
aero de cualquier forma permiten que se forme una
saructura duplo-helicoidal en el RNA.
Cuando se comparan las secuencias de las dife-
mtes molculas de RNAt, las bases que se encuen-
bd en determinadas posiciones son invariables (o
conservadas); casi siempre una base especfica se
encuentra en la misma posicin. Algunas posiciones
:
r escriben como semi-invariables (o semi-con-
ervadas) porque estn restringidas a un tipo de
<e (purina frente a pirimidina), pero puede haber
-;
quier base del tipo correspondicnie.
Cuando un RNAt est cargado con el amino-
tido que corresponde a su anticodn, se le llama
noacil-RNAt y el aminocido se liga mediante
enlace ster que va del grupo carboxilo al hi-
: vilo 2' o 3' de la ribosa de la base terminal 3' del
-
t (que siempre es adenina). El proceso de carga
in RNAt es catalizado por una enzima espec-
ka. la aminoacii-RNAt sintetasa. Hay (cuando
mos) 20 de ellas, y cada una reconoce a un solo
inocido y a todos los RNAt en los cuales puede
:
locado de manera legtima.
Hay cuando menos un RNAt (pero en general
ms) para cada aminocido. Un RNAt se nom-
MCilizando como superndice la abreviatura de
letras de cada aminocido, y si hay ms de un
\r para el mismo aminocido, se utilizan subn-
numricos para distinguirlos. As, dos RNAt
la tirosina se describen como RNAt
j
1"'
y RNAt2Tir.
RXAt que transporta un aminocido, es decir,
aminoacil-RNAt, se indica mediante un prefijo
identifica al aminocido
, de modo que Ala-RNAt
.
ale a RNAf413 que porta a su aminocido.
El anticodn determina la especificidad del RNAt
Cistena
ACA
UGU
La desulfuracin
cambia al
aminocido
Reconocimiento
del codn sin
cambios
Alanina
ACA
UGU
El significado del RNAt depende de su anticodn
y no de su aminocido.
La secuencia anticodn por s misma permite
al aminoacil-RNAt reconocer al codn correcto? En
la se ilustra un experimento clsico para
responder esta pregunta. La desulfuracin reduc-
tora convierte al aminocido del cisteinil-RNAt en
alanina, generando alanil-RNAtc's. El RNAt tiene un
anticodn que responde al codn UGU. La modifi-
cacin del aminocido no influye en la especificidad
de la interaccin anticodn-codn, de manera que
el residuo de alanina es incorporado a la protena
en el lugar de la cistena. Una vez que un RNAt ha
sido cargado, el aminocido no desempea ningn papel
en su especificidad, la cual es determinada exclusivamente
por el anticodn.
El taLLo aceptor y el anticodn
estn Localizados
en los extremos
de la estructura terciana
Concepto principal
La hoja de trbol constituye una estructura terciaria
en forma de L con el brazo aceptor en un extremo y el
brazo anticodn en el otro.
La estructura secundaria de cada RNAt se dobla para
formar una estructura terciaria compacta en forma
de L en la cual el extremo 3' que se une al amino-
cido est lejos del anticodn que se une al RNAm.
Todos los RNAt tienen la misma estructura tercia-
ria general, aunque se distinguen por variaciones
individuales.
Los tallos duplo-helicoidales apareados por ba-
ses de la estructura secundaria se mantienen en la
estructura terciaria, pero su distribucin en tres di-
mensiones crea, esencialmente, dos hlices dobles
en ngulo recto una respecto de la otra, como se
ilustra en la . El tallo aceptor y el tallo
Rj/C forman una hlice doble continua con una sola
7.4 El tallo aceptor y el anticodn estn localizados en los extremos de la estructura terciaria
131
Todos los RNAt comparten una estructura terciaria
La estructura de hoja de trbol tiene
cuatro brazos
3
'
Brazo aceptar
Brazo D I Brazo J\\iC
Brazo anticodn
La proyeccin bdimensonaf tiene dos
dplex perpendiculares
La estructura principal adquiere la
forma de una L
R
l
Aminocido
Brazo TyC
Brazo anticod
Brazo aceptar
Brazo D
-
Anticodn
El RNA de transferencia se dobla en una estructura
terciara compacta en forma de L, con el aminocido en un
extremo y el anticodn en el otro.
El RNAt tiene forma de L
Extremo
ammoacilo
Rotacin de 90
Anticodn
Un modelo espacial compacto de esferas slidas
muestra que la estructura terciara del RNAt
phe
es compacta.
Las dos perspectivas del RNAt giran 90. Imagen cortesa de
Sung-Hou Kim, University of California, Berkeley.
interrupcin; el tallo D y el tallo anticodn formar
otra hlice continua doble, tambin con una inte-
rrupcin. En la regin localizada entre las hlica
dobles, donde se forma el ngulo de la L, se encuen-
tran el lazo T\\iC y el D, de modo que el aminocid o
reside en la extremidad de un brazo de la estructura
en L y el lazo anticodn forma el otro extremo.
La estructura terciaria se crea mediante puente?
de hidrgeno formados principalmente por bases M
apareadas en la estructura secundaria. Muchas de
las bases invariables y semiinvariables estn impli-
cadas en estos puentes de hidrgeno, lo cual explic;
que se conserven. No todas estas interacciones son
universales, pero probablemente identifican el pa-
trn general para establecer la estructura del RNA:
En la FIGURA 7 se muestra un modelo molc=
cular de la estructura del RNAtp
he
, y la imagen de!
lado izquierdo corresponde al esquema de la pane
inferior de la figura 7.6. En otros RNAt se observan
diferencias estructurales que responden al dilem;
de que todos deben tener una forma similar, pero
que permita reconocer diferencias entre ellos. P( :
ejemplo, en el RNAt
Asp
, el ngulo entre los dos ejej
es ligeramente mayor, de modo que la conforma-
cin de la molcula es ligeramente ms abierta.
La estructura sugiere una conclusin genera-
respecto de la funcin del RNAt: los sitios de la mol:-
cula que ejercen funciones particulares estn separados a.
mximo. El aminocido est lo ms lejos posible de
anticodn, lo cual coincide con sus funciones en la
sntesis protenica.
El. RNA mensajero es traducido
por los ribosomas
Conceptos principales
.
Los ribosomas se caracterizan por su velocidad de
sedimentacin (70S en los bacterianos y SOS en los
eucariticos).
.
Un ribosoma est formado por una unidad grande (de
50 o 60S en bacterias y eucariotas) y una subunidad
pequea (de 30 o 40S).
.
El ribosoma proporciona el ambiente en el cual el
aminoacil-RNAt agrega aminocidos a la cadena
polipeptdica creciente en respuesta a los codones
correspondientes.
.
Un iribosoma se desplaza a lo largo de una molcula de
RNAm en direccin 5' a 3'.
La traduccin de un RNAm en una cadena poliper
tdica es catalizada por el ribosoma. Los ribosomi*
se describen tradicionalmente en funcin de su ve
locidad (aproximada) de sedimentacin (medida er
Svedbergs, donde un valor mayor de S indica uiu
CAPTULO 7 El RNA mensajero
velocidad de sedimentacin mayor y mayor masa).
-
"
s ribosomas bacterianos generalmente se sedi-
mentan a ~70S. Los ribosomas del citoplasma de
:
-
5 clulas eucariticas superiores son ms grandes
iuelen sedimentarse a ~80S.
El ribosoma es una partcula ribonucleopro-
enica compacta formada por dos subunidades,
.
-
ia una de las cuales tiene un componente de
7 NA
, incluida una molcula muy larga de RNA y
-
merosas protenas. La relacin entre un riboso-
m
a y sus subunidades se ilustra en la FIGURA 7.8..
|as dos subunidades se disocian in vitro cuando se
. iuce la concentracin de iones de Mg2+. En cada
aso, la subunidad grande tiene una masa aproxi-
madamente dos veces mayor que la subunidad
:
equea. Los ribosomas bacterianos (70S) tienen
:
bunidades que se sedimentan a SOS y a 30S. Las
. bunidades de los ribosomas citoplsmicos euca-
.
'
'
ticos (SOS) se sedimentan a 60S y a 40S. Las
- 'S subunidades operan juntas como parte del ri-
:
soma completo; sin embargo, cada una asume
racciones distintas en la sntesis protenica.
Todos los ribosomas de un compartimiento ce-
ar dado son idnticos y asumen la sntesis de di-
.
-
entes protenas asocindose con diferentes RNAm que
rvorcionan las secuencias codificadoras en s.
El ribosoma crea el ambiente que controla el re-
.. nocimiento entre un codn de RNAm y un antico-
n de RNAt. Al interpretar el cdigo gentico como
.::
a serie de tripletes adyacentes, la sntesis prote-
"
..;
a procede del inicio de una regin codificadora
_ final. Una protena se ensambla por adicin secuencial
;
'
.minocidos en direccin del terminal N al terminal C
forme el ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm.
Un ribosoma empieza la traduccin en el ex-
remo 5' de una regin codificadora y traduce cada
in en un aminocido conforme procede hacia
:. extremo 3'. En cada codn, el aminoacil-RNAt
;
/ropiado se relaciona con el ribosoma y dona su
;
r.inocido a la cadena polipeptdica. En cualquier
momento, el ribosoma puede albergar dos ami-
.
acil-RNAt que corresponden a codones sucesivos,
~
rnnitiendo que se forme un enlace peptdico en-
ne ios dos aminocidos correspondientes. En cada
;
o, la cadena polipeptdica creciente se alarga un
-
:
.r
.
inocido ms.
Q A una moLcula de .RNAm
se unen numerosos ribosomas
loncepto principal
.
ij'na molcula de RNAm es traducida simultneamente
por numerosos ribosomas. Cada ribosoma se encuentra
en una etapa diferente de progresin a lo largo dtel
RNAm.
Los ribosomas se disocian en subunidades
Ribosoma bacteriano = 70S
i
Eliminacin de Mg2 Adicin de Mg
2+
50S
FIGURA 7. Un ribosoma est formado por dos subunidades.
Cuando se aislan ribosomas activos en forma de frac-
cin asociada a protenas recin sintetizadas, se en-
cuentran como un complejo formado por un RNAm
relacionado con numerosos ribosomas, estructura
que se denomina polirribosoma o polisoma. La
subunidad 305 de cada ribosoma se asocia con el
RNAm y la subunidad SOS porta a la protena recin
sintetizada; el RNAt abarca ambas unidades.
Cada ribosoma del polisoma sintetiza indepen-
dientemente a un polipptido en particular duran-
te su recorrido por la secuencia del mensajero. En
esencia, el RNAm es jalado a travs del ribosoma y
cada triplete de nucletidos se traduce en un ami-
nocido, de manera que el RNAm tiene una serie
de ribosomas que portan fragmentos crecientes del
producto protenico y que se desplazan del extremo
5' al 3
'
,
como se ilustra en la FIGURA 7.9. Una cadena
polipeptdica en proceso de sntesis suele llamarse
protena naciente
En general, los 30 a 35 aminocidos reciente-
mente agregados a una cadena polipeptdica crecien-
te estn protegidos del ambiente por la estructura del
ribosoma. Probablemente toda la parte anterior del
polipptido sobresale y es libre de empezar a plegar-
se en su conformacin apropiada, de modo que las
protenas pueden exhibir parte de la conformacin
madura incluso antes de que concluya su sntesis.
En la micrografa electrnica de la FIGURA 7.10
se muestra una caracterizacin clsica de polisemas.
La globina es sintetiza por un conjunto de cinco
ribosomas adheridos a cada RNAm (pentasomas).
Los ribosomas aparecen como objetos esfricos de-
formados de -7 nm (70 ) de dimetro, conectados
por una hebra de RNAm. Los ribosomas se locali-
zan en varias posiciones a lo largo del mensajero.
Los que se encuentran en un extremo apenas han
empezado la sntesis protenica, en tanto que los
7
.6 A una molcula de RNAm se unen numerosos ribosomas 133
Cada ribosoma tiene un polipeptidil-RNAt y un aminoacl-RNAt
Terminal N
Protegido por
el ribosoma
Plegamiento
.
.
Un poLirribosoma est formado por un RNAm traducido simultneamente por numero-
sos ribosomas que se desplazan en direccin 5
'
-3
'
. Cada ribosoma tiene dos molculas de RNAt, una
que porta la protena naciente y otra que porta al siguiente aminocido que se agregar.
i
mmmm

0
La sntesis protenica tiene lugar en los poliso-
mas. Imagen cortesa de Alexander Rich, Massachusetts Insti-
tute of Technology.
Los ribosomas se reciclan para la traduccin
1
Los ribosomas traducen el
RNAm y regresan al banco I
El RNAm es degradado
El RNA mensajero se traduce por medio de ribo-
somas que se reciclan en un banco.
del otro, estn por terminar la produccin de un
polipptido.
El tamao del polisoma depende de mltiples
variables; en las bacterias, por ejemplo, es muy gran-
de, con decenas de ribosomas dedicados simultnea-
mente a la traduccin. Las dimensiones se deben en
parte a la longitud del RNAm (que suele codifica:
numerosas protenas) y en parte a la gran eficienc>
con que se adhieren a ste los ribosomas.
Los polisomas del citoplasma de una clula e |
caritica tienden a ser ms pequeos que los de
bacterias, y tambin en este caso, su tamao es ur_
funcin de la longitud del RNAm (que usualmeliti
representa slo a una protena en las eucariotas
de la frecuencia caracterstica con la que se adhi
ren los ribosomas. Un RNAm eucaritico promedi'
probablemente tenga ~8 ribosomas adheridos a I
vez.
En la Fl se ilustra el ciclo vital del r
_
bosoma. Los ribosomas son extrados de un bao
(formado de hecho por subunidades ribosmica;
se utilizan para traducir un RNAm y posteriormenti
se regresan para ciclos posteriores. El nmero :
ribosomas adheridos a cada molcula de RNAm qv
sintetiza a una protena en particular no se ha deter
minado de manera precisa ni en las bacterias ni e
las eucariotas, pero es una cuestin de fluctuad
estadstica determinada por las variables del tamaf
y la eficiencia del RNAm.
La < constituye una perspectiva globa
de la atencin dedicada a la sntesis de protenas 9
una bacteria intacta. Los aproximadamente 20 00
ribosomas representan un cuarto de la masa de 1
clula. Hay >3 000 copias de cada RNAt, y todas l
molculas de RNAt, juntas, son casi 10 veces m;
numerosas que los ribosomas; la mayor parte es:
en forma de aminoacil-RNAt, listo para utilizarse c
inmediato en la sntesis protenica. Dada su inest:
bilidad, es difcil calcular el nmero de molcuh-
de RNAm, pero un clculo razonable sera ~1 50
en diferentes estados de sntesis y descomposicif
Hay -600 tipos de RNAm en una bacteria, lo cu;
sugiere que, en general, hay slo de dos a tres ce
pias de cada RNAm por cada una de ellas que, &
promedio, codifican quiz a ~3 protenas. Si ha
1850 protenas solubles diferentes, debe haber u:
promedio de >1 000 copias de cada protena en un
bacteria.
134
CAPTULO 7 El RNA mensajero
EL ciclo vital deL RNA
mensajero de las bacterias
lonceptos principales
En [as bacterias, la transcripcin y la traduccin
ocurren simultneamente, pues los ribosomas empiezan
a traducir un RNAm antes de que su sntesis est
completa.
El RNAm bacteriano es inestable y su vida media es de
slo unos cuantos minutos.
Un- RNAm bacteriano puede ser policistrnico, con
varias regiones codificadoras que representan a
diferentes genes.
RNA mensajero tiene la misma fundn en todas
clulas, pero con diferencias importantes en los
lalles de la sntesis y la estructura del RNAm eu-
_itico y del procaritico.
Una diferencia importante en la produccin del
lAm depende de dnde ocurran la transcripcin
; traduccin:
.
En las bacterias, el RNAm se transcribe y
se traduce en el compartimiento celular
nico; los dos procesos estn tan ntima-
mente relacionados que son simultneos.
Los ribosomas se adhieren al RNAm bacte-
riano incluso antes de que haya terminado
su transcripcin, de modo que el polisema
tiende a adherirse al DNA. El RNAm bacte-
riano suele ser inestable, y por lo tanto se
traduce en protenas durante slo algunos
minutos.
.
En una clula eucaritica, la sntesis y la
maduracin del RNAm tienen lugar exclu-
sivamente en el ncleo, y slo despus de
terminados dichos eventos, el RNAm es ex-
portado al citoplasma, donde es traducido
por los ribosomas. El RNAm eucaritico es
relativamente estable y sigue traducindose
durante muchas horas.
En la Fl 13 se muestra que en las bacterias
::
anscripcin y la traduccin estn ntimamente
i clonadas. La primera empieza cuando la enzima
A polimerasa se une al DNA y posteriormente se
splaza formando una copia de una cadena. Tan
"
co se inicia la transcripcin, los ribosomas se
hieren al extremo 5' del RNAm y comienza la tra-
ccin, incluso antes de que el resto del mensaje se
c sintetizado. Un grupo de ribosomas se mueve
"
.argo del RNAm mientras ste es sintetizado.
extremo 3' del RNAm se genera cuando termina
cnscripcin, en tanto que los ribosomas siguen
- cciendo el mRNA mientras sobrevive, pero se
rccida en la direccin general 5
'
-
>3
'
con bastante
-30% de la masa bacteriana deshidratada
se rea ,
n la expresin gnica
Masa celular
deshidratada Tipos Copias de
Componente (%)
fv'olcuias/clula
diferentes
cada tipo
Pared 10 1 1 1
Membrana 10 2 2 1
DNA 1.5 1 1 1
RNAm 1 1 500 600 2-3
RNAt 3 200 000 60 >3 000
RNAr 16 38 000 2 19 000
Protenas 9 106 52 19 000
rlbosmicas
Protenas solubles 46 2.0x106 1 850 >1 000
Molculas pequeas
3 7.5 X 106 800
Anlisis de E. coli en funcin de sus componentes ma-
cromoleculares.
Transcripcin -* traduccin -> degradacin
0 min tmpiez:a la transcripcin
El extremo 5' est trifosfatado
0.
5 min Los ribosomas inician a traduccin
1.5 min La degradacin empieza en el extremo 5'
2.0 La RNA polimerasa termina en el extremo 3"
3.0 min La degradacin continua, los ribosomas
terminam la traduccin
/x /v
Sinopsis: el RNAm se transcribe, se traduce y se
degrada simultneamente en las bacterias.
J
.J El ciclo vital del RNA mensajero de las bacterias
135
Los RNAm bacterianos se traducen mientras son transcritos
La linea cntral
delgada es DNA
Los RNAm nacientes salen del DNA
y son cubiertos por ribosomas
'
l lia
'
3
FIGURA 7.1 En las bacterias pueden observarse las unidades de
transcripcin. Imagen cortesa de Oscar Miller.
rapidez. El RNAm es sintetizado, traducido por los
ribosomas y se degrada, todo en rpida sucesin.
Una molcula individual de RNAm sobrevive si aca-
so, unos minutos.
La transcripcin y la traduccin bacteriana tie-
nen lugar a velocidades similares. A una temperatu-
ra de 370C la transcripcin del RNAm ocurre a -40
nucletidos/segundo, velocidad muy cercana a la
de la sntesis protenica, que es aproximadamente
de 15 aminocidos por segundo, de modo que se
necesitan ~2 minutos para transcribir y traducir a
un RNAm completo de 5 000 bp, que corresponden
a 180 kD de protena. Cuando se inicia la expresin
de un nuevo gen, su RNAm suele aparecer en la c-
lula en -2.5 minutos. La protena correspondiente
aparecer quizs en medio minuto ms.
La traduccin bacteriana es muy eficiente, y la
mayora de las molculas de RNAm son traducidas
por muchos ribosomas empacados de forma com-
pacta. En un caso {trp RNAm), se inician aproxi-
madamente 15 transcripciones por minuto y cada
una de las 15 molculas de RNAm probablemente
sea traducida por -30 ribosomas en el intervalo que
media entre su transcripcin y su degradacin.
La inestabilidad de la mayor parte del RNAm
bacteriano es sorprendente. La degradacin del
RNAm sigue de cerca a su traduccin y quiz em-
pieza en un lapso de un minuto desde el inicio de la
transcripcin. El extremo 5' del RNAm comienza a
degradarse antes de que el 3' haya sido sintetizado o
traducido. La degradacin parece seguir al ltimo ri-
bosoma del convoy del RNAm, pero la degradacin
procede con mayor lentitud, tal vez aproximada-
mente a la mitad de la velocidad de la transcripcin
o la traduccin.
La estabilidad del RNAm influye de manera im-
portante en la cantidad de protena que se produce;
suele expresarse en funcin de la vida media. B.
RNAm que representa a un gen especfico tiene ir-
vida media caracterstica, pero el promedio es de -1
minutos en las bacterias.
Obviamente, esta serie de eventos slo es r
sible porque la transcripcin, la traduccin y la c ;
gradacin ocurren en la misma direccin. En la r
crografa de electrones de la FIGURA 7.14 se descubas
la dinmica de la expresin gnica en delito flagrar/
En estas unidades de transcripcin (desconocids ;
varias molculas de RNAm estn en proceso ;
sntesis simultneamente y cada una porta nun;
rosos ribosomas implicados en la traduccin. (E
corresponde a la etapa que se muestra en el segn;
panel de la Figura 7.13.) Un RNA cuya sntesis ai
no ha concluido con frecuencia se denomina RA
naciente.
Las molculas de RNAm bacteriano vari;
enormemente en cuanto al nmero de protena;
las cuales codifican. Algunos RNAm representar.
un slo gen, son monocistrnicos, en tanto qv
otros (la mayora) portan secuencias que codific;
a numerosas protenas y son policistrnicos. 9
estos casos, una sola molcula de RNAm se transcr -
be a partir de un grupo de genes adyacentes. (Dich
agrupamiento de genes constituye un opern con-
trolado como una unidad gentica nica; vase el
Captulo 12, El opern.)
Todos los RNAm constan de dos tipos de r:
giones; la codificadora est formada por una sen
de codones que representa a la secuencia de air.
nocidos de una protena, empieza (normalmente
con AUG y termina con un codn de terminado*
No obstante, el RNAm siempre es ms largo que
la regin codificadora por la presencia de regioni
adicionales localizadas en ambos extremos. Una se-
cuencia adicional en el extremo 5
'
que precede al
inicio de la regin codificadora se describe como
lder o regin 5' UTR (regin no traducida). La se-
cuencia adicional que sigue a la seal de terminacic -
que forma el extremo 3
'
se denomina remolque I
regin 3
'
UTR y aunque son parte de la unidad c
transcripcin, estas secuencias no se utilizan par?
codificar protenas.
Un RNAm policistrnico tambin contiene re-
giones intercistrnicas, como se ilustra en la FIGU-
RA 7.1;
. Su tamao vara mucho, ya que puede tenai
una longitud de hasta 30 nucletidos en los RNAr
bacterianos (e incluso pueden ser ms largos en kc
RNA de los fagos) o ser muy cortos, en cuyo cas..
slo uno o dos nucletidos separan al codn de tei
minacin de una protena del codn de inicio de I
siguiente. En un caso extremo, dos genes de hecb
se superponen, de manera que la ltima base de un?.
regin codificadora tambin es la primera base de I
siguiente regin codificadora.
136
CAPTULO 7 El RNA mensajero
El nmero de ribosomas comprometidos en la
duccin de un cistrn en particular depende de
ficiencia de su sitio de inicio, que para el primer
rn est disponible siempre y cuando se sintetice
.
xtremo 5
'
del RNAm. Cmo se traducen los cis-
nes subsiguientes? Las numerosas regiones codi-
idoras de un RNAm policistrnico se traducen de
raa independiente o su expresin est conectada?
mecanismo de iniciacin es el mismo para todos
cistrones o es diferente para el primer cistrn y
a los cistrones internos?
La traduccin de un RNAm bacteriano proce-
de manera secuencial a travs de sus cistrones.
ando los ribosomas se adhieren a la primera re-
D codificadora, las subsiguientes an no han sido
nscritas. Para cuando el segundo sitio ribosmico
disponible, la traduccin est muy avanzada a
vs del primer cistrn. En general, los ribosomas
minan la traduccin al nal del primer cistrn (y
Jisocian en subunidades), y un ribosoma nuevo
ensambla de manera independiente al principio
.a siguiente regin codificadora. (El proceso de
dacin se describe en el Captulo 8, Sntesis pro-
-
ica.)
Q EL RNAm eucaritico
es modificado durante su
transcripcin o despus de sta
-:
-
ceptos principales
Un transcrito de RNAm eucaritico es modificado en el
-
iiicleo durante o poco despus de su transcripcin.
_:S modificaciones incluyen la adicin de un casquete
"
etilado en el extremo 5
'
y una secuencia de poli (A)
el extremo 3
'
.
E
. RNAm no es exportado del ncleo al citoplasma
lista que todas las modificaciones estn completas.
produccin del RNAm eucaritico involucra a
B etapas posteriores a la transcripcin. La trans-
::n ocurre de la forma usual, iniciando un
.
"
rito con un extremo 5
'
trifosfato, pero el extre-
V se genera por divisin del transcrito, y no por
;:
-
-Scripcin de terminacin en un sitio determi-
. Las molculas de RNA que derivan de genes
Ttumpidos requieren de corte y empalme para
-ivar los intrones
, generndose una molcula de
-
r:- ms pequea que contiene una secuencia
-T
-cadora intacta.
Eq la FIGURA 7.16 se muestra que ambos extre-
:
el transcrito son modificados por adiciones
teciores de nucletidos (lo cual implica a siste-
ic enzimas adicionales). El extremo 5
'
del RNA
"
: lificado por la adicin de un
"
casquete
"
vir-
El RNAm bacteriano es policistrnico
El lder precede al
codn de iniciacin
El remolque sigue
al codn de terminacin
La distancia nterclstrnica
vara de -1 a +40 bases
5
'
Codm
3
'
Inicio Alto
Codificacioi i
Inicio Alto
7.15 El RNAm bacteriano incluye regiones traducidas y no
traducidas. Cada regin codificadora tiene sus propias seales de ini-
ciacin y terminacin. Un RNAm tpico puede tener numerosas regiones
codificadoras.
El RNAm eucaritico es modificado
en ambos extremos
5 lymimimmmi 3
Casquete |,
iimiMinmmimi
I Poli(A)
mmmninnmmliit
FIGURA 7.1 El RNAm eucaritico es modificado por la adicin
de un casquete en el extremo 5' y un poli(A) en el 3'.
tualmente tan pronto como aparece. ste remplaza
al trifosfato del transcrito inicial con un nucleti-
do en orientacin inversa (3'->5'), "sellando", por
lo tanto, el extremo. El extremo 3' es modificado
por la adicin de una serie de nucletidos de ci-
do adenflico [cido poliadenlico o poli(A)] inme-
diatamente despus de su divisin. Slo una vez
concluidos todos los eventos de modificacin y de
procesamiento, el RNAm puede ser exportado del
ncleo al citoplasma. La demora promedio para salir
del citoplasma es de -20 minutos. Una vez que el
RNAm ha entrado al citoplasma, es reconocido por
los ribosomas y traducido.
En la FIGURA 7. se muestra que el ciclo vital
del RNAm eucaritico es ms prolongado que el
bacteriano. La transcripcin en las clulas animales
ocurre ms o menos a la misma velocidad que en
las bacterias, a -40 nucletidos por segundo. Mu-
chos genes eucariticos son grandes, y un gen de
10 000 bp necesita -5 minutos para transcribirse.
La transcripcin del RNAm no termina con la li-
beracin de enzima del DNA, ms bien, la enzima
sigue ms all del final del gen. Una serie coordi-
nada de eventos genera el extremo 3
'
del RNAm
por divisin y adhiere un fragmento de poli (A) al
extremo 3
'
recin generado.
El RNAm eucaritico constituye slo una pe-
quea porcin del RNA celular total (-3% de la
masa). La vida media es relativamente corta en las
7.S EL RNAm eucaritico es modificado durante su transcripcin o despus de sta
137
El RNAm euca
d min Empieza la transcripcin: el extremo 5' es modificado
6 min
El extremo 3' del RNAm es liberado por divisin
20 min El extremo 3' es poliadenilado
AAAAAA
25 min El RNAm es transportado al citoplasma
NCLEO
= 1 =
CITOPLASMA
AAAAAA
> 240 min Los ribosomas traducen al RNAm
.
PPP
AAAAAA
> Sinopsis: La expresin deL RNAm en Las cLuLas
animales requiere de transcripcin, modificacin, procesamien-
to, transporte ncleo-citopLsmico y traduccin.
squete metilado en el extr
Presente en todos los casquetes
O
B
HN
I
CH3 Puede ser metilado -NH2
en el casquete 1 c
pHN
;
ch
I II NCH
O O
CHo-O-P-0 -P-O-P-O-CH,
O
"
O
"
O'
N
V
Presente en el-
casquete 1
CH3
\ O
O-P-O
-
CH.
O
Presente en el
casquete 2
O-P-O-
B EL casquete bLoquea eL extremo 5' del RNAm y puede ser
metiLado en varias posiciones.
levaduras, en las cuales oscila entre 1 y 60 minu-
tos. En las eucariotas superiores, hay un incremento
sustancial en la estabilidad; el RNAm de las ch: .:
animales es relativamente estable, con una vida mr
dia de entre 4 y 24 horas.
Los polisomas eucariticos son razonableme:
estables. Las modificaciones de ambos extremos:
RNAm contribuyen a su estabilidad.
EL extremo 5' del RNAm
eucaritico posee un casquete
Concepto principal
Un casquete 5' se forma al agregar una G a la base
terminal del transcrito a travs de una ligadura 5'-5'. De
uno a tres grupos metilo se agregan a La base o ribos;
de La guanosina terminal nueva.
La transcripcin empieza con un nuclesido triL
fatado (casi siempre una purina, A o G). El primJ
nucletido retiene a su grupo fosfato 5
'
y forr
el enlace fosfodister usual de su posicin 3
'
a
5' d
el siguiente nucletido. La secuencia inicial ::
transcrito puede representarse como:
5
'
pppA/GpNpNpNp . . .
Sin embargo, cuando el RNAm maduro es t: i
tado in vitro con enzimas que deben degradarlo c -
nucletidos individuales, el extremo 5
'
no origir.
el nuclesido trifosfatado esperado, en cambio, cor
tiene dos nucletidos conectados por una ligadur;
5
'
-
5'
trifosfato, e incluso ostenta grupos metilo. 1;
base terminal siempre es una guanina que se agre ;;
a la molcula de RNA original despus de la trans-
cripcin.
La adicin de la G 5' terminal es catalizada por
una enzima nuclear, la guanilil transferasa. La reac-
cin tan poco despus de iniciada la transcripcir
que es imposible detectar ms que rastros del e: -
tremo 5' trifosfato en el RNA nuclear. La reaccin
global puede representarse como una condensacin
entre el GTP y el trifosfato terminal 5
'
del RNA. P>
lo tanto
5
'
5'
Gppp + pppApNpNp . . .
i
5
'
-
5
'
GpppApNpNp . . . + pp + p
El residuo de G nuevo adherido al extremo
RNA se encuentra en orientacin inversa respeav
de los otros nucletidos.
A esta estructura se le denomina casquete, qui
es un sustrato de muchos eventos de metilacin. En
la FI 8 se observa la estructura completa de
un casquete despus de que se han agregado todos
138
CAPTULO 7 El RNA mensajero
I rupos metilo posibles. Los tipos de casquetes se
isringuen por el nmero de metilaciones de este
I ocurridas:
.
La primera metilacin ocurre en todas las
eucariotas y consiste en la adicin de un
grupo metilo en la posicin 7 de la guanina
terminal. Un casquete que posee este gru-
po metilo nico se conoce como casquete
0
. La reaccin procede hasta este punto en
las eucariotas unicelulares, y la enzima res-
ponsable de esta modificacin se denomina
guanina - 7 -metiltransferasa.
.
El siguiente paso es agregar otro grupo me-
tilo en la posicin 2'-0 de la penltima base
(que de hecho era la primera base original
del transcrito antes de que se hicieran mo-
dificaciones), reaccin catalizada por otra
enzima, la 2
'
-
0-metil-transferasa
.
A un cas-
quete con dos grupos metilos se le denomi-
na casquete 1, que es el tipo predominante
en las eucariotas, excepto en los organismos
unicelulares.
.
En una pequea minora de eucariotas su-
periores, a la segunda base se agrega otro
grupo metilo, pero slo cuando la posicin
es ocupada por adenina; la reaccin implica
la adicin de un grupo metilo en la posicin
N6. La enzima responsable acta slo en un
sustrato de adenosina que ya tiene el grupo
metilo en la posicin 2
'
-
0.
.
En algunas especies se agrega un grupo me-
tilo a la tercera base del RNAm que cuente
con casquete. El sustrato de esta reaccin es
el RNAm con casquete 1 que ya tiene dos
grupos metilo. La modificacin de la tercera
base siempre es una metilacin de una ri-
bosa en la posicin 2'-0, lo cual da lugar al
casquete 2. En general, este caso represen-
ta menos del 10% al 15% de la poblacin
total con casquete.
En una poblacin de RNAm eucariticos, todas
-
molculas poseen casquete, y la proporcin co-
respondiente a cada tipo es caracterstica de cada
;;nismo. No se sabe si la estructura de una mo-
:
:.a especfica de RNAm es invariable o si puede
i.:
rr ms de un tipo de casquete.
Adems de la metilacin implicada en el proceso
: .a adicin del casquete, slo en el RNAm de las
-
:=riotas superiores ocurre una metilacin interna
-
raja frecuencia merced a la generacin de resi-
.
de N6 metiladenina a una frecuencia de aproxi-
:
lamente una modificacin por cada 1 000 bases.
y una o dos metiladeninas en un RNAm eucari-
.
:pico, aunque su presencia no es obligatoria;
. mos RNAm no tienen ninguna de estas mol-
EL extremo 3' est
poLiadenado
Conceptos principales
.
Despus de la transcripcin se agrega un fragmento de
poLi(A) de ~200 nucletidos a un transcrito nuclear.
.
El poli(A) est unido a una protena especfica (PABP).
.
El poli(A) estabiliza al RNAm contra la degradacin.
El fragmento 3' terminal de residuos de A con fre-
cuencia se describe como cola de poli (A); al RNAm
con esta caracterstica se le denomina poli(A)+.
La secuencia de poli(A) no se codifica en el
DNA, ms bien se adhiere al RNA del ncleo des-
pus de la transcripcin. La adicin de poli(A) es
catalizada por la enzima poIi(A) polimerasa, que
agrega -200 residuos de A al extremo 3
'
-
OH libre
del RNAm. El tracto poli(A) del RNA nuclear y del
RNAm se relaciona con una protena, la protena
de unin al poli (A) (PABP, poly(A)-binding pro-
teir). En muchas eucariotas se encuentran formas
relacionadas de esta protena. Un monmero de la
PABP de -70 kD se une cada 10 a 20 bases de la
cola de poli(A), as que una caracterstica comn
en muchas, o la mayora, de las eucariotas es que
el extremo 3
'
del RNAm est formado por un frag-
mento de poli (A) unido a una gran masa protenica.
La adicin del poli(A) es parte de una reaccin en la
que el extremo 3
'
del RNAm es generado y modifi-
cado por un complejo de enzimas (vase la seccin
26.19, Los extremos 3' de los RNAm se generan por
divisin y poliadenilacin).
La unin del PABP con el factor de iniciacin
eIF4G genera un lazo cerrado en el cual los extre-
mos 5
'
y 3' del RNAm se encuentran sujetos al mis-
mo complejo protenico (vase la Fig. 8.20 de la
seccin 8.9, Las eucariotas utilizan un complejo de
numerosos factores de iniciacin). La formacin de
este complejo puede ser la causa de algunos de los
efectos del poli(A) en las propiedades del RNAm,
que suele ser estabilizado por aqul. La capacidad
del poli(A) de proteger al RNAm contra la degrada-
cin implica la unin con la PABP.
La eliminacin del poli(A) inhibe el inicio de
la traduccin in vitro, en tanto que el agotamiento
de la PABP en las levaduras in vivo tiene el mis-
mo efecto, desenlaces que podran depender de la
unin de la PABP con el complejo de iniciacin en el
extremo 5
'
del RNAm. En el desarrollo embrionario
temprano hay muchos ejemplos de ello, en los cua-
les la poliadenilacin de un RNAm especfico est
correlacionada con su traduccin. En algunos casos,
los RNAm se almacenan en forma de no poliadeni-
lada y se agrega un poli(A) cuando es necesaria su
7
.10 El extremo 3' est poliadenilado
139
El poli{A) puede utilizarse para aislar al RNAm
La mayor parte de la
poblacin de RNA es RNAr
que carece de poli(A)
Sefarosa
oligo(dT)
El RNAr fluye
a travs de la
columna
El RNAm con pol(A)
representa una pequea
porcin de RNA
AAA
l
-AAA
-AAA"
I
El RNA poli(A)+
se pega a la
columna
EL RNA poLi(A)+ puede separase de otros RNA por
fraccionamiento en sefarosa-oLigo(dT).
cadena que corresponde a la secuencia del RNAm y
que puede reproducirse en grandes cantidades.
La disponibilidad de un DNA clonado facilia
el aislamiento del RNAm correspondiente por mr
dio de tcnicas de hibridacin, incluso las molo
las de RNAm cuyas copias por clula se present?
en cantidades reducidas pueden aislarse median:;
este mtodo. De hecho, slo los RNAm presentes t
cantidades relativamente grandes pueden aislarse
directamente, sin necesidad de la clonacin.
Casi todos los RNAm celulares poseen poli(A
pero una excepcin que debe tomarse en cuen:;
son los RNAm que codifican a las protenas de las
histonas (componente estructural importante dd
material cromosmico). Estos RNAm comprende"
a la mayora, si no es que a toda, de la fraccin
poli(A)". El significado de la ausencia de poli{A
en el RNAm de las histonas no ha sido definido
y no hay un aspecto particular de su funcin que
justifique dicha ausencia.
traduccin; en otros, los RNAm poli(A)+ son des-
adenilados y se reduce su traduccin.
La presencia del poli(A) tiene una aplicacin
prctica importante. La regin poli(A) del RNAm
puede aparearse con un oligo (U) o con un oligo (dT),
reaccin que puede servir para aislar el RNAm
poli (A)+. La tcnica ms conveniente es inmovilizar
el oligo (U o dT) en un soporte slido y posterior-
mente, cuando se aplica una poblacin de RNA a
la columna, como se ilustra en la FIGURA 7A9, slo
se retiene el RNA poli(A)+. El RNA puede liberarse
tratando a la columna con una solucin que rompa
los enlaces.
El nico inconveniente de este procedimiento
es que aisla todo el RNA que contiene poli(A). Por
ejemplo, si se utiliza el RNA de toda la clula, los
RNA poli(A)+ nuclear y citoplsmico sern reteni-
dos, pero si se utilizan preparaciones de polisomas
(un procedimiento comn), la mayora de los RNA
poli(A)+ sern RNAm activos. Sin embargo, adems
del RNAm en los polisomas, en el citosol que contie-
ne RNAm poli(A)+tambin hay partculas ribonu-
cleoprotenicas que no se traducen. Este RNA puede
ser
"
almacenado
"
para usarse en otra ocasin, de
modo que el aislamiento del RNAm poli(A)+ total
no corresponde exactamente a la poblacin del
RNAm activo.
El mtodo de "clonacin" para purificar el
RNAm consiste en copiarlo para formar una cadena
de DNA complementario (conocido como DNAc,
complementary DNA) que posteriormente podr uti-
lizarse como molde para sintetizar una cadena de
DNA idntica a la secuencia del RNAm original. El
producto de estas reacciones es un DNA de doble
RETI La degradacin del RNAm
bacteriano involucra
a mltiples enzimas
Conceptos principales
.
La direccin global de la degradacin del RNAm
bacteriano es de 5'->3'.
.
La degradacin es resultado de La combinacin de
divisiones endonudeollticas seguidas de la degradacin
exonucleoLtica del fragmento de 3
'
-
>5
'
.
El RNAm bacteriano es constantemente degradad
por una combinacin de endonucleasas y exonu-
cleasas. Las endonucleasas dividen a un RNA en ur
sitio interno, en tanto que las exonucleasas estr
implicadas en reacciones de recorte en las cual*
los residuos adicionales son retirados, base por base.
desde el extremo. Las exonucleasas bacterianas qm
actan en molculas de RNA de cadena individual
proceden a lo largo de la cadena de cido nucleico
a partir del extremo 3
'
.
La manera en que dos tipos de enzimas trabajar
en conjunto para degradar al RNAm se muestra er
la FIGURA 7.20. La degradacin de un RNAm bacte-
riano se inicia con un ataque endonucleoltico, po:
el que pueden generarse numerosos extremos 3
mediante divisiones endonudeollticas del RNAm.
La direccin global de la degradacin (medida poi
la prdida de la capacidad de sintetizar protenas)
es 5'->3
'
, lo cual quiz se deriva de una sucesin
de divisiones endonucleolticas que siguen al l-
timo ribosoma. Ms adelante, la degradacin de
los fragmentos liberados de RNAm a nucletido?
140
CAPTULO 7 El RNA mensajero
debe al ataque exonucleoltico del extremo libre
OH hacia el extremo 5' (en direccin opuesta a
transcripcin). El ataque endonucleoltico libera
gmentos con diferente susceptibilidad a las exo-
cleasas. Una regin de la estructura secundaria
- RNAm puede ser un obstculo para la exonu-
asa, de manera que se protegen las regiones lo-
izadas en su lado 5'. Por lo tanto, la estabilidad
cada RNAm depende de la susceptibilidad de su
cuencia especfica a las divisiones tanto endonu-
olticas como exonucleolticas.
En E. coli se han encontrado ~I2 ribonuclea-
s. Los mutantes carentes de endorribonucleasas
xcepto la ribonucleasa I, cuya carencia no tiene
ogn efecto) acumulan precursores no procesados
RNAr y RNAt, pero son viables. En el caso de
mutantes que carecen de exonucleasas, con re-
lencia sus fenotipos aparentemente no han sufrido
eraciones, lo cual sugiere que una enzima puede
pr la ausencia de otra. Los mutantes que carecen
varias enzimas en ocasiones no son viables.
La RNAasa E es la enzima clave para iniciar la
isin del RNAm, y podra ser la que hace la pri-
tra divisin de numerosos RNAm. En los mutan-
s bacterianos cuya ribonucleasa E est defectuosa,
estabilidad del RNAm es mayor (de dos a tres
;
es), pero no es sa su nica funcin. La RNAasa
;
e descubri originalmente como la enzima cau-
:::
e del procesamiento 5
'
del RNAr del transcrito
-r
.iario por un evento especfico de procesamiento
aonucleoltico.
El proceso de degradacin puede ser cataliza-
dor un complejo multienzimtico (en ocasiones
;r.ado degradosoma) que incluye ribonucleasa
PNPasa (polinucletido fosforilasa) y helicasa. La
Aasa E tiene funciones duales. Su dominio termi-
. N proporciona una actividad de endonucleasa,
:
anto que el terminal C constituye un andamio
r mantiene unidos a los otros componentes. La
'
casa desenrolla el sustrato de RNA para que est
oonible para la PNPasa. De acuerdo con este mo-
- j, la RNAasa E realiza el corte inicial y posterior-
mte pasa los fragmentos a los otros componentes
i complejo para que sean procesados.
Podra ser que la poliadenilacin estuviera rela-
jada con el inicio de la degradacin de algunas
fculas de RNAm en las bacterias. En E. coli, la
A) polimerasa est asociada con los ribosomas
r agregan fragmentos cortos (de 10 a 40 nucle-
-
S) de poli(A) cuando menos a algunos RNAm.
;
mutaciones triples que eliminan la poli(A) po-
;
rasa, la ribonucleasa E y la polinucletido fos-
dlasa (PNPasa, una exonucleasa S'-S') ejercen un
- r.o contundente en la estabilidad. (El efecto de
nutaciones en genes individuales o en pares de
:-;
s es apenas perceptible.) La poli(A) polimerasa
El RNAm es degradado por exonucleasas
y por endonucleasas
Traduccin
3
'
Endonucleasa
\ / r/
RNAasa E
Exonucleasa
l
- -.
La degradacin del RNAm bacteriano tiene lugar
en un proceso de dos etapas. Las divisiones endonucleolticas
proceden en direccin 5
'
-3
'
, detrs de los ribosomas. Los frag-
mentos liberados son degradados por exonucleasas que avanzan
en direccin 3
'
-
5
'
.
puede crear una cola de poli(A) que funge como
sitio de unin para las nucleasas, as que su funcin
en las bacterias sera diferente a su funcin en las
clulas eucariticas,
un La estabilidad del RNAm
depende de su estructura
y su secuencia
Conceptos principales
. Las modificaciones de ambos extremos del RNAm
lo protegen contra la degradacin mediada por las
exonucleasas.
.
Las secuencias especificas de un RNAm pueden producir
efectos estabilizadores o desestabilizadores.
.
La desestabilizacin puede ser activada por La prdida
de poli (A).
Las caractersticas principales del RNAm relacionadas
con su estabilidad se resumen en la FIGURA .21. Tan-
to la estructura como la secuencia son importantes.
Las estructuras terminales 5' y 3' protegen contra
7
.12 La estabilidad del RNAm depende de su estructura y su secuencia
141
La estructura y la secuencia del RNAm eucari
El casquete
protege contra la
sxonucleasa 5'-3'
Los codones sin
sentido activan
el sistema de
vigilancia
La endonudeasa
ataca a la
secuencia
desestabllizadora
El poli(A)
protege contra
la exonucleasa
3
'
-5
'
5
'
i
UAA
UAG
UGA
w
1 1
3
'
XXXX AAAAAfiA
i
1
5' UTR
Regin codificadora
3'UTR
Las modificaciones de los extremos deL RNAm lo protegen
contra la degradacin. Secuencias internas pueden activara los sistemas
de degradacin.
El RNAm p
do medrant
(AUUUA)n
i
(A)n
Protena de unin a la
secuencia ARE
(AUUA)n
Poli(A) ribonucleasa /
I
(AUUUA)n
Endonucieasas
Una ARE en una regin no traducida 3' inicia la
degradacin del RNAm.
dad en respuesta
La protena de unin al IRE se une al IRE en ausencia de hierro
.
c
La protena de unin al IRE se disocia en presencia de hierro
(A)n
I
Un IRE localizado en la regin no traducida 3'
controla la estabilidad del RNAm.
la degradacin, y secuencias especficas del RNAm
pueden funcionar como dianas para desencadenar la
degradacin o conferir proteccin contra sta:
.
Las modificaciones de los extremos 5' y 3'
del RNAm tienen funciones importantes en
la prevencin del ataque de las exonuclea-
sas, de modo que el casquete evita que
exonucleasas 5
'
-
3
'
ataquen el extreme
y el poli(A) que las exonucleasas 3
'
-
5 ;
quen el extremo 3
'
.
.
Los elementos especficos de la secue:
del RNAm pueden estabilizarlo o desc
bilizarlo. La localizacin ms comn de
elementos desestabilizadores se encuer
en la regin no traducida 3
'
. La presenc.i
dicho elemento acorta la vida del RNAr
.
En la regin codificadora, las mutaciones :
crean codones de terminacin activan
sistema de vigilancia que degrada al RN_
-
(vase la seccin 7.14, Las mutaciones
sentido activan un sistema de vigilancia
En numerosas molculas de RNAm de las lew
duras se han encontrado elementos desestabiliza;
res, aunque todava no se han observado secua
cias comunes o no se sabe cmo desestabiliza-
RNAm. No necesariamente actan de forma diiz:
(proporcionando dianas para las endonudeasa
pero pueden funcionar de manera indirecta, q_ -
fomentando la desadenilacin. El criterio para de
finir a un elemento desestabilizador de secuer::
es que su introduccin en un RNAm nuevo put: .
provocar su degradacin, si bien la eliminacin ;
un elemento de un RNAm no necesariamente 1c
tabiliza, lo cual sugiere que cada uno de ellos puedi
tener ms de un elemento desestabilizador.
Una caracterstica comn de algunas molcU-;
de RNAm inestables es una secuencia rica en AU ;
-
50 bases (denominada ARE) en la regin rems
que 3
'
. La secuencia de consenso de la ARE es I
pentanucletido AUUUA, repetido varias veces. Z:
la se muestra que la ARE desencadene
la desestabilizacin por un proceso en dos etap;
primero es desadenilado el RNAm y posteriormerr.T
se degrada. La desadenilacin podra ser necesa
porque da lugar a la prdida de la protena de uni1 -
al poli(A), cuya presencia estabiliza a la regin 3
(vase la seccin 7.13, La degradacin del RNAr:
involucra mltiples actividades).
En algunos casos, un RNAm puede ser estalv:
fizado al inhibir especficamente la funcin de ur.
elemento desestabilizador. El RNAm de la transfe
rrina contiene una secuencia denominada elemen'
de respuesta al hierro (IRE, iron-responsive elemen:
que controla la respuesta del RNAm a los cambie
de concentracin del mismo y que se localiza ei
la regin 3' no traducida, adems de que contien
estructuras tallo-lazo que se unen a protenas cuy
afinidad por el RNAm se controla por medio de
hierro. En la se muestra que la unin d
la protena con el IRE estabiliza al RNAm al inhib
la funcin de secuencias desestabilizadoras cercana
(no identificadas). ste es un modelo general de ,
142
CAPTULO 7 El RNA mensajero
:abilizacin del RNAm, es decir, la estabilidad es
nferida por la inhibicin de la funcin de secuen-
is desestabilizadoras.
La eliminacin del casquete y la degradacin
urren en complejos protenicos grandes localiza-
K como unidades citoplsmicas discretas denomi-
ias cuerpos-P, en los cuales pueden localizarse
cas enzimas implicadas en la produccin o el me-
rolismo del RNAm. De hecho, dichos cuerpos pue-
n secuestrar a cualquier molcula de RNAm que
est involucrada activamente en la traduccin.
Q La degradacin deL RNAm
implica mltiples actividades
I:nceptos principales
Para La degradacin del RNAm de las levaduras se
requiere de la eliminacin del casquete 5
'
y del
poli(A) 3
'
.
Una ruta de las levaduras implica la degradacin
exonucleoltica en direccin 5
'
->3
'
.
Otra ruta de las levaduras utiliza un complejo de
numerosas exonucleasas que funcionan en direccin
|
p>5
'
.
.a desadenilasa de las clulas animales puede unirse
directamente con el casquete 5'.
-
la degradacin del RNAm de las levaduras es de
;
ue ms se sabe. Bsicamente hay dos rutas que
'
piezan con la eliminacin de la cola de poli (A),
traccin catalizada por una desadenilasa espec-
;
que probablemente funciona como parte de un
mplejo protenico vasto. (La subunidad cataltica
la exonucleasa Ccr4 en las levaduras, as como
exonucleasa PARN en los vertebrados, que est
acionada con la RNAasa D.) La accin enzimtica
R
egresiva, una vez que ha empezado a degradar
- sustrato especfico de RNAm, sigue desensam-
Edolo, base por base.
La ruta de degradacin principal se resume en la
24. La desadenilacin del extremo 3' activa
Tjlminacin del casquete del extremo 5
'
.
La base
rita relacin es que la presencia de la PABP (pro-
"
3 de unin a poli(A)) en el poli(A) impide que la
i:ma responsable de la eliminacin del casquete
-.na al extremo 5
'
.
La PABP se libera cuando la
dtuddelpobXA) est por debajo de 10 a 15resi-
os. La eliminacin del casquete ocurre al separar
ase metilada del extremo 5
'
para dejar un mono-
1 :o en la reaccin: m7GpppX... m7GDP + pX...
enzima requiere del grupo 7-metilo.
i Cada extremo del RNAm influye en los eventos
| ocurren en el otro extremo, lo cual se explica
::v.e ambos extremos del RNAm se mantienen
La eliminacin del casquete provoca
la degradacin 5 -3
Casquete
1
Pol(A)/PABP
| Desadenilacin
Dcpl
Eliminacin del casquete
I Degradacin 5'-3'
XRN1
-
La desadenilacin permite la eliminacin del
casquete, lo cual provoca la divisin endonucleoltica a partir
del extremo 5'.
unidos por los factores implicados en la sntesis pro-
tenica (vase la seccin 8.9, Las eucariotas utilizan
un complejo formado por numerosos factores de
iniciacin). El efecto de la PABP en la eliminacin
del casquete permite que el extremo 3' incida en la
estabilizacin del extremo 5
'
. Asimismo, hay una
conexin entre la estructura del extremo 5
'
y la de-
gradacin del extremo 3
'
.
La desadenilasa se une
directamente al casquete 5', interaccin necesaria
para su ataque exonucleoltico contra elpoli(A).
Cul es el fundamento de la conexin entre
los eventos que ocurren en ambos extremos de una
molcula de RNAm? Quiz sea necesario asegurarse
de que el RNAm no permanezca en un estado (te-
niendo la estructura de un extremo, pero no la del
otro) que pueda competir con el RNAm activo por
las protenas que se unen a los extremos.
La eliminacin del casquete activa la ruta de
degradacin 5'-3', en la cual el RNAm es degradado
rpidamente a partir del extremo 5
'
mediante la
exonucleasa 5
'
-
3
'
XRN1. La enzima responsable de
la eliminacin del casquete se concentra en loci cito-
plsmicos discretos, los cuales pueden ser
"
cuerpos
de procesamiento" en que el RNAm es desadenilado
y posteriormente degradado, despus de eliminarse
el casquete.
En la segunda ruta, las molculas de RNAm de-
sadeniladas de las levaduras pueden ser degradadas
por la actividad 3
'
-
5
'
de la exonucleasa del exosoma,
un complejo de >9 exonucleasas. El exosoma tam-
bin participa en el procesamiento de precursores
de molculas de RNAr. La adicin de las exonuclea-
sas individuales al complejo del exosoma puede des-
7.13 La degradacin del RNAm implica mltiples actividades
La ruta 3 -5 tiene tres etapas
Desadenilacin
teiBi AAAAAAAAAAA
Degradacin endonucleoltica
Degradacin exonucleoltica 5'-3'
La desadenilacin puede provocar directamente
la divisin endonucleoltica y la divisin exonucleoltica desde
los extremos 3'.
Las mutaciones sin sentido pueden provocar la
degradacin del RNAm.
encadenar las actividades exonucleolticas 3
'
-
5'
para
que sean controladas coordinadamente. De igual
forma, el exosoma puede degradar a fragmentos de
RNAm liberados por divisin endonucleoltica. En
la FIGURA se muestra que la ruta de degrada-
cin 3
'
-
5'
puede de hecho implicar combinaciones
de actividad endonucleoltica y exonucleoltica. El
exosoma tambin se encuentra en el ncleo, donde
degrada a precursores de RNAm no empalmados.
Los mutantes de levaduras que carecen de cual-
quiera de las rutas exonucleolticas degradan a su
RNAm ms lentamente, pero la prdida de ambas
rulas es letal.
Rffl Las mutaciones sin sentido
activan un sistema
de vigilancia
Conceptos principales
.
Las mutaciones sin sentido provocan La degradacin del
RNAm.
.
En las levaduras y los gusanos se han encontrado genes
que codifican al sistema de degradacin.
Otra ruta de degradacin se identifica por la de-
gradacin del RNAm mediada por mutacio-
nes sin sentido. En la FIGURA 7 se observa que
la introduccin de una mutacin sin sentido cor
frecuencia incrementa la degradacin del RNAm
Como puede esperarse de la dependencia de un
codn de terminacin, la degradacin ocurre ea
el citoplasma, y podra representar un control de
calidad o un sistema de vigilancia para eliminar
molculas de RNAm no funcionales.
El sistema de vigilancia ha sido mejor estudiad':
en las levaduras y en C. elegans, pero tambin puede
ser importante en las clulas animales. Por ejem-
plo, durante la formacin de inmunoglobulinas y
de receptores de clulas T en las clulas del sisteme
inmunolgico, los genes son modificados por re-
combinacin somtica y mutacin (vase el Cap. 23,
La diversidad inmunitaria), suceso que genera un
nmero significativo de genes no funcionales cuyos
productos de RNA son eliminados por un sistema
de vigilancia.
En las levaduras, la degradacin requiere de
elementos de secuencia (denominados DSE) de flujo
descendente a partir de la mutacin sin sentido. Ls
posibilidad ms sencilla sera que se trata de ele-
mentos desestabilizadores y que la traduccin su-
prime su uso. Sin embargo, cuando se bloquea la
traduccin, el RNAm se estabiliza, lo cual sugiere
que el proceso de degradacin est vinculado de
alguna forma directa con la traduccin del RNAm
o con el evento de terminacin.
Los genes necesarios para el proceso han sido
identificados en 5. cerevisiae (loci upfj y en C. ele-
garts (loci smg) mediante la deteccin de supresores
de degradacin mediada por mutaciones sin sen-
tido. Las mutaciones de estos genes estabilizan a
las molculas aberrantes de RNAm, pero no afec-
tan la estabilidad de la mayora de los transcritos
de tipo silvestre. Uno de estos genes se conserva en
las eucariotas (upfl/smg2) y codifica a una helicasa
dependiente de ATP (enzima que desenrolla los ci-
dos nucleicos de doble cadena para formar cadenas
individuales). Esto implica que el reconocimiento
del RNAm como objetivo apropiado para la degra-
dacin requiere de un cambio de estructura.
El RNAm de tipo silvestre tiene una estabilidad normal
Traduccin
Una mutacin sin sentido activa la degradacin
Traduccin i raauccion - .
r 1 y| .3
Terminacin prematura
Se inicia la degradacin
144 CAPTULO 7 El RNA mensajero
El gen Upf 1 interacta con los factores de libe-
-
2vin (eRFl y eRF3) que catalizan la terminacin,
-1 es probablemente la forma en que reconoce el
mto de terminacin. Posteriormente puede
"
es-
-
;riar" al RNAm desplazndose hacia el extremo
ara buscar los elementos de secuencia de flujo
rendente.
En las clulas de los mamferos, el sistema de
.
-
.gilancia parece operar slo en mutaciones locali-
: :as antes del ltimo exn, es decir, debe haber
~
intrn despus del sitio de la mutacin, lo cual
.ere que el sistema requiere de un evento en el
.
;leo antes de que los intrones sean eliminados
::
corte y empalme. Una posibilidad es que las
"
:enas se adhieren al RNAm en el ncleo, en la
ntera exn-exn cuando ocurre un evento de
::
ne y empalme. En la FIGURA 7.27 se muestra un
"
ielo general de la operacin de dicho sistema.
Este mecanismo es similar a la forma en que un
Am puede ser marcado para exportarlo desde el
. :'.eo (vase la seccin 26.10, El corte y empalme
:
conectado con la exportacin del RNAm). La
i.cin de una protena a la unin exn-exn crea
2 marca del evento que persiste en el citoplasma.
-
nomlogos humanos de las protenas Upf2,3 de
.
vadura podran estar implicados en dicho siste-
i pues se unen especficamente al RNAm que ha
"
;
? cortado y empalmado.
B3 Las moLcuLas de RNA
eucaritico se transportan
Triceptos principales
'
El RNA es transportado a travs de una membrana a
Tianera de partculas ribonucleoprotenicas.
.
"
odas las molculas de RNA eucaritico que funcionan
sn el citoplasma deben exportarse desde el ncleo.
.
-as molculas de RNAt y el componente de RNA
de una ribonudeasa se importan al interior de las
-
iiitocondrias.
'
-as molculas de RNAm pueden recorrer grandes
distancias entre las clulas de las plantas.
bacterias estn formadas por un solo comparti-
-
rnto, de modo que todos los RNA funcionan en
. inssmo ambiente en el cual son sintetizados, lo
.
y
. es particularmente sorprendente en el caso del
NAm
, en cuyo caso, la traduccin es simultnea a
rranscripcin (vase la seccin 7.7, El ciclo vital
I RNA mensajero bacteriano).
El RNA se transporta a travs de las membra-
.
-
en los diversos ejemplos resumidos en la GURA
. Transportar una molcula de RNA altamente
rvativa a travs de una membrana hidrfoba cons-
Las uniones de empalme son marcadas con protenas
Exn Intrn Exn
q
X La protena se une
empalme
a la unin exn-exn
NCLEO
CITOPLASMA
Se unen ms
protenas
La terminacin
prematura
desencadena la
degradacin
FIGURA 7.27 Un sistema de vigilancia podria tener dos tipos
de componentes. Las protenas deben unirse en el ncleo para
marcar el resultado de un evento de corte y empalme, en tanto
que otras pueden unirse a la marca, ya sea en el ncleo o en
el citoplasma. Estas se activan para degradar al RNAm cuando
los ribosomas terminan prematuramente.
El RNA eucaritico puede ser transportado entre compartimientos celulares
Transporte
Localiz i"
Todo el Ncleo -> citoplasma
RNA
RNAt Ncleo -> mitocondria
Todas las clulas
Muchas clulas
RNAm Clula nodriza -> ovocito Gnesis embrionaria
de la mosca
RNAm Ovocito anterior -> ovocito Gnesis embrionaria
posterior de la mosca
RNAm Clula clula
Floema de las plantas
FIGURA 7.28 Las molculas de RNA se transportan a travs de membranas
en diversos sistemas.
tituye un problema termodinmico que se solucio-
na transportndola empaquetada en protenas.
En las clulas eucariticas, los RNA se trans-
criben en el ncleo, pero la traduccin ocurre
en el citoplasma. Los diferentes tipos de RNA
deben transportarse en el citoplasma para ensam-
blar el mecanismo necesario para la traduccin. As,
el RNAr se ensambla con las protenas ribosmicas
para formar subunidades ribosmicas inmaduras
que constituyen los sustratos para el sistema de
7
.15 Las molculas de RNA eucaritico se transportan
145
transporte; el RNAt es transportado por un sistema
de protenas especfico; el RNAm es transportado
como una ribonucleoprotena, la cual se forma en
el transcrito de RNA en el ncleo (vase el Cap. 26,
Corte, empalme y procesamiento del RNA). Estos
procesos son comunes en todas las clulas eucari-
ticas. Muchos RNAm se traducen en el citosol, si
bien algunos se localizan en el interior de la clula
porque se adhieren a un elemento del citoesqueleto.
En situaciones en que hay localizacin, es impor-
tante que el producto protenico sea producido cer-
ca del sitio de su incorporacin a alguna estructura
macromolecular.
Algunas molculas de RNA se forman en el n-
cleo, se exportan al citosol y posteriormente se im-
portan al interior de las mitocondrias, que en algunos
organismos no codifican a todos los RNAt necesarios
para la sntesis de protenas (vase la seccin 4.10,
Los genomas de los organelos son molculas circu-
lares de DNA que codifican a protenas de los orga-
nelos). En estos casos, los RNAt adicionales deben
importarse desde el citosol. La enzima ribonucleasa
P
, que contiene RNA y subunidades protenicas, es
codificada por genes nucleares, no obstante que se
encuentra tanto en las mitocondrias como en el n-
cleo, lo cual significa que el RNA debe ser importado
al interior de la mitocondria.
Se sabe de algunas situaciones en que el RNAm
es transportado incluso entre clulas. Durante el de-
sarrollo del ovocito en Drosophila, ciertas molculas
de RNAm son transportadas al interior del vulo
desde las clulas nodrizas que lo rodean, dado que
estas ltimas tienen uniones especializadas con el
ovocito que permiten el paso del material necesario
para el desarrollo inicial. Este material incluye cier-
tos RNAm, que una vez dentro del vulo, asumen
localizaciones especficas. Algunos sencillamente se
difunden en el extremo anterior por el que entran,
pero otros recorren todo el vulo, hasta el extremo
posterior, mediante un motor adherido a microt-
bulos.
El caso ms asombroso de transporte del RNAm
es el de las plantas. El movimiento de cidos nuclei-
cos especficos por distancias largas se descubri por
primera vez en las plantas, en las cuales, las pro-
tenas de movimiento vrico propagan la infeccin
vrica transportando el genoma de un virus de RNA
a travs de los plasmodesmos (conexiones entre las
clulas). Por otra parte, las plantas tienen un siste-
ma de defensa que hace que las clulas silencien a
un virus infeccioso, el cual, de igual manera, puede
implicar la dispersin de componentes, incluido al
RNA, a grandes distancias entre las clulas. Ahora se
ha descubierto que las molculas de RNAm pueden
ser transportadas por sistemas similares entre las c-
lulas de las plantas. Aunque la existencia del sistema
se conoce desde hace tiempo, slo recientemerr.t
se demostr su importancia funcional al injerte:
plantas de tomate de tipo silvestre en plantas o -
la mutacin dominante Me (que provoca cambie-:
en la forma de la hoja). El RNAm de la reserva ct
mutantes se transport al interior de las hojas de
injerto de tipo silvestre, donde cambi su forma.
BJ| EL RNAm puede LocaLizarse
especficamente
Conceptos principales
.
El RNAm del Ashl de la levadura forma una
ribonucleoprotena que se une a un motor de miosina.
.
Un motor lo transporta a lo largo de los filamentos de
actina en el brote germinal.
.
Se ancla y se traduce en el brote, de manera que la
protena se encuentra slo en el brote.
En una clula eucaritica, un RNAm se sintetiza en
el ncleo pero se traduce en el citoplasma; entre
en el citoplasma como una partcula ribonucleopr;
tenica que se transporta a travs de un poro m
clear. Una vez en el citosol, el RNAm puede as_-
ciarse con los ribosomas y ser traducido. El citse.
est atestado, lo ocupa una alta concentracin de
protenas. No se sabe bien qu tan libremente puec -
difundirse un polisema en el citosol, y la mayor par-
te de las molculas de RNAm se traducen probable-
mente en locaciones aleatorias, determinadas por
su punto de entrada al citosol y por la distancia qu
han recorrido hasta alejarse de l, aunque algun-
se traducen en sitios especficos mediante diversal
mecanismos:
.
Un RNAm puede ser transportado especfi-
camente a un sitio en el cual se traduce.
.
Puede estar distribuido umversalmente pero
se degrada en todos lo sitios, excepto en e.
de traduccin.
.
Puede difundirse libremente, pero queda
atrapado en el sitio de traduccin.
Uno de los casos mejor caracterizados de loca-
lizacin dentro de una clula es el del Ashl de las
levaduras, que reprime la expresin de la endonu-
cleasa HO en la clula hija que brota, as que el HO se
expresa slo en la clula madre. La consecuencia a
que el tipo de apareamiento cambia slo en la cluL-
madre (vase la seccin 19.24, La regulacin de la
expresin de HO controla el cambio). La causa de I
restriccin en la clula hija es que el RNAm del Ashl
es transportado a partir de la clula madre, donde se
produce, al interior de la clula hija que brota.
Las mutaciones en cualquiera de los cinco ge-
nes conocidos como SHE1-5 impiden la localizacin
146
CAPTULO 7 El RNA mensajero
El RNAm del Ash1 est conectado a un motor El Ashi se mueve a lo largo de los filamentos
de aclina hacia el brote
l/ y VRNAm
"
la She2 se une a
estructuras tallo-lazo
en el RNAm
La She3 conecta a la
She2 con la miosina
La She1 se une al
. filamento de actina
Filamento de actina
: -
;:
- El RNAm del
. Ashl forma una ribonudeoprotena
i :3ntiene un motor de miosina que se desplaza por un
" "
e'to de actina.
. tzca y hacen que el RNAm del Ashl se cstri-
. ; simtricamente en los compartimientos tanto
:
'
.a madre como de la hija. Las protenas Shel,
3 se unen al RNAm del Ashl en una partcu-
zl nnucleoprotenica que transporta al RNAm al
irior de la clula hija, En laFI '.29 se mues-
"
: las funciones de las protenas. Shelp es una
osina (identificada previamente como Myo4), en
que She3 y She2 son protenas que conectan
- iosina con el RNAm. La miosina es un motor
.:
nueve al RNAm a lo largo de los filamentos
: :aina.
En la FIGt se resume el proceso completo.
:
?XAm del Ashl es exportado del ncleo en for-
-
:e ribonudeoprotena y en el citoplasma se une
~
ero a la She2, que detecta algunas estructuras
- darias tallo-lazo en el RNAm. Posteriormente,
. :e3 se une a la She2, despus de lo cual se les
"
: la miosina Shel. A continuacin, la partcula se
-i
~
cha a un filamento de actina y se transporta
. i el brote. Cuando el RNAm del Ashl llega al
r. se ancla ah, quiz por medio de protenas
. - se unen es
pecficamente al RNAm.
1 :ros casos en los cuales el RNAm se transporta
:
s especficos son regidos por principios simi-
-
El RNAm es reconocido mediante secuencias
a ::uacin en cis, las cuales suelen ser regiones
:;:
ructura secundaria de la regin no traducida
ZL RNAm del Ashl es poco comn en el sen-
e que las regiones de actuacin en cis estn
l marco codificador.) El RNAm se empaca en
. ; articula ribonucleoprotenica, y en ocasiones
- - :,
r verse en partculas muy grandes denomina-
- inulos de RNAm, los cuales son los suficien-
"
rr.ce grandes (muchas veces el tamao de un
:
ma) como para contener numerosas protenas
n Iciples componentes de RNA.
Citoplasma materno
Si
Brote
El RNAm del Ashl se exporta del ncleo al cito-
plasma, donde es ensamblado a un complejo con las protenas
Sha. El complejo lo transporta a lo largo de los filamentos de
actina, hasta el brote.
Una RNPm transportada debe conectarse a un
motor que la mueve a lo largo de un sistema de
vas, que pueden ser filamentos de actina o micro-
tbulos. Mientras que el Ashl utiliza un motor de
miosina en las vas de actina, el RNAm de la prote-
na osear del huevo de Drosophila utiliza un motor de
cinesina para moverse a lo largo de microtbulos.
Una vez que el RNAm llega a su destino, necesita ser
anclado para evitar que se difunda. Poco se sabe al
respecto, pero el proceso parece ser independiente
del transporte. Un RNAm transportado por micro-
tbulos puede anclarse a filamentos de actina loca-
lizados en su destino.
BFW Resumen
La informacin gentica que porta el DNA se expre-
sa en dos etapas, la transcripcin del DNA en RNAm
y la traduccin del RNAm en una protena. El RNA
mensajero se transcribe de una cadena de DNA
complementaria de esta cadena (no codificadora) e
idntica a la otra cadena (codificadora). La secuencia
del RNAm, en codones triples 5'-3', est relacionada
con la secuencia de aminocidos de la protena, del
grupo terminal N al grupo terminal C.
El adaptador que interpreta el significado de un
codn es el RNA de transferencia, que tiene una
estructura terciaria compacta en forma de L; un ex-
tremo del RNAt tiene un anticodn complementa-
rio del codn, y el otro extremo puede estar unido
de forma covalente al aminocido especfico que
corresponde al codn diana. Un RNAt que porta un
aminocido se denomina aminoacil-RNAt.
El ribosoma proporciona el mecanismo que per-
mite que los aminoacil-RNAt se unan a sus codo-
nes en el RNAm; la subunidad grande transporta al
polipptido naciente. Un ribosoma se desplaza a lo
largo de un RNAm a partir de un sitio de iniciacin
localizado en la regin 5' hasta un sitio de termina-
cin ubicado en la regin 3
'
, y los aminoacil-RNAt
7
.
17 Resumen 147
apropiados responden a sus codones, descargando
a su aminocido, de tal manera que la cadena po-
lipeptdica creciente aumenta un residuo por cada
codn recorrido.
El mecanismo de traduccin no es especfico de
cada tejido u cada organismo; un RNAm provenien-
te de una fuente puede ser traducido por los riboso-
mas y por las molculas de RNAt de otra fuente. El
nmero de veces que un RNAm se traduce depende
de la afinidad de su(s) sitio(s) de iniciacin por los
ribosomas y de su estabilidad. En algunos casos se
impide especficamente la traduccin de grupos de
RNAm o de molculas de RNAm, evento conocido
como control de la traduccin.
Una molcula tpica de RNAm contiene un l-
der 5' y un remolque 3' no traducidos y regiones
codificadoras. El RNAm bacteriano suele ser poli-
cistrnico, con regiones no traducidas localizadas
entre los cistrones. Cada cistrn est representado
por una regin codificadora que empieza con un
sitio de iniciacin especfico y concluye en un si-
tio de terminacin. Las subunidades ribosmicas se
asocian en el sitio de iniciacin y se disocian en el
de terminacin de cada regin codificadora.
Una bacteria E. coli en cultivo tiene -20 000
ribosomas y -200 000 molculas de RNAt, princi-
palmente en forma de aminoacil-RNAt. Hay -1 500
molculas de RNAm, que representan a dos o tres
copias de cada uno de los 600 mensajeros.
Un solo RNAm puede ser traducido por nume-
rosos ribosomas de manera simultnea y formar un
polirribosoma (o polisoma). Los polisomas bacteria-
nos son grandes y en general estn formados por
decenas de ribosomas unidos a un solo RNAm. Los
polisomas eucariticos son ms pequeos, tpica-
mente de menos de 10 ribosomas; cada RNAm porta
slo una secuencia codificadora.
El RNAm bacteriano tiene una vida media ex-
tremadamente corta, de slo unos minutos; incluso,
el extremo 5
'
empieza a ser traducido mientras las
secuencias en cascada estn siendo transcritas. La
degradacin es iniciada por las endonucleasas que
realizan cortes en sitios discretos, siguiendo a los
ribosomas en direccin 5
'
-
3
'
. Despus, las exonu-
cleasas reducen los fragmentos a nucletidos, de-
gradndolos a partir del extremo 3
'
liberado hacia
el extremo 5
'
. Cada secuencia puede promover o
retardar la degradacin en los RNAm bacterianos.
El RNAm eucaritico debe ser procesado en el
ncleo antes de ser transportado al citoplasma para
su traduccin. Al extremo 5
'
se agrega un casquete
metilado constituido por un nucletido que se agre-
ga al extremo original por un enlace 5
'
-
5
'
, despus
del cual se agregan grupos metilo. La mayor parte
de las molculas bacterianas de RNAm tienen una
secuencia de -200 bases de poli(A) adheridas a su
extremo 3
'
, en el ncleo, despus de la transen:
cin, sin embargo, los RNAm poli(A)
-
parecen ss-
traducidos y degradados con la misma cintica c _ -
los poli(A)+. El RNAm eucaritico existe como u: :
partcula ribonucleoprotenica; en algunos caso
RNPm estn almacenados, por lo que no se traqu-
een. Los RNAm eucariticos suelen ser estables c
rante muchas horas y tener varias secuencias c_
inician la degradacin; hay ejemplos en los cuales
el proceso es regulado.
El RNAm de las levaduras es degradado cuc
do menos por dos rutas que empiezan con la e;
minacin del poli(A) del extremo 3
'
, provocando U
prdida de la protena de unin al poli(A), lo cua!
su vez conduce a la eliminacin del casquete met-l
lado del extremo 5'. Una ruta degrada al RNAm |
partir del extremo 5
'
por medio de una exonucleq<
y la otra degrada al RNAm desde el extremo 3
'
, a ta
vs del exosoma, complejo que contiene numero
exonucleasas.
La degradacin mediada por mutaciones s -
sentido provoca la destruccin de las molculas
RNAm que tienen un codn de terminacin (s -
sentido) antes del ltimo exn; para el proceso \ \
necesitan los loci upf de las levaduras y los loci stty
de los gusanos, sitios que incluyen la actividad de
la helicasa para desenrollar el RNAm y una prote-
na que interacta con los factores que terminan 1=
sntesis protenica. Las caractersticas del proceso es
las clulas de los mamferos sugieren que alguna.
;
de las protenas se adhieren al RNAm en el nck
al momento del corte y empalme del RNA para e/-
minar a los intrones.
Los RNAm pueden ser transportados a loca
"
-
zaciones especficas dentro de una clula (especie -
mente en el desarrollo embrionario). En el sisteirj
Ashl de las levaduras, el RNAm es transportad;
de la clula madre al interior de la clula hija pc-r
medio de un motor de miosina que se desplaza s. -
bre filamentos de actina. En las plantas, los RNA:
pueden ser transportados grandes distancias entte
las clulas.
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150
CAPTULO 7 El RNA mensajero
Sntesis protenca
ESQUEMA DEL CAPITULO
Introduccin
La sntesis protenica ocurre por iniciacin,
elongacin y terminacin
.
El ribosoma tiene tres sitios de unin al RNAt.
.
Un aminoadl-RNAt entra al sitio A.
.
El peptidil-RNAt est unido al sitio P.
.
El RNAt desacilado sale a travs del sitio E.
.
Al transferir el polipptido del peptidil-RNAt del sitio P al
aminoadl-RNAt del sitio A, se agrega un aminocido a la
cadena polipeptdica.
La precisin de la sntesis protenica es
controlada por mecanismos especiales
.
La precisin de la sntesis protenica es controlada por
mecanismos especcos en cada etapa.
La iniciacin en las bacterias requiere de
subunidades SOS y de factores accesorios
.
La iniciacin de la sntesis protenica requiere de
subunidades ribosmicas 30S y SOS separadas.
.
Tambin se necesitan factores de iniciacin (IF-1, -2 y -3)
que se unen a las subunidades SOS.
.
Para formar un complejo de iniciacin, una subunidad 30S
que porta los factores de iniciacin se une a un sitio de
iniciacin del RNAm.
.
El IF-3 debe ser liberado para permitir que las subunidades
50S se unan a los complejos 30S-RNAm.
Un RNAt iniciador especial empieza la cadena
polipeptdica
.
La sntesis protenica empieza con una metionina
usualmente codificada por el triplete AUG.
.
Los diferentes RNAt de metionina estn implicados en la
iniciacin y la elongacin.
.
El RNAt iniciador tiene caractersticas estructurales nicas
que lo distinguen del resto de los RNAt.
.
El grupo NH
2
de la metionina unida al RNAt iniciador
bacteriano est formilado.
El uso del fMet-RNAt
f
es controlado por el IF-2 y
por el ribosoma
.
El IF-2 se une al fMet-RNAtf iniciador y le permite entrar al
sitio P parcial de la subunidad 30S.
La iniciacin implica el apareamiento de bases
entre el RNAm y el RNAr
.
Un sitio de iniciacin del RNAm bacteriano est formado
por el codn de iniciacin AUG precedido de un espacio de
~
10 bases que contiene el hexmero de polipurina Shine-
Dalgarno.
.
El RNAr de la subunidad ribosmica 30S bacteriana tiene
una secuencia complementaria que se aparea con la
secuencia Shine-Dalgarno durante la iniciacin.
Las subunidades pequeas buscan sitios de
iniciacin en el RNAm eucaritico
*
Las subunidades ribosmicas 40S se unen al extremo 5' del
RNAm y exploran al RNAm hasta que llegan a un sitio de
iniciacin.
*
Un sitio de iniciacin eucaritico est formado por una
secuencia de 10 nucletidos que incluye un codn AUG.
.
Las subunidades ribosmicas 60S se unen al complejo en el
sitio de iniciacin.
Las eucariotas utilizan un complejo formado por
numerosos factores de iniciacin
*
Los factores de iniciacin son necesarios en todas las
etapas de sta, incluida la unin del RNAt iniciador, la
unin de las subunidades 40S al RNAm, el desplazamiento
a lo largo del RNAm y la unin de la subunidad 60S.
El RNAt iniciador eucaritico es un Met-RNAt diferente
del utilizado en la elongacin, pero la metionina no est
formilada.
El eIF2 une al Met-RNAt iniciador con el GTP y el complejo
se une a la subunidad 40S antes de que se asocie con el
RNAm.
El El factor de elongacin Tu carga al aminoacil-
RNAt en el sitio A
.
El EF-Tu es una protena G monomrica cuya forma activa
(unida al GTP) se une al aminoacil-RNAt.
.
El complejo EF-Tu-GTP-aminoacil-RNAt se une al sitio A
ribosmico.
liSU La cadena polipeptdica se transfiere al aminoacil-
RNAt
.
La subunidad SOS tiene actividad peptidil transferasa.
.
La cadena polipeptdica naciente se transfiere del peptidil-
RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A.
.
La sntesis de enlaces peptdicos genera RNAt desacilado
en el sitio P y peptidil-RNAt en el sitio A.
H La translocacin mueve al ribosoma
.
La translocacin ribosmica desplaza al RNAm tres bases a
lo largo del ribosoma.
.
La translocacin lleva al RNAt desacilado al interior del
sitio E y al peptidil-RNAt al interior del sitio P, adems de
vaciar el sitio A.
.
El modelo del estado hbrido propone que la translocacin
ocurre en dos etapas, en las cuales la subunidad SOS se
mueve respecto de la subunidad SOS, y posteriormente
Contina en la siguiente pgina
151
sta se desplaza a lo largo del RNAm para restaurar la
conformacin original.
mmta Los factores de elongacin se unen
alternativamente al ribosoma
.
La translocacin requiere de EF-G, cuya estructura es
semejante a la del complejo aminoacil-RNAt-EF-Tu-GTP.
.
La unin de EF-Tu y EF-G con el ribosoma es
mutuamente excluyente.
.
La translocacin requiere de la hidrlisis de 6TP, ta
cual desencadena un cambio en la estructura del
ribosoma.
m:mim La sntesis protenica termina con tres
codones
.
Los codones UAA (ocre), UAG (mbar) y UGA terminan
la sntesis protenica.
.
En las bacterias se utilizan muy a menudo con
frecuencias relativas UAA>UGA>UAG.
m:mvu Los codones de terminacin son reconocidos
por factores protenicos
.
Los codones de terminacin son reconocidos por
factores de liberacin de protenas, no por molculas
de aminoacil-RNAt.
.
Las estructuras de los factores de liberacin clase 1
son semejantes a las del aminoacil-RNAt-EF-Tu y del
EF-G.
.
Los factores de liberacin clase 1 responden a codones
de terminacin especficos e hidrolizan la ligadura
polipptido-RNAt.
.
Los factores de liberacin clase 1 son asistidos por los
factores de liberacin clase 2 que dependen del GTP.
.
El mecanismo es similar en las bacterias (que tienen
dos tipos de factores de liberacin clase 1) y en las
eucariotas (que tienen slo un factor de liberacin
clase 1).
EBU El RNA ribosmico abarca ambas subunidades
ribosmicas
.
Cada RNAr tiene muchos dominios distintos que se
doblan de manera independiente.
.
Virtualmente todas las protenas ribosmicas estn en
contacto con el RNAr.
.
La mayor parte de los contactos entre las subunidades
ribosmicas se realiza entre los RNAr 16S y 23S.
fcltl ios ribosomas tienen numerosos centros
activos
.
Las interacciones en que est implicado el RNAr son
clave para la funcin del ribosoma.
.
El ambiente de los sitios de unin al RNAt depende
ampliamente del RNAr.
El RNAr 16S desempea un papel activo en la
sntesis protenica
.
El RNAr 16S desempea un papel activo en las
funciones de la subunidad 30S, pues interacta
directamente con la subunidad 50S y con los
anticodones de las molculas de RNAt localizadas en
los sitios P y A.
MtB El RNAr 23S tiene actividad peptidil
transferasa
La actividad peptidil transferasa reside exclusivamente
en el RNAr 23S.
MMiB Las estructuras ribosmicas cambian cuando
se unen las subunidades
.
La cabeza de la subunidad 305 gira en torno al cuello
cuando se forman los ribosomas completos.
.
El sitio activo peptidil transferasa de la subunidad 505
tiene mayor actividad en los ribosomas completos que
en las subunidades individuales 505.
*
La interfase entre las subunidades 505 y 305 es muy
rica en contactos disociables.
t:w*m Resumen
ill Introduccin
Un RNAm contiene una serie de codones que in-
teractan de tal manera con los anticodones de los
aminoacil-RNAt que la serie correspondiente
de aminocidos es incorporada a una cadena po-
lipeptdica. El ribosoma proporciona el ambien-
te necesario para controlar la interaccin entre el
RNAm y el aminoacil-RNAt al comportarse como
una pequea fbrica migratoria que viaja a lo largo
del molde conduciendo ciclos rpidos de sntesis de
enlaces peptdicos. Los aminoacil-RNAt entran y
salen de la partcula a una velocidad impresionante
mientras depositan aminocidos, y ciertos factores
de elongacin se asocian y disocian cclicamente de
ellos. Junto con sus factores accesorios, el ribosoma
proporciona el rango completo de actividades nece-
sarias para todos los pasos de la sntesis protenica.
En la FIGURA 8. se muestran las dimensiones
relativas de los componentes del mecanismo de la
sntesis protenica. El ribosoma est formado por
dos subunidades que tienen funciones especficas
en la sntesis de protenas. El RNA mensajero est
asociado con la subunidad pequea, de modo que
-
30 bases del RNAm estn comprometidas en un
momento dado. El RNAm se desliza por la superficie,
cerca de la unin de la subunidades. Dos molculas
de RNAt presentan actividad en la sntesis protenica
en todo momento, de modo que la elongacin del
polipptido implica reacciones que suceden (aproxi-
madamente) dos de los 10 codones que abarca
el ribosoma. Los dos RNAt se insertan en sitios in-
ternos que se extienden por las subunidades. Antes
de ser reciclada, una tercera molcula de RNAt puede
permanecer en el ribosoma despus de haber sido
utilizada en la sntesis protenica.
La forma bsica del ribosoma se ha conservado
durante la evolucin, sin embargo, hay variaciones
apreciables en el tamao general y en las proporcio-
nes de RNA y de protenas en los ribosomas de las
bacterias, del citoplasma eucaritico y de los orga-
nelos. En lafIGURA 8.2 se comparan los componen-
152 CAPTULO 8 Sntesis protenica
ie los ribosomas bacterianos y de los mamferos,
en ambos casos son partculas ribonucleoprote-
s que contiene una mayor cantidad de RNA que
rotenas. Las protenas ribosmicas se conocen
o protenas r.
Cada una de las subunidades ribosmicas con-
e un RNAr importante y cierta cantidad de
enas pequeas. La subunidad grande tambin
e tener una o ms molculas pequeas de
s.. En E. coli, la subunidad pequea (30S) est
"
.ada por RNAr 16S y 21 protenas r, en tanto
en la grande (SOS) se encuentran el RNAr 23S,
XA pequeo 5S y 31 protenas. Excepto por
de la cual hay cuatro copias por cada ribosoma,
hay una copia de cada protena. Las molculas
jres de RNA constituyen la parte principal de la
h del ribosoma bacteriano; su presencia es pene-
E y, de hecho, todas o casi todas las protenas
cmicas contactan al RNAr, de modo que los
-
r mayores constituyen lo que en ocasiones se
r.dera como la columna vertebral de cada sub-
dad, una hebra continua cuya presencia domina
la estructura y determina las posiciones de las
enas ribosmicas.
Los ribosomas citoplsmicos de las eucariotas
eriores son ms grandes que los de las bacterias.
ontenido total de RNA y de protenas es mayor;
molculas mayores de RNA son ms largas (se
ominan RNAr 18S y 28S) y hay ms protenas.
iHblemente la mayor parte de las protenas, si
es que todas, estn presentes en cantidades es-
-.omtricas. El RNA sigue siendo el componente
.. minante por masa.
Lm ribosomas de los organelos son distintos de
-t. citosol y asumen diversas formas, de mane-
ne en algunos casos son casi del tamao de los
enanos y tienen 70% de RNA, mientras que en
. slo son de 60S y tienen <30% de RNA.
El ribosoma posee numerosos centros activos,
.
:no de los cuales est constituido por un grupo
::
reinas relacionadas con una regin de RNAr
. mico. Los centros activos requieren de la par-
edn directa del RNAr en una funcin estruc-
o incluso cataltica. Para algunas funciones ca-
;
f; se requiere de protenas individuales, pero
-..7-3 de las actividades puede ser reproducida
:
rotenas aisladas o por grupos de protenas;
: nan slo en el contexto del ribosoma.
&i el anlisis del ribosoma son importantes dos
s de informacin. Las mutaciones implican a
-
.mas ribosmicas especficas o a bases del RNAr
raciones especficas. En el anlisis estructural,
:
a la modificacin directa de los componentes
tbosoma y las comparaciones para identificar
m
-
;.ctersticas conservadas en el RNAr, se iden-
05
V
1
60 A
220
RNAm de 35 bases
GURA 8.1 Las comparaciones de tamao muestran que el
ribosoma es lo suficientemente grande coma para unirse a los
RNAt y el RNAm.
Los ribosomas son partculas ribonucleoproteinicas
Ribosomas RhJAr Protenas r
Bacterianos (70S)
masa: 2.5 MDa
50S
23S
5S
= 2904 bases
= 120 bases
31
66% de RNA
303 16S =1542 bases 21
Mamferos (SOS)
masa: 4.2 MDa
60S
28S
5.8S
5S
= 4718 bases
=160 bases
=120 bases
49
60% de RNA 40S 18S = 1874 bases 33
. Los ribosomas son partculas ribonucleoproteini-
cas que contienen ms RNA que protenas y que se disocian en
subunidades grandes y pequeas.
tifican las localizaciones especficas de componentes
implicados en funciones particulares.
m La sntesis protenica ocurre
por iniciacin, elongacin
y terminacin
Conceptos principales
. El ribosoma tiene tres sitios de unin al RNAt.
.
Un aminoacil-RNAt entra al sitio A.
.
El peptidil-RNAt est unido al sitio P.
. El RNAt desacilado sale a travs del sitio E.
.
Al transferir el polipptido del peptidil-RNAt del sitio P
al aminoacil-RNAt del sitio A, se agrega un aminocido
a la cadena polipeptdica.
Un aminocido es transportado al ribosoma por un
aminoacil-RNAt, y la adicin a la cadena protenica
creciente se debe a una interaccin con el RNAt
que transport al aminocido previo. Cada uno de
8
.
?- La sntesis protenica ocurre por iniciacin, elongacin y terminacin
153
CodnV Codr/'n + r
El sitio P sujeta Al sitio A entra el
al peptldil-RNAt aminoacil-RNAt
Movimiento del
ribosoma
3
'
1 Antes de la formacin de! enlace peptidico
,
el
peptidil-RNAt ocupa el sitio P; el aminoacil-RNAt
ocupa el sitio A A
minocido para el
. rrA codn n + 1
Cadena naciente
2 En la formacin c el enlace poptdico, el polipptido
es transferido del polipeptidil-RNAt del sitio P ai
aminoacil-RNAt del sitio A
c
3 La translocacin mueve al ribosoma un codn;
coloca al peptidil-RNAt en el sitio P; el RNAt
desacilado sale por el sitio E; el sitio A es desocupado
para el prximo aa-RNAt
Codn "n + 1" Cod
s
nl.n + 2
cargado.
El ribosoma tiene dos sitios para unirse al RNAt
sitios de unin con al R
n ambas unidades
Los extremos aminoacilo
del RNAt interactan con
la subunidad
ribosmica grande
Los anticodones estn unidos
a tripletes adyacentes del
RNAm en la subunidad
pequea del ribosoma
Los sitios P y A posicionan a los RNAt que inter-
actan a travs de ambas subunidades ribosmicas.
estos RNAt yace en un sitio distinto del ribosoma.
En la se muestra que los dos sitios tienen
caractersticas distintas:
.
Un aminoacil-RNAt se une al sitio A, per?
antes de que entre, el sitio expone el codo
que representa al siguiente aminocido quf
se agregar a la cadena.
.
El codn que representa al aminocido m
recientemente agregado a la cadena poli-
peptdica naciente est en el sitio P, el cual
es ocupado por el peptidil-RNAt,
RNA*
que porta la cadena polipeptdica naciente.
En la se muestra que el extremo de!
RNAt que lleva un aminocido se localiza en la sub'
unidad grande, mientras que el anticodn ubicada
en el otro extremo interacta con el RNAm unidc
a la subunidad pequea, de modo que los sitios P
"

A abarcan las dos subunidades ribosmicas.

Para que un ribosoma sintetice un enlace pepti-
dico, debe encontrarse en el estado que se muestra
en el paso 1 de la Figura 8.3, cuando el peptidil-
RNAt se encuentra en el sitio P y el aminoacil-RNAl
en el A. La formacin del enlace peptidico ocurre
cuando el polipptido transportado por el peptidil-
RNAt es transferido al aminocido transportado por
el aminoacil-RNAt, reaccin catalizada por la sub-
unidad grande del ribosoma.
La transferencia del polipptido genera el ribo-
soma que se muestra en el paso 2, en el cual el
RNAt desacilado, que carece de aminocido, se en
cuentra en el sitio P, mientras que en el sitio A se
ha creado un peptidil-RNAt nuevo ms largo debido
a que tiene un aminocido ms que el peptidil-RNAt
que estaba en el sitio P en el paso 1.
Ahora, el ribosoma desplaza un triplete a 10
largo del mensajero, etapa denominada translo-
cacin. El movimiento transfiere al RNAt desaci-
lado fuera del sitio P y desplaza al peptidil-RNAt al
interior de ste (vase el paso 3 de la figura). El si-
guiente codn que debe ser traducido se encuentra
ahora en el sitio A, listo para que entre un nuevo
aminoacil-RNAt, repitindose as el ciclo. En la R-
se resume la interaccin entre los RNAt y
el ribosoma.
El RNAt desacilado abandona al ribosoma a trd-
vs de otro sitio de unin de RNAt, el sitio E
,
ocu-
pado transitoriamente por el RNAt despus de que
sale del sitio P y antes de ser liberado del ribosoma
hacia el citosol. As pues, el RNAt entra al sitio A,
pasa por el sitio P y sale por el sitio E (vase tam-
bin la Fig. 8.28, seccin 8.12). En la FIGURA 8.6
compara el movimiento del RNAt y del RNAm, que
puede considerarse como una espede de engranaje
en el cual la reaccin es conducida por la interaccin
entre codn y anticodn.
154
CAPTULO 8 Sntesis protenica
La sntesis del enlace pepttdico implica la transferencia
del polipptido al aminoacil-RNAt
El aminoacil-RNAt El polipptido es transferido La transiocacln mueve al
entra al sitio A al aminoacil-RNAt peptidil-RNAt al sitio P
El aminoacil-RNAt entra al sitio A, recibe a la cadena polipeptdica del peptidil-
RNAt y es transferido al sitio P para el siguiente ciclo de elongacin.
:
RNAm y el RNAt se mueven a travs del ribosoma
RNAt
Sitio A
Sitio P
-
NAm <
A 8,6 El RNAt y el RNAm se mueven a travs del ribo-
h la misma direccin.
La sntesis protenica se divide en tres etapas,
Hadas en la FIGURA 8.7:
.
La iniciacin implica las reacciones que pre-
ceden a la formacin del enlace peptdico
entre los primeros dos aminocidos de la
protena, proceso que exige que el ribosoma
se una al RNAm para formar un complejo de
iniciacin que contiene al primer aminoacil-
RNAt. Este paso es relativamente lento en la
sntesis protenica y usualmente determina
la velocidad a la cual se traduce un RNAm.
.
La elongacin incluye todas las reacciones
que tienen lugar desde la sntesis del primer
enlace peptdico hasta la adicin del ltimo
aminocido. Los aminocidos se agregan a
la cadena uno a uno; la adicin de un ami-
nocido es el paso ms rpido en la sntesis
protenica.
La terminacin comprende los pasos nece-
sarios para liberar a la cadena polipeptdica
completa; al mismo tiempo, el ribosoma se
disocia del RNAm.
Ir. cada etapa, el ribosoma es asistido por dife-
zonjuntos de factores accesorios; la energa
tr.e de la hidrlisis del trifosfato de guanosina
'
.-anie triphosphate).
La sntesis protenica consta de tres etapas
iniciacin La subunidad 508 se une a la 308 por
medio del sitio de unin ai RNAm y se agrega el
aminoacil-RNAt
Elongacin El ribosoma se desplaza a lo largo del
RNAm, ampliando la protena por transferencia del
peptidil-RNAt al aminoacil-RNAt
Terminacin La cadena polipeptdica es liberada del
RNAt y el ribosoma se disocia del RNAm
La sntesis protenica se divide en tres etapas.
Durante la iniciacin, la subunidad ribosmi-
ca pequea se une al RNAm y posteriormente a la
subunidad SOS. Durante la elongacin, el RNAm se
desplaza a lo largo del ribosoma y se traduce en tri-
pletes. (Aunque en general se hace referencia a que
el ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm, es ms
realista pensar que el RNAm es jalado a travs del
ribosoma.) En la terminacin, la protena se libera,
el RNAm se separa y las subunidades ribosmicas se
disocian para poder ser utilizadas nuevamente.
8
.2 La sntesis protenica ocurre por iniciacin, elongacin y terminacin
155
La precisin de La sntesis
protenica es controlada
por mecanismos especiales
Concepto principal
La precisin de La sntesis protenica es controlada por
mecanismos especficos en cada etapa.
Se sabe que, en general, la sntesis de las protenas
es exacta por la coherencia con se determina la se-
cuencia de una protena, y aunque son pocas las
mediciones detalladas de la tasa de error in vivo, sue-
le pensarse que el rango de error oscila entre 104 y
105 aminocidos incorporados. Considerando que la
mayor parte de las protenas se produce en grandes
cantidades, la tasa de error es muy baja como para
incidir en el fenotipo de la clula.
No es inmediatamente obvio cmo se logra di-
cha tasa de error tan baja, y de hecho, la naturaleza
de los eventos discriminatorios es un tema general
planteado en varias de las etapas de la expresin
gnica. Cmo reconocen las sintetasas justo a los
RNAt y a los aminocidos correspondientes? Cmo
reconoce un ribosoma los RNAt y los aminocidos
correspondientes? Cmo detecta un ribosoma al
-
etapa de la expresin gnica
Tasa de error
/VA/X/V Base
equivocada
Cambio del
1
Atiiiliiioacij*
RNAt
sinfelaSa
R-C-H
marco de lectura
Aminoacil-RNAt
equivocado
Aminocido
equivocado
RNAt
equivocado
icr6icr5icr
,
2
R-C-H
'
COOH
FIGURA 8.8 Los errores se presentan a tasas que oscilan entre
10"6 y 5 x 10"4 en etapas diferentes de la sntesis protenica.
RNAt que corresponde al codn del sitio A? Cmo
identifican las enzimas que sintetizan DNA o RNa
slo a la base complementaria del molde? Cada caso
plantea un problema similar: cmo distinguir a m
miembro especfico en un conjunto en el que todo;
los integrantes tienen las mismas caractersticas ge-
nerales.
Es probable que uno de los miembros empiect
por contactar el centro activo mediante un proces
de impactos aleatorios, pero despus, los miembro
errneos son rechazados y slo se acepta el apropia-
do, que siempre forma parte de una minora (un:
de 20 aminocidos, uno de -40 RNAt, una de cuatrc
bases), de modo que los criterios de discriminacin
deben ser estrictos. El punto es que la enzima debe
tener algn mecanismo que perfeccione el proce-
so de discriminacin respecto del nivel que podr;
lograrse haciendo contacto slo con las superficie--
disponibles en los sustratos.
En la FIGURA 8. se resumen las tasas de erro:
en cada paso que pueden afectar la precisin de I
sntesis protenica.
Los errores de transcripcin del RNAm son poce
frecuentes, quiz de <10~6. Es importante controlar
esta etapa porque una sola molcula de RNAm se
traduce en muchas copias de protena, y no es mu-
cho lo que se sabe respecto de estos mecanismos.
El ribosoma puede cometer dos tipos de erro-
res en la sntesis protenica: provocar un cambio ec
el marco de lectura al omitir una base cuando lee
RNAm (o en la direccin opuesta al leer una base
dos veces, una como la ltima base de un codn I
nuevamente como la primera base del siguiente)
errores raros cuya incidencia es de ~10
"5
,
o bien
permitir que un aminoacil-RNAt incorrecto se apa-
ree (errneamente) con un codn, provocando la
incorporacin de un aminocido incorrecto, que ta
vez sea el error ms comn en la sntesis protenica.
con una incidencia de ~5 x 10
"*
y que es controladc
por la estructura del ribosoma y por la velocidac
(vase la seccin 9.15, El ribosoma influye la preci-
sin de la traduccin).
Una RNAt sintetasa puede provocar dos tipos
de errores: colocar un aminocido equivocado en su
RNAt o cargar a su aminocido en el RNAt incorrec-
to. La incorporacin de un aminocido errneo es
ms comn, probablemente porque el RNAt ofrece
una superficie ms extensa con la cual la enzima
puede hacer muchos ms contactos para garantizar
la especificidad. Las aminoacil-RNAt sintetasas tie-
nen mecanismos especficos para corregir errores
antes de que sea liberado un RNAt cargado equi-
vocadamente (vase la seccin 9.11, Las sintetasas
utilizan mecanismos de correccin para mejorar la
precisin).
156 CAPTULO 8 Sntesis protenica
La iniciacin en las bacterias
requiere de subunidades SOS
y de factores accesorios
Conceptos principales
La iniciacin de la sntesis protenica requiere de
subunidades ribosmicas 305 y 505 separadas.
Tambin se necesitan factores de iniciacin (IF-1, -2 y
-
3) que se unen a las subunidades 305.
.
Para formar un complejo de iniciacin, una subunidad
305 que porta los factores de iniciacin se une a un
sitio de iniciacin del RNAm.
1 El IF-3 debe ser liberado para permitir que las
subunidades 505 se unan a los complejos 305-RNAm.
_
ribosomas bacterianos implicados en el alarga-
rnto de una cadena polipeptdica existen como
utculas 70S que en la terminacin son liberadas
RNAm como ribosomas libres. En las bacterias
:
:ultivo, la mayor parte de los ribosomas sinte-
-.= -1 protenas; el banco libre tiende a contener
10% de los ribosomas.
los ribosomas que se encuentran en el banco
::
e pueden disociarse en subunidades indepen-
;
~
:
es, es decir, que los ribosomas 70S estn en
equilibrio dinmico respecto de las subunidades 50S
- .
5
. La iniciacin de la sntesis protenica no es una
:::n de los ribosomas intactos, la asumen las subuni-
independientes, las cuales se reasocian durante
reaccin de la iniciacin. En la se resu-
: rl ciclo de las subunidades ribosmicas durante
r
.tesis protenica de las bacterias.
La iniciacin tiene lugar en una secuencia es-
-
-. localizada en el RNAm denominada sitio
-
.;
nin con el ribosoma, que es una secuencia
de bases que precede a la regin codificadora
ri e la Fig. 8.1). Las subunidades grande y peque-
asocian en el sitio de unin con el ribosoma,
sra formar un ribosoma intacto, mediante una re-
::;
n en dos pasos;
.
El reconocimiento del RNAm ocurre cuando
se une una subunidad pequea para formar
un complejo de iniciacin en el sitio de
unin con el ribosoma.
.
Una subunidad grande se une al complejo
para formar un ribosoma completo.
Aunque la subunidad 30S est involucrada en
r_
dacin, no es susceptible de asumir por s mis-
.
as reacciones que unen el RNAm con el RNAt,
a lo cual se necesitan protenas adicionales de-
gradas factores de iniciacin (IF, initiation
rs), los cuales se encuentran slo en las sub-
uisdes 30S y se liberan cuando stas se asocian con
- ?unidades 505 para formar los ribosomas 70S.
Este comportamiento distingue a los factores de ini-
ciacin de las protenas estructurales del ribosoma.
Los factores de iniciacin participan nicamente en
la formacin del complejo de iniciacin, no forman
parte de los ribosomas 70S y no desempean ningu-
na funcin en las etapas de elongacin. En la
se resumen las etapas de la iniciacin.
Las subunidades ribosmicas se recc
Factores de
iniciacin
Subunidades
SOS con
factores de
iniciacin
Subunidades Banco de
separadas ribosomas
libres
iniciacin
Elongacin
Terminacin
La iniciacin requiere de subunidades ribosmicas
libres. Cuando los ribosomas son liberados en la terminacin,
la subunidad 305 se une a factores de iniciacin y se disocia
para generar subunidades Libres. Cuando Las subunidades se
reasocian para formar un ribosoma funcional en La iniciacin,
Liberan a los factores.
La iniciacin requiere de factores y subunidades libres
1 La subunidad SOS se une al RNAm
\F-5
\f-7
2 El IF-2 acarrea ai RNAt ai sitio P
3 Los IF son liberados y se adhiere la unidad 508
Los factores de iniciacin estabilizan a Las sub-
unidades 305 libres y unen al RNAt iniciador con el complejo
30S-RNAm.
8
.4 La iniciacin en las bacterias requiere de subunidades 305 y de factores accesorios
157
El IF-3 controla el equilibrio entre ribosomas
subunidades
Subunidades
libres
Equilibrio
dinmico
Banco de
ribosomas 70S
La subunidad 30S con el IF-3 puede
unirse al RNAm, a diferencia de la
subunidad SOS
El IF-3 debe ser liberado antes de que
la subunidad SOS pueda unirse
La iniciacin requiere de subunidades 30S que
portan IF-3.
Las bacterias utilizan tres factores de iniciacin,
denominados IF-l, IF-2 e IF-3, que el RNAm y el
RNAt necesitan para entrar al complejo de inicia-
cin:
.
El IF-3 permite que las subunidades 30S se
unan especficamente a los sitios de inicia-
cin del RNAm.
.
El IF-2 se une a un RNAt iniciador especial
y controla su entrada al ribosoma.
.
El IF-1 se une a las subunidades 30S slo
como parte del complejo de iniciacin com-
pleto. Se une al sitio A y evita que entre el
aminoacil-RNAt. Su localizacin tambin
puede impedir que la subunidad 30S se una
a la subunidad 505,
El IF-3 tiene mltiples funciones; primeramente
es necesario para estabilizar a las subunidades 30S (li-
bres); despus las habilita para que se unan al RNAm
y, como parte del complejo 30S-RNAm, inspecciona
la exactitud del reconocimiento del primer aminoacil-
RNAt (vase la seccin 8.6, El uso del fMet-RNAt
j
es
controlado por el IF-2 y por el ribosoma).
La primera funcin del IF-3 es controlar el equi-
librio entre los estados ribosmicos, como se mues-
tra en la . Este factor de iniciacin se une
a las subunidades 30S libres que son liberadas del
banco de ribosomas 70S; su presencia evita que la
subunidad 30S vuelva a asociarse con la subunidad
50S. La reaccin entre el IF-3 y la subunidad 30S
es estequiomtrica: una molcula de IF-3 se une a
cada subunidad. La cantidad de IF-3 es relativamen-
te escasa, por lo tanto, su disponibilidad determina
el nmero de subunidades 30S libres.
El IF-3 se une a la superficie de la subunida:
30S cerca del sitio A. Hay una superposicin signi-
ficativa entre las bases del RNAr I6S protegido po:
el IF-3 y las protegidas por la unin de la subuni-
dad SOS, lo cual sugiere que evita fsicamente la
unin de las subunidades, de modo que el IF-3 s
comporta como un factor anti-asociativo que hace
que una subunidad 30S permanezca en el banco de
subunidades libres.
La segunda funcin del IF-3 es controlar la cap-
cidad de las subunidades 30S para unirse al RNAm
Las subunidades pequeas deben tener IF-3 para
formar complejos de iniciacin con el RNAm, factor
que debe ser liberado del complejo 30S-RNAm par;
permitir que se una la subunidad SOS; una vez li-
berado, inmediatamente se recicla al encontrar otn
subunidad 30S.
El IF-2 tiene una actividad GTPasa dependien:;
de ribosomas, pues fomenta la hidrlisis de GTP en
presencia de ribosomas, liberando la energa alma-
cenada en el enlace de alta energa. El GTP es hidn: -
lizado cuando se une la subunidad SOS para generir
un ribosoma completo. La divisin del GTP podr.j
estar implicada en el cambio de conformacin del
ribosoma, de modo que las subunidades unidas seas
transformadas en un ribosoma 70S activo.
Un RNAt iniciador especial
empieza La cadena
polipeptdica
Conceptos principales
La sntesis protem'ca empieza con una metionina
usualmente codificada por el triplete AUG.
Los diferentes RNAt de metionina estn implicados en
la iniciacin y la elongacin.
El RNAt iniciador tiene caractersticas estructurales
nicas que lo distinguen del resto de los RNAt.
El grupo NH
2
de la metionina unida al RNAt iniciador
bacteriano est formilado.
La sntesis de todas las protenas empieza con el mis-
mo aminocido, la metionina. La seal para inicU-
una cadena polipeptdica es un codn de iniciacii :
especial que marca el principio del marco de lertur;
dicho codn de iniciacin suele ser el triplete AUG
aunque en las bacterias tambin se utilizan los c
dones GUG o UUG.
El codn AUG representa a la metionina, an..-
nocido que puede ser transportado por dos tip.-
de RNAt, uno utilizado para la iniciacin y el oti
para el reconocimiento de los codones AUG durame
la elongacin.
CAPTULO 8 Sntesis protenica
En las bacterias y los organelos eucariticos, el
-
XAt iniciador transporta una metionina formilada
:
~
su grupo amino y poder formar una molcu-
i de N-formil-metionil-RNAt, conocido como
RNAt
f
Met
. El nombre del aminoacil-RNAt general-
riente se abrevia como fMet-RNAt
r
El RNAt iniciador adquiere a su aminocido
"
Ddiicado en una reaccin de dos etapas, primero
c carga con el aminocido para generar Met-RNAt
j
| posteriormente, la reaccin de formilacin ilus-
:;
da en la FIGURA 8.12 bloquea al grupo NH
2
libre.
Aunque el grupo aminocido bloqueado evitar que
-
-. iniciador participe en la elongacin de la cade-
na, no interfiere con la capacidad para iniciar una
: rotena.
Este RNAt se utiliza slo para la iniciacin, re-
conoce a los codones AUG o GUG (en ocasiones, al
.
""
JG). Dicho reconocimiento no es tan bueno en
iinbos casos
, la extensin de la iniciacin disminuye
"
roximadamenlc a la mitad cuando el codn AUG
es remplazado por el GUG y nuevamente a la mitad
cuando se utiliza el codn UUG.
La especie responsable del reconocimiento de
i codones AUG en localizaciones internas es el
NAt
m
Met
, el cual responde nicamente a los co-
i nes AUG internos.
Qu caractersticas distinguen al fMet-RNAt,
dador del Met-RNAt
m
utilizado en la elongacin?
-unos rasgos caractersticos de la secuencia del
:
NAt son importantes, como se resume en la FIGUR/
, pues son necesarias para evitar que el iniciador
:
i utilizado en la elongacin, mientras que otras
rrmiten su funcionamiento en la iniciacin:
.
La formilacin no es estrictamente necesaria
porque el Met-RNAtf no formilado puede
funcionar como iniciador, pero incrementa
la eficiencia con la cual es utilizado porque
es una de las caractersticas reconocidas por
el IF-2 que se une al RNAt iniciador.
.
Las bases que se enfrentan una a otra en la
ltima posicin del tallo, a las cuales se
conecta el aminocido, estn apareadas
en todos los RNAt, excepto en el RNAt
(
Met
.
Las mutaciones que crean un par de bases
en esta posicin del RNAt
(
Mct l
e permiten
actuar en la elongacin, de modo que su
ausencia es importante para evitar que el
RNAt
(
M!t
sea utilizado en la elongacin;
tambin es necesario para la reaccin de la
formilacin.
.
En el RNAt/ 1 hay una serie exclusiva de
tres pares G-C en el tallo que precede al lazo
que contiene al anticodn, los cuales son
necesarios para permitir que el fMet-RNAt
f
se inserte directamente en el sitio P.
El Met-RNAt iniciador est formilado
Grupo amino bloqueado
H
0 = 0
r
Met-RNAt
1 D-formil
tetrahidrofolato
N-formil-met-RNAt
,
tetrahidrofoiato
FIGURA 8.1.: El N-formil-metionil-RNAt (fMet-RNAtf) iniciador
es generado por la formilacin del metionil-RNAt utilizando al
formil-tetrahidrofolato como cofactor.
El RNAt iniciador tiene
caracteristi
Aminocido
formilado
Sin apareamiento
de bases
c
u
3 pares de
bases G-C
Formiio
Met
i
'
0
c
c
A
A
Necesario
G C para la
Ss G
formilacin
G C
G
G
Q
C
A
C C G G C C A
G U C G G A
G
C
U
T C
7
(, G
<3 U
AA
G
G
G C
Necesarios
G
G
C
c
para entrar
C A
al sitio P
U A
C A
U
IGURA 8.13 El fMet-RNAtf tiene caractersticas nicas que lo
distinguen como RNAt iniciador.
En las bacterias y en las mitocondrias, el resi-
duo formilo localizado en la metionina iniciadora es
eliminado por una enzima desformilasa especfica
para generar un grupo NH2 terminal normal. Si la
metionina resulta ser el aminocido terminal N de
la protena, este paso ser el nico necesario. Ms o
menos en la mitad de las protenas, la metionina lo-
calizada en el extremo es eliminada por una amino-
peptidasa, la cual crea una terminacin nueva de R2
(originalmente el segundo aminocido incorporado
en la cadena). Cuando ambos pasos son necesarios,
son secuenciales. Las reacciones de eliminacin son
bastante rpidas, probablemente cuando la cadena
polipeptdica naciente ha alcanzado una longitud
de 15 aminocidos.
8.5 Un RNAt iniciador especial empieza la cadena polipeptdica 159
EL uso del fMet-RNAt
f
es controLado por el IF-2
y por el ribosoma
Concepto principal
.
EL IF-2 se une al fMet-RNAt
f
iniciador y le permite
entrar al sitio P parcial de la subunidad 30S.
El significado de los codones AUG y GUG depende
de su contexto. Cuando AUG se utiliza para la ini-
ciacin, se lee como formil-metionina
, pero en la
regin codificadora representa a la metionina. Por
otra parte, el significado del codn GUG depende
an ms de su localizacin, de modo que cuando se
presenta como primer codn, mediante la reaccin
de iniciacin se lee como formil-metionina, pero si
est dentro de un gen, es ledo por el Val-RNAt,
uno
de los miembros regulares del conjunto del RNAt,
para proporcionar valina conforme lo exija el cdigo
gentico.
Cmo se interpreta el contexto de los codones
AUG y GUG? En la se ilustra el papel de-
cisivo del ribosoma cuando acta en conjunto con
los factores accesorios.
Las subunidades 30S inician; ios ribosomas
realizan la elongacin
IF-2
JViet
Slo ei fMet-RNAt, entra al
sitio P parcial de la subunidad
SOS unida al RNAm
fMet
AUG NNN
Slo aa-RNAt entra
al sitio A en el
ribosoma 70S
completo
EF-Tu
aa
l>
Slo el fMet-RNAt
f
puede ser utilizado por las
subunidades 30S para la iniciacin; los otros aminoacil-RNAt
(aa-RNAt) deben ser utilizados para la elongacin por los ri-
bosomas 70S.
En un complejo de iniciacin,
slo la subunidac
pequea est unida al RNA y el codn de iniciacin
se encuentra en la parte del sitio P que porta I
subunidad pequea. El nico aminoacil-RNAt que
puede formar parte del complejo de iniciacin es I
iniciador, el cual tiene la propiedad nica de pode:
entrar directamente ai sitio P parcial para reconocer
a su codn.
Cuando la subunidad grande se une al comple-
jo, los sitios parciales de unin al RNAt se convier-
ten en los sitios intactos P y A. Bl fMet-RNAt
,
ocupa
el sitio P y el sitio A est disponible para la entrad
del aminoacil-RNAt complementario del segundr
codn del gen. El primer enlace peptdico se forifll
entre el RNAt iniciador y el siguiente aminoaci!--
RNAt.
La iniciacin prevalece si un codn AUG (:
GUG) est dentro de un sitio de unin con el ribo-
soma porque slo el RNAt iniciador puede entra?
al sitio P parcial generado cuando la subunidad 30;
se une de novo al RNAm. Subsecuentemente pre-
domina la lectura interna, cuando los codones son
hallados por un ribosoma que sigue traduciendo uR
RNAm, ya que slo los aminoacil-RNAt nrmale:
pueden entrar al sitio A (completo).
Los factores accesorios son muy importante:-
para controlar el uso de los aminoacil-RNAt, todos 1
relacionan con el ribosoma por la unin a un factc"
accesorio. El factor utilizado en la iniciacin es IF-I
(vase la seccin 8.4, La iniciacin en las bacterias,
requiere de subunidades 30S y de factores accesc-
rios) y el factor correspondiente para la elongacir.
es EF-Tu (vase la seccin 8.10, El factor de elongc-
cin Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A).
El IF-2 coloca al RNAt iniciador en el sitio P, y
al formar un complejo especficamente con el fMe:-
RNAt
f,
asegura que slo el RNAt iniciador, y nin-
guno de los aminoacil-RNAt normales, participe ec
la reaccin de iniciacin. Por el contrario, el EF-Tu
que coloca los aminoacil-RNAt en el sitio A, no puf"]
den unirse al fMet-RNAt
{,
cuyo uso, por lo tanto, i
excluido de la elongacin.
El IF-3 se encarga de realizar una verificado:
adicional de la exactitud, por la cual se estabiliza B
unin del RNAt iniciador merced a la deteccin dd
apareamiento correcto de bases con la segunda y \i
tercera base del codn de iniciacin AUG.
En la FIGURA se detalla la serie de eventos
por medio de los cuales el IF-2 coloca al fMet-RNA
iniciador en el sitio P. El IF-2, unido al GTP se re-
laciona con el sitio P de la subunidad 30S. En este
punto, dicha subunidad porta a todos los factores
de iniciacin. El fMet-RNAt
,
se une al IF-2 en la
subunidad 30S y posteriormente el IF-2 transfierr
el RNAt al sitio parcial P.
160 CAPTULO 8 Sntesis proteinica
El codon AUG es precedido por una secuencia
Shine-Dalgamo
La iniciacin es controlada por tres factores
Complejo 30S-RNAm
Ei IF2-GTP se une
IF-3 1F-1
IF-2
al complejo
GTP
fMet
Se une el RNAt iniciador
I
3e une la subunldad SOS
/ los IF1, 2 y 3 son liberados
fMet
IF-1 IF-2 IF-3 GDP P;
IA 8.15 EL IF-2 es necesario para unir al fMet-RNAt
f
con
"
jlejo 30S-RNAm. Despus de la unin de la subunidad
::
dos Los IF son liberados y el GTP es dividido.
Unin del ribosoma
con el sitio de
iniciacin dei
RNAm
Adicin de nucleasa
para digerir todo el
RNAm no protegido
Fragmento aislado
del RNAm
protegido
Determinacin
de la secuencia
MCAGGAGGAUUACCCC. .jGUCGAAGCAA... del RNAm
protegido
Lder
Regin codificadora
Shine-Dalgamo
<10 bases en flujo
ascendente desde
el AUG
en el centro
del fragmento
protegido
Todas las
regiones de
iniciacin tienen
dos elementos
de consenso
Los sitios de unin con el ribosoma del RNAm
pueden ser recuperados de los complejos de iniciacin; inclu-
yen La secuencia de flujo ascendente Shine-Dalgamo y el codn
de iniciacin.
La iniciacin implica
el apareamiento de bases
entre eL RNAm y eL RNAr
-
:
ep:cs principales
Jn sitio de iniciacin del RNAm bacteriano est
"
'
:
'
Tiado por el codn de iniciacin AUG precedido de
espacio de -10 bases que contiene el hexmero de
::
-
;
purina Shine-Dalgamo.
-
- RNAr de la subunidad ribosmica 30S bacteriana
- . una secuencia complementaria que se aparea con
b secuencia Shine-Dalgamo durante la iniciacin.
RNAm contiene numerosos tripletes AUG,
:i se reconoce al codn de iniciacin como
.eedor del punto de inicio de la traduccin?
-
.
-
.ios del RNAm en los cuales se inicia la snte-
::
tenica pueden ser identificados por la unin
.:
osoma y el RNAm en condiciones en que se
uea la elongacin. Posteriormente, el riboso-
permanece en el sitio de iniciacin. Cuando se
r a la ribonucleasa al complejo de iniciacin
: - eado, todas las regiones del RNAm ajenas al
:
na son degradadas, pero las que estn unidas
rstn protegidas, como se ilustra en la FIC
los fragmentos protegidos pueden ser recupe-
4?s y caracterizados.
Las secuencias de iniciacin protegidas por los
ribosomas bacterianos tienen una longitud de -30
bases. Los sitios de unin al ribosoma de distintos
RNAm bacterianos muestran dos caractersticas co-
munes:
.
El codn de iniciacin AUG (o, con menos
frecuencia, los codones GUG y UUG) siem-
pre forma parte de la secuencia protegida.
.
En un espacio de diez bases de flujo ascen-
dente a partir del AUG hay una secuencia
que corresponde total o parcialmente al
hexmero.
5
'
. . . A G G A G G . . . 3'
A este fragmento de polipurina se le conoce como
secuencia Shme-Dalgarno, y es complementaria de
una secuencia muy conservada que se localiza cerca
del extremo 3' del RNAr 16S. (La extensin de la
complementariedad es diferente entre las molculas
de RNAm y puede extenderse desde una secuencia
fundamental formada por cuatro bases GAGG, a una
secuencia de nueve bases que se extiende ms all
del hexmero.) Escrito de forma inversa, la secuencia
del RNAr es el hexmero:
3
'
. . . U C C U C C . . . 5'
Se aparea la secuencia Shine-Dalgarno con
su complemento del RNAr durante la unin ribo-
soma-RNAm? Las mutaciones de ambas partes de
esta reaccin demuestran su importancia en la ini-
8.7 La iniciacin implica el apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr
161
ciacin. Las mutaciones puntuales de la secuencia
Shine-Dalgarno pueden impedir la traduccin de
un RNAm. Adems, la introduccin de mutaciones
en la secuencia complementaria del RNAr es per-
judicial para la clula y cambia el patrn de sntesis
protenica. La confirmacin decisiva de la reaccin
de apareamiento de bases es que una mutacin en
la secuencia Shine-Dalgarno de un RNAm puede
ser suprimida por una mutacin compensadora en
el RNAr que restaure el apareamiento de bases.
La secuencia que se encuentra en el extremo 3'
del RNAr se conserva entre procariotas y eucario-
tas, con la diferencia de que en todas las eucario-
tas tiene lugar la delecin de la secuencia de cinco
bases CCUCC que es el complemento principal de
la secuencia Shine-Dalgarno. No parece haber apa-
reamiento de bases entre el RNAm y el RNAr 18S
eucariticos. sta es una diferencia significativa en
el mecanismo de iniciacin.
En las bacterias, una subunidad 30S se une
directamente con el sitio de unin del ribosoma,
de modo que el complejo de iniciacin se forma
en una secuencia que rodea al codn de iniciacin
AUG. Cuando el RNAm es policistrnico, cada re-
gin codificadora empieza con un sitio de unin
con el ribosoma.
Las caractersticas de la expresin gnica bac-
teriana significan que la traduccin de un RNAm
bacteriano procede secuencialmente a travs de sus
cistrones. Cuando los ribosomas se adhieren a la pri-
mera regin codificadora, las subsiguientes no han
sido transcritas todava. Cuando el segundo sitio ri-
bosmico est disponible, la traduccin a travs del
primer cistrn ya est bastante avanzada.
Lo que sucede entre las regiones codificadoras
depende del RNAm individual. En la mayor parte
de los casos, quiz los ribosomas se unen de mane-
ra independiente al inicio de cada cistrn. La serie
de eventos ms comn se ilustra en la FIGURA 8.17.
Muchos genes de un RNAm inician de manera independiente
Iniciacin Terminacin Iniciacin
Primera regin codificadora Segunda regin codificadora
FIGURA 8.17 La iniciacin ocurre de manera independiente
en cada cistrn de un RNAm policistrnico. Cuando la regin
intercistrnica es ms larga que la extensin del ribosoma,
la disociacin en el sitio de terminacin es seguida por otra
reiniciacin independiente en el siguiente cistrn.
Cuando termina la sntesis de la primera protena
los ribosomas abandonan el RNAm y se disocian en
subunidades, y a continuacin, debe ensamblarse
un ribosoma nuevo en la siguiente regin codifica-
dora para empezar a traducir el siguiente cistrn. 1
En algunas molculas de RNAm bacteriano, I
traduccin entre cistrones adyacentes se vincula di-
rectamente porque los ribosomas logran el acceso 1
codn de iniciacin del segundo cistrn conforme
terminan la traduccin del primer cistrn, efecto
que implica que el espacio entre las dos regiones
codificadoras sea pequeo, lo cual dependera de la
alta densidad local de los ribosomas, o bien, la yux-
taposicin de los sitios de terminacin e iniciacir
podra permitir la omisin de algunos de los eventos
intercistrnicos usuales. Un ribosoma abarca fsica-
mente -30 bases del RNAm, de manera que puedr
contactar simultneamente a un codn de termina-
cin y al siguiente sitio de iniciacin si los separar
slo unas cuantas bases.
gfl Las subunidades pequeas
buscan sitios de iniciacin
en eL RNAm eucaritico
Conceptos principales
. Las subunidades ribosmicas 40S se unen al extremo
5
'
del RNAm y exploran al RNAm hasta que llegan a un
sitio de iniciacin.
Un sitio de iniciacin eucaritico est formado por una
secuencia de 10 nucletidos que incluye un codn AUG.
.
Las subunidades ribosmicas 60S se unen al complejo
en el sitio de iniciacin.
La iniciacin de la sntesis protenica en el citoplas-
ma eucaritico es similar al proceso observado m
las bacterias, sin embargo, difiere el orden de Im
eventos y el nmero de factores accesorios es mayod
En la iniciacin, algunas de las diferencias estn re j
lacionadas con una diferencia en la manera en que
las subunidades 30S bacterianas y 40S eucariticas
encuentran a sus sitios de unin en el RNAm pam
iniciar la sntesis protenica. En las eucariotas, la
subunidades pequeas primero reconocen el extre-
mo 5
'
del RNAm y posteriormente se trasladan al si-
tio de iniciacin, donde se unen a subunidades gran-
des. (En las procariotas, las subunidades pequeas se
unen directamente con el sitio de iniciacin.)
Virtualmente todos los RNAm eucariticos
son monocistrnicos, no obstante, cada RNAm es
sustancialmente ms largo de lo necesario para ce -
dificar slo a su protena. La longitud del RNAr
promedio del citoplasma eucaritico es de 1 000 a
2 000 bases, tiene un casquete metilado en el ex-
162 CAPTULO 8 Sntesis protenica
Bono 5' y porta un poli(A) de 100 a 200 bases en
: rxtremo 3'.
El lder 5' no traducido es relativamente cor-
normalmente de <100 bases. La longitud de la
-
in codificadora depende del tamao de la pro-
:-:-a. El remolque 3' no traducido a menudo es
fcastante largo, y en ocasiones llega a tener hasta
-
: DOO bases.
La primera caracterstica en ser reconocida du-
;/-:e la traduccin de un RNAm eucaritico es el
i ;:uete metilado que marca el extremo 5
'
. Los
msajeros cuyos casquetes han sido eliminados no
traducen eficientemente in vitro. La unin de las
;
unidades 40S con el RNAm requiere de nume-
sos factores de iniciacin, incluidas protenas que
::
tnocen la estructura del casquete.
la modificacin del extremo 5' ocurre en casi
:
?s los RNAm celulares o vricos y es esencial para
-
traduccin en el citoplasma eucaritico (aunque
tn los organelos). La nica excepcin a esta regla
t algunos RNAm vricos (como en los poliovirus),
los cuales carecen de casquete; slo estos RNAm
rtos excepcionales pueden ser traducidos in vitro
tasquetes. Utilizan una ruta alterna que elude
necesidad del casquete.
Algunos virus toman ventaja de esta diferencia.
infeccin por poliovirus inhibe la traduccin de
RNAm hospedadores al interferir con las pro-
rtas de unin con el casquete necesarias para la
dacin de los RNAm celulares, pero que son su-
jerluas para el RNAm carente de casquete de los
virus.
5e ha analizado el proceso de iniciacin consi-
:
tnda que el sitio de unin con el ribosoma siem-
[ est disponible, pero esta disponibilidad puede
r obstaculizada por la formacin de una estructura
ndaria. El reconocimiento del RNAm requiere
:
tumerosos factores adicionales; una parte im-
nante de su funcin es eliminar cualquier estruc-
E secundaria del RNAm (vase la Fig. 8.20).
En ocasiones, el codn de iniciacin AUG se en-
:
ttra entre las primeras 40 bases del extremo 5'
rSAm
, de manera que el casquete y el codn
- I estn en el intervalo de unin con el ribosoma.
.
obstante, en muchos RNAm el casquete y el co-
AUG estn ms lejos, en casos extremos, separa-
tista por 1 000 bases, pero el casquete contina
kndo necesario para que se forme un complejo es-
en el codn de iniciacin. Cmo puede valerse
-
1; soma de dos sitios tan distantes?
En la IGURA 8.18 se ilustra el modelo de "ras-
I que supone que la subunidad 40S reconoce
ero el casquete 5' y posteriormente "migra" a
HE) del RNAm. El rastreo desde el extremo 5'
t proceso lineal.
Cuando las subunidades 40S
pknan. la regin lder, pueden deshacer horquillas
de estructura secundaria con estabilidades de hasta
-
30 kcal, pero las horquillas de mayor estabilidad
obstaculizan o evitan la migracin.
La migracin cesa cuando la subunidad 40S se
encuentra con el codn de iniciacin AUG. En gene-
ral, aunque no siempre, el primer triplete AUG que
se encuentre ser el codn de iniciacin, aunque por
s mismo no es suficiente como para interrumpir la
migracin; se reconoce eficientemente como codn
de iniciacin slo cuando se encuentra en el con-
texto adecuado. Los determinantes ms importantes
del contexto son las bases que ocupan las posiciones
-
4 y +1. Un codn de iniciacin puede ser identifica-
do en la secuencia NNNPuNNAUGG. La presencia de
una purina (A o G) tres bases antes del codn AUG,
y la G que viene inmediatamente despus de l pue-
den influir en la eficiencia de la traduccin hasta
por 10 veces. Cuando la secuencia lder es larga, el
extremo 5
'
puede ser reconocido por subunidades
40S adicionales antes de que la primera haya aban-
donado el sitio de iniciacin, creando una cola de
subunidades que proceden a lo largo del lder, hacia
el sitio de iniciacin.
Probablemente sea verdad que el codn de ini-
ciacin es el primer triplete AUG en ser encontrado
en los RNAm ms eficientemente traducidos. Qu
sucede, sin embargo, cuando hay un triplete AUG
en la regin no traducida 5
'
? Hay dos mecanismos
de escape posibles para un ribosoma que empieza a
El RNAm tiene dos caractersticas que reconocen
los rlbosomas
..
.
*~
X>rv y> \ vGCCAcCAUG G
\
Casquete Sitio de unin /
metilado con el ribosoma
La subunidad pequea se une al casquete
metilado
."
./xxx x xy XGGCAcCAUGG
G
2 La subunidad pequea migra al sitio de unin
_
\
.
*
*
***
f /\ J x ./> ,GCcAcCAUGG
3 Si el lder es largo, las subunidades pueden
formar una cola
SC CGAJG
G(
FIGURA 8.18 Lus ribosomas eucariticos migran del extremo
5
'
del RNAm al sitio de unin con el ribosoma, el cual incluye
un codn de iniciacin AUG.
8
.8 Las subunidades pequeas buscan sitios de iniciacin en el RNAm eucaritico 163
rastrear desde el extremo 5
'
. El ms comn consiste
en que la exploracin presenta fugas, en otras pa-
labras, un ribosoma puede pasar por alto un codn
AUG que no sea de iniciacin debido a que no se
encuentra en el contexto correcto. En casos poco
frecuentes en que el ribosoma s reconoce al AUG,
puede iniciarse la traduccin, pero terminar antes
del codn de iniciacin apropiado, despus de lo
cual reanuda la exploracin.
Una gran parce de los eventos de iniciacin eu-
cariticos implican el rastreo desde el casquete 5
'
,
sin
embargo, hay un medio de iniciacin alterno utiliza-
do especialmente por ciertos RNA vricos, en el cual
una subunidad 40S se asocia directamente con un si-
tio interno denominado ERES (internal ribosome entry
site) (que elude por completo cualquier codn AUG
que se encuentre en la regin 5
'
no traducida). Hay
pocas secuencia homlogas entre los elementos de
los IRES conocidos; con base en su interaccin con la
subunidad 40S es posible distinguir tres tipos:
.
Un tipo de IRES incluye el codn de inicia-
cin AUG en su frontera de flujo ascenden-
te. La subunidad 40S se une directamente a
l utilizando un subconjunto de los mismos
factores necesarios para la iniciacin en los
extremos 5
'
.
.
Otro est localizado incluso a 100 nucle-
tidos del AUG en flujo ascendente, lo cual
implica una subunidad 40S que migre, tam-
bin en este caso quiz por un mecanismo
de rastreo.
.
Un tipo excepcional de IRES del virus de la
hepatitis C puede unirse a la subunidad 40S
de forma directa, sin necesidad de factores
de iniciacin. El orden de los eventos es di-
ferente del de la iniciacin de todas las eu-
cariticas. Despus de la unin 40S-RNAm,
se une un complejo que contiene factores
iniciadores y RNAt iniciador.
El empleo de IRES es especialmente importante
en la infeccin por picornavirus, en la cual se des-
cubri por primera vez, debido a que el virus inhibe
la sntesis protenica del hospedador, destruye las
estructuras de los casquetes e inhibe los factores de
iniciacin que los unen (vase la seccin 8.9, Las
eucariotas utilizan un complejo formado por nu-
merosos factores de iniciacin).
La unin se estabiliza en el sitio de iniciacin.
Cuando a la subunidad 40S se le une una subuni-
dad 60S, el ribosoma intacto se localiza en el sitio
identificado por el anlisis de proteccin. Una sub-
unidad 40S protege a una regin de hasta 60 bases;
cuando las subunidades 60S se unen al complejo,
la regin protegida se contrae a aproximadamente
la misma longitud de 30 a 40 bases que se observa
en las procariotas.
Las eucariotas utilizan
un complejo formado por
numerosos factores de iniciacin
Conceptos principales
.
Los factores de iniciacin son necesarios en todas
las etapas de sta, incluida la unin del RNAt
iniciador, la unin de las subunidades 40S al RNAm, el
desplazamiento a lo largo del RNAm y la unin de la
subunidad 60S.
.
El RNAt iniciador eucaritico es un Met-RNAt diferente
del utilizado en la elongacin, pero la metionina no
est formilada.
.
El eIF2 une al Met-RNAt iniciador con el GTP y el
complejo se une a la subunidad 40S antes de que se
asocie con el RNAm,
En las eucariotas, la iniciacin tiene las mismas ca-
ractersticas generales que en las bacterias, pues usan
un codn de iniciacin especfico y un RNAt inicia-
dor. Para la iniciacin, el citoplasma eucaritico uti-
liza el codn AUG como iniciador. El RNAt iniciador.
denominado RNAt
,
1*1*1
, es una especie distinta, pero
su metionina no se formila, as que entre los Met-
RNAt, la diferencia radica nicamente en la porcin
de RNAt, donde el Met-RNAt. es utilizado para l
iniciacin y el Met-RNAt
m
para la elongacin.
El RNAt " iniciador de las levaduras tiene por lo
menos dos caractersticas nicas, posee una estruc-
tura terciaria inusual y se modifica por fosforilacin
en la posicin 2
'
de la ribosa, en la base 64 (si se evita
esta modificacin, el iniciador puede ser utilizado en
la elongacin). As pues, el principio de una distin-
cin entre el Met-RNAt iniciador y el utilizado en el
proceso de elongacin se conserva en las eucariotas,
pero su base estructural es diferente a la de las bac-
terias (para comparar, vase la Fig. 8.13).
Las clulas eucariticas tienen ms factores ini-
ciadores que las bacterias, la lista actual incluye 12,
directa o indirectamente necesarios para la inicia'
cin, los cuales reciben su nombre de forma similar
a las bacterias, en ocasiones por analoga con los
factores bacterianos; se les asigna el prefijo "e" para
indicar su origen eucaritico. Participan en todas las
etapas del proceso, entre otras:
.
formacin de un complejo de iniciacin con
el extremo 5
'
del RNAm;
.
formacin de un complejo con el Met-RNAt:
.
unin del complejo RNAm-factor con el
complejo Met-RNAt-factor;
.
capacitacin del ribosoma para la explora-
cin del RNAm del extremo 5
'
al primer
codn AUG;
164
CAPTULO 8 Sntesis protenica
La iniciacin eucaritica utiliza varios complejos
Complejo 43S
elF2, elF3,
Met-RNAt,
Complejo de unin
al casquete + mRNA
5;F4A, B
, E y G
=1 complejo 43S
se une al extremo
5
'
del RNAm
El complejo 48S
39 forma en el codn
:e iniciacin elF2,
elF3, elFI, 1A,
5:F4A, B, F
4E 4A
/3
MA 8.19 Algunos factores de iniciacin se unen a la sub-
B ribosmica 40S para formar el complejo 43S, en tanto
se unen al RNAm. Cuando el complejo 43S se une al RNAm,
ea al codn de iniciacin y forma el complejo 48S.
.
deteccin de la unin del RNAt iniciador con
el codn AUG en el sitio de iniciacin, y
.
mediacin en la unin de la subunidad 60S,
En la FIGURA 8.19 se resumen las etapas de ini-
no, adems de que se muestran los factores de
nacin implicados en cada etapa: el eIF2 y el eIF3
men a la subunidad ribosmica 40S; el eIF4A, el
43 y el eIF4F, al RNAm, y el elFI y el elFlA, al
-
piejo subunidad ribosmica-RNAm.
En la FIGURA 8.20 se observa el grupo de factores
: se unen al extremo 5
'
del RNAm. El factor erF4F
m complejo protenico que contiene tres de los
res de iniciacin, aunque no est claro si antes
Kise al RNAm se ensambla como complejo, o
as subunidades individuales se agregan separa-
neme para formar el complejo en el RNAm. In-
c la subunidad de unin con el casquete eIF4E,
elicasa eIF4A y la subunidad de
"
andamiaje
"
K.
Despus que el eIF4E se une al casquete,
SF4A desenrolla cualquier estructura secunda-
re haya en las primeras 15 bases del RNAm.
rr.erga necesaria para desenrollar la estructura
wiene de la hidrlisis de ATP. El desenrollado
rrlor de la estructura a lo largo del RNAm lo
ta a cabo el eIF4A aunado a otro factor
,
el eIF4B.
-r.cin principal del eIF4G es ligar otros compo-
del complejo de iniciacin.
la subunidad eIF4E es un centro de regulacin
2 actividad se incrementa por fosforilacin,
la
Los factores de iniciacin se unen
con el extremo 5
'
del RNAm
El elF4F es un heterotrmero formado por
elF4G, protena de andamiaje
elF4E, une al casquete metilo 5
'
elF4A, helicasa que se desenrolla hacia la estructura 5
'
5
'
PABP
elF4G, une otros dos factores
elF4B, estimula a la helicasa elF4A
PABP, se une al poll(A) 3'
FIGURA 8.2 El heterotrmero eIF4F se une al extremo 5' del
RNAm y tambin a ms factores.
Un compiejo temario se une a la subunidad 40S
El elF-2 est
formado por -
subunidades
elF-2B
El elF2B genera la
J Tr, forma activa del elF2
.
GDP GTP *
1
Met,
Complejo ternario
FIGURA 8.: En la iniciacin eucaritica, el eIF-2 forma un
complejo terminal con el Met-RNAt. El complejo ternario se une
a las subunidades 40S libres, las cuales se unen al extremo 5
'
del RNAm. Despus en la reaccin, el GTP es hidrolizado cuando
el eIF-2 es liberado en forma de eIF2-GDP. El eIF-2B regenera
la forma activa.
cual es desencadenada por estmulos que acentan
la sntesis protenica y revertida por estmulos que la
reprimen. La subunidad eIF4F tiene una actividad
cinasa que fosforila al eIF4E. La disponibilidad del
eIF4E tambin es controlada por protenas que se
unen a l (llamadas 4E-BP1, -2 y -3) para impedir
que funcione en la iniciacin. La subunidad elF4G
tambin constituye una diana para la degradacin
durante la infeccin por picornavirus, como parte
de la destruccin de la capacidad para iniciar en las
estructuras de los casquetes 5
'
(vase la seccin 8.8,
Las subunidades pequeas buscan sitios de inicia-
cin en el RNAm eucaritico).
La presencia de poli(A) en el extremo 3' de un
RNAm estimula la formacin de un complejo de
8
.9 Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciacin
165
Complejo 43S = subunidad 40S + factores + RNAt
El elF3 mantiene en forma
libre a las subunidades 40S
El elF2 une al Met-RNAt
con la subunidad 40S
El elF2 es una GTPasa
El elF2B es el factor
de intercambio
Met
43S
2 GDP i 2 GTP
FIGURA 8.22 Los factores de iniciacin unen al Met-RNAt
iniciador con la subunidad 40S para formar un complejo 43S.
Posteriormente, en la reaccin, el GTP es hidrolizado cuado el
eIF-2 es liberado en forma de eIF2-GDP. El eIF-2B regenera la
forma activa.
El complejo 43S se une al complejo RNAm-factor
Interacciones posibles:
el elF4G se une al elF3,
el RNAm une al elF4G,
al elF3 y a la subunidad 40S
PABP
FIGURA 8.23 Las interacciones que involucran a los factores
de iniciacin adquieren importancia cuando el RNAm se une
al complejo 43S.
La subunidad 40S explora al RNAm para
dar con el codn AUG
El elF1 yelelFIA
activan la exploracin
El elF5 induce la hidrlisis
de GTP por el elF2
El elF2 y el elF3
son liberados
El elF5B media la unin
de la subunidad 60S
Met
2j 1A Complejo 48S
Met
FIGURA 8.24 El elFl y el elFlA ayudan al complejo de inicia-
cin 43S a explorar el RNAm hasta que llega a un codn AUG.
El eIF2 hidroliza a su GTP para permitir su liberacin junto con
el eIF3. El eIF5B media la unin 50S-40S.
iniciacin en el extremo 5', para lo cual es necesaria
la protena de unin al poli(A) (Pablp en las leva-
duras). La Pablp se une a la protena de andamiaje
eIF4G, fenmeno que implica que el RNAm se or-
ganizar de forma circular siempre y cuando el elFG
est unido con los extremos 3
'
y 5' sujetos a este
complejo (vase la Fig. 8.20). La importancia de la
formacin de este lazo cerrado no es obvia, aunque
podra tener muchos efectos, por ejemplo:
. estimular la iniciacin de la traduccin;
.
promover la reiniciacin de los ribosomas.
de manera que cuando terminan en el ex-|
tremo 3', las subunidades liberadas ya se
encuentran cerca del extremo 5
'
.
.
estabilizar el RNAm contra la degradacin, y
.
permitir que los factores que se unen al extre-
mo 3
'
regulen la iniciacin de la traduccin.
La subunidad eIF2 es el factor clave en la unin
del Met-RNAt; se trata de una protena monom-
rica de unin con el GTP tpica, la cual se activa
cuando se une al GTP y se desactiva al unirse coa
el difosfato de guanosina (GDP; guanine diphospha-
te). En la FIGURA 8.21 se muestra que el complejo
eIF2-GTP se une al Met-RNAt, producto que suele]
denominarse complejo ternario (debido a sus tres
componentes, eIF2, GTP y Met-RNAt).
En la FIGURA 8.22 se observa que el complejo ter-
nario ubica al Met-RNAt. sobre la subunidad 40S, la
cual genera el complejo de iniciacin 43S. La reac-
cin es independiente de la presencia de RNAm. Da
hecho, el Met-RNAt. iniciador debe estar presente
para que la subunidad 40S se una al RNAm. Uno
de los factores de este complejo es el eIF3, necesarii*
para mantener a las subunidades 40S en estado de
disociacin. El eIF3 es un factor muy grande, for-
mado por 8 a 10 subunidades.
El siguiente paso consiste en la unin del com-
plejo 43S con el extremo 5
'
del RNAm. En la FIGU-
RA 8.23 se muestra que las interacciones implicadl
en esta etapa no estn completamente definidas,
.
pero probablemente involucren a eIF4 y eIF3, as;
como al RNAm y a la subunidad 40S. La subunidad
eIF4G se une al eIF3 para permitir que la subuni-
dad ribosmica 40S se una al eIF4F, y por lo tanto,
sea reclutada en el complejo. En efecto, la funcin
del eIF4F es colocar al eIF4G de manera que pueda
atraer a la subunidad ribosmica pequea.
Cuando la subunidad pequea se ha unido al
RNAm, migra (habitualmente) al primer codn AUG,
evento que requiere de gasto de energa en forma de
ATP, con ayuda de los factores elFl y elFlA. En la
FIGURA 8.24 se observa que la sub-unidad pequea se
detiene cuando llega al sitio de iniciacin, formando
un complejo 48S.
La unin de las subunidades 60S con el comple-
jo de iniciacin no ocurre hasta que el eIF2 y el eIF3
han sido liberados de dicho complejo por mediacin
del eIF5, de modo que el eIF2 hidroliza a su GTP.
La reaccin ocurre en la subunidad ribosmica pe-
quea e implica que el RNAt iniciador est apareado
con el codn de iniciacin AUG. Todos los factores
restantes probablemente sean liberados cuando se
forma el ribosoma completo 80S.
Por ltimo, el factor eIF5B permite que la suba
unidad 60S se una con el complejo y forme un riJ
bosoma intacto, listo para iniciar la elongacin. La
166 CAPTULO 8 Sntesis proteinica
ubunidad eIF5B tiene una secuencia similar a la
el factor procaritico IF2, el cual tiene una funcin
milar en la hidrlisis del GTP (adems de participar
'
la unin del RNAt iniciador).
Una vez que los factores han sido liberados, pue-
en asociarse con el RNAt iniciador y las subunidades
rosmicas en otro ciclo de iniciacin. La subunidad
;
?2 ha hidxolizado a su GTP, y como resultado,
debe
r enerarse la forma activa
, lo cual se logra por me-
-:
de otro factor, el eIF2B, que desplaza al GDP para
jK pueda ser remplazado por un GTP.
La subunidad eIF2 constituye un objetivo para
a regulacin. Muchas cinasas reguladoras actan
r; la subunidad a del eIF2. La fosforilacin evita
_e el eIF2B regenere la forma activa, evento que
:
~
ita la accin del eIF2B a un ciclo de iniciacin y,
r lo tanto, inhibe la sntesis protenica.
EL factor de eLongacin
Tu carga aL aminoaciL-RNAt
en el sitio A
Zonceptos principales
.
Et EF-Tu es una protena G monomrica cuya forma
activa (unida al GTP) se une al aminoacil-RNAt.
.
El complejo EF-Tu-GTP-aminoacil-RNAt se une al sitio A
ribosmico.
-i 3 vez formado el ribosoma completo en el codn
iniciacin
, la etapa est lista para un ciclo en el
-: el aminoacil-RNAt entra al sitio A de un ribo-
ma cuyo sitio P est ocupado por peptidil-RNAt.
-i
-quier aminoacil-RNAt, excepto el iniciador, in-
- ra al sitio A, entrada mediada por un factor de
riongacin (EF-Tu en las bacterias). El proceso es
-vilar en las eucariotas; el EF-Tu es una protena
-
y conservada en las bacterias y en las mitocon-
-
y es homlogo a su contraparte eucaritica.
Igual que su contraparte en la iniciacin (IF-2),
r
-Tu se asocia con el ribosoma slo en el proceso
-
mtrada del aminoacil-RNAt, y una vez en su lu-
is abandona al ribosoma para funcionar de nuevo
r: otro aminoacil-RNAt
, de manera que exhibe
:
::acin y disociacin cclica del ribosoma, una
- - = cterstica distintiva de los factores accesorios
.
la ruta de entrada del aminoacil-RNAt al sitio
i se ilustra en la ' .El EF-Tu porta una
.
f -iina. El factor es una protena G monomri-
:
uva actividad es controlada por el estado de la
- -
:
-
"
ina:
.
En presencia de GTP, el factor se encuentra
en su estado activo.
.
Cuando el GTP es hidrolizado a GDP, el fac-
tor se desactiva.
El EF-Tu se recicla entre la forma unida a GTP y la forma unida a GDP
c
Ts
Tu-GTP
GTP .../
Tu-Ts
Complejo
ternario
Tu-GDP
<4
5
El aa-RNAt entra al sitio El extremo COA se desplaza
A de la subunidad 30S al nterior del sitio A de la
subunidad 503
"
1 '
El EF-Tu-GTP coloca al aminoacil-RNAt en el ribosoma y
posteriormente es liberado en forma de EF-Tu-GOP. El EF-Ts es necesario
para mediar el remplazo de GDP por GTP. La reaccin consume GTP y
libera GDP. El nico aminoacil-RNAt que no puede ser reconocido por
el EF-TU-GTP es el fMet-RNAt
f, cuya incapacidad para unirse evita que
responda a los codones internos AUG o GUG.
.
La actividad se restaura cuando el GDP es
remplazado por GTP.
El complejo binario formado por EF-Tu-GTP se
une al aminoacil-RNAt para formar un complejo
ternario constituido por aminoacil-RNAt-EF-Tu-
GTP, el cual se une slo con el sitio A de los ri-
bosomas cuyos sitios P ya estn ocupados por un
peptidil-RNAt. Esta es reaccin es crtica para asegu-
rar que el aminoacil-RNAt y el peptidil-RNAt estn
correctamente posicionados para la formacin del
enlace peptdico.
El aminoacil-RNAt es cargado en el sitio A en
dos etapas; primero, el extremo anticodn se une
con el sitio A de la subunidad 30S, y posteriormen-
te, el reconocimiento codn-anticodn desencade-
na un cambio en la conformacin del ribosoma, fe-
nmeno que estabiliza la unin del RNAt y provoca
que el EF-Tu hidrolice a su GTP. El extremo CCA del
RNAt ahora entra al sitio A de la subunidad 5OS y es
liberado el complejo binario EF-Tu-GDP. Esta forma
de EF-Tu est desactivada y no se une al aminoacil-
RNAt de forma efectiva.
Otro factor, el EF-Ts, media la regeneracin de la
forma utilizada, EF-Tu-GDP a EF-Tu-GTP. Primero
,
el
EF-Ts desplaza al GDP del EF-Tu para formar, as,
el factor combinado EF-Tu-EF-Ts, que a su vez ser
desplazado por el GTP, para reconstituir el EF-Tu-
GTP. El complejo binario activo se une al aminoacil-
RNAt y el EF-Ts liberado puede ser redclado.
8.10 El factor de elongacin Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A
167
Hay -70 000 molculas de EF-Tu por bacteria
(-5% del total de las protenas de la bacteria),
cifra
que se aproxima al nmero de molculas de ami-
noacil-RNAt. Esto implica que la mayor parte de los
aminoacil-RNAt tiendan a presentarse en complejos
ternarios. Hay slo -10 000 molculas de EF-Ts por
clula (ms o menos el mismo nmero de riboso-
mas). La cintica de la interaccin entre EF-Tu y
EF-Ts sugiere que el complejo EF-Tu-EF-Ts existe
slo transitoriamente, de manera que el EF-Tu se
convierte muy rpidamente en la forma unida a
GTP y despus en un complejo ternario.
La funcin del GTP en el complejo ternario ha
sido estudiada sustituyndolo con un anlogo que
no pueda ser hidrolizado. El compuesto GMP-PCP
tiene un puente metilnico en vez del oxgeno que
se liga a los fosfatos P y y del GTP. En presencia
de GMP-PCP puede formarse un complejo ternario
que une el aminoacil-RNAt con el ribosoma, pero
no puede formarse el enlace peptdico,
de manera
que se necesita GTP para que el aminoacil-RNAt
se una al sitio A; la hidrlisis no es necesaria hasta
despus.
La kirromicina es un antibitico que inhibe
la funcin del EF-Tu. Cuando este ltimo se une
a la kirromicina, sigue siendo susceptible de unir
el aminoacil-RNAt con e, pero el complejo EF-Tu-
GDP no puede liberarse del cromosoma, su presen-
cia continua evita la formacin del enlace peptdico
entre el peptidil-RNAt y el aminoacil-RNAt, de tal
forma que el ribosoma se queda "atascado" en el
RNAm, frenando la sntesis protenica.
Este efecto de la kirromicina demuestra que la
inhibicin de uno de los pasos de la sntesis proteni-
ca bloquea el siguiente porque la presencia continua
del EF-Tu impide que el extremo aminoacilo del
El polipptido naciente es transferido al aa
Cadena peptdica. ,ch o H
HN Y2Hr
-
llutiiH
1
R
Cadena peptdica
p o |
H
FIGURA 8.26 La formacin del enlace peptdico se debe a la
reaccin que ocurre entre el polipptido del peptidil-RNAt en el
sitio P y el aminocido del aminoacil-RNAt en el sitio A.
aminoacil-RNAt entre al sitio A de la subunidad 50S
(vase la Fig. 8.31), de modo que para que el ribo-
soma lleve a cabo la formacin del enlace peptdico,
es necesaria la liberacin del complejo EF-Tu-GDP.
El mismo principio se observa en otras etapas de la
sntesis protenica: una reaccin debe terminar de
forma adecuada antes de que pueda tener lugar la
siguiente.
La interaccin con EF-Tu tambin desempea
una funcin en el control de calidad. Los aminoacil-
RNAt son introducidos en el sitio A sin saber si sus
anticodones correspondern con el codn. La hidr-
lisis del EF-Tu-GTP es relativamente lenta; el tiempo
que necesita un aminoacil-RNAt para disociarse del
sitio A es mayor del necesario, por lo tanto, la ma-
yor parte de las especies incorrectas son eliminadas
en esta etapa. La liberacin del EF-Tu-GDP despus
de la hidrlisis tambin es lenta, as que cualquier
aminoacil-RNAt incorrecto, sobreviviente, puede
disociarse en esta etapa. El principio bsico es que
las reacciones que involucran al EF-Tu ocurren con
la lentitud suficiente como para permitir que los
RNAt incorrectos se disocien antes de que queden
atrapados en la sntesis protenica.
En las eucariotas, el factor elF es el responsable
de acarrear el aminoacil-RNAt al ribosoma, tambin
en una reaccin que implica la divisin de un enlace
de alta energa del GTP, que igual que su homlogo
procaritico (EF-Tu), es una protena abundante. Des-
pus de la hidrlisis del GTP, la forma activa es regene-
rada por el factor eEFlpy, contraparte del EF-Ts.
nn La cadena poLipeptdca se
transfiere aL aminoacil-RNAt
Conceptos principales
.
La subunidad SOS tiene actividad peptidii transferasa.
.
La cadena polipeptdica naciente se transfiere del
peptidil-RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A.
.
La sntesis de enlaces peptdicos genera RNAt
desacilado en el sitio P y peptidil-RNAt en el sitio A.
El ribosoma se mantiene en posicin mientras la ca-
dena polipeptdica se alarga al transferir el polipptido
adherido al RNAt en el sitio P al aminoacil-RNAt de
sitio A. La reaccin se ilustra en la IGURA 8.26. La
actividad responsable de la sntesis del enlace pep-
tdico se llama peptidii transferasa.
La naturaleza de la reaccin de transferencia es
revelada por la capacidad del antibitico puromi-
cina, asemeja a un aminocido adherido a la ade-
nosina terminal del RNAt, para inhibir la sntesis
protenica. En la FIGURA 8.2: se muestra que dicho
antibitico tiene un N en vez del O que une un
168 CAPTULO 8 Sntesis protenica
- nocido al RNAt, y es tratado por el ribosoma
no si fuera un aminoacil-RNAt entrante, despus
lo cual el polipptido adherido al peptidil-RNAt
transferido al grupo NH
2
de la puromicina.
La porcin de puromicina no est anclada al
IA del ribosoma, por lo que de ste es liberado el
iucto polipeptidil-puromicina. Esta terminacin
matura de la sntesis protenica es la causa de la
ion letal del antibitico.
La peptidil transferasa es una funcin de la sub-
-:.ad ribosmica grande (SOS o 60S). La reaccin
desencadena cuando el EF-Tu libera el extremo
linoacilo de su RNAt, que despus se traslada a
sitio cercano al extremo del peptidil-RNAt cuya
vidad peptidil transferasa asegura esencialmente
:
ansferencia rpida de la cadena peptdica al ami-
Bl-RNAt. El RNAr y las protenas de la subuni-
:
50S son necesarias para dicha actividad, pero la
;
!isis es una propiedad del RNA ribosmico de la
runidad 505 (vase la seccin 8.19, El RNAr 23S
ne actividad peptidil transferasa).
La puromicina es semejante al aminoacil-RNAf
NH,
tRNA
/
HC
\
N
'
o
11
Base
i\ Azcar /
?-?
O OH
0=C-CH-R
NH2
Aminocido
-
N
N
CH
aminoacil-RNAt
CH3 CH
3
\
II
N
CH
CH2OH
h\
c-c
I I
Nh OH
0
=C-CH2 - OH
NH2
Puromicina
OCH,
La puromicina imita al aminoacil-RNAt porque
ejante a un aminocido aromtico ligado a una porcin
La transLocacin mueve
al ribosoma
i. ::--base.
Conceptos principales
La translocacin ribosmica desplaza al RNAm tres
bases a lo largo del ribosoma.
La translocacin lleva al RNAt desacilado al interior del
sitio E y al peptidil-RNAt al interior del sitio P, adems
de vaciar el sitio A.
El modelo del estado hbrido propone que la
translocacin ocurre en dos etapas, en Las cuales la
subunidad SOS se mueve respecto de la subunidad 305,
y posteriormente sta se desplaza a lo largo del RNAm .
para restaurar la conformacin original.
El ciclo de adicin de aminocidos a la cadena po-
lipeptdica creciente culmina con la translocacin,
cuando el ribosoma avanza tres nucletidos a lo largo
del RNAm. En la :;URA 8.28 se observa que la trans-
locacin expele al RNAt descargado del sitio P para
que pueda entrar el nuevo peptidil-RNAt, de modo
que el ribosoma tiene un sitio A vaco listo para la
entrada del aminoacil-RNAt correspondiente al si-
guiente codn. Como se muestra en la figura, en las
bacterias, el RNAt descargado es transferido del sitio
P al E (del cual es expelido hacia el citoplasma). En
las eucariotas se expulsa directamente al citosol. Los
sitios A y P se extienden a ambos lados, hasta abarcar
la subunidad grande y la pequea; el sitio E (en las
bacterias) se localiza principalmente en la subunidad
505, pero tiene algunos contactos en la 305.
Casi todas las ideas en torno a la translocacin
se guan por el modelo de estado hbrido, el cual
propone que tiene dos etapas. En la FIGURA 8.29 se
muestra que primero hay un cambio de la subu-
nidad 505 respecto de la 305, seguido de un se-
gundo cambio que tiene lugar cuando la subunidad
se mueve a lo largo del RNAm para restaurar la
conformacin original. La base de este modelo fue
la observacin de que el patrn de contactos del
RNAt con el ribosoma (medidos por la impresin
qumica de las huellas) cambia en dos etapas. Cuan-
do se agrega puromicina a un ribosoma que tiene
un RNAt aminoacilado en el sitio P, los contactos del
RNAt en la subunidad 505 cambian del sitio
P al sitio E, pero los contactos con la subunidad 305
no cambian, lo cual sugiere que la subunidad 505
se ha desplazado a un estado de postransferencia, si
bien la subunidad 305 no ha cambiado.
La interpretacin de estos resultados sugiere
que los extremos aminoacilo de los RNAt (loca-
lizados en la subunidad 505) se mueven primero
a sitios nuevos (mientras que los extremos anti-
codn permanecen unidos a sus anticodones en
8.
1?. La translocacin mueve al ribosoma 169
El RNAt se desplaza a travs de tres
sitios ribosomicos
Sitio A
Sitio P
La translocacin ocurre en dos etapas
Pretranslocacin:
El peptidil-RNAt se encuentra en el sitio P;
el aminoacil-RNAt entra al sitio A
Postranslocacin:
El RNAt desacilado se mueve al sitio E;
el peptidil-RNAt se desplaza al sitio P
Wvvw wv
v
FIGURA 8.28 Un ribosoma bacteriano tiene tres sitios de
unin con el RNAt. EL aminoacil-RNAt entra al sitio A de un
ribosoma que tiene peptidil-RNAt en el sitio P. La sntesis del
enlace peptdico desacila al RNAt del sitio P y genera peptidil-
RNAt en el sitio A. La translocacin mueve al RNAt desacilado
al interior del sitio E y desplaza al peptidil-RNAt al interior
del sitio P.
la subunidad 30S). En esta etapa, los RNAt estn
unidos efectivamente a sitios hbridos, formados
por los sitios 50SE/30S P y 50SP/30S A. Despus,
el movimiento se extiende a las subunidades 30S,
de manera que la regin de apareamiento anti-
codn-codn se encuentra en el sitio correcto. El
medio ms probable para crear el estado hbrido es
el movimiento de una subunidad ribosmica res-
pecto de la otra, de manera que la translocacin
efectivamente implica dos etapas y la restauracin
de la estructura normal del ribosoma sucede du-
rante la segunda.
El ribosoma enfrenta un dilema interesante en
la translocacin, pues tiene que romper muchos de
sus contactos con el RNAt para permitir el movi-
miento, pero al mismo tiempo debe mantener el
v/X/X/V&v/v'
La subunidad SOS
se desplaza respecto
de la subunidad 30S
i
El RNAt descargado
sale a travs del sitio E
aa-RNAt
\
entrante
\/w
W\/\/
Los modelos de translocacin constan de dos
etapas. Primero, en la formacin del enlace peptdico, el ex-
tremo aminoacilo del RNAt localizado en el sitio A es reubicado
en el P. En la segunda etapa, el extremo anticodn del RNAt
se traslada al sitio P.
apareamiento entre el RNAt y el anticodn (rom-
piendo el apareamiento del RNAt desacilado en el
momento preciso). Una posibilidad es que el ribo-
soma cambie entre conformaciones alternas y dis-
cretas. El cambio puede consistir en variaciones en
el apareamiento de bases del RNAr. La precisin de
la traduccin depende de ciertas mutaciones que in-
fluyen en el apareamiento alterno de las bases de las
secuencias. La interpretacin ms probable es que
el efecto es mediado por la estrechez de la unin de
las conformaciones alternas con el RNAt.
Los factores de eLongacin
se unen alternativamente
aL ribosoma
Conceptos principales
La translocacin requiere del EF-G, cuya estructura es
semejante a la del complejo aminoacil-RNAt-EF-Tu-GTP.
La unin de EF-Tu y de EF-G al ribosoma es
mutuamente exclusiva.
La translocacin requiere de la hidrlisis de GTP, la cual
desencadena un cambio en la estructura del ribosoma.
170 CAPTULO 8 Sntesis protenica
translocacin requiere de GTP y de otro factor
elongacin, denominado EF-G, el cual es uno de
tactores constituyentes mayoritarios de la clula,
?s hay ~1 copia por ribosoma (20 000 molculas
clula).
Los ribosomas no pueden unirse al EF-Tu y al
-
G simultneamente, de modo que la sntesis
tenica sigue el ciclo ilustrado en la Figura 8.31,
el cual los factores se unen al ribosoma y se libe-
de l alternativamente, por lo tanto, el complejo
.
Tu-GDP debe ser liberado antes de que el EF-G
?da unirse; despus, el EF-G debe ser liberado
es de que pueda unirse al complejo aminoacil-
. At-EF-Tu-GTP.
La capacidad que tiene cada factor de elonga-
n para excluir a otro se basa en un efecto alos-
ko sobre la conformacin total del ribosoma o
-a competencia directa por sitios de unin su-
ipuestos? En la GURA 8.30 se observa una simi-
nd extraordinaria entre las estructuras del com-
jo ternario de aminoacil-RNAt-EF-Tu-GDP y el
-
G. La estructura de este ltimo es similar a la
ructura global del EF-Tu unido al tallo aceptor
aminocido del aminoacil-RNAt, de donde la
ijetura inmediata de que completan el mismo
o de unin (presumiblemente en las cercanas
sitio A). La necesidad de cada factor de ser libe-
antes de que el otro pueda unirse, garantiza
e los eventos de la sntesis protenica proceden
manera ordenada.
Ambos factores de elongacin son protenas
?nomricas de unin al GTP las que se activan
.as a ste, pero estn inactivas cuando se unen
GDP. Para la unin al ribosoma se necesita la for-
i trifosfatada para asegurar que cada factor tenga
.
rso al ribosoma slo en compaa del GTP que
-
:
esita para cumplir con su funcin,
El EF-G se une al ribosoma para promover la
inslocacin y es liberado despus del movimiento
ribosoma. El EF-G an puede unirse al ribosoma
t. GMP-PCP es sustituido por GTP; por lo tanto,
i. la unin es necesaria la presencia de guanina,
-
que su hidrlisis no es absolutamente esencial
3 la translocacin (si bien la translocacin es mu-
"
ms lenta sin la hidrlisis del GTP). La hidrlisis
I GTP es necesaria para liberar al EF-G.
la necesidad de la liberacin del EF-G se des-
:
ri por los efectos del cido fusdico, antibitico
rroideo que
"
atasca
"
al ribosoma en ese estado
sterior a la translocacin (vase la FIGURA 8.31).
presencia de cido fusdico ocurre un ciclo de
r.slocacin: el EF-G se une al ribosoma, el GTP es
troizado y el ribosoma se mueve tres nucletidos.
. embargo, el cido fusdico estabiliza el complejo
osoma-EF-G-GDP, de manera que el EF-G y el
? permanecen en el ribosoma en lugar de ser
La estructura del EF-G es semejante
a la del aminoacil-RNAt nf iniiii;--
Aminoac-RNAt-EF-Tu-GTP
La estructura del complejo ternario aminoadl-
RNAt-EF-Tu-GTP (izquierda) es semejante a la del EF-G (dere-
cha). La estructura conservada de los dominios del EF-Tu y del
EF-G se encuentran en color rojo y verde; el RNAt y el dominio
del EF-G semejante a l es prpura. Imagen cortesa de Poui
Nissen, University of Aarhua, Denmark.
Los factores EF tienen interacciones alternantes
Unin del
aminoacil-RNAt
EF-Tu-GTP-
aminoacil-RNAt
Hidrlisis de GTP
EF-Tu-GDP
La kirromicina bloquea
la liberacin
Sntesis del enlace
pMtfdico
Translocacin
Hidrlisis de GTP
EF-G/GTP EF-G + GDP
A El cido fusdico
t
" "
.
bloquea la *. .
liberacin '
La unin de los factores EF-Tu y EF-G se alterna
conforme los ribosomas aceptan nuevos aminoacil-RNAt, for-
man los enlaces peptdicos y se transfieren a otra posicin.
8
.13 Los factores de elongacin se unen alternativamente al ribosoma
171
liberados, de modo que este ltimo no puede unirse
al aminoadl-RNAt y no se agregan ms aminoci-
dos a la cadena.
La translocacion es una propiedad intrnseca
del ribosoma que requiere de un cambio mayor en
la estructura (vase la seccin 8.17, Los ribosomas
tienen numerosos centros activos), sin embargo, es
activada por el EF-G aunado a la hidrlisis del GTP,
que ocurre antes de la translocacin y acelera el
movimiento del ribosoma. El mecanismo ms pro-
bable consiste en que la hidrlisis de GTP provoca
un cambio en la estructura del EF-G, el cual a su
vez fuerza un cambio en la estructura del ribosoma.
En la translocacin tiene lugar una reorientacin
del EF-G que, antes de sta, se encuentra unido
mediante las dos subunidades ribosmicas. La ma-
yor parte de sus contactos con la subunidad 30S
depende de una regin llamada dominio 4, que se
inserta en el sitio A y que puede ser responsable de
desplazar al RNAt. Despus de la translocacin, el
dominio 4 estar, por el contrario, orientado hacia
la subunidad 505.
La contraparte eucaritica del EF-G es la pro-
tena eEF2, la cual funciona de forma similar a una
translocasa dependiente de la hidrlisis de GTP cuya
accin tambin es inhibida por el cido fusdico. Es
posible aislar un complejo estable formado por eEF2
y GTP, en tanto que el complejo puede unirse a los
ribosomas con la consiguiente hidrlisis de su GTP.
Una reaccin nica del eEF2 es su susceptibi-
lidad a la toxina diftrica, que utiliza dinucleti-
do de nicotinamida y adenina (NAD, nicotinamide
admine dinucleotide) como cofactor para transferir
una porcin de ribosil-adenosina difosfato (ADPR,
adenosine diphosphate ribosyl) al eEF2. El conjugado
ADPR-eEF2 est inactivo en la sntesis protenica.
El sustrato al que se une dicho conjugado es un
aminocido inusual que se produce al modificar una
histidina; es comn al eEF2 de muchas especies.
La ribosilacin del ADP provoca los efectos le-
tales de la toxina diftrica. La reaccin es extrema-
damente efectiva, pues una sola molcula puede
modificar suficientes molculas de eEF2 como para
matar una clula.
La sntesis protenica termina
con tres codones
Conceptos principales
Los codones UAA (ocre), UAG (mbar) y UGA terminan
la sntesis protenica.
En las bacterias se utilizan muy a menucio con
frecuencias relativas UAA>UGA>UAG.
Slo 61 tripletes son asignados a aminocidos, k
otros tres son codones de terminacin (o codc
nes de parada) con los que concluye la sntesi
protenica cuyos nombres informales provienen de
la historia de su descubrimiento. El triplete UAG es
llamado codn mbar, el UAA es el codn ocre y i
secuencia UGA suele denominarse codn palo.
En un principio, las caractersticas de estos tr -
pletes se demostraron mediante un anlisis gentk
por el que se distinguieron dos tipos de mutacione
puntuales:
.
La mutacin puntual que modifica a un c
dn de manera que represente a un arJ
nocido diferente se denomina mutacin de
cambio de sentido. Un aminocido rem-
plaza a otro en la protena, y el efecto en ;
funcin de la protena depende del sitio d
la mutacin y de la naturaleza del rempla:
del aminocido.
.
Cuando una mutacin puntual crea uno de
los tres codones de terminacin, da lugar I
una terminacin prematura de la snte?
protenica del codn mutante y en la clM
mutante slo se produce la primera parte d
la protena. Este fenmeno tiende a suprim -
a funcin protenica (dependiendo, por -
puesto, de qu tan lejos en la protena se er .
cuentre el sitio mutante). Un cambio de es:.
tipo se denomina mutacin sin sentido.
(En ocasiones, el trmino codn sin sentido se
utiliza para describir a los tripletes de terminacir
La expresin "sin sentido" es errnea, dado que los
codones s tienen significado, aunque perjudicial e"
un gen mutante. Un trmino ms adecuado es
"
ce -
dn de terminacin").
En los genes secuenciados, uno de los codoney
de terminacin se ubica inmediatamente despu;
del codn que representa al aminocido termina.
C de la secuencia de tipo silvestre. Las mutacione;
sin sentido muestran que cualquiera de los tres cc-
dones basta para terminar la sntesis protenica en
un gen. Las secuencias de los tripletes UAG, UAA I
UGA son, por lo tanto, necesarias y suficientes par
terminar la sntesis protenica si ocurren de manera
natural al final de un gen o son creadas por muta-
cin en una secuencia codificadora.
En los genes bacterianos, el triplete UAA es
codn de terminacin ms comnmente utilizado.
La secuencia UGA se utiliza con mayor frecuencia
que la UAG, aunque parece haber ms errores en
la lectura de la UGA. (Un error al leer un codn de
terminacin, cuando el aminoacil-RNAt responde a
l equivocadamente, resulta en la continuacin de
la sntesis protenica hasta que se encuentra otre
codn de terminacin.)
172 CAPTULO 8 Sntesis protenica
Los codones de terminacin
son reconocidos por factores
protenicos
nceptos principales
.
Los codones de terminacin son reconocidos por
factores de liberacin de protenas, no por molculas
de aminoacil-RNAt.
.
Las estructuras de los factores de liberacin clase 1 son
semejantes a las del aminoacil-RNAt-EF-Tu y del EF-G.
.
Los factores de liberacin clase 1 responden a codones
de terminacin especficos e hidrolizan la ligadura
colipptido-RNAt.
"
Los factores de liberacin clase 1 son asistidos por los
actores de liberacin clase 2 que dependen del GTP.
.
El mecanismo es similar en las bacterias (que tienen
dos tipos de factores de liberacin clase 1) y en las
eucariotas (que tienen slo un factor de liberacin
:
lase 1).
fin de la traduccin implica dos etapas. La reaccin
itrminadn tiene que ver con la liberacin de la
;;
cna protenica del ltimo RNAt, en tanto que
faccin de posterminacin implica la liberacin del
-
At y del RNAm y la disociacin del ribosoma.
Ninguno de los codones de terminacin es re-
risntando por un RNAt,
uncionan de manera
- diferente a los otros codones y son reconocidos
rztamente por factores protenicos. (La reaccin
depende del reconocimiento codn-anticodn,
mlo tanto, parece no haber una razn en particu-
;
ue justifique que su funcin requiera de una se-
: .da de tres nucletidos. Presumiblemente esto
r
:
a la evolucin del cdigo gentico.)
los codones de terminacin son reconocidos
os factores de liberacin (RF, relase factors)
-i>r 1. En coli
, por ejemplo, dos factores de libe-
in clase 1 son especficos para secuencias dife-
:;s. El RFl reconoce a los codones UAA y UAG,
inte que el RF2 identifica a las secuencias UGA
. AA. Los factores actan en el sitio A ribosmico
:
:uieren de polipeptidil-RNAt en el sitio P. Los
'
-i:n presentes en niveles mucho ms bajos que
r.ores de iniciacin y de elongacin; hay -600
Bculas de cada uno por clula, que equivale a un
por cada 10 ribosomas. Quiz en algn momen-
i ba slo un factor de liberacin que reconoca
;: 5 los codones de terminacin, el cual evolu-
posteriormente para formar dos factores con
ncidades para codones especficos. En las cu-
as hay slo un factor de liberacin clase 1, de-
r
.r
.ado eRF. La eficiencia con la cual los factores
cerianos reconocen a sus codones diana depende
Bhsbases que se encuentran en el lado 3'.
Los factores de liberacin clase 1 son asistidos por
los factores de liberacin clase 2, que no son especfi-
cos de ningn codn. Los factores clase 2 son prote-
nas de unin al GTP. En E. coli, la funcin del factor
clase 2 es liberar al factor clase 1 del ribosoma.
Aunque el mecanismo de terminacin general
es similar en las procariotas y las eucariotas, las in-
teracciones entre los factores clase 1 y clase 2 pre-
sentan algunas diferencias.
Los factores de clase 1, RFl y RF2, identifican
a los codones de terminacin y activan el riboso-
ma para hidrolizar al peptidil-RNAt. La divisin del
polipptido y el RNAt tiene lugar mediante una re-
accin anloga a la transferencia usual del grupo
peptidil, excepto que el aceptor es EL,O en vez de
aminoacil-RNAt (vase la Fig. 8.34)
En este punto, el RFl o el RF2 es liberado del
ribosoma por el factor clase 2 RF3, que est relacio-
nado con el EF-G. El RF3-GDP se une al ribosoma
antes de que ocurra la reaccin de terminacin y
el GDP es remplazado por GTP, lo cual faculta al
RF3 para contactar al centro GTPasa del ribosoma,
donde provoca la liberacin de los RFl /2 cuando se
termina la cadena polipeptdica,
El RF3 se asemeja a los dominios de unin del
EF-Tu y del EF-G con el GTP, en tanto que el RFl y
el RF2 son similares al dominio terminal C del EF-G,
parecido al RNAt. Esto sugiere que los factores de
liberacin utilizan el mismo sitio empleado por los
factores de elongacin. En la 12 se ilustra la
EF-Tu
RNAt
EF-G
Sitio P
Si! 0
4
Sitio E
RF3
RF1/2
RRF
El mimetismo molecular permite que el complejo
factor de elongacin Tu-RNAt, el factor de translocacin EF-G
y los factores de liberacin RF1/2-RF3 se unan al mismo sitio
ribosmico. El RRF es el factor de reciclaje del ribosoma (vase
la Fig. 8.35).
8
.15 Los codones de terminacin son reconocidos por factores protenicos
173
el eRFI imita al RNAt
Dominio 2
(extremo
aminoacilo)
GGQ
Dominio 3
Dominio 1
(extremo
anticodn)
\ 8.33 La estructura del factor de terminacin eucari-
tico eRFI imita a La del RNAt. EL componente GGQ LocaLizado en
la punta deL dominio 2 es esencial para hidrolizar a la cadena
polipeptdica del RNAt. Imagen cortesa de David Barford, The
Institute of Cncer Research.
El eRFI utiliza agua para hidrolizar al polipeptidil-RNAt
Elongacin
Terminacin
Centro de
transferencia
del peptidilo
Centro de
transferencia
del peptidilo
Base: Base:
Sitio. P Sitio a\
cadena peptdica
,_,
, i
RNAt
|
RNAt
cadena peptdica
H-N
H-C-R
C H
H-C-R
H
o o b
Sitio P \
cadena peptdica y
H-N
f-py
H-C-R /
o
* s
o \ j.
RNAt:
CH
\ ?H
T QGG
cadena peptdica
H-
H-C-R
0
*

bH
RNAt RNAt
La transferencia y la terminacin del pptido son
reacciones similares en que una base del centro de transferencia
del grupo peptidilo desencadena una reaccin de transesterifi-
cacin al atacar a un enlace N-H u 0-H, liberando al N o al O
para que ataque la ligadura formada con el RNAt.
idea bsica de que todos estos factores tiene la mis-
ma forma general y se unen al ribosoma de forma
sucesiva en el mismo sitio (bsicamente el sitio
una regin sobrepuesta a sta).
El factor eucaritico de liberacin clase 1
,
eRFI, es una protena individual que reconoce
los tres codones de terminacin cuya secuencia
est relacionada con la de los factores bacteriair
y puede terminar la sntesis protenica in vitro
el factor clase 2, eRF2, aunque in vivo es esenci
en las levaduras. La estructura del eRFI sigue m
contexto familiar; en la JRA 8. se muestra cr-
esta formada por tres dominios que simulan la es-
tructura del RNAt.
Un componente esencial de los tres aminocic
GGQ se exhibe en la parte superior del dominio 2.
Su posicin en el sitio A corresponde a la loca
zacin usual de un aminocido en un aminoacL-
RNAt, lo cual lo posiciona para utilizar la glutamir:
(Q) para sustituir al aminocido del aminoacil-RNA-
con una molcula de agua en la reaccin de trar.
lerenda del grupo peptidilo. En la
compara la reaccin de terminacin con la de trans-j
ferencia peptdica usual. La terminacin transfiere
un grupo hidroxilo del agua e hidroliza de manera
efectiva el enlace pptido-RNAt (vase la Fig. Se-
para la descripcin de cmo funciona el centro pe
tidil transferasa).
Las mutaciones en los genes RE reducen la en-
cienda de la terminacin, como se observa por un
incremento de la capacidad para continuar la sn-
tesis protenica ms all del codn de terminacin
La expresin excesiva de REI o de RE2 incremenu
la eficiencia de la terminacin en los codones en loi
cuales acta, lo cual sugiere que la identificacir.
de stos por uno u otro compite con los aminoacii-
RNAt que reconocen errneamente a los codonc:
de terminacin. Los factores de liberacin identifi-
can sus secuencias diana de forma muy eficiente.
La reaccin de terminacin implica la liberacir
del polipptido completo, pero deja a un RNAt dess -
cilado y al RNAm todava asociados con el ribosoraj
En la se muestra que la disociacin de Io
componentes restantes (RNAt, RNAm y subunida-
des 30S y 50S) requiere del factor de reciclaje del ri-
bosoma (RRF, ribosome recydingfactor). El RRF act;
con el EF-G en una reacdn que utiliza la hidrlisiv
de GTP. En cuanto a los otros factores implicados et;
la liberacin, la estructura del RRF imita al RNAt
excepto que carece de un componente equivalente
de la regin 3' de unin al aminocido. Tambin
se necesita IF-3 para cerrar el ciclo de cuando fue
descubierto originalmente y se propuso que era utt
factor de disociacin! El RRF acta sobre la sub-
unidad 50S y el IF-3 elimina el RNAt desaciladc
de la subunidad 30S. Obviamente, una vez que:se
han separado las subunidades, el IF-3 sigue siendc
necesario para evitar que vuelvan a asociarse.
174
CAPTULO 8 Sntesis protenica
EL RNA ribosmico abarca
ambas subunidades
ribosmicas
Conceptos principales
.
Cada RNAr tiene muchos dominios distintos que se
doblan de manera independiente.
.
Virtualmente todas las protenas ribosmicas estn en
contacto con el RNAr.
.
La mayor parte de los contactos entre las subunidades
-
ibosmicas se realiza entre los RNAr 15S y 23S.
5 tercios de la masa de los ribosomas bacterianos
estn constituidos por RNAr. El enfoque de anli-
sis ms penetrante de la estructura secundaria de
fculas grandes de RNA consiste en comparar
:
secuencias de los RNAr correspondientes en or-
5iismos relacionados. Dichas regiones importantes
r
'
.a estructura secundaria conservan la capacidad
;
interactuar por apareamiento de bases, de modo
- j si se requiere de un par de ellas, puede formarse
:
'
. la misma posicin relativa de cada RNAr. Este
ciodo ha permitido la creacin de modelos deta-
;
Jos del RNAr 16S y del RNAr 23S.
Los principales RNAr pueden trazarse en una
-
::uctura secundaria con numerosos dominios dis-
r:os. En el RNAr 16S, que forma cuatro dominios
.rr.erales
, poco menos de la mitad de la secuencia
.
rsenta apareamiento de bases (vase la Fig. 8.45),
;
tanto que el RNAr 23S forma seis. Las regiones de
fcble hlice individuales tienden a ser cortas (<8 bp);
'
frecuencia, las regiones dplex no son perfectas
contienen abultamientos de bases no apareadas.
-
a se han trazado modelos comparables de los RNAr
..:
ocondriales (ms cortos y con menos dominios) y
:
-
. los RNAr del citosol eucaritico (ms largos y con
3 dominios). La mayor longitud de los RNAr eu-
ariticos se debe principalmente a la adquisicin de
cuencias que representan a dominios adicionales.
La estructura cristalina (o tridimensional) del ribo-
.
rna muestra que en cada subunidad, los dominios
r. RNAm mayor se pliegan independientemente y
.
.
"
upan un lugar discreto.
Cuando las subunidades 30S se comparan con
-
ribosomas 70S se encuentran diferencias en la
:
?.ddad del RNAr 16S para reaccionar con los
agenies qumicos; asimismo, hay diferencias entre
teribosomas libres y los comprometidos en la snte-
;
rotenica. Los cambios de reactividad del RNAr
-
c piesentan cuando el RNAm est unido,
cuando se
Boan las subunidades o cuando se ha incorporado
RXAt. Algunos cambios reflejan una interaccin
-. :ta del RNAr con el RNAm o el RNAt, mientras
.;
otros son provocados indirectamente por cam-
;
adicionales en la estructura del ribosoma. El
La terminacin requiere de muchos factores proteinlcos
1
, El RF libera a la protena 2. El RRF entra a! sitio A
R pe RRF
3.
El EF-G transfiere al RRF 4. El ribosoma se disocia
Jh
5 El RF (factor de liberacin) termina la sntesis
protenica liberando a la protena. El RRF (factor de reciclaje del
ribosoma) libera al ltimo RNAt y el EF-G libera RRF, provocando
la disociacin del ribosoma.
punto principal es la flexibilidad de la conformacin
del ribosoma durante la sntesis protenica.
Una caracterstica de la estructura primaria del
RNAr son los residuos metilados. Hay -10 grupos
metilo en los RNAr 16S (localizados principalmen-
te hacia el extremo 3' de la molcula) y -20 en el
RNAr 23S. En las clulas de los mamferos, el RNAr
18S y el 28S portan 43 y 74 grupos metilo, respec-
tivamente, de modo que -2% de los nucletidos
estn metilados (aproximadamente tres veces la
proporcin de metilados en las bacterias).
La subunidad ribosmica grande tambin con-
tiene una molcula de RNA 5S de unas 120 ba-
ses (en todos los ribosomas, excepto en los de las
mitocondrias). La secuencia del RNA 5S no es tan
buen como la de las secuencias de los RNAr mayo-
res. Todas las molculas de RNA 5S exhiben una
estructura con intenso apareamiento de bases.
En los ribosomas del citosol de las eucariotas
est presente otro RNA pequeo en la subunidad
grande, el RNA 5.8S. Su secuencia corresponde al
extremo 5
'
del RNAr 235 procaritico.
Algunas protenas ribosmicas se unen fuerte-
mente al RNAr aislado; otras no se unen al RNAr
libre, pero pueden hacerlo despus de la incorpora-
cin de otras protenas, lo cual sugiere que la con-
formacin del RNAr es importante para determinar
:.;l: El RNA ribosmico abarca ambas subunidades ribosmicas 175
La subunidad 30S tiene una plataforma
Surco rico
en RNA
Plataforma
Cabeza Cuello Cuerpo
6 La subunidad 30S tiene una cabeza separada del
cuerpo por un cuello, con una plataforma protuberante.
Las subunidades SOS tienen tres
rasgos caractersticos
Protuberancia
central 5S
Pednculo
\ L7
Hendidura
7 La subunidad SOS tiene una protuberancia cen-
tral donde se encuentra el RNAr BS, separada por una hendidura
del pednculo formado por copias de la proteina 11.
30S f SOS = 7DS
B La plataforma de la subunidad 30S embona en la
hendidura de la subunidad BOS para formar el ribosoma 705.
El RNA ribosmico est expuesto en la
superficie de la subunidad 30S
La subunidad ribosmica 30S es una partcula
ribonucleoproteinica. Las proteinas se muestran en color ama-
rillo. Imagen cortesa de V. Ramakrishnan, Medical Research
Council (UK).
si existen sitios de unin para algunas protenas.
Conforme se une cada una de stas, introduce cam-
bios conformacionales en el RNAr que hacen pol
sible la incorporacin de ms protenas. En E. ce.
virtualmente todas las protenas ribosmicas 30S la
teractan (si bien en diferente medida) con el RNAr
I6S. Los sitios de unin localizados en las protenas
muestran una amplia variedad de caractersticas es-
tructurales que sugiere diferencias en los mecanis-
mos de reconocimiento protena-RNA.
La estructura del ribosoma 70S es asimtrica.
En la 16 se observa una representacin es-
quemtica de la estructura de la subunidad 30S, que
se divide en cuatro regiones, cabeza, cuello, cuerpo
y plataforma, y en la F; , una represen-
tacin similar de la SOS, donde dos caracterstica;
prominentes son la protuberancia central (dond-.
se localiza el RNAr 5S) y el pednculo (formado
por mltiples copias de la protena L7). En la FIGURA
se muestra que la plataforma de la subunidac
pequea encaja en la hendidura de la grande; entre
ambas subunidades hay una cavidad que contiene
algunos de los sitios importantes.
La estructura de la subunidad 30S sigue la orgaa
nizacin del RNAr 16S, en donde cada caractersti-
ca estructural corresponde a un dominio. El cuerpo
est basado en el dominio 5
'
, la plataforma en el
central y la cabeza, en la regin 3
'
.
En la
se muestra que la distribucin de RNA y protenas
de la subunidad 305 es asimtrica. Una caracterstica
importante es que la plataforma de esta subunidad,
que proporciona la inferase para la subunidad 50S,
est compuesta casi por completo de RNA. Slo dos
protenas (una parte pequea de la S7 y posible-
mente de la S12) se localizan cerca de la interfase.
es decir, que la asociacin y la disociacin de las
subunidades ribosmicas deben depender de las in-
teracciones con el RNAr 16S. La asociacin de las
subunidades experimenta una mutacin en un lazo
de RNAr 16S (posicin 719), localizado en la nter-
fase de la subunidad, adems de que por medio da
experimentos de modificacin/interferencia se hj
demostrado que otros nucletidos del RNAr 16S esa
tn involucrados. Este comportamiento respalda laj
idea de que el origen evolutivo del ribosoma puda
haber sido una partcula formada por RNA y no pon
protenas.
La subunidad SOS presenta una distribucin da
componentes ms uniforme que la 30S, con varillad
largas de RNA de doble cadena que entrecruzan la
estructura. El RNA forma una masa de hlices es4
trechamente empaquetadas. La superficie exterion
consta principalmente de protenas, con excepcin
del centro peptidil transferasa (vase la seccin 8.19a
El RNAr 23S tiene actividad peptidil transferasa)!
Casi todos los segmentos del RNAr 23S interactanj
con las protenas, si bien muchas de las protenas
carecen relativamente de estructura.
176 CAPTULO 8 Sntesis protenica
La unin de las subunidades en el ribosoma 70S
.plica contactos entre el RNAr 16S (muchos en la
gion de la plataforma) y el 23S, as como algunas
:eracciones entre el RNAr de cada subunidad con
s protenas de la otra, y pocos contactos protena-
oiena. En la GURA se identifican los puntos
: rontacto de las estructuras del RNAr. En la
se abre la estructura (imagnese la subunidad
S rotada en direccin contraria a las manecillas
reloj y la 30S en sentido contrario, en torno al
:
ie la figura) para mostrar las localizaciones de los
mtos de contacto en la cara de cada subunidad.
Q Los ribosomas tienen
numerosos centros activos
I;nceptos principales
Las interacciones en que est implicado el RNAr son
clave para la funcin del ribosoma.
B ambiente de los sitios de unin al RNAt depende
ampliamente del RNAr.
-
Tiensaje bsico que no debe olvidarse sobre el
sbosoma es que se trata de una estructura coope-
"
va que depende de cambios en las relaciones en-
;
us sitios activos durante la sntesis protenica.
"
ir.os sitios no son regiones discretas y pequeas
~
o los centros activos de las enzimas, son regio-
extensas cuya construccin y cuyas activida-
:
--
pueden depender tanto del RNAr como de las
lenas ribosmicas. Las estructuras cristalinas
;
-
;
subunidades individuales y de los ribosomas
seranos proporcionan una buena impresin de
- anizacin general y subrayan la funcin del
Ar. La estructura ms reciente, a una resolucin
r
-5 , identifica claramente la ubicacin de los
\t y de los sitios funcionales, de modo que ahora
: sible dar cuenta de muchas funciones ribos-
;:
;
en funcin de su estructura.
_as fundones ribosmicas giran en torno a la in-
: .
"
rin con los RNAt. En la se muestra
nbosoma 70S con las posiciones de los RNAt en
res sitios de unin, en los sitios A y P estn casi
elos; todos se alinean con sus lazos anticodn
coos al RNAm en el surco de la subunidad 30S y
-
:o de cada RNAt se une a la subunidad SOS. El
ente que rodea a cada RNAt es proporcionado
'
plmente por el RNAr. En cada sitio, el RNAr
:
cta al RNAt en partes de la estructura univer-
toeate conservadas.
Siempre ha sido un gran enigma cmo dos
pt voluminosos pueden acomodarse uno al lado
V-
'
o en codones adyacentes de lectura. La es-
ctura cristalina muestra un doblez de 45 en el
Las interacciones entre los RNAr estn muy localizadas
890-
-1900
,
700,7&O
- 1930
19901950
700 710
690
79Q
780-
770-
,
800
350
340
890 -900
400-
1410 :]
1400-
,
1520
-
1500
'
1490
v1480
-
1470
1420
,
1430
.
RNAr 23S RNAr 16S
Los puntos de contacto entre los RNAr estn localizados en
dos dominios de RNAr 16S y en uno de RNAr 23S. Reproducida de Yusupov,
M
. M. 2001. Science. 292: 883-896. 2001 AAAS. Imagen cortesa de Harry
Noller, University of California, Santa Cruz.
rcionan los contactos p
subunidades ribosm
Los contactos entre las subunidades ribosmicas son princi-
palmente de RNA (en color prpura). Los contactos que implican protenas
se identifican con color amarillo. Las dos subunidades se han rotado para
alejar una de otra y mostrar las caras en que tienen lugar los contactos;
desde un plano perpendicular a la pantalla, la subunidad SOS ha sido girada
90 en direccin contraria a las manecillas del reloj, en tanto que la 30S
ha sido rotada 90 en direccin de las manecillas del reloj (aqu muestra al
contrario de la orientacin usual). Imagen cortesa de Harry Noller, Univer-
sity of California, Santa Cruz.
RNAm, entre los sitios P y A, que permite que los
RNAt embonen, segn se ve en la ampliacin de la
. Los RNAt de los sitios P y A se ubican en
un ngulo de 26

respecto de ellos mismos, en sus

anticodones. La aproximacin mayor entre las co-
lumnas vertebrales del RNAt ocurre en los extremos
3
'
, donde convergen con una separacin 5 (per-
pendicular al plano de la pantalla), lo cual permite
que la cadena peptdica sea transferida del peptidil-
RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A.
Para que el EF-Tu hidrolice al GTP y sea libe-
rado del ribosoma, es necesario que el aminoacil-
RNAt sea insertado en el sitio A por el EF-Tu y que
se apare con el codn (vasela seccin 8.10, El fac-
tor de elongacin Tu carga al aminoacil-RNAt en el
sitio A). Para empezar, el EF-Tu coloca al aminoacil-
8
.
17 Los ribosomas tienen numerosos centros activos 177
.
4
.
El ribosoma 70S est formado por La subunidad
SOS (blanco) y la 30S (prpura), con tres molculas de RNAt
localizadas superficialmente: representadas con color amarillo
en el sitio A, azul en el sitio P y verde en el E. Imagen cortesa
de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.
El RNAm se dobla entre los sitios P y A
Sitio E Sitio P Sitio A
Doblez
Las tres molculas de RNAt tienen orientacio-
nes distintas en el ribosoma. El RNAm gira entre los sitios P
y A para permitir que los aminoacil-RNAt se unan a codones
adyacentes. Imagen cortesa de Harry Noller, University of Ca-
lifornia, Santa Cruz.
RNAt en la subunidad pequea,
donde el anticodn
se aparea con el codn. Es necesario que el RNAt se
mueva para que penetre totalmente en el sitio A,
cuando su extremo 3
'
entra al centro peptidil trans-
ferasa en la subunidad grande. Hay diferentes mo-
delos que explican cmo ocurre este proceso. Uno
de ellos exige que el RNAt completo gire,
de manera
que el codo de la estructura en forma de L formada
por los brazos D y WC entre en el ribosoma para
que el brazo TPC se apare con el RNAr. En otro se
requiere que la estructura interna del RNAt cambie
y utilice el lazo anticodn como bisagra para que el
resto del RNAt rote de una posicin en la cual est
apilado en el lado 3
'
del lazo anticodn, a una en
que est apilado en el lado 5
'
. Despus de la transi-
cin, el EF-Tu hidroliza al GTP para que proceda I
sntesis protenica.
La translocacin implica movimientos amplio;
en las posiciones de los RNAt en el ribosoma. 9
extremo anticodn del RNAt se mueve -28 de!
sitio A al P, y posteriormente otros 20 del P al E.
Como resultado del ngulo de cada RNA respecte
del anticodn, el volumen del RNAt avanza distan-
cias mucho ms grandes: 40 del sitio A al P, y 5;
del P al E, lo cual sugiere que la translocacin exige
una importante reorganizacin de la estructura.
Durante muchos aos se pens que la trans-
locacin poda ocurrir slo en presencia del factor
EF-G, sin embargo, el antibitico esparsomicina
(que inhibe la actividad de la peptidil transferasa) U
desencadena. Esto sugiere que la energa necesaria
para conducir la translocacin de hecho es almace-
nada en el ribosoma despus de que se ha formade
el enlace peptdico. En general, el EF-G acta en el
ribosoma para liberar esa energa y permitirle con-
ducir la translocacin, no obstante la esparsomicina
puede tener la misma fundn. La esparsomicina in-
hibe la peptidil transferasa al unirse al peptidil-RNA:
al bloquear su interaccin con el aminoacil-RNAt
Probablemente crea una conformacin semejante
a la conformacin postranslocacin usual, que a su
vez, favorece el movimiento del peptidil-RNAt. Lo
importante es que la translocacin es una propiedad
intrnseca del ribosoma.
El modelo de estados hbridos sugiere que le
translocacin puede suceder en dos etapas, con una
unidad ribosmica desplazndose respecto de la otra
para dar lugar a una etapa intermedia en la cua
"
.
hay sitios de unin al RNAt hbridos (50SE/30S PI
50SP/30S A) (vase la Fig. 8.29). La comparacin-
de la estructura del ribosoma entre el estado previo
y el posterior a la translocacin y de la conforma-
cin del RNAr 16S entre las subunidades 30S libre;
y los ribosomas 70S, sugiere que la motilidad de la
estructura es especialmente obvia en las regiones de
la cabeza y de la plataforma de la subunidad 30S.
Una perspectiva interesante del modelo de estado?
hbridos proviene de que numerosas bases del RNA:
implicadas en la asociacin de las subunidades es-
tn cerca de bases involucradas en la interaccin
con el RNAt, fenmeno que sugiere que los sitio?
de unin con el RNAt estn prximas a la interfase
entre las subunidades e implica que ciertos cambios
en la interaccin entre stas tengan relacin con J
movimiento del RNAt.
Gran parte de la estructura del ribosoma m
ocupada por sus centros activos. La perspectiva
esquemtica de los sitos ribosmicos de la 1 IGUfcA
muestra que constituyen unos dos tercios e
la estructura ribosmica. Un RNAt entra al sitio A,
es transferido por translocacin al interior del P y
178
CAPTULO 8 Sntesis protenica
:
eriormente abandona el ribosoma (bacteriano)
avs del sitio E. Los sitios A y P cubren las dos
unidades ribosmicas; el RNAt se aparea con el
\m en la subunidad 30S, sin embargo, la transfe-
ria del pptido sucede en la subunidad 50S. Los
s P y A son adyacentes, lo que permite que la
islocacin desplace al RNAt de un sitio al inte-
del otro. El sitio E est localizado cerca del sitio
osicin a medio camino hacia la superficie de
ubunidad SOS). El centro peptidil transferasa se
iliza en la subunidad SOS, cerca de los extremos
noacilo de los RNAt de los sitios A y P (vase la
on 8.18, El RNAr 16S desempea una funcin
va en la sntesis protenica).
Todas las protenas de unin al GTP que fu-
an en la sntesis protenica (EF-Tu, EF-G, IF-2
?!, -2 y -3) se unen al mismo sitio de unin al
I (en ocasiones llamado centro GTPasa), el cual
rablemente desencadena la hidrlisis de sus GTP.
I sitio se encuentra en la base del pednculo de la
unidad grande, formada por protenas L7 y L12
es una modificacin de L12 y tiene un grupo
tilo en la terminal N). Adems de esta regin,
mplejo formado por la protena Lll con un
:
mento de 58 bases del RNAr 23S provee el sitio
unin para algunos antibiticos que inciden en
r.ividad GTPasa, y si de hecho ninguna de estas
v.
cturas ribosmicas posee actividad GTPasa, am-
son necesarias para ello. La funcin del riboso-
es activar la hidrlisis de GTP mediante factores
dos al sitio de unin con el factor.
La unin inicial de las subunidades 30S con el
ton requiere de la protena SI, que posee una
r.
e afinidad por el cido nucleico de cadena in-
idual y es responsable del mantenimiento del
ido de cadena nica en el RNAm unido a la sub-
iad 30S. Esta accin es necesaria para evitar que
NAm adquiera una conformacin de bases parea-
nadecuada para la traduccin. La estructura de
:
rotena SI es demasiado alargada y se relaciona
.
ias protenas S18 y S21; las tres constituyen un
rinio involucrado en la unin inicial del RNAm
unin del RNAt iniciador, lo cual ubica el sitio
min con el RNAm en las cercanas de la hendi-
I de la subunidad pequea (vase la Fig. 8.3). El
rmo 3
'
del RNAr, que se aparea con el sitio de
lacin del RNAm, se localiza en esta regin.
Los factores de iniciacin se unen a la misma
:
n del ribosoma. El IF-3 puede estar entrelazado
e extremo 3' del RNAr, as como con numero-
protenas ribosmicas, incluidas las que proba-
ente estn implicadas en la unin del RNAm.
fccin del IF-3 podra ser estabilizar la unin
-
-Ti-subunidad 30S; posteriormente sera despla-
j. al unirse la subunidad SOS.
El ribosoma tiene numerosos centros activos
Sitio A
Sitio P Sitio 5S sitio de
\ L3/L8/2 / sa|ida de
V / protenas
Membrana
Sitio E
S1/S18/S21
Unin del IF y el EF
El ribosoma tiene numerosos centros activos y
puede estar asociado con una membrana. El RNAm gira al pasar
a travs de los sitios P y A, que forman un ngulo. El sitio E est
ms all del P. El sitio peptidil transferasa (no ilustrado) abarca
Las regiones superiores de los sitios P y A. Parte del sitio unido
al EF-Tu/G se encuentra en la base de los sitios A y P.
La incorporacin del RNA 5S a las subunidades
SOS ensambladas in vitro depende de la capacidad de
tres protenas, LS, L8 y L2S, para formar un complejo
estequiomtrico con l. Dicho complejo puede unir-
se con el RNAr 23S, a diferencia de los componentes
aislados; se encuentra prximo a los sitios A y P.
Una protena naciente emerge a travs del ribo-
soma, lejos de los sitios activos, en el interior de la
regin en la cual los ribosomas pueden ser adheri-
dos a las membranas (vase el Captulo 10, La loca-
lizacin de las protenas). Una cadena polipeptdica
emerge del ribosoma a travs de un canal de salida
que va del sitio peptidil transferasa a la superficie
de la subunidad SOS. El tnel est formado princi-
palmente por RNAr. Es bastante angosto, mide de
1 a 2 nm, y tiene -10 nm de largo. El polipptido
naciente emerge del ribosoma a ~ 15 de distancia
del sitio peptidil transferasa. En el tnel caben ~S0
aminocidos y probablemente constrie a la cade-
na polipeptdica, de manera que no pueda plegarse
hasta abandonar el domino de salida.
EL RNAr 16S desempea una
fundn activa en La sntesis
protenica
Concepto principal
El RNAr 16S desempea un papel activo en las
funciones de la subunidad 305, pues interacta
directamente con la subunidad 505 y con los
anticodones de las molculas de RNAt localizadas en
los sitios P y A.
Originalmente se pensaba que el ribosoma era una
coleccin de protenas con varias actividades catal-
ticas mantenidas juntas por interacciones protena-
8
.18 El RNAr 165 desempea una funcin activa en la sntesis protenica
179
El RNAr es importante en la funcin ribosmica
Protegido por P-RNAt
Cerca de
CECnnCTD la unin al E
= De asociacin de
subunidad
Dominio central C )
i
II i
Lazo 530 en el sitio A
, /?
Supresin TERM
1;400 en el sitio A -
en el sitio A -
imi
Supresin
TERM
ominio mayor 3
'
Necesario para la afiin del
'
P-RNAt
/
V
n ni
Necesario'para la
/ unin de0-RNAt
Divisifeje la cc icina E3
Sin metilacin
en los mutantes-
Complementario del RNAm
=
-
De precisin
Dominio 5'
Dominio menor 3'
Algunos sitios del RNAr 16S estn protegidos de sondas
qumicas cuando las subunidades 505 se unen a las 305 o cuando el
aminoacil-RNAt se une al sitio A. Otros son los sitios de mutaciones
que afectan a la sntesis protenica. Los sitios de supresin TERM
pueden afectar la terminacin en algunos o muchos codones de ter-
minacin. Los bloques grandes coloreados indican los cuatro dominios
del RNAt.
protena y por unin al RNAr. Sin embargo, el des-
cubrimiento de molculas de RNA con actividades
catalticas (vase el Captulo 26, Corte, empalme y
procesamiento del RNA) sugiere inmediatamente
que el RNAr puede tener una participacin ms ac-
tiva en la funcin del ribosoma. Ahora hay eviden-
cias de que el RNAr interacta con el RNAm o con
el RNAt en todas las etapas de la traduccin y que
las protenas son necesarias para mantener al RNAr
en una estructura en la cual pueda realizar las fun-
ciones catalticas. En numerosas interacciones estn
involucradas regiones especficas del RNAr:
.
El extremo 3' del RNAr interacta directa-
mente con el RNAm en la iniciacin.
.
Regiones especficas del RNAr 16S interac-
tan directamente con las regiones antico-
dn de los RNAt en el sitio A y el P. De
manera similar, el RNAr 23S interacta con
el extremo CCA del peptidil-RNAt en el sitio
A y el P.
.
La interaccin de las subunidades implica
interacciones entre los RNAr 16S y 23S
(vase la seccin 8.16, El RNA ribosmico
abarca ambas subunidades ribosmicas).
Mediante antibiticos que inhiben el proceso
en ciertas etapas se ha obtenido mucha informacin
acerca de cada paso de la sntesis protenica bacte-
riana. La diana del antibitico puede ser identificada
por el componente en el cual ocurren mutaciones
resistentes, y si bien algunos antibiticos actan
sobre protenas ribosmicas individuales, muchos
inciden en el RNAr, lo cual sugiere que est invo-
lucrado en muchas de las funciones del ribosoma.
si no es que en todas.
Las funciones del RNAr se han investigado me-
diante dos tipos de mtodos. Los estudios estruc-
turales muestran que regiones especficas estn lo-
calizadas en sitios importantes del ribosoma y que
las modificaciones qumicas de estas bases impiden
funciones particulares de los ribosomas. Por otra
parte, las mutaciones identifican a bases del RNAr
necesarias para funciones ribosmicas particulares.
En la se resumen los sitios del RNAr I6S
identificados por estos medios.
Un indicio de la importancia del extremo 3' de.
RNAr 16S es su susceptibilidad al agente letal co-
licina E3 producida por algunas bacterias, la cual
divide a -50 nucletidos del extremo 3' del RNAr
16S de E. coli. Esta divisin suprime por complete
el inicio de la sntesis protenica. Muchas funcionen
importantes necesitan la regin dividida, como la
unin del factor IF-3, el reconocimiento del RNAm
y la unin del RNAt.
El extremo 3' del RNAr 16S participa directa-
mente en la reaccin de iniciacin por apareamientc
con la secuencia Shine-Dalgarno en el sitio de unin
con el ribosoma del RNAm (vase la Fig. 8.16). Otra
funcin directa del extremo 3' del RNAr 16S en la
sntesis protenica se demuestra por las propieda-
des de los mutantes resistentes a la kasugamicina
que carecen de ciertas modificaciones en el RNAr
16S. La kasugamicina bloquea la iniciacin de U
sntesis protenica. Los mutantes resistentes del tipr
ksgA carecen de la enzima metilasa que introduce
cuatro grupos metilo a adeninas adyacentes locali-
zadas en un sitio cercano al extremo 3
'
del RNAr
16S. La metilacin genera la secuencia altamente
conservada G-m
2
6A
-
m
2
6A
, que se encuentra en I
RNAr pequeo de las eucariotas y las procariotas.
La secuencia metilada se relaciona con la unin de
las subunidades 30S y 50S, la cual a su vez est
vinculada con la retencin del RNAr iniciador en
el ribosoma completo. La kasugamicina induce
liberacin del fMet-RNAt
f
de los ribosomas sensiti-
vos (metilados), pero los ribosomas resistentes son
capaces de retener al iniciador.
180
CAPTULO 8 5ntesis protenica
La conformacin del RNAt puede cambiar
GGGAG
912 910
G G G GAG
O U C
r 912 910
KURA 8.46 Durante la sntesis protenica puede ocurrir un
-
"-
oio en la conformacin del RNAr 16S.
Los cambios en la estructura del RNAr 16S ocu-
mcn cuando los ribosomas estn implicados en la
sntesis protenica, como se observa por la protec-
:
n de bases particulares contra ataques qumicos.
'
-.
5 sitios individuales se encuentran en algunos
r
-
jpos concentrados en los dominios 3
'
menor y
entral. Aunque las localizaciones estn dispersas
n la secuencia lineal del RNAr 16S
, parece probable
ue la posicin de las bases involucradas en la mis-
-
.a funcin estn de hecho ubicadas en la estructura
;:ciaria, cerca una de la otra.
Algunos de los cambios del RNAr 16S son in-
Aicidos por la unin de las subunidades 505, la del
Am o la del RNAt. Dichos cambios indican que
ios eventos tienen relacin con cambios en la con-
rmacin del ribosoma que afectan la exposicin
.:
"
. RNAr, aunque no necesariamente indican la
"
inicipacin directa del RNAr en estas funciones.
1- l
a FIGURA 8.46 se muestra un cambio que ocurre
. _
:ante la sntesis protenica; implica un movimien-
! xal para modificar la naturaleza de una secuen-
dplex corta.
El RNAr 16S tiene que ver con la funcin del
do A y del P, y cuando estos sitios estn ocupa-
-:
i - ocurren cambios significativos en su estructu-
bl Ciertas regiones distintas estn protegidas por
dRNAt unido al sitio A (vase la Fig. 8.45). Una
sel lazo 530 (que tambin es el sitio de una mu-
Bdn que impide la terminacin en los codones
.
-
.A
, UAG y UGA). La otra es la regin 1400 a 1500
.
tnominada as porque las bases 1399 a 1492 y
i Brdeninas 1492-1493 son dos fragmentos de ca-
-
-
.r.
s nica conectados por una horquilla larga).
'
cios los efectos de la unin del RNAt en RNAr
5 pueden ser producidos por el oligonucletido
dado del tallo-lazo anticodn, de tal manera que
b unin RNAt-subunidad 30S debe involucrar a
-
regin.
las adeninas que se encuentran en 1492 y
-
:
5 proporcionan un mecanismo para detectar
Perplejos codn-anticodn apareados adecuada-
r.
eme. El principio de la interaccin es que la es-
El RNAr interacta con el RNAt apareado
adecuadamente
Interaccin RN
.
AM6S
RNAm-BNAt 1492-1493
El complejo codn-anticodn
forma 3 pares de bases
Interaccin
La combinacin apareada errneamente
tiene slo dos pares de bases
'
Sin ilnteraccin
ausente
IGURA 8.47 El apareamiento codn-anticodn respalda la
interaccin con las adeninas 1492 a 1493 del RNAr 16S, si
bien los apareamientos errneos RNAt-RNAm no pueden in-
teractuar.
tructura de RNAr 16S responde a la estructura de
los dos primeros pares de bases en el surco menor
del dplex formado por la interaccin codn-anti-
codn. El cambio de la posicin NI de la base 1492
o de la 1493 en el RNAr impide la unin del RNAt
con el sitio A. Sin embargo, las mutaciones en las
posiciones 1492 y 1493 pueden ser suprimidas por
la introduccin de fluorina en la posicin 2' de las
bases correspondientes del RNAm (con lo cual se
restablece la interaccin). En la FIGURA 8.47se mues-
tra que el apareamiento entre el codn y el antico-
dn permite que el NI de cada adenina interacte
con el grupo OH-2
'
de la estructura principal del
RNAm. Cuando entra un RNAt incorrecto al sitio A
,
la estructura del complejo codn-anticodn se dis-
torsiona y no puede tener lugar dicha interaccin,
que la asociacin del RNAt con el sitio A.
El RNAt localizado en el sitio P protege a una
variedad de bases en posiciones diferentes del RNAr
16S; muy probablemente las bases se encuentren
cerca una de la otra en la estructura terciaria. De he-
cho, hay ms contactos con el RNAt cuando se en-
cuentra en el sitio P que cuando se encuentra en el
A
, situacin que puede ser responsable de la mayor
estabilidad del peptidil-RNAt respecto de la del ami-
8
.
18 El RNAr 16S desempea una funcin activa en la sntesis protenica
181
noacil-RNAt. Esto tiene sentido, pues una vez que el
RNAt ha llegado al sitio P, el ribosoma ha decidido
que est correctamente unido, mientras que en el
sitio A tiene lugar la evaluacin de las uniones. La
regin 1400 puede entrelazarse directamente con el
peptidil-RNAt, lo cual sugiere que esta regin es un
componente estructural del sitio P.
La conclusin bsica derivada de estos resultados
es que el RNAr tiene numerosas interacciones con el
RNAt y con el RNAm y que estas interacciones se re-
piten cada ciclo de formacin de enlaces peptdicos.
EL RNAr 23S tiene actividad
peptidiL transferasa
Concepto principal
.
La actividad peptidil transferasa reside exclusivamente
en el RNAr 23S.
Los sitios implicados en las funciones del RNAr 23S no
estn tan bien identificadas como los del RNAr 16S,
sin embargo, se observa el mismo patrn general:
las bases de ciertas posiciones influyen en funciones
especficas. Las bases ubicadas en algunas posicio-
nes del RNAr 23S son afectadas por la conformacin
del sitio A o del P; en particular, los oligonucletidos
derivados del CCA terminal 3' del RNAt protegen a
un conjunto de bases del RNAr 23S, esencialmente
las mismas protegidas por el peptidil-RNAt, lo cual
sugiere que la interaccin principal del RNAr 23S con
el peptidil-RNAt en el sitio P involucra al extremo 3
'
del RNAt.
El RNAt establece contactos con el RNAr 23S
tanto en el sitio P como en el A. En el sitio P, la
G2552 del RNAr 23S se aparea con la C74 del pep-
tidil-RNAt. Una mutacin en la G del RNAr evita la
interaccin con el RNAt, si bien dicha interaccin es
restablecida por una mutacin compensadora en la
C del extremo amino aceptor del RNAt. En el sitio
A
, la G2553 del RNAr 23S se aparea con la C75
del aminoadl-RNAt, de modo que en ambos sitios de
unin con el RNAt hay una funcin cercana del
RNAr. Ciertamente, cuando se tenga una perspec-
tiva estructural ms clara de la regin, ser posible
entender los movimientos del RNAt entre los sitios
A y P en cuanto a establecimiento y prdida de con-
tactos con el RNAr.
Otro sitio que se une al RNAt es el E, localizado
casi exclusivamente en la subunidad SOS. Las bases
afectadas por su conformacin pueden ser identifi-
cadas en el RNAr 23S.
Cul es la naturaleza del sitio de la subunidad
SOS que proporciona la funcin peptidil transferasa?
Primero se indic la implicacin del RNAr debido a
que una regin del RNAr 23S es el sitio de muta-
ciones que confiere resistencia a los antibiticos que1
inhiben a la peptidil transferasa.
No se ha tenido xito en una larga bsqueda
de protenas ribosmicas que potencialmente ten-
gan actividad cataltica, aunque resultados recientes
sugieren que el RNA ribosmico de la subunidac
grande posee dicha actividad. La extraccin de cas;
todo el contenido protenico de las subunidades
SOS deja al RNAr 23S asociado en gran medida
fragmentos de protenas que representan <5% de
la masa de las protenas ribosmicas. Esta prepa-
racin retiene la actividad peptidil transferasa. Los
tratamientos que daan al metabolismo del RNA
suprimen la actividad cataltica.
A partir de estos resultados, el RNAr 23S pre-
parado por transcripcin in vitro puede catalizar I
formacin de un enlace peptdico entre el Ac-Phe-
RNAt y el Phe-RNAt. El rendimiento del AC-Phe-
Phe es muy bajo, lo cual sugiere que el RNAr 23S
requiere de protenas para funcionar con la mxi-
ma eficiencia. Sin embargo, debido a que el RNA:
tiene la actividad cataltica bsica, la funcin de las
protenas debe ser indirecta, de modo que plieguen
al RNAr de forma adecuada o para presentar a l
los sustratos. Por otra parte, la reaccin funciona.
aunque con menor efectividad, si los dominios de
'
RNAr 23S son sintetizados separadamente y des-
pus se combinan. De hecho, el dominio V, que
tiene al centro cataltico, presenta cierta actividad.
Esta ltima es abolida por mutaciones en la posicin
2252 del domino V que yace en el sitio P.
La estructura cristalina de la subunidad SOS de
las archaea muestra que el sitio peptidil transferase
bsicamente est formado por RNAr 23S. No hay
protenas a una distancia de 18 del sitio activo en
donde ocurre la reaccin de transferencia entre el
peptidil-RNAt y el aminoacil-RNAt!
La sntesis del enlace peptdico exigue que e!
grupo amino de un aminocido ataque al grupo
carboxilo de otro aminocido. La catlisis implica
que un residuo bsico acepte el tomo de hidr-
geno liberado del grupo amino, como se muestra
en la FIGURA 8.48. Si el RNAr es el catalizador, debe
proporcionar dicho residuo, sin embargo no se sabe
cmo sucede esto. Las purinas y las pirimidinas no
son bsicas a pH fisiolgico. Una base ampliamente
conservada (en la posicin 24S1 de E. coli) haba
sido implicada, pero ahora parece no tener las pro-
piedades adecuadas ni ser crucial para la actividad
peptidil transferasa.
Las protenas unidas al RNAr 23S fuera de la re-
gin peptidil transferasa casi seguramente necesarias
son que que el RNAr forme la estructura apropiada
in vivo. La idea de que este ltimo es el componente
cataltico coincide con los resultados descritos en el
182 CAPTULO 8 Sntesis protenica
Cul es la fuente de la catlisis bsica?
Aminoacil-RNAt Peptidil-RNAt
Centro de
transferencia
del peptidilo
Base:
cadena
peptdica
H-C-F H-C-P
cadena
peptdica
H-C-F H-C-F
cadena peptdica
H-C-P
H-C-R
RNAt
., La formacin de enlaces peptdicos requiere de
catlisis cido-base en La cual se transfiere un tomo de H a
" -
siduo bsico.
la: tulo 26
, Corte, empalme y procesamiento del
SNA, los cuales identifican las propiedades catalticas
: RNA involucradas en numerosas reacciones de
procesamiento del RNA, adems de que concuerda
oon la nocin de que el ribosoma evolucion a partir
;
iMnciones originalmente posedas por el RNA.
m Las estructuras ribosmicas
cambian cuando se unen
Las subunidades
lonceptos principales
ta cabeza de la subunidad 305 gira alrededor del cuello
cuando se forman los ribosomas completos.
El sitio activo peptidil transferasa de la subunidad 50S
es ms activo en los ribosomas completos que en las
subunidades individuales 505.
La interfase entre las subunidades 505 y 305 es muy
"
ica en contactos disociables.
ribosoma completo. Las diferencias de susceptibili-
dad de los RNAr a agentes externos constituyen uno
de los indicadores ms poderosos (vase la seccin
8
.18, El RNAr 16S desempea una funcin activa
en la sntesis protenica). De forma ms directa, las
comparaciones entre estructuras cristalinas de alta
resolucin de las subunidades individuales y la es-
tructura de menor resolucin del ribosoma intacto
sugieren diferencias significativas, idea confirmada
por una estructura cristalina del ribosoma de E. coli
a 3.5 , la cual, adems, identifica dos conformacio-
nes diferentes del ribosoma que prueban represen-
tar etapas diferentes de la sntesis protenica.
El cristal contiene dos ribosomas por unidad,
cada uno con diferente conformacin. Las diferen-
cias se deben a cambios en el posicionamiento de los
dominios en cada subunidad, y la ms importante
consiste en que en una conformacin, la cabeza de
la subunidad pequea ha girado aproximadamente
6o
en torno a la regin del cuello, hacia el sitio E.
Asimismo, la rotacin de 6 en la direccin opuesta
se observa en las estructuras (de baja resolucin)
de los ribosomas de Thermus thermophus que estn
unidos al RNAm y que tienen molculas de RNAt en
los sitios A y P, lo cual sugiere que la cabeza puede
girar en total 12

, dependiendo de la etapa de la
sntesis protenica. La rotacin de la cabeza sigue el
curso de los RNAt a travs del ribosoma, haciendo
posible que su rotacin controle el movimiento del
RNAm y el RNAt.
Los cambios de conformacin que ocurren con
la unin de las subunidades son mucho ms mar-
cados en la subunidad 30S que en la 50S, y proba-
blemente estn relacionados con el control de la
posicin y con el movimiento del RNAm. El cambio
ms significativo en la subunidad SOS concierne al
centro peptidil transferasa. Las subunidades SOS son
~
1 000 veces menos efectivas en la catlisis de la
sntesis de los enlaces peptdicos que los ribosomas
completos, quiz por un cambio en la estructura
que posiciona al sustrato de forma ms efectiva en
el sitio activo del ribosoma completo.
Una de las caractersticas principales derivadas
de la estructura del ribosoma completo es la densi-
dad extremadamente alta de contactos disociables en
su interfase, que puede ayudar a establecer y rom-
per contactos, fenmeno esencial para la asociacin
y disociacin de subunidades que tambin podra
estar involucrado en los cambios estructurales que
ocurren durante la translocacin.
tochas evidencias indirectas sugieren que las es-
;;uras de las subunidades individuales cambian
Ignificativamente cuando se juntan para formar un
Resumen
Los ribosomas son partculas ribonucleoprotenicas
en las cuales la mayor parte de la masa es propor-
8.
21 Resumen 183
donada por el RNAr. La forma de todos los riboso-
mas suele ser similar, no obstante, slo los de las
bacterias (70S) han sido caracterizados en detalle.
La subunidad pequea (30S) es de forma alarga-
da y est constituida por un "cuerpo" que contiene
aproximadamente dos tercios de la masa dividida
a la altura de la
"
cabeza" por una hendidura. La
subunidad grande (50S) es ms esfrica, con un
"
pednculo
"
prominente en la parte derecha y una
"
protuberancia central
"
. En la subunidad pequea
se conoce la localizacin de aproximadamente todas
las protenas.
Cada subunidad contiene un RNAr mayor ni-
co, de 16S y 23S en las procariotas y de 18S y 28S en
el citosol eucaritico. Tambin hay RNAr menores,
notablemente el 5S localizado en la subunidad gran-
de. Los RNAr presentan un extenso apareamiento
de bases, principalmente en forma de cortos tallos
dplex apareados de manera imperfecta con lazos
de cadena nica. Las caractersticas conservadas en
el RNAr pueden ser identificadas al comparar las
secuencias y las estructuras secundarias que pueden
extraerse de los RNAr de diversos organismos. El
RNAr 16S tiene cuatro dominios, en tanto que el
23S posee seis dominios diferentes. Los RNAr eu-
cariticos tienen dominios adicionales.
La estructura cristalina muestra que en la sub-
unidad 30S la distribucin del RNA y las protenas
es asimtrica, el primero est concentrado en la
interfase con la subunidad SOS. La subunidad 5OS
tiene una superficie de protenas con varillas largas
de RNA de cadena doble que se entrecruzan sobre
la estructura. La unin de las subunidades 30S y
50S implica contactos entre el RNAr 16S y el RNAr
23S. La interfase entre las subunidades es muy rica
en contactos disociables. En ambas subunidades
ocurren cambios estructurales cuando se unen para
formar un ribosoma completo.
Cada subunidad tiene varios centros activos con-
centrados en el domino de traduccin del ribosoma,
donde las protenas son sintetizadas. Estas ltimas
abandonan al ribosoma a travs del dominio de sa-
lida, el cual puede asociarse con una membrana. Los
sitios activos principales son A y P, as como el E y
los sitios de unin con el EF-G y el EF-Tu, el peptidil
transferasa y el de unin con el RNAm. La confor-
macin del ribosoma puede cambiar en etapas de la
sntesis protenica; se han detectado diferencias en
la accesibilidad de regiones especficas de los RNAr
mayores.
Los RNAt localizados en los sitios A y P son pa-
ralelos. Los lazos anticodn estn unidos al RNAm
en un surco localizado en la subunidad 30S. El resto
de cada RNAt se une a la subunidad SOS. Un cam-
bio conformacional del RNAt en el sitio A es nece-
sario para colocar su extremo aminoacilo en yuxta-
posicin con el extremo del peptidil-RNAt del sitio
P
. El sitio peptidil transferasa que liga a los sitios de
unin A y P est hecho de RNAr 235, el cual tiene
actividad cataltica peptidil transferasa, aunque las
protenas son probablemente necesarias para que se
adquiera la estructura correcta.
La funcin activa del RNAr en la sntesis prote-
nica es indicada por mutaciones que inciden en Q
funcin ribosmica, las interacciones con el RNAm
o el RNAt que pueden ser detectadas por ligamiento
cruzado qumico y los requerimientos para man-
tener las interacciones de apareamiento de bases
individuales con el RNAt o el RNAm. La regin 3
terminal del RNAr se aparea con el RNAm en la
iniciacin. Las regiones internas forman contactos
individuales con los RNAt en los sitios P y A. El RNA1
ribosmico es el objetivo de algunos antibiticos u
otros agentes que inhiben la sntesis protenica.
Un codn en el RNAm es reconocido por un
aminoacil-RNAt, el cual tiene un anticodn comple-
mentario del codn que transporta al aminocido'
correspondiente a dicho codn. Un RNAt iniciador
especial (fMet-RNAt
[
en las procariotas o Met-RNAt
en las eucariotas) reconoce al codn AUG, el cual
es utilizado para iniciar todas las secuencias codi-
ficadoras. En las procariotas tambin se utiliza el
codn GUG. Slo los codones de terminacin (sin
sentido), UAA, UAG y UGA, no son reconocidos por
los aminoacil-RNAt.
Los ribosomas son liberados de la sntesis pro-
tenica para entrar a un banco de ribosomas libres
que estn en equilibrio con subunidades pequeas
y grandes separadas. Las subunidades pequeas se
unen al RNAm y posteriormente se ensamblan con
las subunidades grandes para formar ribosomas in-
tactos que asumen la sntesis protenica. El reconoci-
miento de un sitio de iniciacin procaritico implica
la unin de una secuencia localizada en el extremo
3' d
el RNAr con la secuencia Shine-Dalgarno, la
cual precede al codn AUG (o GUG) en el RNAm.
El reconocimiento de un RNAm eucaritico invo-
lucra la unin con el casquete 5'; posteriormente,
la subunidad pequea migra al sitio de iniciacin aj
buscar codones AUG, y cuando reconoce al apropia-
do (en general, aunque no siempre, el primero que
encuentra), se le adhiere una subunidad grande.
Un ribosoma puede portar dos aminoacil-RNAt
simultneamente: su sitio P es ocupado por un po-
lipeptidil-RNAt, el cual transporta la cadena poli-
peptdica sintetizada hasta el momento, mientras
que el sitio A es utilizado como entrada por un ami-
noacil-RNAt que porta al siguiente aminocido que
ser agregar a la cadena. Los ribosomas bacteria-
nos tambin tienen un sitio E a travs del cual pasa
184
CAPTULO 8 Sntesis protenica
LNAt desacilado antes de su liberacin despus
.aber sido utilizado en la sntesis protenica. La
ena polipeptdica ubicada en el sitio P se transfie-
I aminoacil-RNAt del sitio A, creando un RNAt
icilado en el sitio P y un peptidil RNAt en el A.
Despus de la sntesis de los enlaces peptdicos, el
orna transfiere un codn a lo largo del RNAm,
alazando al RNAt desacilado al interior del sitio E
peptidil-RNAt del sitio A al interior del sitio P. La
islocacin es catalizada por el factor de elongacin
G y, como muchas otras etapas de la funcin del
soma
, requiere de la hidrlisis de GTP. Durante la
slocacin, el ribosoma pasa por una etapa hbrida
a cual la subunidad SOS se mueve, respecto de
ibunidad 30S.
La sntesis protenica es un proceso costoso,
.
que se utiliza ATP para proporcionar energa
numerosas etapas, incluida la carga del RNAt con
minocido y el desenrollamiento del RNAm. Se
estimado que hasta el 90% de las molculas de
'
sintetizadas en una bacteria que se desarrolla
damente es consumido en el ensamblaje de los
nocidos para formar protenas!
En cada etapa de la sntesis protenica se nece-
I factores adicionales, los cuales son definidos
su asociacin cclica con el ribosoma y por su
dacin del mismo. Los IF estn implicados en la
iacin procaritica. El IF-3 es necesario para que
Bbunidades 30S se unan al RNAm, y tambin
esponsable del mantenimiento de la subunidad
i en forma libre
. El IF-2 es necesario para que el
rt-RNAt
j
se una a la subunidad 30S y es respon-
r de excluir a otros aminoacil-RNAt de la reac-
. Je iniciacin. El GTP es hidrolizado despus
e el RNAt iniciador se ha unido al complejo de
icin. Los factores de iniciacin deben ser lbe-
os para permitir que se adhiera una subunidad
lile al complejo de iniciacin.
la iniciacin eucaritica implica un mayor n-
| de factores, algunos de los cuales estn im-
dos en la unin inicial de la subunidad 40S
xtremo 5
'
del RNAm, que posee un casquete,
I o el RNAt iniciador est unido a otro grupo de
res. Despus de esta unin inicial, la subunidad
I ra explora al RNAm hasta que reconoce al
n AUG correcto. En ese punto, son liberados
factores de iniciacin y la subunidad 60S se une
rnplejo.
Los EF procariticos tienen que ver con la elon-
b
.
El EF-Tu une el aminoacil-RNAt con el ri-
ma 70S. El GTP se hidroliza al ser liberado el
Tu. y para regenerar la forma activa del EF-Tu,
::
esita EF-Ts. El EF-G es necesario para la trans-
::
m. La unin de los factores EF-Tu y EF-G con
nbosomas es excluyente, de modo de garantizar
la conclusin de cada paso antes de que se inicie el
siguiente.
La terminacin ocurre en cualquiera de los co-
dones especiales, UAA, UAG y UGA. Los RF dase 1
que identifican especficamente a los codones de ter-
minacin activan al ribosoma para que hidrolice al
peptidil-RNAt. Un RF clase 2 es necesario para liberar
al RF clase 1 del ribosoma. Los factores de unin con
el GTP, IF-2, EF-Tu, EF-G y RF3, tienen estructuras
similares, adems de que los dos ltimos simulan la
estructura RNA-protena de los primeros dos cuando
estn unidos a RNAt. Todos se unen al mismo sitio
ribosmico, el sitio de unin al factor G.
Referencias
La iniciacin en Las bacterias requiere
de subunidades 305 y de factores accesorios
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188 CAPTULO 8 Sntesis protenica
Utilizacin del cdigo gentico
ESQUEMA DEL CAPITULO
Introduccin
Los codones relacionados representan a
aminocidos relacionados
*
Sesenta y uno de los sesenta y cuatro tripletes posibles
codifican a veintin aminocidos.
-
Tres codones no representan a aminocidos y provocan la
terminacin.
*
El cdigo gentico fue congelado en una etapa inicial de la
evolucin y es universal.
*
La mayora de los aminocidos estn representados por ms
de un codn.
"
Los codones mltiples asignados a un aminocido suelen
estar relacionados.
"
Los aminocidos relacionados con frecuencia tienen codones
relacionados, asi se minimizan los efectos de la mutacin.
EL reconocimiento codn-anticodn implica
balanceo
"
Los codones mltiples que representan al mismo aminocido
frecuentemente difieren en la posicin de la tercera base.
"
El balanceo del apareamiento entre la primera base
del anticodn y la tercera base del codn resulta de la
estructura del lazo anticodn.
Los RNAt son procesados a partir de precursores
ms largos
"
Un RNAt maduro se genera por el procesamiento de un
precursor.
"
El extremo 5' se crea por divisin mediada por la
endonucleasa RNAasa P.
"
El extremo 3' se genera por divisin seguida de recorte de
las ltimas bases y de la adicin del trinucletido terminal
comn CCA.
EL RNAt contiene bases modificadas
.
Los RNAt contienen >50 bases modificadas.
"
La modificacin implica generalmente la alteracin directa de
las bases primarias del RNAt, si bien hay algunas excepciones
en que una base es eliminada y remplazada por otra.
Las bases modificadas afectan el apareamiento
codn-anticodn
.
Las modificaciones del anticodn inciden en el patrn de
apareamiento por balanceo y por lo tanto son importantes
para la determinacin de la especificidad del RNAt.
EL cdigo universal tiene alteraciones espordicas
En el cdigo gentico universal de algunas especies han
ocurrido cambios.
fc Estos cambios son muy comunes en los genomas
mitocondriales, en los cuales puede construirse un rbol
filogentico de los cambios.
BMTil
En los genomas nucleares, los cambios son espordicos y
normalmente afectan slo a los codones de terminacin.
En ciertos codones de terminacin pueden
insertarse aminocidos nuevos
En ciertos genes pueden ocurrir cambios en la lectura de
codones especficos.
La insercin del seleno-Cis-RNAt en ciertos codones GA
implica que muchas protenas modifiquen al Cis-RNAt y lo
inserten en el ribosoma.
La pirrolisina puede ser insertada en ciertos codones UAG.
Los RNAt son cargados con aminocidos por
medio de sintetasas
Las aminoacil-RNAt sintetasas son enzimas que cargan al
RNAt con un aminocido para generar aminoacil-RNAt en
una reaccin de dos etapas que utiliza energa proveniente
del ATP.
.
Las clulas tienen 20 aminoacil-RNAt sintetasas, cada
clula porta todos los RNAt que representan a un
aminocido especifico.
.
El reconocimiento de un RNAt se basa en un pequeo
nmero de puntos de contacto en la secuencia del RNAt.
Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos
grupos
.
Las aminoacil-RNAt sintetasas se dividen en clase I y
clase II de acuerdo con su secuencia y sus similitudes
estructurales.
Las sintetasas utilizan mecanismos de correccin
para incrementar la precisin
.
La especificidad del reconocimiento del aminocido y
del RNAt es controlada por las aminoacil-RNAt sintetasas
por reacciones de correccin que invierten la reaccin
cataltica en caso de que haya sido incorporado un
componente errneo.
Los RNAt supresores tienen anticodones mutados
que leen a codones nuevos
.
Un RNAt supresor suele presentar una mutacin en el
anticodn que cambia los codones a los cuales responde.
.
Cuando el anticodn nuevo corresponde a un codn
de terminacin, se inserta un aminocido y la cadena
polipeptdica rebasa al codn de terminacin, lo cual
resulta en la supresin de una mutacin sin sentido en el
sitio de una mutacin sin sentido, o en la lectura a travs
de un codn natural de terminacin.
.
La supresin de mutaciones de sentido errneo ocurre
cuando el RNAt reconoce a un codn distinto del normal,
de manera que un aminocido es sustituido por otro.
Contina en la siguiente pgina
189
BO Hay supresores de mutaciones sin sentido para
cada codn de terminacin
.
Cada tipo de codn sin sentido es suprimido por
molculas de RNAt con anticodones mutantes.
.
Algunos RNAt supresores extraos presentan
mutaciones en otras partes de la molcula.
mtmem Los supresores pueden competir con La Lectura
de tipo silvestre del cdigo
Los RNAt supresores compiten con los RNAt de tipo
silvestre que tienen el mismo anticodn para leer el
codn o los codones correspondientes.
.
La supresin eficiente es perjudicial porque resulta en
una lectura que rebasa codones de terminacin.
.
El codn UGA es permeable y no es interpretado
correctamente por el Trp-RNAt del 1 al 3% de las
veces.
mtmvm El ribosoma influye en la precisin de la
traduccin
.
La estructura del RNAr 16S de los sitios P y A del
ribosoma influye en la exactitud de la traduccin.
MMVm La modificacin de la codificacin cambia el
significado de los codones
.
Los cambios de significado de los codones pueden
ser provocados por RNAt mutantes o por RNAt con
propiedades especiales.
.
El marco de lectura puede sufrir modificaciones por
desviacin o por cambios en la pauta de lectura que
dependen de las propiedades del RNAm.
ES9 Los cambios del marco de lectura ocurren en
las secuencias resbaladizas
.
El marco de lectura debe ser influido por la secuenci
del RNAm y por el ambiente ribosmico.
.
Las secuencias resbaladizas permiten que el RNAt se
desplace una base despus de que se ha apareado crr
su anticodn, cambiando as el marco de lectura.
.
La traduccin de algunos genes depende de la
aparicin regular de cambios programados del marco
de lectura.
K-
'
itta La evasin implica el movimiento del
ribosoma
EBl Resumen
IT1 Introduccin
La secuencia de una cadena codificadora de DNA que
se lee en direccin 5
'
a 3', est formada por triple-
tes de nucletidos (codones) que corresponden a la
secuencia de aminocidos de una protena leda del
grupo terminal N al terminal C. La secuenciacin
del DNA y las protenas permite comparar de manera
directa las secuencias correspondientes de nucleti-
dos y aminocidos. Hay 64 codones (uno de los cua-
tro nucletidos posibles puede ocupar una de las tres
posiciones del codn, es decir, 43 = 64 secuencias de
trinucletidos posibles). Cada uno de estos codones
tiene un significado especfico en la sntesis proteni-
ca, 61 codones representan a aminocidos; tres pro-
vocan la terminacin de la sntesis protenica.
El significado de un codn que representa a un
aminocido depende del RNAt que le corresponde;
el significado de los codones de terminacin es de-
terminado directamente por factores protenicos.
La descodificacin del cdigo gentico demos-
tr originalmente que la informacin gentica se
almacena en forma de tripletes de nucletidos, pero
no revel la forma en que cada codn especifica al
aminocido correspondiente. Antes de la secuen-
ciacin, las asignaciones de los codones se deducan
con base en dos tipos de estudios in vitro. En 1961
se introdujo un sistema que implicaba la traduccin
de polinucletidos sintticos, cuando Nirenberg de-
mostr que el cido poliuridlico [poli(U)] dirige el
ensamblado de la fenilalanina en la polifenilalanina,
resultado que implica que el tripleto UUU debe ser
un codn de fenilalanina. Despus se introdujo un
segundo sistema en el cual se utilizaba un trinu-
cletido para imitar a un codn, para que el ami-
noacil-RNAt correspondiente se uniera a un ribo-
soma. Al identificar el componente aminocido de!
aminoacil-RNAt, se puede encontrar el significac
del codn. Las dos tcnicas combinadas le asignare:
un significado a todos los codones que representan
a aminocidos.
Sesenta y uno de los 64 codones representan a
aminocidos, los tres restantes provocan la termi-
nacin de la sntesis protenica. La asignacin de
los aminocidos a los codones no es aleatoria, mi
bien muestra relaciones en las cuales la tercera bas |
tiene menos efecto en el significado del codn. P
otra parte, los aminocidos relacionados suelen se:
representados por codones relacionados.
1T1 Los codones relacionados
representan a aminocidos
relacionados
Conceptos principales
.
Sesenta y uno de los sesenta y cuatro tripletes posibles
codifican a veintin aminocidos.
.
Tres codones no representan a aminocidos y provocan
la terminacin.
.
El cdigo gentico fue congelado en una etapa inicial
de La evolucin y es universal.
.
La mayora de los aminocidos estn representados po-
ms de un codn.
.
Los codones mltiples asignados a un aminocido
suelen estar relacionados.
.
Los aminocidos relacionados con frecuencia tienen
codones relacionados, as se minimizan los efectos de
la mutacin.
190
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
;
digo se resume en la FIGURy . Hay ms co-
rs que aminocidos, de modo que casi todos
aminocidos estn representados por ms de un
n.
Las nicas excepciones son la metionina y el
:
rano. Los codones que tienen el mismo signifi-
se denominan sinnimos. El cdigo gentico
. ; de hecho en el RNAm, de modo que suele
:
r:birse en funcin de las cuatro bases presentes
RNA, U, C, A y G.
- is codones que representan al mismo amino-
o a aminocidos relacionados tienden a tener
: secuencia similar
.
Con frecuencia, la base de la
posicin de un codn no es significativa por-
-
- -s cuatro codones que difieren slo en la tercera
- representan al mismo aminocido. En ocasiones
- cingue slo entre una purina y una pirimidina
t?, posicin. La menor especificidad de la lti-
ms. posicin se conoce como degeneracin de la
rcera base.
la interpretacin de un codn implica el aparea-
:
-
:o de sus bases con el anticodn del aminoacil-
A: correspondiente. La reaccin ocurre dentro
ribosoma: los trinucletidos complementarios
: -os suelen ser demasiado cortos para aparearse
:
rma estable, sin embargo, la interaccin es es-
zada por el ambiente del sitio A del ribosoma.
"
smo, el apareamiento de bases entre el codn y
mncodn no es slo una cuestin de apareamien-
:
mre A-U y G-C; el ribosoma controla el ambiente
isnera que el apareamiento convencional tiene
::
r en las primeras dos posiciones del codn,
a
i
- Je que las reacciones adicionales suceden en la
:
era base. El resultado es que un solo aminoacil-
-
:
puede reconocer a ms de un codn, lo cual
rsponde al patrn de degeneracin. Por otra
-
-t. las interacciones de apareamiento tambin
ien ser influidas por la introduccin de bases
;cales en el RNAt
, sobre todo por modificaciones
anticodn o cerca de l.
la tendencia de los aminocidos similares a ser
/esentados por codones relacionados minimiza
riectos de las mutaciones, con lo cual se incre-
T--:
a la probabilidad de que el cambio aleatorio
una sola base no resulte en una sustitucin de
-:
ocido o en un cambio que involucre amino-
"
: >s de caractersticas similares
. Por ejemplo, una
:
adn de CUC a CUG no produce ningn efecto
ru ambos codones representan a la leucna, en
"
::
que una mutacin de CUU a AUU resulta en
remplazo de leucna por isoleucina,
aminocido
rchamente relacionado.
In la 1GURA 9.:. es una grfica del nmero de
dones que representan a cada aminocido frente
- fiecuencia con que el aminocido es utilizado
-=s
protenas (en E. coli). Los aminocidos ms
mimes tienden slo ligeramente a ser represen-
El cdigo gentico se lee en tripletes
Segunda base
U C A
UUU
UUCJ
UUA
UUGj
-Phe
-
Leu
UCU
UCC
UCA
UCGJ
-
Ser
UAU
UACJ
UAA"
UAG
_
-
ALTO
E
CUU
CUC
CUA
GUG_,
-Leu
ccu
GCC
OCA
CCGJ
-
Pro
CAU
CAGl
CAA
CAGJ
-
His
-
G!n
UGA
UGG
CGU
CGC
CGA
CGGJ
ALTO
Trp
-
Arg
AUU
AUC
AUA J
AUG
GU
GUG
|
gua
GUGJ
-
lie
fvlet
-
Val
ACU
ACC
ACA
ACGJ
H
'
reo
AAU
AAGJ
-
Asn
AAA"
AAGJ
-
Lis
AGU
AGCJ
AGA
AGGJ
-
Ser
-
Arg
GGU
GGG
GCA
GCGl
-
Ala
GAU'
GACJ
GAA
GAOJ
-
Asp
-
Glu
GGU"
GGG
GGA
GGG.
-
Gil
'
. To
dos los codones tienen significado; 61 represen-
tan a aminocidos y tres inducen la terminacin (ALTO).
Los aminocidos tienen de 1 a 6 codones cada uno
10
ra
c
o
8
CL
Glu
0
6
Lis c
o
Asp
-
o Gln.
'
<fi
CD
Asn
<D
a
4 Phe
Tir ,
(D
B Met
His .
c
0)
2
Gis
u
o
Trp
CL
Leu i
Ser
He
Ala
Gil
Val
.
Treo
. Pro Arg
2 3 4 5
Nmero de codones
El nmero de codones para cada aminocido no
se correlaciona estrechamente con la frecuencia de uso en las
proteinas.
tados por ms codones, de modo que no parece que
el cdigo gentico haya sido optimizado respecto del
uso de los aminocidos.
Los tres codones (UAA, UAG y UGA) que no re-
presentan a aminocidos se utilizan especficamente
para terminar la sntesis protenica. Uno de los co-
dones de terminacin marca el final de cada gen.
El cdigo gentico es el mismo en todos los
organismos vivientes?
La comparacin de las secuencias de DNA con
las secuencias protenicas correspondientes revela
que se utiliza un conjunto idntico de asignacin
5
.2 Los codones relacionados representan a aminocidos relacionados
193
de codones en el citoplasma eucaritico y en las
bacterias, de modo que el RNAm de una especie en
general puede ser traducido correctamente in vitro
o in vivo por el mecanismo de sntesis de protenas
de otra especie; por lo tanto, los codones utilizados
en el RNAm de una especie tienen el mismo signi-
ficado para los ribosomas y para los RNAt de otras
especies.
La universalidad del cdigo sugiere que debe ha-
ber sido establecido muy al principio de la evolucin,
quiz como una forma primitiva en la que un nme-
ro reducido de codones se utilizaba para representar
a un nmero comparativamente pequeo de ami-
nocidos; es posible, incluso, que un codn corres-
pondiera a cualquiera de los miembros de un grupo
de aminocidos y que el significado ms preciso de
otros codones y aminocidos adicionales hubieran
sido introducidos posteriormente. Una posibilidad es
que, al principio, slo dos de las tres bases de cada
codn se utilizaran; la discriminacin en la tercera
posicin pudo haber evolucionado despus. (Origi-
nalmente pudo haber una relacin estereoqumica
entre los aminocidos y los codones que los repre-
sentaban, la cual despus evolucion un sistema ms
complejo.)
La evolucin del cdigo pudo "congelarse" en
un punto en el que el sistema lleg a ser tan com-
plejo que cualquier cambio en el significado de los
codones hubiera deteriorado a las protenas exis-
1 ses tienen muy poco significado
uuu UCU UAU UGU
uuc UGC UAG UGC
UUA
UGA
UAA UGA
UUG
UCG
UAG UGG
CUU CCU CAU CGU
CUC CCC CAC CGC
CUA CCA
CAA
CGA
CUG CCG
CAG
CGG
AUU ACU AAU AGU
AUC ACC AAC AGG
AUA AGA
AAA AGA
AUG AGG AAG
AGG
GUU GCU GAU GGU
GUC GCC GAC GGC
GUA GCA
GAA
GGA
GUG GCG
GAG
GGG
Relacin de la tercera
base
Terceras bases
con el mismo
significado
Nmero
de
bodones
La tercera base U, C, A, G
no es pertinente U, C, A
Las purinas difieren A o G
de las pirimidinas U o C
Codones nicos Slo G
32
3
14
10
2
FIGURA 9.3 Las terceras bases influyen muy poco en el sig-
nificado de los codones. Las cajas indican grupos de codones
dentro de los cuales la degeneracin de la tercera base asegura
que el significado sea el mismo.
lentes por la sustitucin con aminocidos inacepta-
bles. Su universalidad implica que esto debi haber
ocurrido en una etapa tan temprana que todos lo
organismos vivientes descienden de un solo banco
de clulas primitivas en el que esto tuvo lugar.
Las excepciones a la universalidad del cdigi
gentico son raras. Los cambios en el significado del
genoma principal de una especie en general con-
ciernen a los codones de terminacin. Por ejempk
en los micoplasmas, el codn UGA codifica al tript-
fano; en ciertas especies de los ciliados Tetrahymena
y Paramecium, los codones UAA y UAG codifican a
la glutamina, y modificaciones sistemticas del cc-
digo slo se han presentado en el DNA mitocondril
(vase la seccin 9.7, El cdigo universal tiene alte-
raciones espordicas).
Q| EL reconocimiento codn-
anticodn involucra balanceo
Conceptos principales
Los codones mltiples que representan al mismo
aminocido frecuentemente difieren en la posicin de
la tercera base.
El balanceo del apareamiento entre la primera base
del anticodn y la tercera base del codn resulta de la
estructura del lazo anticodn.
La funcin del RNAt en la sntesis protenica se lle-
va a cabo cuando reconoce al codn en el sitio r
ribosmico. La interaccin entre el anticodn y g
codn sucede por apareamiento de bases, pero em
funcin de reglas que llevan el apareamiento ms
all de las asociaciones usuales A-U y G-C.
Las reglas que rigen la interaccin pueden de-
ducirse a partir de las secuencias de los anticodom-.
que corresponden a codones especficos. La capac:
dad de cualquier RNAt para responder a un codr
dado puede medirse directamente por la prueba de
unin a trinucletidos o utilizndolo en un sistema
de sntesis de protenas in vitro.
El cdigo gentico proporciona algunas pistar
importantes respecto del proceso del reconocimien
to de los codones. El patrn de degeneracin de j
tercera base se ilustra en la rIGURA 9.3, la cual mues-
tra que, en casi todos los casos, la tercera base es no
pertinente o slo se distingue entre purinas y pir
midinas.
Hay ocho familias de codones en las cuales |
cuatro codones que comparten las mismas primera
dos bases tienen el mismo significado, de maner,:
que la tercera base no desempea ninguna funr:
en la determinacin del aminocido. Hay siete pare
de codones en los que el significado es el misow
192
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
pendientemente de qu pirimidina est presen-
la tercera posicin, y cinco pares en los que
K presentarse cualquier purina sin cambiar al
inocido codificado.
Son slo tres los casos en que la presencia de
;
base particular en la tercera posicin confiere
;:
gnificado nico: AUG (para metionina), UGG
ra triptfano) y UGA (para terminacin), de ma-
I que la C y el U nunca tienen un significado
B en la tercera posicin, y la A nunca significa
;mjnocido nico.
El anticodn es complementario del codn; por
feto, la primera base de la secuencia del antico-
a
.
escrita convencionalmente en direccin 5' a 3',
I que se aparea con la tercera base del codn,
Bp de la misma manera (de 5' a 3'). As pues,
; mbinacin
Codn 5' A C G 3'
Anticodn 3' U G C 5'
.cribe generalmente como codn ACG/anticodn
B donde la secuencia del anticodn debe ser leda
rvs para que sea complementaria del codn.
Para evitar confusiones, se debe obedecer la
'
.vencin usual de escribir todas las secuencias
5
'
, pero marcar las secuencias anticodn con una
a dirigida en sentido inverso como recordatorio
relacin con el codn, de modo que el ante-
apareamiento codn/anticodn se escribe ACG
'
SU, respectivamente.
Cada codn triple exige su propio RNAt con
anticodn complementario, o es posible que un
At individual responda a ambos miembros de
par de codones y a los cuatro miembros (o al
feos algunos) de una familia de codones?
A menudo un RNAt puede reconocer a ms de
codn, o sea que la base que ocupa la prime-
posicin del anticodn debe ser susceptible de
Bkrse con bases alternas en la tercera posicin
respondiente del codn. El apareamiento de ba-
en esta posicin no se limita a las asociaciones
rituales G-C y A-U.
Las reglas que rigen el reconocimiento de los
Baeros se resume en la hiptesis del balan-
i
, que establece que el apareamiento entre el co-
I y el anticodn en las primeras dos posiciones
codn siempre sigue las reglas normales, pero
I en la tercera posicin se presentan "balanceos"
repcionales. El balanceo se debe a que la con-
rnacin del lazo anticodn del RNAt confiere
oibilidad a la primera base del anticodn. En la
IRA 9.4 se muestra que pueden formarse pares
adems de los normales.
Este cambio crea un patrn de apareamiento de
es en el que la A ya no puede tener un significado
m en el codn (debido a que el U que la reconoce
tambin debe reconocer a la G). De manera similar,
la C ya no tiene un significado nico (porque la G
que la reconoce tambin debe reconocer al U). En la
se resume el patrn de reconocimiento.
As pues, el reconocimiento de codones nicos
slo es posible cuando las terceras bases son G o
U
, opcin no frecuente debido a que UGG y AUG
son los nicos ejemplos del primer tipo y no hay
ninguno del segundo. (Los pares G-U son comunes
en las estructuras dplex de RNA, pero cuando slo
pueden formarse tres pares de bases, la formacin
de contactos estables entre el codn y el anticodn es
ms estrecha, o sea que los pares G-U pueden con-
tribuir slo en la ltima posicin del codn.)
FIGURA 9.4 EL balanceo en el apareamiento de bases permite
que se formen pares G-U entre La tercera base del codn y la
primera del anticodn.
La tercera base del codn se balancea
Base en la primera Bases reconocidas en ia
posicin dei anticodn tercera posicin dei codn
U A o G
C Sio G
A Slo U
G CoU
S El apareamiento codn-anticodn implica balan-
ceo en la tercera posicin.
9.
3 El reconocimiento codn-anticodn involucra balanceo 193
Los pares G-U se forman en la tercera base del codn
Los pares de bases estndar ocurren en
todas las posiciones
!_!
Citosina HC- c" "H
i il o
Azcar
0 ? >H
1 V
CH 3 H Azcar
r
#C o
Uracilo HV
| u. H
< II m C -N Acissnina
Adcar O 9 CH
Azcar
El apareamiento de balanceo entre G y U ocurre slo
en ia tercera posicin del codn
Uracilo hY y
Azcar V; u,
"
H-N "G'Nxx Guanina
1 " CH
H \zcar
Los RNAt son procesados a
partir de precursores ms Largos
Conceptos principales
Un RNAt maduro se genera por el procesamiento de un
precursor.
El extremo 5' se crea por divisin mediada por La
endonudeasa RNAasa P.
El extremo 3' se genera por divisin seguida de recorte
de las ltimas bases y de la adicin del trinucletido
terminal comn CCA.
Los RNAt se sintetizan comnmente como cadenas
precursoras con material adicional en uno o am-
bos extremos. En la FIGURA 9.6 se observa que las
secuencias adicionales son eliminadas por combi-
naciones de actividades endonucleolticas y exo-
nucleolticas. Una caracterstica comn a todos los
RNAt es que los tres nucletidos localizados en el
extremo 3
'
, siempre la secuencia triple CCA, no son
codificados en el genoma, sino agregados como par-
te del procesamiento del RNAt,
Ambos extremos del RNAt son generados
por procesamiento
El RNAt precursor tiene secuencias 5' y 3' adicionales
5
'
= = 3
'
Fndcnuoteasa
Se divide el extremo 3' 1 Se recorta el extremo 3'
3
'
3' 5
'
B
.ronucleasa
Se divide el extremo 5'
tndoiwcl easc?
(RNAasa Pj i

5
'
3
'
Se agrega CCA
s'EfflzImaa de
A adicisrr desl
5
,<
externo 3
'

FIGURA 9.6 El extremo 3' del RNAt se genera por medio de

divisin y recorte seguidos de la adicin de la secuencia CCA;
el extremo 5
'
se genera por medio de corte.
El extremo 5' del RNAt se genera por una ac
cin de divisin catalizada por la enzima ribonu
cleasa P.
Las enzimas que procesan el extremo 3' esta
mejor caracterizadas en E. coli, donde una endonu
cleasa activa la reaccin al dividir al precursor ej
flujo descendente y despus, muchas exonucleas
recortan el extremo por degradacin en direccin 3
'
5
'
.
En las eucariotas, la reaccin tambin involucra.
numerosas enzimas y genera un RNAt que necesi:.
que se agregue el trinucletido CCA al extremo 3
'
La adicin de la secuencia CCA es exclushi
mente resultado de un proceso enzimtico, en otra
palabras, la actividad enzimtica porta la especi:
cidad de la secuencia del trinucletido, que no -
determinada por un molde. Hay numerosos n:
dlos para el proceso, que puede ser diferente a
organismos distintos.
En algunos organismos, el proceso es cataliza,:
por una sola enzima. En un modelo se propone qu
una sola enzima se une al extremo 3
'
y en secuen
cia adhiere C, C y A, y que la especificidad de ca;
etapa depende de la estructura del extremo 3
'
.
E
otros modelos se propone que la enzima tiene sitio
activos diferentes para el trifosfato de citosina (CT?
cytosine triphosphate) y para el trifosfato de adenosir
(ATP, adenosine triphosphate).
En otros organismos, son otras las enzimas res
ponsables de la adicin de residuos de C y de A
funcionan en forma secuencial.
Cuando un RNAt no es procesado adecuad;
mente, atrae la atencin de un sistema de contri-
de calidad que lo degrada, con lo cual se garantiz
que el mecanismo de sntesis de protenas no s
bloqueado por molculas no funcionales de RNA
gCT EL RNAt contiene bases
modificadas
Conceptos principales
Los RNAt contienen >50 bases modificadas.
La modificacin implica generalmente la alteracin
directa de las bases primarias del RNAt, si bien hay
algunas excepciones en que una base es eliminada
y remplazada por otra.
El RNA de transferencia es nico entre los cicU
nucleicos debido a su contenido de bases
"
inusu:
les". Una base inusual es cualquier anillo de purirv
o de pirimidina diferente de los anillos normales i
A
, G, C y U a partir de los cuales se sintetizan todo
los RNA; las dems bases se producen por mod
ficacin de una de estas cuatro despus de que |
han incorporado a la cadena polirribonucleotdk;
19'i
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
Todas las clases de RNA exhiben cierto grado de
;:ncadn
, pero en todos los casos, excepto en el
se trata de eventos bastante sencillos, como
licin de grupos metilo. En el RNAt, la gama
iodificaciones es amplia, desde metilaciones
>les hasta la reestructuracin total del anillo de
pa, y en cualquier parte de la molcula; hay >50
? diferentes de bases modificadas en el RNAt.
Hn la se muestran algunas de las ba-
v.odificadas ms comunes. Las modificaciones
I pirimidinas (C y U) son menos complejas que
:
. las purinas (A y G). En la posicin 2'-0 del
de ribosa, adems de las modificaciones de las
tambin ocurren metilaciones.
Las modificaciones ms comunes de la uridina
>encillas. La metilacin en la posicin 5 crea
Snidina (T), y aunque la base es la misma que
r.cuentra comnmente en el DNA, en este caso
adherida a una ribosa y no a una desoxirribosa.
H RNA, la timina constituye una base inusual
I ada de la modificacin del U.
la dihidrouridina (D) se genera por la satura-
i de un doble enlace que modifica la estructura
anillo. La seudouridina intercambia las po-
mes de los tomos de N y de C (vase la Fig.
). En la 4-tiouridina, el azufre es sustituido
xgeno.
El nuclesido inosina suele estar en la clula
o intermediario de la ruta de biosntesis de las
as, sin embargo, no se incorpora directamente
NA, en cambio, su existencia depende de la mo-
acin de la A para crear I. Otras modificaciones
i A incluyen la adicin de grupos complejos.
Dos series complejas de nucletidos dependen
a modificacin de la G. Las bases Q, como la
uosina, tienen un anillo pentonilo adicional
rgado mediante una ligadura de NH al gru-
r
.etilo de la 7-metilguanosina, el cual puede
sportar varios grupos adicionales. Las bases Y,
la wyosina, tienen un anillo adicional fusio-
Bcon el propio anillo de purina. Ese anillo adi-
1 transporta una cadena larga de carbono a la
L tambin en este caso, se agregan ms grupos
Aferentes casos.
la reaccin de modificacin suele implicar
edificacin de bases existentes del RNAt o el
gado de grupos adicionales. Una excepcin es
ntesis de las bases Q en el RNAt, pues una en-
;
especial intercambia queuosina libre por un
:
.l de guanosina. La reaccin implica la rotura
reconstruccin de enlaces en ambos lados del
Lesido.
Los nuclesidos modificados son sintetizados
enzimas especficas modificadoras del RNAt.
.idesido original presente en cada posicin
se puede determinar comparando la secuencia del
RNAt con la de su gen o (con menos eficiencia) ais-
lando molculas precursoras que carezcan de una
o de todas las modificaciones. Las secuencias de los
precursores muestran que durante la maduracin
del RNAt se introducen diversas modificaciones en
etapas distintas.
Ciertas modificaciones son caractersticas cons-
tantes de todas las molculas de RNAt, por ejemplo
los residuos D que dan lugar al nombre del brazo D
y los residuos y que se encuentran en la secuencia
Tij/C. En el lado 3' del anticodn siempre hay una
purina modificada, aunque la variedad de modifi-
caciones es amplia.
Otras modificaciones son especficas de deter-
minados RNAt o grupos de RNAt, como las bases
de wyosina, que son caractersticas del RNAtphc de
las bacterias, las levaduras y los mamferos. Por otra
parte, hay tambin algunos patrones especficos de
cada especie.
Las numerosas enzimas modificadoras del
RNAt (-60 en las levaduras) varan enormemente
en cuanto a especificidad. En algunos casos, una
enzima acta y provoca una modificacin en par-
ticular en una sola posicin, mientras que en otros
casos, una enzima puede modificar bases en diver-
sas posiciones diana. Algunas enzimas asumen re-
acciones nicas en RNAt especficos, en tanto que
Bases normales
O
HN CH
Uridina
JIH,
f r
Citidina
NH,
La complejidad de las modificaciones
de las bases del RNAt es variable
Ribotimidina (T)
Bases modificadas
O o
n i j
HN
/
C
C HN/
C
"
HN CH
0

H c/ H
Dihidrouridina (D) ' 4-tiOridina
Seudouridina (ui)
NH NH
2
3-metilcitidina >-metilcitidina
:H
Adenosina
O
HN'
H.
;h
Guanosina
,
, . . I . N6i
sopentenladenosina
Inosina n6 metiladenosina (m6 A)
( NH-COOCHa
Y
OH H-COOCH
3
0 0 o
I Ji > > ' i )
7
-metilguanosina Queuosina (Q) Wyosina (W)
Las cuatro bases del RNAt pueden ser modificadas.
9
.5 El RNAt contiene bases modificadas 195
otras tienen un rango de molculas de sustrato. Se
desconocen las caractersticas reconocidas por las
enzimas modificadoras de RNAt
, pero probable-
mente implican la identificacin de caractersticas
estructurales en torno al sitio de modificacin; al-
gunas modificaciones requieren de la accin de ms
de una enzima.
Las bases modificadas afectan
apareamiento codn-anticodn
Concepto principal
.
Las modifcaciones del anticodn inciden en el patrn de
apareamiento por balanceo y por Lo tanto son importante:
para la determinacin de la especificidad del RNAt.
La inosina se aparea con tres bases
Citosina HY V H
N
ia i II
Azcar o
O
H
-N
XS-N
ln0S'na
i ii Vh
H
Uracilo i ii
>
Azcar
O
Azcar O- K
C
N
Inosina
HC C
>
Azcar
Adenina C' M lnosina
Azcar
Azcar
La inosina puede aparearse con U, C y A.
El apareamiento del 2-tlouracilo es restringido
Un enlace no es suficiente
H
HC C-
0
V H
*
II
Azcar S
O
II
-
..
/C n Guanina
N o \
I II CH
H
Azcar
El 2-tiouraclo se aparea nicamente con A
CH o
Azcar
i ior-aco
.H
.
c
x ,W Aden
'
ma
!CH
NAzcar
La modificacin de la 2-tiouridina restringe el
apareamiento slo a la A, pues slo puede formarse un enlace
de H con G.
El efecto ms directo de la modificacin se obser-
va en el anticodn, donde el cambio de secuenci
influye en su capacidad de aparearse con el codc
determinado as el significado del RNAt. Las modir-
caciones en cualquier otro lado, en las cercanas c
anticodn, tambin influyen en su apareamiento.
Cuando se modifican las bases del anticodr.
suelen producirse patrones de apareamiento ac
dnales, adems de los pronosticados por el ap:-
reamiento regular y con balanceo que llevan a car
las bases A, C, U y G. En la R se muestra d
uso de la inosina (I), que con frecuencia se presenta
en la primera posicin del anticodn, y que puec:
aparearse con cualquiera de las bases U, C, y A.
Esta capacidad es especialmente importante c:
los codones de isoleucina, en los cuales el tripleie
AUA codifica a la isoleucina, mientras que el coder
AUG hace lo propio con la metionina. Con las base.-
usuales no es posible reconocer a la A sola en
tercera posicin, y como resultado, cualquier RN.V
con U en la primera posicin de su anticodn tendr;
que reconocer al triplete AUG y al AUA, as que
este ltimo debe leerse junto con los AUU y AUC
problema que se resuelve por la existencia de RN.-v
con I en el anticodn.
De hecho, algunas de las combinaciones regu-
lares pronosticadas no se realizan porque alguna
bases siempre estn modificadas. Parece haber un;
prohibicin absoluta en el empleo de la A, que sue;_
convertirse en I. En la mayora de los casos, el I
localizado en la primera posicin del anticodn pas;
a ser una forma modificada cuyas propiedades de
apareamiento se han alterado.
Ciertas modificaciones crean lecturas preferen-
cales de algunos codones respecto de otros. Los aUr
ticodones con uridina-S-cido oxiactico y 5-metox;-
uridina en la primera posicin reconocen a la A y e
la G eficientemente como terceras bases del codr
.
pero la deteccin del U no es tan eficiente. Otro cas
en el que pueden tener lugar apareamientos mlti-
ples, pero preferentemente unos respecto de otros, 8
el de la serie de queuosina y sus derivados, ya que es-
tas bases de G modificadas siguen reconociendo a I
C y al U, pero se aparean ms fcilmente con el U.
Una restriccin no permitida por las reglas nor-
males se logra utilizando 2-tiouridina en el antico-
dn. En la I se muestra que su modifica-
196
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
- facilita que siga aparendose con la A, pero
que se aparee por balanceo con la G.
stas y otras relaciones de apareamiento res-
.
:in la conclusin general de que hay muchas
rr.as de construir un conjunto de molculas de
At susceptibles de reconocer los 61 codones que
-
csentan a los aminocidos. Ningn patrn espe-
:
:j predomina en un organismo dado, aunque la
r.
-
.cia de cierta ruta de modificacin puede evitar
f de algunos patrones de reconocimiento, de
;
i que una familia de codones en particular se
: le leer con molculas de RNAt con anticodones
:
rentes en organismos distintos.
Ion frecuencia, RNAt tendrn respuestas su-
-
; cestas, de tal manera que un codn en parti-
-
3r pueda ser ledo por ms de un RNAt, en cuyo
aso. podr haber diferencias en cuanto a la eficien-
i de las reacciones de reconocimiento alterno.
mo regla general, los codones que se utilizan
r.nmente tienden a ser ledos de forma ms
:
rente.) Adems de la construccin de un con-
v.o de RNAt susceptible de reconocer a todos los
.
dones, podra haber muchas molculas de RNAt
. r respondieran a los mismos codones.
los pronsticos del apareamiento por balanceo
-
ruerdan muy bien con las capacidades observadas
:
asi todos los RNAt, pero hay excepciones en las
r [os codones reconocidos por un RNAt difieren de
pronosticados por las reglas del balanceo. Dichos
:
r.os probablemente se deban a la influencia de
asses vecinas o a la conformacin del lazo anticodn
-= estructura terciaria
global del RNAt. De hecho,
mportancia de la estructura de lazo del anticodn
merente a la idea de la hiptesis del balanceo.
aislamiento de mutantes ocasionales en los que
;
r nbio de una base en alguna otra regin de la
fcula modifica la capacidad del anticodn para
;
::ocer a los codones, proporciona soporte adicio-
- a la influencia de la estructura circundante.
Dtra reaccin de apareamiento inesperada se
;
r.ifiesta por la capacidad del iniciador bacteriano,
- let-RNAt
j,
para reconocer tanto al codn AUG
~
:> al GUG. Este comportamiento errneo impli-
:
"
.a tercera base del anticodn.
3 EL cdigo universal tiene
alteraciones espordicas
nceptos principales
Er el cdigo gentico universal de algunas especies
"
an ocurrido cambios.
.
Estos cambios son muy comunes en los genomas
"
itocondriales, en los cuales puede construirse un
ibol filogentico de los cambios.
f r los genomas nucleares, los cambios son espordicos y
'
rmalmente afectan slo a los codones de terminacin.
La universalidad del cdigo gentico es impresionan-
te, pero hay excepciones que tienden a afectar a los
codones implicados en la iniciacin o la terminacin
y que resultan de la produccin (o ausencia) de los
RNAt que representan a ciertos codones. Los cambios
encontrados en los genomas principales (bacterianos
o nucleares) se resumen en la rI6URA 9.10.
Casi todos los cambios que permiten que un co-
dn represente a un aminocido afectan a los codo-
nes de terminacin:
.
En la procariota Mycoplasma capricolum, el tri-
plete UGA no se utiliza para la terminacin,
sino que codifica al triptfano (Trp). De he-
cho, es el codn Trp predominante, y la se-
cuencia UGG es utilizada con poca frecuen-
cia. Existen dos especies de Trp-RNAt que
tienen anticodones UCA (que lee a UGA y
a UGG) y CCA (que slo lee a UGG).
.
Algunos ciliados (protozoarios unicelulares)
leen a las secuencias UAA y UAG como glu-
tamina y no como seales de terminacin.
Uno de ellos, Tetrahymena thermophila, contie-
ne tres especies de RNAtG'u, de las cuales, una
reconoce a los codones usuales CAA y CAG
para glutamina; la segunda, a los tripletes
UAA y UAG (de acuerdo con la hiptesis del
balanceo), y la tercera, slo al triplete UAG.
Se supone que la especificidad restringida del
factor de liberacin eRF es un cambio poste-
rior respecto del de otras eucariotas.
.
En otro ciliado [Euplotes octacarinatus), el co-
dn UGA codifica a la cistena; slo se utiliza
el triplete UAA como codn de terminacin
y falta la secuencia UAG. El cambio en el
seales de alto y seales nulas
r
U Phe
UUC
UUA
,
UUG
LeU
UCU
UCC Ser
UCA
UCG
UAU
Tr
UAC
UAA ALTO -
> Gln
UAG
UGU
UGC
L'IS
UGA ALTO -> Trp, Cis, Sel
UGG Trp
CUU
CUC Leu
CUA
CUG Leu->Ser
CGU
CCC Pro
OCA
CCG
CAU His
CAC
CAA Gln
CAG
CGU
CGC .
CGA
Ar9
CGG Arg -> NULA
AUU
AUC lie
AUA lie -h> NULA
AUG Met
ACU
ACC Treo
ACA
ACG
AAU .
AAC
ASn
AAA , .
AAG
LlS
AGU 0
AGC
Ser
AGA Arg -> NULA
AQG Arg
GUU
GUA
Val
GUG
GCU
GCCAla
GCA
GCG
GAU A
sp
GAC
GAA
GAG Glu
GGU
GGC
GGA Gl1
GGG
FIGURA 9.10 Los cambios del cdigo gentico en los genomas bac-
terianos o nucleares eucariticos usualmente asignan aminocidos a
codones de terminacin o cambian a codn, de manera que deja de
codificar a un aminocido. Es raro un cambio de significado de un
aminocido a otro.
9
.7 El cdigo universal tiene alteraciones espordicas 197
Las mitocondrias presentan cambios en el cdigo gentico
AUA = Met
AG = Ser
UGA = Trp
Cdigo universal
4-
Alto
Vertebrados
Insectos
Moluscos
AUA = lie
Equinodermos
AAA = Asn Nematodos
AAA = Asn
Platelmintos
Mohos
AUA = Met Levaduras
CUN = Treo Plantas
FIGURA 9.11 Los cambios del cdigo gentico de las mitocon-
drias pueden rastrearse en una filogenia. El nmero mnimo de
cambios independientes se genera al suponer que los cambios
AUA=Met y AAA=Asn tuvieron lugar de manera independiente
en dos ocasiones, y que el cambio temprano AUA=Met se revir-
ti en los equinodermos.
significado del codn UGA puede lograrse
por una modificacin en el anticodn del
RNAtCis para permitirle leer a la secuencia
UGA con los codones usuales UGU y UGC
.
La nica sustitucin en la codificacin de
aminocidos ocurre en una levadura (Can-
dida), en la que el triplete CUG representa a
la serina y no a la leucina (y el triplete UAG
se utiliza como codn codificador),
Para que un codn de terminacin adquiera
una funcin codificadora se necesitan dos tipos de
cambios, un RNAt debe ser mutado para reconocer
al codn y el factor de liberacin clase I debe mutar
para que la terminacin no tenga lugar en dicho
codn.
El otro tipo comn de cambio es la prdida del
RNAt que responde a un codn, de manera que ste
ya no especifique a ningn aminocido. Lo que su-
ceda a dicho codn depender de que el factor de
terminacin evolucione para reconocerlo,
Todos estos cambios son espordicos, es decir,
parecen haber ocurrido de manera independiente en
lneas de evolucin especficas; pueden concentrar-
se en los codones de terminacin porque los cam-
bios no implican la sustitucin de un aminocido
por otro. Una vez establecido el cdigo gentico al
principio de la evolucin, cualquier cambio general
en el significado de un codn hubiera provocado
una sustitucin en todas las protenas que contu-
vieran dicho aminocido. Parece probable que el
cambio podra haber sido perjudicial cuando menos
en algunas de estas protenas, con el resultado de
una eliminacin selectiva determinante. Los usos
divergentes de los codones de terminacin tal vez
representaron su
"
captura
"
con fines de codificacin
normal. Si algunos codones de terminacin rara vez
eran utilizados, slo seran reclutados para codifica-
cin por cambios que permitieran que los RNAt los
reconocieran.
En las mitocondrias de numerosas especies tam-
bin se observan excepciones al cdigo gentico uni-
versal. En la FIGURA 9.11 se representa una filogenis
de los cambios en la cual se sugiere que hubo ur.
cdigo universal modificado en varios periodos de
la evolucin mitocondrial. El primero de ellos fue el
empleo del triplete UGA para codificar al triptfanc
que es comn en todas las mitocondrias (ajenas a
las plantas).
Algunos de estos cambios simplifican el cdig
al remplazar dos codones con significados diferente;
por un par con significado nico, entre los que se in-
cluyen los tripletes UGG y UGA (ambos representar
a Trp, en vez de que uno represente Trp y el otro, la
terminacin) y AUG y AUA (ambos Met, y no uno
Met y el otro lie).
Por qu han podido evolucionar los cambic-f
en el cdigo mitocondrial? La mitocondria sintetiza
a un nmero pequeo de protenas (-10), de modr
que el problema de la discontinuidad provocada pa
cambios de significado es mucho menos grave. Es
probable que los codones alterados no fueran mu-
utilizados en localizaciones en que las sustitucionef
de aminocidos hubieran sido nocivas. La varieda;
de cambios encontrados en las mitocondrias de dife-
rentes especies sugiere que dichos cambios han ev( -
ludonado de manera aislada y no por tr'ansmisir
de un caigo mitocondrial ancestral comn.
De acuerdo con la hiptesis del balanceo, se ne-
cesita un mnimp de 31 RNAt (excluido el iniciado:
para reconocer los 6T cocton (5iTnecesarios cuan-
do menos dos RNA de transferencia para cada fare -
lia de codones y un RNAt por cada par de codontr
o por cada codn). No obstante, cuando menos e:
las mitocondrias de los mamferos se presenta um
situacin inusual, pues slo hay 22 RNAt. Cn;
caben en este conjunto limitado de molculas de
RNAt todos los codones?
La caracterstica clave es una simplificacin de.
apareamiento codn-anticodn, de manera que un
RNAt reconoce a los cuatro miembros de una familia
de codones, con lo que se reduce a 23 el nmer.-
mnimo de molculas de RNAt necesarias para res-
ponder a todos los codones normales. El uso de los
tripletes AGA
G
para la terminacin elimina la nece-
sidad de otro RNAt y los reduce a 22.
En las ocho familias de codones, la secuencia
del RNAt contiene un U no modificado en la prime-
ra posicin del anticodn y los codones restantes se
agrupan en pares, en los cuales, los que termine.:
en pirimidinas son ledos por una G del anticodc
'
:
y todos los que terminan en purinas son ledos p
198
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
U modifcado en el anticodn, como se pronosti-
n la hiptesis del balanceo. La complicacin del
n individual UGG se evita mediante un cambio
el cdigo, de modo que los tripletes UGA y UGG
terpreten como triptfano. En los mamferos,
ecuencia AUA deja de representar a la isoleucina
lee como metionina, aunada al triplete AUG, lo
1 permite que todos los codones que no son de
amilia sean ledos como 14 pares,
As pues, los 22 genes de RNAt identificados
ifican a 14 molculas de RNAt que representan
3res, y a ocho molculas de RNAt que represen-
a familias, lo cual implica que los dos codones
terminacin usuales, UAG y UAA, adems del
de codones AGA
G
, no sean reconocidos por el
At. En las mitocondrias de los hongos aplican
as similares.
En ciertos codones
de terminacin pueden
insertarse aminocidos nuevos
nceptos principales
En ciertos genes pueden ocurrir cambios en la lectura
je codones especficos.
La insercin del seleno-Cis-RNAt en ciertos codones
JGA implica que muchas protenas modifiquen ai
I
;
s
-RNAt y lo inserten en el ribosoma.
.a pirrolisina puede ser insertada en ciertos codones
UAG.
ciertos genes ocurren cambios especficos en la
ura del cdigo. La especificidad de dichos cam-
;
implica que la lectura de un codn en particular
?ender de las bases circundantes. En dos casos
insertan aminocidos diferentes a los 20 clsicos
'
medio de aminoacil-RNAt especiales.
Un ejemplo destacado es la incorporacin del
inocido modificado selenocistena en ciertos
iones UGA localizados en los genes que codifi-
.
a selenoprotenas tanto en procariotas como
eucariotas. En general, estas protenas catalizan
reacciones oxidacin-reduccin y contienen un
I residuo de selenocistena, el cual forma parte
Rio activo. Se sabe ms sobre el uso de los co-
K UGA en tres genes de E. coli que codifican
lS isoenzimas formato deshidrogenasa. El codn
A interno es interpretado por un RNAt de se-
ocistena, reaccin inusual determinada por la
ructura secundaria local del RNAm, en particular
ra presencia de un lazo en horquilla en flujo
endent del UGA.
Las mutaciones en cuatro genes sel crean una
deficiencia en la sntesis de selenoprotenas. El gen
selC codifica a RNAt (con el anticodn ACU*-) que
se carga con serina. Los genes selA y selD permi-
ten transformar a la serina en selenocistena. SelB
es un factor alterno de elongacin; se trata de una
protena de unin a guanina que acta como factor
especfico de traduccin para la entrada del seleno-
Cis-RNAt al sitio A y, por lo tanto, proporciona un
remplazo para el factor EF-Tu (slo para este RNAt).
La secuencia de la protena SelB est relacionada
con la del EF-Tu y la del IF-2.
Por qu se inserta el seleno-Cis-RNAt slo en
ciertos codones UGA? Dichos codones van segui-
dos de una estructura tallo-lazo en el RNAm. En la
se muestra que el tallo de la misma es
reconocido por un dominio adicional de la protena
SelB (el cual no est presente en el EF-Tu ni en el
IF-2). Por un mecanismo similar se interpretan al-
gunos codones UGA en las clulas de los mamferos,
con la salvedad de que se necesitan dos protenas
para identificar los codones UGA apropiados. Una
protena (SBP2) se une a la estructura tallo-lazo en
flujo descendente, lejos del codn UGA, mientras
que la contraparte del SelB (denominada SECIS)
se une a la SBP2 y simultneamente une el RNAt
con el codn UGA.
Otro ejemplo de la insercin de un aminocido
especial es la colocacin de pirrolisina en un codn
UGA en las archaea y las bacterias a travs de un
mecanismo probablemente similar al de la insercin
del seleno-Cis-RNAt. Un RNAt inusual se carga con
Usina, el cual presumiblemente ser modificado ms
tarde. El RNAt tiene un anticodn CUA que respon-
de al triplete UAG, y debe haber otros componentes
del sistema que restrinjan su respuesta a los codones
UGA apropiados.
El selB es especfico para el seleno-Cis-RNAt
SelB EJ selB se une con
el RNAm
GA
FIGURA 9.1. SelB es un factor de elongacin que une espec-
ficamente el seleno-Cis-RNAt con el codn UGA, que va seguido
de una estructura tallo-lazo en el RNAm.
9
.
8' En ciertos codones de terminacin pueden insertarse aminocidos nuevos
Los RNAt son cargados
con aminocidos por medio
de sintetasas
Conceptos principales
.
Las aminoacil-RNAt sintetasas son enzimas que cargan
al RNAt con un aminocido para generar aminoacil-
RNAt en una reaccin de dos etapas que utiliza energa
proveniente del ATP.
.
Las clulas tienen 20 aminoacil-RNAt sintetasas, cada
clula porta todos los RNAt que representan a un
aminocido especfico.
.
El reconocimiento de un RNAt se basa en un pequeo
nmero de puntos de contacto en la secuencia del RNAt.
Bs necesario que ios RNAt tengan ciertas caracters-
ticas en comn, y que aun as, otras permitan dis-
tinguirlos uno de otro. La caracterstica clave que
confiere esta facultad, es la capacidad del RNAt para
doblarse en una estructura terciaria especfica. Los
La reaccin de carga gasta ATP
i-
Enzima
Sitio del
Sitio
aminocido
del ATP
La sintetasa
tiene 3 sitios
de unin
Sitio del RNAt
0-P=0
0-P=0
0-P=0
Adenosma
El aminocido
y el ATP forman
aminoacil-AMP
H-C-NH
0-P=0
Se une el RNAt
Adenosina
El RNAt es
cargado con
aminocido
FIGURA 9.13 Una aminoacil-RNAt sintetasa carga al RNAt con
un aminocido.
diferentes detalles de esta estructura, como el ngulc
que forman los dos brazos de la
"
L
"
o la protrusin de
bases nicas, son los que caracterizan a cada RNAt.
Todos los RNAt pueden embonar en los sitios
P y A del ribosoma, en un extremo se asocian cor.
el RNAm por el apareamiento codn-anticodn, I
en el otro, el polipptido est siendo transferido.
De manera similar, todos los RNAt (excepto el inj'
ciador) comparten la posibilidad de ser reconocidos
por los factores de traduccin (EF-Tu o eEFl) par
unirse al ribosoma. Por el contrario, el RNAt ini-
ciador es reconocido por el IF-2 o por el eIF2, de
modo que el conjunto de molculas de RNAt posee
caractersticas comunes para interactuar con los fac-
tores de elongacin, si bien es posible reconocer I
RNAt iniciador.
Los aminocidos entran a la ruta de la sntesis
protenica a travs de las aminoacil-RNAt sintetasas.
las cuales proporcionan la interfase para la conexin
con el cido nucleico. Todas las sintetasas funcionar.
por medio del mecanismo de dos pasos que se ilus-
tra en la FIGURA 9.13:
.
Primero, el aminocido reacciona con |
ATP para formar aminoacil-adenilato, libe-
rando pirofosfato. La energa necesaria para
la reaccin es proporcionada por la divisir.
del enlace de alta energa del ATP.
.
Despus, el aminocido activado es transfe-
rido al RNAt, liberndose AMP.
Las sintetasas clasifican a los RNAt y a los ami-
nocidos en sus conjuntos correspondientes. Cadi
sintetasa reconoce slo a un aminocido y a todo-
Ios RNAt que deben ser cargados con l. En gene-
ral, cada aminocido es representado por ms -de
un RNAt, y pueden necesitarse muchos RNAt par
responder a codones sinnimos; por otra parte
suele haber varias especies de RNAt que reaccio-
nan con el mismo codn. Los mltiples RNAt qt:
representan al mismo aminocido se denominar.
RNAt isoaceptores, y como la misma sintetas,:-
los reconoce a todos, tambin se definen como su,
RNAt cognados.
Mediante muchos intentos para deducir las simi-
litudes de las secuencias de los RNAt o para induc:
alteraciones qumicas que inciden en su carga se 9
demostrado que la base de reconocimiento no es U
misma para los diferentes RNAt y que no necesaria..
mente yace en alguna caracterstica de la estructura
primaria o secundaria. Gracias a la estructura crista-
lina se sabe que el tallo aceptor y el tallo anticodr
forman contactos firmes con la sintetasa y que "la;
mutaciones que influyen en el reconocimiento de
un RNAt se encuentran en estas dos regiones. _(E.
anticodn no necesariamente es reconocido come-
tal; por ejemplo, las mutaciones
"
supresoras
"
aM
se describen ms adelante en este captulo cambiar
200 CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
:
base del anticodn y, por lo tanto, a los codones
I cuales responde un RNAt, sin alterar su carga
el aminocido correspondiente.)
Un grupo de RNAt isoaceptores debe ser carga-
slo por la aminoacil-RNAt sintetasa especfica
a su aminocido, de modo que deben compartir
mas caractersticas que permitan a la enzima dis-
mirlos de los otros RNAt. Todo el complemen-
de molculas de RNAt se divide en 20 grupos
-
ceptores, y cada grupo es susceptible de identi-
r a su sintetasa particular.
Los RNAt son identificados por sus sintetasas
diante contactos que reconocen a un nmero
ucido de bases, en general, de una a cinco. Nor-
Lmente se utilizan tres tipos de caractersticas:
.
Generalmente (pero no siempre), se reco-
noce cuando menos una base del anticodn.
En ocasiones todas las posiciones del antico-
dn son importantes.
.
Con frecuencia se reconoce uno de los tres
ltimos pares de bases del tallo aceptor. Un
caso extremo lo representa el Ala-RNAt,
identificado slo por un par de bases nico
en el tallo aceptor.
.
La as llamada base discriminadora, que se
encuentra entre el tallo aceptor y el CCA
terminal, nunca vara en los RNAt isoacep-
tores.
Ninguna de estas caractersticas constituye un
dio nico para distinguir 20 conjuntos de mo-
llas de RNAt ni proporciona suficiente especi-
dad, de modo que, aparentemente, el recono-
iento de los RNAt es idiosincrsico
, y cada uno
:
e sus reglas.
Numerosas sintetasas pueden cargar de mane-
pecfica una
"
mini-hlice
"
formada slo por el
B aceptor y el T\|/ C (equivalentes a un brazo
a molcula en forma de L) con el aminocido
recto. En ciertos RNAt
, la especificidad depende
tusivamente del tallo aceptor, pero es obvio que
variaciones significativas entre los RNAt y que,
itgunos casos, la regin anticodn es importan-
Las mutaciones del anticodn pueden afectar el
nocimiento por la Phe-RNAt sintetasa clase II,
.:
eden estar implicadas muchas caractersticas;
Kni-hlices del RNAtVa' y del RNAtMeI (de los
les sabemos que el anticodn es importante in
I pueden reaccionar especficamente con sus
etasas.
As pues, el reconocimiento depende de una in-
iccin entre varios puntos de contacto del RNAt,
centrados en las extremidades, y unos cuantos
nocidos que constituyen el sitio activo de la
tena. La importancia relativa de las funciones
tallo aceptor y del anticodn difiere en cada in-
ccin RNAt-sintetasa,
Las aminoaciL-RNAt sintetasas
se clasifican en dos grupos
Concepto principal
.
Las aminoaciL-RNAt sintetasas se dividen en clase I y
clase II de acuerdo con su secuencia y sus similitudes
estructurales.
A pesar de su funcin comn, las sintetasas consti-
tuyen un grupo de protenas ms bien variado. Las
subunidades fluctan entre 40 y 110 kD, y las enzi-
mas pueden ser monomricas, dimricas o tetram-
ricas, y es raro que se parezcan. Obviamente, el sitio
activo que reconoce al RNAt comprende una parte
bastante pequea de la molcula, y es interesante
comparar los sitios activos de diferentes sintetasas.
Las sintetasas se han dividido en dos grandes
grupos, cada uno formado por 10 enzimas, con base
en la estructura del dominio que contiene al sitio
activo. En la FIGURA 9.14 se ilustra un tipo general de
organizacin aplicable a ambos grupos. El dominio
cataltico incluye a los sitios de unin con el ATP y
al aminocido, y se distingue por ser una regin ex-
tensa interrumpida por la insercin del dominio que
se une a la hlice aceptora de RNAt, lo cual coloca
al extremo del RNAt cerca del sitio cataltico. Un
dominio independiente se une a la regin antico-
dn del RNAt. Las sintetasas multimricas tambin
poseen un dominio de oligomerizacin.
Las sintetasas clase I poseen un dominio catal-
tico terminal N que se identifica por dos secuencias
cortas de aminocidos parcialmente conservadas
que en ocasiones se denominan
"
secuencias distin-
tivas". El dominio cataltico asume la forma de un
rasgo llamado pliegue de unin con el nucletido
(que tambin se encuentra en otras clases de en-
zimas que se unen a nucletidos). Dicho pliegue
El
UI|nl..:l.l.l.|l:IJMl,.IJ!!.I.I.I.M..|4
Dominio cataltico: Unin de la Unin con Formacin
j sitios del ATP y hlice aceptora anticodn del
del aminocido de RNAt del RNAt oligmero i
Pliegue nucletido (clase I) Hlice a.
o lmina [3 antiparalela (clase II) o barril p
Clase I principalmente monmeros, algunos homodmeros
Clase II principalmente homodmeros,
2 tetrmeros
FIGURA 9.14 Una aminoacil-RNAt sintetasa contiene tres o
cuatro regiones con funciones distintas. (Slo las sintetasas
multimricas poseen un dominio de oligomerizacin.)
9
.10 Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos
201
9
.
15 Las estructuras cristalinas muestran que las aminoacil-
RNAt sintetasas de clase I y II se unen a caras opuestas de sus sustratos
de RNAt. El RNAt se muestra en color rojo y la protena en color azul.
Imagen cortesa de Dio Moras, Institute of Genetics and Molecular and
Cellular Biology.
La estructura del RNAt cambia para acoplarse
con una enzima de tipo I
Se interrumpe el par
de bases U1-A72
El tallo aceptor se
encuentra en una
cavidad profunda de
la protena
El ATP se une cerca
del tallo aceptor
El lazo anticodn se
distorsiona en U35-U36
Gln-RNAt sintetasa
U1A72
FIGURA 9.1' Una RNAt sintetasa de clase I contacta al RNAt
en el surco menor del tallo aceptor y en el anticodn.
est formado por cadenas [3 paralelas y hlices a; la
secuencia distintiva forma parte del sitio de unin
con el ATP. La insercin que hace contacto con la
hlice aceptora del RNAt difiere ampliamente entre
enzimas de clase I. Los dominios terminal C de las
sintetasas clase I, que incluyen el domino de unin
con el anticodn del RNAt, y con cualquier dominio
de oligomerizacin, tambin difieren bastante uno
de otro.
Las enzimas clase 11 comparten en sus dominios
catalticos tres similitudes de secuencia bastante ge-
nerales. El sitio activo contiene una gran lmina [3
antiparalela rodeada de hlices a. Tambin en esa
caso, el dominio de unin con la hlice aceptora.
interrumpe el dominio cataltico tiene una estruc
ra que depende de la enzima individual. El donr."
de unin con el anticodn tiende a ser terminal V
La localizacin de los dominios de oligomerizacios
es muy variable.
El hecho de que aparentemente no haya un
relacin entre los dos grupos de sintetasas es na
enigma, quizs evolucionaron de manera indepeaJ
diente, incluso parece posible que existiera una fof-
ma de vida ancestral con protenas formadas sol
por los 10 aminocidos codificados por uno u oo
tipo de sintetasas.
Un modelo general de la unin de las RNAt
tetasas sugiere que la protena se acopla al RNAt ca
el
"
lado" de la molcula con forma de L, y el misir
principio general se aplica a todas las uniones de Us
RNAt sintetasas: la adhesin al RNAt tiene lugar
bre todo en sus dos extremidades, y la mayor pe-
de la secuencia del RNAt no participa en el recouoJ
cimiento por medio de una sintetasa. Sin embar.
la naturaleza detallada de la interaccin difiere e-
tre las enzimas clase I y clase II, como se obser
en los modelos de la
'
GURA 9.1'
, que se basar.
estructuras cristalinas. Ambos tipos de enzimas se
aproximan al RNAt por lados opuestos, lo cual h;
que los modelos RNAt-protena luzcan casi con
imgenes en espejo.
Una enzima clase I (Gln-RNAt sintetasa) aborda
el lado del lazo D del RNAt, reconoce el surco menee
del tallo aceptor localizado en un extremo del si:
de unin e interacta con el lazo anticodn del otr
extremo. La FIGURA 9.16 es un diagrama de la estruc-
tura cristalina del complejo RNAtGln-sintetasa. Ur:
caracterstica reveladora de la estructura es que los
contactos con la enzima cambian la estructura dr
RNAt en dos puntos importantes, que se observan
comparar las lneas punteadas y las continuas ubica-
das en el lazo anticodn y el tallo aceptor:
.
Las bases U35 y U36 del lazo anticodn se
jalan para alejarlas del RNAt, hacia el inte-
rior de la protena.
.
El extremo del tallo aceptor se distorsiona
mucho, lo cual resulta en la interrupcin del
apareamiento de bases entre Ul y A72. E
'
extremo de cadena nica del tallo se empo-
tra en una cavidad profunda de la protena
sintetasa que tambin contiene al sitio de
unin para el ATP.
Esta estructura explica porqu los cambios del
U35, la G73 y el par de bases U1-A72 afectan la
identificacin del RNAt por su sintetasa. En todas
estas posiciones se forman ligaduras de hidrgenc
entre la protena y el RNAt.
202 CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
Una enzima clase II (Asp-RNAt sintetasa) se
-
xna al RNAt por el otro lado y reconoce el lazo
-.
-
.ble y el surco mayor del tallo aceptor, como
-/astra en la FIGURA 9.17. Este ltimo conserva
conformacin helicoidal regular y el ATP proba-
mente se una cerca de la adenina terminal. En
:
ro extremo del sitio de unin hay un contacto
-::cho con el lazo anticodn, el cual muestra un
mbio de conformacin que permite que el antico-
r. est en estrecho contacto con la protena.
5J Las sintetasas utilizan
mecanismos de correccin para
incrementar la precisin
! :ncepto principal
_a especificidad deL reconocimiento del aminocido
del RNAt es controlada por las aminoacU-RNAt
ritetasas por reacciones de correccin que invierten
la reaccin cataltica en caso de que haya sido
-
corporado un componente errneo.
aminoacil-RNAt sintetasas tienen una labor di-
- pues cada sintetasa debe distinguir a uno de
r
"
:
re 20 aminocidos y diferencia a los RNAt cog-
andos (tpicamente de uno a tres) del conjunto total
-iz 100 en total).
Hay muchos aminocidos ntimamente relacio-
aados entre s, amn de que todos estn relaciona-
- - con los intermediarios metablicos de su ruta
mica particular. Es especialmente difcil distin-
.. : entre dos aminocidos que difieren slo en la
icgitud del esqueleto de carbonos (por ejemplo,
: un grupo CH.
,
).
La discriminacin intrnseca ba-
- z en las energas relativas de la unin de estos
; - aminocidos sera slo de -1/5. Las enzimas
rasas incrementan ~1 000 veces este ndice.
la discriminacin intrnseca entre RNAt es me-
.ir porque el RNAt ofrece una superficie ms am-
:
j. que provee ms contactos, pero sigue siendo
Wtao que todos se conforman a la misma estructura
:
.
-
ral, y el grupo de caractersticas que distinguen
RNAt cognados de los no cognados podra ser
ante limitado.
Podran imaginarse dos formas generales en
. - enzima selecciona a su sustrato:
.
El ciclo de admisin, escrutinio y acepta-
cin/rechazo podra representar un solo
paso de unin previo a todas las etapas res-
tantes de cualquier reaccin involucrada, lo
cual equivale a decir que la afinidad del sitio
de unin es suficiente como para controlar
la entrada del sustrato. En el caso de las sin-
tetasas, esto significara que slo los amino-
Las sintetasas clase II contactan al RNAt
en dos regiones
La cola de cadena -'-. nV
,
individual yace
"
N
profundamente V
en la protena
El lazo anticodn se
distorsiona
Asp-RNAt sintetasa
FIGURA 9.1 Una aminoacil-RNAt sintetasa clase II contacta
al RNAt en el surco mayor de la hlice aceptora y en el Lazo
anticodn.
cidos correctos y los RNAt cognados po-
dran formar una unin estable en el sitio.
.
Alternativamente, la reaccin avanza por al-
gunas de estas etapas, despus de las cuales
se decide si la especie correcta est presente;
en caso contrario, la reaccin se revierte o
se toma una ruta de evasin, y el miembro
errneo es expulsado. Este tipo de escruti-
nio posterior a la unin suele llamarse co-
rreccin. En el ejemplo de las sintetasas,
implica que la reaccin de carga proceda a
travs de ciertas etapas, incluso si hay un
RNAt o un aminocido errneos.
Las sintetasas utilizan mecanismos de correccin
para controlar el reconocimiento de ambos tipos de
sustrato, y mejoran significativamente en las dife-
rencias intrnsecas entre aminocidos o entre RNAt,
pero coincidiendo con las diferencias intrnsecas de
cada grupo, cometen ms errores al seleccionar ami-
nocidos (las tasas de error van de lO
"
a 10"5) que
al seleccionar RNAt (en cuyo caso, la tasa de error
es ~10"6) (vase laFig. 8.8). El RNA de transferencia
se une a la sintetasa mediante la reaccin ilustrada
en la FIGURA 9.18. Los RNAt cognados tienen una
mayor afinidad intrnseca por el sitio de unin, por
lo que se unen ms rpidamente y la disociacin es
ms lenta. Despus de la unin, la enzima analiza
al RNAt que se ha unido, y si es el RNAt correcto, la
unin es estabilizada por un cambio de conforma-
cin en la enzima, lo cual permite que la aminoaci-
lacin ocurra rpidamente. Si se presenta un RNAt
equivocado, no ocurre el cambio de conformacin,
la reaccin sucede mucho ms despacio y se incre-
mentan las probabilidades de que el RNAt se disocie
9
.11 Las sintetasas utilizan mecanismos de correccin para incrementar la precisin
203
La correccin cintica reduce la
incidencia de errores
El RNAt cognado
se asocia rpidamente,
se disocia lentamente
/NH2
RCH
;
co
AMP
El RNAt cognado
desencadena
un cambio de
conformacin
La aminoacilacin
sin cambio de
conformacin es lenta
La aminoacilacin
es rpida
/ RCH
El RNAt no cognado
se asocia lentamente,
se disocia rpidamente
/ NH2
RCH
/CO
AMP
.
AMP AMP
FIGURA 9.18 El reconocimiento del RNAt correcto por la sin-
tetasa se controla en dos pasos. En el primero, la enzima tiene
mayor afinidad por su RNAt cognado, y en el segundo, la ami-
noacilacin del RNAt incorrecto es muy lenta.
de la enzima antes de ser cargado. Este tipo de con-
trol se denomina correccin cintica.
La especificidad por los aminocidos vara entre
las sintetasas; algunas son muy especficas y se unen
inicialmente a un solo aminocido, mientras que
otras tambin pueden activar aminocidos estrecha-
mente relacionados con el sustrato apropiado. En
ocasiones, el aminocido anlogo puede ser conver-
tido a la forma adenilada, pero en ninguno de estos
casos se utiliza un aminocido incorrectamente ac-
tivado para formar un aminoacil-RNAt estable.
El RNAt cognado usualmente es necesario para
activar la correccin, incluso si la reaccin ocurre
en la etapa previa a la formacin del complejo ami-
noacil-adenilato. (Una excepcin es la Met-RNAt
sintetasa, que puede rechazar a complejos ami-
noacilo-adenilato no cognados incluso en ausencia
de RNAt.)
Hay dos etapas en que puede hacerse la correc-
cin de un aminoacil-adenilato incorrecto durante
Las sintetasas utilizan correccin qumica
RCH1
COOH
Adenilacin
RCH
CO
AMP
(
i
delRNAt
\ iEI aminoaci|-adeni!ato es drolizado
N
.
Aminocido
r
'
,
2 -incorrecto
ROr
w >
,
NH2
AMP RCH
AMP
Carga
del RNAt |
RCH
XOOH
El vnnoac-RNAt es hidrolizado
Aminocido
incorrecto O 'HH
$ COOH
Aminocido
correcto
AMP
RCH
yco
Aminoacil-RNAt
FIGURA 9.19 Cuando una sintetasa une al aminocido inco-
rrecto, la correccin requiere de la unin con el RNAt cognado
[a cual puede tener lugar por un cambio conformacional que
provoque la hidrlisis del. aminoacil-adenilato incorrecto o pm
medio de la transferencia del aminocido al RNAt, seguida de
hidrlisis.
la formacin del aminoacil-RNAt. En la FIGURA 9.19
se observa la aplicacin de una correccin qumi-
ca, en la cual la reaccin cataltica es invertida. Si
grado de predominio de una ruta u otra vara de
acuerdo con cada sintetasa:
.
El aminoacil-adenilato no cognado podra
hidrolizarse si se une el RNAt cognado. Ei:
este mecanismo es utilizado de manera pre
dominante por numerosas sintetasas, inclui-
das las de metionina, isoleucina y valina. (En
general, la reaccin no puede observarse b:
vivo, pero puede ser seguida por la Met-RNA
sintetasa cuando el aminocido activado
incorrectamente es la homocistena, que ca-
rece del grupo metilo de la metionina.) Ls
correccin libera una forma modificada del
aminocido, como la homocistena tiolacto-
na. De hecho, sta es producida en E. cal:
como un producto derivado de la reacciit
de carga de la Met-RNAt sintetasa, lo cual
demuestra que la correccin continua es
parte del proceso de carga de un RNAt con
su aminocido.
204 CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
.
Algunas sintetasas utilizan la correccin qu-
mica en una etapa posterior. De hecho, el
aminocido errneo es transferido al RNAt,
despus es reconocido como incorrecto por
su estructura en el sitio de unin con el
RNAt, y por lo tanto, hidrolizado y liberado.
El proceso requiere de un ciclo continuo de
ligamiento e hidrlisis hasta que se transfie-
re el aminocido correcto al RNAt.
la Ile-RNAt sintetasa de E. coli constituye un
rmplo clsico en el que la discriminacin entre
mocidos depende de la presencia de RNAt. La
rizima puede cargar valina con AMP, pero hidroli-
a I valil-adenilato cuando se agrega el RNAtll<:. La
;
de error general depende de las especificidades
.
;ada paso, como se resume en la FIGURA
;
de 1.5 x 10"5 es menor que la tasa a la cual la
-
na es sustituida por isoleucina (en la globina del
-jo), que oscila entre 2 y 5 x 10"4, por lo tanto,
arga errnea probablemente represente slo una
-
;uea fraccin de los errores que ocurren en la
-rsis protenica.
la Ile-RNAt sintetasa utiliza el tamao como
c para discriminar aminocidos. En la
muestra que tiene dos sitios activos: el sitio sint-
o de activacin) y el sitio de edicin (o hidrol-
. La estructura cristalina de la enzima muestra
r el sitio sinttico es demasiado pequeo como
permitir la entrada de la leucina (anlogo cer-
io de la isoleucina). Todos los aminocidos ms
:
des que la isoleucina son excluidos de la activa-
r. debido a que no pueden entrar al sitio sintti-
ero un aminocido que s lo logra, es colocado
7. RNAt. Despus, la enzima intenta transferirlo
itio de edicin. La isoleucina est a salvo de la
Brin porque es demasiado grande como para en-
.
'
:A sitio correspondiente. Sin embargo, la valina
:
ie entrar a ese sitio, de modo que se hidroliza
al-RNAt1'0 incorrecto. En esencia, la enzima
perdona un filtro molecular doble, en el que el
-=o del aminocido es utilizado
para discriminar
.
-
.
j especies estrechamente relacionadas.
Ina caracterstica interesante de la Ile-RNAt
:
-
:
asa es que los sitios sinttico y de edicin estn
Iderablemente separados, -34 . Una estructu-
rristalina de la enzima que forma un complejo
n un anlogo editado de isoleucina muestra que
v
-inocido es transportado del sitio sinttico al
fdicin. En la ><rohserva que esto
>ca un cambio en la conformacin del RNAt. El
I aceptor del aminocido del RNAtII,: puede pre-
nse en conformaciones alternas, por ejemplo,
ipia una estructura de horquilla inusual para ser
bacilado por un aminocido en el sitio sinttico
i -pus recupera la estructura helicoidal ms co-
cn para mover el aminocido al sitio de edicin.
Daso
Los errores se controlan en cada etapa
Frecuencia de errores
Activacin de valina
a Val-AMP
lle
Liberacin de Val-RNAt
Tasa global de error
1/225
1/270
1/225x 1/270 =1/60 000
La precisin de La carga del RNAtIle por medio de
su sintetasa depende del control de los errores en dos etapas.
El modelo de doble filtro utiliza dos sitios activos
El sitio de edicin es ms pequeo que el sinttico
/ Sitio sinttico B NSitio de edicin
La Leu es muy grande para entrar al sitio sinttico
,_a lie entra en el sitio sinttico pero no en e) de edicin
La Val pasa del sitio sinttico al de edicin
La Ile-RNAt sintetasa tiene dos sitios activos.
Los aminocidos ms grandes que la leucina no pueden ser ac-
tivados debido a que no embonan en el sitio sinttico, en tanto
que los ms pequeos son eliminados porque son susceptibles
de entrar al sitio de edicin.
La conformacin del RIMAt controla el uso
Extremo de horquilla alterno Extremo helicoidal usual
Sitio de edicin
34A|
Sitio sinttico
Un aminocido es transportado del sitio sint-
tico al de edicin de la Ile-RNAt sintetasa por un cambio en la
conformacin del tallo aceptor del aminocido del RNAt.
9.11 Las sintetasas utilizan mecanismos de correccin para incrementar la precisin 205
La translocacin entre sitios es el paso que limita la
velocidad de la correccin. La Ile-RNAt sintetasa es
una sintetasa de clase I, sin embargo, el mecanismo
de doble filtro tambin es utilizado por las sintetasas
clase II.
Los RNAt supresores tienen
anticodones mutados que Leen
a codones nuevos
Conceptos principales
.
Un RNAt supresor suele presentar una mutacin en
el anticodn que cambia los codones a los cuales
responde.
.
Cuando el anticodn nuevo corresponde a un codn
de terminacin, se inserta un aminocido y la cadena
polipeptdica rebasa al codn de terminacin, lo cual
resulta en la supresin de una mutacin sin sentido en
el sitio de una mutacin sin sentido, o en la lectura a
travs de un codn natural de terminacin.
.
La supresin de mutaciones de sentido errneo ocurre
cuando el RNAt reconoce a un codn distinto del
normal, de manera que un aminocido es sustituido
por otro.
El aislamiento de los RNAt mutantes ha sido una
de las herramientas ms potentes para analizar la
capacidad de un RNAt para responder a sus codo-
nes en el RNAm y para determinar los efectos que
tienen diferentes partes de la molcula de RNAt en
el reconocimiento codn-anticodn.
Los RNAt mutantes se aislan por su capacidad
para superar los efectos de las mutaciones en genes
codificadores de protenas. En terminologa gentica
general, una mutacin susceptible de superar los
efectos de otra se denomina supresora.
En los sistemas de RNAt supresores, la muta-
cin primaria transforma un codn de un RNAm
de manera que el producto protenico deja de ser
funcional. La mutacin supresora secundaria cam-
bia el anticodn de un RNAt, de tal forma que ste
reconoce al codn mutante en lugar de (o tambin)
a su codn diana original. El aminocido que se
inserta ahora restaura la funcin de la protena.
Los supresores se describen como supresores de
mutaciones sin sentido o supresores de mu-
taciones de sentido errneo, dependiendo de la
naturaleza de la mutacin original.
En una clula de tipo silvestre, una mutacin
sin sentido es reconocida slo por un factor de li-
beracin que termina la sntesis protenica. La mu-
tacin supresora crea un aminoacil-RNAt capaz de
reconocer al codn de terminacin, y por medio
de la insercin de un aminocido, permite que la
El RNAt supresor reconoce a un codn sin sentido
Tipo silvestre:El codn UUG es ledo por el Leu-RNAt
AUG UUG UAA
AAG
Leu-
Leu
Muante sin sentido: termina el codn AG
AUG UAG UAA
Fabte-de
liberacin
\
Mutacin supresora: cambia al anticodn del Tir-RNAt
AUG
Mutacin del RNAt
UAC UAG
AUG AUC /T
Tir
UAO UAA
AUC
Tir
Las mutaciones sin sentido pueden ser suprir .
das por un RNAt con un anticodn mutante, el cual inserta
aminocido en el codn mutante, de modo que se produce ir
protena de longitud total en la cual el residuo de Leu origrj
ha sido remplazado por Tir.
sntesis protenica rebase el sitio de la mutacin sir
sentido. Esta nueva capacidad del sistema de tradt:;
cin permite que se sinteticen protenas de longit..
completa, como se ilustra en la i GURA 9.:' . En ca-
de que el aminocido insertado por supresin s:
diferente del que estaba originalmente en ese sitia
de la protena de tipo silvestre, la actividad de _
protena puede ser modificada.
Las mutaciones de sentido errneo transfonru-
a un codn que representa a un aminocido en
codn que representa a otro que no pueda funciona
en la protena en lugar del residuo original. (Fu
malmente, cualquier sustitucin de aminociM
constituye una mutacin de sentido errneo, pe-
en la prctica se detectada slo si altera la actividai
de la protena.) La mutacin puede ser suprimaJ
por la insercin del aminocido original o de alg_
otro que sea aceptable para la protena.
En la GURA se demuestra que la supresig
de una mutacin de sentido errneo puede logr:-
206 CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
de la misma manera que la supresin de una
Litacin sin sentido, mutando el anticodn de un
At que porta a un aminocido aceptable de ma-
r que responda al codn muante. Por lo tanto,
supresin de una mutacin de sentido errneo
plica un cambio en el significado del codn de
i aminocido a otro.
3 Hay supresores de mutaciones
sin sentido para cada codn
de terminacin
"
iiceptos principales
Cada tipo de codn sin sentido es suprimido por
molculas de RNAt con anticodones motantes.
Algunos RNAt supresores extraos presentan
mutaciones en otras partes de la molcula.
os supresores de mutaciones sin sentido se enca-
lan en tres clases, una por cada tipo de codn de
frminacin. En la FIGURA se describen las pro-
.
edades de algunos de los supresores mejor carac-
-Lzados.
Los ms fciles de caracterizar han sido los su-
cesores mbar. En E. coli se han mutado cuando
senos seis RNAt para reconocer a los codones UAG.
bdos los RNAt supresores mbar tienen el antico-
.
d CUA*- y derivan del tipo silvestre por un solo
nbio de base. El sitio de la mutacin puede ser
alquiera de las tres bases del anticodn, como se
fcserva en supD, supE y supF. Cada RNAt supresor
conoce slo al codn UAG, no a sus codones an-
rriores. Los aminocidos insertados son serina
, glu-
nina o tirosina, los mismos que portan los RNAt
e ripo silvestre correspondientes.
Los supresores ocre tambin surgen por mu-
sciones del anticodn; los que mejor se conocen
on supC y supG, que insertan tirosina o Usina en
espuesta a los codones ocre (UAA) o a los mbar
L
'
AG), fenmeno que concuerda con el pronstico
r la hiptesis del balanceo de que un triplete UAA
_
rio, no es susceptible de ser reconocido.
Un supresor UGA tiene una propiedad ines-
erada, es un derivado del RNAtTrp
, pero su nica
: .
-
acin consiste en la sustitucin de una A y no
una G en la posicin 24. Con este cambio se rem-
bza un par G-U por un par A-U en el tallo D, de
i io que se incrementa la estabilidad de la hlice.
i ecuencia del anticodn se mantiene igual que
Bel tipo silvestre, CCA*-. Por lo tanto, las mutacio-
es del tallo D deben, de alguna manera,
alterar la
rformacin del lazo anticodn al permitir que el
plele CCA*- se apare con el UGA en un balanceo
sual que permite el apareamiento entre C y A.
Los supresores de mutaciones de sentido errneo
de tipo sil
Tipo silvestre: el codn GGA es ledo por el Gli-RNAt
AUG UAA
rVft ftft fifrft i i
Sentido errneo: el triplete AGA es ledo por el Arg-RNAt
AUG GA UAA
Sup resin: el triplete AGA es ledo por el Gli-RNAt mutante
AUG
Mutacin del RNAt
CCU UCU
GA
CU
UAA
dVfo fgrforfoft dfr,
La supresin de una mutacin de sentido errneo
ocurre cuando el anticodn del RNAt es mutado de tal manera
que responde al codn incorrecto. La supresin es solamente
parcial porque tanto el RNAt de tipo silvestre como el RNAt
supresor pueden responder al triplete AGA.
Los supresores tienen mutaciones
en los anticodones
Lcus RNAt Tipo silvestre Supresor
Codn/aotf Aoi/codn
supD (sul)
Ser UCG CGA GUA UAG
supE (su2)
Gln CAG CUG OJA UAG
supF (su3)
Tir
uaS
GUA ClA UAG
supC (su4)
Tir
uaS GUA UA
UA
supG (su5)
Lis
AAq
UUU UU
UAC3
supU (su7) Trp
UGG OCA CA
UG
FIGURA 9.25 Los RNAt supresores de mutaciones sin sentido
son generados por mutaciones en el anticodn.
9
,13 Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada codn de terminacin
207
El RNAt supresor sigue reconociendo a su codn
usual, UGG.
En un RNAt eucaritico se observa una respues-
ta similar. El hgado bovino contiene un RNAt5" con
el anticodn "'CCA . Las reglas del balanceo pro-
nostican que este RNAt debe responder al codn de
triptofano UGG, pero de hecho responde al codn
de terminacin UGA, de modo que es posible que
el triplete UGA sea suprimido de forma natural en
esta situacin.
La importancia general de estas observaciones
yace en la demostracin de que el reconocimiento
codn-anticodn del RNAt silvestre o del RNAt mu-
lante no es pronosticable completamente a partir
de las secuencias de los tripletes pertinentes, sino
que tambin depende de otras caractersticas de la
molcula.
Los supresores pueden
competir con La Lectura de tipo
silvestre deL cdigo
Conceptos principales
Los RNAt supresores compiten con Los RNAt de tipo
silvestre que tienen el mismo anticodn para Leer eL
codn o Los codones correspondientes,
La supresin eficiente es perjudicial porque resulta en
una Lectura que rebasa codones de terminacin.
EL codn UGA es permeable y no es interpretado correc-
tamente por eL Trp-RNAt del 1 al 3% de las veces.
La supresin de una mutacin sin sentido
rovoca una ultralectura
Traduccin de tipo silvestre
AUG
El factor de liberacin
termina la sntesis en un
codn de terminacin
UAG UAA
C
J
Supresin mbar
AUG
El RNAt supresor lee el
codn UAG y la protena
se extiende al codn de Tit
terminacin
UAG
AUC
UAA
Factor de
iberacion
FIGURA 9.26 Los supresores de mutaciones sin sentido tam-
bin leen a travs de los codones de terminacin, sintetizando
asi proteinas ms largas que las de tipo silvestre.
Hay una diferencia interesante entre el reconoci-
miento usual de un codn por el aminoacil-RNAt
apropiado y la situacin en la cual la mutacin per-
mite que un RNAt supresor reconozca a un codn
nuevo. En una clula de tipo silvestre slo puede
atribursele un significado a un codn determinado.
el cual representa a un aminocido particular o a una
seal de terminacin. Sin embargo, en una clula
que porta una mutacin supresora, el codn mutante
tiene la alternativa de ser reconocido por el RNAt
supresor o de ser ledo con su significado usual.
Un RNAt supresor de mutaciones sin sentidc
debe competir con los factores de liberacin que
reconocen al codn o a los codones de termina-
cin. Un RNAt supresor de mutaciones de sentido
errneo debe competir con los RNAt que respon-
den adecuadamente a su nuevo codn. La exten-
sin de la competencia influye en la eficiencia de la
supresin, de modo que la efectividad de un supre-
sor particular depende no slo de la afinidad entr
su anticodn y el codn diana, sino tambin de <u
concentracin en la clula y de los parmetros q\>
rigen las reacciones competitivas de terminacin
de insercin.
La eficiencia con la que se lee cualquier codcr
en particular depende de su localizacin, de mod :
que la extensin de la supresin de una mutacic
sin sentido por un RNAt dado puede variar amplia'
mente, segn el contexto del codn. Se desconoce -
efecto de las bases vecinas del RNAm en el recon -
cimiento codn-anticodn, pero el contexto puede
cambiar la frecuencia con que un codn es recon _
cido por un RNAt especfico en ms de un orden de
magnitud. El efecto de la base que se encuentra m
el lado 3
'
de un codn parece ser particularmen-
contundente.
Un supresor de mutaciones sin sentido es s:
lado por su capacidad para responder a un cod'
mutante sin sentido. Pero el mismo triplete cons:
tuye una de las seales de terminacin de la clula!
El RNAt mutante que suprime una mutacin s.'
sentido debe, en principio, ser capaz de suprir
la terminacin natural en el extremo de cualqtiia
gen que utilice dicho codn. En la
muestra que esta ulraleciHra del codn de ,
minacin natural resulta en la sntesis de una
tena ms larga, con material terminal C adiciorial
La protena ampliada terminar en la siguiente 5
cuencia de terminacin que se encuentre en la f
del marco de lectura. Cualquier supresin exte:;.
de la terminacin probablemente sea perjudir
para la clula porque se han producido proter
ampliadas cuyas funciones han sido modificadas
Los supresores mbar tienden a ser relat*
mente eficientes, en general funcionan a tasa?. I
10% a 50%, dependiendo del sistema. Esta efil
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
3 es posible porque los codones mbar se utilizan
dativamente con poca frecuencia para terminar ia
ntesis protenica de E. coli.
Los supresores ocre son difciles de aislar, siem-
'
e son mucho menos eficientes, su actividad suele
:
ar por debajo del 10%. El crecimiento de todos
s supresores ocre es deficiente, lo cual indica que
supresin de los tripletes UAA y UAG es daina
:
ra E. coli, probablemente debido a que el codn
zre se utiliza con mayor frecuencia como seal de
xminacin natural.
El triplete UGA es el menos eficiente de los co-
snes de terminacin en su funcin natural; el Trp-
NAt lo interpreta de manera errnea con una fre-
:
encia de 1 a 3% en situaciones de tipo silvestre,
Ero a pesar de esta deficiencia, se utiliza con mayor
ecuencia que el triplete mbar para terminar a los
rites bacterianos.
El supresor de mutaciones de cambio de senti-
de un gen tiende a ser el mutador de otro gen.
supresor corrige una mutacin al sustituir a un
Tiinocido por otro en el sitio mutante. No obs-
:rte
,
en otras ubicaciones, la misma sustitucin
mplazar al aminocido de tipo silvestre por un
Binocido nuevo. El cambio puede inhibir la fu-
n protenica normal.
Esto plantea un dilema a la clula, pues debe
:
primir a un codn mutante en una localizacin
n cambiar mucho su significado normal en otras
calizaciones. As pues, ia ausencia de poderosos
ipresores de mutaciones de cambio de sentido se
plica por los efectos dainos que causara una
tetitucin general y eficiente de aminocidos.
Una mutacin que crea un RNAt supresor pue-
tener dos consecuencias. Primero, permite que
RNAt reconozca a un codn nuevo, y segundo,
I ocasiones impide que el RNAt reconozca a los
dones a los cuales responda previamente. Es sig-
iiicativo que todos los supresores mbar de gran
Sciencia sean derivados de la mutacin de una co-
de un conjunto de RNAt redundante. En estos
bos, la clula tiene numerosos RNAt susceptibles
r responder al codn originalmente reconocido
f el RNAt de tipo silvestre, de modo que la mu-
rin no elimina el reconocimiento de los codones
uiguos, los cuales siguen producidos adecuada-
iente por los RNAt del conjunto. En una situacin
usual en la que slo hay un RNAt que responde
un codn en particular, cualquier mutacin que
-
pida la respuesta es letal.
Muy a menudo, la supresin se analiza en el
ntexto de una mutacin que cambia la lectu-
:
de un codn, pero hay situaciones en que un
xin de terminacin se lee como aminocido de
aja frecuencia en la situacin de tipo silvestre. El
mer caso descubierto fue el del gen de la prote-
na de la cubierta del fago de RNA Q|3. La formacin
de partculas Qp ineficientes implica que el codn de
terminacin ubicado en el extremo de ese gen sea su-
primido a baja frecuencia para generar una pequea
proporcin de protenas de cubierta con una exten-
sin terminal C. En efecto, este codn de terminacin
es permeable, y la razn es que el Trp-RNAt reconoce
al codn a baja frecuencia.
La ultralectura de los codones de terminacin
tambin ocurre en las eucariotas, donde los virus
de RNA son los que la utilizan con ms frecuencia,
fenmeno que puede implicar la supresin de los tri-
pletes UAG/UAA por el Tir-RNAt, el Gln-RNAt o el
Leu-RNAt, o bien la supresin del triplete UGA por
Trp-RNAt o Arg-RNAt. La extensin de la supresin
parcial la dicta el contexto circundante del codn.
CTH EL ribosoma influye en La
precisin de La traduccin
Concepto principal
.
La estructura del RNAr 16S en los sitios P y A del
ribosoma influye en la exactitud de la traduccin.
La falta de una variacin detectable cuando se ana-
liza la secuencia de una protena demuestra que la
sntesis protenica debe ser extremadamente precisa.
Muy pocos errores son aparentes en forma de susti-
tuciones de un aminocido por otro. Hay dos etapas
generales en la sntesis protenica en las cuales pue-
den cometerse errores (vase la Fig. 8.8, seccin 8.3,
La precisin de la sntesis protenica es controlada
por mecanismos especiales):
.
No hay duda de que cargar a un RNAt slo
con su aminocido correcto es important-
simo, lo cual es una de las funciones de la
aminoacil-RNAt sintetasa. La tasa de error
probablemente vara en funcin de la enzi-
ma especfica, pero en general, se producen
errores en <1/105 aminoacilaciones.
.
La especificidad del reconocimiento codn-
anticodn es crucial, pero desconcertante.
Aunque las constantes de unin varan se-
gn la reaccin codn-anticodn, la espe-
cificidad siempre es demasiado baja como
para proporcionar una tasa de error <10"5.
Cuando se encuentran libres en solucin,
los RNAt se unen a sus codones muy d-
bilmente. Los tripletes relacionados, pero
errneos (con dos de tres bases correctas),
son reconocidos de 10"1 a 10"2 veces ms
eficientemente que los correctos.
As pues, el apareamiento de bases codn-anti-
codn parece ser un punto dbil en la exactitud de
9
.15 El ribosoma influye en la precisin de la traduccin
la traduccin. El ribosoma tiene una funcin impor-
tante en el control de la especificidad de esta reac-
cin, funciona de manera directa o indirecta como
un
"
corrector
"
para distinguir entre apareamientos
codn-anticodn correctos e incorrectos
,
de modo
que la diferencia intrnseca bastante modesta se am-
pla ~1 000 veces. Adems de la funcin del ribo-
soma, los factores que ponen a los aminoacil-RNAt
y a los RNAt iniciadores en el ribosoma tambin
pueden influir en la reaccin de apareamiento.
Debe haber algunos mecanismos para estabi-
lizar al aminoacil-RNAt correcto y permitir que su
aminocido sea aceptado como sustrato para reci-
bir a la cadena polipeptdica; los contactos con un
aminoacil-RNAt incorrecto deben romperse rpida-
mente, de manera que el complejo salga sin reac-
cionar. Supngase que no hay especificidad en la
colisin inicial entre el complejo aminoacil-RNAt-
El RNAt correcto interacta con el RNAr
R N A r
RNAm
Interaccin
Un RNAt incorrecto sale del sitio A
Un aminoacil-RNAt puede ser colocado en el sitio
A (por el EF-Tu), pero slo uno que se apare con el anticodn
puede hacer contactos estabilizadores con el RNAr. En ausen-
cia de estos contactos, el aminoacil-RNAt se difunde fuera del
sitio A.
EF-Tu-GTP y el ribosoma. Si cualquier complejo.
independientemente de su RNAt, puede entrar al
sitio A, el nmero de entradas incorrectas debe ex-
ceder por mucho el de entradas correctas.
Hay dos modelos bsicos que explican cmo el
ribosoma discrimina entre aminoacil-RNAt aparea-
dos correcta o incorrectamente. La situacin actual
incorpora elementos de ambos modelos.
.
El modelo de reconocimiento directo supone
que la estructura del ribosoma est diseada
para reconocer a los aminoacil-RNAt apa-
reados de forma correcta, lo cual significa-
ra que el apareamiento correcto resulta en
algn cambio pequeo en la conformacin
del aminoacil-RNAt, que puede reconocer
al ribosoma. La discriminacin ocurre ante
de cualquier reaccin posterior.
.
El modelo de la correccin cintica propone
que hay cuando menos dos etapas en el pro-
ceso, de manera que el aminoacil-RNAt tiene
mltiples oportunidades para disgregarse. Un
aminoacil-RNAt apareado incorrectamente
puede pasar a travs de algunas etapas de 19
reaccin antes de ser rechazado. En princi-
pio, la selectividad global puede ser producto
de las selectividades de cada etapa.
La FIGURA es un diagrama de lo que sucede
a los aminoacil-RNAt apareados de manera correcta
e incorrecta. Un aminoacil-RNAt apareado de forma
correcta es susceptible de establecer contactos esta-
bilizadores con el RNAr, en tanto que el incorrecta-
mente apareado no forma dichos contactos y, por k
tanto, puede difundirse fuera del sitio A.
La ruta del descubrimiento de estas interac-
ciones comenz con investigaciones de los efecto?
de la estreptomicina, un antibitico, en la dcada
de 1960. Dicho frmaco impide la sntesis prote-
nica al unirse al RNAr 16S e inhibir la capacidac
del EF-G para catalizar la translocadn. Asimismo
incrementa el nivel de lecturas errneas de las piri-
midinas U y C (una suele ser confundida con la otrs
y, en ocasiones, con A). La protena S12, cuya se-
cuencia ha sido modificada en mutantes resistentes
influye en el sitio en que acta la estreptomicina
Los ribosomas con una protena S12 derivada de-
bacterias resistentes muestra una reduccin en el
nivel de lecturas errneas respecto de los riboso-
mas de tipo silvestre, pues efectivamente, la Si;
controla el nivel de lecturas errneas, y cuando J
mulada para disminuirlas, suprime el efecto de i
estreptomicina.
La S12 estabiliza la estructura del RNAr 16S er.
la regin que se une a la estreptomicina. Lo impor-
tante aqu es que la regin de los sitios Py A influye en
la precisin de la traduccin, que puede ser ms o menc:
precisa al cambiar la estructura del RNAr 16S. La com-
210
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
acin de los efectos de la protena S12 y de la
'
eptomicina en la estructura del RNAr explica el
"
.portamiento de mutantes diferentes de la SI2,
.nos de los cuales incluso hacen al ribosoma de-
iente de la estreptomicina para realizar la tra-
dn correcta.
Por la estructura cristalina del ribosoma ahora
emos que el RNAx 16S se encuentra en posicin
i formar contactos con el aminoacil-RNAt. Dos
es del RNAr 16S pueden hacer contacto con el
co menor de la hlice formada por el aparea-
nto entre el anticodn del RNAt y las dos pri-
ras bases del codn del RNAm
,
lo cual estabiliza
ctamente la estructura cuando se forman los
-
actos correctos codn-anticodn en las prime-
ios posiciones del codn, pero no monitorea a
contactos de la tercera posicin.
La estabilizacin de los aminoacil-RNAt correcta-
nte apareados puede tener dos efectos. Al mante-
el aminoacil-RNAt en el sitio A, se evita que esca-
ntes de la siguiente etapa de la sntesis protenica.
amblo conformacional del RNAr puede ayudar a
var la siguiente etapa de la reaccin, que consiste
a hidrlisis de GTP por medio de EF-Tu.
Una parte del efecto de correccin depende del
'
:
po. Un aminoacil-RNAt ubicado en el sitio A
de, en efecto
, quedar atrapado si la siguiente
M de la sntesis protenica ocurre mientras se
uentra ah, de modo que un retraso entre la en-
la al sitio A y la transferencia del grupo peptidilo
de incrementar la posibilidad de disociacin de
Rnoacil-RNAt apareado de forma incorrecta, lo
J ocurre con mayor rapidez que en el aminoacil-
At apareado de forma correcta, probablemente
Bees
, de modo que su oportunidad para escapar
ncrementa cuando disminuye la velocidad de la
de transferencia del pptido,
Se supone que la especieidad de la decodifica-
-
reside en el ribosoma, pero resultados recientes
ieren que los factores de traduccin influyen en
troceso en los sitios P y A. Un indicio de que el
Tu est implicado en la conservacin del marco
lectura son los mutantes del factor que suprime
cambios de este ltimo
, lo cual implica que el
Tu no simplemente transporta aminoacil-RNAt
Kb A, sino que tambin est involucrado en el
:donamiento del aminoacil-RNAt entrante res-
:
o del peptidil-RNAt del sitio P.
Un caso sobresaliente en el cual los factores in-
ren en el signieado es la iniciacin. La mutacin
codn de iniciacin AUG a UUG en el gen HIS4
ias levaduras evita la iniciacin, pero puede ser
las mutaciones supresoras extragnicas permi-
que se inicie la sntesis protenica en el codn
tante UUG. Se ha demostrado que dos de estos
cesores se encuentran en los genes que codifican
a las subunidades a y p del eIF2, factor que une al
Met-RNAt. con el sitio P. La mutacin del eIFp2 resi-
de en una parte de la protena que casi seguramente
se relaciona con la unin del cido nucleico, parece
probable que su diana sea la secuencia de iniciacin
del RNAm como tal o la asociacin de apareamiento
de bases entre el codn del RNAmy el anticodn del
Met-RNAt, lo cual sugiere que el eIF2 participa en
la discriminacin de los codones de iniciacin y en
el transporte del RNAt iniciador al sitio P.
El costo de la sntesis protenica en cuanto a
enlaces de alta energa puede incrementarse por los
procesos de correccin. Una pregunta importante
en el clculo del costo de la sntesis protenica es en
qu etapa se toma la decisin de aceptar al RNAt.
Si inmediatamente se toma la decisin de liberar
un complejo aminoacil-RNAt-EF-Tu-GTP, hay poco
costo extra por rechazar el gran nmero de RNAt
incorrectos que (estadsticamente) tienden a en-
trar al sitio A antes de que el RNAt sea reconocido.
Sin embargo, si el GTP es hidrolizado antes de que
se disocie el aminoacil-RNAt apareado de manera
errnea, el costo ser mayor. Un aminoacil-RNAt
apareado errneamente puede ser rechazado antes
o despus de la divisin del GTP, aunque an no
sabemos dnde, en promedio, es rechazado. Hay
evidencias de que el uso de GTP in vivo es mayor que
el de los tres enlaces de alta energa utilizados en la
adicin de cada aminocido (correcto) a la cadena.
La modificacin
de La codificacin cambia
eL significado de Los codones
Conceptos principales
.
Los cambios de significado de los codones pueden
ser provocados por RNAt mutantes o por RNAt con
propiedades especiales.
.
El marco de Lectura puede sufrir modificaciones por
desviacin o por cambios en La pauta de Lectura que
dependen de Las propiedades del RNAm.
El marco de lectura de un mensajero suele ser in-
variable. La traduccin empieza en un codn AUG
y contina en tripletes hasta un codn de termi-
nacin. La lectura no nota el sentido; la insercin
o delecin de una base provoca una mutacin de
cambio de marco, en la cual la fase de lectura va
ms all del sitio de la mutacin. Los ribosomas y
los RNAt siguen inevitablemente en tripletes,
sin-
tetizando una serie de aminocidos completamente
diferente.
Hay algunas excepciones al patrn usual de
traduccin que permiten que un marco de lectu-
9.
16 La modificacin de la codificacin cambia el significado de los codones
211
Los RNAt mulantes o especiales
La supresin es provocada por ei anticodn mutado
Los cambios del marco de lectura pueden
NNNNNUGANNNNNNNNNN
Factor especial + RNAt reconocen al codn
Sel-Cis-
_ NN
NN
NN
NN
NNNNNUGANNNNNNNNNN
I Una mutacin en un RNAt individual (usualmen-
te en el anticodn) puede suprimir el significado normal de
ese codn. En un caso especial, un RNAt especfico se une a
un factor de elongacin inusual para reconocer a un codn de
terminacin adyacente a un lazo de horquilla,
ra con algn tipo de interrupcin, como un codn
sin sentido o un cambio en el marco de lectura,
sea traducido en un protena de longitud total. Los
eventos de recodificacin son responsables de las
excepciones a las reglas usuales e involucran a cier-
to tipo de eventos.
El cambio del significado de un solo codn per-
mite que un aminocido sea sustituido por otro o
que un aminocido se inserte en un codn de ter-
minacin. En la se muestra que estos
cambios se basan en las propiedades del RNAt indi-
vidual que responde al codn:
.
La supresin implica el reconocimiento
de un codn por un RNAt (mutante) que
usualmente respondera a un codn dife-
rente (vase la seccin 9.12, Los RNAt su-
presores tienen anticodones mutados que
leen a codones nuevos).
.
La redefinicin del significado de un codn
ocurre cuando se modifica un aminoacil-
RNAt (vase la seccin 9.8, En ciertos co-
dones de terminacin pueden insertarse
aminocidos nuevos).
Los cambios del marco de lectura ocurren en
dos tipos de situaciones:
.
Los cambios del marco de lectura tpicamen-
te implican permutaciones en la fase de lec-
tura cuando el aminoacil-RNAt se desliza
una base, hacia delante +1 o hacia atrs -1
(vase la siguiente seccin. Los cambios del
marco de lectura ocurren en las secuencias
resbaladizas). El resultado que se muestra
en la Fl k 9.2i es que la traduccin rebasa
al codn de terminacin.
Cambio del marco de lectura -1 en el
retrovlrus VIH
NNNNUUUUU GNNNNNNNN
Ultimo codn ledo en la fase de lectura inicial
Primer codn ledo en la nueva fase de lectura
Lectura sin cambio en la fase de lectura
NNNNUUUUU GNNNNNNNN
Lectura despus del cambio del
marco de lectura
NNNNUUUUU 1 GNNNNNNNN
9 Un RNAt que se desliza una base en el apare
miento con un codn provoca un cambio en el marco de lectu
que suprime la terminacin. La eficiencia suele ser de ~50/c.
La evasin brinca entre codones idnticos
Evasin de 60 nucletldos en el gen 60 del fago T4
GAUGGAl C AUUGGAUUA
ltimo codn del marco de lectura original
Primer codn del nuevo marco de lectura
Lectura sin cambio del marco de lectura
GAUGGAUGAC AUUGGAUUA
Lectura despus del cambio del marco de lectura
GAUGGAUGAC AUUGGA'HHI
0 La evasin ocurre cuando el ribosoma se I
plaza a lo largo del RNAm, de manera que el peptidil-R
'
.
localizado en el sitio P es liberado del apareamiento co-
codn y posteriormente repara con otro codn localizado -
adelante en la cadena.
La evasin implica un movimiento del ri:
soma para cambiar al codn apareado c
el peptidil-RNAt que se localiza en el sitio
La secuencia entre los dos codones no p
de ser representada en una protena. Ce
se muestra en la 1GURA 9.30, esta situad
permite que la traduccin vaya ms all
cualquier codn de terminacin localiza
en la regin intermedia.
212
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
Los cambios deL marco
de Lectura ocurren
en Las secuencias resbaLadizas
Iriceptos principales
El marco de Lectura debe ser influido por la secuencia
nel RNAm y por el ambiente ribosmico.
tas secuencias resbaLadizas permiten que el RNAt se
desplace una base despus de que se ha apareado con
su anticodn, cambiando as el marco de lectura.
_a traduccin de algunos genes depende de La aparicin
-
egular de cambios programados del marco de lectura.
;?.mbio del marco de lectura se relaciona con mo-
Jilas de RNAt especficas en dos circunstancias:
.
Algunos RNAt supresores mutantes recono-
cen a un
"
codn
"
por cuatro bases y no por
las tres usuales.
.
Ciertas secuencias "resbaladizas" permiten
que el RNAt se mueva una base hacia ade-
lante o hacia atrs del RNAm en el sitio A.
Las mutaciones de cambio del marco de lectu-
resultan de la insercin o delecin de una base,
pueden ser suprimidas al restaurar el marco de
ctura original compensando deleciones e inser-
tes de bases en un gen (vase la seccin 2.8, El
iigo gentico se lee en tripletes). Sin embargo, los
resores de los cambios del marco de lectura ex-
ijnicos tambin pueden encontrarse en forma de
olculas de RNAt con propiedades aberrantes.
El tipo ms sencillo de supresor de cambios del
;:
co de lectura externo corrige la fase de lectura
indo se ha provocado una mutacin por la in-
Tdn de una base adicional en un fragmento de
>!duos idnticos, por ejemplo, una G puede ser
sertada en una serie de muchas bases G contiguas.
supresor de cambio del marco de lectura es un
AtGli que tiene una base extra insertada en su lazo
:icodn, convirtiendo al anticodn de la secuen-
- triplete usual CCC en la secuencia cudruple
ICC . El RNAt supresor reconoce a un "codn"
cuatro bases.
Algunos supresores de los cambios del marco de
::
ura pueden reconocer a ms de un
"
codn
"
cuatro bases, por ejemplo, un supresor RNAtLis
cteriano puede responder a las secuencias AAAA
AAAU, y no al codn usual AAA. Otro supresor
jde leer cualquier
"
codn
"
de cuatro bases con
IC en las tres primeras posiciones; la siguiente
e no es pertinente. En estos casos, las bases al-
nas aceptables en la cuarta posicin del
"
codn
"
s largo no estn relacionadas con las reglas de ba-
:
ceo normales. El RNAt supresor probablemente
ronoce a un codn de tres bases, pero por alguna
El cambio del marco de lectura controla la traduccin
Polpptido-Le
AU
CUAGGC
El Arg-RNAt reconoce al triplete AGC
Contina la lectura normal
Modos alternos de traduccin resultan en Tya o Tya-Tyb
Protena Tya
Iniciacin Terminacin
tya . u.
Iniciacin Camb0 del Terminacin
marco de lectura
Fusin protenica Tya-Tyb
En ausencia de Arg-RNAt, el Leu-RNAt se desliza una
base, Gli-RNAt reconoce al triplete GGC
(3AU
CUUAGGC
&
CUUAGGC
(CG
FIGURA 9.31 Para La expresin del gen tyb del elemento Ty de
Las Levaduras se necesita un cambio +1 del marco de lectura, el
cual tiene lugar en una secuencia de siete bases en la que dos
codones de Leu van seguidos de un codn de Arg escaso.
razn, probablemente obstaculizacin espacial, la
base adyacente est bloqueada, lo cual fuerza a pa-
sar por alto una base antes de que el siguiente RNAt
pueda encontrar un codn.
Las situaciones en que el cambio de marco de
lectura es un evento normal se presentan en fagos
y virus, y pueden afectar la continuacin o termina-
cin de la sntesis protenica, adems de ser resulta-
do de las propiedades intrnsecas del RNAm,
En los retrovirus, la traduccin del primer gen
es terminada por un codn sin sentido en fase con
el marco de lectura. El segundo gen se encuentra
en un marco de lectura diferente, y (en algunos vi-
rus) se traduce por un cambio del marco de lectura
que modifica una segunda fase de lectura y, por lo
tanto, evade al codn de terminacin (vase la Fig.
9
.29 e incluso la seccin 22.3, Los genes retrovricos
codifican a poliprotenas). La eficiencia del cambio
de marco de lectura es baja, habitualmente -5%;
de hecho, este hallazgo es importante en la biologa
del virus, un incremento en la eficiencia puede ser
daino. En la FIGURA 9.31 se ilustra la situacin si-
milar del elemento Ty de las levaduras, en el cual el
codn de terminacin del gen tya debe ser evadido
por un cambio del marco de lectura para leer al gen
tyb subsecuente.
9
.
17 Los cambios del marco de Lectura ocurren en las secuencias resbaladizas 213
Dicha situacin aclara porqu la rara (pero pre-
decible) ocurrencia de eventos de "lectura errnea"
puede basarse en un paso necesario de la traduccin
natural, llamada cambio programado del marco
de lectura, que ocurre en sitios especficos a fre-
cuencias 100 a 1 000 veces ms altas que la tasa a la
cual se presentan errores en sitios no programados
(
~3 x lO
-
5
por codn).
Hay dos caractersticas comunes en este tipo de
cambio del marco de lectura:
.
Una secuencia "resbaladiza" permite que
un aminoacil-RNAt se apare con su codn
y que despus se desplace +1 base (poco
frecuente) o -1 base (ms frecuente) para
aparearse con una secuencia triplete super-
puesta que tambin puede aparearse con su
anticodn.
.
El ribosoma se demora en el sitio del cambio
de marco de lectura de modo de dar tiem-
po a que el aminoacil-RNAt reestructure su
apareamiento. Las causas de la demora pue-
den ser un codn adyacente que necesita
un aminoacil-RNAt que escasea; un codn
de terminacin que tarda en ser reconocido
por su factor de liberacin, o un impedi-
mento estructural del RNAm (por ejemplo,
un
"
seudonudo
"
, conformacin particular
del RNA) que obstaculiza al ribosoma.
GAUGGAUGAC AUUGGAUUA
/
Despegue
El ribosoma se
desplaza a lo largo
de RNAm
GAUGGAU GAO AUUGGAUUA
Aterrizaje
El peptidil-RNAt se aparea
nuevamente con un codn nuevo
FIGURA 9.32 En el modo de evasin, un ribosoma cuyo sitio
P est ocupado, puede detener la traduccin si se desliza a Lo
largo del RNAm hasta un sitio en donde el peptidil-RNAt se
aparee con un codn nuevo en el sitio P. Se reanuda la sntesis
protenica.
Los eventos de deslizamiento suelen implicar
movimiento en cualquier direccin; se provoca un
cambio del marco de lectura -1 cuando el RNAt se
desplaza hacia atrs, y al contrario, un cambio del
marco de lectura +1 cuando se mueve hacia delante.
En cualquier caso, el resultado es la exposicin de
un triple fuera de fase en el sitio A para el siguiente
aminoacil-RNAt. El evento del cambio de marco de
lectura ocurre antes de la sntesis del enlace pep-
tdico, muy comnmente, cuando es activado por
una secuencia resbaladiza aunada a una horquilla
de flujo descendente del RNAm y las secuencias cir-
cundantes influyen en su eficiencia.
El cambio de marco de lectura de la Figura 9.31
muestra el comportamiento de una secuencia res-
baladiza tpica. La secuencia CUUAGGC de siete
nucletidos suele ser reconocida por el Leu-RNAt
en el codn CUU y despus por el Arg-RNAt en el
triplete AGG. Sin embargo, el Arg-RNAt es escaso, y
cuando la escasez resulta en retraso
,
el Leu-RNAt se
desliza del codn CUU al triplete superpuesto UUA
para provocar un cambio en el marco de lectura, de-
bido a que el siguiente triplete en fase como el nue-
vo apareamiento (GGC) es ledo por el Gli-RNAt.
Normalmente, el deslizamiento ocurre en el sitio P
(cuando el Leu-RNAt de hecho se ha convertido en
peptidil-RNAt y porta la cadena naciente).
El cambio de marco de lectura en un codn de
terminacin da lugar a la ultralectura de la protena.
La base que se localiza en el lado 3' del codn de
terminacin influye en las frecuencias relativas
de terminacin y en los cambios de marco, y por lo
tanto
,
en la eficiencia de la seal de terminacin.
lo cual facilita la explicacin de la importancia del
contexto en la terminacin.
Ijg La evasin impLica
eL movimiento del ribosoma
Ciertas secuencias desencadenan un evento de eva-
sin, en el que un ribosoma detiene la traduccin,
se desliza a lo largo del RNAm con el peptidil-RNAt
en el sitio P y posteriormente reanuda la traduccin
(vase la Figura 9.30), pero es un fenmeno bastan-
te raro, slo se han autentificado ~3 ejemplos. El
ejemplo de evasin ms impactante se observa en
el gen 60 del fago T4, donde el ribosoma se desplaza
sesenta nucletidos a lo largo del RNAm.
La clave del sistema de evasin son los codones
idnticos (o sinnimos) en ambos extremos de la
secuencia evadida. En ocasiones se les denomina
sitios de
"
despegue" y de "aterrizaje". Antes de la
evasin, el ribosoma se posiciona con un peptidil-
RNAt apareado con el codn de "despegue", en el
sitio P, con un sitio A vaco en espera de la entrada
214
CAPTULO 9 Utilizacin del cdigo gentico
- r. aminoacil-RNAt. En la -IGURA se muestra
.
: rl ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm
-
::a condicin hasta que el peptidil-RNAt puede
::
5rse con el codn del sitio de aterrizaje. Una
acterstica sobresaliente del sistema es su gran
r eacia
, -50 por ciento.
la secuencia del RNAm desencadena la evasin.
:
.= ractersticas im
portantes son los dos codones
.
-
.
para el despegue y el aterrizaje, el espacio en-
-
dios, una estructura tallo-lazo que incluye al
:
. r. de despegue y el codn de terminacin adya-
:
i a l; adems est involucrada la protena que
rr.i sintetizando.
"
ira la etapa de despegue se necesita el desapa-
.
ento del peptidil-RNAt de su codn, seguido de
:;
vimiento del RNAm que evita que se aparee
saes mente. Despus, el ribosoma explora al RNAm
i :ue el peptidil-RNAt puede aparearse de nue-
:. n el codn en la reaccin de aterrizaje, seguido
:
eanudacin de la sntesis protcnica cuando el
~
-
"
. racil-RNAt entra al sitio en la forma usual.
Igual que en el cambio del marco de lectura,
:;
:dn de evasin depende de que el ribosoma
3 una pausa. La probabilidad de que el peptidil-
-
.: se disocie de su codn en el sitio P se incre-
: 12 con la demora de la entrada del aminoacil-
al sitio A. La escasez de aminocidos puede
:r.
cadenar la evasin en los genes bacterianos
;
o al retraso provocado porque no hay ami-
Bt-RNAt disponible para entrar al sitio A. Una
"
. n de la estructura del RNAm en el gen 60 del
74 puede ser la reduccin de la eficiencia de la
"
r.
acin, que da lugar al retraso necesario para
-
;
-
:
dn de despegue.
Resumen
:r
.iencia del RNAm leda en tripletes 5
'
-
>3
'
se
cacona por medio del cdigo gentico con una se-
na de aminocidos de una protena leda de la
"
-
"
.al N ala terminal C. De los 64 tripletes,
61 co-
fcan aminocidos y tres proporcionan seales de
-r acin. Los codones sinnimos que represen-
: los mismos aminocidos estn relacionados,
mudo por un cambio en la tercera base del co-
r.
Esta degeneracin de la tercera base, acoplada
;
airn en el cual los aminocidos relacionados
:
rn a ser codificados por codones relacionados,
armiza los efectos de las mutaciones. El cdigo
cco es universal y debe haber sido establecido
"
.
emprano en la evolucin. Los cambios de los
aotnas nucleares son raros
, pero han ocurrido al-
. Jurante la evolucin mitocondrial.
'
.
luchos RNAt pueden responder a un codn en
r: rular. El conjunto de molculas de RNAt que
responde a los varios codones de cada aminocido
es distintivo de cada organismo. El reconocimiento
codn-anticodn implica un balanceo en la prime-
ra posicin del anticodn (tercera del codn) que
permite que algunos RNAt reconozcan a varios co-
dones. Todos los RNAt tienen bases modificadas,
introducidas stas por enzimas que reconocen a las
bases diana de la estructura del RNAt. El aparea-
miento codn-anticodn depende de modificaciones
del codn mismo y tambin del contexto de las ba-
ses adyacentes, en especial del lado 3
'
del anticodn.
Aprovechando el balanceo codn-anticodn, las mi-
tocondrias de los vertebrados utilizan slo 22 RNAt
para reconocer a todos los codones, a diferencia del
mnimo usual de 31 molculas de RNAt; en esto
colaboran los cambios del cdigo mitocondrial.
Cada aminocido es reconocido por una ami-
noacil-RNAt sintetasa especfica, que tambin
reconoce a todos los RNAt que codifican a dicho
aminocido. Las aminoacil-RNAt sintetasas tienen
una funcin correctora que explora los productos
de aminoacil-RNAt e hidroliza las molculas unidas
de manera incorrecta.
Las aminoacil-RNAt sintetasas varan amplia-
mente, pero se clasifican en dos grupos generales
segn la estructura del dominio cataltico. Las sin-
tetasas de cada grupo se unen lateralmente al RNAt,
formando contactos principalmente con las extre-
midades del tallo aceptor y con el tallo-lazo antico-
dn, y lo hacen por lados opuestos. La importancia
relativa del tallo aceptor y la regin anticodn para
el reconocimiento especfico vara en funcin de
cada RNAt.
Las mutaciones pueden permitir que un RNAt
lea codones diferentes; la forma ms comn de di-
chas mutaciones ocurre en el anticodn. La altera-
cin de su especificidad puede permitir que el RNAt
suprima una mutacin de un gen codificador de
una protena. Un RNAt que reconoce a un codn
de terminacin es un supresor de cambio de sentido,
y el que cambia al aminocido que corresponde a
un codn, es un supresor de sentido errneo. Los
supresores de los codones UAG y UGA son ms efi-
cientes que los de UAA, lo cual se explica porque
el UAA es el codn de terminacin natural ms
comnmente utilizado. La eficiencia de todos los
supresores, sin embargo, depende del contexto del
codn diana individual.
Los cambios del marco de lectura de tipo +1
pueden ser provocados por RNAt aberrantes que
leen a "codones" de cuatro bases. Los cambios del
marco de lectura +1 o -1 pueden ser provocados por
secuencias resbaladizas localizadas en el RNAm, las
cuales permiten que un peptidil-RNAt se deslice de
su codn a una secuencia superpuesta que tambin
9.19 Resumen 215
puede aparearse con su anticodn. Este cambio del
marco de lectura tambin requiere de otra secuen-
cia que hace que el ribosoma se retrase. Los cambios
del marco de lectura determinados por la secuencia
del RNAm pueden ser necesarios para la expresin
de genes naturales. La evasin ocurre cuando un
ribosoma detiene la traduccin y se desplaza a lo
largo del RNAm con su peptidil-RNAt en el sitio P,
hasta que ste se aparea con un codn apropiado;
posteriormente se reanuda la traduccin.
Referencias
Introduccin
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Las bases modificadas afectan el apareamiento
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216
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Referencias
10
Localizacin de las protenas
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
EL desplazamiento a travs de una membrana
requiere de un mecanismo especial
*
Las protenas atraviesan las membranas por estructuras
protenicas especializadas insertadas en la membrana.
.
Los sustratos protenicos interactan directamente con
el sistema de transporte del ER, las mitocondrias o los
cloroplastos, pero requieren de protenas acarreadoras para
interactuar con los peroxisomas.
Para el transporte dentro del ncleo es necesario un
mecanismo mucho ms grande y complejo.
La translocacin de las protenas puede ser
posterior a la traduccin o durante sta
.
Las protenas que son importadas al interior de los
organelos citoplsmicos se sintetizan en los ribosomas
libres del citosol.
.
Las protenas que son importadas al interior del sistema
ER-Golgi se sintetizan en los ribosomas que estn
asociados al ER.
.
Las protenas se asocian con las membranas por medio
de secuencias de aminocidos esperficas denominadas
secuencias de seal.
*
Las secuencias de seal con mayor frecuencia son lderes
Localizados en la terminal N.
. Las secuencias de seal terminal N usualmente son
separadas de la protena durante el proceso de insercin.
Los chaperones pueden ser necesarios para el
plegamiento de las protenas
.
Se dice que las protenas que pueden adquirir su
conformacin de manera espontnea se autoensamblan.
.
Con frecuencia, las protenas pueden ensamblarse en
estructuras alternas.
.
Un chapern dirige a una protena a una ruta particular al
excluir rutas alternas.
*
Los chaperones evitan la formacin de estructuras
incorrectas al interactuar con protenas no plegadas para
impedir que se plieguen de manera incorrecta.
Las protenas desnaturalizadas y las sintetizadas
recientemente necesitan chaperones
"
Los chaperones actan en protenas recin sintetizadas,
en protenas que atraviesan membranas o en protenas que
han sido desnaturalizadas.
*
La Hsp70 y algunas protenas relacionadas constituyen
una clase mayor de chaperones que actan en numerosas
protenas diana.
.
Las chaperoninas del grupo I y del grupo II son ensambles
oligomricos extensos que actan en protenas diana a las
cuales secuestran en cavidades internas.
.
La protena Hsp90 es un chapern especializado que acta
en protenas de rutas de transduccin de seal.
KiWM La familia Hsp70 es ubicua
.
Los miembros de la familia Hsp70 se encuentran en el
citosol, el ER, las mitocondrias y los cloroplastos.
.
La protena Hsp70 es un chapern que acta en protenas
diana aunada a los chaperones DnaJ y GrpE.
mima Las secuencias de seal inician la translocacin
.
Las protenas se asocian con el sistema del ER slo dugj H
la traduccin.
.
La secuencia de seal del sustrato protenico es
responsable de la asociacin con la membrana.
Mfcl La secuencia de seal interacta con la SRP
.
La secuenda de seal se une a la SRP (partcula de
reconocimiento de seal).
.
La unin seal-SRP provoca la interrupcin de la sntesis
protenica.
.
La sntesis protenica se reinicia cuando la SRP se une al
receptor de la SRP en la membrana.
.
La secuencia de seal es separada de la protena de
translocacin por la peptidasa seal localizada en la cara
"
interna" de la membrana.
!.' La SRP interacta con el receptor de SRP
-
La SRP es un complejo formado por RNA 7S y seis
protenas.
.
El equivalente bacteriano de la SRP es un complejo fomac;
por RNA 4.5S y dos protenas.
.
El receptor de la SRP es un dimero.
.
La hidrlisis de GTP libera a la SRP de su receptor despus
de su interaccin.
mmii El traslocn forma un poro
.
El complejo trimrico Sec61 proporciona el canal para que
pasen protenas a travs de una membrana.
.
Una protena transferente pasa directamente del ribosoma
al traslocn sin exponerse al citosol.
IPim La translocacin requiere de insercin en el
traslocn y (en ocasiones) de un trinquete en el EF
.
El ribosoma, la SRP y el receptor de la SRP bastan para
insertar una protena naciente en un traslocn.
.
Las protenas que se insertan despus de la traduccin
requieren de componentes adicionales en el citosol y del
BiP en el ER.
218
i El BiP es un trinquete que evita que una protena se
deslice hacia atrs.
~
5 -a translocacin inversa enva protenas al
citosol para que sean degradadas
.
Los traslocones Sec61 pueden utilizarse para la
translocacin inversa de protenas del ER al citosol.
_as proteinas residen en las membranas por
medio de regiones hidrfobas
.
Las protenas del grupo I tienen al grupo terminal N
en el extremo distante de la membrana y las del grupo
11 presentan una orientacin opuesta.
.
Algunas protenas tienen mltiples dominios
transmembrana.
Las secuencias de anclaje determinan la
orientacin de las protenas
.
Una secuencia de anclaje detiene el paso de una
proteina a travs del traslocn. Habitualmente esta
secuencia se localiza en el extremo C y resulta en una
orientacin de grupo I en la cual el extremo N ha
pasado a travs de la membrana.
.
Para insertar a una protena en la membrana y anclar
el sitio de insercin puede utilizarse una secuencia
combinada ancla-seal. Tpicamente, esto es interno
y resulta en una orientacin de grupo II en la cual el
extremo N es citoslico.
Cmo se insertan Las protenas en las
membranas?
.
La transferencia de los dominios transmembrana del
traslocn al interior de la bicapa de lpdos es activada
por la interaccin de la regin transmembrana con el
traslocn.
La insercin en la membrana despus de la
traduccin depende de las secuencias lder
.
Las secuencias lder termnales N proporcionan la
informacin que permite a las protenas asociarse
con las membranas de las mtocondrias o de los
doroplastos.
Una jerarqua de secuencias determina la
localizacin dentro de los organelos
.
La porcin terminal N de una secuencia lder dirige a
una protena a la matriz mitocondnal o al lumen del
cloroplasto.
.
Una secuencia adyacente puede controlar la direccin
a una membrana o a los espacios intermembranosos.
.
Las secuencias son divididas sucesivamente de la
protena.
inma La membrana mitocondrial interna y la externa
tienen traslocones distintos
.
El transporte a travs de las membranas mitocondriales
interna y externa utiliza diferentes complejos de
receptores.
.
El complejo TOM (membrana exterior) es un complejo
grande en el que los sustratos protenicos son dirigidos
al canal Tom40 por uno de dos subcomplejos.
.
Los diferentes complejos TIM (membrana interna) se
utilizan dependiendo de que el sustrato protenco est
dirigido a la membrana interna o al lumen.
.
Las protenas pasan directamente del complejo TOM al
complejo TIM.
inma Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema
de translocacin
.
Las protenas son importadas al interior de los
peroxisomas en su estado de plegamento completo.
.
Tienen una secuencia PTS1 en el extremo C o una
secuencia PTS2 en el extremo N.
.
El receptor Pex5p se une a la secuencia PTS1 y el
Pex7p a la PTS2.
.
Los receptores son protenas del citosol que
transbordan al interior del peroxisoma portando un
sustrato protenico y despus regresan al citosol.
miwii Las bacterias utilizan tanto translocacin
cotraduccional como translocacin
postraduccional
.
Las proteinas bacterianas exportadas a las
membranas o a travs de ellas utilizan mecanismos
postraduccionales y cotraduccionales.
Himi El sistema Sec transporta protenas al interior
de la membrana interna y a travs de ella
.
El traslocn bacteriano SecYEG de la membrana interna
est relacionado con el traslocn eucaritico Sec61.
.
En la orientacin de las protenas secretadas al
traslocn estn implicados varios traslocones.
EEEi Sistemas de translocacin independientes de
Sec en Escherchia coli
.
E. coli y los organelos tienen sistemas de translocacin
protenica relacionados.
.
Un sistema permite que ciertas protenas se inserten
en las membranas sin un mecanismo de translocacin.
YidC es homlogo al sistema mitocondrial para
transferir protenas al interior de la membrana interna.
.
El sistema tat transfiere protenas con un elemento de
arginina doble al espacio periplsmico.
wwei Resumen
CAPTULO 10 Localizacin de Las protenas 219
gm Introduccin
Las protenas son sintetizadas en dos tipos de loca-
ciones:
.
La vasta mayora de las protenas es sinteti-
zada por los ribosomas en el citosol.
.
Una pequea minora se sintetiza en los or-
ganelos (mitocondrias o cloroplastos).
Las protenas sintetizadas en el citosol pueden
dividirse en dos clases generales segn su localiza-
cin, las que no estn asociadas con las membranas
y las asociadas con ellas. En la GURA 10. se ilustra
la clula en funcin de los destinos finales probables
de una protena recin sintetizada y los sistemas que
la transportan.
.
Las protenas citoslicas (o "solubles") no se
encuentran en ningn organelo en particu-
lar, se sintetizan en el citosol y permanecen
Las protenas son ubicadas mediante
"'
Protena secretada
Protena de la membrana
plasmtica
Transporte de vescula
revestida
Seal de retencin del
aparato de Golgi
Protenas
Seal citoslicas
mitocondrial
Ribosomas libres
Seal nuclear
Seal de retencin
o-; .ER
Ribosomas
"
membranosos'
'
Transporte postraduccional Transporte cotraducclonal
FIGURA 10.1 Sinopsis; las protenas localizadas de forma postraduccio-
nal son liberadas en el citosol despus de ser sintetizadas en los ribo-
somas libres. Algunas tienen seales de asignacin a organelos como el
ncleo o como las mitocondrias. Las protenas as localizadas se asocian
con la membrana del ER durante la sntesis, de modo que sus ribosomas
estn
"
unidos a la membrana
"
. Las protenas pasan al interior del retculo
endoplsmico a un lado del aparato de Golgi y despus a travs de la
membrana plasmtica, a menos que posean seales para ser retenidas
en alguna de las etapas de la ruta. Incluso pueden ser dirigidas a otros
organelos, como los endosomas o los lisosomas.
ah, donde funcionan como centros catal-
ticos individuales, actuando sobre metabo-
litos que se encuentran en solucin en el
citosol.
Las estructuras macromoleculares pueden
localizarse en sitios especficos del citoplas-
ma; por ejemplo, los centrolos estn asocia-
dos con las regiones que se convierten en los
polos del huso mittico.
Las protenas nucleares deben ser transpor-j
tadas de su sitio de sntesis en el citosol, a
travs de la envoltura nuclear, al interior del
ncleo.
La mayora de las protenas localizadas en
los organelos citoplsmicos se sintetizan
en el citosol y se transportan especficamente
a la membrana del organelo y a travs de
ella, por ejemplo, a las mitocondrias, los pe-
roxisomas o los cloroplastos (en las clulas
de las plantas). (Las protenas que se sinteti-
zan dentro del organelo permanecen en l.)
El citoplasma contiene una serie de cuerpos
membranosos, incluidos retculo endopls-
mico (ER, endoplasmic reticulum), aparato de
Golgi, endosomas y lisosomas. En ocasiones,
a este conjunto se le conoce como
"
sistema
reticuloendotelial
"
. Las protenas dentro de
estos compartimientos se insertan en las
membranas del ER y luego son dirigidas a
sus localizaciones particulares por el sistema
de transporte del aparato de Golgi.
Las protenas que son secretadas a partir de
la clula son transportadas a la membrana
plasmtica y despus deben pasar a travs
de ella, hacia el exterior. Su sntesis empieza
de la misma manera que la de las protenas
asociadas con el sistema reticuloendotelial,
pero pasan completamente a travs del sis-
tema en lugar de detenerse en algn punto
particular dentro de l.
EL despLazamiento a travs
de una membrana requiere
de un mecanismo especial
Conceptos principales
Las protenas atraviesan las membranas por estructuras
protenicas especializadas insertadas en la membrana.
Los sustratos protenicos interactan directamente con
el sistema de transporte del ER, las mitocondrias o los
cloroplastos, pero requieren de protenas acarreadoras
para interactuar cor tos peroxisomas.
Para el transporte dentro del ncleo es necesario un
mecanismo mucho ms grande y complejo.
220
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
-
roceso de insercin de una protena en la mem-
5 ia o el paso a travs de ella se denomina transi-
acin protenica. El mismo dilema debe resolverse
-
ra cada situacin en la que una protena atraviesa
"
a membrana. La superficie de la protena es hi-
, u'lica, pero la membrana es hidrfoba, y como
agua y el aceite, ambos componentes preferiran
mezclarse
, de modo que la solucin es crear una
nictura especial en la membrana para que pase
rotena. Hay tres tipos diferentes de distribucin
-
i dichas estructuras.
El retculo endoplsmico, las mitocondrias y
. doroplastos contienen estructuras protenicas
..
astadas en sus membranas que permiten que
protenas pasen a travs de ellas sin entrar en
"
tacto con los lpidos hidrfobos circundantes. En
se muestra que un sustrato protenico
ne directamente a la estructura, es transportado
'
elia al otro lado y posteriormente, liberado.
Los peroxisomas tambin cuentan con dichas
cturas en sus membranas, pero los sustratos
protenas no se unen directamente a ellas. En
se observa que ms bien se unen a
:
enas transportadoras localizadas en el citosol,
:
jales son acarreadas por el canal al interior del
leroxisoma y, posteriormente, el sustrato proteni-
: liberado.
Para el transporte hacia el interior del ncleo
.liza una estructura mucho ms grande y ms
cnpleja, el poro nuclear. En la f i se mues-
:
ue aunque dicho poro proporciona el ambiente
.
permite que un sustrato entre (o salga) del n-
:
de hecho no proporciona un sistema que se
u a los sustratos protenicos y los desplace. Este
:
Mnismo incluye protenas transportadoras que
~
en a los sustratos y los transportan a travs del
hacia el otro lado.
H La translocann de las
protejas puede ser despas
de la traduccin o durante e(a
joceptos principales
.
-
-i protenas que son importadas al interior de los
imnelos citoplsmicos se sintetizan en los ribosomas
libres del citosol.
-;
s protenas que son importadas al interior del
fetema R-Golgi se sintetizan en los ribosomas que
sin asociados al ER.
-L protenas se asocian con las membranas por medio
:
e secuencias de aminocidos especificas denominadas
*;cuencias de seal.
-:
5 secuencias de seal con mayor frecuencia son
/deres localizados en la terminal N.
_H5 secuencias de seal terminal N usualmente son
aparadas de la protena durante el proceso de insercin.
Protena
Las protenas entran al ER o a una mitocon-
dria al unirse a un traslocn que las transporta a travs de la
membrana.
La prolema e acarreada a
travs de un traslocn
Protena Acarreador
Las protenas son transportadas al interior de los
peroxisomas por una protena acarreadora que se une a ellas
en el citosol, pasa con ellas a travs del canal de la membrana
y las libera en el otro lado.
Hay dos maneras de que una protena haga su con-
tacto inicial con una membrana:
.
La protena naciente puede asociarse con
el mecanismo de translocacin mientras
sigue siendo sintetizada en el ribosoma, pro-
ceso conocido como translocacin cotra-
duccional.
10.3 La translocacin de las protenas puede ser despus de la traduccin o durante ella
221
Un
a proteii
\\\\fl
Protena Acarreador
FIGURA 10.4 Las protenas entran al ncleo al atravesar poros
nucleares bastante amplios. El mecanismo de transporte es
distinto del poro e incluye componentes que transportan a la
protena a travs del poro.
Las protenas se localizan por medio de seales cortas
Organelo
Seal de
localizacin
Tipo Longitud
de la sea!
Mitocondria Terminal N
Hlice antiptica
12-30
Cloroplasto
Terminal N
Cargada
>25
Ncleo interna
Bsica o bipartita
4-9
Peroxisoma Terminal C
Pptido corto
3-4
Las protenas sintetizadas en los ribosomas li-
bres del citosol son dirigidas despus de su liberacin a desti-
nos especficos por medio de elementos de seal cortos.
La protena puede ser liberada de un riboso-
ma una vez terminada la traduccin. Poste-
riormente, la protena completa se difunde
a la membrana apropiada y se asocia con el
mecanismo de translocacin. A esto se le de-
nomina translocacin postraduccional.
La localizacin de un ribosoma depende de que
la protena que est siendo sintetizada est asociada
de manera cotraduccional con una membrana:
.
Las protenas que entran al retculo endo-
plsmico (ER, endoplasmk reticulum) utilizan
translocacin cotraduccional. La consecuen-
cia de esta asociacin es que el ribosomal
est en la superficie del ER. Los ribosomas se
asocian con las membranas del ER durante
la sntesis de estas protenas, por lo tanto, se
encuentran en fracciones de membrana da
la clula, por lo que suelen decirse de ellos
que estn
"
unidos a la membrana
"
.
.
El resto de los ribosomas estn en el cito-
sol, y como no estn asociados con ningn
organelo y se fraccionan separadamente de
las membranas, en ocasiones se les denomi--
na
"
ribosomas libres
"
,
los cuales sintetizan
a todas las protenas, excepto las sometidas a
translocacin cotraduccional. Las protenas
son liberadas en el citosol mientras se com-
pleta su sntesis. Algunas de estas protenas
permanecen libres en el citosol en forma casi
soluble, mientras que otras se asocian con
estructuras macromoleculares citoslicas,
como filamentos, microtbulos, centrolos,
etc., son transportadas al ncleo o se aso-
cian con organelos unidos a membranas por
translocacin postraduccional.
Para asociarse con una membrana (o con cual-
quier otro tipo de estructura), una protena requiere
de una seal apropiada, habitualmente un fragmen-
to de secuencia que hace que sta sea reconocida
por un sistema de translocacin (o sea ensamblada
en una estructura macromolecular).
En la FIGURA 10.5 se resumen algunas seales
utilizadas por las protenas liberadas de los riboso-
mas citoscos. La importacin al interior del ncleo
resulta de la presencia de una variedad de secuen-
cias ms bien cortas en el interior de las protenas.
Estas "seales de localizacin nuclear" les permi-
ten pasar a travs de los poros nucleares. Un tipo
de seal que determina el transporte al peroxisoma
es una secuencia terminal C muy corta. Las prote-
nas mitocondriales y de los cloroplastos se sintetizan
en los ribosomas
"
libres"; despus de su liberacin eq
el citosol, se asocian con las membranas de los orgaa
nelos por medio de secuencias terminales N de -25
aminocidos de longitud reconocidas por receptores
localizados en la envoltura del organelo.
Las protenas que residen dentro del sistema re-
ticuloendotelial entran al ER mientras estn siendo
sintetizadas. El principio de la translocacin cotra-
duccional se resume en la GURA 10.6. Una caracte-
rstica importante de este sistema es que la protena
naciente es responsable del reconocimiento del me-
222
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
"
c 'sitio de translocacin, para lo cual se necesita
- j la seal para la translocadn cotraduccional for-
:
e parte de la protena que se sintetiza primero y, de
:ho, usualmente se localiza en el extremo N.
Las protenas que utilizan secuencias terminales
P para ser transportadas de forma cotraduccional
o postraduccional a las mitocondrias o los clo-
plastos tienen una caracterstica comn. La se-
i encia terminal N incluye un lder que no forma
;
rte de la protena madura. La protena que porta
rste lder se denominada preprotena y es un
:;
cursor transitorio de la protena madura. El lder
s separado de la protena durante la translocacin
ritenica.
Los chaperones pueden ser
necesarios para el pLegamiento
de Las protenas
E
nceptos principales
Se dice que las protenas que pueden adquirir
su conformacin de manera espontnea se auto-
ensamblan.
Con frecuencia, las protenas pueden ensamblarse
en estructuras alternas.
Un chapern dirige a una protena a una ruta particular
al excluir rutas alternativas.
Los chaperones evitan la formacin de estructuras
incorrectas al interactuar con protenas no plegadas
para impedir que se plieguen de manera incorrecta.
-
gimas protenas son susceptibles de adquirir su
.
iformacin madura de forma espontnea, y una
~
anera de probarlo consiste en desnaturalizarla y
:determinar si se renaturaliza en la forma acti-
a.
Esta capacidad se denomina autoensamblaje.
Las protenas con esta capacidad pueden plegarse o
-
plegarse en el estado activo a partir de otras con-
'
'rmaciones
, incluido el estado en que inicialmente
. sintetiz, lo cual implica que las interacciones in-
-
;
mas se dirijan intrnsecamente a la conformacin
.orrecta. El caso clsico es el de la ribonucleasa; en
i dcada de 1970 se demostr que,
cuando la enzi-
"
.2 es desnaturalizada
, puede renaturalizarse in vitro
:on la conformacin correcta. Ms recientemente el
:
)ceso del plegamiento intrnseco ha sido descrito
cti detalle para algunas protenas pequeas.
Cuando no tiene lugar el plegamiento correcto
iuelen ocurrir conjuntos alternos de interacciones,
a protena puede quedar atrapada en una confor-
-
acin estable que no es la forma final pretendida,
:
cuyo caso no puede autoensamblarse, y para ad-
:
-.
irir la estructura apropiada requiere de la asisten-
;
de un chapern.
Las protenas pueden entrar al ER slo
Separacin de la
secuencia de seal
terminal N
RETCULO ENDOPLSMICO
CITOSOL
Las protenas pueden entrar a la ruta ER-Golgi
slo asocindose con el retculo endoplsmico mientras estn
siendo sintetizadas.
rfobas expuestas mteractuan
Parche hidrfobo
Agregacin
Las regiones hidrfobas de las protenas in-
teractan intrnsecamente, y a menos que se les impida,
se
agregarn entre s cuando una protena sea sintetizada (o des-
naturalizada).
El plegamiento de las protenas se debe a inter-
acciones entre superficies reactivas que, en general,
estn formadas por cadenas laterales hidrfobas ex-
puestas cuyas interacciones forman un centro hidr-
fobo. La reactividad intrnseca de estas superficies
significa que las interacciones podran ser incorrec-
tas, a menos que el proceso sea controlado. En la
se ilustra este caso. Conforme una pro-
tena recin sintetizada emerge del ribosoma, uno
de los parches hidrfobos de la secuencia tiende a
agregarse a otro, asociaciones generalmente alea-
torias que quiz no representen la conformacin
deseada de la protena.
Los chaperones son protenas que median el en-
samble correcto al provocar que una protena diana
adquiera cierta conformacin y no otras posibles por
la unin de los chaperones a superficies reactivas de
la protena diana expuestas durante el proceso de
ensamblaje, de modo de impedir que dichas super-
ficies interacten con otras regiones de la protena
10.4 Los chaperones pueden ser necesarios para el plegamiento de las protenas
223
Los chaperones controlan las interacciones del plegamiento
de las protenas
Chapern
chapern
controla las
interacciones
Las protenas desnaturalizadas
y las recin sintetizadas
necesitan chaperones
FIGURA 10.8 Los chaperones se unen a Las regiones interactivas de Las
protenas conforme son sintetizadas para evitar la agregacin aleatoria.
Las regiones de las protenas son liberadas para que interacten de forma
ordenada y adquieran, as, la conformacin apropiada.
para establecer una conformacin incorrecta. La
funcin de los chaperones es evitar la formacin de
estructuras incorrectas, no de promover la forma-
cin de estructuras correctas. En la FIGURA 10.8 se
muestra un ejemplo en el que un chapern efecti-
vamente secuestra a un parche hidrfobo de modo
de permitir interacciones que no hubieran sido po-
sibles en su presencia, como puede observarse al
comparar el resultado con la Figura 10.7.
Una estructura incorrecta puede ser producto
del plegamiento errneo de una sola protena o de
interacciones con otra protena. La densidad de las
protenas en el citosol es alta, y el
"
hacinamiento
macromolecular
"
puede incrementar la eficiencia
de numerosas reacciones respecto de las tasas obser-
vadas in vitro. El hacinamiento puede provocar que
las protenas plegables se agreguen, pero los cha-
perones pueden contrarrestar este efecto, as pues,
una de las funciones de los chaperones podra ser
proteger a una protena de manera que pueda ple-
garse sin resultar afectada de manera adversa por el
hacinamiento en el citosol.
Se desconoce la proporcin de protenas suscep-
tible de autoensamblarse, contrario a la que requiere
la asistencia de un chapern. (No es axiomtico que
una protena capaz de autoensamblarse in vitro de
hecho se autoensamble in vivo porque puede haber
diferencias de proporciones en una y otra condicin,
y los chaperones an pueden estar involucrados in
vivo. Sin embargo, debe distinguirse entre las pro-
tenas que bsicamente pueden autoensamblarse y
las que en principio deben tener un chapern que
las ayude a adquirir la estructura correcta.)
Conceptos principales
.
Los chaperones actan en protenas recin
sintetizadas, en protenas que atraviesan membranas o
en protenas que han sido desnaturalizadas.
La Hsp70 y algunas protenas relacionadas constituyen
una clase mayor de chaperones que actan en
numerosas protenas diana.
.
Las chaperoninas del grupo I y del grupo II son
ensambles oligomricos extensos que actan en
protenas diana a las cuales secuestran en cavidades
internas.
.
La protena Hsp90 es un chapern especializado que
acta en protenas de rutas de transduccin de seal.
La capacidad de los chaperones para reconocer con-
formaciones protenicas incorrectas les permite des-
empear dos funciones relacionadas que conciemen
a la estructura protenica:
.
Cuando una protena es sintetizada inicial-
mente, es decir, cuando sale del ribosoma
para entrar al citosol, aparece desplegada.
Posteriormente, el plegamiento espontneo
se produce conforme la secuencia emergen-
te interacta con las regiones de la protena
que se sintetizaron previamente. Los chape-
rones influyen en el proceso de plegamiento
controlando la accesibilidad de las superfi-
cies reactivas. Este proceso est involucrado
en la adquisicin inicial de la conformacin
correcta.
.
Cuando una protena es desnaturalizada, se
exponen nuevas regiones que adquieren la
capacidad de interactuar, interacciones que
son similares a las que se producen cuan-
do una protena se pliega (transitoriamen-
te) de forma errnea conforme/empieza a
sintetizarse y los chaperones reconocen la
conformacin de pliegues incorrectos. Este
proceso est implicado en el reconocimiento
de una protena desnaturalizada y ayuda a
la renaturalizacin o hace que sea eliminada
por degradacin.
Los chaperones tambin pueden ser necesarios
para la formacin de estructuras oligomricas y para
el transporte de protenas a travs de las membra-
nas, respecto del cual, un tema persistente es la
importancia del control (o la demora) del plega-
miento. En la FIGURA 10.9 se muestra que, dada la
geometra del pasaje, podra ser necesario mante-
nerlas no plegadas antes de que penetren la mem-
224
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
El pasaje de la membrana restringe
la conformacin
La protena adquiere
su conformacin
despus de atravesar
la membrana
La protena debe pasar
a travs del canal de
la membrana
La conformacin
plegada podra impedir
el paso a travs de la
membrana
GURA 10.' Una proteina se aprieta en un pasaje angosto
nforme atraviesa la membrana.
Las protenas desplegadas se unen
a los chaperones
Las protenas emergen desplegadas del ribo-
ia o del pasaje que atraviesa la membrana, de forma que
raen a los chaperones para que las protejan del plegamiento
5neo.
ana, sencillamente porque la proteina madura po-
ia ser demasiado grande como para embonar en
canal disponible. Los chaperones evitaran que
a protena adquiriera una conformacin que im-
diera su paso por la membrana, de modo que su
ncion sera, bsicamente, mantener la protena
esible y sin plegarse. Una vez que ha pasado por
membrana, puede requerir otro chapetn que le
rude a plegarse en su conformacin madura, casi
i la misma forma en que una protena citoslica
quiere de la asistencia de un chapetn al salir del
i'Osoma. Probablemente el estado de la protena
mforme emerge de una membrana es similar a
piel en que se encuentra cuando emerge del ri-
/soma
, bsicamente extendida, en posicin ms o
.nos lineal.
Se han caracterizado apropiadamente dos tipos
"
pales de chaperones que inciden en el plega-
ento merced a dos mecanismos diferentes:
.
En la FIGURA 10. K se muestra que e\ sistema
Hsp70 consiste en protenas individuales que se
unen a los sustratos cuyo plegamiento debe ser
controlado y actan en ellos y las reconoce
Las chaperoninas pliegan sus sustratos internamente
La protena emerge
despus del plegamiento La protena se inserta
en una cmara cerrada
0&?
IGURA 10.11 Una chaperonina forma un complejo oligomri-
co amplio y pliega a un sustrato protenico en su interior.
conforme son sintetizadas o emergen de las
membranas (incluso cuando son desnatu-
ralizadas por estrs). Bsicamente, controla
las interacciones entre las regiones reactivas
expuestas de la protena, permitindole ple-
garse en la conformacin correcta in situ. Los
componentes del sistema son Hsp70, Hsp40
y GrpE, y su nombre refleja la identificacin
original de la Hsp70 como una protena in-
ducida por choque trmico. Las protenas
Hsp70 y Hsp40 se unen individualmente
a los sustratos protenicos y utilizan la hi-
drlisis de ATP para proporcionar la ener-
ga necesaria para cambiar la estructura del
sustrato protenico, adems de que trabajan
en conjunto con un factor de intercambio
que regenera ATP a partir de ADP.
.
En la FIGURA 10. se muestra que un sistema
de chaperoninas est formado por un ensamble
oligomrico extenso (representado como un cilin-
dro). Este ensamble forma una estructura en
la cual se insertan las protenas no plegadas.
El ambiente protegido dirige su plegamien-
to. Hay dos tipos de sistemas de chaperoni-
nas, el GroEL/GroES se encuentra en todo
tipo de organismos y el TRiC, en el citosol
de las eucariotas.
Los componentes de los sistemas se resumen en
la figura . El sistema Hsp70 y los dos sistemas
de chaperoninas actan sobre numerosos sustratos
protenicos distintos y otro, el de la protena Hsp90,
funciona en conjunto con la Hsp70, sin embargo,
Las protenas desnaturalizadas y las recin sintetizadas necesitan chaperones
Hay dos tipos principales de sistemas de chaperones
Sistema Estructura/funcin
Chaperones individuales
Sistema Hsp70
Hsp70 (DnaK) ATPasa
Hsp40 (DnaJ) Estimula a la ATPasa
GrpE (GrpE) Factor de intercambio de nucletidos
Hsp90 Funciones en las protenas implicadas
en la transduccin de seal
Estructuras oligomrcas (chaperoninas)
3fup
Hsp60 (GroEL) Forma dos anillos heptamricos
Hsp10 (GroES) Forma un casquete
Grupa (I
TRiC Forma dos anillos octamricos
La familia de chaperones tiene contrapartes
eucariticas y bacterianas (nombres entre parntesis).
Cada ciclo de unin entre Hsp40 y Hsp70 requiere
de la hidrlisis de ATP
Hsp70
hidroliza ATP
Hsp70-ATP se une
a Hsp40 + sustrato
Hsp40 se
une al sustrato
ATP &
DnaK
-
Hsp40
GrpE
desplaza al ADP
Hsp40
es liberado
Hsp70
se disocia
El Hsp40 se une al sustrato y despus al Hsp70. La hidrlisis
de ATP dirige un cambio conformacional. El GrpE desplaza al ADP, de modo
que los chaperones son liberados. Durante el plegamiento de un sustrato
protenico pueden ocurrir mltiples ciclos de asociacin y disociacin.
se dirige a clases especficas de protenas involucra-
das en la transduccin de seal especialmente los
receptores de hormonas esteroideas y las cinasas de
sealizacin. La funcin bsica del sistema Hsp90 es
mantener a sus dianas en una conformacin ade-
cuada hasta que sean estabilizadas por la interac-
cin con otros componentes de la ruta. (La razn
de que muchas de estas protenas se denominen
"
Hsp", "protena de choque trmico" [por sus siglas
en ingls, heat shock protein], es que el incremento
de temperatura induce la produccin de este tipo de
protenas cuya funcin es minimizar el dao pro-
vocado por la desnaturalizacin calrica. Muchas
de las protenas de choque trmico son chaperones
y fueron descubiertas y nombradas inicialmente
como parte de la respuesta al choque trmico.)
La familia Hsp70 es ubicua
Conceptos principales
.
Los miembros de la familia Hsp70 se encuentran en el
citosol, el ER, las mitocondrias y los cloroplastos.
.
La protena Hsp70 es un chapern que acta en
protenas diana aunada a los chaperones DnaJ y GrpE.
La familia Hsp70 se encuentra en las bacterias, el
citosol de las eucariotas, el ER, los cloroplastos y las
mitocondrias. Una Hsp70 tpica tiene dos dominios,
de los cuales, la terminal N es una ATPasa y la ter-
minal C se une al sustrato polipeptdico. Cuando
est unida a ATP, la Hsp70 se une a los sustratos u
los libera rpidamente, por el contrario, con ADP
las reacciones son lentas. El reciclaje entre estos es-
tados es regulado por otras dos protenas, la Hsp40
(DnaJ) y la GrpE.
En la 10.13 se muestra que la Hsp40
(DnaJ) se une primero a una protena naciente con-
forme emerge del ribosoma. La Hsp40 contiene una
regin denominada dominio J (cuyo nombre se de-
riva de DnaJ) que interacta con la Hsp70 (DnaK).
Esta ltima se une a la Hsp40 y a la protena desple-
gada. En efecto, dos chaperones que interactan se
unen a la protena. El dominio J representa la espe-
cifidad de la interaccin de apareamiento y conduce
a una Hsp40 especfica a seleccionar al compaero
adecuado de la familia Hsp70.
La interaccin de la Hsp70 (DnaK) con la Hsp40
(DnaJ) estimula la actividad ATPasa de la Hsp70. La
forma del complejo unida a ADP se mantiene asocia-
da con el sustrato protenico hasta que la GrpE des-
plaza al ADP, fenmeno que provoca la prdida de la
Hsp40 seguida de la disociacin de la Hsp70, que se
une a otro ATP y el ciclo puede repetirse. La GrpE (o
su equivalente) se encuentra slo en las bacterias, las
mitocondrias y los cloroplastos; en otras ubicaciones,
la reaccin de disociacin est acoplada a la hidrlisis
de ATP de manera ms compleja.
El plegamiento de las protenas se logra mediante
mltiples ciclos de asociacin y disociacin. Confor-
me se alarga la cadena protenica, la Hsp70 (DnaKi
puede disociarse de un sitio de unin y posterior-
mente reasociarse a otro, de modo de liberar partes
del sustrato protenico para plegarlo correcta y orde-
nadamente. Por ltimo, la protena intacta se libera
del ribosoma plegada en su conformacin madura.
Diferentes miembros de la clase Hsp70 funcio-
nan en varios tipos de protenas diana. Las protenas
226
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
:
'
tosol (Hsp70 epnima y una protena relacio-
cada llamada Hsc70) actan en las protenas na-
fcntes de los ribosomas. Las variantes del ER (de-
minadas BiP o Grp78 en las eucariotas superiores
-
vr2 en Saccharomyces cerevisiae), las mitocondrias
-
cloroplastos, funcionan de manera bastante
.ar en las protenas conforme se introducen en
:
ganelo o en su paso a travs de la membrana.
iQu caracterstica reconoce la Hsp70 en una
"
.ena diana? Se une a un fragmento lineal de
-nocidos incrustados en un contexto hidrfo-
:ue es precisamente el tipo de elemento que
: -ti
erra en el centro hidrfobo de una protena
adura adecuadamente plegada, de modo que su
.
.
Tosicin indica que la protena es naciente o est
.esnaturalizada. Los elementos de esta naturaleza
:
:esentan aproximadamente cada 40 aminoci-
y la unin con el elemento evita que ste se
3C de manera errnea a otro.
Hste modelo de accin explica la forma en que
rotena Hsp70 Bip puede cumplir con dos fun-
"
es, ayudar a la oligomerizacin y al plegamiento
rotenas recin translocadas en el ER y eliminar
reinas plegadas de forma errnea. Supngase
r_
e la Bip reconoce ciertas secuencias peptdicas
- :cesibles en la conformacin de una protena
r iura plegada adecuadamente; dichas secuencias
-xponen y atraen a la Bip cuando la protena
'
ra al lumen del ER en una forma esencialmente
-
dimensional. Si una protena es plegada de ma-
incorrecta o es desnaturalizada, la secuencia
t e ser expuesta en su superficie,
en vez de ser
cerrada adecuadamente.
Las secuencias de seal inician
La transLocacin
-;*
icep-os principales
-as protenas se asocian con el sistema del ER slo
zjrante la traduccin.
.a secuencia de seal del sustrato protenico es
esponsable de la asociacin a la membrana.
protenas que se asocian con las membranas
iiante lderes terminales N utilizan una jerar-
i de seales para encontrar su destino final. En
aso del sistema reticuloendotelial
,
la localizacin
I de una protena depende de la forma en que
prigida conforme transita por el retculo endo-
feco y el aparato de Golgi. La secuencia lder
Bduce la protena a la membrana, y la conse-
:
ncia intrnseca de la interaccin es que la pro-
pasa a travs de la membrana hacia el interior
compartimiento. Para que una protena resida
Seales especificas desvan a las protenas de la secrecin
Retculo
endoplsmioo
Lisosoma
T.
Maosa -6-
*
GolQ
fosfato
Membrana
plasmtica
PREDETERMINADA
Extracelular
KDEL terminal C
Seal de
residencia
4 Las protenas que entran a la ruta ER-Golgi
pueden fluir a travs de la membrana plasmtica o ser desviadas
a otros destinos por medio de seales especficas.
en la membrana, se necesita una seal adicional que
le impida atravesarla. Para que una protena sea
designada a un destino particular, en otras pala-
bras, para que permanezca dentro de la membrana
o del lumen de algn compartimiento especfico
se necesita otro tipo de seales. El proceso general
necesario para la localizacin del destino final de
una protena transportndose a travs de sistemas
membranosos sucesivos se denomina trfico de
protenas o asignacin, y se describe en el trfico
de protenas.
Las caractersticas generales de la ruta se resu-
men en la FIGURA 10.1 i. La
"
ruta predeterminada
"
lleva a una protena a travs del ER, al interior del
aparato de Golgi y a la membrana plasmtica. Las
protenas que residen en el ER poseen un tetrapp-
tido terminal C (KDEL, el cual de hecho propor-
ciona una seal para que las protenas regresen del
aparato de Golgi al ER). La seal que desva a una
protena al lisosoma es una modificacin covalen-
te, es decir, la adicin de un azcar en particular.
Para que una protena se transforme en un cons-
tituyente permanente del aparato de Golgi o de la
membrana plasmtica, se necesitan otras seales.
Hay un punto de inicio comn para las protenas
que se asocian con el sistema reticuloendotelial de
membranas o que pasan a travs de l. Estas pro-
tenas pueden asociarse con la membrana slo mientras
estn siendo sintetizadas. Los ribosomas que sintetizan
a estas protenas se asocian con el ER, de modo de
permitir que la protena naciente sea transferida
de forma cotraduccional a la membrana. En ocasio-
nes, a las regiones en las que estn asociados riboso-
mas y ER se les llama
"
ER rugoso", en contraste con
las regiones de "ER liso" que carecen de polisomas
asociados y tienen una apariencia tubular, en vez
10.7 Las secuencias de seal inician la translocacin 227
de laminar. En la se muestran los ri-
bosomas en la transferencia de protenas nacientes
a las membranas del ER.
Las protenas sintetizadas en el ER rugoso pa-
san del ribosoma directamente a la membrana, para
despus ser transferidas al aparato de Golgi y final-
mente dirigidas a su destino final, ya sea un lisosoma,
una vescula de secrecin o la membrana plasmti-
ca. El proceso ocurre en un ambiente membrano-
so, puesto que las protenas son acarreadas entre
los organelos en vesculas pequeas con revesti-
miento de membrana. La insercin cotraduccional
es dirigida por una secuencia de seal, que suele
ser una secuencia lder divisible de 15 a 30 amino-
cidos terminales N. En el extremo N, o cerca de l
,
hay numerosos residuos polares, y dentro del lder,
un centro hidrfobo que consiste exclusiva, o prin-
cipalmente, de aminocidos hidrfobos. No se con-
serva ninguna otra secuencia. La es un
ejemplo de ello.
La secuencia de seal es necesaria y suficiente
para promover la transferencia de cualquier poli-
pptido al interior de la membrana diana. Una se-
cuencia de seal agregada al extremo N de una glo-
bina, por ejemplo, hace que sea secretada a travs
* "l
r ijBfc w/1
m, v
El retculo endoplsmico est formado por
una lmina de membranas muy plegada que parte del ncleo.
Los pequeos objetos adheridos a la superficie externa de las
membranas son los ribosomas. Imagen cortesa de Lelio Orci,
University of Geneva, Switzerland.
de las membranas de las clulas en lugar de qid
permanezca en el citosol.
La secuencia de seal proporciona la conexin
que permite a los ribosomas adherirse a la mem-
brana. No hay una diferencia intrnseca entre la
ribosomas libres (que sintetizan protenas en el ci-
tosol) y los adheridos al ER. Un ribosoma empieza la
sntesis de una protena sin saber si ser sintetizad
en el citosol o ser transferida a una membrana. La
sntesis de una secuencia de seal es la que provoca
que el ribosoma se asocie con una membrana.
BJ] La secuencia de seal
interacta con La SRP
Conceptos principales
La secuencia de seal se une a la SRP (partcula de
reconocimiento de seal).
La unin seal-SRP provoca la interrupcin de la
sntesis protenica.
La sntesis protenica se reinicia cuando la SRP se une
al receptor de la SRP en la membrana.
La secuencia de seal es separada de la protena de
translocacin por la peptidasa seal localizada en la
cara
"
interna" de la membrana.
La translocacin protenica puede dividirse en do?
etapas generales, primero, los ribosomas que portan
polipptidos nacientes se asocian con las membra-
nas y posteriormente la cadena naciente es transfe-
rida al canal y transportada a travs de l.
La unin de los ribosomas a las membranas
exige la partcula de reconocimiento de seal
(SRP, signal recognition particle), que tiene dos capa-
cidades importantes:
.
Puede unirse a la secuencia de seal de una
protena secretora naciente.
.
Puede unirse a una protena (receptora de
la SRP) localizada en la membrana.
La SRP y su receptor funcionan de manera ca-
taltica para transferir a un ribosoma que porta una
uencia de seal terminal N es hidrfoba
Iniciacin
MeuMen Ala Ma i G Pro
Polar*-- Centro hidrfobo
i Trp
;tieo ln' (v
'
Gli fAla)
madura
Divisin'
Protena
La secuencia de seal de la hormona de crecimiento bovina est formada por 29
aminocidos terminales N y tiene una regin central altamente hidrfoba, precedida o flanqueada
por regiones que contienen aminocidos polares.
228 i AI'Ullll UJ Localizacin de las protenas
tena naciente a la membrana. El primer paso es
pee la SRP reconozca la secuencia de seal, se una a
rceptor y el ribosoma a la membrana. Las etapas
'
aduccin de las protenas de la membrana se
Humen en la FIGURA 10.17.
la funcin del receptor de la SRP en la trans-
;
;:n protenica es transitoria; cuando la SRP se
r a la secuencia de seal
,
detiene la traduccin,
general cuando se han incorporado -70 ami-
"
;:idos a la cadena polipeptdica (en este punto
ier de 25 residuos ha quedado expuesto, con
40 aminocidos siguientes an enterrados en el
.
soma).
Cuando la SRP se une al receptor correspon-
Zznxt, libera la secuencia de seal y el ribosoma
se adhiere a otro componente de la membrana,
.
ment en que la traduccin puede continuar.
;.
ndo el ribosoma haya pasado a la membrana,
..
:
acin combinada de la SRP y del receptor de la
:
? habr concluido. Despus se reciclan y son li-
:
res para fomentar la asociacin de otro polipptido
; lente con la membrana.
Este proceso puede ser necesario para contro-
.3. conformacin de la protena. Si la protena
Mente fuera liberada en el citoplasma, adquirira
la conformacin que no le permitira atravesar la
"
;:nbrana, por lo tanto, la capacidad de la SRP para
-
.ibir la traduccin mientras el ribosoma es entre-
- -
:
::o a la membrana es importante para evitar que
j protena sea liberada en el ambiente acuoso.
El pptido seal es separado de una protena en
.
"
r
.
slocacin por un complejo de cinco protenas
-
.;:
ominado peptidasa seal, que suele ser ms
;
.:
ndante que la SRP y que su receptor, casi equi-
i
'
.e a la cantidad de ribosomas unidos, lo cual su-
giere que su capacidad de funcionamiento es estruc-
:
al. Dicho complejo se localiza en la cara luminal
:
la membrana del ER, lo cual implica que toda la
r:
"
.iencia de seal debe atravesar la membrana an-
:.
;
de que ocurra la divisin. En las eubacterias, las
rhaea y las eucariotas pueden reconocerse pepti-
:?.sas de seal homlogas.
ITifl La SRP i n teracta
con el receptor de la SRP
Conceptos principales
.
La SRP es un complejo formado por RNA 75 y seis
protenas.
.
El equivalente bacteriano de la SRP es un complejo
formado por RNA 4.5S y dos protenas.
.
El receptor de la SRP es un dmero.
.
La hidrlisis de GTP libera a la SRP de su receptor
despus de su interaccin.
La interaccin entre la SRP y su receptor es el even-
to principal de la traduccin eucaritica que trans-
fiere un ribosoma que porta a una protena naciente
a la membrana. Las bacterias tienen un sistema de
interaccin anlogo, aunque su funcin est ms
restringida.
La SRP es un complejo ribonucleoprotenico
11S que contiene seis protenas (con una masa total
de 240 kD) y un RNA 7S pequeo (de 305 bases,
100 kD). En la FI61 se muestra que el RNA
7S proporciona el esqueleto a la partcula; las pro-
tenas no se ensamblan si no est presente.
El RNA 7S de la SRP se divide en dos partes;
las 100 bases del extremo 5' y las 45 del extremo 3'
La secuencia de seal inicia la entrada a la membrana
Los ribosomas que sintetizan protenas secre-
toras estn adheridos a la membrana por medio de la secuencia
de seal localizada en el polipptido naciente.
Cara interna del ER
CltOS
Receptor
de la SRP
SRP
%
El ribosoma inicia la sntesis
protenica en el mRNA "libre
"
La SRP se adhiere a la
secuencia lder; se interrumpe
la traduccin
La SRP se une al receptor
respectivo; el ribosoma se
adhiere a la membrana;
se reinicia la traduccin
La secuencia lder entra
a la membrana
La protena pasa a travs
de la membrana; el lderes
dividido; contina la traduccin
La protena es secretada a
travs de la membrana; las
subunidades ribosmicas son
liberadas del mRNA
10.9 La SRP interacta con el receptor de la SRP
229
La SRP es RNA 7S + 6 protenas
La unin de la seal cambia la conformacin de la SRP
-
Dominio Alu RNA'
r
4
23-24 nm .
Dominio S RNA-*-
Dominio IV
SRP54
SRP9/14 SR
Bisagra-
SRP19
t
"
SRP9
SRP68/72
SRP54M
SRP14
SRP54NG
Secuencia
de seal
FIGURA 10.18 El RNA 7S de La SRP tiene dos dominios
.
Las
protenas se unen como se muestra en el diagrama bidimensio-
nal (arriba) para formar La estructura cristalina que se muestra
abajo. Cada funcin de la SRP est asociada con una parte
discreta de la estructura.
La secuencia de seal
emerge de! ribosoma;
la SRP se aproxima en
conformacin extendida
-
Secuencia de seal
SRP54
SRP19
SRP54
SRP19
La SRP se une
a la secuencia de
seal y se dobla
en la bisagra para
contactar al ribosoma
FIGURA 10.19 La SRP se une a una secuencia de seal tan
pronto emerge del ribosoma. La unin provoca que la SRP cam-
bie de conformacin y se doble en la "bisagra", de modo de
permitir que la SRP54 entre en contacto con el ribosoma en el
sitio de salida de la protena, en tanto que la SRP19 forma uri
segundo conjunto de contactos.
estn estrechamente relacionadas con la secuencia
de Alu RNA, un pequeo RNA comn en los ma-
mferos, de modo que definen al dominio Alu. La
parte restante del RNA forma el dominio S.
Las diferentes partes de la estructura de la SRP
representadas en la figura 10.18 desempean fun-
ciones independientes en la asignacin de las pro-
tenas. La SRP54 es la subunidad ms importante;
se localiza en un extremo de la estructura de RNA
y es responsable directa de reconocer al sustrato
protenico por la unin con la secuencia de seal,
adems de que se une al receptor de la SRP junto
con el dmero SRP68-SRP72 localizado en la regin
central del RNA. El dmero SRP9-SRP14 est en el
otro extremo de la molcula y se encarga de la in-
terrupcin de la elongacin.
La SRP es una estructura flexible que en su
forma libre (separada de la secuencia de seal) es
bastante amplia, como se observa en la estructura
cristalina de la figura 10.18. En la IGURA 10.19 se
muestra que la unin con una secuencia de seal
desencadena un cambio conformacional. La pro-
tena se dobla en una bisagra para permitir que el
extremo SRP54 haga contacto con el ribosoma en el
sitio de salida de la protena, mientras que la SRP19
se balancea para contactar al ribosoma en el sitio de
unin con el factor de elongacin, lo cual le permi-
te provocar la interrupcin de la elongacin y dar
tiempo a la asignacin del sitio de translocacin en
la membrana.
El receptor de la SRP es un dmero que contie-
ne subunidades SRa (de 72kD) y SRP (de 30 kD). La
subunidad (3 es una protena integral de membrana.
El extremo N de la subunidad a grande es anclado
por la subunidad [3. El grueso de la protena a so-
bresale hacia el citosol. Gran parte de la secuencia
de la regin citoplsmica de la protena se asemeja a
una protena de unin con cido nucleico con mu-
chos residuos positivos. Lo cual sugiere la posibilidad
de que el receptor de la SRP reconozca al RNA 7S de
la SRP.
En las bacterias hay una contraparte de la SRP,
aunque contiene menos componentes; E. coli, por
ejemplo, tiene un RNA 4.5S que se asocia con los
ribosomas y es homlogo del RNA 7S de la SRP.
Se asocia con dos protenas, Fth es homologa de
la SRP54 y FtsY, de la subunidad a del receptor
de la SRP. De hecho, la FtsY remplaza las funciones
de las subunidades a y P de la SRP; su dominio
terminal N sustituye a la SRPP en la asignacin de
230
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
rr.brana y el dominio terminal C interacta con
rotena diana. La fundn de este complejo es
> limitada que la del complejo formado por el
ptor de la SRP y la SRP; quiz sea necesario para
ttitener a algunas protenas secretadas (aunque
a todas) en una conformacin que les permi-
nteractuar con el mecanismo de secrecin. sta
a ser la conexin original entre la sntesis pro-
ica y la secrecin; en las eucariotas, la SRP ha
irido las funciones adicionales de provocar la
:
:'upcin de la traduccin y permitir el acceso a
;mbrana.
Por qu la SRP debe tener un componente de
KA? La respuesta debe estar en la evolucin de la
debe haberse originado muy al principio de
;
olucin, en un mundo dominado por el RNA,
"
-
-
umiblemente en conjunto con un ribosoma cu-
runciones eran responsabilidad principalmente
RNA. La estructura cristalina del complejo entre
-
minio de unin con la protena del RNA 4.5S
:
Je unin con el RNA de la Ffh sugiere que el
-
-
sigue desempeando algn papel en la funcin
:
-
SRP.
El RNA 4.5S tiene una regin (dominio IV) muy
-.ar al dominio IV del RNA 7S (vase la
5ie. 10.18). La Fth est formada por tres dominios
j y M). El dominio M (as llamado por su alto
.enido de molculas de metionina) realiza las
"
ripales funciones de unin. Tiene una cavidad
kirfoba que se une a la secuencia de seal de
in protena diana. Las cadenas laterales hidrfo-
kde los residuos de metionina crean la cavidad
yectarse en una hendidura de la estructura
- protena. Junto a la cavidad se encuentra un
.
rmento hlice-vuelta-hlice tpico de las prote-
Je unin con el DNA (vase la seccin 14.11, El
tpresor utiliza un elemento hlice-vuelta-hlice
unirse al DNA).
la estructura cristalina muestra que la estruc-
hlice-lazo-hlice del dominio M se une a una
:
>n dplex del RNA 4.
5S en el dominio IV. El es-
eto del RNA cargado negativamente est junto
;
;avidad hidrfoba, lo cual sugiere la posibilidad
:ue una secuencia de seal de hecho se una a
b componentes protenicos y de RNA de la SRP.
ecuencias cargadas positivamente que inician
raiencia de seal (vase la Fig. 10.16) podran
: -
'
actuar con el RNA
, mientras que la regin hi-
tofoba de la secuencia de seal podra postrarse
.= cavidad
.
la hidrlisis de GTP tiene una funcin impor-
fcie en la insercin de la secuencia de seal a la
:
~
brana. La SRP y su receptor tienen capacidad
"
lisa. La subunidad de unin con la seal de la
-
SRP54, es una GTPasa. Las dos unidades del re-
aor de la SRP son GTPasas. Todas las actividades
El ribosoma convierte a la SRP-GDP en SRP-GTP
FIGURA 10.20 La SRP transporta GDP cuando se une a la se-
cuencia de seal. El ribosoma hace que la GDP sea remplazada
por GTP.
La hidrlisis de GTP finaliza la interaccin SHP-receptor
RETCULO ENDOPLSMICO
GDP
CITOSOL
-GDP
La SRP y su receptor hidrolizan GTP cuando la
secuencia de seal es transferida a la membrana.
GTPasa son necesarias para que una protena na-
ciente sea transferida a la membrana. En la f
10.20se muestra que la SRP empieza con GDP cuan-
do se une a la secuencia de seal y posteriormente
el ribosoma estimula el remplazo del GDP por GTP.
La secuencia de seal inhibe la hidxlisis de GTP con
lo que asegura que al complejo se le haya unido GTP
cuando encuentre al receptor de la SRP.
Para que la protena naciente sea transferida
de la SRP a la membrana, la SRP debe ser liberada
de su receptor. En la se muestra que
para ello es necesario que se hayan hidrolizado las
molculas de GTP de la SRP y de su receptor. La re-
accin se ha caracterizado en el sistema bacteriano,
donde tiene la caracterstica inusual de que la Ffh
active la hidrlisis mediada por FtsY, y la FtsY active
recprocamente la hidrlisis mediada por la Ffh.
EL tras Lo con forma un poro
Conceptos principales
.
El complejo trimrico Sec61 proporciona el canal para
que pasen protenas a travs de una membrana.
.
Una protena transferente pasa directamente del
ribosoma al traslocn sin exponerse al citosol.
Hay un problema bsico en el paso de una protena
hidroflica (en gran medida) a travs de una mem-
brana hidrfoba. La energtica de la interaccin
entre la protena cargada y los lpidos hidrfobos es
10.10 El traslocn forma un poro
231
Un traslocon forma un canal acuoso
El poro contiene
RETCULO
ENDOPLSMICO
CITOSOL
un canal acuoso
FIGURA 10.22 El traslocon es un trimero de Sec61 que forma
un canal a travs de la membrana. Est sellado en la porcin
luminal (del ER).
muy desfavorable. Sin embargo, una protena en
proceso de translocacin a travs de la membrana
del ER puede ser extrada por agentes de desnatu-
ralizacin efectivos en un ambiente acuoso, que no
son los que extraen las protenas que son compo-
nentes residentes de la membrana, fenmeno que
sugiere el modelo de translocacin que se ilustra
en la , en el cual las protenas que for-
man parte de la membrana del ER constituyen un
canal acuoso a travs de la bicapa. Una protena en
proceso de translocacin se desplaza por este canal
e interacta con las protenas residentes, no con
la bicapa de lpidos. El canal es sellado en el lado
luminal para detener la transferencia libre de iones
entre el ER y el citosol.
El canal que atraviesa la membrana se deno-
mina traslocon. Sus componentes se han identi-
ficado de dos formas: las protenas que residen en
la membrana del ER entrecruzadas con protenas
transferentes son subunidades potenciales del canal,
y los mutantes sec de las levaduras (as llamados por-
que son incapaces de secretar protenas) incluyen
una clase que provoca que los precursores de las
protenas de secrecin o de la membrana se acu-
mulen en el citosol. Mediante estos mtodos juntos
se identific el complejo Secl, formado por tres pro-
tenas transmembrana, Secla, P y y. Secl es el
componente principal del traslocn. En detergente
(que proporciona un ambiente hidrfobo que imita
el efecto de una membrana circundante), el Secl
forma oligmeros cilindricos con un dimetro de
-
85 y un poro central de -20 , cada uno de los
cuales consta de cuatro heterotrmeros.
En todos los organismos se encuentra una es-
tructura trimrica similar para el canal, que en las
bacterias y las archaea se denomina complejo SecY.
La subunidad Secla (o la SecY correspondiente de
las bacterias/archaea) proporciona el poro a travs
del cual pasa la protena, y es la mejor conservada
en cuanto a secuencia. El poro se crea a partir de
dmeros del complejo trimrico organizados ininte-
rrumpidamente de manera que las subunidades a se
fusionan en un solo canal. Un complejo de canal de
la membrana puede contener dos dmeros, probable-
mente organizados lado a lado, aunque el ribosoma
slo puede acceder a uno en un momento dado.
El canal es una estructura preexistente (como
se implica en la figura) o puede ser ensambladc
como respuesta a la asociacin entre una secuencia
de seal hidrfoba y la bicapa de lpidos? Los canales
pueden ser detectados por su capacidad para permiti:
el paso de iones (medida como un cambio localiza-
do en la conduccin elctrica). En la membrana del
ER pueden ser detectados canales conductores
de iones, y su estado depende de la translocacii
protenica, lo cual demuestra que el canal es una ca-
racterstica permanente de la membrana.
Un canal se abre cuando un polipptido nacien-
te es transferido de un ribosoma a la membrana
del ER. La protena transferente llena el canal por
completo, de manera que los iones son incapaces de
atravesar durante la translocacin, pero si la prote-
na es liberada mediante tratamiento con puromi-
cina, el canal se torna permeable. Si los ribosomas
son eliminados de la membrana, el canal se cierra
lo cual sugiere que el estado de abierto exige y i
presencia del ribosoma y que el canal es controlad.
en respuesta a una protena transferente.
La medicin de la capacidad de entrada al cana!
de los agentes de desactivacin de fluorescencia de
diferentes tamaos sugiere que es grande, con ur_
dimetro interno de 40 a -0 , mucho mayor
que el de un fragmento de protena a helicoidal, y
tambin es ms grande que el poro que se observa
en perspectivas visuales directas del canal, discre-
pancia que an debe ser explicada.
El ambiente acuoso de un aminocido en una
protena puede medirse incorporando aminocidc
variables con residuos fotorreactivos. La fluores-
cencia de estos residuos indica si se encuentran er
un ambiente acuoso o en un medio hidrfobo. Er
experimentos con dichas sondas se ha observado
que cuando se sintetiza inicialmente la secuencia
de seal en el ribosoma, se encuentra en un estad.
acuoso, pero es inaccesible para los iones del citosol
permanece en estado acuoso durante su interacci:
con una membrana; esto sugiere que la proten;
transferente viaja directamente de un tnel incluid
en el ribosoma al interior de un canal acuoso loca-
lizado en la membrana.
De hecho, el acceso al poro es controlado (o
"
cercado
"
) en ambos lados de la membrana, antes
de que se una el ribosoma, el poro se cierra del
lado luminal. En la se muestra qu:
232 CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
adherirse el ribosoma, sella al poro del lado del
sol. Cuando la protena naciente alcanza una
gitud de -70 aminocidos, muy probablemente
;
ndo se extiende por completo a travs del canal,
~
ioro se abre del lado luminal
, de modo que, en
> momento est cerrado de un lado o del otro
,
ateniendo las integridades inicas de cada com-
nimiento.
21 traslocn es verstil y puede ser utilizado por
:enas transferentes de mucha maneras:
.
Es el medio por el cual las protenas nacien-
tes son transferidas de los ribosomas cito-
slicos al lumen del ER (vase la seccin
10.11, La translocacin requiere de inser-
cin en el traslocn y [en ocasiones] de un
trinquete en el ER).
.
Tambin es la ruta por la cual las prote-
nas integrales de la membrana del sistema
ER son transferidas a la membrana, para lo
cual es necesario que el canal se abra o des-
agregue en alguna forma desconocida, de
manera que la protena se pueda desplazar
lateralmente dentro de la bicapa de lpidos
(vase la seccin 10.15, Cmo se insertan
las protenas en las membranas?).
.
Las protenas tambin pueden ser transferi-
das del ER al citosol, evento que se conoce
como translocacin inversa (vase la seccin
10.12, La translocacin Inversa enva prote-
nas al citosol para que sean degradadas).
Q La translocacin requiere
de insercin en eL traslocn
y (en ocasiones)
de un trinquete en eL ER
ceptos pri icipales
:. ribosoma, ia SRP y eL receptor de la SRP bastan para
"
sertar una protena naciente en un traslocn.
uc protenas que se insertan despus d.e la traduccin
quieren de componentes adicionales en el citosol y
-
-e
. BiP en el ER.
I
. BiP es un trinquete que evita que una protena se
rslice hacia atrs.
raslocn y el receptor de la SRP son los compo-
|Es bsicos de la translocacin cotraduccional.
lo el complejo Secl es incorporado a mem-
:
s artificiales con el receptor de la SRP, puede
::
ar la translocacin de protenas nacientes,
I oirs requieren de la presencia de un compo-
rte adicional, la protena de membrana asociada
polipptido de translocacin (TRAM, trans-
chain-associating membrane), una protena
La proteina naciente se transfiere al Interior del ER
RETCULO
ENDOPLSMICO

El ribosoma sella
el lado citosiico
CITOSOL
Una protena naciente es transferida directa-
mente del ribosoma al traslocn. El ribosoma sella el canal en
el lado citosiico.
Para la translocacin se necesitan otros componentes
La TRAM es requerida
ER
por algunas protenas
Peptida
sen;
Receptor de
Sec61 se
la SRP
une a
ribosoma
SRP
N
CITOSOL
h La translocacin requiere de traslocn, SRP,
receptor de SRP, Sec61, TRAM y peptidasa seal.
mayor que se entrecruza con una cadena transfe-
rente naciente. La TRAM estimula la translocacin
de todas las protenas.
Los componentes del traslocn y sus funcio-
nes se resumen en la IGURA 10.24. La sencillez de
este sistema genera varios puntos importantes. El
Secl se visualiza como parte del canal y tambin
interactuando con el ribosoma. La asignacin inicial
se realiza cuando la SRP reconoce la secuencia de
seal conforme empieza a emerger del ribosoma la
protena recin sintetizada y se une a su receptor,
y la secuencia de seal es transferida al traslocn.
Cuando esta ltima entra al traslocn, el ribosoma
se adhiere al Secl para formar un sello que impide
que el poro sea expuesto al citosol. En este sistema
no ocurre la separacin del pptido seal, de modo
que no puede ser necesaria por s misma para la
translocacin. En este sistema no se necesitan los
10.11 La translocacin requiere de insercin en el traslocn y (en ocasiones) de un trinquete en el ER
233
BiP es un trinquete que evita el desplazamiento hacia atrs
BiP
RETICULO
ENDOPLSMICO
CITOSOL
5 El BiP hace Las veces de trinquete para evitar
[a difusin hacia atrs de una protena transferente.
componentes del lado luminal de la membrana para
la translocacin.
Por supuesto, la eficiencia del sistema in vitro es
relativamente baja, pues in vivo pueden requerirse
otros componentes para lograr una transferencia
eficiente o para evitar que otras protenas celulares
interfieran con el proceso.
En ciertos casos en que se inserta una prote-
na en una membrana de manera postraduccional,
se necesita un mecanismo ms complicado. El mis-
mo complejo Secl forma al canal, pero tambin
son necesarias otras cuatro protenas Sec, adems
del chapern BiP (miembro de la clase Hsp70) y del
abastecimiento de ATP en el lado luminal de la mem-
brana. En la FIGURA 10.2 se muestra que el chapern
BiP se comporta como un trinquete, que de no estar,
el movimiento browniano permitir que la prote-
na se deslice hacia atrs, al interior del citosol. En
caso contrario, afianza a la protena dentro del ER
conforme sale del poro e impide que se desplace
hacia atrs. El BiP no jala a la protena, slo evita
que se deslice hada atrs. (La razn de que se nece-
site BiP para la translocacin postraduccional, pero
no para la cotraduccional, puede ser que una pro-
tena recin sintetizada es extrada continuamente
del ribosoma y, por lo tanto, es incapaz de deslizarse
hacia atrs.)
tTifW La transLocacin Inversa enva
protenas al dtosoL
para que sean degradadas
Concepto principal
tos tuaslocones Sec61 pueden utilizarse para la
translocacin inversa de protenas del ER al citosol.
Cmo se inicia la translocacin inversa? I
RETCULO
ENDOPLSMICO
9 r
B
( I
CITOSOL
La translocacin inversa utiliza el traslocc-
para enviar una protena desplegada del ER al citosol, do--
de es degradada. Se desconoce el mecanismo para orientar *
traslocn en reversa.
En el ER tienen lugar varias actividades importan-
tes. Las protenas se desplazan a travs del ER rum-
bo a diversos destinos, glucosiladas y plegadas en
conformadn final. El ER proporciona un sisteni.;
de "control de calidad" por el cual se identifican y
degradan las protenas plegadas de forma errnea,
No obstante, la degradacin no sucede en el ER, I
podra ser necesario que la protena se exportar
nuevamente al citosol.
La primera indicacin de que las protenas dd
ER son degradas en el citosol y no en el ER misrm
provino de evidencias de implicacin del protea-
soma, agregado protenico grande con numerosas
actividades proteolticas. Los inhibidores del protea-
soma evitan la degradacin de protenas aberrante:-
del ER. Las protenas por degradar son marcadas po:
el proteasoma cuando son modificadas por la adi-
cin de ubiquitina, pequea cadena polipeptdica.
El punto importante es que la adicin de ubiquitina
y la degradacin por proteasomas ocurren en el ci-
tosol (y una proporcin menor en el ncleo).
El transporte del ER al citosol se debe a la in-
versin del proceso usual de importacin, al que se
le llama translocacin inversa (en ocasiones tam-
bin se le llama retrotranslocacin o dislocacin).
para la cual se utiliza el traslocn Secl. Las con-
diciones son distintas; por ejemplo, el traslocn nc
est asociado con un ribosoma. Algunas mutaciones
del Secl impiden la translocacin inversa, pero ni
la translocacin ordenada, quiz por diferencias en
el proceso o (muy probablemente) porque estas re-
giones interactan con otros componentes necesa-
rios para la translocacin inversa.
En la FIGURA 10.26 se seala que se desconoce
la forma en que se abre el canal para permitir la
insercin de la protena en el lado del ER; presu-
miblemente estn implicados componentes espe-
ciales. Un modelo consiste en que los chapetones
reconocen las protenas mal ensambladas o plegadas
234
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
rrrneamente y las transfieren al traslocn. En un
no especfico, el citomegalovirus (CMV) humano
. difica a protenas citoslicas que destruyen a pro-
..nas clase I del complejo mayor de histocompati-
.
:
.dad (MHC, major histocompatibility complex) recin
rintetizadas
, para lo cual se necesita un producto
protenico vrico (el US 11), el cual es una protena
:
membrana que funciona en el ER, interacta con
- protenas del MHC y probablemente las trans-
a al traslocn para la translocacin inversa.
El sistema implicado en la degradacin de pro-
idnas aberrantes del ER puede ser identificado me-
. inte mutaciones (en las levaduras) que conducen
la acumulacin de las mismas. En la mayora de
casos
, una protena que se pliega errneamente
roducida por un gen mutante) es degradada y no
;
nsportada a travs del ER. Los mutantes de leva-
ras incapaces de degradar al sustrato se clasifican
'
ios grupos, los que identifican a componentes
: . mecanismo proteolitico, como las enzimas invo-
cadas en la adicin de ubiquitina, y los que iden-
"
;an a componentes del mecanismo de transporte,
buidos Secl, Bip y Sec63.
Las protenas involucradas en el sistema tam-
r.i han sido identificadas por sus interacciones
"
. el sistema del CMV, cuya protena US 11 pasa
los sustratos del MHC a una protena denomina-
. Derlin que se localiza en la membrana del ER.
.. protena Derlin, a su vez, pasa a los sustratos a
"
3 ATPasa citoslica llamada p97, la cual proba-
mente es responsable de sacarlos del canal, hacia
itosol. La protena Derlin es un homlogo de la
::
"
-P de las levaduras, una de las protenas iden-
"
;adas por mutaciones como parte del sistema de
. slocacin inversa.
TT Las protenas residen
en Las membranas por medio
de regiones hidrfobas
:
'
ceptos principales
-as protenas del grupo I tienen al grupo terminal N en
i extremo distante de la membrana y las del grupo II
presentan una orientacin opuesta.
.
Algunas protenas tienen mltiples dominios
ransmembrana.
= 5 las membranas biol
gicas contienen prote-
:
etenidas en la bicapa de lpidos por medio de
.
-
acciones no covalentes. La definicin opera-
heal de una protena integral de membrana
- e requiere de la discontinuidad de la bicapa de
; -s para ser liberada de la membrana. Una carac-
::
ca comn de dichas protenas es la presencia
Dos tipos de protenas atraviesan
la membrana una sola vez
Las protenas del grupo I tienen el extremo N en el
lado distante y el extremo C en el citosol
Extremo N g
EXTERIOR
CITOSOL
Extremo C Z
Las protenas del grupo II
tienen el extremo C en el
lado distante y el N en el citosol
fcxtremo C
EXTERIOR
CITOSOL
J Extremo N
Las protenas transmembrana del grupo I y del
grupo II tienen orientaciones opuestas respecto de la mem-
brana.
de por lo menos un dominio transmembrana,
formado por un fragmento a-helicoidal de 21 a 26
aminocidos hidrfobos. Una secuencia que cumpla
con los criterios para la insercin en la membrana
puede identificarse por medio de un diagrama de
hidropata, el cual mide la hidrofobicidad acumula-
tiva de un fragmento de aminocidos. Una protena
que tiene dominios expuestos en ambos lados de la
membrana se denomina protena transmembra-
na. La asociacin de una protena con una mem-
brana adopta diferentes formas, y esta topografa
depende del nmero y de la distribucin de las re-
giones transmembrana.
Cuando una protena tiene una sola regin trans-
membrana, su posicin determina la porcin que se
expondr a un lado y otro de la membrana. Una
protena puede tener extensos dominios expuestos a
ambos lados de la membrana o un sitio de insercin
cerca de un extremo, de manera que en un lado se
expone muy poco material, en su caso. La longitud
de la cola terminal N o terminal C que sobresale de
la membrana, cerca del sitio de insercin, puede ser
insignificante o de dimensiones considerables.
En la FIGURA 10. se muestra que las protenas
con un solo dominio transmembrana se agrupan
en dos clases; las del grupo I, en las cuales el gru-
po terminal N apunta hacia el espado extracelular,
son ms comunes que las del grupo , en las cuales
10.13" Las protenas residen en las membranas por medio de regiones hidrfobas
235
Las protemas pueden tener mltiples segmentos
transmembrana
Las protenas que tienen un nmero impar de
dominios transmembrana tienen los extremos N
y C en lados opuestos
(1
w
Las protenas con un nmero par de dominios
transmembrana tienen los extremos N y C
del mismo lado
1
FIGURA 10.28 La orientacin de Los extremos de las protenas
con mLtipies segmentos transmembrana depende de que haya
un nmero par o impar de segmentos transmembrana.
la orientacin ha sido invertida, de manera que el
grupo terminal N apunta hacia el citoplasma. La
orientacin se determina durante la insercin de la
protena en el ER.
En la se muestra la orientacin de
las protenas que tienen mltiples dominios trans-
membrana. Un nmero impar significa que ambos
extremos de la protena estn en lados opuestos de
la membrana, mientras que un nmero par implica
que los extremos se encuentran del mismo lado.
La extensin de los dominios expuestos en uno o
ambos lados depende de la localizacin de los do-
minios transmembrana; los que estn en uno u otro
extremo pueden estar expuestos, y las secuencias
internas ubicadas entre dominios forman "lazos" en
el espacio extracelular o en el citoplasma. Un tipo
comn de estructura es el pasaje de siete dominios
transmembrana, o receptor "serpentina"; otro es el
pasaje de 12 dominios transmembrana que forma
parte de un canal de iones.
Un dominio transmembrana desempea un
papel importante en la funcin protenica, adems
de permitir que la protena se inserte en la bicapa
de lpidos? En las protenas simples del grupo I o del
II, tiene poco qu hacer, y con frecuencia puede ser
remplazado por cualquier otro dominio transmem-
brana. Sin embargo, estos ltimos desempean un
papel importante en la funcin de las protenas que
atraviesan varias veces la membrana o que tienen
subunidades que se oligomerizan dentro de la mem-
brana. En tales casos, los dominios transmembrana
a menudo contienen residuos polares, los cuales no
se encuentran en los dominios individuales trans-
membrana de las protenas del grupo I ni en las del
grupo II. Las regiones polares de los dominios trans-
membrana no interactan con la bicapa de lpidos,
interactan entre s, lo que les permite formar un
poro o canal polar dentro de la bicapa de lpidos. La
interaccin entre dichos dominios transmembrana
puede crear un pasaje hidroflico por el interior hi-
drfobo de la membrana y permitir que las mol-
culas o los iones altamente cargados pasen a travs
de la membrana, adems de ser importante para la
funcin de los canales de iones y el transporte de
los ligandos. Otro caso en el que la conformacin de
los dominios transmembrana es importante, es el de
ciertos receptores que se unen a ligandos lipoflicos,
en cuyo caso, los dominios transmembrana (y no
los dominios extracelulares) se unen a los ligandos
dentro del plano de la membrana.
[[Jg Las secuencias de anclaje
determinan La orientacin
de las protenas
Conceptos principales
.
Una secuencia de anclaje detiene el paso de una
protena a travs del traslocn. Habitualmente esta
secuencia se localiza en el extremo C y resulta en una
orientacin de grupo I en la cual el extremo N ha
pasado a travs de la membrana.
.
Para insertar una protena en la membrana y anclar
el sitio de insercin puede utilizarse una secuencia
combinada ancla-seal. Tpicamente, esto es interno
y resulta en una orientacin de grupo II en la cual el
extremo N es citoslico.
Las protenas secretadas por la clula atraviesan la
membrana mientras permanecen en el canal acuoso
del traslocn, por el contrario, las que residen en las
membranas empiezan el proceso de la misma mane-
ra, pero despus se transfieren del canal acuoso al
interior del ambiente hidrfobo. El reto al explicar
la insercin de protenas en el interior de las mem-
branas es diferenciar a las protenas transmembrana
de las secretadas y encontrar la causa de esta trans-
ferencia. La ruta por la cual las protenas de tipo I o
de tipo II son insertadas en la membrana es igual a
la ruta inicial de las protenas secretoras, basada en
una secuencia de seal que funciona de forma co-
236
CAi'ilULO 10 Localizacin de Las protenas
::
uccional. Sin embargo, las protenas que deben
mnanecer en la membrana poseen una segunda
:
al de parada de transferencia que asume la
ta de un agrupamiento de aminocidos hidrfo-
- adyacentes a algunos residuos inicos. El agru-
ento sirve como ancla para enganchar la pro-
-
a en la membrana y evitar que pase.
Una propiedad sorprendente de las secuencias
7nclaje es que funcionan como secuencias de
al cuando se forman en una localizacin dife-
e.
Cuando se coloca en una protena que carece
tras seales, dicha secuencia suele favorecer la
locacin membranal. Una explicacin posible
estos resultados es que la secuencia de seal y
secuencia de anclaje interactan con algunos
.ponentes comunes del mecanismo de translo-
. in. La unin de la secuencia de seal inicia la
jnslocacin
, aunque la aparicin de la secuencia
i celaje desplaza a la secuencia de seal y detiene
fcansferencia.
la insercin de la membrana empieza con la
r cin de una secuencia de seal en forma de un
B> de horquilla en el que el grupo terminal N per-
ece en el lado citoplsmico. Dos caractersticas
..minan la posicin y la orientacin de una pro-
r en la membrana: la se
paracin de la secuencia
eal y la localizacin de la secuencia de ancla.
la insercin de las protenas tipo I se ilustra en
BURA 10.2 .La secuencia de seal es terminal N,
: . realizacin de la secuencia de anclaje determi-
1 momento en que se detiene la transferencia
l
e protena. Cuando esta secuencia se arraiga en
mbrana, los dominios localizados en el lado
"
inal N estarn en el lumen
, mientras que los
-izados en el lado C
, apuntarn al citosol.
Una localizacin comn para una secuencia de
: ia de transferencia es el extremo C. Como se
nesira en la figura, la transferencia se detiene slo
'
.
do las ltimas secuencias de la protena entran
ia membrana. Este tipo de distribucin es respon-
-
de la localizacin de numerosas protenas en
embrana
, incluidas las de la superficie celular.
ayor parte de la secuencia de la protena est
sta en el lado luminal de la membrana
,
con
;
ola pequea o insignificante apuntando hacia
i .sol.
as protenas tipo II carecen de una secuencia
ivisible en el extremo del grupo N. En cambio,
cenca de seal se combina con una secuencia
ndaje. Supuestamente, la ruta general para la
:
oracin de las protenas tipo I en la membrana
olucra los pasos ilustrados en la
sentencia de seal entra a la membrana, pero las
uencias de seal y de anclaje unidas no pueden
y permanecern en la membrana (quiz in-
Kiuando directamente con la bicapa de lpidos),
1. La secuencia entra a la membrana
N
2. La seal es separada; la translocacin contina
3. La secuencia de anclaje interrumpe la transferencia
C
Las protenas que residen en las membranas
entran por la misma ruta que las secretadas, pero su transfe-
rencia es interrumpida cuando la secuencia de anclaje pasa a
travs de la membrana. Si el ancla se encuentra en el extremo
C
, el volumen de la protena atraviesa la membrana y se expone
en la superficie distante.
mientras que el resto del polipptido creciente con-
tina enrollndose en el ER.
La secuencia seal-ancla suele ser interna, y su
localizacin determina las partes de la protena que
permanecern en el citosol y las que sern extrace-
lulares. En esencia, todas las secuencias terminales
N que preceden al complejo seal-ancla estn ex-
puestas en el citosol, muy frecuentemente la cola
citoslica es corta, de ~6 a 30 aminocidos. En efec-
to, el extremo N es restringido, mientras que el resto
de la protena atraviesa la membrana, con lo cual
se revierte la orientacin de la protena respecto de
la membrana.
Las secuencias seal-ancla combinadas de las
protenas tipo II se asemejan a las secuencias seal
divisibles; en la se ilustra un ejemplo.
Igual que en las secuencias divisibles, la composicin
de aminocidos es ms importante que la secuencia
en s. Las regiones localizadas en las extremidades
de la secuencia seal-ancla portan cargas positivas;
10.14 Las secuencias de anclaje determinan la orientacin de las protenas
237
Los complejos seal-ancla tienen una funcin combina
1. La secuencia seal-ancla entra a la membrana
2. La seal-ancla permanece y la translocacin contina
3.
La translocacin termina
Ce
Una secuenda combinada seal-anda hace que
una protena invierta su orientacin, de manera que el extremo
N permanezca en la cara interna y el C se exponga en la cara
externa de La membrana.
la regin central no tiene carga y se parece al centre
hidrfobo de un lder divisible. Las mutaciones que
introducen aminocidos cargados en la regin cen-
tral evitan la insercin en la membrana; las muta-
ciones localizadas a ambos lados evitan que funcio-
ne el ancla, de manera que la protena es secretad,;
o colocada en un compartimiento incorrerto.
La distribucin de cargas en torno a la secuencia
de anclaje produce un efecto importante en la orien-
tacin de la protena. Normalmente hay ms carga
positivas en el lado del citoplasma (lado terminal K
de las protenas tipo H), pero si las cargas positiva-
son removidas por una mutacin, la orientacin de
la protena puede invertirse. El efecto de las carga:
en la orientacin se resume en la regla del
"
interid;
positivo
"
, la cual asevera que el lado del ancla cor:
las cargas ms positivas se localizar en el citoplas-
ma. En efecto, las cargas positivas proporcionan un
garfio que se engancha en el lado citoplsmico de
la membrana, que a su vez controla la direccin er
que se inserta la regin hidrfoba, determinando as
la orientacin de la protena.
fTro Cmo se insertan Las
prateffias en las membranas?
Concepto principal
La transferencia de los dominios transmembrana del
traslocn al interior de la bicapa de tpidos es activada
por la interaccin de la regin transmembrana con el
traslocn.
Es razonable la comprensin de los procesos por los
cuales las protenas secretadas pasan a travs de la*
membranas y de cmo esto se relaciona con la inser-
Una secuencia seal-ancla cumple con los criterios de las regiones transmembrana
-
Iniciacin
f
.
'
m Citoplsmicos
Asn
Oh Centro hidrfobo
M *> W T,. Ue Gli S*- % O. M., Va, G,y o Se, Leu .lo u Gln ,le
< Regin transmembrana
Gli i*sn {
o
I o
Envoltura
exterior
expuesta w
I O
FIGURA 10.31 La secuenda combinada seal-ancla de la neuramidasa de la influenza se localiza en el extremo N y
tiene un centro hidrfobo.
238
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
Los segmentos tran.
La protena transferente se desplaza a travs del canal
La protena transmembrana reside en la bicapa de lpidos
Cmo hace la transicin una protena trans-
"
embrana y se desplaza a travs de un canal protenico para
"
teractuar directamente con la bicapa de lpidos?
r
.n de las protenas del grupo I y del grupo n con
un dominio transmembrana individual, pero an es
:
nposible explicar los detalles de la insercin de las
protenas con mltiples dominios transmembrana.
Se sabe cmo una protena secretada atraviesa
- la membrana sin problema, sin embargo, es ms
iicil aplicar el mismo modelo a una protena que
.ide en la membrana. En la se ilustra
la diferencia entre la organizacin de una protena
vnsferente, protegida de la bicapa de lpidos por el
.
'
.mal acuoso, y la de una protena transmembrana,
"
.:
e tiene un segmento hidrfobo en contacto di-
.10 con la membrana. La pregunta clave es cmo
. transfiere una protena del canal protenico al
erior de la bicapa de lpidos.
En la IGURA 10.33 se sugiere la posibilidad de
- ..e haya un mecanismo que transfiera dominios
-
.:drfobos transmembrana directamente del canal
al interior de la membrana. Esta idea est respaidada
podas observaciones de un sistema in vitro en el cual
: .nidi la transferencia de protenas con diferentes
. .ninios transmembrana ai interior de un ambien-
v Jipdico. Cuando el dominio pas un umbral de
-
.Jrofobicidad, la protena pudo pasar de un canal
it Secl y TRAM al interior de la bicapa de lpidos.
Atfcms de la hidrofobicidad global, la localizacin
it los residuos polares en los segmentos transmem-
rrana tiene un efecto importante. La explicacin
Una protena de membrana se desplaza hacia
el Interior de la bicapa de lipidos
FIGURA 10.33 Las protenas de membrana recin sintetiza-
das son capaces de transferirse lateralmente del traslocn al
interior de la bicapa de lpidos. Se desconoce el mecanismo
de transferencia.
ms sencilla es que la estructura del canal permite
que la protena transferente entre en contacto con
la bicapa de lpidos, de manera que un segmento lo
suficientemente hidrfobo pueda distribuirse de ma-
nera sencilla directamente en el lpido. La estructura
del traslocn sugiere que entre dos hlices podra
haber una compuerta para la transferencia.
Siempre se ha supuesto que, independiente-
mente del mecanismo exacto, la transferencia del
segmento transmembrana al interior de la mem-
brana es activada por la secuencia transmembrana
que est en el poro. Sin embargo, los cambios del
poro ocurren antes, como respuesta a la sntesis de
la secuencia transmembrana en el ribosoma. Cuan-
do una protena secretada pasa a travs del poro, el
canal se mantiene sellado del lado del citosol, pero
se abre del lado luminal despus de la sntesis de los
primeros 70 residuos. Tan pronto como se ha sin-
tetizado completamente una secuencia transmem-
brana, en otras palabras, mientras est totalmente
dentro del ribosoma, el poro se cierra del lado lu-
minal. No s sabe bien a bien cul es la relacin
de este cambio con la transferencia de la secuencia
transmembrana en el interior de la membrana.
El proceso de insercin en una membrana ha
sido caracterizado para las protenas de tipo I y las
de tipo 11, en las cuales hay un solo dominio trans-
membrana. De qu manera se inserta una prote-
na con mltiples regiones transmembrana en una
membrana? Se sabe mucho menos acerca de este
proceso, pero se supone que se basa en las secuen-
cias con capacidades de seal o de ancla. Un modelo
consiste en suponer que hay una serie alternante
de secuencias de seal y de ancla, y que la trans-
locacin se inicia en la primera secuencia de seal
y contina hasta que es detenida por la primera
secuencia de anclaje. Despus se reinicia mediante
una secuencia de seal subsiguiente hasta que la
interrumpe la siguiente ancla. Es posible que haya
10.15 Cmo se insertan las protenas en las membranas?
'
23.9
varias rutas para la integracin en la membrana,
pues en algunos casos el dominio transmembrana
parece desplazarse al interior de la bicapa de lpidos
tan pronto entra al traslocn. En otros, sin embargo,
puede presentarse una demora hasta que se hayan
sintetizado otras regiones transmembrana.
La insercin en La membrana
despus de La traduccin
depende de Las secuencias Lder
Concepto principal
Las secuencias Lder terminales N proporcionan la
informacin que permite a las protenas asociarse
con las membranas de las mitocondrias o de los
doroplastos.
ORGANELO
unen a I l.
'
il.l,,!.',,!.!. i.l.l
La protena pasa a travs de la
membrana y la secuencia lder
es separada
Protena madura
Lder
La secuencia lder se une al
receptor en la membrana del
organelo
CITOSOL
Las secuencias lder permiten que las protenas
reconozcan las superficies de las mitocondrias o de los cloro-
plastes por medio de un proceso postraduccional.
Las mitocondrias y los doroplastos sintetizan slo
a algunas de sus protenas, las primeras slo a ~I0
y los segundos, a -50. La mayora de las protenas
de los organelos es sintetizada en el citosol por e!
mismo banco de ribosomas libres que sintetiza a las
protenas de ste; despus deben ser importadas al
interior del organelo.
Muchas protenas que entran a las mitocondria?
o a los doroplastos por un proceso postraduccional
tienen secuencias lder encargadas del reconoci-
miento primario de la membrana exterior del orga-
nelo. Como se muestra en el diagrama simplificado
de la , la secuencia lder inicia la inter-
accin entre el precursor y la membrana del orga-
nelo, la protena atraviesa la membrana y el lder es
dividido por una proteasa en el lado del organelo.
En general, los lderes de las protenas importa-
das al interior de las mitocondrias y de los doroplas-
tos tienen aminocidos hidrfobos y bsicos; esta
formados por fragmentos de aminocidos sin carga
interrumpidos por aminocidos bsicos y carecen
de aminocidos cidos, hay poca homologa de otro
tipo, como en la FIGURA 10.35, El reconocimiento del
lder no depende de su secuencia exacta, sino de
su capacidad para formar hlices anfipticas, en la-i
cuales una cara tiene aminocidos hidrfobos y la
otra, aminocidos bsicos.
La secuencia lder contiene toda la informador
necesaria para localizar una protena de organelo,
La capacidad de una secuencia lder puede evaluar-
se construyendo una protena artificial en la cual el
lder de una protena de organelo se une con una.
del citosol. El experimento consiste en crear un gen
hbrido que posteriormente es traducido en la pro-
tena hbrida.
Mediante estos experimentos se ha demostrado
que numerosas secuencias lder son independien-
tes para dirigirse a cualquier secuencia adherida i
la mitocondria o al cloroplasto; por ejemplo, si (a
secuencia lder de la figura 10.35 est adherida a La
protena del citosol DHFR (dihidrofolato reductasa),
la DHFR estar en la mitocondria.
La secuencia lder y la protena transportada re-
presentan dominios que se pliegan de manera inde-
Las seales de asignacin a las mitocondrias son terminales N
.
Hidrfobo Polar Bsico
Iniciacin Divisin
+ + + + +
Me e Ser Leu Are, pn) Sor ib Arg Phe Ph .Us Pro) (Ala Treo'rg r-eo Lou fcis) ,Sor Sor Are tir) Lni Leii
Seal de asignacin a la matriz
La secuencia lder de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa de las levaduras est formada por 25 aminocidos
neutros y bsicos. Los primeros 12 son suficientes para transportar a la matriz mitocondrial cualquier polipptido adherido.
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
rendiente. A pesar de la secuencia a la cual se ad-
ere, el lder debe poder plegarse en una estructura
iruopiada para ser reconocido por los receptores de
envoltura del organelo. La secuencia polipeptdi-
ca adherida no desempea ninguna funcin en el
conocimiento de la envoltura.
Qu restricciones se imponen al transporte de
una protena hidroflica a travs de la membrana hi-
irfoba? Una respuesta podra ser la observacin de
;
je el metotrexato, un ligando de la enzima DHFR,
:
oquea el transporte al interior de la mitocondria
r la DHFR fusionada a un lder mitocondrial. La
nin estrecha del metotrexato impide a la enzima
aplegarse cuando se transfiere a travs de la mem-
::
ina. Para ser asignada, la secuencia de la protena
ansportada no tiene importancia, pero para seguir
s su lder a travs de la membrana, de exibilidad
para desplegarse.
Para la translocacin, la hidrlisis de ATP es
rcesaria dentro y fuera; podra tener que ver con
.
.pujar la protena desde el exterior y jalarla des-
- el interior. En caso de importacin mitocondria]
bacteriana, tambin se requiere de un potencial
-
-ctroqumico a travs de la membrana interna
ra transferir la porcin terminal N del lder.
QQ Una jerarqua de secuencias
determina la localizacin
dentro de los organelos
znceptos orincipales
La porcin terminal N de una secuencia lder dirige a
jna protena a la matriz mitocondrial o al lumen del
:
loroplasto.
Jna secuencia adyacente puede controlar la direccin a
una membrana o a los espacios intermembranosos.
.
Las secuencias son divididas sucesivamente de la
orotena.
mitocondria est rodeada de una envoltura for-
Ja por dos membranas, y las protenas importa-
ai interior de las mitocondrias pueden estar en
~
embrana externa, el espacio intermembrana, la
;
mbrana interna o la matriz; cualquiera que forme
:
-
~
e de una de las membranas, puede estar orienta-
re tal manera que apunte hacia un lado o hacia
tro.
Qu dirige a una protena mitocondrial al
-
partimiento apropiado? La ruta
"
predetermi-
para una protena importada al interior de
: mitocondria es a travs de las dos membranas,
:
a la matriz, propiedad que le confiere la por-
r. terminal N de la secuencia lder. Una prote-
xalizada en el espacio intermembrana o en la
:
mbrana interna requiere de una seal adicional
que especifica su destino en el organelo. Un lder
formado por varias porciones contiene seales que
funcionan de manera jerrquica, como se resume
en la IGURA . La primera parte del lder diri-
ge a la protena al organelo, y necesita la segunda
parte si su destino est en alguna parte ajena a la
matriz. Las dos partes del lder son eliminadas por
divisiones sucesivas.
Ejemplo de ello es el citocromo el, que est uni-
do a la membrana interna y apunta hacia el espa-
cio intermembrana. Su secuencia lder est formada
por 61 aminocidos y puede dividirse en regiones
con funciones distintas. La secuencia de los prime-
ros 32 aminocidos, o incluso la mitad terminal N
de esta regin, puede transportar la DHFR a la ma-
triz, de modo que la primera parte de la secuencia
lder (los 32 aminocidos terminales N) comprende
una seal de asignacin a la matriz. El lder intac-
to, sin embargo, lleva adherida una secuencia, por
ejemplo, la DHFR murina, en el interior del espacio
intermembrana.
Qu impide que la protena rebase el espado
intermembrana si el lder est intacto? La regin
Las seales jerrquicas funcionan de
manera independiente
.
Seal para la
membrana externa
Receptor TOM
Espacio intermembrana
Receptor TIM
\
Matriz (lumen
/
Membrana intern
Seal para el
Membrana externa
espacio intermembrana
Las mitocondrias tienen receptores para el trans-
porte protenico en las membranas interna y externa. El recono-
cimiento en la membrana externa puede provocar el transporte
a travs de ambos receptores, al interior de la matriz, donde el
lder es escindido. S la protena tiene una seal de asignacin
a la membrana, puede ser reexportada.
10.17 Una jerarqua de secuencias determina la localizacin dentro de los organelos
241
-
Regin lder cargada para la asignacin a la mitocondria >
+ + + +
Se!1, sn u Ser lis rg Trp Ala GIn rgtreoeu Ser Lis
Ser
+ +
Treole Lis
'
Gli Ser lis Ser Ala Ala Gli freo Ala freo Ser fir he
Un lder mitocondriai contiene dos seales ndependent
Iniciacin
Divisin 1
Leu Val Treo Ala. Gli 'Val Ala Ala Ala Gli lie Treo Ala Ser Treole Leu tir Ala
Asp-
-
La regin lder continua, sin carga, asigna el sustrato a la membrana interna > ' "
Ser
Treo
Ala
Ala
Divisin 2
FIGURA 10.37 El lder del citocromo el de las levaduras contiene una regin terminal N que
dirige la protena a la mitocondria, seguida de una regin que dirige a la protena (dividida)
a la membrana interna. El lder es eliminado por dos eventos de divisin.
posterior a la seal de asignacin a la matriz (forma-
da por 19 aminocidos del lder) proporciona otra
seal que ubica a la protena en la membrana in-
terna o en el espacio intermembrana. Para nes de
trabajo, esta seal se denomina seal de asignacin
a la membrana.
La composicin de las dos partes de un lder que
contiene ambos tipos de seal es distinta. Como se
indica en la FI , los 35 aminocidos ter-
minales N son semejantes a otras secuencias lder
de los organelos en cuanto al alto contenido de
aminocidos sin carga intercalados con amino-
cidos bsicos, pero los siguientes 19 comprenden
un fragmento ininterrumpido de aminocidos sin
carga lo suficientemente grande como para abarcar
una bicapa de lpidos. Esta seal de asignacin a la
membrana se asemeja a las secuencias implicadas
en la translocacin de las protenas en el interior de
las membranas del ER (vase la seccin 10.7, Las
secuencias de seal inician la translocacin).
La divisin de la seal de asignacin a la ma-
triz es el nico evento de procesamiento que ne-
cesitan las protenas residentes en la matriz, seal
que tambin debe separarse de las protenas que
residen en el espacio intermembrana; sin embargo,
despus de esta divisin, la seal de asignacin a la
membrana (que es ahora la secuencia terminal N
de la protena) dirige a la protena a su destino en
la membrana externa, el espacio intermembrana o
la membrana interna. A su vez, la seal se dividir i
posteriormente.
La seal de asignacin a la matriz terminal .
funciona de la misma manera en todas las protenf
mitocondriales, al ser reconocida mediante un re-
ceptor de la membrana externa ser transportada :
travs de las dos membranas. Ntese que el misn
proceso est involucrado en la divisin de la se;
de asignacin a la matriz, a pesar del destino ir;
de la protena. Esta proteasa es una enzima solub':
en agua y dependiente de Mg2+ que se localiza en b
matriz, as que la secuencia terminal N debe lleg:
a sta, incluso si la protena finalmente residir en
el espacio intermembrana.
La residencia en la matriz ocurre en ausencia
de cualquiera otra seal, pero si hay una seal C:
asignacin a la membrana, sta se activar por 1:
divisin de la seal de asignacin a la matriz. Dea
pus, la porcin remanente del lder (que ahora
terminal N) provoca que la protena se aloje en s i
destino final.
La naturaleza de la seal de asignacin a
membrana es motivo de controversia. Mediar;
un modelo se afirma que toda la protena entra a
matriz, despus de lo cual la seal de asignacin =
la membrana hace que sea reexportada al inter
o a travs de la membrana interna. En un mode
alterno se propone que la secuencia de asignacii -
a la membrana simplemente evita que el resto c-
242
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
m
Espacio de membrana
extenor
Espacio mtermembrana
Primera seal Membrana interna
ESTROMA
Membrana del tilacoide
protena siga al lder a travs de la membrana
:
erna hasta el interior de la matriz. Independien-
d
iente del modelo que se aplique, otra proteasa
balizada en el espacio intermembrana) termina
sliminacin de las secuencias lder.
El desplazamiento a travs de la membrana del
- roplasto se logra de forma similar. En la
B.38 se ilustra la variedad de localizaciones dispo-
Jes para las protenas del cloroplasto, que atra-
can las membranas interna y externa de la envol-
- a para llegar al estroma, proceso que involucra
mismos tipos de desplazamiento al interior de la
itriz mitocondrial. No obstante
, algunas protenas
n transportadas an ms, a travs de las pilas de
-
-
mbrana de tilacoides, hasta el lumen; en su Cami-
las protenas destinadas a las membranas de los
icoides o al lumen deben atravesar el estroma.
Las seales de asignacin de los cloroplastos
:
asemejan a las de las mitocondrias. El lder est
"
;
nado por -50 aminocidos y la mitad terminal
ermite reconocer la envoltura del cloroplasto.
i vre las posiciones 20 y 25 tiene lugar una divisin
- rante o despus del paso a travs de la envoltura,
- modo que las protenas destinadas a la mem-
cana de los tilacoides o al lumen tienen un lder
rminal N nuevo que dirige el reconocimiento de
c embrana de los tilacoides. Son varios los sis-
- .as
(cuando menos cuatro) del cloroplasto que
dizan la importacin de protenas al interior de
- membrana de los tilacoides.
As pues, el principio general que rige el trans-
n e de las protenas al interior de las mitocondrias
:
los cloroplastos consiste en que la porcin ter-
r.
mal N del lder dirige a una protena a la matriz
rganelo, y para ubicarla protena en la mem-
rrana externa
, el espacio intermembrana o la
. rnbrana interna es necesaria una secuencia adi-
nal (dentro del lder).
Las membranas mitocondriaLes
interna y externa tienen
trasLocones distintos
lanceptos principales
El transporte a travs de las membranas mitocondriales
"
"
nterna y externa utiliza diferentes complejos de
'
eceptores.
El complejo TOM (membrana exterior) es un complejo
grande en el que los sustratos protenicos son dirigidos
n canal Tom40 por uno de dos subcomplejos.
.os diferentes complejos TIM (membrana interna) se
jtilizan dependiendo de que el sustrato protenico est
jirigido a la membrana interna o al lumen.
-as protenas pasan directamente del complejo TOM al
romplejo TIM.
Una protena se aproxima al cloroplasto desde
el citosol con un lder de ~50 residuos. La mitad terminal N del
Lder promueve el paso al interior de La envoltura o a travs de
ella hacia el estroma. La escisin ocurre durante el transporte a
travs de la envoltura.
.
{.liiMni-H'lMiHiilfiliiTiiill
r-
CITOSOL
Receptor Tom37,71,70
Receptor Tom22,20
5
'
Tom40 = canal Tom5,6,7
Las protenas TOM forman un complejo de re-
ceptores, o varios, necesario para la translocacin a travs de
la membrana mitocondrial externa.
Los receptores que median el transporte a travs
de cada membrana del cloroplasto y la mitocondria
son diferentes. En el primer caso se denomina TOC
y TIC, en tanto que en las mitocondrias son TOM
y TIM, refrindose a las membranas externa e in-
terna, respectivamente.
El complejo TOM est formado por aproxima-
damente nueve protenas, muchas de las cuales son
protenas integrales de membrana. En la
se muestra un modelo general del complejo.
El agregado TOM mide >500 kD, con un dimetro
de -138 , y forma un canal conductor de iones.
Un complejo consta de dos o tres anillos de 75
10.18 Las membranas mitocondriales interna y externa tienen trasLocones distintos
243
El completo TIM se encuentra en la membrana interna
ESPACIO INTERMEMBRANA
Tim17-23 = canal?
Tim44
MATRIZ
Hsp70
MGE
Las protenas Tim forman el complejo de trans-
locacin a travs de la membrana mitocondrial interna,
de dimetro, cada uno con un poro de 20 de di-
metro.
El Tom40 est incrustado profundamente en la
membrana y proporciona el canal para la transloca-
cin, adems de contactar a las protenas conforme
atraviesan la membrana externa y de unirse a tres
protenas ms pequeas, Tom5, 6 y 7, que pueden
ser componentes del canal o factores de ensamblaje.
Hay dos subcomplejos que proporcionan recepto-
res de superficie. Tom20 y Tom22 forman un sub-
complejo con dominios expuestos en el citosol. La
mayora de las protenas importadas al interior de
las mitocondrias son reconocidas por el subcomple-
jo Tom20,22, receptor primario que reconoce a la
secuencia terminal N de la protena transferente,
Tom37,70,71 proporciona un receptor para un n-
mero ms reducido de protenas que tienen secuen-
cias de asignacin interna.
Cuando una protena es translocada a travs del
complejo TOM, pasa, de estar expuesta al citosol a
estar expuesta al espacio intermembrana, pero nor-
malmente no es liberada, sino transferida directa-
mente al complejo TIM. Es posible capturar interme-
diarios en las cuales el lder es separado de la matriz
por la proteasa, dejando gran parte del precursor
expuesta en la superficie citoslica de la envoltura,
lo cual sugiere que, durante el paso, una protena
abarca las dos membranas. Los complejos TOM y
TIM no parecen interactuar directamente (o cuando
menos no forman un estable complejo detectable),
de modo que pueden estar ligados nada ms por una
protena en trnsito. Cuando una protena transfe-
rente llega al espacio intermembrana, de inmediato
los residuos expuestos pueden unirse a un comple-
jo TIM, mientras que el resto de la protena sigu-
transfirindose a travs del complejo TOM.
En la membrana interna hay dos complejos TIM
de los cuales, Timl7-23 transfiere protenas al lu-
men. Los sustratos son reconocidos porque poseer.
una seal terminal N cargada positivamente. L;
protenas transmembrana Tim 17 a Tim23 formar.
el canal. En la F se muestra que estr
asociadas con la protena Tim44 en el lado de
matriz de la membrana, protena que a su vez
une al chapern Hsp70, asociado tambin con or
el Mge, contraparte del GrpE bacteriano. Esta as. -
dacin garantiza que cuando la protena importad;
llegue a la matriz, se una al chapern Hsp70. La grar.
afinidad del Hsp70 por la conformacin no plegada
de la protena conforme emerge de la membrana
interna ayuda a "jalar" sta a travs del canal.
Una importante actividad del chapern en U
matriz mitocondrial proviene del Hsp60 (que for-
ma la misma clase de estructura que su contrapar-
te GroEL). La asociacin con el Hsp60 es necesaria
para la unin de las subunidades de protenas im-
portadas que forman complejos oligomricos. Un;
protena importada puede ser
"
transmitida" da
Hsp70 al HspO en el proceso de adquisicin de la
conformacin correcta.
El complejo Tim22-54 transfiere a protena?
que residen en la membrana interna.
Cmo encuentra una protena transferente su
camino del complejo TOM al complejo TIM apro-
piado? Dos complejos protenicos localizados en e
espacio intermembrana escoltan a una protena que
se transfiere del complejo TOM al TIM. Los comple-
jos Tim9-10 y Tim8-13 fungen como escoltas de dife-
rentes conjuntos de sustratos protenicos. El Tim9-10
puede dirigir a sus sustratos al complejo Tim22-54
o al Tim23-17, mientras que el complejo TimS-
13 los dirige slo al Tim22-54. Algunos sustratos
no utilizan elTim9-10 ni elTim8-I3, de manera que
tambin debe haber rutas, que se resumen en la
GURA 10.41.
Cul es la funcin de los complejos de escolta?
Tal vez sean necesarios para ayudar a la protena a
salir del complejo TOM, as como para reconocer al
complejo TIM. En la se muestra que
una protena en proceso de transferencia puede pal
sar directamente del canal TOM al complejo Tim9-
10 y despus al interior del canal Tim22-54.
Una protena mitocondrial se pliega en dife-
rentes condiciones antes y despus de atravesar la
membrana. Las condiciones inicas y los chapero-
nes presentes difieren en el citosol y la matriz mito-
condrial, de modo que es posible que una protena
mitocondrial adquiera su conformacin madura sola
en la mitocondria.
244
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
Hay dos rutas de importacin mitocondrial
TOM
CITOSOL
nm9-10 Tim&-13
ESPACIO
INTERMEM-
BRANA
Tm17-23 Tim22-54
MATRIZ
IA 10.41 EL complejo Tim9-10 lleva protenas del TOM a
jier complejo TIM, y Tim8-13 a Tim22-54.
tenas pasan directamente entre las membranas
TOM CITOSOL
:
-
olena pasa , -
; ramente de /
MaTim9-10
espus a TIM
-
12-54 = cana
ESPACIO
IIMTERMEMBRANA
MATRIZ
IA 10.4? Una protena transferente puede ser transpor-
:-
ectamente de TOM a Tim22-54.
Los peroxisomas emplean
otro tipo de sistema
de translocacin
Conceptos principales
Las protenas son importadas al interior de los
peroxisomas en su estado de plegamiento completo.
Tienen una secuencia PTSl en el extremo C o una
secuencia PTS2 en el extremo N.
El receptor Pex5p se une a la secuencia PTSl y el Pex7p
a la PTS2.
Los receptores son protenas del citosol que
transbordan al interior del peroxisoma portando un
sustrato protenico y despus regresan al citosol.
Los peroxisomas son cuerpos pequeos (de 0.5 a
1.
5 ym de dimetro) cubiertos por una sola mem-
brana que contienen enzimas implicadas en el uso
del oxgeno que lo convierten en perxido de hidr-
geno al eliminar tomos de los sustratos. Posterior-
mente, la catalasa utiliza el perxido de hidrgeno
para oxidar diversos sustratos; sus actividades son
cruciales para la clula. Desde que se encontr que
la enfermedad fatal del sndrome de Zellweger es
provocada por falta de peroxisomas, >15 enferme-
dades humanas han sido vinculadas con trastornos
de funcionamiento de los peroxisomas.
Todos los componentes del peroxisoma son im-
portados del citosol; las protenas necesarias para
su formacin se denominan peroxinas, y se han
identificado 23 genes que las codifican. Por otra par-
te, se han localizado enfermedades del peroxisoma
humano en 12 grupos de complementacin, de las
cuales, la mayora se identifica con genes especfi-
cos. Los peroxisomas parecen estar ausentes de las
clulas con mutaciones nulas en algunos de estos
genes, que en ciertos casos reaparecen con la in-
troduccin de un gen de tipo silvestre. En general
se supone que, igual que otros organelos unidos
a membranas, los peroxisomas pueden surgir slo
por duplicacin de peroxisomas preexistentes. Sin
embargo, estos resultados despiertan la duda de si
sera posible ensamblarlos de novo a partir de sus
componentes. Cuando menos en algunos casos,
la
ausencia de peroxinas deja a las clulas con fantas-
mas peroxismicos, o cuerpos membranosos vacos.
Incluso si no es fcil verlos, resulta difcil excluir la
posibilidad de que haya remanentes que sirvan para
regenerarlos.
El transporte de las protenas a los peroxisomas
ocurre despus de la traduccin. Las protenas im-
portadas a la matriz tienen una de dos secuencias
cortas, la seal de asignacin peroxismica 1 (PTS,
peroximal targeting signal) y la PTS2. La PTSl es un
:
L0.'19 Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocacin
245
tripptido o tetrapptido localizado en el extremo
C que originalmente se caracteriz como la secuen-
cia SKL (Ser-Lis-Leu), pero se ha demostrado que
una gran variedad de secuencias hacen las veces de
una PTS1. La adicin de una secuencia adecuada al
extremo C de las protenas del citosol es suficien-
te como para garantizar la importacin al interior
del organelo. La PTS2 es una secuencia de nueve
aminocidos, muy diversos, tambin en este caso,
que puede localizarse cerca del extremo N o inter-
namente. Podra haber incluso un tercer tipo de
secuencia, la PTS3.
Para la importacin de protenas desde el citosol
son necesarias numerosas protenas peroxismicas,
cuyos receptores, ya unidos a los dos tipos de sea-
les se llaman Pex5p y Pex7p, respectivamente. Las
otras protenas son parte de complejos asociados a
membranas e involucrados en la reaccin de trans-
locacin.
El transporte al interior del peroxisoma exhibe
caractersticas inusuales que marcan importantes
diferencias del sistema utilizado para el transporte
a otros organelos.
Las protenas pueden ser importadas al interior
del peroxisoma en estado maduro, totalmente plega-
das, lo cual contrasta con la necesidad de desplegar
una protena para que se introduzca en el ER o la
mitocondria, donde se desplaza a travs de un canal
localizado en la membrana, en el interior del orga-
nelo, de forma semejante a una cadena desplegada
de aminocidos. Si bien no est claro de qu manera
podra expandirse la estructura de un canal preexis-
tente para permitirlo, una posibilidad sera resucitar
una idea antigua y suponer que el canal se ensambla
en torno al sustrato protenico cuando se asocia con
la membrana.
Los receptores Pex5p y Pex7p no son protenas
integrales de membrana, son ms bien citoslicas,
con slo una pequea proporcin asociada con los
peroxisomas, adems de que se comportan de la
misma manera, alternando entre el peroxisoma y el
citosol. En la FIGURA 10.43 se muestra que el receptor
se une al sustrato protenico en el citosol, lo lleva al
peroxisoma, se desplaza con l a travs de la mem-
brana hada el interior y despus regresa al citosol
para emprender otro ciclo. Este comportamiento de
transbordador es semejante al sistema acarreador de
importacin hacia el interior del ncleo.
Las rutas de importacin convergen en la mem-
brana del peroxisoma, donde Pex5p y Pex7p inter-
actan con el mismo complejo protena-membrana
formado por Pexl4p y Pexl3p. Los receptores se
ensamblan a este complejo, y despus, muchas otras
peroxinas se involucran en el proceso de transpor-
tacin al lumen; los detalles del proceso an no han
sido aclarados.
Pex5p
Sustrato
EL receptor Pex5p se une a un sustrato prote -
nico en el citosol, lo transporta a travs de la membrana hada
el interior del peroxisoma y despus regresa al citosol.
Las protenas incorporadas a la membrana dd
peroxisoma llevan una secuencia denominada mPTS
pero poco se sabe sobre el proceso de integracin
La Pex3p puede ser una protena clave porque si rj
est presente, en las membranas de los peroxiso-
mas no se encuentran otras protenas. Por otra parte
PexBp tiene su propia mPTS, que lleva a preguntarse
cmo entra a la membrana, quiz interacta con e
PexBp que ya se encuentra en sta, lo cual influy.
en la duda respecto de que los peroxisomas pueda-
ensamblarse de nuevo.
Las bacterias utilizan tanto
translocacin cotraduccionaL
como translocacin
postraduccionaL
Concepto principal
.
Las protenas bacterianas exportadas a las
membranas o a travs de ellas utilizan mecanismos
postraduccionales y cotraduccionales.
La envoltura bacteriana est formada por dos capas
de membrana, y el espacio intermedio se conoce
como periplasma. Las protenas se exportan del
citoplasma para que residan en la envoltura o sear
secretadas por la clula. Los mecanismos de secre-
cin de las bacterias son similares a los caracteriza-
246
CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
s en las clulas eucariticas, con la posibilidad de
conocer algunos componentes relacionados. La
URA 10.- muestra las protenas exportadas del
plasma con uno de cuatro destinos posibles:
.
ser insertadas en la membrana interna
.
ser transferidas a travs de la membrana in-
terna para postrarse en el periplasma
.
ser insertada en la membrana externa o
.
ser translocadas a travs de la membrana,
hacia el medio.
Varios de los complejos protenicos de la mem-
i na interna son responsables del transporte de las
:
enas, ya sea que estn destinadas a atravesar
membrana interna o a permanecer en ella. Esta
-acin es semejante a la observada en las mito-
-
Jrias, donde complejos diferentes de la membra-
i interna y de la externa manejan subconjuntos
:
:
ntos de sustratos protenicos, dependiendo de
:
estino (vase la seccin 10.16, La insercin en la
:
-
nbrana despus de la traduccin depende de las
;
uencias Kder). Una diferencia con la importacin
terior de los organelos es que la transferencia en
// puede ser cotraduccional o postraduccional.
-
nas protenas son secretadas de manera cotra-
::
ional o postraduccional, y la cintica relativa
:
traduccin frente a la secrecin a travs de la
mibrana podra determinar el balance.
Las protenas bacterianas exportadas tienen se-
vicias lder terminales N con un extremo N hi-
;:
lico y un centro hidrfobo adyacente. El lder
;
para mediante una peptidasa seal que recono-
3s formas precursoras de muchas protenas ex-
piadas. La peptidasa seal es una protena integral
. embrana localizada en la membrana interna.
mutaciones que se producen en los lderes ter-
~
"l
es N evitan la secrecin, y son suprimidas por
- aciones de otros genes, que, por lo tanto, son
finidos como componentes del mecanismo de ex-
.Hcin de protenas. Muchos genes, de acuerdo
a descripcin general del sec, estn implicados
i codificacin de componentes del mecanismo
etor por las mutaciones que bloquean la secre-
bd de muchas, o todas, las protenas exportadas.
EL sistema Sec transporta
protenas al interior
de La membrana interna
y a travs de eLLa
:
eptos principales
Eltraslocn bacteriano SecYEG de la membrana interna
rit relacionado con el traslocn eucaritico Sec61.
En la orientacin de las protenas secretadas al
:
-
3slocn estn implicados varios traslocones.
Las bacterias tienen dos membranas
Protena de
la membrana
interna
Protena
periplsmica
Transporte protenico
postraduccional
CITOPLASMA
t
t
Protena de
ia membrana
extema
OH
r
Membrana interna
PERIPLASMA
Membrana externa
Protema
Translocacin
cotraduccional
Las protenas bacterianas pueden ser exportadas
de manera postraduccional o cotraduccional y ser ubicadas en la
membrana o en el espacio periplsmico, o bien, ser secretadas.
La peptidasa
seal divide
el extremo N
El SecYEG es
un complejo
transmembrana
CITOPLASMA
SecB es un chapern
que se une a la
protenas naciente
SecA es un motor
asociado a la membrana
FIGURA 10.45 El sistema Sec consta del traslocn SecYEG
incrustado en la membrana, la protena asociada a SecA que
impulsa a las protenas a travs del canal, el chapern SecB que
transfiere las protenas nacientes al SecA y la peptidasa seal
que divide la seal terminal N de la protena translocada.
Hay varios sistemas de transporte a travs de la
membrana interna, pero el mejor caracterizado es
el sistema Sec, cuyos componentes se muestran en
la FIGURA 10.45. El traslocn incrustado en la mem-
brana consta de tres subunidades relacionadas con
los componentes del Secl de las levaduras y los
mamferos, cada una de las cuales es una protena
integral transmembrana (SecY tiene 10 segmentos
transmembrana; SecE, tres). El traslocn funcional
es un trmero con una copia de cada subunidad.
La ruta principal para dirigir a las protenas al traslo-
cn consiste en SecA y SecB. Este ltimo es un cha-
pern que se une a la protema naciente para con-
10.21 El Sistema Sec transporta protenas al Interior de la membrana interna y a travs de ella
247
Hay rutas diferentes para el traslocon
I
Jl
S=a SecA
4.5S RNA
FtsY
;
S
"
.
-
-
SecB
-
Ffh
r
SecB/SecA transfiere protenas altraslocn que
pasa a travs de La membrana. El RNA 4.5S transfiere a las
protenas que entran a La membrana.
trolar el plegamiento y que transfiere a la protena al
SecA, el cual, a su vez, la transfiere al traslocon.
En la se muestra que son dos las
formas principales de dirigir las protenas al canal
Sec:
.
el chapern SecB y
.
laSRPbasadaenelRNA4.5S
Muchos chaperones pueden incrementar la
eficiencia de la exportacin protenica bacteriana
impidiendo el plegamiento prematuro; incluyen
el
"
factor desencadenante" GroEL (caracterizado
como chapern que colabora con la exportacin)
(vase la seccin 10.5, Las protenas desnaturali-
zadas y las recin sintetizadas requieren de chape-
rones, y la 10.8, La secuencia de seal interacta
con la SRP) y la protena SecB (identificada como
el producto de uno de los mutantes sec). SecB es la
menos abundante de estas protenas, pero desem-
pea la importante funcin de fomentar la expor-
tacin, que comprende dos actividades. Primero,
la SecB se comporta como chapern y se une a
una protena naciente para retrasar el plegamien-
to, no puede revertir el cambio de estructura de
una protena plegada, de manera que no funcio-
na como factor de desdoblamiento, por lo tanto,
su funcin es inhibir el plegamiento errneo de la
protena recin sintetizada. Segundo, la SecB tiene
cierta afinidad por la protena SecA que le permite
dirigir a un precursor protenico a la membrana. La
ruta SecB-SecYEG se utiliza para la translocacin
de protenas secretadas en el interior del periplasma
y se resumen en la FIGURA 10.47,
SecA es una gran protena perifrica de mem-
brana que tiene alternativas para asociarse con la
membrana. Como protena perifrica de membrana,
se asocia con esta membrana gracias a su afinidad
SecA impulsa la translocacin
SecB transfiere la protena a SecA
CITOPLASMA
SecA inserta protenas en el traslocon
SecA se recicla
SecB transfiere una protena naciente al Sec-
el cual la inserta en el canal. La translocacin requiere de .i
hidrlisis de ATP y de una fuerza protonmotriz. SecA ejecu::
ciclos de asociacin y disociacin con el canal y proporcions
la fuerza motriz para empujar la protena.
por lpidos cidos y por el componente SecY del
traslocn, los cuales son parte de un complejo de
subunidades mltiples que proporciona la funcir
translocasa. No obstante, en presencia de otras pro-
tenas (SecD y SecF), SecA puede asumir la forms
de una protena transmembrana. Probablemente
constituye el motor que empuja al sustrato prote-
nico a travs del traslocn SecYEG.
La SecA reconoce a la SecB y al precursor prote-
nico, a los cuales sirve de chapern; es muy probable
que las caractersticas de la secuencia de la protena
madura, as como su lder, sean necesarias para a
reconocimiento. La SecA tiene actividad ATPasa que
depende de la unin con lpidos, la SecY y la prote-
na precursora. La ATPasa funciona de forma cclica
durante la translocacin. Despus de unirse a un
precursor protenico, la SecA se une al ATP y -20
aminocidos son translocados a travs de la mem-
brana. Para liberar al precursor de la SecA se nece-
sita la hidrlisis de la ATP, para que pueda repetirse
el ciclo. El precursor protenico se une de nuevo I
248 CAPTULO 10 Localizacin de las protenas
oporciona el estmulo para unir ms molculas de
BP, transferir otro segmento de protena y liberar
precursor. La SecA puede alternar entre la forma
;
egral y la perifrica de la membrana durante la
mslocacin; en cada ciclo, un dominio de 30 kD
SecA puede insertarse en la membrana y despus
actarse.
La translocacin tambin puede suceder por
proceso. Cuando un precursor es liberado por
5 ecA, puede ser conducido a travs de la mem-
a por una fuerza protonmotriz (es decir, un po-
cial elctrico a travs de la membrana), que no
je iniciar la transferencia a travs de la membra-
ero s continuar el proceso iniciado por un ciclo
;
cin ATPasa de la SecA, de modo que despus
:
los ciclos de la reaccin mediada por el complejo
-
A-ATP
, o entre ellos, la fuerza protonmotriz pue-
:
mpulsar la translocacin del precursor.
51 complejo ribonucleoprotenico de E. coli
ado por RNA 4.5S y las protenas Ffh y FtsY
tituye una contraparte de la SRP eucaritica
5se la seccin 10.9, La SRP interacta con el re-
Jor de la SRP), cuya fundn quiz sea mantener a
protena naciente en una conformacin apro-
pia hasta que interacte con otros componentes
mecanismo secretor, se necesita para la secre-
in de algunas protenas, pero no de todas. Como
bserva en la Figura 10.46, sus sustratos son pro-
-
.as integrales de membrana. La base de la selec-
diferencial de sustratos es que la SRP de E. coli
noce una secuencia de anclaje localizada en la
na (por definicin, las secuencias de anclaje
n presentes slo en las protenas integrales de
mbrana). Los cloroplastos tienen contrapartes
i i protenas Ffh y FtsY, pero no requieren de un
ponente de RNA.
La proteina MI3 se inserta en las membranas
El contacto inicial es electrosttico
+ +
Se inserta el lder hidrfobo
La protena se transfiere
+ +
llTtSraCCiOtSS
hidrfobas
Fuerza
proiormoiriz
La protena de envoltura M13 se inserta en La
membrana interna al hacer un contacto electrosttico inicial,
seguido de la insercin de secuencias hidrfobas. La translo-
cacin es conducida por interacciones hidrfobas y una fuer-
za protonmotriz hasta que la secuencia de anclaje entra a la
membrana.
Sistemas de translocacin
independientes de Sec
en F. coli
"
ceptos principales
Escherichia coli y los organelos tienen sistemas de
translocacin protenica relacionados.
Jn sistema permite que ciertas protenas se inserten
i' las membranas sin un mecanismo de translocacin.
;
C es homlogo al sistema mtocondrial para la
"
- isferenca de protenas al interior de la membrana
iterna.
I
. sistema tat transfiere a protenas con un elemento
:
; arginina doble al espacio periplsmico.
stema alterno ms sobresaliente para la translo-
in de protenas en E. coli se presenta en la pro-
tena de envoltura del fago MI 3. En la
se observa que parece no necesitar ningn meca-
nismo de translocacin! Puede insertarse de forma
postraduccional en el interior de los liposomas sin
protenas. Dirigir la protena hacia la membrana im-
plica secuencias especficas (formadas por residuos
bsicos) en las regiones terminal N y terminal C
que pueden interactuar con cabezas de fosfolpidos
con carga negativa. Posteriormente, la protena en-
tra a la membrana utilizando grupos hidrfobos en
su secuencia lder terminal N y una secuencia de
anclaje interna. La hidrofobicidad es la fuerza im-
pulsora principal para la translocacin, pero puede
ser asistida por una fuerza protonmotriz generada
entre el lado periplsmico de la membrana, cargado
positivamente, y una regin cida de la protena,
que lleva a sta atravesar la membrana; la peptidasa
del lder puede posteriormente separar la secuencia
10.22 Sistemas de translocacin independientes de Sec en E. coli
249
terminal N. La generalizacin de este mecanismo
en las bacterias no est clara, puede aplicarse slo
al caso especial de las protenas de envoltura del
bacterifago. Algunas protenas de los cloroplastos
pueden insertarse en la membrana de los tilacoides
por una ruta similar.
Las mutaciones del gen yidC bloquean la inser-
cin de protenas en la membrana interna. Dicho
gen es homlogo de la protena Oxalp, necesaria
cuando las protenas son insertadas en la membrana
mitocondrial interna desde la matriz
, el cual pue-
de funcionar independientemente de la SecYEG o
aunada a ella. La insercin de algunas protenas
dependientes del YidC requiere de SecYEG,
lo cual
sugiere que YidC acta en conjunto con el traslocn
para desviar el sustrato en la insercin a la membra-
na de manera opuesta a la secrecin. Otras prote-
nas cuya insercin depende del YidC no necesitan
SecYEG, parece probable que sean necesarias otras
funciones (no identificadas) y no el traslocn.
El nombre del sistema tat se deriva de su ca-
pacidad para transportar protenas que portan un
elemento de arginina doble; su responsabilidad es
la translocacin de protenas que tienen cofactores
estrechamente unidos, lo cual podra implicar limi-
taciones en su capacidad para desplegarse y atrave-
sar la membrana. Este fenmeno ira en contra del
principio de la mayora de los sistemas de transloca-
cin, en los cuales la protena pasa desplegada a tra-
vs de la membrana y ya madura, despus de haber
pasado, se pliega. Este sistema est relacionado con
un sistema del lumen del tilacoide del cloroplasto
llamado HcflO. Ambos transportan protenas al
interior del periplasma.
Resumen
Una protena que se inserta en una membrana o que
la atraviesa, tiene una secuencia de seal reconocible
por un receptor que forma parte de la membrana o
que puede asociarse con ella. La protena pasa a tra-
vs de un canal acuoso creado por la protena trans-
membrana que reside en la membrana. En casi todos
los casos, la protena pasa desplegada por el canal, y
es necesario que se asocie con los chaperones cuan-
do emerge para adquirir la conformacin correcta.
La excepcin principal es el peroxisoma,
en el cual
una protena importada con conformacin madura,
se une a una protena del dtosol que la transporta a
travs del canal localizado en la membrana.
La sntesis de protenas en el citosol empieza
en los ribosomas
"
libres". Las protenas secretadas en
la clula o insertadas en membranas del sistema re-
ticuloendotelial inician con una secuencia de seal
terminal N que hace que el ribosoraa se adhiera a la
membrana del retculo endoplsmico. La proten;
es translocada a travs de la membrana por trans-
ferencia cotraduccional. El proceso empieza cuan-
do la secuencia de seal es reconocida por la SRF
(partcula ribonucleoprotenica), que interrumpe
traduccin, se une a su receptor en la membran;
del ER y transfiere la secuencia de seal al recepte
Sec61/TRAM ubicado en la membrana. La sntesi-
se reinicia y la protena es translocada a travs de U
membrana mientras est siendo sintetizada, aunqiK
no hay una conexin energtica entre los proceso?
El canal que atraviesa la membrana proporciona un
ambiente hidxoflico y est formado principalmenu
por Secl.
Una protena secretada atraviesa por complei
la membrana, hasta el lumen del ER. Las proten?'
integradas en las membranas se dividen en dos tipcK
generales, con base en su orientacin. En las prote-
nas integrales de membrana tipo I, la secuencia dt
seal terminal N es dividida y la transferencia a tra-
vs de la membrana se interrumpe posteriormenr.
por una secuencia de anclaje. La protena se orient:
en la membrana con su extremo N localizado en
el lado alejado y con su extremo C, ubicado en t
citosol. Las protenas tipo n no tienen una seal ter-
minal N divisible, sino una secuencia combinada se-
al-ancla, la cual entra a la membrana y se incrust
en ella, fenmeno que provoca que el extremo C
localice en el lado alejado, mientras que el extrem1
N permanece en el citosol. La orientacin de la se-
cuencia seal-ancla depende de la regla del
"
interior
positivo
"
, que afirma que el lado del ancla con ms
cargas positivas se localizar en el citoplasma. La-
protenas que tienen regiones transmembrana nl-
cas se desplazan lateralmente del canal a la bicapc
de lpidos; dichas regiones pueden ser varias, con la-
zos localizados entre ellas que sobresalen en ambi -
lados de la membrana. Se desconoce el mecanism'
de insercin de segmentos mltiples.
Si no hay una seal especfica, una protena 3
liberada en el citosol cuando termina su sntesis. Ltis
protenas se importan de manera postraducciona
al interior de las mitocondrias y de los cloroplasto?
poseen secuencias lder terminales N que las dirige"
a la membrana externa de la envoltura del orga-
nelo y posteriormente son transportadas a trav?
de las membranas interna y externa, a la matriz
La translocacin requiere de ATP y de un poten-
cial para atravesar la membrana interna. El lder
terminal N es escindido por una proteasa que d
encuentra en el organelo. Las protenas que reside;
en las membranas o en el espacio mtermembran;
poseen una seal (que se vuelve terminal N cuand
se elimina la primera parte del lder) que provoca Ja
exportacin de la matriz a la localizacin apropiad:
o que detiene la transferencia antes de que toda U
250
CAPTULO 10 Localizacin de Las protenas
r:na haya entrado a la matriz. El control del
-
Cimiento mediante Hsp70 y Hsp60,
ubicados en
i
'
.
riz mitocondrial, es una caracterstica impor-
-
- '
r del proceso.
1 as mitocondrias y los cloroplastos tienen com-
-
> de receptores separados que crean canales
ri.cs de la membrana interna y de la externa.
..
> las protenas importadas pasan directamen-
rl complejo TOM localizado en la membrana
-
Ta a un complejo TIM que se encuentra en la
r~b
rana interna. Las protenas que residen en el
Codo intermembrana o en la membrana externa
reexportadas desde el complejo TIM despus
- _
e entran a la matriz. El complejo TOM utiliza
ntes receptores para protenas importadas de-
pendo de que tengan secuencias de seal termi-
N o internas, y las dirige al interior del canal
0
. Hay dos receptores TIM en la membrana
a
, uno es utilizado por las protenas cuyo des-
final es la matriz interna y el otro por las que
reexportadas al espacio intermembrana o a la
brana externa.
las bacterias tienen componentes para la trans-
pon a travs de la membrana que se relacionan
-
- )s del sistema cotraduccional eucaritico, pero
mslocacion a menudo tiene lugar mediante un
-
mismo postraduccional. SecY/E proporcionan
:
slocasa, y la SecA se asocia con el canal, ade-
e estar implicada en la insercin y la propul-
'
del sustrato protenico. SecB es un chapern
.
acarrea a la protena hasta al canal. Algunas
-
:
nas integrales de membrana son insertadas
;
canal por una interaccin con un aparato se-
t ante a la SRP
, formado por RNA 4.5S y por las
-
:
inas Ffh y FtsY.
la protena YidC es homloga a una protena
aondrial
, es necesaria para la insercin de al-
-
as protenas de membrana.
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Referencias 255
11
I
Transcripcin
ESQUEMA DEL CAPTULO
DO Introduccin
BO La transcripcin ocurre por medio de
apareamiento de bases en una
"
burbuja" de DNA
no apareado
.
La polimerasa de RNA separa las dos cadenas de DNA en
una
"
burbuja" transitoria y utiliza una cadena como molde
para dirigir la sintesis de una secuencia complementaria de
RNA.
La longitud de la burbuja es ~12 a 14 bp y la longitud del
hbrido de RNA-DNA dentro de ella es de ~8 a 9 bp.
1M La reaccin de La transcripcin consiste en tres
etapas
.
La polimerasa de RNA inicia la transcripcin despus de
unirse a un sitio promotor en el DNA.
.
Durante la elongacin la burbuja de transcripcin se
desplaza a lo largo del DNA y la cadena de RNA se extiende
en direccin 5
'
-3
'
,
.
Cuando la transcripcin se detiene, el dplex de DNA se
vuelve a formar y la polimerasa de RNA se disocia en un
sitio de terminacin.
mKm La polimerasa de RNA deL fago T7 es un sistema
de modeLos tiL
Las polimerasas de RNA de los fagos T3 y T7 son
polipptidos individuales con actividades mnimas en el
reconocimiento de un pequeo nmero de promotores de
fagos.
Las estructuras cristalinas de la polimerasa de RNA T7 con
DNA identifican la regin de unin al DNA y el sitio activo,
La estructura cristalina sugiere un modelo de
desplazamiento enzimtico
.
El DNA se desplaza por un surco de la polimerasa de RNA de
Las levaduras que forma una vuelta pronunciada en el sitio
activo.
Un puente protenico cambia la conformacin para
controlar la entrada de los nucletidos al sitio activo.
mtmim La polimerasa de RNA bacteriana est formada por
mltiples subunidades
.
Las polimerasas centrales de RNA bacterianas son
complejos de subunidades mltiples de -500 kD con una
estructura general a
2
pP'.
El DNA est unido en un canal y entra en contacto con la
subunidades p y P
'
.
mtWM La polimerasa de RNA est formada por La enzima
central (o enzima medular) y por un factor a
La polimerasa de RNA bacteriana puede dividirse en la
enzima central a
2
pP', la cual cataliza la transcripcin, y en
la subunidad a, que es necesaria slo para la iniciacin. 1
El factor a cambia las propiedades de unin al DNA de la ]
polimerasa de RNA de tal manera que su afinidad por el j
DNA general se reduce y su afinidad por los promotores
aumenta.
.
Las constantes de unin de la polimerasa de RNA a
diferentes promotores varian en alrededor de seis rdenes!
de magnitud, lo cual corresponde a la frecuencia con la
cual la transcripcin es iniciada en cada promotor.
m:l La asociacin con el factor a cambia en la
iniciacin
.
Cuando la polimerasa de RNA se une a un promotor, separa
las cadenas de DNA para formar una burbuja de transcripcifi
e incorpora hasta nueve nucletidos en el RNA.
Puede haber un ciclo de iniciaciones abortivas antes de qj
la enzima avance a la siguiente fase.
.
El factor o puede ser liberado de la polimerasa de RNA
cuando la cadena naciente de RNA alcanza una longitud 9
ocho a nueve bases.
mtwu Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la
transcripcin
.
Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la
transcripcin al separar al transcrito de RNA para generar
un extremo 3
'
nuevo.
itmn Cmo encuentra una polimerasa de RNA las
secuencias promotoras?
La velocidad con la cual la polimerasa de RNA se une a
[os promotores es demasiado alta para que la justifique ta
difusin aleatoria.
.
Es probable que la polimerasa de RNA se una a sitios
aleatorios del DNA y los intercambie por otras secuencias
con bastante rapidez hasta que encuentra un promotor. I
I1BU El factor a controla la unin al DNA
Un cambio en la asociacin entre el factor a y la
holoenzima modifica la afinidad de unin por el DNA de ta
256
manera que la enzima central puede desplazarse a lo
largo del DNA.
WTO El reconocimiento del promotor depende
de las secuencias de consenso
.
Un promotor es definido por la presencia de secuencias
de consenso cortas en localizaciones especificas.
.
Las secuencias de consenso promotoras estn formadas
por una purina en el punto de inicio, por el hexmero
TATAAT centrado en -10, y por otro hexmero centrado
en -35.
.
Los promotores individuales suelen diferir del consenso
en una o ms posiciones.
Mf La eficiencia de los promotores puede
aumentar o disminuir por medio de
mutaciones
.
Las mutaciones lentificadoras que disminuyen la
eficiencia de un promotor a menudo reducen la
adaptacin a las secuencias de consenso, mientras que
las mutaciones aceleradoras tienen el efecto contrario.
Las mutaciones que se presentan en la secuencia -35
suelen afectar la unin inicial de la polimerasa de
RNA.
.
Las mutaciones localizadas en la secuencia -10 a
menudo influyen en la reaccin de desnaturalizacin
que convierte un complejo cerrado en uno abierto,
Kl La polimerasa de RNA se une a una cara del
DNA
Las secuencias de consenso localizadas en -35 y -10
proporcionan la mayor parte de los puntos de contacto
para la polimerasa de RNA en el promotor.
Los puntos de contacto se encuentran en una de tas
caras del DNA.
mma El superenrollamiento es una caracterstica
importante de la transcripcin
.
El superenrollamiento negativo incrementa la
eficiencia de algunos promotores al ayudar en la
reaccin de desnaturalizacin.
.
La transcripcin genera superenrollamientos positivos
delante de la enzima y superenrollamientos negativos
detrs de ella, y stos deben ser retirados por la girasa
y por la topoisomerasa.
mtt.f La sustitucin de los factores o puede
controlar la iniciacin
Escherichia.coli tiene numerosos factores o, cada uno
de los cuales provoca que la polimerasa de RNA inicie
en un conjunto de promotores definido por secuencias
especificas -35 y -10.
a70 se utiliza en la transcripcin general y los dems
factores a son activados por condiciones especiales.
*mtt Los factores o contactan de manera directa
al DNA
.
a' cambia su estructura para liberar a sus regiones de
unin al DNA cuando se asocia a la enzima central.
.
a70 se une a las secuencias -35 y -10.
mmt.i Los factores o pueden organizarse en cascadas
Una cascada de factores o se crea cuando un factor a
es necesario para transcribir al gen que codifica al
siguiente factor o.
.
Los genes tempranos del fago SP01 son transcritos por
una polimerasa de RNA hospedadora.
.
Uno de los genes tempranos codifica un factor a que
hace que la polimerasa de RNA transcriba los genes
intermedios.
Dos de los genes intermedios codifican subunidades
de un factor o que hace que la polimerasa de RNA
transcriba los genes tardos.
nm.'i La esporulacin es controlada por factores o
La esporulacin divide a una bacteria en una clula
madre que es desintegrada y una espora que es
liberada.
.
Cada compartimiento avanza a la siguiente etapa
de desarrollo al sintetizar a un factor o nuevo que
desplaza al factor a anterior.
.
La comunicacin entre los dos compartimientos
temporiza las sustituciones de los factores a.
UWM La polimerasa de RNA bacteriana termina
en sitios discretos
.
La terminacin puede requerir el reconocimiento de
la secuencia terminadora en el DNA y la formacin de
una estructura en forma de horquilla en el producto de
RNA.
ai Hay dos tipos de terminadores en E. coi
.
Los terminadores intrnsecos estn formados por una
horquilla abundante en G-C localizada en el producto
de RNA seguida por una regin rica en U en la cual
ocurre la terminacin.
nmtn Cmo funciona el factor p?
.
El factor p es una protena terminadora que se une a
un sitio rut ubicado en un RNA naciente y viaja por el
RNA para liberarlo de la estructura del hibrido de
RNA-DNA en la polimerasa de RNA.
iem La antiterminacin es un episodio regulador
.
La terminacin es inhibida cuando las protenas
antiterminacin actan sobre la polimerasa de RNA
para provocar que sta lea a travs de un terminador
especifico o de varios de ellos.
.
El fago X tiene dos proteinas antiterminacin, pN
y pQ, las cuales actan en diferentes unidades de
transcripcin.
nwa La antiterminacin requiere sitios que sean
independientes de los terminadores
El sitio en el cual una protena antiterminacin
acta se encuentra en sentido ascendente al sitio de
terminacin en la unidad de transcripcin.
. La localizacin del sitio antiterminador vara en casos
diferentes y puede ubicarse en el promotor o dentro de
la unidad de transcripcin.
nma Los factores de terminacin y de
antiterminacin interactan con la polimerasa
de RNA
.
Numerosas proteinas bacterianas son necesarias para
que la pN de X interacte con la polimerasa de RNA.
.
Estas protenas tambin participan en la
antiterminacin en los operones rrn de la bacteria
hospedadora.
.
El antiterminador pQ de X tiene un mecanismo de
accin diferente que comprende la unin al DNA en el
promotor.
itma Resumen
11 Transcripcin 257
Una cadena de DNA se tran
Cadena codificadora
\ ?V ?V = TACGCGGTACGGTCAATGCATCTACCT
* ' * * 3'ATGGGCGATGGGAGTTAGGTAGATGGA
Cadena molde
TRANSCRIPCIN
Transcrito de RNA
x/x/xx
La secuencia de RNA es
complementaria a la cadena
molde e idntica a la cadena
codificadora
5' UACGCGGUACGGUCAAUGCAUCUACCU
La funcin de la poLimerasa de RNA es copiar a RNA una cadena deL DNA dpLex.
Las promotores y los terminadores definen la unidad
Punto de inicio
Pronioto
-
35-10-1+1 +10
Terminador
Proximal Distal
Sentido Sentido
ascendente descendente
FIGURA 11.2 Una unidad de transcripcin es una secuencia de
DNA transcrita a una cadena individual de RNA
, que comienza
en el promotor y finaliza en el terminador.
gTWl Introduccin
La transcripcin comprende la sntesis de una cadena
de RNA que representa a una cadena del DNA d-
plex. Cuando se dice
"
que representa
"
, lo que se quie-
re decir es que el RNA tiene una secuencia idntica a una
de las cadenas del DNA, la cual se denomina cadena
codificadora. Es complementaria a la otra cadena, la
cual es la cadena molde para su sntesis. La TGURA
recapitula la relacin entre el DNA de doble ca-
dena y su transcrito de RNA de cadena individual.
La sntesis de RNA es catalizada por la enzima
polimerasa de RNA. La transcripcin comienza
cuando la polimerasa de RNA se une a una regin
especial, el promotor, que se encuentra en el inicio
del gen. El promotor rodea al primer par de bases que
se transcribe en RNA, el punto de inicio. A partir
de este punto, la polimerasa de RNA se desplaza a lo
largo del molde, sintetizando RNA, hasta que alcanza
a una secuencia terminadora (f). Esta accin define
a una unidad de transcripcin que se extiende
desde el promotor hasta el terminador. La caracters-
tica determinante de la unidad de transcripcin, qu<
se describe en la FIGURA 11.2, es que constituye ur
fragmento de DNA expresado por medio de la produc-:-
de una sola molcula de RNA. Una unidad de transcrip-
cin puede incluir a ms de un gen.
Las secuencias que se encuentran antes del pun-
to de inicio se describen en flujo ascendente a
aquellas que se encuentran despus del punto de ini-
cio (dentro de la secuencia transcrita) se encuentran
en flujo descendente a l. Convencionalmcntc, i:
secuencias se escriben de tal manera que la transcrip-
cin proceda de izquierda (en flujo ascendente) :
derecha (en flujo descendente). Esto corresponde a;:
escritura del RNAm en la direccin habitual 5
'
-
>3
La secuencia de DNA a menudo se escribe P|H
mostrar slo a la cadena codificadora, la cual tiei: -
la misma secuencia que el RNA. Las posiciones c:
las bases se numeran en ambas direcciones lejos c .
punto de inicio, al cual se le asigna el valor +1; 1qs;
nmeros se incrementan a medida que avanzan en
flujo descendente. A la base anterior al punto de ir
ci se le asigna el nmero -1, y los nmeros nega-
tivos se incrementan en flujo ascendente. (No h;
ninguna base a la que se le asigne el nmero 0.
Al producto inmediato de la transcripcin se
denomina transcrito primario. Consiste en R5-
que se extiende desde el promotor hasta el tenr
nador y posee los extremos originales 5
'
y 3'. 5;
embargo, el transcrito primario casi siempre es ines-
table. En las procariotas, se degrada con rapidez i
RNAm) o se divide para formar productos madur
(RNAry RNAt). En las eucariotas, es modificado r
los extremos (RNAm) o dividido para formar p:
ductos maduros (todos los RNA).
La transcripcin es la primera etapa de la r
presin gnica y el paso principal en el cual es COI
trolada. Las protenas reguladoras determinan
un gen particular est disponible para ser transen"
por la polimerasa de RNA. El paso inicial (y c
frecuencia el nico) en la regulacin es la decis: l
de transcribir o no a un gen. La mayora de los
sodios reguladores ocurren en la iniciacin de
258 CAPTULO 11 Transcripcin
"
.
-
cripcion, aunque en ocasiones son reguladas
pas subsiguientes de la transcripcin (u otras eta-
ie la expresin gnica).
En este contexto, surgen dos interrogantes b-
ts con respecto a la expresin gnica:
.
Cmo encuentra la polimerasa de RNA a
los promotores en el DNA? ste es un ejem-
plo particular de una pregunta ms general:
Cmo distinguen las protenas a sus sitios
de unin especficos entre otras secuencias
en el DNA?
.
Cmo interactan las protenas regulado-
ras con la polimerasa de RNA (y entre s)
para activar o reprimir pasos especficos en
la iniciacin, en la elongacin o en la termi-
nacin de la transcripcin?
En este captulo se analizan las interacciones de
"
-iimerasa de RNA bacteriana con el DNA des-
su contacto inicial con un gen, a travs del
I de la transcripcin, hasta que es liberada cuan-
ei transcrito se ha completado. El Captulo 12, El
rrn, describe los diversos medios por los cuales
protenas reguladoras pueden facilitar o impedir
e la polimerasa de RNA bacteriana reconozca un
l particular para transcribirlo. En el Captulo 13,
DA regulador, se abordan otros mecanismos
regulacin, como el uso de molculas pequeas
RNA, y se analiza la manera como estas interac-
ces pueden ser conectadas en redes reguladoras
I grandes. En el Captulo 14, Estrategias de los
. se estudia cmo las interacciones reguladoras
viduales pueden ser conectadas en redes
is complejas. En el Captulo 24, Promotores y
adadores, y en el Captulo 25, Activacin de la
"
feripcin, se abordan las reacciones anlogas en-
bs polimerasas de RNA eucariticas y sus moldes.
La transcripcin ocurre
por medio de apareamiento de
bases en una "burbuja"
de DNA no apareado
-:
-
ceptos ptincipales
-5 polimerasa de RNA aparta las dos cadenas de DNA
en una
"
burbuja" transitoria y utiliza una cadena
como molde para dirigir la sntesis de una secuencia
;;
mplementaria de RNA.
La lo-ngitud de la burbuja es -12 a 14 bp y la longitud
:
el hbrido de RNA-DNA dentro de ella es de ~8 a 9 bp.
::
3nscripcin ocurre por medio del apareamien-
Je bases complementarias. En la FIGURA 11,3 se
;
::
a el principio general de transcripcin. La
tesis de RNA sucede dentro de una
"
burbuja de
La sntesis de RNA ocurre en la burbuja de transcripcin
5
'
3
'
3
'
.5
'
El DNA es desnaturalizado
1
Burbuja de transcripcin*-
mi<
aiJJiJLim)> 5
La sntesis de RNA Cadena codificadora
inicia en la burbuja
<
RNA-
CUIlilLLUX
La cadena de RNA I Cadena molde
se extiende
I i I I I i 1
FIGURA 11.. Las cadenas de DNA se separan para formar una
burbuja de transcripcin. El RNA es sintetizado por apareamien-
to complementario de bases con una de las cadenas de DNA.
transcripcin", en la cual las cadenas individuales
del DNA son separadas de manera transitoria y la
cadena molde se utiliza para dirigir la sntesis de
la cadena de RNA.
La cadena de RNA se sintetiza del extremo 5'
hacia el extremo 3'. El grupo 3'- OH del ltimo
nucletido agregado a la cadena reacciona con
un nuclesido entrante 5
'
trifosfatado. El nuclesido
entrante pierde dos de sus grupos fosfato terminales
(y y (3); su grupo a se utiliza en el enlace fosfodister
unindolo a la cadena. La velocidad total de la reac-
cin es -40 nucletidos/s a 37
0C (para la polimerasa
de RNA bacteriana); y es casi igual a la tasa de tra-
duccin (15 aminocidos/s), pero es mucho ms len-
ta que la tasa de replicacin del DNA (800 bp/s).
La polimerasa de RNA crea la burbuja de trans-
cripcin cuando se une a un promotor. La GURA 11.4
muestra que a medida que la polimerasa de RNA se
desplaza a lo largo del DNA, la burbuja se mueve
con ella y la cadena de RNA crece. El proceso de
apareamiento de bases y adicin de bases dentro de la
burbuja es catalizado y escudriado por la enzima.
La estructura de la burbuja dentro de la po-
limerasa de RNA se muestra en la imagen ampli-
ficada de la FIGURA ll.S. Conforme la polimerasa
de RNA se desplaza a lo largo del molde de DNA,
11. La transcripcin ocurre por medio de apareamiento de bases en una "burbuja" de DNA no apareado
259
La burbuja de transcripcin se desplaza a lo largo del DNA
r\f\/\f\f\f
\f\f\//
La transcripcin tiene Lugar en una burbuja, en
La cual se sintetiza RNA por medio de apareamiento de bases
con una cadena de DNA en La regin desenrollada de manera
transitoria. Conforme progresa La burbuja, eL DNA dplex se
reconstituye detrs de ella, desplazando al RNA en forma de
una cadena polinucleotdica individual.
La polimerasa de RNA rodea a la burbuja
Movimiento de la enzima
Punto de enrollamiento
Cadena codificadora de DNA
Punto de
desenrollamiento
/ Sitio cataltico
Sitio de unin al RNA
Cadena molde de DNA
FIGURA 11.5 Durante La transcripcin. La burbuja se mantiene
dentro de La polimerasa de RNA bacteriana. La cual desenrolla
y enrolla al DNA y sintetiza RNA.
desenrolla al DNA dplex frente a la burbuja (en el
punto de desenrollamiento) y enrolla al DNA por
detrs (en el punto de rebobinado). La longitud de
la burbuja de transcripcin es de -12 a 14 bp, pero
la longitud de la regin del hbrido de RNA-DNA
dentro de ella es ms corta.
Hay un cambio importante en la topologa del
DNA que se extiende cerca de una vuelta, pero no
es evidente qu porcin de esta regin est de hecho
pareada con el RNA en un momento dado. Sin duda
el hbrido de RNA-DNA es corto y es transitorio.
Conforme se desplaza la enzima, se reconstituye el
DNA dplex y el RNA es desplazado como una ca-
dena polinucleotdica libre. Aproximadamente los
ltimos 25 ribonucletidos agregados a una cader;
creciente se encuentran formando un complejo ce:
el DNA o con la enzima en un momento dado.
QQ La reacefn de La transcripcin
consiste en tres etapas
Conceptos principales
La polimerasa de RNA inicia la transcripcin despus de
unirse a un sitio promotor en el DNA.
Durante la elongacin la burbuja de transcripcin se
desplaza a lo largo del DNA y la cadena de RNA se
extiende en direccin 5
'
-
3
'
.
Cuando La transcripcin se detiene, el dplex de DNA
se vuelve a formar y la polimerasa de RNA se disocia e-
un sitio de terminacin.
La reaccin de la transcripcin puede dividirse e
las etapas que se ilustran en la .6, en las
cuales se crea una burbuja, comienza la sntesis t
RNA, la burbuja se desplaza a lo largo del DNA |
por ltimo la burbuja es terminada:
.
El reconocimiento del molde comienza con !:
unin de la polimerasa de RNA a un pro-
motor localizado en el DNA de doble c;-
dena para formar un "complejo cerrado'
Despus las cadenas de DNA se separa-
para formar el
"
complejo abierto
"
que de;;
la cadena molde disponible para realizar a
apareamiento de bases con los ribonuclei:
dos. La burbuja de transcripcin se crea po:
un desenrollamiento local que comienza er
el sitio en el que se une la polimerasa de
RNA.
.
La iniciacin describe la sntesis de los pri-
meros enlaces de nucletidos en el RNA. La
enzima permanece en el promotor mier.-
tras sintetiza los primeros nueve enlace-
de nucletidos, aproximadamente. La fase
de iniciacin se prolonga por los episodi
abortivos que tienen lugar, en los cuales i;
enzima forma transcritos cortos, los libera
y despus reinicia la sntesis de RNA. La
fase de iniciacin termina cuando la enzim
logra extender la cadena y libera al pro-
motor. La secuencia de DNA necesaria par
que la polimerasa de RNA se una al molde
logre la reaccin de iniciacin se denomina pr:-
motor. Es probable que la iniciacin abor-
tiva comprenda la sntesis de una cader:
de RNA que abarque la totalidad del siti:
activo. Si se libera al RNA, la iniciacin es
cancelada y debe iniciar de nuevo. La in-
ciacin se logra siempre y cuando la enzm
se desplace a lo largo del molde para Uevai
260 CAPTULO 11 Transcripcin
la siguiente regin del DNA al interior del
sitio activo.
.
Durante la elongacin la enzima se despla-
za a lo largo del DNA y extiende la cadena
creciente de RNA. A medida que la enzima
se desplaza, desenrolla la hlice de DNA para
exponer un segmento nuevo del molde en
una condicin de hlice individual. Los nu-
cletidos son agregados de forma covalente
al extremo 3
'
de la cadena creciente de RNA,
lo que forma un hbrido de RNA-DNA en la
regin desenrollada. Atrs de la regin des-
enrollada, la cadena de DNA que funciona
como molde se aparea con su pareja origi-
nal para volver a formar la doble hlice. El
RNA emerge como una cadena individual
libre. La elongacin comprende el movimiento de
la burbuja de transcripcin por una interrupcin
de la estructura del DNA, en la cual la cadena
molde de la regin desenrollada de manera tran-
sitoria se aparea con el RNA naciente en el punto
de crecimiento.
.
La terminacin implica el reconocimien-
to del punto en el cual no deben agregar-
se ms bases a la cadena. Para terminar la
transcripcin, la formacin de enlaces fos-
fodister debe cesar y el complejo de trans-
cripcin debe separarse. Cuando se agrega la
ltima base a la cadena de RNA, la burbuja
de transcripcin se colapsa a medida que el
hbrido de RNA-DNA se disoda, el DNA ad-
quiere de nuevo su estado dplex y la en-
zima y el RNA son liberados. La secuencia de
DNA necesaria para estas reacciones se denomina
terminador.
La elongacin tradicionalmente se aprecia como
- proceso montono, en el cual la enzima se des-
iza hacia adelante un par de bases a lo largo del
A por cada nucletido agregado a la cadena de
- A. En ciertas circunstancias ocurren cambios en
:
e patrn, sobre todo cuando la polimerasa de
IA hace una pausa. Un tipo de patrn consiste en
-1 el
"
extremo frontal
"
de la enzima permanezca
acionario mientras el
"
extremo posterior
"
con-
- e movindose, comprimiendo as la impresin
a huella en el DNA. Despus del movimiento
largo de numerosos pares de bases, el "extre-
o frontal" es liberado, con lo que se restaura una
-
resin de huella de longitud total. Esto da pie
modelo de transcripcin de la
"
oruga gemetra
"
geometrino
"
),
en el cual la enzima avanza de
f
.iera interrumpida, comprimiendo y liberando
-
manera alternada la impresin de huella del
A. Sin embargo, puede ser que estos episodios
:riban una situacin aberrante en vez de la trans-
_"
cin normal.
La polimerasa de RNA cataliza la transcripcin
Reconocimiento del molde:
La polimerasa de RNA se une al DNA dplex
El DNA es desenrollado en el promotor
Iniciacin: se sintetizan y se liberan cadenas muy cortas
tiongasin: la polimerasa sintetiza RNA
Terminacin: la polimerasa de RNA y el RNA son liberados
FIGURA 11.6 La transcripcin sucede en cuatro etapas: la
enzima se une al promotor y desnaturaliza al DNA, permanece
estacionaria durante la iniciacin, se desplaza a lo largo del
molde durante la elongacin y se disocia en la terminacin.
nn La polimerasa de RNA del fago
T7 es un sistema de modelos til
Conceptos principales
Las polimerasas de RNA de los fagos T3 y T7 son
polipptidos individuales con actividades mnimas en el
reconocimiento de un pequeo nmero de promotores
de fagos.
.
Las estructuras cristalinas de la polimerasa de RNA T7
con DNA identifican la regin de unin al DNA y el
sitio activo.-
La existencia de polimerasas de RNA muy peque-
as, que constan de cadenas polipeptdicas indivi-
duales codificadas por ciertos fagos, ofrece una idea
del mecanismo "mnimo" necesario para la trans-
cripcin. Estas polimerasas de RNA reconocen slo
unos cuantos promotores en el DNA de los fagos,
y no tienen la capacidad de cambiar el conjunto de
promotores a los cuales responden. Proporcionan
11.4 La polimerasa de RNA del fago T7 es un sistema de modelos til
261
La polimerasa de RNA T7 tiene una
subunidad individual
La amina de
especificidad
Pulgar
Dedos
B se une en un
surco amplio
Movimiento de la enzima
La polimerasa de RNA T7 tiene un Lazo de es-
pecificidad que se une a las posiciones del promotor que se
encuentran entre -7 y -11, mientras las posiciones -1 a -4
entran al sitio activo.
La polimerasa de RNA cuenta con un canal para el DNA
Subunidad p
Cadena
codificadora
Cadena' Transcrito
de RNA molde
Subunidad B'
Las subunidades (5 (en color azuloso) y [3' (en
color rosa) de la polimerasa de RNA tienen un canal para el
molde de DNA. La sntesis de un transcrito de RNA (en color
cobre) acaba de iniciar; la cadena molde (en color rojo) y la
cadena codificadora (en color amarillo) de DNA son separadas
en una burbuja de transcripcin. Fotografa cortesa de Seth
Darst, Rockefeller University.
sistemas de modelos simples para caracterizar la
unin de la polimerasa de RNA al DNA y la reac-
cin de iniciacin.
Las polimerasas de RNA codificadas por los fa-
gos relacionados T3 y T7 son cadenas polipeptdicas
individuales de <100 kD cada una. Sintetizan RNA a
una velocidad de -200 nucletidos/s a 370C
, mayor
que la de la polimerasa de RNA bacteriana.
La polimerasa de RNA del fago T7 es homologa a
las polimerasas de DNA y tiene una estructura simi-
lar, en la cual el DNA yace en una "palma" rodeada
de "dedos" y de un "pulgar" (vase la Figura 18.7).
Ahora se tiene una vista directa del sitio activo a
partir de la estructura cristalina de una polimerasa
de RNA del fago T7 realizando la transcripcin.
La polimerasa de RNA T7 reconoce su secuend;
diana en el DNA unindose a bases en el surco ma-
yor en una posicin que se ubica en flujo ascenden-
te desde el punto de inicio, como se muestra en \i
'
. '
. La enzima utiliza un lazo de especificids-
que se forma por un listn p. Esta caracterstica
nica de la polimerasa de RNA (no se observa e;
las polimerasas de DNA). La caracrerfstiea,
_
pmB
de todas las polimerasas de RNA es que la enzim;
reconoce bases especficas del DNA en el flujo as-
cendente de la secuencia que es transcrita.
Cuando comienza la transcripcin, la confor-
macin de la enzima permanece esencialmemt
igual mientras se agregan numerosos nucletidos '<
la cadena molde transcrita es "triturada" en el sit'.O
activo. El sitio activo puede contener un transcrit1;
de seis a nueve nucletidos. La transicin de la ini-
ciacin a la elongacin se define como el punto f
el cual la enzima comienza a desplazarse a lo larg<:
del DNA. Esto ocurre cuando el transcrito nacientr
rebasa el sitio activo e interacta con el lazo de espe-
cificidad. El RNA emerge a la superficie de la enzinl
cuando se han sintetizado de 12 a 14 nucletido
Estas caractersticas son similares a aquellas exhiba
das por la polimerasa de RNA bacteriana.
BH La estructura cristaLina sugiere
un modelo de despLazamiento
enzimtico
Conceptos principales
.
El DNA se desplaza por un surco de la polimerasa de
RNA de las levaduras que forma una vuelta pronunciada
en el sitio activo.
.
Un puente protenico cambia la conformacin para
controlar la entrada de los nucletidos al sitio activo.
Ahora se tiene bastante informacin sobre la estruc-
tura y la funcin de la polimerasa de RNA, como d
resultado de las estructuras cristalinas de las enzims;
de las bacterias y de las levaduras. Las dimensione-
totales de la polimerasa de RNA bacteriana son ~9r.
x 95 x 160 ; la polimerasa de RNA eucaritica e?
ms grande pero menos alargada. El anlisis estruc-
tural muestra que comparten un tipo de estructura
comn, en el cual hay un
"
canal
"
o surco en la su-
perficie de -25 de ancho que podra ser la ruta t\
DNA. En la : se muestra un ejemplo dt
este canal en la polimerasa de RNA bacteriana. L;
longitud del surco podra contener 16 bp en la en-
zima bacteriana y -25 bp en la enzima eucaritica
pero esto representa slo una parte de la longitud
total del DNA unido durante la transcripcin. L;
superficie de la enzima tiene cargas negativas en si
262 CAPTULO 11 Transcripcin
br parte, pero el surco est revestido con cargas
.ivas, lo que le permite interactuar con los gru-
r
'
osfato del DNA cargados negativamente.
la enzima de las levaduras es una estructura
rnsa con 12 subunidades (vase la seccin 24.2,
-
polimerasas de RNA eucariticas estn formadas
numerosas subunidades). Se han localizado 10
nidades de la polimerasa de RNA II de las le-
uras en la estructura cristalina, como se muestra
la FIGURA 11.9. El sitio cataltico se forma por una
judidura entre las dos subunidades grandes (#1
O
, la cual sujeta al DNA en flujo descendente
n un par de "mandbulas" a medida que entra
:
-
polimerasa de RNA. Las subunidades cuatro y
::e estn ausentes en esta estructura; forman un
. .complejo que se disocia de la enzima completa.
:
lo general, la estructura es similar a la de la
merasa de RNA bacteriana. Esto puede obser-
:
:se con mayor claridad en la estructura cristalina
Hbla FIGURA 11.10. La polimerasa de RNA rodea al
H
.,
como se observa en la FIGURA 11.1 . En el si-
so activo se encuentra un ion cataltico de Mg2+. El
1 VA es pinzado en posicin en el sitio activo por las
- -umidades 1, 2 y 6. La FIGURA 11.12 muestra que
-
DNA es forzado a dar una vuelta en la entrada al
v.o debido a la presencia de una pared adyacente
.:
protena. La longitud del hbrido de RNA est
imitada por otra obstruccin protenica, denomina-
b timn (o gua). Es probable que los nucletidos
:::
tren al sitio activo desde abajo, por los poros que
traviesan la estructura.
La imagen ampliada del sitio activo en la FIGURA
11.13 muestra que la burbuja de transcripcin inclu-
ye nueve pares de bases del hbrido de RNA-DNA.
En donde el DNA da la vuelta, las bases que se en-
centran en flujo descendente giran hacia afuera de
hlice de DNA. A medida que la enzima se despla-
:;
-
a lo largo del DNA, la base que se encuentra en la
cdena molde al inicio de la vuelta ser girada para
jue apunte al sitio de entrada de los nucletidos.
extremo 5' del RNA es forzado a abandonar al
DNA cuando choca con el timn de protena (vase
.
a Figura 11.12).
Una vez que el DNA ha sido desnaturalizado,
las cadenas individuales adquieren una estructura
lexible en la burbuja de transcripcin. Esto permite
DNA dar la vuelta en el sitio activo. No obstante,
tites de que comience la transcripcin, el DNA de
ioble cadena es una estructura recta relativamente
rgida. Cmo entra esta estructura a la polimerasa
sin ser bloqueada por la pared? La respuesta es que
iebe ocurrir un gran cambio de conformacin en
la enzima. Adyacente a la pared hay una pinza.
En la forma libre de la polimerasa de RNA, esta pinza
.
;
e balancea para alejarse de la pared y permitir que
el DNA siga una ruta directa a travs de la enzima.
La polimerasa de RNA rodea al DNA
11
12
Mg++
9 Mandbula
> 'vvrv/v/
-
Sitio activo
Movimiento
A partir de la estructura cristalina de la poli-
merasa de RNA se ubican 10 subunidades. Los colores de las
subunidades son los mismos que los de las estructuras crista-
linas de las figuras siguientes.
La vista desde arriba de la estructura cristalina
de la polimerasa II de RNA de las levaduras muestra que el DNA
es sujetado en sentido descendente por un par de mandbulas
y es pinzado en la posicin adecuada en el sitio activo, el cual
contiene un ion de Mg*
"
. Fotografa cortesa de Roger Kornberg,
Stanford University School of Medicine.
La vista desde el extremo de la estructura cris-
talina de la polimerasa II de RNA de las levaduras muestra que
el DNA es rodeado por protena en un rea de -270. Fotogra-
fa cortesa de Roger Kornberg, Stanford University School of
Medicine.
11.5 La estructura cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimtico
263
El DNA da la vuelta en el sitio activo
DNA en sentido ascendente
Movimiento
de la enzima
Salida de RNA
Pr za
ni
E DNA
entra
a las
V
mandbulas
Puente
Pared
Nucleotidos
las
2 El DNA es forzado a dar una vuelta en el sitio
activo por una pared de protena. Los nucLetidos pueden entrar
al sitio activo a travs de un poro localizado en la proteina.
El sitio activo sujeta a la burbuja de transcripcin
a -10 bp en sentido
ascer.aente
La burouja de
transcripcin tiene
una longitud
El hbrido de
-
as
de -25 bp RNArDNA
tiene 9 bp \
V
La enzima suietE
10b5.
en--entido
descendente de DNA
La vista amplificada del sitio activo muestra la
vuelta pronunciada que se encuentra en el camino del DNA.
Despus de que el DNA ha sido desnaturalizado para
crear la burbuja de transcripcin, la pinza debe ba-
lancearse y regresar a su posicin contra la pared,
Uno de los dilemas de cualquier polimerasa de
cido nucleico es que la enzima debe formar con-
tactos estrechos con el sustrato de cido nucleico y
con el producto, pero debe romper estos contactos
y rehacerlos en cada ciclo de adicin de nucletidos.
Considrese la situacin que se ilustra en la
1.14
. Una polimerasa hace una serie de contactos
especficos con las bases, en posiciones particulares.
Por ejemplo, el contacto "1" se hace con la base que
se encuentra en el extremo de la cadena creciente y
el contacto
"
2
"
se hace con la base que se encuen-
tra en la cadena molde que es complementaria a
la siguiente base que ser agregada. Obsrvese, sin
embargo, que las bases que ocupan estas ubicacio-
nes en las cadenas de cido nucleico cambian cada
vez que se agrega un nucletido.
Las polimerasas deben crear y romper enlaces
La polimerasa contacta al cido nucleico
Cadena
l
nm
esplaza y reconsti tuye los enlaces
La enzima se d
1
El movimiento de una polimerasa de cido -.-
cleico requiere el rompimiento y la reconstitucin de enlaoa
de cidos nucleicos en posiciones fijas en relacin con la efi
tructura de la enzima. Los nucletidos que se encuentran
estas posiciones cambian cada vez que la enzima se mueve u-;
base a lo largo del molde.
Los segmentos superior e inferior de la figud
muestran la misma situacin: una base est por ser
agregada a la cadena creciente. La diferencia es qu-
esta cadena creci una base en el segmento infe-
rior de la figura. La geometra de ambos complejos
es exactamente la misma, pero los contactos
"
1' -
"
2"
en el segmento inferior se hacen con bases oj
las cadenas de cido nucleico que se localizan ur;
posicin ms lejos a lo largo de la cadena. El seg-
mento del centro muestra que esto debe signiia-
que, despus de que la base es agregada (y antes de
que la enzima se mueva en relacin con el cic
nucleico), los contactos establecidos con posiciones
especficas deben romperse para que puedan reh;--
cerse con las bases que ocupan dichas posiciones
despus del desplazamiento.
La estructura de la polimerasa de RNA sugie-
re una idea de cmo la enzima mantiene contactr
con su sustrato mientras rompe y restaura enlace
Una estructura ubicada en la protena denominaci
puente es adyacente ai sitio activo (vase la Figura
11.12). Esta caracterstica se observa en las enzima
de las bacterias y de las levaduras, pero tiene form.:
diferentes en las estructuras cristalinas distintas. Er
264 CAPTULO 11 Transcripcin
El puente controla la entrada
de los nucletidos
DNA
Puente de
protena
RNA
Sito de entrada
de los nucletidos
Nucletido agregado a la cadena
1 I i
lu y
Translocacin por un par de bases
na
lili
El puente regresa a su conformacin rectal
;
est doblada y en la otra es recta. La
15 sugiere que el cambio de conformacin de la
ructura del puente se relaciona de manera cerca-
-
:3n la translocacin de la enzima a lo largo del
:) nucleico.
Al inicio del ciclo de translocacin, el puente
r
'
.e una conformacin vertical y se encuentra ad-
- lente al sitio de entrada de los nucletidos. Esto
-
.rite que el siguiente nucletido se una en el si-
ie entrada de los nucletidos. El puente est en
:
acto con el nucletido que acaba de agregarse.
::
?us la protena se desplaza un par de bases a lo
i del sustrato. El puente cambia su
conformacin
r iobla para mantener contacto con el nucletido
;
m agregado. En esta conformacin, el puente
:uea el sitio de entrada de los nucletidos. Para
~
i izar el ciclo, el puente regresa a su conformacin
"
;al con lo que permite de nuevo el acceso al sitio
nitrada de los nucletidos. El puente acta como
luquete que libera a las cadenas de DNA y de
A para la translocacin al tiempo que se sujeta al
Temo de la cadena creciente.
La polimerasa de RNA
bacteriana est formada
por rnuLtiples subunidades
.
'
:
ep:os principales
las potimerasas centrales de RNA bacterianas son
:;
-
Tiplejos de subunidades mltiples de -500 kD con
.
-
a estructura general a
2
|3P'.
E
. DNA est unido en un canal y entra en contacto con
as subunidades 3 y (3
'
.
I ilimerasas de RNA mejor caracterizadas son las
as eubacterias, de las cuales Escherichia coli es un
:
pico. Un solo tipo de polimerasa de RNA parece
-
ruarse de casi toda la sntesis de RNAm y de toda la
-
Kdn de RNAry de KNAt, en una eubacteria. Hay
dedor de 7 000 molculas de polimerasa de RNA
:na clula de E. coli. Muchas de ellas intervienen
:
ranscripcin; es probable que de 2 000 a 5 000
mas estn sintetizando RNA en un momento
b
. pero el nmero depende de las condiciones
-
'
.
vo.
La enzima completa o la holoenzima en
wli tiene un peso molecular de -465 kD. Las
unidades que la componen se describen en la
Las subunidades p y p' juntas forman el centro
dtico. Sus secuencias estn relacionadas con
rilas de las subunidades ms grandes de las poli-
:
3ias de RNA eucariticas (vase la seccin 24.2,
rolimerasas de RNA eucariticas estn formadas
numerosas subunidades), lo cual sugiere que
El ciclo de elongacin de la polimerasa de RNA
comienza con un puente recto adyacente al sitio de entrada
de los nucletidos. Despus de la adicin de los nucletidos,
[a enzima se desplaza un par de bases y el puente se dobla al
tiempo que mantiene contacto con el nucletido que acaba de
agregarse. Cuando el puente es liberado, el ciclo puede comen-
zar de nuevo.
hay caractersticas comunes en las acciones de to-
das las polimerasas de RNA. La subunidad p puede
entrecruzarse con el molde de DNA, con el producto
de RNA y con los ribonucletidos de los sustratos;
las mutaciones en rpoB afectan a todas las etapas de
la transcripcin. Las mutaciones en rpoC muestran
que la subunidad P
'
tambin est implicada en todas
las etapas.
La subunidad a es necesaria para el ensamblaje
de la enzima central. Cuando el fago T4 infecta a E.
coli, la subunidad a es modificada por la transferen-
cia deuha molcula ADP-ribosa a un residuo de ar-
ginina (lo\que se conoce como ADP-ribosilacin de
la arginip). La modificacin se relaciona con una
menor afinidad por los promotores que antes reco-
noca la holoenzima, lo cual sugiere que la subuni-
dad a tiene cierta fundn en el reconocimiento del
promotor. La subunidad a tambin participa en la
interaccin de la polimerasa de RNA con algunos
otros factores reguladores.
11.6 La polimerasa de RNA bacteriana est formada por mltiples subunidades
265
La polimerasa de RNA tiene cuatro
de subunidades
Gen Produco Funciones
rpoA
rpoB
rpoC
rpoD
2 subunidades
a (40 kD
cada una
Subunidad
(155 kD)
Subunidad p'
(160 kD)
Subunidad a
(32-90 kD)
Enzima de
E.
cot = 465 kD
ensamble enzimtico,
reconocimiento del
promotor y unin a
algunos activadores
- centro cataltico
especificidad del
promotor
\/\/\
Las poh'merasas de RNA de Las eubacterias tie-
nen cuatro tipos de subunidades; a, P y P
'
tienen dimensiones
bastante constantes en diferentes especies bacterianas, pero
a vara de manera ms amplia.
Las subunidades \S y |i contactan al DNA y al RNA
Subunidad |
Sentido
ascendente
5
'
Sentido
descendente
RNA
Subunidad p'
La cadena molde y la cadena codificadora del
DNA son contactadas por las subunidades P y P' sobre todo
en la regin de la burbuja de transcripcin y en sentido des-
cendente. El RNA es contactado sobre todo en La burbuja de
transcripcin. No hay RNA en sentido descendente, excepto en
el caso especial que se presenta cuando la enzima se desplaza
hacia atrs.
La subunidad a interviene de manera especfica
en el reconocimiento del promotor, y se cuenta con
ms informacin acerca de sus funciones que de las
de cualquier otra subunidad (vase la seccin 11.7,
La polimerasa de RNA est formada por la enzima
central y por un factor a).
La estructura cristalina de la enzima bacteriana
(vase la Figura 11.8) muestra que el canal para el
DNA yace en la interfase de las subunidades p y
(Las subunidades a son invisibles en esta imagen.)
El DNA est desenrollado en el sitio activo, en don-
de una cadena de RNA est siendo sintetizada. Los
experimentos de entrecruzamiento identifican L -
puntos en los cuales las subunidades de la polimera-
sa de RNA entran en contacto con el DNA. stas se
resumen en la FIGURA 11.17. Las subunidades p y jf
entran en contacto con el DNA en numerosos pun-
tos localizados en sentido descendente con respec
al sitio activo. Forman numerosos contactos con j
cadena codificadora en la regin de la burbuja c-.
transcripcin, lo que estabiliza las cadenas indiv-
duales independientes. El RNA es contactado sobre
todo en la regin de la burbuja de transcripcin.
El medicamento rifampicina (un miembro de i;
familia de las rifamicinas) b/l'oquea la transcripci
mediada por la polimerasa de RNA bacteriana. H
un medicamento importantjDara el tratamiento ; -
la tuberculosis. La estructura cristalina de la po'
merasa de RNA unida a la rifampicina explica _
accin: se une a una hendidura de la subunidad p
a >12 de distancia del sitio activo, pero en un;
posicin en la que bloquea la ruta del RNA en pro-
ceso de elongacin. Al impedir que la cadena
RNA se extienda ms all de dos o tres nucletido*
se bloquea la transcripcin.
Definida en un principio slo por su capacid;:
para incorporar nucletidos en el RNA bajo la c
reccin de un molde de DNA, la enzima polimerasa
de RNA ahora se considera parte de un mecanismo
ms complejo que interviene en la transcripcin. I.
capacidad de catalizar la sntesis de RNA define al comj::-
nente mnimo que puede describirse como polimerasa :
RNA. Supervisa el apareamiento de bases de los ri-
bonucletidos de los sustratos con el DNA y catali:;
la formacin de enlaces fosfodister entre ellos.
Todas las subunidades de la polimerasa bsid
que participan en la elongacin son necesarias par;
la iniciacin y para la terminacin. No obstante, las
unidades de transcripcin difieren en cuanto a qL-
dependen de polipptidos adicionales en las etap;
de iniciacin y de terminacin. Algunos de est_
polipptidos adicionales son indispensables en todo?
los genes, mientras que otros se necesitan de mane-
ra especfica para la iniciacin o para la terminado;
en genes particulares. La analoga con la divisin ct
labores entre el ribosoma y los factores de la sntes.
protenica es evidente.
La polimerasa de RNA de Escherichia coli puedt
transcribir cualquiera de las muchas unidad;
de transcripcin (>1000). Por lo tanto, la enzirr.;
requiere la capacidad de interactuar con una varie-
dad de funciones hospedadoras y de los fagos que
modifican sus actividades intrnsecas de transcrip-
cin. Por lo tanto, la complejidad de la enzima, al
menos en parte, refleja su necesidad de interacttid:
con factores reguladores, en vez de una demanc;
inherente en su actividad cataltica.
266 CAPTULO 11 Transcripcin
La poh'merasa de RNA est
formada por La enzima central
y por un factor a
lonceptos principales
.
-a polimerasa de RNA bacteriana puede dividirse en la
enzima central a
2
PP', la cual cataliza la transcripcin,
y en la subunidad a, que es necesaria slo para la
'
niciacin.
.
El factor a cambia las propiedades de unin al DNA de
.a polimerasa de RNA de tal manera que su afinidad
por el DNA general se reduce y su afinidad por los
oromotores aumenta.
Las constantes de unin de la polimerasa de RNA
a diferentes promotores vara en alrededor de seis
rdenes de magnitud, lo cual corresponde a la
Secuencia con la cual la transcripcin es iniciada en
cada promotor.
:
holoenzima (a
2
p(3'a) puede separarse en dos
r.
iponentes, la enzima central (a
2
PP') y el fac-
er o (el polipptido a). Slo la holoenzima puede in-
:r la transcri
pcin. El factor a garantiza que la polime-
''
.
1 de RNA bacteriana se una de manera estable al DNA
'
.:
en los promotores. El "factor" o suele ser liberado
..ando la cadena de RNA alcanza ocho o nueve
:
;es de longitud, lo que permite que el centro de la
"
-
zima asuma la elongacin. La enzima central tiene
:
2pacidad de sintetizar RNA a partir de un molde de
- A, pero no puede iniciar la transcripcin en los sitios
-ecuados.
La enzima central tiene una afinidad general
r el DNA, en el cual la atraccin electrosttica
--tre la protena bsica y el cido nucleico cido
rsempea una funcin muy importante. Cual-
:
ier secuencia (aleatoria) de DNA que se une a la
;
limerasa central en esta reaccin de unin gene-
i- se describe como sitio de unin dbil. Ningn
imbio ocurre en el DNA
,
el cual contina siendo
.;
plex. El complejo en tal sitio es estable, con una
a media de disociacin de la enzima del DNA de
-
60 min. La enzima central no distingue entre promoto-
-; y otras secuencias del DNA.
La FIGURA 11.18 muestra que el factor a intro-
|ce un cambio importante en la afinidad de la po-
r.ierasa de RNA por el DNA. La holoenzima tiene
:j. capacidad drsticamente reducida para reconocer los
fo de unin dbiles, es decir, para unirse a cualquier
ecuencia general del DNA. La constante de asocia-
:
m de la reaccin disminuye ~104 veces, y la vida
nedia del complejo es <1 s. Por lo tanto, el factor o
:
esestabiliza la capacidad general de unin de forma
puy considerable.
Ntese que el factor a tambin confiere la capaci-
:J
. de reconocer sitios de unin especficos. La holoenzi-
El factor o controta la especificidad
La enzima central se une a cualquier secuencia de DNA
El factor a desestabiliza la unin
a
l
La holoenzima se une al promotor
FIGURA 11.18 La enzima central se une en forma indiscri-
minada a cualquier secuencia de DNA. El factor o reduce la
afinidad de la unin independiente de La secuencia y confiere
especificidad por los promotores.
ma se une a los promotores de manera muy firme,
con una constante de asociacin incrementada (en
promedio) 1 000 veces con respecto a la de la enzi-
ma central y con una vida media de varias horas.
La especificidad de las holoenzimas por los pro-
motores en comparacin con otras secuencias es de
~
107, pero ste slo es un promedio debido a que
hay una amplia variacin en la velocidad con la
cual la holoenzima se une a secuencias promotoras
diferentes. ste es un parmetro importante para
determinar la eficiencia de un promotor individual
en la iniciacin de la transcripcin. Las constantes
de unin oscilan entre ~102y ~106. Otros factores
tambin afectan la frecuencia de la iniciacin, la
cual vara de ~l/s (en los genes de RNAr) a -1/30
min (en el promotor lat).
Tfl La asociacin con eL factor a
cambia en La iniciacin
Conceptos principales
.
Cuando la polimerasa de RNA se une a un promotor,
separa las cadenas de DNA para formar una burbuja de
transcripcin e incorpora hasta nueve nucletidos en el
RNA.
.
Puede haber un ciclo de iniciaciones abortivas antes de
que la enzima avance a la siguiente fase.
.
El factor a puede ser liberado de la polimerasa de
RNA cuando la cadena naciente de RNA alcanza una
longitud de ocho a nueve bases.
11.8 La asociacin con el factor o cambia en la iniciacin 267
En la iniciacin hay mltiples etapas
Holoenama
Constante de
equilibrio
KB = 106-109l\r1
Gomptejo biniario
cerrado
I 1 Unin al DNA
T
Constante de
Desnaturalizacin velocidad
del DNA
1 = KrMcr1 s-1
Iniciacin
abortiva
Liberacin
de o
Complejo
binario abierto
Constante de
velocidad
k;- tO s"1
Complejo
ternario
Despeje del promotor
1-2 s
Comienza la
sntesis de RNA
FIGURA 11.19 La polimerasa de RNA atraviesa por numerosos
pasos antes de la elongacin. Un complejo binario cerrado se
transforma en un complejo abierto y Luego en un complejo
ternario.
Ahora se pueden describir las etapas de la transcrip-
cin en trminos de las interacciones entre las di-
ferentes formas de polimerasa de RNA y del molde
de DNA. La reaccin de iniciacin puede describir-
se con los parmetros que se resumen en la FIGURA
11.19:
.
La reaccin holoenzima-promotor comien-
za al formarse un complejo binario cerrado.
"
Cerrado" implica que el DNA sigue siendo
dplex. La formacin del complejo binario
cerrado es reversible; por lo tanto, suele
describirse por una constante de equilibrio
(KB). Hay un intervalo amplio de valores
de la constante de equilibrio para formar el
complejo cerrado.
.
El complejo cerrado se transforma en un
complejo abierto cuando se
"
desnatura-
liza" una regin corta de DNA dentro de la
secuencia a la que se ha unido la enzima. La
serie de eventos que conducen a la forma-
cin de un complejo abierto se denomina
unin fuerte. En el caso de los promotores
fuertes, la conversin a un complejo binario
abierto es irreversible, por lo que esta reac-
cin se describe por medio de una constante
de velocidad (
,
). Esta reaccin es rpida.
El factor a participa en la reaccin de des-
naturalizacin (vase la seccin 11.16, L
sustitucin de los factores a puede controlar
la iniciacin).
.
El siguiente paso es incorporar los primero?
dos nucletidos; entre ellos se forma un en-
lace fosfodister. Esto genera un complejo
ternario que contiene RNA, DNA y la en-
zima. La formacin del complejo temario se
describe por medio de la constante de veloci-
dad A:.; sta es incluso mayor que la constan-
te de velocidad k
2
. Pueden agregarse ms nu-
cletidos sin ningn movimiento enzimtico
para generar una cadena de RNA de hasta
nueve bases. Despus de que se agrega cada
base, hay cierta probabilidad de que la enzi-
ma libere a la cadena. Esto comprende una
iniciacin abortiva, despus de la cual la
enzima comienza de nuevo con la primera
base. Por lo general, hay un ciclo de inicia-
ciones abortivas que generan una serie de
oligonucletidos muy cortos.
.
Cuando la iniciacin es exitosa, el factor m
deja de ser necesario, y la enzima realiza tal
transicin al complejo temario de elonga-
cin de polimerasa central-DNA-RNA na-
ciente. El parmetro fundamental en este
suceso es cunto tiempo requiere la polimeras
para dejar el promotor de modo que otra poli-
merasa pueda iniciar. Este parmetro es a
tiempo de despeje del promotor; su val
mnimo de 1 a 2 s establece que la frecueia
cia mxima de iniciacin es menor a un
episodio por segundo. Luego la enzima &|
desplaza a lo largo del molde y la cadena de
RNA se extiende ms all de 10 bases.
Cuando la polimerasa de RNA se une al DNA.
la dimensin elongada de la protena se extiende
a lo largo del DNA, pero ocurren algunos cambios
morfolgicos interesantes durante la transcripcin.
Las transiciones de forma y de tamao originan tres
formas del complejo, como se ilustra en la FIGUFtA
11.20:
.
Cuando la polimerasa de RNA en forma de
holoenzima se une en un inicio al DNA, cul
bre unas 75 a 80 bp y se extiende de -55 a
+20. (La larga dimensin de la polimerasa
de RNA [160 ] podra abarcar -50 bp de
DNA en forma extendida, lo cual implidl
que la unin de un fragmento ms largo de
DNA debe suponer algn plegamiento da
cido nucleico.)
.
La forma de la polimerasa de RNA cambia
en la transicin de la iniciacin a la elonga-
cin. Esto se asocia a la prdida de contactos
en la regin que abarca de -5 5 a -3 5, lo que
268
CAPTULO 11 Transcripcin
deja slo -60 bp de DNA cubiertas por la
enzima. Esto coincide con el concepto que
indica que la parte que se encuentra ms
distante del promotor en sentido ascenden-
te interviene en el reconocimiento inicial
por parte de la polimerasa de RNA, pero no
es indispensable en las ltimas etapas de la
iniciacin (vase la seccin 11.13, La efi-
ciencia de los promotores puede incremen-
tar o disminuir por medio de mutaciones).
.
Cuando la cadena de RNA se extiende de
15 a 20 bases, la enzima realiza una transi-
cin posterior para formar el complejo que
se hace cargo de la elongacin; ahora abarca
de 30 a 40 bp (de acuerdo con la etapa del
ciclo de elongacin),
Ha sido un dogma de la transcripcin, desde poco
rspus de su descubrimiento, que el factor a es li-
rrado despus de la iniciacin. Es posible que esto
sea del todo cierto. Las mediciones directas de
s complejos de polimerasa de RNA en proceso
i elongacin muestran que -70% de ellos retiene
.
zactor o. Un tercio de las polimerasas en proceso
. elongacin carecen de o; por lo tanto, la conclu-
n original, la cual afirma que no es indispensable
;
ra la elongacin, es sin duda correcta. En los casos
- . los que permanece asociado a la enzima central,
-
casi seguro que la naturaleza de la asociacin ha
.i mbiado (vase la seccin 11.11, El factor o controla
;
unin al DNA).
rm Una poLimerasa de RNA varada
puede reiniciar La transcripcin
.oncepto principal
Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la
transcripcin al separar el transcrito de RNA para
generar un extremo 3
'
nuevo.
La polimerasa de RNA debe estar en condiciones de
'
.
anejar situaciones en las que se bloquea la trans-
cripcin. Esto puede suceder, por ejemplo,
cuando
el DNA ha sido daado. Un sistema modelo de di-
iias situaciones lo proporciona la interrupcin de
k elongacin in vitro al omitir uno de los nucleti-
.
is precursores necesarios. Cuando el nucletido
atante es restaurado, la enzima puede superar el
Oqueo al dividir el extremo 3' del RNA, para crear
.extremo 3
'
nuevo para la elongacin de la cade-
na. La divisin implica a factores accesorios adems
.;
la enzima. En el caso de la polimerasa de RNA de
r :
oli, las protenas GreA y GreB liberan a la poli-
merasa de RNA de la interrupcin de la elongacin.
13. las clulas eucariticas, la polimerasa de RNA II
requiere un factor accesorio (TF
jj
S), el cual permite
La polimerasa de RNA cambia de
tamao en la iniciacin
ti complejo de iniciacin incluye al factor o
y cubre de 75 a 80 bp
-
50 -40 -30 -20 -10 1 +10 +20 +30
El complejo de elongacin inicial se forma cuando la
cadena de RNA se extiende 10 bases, puede perder
a a y deja de hacer contactos desde la posicin -35
hasta la posicin -55
-
50 -40 -30 -20 -10 1 +10 +20 +30
El complejo de elongacin general
se forma cuando la cadena de RNA se extiende de
15 a 20 bases y abarca de 30 a 40 bp
-
50 -40 -30 -20 -10 1 +10 +20 +30
La polimerasa de RNA en un inicio hace con-
tacto con la regin -50 a +20. Cuando se disocia o, la enzima
central hace contacto desde la posicin -30; cuando la en-
zima se desplaza pocos pares de bases, se organiza de forma
ms compacta en el complejo de elongacin general.
a la polimerasa separar unos cuantos ribonucleti-
dos del extremo 3' del producto de RNA.
El sitio cataltico de la polimerasa de RNA reali-
za la divisin en cada caso. Las funciones de GreB y
de TF
n
S son convertir el sitio cataltico de la enzimas
en un sitio ribonucleoltico. Aunque no hay homo-
loga en la secuencia de los factores, las estructuras
cristalinas de sus complejos con las polimerasas de
RNA respectivas sugieren que funcionan de ma-
nera similar. Cada uno de los factores inserta un
dominio protenico angosto (en un caso una cinta
de cinc, y en el otro una hlice superenrollada) de
manera profunda en la polimerasa, en donde ter-
mina en el interior del sitio cataltico. El dominio
insertado coloca dos aminocidos cidos cerca del
ion de magnesio cataltico primario del sitio activo;
esto permite la introduccin de un segundo ion de
magnesio, el cual convierte el sitio cataltico en un
sitio ribonucleoltico.
Esta reaccin puede deberse a que la demora
provoca que el molde sea posicionado de manera
11.9 Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la transcripcin
269
incorrecta, de tal forma que el extremo 3' ya no se
localiza en el sitio activo. La divisin y el retroceso
son necesarios para colocar el extremo en la ubica-
cin correcta para la adicin de ms bases.
Por lo tanto, se observa que la polimerasa de
RNA tiene las capacidades de desenrollar y de rebo-
binar el DNA, de sujetar el producto de RNA y las
cadenas del DNA separadas, de catalizar la adicin
de ribonucletidos a la cadena creciente de RNA y
de ajustarse a dificultades en el proceso al separar el
producto de RNA y reiniciar la sntesis de RNA (con
la ayuda de algunos factores accesorios).
Cmo encuentra una
poh
'
merasa de RNA Las
secuencias promotoras?
Conceptos principales
La velocidad con la cual la polimerasa de RNA se une
Los promotores es demasiado alta para que la justifc.
la difusin aleatoria.
Es probable que la polimerasa de RNA se una a
sitios aleatorios del DNA y los intercambie por otras
secuencias con bastante rapidez hasta que encuentra
un promotor.
Toda la polimerasa de RNA est unida al DNA
\
500-1 000
enzimas
centrales en
compiejos
dbiles
500-1 000
holoenzimas
en complejos
dbiles
500-1 000
holoenzimas
en complejos
promotores
-2 500
enzimas
centrales
implicadas en
la transcripcin
La enzima central y la holoenzima estn distri-
buidas en el DNA y muy poca polimerasa de RNA se encuentra
en estado libre.
I La dltuslon al promotor es demasiado lenta
A :
: y
<108 M-V1
>\>\
FIGURA 11.22 La constante de velocidad hacia delante de la
unin de la polimerasa de RNA a los promotores es ms veloz
que la difusin aleatoria.
Cmo se distribuye la polimerasa de RNA en!
clula? Una imagen (un tanto especulativa) de ll
tuacin de la enzima se ilustra en la
.
El exceso de enzima central existe en g.
medida en forma de complejos cerrados :
biles porque la enzima entra en ellos tta
mucha rapidez y los abandona con lentitu
Hay muy poca enzima central libre,
si es -
la hay.
.
Hay suficiente factor a para que cerca :
un tercio de las polimerasas existan corml
holoenzimas y stas se distribuyen ena
complejos dbiles localizados en sitios w
especficos y complejos binarios (en su :
yor parte cerrados) en los promotores.
.
Cerca de la mitad de las polimerasas de R
consisten en enzimas centrales que inter-
nen en la transcripcin.
.
Qu cantidad de holoenzimas se encuen-
tran en forma libre? Se desconoce la n
puesta, pero se sospecha que la cantidac
muy pequea.
La polimerasa de RNA debe encontrar promcBH
res dentro del contexto del genoma. Supngase c;_
;
un promotor es un fragmento de -60 bp. Cmc>
distingue de las 4 x 106 bp que forman el genor
de E. coli? Las tres figuras siguientes ilustran el prir-
cipio de algunos modelos posibles.
La FIGURA 11.22 muestra el modelo ms senci];
para la unin con el promotor, en el cual la po. -
merasa de RNA se desplaza por difusin aleatoria
Con rapidez, la holoenzima se asocia a los sitios -
unin dbiles y se disocia de ellos. De tal mane::
puede continuar formando y rompiendo una ser:
de complejos cerrados hasta que (por probabilida
encuentra un promotor, y el reconocimiento de t
secuencia especfica permitir la unin firme me-
diante la formacin de un complejo abierto.
Para que la polimerasa de RNA se desplace dt
un sitio de unin del DNA a otro, debe disociar
del primer sitio, encontrar el segundo sitio y des-
pus asociarse a l. El desplazamiento de un sitio
270
CAPTULO 11 Transcripcin
otro est limitado por la velocidad de difusin a
:
vs del medio
.
La difusin establece un lmite
rior <108 M-1 s-1 para la constante de velocidad
asociacin a una secuencia diana de 60 bp. Sin
nbargo, la constante de velocidad real de algunos
imotores in vitro parece ser de ~10
s M-1 s
-1
,
en el
-
"
:
ite de difusin o por encima de l. Si este valor
aplica in vivo, el tiempo necesario para los ciclos
;
atorios de asociacin y disociacin sucesivas en
;
sitios de unin dbiles es excesivo para justificar
forma en la cual la polimerasa de RNA encuentra
-
promotor.
Por lo tanto, la polimerasa de RNA debe utilizar
::
os medios para encontrar sus sitios de unin. La
KURA 11. muestra que el proceso podra acele-
3rse si la diana inicial de la polimerasa de RNA es
si genoma completo, no slo una secuencia promo-
ra especfica. Al incrementar las dimensiones de
k diana, la constante de velocidad para la difusin
:
'
el DNA incrementa proporcionalmente y deja de
;r una limitante.
Si esta idea es correcta, una polimerasa de RNA
rre se une al DNA y despus permanece en contac-
con l. Cmo se desplaza la enzima de un sitio
unin aleatorio (dbil) del DNA a un promotor?
l\ modelo ms probable es suponer que la secuen-
cia de unin es desplazada en forma directa por
'
.ra secuencia. Una vez sujeta al DNA, la enzima
mtercambia esta secuencia por otra secuencia muy
ripido y contina intercambiando secuencias hasta
;
.:
e encuentra un promotor. Luego la enzima for-
ma un complejo abierto y estable, despus de lo cual
.
ucede la iniciacin. El proceso de bsqueda se hace
~
iucho ms rpido debido a que la asociacin y la
disociacin son virtualmente simultneas y no se
iesperdicia tiempo intercambiando sitios. El des-
plazamiento directo puede proporcionar un
"
movi-
miento dirigido
"
, en el cual la enzima se desplaza de
manera preferente de un sitio dbil a un sitio ms
fuerte.
Otra idea supone que la enzima se desliza a lo
'
.argo del DNA en una caminata aleatoria de una
i>la dimensin, como se muestra en la FIGURA 11.24,
I se detiene slo cuando encuentra un promotor.
Sin embargo, no hay pruebas de que la polimerasa
re RNA (u otra protena de unin al DNA) pueda
funcionar de esta manera.
(JJJj EL factor a controla la unin
al DNA
Concepto principal
.
Un cambio en La asociacin entre el factor o y la
holoenzima modifica La afinidad de unin por eL DNA
de tal manera que la enzima central puede desplazarse
a lo largo del DNA.
La polimerasa de RNA enfrenta un dilema para re-
conciliar sus necesidades para la iniciacin y la elon-
gacin. La iniciacin requiere una unin fuerte slo
con secuencias particulares (promotores), mientras
que la elongacin requiere una asociacin fuerte
con todas las secuencias que la enzima encuentre
durante la transcripcin. La FIGURA 11.25 ilustra
cmo se resuelve el dilema por medio de la asocia-
cin reversible entre el factor o y la enzima central.
Como se mencion antes (vase la seccin 11.8, La
asociacin con el factor o cambia en la iniciacin),
el factor a es liberado despus de la iniciacin o
cambia su asociacin con la enzima central de tal
manera que ya no participa en la unin al DNA. Hay
menos molculas de factor o que de enzima central;
por lo tanto, el uso de la enzima central requiere el
reciclaje de a. Esto ocurre inmediatamente despus
de la iniciacin (como se muestra en la figura) en
cerca de un tercio de los casos; se supone que o y la
enzima central se disocian en un momento poste-
rior en los dems casos.
La difusin aleatoria a cualquier sitio es veloz
I~io14\r1s-1
mmmmm
El intercambio con el promotor puede ser rpido
a : 7
La polimerasa de RNA se une de manera muy rpi-
da a secuencias de DNA aleatorias y podra encontrar un promotor
por desplazamiento directo de la secuencia de unin del DNA.
J!.i.!jlli.'|.!.i!llJI.,!!!.il.|||.II.U.!.i.!ll.|.Tl
FIGUR/
La polimerasa de RNA no se desliza por el DNA.
11.11 EL factor a controla la unin al DNA 271
El factor a y la enzima central deben disociarse
Rpido | Lento
Rpido {
Muy rpido
Muy rpido
Enzima central
aimacenada en
el DNA
El factor o se
asocia a la
enzima central
La holoenzima
se desplaza
hacia los
promotores
La enzima
central
sintetiza RNA
La enzima
central termina
y es liberada
El factor o y la enzima central se reciclan en
puntos diferentes durante la transcripcin.
A pesar de la sincronizacin exacta de su libe-
racin de la enzima central, el factor a interviene
slo en la iniciacin. Se hace innecesario cuando
la iniciacin abortiva concluye y la sntesis de RNA
ha logrado iniciarse. Se desconoce si el estado de la
polimerasa cambia porque se supera la iniciacin
abortiva o si, por el contrario, es el cambio de estado
el que finaliza la iniciacin abortiva y permite que
comience la elongacin.
Cuando el factor a es liberado de la enzima cen-
tral, queda disponible de inmediato para ser utiliza-
do por otra enzima central. Sin importar si el factor o
es liberado o permanece asociado con mayor de-
bilidad a la enzima central, esta ltima est unida
con bastante fuerza al DNA en el complejo ternario.
Esencialmente est "encerrada" hasta que se com-
pleta la elongacin. Cuando finaliza la transcripcin,
la enzima central es liberada. Entonces se "almace-
na
"
unindose a un sitio dbil del DNA. Si ha perdi-
do su factor a, debe encontrar otro para emprender
un nuevo ciclo de transcripcin,
La enzima central tiene una afinidad intrnseca
alta por el DNA, la cual se incrementa en la presen-
cia de un RNA naciente. Sin embargo, su afinida*
por los sitios de unin dbiles es muy alta para per
mitir que la enzima distinga de manera eficaz lo
promotores entre las otras secuencias. Al reducir I
estabilidad de los complejos dbiles, el factor a per
mite que el proceso ocurra mucho ms rpido; y a
estabilizar la asociacin en los sitios de unin fuero
el factor conduce la reaccin de manera irreversilv
hacia la formacin de complejos abiertos. Cuando L
enzima libera el factor a (o cambia su asociacin coi
l), vuelve a tener una afinidad general por tod
el DNA, sin importar la secuencia, que le permi:
continuar con la transcripcin.
Qu controla la capacidad de la holoenzima par
unirse de manera especfica a los promotores? E
factor a tiene dominios que reconocen al DN_
promotor. Como un polipptido independiente, I
factor a no se une al DNA, pero cuando la holoer
zima forma un complejo de unin fuerte, a entr
en contacto con el DNA en la regin localizada i
sentido ascendente con respecto al punto de inicie
Esta diferencia se debe a un cambio en la conforma
cin del factor a cuando se une a la enzima centra!
La regin terminal N del factor o libre suprime l
actividad de la regin de unin al DNA; cuando o I
une a la enzima central, esta inhibicin es liberad.
y puede unirse de manera especfica a las secuen
cias promotoras (vase tambin la Figura 11.35 c
la seccin 11.17). La incapacidad del factor a Ubn
de reconocer las secuencias promotoras puede se
importante: si a pudiera unirse libremente a los pro
motores, podra bloquear la iniciacin de la tran-
cripcin mediada por la holoenzima.
BWW EL reconocimiento
del promotor depende
de Las secuencias de consenso
Conceptos principales
.
Un promotor es definido por la presencia de secuencias
de consenso cortas en localizaciones especficas.
.
Las secuencias de consenso promotoras estn formadas
por una purina en el punto de inicio, por el hexmero
TATAAT centrado en -10, y por otro hexmero centrado
en -35.
.
Los promotores individuales suelen diferir del consenso
en una o ms posiciones.
Al ser una secuencia de DNA cuya funcin es aj
reconocida por ciertas protenas, un promotor difiere d
las secuencias cuyo papel es ser transcritas o tradui
das. La informacin para la funcin del promotor
proporciona de manera directa la secuencia de DNA
su estructura es la seal. ste es un ejemplo elsie
272 CAPTULO 11 Transcripcin
B sitio de actuacin en cis, como se defini antes
B Figura 2.16 y en la Figura 2.17. En contras-
las regiones expresadas adquieren su significado
o despus de que la informacin es transferida a
a forma de cido nucleico o protena,
Una pregunta fundamental en la exploracin de
nteraccin entre la polimerasa de RNA y su pro-
:
or es, cmo reconoce la protena una secuen-
promotora especfica? Tiene la enzima un sitio
wo que distingue la estructura qumica de una
aencia particular de bases en el DNA de doble h-
? Qu tan especficos son sus requerimientos?
Una manera de disear un promotor podra
sistir en una secuencia particular de DNA que
reconocida por la polimerasa de RNA. Cada pro-
!or estara formado por,
o al menos incluira, esta
Inda. En el genoma bacteriano, la longitud m-
a que podra proporcionar una seal adecuada
'
.a de 12 bp. (Es probable que ocurra alguna se-
encia ms corta, slo por casualidad, con suficien-
firecuencia para proveer seales falsas. La longitud
bima necesaria para el reconocimiento exclusivo
~
ienta con el tamao del genoma.) La secuencia
12 bp no necesita ser contigua. Si un nmero
recfico de pares de bases separa dos secuencias
estantes ms cortas, su longitud combinada po-
B ser menor a 12 bp, debido a que la misma dis-
ida de separacin ofrece una parte de la seal
Buso si la secuencia intermedia es irrelevante).
Los intentos por identificar las caractersticas del
IA que son necesarias para la unin de la polime-
a de RNA iniciaron al comparar las secuencias de
tintos promotores. Toda secuencia esendal de nu-
tridos debe estar presente en todos los promotores;
dice que dicha secuenda est conservada. Sin em-
igo, no es necesario que una secuencia conservada
incida en cada una de las posiciones; se permite
ta variacin. Cmo se analiza una secuencia de
A para determinar si est lo suficientemente con-
ada para constituir una seal reconocible?
Los presuntos sitios de reconocimiento del DNA
tten definirse como una secuencia idealizada que
-resenta la base que est presente con mayor fre-
eacia en cada posicin, Una secuencia de con-
nso consiste en la alineacin de todos los ejemplos
nocidos para aumentar al mximo su homologa,
ra que una secuencia sea aceptada como consen-
cada base particular debe predominar de mane-
raaonable en su posicin y la mayor parte de los
mplos debe relacionarse con el consenso por slo
a o dos sustituciones.
La caracterstica sobresaliente de la secuencia de
;
promotores de E. coli es que no hay una conserva-
n extensa de secuencia en los 60 bp asociados a la
merasa de RNA. La secuencia de gran parte del
I de unin es irrelevante. Sin embargo, algunos
fragmentos cortos dentro del promotor estn con-
servados y son determinantes para su funcin. La
conservacin slo de secuencias de consenso muy cortas es
una caracterstica tpica de los sitios reguladores (como los
promotores) en los genomas de los organismos procariti-
eos y eucariticos.
Hay cuatro (tal vez cinco) caractersticas con-
servadas en un promotor bacteriano: el punto de
inicio, la secuencia-10, la secuencia-35, la separa-
cin entre las secuencias -10 y -35 y (en ocasiones)
el elemento UP:
.
El punto de nido casi siempre (>90% de las
veces) es una purina. Es frecuente que el pun-
to de inicio sea la base central de la secuen-
cia CAT, pero la conservacin de este triplete
no es lo suficientemente representativa para
considerarlo como una seal obligatoria.
.
Al lado del punto de inicio en sentido as-
cendente, en casi todos los promotores es
reconocible una regin de 6 bp. El centro
del hexmero en general se localiza a unos
10 bp en sentido ascendente con respec-
to al punto de inicio; en los promotores
conocidos, la distancia vara de -18 a -9.
Debido a su localizacin, el hexmero a
menudo es denominado secuencia -10. Su
secuencia de consenso es TATAATy puede
describirse de la siguiente manera:
T
80 95
T
45
A
60
A
50
T
96
en donde el subndice denota el porcentaje
de apariciones de la base observada ms a
menudo, el cual vara de 45 a 96%. (Una
posicin en la cual no hay una preferencia
discernible por ninguna base se indica con la
letra N.) Si la frecuencia de apariciones indi-
ca una importancia probable en la unin de
la polimerasa de RNA, se esperara que las
bases TA iniciales, altamente conservadas, y
la base T final, casi por completo conserva-
da, de la secuencia -10 fueran las bases ms
importantes,
.
Otro hexmero conservado se centra a -35
bp en sentido ascendente desde el punto de
inicio. A ste se le denomina gecuencia -35.
La secuencia de consenso es TTGACA; en for-
ma ms detallada, la conservacin es:
T
S2
T
S4
G
78
A
65
C
54
A
45
.
La distancia que separa los sitios -10 y -35
es de entre 16 y 18 bp en 90% de los pro-
motores; en los casos excepcionales, llega a
ser de apenas 15 bp o de hasta 20 bp. Aunque
la secuencia de la regin intermedia no es impor-
tante, la distancia es crucial para que los dos sitios
conser\>en la separacin adecuada para la geome-
tra de la polimerasa de RNA.
11.12 El reconocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso
273
El promotor tiene tres componentes
Puni de inicio
-
35 -10 |
TTGACA 16-19 bp TATAAT 5-9 bp
Un promotor tpico tiene tres componentes,
que son Las dos secuencias de consenso localizadas en -35 y
en -10 y el punto de inicio.
.
Algunos promotores tienen una secuencia
abundante en A-T localizada ms lejos en
sentido ascendente. A sta se le denomina
elemento UP. Interacta con la subunidad
a de la polimerasa de RNA. Suele encon-
trarse en los promotores que se expresan de
manera amplia, como los promotores de los
genes de RNAr.
El promotor ptimo es una secuencia formada
por el hexmero -35, separada por 17 bp del hex-
mero -10, postrndose a 7 bp en sentido ascendente
del punto de inicio. En la FIGURA 11.26 se ilustra la
estructura de un promotor y muestra el intervalo
de variacin permitido a partir de este parmetro
ptimo.
Q La eficiencia de Los promotores
puede incrementar o disminuir
por medio de mutaciones
Conceptos principales
.
Las mutaciones Lentificadoras que disminuyen la
eficiencia de un promotor a menudo reducen la
adaptacin a las secuencias de consenso, mientras que
las mutaciones aceleradoras tienen el efecto contrario.
.
Las mutaciones que se presentan en la secuencia -35
suelen afectar la unin inicial de la polimerasa de RNA.
.
Las mutaciones localizadas en la secuencia -10 a
menudo influyen en la reaccin de desnaturalizacin
que convierte un complejo cerrado en uno abierto.
Las mutaciones son una fuente importante de in-
formacin de la funcin de los promotores. Las mu-
taciones de los promotores afectan el nivel de la
expresin de los genes que controlan sin alterar los
productos gnicos. La mayor parte es identificada
como mutantes bacterianos que perdieron, o redu-
jeron en gran medida, la capacidad de transcripcin
de los genes adyacentes. Se conocen como muta-
ciones lentificadoras. Con menor frecuencia, se
encuentran mutantes en los que la transcripcin
aumenta por el promotor. stas son mutaciones
aceleradoras
Es importante recordar que las mutaciones "ace-
leradoras" y "lentificadoras" se definen de acuerdo
a la eficiencia habitual con la cual funciona un pro-
motor particular. Esto vara mucho. Por lo tanto, un
cambio identificado como una mutacin lentificadc-
ra en un promotor podra nunca haberse aislado er,
otro promotor (el cual en su estado silvestre podr;
ser incluso menos eficiente que la forma mulante
del primer promotor). La informacin adquirida er.
estudios in vivo tan slo identifica la direccin glob
del cambio provocado por la mutacin.
El promotor ms eficaz es aquel que tiene la?
secuencias de consenso reales? Esta expectativa sur-
ge de la sencilla regla que afirma que las mutaciones
aceleradoras por lo general incrementan la homolo-
ga con una de las secuencias de consenso o acortar.
la distancia entre ellas a 17 bp. Las mutaciones len-
tificadoras casi siempre disminuyen la semejanza de
cualquiera de los sitios con respecto a las secuencia-
de consenso o incrementan la distancia entre ellos I
ms de 17 bp. Las mutaciones lentificadoras hender.
a concentrarse en las posiciones mucho ms conser-
vadas, lo cual confirma su importancia particular
como el determinante principal de la eficiencia de
un promotor. Sin embargo, hay excepciones ocasio-
nales a estas reglas.
Para determinar los efectos absolutos de las mu-
taciones de los promotores, se debe medir in vitro la
afinidad de la polimerasa de RNA por los promoto-
res mutantes y de tipo silvestre. Hay una variacior.
cercana a 100 veces en la velocidad a la cual la po-
limerasa de RNA se une a promotores diferentes
vitro, lo cual se correlaciona bien con las frecuencia
de la transcripcin que se observa cuando sus gene -
correspondientes se expresan in vivo. Si se profundi-
za ms en este anlisis, se puede investigar la etap
en la cual una mutacin influye en la capacidad de
promotor. Cambia la afinidad del promotor por la
polimerasa de RNA? Queda la enzima con capaci-
dad de unirse pero es incapaz de iniciar? Se alten
la influencia de un factor accesorio?
Al medir las constantes cinticas de la forma-
cin de un complejo cerrado y de su conversin |
un complejo abierto, como se define en la Figur;
11.19, se pueden analizar las dos etapas de la reac-
cin de iniciacin:
. Las mutaciones lentificadoras de la secuen-
cia -35 reducen la velocidad de la formacin
de los complejos cerrados (reducen la K
i
pero no inhiben su conversin en un com-
plejo abierto.
.
Las mutaciones lentificadoras en la secuenc;
-10 no afectan la formacin inidai de un com-
plejo cerrado, pero hacen ms lenta su con-
versin en la forma abierta (reducen la k
2).
I
Estos resultados sugieren el modelo que se mues-
tra en la fIGURA 11.27. La funcin de la secuencia-35
es proporcionar la seal de reconocimiento para la
274 CAPTULO 11 Transcripcin
Contacto -> unin -> desnaturalizacin
-
35 -10 Inicio
1. La polimerasa de RNA en un principio
contacta a la secuencia -35
2. El complejo cerrado se forma en una
regin promotora
Una protena protege a una serie de enlaces contra
el ataque de las nucleasas
/\/\
3. La desnaturalizacin en la regin
-
10 transforma el complejo a su forma
abierta
La secuencia -35 se utiliza para el reconoci-
"":
3nto inicial y la secuencia -10 se utiliza en la reaccin de
lsnaturalizacin que transforma un complejo cerrado en un
:;
Tip[ejo abierto.
polimerasa de RNA, mientras que la secuencia -10
permite al complejo pasar de la forma cerrada a la
Ibrma abierta. Se puede considerar que la secuencia
-
35 constituye un "dominio de reconocimiento",
~
ientras que la secuencia -10 es un "dominio de
iesenrollamiento" del promotor.
La secuencia de consenso del sitio -10 est for-
nada de manera exclusiva por pares de bases A-T,
.na configuracin que ayuda a la desnaturalizacin
fcaicial de las cadenas individuales del DNA dplex,
1 menor cantidad de energa necesaria para sepa-
rar los pares A-T en comparacin con la requerida
para romper los enlaces de los pares G-C indica que
-n fragmento de pares A-T demanda la cantidad m-
nima de energa para la separacin de las cadenas.
La secuencia ubicada alrededor del punto de ini-
o influye en el episodio de la iniciacin. La regin
cial transcrita (de +1 a +30) afecta la velocidad a
a cual la polimerasa de RNA despeja al promotor
f. p
or lo tanto, tiene cierto efecto sobre la fuerza
pe promotor. En consecuencia, la fuerza global de
m promotor no puede predecirse por completo por
sus secuencias de consenso -35 y -10.
Un promotor "tpico" se vale de sus secuencias
-
-
5 y -10 para ser reconocido por la polimerasa de
7 XA
, pero una de las dos secuencias est ausente
en ciertos promotores (excepcionales). En algunos
ie estos casos, el promotor no puede ser reconocido
lo por la polimerasa de RNA; la reaccin requiere
protenas auxiliares, las cuales superan la deficien-
a en la interaccin intrnseca entre la polimerasa
.
i RNA y el promotor,
Complejo polimerasa de
RNA-promotor parcialmente
atacado por la DNAasa !
DNA etiquetado en
un extremo de una
de las cadenas
GEL
EXPERIMENTAL
Las bandas
ausentes
identifican e!
sitio de unin
DNA aislado y
desnaturalizado en cadenas
individuales
A/v/y/ .
V/WA/VX,
ELECTROFORESIS Punto ms
distante con
- respecto al
extremo
eti
quetado
- GELDE
CONTROL
El DNA no unido
la polimerasa
-
presenta bandas
en las posiciones
correspondientes
a los cortes en
cada uno de los
enlaces
-
Punto ms
cercano al
extremo
etiquetado
FIGURA 11.28 La impresin de huellas identifica los sitios
de unin de las protenas al DNA por su proteccin contra la
formacin de mellas.
La poLimerasa de RNA
se une a una cara del DNA
Conceptos principales
Las secuencias de consenso localizadas en -35 y -10
proporcionan la mayor parte de los puntos de contacto
para la polimerasa de RNA en el promotor.
Los puntos de contacto se encuentran en una de las
caras del DNA.
La capacidad de la polimerasa de RNA (o, de he-
cho, de cualquier protena) para reconocer el DNA
puede caracterizarse por medio de impresin de
huellas. Una secuencia de DNA unida a la protena
es digerida de manera parcial con una endonucleasa
que rompe los enlaces fosfodister individuales en el
interior del cido nucleico. En condiciones apropia-
das, un enlace fosfodister particular se rompe en
algunas molculas de DNA, pero no en todas. Las
posiciones que son cortadas se reconocen mediante
11.14 La polimerasa de RNA se une a una cara del DNA
275
La polimerasa de RNA hace contacto con una cara del DNA
Secuencia -35
TTGACA
AACTGT
Secuencia -10 Punto de inicio
miUl U A A TX X X X A J
j Cadena
, ; , codificadora
1111 11 1 Desenrolla niento
ATA Cadena molde

T T AX X X X C
tt
La mayor parte de los puntos de contacto se encuentra en una cara del
DNA (en la cadena codificadora) ,
v
l Modificaciones que impiden que se una la polimerasa de RNA
i Sitios en los cuales la polimerasa de RNA brinda proteccin contra las
modificaciones
Mutaciones que eliminan o disminuyen la actividad del promotor
para el RNA.
Una cara del. promotor contiene los puntos de contacto
DNA etiquetado en una cadena en un solo extremo.
El principio es el mismo que rige la secuenciacin
del DNA: la divisin parcial de una molcula etique-
tada en un extremo en un sitio susceptible crea un
fragmento de longitud nica.
Como se puede observar en la
despus del tratamiento con la endonucleasa,
los
fragmentos de DNA son recuperados y sometidos a
electroforesis en un gel que los separa de acuerdo
con su longitud. Cada fragmento que retiene un
extremo etiquetado produce una banda radioactiva.
La posicin de la banda corresponde al nmero de
bases que tiene el fragmento. Los fragmentos ms
cortos se desplazan con ms rapidez, por lo que la
distancia del extremo etiquetado se cuenta a partir
del fondo del gel.
En un DNA libre, cada posicin de enlace sus-
ceptible se rompe en una u otra molcula. Sin em-
bargo, cuando el DNA forma un complejo con una
protena, la regin cubierta por la protena de unin
al DNA est protegida en cada molcula. As,
dos
reacciones corren en paralelo: un control de DNA
solo y una mezcla experimental que contiene mo-
lculas de DNA unidas a la protena. Cuando una
protena unida bloquea el acceso de la nucleasa al DNA,
los enlaces de la secuencia unida no se rompen en la mez-
cla experimental
En el control se rompen todos los enlaces. Esto
genera una serie de bandas, en donde una banda
representa a cada base. Hay 31 bandas en la figura.
En el fragmento protegido, los enlaces no pueden
romperse en la regin unida a la protena, por lo que
las bandas que representan los fragmentos de los ta-
maos correspondientes no se generan. La ausencia
de las bandas 9-18 en la figura identifica un sitio de
unin a la protena que cubre la regin localizada
a 9-18 bases del extremo del DNA etiquetado. Al
comparar las lneas de control y las experimentales
por medio de una reaccin de secuenciacin que
corre en paralelo, es posible
"
leer" en forma directa
la secuencia correspondiente, e identificar as la se-
cuencia de nucletidos del sitio de unin.
Como se describi antes (vase la Figura 11.20),
la polimerasa de RNA se une en un inicio a la regin
de -50 a +20. Los sitios en los cuales la polimera-
sa de RNA s entra en contacto con el promotor
pueden identificarse cuando se modifica la tcnica
de impresin de huellas para tratar los complejos
promotor-polimerasa de RNA con agentes reactivos
que modifican bases particulares. Se puede realizar
el experimento de dos formas:
.
El DNA puede ser modificado antes de que
se una a la polimerasa de RNA. Si la modi-
ficacin evita que la polimerasa de RNA se
una, se habr identificado la posicin de una
base en la cual el contacto es esencial.
.
El complejo DNA-polimerasa de RNA puede
ser modificado. Despus se compara el pa-
trn de bandas protegidas con el del DNA
libre y con el del complejo no modificado.
Algunas bandas desparecen, lo que permi-
te identificar sitios en los cuales la enzima
protegi al promotor contra la modificacin.
Otras bandas aumentan en intensidad, con
lo que se identifican sitios en los cuales el
DNA debe permanecer en una conforma-
cin en la cual est ms expuesto.
Los cambios de sensibilidad revelan la geo-
metra del complejo, como se resume en la GURA
11.29
, con un promotor tpico. Las regiones -10 y
-
35 contienen la mayor parte de los sitios de con-
tacto para la enzima. Dentro de estas regiones,
los
mismos conjuntos de posiciones tienden a impedir
la unin si fueron modificados con anterioridad y-a
mostrar un incremento o una disminucin de la sus-
ceptibilidad a la modificacin despus de la unin.
Los puntos de contacto no coinciden por completo
con los sitios de mutacin; no obstante, ocurren en
la misma regin limitada.
Es notable que las mismas posiciones en dife-
rentes promotores ofrezcan los puntos de contacto,
aunque haya una base diferente. Esto indica que
hay un mecanismo comn para la unin de la po-
limerasa de RNA, aunque la reaccin no dependa
de la presencia de bases particulares en algunos d-
los sitios de contacto. Este modelo explica porqu
algunos de estos puntos no son sitios de mutacin"
Adems, no todas las mutaciones se encuentran1 . I
un punto de contacto; las mutaciones pueden Ir
fluir en la vecindad sin ser tocados por la enzimi
276 CAPTULO 11 Transcripcin
Es especialmente significativo que los experi-
entos con modificaciones previas identifican slo
. )s en la misma regin que est protegida por la
zima contra la modificacin subsiguiente. Estos
. s experimentos evalan cosas diferentes. La mo-
Bcacin previa identifica a todos aquellos sitios que
a enzima debe reconocer para unirse al DNA. Los
.perimentos de proteccin reconocen todos los si-
s que en realidad hacen contacto en el complejo
inario. Los sitios protegidos incluyen todos los si-
s de reconocimiento e incluso algunas posiciones
iicionales, lo cual sugiere que la enzima primero
econoce una serie de bases indispensable para que
;:emce
"
y luego extienda sus puntos de contacto
tras bases.
La regin del DNA que est desenrollada en el
implejo binario puede identificarse de manera di-
ccta por medio de cambios qumicos en su disponi-
..idad. Cuando se separan las cadenas de DNA, las
ases no apareadas se hacen susceptibles a agentes
eactivos que no pueden alcanzarlas en la estructu-
;
de doble hlice. Dichos experimentos implican
Posici
ones entre -9 y +3 en la reaccin inicial de
iesnaturalizacin. La regin desenrollada durante
i iniciacin, por lo tanto, incluye el extremo dere-
"
o de la secuencia -10 y se extiende justo despus
B sitio de inicio.
En una perspectiva tridimensional, todos los
. ntos de contacto que se encuentran en sentido
rendente de la secuencia -10 se localizan en una
:
_
a del DNA. Esto puede observarse en el dibujo
"
;
erior de la Figura 11.29, en donde los puntos de
aontacto estn marcados en una doble hlice vista
:de uno de los lados. La mayor parte yace en la ca-
. .na codificadora. Es probable que estas bases sean
.;
jnocidas en la formacin inicial de un complejo
/
.ario cerrado. Esto permitira que la polimerasa de
"
NA se aproximara al DNA por un lado y recono-
rra dicha cara del DNA. A medida que comienza
i esenrollamiento del DNA, ms sitios que origi-
;
mente yacen en la otra cara del DNA pueden ser
nocidos y pueden realizarse uniones con ellos.
EL superen rolla miento
es una caracterstica
importante de la transcripcin
Conceptos principales
.
El superenrollamiento negativo incrementa la eficiencia
de algunos promotores al ayudar en la reaccin de
desnaturalizacin.
.
La transcripcin genera superenrollamientos positivos
delante de la enzima y superenrollamientos negativos
detrs de ella, y stos deben ser retirados por La girasa
y por La topoisomerasa.
La transcripcin altera la estructura del DNA
(Superenrollamientos Transcripcin Sobregirado
negativos) del DNA (superenrollamientos
> positivos) *
La topoisomerasa -
relaja los
111 9''rasa introduce
superenrollamientos i superenro
llamientos ;
negativos
T positivos
I
DNA dplex (10.4 bp/vuelta)
I
0 La transcripcin genera DNA enrollado de forma
ms compacta (superenrollado positivamente) por delante de
la polimerasa de RNA, mientras que el DNA que se encuentra
detrs de sta est enrollado de forma ms laxa (superenrollado
negativamente).
La importancia de la separacin de las cadenas en la
reaccin de iniciacin sobresale por los efectos del
superenrollamiento. Las polimerasas de RNA euca-
riticas y procariticas pueden iniciar la transcrip-
cin con mayor eficiencia in vitro cuando el molde
est sobregirado, al parecer porque la estructura
superenrollada requiere menos energa libre para
la desnaturalizacin inicial del DNA en el complejo
de iniciacin.
La eficiencia de algunos promotores est deter-
minada por el grado de superenrollamiento. La re-
lacin ms frecuente es que el superenrollamiento
negativo ayude a la transcripcin. En principio, se
entiende cmo esta situacin colabora en la reac-
cin de iniciacin. Sin embargo, por qu algunos
promotores dependen de la extensin del super-
enrollamiento en tanto que otros no? Una posibi-
lidad es que sea su secuencia la que determine la
dependencia de un promotor en el enrollamiento
excesivo. Esto permitira pronosticar que algunos
promotores tienen secuencias ms fciles de desna-
turalizar (y, por lo tanto, menos dependientes del
superenrollamiento), al tiempo que otros tienen
secuencias ms complejas (y una necesidad mayor
de estar superenrollados). Una alternativa es que la
localizacin del promotor puede ser importante si
las regiones diferentes del cromosoma bacteriano
tienen grados distintos de superenrollamiento.
El superenrollamiento tambin tiene una par-
ticipacin constante en la transcripcin. A medida
que una polimerasa de RNA transcribe el DNA, ocu-
rre desenrollamiento y enrollamiento, como se ilus-
tra en la Figura 11.4. Esto requiere que el complejo
de transcripcin completo gire en torno al DNA o
que el DNA mismo gire sobre su eje helicoidal. Las
consecuencias de la rotacin del DNA se ilustran
en la GURA 0 en el modelo del bidominio para
11.15 El superenrollamiento es una caracterstica importante de la transcripcin
277
la transcripcin. Conforme la polimerasa de RNA
avanza por la doble hlice, genera superenrolla-
miento positivo (DNA enrollado de manera ms
compacta) por delante y produce superenrollamien-
to negativo (DNA enrollado de forma ms laxa) por
detrs. Por cada vuelta helicoidal recorrida por la
polimerasa de RNA, se genera un giro +1 adelante
y un giro -1 atrs.
Por lo tanto, la transcripcin tiene un efecto
significativo en la estructura (local) del DNA. Como
resultado, las enzimas girasa (que introduce super-
enrollamientos negativos) y topoisomerasa I (la cual
retira los superenrollamientos negativos) son nece-
sarias para rectificar la situacin adelante y detrs de
la polimerasa, respectivamente. El bloqueo de las ac-
tividades de la girasa y de la topoisomerasa provoca
cambios importantes en el superenrollamiento del
DNA. Por ejemplo, en las levaduras que carecen de
una enzima que relaje superenrollamientos nega-
tivos, la densidad del superenrollamiento negativo
se duplica en una regin transcrita. Una implicacin
posible de estos resultados es que la transcripcin se
encarga de generar una proporcin significativa del
superenrollamiento que ocurre en la clula.
En la replicacin sucede una situacin similar,
cuando el DNA debe ser desenrollado en una hor-
quilla de replicacin en movimiento de modo que
las cadenas individuales separadas puedan utilizarse
como moldes para la sntesis de cadenas hijas. (Ms
adelante, en la Figura 19.20, se indican las solu-
ciones de las restricciones topolgicas asociadas a
dichas reacciones.)
La sustitucin de Los factores
a puede controlar La iniciacin
Conceptos principales
.
Escherichia coli tiene numerosos factores a, cada uno
de los cuales provoca que la polimerasa de RNA inicie
en un conjunto de promotores definido por secuencias
especficas -35 y -10.
o70 se utiliza en la transcripcin general y los dems
factores o son activados por condiciones especiales.
La divisin de labores entre la enzima central, que
realiza la elongacin de la cadena, y un factor a,
que interviene en la seleccin del sitio, de inmediato
da origen a la pregunta de si hay ms de un tipo de
factor o, cada uno especfico para una clase diferente
de promotores. La FIGURA 11 muestra el principio
de un sistema en el cual una sustitucin del factor a
cambia la eleccin de promotor.
Escherichia coli utiliza factores o alternativos para
responder a cambios ambientales generales; stos
se enlistan en la GURA 11. . (Reciben su nombre
El factor a controla el reconocimiento de los promotores
La holoenzima que incluye a a70 reconoce a un
conjunto de promotores
O:
.
6
La sustitucin del factor o provoca que la enzima
reconozca a un conjunto diferente de promotores
FIGURA 11. El factor a asociado a la enzima central deter-
mina el conjunto de promotores en los cuales debe iniciarse
La transcripcin.
por el peso molecular del producto o por el gen'.
El factor general, el cual se encarga de la transcrip-
cin de la mayor parte de los genes bajo condiciones
normales, es a70. Los factores o alternativos as, o3:
aE y a54 son activados en respuesta a cambios am-
bientales; el factor o28 se utiliza para la expresin
de genes flagelares durante el crecimiento norma!
pero su nivel de expresin responde a cambios en
el ambiente. Todos los factores o, excepto a
54
perte-
necen a la misma familia de protenas y funcionan
de la misma forma general.
La fluctuacin de temperatura es un tipo fre-
cuente de cambio ambiental. Numerosos organis-
mos, tanto eucariticos como procariticos, res-
ponden de manera similar. En presencia de ur
incremento de temperatura, la sntesis de las prc -
tenas que se estaban produciendo se interrumpe
o disminuye y se sintetiza un nuevo conjunto de
protenas. Las protenas nuevas son los producu -
de los genes de choque trmico, cuyas funcione;
son proteger a la clula contra el estrs ambienta!.
Los genes de choque trmico tambin se expresar.
en respuesta a condiciones ajenas al choque trmi-
co. Varias de las protenas de choque trmico se:-
chaperones. En E. coli, la expresin de 17 protena
de choque trmico es activada por cambios en
transcripcin. El gen rpoU es un regulador necesa-
rio para activar la respuesta al choque trmico. S _
producto es o32, el cual funciona como un facto;
a alternativo que provoca la transcripcin de le-
genes de choque trmico.
La respuesta al choque trmico se logra al in-
crementar la cantidad de a32 cuando la temperatui
aumenta y al disminuir su actividad cuando el cam-
bio de temperatura se revierte. La seal bsica que
278 CAPTULO 11 Transcripcin
- -
ice la produccin de a32 es la acumulacin de
:
enas desplegadas (desnaturalizadas en forma
rial) que resultan del incremento de la tempe-
- -:
ra. La protena o32 es inestable, lo cual es im-
rante porque permite que su cantidad aumente
iisminuya con rapidez. Las protenas a70 y a32
-
rden competir por la enzima central disponible,
:
al manera que el conjunto de genes transcritos
-
rante el choque trmico depende del balance en-
: ellos. Los factores o cambiantes son un asunto
:
r:o que repercute de manera generalizada en la
-
resin de los genes en las bacterias. Por lo tanto,
es sorprendente que la produccin de factores a
evos pueda ser el objetivo de numerosos circuitos
-
guiadores. El factor as es inducido cuando la bac-
: ra transita de la fase de crecimiento a la fase esta-
ara y tambin en otras condiciones de estrs. Es
r
.lrolado en dos niveles. La traduccin del RNAm
-
rS se incrementa con la reduccin de la tempe-
vara o con la osmolaridad elevada. La protelisis
-
r- producto protenico es inhibida por escasez de
irbono (la seal tpica de la fase estacionaria) y por
:
:emperatura alta.
Otro grupo de genes regulados por cambios tr-
v-
cos es controlado por el factor aE. Responde a
ambios ms extremos de temperatura que a32 y es
aducido por la acumulacin de protenas desple-
,
;
las en el espacio periplsmico o en la membrana
.
lerna. Es controlado por el circuito intrincado que
r resume en la . El factor oE se une a
ma protena (RseA) que se localiza en la membrana
v;erna. Como resultado
, no puede activar la trans-
:
npcin. La acumulacin de protenas desplegadas
:::
iva a una proteasa (DegS) en el espacio peripls-
vico
, la cual separa el extremo C de la protena
I seA. Esta separacin activa otra protena localizada
la membrana interna (YaeL), la cual divide a la
-
:
gin terminal N de la RseA. Cuando esto sucede,
r.
factor oE es liberado y puede activar entonces la
transcripcin. El resultado neto es que la acumula-
rin de protenas desplegadas en la periferia de la
bacteria se encarga de la activacin del conjunto de
genes controlados por el factor a.
Este circuito tiene dos similitudes interesantes
con otros circuitos reguladores. La respuesta a las
protenas desplegadas en las clulas eucariticas
tambin utiliza una ruta en la cual una protena
:
esplegada (ubicada dentro del retculo endopls-
mico) activa una protena de membrana. En este
;
aso, la protena de membrana es una endonuclea-
sa que divide a un RNA, lo que al final conduce a
un cambio en el corte y empalme que ocasiona la
'
roduccin de un factor de transcripcin (vase la
ieccin 26.17
, La respuesta a protenas desplegadas
se relaciona con el corte y empalme del RNAt). Una
similitud ms directa se encuentra en el primer caso
en ser descubierto, en el cual la separacin de una
protena de membrana activa un factor de transcrip-
cin. En este caso, el propio factor de transcripcin
es sintetizado como una protena de membrana y
el nivel de esterles en la membrana controla la
activacin de las proteasas que liberan al factor de
transcripcin del dominio citoslico de la protena.
Otro factor o se utiliza en condiciones de esca-
sez de nitrgeno. Las clulas de E. coli contienen una
pequea cantidad de a54, el cual es activado cuando
no hay amonio en el medio. En estas condiciones,
los genes son activados para permitir el uso de otras
fuentes de nitrgeno. Las contrapartes de este fac-
tor a se han encontrado en una amplia variedad de
bacterias, por lo que representa un mecanismo de
respuesta que se ha conservado en la evolucin.
Otro caso de conservacin evolutiva de los fac-
tores a es el del factor aF, el cual se presenta en pe-
queas cantidades y hace que la polimerasa de RNA
SEir i
Gen Factor Uso
rpoD o
70
general
rpoS
s
estrs
rpoH a
32
choque trmico
rpoE a
E
choque trmico
rpoN a
54
escasez de nitrgeno
fliA a28(aF) sntesis flagelar
Adems de a70, E. co//tiene numerosos factores
a que son introducidos por condiciones ambientales particula-
res. (El superindice del factor indica su masa.)
1 a* es activado por la dlvisM
PERIPLASMA
C
Divisin
por DegS
Divisin
por YaeL
RseA
w
-
t
N
o liberado
'
s
E
'
CITOPLASMA
l
Activa la
transcripcin
RseA es sintetizada como una protena en la
membrana interna. Su dominio citoplsmico se une al factor
aE. RseA es dividida de manera secuencial en el espacio peri-
plsmico y despus en el citoplasma. La divisin citoplsmica
libera (jE.
11.16 La sustitucin de los factores a puede controlar la iniciacin
279
Los factores a reconocen a los promotores por
medio de secuencias de consenso
Gen Factor
Secuencia -35 Separacin Secuencia-10
rpoD a
70
TTGACA
16-18 bp
TATAAT
rpoH a
32
CCCTTGAA
13-15 bp
CCCGATNT
rpoN a
54
CTGGNA
6 bp
TTGCA
fliA a28(aF) CTAAA
15 bp
GGCGATAA
sigH a
H
AGGANPuPu
11-12 bp
GCTGAATCA
FIGURA 11.34 Los factores o de E. coli reconocen promotores con
diferentes secuencias de consenso.
i tiene regiones c
Extremo N 200
1.1 1.2
Impide la
unin ai DNA
Unin de la enzima central
400 600
I l
4.14.2 2.12.22.4
Interacciones con el promotor
i 1
1 Gen
1 -10 -35
.
TAA7AT-ACAGTT-5'
;
-
Un mapa del factor o70 de E. coli identifica regio-
nes conservadas. Las regiones 2.1 y 2.2 contactan a la polime-
rasa central, La regin 2.3 es necesaria para la desnaturalizacin
y las regiones 2.4 y 4.2 contactan a los elementos promotores de
las secuencias -35 y -10. La regin terminal N impide que 2.4 y
4
.
2 se unan al DNA en ausencia de la enzima central.
transcriba genes que intervienen en la quimiotaxis
y en la estructura flagelar. Su contraparte en Bacllus
subtilis es D, el cual controla los genes flagelares y de
motilidad; en numerosas especies de bacterias hay
factores con la misma especificidad promotora,
Cada factor a provoca que la polimerasa de
RNA inicie en un conjunto particular de promoto-
res. Al analizar las secuencias de estos promotores,
se puede demostrar que cada conjunto es identifica-
do por elementos de secuencia nicos. De hecho, la
secuencia de cada tipo de promotor asegura que sea
reconocido slo por la polimerasa de RNA dirigida
por el factor o apropiado. Se pueden deducir las
reglas generales del reconocimiento de los promo-
tores a partir de la identificacin de los genes que
responden a los factores o que se encuentran en
E
. coli y de aquellos que participan en la espomla-
cin en B. subtilis (vase la seccin 11.19, La espo-
rulacin es controlada por factores a).
Una caracterstica significativa de los promoto-
res para cada enzima es que tienen el mismo tamao y
localizacin relativa con respecto al punto de inicio y mues-
tran secuencias conservadas slo alrededor de los centros
usuales -35 y -10. (El factor a54 es una excepcin en
la cual las secuencias de consenso estn ms cerca
una de la otra y se ubican en -24 y -12; vase 9
seccin 11.17, Los factores o entran en contacto dt
manera directa con el DNA.) Como se resume en le
FIGURA 11. , las secuencias de consenso para cada
conjunto de promotores son diferentes entre s en
una de las posiciones -35 y -10, o en ambas. Esto
significa que una enzima que contiene un factor |
particular puede reconocer slo su propio conjunto
de promotores, por lo que la transcripcin de los
diferentes grupos es mutuamente excluyeme. Er.
consecuencia, la sustitucin de un factor a por otro
desactiva la transcripcin del conjunto antiguo dt
genes y activa la transcripcin de un conjunto nue-
vo. (Algunos genes son expresados por polimerasas
de RNA con factores a distintos debido a que tienen
ms de un promotor, cada uno con un conjunto
diferente de secuencias de consenso.)
Los factores a entran
en contacto de manera
directa con eL DNA
Conceptos principales
a70 cambia su estructura para liberar sus regiones de
unin al DNA cuando se asocia a la enzima central.
a se une a las secuencias -35 y -10.
La definicin de una serie de secuencias de consen-
so diferentes reconocidas en -35 y -10 por holoen-
zimas que contienen factores diferentes (vase la
Figura 11.34) conlleva la implicacin inmediata de
que la subunidad a debe entrar en contacto con a
DNA en estas regiones. Esto sugiere el principio ge-
neral que afirma que hay un tipo comn de relacin
entre el factor a y la enzima central, en la cual el
factor a es colocado de una manera especfica para
que establezca contactos cruciales con las secuencias
promotoras en la vecindad de -35 y -10.
Las mutaciones del factor a que suprimen las
mutaciones en las secuencias de consenso ofrecen
indicios directos de que el factor a entra en contacte
de manera directa con el promotor en las secuencias
de consenso -35 y -10. Cuando una mutacin en
una posicin particular del promotor impide que sea
reconocido por la polimerasa de RNA y una muta-
cin compensadora en el factor permite que la
polimerasa utilice el promotor murante, la explica-
cin ms probable es que el par de bases relevante
del DNA sea contactado por el aminocido que ha
sido sustituido.
Las comparaciones de las secuencias de numero-
sos factores o bacterianos permiten identificar las re-
giones que se han conservado. Sus localizaciones en
el factor a70 de E. coli se resumen en la FIGURA 11.35.
280 CAPTULO 11 Transcripcin
estructura cristalina de un fragmento de factor a
bacteria Thermus aquatkus muestra que estas
Jones se pliegan en tres dominios independientes
la protena: el dominio o
2
contiene a 1.2-2.4, a
3
ntiene a 3.0-1.3 y a
4
contiene a 4.1-4.2.
La Figura 11.35 muestra que dos partes peque-
:
de las regiones dos y cuatro (nombradas 2.4 y
-
- participan en el contacto con las bases en los
mientos -10 y -35, respectivamente. Estas dos
;i mes forman fragmentos pequeos de hlice
en la protena. Los experimentos con molculas
-:
eroduplex muestran que a
70 hace contactos con
bases sobre todo en la cadena codificadora, y
;
atiene estos contactos despus de que el DNA ha
:
> desenrollado en esta regin. Esto sugiere que
factor a podra ser importante en la reaccin de
r naturalizacin.
El uso de elementos helicoidales a en las pro-
iinas para reconocer secuencias de DNA dplex es
ecuente (vase la seccin 14.11, El represor utili-
:
un elemento hlice-vuelta-hlice para unirse al
NA). Los aminocidos separados por tres a cuatro
siciones se encuentran en la misma cara de una
lice a y, por lo tanto, estn en una posicin en
;
que pueden establecer contacto con los pares de
;
5es adyacentes. La IGURA 11.36 muestra que los
iminocidos que se encuentran a lo largo de una
bra de la regin 2.4 de la hlice a contactan a las
:::
ses de las posiciones -12 a -10 de la secuencia
promotora -10.
La regin 2.3 es semejante a las protenas que
I unen a cidos nucleicos de cadena individual y
participa en la reaccin de desnaturalizacin. Las
regiones 2.1 y 2.2 (las cuales forman la parte ms
conservada del factor a) intervienen en la interac-
ln con la enzima central. Se asume que todos los
factores o se unen a las mismas regiones de la poli-
:
erasa central, lo cual garantiza que las reacciones
ean competitivas.
La regin terminal N de o70 tiene funciones re-
guladoras importantes. Si es retirada, la protena
acortada adquiere la capacidad de unirse de manera
-
ipecfica a secuencias promotoras. Esto sugiere que
I regin terminal N acta como un dominio de au-
:
linhibicin. Ocluye los dominios de unin al DNA
Bando o70 est libre. La asociacin con la enzima
;entral cambia la conformacin de o, de tal mane-
ra que la inhibicin es liberada y los dominios de
unin al DNA pueden hacer contacto con el DNA.
La FIGURA 11.37 esquematiza el cambio de con-
lormacin del factor o en la formacin de un com-
plejo abierto. Cuando el factor a se une a la polime-
rasa central, el domino terminal N se balancea -20
A y se aleja de los dominios de unin al DNA, y los
iominios de unin al DNA se separan uno de otro
-
15 , al parecer para adquirir una conformacin
La hlice 2.4 de o determina la especificidad
Protena
DNA
Posicin -13-12-11-10-9-8-7
Los aminocidos de la hlice a 2.4 de o hacen
contacto con bases especficas en la cadena codificadora de la
secuencia promotora -10.
El extremo N de o controla la unin al DNA
Dominios de unin ai DNA
La regin terminal N
se une a los dominios
de unin al DNA en
el factor a libre
El DNA desplaza al
extremo N cuando se
forma el complejo con
el DNA
\ i
Regin terminal N
Regin terminal N
FIGURA 11.37 El extremo N de a impide que las regiones de
unin al DNA se unan al DNA. Cuando se forma un complejo
abierto, el extremo N se separa 20 y las dos regiones de unin
al DNA se alejan 15 .
ms alargada, apropiada para hacer contacto con el
DNA. Las mutaciones en cualquiera de las secuen-
cias -35 o -10 impiden que un factor a70 (grupo
terminal N eliminado) se una al DNA, lo cual su-
giere que a70 contacta ambas secuencias de manera
simultnea. Esto implica que el factor o debe tener
una estructura bastante alargada, que rebase los
-68 de dos vueltas de DNA.
En la holoenzima libre, el dominio terminal N
se localiza en el sitio activo de los componentes de
la enzima central, esencialmente imitando la loca-
lizacin que el DNA ocupar cuando se forme un
complejo de transcripcin. Cuando la holoenzima
forma un complejo abierto en el DNA, el dominio
terminal N a es desplazado del sitio activo. Su re-
lacin con el resto de la protena es, por lo tanto,
muy flexible; la relacin cambia cuando el factor
a se une a la enzima central y de nuevo cuando la
holoenzima se une al DNA.
Las comparaciones de las estructuras cristalinas
de la enzima central y de la holoenzima muestran
que el factor a se encuentra sobre todo en la superfi-
11.17 Los factores o entran en contacto de manera directa con el DNA 281
o
Enzima central
FIGURA 11.38 El factor a tiene una estructura alargada que
se extiende por la superficie de las subunidades de la enzima
central cuando se forma la holoenzima.
*
El DNA en un inicio entra en contacto con el
factor o (en color rosa) y con la enzima central (en color gris).
Se desplaza ms hacia el interior de la enzima central para for-
mar contactos con la secuencia -10. Cuando o es liberado, la
anchura del pasaje que contiene al DNA aumenta. Reproducida
deVassylyev, D. G., etal. Nature. 2002. 417: 712-719. Fotogra-
fa cortesa de Shigeyuki Yokoyama, The University of Tokyo.
ele de la enzima central. La ; GURA 11. ; muestra que
tiene una estructura alargada que rebasa el sitio de
unin al DNA. Esto lo coloca en una posicin que le
permite hacer contacto con el DNA durante la unin
inicial. La hlice de DNA tiene que desplazarse unos
16 a partir de la posicin inicial para entrar al sitio
activo. La FIGURA 11.3 9 ilustra este movimiento
,
visto
en corte transversal a lo largo del eje helicoidal del
DNA.
En el factor a54 se observa una diferencia in-
teresante de comportamiento. Esto provoca que la
polimerasa de RNA reconozca los promotores que
tienen una secuencia de consenso distinta, con
un elemento conservado en -12 y con otro en la
cercana ubicado en -24 (expuesto en la columna
"
-
35" de la Figura 11.32). Por lo tanto, la geome-
tra del complejo polimerasa-promotor es diferente
bajo la direccin de este factor o. Otra diferencia
en el mecanismo de regulacin es que un nivel alto
282 CAPRJL 11 Transcripcin
de transcripcin dirigido por o54 requiere que otros
activadores se unan a sitios que estn bastante dis-
tantes del promotor. Esto contrasta con los otro?
tipos de promotores bacterianos, para los cuales lo?
sitios reguladores estn siempre muy cerca del pro-
motor. El comportamiento de o54 es diferente al de
otros factores a, sobre todo en lo que se refiere a si:
capacidad para unirse al DNA independientemente
de la polimerasa central. En este aspecto, a54 es m?
parecido a los reguladores eucariticos que se anali-
zan en el Captulo 24, Promotores y potenciadores.
que a los reguladores procariticos tpicos que se
abordan en el Captulo 12, El opern.
njj} Los factores cf pueden
organizarse en cascadas
Conceptos principales
.
Una cascada de factores a se crea cuando un factor
o es necesario para transcribir al gen que codifica al
siguiente factor o.
.
Los genes tempranos del fago SP01 son transcritos por
una polimerasa de RNA hospedadora.
.
Uno de los genes tempranos codifica un factor a que
hace que la polimerasa de RNA transcriba los genes
intermedios.
.
Dos de los genes intermedios codifican subunidades
de un factor o que hacen que la polimerasa de RNA
transcriba los genes tardos.
Los factores a se utilizan de manera amplia par;.
controlar la iniciacin de la transcripcin en la bac-
teria B. subtilis, en la cual se conocen -10 factores o
distintos. Algunos se encuentran en las clulas ve-
getativas; otros se producen slo en circunstancien
especiales de infecciones por fagos o en el cambie
de crecimiento vegetativo a esporulacin.
La principal polimerasa de RNA observada en las
clulas de B. subtilis que participan en el crecimiento
vegetativo normal tiene la misma estructura que 1
polimerasa de RNA de E. coli, a2pP
'
o
.
Su factor c
(descrito como o43 o aA) reconoce promotores cor
las mismas secuencias de consenso utilizadas por la
enzima de E. coli bajo la direccin de a70. Muchas-
variantes de la polimerasa de RNA que contiener
otros factores a se encuentran en cantidades muefu
ms pequeas. Las enzimas variantes reconocer,
promotores distintos con base en las secuencias dt
consenso localizadas en -35 y en -10.
La transicin de la expresin de un conjunto
de genes a la expresin de otro conjunto es un;
caracterstica comn de la infeccin por bacterifa
gos. En todos las casos, excepto en los que son mt'
simples, el desarrollo del fago comprende cambie
en el patrn de transcripcin durante el ciclo infec
;
so. Estos cambios pueden lograrse gracias a la
"
tesis de una polimerasa de RNA codificada por los
i ios o a los esfuerzos de los factores accesorios co-
::
cados por los fagos que controlan la polimerasa
|e RNA bacteriana. Un ejemplo bien caracterizado
:
control mediante la produccin de factores o
-
jevos ocurre durante la infeccin por el fago SPO1
; e B. subtilis.
El ciclo infeccioso de SPOl pasa por tres eta-
aas de expresin gnica. En cuanto tiene lugar la
Eleccin se transcriben los genes tempranos del
i o. Despus de 4 a 5 min, cesa la transcripcin de
i genes tempranos y comienza la transcripcin
-
c los genes intermedios. A los ocho a 12 min, la
ranscripcin de los estos genes es remplazada por
:
transcripcin de los genes tardos.
Los genes tempranos son transcritos por la ho-
ioenzima de la bacteria hospedadora. En esencia,
es imposible distinguirlos de los genes hospedado-
ies cuyos promotores tienen la capacidad intrn-
seca de ser reconocidos por la polimerasa de RNA
xpp'a43.
La expresin de los genes de los fagos es indis-
rnsable para las transiciones a la transcripcin de
s genes intermedios y tardos. Tres genes regula-
:
es, 28, 33 y 34, controlan el curso de la transcrip-
- m. Sus funciones se resumen en la iGURA
El patrn de regulacin crea una cascada, en la cual
l enzima hospedadora transcribe un gen tempra-
o cuyo producto es necesario para transcribir los
enes intermedios. Despus de esta transcripcin,
.
s de los genes intermedios codifican productos
jispensables para transcribir los genes tardos.
Los organismos con mutaciones en el gen tem-
"
:
ano 28 no pueden transcribir los genes interme-
::
os. El producto del gen 28 (denominado gp28)
es una protena de 26 kD que remplaza al factor
"
hospedador en la enzima central. Esta sustitucin
:
d nico hecho requerido para hacer la transicin de
-
expresin de los genes tempranos a la expresin de los
mes intermedios. Esto crea una holoenzima que ya
no puede transcribir ms los genes del hospedador
yen cambio transcribe de manera especfica los ge-
es intermedios. No se sabe cmo el producto gp28
:;
splaza a c43 o qu le sucede al polipptido a hos-
edador.
Dos de los genes intermedios participan en la
mente transicin. Las mutaciones en el gen 33
en el gen 34 impiden la transcripcin de los ge-
nes tardos. Los productos de estos genes forman
an dmero que remplaza a gp28 en la polimerasa
-rntral. Una vez ms
, se desconoce cmo gp33 y
B)34 excluyen a gp28 (o a cualquier a43 hospedador
"
rsidual), pero una vez que se han unido a la enzima
mtral, sta es capaz de iniciar la transcripcin slo en los
r
-
omotores de los genes tardos.
Los factores n alternativos controlan el
desarrollo del fago
1GURA 11.40 La transcripcin de Los genes del fago SPOl
es controlada por dos sustituciones sucesivas del factor o que
cambian la especificidad de la interaccin.
Los remplazos sucesivos del factor a tienen
consecuencias dobles. Cada vez que se cambia la
subunidad, la polimerasa de RNA adquiere la ca-
pacidad de reconocer a una nueva clase de genes y
deja de reconocer a la clase anterior. Por lo tanto,
estos cambios constituyen cambios globales en la
actividad de la polimerasa de RNA. Es probable que
toda, o casi toda, la enzima central se asocie al factor
a de ese momento, y el cambio es irreversible.
La esporulacin es controlada
por factores o
Conceptos principales
.
La esporulacin divide a una bacteria en una clula
madre que es desintegrada y una espora que es
liberada.
.
Cada compartimiento avanza a la siguiente etapa de
desarrollo al sintetizar un factor a nuevo que desplaza
al factor a anterior.
.
La comunicacin entre los dos compartimientos
temporiza las sustituciones de los factores o.
Temprano
Los promotores
del fago son
reconocidos por la
holoenzima bacteriana
El gen temprano 28
codifica a un factor a
nuevo que desplaza al
factor a bacteriano
V
Intermedio
La enzima central-gp28
transcribe a los
genes Intermedios
del fago
Los genes Intermedios
33 y 34 codifican f -
protenas que -
remplazan a gp28
Tardo
La enzima central-gp33-gp34
transcribe los genes
tardos del fago
ae
11.19 La esporulacin es controlada por factores a
283
Bacteria
vegetativa
El DNA se
replica
Se forma el
tabique
El DNA se
transfiere al
interior de la
pre-espora
La espora
es engullida
Se forma la
cubierta de
la espora
La clula
madre se lisa
iiiii rr*
*
La espora
se libera
La esporulacin comprende la diferenciacin
de una bacteria vegetativa en una clula madre que se lisa y
en una espora que se libera.
Quiz el ejemplo ms extenso de cambios en los
factores o lo ofrece la esporulacin, otra forma
de vida de disponer algunas bacterias. Al final de
la fase vegetativa en un cultivo de bacterias, el
crecimiento logartmico es interrumpido debido a
que los nutrientes en el medio se agotan. Esto activa
la esporulacin, como se ilustra en la FIGURA 11.41,
El DNA es replicado, un genoma es segregado en
un extremo de la clula y a la larga el genoma es
rodeado por la cubierta rgida de la espora. Cuando
se forma el tabique, genera dos compartimientos
independientes, el de la clula madre y el de la pre-
espora. Al principio del proceso se adhiere un cro-
mosoma a cada polo de la clula. El tabique crecien-
te atrapa parte de un cromosoma en la pre-espora, y
despus una translocasa (SpoI-IIE) bombea al resto
del cromosoma al interior de la pre-espora.
La esporulacin sucede en unas 8 h. Puede con-
siderarse como un tipo primitivo de diferenciacin,
en el cual una clula progenitora (la bacteria ve-
getativa) da origen a dos clulas hijas distintas co-
destinos diferentes; la clula madre a la larga se lis:
y la espora que es liberada tiene una estructura po:
completo diferente a la de la bacteria original.
La esporulacin implica un cambio drstico en
las actividades biosintticas de la bacteria, en el cu
participan numerosos genes. El nivel bsico de con-
trol sucede en la transcripcin. Algunos de los gent
que funcionaron en la fase vegetativa son apagad'
durante la esporulacin, pero la mayor parte com -
na siendo expresado. Adems, los genes espec-
eos utilizados para la esporulacin se expresan slo
durante este periodo. Al final de la esporulacir.
-
40% del RNAm bacteriano es especfico de la el
porulacin.
Las formas nuevas de polimerasa de RNA se ac-
tivan en las clulas sometidas a esporulacin; st;
contienen la misma enzima central que las clul?
vegetativas, pero tienen protenas diferentes en luge
del factor o43 vegetativo. Los cambios en la especifici-
dad de la transcripcin se resumen en la FIGURA 11.4.
El principio especifica que en cada compartimiento:
el factor a existente es desplazado en forma sucesiva
por un factor nuevo que provoca la transcripcin d:
un conjunto diferente de genes. La comunicacin
entre los compartimientos ocurre para coordine:
la cronologa de los cambios en la pre-espora y en la
clula madre.
La cascada de esporulacin inicia cuando la
condiciones ambientales activan un fosforreleva-
dor, en el cual un grupo fosfato pasa por una ser
de protenas hasta que alcanza a SpoOA. (Numer -
sos productos gnicos intervienen en este procey
cuya complejidad puede reflejar la necesidad de ev .
tar errores y desencadenar de manera innecesaria _.
esporulacin.) SpoOA es un regulador de la tran_
cripcin cuya actividad es afectada por la fosforila-
cin. En la forma fosforilada, activa la transcripcin
de dos operones, cada uno de los cuales es transcrito
por una forma diferente de la polimerasa de RNi
hospedadora. Bajo la direccin de un SpoOA h -
forilado, la enzima hospedadora que utiliza el r
general transcribe al gen que codifica al factor o:
;
la enzima hospedadora dirigida por un factor men.
"
aH, transcribe al gen que codifica al factor pro-oE. E
tos dos factores a nuevos son producidos antes de |
formacin del tabique, pero se activan despus.
El factor oF es el primero en ser activado er l
compartimiento de la pre-espora. Es inhibido r
un factor anti-a que se une a l; en la pre-espora, _
factor anti-anti-a retira al inhibidor. Esta reaed :
es controlada por una serie de episodios de fo
rilacin/desfosforilacin. El determinante inicial a
una fosfatasa (SpoIIE) que es una protena integn
de membrana que se acumula en el polo, lo cv
resulta en un incremento de la concentracin c--
284 CAPTULO 11 Transcripcin
El factor n cambia en ambos compartimientos durante la esporulacin
CLULA MADRE La holoenzima
contiene oH o c4
3
PRE-ESPORA
I
i
Ei fostorrelevador
activa la sntesis de
0
F
yopro-E
aE
es activado y desplaza
a a4
3
aF
remplaza a o
43
en ia enzima central
Se crea el gen oK; es
transcrito por aE
El complejo enzima central-aF
transcribe a los genes tempranos
de la esporulacin
aG es el producto de un gen
temprano de la esporulacin
.
Se activa aG y desplaza a oF
Se activa aK y desplaza a oE
El factor aK activado promueve
la transcripcin de los genes
tardos
El factor aG activado promueve la
transcripcin de los genes tardos
>\/\
] La esporulacin involucra cambios sucesivos en los factores
a que controlan la especificidad de la iniciacin de la polimerasa de RNA. Las
cascadas de la clula madre (lado izquierdo) y de la pre-espora (lado derecho)
estn vinculadas por seales que pasan a travs del tabique (indicadas con
flechas horizontales).
:
ominio fosfatase en la pre-espora. Desfosforila y,
ror lo tanto, activa, al factor SpoIIAA, el cual a su
vez desplaza al factor anti-a SpoIIAB del complejo
poIlAB-a1
5
.
La liberacin de aF lo activa,
La activacin de aF determina el inicio de la es-
porulacin. Bajo la direccin de aF, la polimerasa
ie RNA transcribe el primer conjunto de genes de
esporulacin en vez de los genes vegetativos que
estaba transcribiendo antes. Es probable que la reac-
dn de remplazo afecte slo a parte de la poblacin
ie polimerasa de RNA, debido a que aF se produce
lo en pequeas cantidades. Una escasa cantidad
ie enzima vegetativa prevalece durante la esporula-
cin. El a43 desplazado no es destruido; puede ser re-
cuperado de extractos de clulas en esporulacin.
Dos episodios reguladores siguen a la actividad
de aF, como se detalla en la . . En la pre-
espora, otro factor, aG, es el producto de uno de los
genes tempranos de la esporulacin. El factor g
hace que la polimerasa de RNA transcriba los ge-
nes de esporulacin tardos en la pre-espora. Otro
producto gnico temprano de la esporulacin se
encarga de la comunicacin con el compartimiento
de la clula madre. El factor oF activa a SpoIIR, el
cual es secretado de la pre-espora. Despus activa a
la protena de unin a la membrana SpoIIGA para
transformar al precursor inactivo pro-aE en el factor
activo aE en la clula madre. (Cualquier oE produ-
cido en la pre-espora es degradado por funciones
especficas de la pre-espora.)
11.19 La esporulacin es controlada por factores o
285
La pre-espora se comunica con la clula madre
CELULA
MADRE
PRE-ESPORA
SpollGA
Pro-CTE
SpoIIR
FIGURA 11.43 El factor af desencadena la sntesis del siguien-
te factor a en La pre-espora (oG) y activa a SpoIIR, que provoca
que SpollGA divida a pro-o
E
.
Numerosas rutas cruzan el
CLULA PRE-ESPORA
MADRE SpoilE-SpollAA
Protelisis
Protelisis
SpollGA-SpollR
SpolllA y
,
Factor
descong dp
La regulacin entrecruzada de la esporulacin
coordina la cronologa de Los episodios que suceden en La clula
madre y en La pre-espora.
La cascada contina cuando aE es remplazado
por aK. (De hecho, la produccin de o
K es bastante
compleja, debido a que primero su gen debe ser
creado por un episodio de recombinacin.) Este
factor tambin es sintetizado como un precursor
inactivo (pro-aK) que es activado por una protea-
sa. Una vez que aK ha sido activado, desplaza a o
E
y provoca la transcripcin de los genes tardos en
la clula madre. La cronologa de estos sucesos
en los dos compartimientos es coordinada por sea-
les adicionales. La actividad de aE en la clula madre
es necesaria para la activacin de aG en la pre-espo-
ra; en cambio, la actividad de oG es necesaria para
generar una seal que es transmitida a travs del
tabique para activar a aK.
De este modo, la esporulacin es controlada por
dos cascadas, en las cuales los factores a de cada
compartimiento son activados en forma sucesiva
cada uno dirige la sntesis de un conjunto particuli
de genes. La 11.44 ilustra la forma en la cu;
las dos cascadas estn conectadas por la transmisia
de seales de un compartimiento al otro. A medid
que se activan los factores o nuevos, los factore
a antiguos son desplazados, de tal manera que 1
transiciones de los factores o apagan y enciende:
a los genes. La incorporacin de cada factor en |
polimerasa de RNA determina cundo se exprs.
su conjunto de genes diana, y la cantidad de facto
disponible influye en el nivel de expresin gr.
ca. En un momento dado puede activarse ms
un factor o, y las especificidades de algunos de [g
factores a se superponen. Se desconoce de qu de
pende la capacidad de cada factor a de remplazar,
su predecesor.
La poLirnerasa de RNA
bacteriana termina en sitios
discretos
Concepto principal
.
La terminacin puede requerir el reconocimiento de La
secuencia terminadora en el ONA y la formacin de una
estructura en forma de horquilla en el producto de RNA.
Una vez que la polimerasa de RNA ha iniciado L
transcripcin, la enzima se desplaza por el mold:
sintetizando RNA, hasta que encuentra una secuen-
cia terminadora. En este punto, la enzima deja 1
agregar nucletidos a la cadena creciente de RN-
libera el producto terminado y se disocia del me
de de DNA. La terminacin requiere que todos 1c
puentes de hidrgeno que mantienen unido al coir
piejo RNA-DNA se rompan, despus de lo cual |
reconstituye el DNA dplex.
Es difcil definir el sitio de terminacin i
una molcula de RNA que ha sido sintetizada en un
clula viva. Siempre es posible que el extremo j
de la molcula haya sido generado por divisin di
transcrito primario y, por lo tanto, no representa
sitio real en el cual termin la polimerasa de RNA
La mejor identificacin de los sitios de tena
nacin la ofrecen los sistemas en los cuales la pe
limerasa de RNA termina in vitro. La capacidad i
la enzima para terminar depende en gran medie
de ciertos parmetros como la fuerza inica; con:
resultado, su terminacin en un punto particul
in vitro no demuestra que este mismo punto sea n
terminador natural. Sin embargo, se pueden idei
tificar extremos 3
'
autnticos cuando se genera
mismo extremo in vitro e in vivo.
La JRAll. resume los dos tipos de caraca
rsticas en los terminadores bacterianos.
286 CAPTULO 11 Transcripcin
.
Los terminadores de las bacterias y de sus
fagos se han identificado como secuencias
necesarias para la reaccin de terminacin
{in vitro o in vivo). Las secuencias de los ter-
minadores procariticos no muestran simili-
tudes ms all del sitio en el cual se agrega la
ltima base al RNA. La responsabilidad de la
terminacin recae en las secuencias ya trans-
critas por la polimerasa de RNA. Por lo tanto,
la terminacin se basa en la exploracin del
molde o del producto que la polimerasa est
transcribiendo en este momento.
.
Muchos terminadores requieren que se for-
me una horquilla en la estructura secunda-
ria del RNA que est siendo transcrito. Esto
indica que la terminacin depende de un produc-
to de RNA y no est determinada tan slo por la
exploracin de la secuencia de DNA durante la
transcripcin.
Los terminadores varan mucho en cuanto a su
eficiencia de terminacin. En algunos terminado-
res, el episodio de terminacin puede impedirse por
medio de factores accesorios especficos que interac-
nan con la polimerasa de RNA. La antitermina-
cin hace que la enzima contine la transcripcin
ms all de la secuencia de terminacin, un suceso
denominado ultralectura (el mismo trmino uti-
lizado en la seccin 9.14, Los supresores pueden
rompetir con la lectura de tipo silvestre del cdigo,
para describir la supresin de los codones de termi-
:
tacin de un ribosoma).
Al examinar el hecho de la terminacin, se le
debe considerar no slo como un mecanismo para
generar el extremo 3' de la molcula de RNA, sino
como una oportunidad de controlar la expresin
gnica. Por lo tanto, las etapas en las cuales la po-
limerasa de RNA se asocia al DNA (iniciacin) o se
isocia de l (terminacin) estn sujetas a un control
especfico. Hay similitudes interesantes entre los sis-
temas empleados en la iniciacin y en la termina-
cin. Ambos requieren que se rompan los puentes
de hidrgeno (desnaturalizacin inicial del DNA en
La iniciacin y disociacin del complejo de DNA-RNA
en la terminacin), y ambos requieren la adicin de
protenas para interactuar con la enzima central. De
hecho, se logran por formas alternativas de la poli-
merasa. Mientras que la iniciacin se basa tan slo
en la interaccin entre la polimerasa de RNA y el
DNA dplex, el episodio de terminacin implica
el reconocimiento de seales en el transcrito por
parte de la polimerasa de RNA o de factores acceso-
rios, as como el reconocimiento de las secuencias
del DNA.
Hay dos tipos de terminadores
en f. coli
Concepto principal
Los terminadores intrnsecos estn formados por una
horquilla abundante en G-C Localizada en el producto
de RNA seguida por una regin rica en U en La cual
ocurre la terminacin.
En E. coli, los terminadores se distinguen por la ne-
cesidad de la polimerasa de RNA de algn otro fac-
tor para realizar la terminacin in vitro:
La terminacin ocurre en sitios discretos
Todas las secuencias necesarias
para la terminacin se encuentran
en la regin transcrita
La horquilla que se
. localiza en el RNA
I puede ser necesaria
La polimerasa de RNA y el RNA son liberados
Las secuencias de DNA necesarias para la ter-
minacin se localizan en sentido ascendente con respecto a
la secuencia terminadora. La formacin de una horquilla en el
RNA puede ser necesaria.
Un termi rnseco tiene dos caractersticas
GC
Regin abundante en pares G-C
5 localizada en el tallo
\ Fragmento de cadena individual
-
j /rico en U
UUU
FIGURA 11.46 Los terminadores intrnsecos incluyen regiones
de palndromos que forman horquillas cuya longitud vara de 7
a 20 bp. La estructura tallo-lazo incluye una regin rica en G-C
y es seguida por un fragmento abundante en residuos de U.
11.21 Hay dos tipos de terminadores en E. coli
287
.
La enzima central puede terminar in vitro
en ciertos sitios en ausencia de algn otro
factor. Estos sitios se denominan termina-
dores intrnsecos.
.
Los terminadores dependientes de p se de-
finen por la necesidad de aadir el factor rho
(p) in vitro, y las mutaciones demuestran que
el factor interviene en la terminacin in vivo.
Los terminadores intrnsecos tienen dos carac-
tersticas estructurales mostradas en la FIGURA 11.46:
una horquilla en la estructura secundaria y una re-
gin en el extremo de la unidad abundante en re-
siduos de U. Ambas caractersticas son indispensa-
bles para la terminacin. La horquilla casi siempre
contiene una regin rica en G-C cerca de la base del
tallo. La distancia tpica entre la horquilla y la regin
rica en U es de siete a nueve bases. Hay ~1100 se-
cuencias en el genoma de E. coli que cumplen con
estos criterios, lo cual sugiere que cerca de la mitad
de los genes tiene terminadores intrnsecos.
Las mutaciones puntuales que impiden la ter-
minacin ocurren dentro de la regin del tallo de
la horquilla. Cul es el efecto de una horquilla en
la transcripcin? Es probable que todas las horqui-
llas que se forman en el producto de RNA hagan
que la polimerasa disminuya la velocidad de (y qui-
zs detenga) la sntesis de RNA.
La pausa crea una oportunidad para que ocurra
la terminacin. La pausa sucede en los sitios que se
asemejan a los terminadores pero cuya separacin
se ha incrementado (por lo general de 10 a 11 bases)
entre la horquilla y la regin abundante en U. Sin
embargo, si el sitio de la pausa no corresponde a un
terminador, la enzima suele seguir adelante para
continuar la transcripcin. La longitud de la pausa
vara, pero un terminador tpico dura -60 s.
Una regin rica en U localizada en sentido
descendente desestabiliza el hbrido de DNA-RNA
cuando la polimerasa de RNA hace una pausa en
la horquilla. El hbrido rU-dA RNA-DNA tiene una
estructura de apareamiento de bases inusualmente
dbil; requiere la menor energa que cualquier hbri-
do para romper la asociacin entre las dos cadenas.
Cuando la polimerasa hace una pausa, el hbrido de
DNA-RNA se desenreda de la regin terminal rU-dA
unida de manera dbil. Con frecuencia, el episodio
de terminacin sucede en una de las numerosas po-
siciones que se dirigen hacia el extremo de la regin
rica en U o en l, como si la enzima
"
tartamudeara"
durante la terminacin. La regin rica en U del RNA
corresponde a una regin rica en A-T del DNA, por
lo que puede observarse que las regiones ricas en
A
-T son importantes en la terminacin intrnseca y
en la iniciacin.
La secuencia de la horquilla y la longitud del
segmento rico en U determinan la eficiencia de la
terminacin. Sin embargo, la eficiencia de la ter-
minacin in vitro vara de 2% a 90% y no se co-
rrelaciona de manera sencilla con la constitucin
de la horquilla o con el nmero de residuos de U
en la regin rica en U. Por lo tanto, la horquilla y
la regin abundante en U son necesarias, aunque
insuficientes, y otros parmetros influyen en la in-
teraccin con la polimerasa de RNA. En particular.
las secuencias que se encuentran en sentido ascen-
dente y descendente con respecto al terminador
intrnseco afectan su eficiencia.
Se conoce menos an sobre las seales y sobre
los factores accesorios involucrados en la termina-
cin de las polimerasas eucariticas. Cada clase de
polimerasa utiliza un mecanismo diferente (vase e!
Captulo 26, Corte, empalme y procesamiento del
RNA).
E Cmo funciona el factor p?
Concepto principal
.
El factor p es una protena terminadora que se une a
un sitio rut ubicado en un RNA naciente y viaja por el
RNA para liberarlo de la estructura del hbrido de
RNA-DNA en la polimerasa de RNA.
El factor p es una protena esencial en E. coli que
funciona slo en la etapa de la terminacin. Acta
en terminadores dependientes de p, los cuales re-
presentan cerca de la mitad de los terminadores de
E
.
coli.
La FIGURA 11.47 muestra cmo funciona p. Pri-
mero se une a una secuencia dentro del transcrito
en sentido ascendente con respecto al sitio de ter-
minacin. A esta secuencia se le denomina sitio rut
(por sus siglas en ingls: rho utilization). El p despus
viaja por el RNA hasta que encuentra una polime-
rasa de RNA. Cuando la polimerasa de RNA alcanza
el sitio de terminacin, p acta sobre el hbrido de
RNA-DNA en la enzima para provocar la liberacin
del RNA. La pausa que hace la polimerasa en el si-
tio de terminacin proporciona tiempo para que el
factor p se transfiera al fragmento hbrido, lo cual es
una caracterstica importante de la terminacin.
Se observa aqu un principio general importan-
te. Cuando se conoce el sitio del DNA en el cual
alguna protena ejerce su efecto, no puede asumir-
se que coincide con la secuencia de DNA a la que
reconoce en un inicio. Pueden estar separados y no
es necesario que haya una relacin estable entre
ellos. De hecho, los sitios rut en diferentes unidades
de transcripcin se encuentran a distancias varia-
bles precediendo a los sitios de terminacin. En lo?
factores antiterminadores se hace una distincir
similar (vase la seccin 11.24, La antiterminacir
288
CAPTULO 11 Transcripcin
arquiere sitios que sean independientes de los ter-
mnadores).
Las caractersticas comunes de los sitios rut son
.e la secuencia tiene una alta concentracin de
:.
:
:
duos de C y una concentracin baja de residuos
:
G y que no tienen una estructura secundaria. En
b FIGURA 11.48 se ilustra un ejemplo. La C es por
~"
.ucho la base ms comn (41%) y la G es la base
Beos frecuente (14%). La longitud de los sitios rut
rs variable. Como regla general, la eficiencia de un
ario rut aumenta con la longitud de la regin rica
C y escasa en G.
El factor p es un miembro de la familia de las
belicasas hexamricas dependientes de ATP. La
-bunidad tiene un dominio de unin al RNA y un
minio de hidrlisis de ATP. El hexmero funciona
il pasar el cido nucleico por una cavidad ubicada
-
r. la mitad del ensamble formado a partir de los
: minios de unin al RNA de las subunidades. La
FKURA 11
.49 muestra que la estructura del factor p
ofrece algunos indicios de cmo funciona. Enrolla el
IXA desde el extremo 3' alrededor del exterior de
5 dominios terminales N, y empuja el extremo 5
'
Je la regin unida hacia el interior, en donde se une
i un dominio secundario de unin al RNA en los
iominios terminales C. La forma inicial del factor p
p un anillo discontinuo, pero la unin del RNA lo
convierte en un anillo cerrado.
Despus de la unin al sitio rut, p utiliza su ac-
-
'
.
idad helicasa, conducida por la hidrlisis de ATP,
?ara transferirse a lo largo del RNA hasta que al-
ianza al fragmento hbrido de RNA-DNA en la po-
mrerasa de RNA. Despus desenrolla la estructura
iplex. No se sabe si esta accin es suficiente para
berar el transcrito o si p tambin interacta con la
polimerasa de RNA para ayudar a liberar el RNA.
El factor p acta como factor accesorio de la poli-
nerasa de RNA; por lo general, su actividad mxi-
na in vitro se exhibe cuando est presente en una
roncentracin de -10% de la concentracin de la
fclimerasa de RNA.
El factor o termina la transcripcin
La polimerasa de RNA transcribe al DNA
El factor p se adhiere al sitio rut del RNA
El factor p se transfiere a lo
larqo del RNA
La polimerasa de RNA hace una pausa en la
horquilla y se agrega el factor p
El factor p desenrolla al hbrido de RNA-DNA
Terminacin: todos los componentes son liberados
El factor p se une al RNA en un sitio rut y se
transfiere a lo largo del RNA hasta que encuentra un hbrido de
RNA-DNA en la polimerasa de RNA, en donde libera al RNA
del DNA.
Un sitio rut tiene una composicin de bases
Ali G5 UA U AUAU .G k U b' AAA G UA U GA AGAAAGGCGU U UU
Bases
O 41%
A 25%
U 20%
G 14%
La delacin impide la terminacin-
FIGURA 11.48 Un sitio rut tiene una secuencia rica en C y deficiente en G que precede al sitio,
o
a los sitios, de terminacin, ta secuencia corresponde al extremo 3
'
del RNA.
11.22 Cmo funciona el factor p?
289
Un hexmero p se transfiere a lo largo del RNA
El monmero p tiene dos dominios
Domm de unin ai RNA .n
Ei iiiiiio 11 " ii X)
se une ai RNA
3
'
FIGURA 11.49 EL factor p tiene un dominio terminal N de
unin aL RNA y un dominio terminal C con actividad ATPasa.
Un hexmero en forma de anillo discontinuo se une al RNA a
lo largo del exterior de los dominios terminales N. El extremo
5
'
del RNA se une a un sitio de unin secundario en el interior
del hexmero.
Es necesario para p transferirse a lo largo del
RNA desde el sitio rut hasta el lugar de la termina-
cin. Esto requiere que el factor se desplace ms
rpido que la polimerasa de RNA. La enzima hace
una pausa cuando alcanza un terminador y la ter-
minacin ocurre si p lo captura ah. Por lo tanto,
hacer una pausa es importante en la terminacin
dependiente de p, del mismo modo que en la termi-
nacin intrnseca, porque hay tiempo de que ocu-
rran los dems sucesos necesarios.
La idea de que p se desplaza por el RNA con-
duce a una prediccin importante con respecto f
la relacin entre la transcripcin y la traduccin
Rho primero debe tener acceso a una secuencia de
unin en el RNA y despus deber ser capaz de des-
plazarse a lo largo del RNA. Una o ambas condi-
ciones pueden ser impedidas si los ribosomas estn
traduciendo un RNA. Por lo tanto, la capacidad del
factor p para alcanzar a la polimerasa de RNA en
un terminador depende de lo que est sucediendo
en la traduccin.
Este modelo explica un fenmeno desconcer-
tante. En algunos casos, una mutacin sin sentidc
en un gen de una unidad de transcripcin impide h
expresin de los genes subsiguientes en la unidad.
Este efecto se denomina polaridad. Una causa fre-
cuente es la ausencia del RNAm que corresponde a
las partes subsiguientes (distales) de la unidad.
Supngase que hay terminadores dependiente?
de p dentro de la unidad de transcripcin, es decir
antes del terminador que se utiliza de manera habi-
tual. Las consecuencias se ilustran en la FIGURA 11.50,
En general, estos terminadores ms tempranos nc
son utilizados debido a que los ribosomas impiden
que p alcance a la polimerasa de RNA. Sin embargo.
una mutacin sin sentido libera a los ribosomas, de
tal manera que p es libre de adherirse al RNAm O
desplazarse por l, lo que le permite actuar sobre la
El factor p puede realizar la terminacin cuando una mutacin sin sentido retira los ribosomas
TIPO SILVESTRE
,MLITANTE SIN SENTIDO
Los ribosomas empaquetan
al RNAm detrs de la
polimerasa de RNA
Los ribosomas
impiden la
adhesin o el
movimiento del
factor p
p se adhiere
pero los
ribosomas
impiden su
movimiento
La transcripcin
contina
Los ribosomas
se disocian
en la mutacin
p obtiene
acceso a la
polimerasa
de RNA
La transcripcin
termina de
forma prematura
"
.
/\/
FIGURA 11.50 La accin del factor p puede crear un vnculo entre la transcripcin y la traduccin
cuando el terminador dependiente de p se encuentra enseguida de una mutacin sin sentido.
290
CAPTULO 11 Transcripcin
Ezerasa de RNA en el terminador. Como resul-
.a enzima es liberada y las regiones distales de
-
iad de transcripcin nunca son expresadas.
ft:-f qu debe haber terminadores internos? Quiz
:;
n slo secuencias que por coincidencia Lmi-
:
ermmador dependiente de p usual.) Algunas
i eculas estables de RNA que tienen una estructu-
rrjndaria extensa son protegidas de los efectos
ires, al parecer debido a que la estructura impide
i ihesin o el movimiento de p,
Las mutaciones del gen rho influyen de muy
T:sas maneras en la terminacin. La naturaleza
- .;
a del efecto es la incapacidad de realizar la ter-
- .acin. Sin embargo, la magnitud de esta impo-
:
_:
dad, como se observa en el porcentaje de ultra-
erara in vivo, depende del locus diana particular.
-
:
nrma similar, la necesidad de factor p in vtro es
ir.able. Algunos terminadores (dependientes de p)
ppiieren concentraciones relativamente altas de p,
i-ntr
as que otros funcionan muy bien con nive-
fcbajos. Esto sugiere que terminadores diferentes
quieren niveles distintos de factor p para la termi-
i zn y, por lo tanto, responden de forma diferente
:
5 niveles residuales de factor p en los mutantes
ds mutantes p suelen ser permeables).
Algunas mutaciones del gen rho pueden ser su-
_
:
nidas por mutaciones en otros genes. Este m-
ido ofrece una manera excelente para identificar
i protenas que interactan con p. La subunidad
ie la polimerasa de RNA participa en dos tipos
E mutaciones. En el primero, las mutaciones en el
:r. rpoB pueden reducir la terminacin en un sitio
nendiente de p. En el segundo, las mutaciones del
m rpoB pueden restaurar la capacidad de terminar
transcripcin en sitios dependientes de p en bac-
rias con rho mutantes. Sin embargo, se desconoce
ie funcin tiene la interaccin.
La antiterminacin
es un episodio regulador
Conceptos principales
La terminacin es inhibida cuando las protenas
antiterminacin actan sobre la polimerasa de RNA
para provocar que sta lea a travs de un terminador
especfico o de varios de ellos.
El fago X tiene dos protenas antiterminacin, pN y pQ,
las cuales actan en diferentes unidades de transcripcin.
La antiterminacin sirve como un mecanismo de
control en los circuitos reguladores de los fagos y en
'
.os operones bacterianos. La FIGURA 11.51 muestra
que la antiterminacin controla la capacidad de la
enzima para leer a travs de un terminador a los ge-
La accin en un terminador controla la transcripcin
TERMINACIN Slo se transcribe la regin 1
< Regin 1 > t Regin 2
Promotor Terminador
La polimerasa de RNA termina
El RNA es slo de la regin 1
ANTITERMINACION Se transcriben las regiones 1 y 2
La polimerasa de
RNA contina
-
El RNA representa las
regiones 1 y 2
FIGURA 11.51 La antiterminacin puede controlar la transcripcin al
determinar si la polimerasa de RNA termina o lee la siguiente regin
atravesando un terminador particular.
n extiende la unidad de transcripcin
La polimerasa de RNA transcribe desde el promotor hasta el terminador
Promotor
erminador
RNA
i
La protena antiterminacin permite a la polimerasa de RNA dejar atrs
al terminador
Protena antiterminacin
rma X/X/Nyx/X/X/ /X/X/
Las protenas antterminacin actan en terminadores especficos
Unidad de
transcripcin
Promotor Terminador
Protena
antiterminacin
Temprana inmediata Pl
'
l
pN
Temprana inmediata Pri pN
Tarda
Pr- R- pQ
FIGURA 11.52 Una protena antiterminacin puede actuar sobre la
polimerasa de RNA para permitirle la ultralectura de un terminador
especfico.
11.23 La antiterminacin es un episodio regulador
291
nes que yacen ms all. En el ejemplo que se mues-
tra en la figura, la ruta predeterminada establece
que las polimerasas de RNA terminen al final de la
regin 1; sin embargo, la antiterminacin le permite
continuar la transcripcin a travs de la regin 2. El
promotor no cambia, por lo que ambas situaciones
producen un RNA con las mismas secuencias 5
'
;
la
diferencia es que despus de la antilerminacin el
RNA se extiende para incluir secuencias nuevas en
el extremo 3
'
.
La antiterminacin se descubri en las infeccio-
nes por bacterifagos. Una caracterstica frecuente
en el control de la infeccin por fagos es que muy
pocos de los genes de estos virus (los genes
"
tem-
pranos
"
) pueden ser transcritos por la polimerasa de
RNA hospedadora. No obstante, entre estos genes
hay reguladores cuyos productos permiten que se
exprese el siguiente conjunto de genes de los fagos
(vase la seccin 14.4, Dos tipos de episodios regula-
dores controlan la cascada ltica). Uno de estos tipos
de regulador es una protena antiterminacin.
La muestra que sta permite que la
polimerasa de RNA lea a travs de un terminador,
lo que extiende el transcrito de RNA. En ausencia de
la protena antiterminacin, la polimerasa de RNA
termina en el terminador (segmento superior de la
figura). Cuando la protena antiterminacin est
presente, contina ms all del terminador (seg-
mento medio de la figura). El ejemplo de antiter-
minadn mejor caracterizado lo proporciona el fago
A
-,
en el cual se descubri el fenmeno. Se utiliza
en dos etapas de la expresin del fago. La protena
antiterminacin producida en cada etapa es espec-
fica para las unidades de transcripcin particulares
que se expresan en esa etapa, como se resume en
el segmento inferior de la Figura 11.52.
La polimerasa de RNA hospedadora transcribe
en un inicio dos genes, los cuales se denominan ge-
nes tempranos inmediatos. La transicin a la si-
guiente etapa de expresin se controla al impedir la
terminacin en los extremos de los genes tempranos
inmediatos, lo cual da como resultado la expresin
de los genes tempranos retrasados. (Se abord la
regulacin general del desarrollo de X en el Captulo
14, Estrategias de los fagos.)
El gen regulador que controla el cambio de la
expresin temprana inmediata a la expresin tem-
prana retrasada se identifica por medio de muta-
ciones en el gen A, N que transcribe slo los genes
tempranos inmediatos; no siguen su curso en el
ciclo infeccioso. Hay dos unidades de transcripcin
de genes tempranos inmediatos (transcritos a partir
de los promotores P
L
y PR). La transcripcin por la
polimerasa de RNA de E. coli se detiene en los ter-
minadores localizados en los extremos de estas uni-
dades de transcripcin (r
L1
y R1, respectivamente).
Ambos terminadores dependen de p; de hecho, stcs
fueron los terminadores con los cuales se identific
a p en un principio. La situacin cambia por la es-
presin del gen N. El producto pN es una prote-
antiterminacin que acta en las dos unidades *
transcripcin temprana inmediata y permite que U
polimerasa de RNA lea a travs de los terminadores
a los genes tempranos retrasados que se encuentren
ms all de ellos.
Como sucede en otros fagos, es necesario im
control ms para expresar los genes tardos qv:
codifican los componentes de la partcula del fago
Este cambio es regulado por el gen Q, uno de los
genes tempranos retrasados. Su producto, pQ, t
otra protena antiterminacin, una que permite de
manera especfica que la polimerasa de RNA inicie
en otro sitio, el promotor tardo F
R,
para la ultralec-
tura de un terminador que se encuentra entre dicho
promotor y los genes tardos.
Las distintas especificidades de pN y de pQ e;
tablecen un principio general importante: la poliir.:-
rasa de RNA interacta con las unidades de transcripd
de tal manera que un factor accesorio puede promover k
antiterminacin especficamente de algunos transcrita
La terminacin puede ser controlada con la misrr-
precisin que la iniciacin.
La antiterminacin requiere
sitios que son independientes
re [ns terrninadorss
Conceptos principales
.
El sitio en el cual una protena antiterminacin
acta se encuentra en sentido ascendente al sitio de
terminacin en la unidad de transcripcin.
*
La localizacin del sitio antiterminacin varia en casos
diferentes y puede ubicarse en el promotor o dentro de
la unidad de transcripcin.
Qu sitios intervienen en el control de la espec-
fieldad de la antiterminacin? La actividad antiter
minacin de pN es muy especfica, pero el episdi:
de la antiterminacin no est determinando por los termi-
nadores t
u
y fRI; el sitio de reconocimiento necesario par*.
la antiterminacin se encuentra en sentido ascendente ce:
respecto a la unidad de transcripcin, es decir, en un lug.-'
distinto al sitio de terminacin en el cual concluye al fin:-
a accin. La 11.53 muestra las ubicacione?
de los sitios necesarios para la antiterminacin en
el fago X.
Los sitios de reconocimiento necesarios pata
la accin de pN se denominan nut (por sus sgfl
en ingls: N Mrilization). Los sitios encargados de
determinar la antiterminacin hacia la izquierda
292 CAPTULO 11 Transcripcin
hada la derecha se describen como nutL y nutR,
lpectivamente. El mapeo de las mutaciones nut
;
aJiza a nutL entre el punto de inicio de P
L
y el
"
do de la regin codificadora de iV. En contraste,
.:
R se encuentra entre el extremo del gen ero y t
LI.
l:'o si
gnifica que los dos sitios nut se encuentran
posiciones diferentes en relacin con la organi-
Bcin de sus unidades de transcripcin. Mientras
ne nutL est cerca del promotor, nutR est ubicado
:
erca del terminador. (De nuevo qut es diferente y
r encuentra dentro del promotor.)
Cmo ocurre la antiterminacin? Cuando pN
rconoce el sitio nut, debe actuar sobre la polimerasa
|e RNA para garantizar que la enzima no pueda res-
ponder ms al terminador. Las localizaciones variables
de los sitios m indican que este episodio no est liga-
o a la iniciacin ni a la terminacin
, pero que puede
curtir conforme la polimerasa de RNA alarga la ca-
:ma de RNA ms all del sitio nut. Como se ilustra en
b FIGURA 11.54, la polimerasa despus se transforma
en una fuerza inexorable que rebasa al terminador,
sin prestar atencin a su seal. (Esta reaccin implica
?.
antiterminacin en los terminadores dependientes
Ie p, pero pN tambin suprime la terminacin en los
Terminadores intrnsecos.)
Es la capacidad de pN para reconocer una
ecuencia corta dentro de la unidad de transcrip-
cin un ejemplo de un mecanismo de antitermi-
nacin ms utilizado? Los fagos que estn relaciona-
eos con X tienen genes N diferentes y especificidades
de antiterminacin distintas. La regin del genoma
fe fago en la cual se encuentran los sitios nut tiene
Bna secuencia diferente en cada uno de estos fagos
I cada fago debe, por lo tanto, tener sitios nut carac-
tersticos reconocidos de manera especfica por su
propio pN. Cada uno de estos productos pN debe
:
ener la misma capacidad general para interactuar
:
on el mecanismo de transcripcin y provocar la
antiterminacin, pero tambin tienen una especifi-
cidad diferente para la secuencia de DNA que activa
ti mecanismo.
Los factores de terminacin y
de antiterminacin interactan
con La polimerasa de RNA
Conceptos principales
Numerosas protenas bacterianas son necesarias para
que la pN de X interacte con la polimerasa de RNA.
Estas protenas tambin participan en la antitermina-
cin en los operones rm de la bacteria hospedadora.
El antiterminador pQ de X tiene un mecanismo de
accin diferente que comprende la unin al DNA en el
promotor.
antiterminadores pueden actuar en localizaciones distintas
en la unidad de Ira
Uiiiaiuiuu
La polimerasa de RNA transcribe desde el promotor hasta el terminador
Promotor
PL o PR o Pw Terminador
tLo fRo fR.
RNAm X/WX/VW
pN acta en nutL para permitir que la polimerasa de RNA deje atrs fL
nutL fL
RNAm extendido \/\/\/\/\/\/\/\/\/
pN acta en nut para permitir que la polimerasa de RNA deje atrs fR1
Pr nutf
RNAm extendido V/ V/ V/ \X \X \X \X \y \X
pQ acta en qut para permitir que la polimerasa de RNA deje atrs fR-
qut PR, -
RNAm extendido v/\/\/\/\/\/\/V\/
3 La polimerasa de RNA hospedadora transcribe los ge-
nes termina en los sitios t. pN le permite la ultralectura de los
terminadores en las unidades L y Rl; pQ le permite la ultralectura del
terminador R'. Los sitios en los cuales acta la protena pN (nut) y en
los cuales acta la protena pQ {qut) se localizan en posiciones relati-
vas distintas en las unidades de transcripcin.
La terminacin es inhibida por factores que actan en nut
Promotor Sitio nut Terminador
Los factores actan sobre la
polimerasa de RNA
p no puede realizar la terminacin
FIGURA 11.54 Los factores accesorios se unen a la polimerasa de RNA a
medida que pasa por el sitio nut. Impiden que p ocasione la terminacin
cuando la polimerasa llega al terminador.
11.25 Los factores de terminacin y de antiterminacin interactan con la polimerasa de RNA
293
Los tactores de terminacin y de antiterminacion se
unen a la polimerasa de RNA
Promotor Sitio nut Terminador
boxA boxB
CGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCA
GCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyT TCGC GT
.
X Q Cril MusA '
NusB-S10se NusG facilita pN se Factor de
une a boxA el ensamblaje une a terminacin general
del complejo boxB
FIGURA 11.55 Los factores accesorios se unen a la polimerasa de
RNA a medida que pasa por ciertos sitios. El sitio nut est formado
por dos secuencias. NusB-SlO se une a la enzima central cuando pasa por
boxA. Despus, NusA y la proteina pN se unen conforme la polimerasa
pasa por boxB. La presencia de pN le permite a la enzima la ultralec-
tura del terminador, lo que produce un RNAm unificado que contiene
secuencias tempranas inmediatas adheridas a las secuencias tempranas
retrasadas.
La terminacin y la antiterminacin estn conec-
tadas de manera cercana e involucran a protenas
bacterianas y de los fagos que interactan con la
polimerasa de RNA. Numerosas protenas implica-
das en la terminacin han sido identificadas al aislar
mutantes de E. coli en los cuales pN es ineficiente.
Muchas de estas mutaciones se encuentran en el
gen rpoB. Esto demuestra que pN (como el factor
p) interacta con la subunidad p de la enzima cen-
tral. Otras mutaciones en E. coli que obstaculizan la
funcin de pN identifican los loci us: nusA, nusB,
nusE y nusG. (El trmino
"
us
"
es un acrnimo de
"
sustancia utilizada por N
"
, por sus siglas en ingls:
N Mfilization mbstance)
Un sitio nut X est formado por dos elementos
de secuencia denominados boxA y boxB. Los elemen-
tos de secuencia relacionados con boxA tambin se
encuentran en los operones bacterianos. boxA es
necesario para la unin de protenas bacterianas
que son indispensables para la antiterminacin en
los operones de los fagos y de las bacterias. boxB es
especfico del genoma de los fagos, y las mutaciones
en boxB eliminan la capacidad de pN para provocar
la antiterminacin.
Los loci us codifican protenas que forman par-
te del mecanismo de transcripcin, pero que no se
aislan con la enzima polimerasa de RNA. Las fun-
ciones de usA, nusBynusG tienen que ver slo con
la terminacin de la transcripcin. nusE codifica la
protena ribosmica SIO; la relacin entre su ubica-
cin en la subunidad 30S y su funcin en la termi-
nacin no es clara. Las protenas us se unen a la
polimerasa de RNA en el sitio nut, como se resume
en la FIGURA 11.55.
NusA es un factor general de transcripcin que
incrementa la eficiencia de la terminacin, tal vez
al aumentar la tendencia de la polimerasa de RNA
de hacer pausas en los terminadores (y de hechc
en otras regiones de la estructura secundaria; vase
ms adelante). NusB y SIO forman un dmero que
se une de manera especfica al RNA que contiene
una secuencia foxA NusG puede estar relacionadc
con el ensamblaje general de todos los factores us
en un complejo con la polimerasa de RNA.
Los terminadores intrnsecos y dependiente?
de p tienen diferentes requerimientos de factores
us. NusA es necesario para la terminacin en los
terminadores intrnsecos y la reaccin puede ser
impedida por pN. En los terminadores dependien-
tes de p son necesarias las cuatro protenas us,
I
una vez ms pN por s solo puede inhibir la reac-
cin. La caracterstica comn de pN en ambos tipos
de terminadores es impedir la funcin de NusA er.
la terminacin. La unin de pN a NusA inhibe la
capacidad de NusA para unirse al RNA, lo cual es
necesario para la terminacin.
La antiterminacin ocurre en los operones rrn
(RNAr) de E. coli y comprende las mismas funciones
us. Las regiones lderes de los operones rrn contie-
nen secuencias boxA; los dmeros NusB-SlO recono-
cen estas secuencias y se unen a la polimerasa de
RNA a medida que se alarga ms all de boxA. Esto
altera las propiedades de la polimerasa de RNA de
tal manera que puede realizar ahora la ultralectura
de los terminadores dependientes de p que estn
dentro de la unidad de transcripcin.
La secuencia boxA del RNA A, no se une a NusB-
S10 y es probable que la presencia de NusA y de pK
le permitan hacerlo; la secuencia boxB podra ser
necesaria para estabilizar la reaccin. Por lo tan-
to, las variaciones en las secuencias boxA pueden
determinar qu conjunto particular de factores se
requiere para la antiterminacin. Las consecuencias
son las mismas: cuando la polimerasa de RNA pasa
del sitio nut, es modificada por la adicin de factores
apropiados y es incapaz de terminar cuando se en-
cuentran despus los sitios de terminacin.
La antiterminacin en X requiere pN para unirse
a la polimerasa de RNA en una forma que depende-
de la secuencia de la unidad de transcripcin. Re-
conoce pN el sitio boxB en el DNA o en el transcrito
de RNA? No se une de forma independiente a nin-
gn tipo de secuencia, pero s se une a un complejc
de transcripcin cuando la enzima central pasa del
sitio boxB. pN tiene dominios separados que recono-
cen la secuencia boxB del RNA y la protena NusA.
Despus de unirse al complejo de transcripcin, pN
permanece asociado a la enzima central y se trans-
294 CAPTULO 11 Transcripcin
iTna en efecto en una subunidad adicional cuya
rresenda cambia el reconocimiento de los termina-
-
res. Es posible que pN de hecho contine unin-
-:
se a la secuencia boxB del RNA y a la polimerasa
:; RNA, la cual mantiene un lazo en el RNA; de este
. ;do, la funcin de la secuencia boxB del RNA ser
te parte sujetar a pN en la vecindad e incrementar
manera eficaz su concentracin local.
El producto pQ, el cual inhibe la terminacin
iripus en la infeccin por fagos al actuar en qut,
-rne un mecanismo de accin distinto. La secuencia
:
se encuentra en el inicio de la unidad de transcrip-
;
. n tarda. La regin ubicada en sentido ascendente
.:
qut est en el interior del promotor, mientras
la parte que se localiza en sentido descendente
ice en el inicio de la regin transcrita. Esto indi-
tp que la accin de pQ implica el reconocimiento
-i
. DNA; tambin significa que su mecanismo de
:dn
, al menos con respecto a la unin inicial al
:
"
mplejo, debe ser diferente del de pN. pQ interac-
-a con la holoenzima durante la fase de iniciacin.
De hecho
, a70 es necesario par la interaccin con pQ.
Ir.o refuerza la idea de que la polimerasa de RNA es
-na estructura interactiva en la cual los cambios de
mformacin inducidos en una fase pueden afectar
rj actividad en una fase posterior.
La accin bsica de pQ es interferir con las
:
3usas. Una vez que pQ ha actuado sobre la poli-
merasa de RNA, la enzima muestra una capacidad
muy reducida para hacer pausas en todos los sitios,
-
"
.cluidos los dependientes de p y los terminadores
-
mrnsecos. Esto significa que pQ no acta por s
pismo de manera directa en la terminacin, sino
;
ue permite que la enzima pase al terminador con
~
ayor rapidez, con lo que despoja a la polimerasa
fentral o al factor accesorio de la oportunidad de
revocar la terminacin.
El principio general es que la polimerasa de
RNA puede existir en formas que son competentes
para emprender etapas particulares de la transcrip-
Kn, y sus actividades en estas etapas pueden ser
"
.eradas slo si se modifica la forma apropiada. Por
Lo tanto, las sustituciones de los factores a pueden
amblar una forma de iniciacin competente a otra;
| las adiciones de los factores us pueden cambiar
Las propiedades de las formas de terminacin com-
: etentes.
La terminacin parece relacionarse muy de cer-
ca con la forma de elongacin. En su forma bsica
ie transcripcin, la polimerasa central est sujeta a
muchas pausas durante la elongacin y realizar una
causa en un sitio de terminacin es un prerrequisito
para que ocurra la terminacin. Bajo la influencia
ce factores como NusA
, las pausas se extienden,
B que incrementa la eficiencia de la terminacin;
pentras que bajo la influencia de pN o de pQ, las
pausas son ms breves, lo que disminuye la eficacia
de la terminacin. Los sitios de reconocimiento para
estos factores se encuentran slo en ciertas unidades
de transcripcin, y como resultado las pausas, y en
consecuencia la terminacin, son alteradas slo en
dichas unidades.
Resumen
Una unidad de transcripcin est formada por el
DNA que se encuentra entre un promotor, en don-
de inicia la transcripcin, y un terminador, en donde
finaliza. Una cadena de DNA en esta regin sirve
como molde para la sntesis de una cadena comple-
mentaria de RNA. La regin del hbrido de RNA-
DNA es corta y transitoria, conforme la "burbuja" de
transcripcin se desplaza por el DNA. La holoenzima
polimerasa de RNA que sintetiza el RNA bacteriano
puede separarse en dos componentes. La enzima
central es un multmero de estructura a
2
PP' que
se encarga de alargar la cadena de RNA. El factor
a es una subunidad individual indispensable en la
etapa de la iniciacin para el reconocimiento del
promotor.
La enzima central tiene afinidad general por el
DNA. La adicin del factor a reduce la afinidad de
la enzima por la unin no especfica al DNA, pero
incrementa la afinidad por los promotores. La ve-
locidad con la cual la polimerasa de RNA encuentra
sus promotores es demasiado alta para que la jus-
tifiquen la difusin y los contactos aleatorios con
el DNA; tal vez haya un intercambio directo de las
secuencias de DNA sujetas por la enzima.
Los promotores bacterianos son identificados
por dos secuencias cortas conservadas, centradas
en -35 y -10 en relacin con el punto de inicio.
La mayor parte de los promotores tiene secuencias
que estn muy relacionadas con las secuencias de
consenso en estos sitios. La distancia que separa las
secuencias de consenso es de 16 a 18 bp. La polime-
rasa de RNA en un inicio
"
aterriza
"
en la secuencia
-
35 y luego extiende sus contactos a la regin -10.
La enzima abarca -77 bp del DNA. El complejo bi-
nario
"
cerrado
"
inicial es transformado en un com-
plejo binario
"
abierto
"
al desnaturalizar una secuen-
cia de -12 bp que se extiende de la regin -10 al
punto de inicio. La composicin rica en pares de
bases A-T de la secuencia -10 puede ser importante
en la reaccin de desnaturalizacin.
El complejo binario es transformado en un
complejo ternario por la insercin de precursores
ribonucleotdicos. Hay mltiples ciclos de iniciacin
abortiva, durante los cuales la polimerasa de RNA
sintetiza y libera cadenas de RNA muy cortas sin
desplazarse del promotor. Al final de esta etapa, hay
11.26 Resumen 295
un cambio en la estructura y la enzima central se
contrae para cubrir -50 bp. El factor o es liberado
(en 30% de ios casos) o cambia su forma de aso-
ciacin con la enzima central. La enzima central
despus se desplaza por el DNA, sintetizando RNA.
Una regin del DNA desenrollada de manera local
se mueve con la enzima. La enzima se contrae ms
para cubrir tan slo de 30 a 40 bp cuando la cade-
na naciente ha alcanzado una longitud de 15 a 20
nucletidos; despus contina hasta el final de la
unidad de transcripcin.
La "fuerza" de un promotor describe la frecuen-
cia con la cual la polimerasa de RNA inicia la trans-
cripcin; se relaciona con la cercana con la cual sus
secuencias -35 y -10 se ajustan a las secuencias de
consenso ideales, pero tambin influyen en ella las
secuencias que se localizan enseguida del punto de
inhibicin en sentido descendente. El superenro-
llamiento negativo incrementa la fuerza de ciertos
promotores. La transcripcin genera superenrolla-
mientos positivos delante de la polimerasa de RNA
y deja superenrollamientos negativos detrs de la
enzima.
La enzima central puede ser dirigida a recono-
cer promotores con diferentes secuencias de con-
senso por medio de otros factores a. En E. coli estos
factores o son activados por condiciones adversas,
como un choque trmico o escasez de nitrgeno. B.
subtilis contiene un solo factor a importante con la
misma especificidad que el factor a de E. coli y tam-
bin contiene una variedad de factores a menores.
Otra serie de factores es activada cuando se inicia
la esporulacin; la esporulacin es regulada por dos
cascadas en las cuales los remplazos de los factores
a ocurren en la pre-espora y en la clula madre,
Asimismo, el fago SPOl utiliza una cascada para
regular la transcripcin por medio de la sustitucin
de factores a.
La geometra del reconocimiento entre la po-
limerasa de RNA y el promotor es similar para las
holoenzimas que contienen a todos los factores c
(excepto al factor a54). Cada factor a hace que la
polimerasa de RNA inicie la transcripcin en un
promotor que se ajusta a un consenso particular en
-
35 y -10. Los contactos directos entre a y el DNA
en estos sitios se han demostrado en el factor o70 de
E
.
coli. El factor a70 de E. coli tiene un dominio au-
toinhibidor terminal N que impide que las regiones
de unin al DNA reconozcan al DNA. La regin de
autoinhibicin es desplazada por el DNA cuando la
holoenzima forma un complejo abierto.
La polimerasa de RNA bacteriana forma la
transcripcin en dos tipos de sitios. Los terminado-
res intrnsecos contienen una horquilla rica en G-C
seguida por una regin rica en U. Son reconocidos
in vitro por la enzima central sola. Los terminadores
dependientes de p necesitan el factor p in vitro e ir
vivo; p se une a los sitios rut que son abundantes en
C y deficientes en residuos de G y que preceden a!
sitio real de la terminacin, p es una helicasa hexa-
mrica dependiente de ATP cuya actividad es trans-
ferirse a lo largo del RNA hasta que alcanza la regin
del hbrido de RNA-DNA en la burbuja de transcrip-
cin de la polimerasa de RNA, en donde disocia a!
RNA del DNA. En ambos tipos de terminacin, la?
pausas que realiza la polimerasa de RNA son impor-
tantes para que tenga lugar la terminacin.
Los factores us son indispensables para la ter-
minacin. NusA es necesario para los terminadores
intrnsecos y adems NusB-SlO es necesario para lo?
terminadores dependientes de p. El dmero NusB-
S10 reconoce la secuencia boxA de un sitio nut de!
RNA en proceso de elongacin; NusA se une de ma-
nera subsiguiente.
La antiterminacin es aprovechada por alguno:
fagos para regular la progresin de una etapa de la
expresin gnica a la siguiente. El gen N X codifica
una protena antiterminacin (pN) que es necesaria
para permitir que la polimerasa de RNA lea a travs
de los terminadores localizados en los extremos d-
los genes tempranos inmediatos. Otra protena an-
titerminacin, pQ, es necesaria despus en la infec-
cin por fagos. pN y pQ actan sobre la polimerasa
de RNA cuando pasa por sitios especficos {nut y
qut, respectivamente). Estos sitios estn localizado;
en posiciones relativas diferentes en sus unidades
de transcripcin respectivas. pN reconoce a la po-
limerasa de RNA que transporta a NusA cuando la
enzima pasa a la secuencia boxB. Luego, pN se une
al complejo e impide la terminacin al antagonizar
la accin de NusA cuando la polimerasa alcanza al
terminador dependiente de p.
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Referencias 299
El Opern
ESQUEMA DEL CAPTULO
mvMm Introduccin
rnanm La regulacin puede ser positiva o negativa
.
En la regulacin negativa, una protena represora se une a
un operador para evitar que se exprese un gen.
.
En la regulacin positiva es necesario que se una un factor
de transcripcin al promotor para permitir a la polimerasa
de RNA iniciar la transcripcin.
m Los agrupamientos de genes estructurales son
controlados de manera coordinada
.
Los genes que codifican protenas que funcionan en la
misma ruta pueden ser adyacentes y ser controlados como
una unidad individual que se transcribe en un RNAm
polcistrnico.
HB Los genes lac son controlados por un represor
.
La transcripcin del agrupamiento de genes lacZYA es
controlada por una protena represora que se une a un
operador que se superpone al promotor en el inicio del
agrupamiento.
.
La protena represora es un tetrmero formado por
subunidades idnticas codificadas por el gen ad.
WEB El opern lac puede ser inducido
.
Las molculas pequeas que inducen a un opern son
idnticas al sustrato en lo que se refiere a sus enzimas,
o
estn relacionadas con l.
.
Los galactsidos p son los sustratos para las enzimas
codificadas por lacZYA.
.
En ausencia de galactsidos p, el opern lac se expresa
slo en un nivel (basal) muy bajo.
.
La adicin de galactsidos P especficos induce la
transcripcin de los tres genes del opern.
El RNAm lac es muy inestable; como resultado, la induccin
puede revertirse con rapidez.
.
Los mismos tipos de sistemas que permiten a los sustratos
inducir a los operones que codifican enzimas metablicas
pueden ser utilizados para permitir a los productos
finales reprimir a los operones que codifican las enzimas
biosintticas.
wbw El represor es controlado por una pequea
molcula inductora
.
Un inductor funciona al convertir a la protena represora en
una forma con menor afinidad por el operador.
.
El represor tiene dos sitios de unin, uno para el operador
y otro para el inductor.
.
El represor es desactivado por una interaccin alostrica
en la cual la unin del inductor a su sitio cambia las
propiedades del sitio de unin al DNA.
fEfl Las mutaciones constitutivas de actuacin en cis
identifican al operador
.
Las mutaciones localizadas en el operador provocan la
expresin constitutiva de los tres genes estructurales lac.
.
Estas mutaciones actan en configuracin ds y afectan
slo a aquellos genes que se encuentran en el fragmento
contiguo de DNA.
lfiil Las mutaciones de actuacin en trans identifican
el gen regulador
.
Las mutaciones localizadas en el gen lacl actan en
configuracin trans y afectan la expresin de todos los
agrupamientos lacZYA en la bacteria.
.
Las mutaciones que eliminan la funcin de lacl provocan
expresin constitutiva y son recesivos.
.
Las mutaciones que se encuentran en el sitio de unin al
DNA del represor son constitutivas debido a que el represor
no puede unirse al operador.
*
Las mutaciones que se localizan en el sitio de unin al
inductor del represor le impiden ser desactivado e impiden
la inducibilidad.
.
Las mutaciones de los promotores son no inducibles y de
actuacin en cis.
E&l Las protenas multimricas tienen propiedades
genticas especiales
.
Un represor activo es un tetrmero formado por
subunidades idnticas.
.
Cuando se presentan subunidades mutantes y silvestres,
una sola subunidad mutante lacl''1 puede inactivar a un
tetrmero cuyas subunidades restantes sean silvestres.
.
Las mutaciones lacl'1 ocurren en el sitio de unin al DNA.
Su efecto se explica porque la actividad del represor
requiere de todos los sitios de unin al DNA en el
tetrmero para que sea activo.
lEBIil El monmero represor tiene numerosos dominios
.
Una subunidad represora individual puede ser dividida en
un dominio terminal N de unin al DNA, una bisagra y el
ncleo de la protena.
.
El dominio de unin al DNA contiene dos regiones
helicoidales a cortas que se unen al surco mayor del DNA.
.
La regin de la bisagra se inserta en el surco menor como
una hlice a corta y plegada.
.
El sitio de unin al inductor y las regiones responsables de
la formacin de los multimeros se localizan en el ncleo.
300
Un represor es un tetrmero formado por dos
dmeros
.
Los monmeros forman un dmero al hacer contactos
entre los dominios nucleares 1 y 2, y es posible
que entre las hlices de oligomerizacin.
.
Los dmeros forman un tetrmero por medio de
interacciones entre las hlices de oligomerizacin.
i-w La unin al DNA es regulada por un cambio
alostrico en la conformacin
.
El dominio de unin al DNA de cada monmero dentro
de un dmero se inserta en el surco mayor del DNA.
.
La hlice bisagra se inserta en el surco menor del DNA
operador.
.
Un represor activo tiene una conformacin en la
cual los dos dominios de unin al DNA de un dmero
pueden insertarse en vueltas sucesivas de la doble
hlice.
.
La unin del inductor interrumpe la hlice bisagra
y cambia la conformacin de tal manera que los
dos sitios de unin al DNA no se encuentran en la
geometra correcta para hacer contactos simultneos.
<mm Los fenotipos mutantes se correlacionan con
la estructura del dominio
.
Diferentes tipos de mutaciones ocurren en dominios
distintos de la subunidad del represor.
HQ La protena represora se une al operador
*
La protena represora se une a la secuencia de DNA de
doble cadena del operador.
.
El operador es una secuencia palindrmica de 26 bp.
Cada repeticin invertida del operador se une al sitio
de unin al DNA de una subunidad represora.
-
fi La unin del inductor libera al represor del
operador
.
La unin del inductor provoca un cambio en la
conformacin del represor que reduce su afinidad por
el DNA y lo libera del operador.
Kl El represor se une a tres operadores
e interacta con la polimerasa de RNA
.
Cada dmero localizado en un tetrmero represor puede
unirse a un operador, de tal manera que el tetrmero
puede unirse a dos operadores de forma simultnea.
.
La represin total requiere que el represor se una a un
operador adicional localizado en flujo descendente o
ascendente as como al operador en el promotor lacZ.
.
La unin del represor al operador estimula la unin
de la polimerasa de RNA al promotor, pero impide la
transcripcin.
HB El represor siempre est unido al DNA
Las protenas que tienen gran afinidad por una
secuencia especfica de DNA tambin tienen una
afinidad baja por otras secuencias del DNA.
.
Cada par de bases localizado en el genoma bacteriano
es el inicio de un sitio de unin de baja afinidad para
el represor.
.
El gran nmero de sitios de baja afinidad garantiza que
toda la protena represora est unida al DNA.
.
El represor se une al operador al desplazarse desde un
sitio de baja afinidad en vez de hacerlo al equilibrarse
en la solucin.
mmit El operador compite con los sitios de baja
afinidad para unirse al represor
En ausencia de inductor, el operador tiene una afinidad
por el represor que es 107 veces mayor que la de un
sitio de baja afinidad.
.
El nivel de 10 tetrmeros represores por clulas
asegura que el operador est unido al represor 96% del
tiempo.
.
La induccin reduce la afinidad por el operador a 104
veces la de los sitios de baja afinidad, por lo que slo
3% de los operadores estn unidos.
.
La induccin provoca que el represor se mueva
del operador a un sitio de baja afinidad por
desplazamiento directo.
.
Estos parmetros podran cambiarse con un incremento
o reduccin de la concentracin efectiva de DNA
in vivo.
fEBS La represin puede suceder en mltiples loci
.
Un represor actuar en todos los loci que tengan una
copia de su secuencia operadora diana.
iwwti El AMP cclico es un efector que activa al
factor CRP para que acte en mltiples
operones
.
CRP es una protena activadora que se une a una
secuencia diana en un promotor.
'
Un dmero de CRP es activado por una sola molcula
de AMP cclico.
iwwi EL factor CRP funciona de formas diferentes en
operones diana distintos
.
CRP introduce un giro de 90 en el DNA en su sitio de
unin.
.
Los sitios de unin al CRP se encuentran en
ubicaciones muy variables con respecto al promotor.
.
CRP interacta con la polimerasa de RNA, pero los
detalles de la interaccin dependen de las ubicaciones
relativas del sitio de unin al CRP y del promotor.
wwa La traduccin puede ser regulada
Una protena represora puede regular la traduccin
al impedir que un rbosoma se una a un codn de
iniciacin.
.
La accesibilidad a los codones de iniciacin en un
RNAm policistrnico puede ser controlada por medio
de cambios en la estructura del RNAm, los cuales
ocurren como resultado de la traduccin.
wwa La sntesis de las protenas r es controlada por
medio de regulacin autgena
.
La traduccin de un opern de protena r puede ser
controlada por un producto del opern que se une a un
sitio localizado en el RNAm policistrnico.
iEEB La p32 del fago T4 es controlada por un
circuito autgeno
.
p32 se une a su propio RNAm para impedir la
iniciacin de la traduccin.
ww.-i La regulacin autgena se utiliza a menudo
para controlar la sntesis de ensambles
macromoleculares
.
El precursor de los microtbulos, la protena tubulina
libre, inhibe la traduccin del RNAm de la tubulina.
iMWil Resumen
CAPTULO 12 El opern 301
QQ Introduccin
La expresin gnica puede ser controlada en cual-
quiera de las mltiples etapas, las cuales se dividirn
en trminos generales en transcripcin, procesa-
miento y traduccin:
.
La transcripcin a menudo es controlada en
la etapa de iniciacin. La transcripcin casi
nunca se controla en la elongacin, pero
puede ser controlada en la terminacin para
determinar si a la polimerasa de RNA se le
permite dejar atrs un terminador y avan-
zar al gen o a los genes que se encuentran
despus de l.
.
En las clulas eucariticas, el procesamien-
to del producto de RNA puede ser regulado
en la etapa de modificacin, en la de corte
y empalme, en la de transporte o en la de
estabilidad. En las bacterias, un RNAm en
principio est disponible para la traduccin
tan pronto ha sido sintetizado, e incluso du-
rante su sntesis, pero durante este periodo
las etapas de control no estn disponibles.
.
La traduccin puede ser regulada, por lo ge-
neral en las etapas de iniciacin y de termi-
nacin (como la transcripcin). La regula-
cin de la iniciacin es formalmente anloga
a la regulacin de la transcripcin: el siste-
ma de circuitos puede ilustrarse en trminos
similares para regulacin de la iniciacin de
la transcripcin en el DNA o de la iniciacin
de la traduccin en el RNA.
El concepto bsico que explica cmo se controla
la transcripcin en las bacterias lo proporcion la
formulacin clsica del modelo para el control de
la expresin gnica elaborado por Jacob y Monod
en 1961. Ellos distinguieron dos tipos de secuencias
en el DNA: las secuencias que codifican los pro-
ductos de actuacin en trans y las secuencias de
actuacin en cis que funcionan de manera exclu-
siva dentro del DNA. La actividad gnica es regulada
por las interacciones especficas de los productos de
actuacin en trans (por lo general protenas) con las
Un regulador se une . un sitio diana del ONA
WBSK/
Gen regulaiOT
l
RNAm
Protena reguladora Sifio diana Cien estructural
FIGURA 12.1 Un gen regulador coaifica una protena que ac-
ta en un sitio diana del DNA.
302 CAPT ULO 12 El Opern
secuencias de actuacin en cis (por lo general sitios
en el DNA). En trminos ms formales:
.
Un gen es una secuencia de DNA que codi-
fica un producto capaz de difundirse. Este
producto puede ser una protena (como
en la mayor parte de los genes) o puede
ser RNA (como en los genes que codificar.
RNAt y RNAr). La caracterstica fundamenta' .
es que el producto se difunde lejos del sitio de su
sntesis y acta en otra ubicacin. Cualquier
producto gnico que es libre de difundirse
para encontrar su objetivo se describe como
de actuacin en trans.
.
La descripcin del concepto actuacin en
cis se aplica a cualquier secuencia de DNA
que no es transformada a ninguna otra for-
ma, pero que funciona de manera exclusi-
va como una secuencia de DNA in situ, que
afecta slo al DNA al cual est fsicamente
ligado. (En algunos casos, una secuencia de
actuacin en cis funciona en un RNA en vez
de hacerlo en una molcula de DNA.)
Para ayudar a distinguir entre los componentes
de los circuitos reguladores y los genes a los cuales
regulan, en ocasiones utilizamos los trminos gen
estructural y gen regulador. Un gen estructural es
tan slo un gen que codifica un producto protenico
(o un RNA). Los genes estructurales representan una
enorme variedad de funciones y estructuras prote-
nicas, como las protenas estructurales, las enzimas
con actividades catalticas y las protenas regulado-
ras. Un gen regulador simplemente describe a un
gen que codifica una protena (o una molcula de
RNA) que interviene en la regulacin de la expre-
sin de otros genes.
La forma ms sencilla del modelo regulador
se ilustra en la ;)RA 12.i: un gen regulador codifi-
ca una protena que controla la transcripcin al unitm
a un sitio particular del DNA, o a varios. Esta interac-
cin puede regular a un gen diana de forma positiva
(la interaccin activa al gen) o de forma negativa (k
interaccin desactiva al gen). Los sitios del DNA casi
siempre (pero no de forma exclusiva) se localizan
enseguida del gen diana, en sentido ascendente.
Las secuencias que indican el inicio y el fin de
la unidad de transcripcin, el promotor y el termi-
nador, son ejemplos de sitios de actuacin en cis.
Un promotor sirve para iniciar la transcripcin slo del
gen o de los genes que estn conectados fsicamente a Un
el mismo fragmento de DNA. En la misma forma, un
terminador puede finalizar la transcripcin slo por
medio de una polimerasa de RNA que ha atrave-
sado al gen o a los genes precedentes. En su forma
ms simple, los promotores y los termmadores son
elementos de actuacin en cis que son reconocidos
por la misma especie de actuacin en trans, es decir
- la polimerasa de RNA (aunque otros factores
"
bin participan en cada sitio).
Hay otros sitios reguladores de actuacin en cis
:
e a menudo estn yuxtapuestos al promotor o
eminados en l. Un promotor bacteriano puede
ner uno o ms de dichos sitios localizados en la
rcana, es decir, en la vecindad inmediata del pun-
de inicio. Un promotor eucaritico es probable
le tenga un nmero mayor de sitios dispersos en
na distancia ms larga.
La regulacin puede
ser positiva o negativa
Conceptos principales
.
En la regulacin negativa, una protena represora se
une a un operador para evitar que se exprese un gen.
En La regulacin positiva, es necesario que se una un
factor de transcripcin al promotor para permitir a la
polimerasa de RNA iniciar la transcripcin.
Dn modelo clsico del control en las bacterias es
-
-
yativo: una protena represora impide que un gen
- a expresado. La iGURA 12.2 muestra que el
"
esta-
do predeterminado" de dicho gen es ser expresado
i travs del reconocimiento de su promotor por la
polimerasa de RNA. Cerca del promotor se encuen-
tra otro sitio de actuacin en cis denominado opera-
dor
, el cual es el objetivo de la protena represora.
Cuando el represor se une al operador, se le impide
i la polimerasa de RNA iniciar la transcripcin y,
3r lo tanto, la expresin gnica es desactivada.
Hay un modelo alternativo de control positivo.
Zste se utiliza en las bacterias (probablemente) con
una frecuencia casi igual a la del control negativo
'
es la forma de control ms comn en las eucario-
bs. Un factor de transcripcin es necesario para
ayudar a la polimerasa de RNA en la iniciacin en
l promotor. La FIGURA 12.3 muestra que el estado
predeterminado tpico de un gen eucaritico es in-
activo: la polimerasa de RNA no puede iniciar por s
aisma la transcripcin en el promotor. Numerosos
actores de actuacin en trans tienen sitios diana
localizados en la vecindad del promotor y la unin
m algunos o de todos estos factores permite a la polimerasa
de RNA iniciar la transcripcin.
El tema unificador es que las protenas regulado-
ras son factores de actuacin en trans que reconocen
elementos de actuacin en cis (por lo general) locali-
zados en sentido ascendente con respecto al gen. Las
-
onsecuencias de este reconocimiento son la activa-
:
in o la represin del gen, segn el tipo individual
le protena reguladora. Una caracterstica tpica es
que la protena funciona al reconocer una secuencia
muy corta localizada en el DNA, casi siempre con
Promoior/operador de actuacin en cis precede a los genes
estructurales
Promotor operador Gen(es) e5tructural{es)
Gen encendicio: la pc,|lmerasa de RNA inicig n 6l promotor
RNA
sy\y\/\/|v/
Protena
El gen es apagado cuando el represor se une ai opcsrador
Represor
FIGURA 12.. En el control negativo un represor de actuacin
en trans se une al operador de actuacin en cis para apagar La
transcripcin.
Los factores de transcripcin permitan a la polimerasa
de RNArmremi.u.i.n.iwi
GEN APAGADO EN FORMA. PREDETERMIMADA,
Punto de inicio
Promotor
l
J\'\'\
Gen
GEN CNCE=UIDOPOR LOS ACTIVADORES
Los factores interactan con la polimerasa de RNA
rna s/x/ y
Protenaji ?
FIGURA 12.' En el control positivo, los factores de actuacin
en trans deben unirse a los sitios de actuacin en cis para que
la polimerasa de RNA inicie La transcripcin en el promotor.
una longitud <10 bp, aunque la protena de hecho
se une a un fragmento del DNA un tanto mayor. El
promotor bacteriano es un ejemplo: la polimerasa
de RNA cubre >70 bp del DNA en la iniciacin, pero
las secuencias cruciales a las cuales reconoce son los
hexmeros centrados en las posiciones -35 y -10.
Una diferencia significativa en la organizacin
de los genes entre las procariotas y las eucariotas
es que los genes estructurales de las bacterias estn
organizados en agrupamientos, mientras que los de
las eucariotas se presentan de manera individual. El
agrupamiento de los genes estructurales les permi-
te ser controlados de forma coordinada por medio
de interacciones en un solo promotor: como resul-
\:.: La regulacin puede ser positiva o negativa 03
tado de estas interacciones, el conjunto completo
de genes se transcribe o no se transcribe. En este
captulo se analiza esta forma de control y su uso
por parte de las bacterias. Los medios empleados
para coordinar el control de los genes eucariticos
dispersos se abordan en el Captulo 25,
Activacin
de la transcripcin.
|2J Los agrupamientos de genes
estructurales son controlados
de manera coordinada
Concepto principal
.
Los genes que codifican protenas que funcionan en la
misma ruta pueden ser adyacentes y ser controlados
como una unidad individual que se transcribe en un
RNAm policistrnico.
Los genes estructurales bacterianos con frecuencia
estn organizados en agrupamientos que incluyen
genes que codifican protenas cuyas funciones es-
tn relacionadas. A menudo los genes que codifican
las enzimas de una ruta metablica estn organiza-
dos en uno de estos agrupamientos. Adems de las
enzimas que intervienen en la ruta, la unidad de
control coordinado puede incluir otras actividades
relacionadas; por ejemplo, la protena encargada de
transportar la molcula pequea (sustrato) al inte-
rior de la clula.
El agrupamiento de los tres genes estructurales
lac, lacZYA, es tpico. La FIGURA 12.4 resume la or-
ganizacin de los genes estructurales, sus elemen-
tos reguladores asociados de actuacin en cis y el
gen regulador de actuacin en trans. La caracterstica
principal es que el agrupamiento se transcribe en un solo
RNAm policistrnico a partir de un promotor en el cual
se regula la iniciacin de la transcripcin.
Los productos protenicos permiten a las clulas
absorber y metabolizar los galactsidos (3, como la
lactosa. Las funciones de los tres genes estructurales
son:
.
El gen lacZ codifica la enzima galactosida-
sa p, cuya forma activa es un tetrmero de
-
500 kD. La enzima separa un galactsido (3
en sus azcares constitutivas. Por ejemplo,
la lactosa es dividida en glucosa y galactosa
(las cuales son metabolizadas posteriormen-
te). Esta enzima tambin elabora un subpro-
ducto importante, la alolactosa (3-1,6, la cual
tiene cierta funcin en la regulacin.
.
El gen lacY codifica la permeasa de galac-
tsido (3, una protena de -30 kD unida a
la membrana, componente del sistema de
transporte. sta transporta a los galactsidos
[3 al interior de la clula.
.
El gen lacA codifica la transacetilasa de galac-
tsido |3, una enzima que transfiere un grupo
acetilo de la acetil-CoA a los galactsidos p.
Las mutaciones en lacZ o en /iac7pueden crear el
genotipo lac, en el cual las clulas no pueden utilizar
la lactosa. (La descripcin genotpica "lac" sin un cali-
ficativo indica prdida de la funcin.) Las mutaciones
lacZ eliminan la actividad enzimtica e impiden de
manera directa el metabolismo de la lactosa. Los mu-
lantes lacY no pueden absorber la lactosa del medio.
(Ningn defecto es identificable en las clulas lacA
lo cual es desconcertante. Es posible que la reaccin
de acetilacin proporcione una ventaja cuando las
bacterias crecen en presencia de ciertos anlogos de
los galactsidos P que no pueden ser metabolizados,
debido a que la modificacin da origen a la desintoxi-
cacin y la excrecin.)
El sistema completo, incluidos los genes estruc-
turales y los elementos que controlan su expresin.
forma una unidad comn de regulacin denomina-
da opern. La actividad del opern es controlada
por el gen o los genes reguladores cuyos productos
protenicos interactan con los elementos de con-
trol de actuacin en cis.
El opern lac incluye los elementos reguladores de actuacin en cis y los genes
es de protei
nii ni ilfItyiV'iliim'riM
P lacl PO lacZ lacY lacA
1 040 82 3 510 780 825
RNAm xyxxxxxyxyxxxxxyvxxx
i
PnXefna
Represor Galactosidasa p
1 i
PermeasaTransacetilasa
El Qoern oc ocupa ~5 000 bp del DNA. En el lado izquierdo el gen lacl tiene su
propio promotor y su propio terminador. El extremo de la regin lac es adyacente al promotor, P.
El operador, 0, ocupa los primeros 26 bp de la unidad de transcripcin. El gen largo lacZ comienza
en La base 39 y es seguido por los genes LacY y lacA y por un terminador.
CAPTULO 12 El Opern
Los genes ac son controlados
por un represor
Conceptos principales
.
La transcripcin del agrupamiento de genes lacZYA es
controlada por una protena represora que se une a un
operador que se superpone al promotor en el inicio del
agrupamiento.
.
La protena represora es un tetrmero formado por
subunidades idnticas codificadas por el gen lacl.
Se pueden distinguir los genes estructurales de los
genes reguladores por los efectos de las mutaciones.
Una mutacin en un gen estructural priva a la clula
le la protena particular a la cual codifica el gen.
Sin embargo, una mutacin en un gen regulador
mfluye en la expresin de todos los genes estructu-
rales a los cuales controla. Las consecuencias de una
mutacin en un gen regulador revelan el tipo de
egulacin.
La transcripcin de los genes lacZYA es contro-
Lada por una protena reguladora sintetizada por el
gen lacl. Sucede que lacl est localizado al lado de los
enes estructurales, pero comprende una unidad de
transcripcin independiente con su propio promo-
:
n y con su propio terminador. En principio, lacl no
necesita localizarse cerca de los genes estructurales
iebido a que especifica a un producto que se difun-
de. Puede funcionar muy bien si es transportado a
rualquier otro sitio, o puede estar contenido en una
molcula de DNA independiente (la prueba clsica
para un regulador de actuacin en trans).
Los genes lac son controlados por medio de re-
ulacin negativa: son transcritos a menos que sean
.
'
vagados por la protena reguladora. Una mutacin
que desactiva al regulador hace que los genes es-
tructurales permanezcan en la condicin expresada.
El producto de lacl se denomina represor Lac, debido
a que su funcin es impedir la expresin de los ge-
nes estructurales.
El represor es un tetrmero de subunidades
lnticas de 38 kD cada una. Hay -10 tetrmeros
m una clula de tipo silvestre. El gen regulador no
es controlado por la disponibilidad de la lactosa. Se
.
.ranscribe en un RNAm monocistrnico a una velo-
cidad que parece ser gobernada tan slo por la afini-
:
ad de su promotor por la polimerasa de RNA.
El represor funciona unindose a un operador
(cuyo smbolo formal es 0
lac
) localizado al inicio del
agrupamiento lacZYA. El operador se ubica entre el
promotor (Plac) y los genes estructurales {lacZYA).
Mando el represor se une al operador, impide que la po-
..merasa de RNA inicie la transcripcin en el promotor. La
flGURA 12.5 ampla nuestra visin de la regin que
El promotor y el operador se superponen
Punto de nicio
Desenrollamiento
l
-50 -40 -30 -20 -10 1 10 20 30
< Promotor >
se une a la polimerasa de RNA
*
= Operadora
se une ai represor
FIGURA 12.5 El represor y la polimerasa de RNA se unen a
sitios que se superponen alrededor del punto de inicio de la
transcripcin del opern lac.
se encuentra al principio de los genes estructurales
lac. El operador se extiende desde la posicin -5 justo
en sentido ascendente del punto de inicio del RNAm
hasta la posicin +21 localizada dentro de la unidad
de transcripcin; por lo tanto, se superpone al ex-
tremo derecho del promotor. Se analiza la relacin
entre el represor y la polimerasa de RNA con mayor
detalle en la seccin 12.14, La protena represora se
une al operador, y en la seccin 12.16 El represor se
une a tres operadores e interacta con la polimerasa
de RNA.
rm El opern ac puede ser inducido
Conceptos principales
.
Las molculas pequeas que inducen a un opern son
idnticas al sustrato en lo que se refiere a sus enzimas,
o estn relacionadas con l.
.
Los galactsidos (3 son los sustratos para las enzimas
codificadas por lacZYA.
.
En ausencia de galactsidos p, el opern lac se expresa
slo en un nivel (basal) muy bajo.
.
La adicin de galactsidos |3 especficos induce la
transcripcin de los tres genes del opern.
El RNAm oc es muy inestable; como resultado, la
induccin puede revertirse con rapidez.
.
Los mismos tipos de sistemas que permiten a los
sustratos inducir a los operones que codifican enzimas
metablicas pueden ser utilizados para permitir a los
productos finales reprimir a los operones que codifican
las enzimas biosintticas.
Las bacterias necesitan responder con rapidez a los
cambios que surgen en su ambiente. Las fluctuacio-
nes en el abastecimiento de los nutrientes pueden
ocurrir en cualquier momento y la supervivencia de-
pende de la capacidad de cambiar el metabolismo de
un sustrato por el de otro. Sin embargo, la econo-
12.5 El opern lac puede ser inducido 105
iiiimiiiJjJiiiiJiJjjJMii
Adicin del inductor Retiro dei inductor
i
Nivel inducido
Nivel basa Nivel
0 2 4 6 8 10 12 min
Nivel de RNAm lac
Periodo Periodo
Nivel basal
Nivel inducido
0 2 4 6 8 10 12 min
Nivel de galactosidasa fi
FIGURA 12.6 La adicin del inductor propicia La rpida in-
duccin del RNAm lac y es seguida despus de un breve Lapso
por La sntesis de Las enzimas; aL retiro deL inductor Le sigue La
interrupcin rpida de La sntesis.
ma tambin es importante: una bacteria que destina
mucha energa para satisfacer las demandas del am-
biente tiende a estar en desventaja. Por lo tanto, una
bacteria evita sintetizar las enzimas de una ruta en
ausencia del sustrato, pero est preparada para pro-
ducir las enzimas si el sustrato vuelve a aparecer.
La sntesis de las enzimas en respuesta a la apa-
ricin de un sustrato especfico se denomina induc-
cin. Este tipo de regulacin es generalizado en las
bacterias y tambin ocurre en las eucariotas unice-
lulares (como las levaduras). El sistema de la lactosa
de E. coli proporciona el modelo de este tipo de me-
canismo de control.
Cuando las clulas de E. coli son cultivadas en
ausencia de un galactsido (3 no hay necesidad de
galactosidasa (3, y contienen muy pocas molculas
de la enzima, menos de cinco. Cuando se agrega un
sustrato apropiado, la actividad enzimtica aparece
en forma muy rpida en las bacterias. En 2 a 3 min
hay cierta cantidad de enzima, y pronto aparecen
~
5 000 molculas de la enzima en cada bacteria.
(En condiciones adecuadas, la galactosidasa 3 puede
representar de 5 a 10% del total de protena soluble
de la bacteria.) Si se retira el sustrato del medio, la
sntesis de la enzima se detiene con la misma rapi-
dez con que comenz.
La FIGURA 12.6 resume las caractersticas esen-
ciales de la induccin. El control de la transcripcin
de los genes lac responde con mucha rapidez al in-
ductor, como se muestra en la parte superior de la
figura. En ausencia del inductor, el opern se trans-
cribe en un nivel basal muy bajo. La transcripcin
es estimulada en cuanto se agrega el inductor; fl
cantidad de RNAm lac aumenta de manera rpids
a un nivel inducido que reeja un balance entre la
sntesis y la degradacin del RNAm.
El RNAm lac es muy inestable y se degrada des-
pus de una vida media de apenas unos 3 min. Est
caracterstica permite que la induccin sea reverti-
da con rapidez. La transcripcin cesa en cuanto se
retira al inductor, y en un periodo muy corto todo
el RNAm lac habr sido destruido y el contenidc
celular regresar al nivel basal.
La produccin protenica se observa en la parte
inferior de la figura. La traduccin del RNAm la:
produce galactosidasa p (y los productos de los otros
genes lac). Hay un rezago corto entre la aparicir
del RNAm lac y el surgimiento de las primeras mo-
lculas enzimticas completas (la concentracin de
protena comienza a aumentar unos 2 min despu;
del incremento del nivel basal de RNAm). Hay ur.
rezago similar para alcanzar los niveles inducido;
mximos de RNAm y de protena. Cuando se reti-
ra al inductor, la sntesis de la enzima cesa casi de
inmediato (a medida que el RNAm es degradado
pero la galactosidasa (3 que se encuentra en la cluLs
es ms estable que el RNAm, de tal manera que 9
actividad de la enzima permanece en el nivel indu-
cido durante ms tiempo.
Este tipo de respuesta rpida a los cambios en el
abastecimiento de nutrientes no slo proporciona l
capacidad de metabolizar sustratos nuevos, sino que
tambin sirve para desactivar la sntesis endgena
de compuestos que aparecen de manera sbita en
el medio. Por ejemplo, E. coli sintetiza el aminocid.
triptfano por medio de la accin de la enzima sin-
tetasa de triptfano. Sin embargo, si el medio en
cual las bacterias son cultivadas proporciona el trip-
tfano, la produccin de la enzima es interrumpid,;-
de inmediato. A este efecto se le llama represin
Permite a la bacteria evitar que sus recursos se des-
tinen a actividades sintticas innecesarias.
La induccin y la represin representan el mis-
mo fenmeno. En un caso la bacteria ajusta su capa-
cidad para utilizar un sustrato determinado (com:
la lactosa) para el crecimiento; en el otro, ajust;
su capacidad para sintetizar un intermediario me-
tablico particular (como un aminocido esenciaii
El desencadenante de cualquier tipo de ajuste
una molcula pequea que es el sustrato, o que
est relacionada al sustrato de la enzima, o que e
el producto de la actividad enzimtica, respectiva-
mente. Las molculas pequeas que provocas I
produccin de las enzimas capaces de metaboliza:-
las se denominan inductores. Aquellas molcuk-
que impiden la produccin de enzimas capaces c-
sintetizarlas se llaman correpresores.
CAPTULO 12 El Opern
EL represor es controlado por
una pequea molcula inductora
iceptos principales
Jn inductor funciona al convertir a la protena
'
epresora en una forma con menor afinidad por el
:
perador.
El represor tiene dos sitios de unin, uno para el
:
perador y otro para el inductor.
i represor es desactivado por una interaccin
alostrica en la cual la unin del inductor a su sitio
:
ambia Las propiedades del sitio de unin al DNA.
rapacidad de actuar como un inductor o como un
-
represor es muy especfica. Slo sirven el sustra-
producto o una molcula muy relacionada. Sin
r.bargo, en la mayor parte de los casos la actividad
molcula pequea no depende de su interaccin con
mzima diana. No obstante, para el sistema lac el
iuctor natural es un subproducto de la enzima
:Z
, la alolactosa [3-1,6, producida por la transglico-
icin de la ligadura |3-1, 4 en la lactosa. La alolac-
:
a tambin es un sustrato de la enzima lacZ, por lo
-
1 no persiste en la clula. Algunos inductores se
;
mejan a los inductores naturales del opern lac,
-
.:
<) no pueden ser metabolizados por la enzima.
El
cmplo por excelencia es el isopropiltiogalactsido
-
?TG), uno de los numerosos tiogalactsidos que
;:
entan esta propiedad. El IPTG no es reconocido
:
la galactosidasa [3; de cualquier manera, es un
inductor muy eficiente de los genes lac.
A las molculas que inducen la sntesis enzim-
a
, pero que no son metabolizadas, se les denomi-
pa inductores gratuitos. Son muy tiles porque
permanecen en la clula en su forma original. (Un
ductor real sera metabolizado, interfiriendo as
-
.
. el estudio del sistema.) La existencia de induc-
:
es gratuitos revela un punto importante. El sis-
<ana debe poseer algn componente,
distinto a la enzima
ma, que reconozca al sustrato apropiado, y su capacidad
-
reconocer sustratos potenciales relacionados es dife-
::e a la de la enzima.
El componente que responde al inductor es la
rotena represora codificada por lacl. Los genes es-
ructurales lacZYA se transcriben en un solo RNAm
i partir de un promotor adyacente a lacZ que se
r ruentra en sentido ascendente. El estado del
rr-resor determina si este promotor es activado o
- ;activado:
.
La FIGURA 12.7 muestra que en ausencia de un
inductor los genes no se transcriben, debido a
que la protena represora se encuentra en una
forma activa que est unida al operador.
.
La FIGURA 12 8 muestra que cuando se agre-
ga un inductor, el represor muta a una for-
Un tetramero represor se une al operador para
Impedir la transcripcin
El tetrmero se une al operador
y bloquea la transcripcin
X'XCJ, JX'XtX'X'X'X/
lacl k Promotor/ lacZ lacY lacA
operador
El gen lacl sintetiza al
monmero represor que
forma al tetrmero
Monmero
Tetrmero
FIGUR - El represor mantiene al opern lac en condicin
inactiva al unirse al operador. La forma del represor se repre-
senta como una serie de dominios conectados segn lo revela
su estructura cristalina (vase ms adelante).
El inductor desactiva al represor
y permite asi la expresin genlca
INDUCTOR-*
La polimerasa de
RNA se une a un
promotor y transcribe
el RNA
El inductor transforma
al represor lac en una
forma inactiva que
no puede unirse
al operador
El RNAm es traducido
en las tres protenas
I
FIGURA 12. La adicin del inductor transforma al represor en
una forma inactiva incapaz de unirse al operador. Esto permite
a la polimerasa de RNA iniciar la transcripcin.
ma sin afinidad menor por el operador o es
convertido a una forma con menor afinidad
que abandona al operador. Despus inicia
la transcripcin en el promotor y procede a
travs de los genes hasta un terminador loca-
lizado despus del extremo 3' del gen lacA.
Las caractersticas ms importantes del circui-
to de control residen en las propiedades dobles del
represor: puede impedir la transcripcin y puede
reconocer la pequea molcula inductora. El repre-
sor tiene dos sitios de unin; uno para el operador
y uno para el inductor. Cuando el inductor se une
a su sitio, cambia la conformacin de la protena
de tal forma que influye en la actividad del sitio de
unin al operador. La capacidad de un sitio localiz-
is.6 El represor es controlado por una pequea molcula inductora
307
do en la protena para controlar la actividad de otro
se llama control alostrico.
La induccin logra una regulacin coordina-
da: todos losgenes se expresan (o no) al unsono. El RNAm
es traducido de forma secuencial desde su extremo
5
'
, lo cual explica porqu la induccin siempre pro-
voca la aparicin de galactosidasa [3, de permeasa
de galactsido (3 y de transacetilasa de galactsido
[3, en ese orden. La traduccin de un RNAm comn
explica porqu las cantidades relativas de las tres en-
zimas siempre permanecen iguales en condiciones
variables de induccin.
La induccin provoca un cambio que ocasio-
na que los genes sean transcritos. La eficacia de los
inductores vara, y hay otros factores que influyen
en el nivel absoluto de la transcripcin o de la tra-
duccin, pero la relacin entre los tres genes est
predeterminada por su organizacin.
Se observa una posible paradoja en la constitu-
cin del opern. El opern de la lactosa contiene el
gen estructural {lacZ) que codifica la galactosidasa {3
con la actividad necesaria para metabozar al azcar;
tambin incluye el gen (lacY) que codifica la protena
indispensable para transportar el sustrato al interior
de la clula. Sin embargo, si el opern se encuentra
en un estado reprimido, cmo entra el inductor
a la clula para iniciar el proceso de induccin?
Dos caractersticas garantizan que siempre haya
una cantidad mnima de protena en la clula, sufi-
ciente para iniciar el proceso. Hay un nivel basal de
expresin del opern: incluso cuando no es induci-
do, se expresa en un nivel residual (0.1% del nivel
inducido). Adems, cierta cantidad de inductor entra
de cualquier forma por otro sistema de transporte.
Las mutaciones constitutivas
de actuacin en ds identifican
al operador
Conceptos principales
*
Las mutaciones localizadas en el operador provocan la
expresin constitutiva de los tres genes estructurales lac.
*
Estas mutaciones actan en configuracin ds y
afectan slo a aquellos genes que se encuentran en el
fragmento contiguo de DNA.
Las mutaciones que tienen lugar en el circuito regu-
lador pueden inhibir la expresin del opern o pro-
vocar una expresin no regulada. Los mutantes que
no pueden ser expresados en absoluto se llaman no
inducibles. La expresin continua de un gen que
no responde a la regulacin se denomina expresin
gnica constitutiva, y los mutantes con esta propie-
dad se conocen como mutantes constitutivos.
Los componentes de un circuito regulador del
opern pueden identificarse por las mutaciones que
afectan la expresin de todos los genes estructurales y qm
elaboran el mapeo fuera de ellos. Se dividen en do;
clases. El promotor y el operador son identifica-
dos como dianas para las protenas reguladoras (la
polimerasa de RNA y el represor, respectivamente i
por mutaciones de actuacin en cis. El locus lacl es
identificado como el gen que codifica la protena
represora por medio de mutaciones que eliminan
el producto de actuacin en trans.
El operador fue identificado en un inicio por
mutaciones constitutivas, a las que se les asign i
smbolo Oc, cuyas propiedades distintivas ofrecieron
la primera prueba de un elemento que funciona sin ser
representado en un producto que se difunde.
Los genes estructurales contiguos con una muta-
cin Oc se expresan en trminos constitutivos porque
la mutacin cambia el operador de tal manera que el
represor ya no es capaz de unirse a l. Por lo tanto.
el represor no puede impedir que la polimerasa de
RNA inicie la transcripcin. El opern se transcri-
be en trminos constitutivos, como se ilustra en I
FIGURA 12.9.
El operador puede controlar slo los genes lac adya-
centes a l. Si un segundo opern lac es introducido
en una bacteria en una molcula de DNA indepen-
diente, tiene su propio operador. Ninguno de los
operadores recibe la influncia del otro operador.
Por lo tanto, si un opern tiene un operador de tipo
silvestre, ser reprimido en las condiciones habitua-
les, en tanto que un segundo opern con una muta-
cin Oc ser expresado en su forma caracterstica.
Estas propiedades definen al operador como un
tpico sitio de actuacin en cis, cuya funcin depen-
de del reconocimiento de su secuencia de DNA por
algn factor de actuacin en trans. El operador con-
El mulante operador constitutivo no puede
unirse a la protena represora
/\s\
i *
t
El represor no puede unirse
a un operador mulante
#
Operador Oc
El opern es transcrito
y traducido
Las mutaciones operadoras son constitutivas de-
bido a que el operador es incapaz de unirse a la protena repre-
sora; esto permite que la polimerasa de RNA tenga acceso sin
restricciones al promotor. Las mutaciones 0C actan en ds por-
que afectan slo al conjunto contiguo de genes estructurales.
308
CAPTULO 12 El Opern
.
a los genes adyacentes a pesar de la presencia de
: s alelos del sitio en la clula. Una mutacin en
.
de estos sitios (p. ej., la mutacin 0C) se describe
; manera formal como dominante en cis.
Una mutacin en un sitio de actuacin en cis
puede ser asignada a un grupo de complemen-
;:
n. (La capacidad de complementar define a los
:
-
es que se expresan como productos que se di-
mden.) Cuando dos sitios de actuacin en cis se
"
:uentran cerca uno del otro (p. ej., un operador y
d promotor) no se pueden clasificar las mutaciones
..
una prueba de complementacin. Slo es posi-
-
.
distinguirlos por sus efectos sobre el fenotipo.
La dominancia en configuracin cis es una ca-
cterstica de cualquier sitio fsicamente contiguo a las
::.enras a las cuales controla. Si un sitio de control
r
.ciona como parte de un RNAm policistrnico,
mutaciones en l exhibirn exactamente el mismo
""
n de dominancia en cis que mostraran si fun-
onaran en el DNA. El factor determinante es que
sitio de control no puede separarse en trminos
icos de los genes a los cuales regula. Desde el pun-
de vista gentico, no importa si el sitio y los genes
rtn juntos en el DNA o en el RNA.
B[ Las mutaciones de actuacin en
trans identifican el gen regulador
Conceptos principales
.
Las mutaciones Localizadas en el gen fac actan en
configuracin trans y afectan la expresin de todos los
agrupamientos lacZYA en la bacteria.
Las mutaciones gue eliminan la funcin de iacl
provocan expresin constitutiva y son recesivos.
.
Las mutaciones gue se encuentran en el sitio de unin
al DNA del represor son constitutivas debido a que el
represor no puede unirse al operador.
.
Las mutaciones gue se Localizan en el sitio de unin
al inductor del represor Le impiden ser desactivado e
'
mpiden la inducibilidad.
.
Las mutaciones de Los promotores son no inducibles y
de actuacin en cis.
-
i transcripcin constitutiva tambin es ocasionada
i mutaciones de tipo lacl, las cuales son provoca-
;
;
por prdida de la funcin (incluidas las deleciones
.
gen). Cuando el represor es inactivo o est ausen-
: .a transcripcin puede iniciar en el promotor. La
"
GURA 12.1' muestra que los mutantes /ac/" expresan
bs genes estructurales todo el tiempo (constitutiva-
mente), sin importar si el inductor est presente o ausente,
.:
ido a que el represor est inactivo.
Ambos tipos de mutaciones constitutivas pueden
Bstinguirse en trminos genticos. Los mutantes Oc
dominantes en cis, en tanto que los mutantes
son recesivos. Esto significa que la introduccin
de un gen lacl* normal restablece el control, a pesar
de la presencia del gen lact defectuoso.
Las mutaciones que se presentan en el opern que
son no inducibles se dividen en los mismos dos tipos
de clases genticas que los mutantes constitutivos:
.
Las mutaciones de los promotores son de
actuacin en cis. Si impiden que la polime-
rasa de RNA se una a P
lac, p
roducen un ope-
rn no funcional debido a que no puede ser
transcrito.
.
Las mutaciones que inhiben la capacidad del
represor para unirse al inductor se descri-
ben como lacF. Son de actuacin en trans.
El represor queda "bloqueado" en la forma
activa que reconoce al operador y que im-
pide la transcripcin. La adicin de induc-
tor no tiene efecto alguno debido a que su
unin es impedida o no puede propiciar el
cambio alostrico y, por lo tanto, es impo-
sible convertir al represor a la forma con
baja afinidad por el operador. El represor
mutante se une a todos los operadores lac
de la clula para evitar su transcripcin y
no puede ser eliminado, a pesar de las pro-
piedades de cualquier protena represora de
tipo silvestre que pueda estar presente, por
lo que es genticamente dominante.
Los dos tipos de mutaciones en el gen lacl per-
miten identificar los sitios activos individuales de la
protena represora. El sitio de unin al DNA reconoce
la secuencia del operador. Es identificada por muta-
ciones puntuales constitutivas que impiden que el
represor se una al DNA para bloquear la polimerasa
de RNA. El sitio de unin al inductor es identificado
por mutaciones puntuales que imposibilitan la in-
duccin, debido a que el inductor no puede unirse
para desencadenar el cambio alostrico en el sitio
de unin al DNA.
ran Las protenas multimricas tienen
propiedades genticas especiales
Conceptos principales
.
Un represor activo es un tetrmero formado por
subunidades idnticas.
Cuando se presentan subunidades mutantes y silvestres,
una sola subunidad mutante lacl'* puede desactivar a un
tetrmero cuyas subunidades restantes sean silvestres.
.
Las mutaciones lacl"* ocurren en el sitio de unin al DNA.
Su efecto se explica porque la actividad del represor
necesita todos los sitios de unin al DNA en el tetrmero
para que sea activo.
Una caracterstica importante del represor es que es
muliimcrico. Las subunidades del represor se aso-
cian de manera aleatoria en la clula para formar el
12.9 Las protenas muLtimricas tienen propiedades genticas especiales
309
tuoso ocasi
constitutiva
presin
1
t
33
El gen lacl- sintetiza al
represor defectuoso que
no se une al DNA
El opern es
transcrito y traducido
l
FIGURA 12.10 Las mutaciones que desactivan al gen lacl
provocan que el opern sea expresado constitutivamente, de-
bido a que la protena represora mutante no puede unirse al
operador.
tetrmero activo. Cuando hay dos alelos diferentes
del gen lacl, las subunidades formadas por cada uno
pueden asociarse para formar un heterotetrmero,
cuyas propiedades son diferentes a las del homote-
trmero. Este tipo de interaccin entre las subuni-
dades es una caracterstica distintiva de las protenas
multimricas y se describe como complementa-
clon interalllca.
Entre algunos mutantes represores ocurre com-
plementacln negativa, como se observa en la
combinacin de los genes lacl~
4
con los genes lacl*.
La mutacin lacl-0 sola da como resultado la produc-
La complemontacin negativa identifica
al multfmero proteimco
El muante/ac/- sintetiza
a un represor con un sitio
defectuoso de unin al DNA
El gen lacl de tipo silvestre
sintetiza al represor normal
Una subunidad "n
al tetrmero; no p
DNA de manera r
el opern se expr
S\S\j
lala
"
envenena
uede unirse al
ormal por lo que
3sa

FIGURA 12.11 Un mutante /ocJ"d crea un monmero que tiene

un sitio daado de unin al DNA (simbolizado por un crculo
rojo). Cuando se presenta en la misma clula como un gen de
tipo silvestre, los represores multimricos son ensamblados en
forma aleatoria a partir de ambos tipos de unidades. Slo se
requiere que una de las subunidades del multmero sea de tipo
lacl-6 para bloquear la funcin del represor. Esto explica el
comportamiento dominante negativo de la mutacin /oc/
"d
.
El monmero represor Lac
numerosos dominios
giro
Hlice-giro-hlice hlice a hlice a
Bisagra :
hlice a
Oligomerizacin-
mina |i hlice a
Dominio nuclear 1
-
Sitio de unin al inductor
Dominio nuclear 2
hlice o:
FIGURA 12.12 La estructura de un monmero de represor Uc
identifica numerosos dominios independientes. Estructura ?
presentada a partir del archivo PDB llbg de Hangli Zhan }
proporcionada por Kathleen S. Matthews, Rice University.
cin de un represor que no puede unirse al operado:
y, p
or lo tanto, es constitutiva, como los alelos lacr
La mutacin de tipo /jc/-desactiva al represor; t
consecuencia, suele ser recesiva con respecto al tip
silvestre. Sin embargo, el superndice -d indica qut
esta variante del tipo negativo es dominante cuantk
se aparea con un alelo de tipo silvestre. Dichas mutj
dones se denominan dominantes negativas.
La 1 explica este fenmeno. La ra
zn de la dominancia es que el alelo lacl-4 produc
una subunidad
"
mala
"
, la cual no es slo incapaz dt
unirse por s misma al DNA operador, sino que, de
bido a que es indispensable como parte del sitio di
unin al DNA, tambin es capaz, como parte de u
tetrmero, de impedir la unin de las subunidadt
"
buenas". Esto demuestra que para lograr la repre
sin es necesario el tetrmero represor completo, e
vez de monmeros individuales. De hecho, se pue
de invertir el argumento para expresar que siempr
que una protena tenga una forma negativa dom;
nante debe funcionar como parte de un multmerc
La produccin de protenas negativas dominante
se ha convertido en una tcnica importante en \
gentica eucaritica.
ff>W EL monmero represor
tiene numerosos dominios
Conceptos principales
Una subunidad represora individual puede dividirse en
un dominio terminal N de unin al DNA, una bisagra y
el ncleo de la protena.
El dominio de unin al DNA contiene dos regiones heli-
coidales a cortas que se unen al surco mayor del DNA.
La regin de la bisagra se inserta en el surco menor
como una hlice a corta y plegada.
310
CAPTULO 12 El Opern
El sitio de unin al inductor y las regiones encargadas de
z formacin de los multmeros se localizan en el ncleo.
-
rpresor tiene numerosos dominios. El dominio
-
-
inin al DNA ocupa los residuos 1-59 y se co-
como casco. Puede dividirse del resto del mo-
cero, conocido como ncleo
, por la tripsina. La
uctura cristalina en la FIGURA 12.12 muestra una
;;
pectiva ms detallada de estas regiones.
El extremo N del monmero est formado por
hlices a separadas por un giro. ste es un ele-
rr.ro comn de unin al DNA denominado HTH
T
ce-giro-hlice); las dos hlices a caben en el sur-
:
'
;:
ayor del DNA, en donde forman contactos con
rs especficas (vase la seccin 14.11, El represor
iza un elemento hlice-giro-hlice para unirse al
A). Esta regin est conectada por una bisagra al
ipo principal de la protena. En la forma unida
I NA del represor, la bisagra forma una hlice a
-
;uea (como se muestra en la figura), pero cuan-
el represor no est unido al DNA, esta regin est
.
ordenada. El elemento HTH y la bisagra juntos
rresponden al domino de unin al DNA.
El volumen del ncleo est formado por dos re-
"
es con estructuras similares (los dominios nu-
;
ares 1 y 2). Cada uno cuenta con una lmina [3 pa-
i
-i.a. de seis cadenas emparedada entre dos hlices
i cada lado. El inductor se une a una hendidura
-
: .cada entre las dos regiones. En el extremo C, hay
a hlice a que contiene dos septetos de leucia.
I :e es el dominio de oligomerizacin.
Las hlices
:
r oligomerizacin de cuatro monmeros se asocian
; ra mantener la estructura tetramrica.
2B Un represor es un tetrmero
formado por dos dmeros
Conceptos principales
.
Los monmeros forman un dmero al hacer contactos
entre Los dominios nucleares 1 y 2, y es posible que
entre las hlices de oligomerizacin.
.
Los dmeros forman un tetrmero por medio de
interacciones entre las hlices de oligomerizacin.
La FIGURA 12.13muestra la estructura del ncleo
rramrico (con un sistema de modelado diferente
re la Figura 12.12). De hecho, est formado por
-;
5 dmeros. El cuerpo del dmero contiene una in-
friase laxa entre las regiones terminales N de los
;nmeros nucleares
,
una hendidura a la cual se
re el inductor
, y un ncleo hidrfobo (parte supe-
:i. Las regiones terminales C de cada monmero
:
resalen como hlices paralelas. (El casco se unir
rs regiones terminales N en la parte superior.) Los
.
meros juntos interactan para formar un tetrme-
ro (centro) que se mantiene unido por un conjunto
terminal C formado por cuatro hlices.
Los sitios de las mutaciones se ilustran en forma
de abalorios localizados en la estructura de la parte
inferior. Las mutaciones lacF hacen que el represor
no reaccione ante el inductor, de tal manera que el
opern no es inducible. Se mapean en dos grupos: en
color gris se muestran las localizadas en la hendidura
de unin al inductor, y en color amarillo se mues-
tran aquellas que afectan la interfase del dmero del
domino nuclear 1. El primer grupo inhibe el sitio de
unin al inductor; el segundo grupo evita que los
efectos de la unin del inductor se transmitan al sitio
de unin al DNA. Las mutaciones lacl4 que afectan
la oligomerizacin se mapean en dos grupos. En co-
lor blanco se muestran las mutaciones en el dominio
nuclear 2 que impiden la formacin del dmero. En
color morado se sealan aquellas ubicadas en la h-
lice de oligomerizacin que impiden la formacin
del tetrmero a partir de los dmeros.
FIGURA 12. La estructura cristalina de la regin nuclear del
represor Lac identifica las interacciones entre los monmeros
en el tetrmero. Cada monmero es identificado por un color
diferente. Las mutaciones estn coloreadas de la siguiente ma-
nera: interfase del dmero = amarillo; unin al inductor = azul;
oligomerizacin = blanco y prpura. Fotografas cortesa de
Benjamn Wieder and Ponzy Lu, University of Pennsylvania.
Monmeros ; di
Interacciones en el dmero
Hendidura de unin
ai inductor
Ncleo hidrfobo
Hlices
terminales C
Dos dmeros tor.ma.n un letrmero
Conjunto de
cuatro hlices
Las mutaciones identican los sitios funcionales
;s en la
interfase del dmero
tS en la hendidura -
inductora
Oligomerizacin
Oligomerizacin
c c
12.11 Un represor es un tetrmero formado por dos dmeros
311
Con estos datos se puede deducir el esquema
que se muestra en la FIGURA 12.U, la cual muestra la
forma en la que estn organizados los monmeros
en el tetrmero. Dos monmeros forman un dme-
ro por medio de contactos en el dominio nuclear 2
y en la hlice de oligomerizacin. El dmero tiene
dos dominios de unin al DNA en un extremo de
la estructura y a las hlices de oligomerizacin en
el otro extremo. Despus, dos dmeros forman un
tetrmero mediante interacciones en la interfase de
oligomerizacin.
El represor es un tetrmero formado por dos dmeros
Sitios de unin al DNA
Dominios
1
nucleares
2
Oligomerizacin
f
FIGURA 12.14 EL tetrmero represor est formado por dos
dmeros. stos se mantienen unidos por medio de contactos que
invoLucran a Los dominios 1 y 2 y por La hLice de oLigomeriza-
cin. Los dmeros estn Ligados en eL tetrmero por La interfase
de oLigomerizacin.
jll.l.HMI.IIMff
Los cascos se unen a giros sucesivos en el surco mayor
Ncleo
La unin del inductor cambia la conformacin en la
bisagra, por lo que los cascos no embonan en el surco
-Inductor
FIGURA 12.15 EL inductor cambia La estructura del ncleo de
tal manera que La hLice bisagra se desdobla y Las regiones HTH
del dmero represor ya no se encuentran en una orientacin que
permita La unin al DNA.
La unin al DNA es regulada
por un cambio alostrico
en la conformacin
Conceptos principales
EL dominio de unin aL DNA de cada monmero dentro
de un dmero se inserta en el surco mayor deL DNA.
La hlice bisagra se inserta en eL surco menor del DNA
operador.
Un represor activo tiene una conformacin en La cual
los dos dominios de unin aL DNA de un dmero pueden
insertarse en vueltas sucesivas de La doble hLice.
La unin del inductor interrumpe La hLice bisagra
y cambia la conformacin de tal manera que Los
dos sitios de unin al DNA no se encuentran en la
geometra correcta para hacer contactos simultneos.
Trabajos anteriores sugirieron un modelo en el cual
el casco es relativamente independiente del ncleo.
Puede unirse al DNA operador al formar el mismc
patrn de contactos con una mitad de sitio come
represor intacto. Sin embargo, su afinidad por el
DNA es numerosas rdenes de magnitud menor
que la del represor intacto. La razn de la diferencia
es que la forma dimrica del represor intacto per-
mite que dos cascos entren en contacto con el ope-
rador de manera simultnea y cada uno se enlaza i
una mitad de sitio. LariGURA 12.i: muestra que lo
dos dominios de unin al DNA de una unidad dim-
rica hacen contacto con el DNA al insertarse en giro<
sucesivos del surco mayor. Esto incrementa en gran
medida la afinidad por el operador. Un elemente
clave de la unin es la insercin de la hlice bisagfl
corta en el surco menor del DNA operador, lo que
une al DNA por -45

.
Este doblez orienta al surco
mayor para la unin del elemento HTH.
La unin del inductor ocasiona un cambio de
conformacin inmediato en la protena represora.
La unin de dos molculas de inductor al tetrmerc
represor es adecuada para liberar la represin. L
unin del inductor deteriora las hlices bisagra |
cambia la orientacin de los cascos en relacin con
el ncleo, lo cual ocasiona que los dos cascos de un
dmero ya no puedan unirse de manera simultnea
al DNA. Esto elimina la ventaja del represor multi-
mrico y reduce la afinidad por el operador.
Los fematpos mudantes
se coiTeladonaa
coa la estructura del dominio
Concepto principal
Diferentes tipos de mutaciones ocurren en dominios
distintos de la subunidad del represor.
312 CAPTULO 12 ELOpern
mutaciones en el represor Lac identificaron
r'dstencia de diferentes dominios incluso antes
:
ue se conociera la estructura. Ahora se puede
/car de manera ms cabal la naturaleza de las
naciones gracias a la referencia de la estructura,
"
3 se resume en la 12.16.
las mutaciones recesivas de tipo lacl~ pueden
urrir en cualquier lugar de la protena. En esen-
;
ualquier mutacin que desactive a la protena
-
:
r este fenotipo. El mapeo ms detallado de
as mutaciones que se observa en la estructura
sialina de la Figura 12.13 identifica los daos es-
trieos de algunas de estas mutaciones, como las
r afectan la oligomerizacin.
La clase especial de mutaciones lad dominan-
negativas se encuentra en el sitio de unin al
A de la subunidad represora (vase la seccin
.
9
, Las protenas multimricas tienen propiedades
d cas especiales). Esto explica su capacidad para
dir que los tetrmeros mixtos se unan al ope-
: r; una reduccin del nmero de sitios de unin
-
;
inuye la afinidad especfica por el operador. La
"
.cin de la regin terminal N en la unin espec-
:
al DNA tambin se demuestra por su localiza-
r. como el sitio donde tienen lugar mutaciones
unin fuerte
"
.
stas incrementan la afinidad del
resorpor el operador, en algunas ocasiones tanto
i no puede ser liberado por el inductor. Ocurren
poca frecuencia.
las mutaciones no inducibles lacF se mapean
;
ran medida en la regin del dominio nuclear 1
e extienden desde el sitio de unin al inductor
sta la bisagra. Un grupo se ubica en los aminoci-
:
que entran en contacto con el inductor, y estas
-
:adones funcionan al impedir la unin del induc-
as mutaciones restantes se encuentran en sitios
r deben participar en la transmisin del cambio
>sirico de la conformacin a la bisagra cuando se
r el inductor.
La protena represora
se une al operador
l:-ceptos principales
la protena represora se une a la secuencia de DNA de
ioble cadena del operador.
E
. operador es una secuencia palindrmica de 26 bp.
Cada repeticin invertida del operador se une al sitio
de unin al DNA de una subunidad represora.
epresor se aisl en un principio mediante la pu-
ncin del componente capaz de unir al inductor
mito IPTG. (La cantidad de represor que se en-
mra en la clula es demasiado pequea para ob-
er suficiente material; fue necesario utilizar una
Las mutaciones identifican los dominios del represor
Extremo N Sitios de las mutaciones
(dominante negativa; no
puede unirse al DNA)
/ac/s
(dominante;
no puede
/ac/- unirse al
(recesiva; induc,or)
no puede
reprimir)
Extremo C
FIGURA 12.16 Las ubicaciones de los tres tipos de mutaciones
en el represor de la lactosa se mapean en la estructura de la
protena. Los mutantes recesivos /ocJ" que no pueden reprimir
pueden mapearse en cualquier lugar de la protena. Los mu-
tantes dominantes negativos lacl'* que no pueden reprimir se
mapean en el dominio de unin al DNA. Los mutantes domi-
nantes IacP que no pueden inducir debido a que no se unen al
inductor o que no pueden experimentar el cambio alostnco
se mapean en el dominio nuclear 1.
mutacin aceleradora [ promotora] para incrementar
la transcripcin /ac/y para colocar a este locus laclen
una molcula de DNA presente en numerosas copias
por clula. Esto da como resultado una sobreproduc-
cin total de 100 a 1 000 veces mayor.)
El represor se une al DNA de doble cadena que
contiene la secuencia del operador lac de tipo silves-
tre. El represor no se une al DNA de un mutante O".
La adicin de IPTG libera al represor del DNA ope-
rador in vitro. La reaccin in vitro entre la protena
represora y el DNA operador, por lo tanto, exhibe
las caractersticas del control inferido in vivo; de este
modo, puede servir para establecer las bases de la
represin.
Cmo reconoce el represor la secuencia espe-
cfica del DNA operador? El operador tiene una ca-
racterstica que es comn a muchos sitios de recono-
cimiento para las protenas reguladoras bacterianas:
es un palndromo. Las repeticiones invertidas se
resaltan en la CI6URA 12.17. Cada repeticin puede
considerarse como una mitad de sitio del operador.
Se puede recurrir a los mismos mtodos utili-
zados en el anlisis de la interaccin polimerasa-
promotor para definir los puntos con los que hace
contacto el represor en el operador (vase la seccin
11.14, La polimerasa de RNA se une a una cara del
DNA). Las deleciones de material en cualquiera de
los lados definen los puntos terminales de la regin;
las mutaciones puntuales constitutivas identifican
12.14 La protena represora se une al operador
313
r lac tiene simetra da
RNAm
TGTTC3 TGTGGAATTGAG AGCG G A T A A C A A T T T C A C A 0 A
acaacacaccttaagactcgcctattgttaaagtgtgt!
-10 -5 +1 +5 +10 4-15 +20 +25
Eje de simetra
FIGURA 12.17 EL operador lac tiene una secuencia simtrica. La se-
cuencia se numera en relacin con el sitio de inicio de La transcripcin
en +1. Las flechas rosas a ambos Lados identifican Las dos repeticiones
diadas. Los bloques verdes indican Las posiciones de identidad.
Las mutaciones y los contactos qumicos I
las posiciones clave en el operador
Mutaciones constitutivas
A TGTTA
T ACAAT
C
G
T
A
Bases que entran en
contacto con el represor
TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCAGACA
ACAACACACCTTAACACTCGCCTrtTTGr7 AAGFG7G7
tttt f t ttttt t
Protegidas por el represor unido
-
10
-
5 +5
RNAm
+10 +15 +20 +25
sEie de simetra
FIGURA 12,18 Las bases que hacen contacto con el represor pueden
identificarse mediante entrecruzamiento qumico o por medio de ex-
perimentos que permitan observar si la modificacin impide La unin.
Identifican posiciones en las dos cadenas del DNA que se extienden
desde +1 hasta +23. Las mutaciones constitutivas ocurren en ocho
posiciones en el operador entre +5 y +17.
los pares de bases individuales que deben ser cru-
ciales. Los experimentos en los cuales se compara el
DNA unido al represor con el DNA no unido en lo
que se refiere a su susceptibilidad a la metilacin o
al entrecruzamiento con luz UV identifican las ba-
ses que estn protegidas o que son ms susceptibles
cuando estn asociadas a la protena.
La FIGURA 12.1c muestra que la regin del DNA
protegida de las nucleasas por el represor unido se
encuentra dentro de la regin de simetra, que abar-
ca una regin de 26 bp desde -5 hasta +21. El rea
identificada por mutaciones constitutivas es incluso
ms pequea. Dentro de una regin central, que se
extiende 13 bp desde +5 hasta +17, hay ocho sitios
en los cuales las sustituciones de pares de bases in-
dividuales provocan constitutividad. Esto subraya
la misma afirmacin hecha en tomo a las mutacio-
nes promotoras y que se resume antes en la Figura
11.29. Un nmero pequeo de contactos especficos esen-
ciales ubicados dentro de una regin ms extensa puede
encargarse de la asociacin de secuencia especfica del DNA
con la protena.
La simetra de la secuencia de DNA refleja la si-
metra en la protena. Cada una de las subunidade-
idnticas de un tetrmero represor tiene un sitio de
unin al DNA. Dos de estos sitios hacen contacto
con el operador de tal manera que cada repeticir_
invertida del operador forma el mismo patrn de
contactos con un monmero represor. Esto se de-
muestra por la simetra en los contactos que hace
el represor con el operador (el patrn entre +1 y +.:
es idntico a aquel que se encuentra en +21 y +16
y por la concordancia de las mutaciones constituti-
vas en cada repeticin invertida. (Sin embargo, a
operador no guarda una simetra perfecta; el las
izquierdo se une con mayor fuerza al represor que
el lado derecho. Se crea un operador ms fuerte por
una duplicacin invertida perfecta del lado izquier-
do y se elimina del par de bases central.)
[2g La unin del inductor libera
al represor del, operador
Concepto principal
.
La unin del inductor provoca un cambio en la
conformacin del represor que reduce su afinidad
por el DNA y lo libera del operador.
Varios inductores provocan reducciones caracters-
ticas de la afinidad del represor por el operador 1
vitro. Estos cambios se correlacionan con la efleacu
de los inductores in vivo. Esto sugiere que la induc-
cin es el resultado de una reduccin de la atraccir
entre el operador y el represor. Por lo tanto, cuand
el inductor entra a la clula, se une a represore<
libres y de hecho impide que encuentren a sus ope-
radores. Sin embargo, si se considera un tetrmer
represor que ya se encuentra unido con fuerza a_
operador. Cmo provoca el inductor que este re-
presor sea liberado?
En la FIGURA 12.19 se ilustran dos modelos de L;
accin del represor:
.
El modelo del equilibrio (lado izquierdo
exige que el represor unido al DNA se en-
cuentre en rpido equilibrio con el represo:
libre. El inductor se unira a la forma libre
del represor y as rompera el equilibrio I
evitar la reasociacin con el DNA.
.
Sin embargo, la velocidad con la que se df
soda el represor del operador es demasiad
lenta para ser compatible con este model
(la vida media in vitro en ausencia del ir:
ductor es >15 min). Esto significa que m
bien el inductor debe unirse de manera direa.
a la protena represora que forma un compm
con el operador. Como se indica en el modei
de la derecha, la unin del inductor debe
314 CAPITULO i- ELOpern
producir un cambio en el represor que lo
haga liberar al operador. De hecho, la adi-
cin de IPTG ocasiona una desestabilizacin
inmediata del complejo represor-operador
in vitro.
1-
a unin del complejo represor-IPTG al ope-
i puede estudiarse con concentraciones muy
la protena en el anlisis de proteccin/po-
cidcin de la metilacin. La gran cantidad de
-ina compensa la baja afinidad del complejo
G
-represor por el operador. El complejo forma
a mente el mismo patrn de contactos con el
que el represor libre. Un resultado anlogo
::
iene con represores motantes cuya afinidad
el DNA operador se incrementa; stos tambin
en el mismo patrn de contactos.
Hn general, una serie de variantes de represores
as afinidades por el operador se extienden siete
enes de magnitud hacen los mismos contactos
i el DNA. Los cambios en la afinidad del represor por
'
SA deben ocurrir, por lo tanto, al influir en la confor-
zsn general de la protena en la unin del DNA, no al
rr o deshacer uno o algunos enlaces individuales.
B El represor se une a tres
operadores e interacta
con la poLimerasa de RNA
-
ceptos principales
lada dmero localizado en un tetrmero represor puede
.
-
irse a un operador, de tal manera que eL tetrmero
:
jede unirse a dos operadores de forma simultnea.
-3 represin total requiere que el represor se una a
irro operador localizado en sentido descendente o
:'ondente
, as como al operador en el promotor lacZ.
-2 unin del represor al operador estimula la unin
Ie la polimerasa de RNA al promotor, pero impide la
vanscripcin.
modelos para la liberac
El inductor se une al
represor libre
para alterar el
equilibrio con
el represor
unido
* *
El inductor se une de
manera directa para
liberar al
represor
del
operador
FIGURA 12.; Se une el inductor al represor libre para alterar
un equilibrio (izquierda) o de manera directa al represor unido
al operador (derecha)?
FIGURA 12.20 Si los dos dmeros de un tetrmero represor
se unen al DNA, el DNA que se encuentra entre Los dos sitios de
unin se mantiene en un Lazo.
-
::ansicin alostrica que se deriva de la unin
aductor tiene lugar en el dmero represor. En-
ees, por qu se necesita un tetrmero para es-
ecer la represin total?
Cada dmero puede unirse a una secuencia ope-
adora. Esto le permite al represor intacto unirse
- s sitios operadores de manera simultnea. De
:
:ho, hay dos sitios operadores ms en la regin
-
:-al del opern lac. El operador original, 01, se
liLiza justo en el inicio del gen lacZ. Tiene la afi-
lad ms fuerte por el represor. Las secuencias
rradoras ms dbiles (en ocasiones denominadas
- -o
-operadores) se localizan a ambos lados; 02 se
:;
'
iza 410 bp en sentido descendente del punto
:
nido en lacZ y 03 se encuentra 88 bp en sentido
. endent con respecto a l en lacl.
La FIGURA 12.20 muestra lo que sucede cuando
una protena de unin al DNA puede adherirse en
forma simultnea a dos sitios distintos en el DNA. El
DNA que se encuentra entre los dos sitios forma un
lazo desde una base en donde la protena ha unido
a los dos sitios. La longitud del lazo depende de la
distanda entre los dos sitios. Cuando el represor Lac
se une de forma simultnea a 01 y a uno de los otros
operadores, hace que el DNA localizado entre ellos
forme un lazo bastante corto, lo que restringe de ma-
nera significativa la estructura del DNA. En la
12.21 se muestra un modelo a escala de la unin de
un represor tetramrico a dos operadores.
La unin a los operadores adicionales afecta el
nivel de la represin. La eliminacin del operador
que se encuentra en sentido descendente (02) o del
12.16 El represor se une a tres operadores e interacta con La polimerasa de RNA
315
El DNA forma un lazo entre los represores
I
Cuando un tetrmero represor se une a dos
operadores, el fragmento de DNA que se encuentra entre ellos
forma un lazo ajustado. (La estructura azul localizada en el
centro del lazo de DNA representa la CAP, la cual es otra pro-
tena reguladora que se une a esta regin). Imagen reproducida
con autorizacin de Lewis, M., etal. 1996. Science. 271: cover.
1996 AAAS
. Fotografa cortesa de Ponzy Lu, University of
Pennsylvania.
operador localizado en sentido ascendente (03) re-
duce la eficiencia de la represin de dos a cuatro ve-
ces. Sin embargo, si se eliminan 02 y 03, la eficacia
de la represin se reduce 100 veces. Esto sugiere que
la capacidad del represor para unirse a uno de los dos otros
operadores, as como a 01, es importante para estabilizar
la represin. Los experimentos in vitro con plsmidos
superenrollados que contienen mltiples operado-
res demuestran una estabilizacin significativa del
complejo /flci-DNA. No obstante, estas molculas de
DNA en forma de lazo son liberadas con rapidez por
la unin de lacl a IPTG.
Tambin se conocen los efectos directos de la
unin del represor al operador (07). En un princi-
pio se pensaba que la unin del represor obstrua la
unin de la polimerasa de RNA al promotor. Ahora
se sabe que estas dos protenas pueden unirse al
DNA de forma simultnea y que la unin del represor
de hecho potencia la unin de la polimerasa de RNA. Sin
embargo, a la enzima unida se le impide iniciar la
transcripcin.
La constante de equilibrio de la polimerasa de
RNA que se une sola al promotor lac es de 1.9 x
107 M-1. La presencia del represor incrementa esta
constante dos rdenes de magnitud a 2.5 x 10
9 M-1
.
En trminos de los lmites de valores de la constante
de equilibrio K
B
dada en la Figura 11.20, la protena
represora convierte de manera eficaz la formacin
de los complejos cerrados por la polimerasa de RNA
en el promotor lac de una interaccin dbil a una
interaccin fuerte.
Qu significa esto para la induccin del ope-
rn? El valor ms alto de la K
B
significa que, cuando
est ocupado por un represor, el promotor es 100
veces ms propenso a unirse a una polimerasa de
RNA. Adems, al permitir que la polimerasa de RNA
se una al mismo tiempo que el represor, es posible
que la transcripcin comience en cuanto tiene lugar
la induccin en vez de esperar a que una polimerasa
de RNA sea capturada.
El represor en efecto provoca que la polimerasa
de RNA sea almacenada en el promotor. El comple-
jo polimerasa de RNA-represor-DNA es bloqueadr
en el estado cerrado. Cuando se agrega el induc-
tor, el represor es liberado y el complejo cerrado
se transforma en un complejo abierto que inicia la
transcripcin. El efecto global del represor consiste
en acelerar el proceso de induccin.
Es posible aplicar este modelo a otros sistemas?
La interaccin entre la polimerasa de RNA, el re-
presor y la regin promotora/operadora es distinta
en cada sistema, debido a que el operador no siem-
pre se superpone en la misma regin del promotor
(vase la Figura 12.26). Por ejemplo, en el fago, el
operador se encuentra en la regin ubicada en sen-
tido ascendente con respecto al promotor y la unin
del represor obstruye la unin de la polimerasa de
RNA (vase el Captulo 14, Estrategias de los fagos i.
Por lo tanto, un represor unido no interacta con
la polimerasa de RNA de la misma forma en todos
los sistemas.
E2B represor sienrpre est unido
aL DNA
Conceptos principales
.
Las protenas que tienen gran afinidad por una
secuencia especfica de DNA tambin tienen una
afinidad baja por otras secuencias del DNA.
.
Cada par de bases localizado en el genoma bacteriano
es el inicio de un sitio de unin de baja afinidad para
el represor.
.
El gran nmero de sitios de baja afinidad garantiza que
toda la protena represora est unida al DNA.
.
EL represor se une al operador al desplazarse desde un
sitio de baja afinidad en vez de hacerlo al equilibrarse
en la solucin.
Es probable que todas las protenas con gran afini-
dad por una secuencia especfica tambin posear.
una baja afinidad por cualquier secuencia (aleato-
ria) de DNA. Un gran nmero de sitios de baja afini-
dad competirn tan bien por un tetrmero represor
como un pequeo nmero de sitios de alta afinidad
Hay slo un sitio de alta afinidad en el genoma de
E
. coli: el operador. El resto del DNA proporciona
sitios de baja afinidad. Cada par de bases del gea
noma comienza un nuevo sitio de baja afinidad
316 CAPTULO 12 ELOpern
Represor + DNA= Represor-DNA
El equilibrio de la unin del represor al DNA
(aleatorio) se describe con la ecuacin:
K4 = :
[Represor-DNAj
[Represor ilbrej [DNA]
La proporcin de represor libre se obtiene al
despejar la ecuacin:
[Represor libre] 1
[Represor-DNA] KA x [DNA]
URA 12.22 La unin del represor a sitios aleatorios se rige
una ecuacin de equilibrio.
Ho movindose un par de bases por el genoma,
-
ra de fase con el operador mismo, crea un sitio
baja afinidad.) Por lo tanto, hay 4.2 x 106 sitios
baja afinidad.
El gran nmero de sitios de baja afinidad signi-
;
que, incluso en ausencia de un sitio de unin
ecfico
, todos, o casi todos, los represores estn
dos al DNA y ninguno se encuentra libre en so-
n. La FIGURA 12.22 muestra cmo la ecuacin
nteada para describir el equilibrio entre el re-
sor libre y el represor unido al DNA puede rees-
durarse para proveer la proporcin de represor
Si se aplican los parmetros del sistema lac, se
erva que:
.
La constante de unin de equilibrio no es-
pecfica esKA = 2 x lO'M-1.
.
La concentracin de los sitos de unin no
especficos es 4 x 106 en un volumen bacte-
riano de 10"15 L, lo cual corresponde a una
[DNA] = 7 x 10"3 M (una concentracin de-
masiado alta).
Al sustituir estos valores se obtiene: repre-
libre/unido = 10"4.
Por lo tanto, todo el represor, excepto el 0.01 %, est
.io al DNA (aleatorio). Puesto que hay -10 mol-
is de represor por cada clula, esto es equivalen-
~
-
decir que no hay protena represora libre. Esto
"
e una repercusin importante en la interaccin
represor con el operador: significa que hay un
~
o por la particin del represor en el DNA, en la
i- el sitio de alta afinidad individual del opera-
:
:ompite con un gran nmero de sitios de baja
oad.
En esta competencia los valores absolutos de las
atantes de asociacin para el operador y el DNA
;:
orio no son importantes; lo que es importante
2 proporcin de /
p
(la constante de unin a un
, especfico) con respecto a K
nsp
(la constante de
ki a cualquier secuencia de DNA aleatoria), es
Br, la especificidad.
EL operador compite
con Los sitios de baja afinidad
para unirse aL represor
Conceptos principales
En ausencia de inductor, el operador tiene una afinidad
por el represor que es 107 veces mayor que la de un
sitio de baja afinidad.
El nivel de 10 tetrmeros represores por clulas asegura
que el operador est unido al represor 95% del tiempo.
La induccin reduce la afinidad por el operador a lO4
veces la de los sitios de baja afinidad, por lo que slo
3% de los operadores estn unidos.
La induccin hace que el represor se mueva
del operador a un sitio de baja afinidad por
desplazamiento directo.
Estos parmetros podran cambiarse con un incremento
o reduccin de la concentracin efectiva de DNA in vivo.
Se pueden definir los parmetros que influyen en
la capacidad de una protena reguladora de satu-
rar su sitio diana si se comparan las ecuaciones de
equilibrio de la unin especfica y de la unin no
especfica. Como puede deducirse de manera intui-
tiva, los parmetros importantes son:
.
El tamao del genoma disminuye la capa-
cidad de una protena para unirse a sitios
diana especficos.
.
La especificidad de la protena contrarresta
el efecto de la masa del DNA.
.
La cantidad de protena necesaria aumenta
con la cantidad total de DNA en el genoma
y disminuye con la especificidad.
.
La cantidad de protena tambin debe exce-
der de un modo razonable el nmero total
de sitios diana especficos, por lo que se es-
pera encontrar reguladores con numerosas
dianas en cantidades mucho mayores que
los reguladores con pocas dianas.
La FIGURA 12.23 compara las constantes de equi-
librio de la unin operador/represor lac con la unin
represor/DNA general. A partir de estas constantes,
se puede deducir cmo se divide el represor entre
el operador y el resto del DNA y qu sucede con el
represor cuando el inductor hace que se disocie del
operador.
El represor se une ~107 veces mejor al DNA
operador que a cualquier secuencia aleatoria de
DNA de la misma longitud. Por lo tanto, el operador
comprende un solo sitio de alta afinidad que com-
petir por el represor 10
7
veces mejor que cualquier
sitio de afinidad baja (aleatorio). Cmo garantiza
esto que el represor pueda mantener un control efi-
caz del opern?
12.18 El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor 317
El represor se une de manera especifica
al DNA operador
DNA
Represor Represor + inductor
Operador 2 x 1013 2 x 1010
Otro DNA 2 x 106 2x 106
Especificidad 107 104
Operadores unidos 96% 3%
El operan es; reprimido
inducido
EL represor Lac se une con fuerza y de manera
especfica a su operador, pero es Liberado por eL inductor. Todas
Las constantes de equilibrio estn en M-1.
El represor afecta los sitios en los cuales
el represor est unido en el DNA
MANTENIMIENTO DE LA REPRESIN
El represor est > Represor en exceso
N
unido al operador \ unido a cualquier otro
\ lugar del DNA
I
Inductor
INDUCCION
El represor es liberado del operador y
todos los represores estn unidos a sitos * *
aleatorios en el DNA
Retiro del inductor
ESTABLECIMIENTO DE LA REPRESIN
El represor regresa a la forma 'a
activa y se desplaza de un sitio f
aleatorio al operador por medio
de deslizamiento o de
desplazamiento directo
J
Casi todo eL represor que se encuentra en La cLuLa est
unido aL DNA.
Si se recurre a la especificidad, se puede calcular
la distribucin entre los sitios aleatorios y el operador
y expresarse en trminos de ocupacin del operador.
Si hay 10 molculas de represor lac por clula, con
una especificidad por el operador de 107, el operador
estar unido al represor 96% del tiempo. La funcin
de la especificidad explica dos caractersticas de la
interaccin operador-represor lac:
.
Cuando el inductor se une al represor, la
afinidad por el operador se reduce ~103 ve-
ces. La afinidad por las secuencias generales
del DNA permanece sin alteraciones. Por lo
tanto, la especificidad ahora es de slo 104,
la cual es insuficiente para capturar al re-
presor contra la competencia con el exceso
de 4.2 x 106 de los sitios de baja afinidad.
Slo 3% de los operadores estaran unidos
en estas condiciones.
.
Las mutaciones que reducen 20 o 30 ve-
ces la afinidad del operador por el represor
tienen el efecto suficiente para ser consti-
tutivas. Dentro del genoma, los operado-
res matantes pueden ser superados por la
preponderancia de los sitios aleatorios. La
ocupacin del operador disminuye a -50%
si la especificidad del represor se reduce -10
veces.
La consecuencia de estas afinidades es que, en
una clula no inducida, un tetrmero represor suele
estar unido al operador. Todos, o casi todos, los te-
trmeros restantes estn unidos de manera aleatoria
a otras regiones del DNA, como se ilustra en la FIGU-
. Es probable que haya muy pocos o ningn
tetrmero represor libre dentro de la clula.
La adicin del inductor inhibe la capacidad del
represor para unirse de manera especfica al ope-
rador. Aquellos represores unidos al operador son
liberados y se unen a sitios aleatorios (de baja afini-
dad). Por lo tanto, en una clula inducida, los tetr-
meros estn
"
almacenados
"
en sitios aleatorios del
DNA. En una clula no inducida, un tetrmero est
unido al operador, mientras que las molculas re-
presoras restantes se unen a sitios no especficos. Por
lo tanto, el efecto de la induccin es cambiar la distribucir.
del represor en el DNA, en vez de generar represor libre.
Cuando el inductor es retirado, el represor re-
cupera su capacidad para unirse en forma especfica
al operador y lo hace con mucha rapidez. Esto debe
involucrar su desplazamiento a partir de un sitio de
"
almacenaje
"
no especfico en el DNA. Qu meca-
nismo se utiliza para este desplazamiento rpido?
La capacidad de unirse al operador en forma rpida
no es congruente con el tiempo que se necesita-
r para realizar mltiples ciclos de disociacin y de
reasociacin con los sitios no especficos del DNA.
La discrepancia excluye a los mecanismos de im-
pactos aleatorios para encontrar al operador, lo cua;
sugiere que el represor puede moverse de manera
directa desde un sitio aleatorio del DNA hasta el
operador. Esta es la misma situacin que se observ
antes con la capacidad de la polimerasa de RNApara
encontrar sus promotores (vanse la Figura 11.22 y
la Figura 11.23). La misma solucin es probable: .
movimiento puede lograrse si se reduce la dimen-
sionalidad de la bsqueda al deslizarse a lo largo de!
DNA o por desplazamiento directo de un sitio a otro
318
CAPTULO 12 ElOpern
mo se indica en la Figura 12.24). Una reaccin
desplazamiento puede facilitarse con la presen-
de ms sitios de unin por tetrmero (cuatro) de
que son de hecho necesarios para contactar al
A en un momento dado (dos).
Los parmetros implicados en la localizacin de
operador de alta afinidad en competencia con
chos sitios de baja afinidad plantean un dilema
a el represor. En condiciones de represin, debe
.
er una especificidad alta por el operador. Sin
bargo, en condiciones de induccin, esta espe-
cidad debe eliminarse. Por ejemplo, supngase
e hay 1 000 molculas de represor por clula: solo
4% de los operadores estaran libres en condicio-
de represin. No obstante, tras la induccin slo
:
o de los operadores estaran desocupados. Por
:anto, se observa una correlacin inversa entre
capacidad de lograr la represin completa y la
acidad de liberar la represin de manera eficaz.
asume que el nmero de represores sintetizados
vo ha estado sujeto a fuerzas selectivas que equi-
p
n estas demandas.
La diferencia in vivo en la expresin del opern
'
a lactosa entre su estado inducido y su estado
rimido es de 103 veces. En otras palabras, incluso
ando el inductor est ausente, hay un nivel basal
expresin de -0.1% del nivel inducido. Dicho
r; disminuira si hubiera ms protena represora
-
crementara si hubiera menos. Por lo tanto, sera
posible establecer una represin contundente si
iera menos represores que los 10 que se en-
r
-
tran en cada clula, y podra dificultarse la in-
;
cin del opern si hubiera demasiados. Es posi-
1 intr
oducir el sistema represor-operador lac en el
B] Cuando el operador laces conectado a un gen
ortero de tirosinasa
, la enzima es inducida por la
:
in de IPTG. Esto significa que el represor est
centrando su diana en un genoma 103 veces ms
nde que el de E. coli. La induccin ocurre aproxi-
: ament con la misma concentracin de IPTG
r en las bacterias. Sin embargo, se desconoce la
"
:entracin del represor Lac y la eficiencia con
.Mal se induce la diana.
Para extrapolar in vivo a partir de la afinidad de
:
-
interaccin DNA-protena in vitro, es necesario
"
.
cer la concentracin efectiva de DNA in vivo.
concentracin efectiva
"
difiere de la masa/volu-
I debido a numerosos factores. La concentracin
ctiva aumenta, por ejemplo, por el hacinamien-
molecular, el cual ocurre cuando los cationes
avalentes neutralizan a -90% de las cargas del
A y el cido nucleico se colapsa en estructuras
iensadas. La fuerza principal que disminuye la
"
rentracin efectiva es la inaccesibilidad del DNA
"
ada de la oclusin o del secuestro por parte de
:
-
'
Otenas de unin al DNA.
Una manera de determinar la concentracin
efectiva es comparar la velocidad de una reaccin
in vitro e in vivo que dependa de la concentracin de
DNA. Esto se ha realizado utilizando recombinacin
intermolecular entre dos molculas de DNA. Para
proporcionar un control, la misma reaccin es se-
guida como una recombinacin intramolecular, es
decir, los dos sitios recombinantes son presentados
en la misma molcula de DNA. Se asume que la
concentracin es la misma in vivo e in vitro para la
reaccin intramolecular y por lo tanto cualquier dife-
rencia en la proporcin de las velocidades de recom-
binacin intermolecular/intramolecular puede atri-
buirse a un cambio de la concentracin efectiva in
vivo. Los resultados de dicha comparacin sugieren
que la concentracin efectiva del DNA disminuye
ms de 10 veces in vivo.
Esto podra afectar la velocidad de las reacciones
que dependen de la concentracin de DNA, como la
recombinacin del DNA y la unin protena-DNA.
Esta situacin destaca el problema que enfrentan
todas las protenas de unin al DNA para encontrar
sus dianas con la velocidad suficiente y refuerza la
conclusin de que la difusin no es adecuada (vase
la Figura 11.22).
La represin puede suceder
en muLtipLes Loci
Concepto principal
e Un represor actuar en todos los loci que tengan una
copia de su secuencia operadora diana.
El represor lac acta slo en el operador del agru-
pamiento lacZYA. Sin embargo, algunos represores
controlan los genes estructurales dispersos si se
unen a ms de un operador. Un ejemplo es el re-
presor trp, el cual controla tres conjuntos de genes
no vinculados:
.
Un operador localizado en el agrupamiento
de los genes estructurales trpEDBCA contro-
la la sntesis coordinada de las enzimas que
sintetizan el triptfano a partir del cido co-
rsmico.
.
Un operador que se encuentra en otro locus
controla el gen aroH, el cual codifica una de
las tres enzimas que catalizan la reaccin
inicial de la ruta comn de la biosntesis de
aminocidos aromticos.
.
El gen regulador trpR es reprimido por su
propio producto, el represor trp. Por lo tan-
to, la protena represora acta para reducir
su propia sntesis. Este circuito es un ejem-
plo de control autgeno. Dichos circuitos
12.19 La represin puede suceder en mltiples loci
319
Los operadores de TrpR tienen secuencias relaci
Regin operadora-
aroH GCCGAATGTACTAGAGAACTaGTGCATTAGGCTTATTTTTTTGTTATCATGCTAA
,
RNAm
trp lAATGATCGAACTAGTTAAGTAGTAGGCA
RNAm
trpR TGCtATGGTAGTCTTTAGCGAGTACAAGG
RNAm
FIGURA 12.25 El represor trp reconoce a los operadores en los tres loci. Las bases conservadas
se muestran en color rojo. La localizacin del punto de inicio del RNAm vara, como lo indican
las flechas negras.
Los operadores estn cerca del promotor
Punto de inicio
gal
aroH
lac
-Promotora
Ubicaciones del
operador
FIGURA 12.26 Los operadores pueden estar en varias posicio-
nes con respecto al promotor.
DNA especfica reconocida por el represor (del mismo
modo como cada promotor comparte secuencias de
consenso con otros promotores).
La FIGURA 12.2o resume la variedad de relaciones
entre los operadores y los promotores. Una caracte-
rstica notoria de los operadores dispersos reconoci-
dos por TrpR es su presencia en diferentes localiza-
ciones dentro del promotor en cada locus. En trpR d
operador se encuentra entre las posiciones -12 y -i-1
en tanto que en el opern trp ocupa las posiciones
-
23 a -3. En el locus aroB. se encuentra ms lejos er
sentido ascendente, entre -49 y -29. En otros case
el operador se encuentra en sentido descenden:;
con respecto al promotor (como en lac) o al pareced
justo en sentido ascendente del promotor (como er.
gal, del cual la naturaleza del efecto represivo no I
muy clara). La capacidad que tienen los represores
para actuar en operadores cuyas posiciones son di-
ferentes en cada promotor diana sugiere que podr
haber diferencias en la forma exacta de represin; la
caracterstica comn es que se impide a la polimera-
sa de RNA iniciar la transcripcin en el promotor.
son bastante comunes en los genes regu-
ladores y pueden ser negativos o positivos
(vase la seccin 12.23, La sntesis de las
protenas r es controlada por medio de re-
gulacin autgena, y la seccin 14.15, El
represor mantiene un circuito autgeno).
Una secuencia operadora relacionada de 21 bp
est presente en cada uno de los tres loci en los
cuales acta el represor trp. La conservacin de la
secuencia se indica en la FIGURA 12.25. Cada ope-
rador tiene una simetra diada apreciable (pero no
idntica). Las caractersticas conservadas en los tres
operadores incluyen los puntos importantes de con-
tacto para el represor trp. Esto explica la manera de
actuar de una protena represora en numerosos loci:
cada locus posee una copia de una secuencia de unin al
EL AMP cclico es un efector
que activa aL factor CRP
para que acte en mLtipLes
operones
Conceptos principales
.
CRP es una protena activadora que se une a una i
secuencia diana en un promotor.
Un dmero de CRP es activado por una sola molcula de
AMP cclico.
Hasta ahora se ha considerado al promotor como
una secuencia de DNA capaz de unirse a la polime-
rasa de RNA, la cual inicia entonces la transcripcin
320
CAPTULO 12 El Opern
"
embargo, hay algunos promotores en los cuales
: .imerasa de RNA no puede iniciar la transcrip-
sin la asistencia de una protena auxiliar. Dichas
:
enas son reguladores positivos, debido a que
; resela es necesaria para activar la unidad de
"
=cripcin. Por lo general, el activador supera una
rienda en el promotor, por ejemplo, una mala
r
.
:enda de consenso localizada en -35 o en -10.
Uno de los activadores de actuacin ms amplia
vna protena denominada activador CRP que
"
:
rola la actividad de un gran conjunto de ope-
res en E. coli. La protena es un factor de control
"
itivo cuya presencia es necesaria para iniciar la
inscripcin en promotores dependientes. La CRP
activa slo en presencia de AMP cclico, el cual acta
.T.o una pequea molcula inductora clsica para
;
ontrol positivo (vase la FIGURA 12.27; parte de-
.
:na superior).
El AMP cclico es sintetizado por la enzima ci-
masa de adenilato
.
La reaccin utiliza el ATP como
trato e introduce una ligadura 3
'
-
5
'
por medio de
..aces fosfodister, el cual genera la estructura de
ti FIGURA 12.28. Las mutaciones que se presentan en
-
;en que codifica la ciclasa de adenilato {cya~) no
rponden a cambios en los niveles de glucosa.
El nivel de AMP cclico se relaciona de manera
"
versa con el nivel de glucosa. La base de este efec-
:
radica dentro del mismo componente del sistema
Bs que se encarga del control de la absorcin de la
;
nosa. La forma fosforilada de la protena IIAGk es-
.
.
nula la ciclasa de adenilato. Cuando la glucosa es
mportada, la desfosforilacin de IIAGlc conduce a un
Icscenso de la actividad de la ciclasa de adenilato.
La FIGURA 12.29 muestra que la reduccin del
"
;
vel del AMP cclico hace que la protena (tipo sil-
vestre) sea incapaz de unirse a la regin de control,
;
cual a su vez impide que la polimerasa de RNA
.
"
.
icie la transcripcin. Por lo tanto, el efecto de la
.. .
icosa en la reduccin de los niveles de AMP deli-
ro es privar a los operones relevantes de un factor
le control indispensable para su expresin.
EL factor CRP funciona
de formas diferentes
en operones diana distintos
Conceptos principales
CRP introduce un giro de 90 en el DNA en su sitio de
unin.
Los sitios de unin al CRP se encuentran en
ubicaciones muy variables con respecto al promotor.
CRP interacta con la polimerasa de RNA, pero los
detalles de la interaccin dependen de las ubicaciones
relativas del sitio de unin al CRP y del promotor.
La induccin y la represin pueden estar
bajo control positivo o negativo
CONTROL NEGATIVO
8
D
Q
Z
1
Represor
REPRIMIDA
CONTROL POSITIVO
.y\/\ y\X
_
RNA polimerasa
Represor
Q inactivo
inductor
iNDUCiDA
Activador I Activador
inactivo | activo
Inductor
REPRiMIDA iNDUCiDA
xxxx
tu
ce
LU
c
Represor " Represor
inactivo activo
Correpresor
iNDUCiDA REPRiMiDA
Activador
active
INDUCIDA
Activador
inactivo
Correpresor
REPRIMIDA
FIGURA 12.27 Los circuitos de control son verstiles y pueden crearse
para permitir el control positivo o negativo de la induccin o de la
represin.
El AMP cclico tiene enlaces 5'-p-3'
5
'
O -CH2 q Adenina
FIGURA 12.28 El AMP cclico tiene un solo grupo fosfato co-
nectado a las posiciones 3
'
y 5' del anillo de azcar.
El factor CRP se une al DNA y los complejos de
AMP cclico-CRP-DNA pueden ser aislados en cada
promotor en el cual funciona. El factor es un d-
mero de dos subunidades idnticas de 22.5 kD
,
el
cual puede ser activado por una sola molcula de
AMP cclico. Un monmero de CRP contiene una
regin de unin al DNA y una regin activadora de
la transcripcin.
Un dmero de CRP se une a un sitio de -22 bp
en un promotor reactivo. Los sitios de unin inclu-
yen variaciones de la secuencia de consenso que se
.12;21 El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos
321
La glucosa reduce la actividad de la CRP
Glucosa
ai
*
i
H
CRP activa
i
-
V
.
[
: red
l
AMPc reducido
CRP inactiva
Transcripcin
ausente
FIGURA 12.29 AL reducir el nivel de AMP cclico, la glucosa
inhibe la transcripcin de los operones que requieren la acti-
vidad de la CRP.
La CRP se une a una secuencia de consenso
Transcripcin
)
NTGT .N N T N N Ntifi \T TN N
;NAC A CTNiNN NN "
Pentmero con
un nivel alto de
conservacin
Pentmero menos
conservado
FIGURA 12.30 La secuencia de consenso de la CRP contiene
el pentmero bien conservado TGTGA y (en ocasiones) una in-
versin de esta secuencia (TCANA).
La CRP pliega al DNA
Centro de
simetra diada
Angulo del pliegue >90
FIGURA 12. La CRP dobla el DNA >900 alrededor del centro
de simetra.
muestra en la flGURA 30. Las mutaciones que im-
piden la accin de la CRP suelen localizarse dentro
del pentmero bien conservado
"
el cual pa- F
ACACT
rece ser el elemento esencial en el reconocimien-
to. El factor CRP se une con mayor fuerza a los
sitios que contienen dos versiones (invertidas) del
pentmero debido a que esto permite a las dos sub-
unidades del dmero unirse al DNA. Sin embargo.
numerosos sitios de unin carecen del segundo
pentmero y en stos la segunda subunidad debe
unirse a una secuencia diferente (si se une al DNAB
La jerarqua de las afinidades de unin por la CRP
ayudan a explicar porqu genes diferentes son acti-
vados por niveles distintos de AMP cclico in vivo.
La CRP introduce un gran doblez cuando se
une al DNA. En el promotor lac, este punto se en-
cuentra en el centro de la simetra diada. El doblez
es bastante pronunciado, >90
o
<
como se ilustra er.
el modelo de la FIGURA 12.3 i. Por lo tanto, hay ur.
cambio drstico en la organizacin del DNA de do-
ble hlice cuando se une la CRP. El mecanismo de
doblamiento consiste en introducir un doblez agu-
do en la secuencia de consenso TGTGA. Cuand.
hay repeticiones invertidas del consenso, los do;
dobleces en cada copia presentes en un palndro-
mo provocan el doblez general de 90

. Es posible
que el pliegue tenga algn efecto directo sobre la
transcripcin, pero podra ser que se necesitara tan
slo para permitir que la CRP hiciera contacto co-
la polimerasa de RNA en el promotor.
La accin de la CRP tiene la caracterstica nota-
ble de que sus sitios de unin se encuentran en ubi-
caciones distintas en relacin con el punto de inidi"
en los diversos operones que regula. El pentmcn
TGTGA puede encontrarse en cualquier orientacin
Los tres ejemplos que se resumen en la FIGURA 12.32
abarcan el intervalo de las localizaciones.
.
El sitio de unin a la CRP es adyacente ai
promotor, como en el opern lac, en el cuai
la regin de DNA protegida por la CRP se
centra en -61. Es posible que dos dmeros
de CRP estn unidos. El patrn de unin es
congruente con la presencia de CRP sobre
todo en una cara del DNA, la cual es la mis-
ma cara a la cual se adhiere la polimerasa de
RNA. Esta localizacin ubicar una proteru
justo al alcance de la otra.
.
En algunas ocasiones el sitio de unin a
la CRP se encuentra dentro del promotor
como en el locus gal, en donde el sitio de
unin a la CRP est centrado en la posicin
-
41. Es probable que slo un dmero de CRP
est unido, tal vez en contacto muy cercano
con la polimerasa de RNA, debido a que
sitio de unin a la CRP se extiende profun
damente en la regin protegida en genera
por la polimerasa de RNA.
.
En otros operones, el sitio de unin a la CRF
se encuentra bastante lejos del promotor en
sentido ascendente. En la regin ara, el sitia
de unin para una sola CRP est lo ms lejl
322
CAPTULO 12 El Opern
posible del punto de inicio, centrado en la
posicin -92.
La dependencia de la CRP se relaciona con la
eficiencia intrnseca del promotor. Ningn pro-
motor dependiente de la CRP tiene una secuencia
?uena -35 y algunos tambin carecen de secuen-
cias buenas -10. De hecho, se puede afirmar que
i control efectivo provisto por la CRP sera difcil
i el promotor tuviera regiones efectivas -35 y -10
;
ue interactuaran de manera independiente con la
olimerasa de RNA.
En principio hay dos formas en las cuales la
IRP puede activar la transcripcin: podra interac-
vaar en forma directa con la polimerasa de RNA o
podra actuar en el DNA para cambiar su estructura
ie una manera tal que ayudara a la polimerasa de
RNA a unirse. De hecho, la CRP tiene efectos en la
polimerasa de RNA y en el DNA,
Los sitios de unin para la CRP en la mayor
parte de los promotores se asemejan a lac (centrado
en la posicin -61) o a gal (centrado en la posicin
11). La diferencia bsica entre ellos es que en el
primer tipo (denominado clase I) el sitio de unin
| la CRP se encuentra completamente en sentido
ascendente con respecto al promotor, mientras que
en el segundo tipo (denominado clase II) el sitio
de unin a la CRP se superpone al sitio de unin
de la polimerasa de RNA. (Las interacciones en el
promotor ara pueden ser diferentes.)
En ambos tipos de promotor, el sitio de unin a
E CRP se centra en un nmero integral de vueltas
de la doble hlice desde el punto de inicio. Esto su-
giere que la CRP est unida a la misma cara del DNA
que la polimerasa de RNA. Sin embargo, la natura-
leza de la interaccin entre la CRP y la polimerasa
le RNA es diferente en los dos tipos de promotor.
Cuando la subunidad a de la polimerasa de RNA
presenta una delecin en el extremo C, la transcrip-
16n parece ser normal excepto porque pierde la
;
apacidad de ser activada por la CRP. Esta ltima
:
iene una "regin activadora" que es necesaria para
activar sus dos tipos de promotores. Esta regin ac-
tivadora, la cual est formada por un lazo expuesto
de ~I0 aminocidos, es un parche pequeo que in-
teracta de manera directa con la subunidad a de
la polimerasa de RNA para estimular a la enzima.
En los promotores de clase I esta interaccin es sufi-
ciente. En los promotores de clase II se requiere una
segunda interaccin, la cual involucra otra regin
de la CPR y la regin terminal N de la subunidad ex
de la polimerasa de RNA.
Los experimentos que se han realizado con d-
meros de CRP en los cuales slo una de las sub-
unidades tiene una regin funcional de transcrip-
cin-activacin muestran que cuando la CRP est
unida al promotor lac, slo es necesaria la regin
Los sitios de unin a la CRP est
cerca del promotor
Punto de inicio
gal il i\r\A\
-Promotor -
(
Localizaciones de la
>
unin a la CRP
FIGURA 12. La protena CRP puede unirse a diferentes sitios
en relacin con la polimerasa de RNA.
activadora de la subunidad ms cercana al punto de
inicio, al parecer debido a que hace contacto con la
polimerasa de RNA. Esto explica que no haya una
dependencia de la orientacin del sitio de unin: la
estructura dimrica de la CRP garantiza que una de
las subunidades est disponible para hacer contacto
con la polimerasa de RNA, sin importar qu subuni-
dad se una al DNA y en qu orientacin.
El efecto ejercido sobre la unin de la polime-
rasa de RNA depende de las localizaciones relativas
de las dos protenas. En los promotores de clase I,
en donde la CRP se une adyacente al promotor,
aumenta la velocidad de la unin inicial para formar
un complejo cerrado. En los promotores de clase
n
, en donde la CRP se une dentro del promotor,
aumenta la velocidad de la transicin del complejo
cerrado al complejo abierto.
La traduccin
puede ser regulada
Conceptos principales
Una protena represora puede regular la traduccin
al impedir que un ribosoma se una a un codn de
iniciacin.
La accesibilidad a los codones de iniciacin en un
RNAm policistrnico puede ser controlada por medio de
cambios en la estructura del RNAm los cuales ocurren
como resultado de la traduccin,
El control de la traduccin es una caracterstica no-
toria de los operones que codifican componentes
del mecanismo de la sntesis de protenas. El opern
proporciona un arreglo para la regulacin coordinada
de un grupo de genes estructurales. Sin embargo,
controles posteriores superpuestos en el opern,
como los del nivel de la traduccin, pueden crear
diferencias en el grado al cual se expresan los genes
individuales.
12.22 La traduccin puede ser regulada
323
Se utiliza un mecanismo similar para lograr el
control de la traduccin en numerosos sistemas. La
funcin del represor la proporciona una protena que se
enlaza a una regin diana del RNAm para impedir que
los ribosomas reconozcan la regin de la iniciacin. En
trminos formales esta situacin es equivalente a la
de una protena represora que se une al DNA para
evitar que la polimerasa de RNA utilice un promo-
tor. La FIGURA 12.33 ilustra la forma ms frecuente
de esta interaccin, en la cual la protena reguladora
se une de manera directa a una secuencia que in-
cluye al codn de iniciacin AUG, lo que impide la
unin del ribosoma.
En la FIGURA 12.34 se ofrecen algunos ejemplos
de represores de la traduccin y de sus dianas. Un
ejemplo clsico es la protena de envoltura del fago
de RNA R17; sta se une a una horquilla que se
extiende sobre el sitio de unin al ribosoma en el
RNAm del fago. De forma similar, la protena RegA
T4 se une a una secuencia de consenso que incluye
al codn de iniciacin AUG en numerosas molcu-
las tempranas de RNAm T4, y la polimerasa de DNA
T4 se une a una secuencia en su propio RNAm que
incluye el elemento Shine-Dalgarno indispensable
para la unin de los ribosomas.
il'lili-linliri.'Miill
Sitio de unin reguladora-
NNNNNNNNNNNNNINW.AUGlINNNMNNNkJNNNNNNN
. Sitio de unin al ribosoma.
FIGURA 12.33 Una protena reguladora puede bloquear la tra-
duccin al unirse a un sitio del RNAm que se superpone al sitio
de unin al ribosoma en el codn de iniciacin.
Otra forma de control de la traduccin ocurre
cuando la traduccin de un cistrn requiere cam-
bios en la estructura secundaria que dependen de
la traduccin de un cistrn precedente. Esto sucede
durante la traduccin de los fagos de RNA, cuyo?
cistrones siempre se expresan en un orden prede-
terminado. La FIGURA 12.35 muestra que el fago de
RNA adquiere una estructura secundaria en la cual
slo es accesible una secuencia de iniciacin; la se-
El movimiento de los ribosomas puede
controlar la traduccin
polo un pitio da iniciacin est disponible
en un principio _, .. ,
El segundo sitio de
iniciacin est
loqueado
El primer sitio de
iniciacin est disponible
Ls traduccin expone el geaundo sitio de iniciaciri
Los ribosomas
desestabilizan la
estructura secundaria
El segundo sitio
de iniciacin est
disponible
FIGURA 12.35 La estructura secundaria puede controlar Is
iniciacin. Slo un sitio de iniciacin est disponible en los
fagos de RNA, pero la traduccin del primer cistrn cambia la
conformacin del RNA para que otro u otros sitios de iniciacin
estn disponibles.
Los represores de la traduccin se unen al RNAm
essr GSendBTia Siilio.deac-sln
Protena de envoltura R17 repilcasa R17 la horquilla que incluye el sitio de unin ribosmica
RegA T4 RNAm T4 tempranos varias secuencias que incluyen el codn de iniciacin
Polimerasa de DNA T4 polimerasa de DNA T4 secuencia Shine-Dalgarno
p32 T4 gen 32 lder 5
'
de cadena individual
FIGURA 12.34 Las protenas que se unen a las secuencias que se encuentran en el interior de las regiones
de iniciacin de las molculas de RNAm pueden funcionar como represores de la traduccin.
324 CAPTULO 12 El Opern
. -
nda no puede ser reconocida por los ribosomas
:
rbido a que est apareada con otras regiones del
:
XA. Sin embargo, la traduccin del primer cistrn
nterrumpe la estructura secundaria, lo que permi-
E a los ribosomas unirse al sitio de iniciacin del
.guente cistrn. En este RNAm, la estructura se-
-ndaria controla la traducibilidad.
22 La sntesis de Las protenas r
es controlada por medio
de reguLacin autgena
Zoncepto principal
.
La traduccin de un opern de protena r puede ser
controlada por un producto del opern que se une a un
sitio localizado en el RNAm policistrnico.
.
"
as 70 protenas constituyen el aparato de la ex-
presin gnica bacteriana. Las protenas ribos-
micas son el componente principal, junto con las
rrotenas accesorias involucradas en la sntesis pro-
jenica. Las subunidades de la polimerasa de RNA y
sus factores accesorios integran el resto. Los genes
que codifican las protenas ribosmicas, a los facto-
res de la sntesis protenica y a las subunidades de
J polimerasa de RNA,
todos estn entremezclados
organizados en un pequeo nmero de operones.
la mayor parte de estas protenas estn representa-
das slo por genes individuales en E. coli.
Los controles coordinados garantizan que estas
rTotenas sean sintetizadas en cantidades apropa-
las para las condiciones de crecimiento: cuando las
racterias crecen con mayor rapidez,
dedican una
mayor proporcin de sus esfuerzos a la produccin
iel mecanismo para la expresin gnica. Se utiliza
jn conjunto de mecanismos para controlar la ex-
presin de los genes que codifican este mecanismo
I para garantizar que las protenas sean sintetizadas
en niveles comparables que se relacionan con los
rjveles de las molculas de RNAr.
La organizacin de seis operones se resume en
la FIGURA 12.36. Cerca de la mitad de los genes de las
protenas ribosmicas (protenas r) mapean en cua-
a
-
o operones que se encuentran cerca uno del otro
denominados str, spc, SlOy a tan slo por la primera
de las funciones que han sido identificadas en cada
caso). Los operones rify Lll se encuentran juntos
aa otra ubicacin.
Cada opern codifica una variedad de funcio-
nes. El opern str tiene genes que codifican las pro-
tenas de la subunidad ribosmica pequea,
as
como EF-Tu y EF-G. Los operones spc y S10 tienen
enes diseminados para las protenas de las sub-
jnidades ribosmicas pequea y grande. El ope-
Los operones de las protenas r se regulan de
forma autgena en la traduccin
rpsLrpsGfusA tufA
S12S7 EF-G EF-Tu '
5
rpIN rplX rplE rpsN rpsH rplf rpIR rpsE rpID rpmO secY-X
L14 L24 L5 S14 S8 L6 L18 S5 L30 L15 Y X
t I
rpsJ rplC rplB rpID rplW rpIS rplV rpsC rpsQ rplP rpmC
S10 L3 L2 L4 L23 SI9 L22 S3 SI7 L16 L29
t I
rpsM rpsKrpsDrpoArplQ
S13 S11 S4 a L17
t I
rplK rplA
L11 L1
t I
rpIJrpll rpoBrpoC
L10L7 p p'

FIGURA 12.36 Los genes de las protenas ribosmicas,

los factores de
la sntesis protenica y las subunidades de la polimerasa de RNA estn
esparcidos en un pequeo nmero de operones que se regulan de manera
autnoma. El regulador se indica en color violeta; las protenas que son
reguladas se muestran sombreadas en color rosa.
rn a tiene genes para las protenas de ambas sub-
unidades ribosmicas y para la subunidad a de la
polimerasa de RNA. El locus rif tiene genes para las
protenas de la subunidad ribosmica grande y para
las subunidades |3 y P' de la polimerasa de RNA.
Todas, excepto una de las protenas ribos-
micas, son necesarias en cantidades equimolares,
las cuales deben estar coordinadas con el nivel de
RNAr. La dispersin de los genes cuyos productos
deben ser equimolares y su mezcla con los genes
cuyos productos se necesitan en cantidades diferen-
tes plantean algunos problemas interesantes para la
regulacin coordinada.
Una caracterstica comn en todos los opero-
nes descritos en la Figura 12.36 es la regulacin de
algunos de los genes por uno de los productos. En
cada caso, el gen que codifica el producto regulador
es una de las dianas de la regulacin. La regulacin
autgena ocurre siempre que una protena (o RNA)
regula su propia produccin. En el caso de los ope-
rones de las protenas r, la protena reguladora in-
hibe la expresin de un conjunto contiguo de genes
dentro del opern, por lo que ste es un ejemplo de
regulacin autgena negativa.
En cada caso, la acumulacin de la protena inhibe
la sntesis posterior de s misma y de algunos otros pro-
ductos gnicos. El efecto con frecuencia es ejercido en
12.23 La sntesis de las protenas r es controlada por medio de regulacin autgena
325
El RNAr controla el nivel de protenas r libres
Cuando hay RNAr disponible, las protenas r se
asocian a l. La traduccin del RNAm contina
,
/ ./ ,/ ,/ W
. RNAm RNAr
9 9 9
Protenas r
V
9
Cuando no hay RNAr disponible, las protenas r se
acumulan. Una protena r se une al RNAm e impide
la traduccin
=9=
I
9
La traduccin de los operones de protenas r es
controlada de manera autgena y responde al nivel del RNAr.
La p32 controla su propia traduccin
i
La p32 se une de
manera preferente
al DNA de cadena
individual y contina
siendo sintetizada en
presencia de sus sitios
de unin
En ausencia de DNA de cadena
individual, la p32 se une a una
regin rica en A-T alrededor del
codn de iniciacin del RNAm e
impide que los ribosomas inicien
El exceso de la protena del gen 32 (p32) se
une a su propio RNAm para impedir que los ribosomas inicien
la traduccin.
el nivel de la traduccin del RNAm policistrnico.
Cada uno de los reguladores es una protena ribos-
mica que se une en forma directa al RNAr. Su efecto
sobre la traduccin es el resultado de su capacidad para
unirse tambin a su propio RNAm. Los sitios ubicados
en el RNAm a los cuales se unen estas protenas
se superponen a la secuencia en la cual se inicia la
traduccin o se encuentran cerca y tal vez influyen
en la accesibilidad al sitio de iniciacin al inducir
cambios de conformacin. Por ejemplo, en el ope-
rn S10, la protena L4 acta en el inicio preciso
del RNAm para inhibir la traduccin de S10 y c;
los genes subsiguientes. La inhibicin puede pro-
venir de un simple bloqueo del acceso al ribosoma.
como se ilustra antes en la Figura 12.34, o puect
inhibir alguna otra etapa subsiguiente de la traduc-
cin. En dos casos (que incluyen S4 en el opere:
a), la protena reguladora estabiliza una estructuri
secundaria particular en el RNAm que impide que
la reaccin de iniciacin contine despus de que st-
ha unido la subunidad 30S.
El uso de las protenas r que se unen al RNA
para establecer la regulacin autgena de maner;
inmediata sugiere que esto ofrece un mecanisrr.
para vincular la sntesis de protena r a la sntesis de
RNAr. Un modelo generalizado se ilustra en la FIGU-
RA 12.37
. Supngase que los sitios de unin para las
protenas r reguladoras autgenas en el RNAr son
mucho ms fuertes que aquellos de las molcula'
de RNAm. Siempre que haya un RNAr libre dispt -
nible, las protenas r que acaban de sintetizarse se
asociarn a l para iniciar el ensamble del ribosoms-
No habr protena r libre para unirse al RNAm, por
lo que su traduccin continuar. Sin embargo, en
cuanto disminuye de velocidad la sntesis de RNA:
o se detiene, las protenas r libres comienzan a acu-
mularse. Despus estarn disponibles para unirse a
sus molculas de RNAm, y reprimir as la traduccin
posterior. Este circuito garantiza que cada oper-
de protena r responda de la misma manera al nivd
del RNAr: tan pronto haya un exceso de protena I
en relacin con el RNAr, la sntesis protenica ser
reprimida.
La p32 deL fago T4
es controLada por un circuito
autgeno
Concepto principal
.
p32 se une a su propio RNAm para impedir la iniciacin
de la traduccin.
La regulacin autgena se ha establecido en una base
cuantitativa para el gen 32 del fago T4. La protena
(p32) tiene una funcin fundamental en la recom-
binacin gentica, la reparacin del DNA y la repli-
cacin, en la cual su funcin se ejerce por virtud de
su capacidad de unirse al DNA de cadena individual.
Las mutaciones sin sentido hacen que la proten?
inactiva se produzca en demasa. Por lo tanto, mana-
se impide la funcin de la protena, se produce ms de ella
Este efecto ocurre en el nivel de la traduccin; e
RNAm del gen 32 es estable y permanece as a pesa:
del comportamiento del producto protenico.
326 CAPTULO 12 El Opern
p32 tiene preferencias de unin
Otros
Unin a; DNAss RNAm p32 RNArn Unin a: DNAss RNAm p32 RNArn
t 100
S 75
ra 50
25
0
8
10-5 10 10 10 10 10
Concentracin (molar) protenica
La protena del gen 32 se une a varios sustratos
afinidades distintas, en el siguiente orden: DNA de cadena
pBvdual, su propio RNAm y otras molculas de RNAm. La
"
in de dicha protena a su RNAm impide que incremente el
el de p32 a ms de 10"6 M.
La FIGURA 12.38 presenta un modelo del circuito
<e control del gen 32. Cuando hay DNA de cadena
iividual en la clula infectada por el fago, secues-
ca la p32. Sin embargo, en ausencia de DNA de
cadena individual, o al menos en condiciones en
as cuales hay un remanente de p32, la protena
"
;
"
.pide la traduccin de su propio RNAm. El efecto
es mediado en forma directa por la unin de p32 al
.
XAm para inhibir la iniciacin de la traduccin. Es
"
robable que esto ocurra en una regin rica en A-T
que rodea al sitio de unin ribosmico.
Para que el lazo de control funcione de mane-
ra eficiente son necesarias dos caractersticas de la
.
rn de p32 al sitio del RNAm:
.
La afinidad de p32 por el sitio localizado en
el RNAm del gen 32 debe ser significativa-
mente ms baja que su afinidad por el DNA
de cadena individual. La constante de equi-
librio de la unin del RNA est, de hecho,
casi dos rdenes de magnitud por debajo de
la del DNA de cadena individual.
.
No obstante, la afinidad de la protena p32
por el RNAm debe ser significativamente
mayor que la afinidad por otras secuencias
de RNA. Est determinada por la composi-
cin de las bases y por la estructura secun-
daria; un aspecto importante de la unin al
RNAm del gen 32 es que la regin regulado-
ra tiene una secuencia extendida que carece
de estructura secundaria.
Utilizando las constantes de equilibrio conoci-
das
, se puede realizar un diagrama de la unin de
p32 a sus sitios diana en funcin de la concentracin
protenica. La FIGURA 12.39 muestra que en concen-
-
-
aciones por debajo de lO-6 M, la protena p32 se
une al DNA de cadena individual. En concentra-
dones mayores a lO-6 M, se une al RNAm del gen
32. En concentraciones incluso mayores se une a
las otras secuencias de RNAm
,
con un intervalo de
afinidades.
Estos resultados implican que el nivel de p32
debe estar autorregulado para ser <10"6 M, lo cual
corresponde a ~2 000 molculas por bacteria. Esto
corresponde apropiadamente al nivel medido de
1 000 a 2 000 molculas/clula.
Una caracterstica del control autgeno es que
cada interaccin reguladora es nica: una protena
acta slo en el RNAm encargado de su propia sn-
tesis. El fago T4 constituye un ejemplo de un regu-
lador de la traduccin ms general, codicado por el
gen regA, el cual reprime la expresin de numerosos
genes que se transcriben durante el inicio de la in-
feccin. La protena RegA impide la traduccin de
las molculas de RNAm de estos genes al competir
con las subunidades 30S por los sitios de iniciacin
del RNAm. Su accin es una contraparte directa de
la funcin de una protena represora que se une a
operadores mltiples.
La regulacin autgena
se utiLiza a menudo para
controlar La sntesis de
ensambles macromoleculares
Concepto principal
.
El precursor de los microtbulos, la protena tubulina
libre, inhibe la traduccin del RNAm de La tubulina.
La regulacin autgena es un tipo frecuente de con-
trol entre las protenas que son incorporadas en en-
sambles macromoleculares. La partcula ensambla-
da puede ser inadecuada como regulador porque es
demasiado grande, muy numerosa o bastante res-
tringida en cuanto a su localizacin. Sin embargo,
la necesidad de sintetizar sus componentes puede
reflejarse en el banco de subunidades precursoras li-
bres. Si se bloquea la ruta de ensamble por cualquier
motivo, las subunidades libres se acumulan y apa-
gan la sntesis innecesaria de ms componentes.
Las clulas eucariticas tienen un sistema co-
mn en el cual tiene lugar la regulacin autgena
de este tipo. La tubulina es el monmero del cual se
sintetizan los microtbulos, un sistema filamentoso
importante de todas las clulas eucariticas. La pro-
duccin del RNAm de la tubulina es controlada por
el banco de tubulina libre. Cuando este banco alcan-
za cierta concentracin, la produccin de ms RNAm
de la tubulina se inhibe. Una vez ms
, el principio
es el mismo: la tubulina secuestrada en su ensam-
ble macromolecular no tiene ninguna funcin en la
regulacin, pero el nivel de precursores libres en el
banco determina si se agregarn ms monmeros,
El sitio diana para la regulacin es una secuen-
cia corta localizada en el inicio de la regin codifi-
12.25 La regulacin autgena se utiliza a menudo para controlar la sntesis de ensambles macromoleculares
327
La tubulina libre reprime su propia traduccin
La tubulina libre se une
RNAm Proteina naciente
n
La tubulina es ensamblada
en microtubulos
El RNAm es
degradado
FIGURA 12.40 La tubulina se ensambla en microtubulos cuan-
do es sintetizada. La acumulacin del exceso de tubulina libre
induce inestabilidad en el RNAm de la tubulina al actuar en un
sitio localizado en el inicio del marco de lectura en el RNAm o
en la posicin correspondiente en la protena naciente.
cadora. Todava no se conoce qu funcin tiene esta
secuencia, pero se ilustran dos modelos en la FIGURA
12.40. La tubulina puede unirse de manera directa
al RNAm o puede unirse al polipptido naciente
que representa a esta regin. Cualquiera que sea
el modelo que se aplica, el exceso de tubulina hace
que el RNAm de la tubulina que se localiza en los
polisomas sea degradado, por lo que la consecuen-
cia de la reaccin es hacer inestable al RNAm de la
tubulina.
El control autgeno es un sistema intrnseca-
mente auto-limitante, en contraste con el control
extrnseco que se analiz antes. La capacidad de una
protena represora de unirse a un operador puede
ser controlada por el nivel de una pequea mol-
cula extraa, la cual inhibe o facilita su actividad.
En el caso de la regulacin autgena, sin embargo,
el parmetro determinante es la concentracin de
la protena misma.
Resumen
La transcripcin es regulada por la interaccin entre
los factores de actuacin en trans y los sitios de ac-
tuacin en cis. Un factor de actuacin en trans es el
producto de un gen regulador. Casi siempre es una
protena, pero tambin puede ser RNA. Se difunde
en la clula y en consecuencia puede actuar en cual-
quier gen diana apropiado. Un sitio de actuacin en
cis en el DNA (o en el RNA) es una secuencia que
funciona al ser reconocida in situ. No tiene funcin
codicadora y puede regular slo aquellas secuen-
cias a las cuales es contigua fsicamente. Los genes
bacterianos codifican protenas cuyas funciones es-
tn relacionadas, como las enzimas sucesivas de um
ruta, y pueden ser organizadas en un agrupamiento
que se transcribe en un RNAm policistrnico a par-
tir de un solo promotor. El control de este promotor
regula la expresin de toda la ruta. La unidad de re-
gulacin, la cual contiene genes estructurales y ele-
mentos de actuacin en cis, se denomina opern. 1
La iniciacin de la transcripcin es regulada por
interacciones que tienen lugar en la vecindad de_
promotor. La capacidad de la polimerasa de RNfl
para iniciar en el promotor es inhibida o activad;
por otras protenas. Los genes que son activos a me-
nos que sean apagados se dice que se encuentran
bajo control negativo. Los genes que son activo?
slo cuando son encendidos de manera especfi-
ca se dice que estn bajo control positivo. El tip:
de control puede determinarse por las relaciones de
dominancia entre los genes de tipo silvestre y los ge-
nes mutantes que son constitutivos/no reprimidc
(encendidos de forma permanente) o no inducibles
sperreprimidos (apagados de manera perpetua).
Una protena represora impide que la polime-
rasa de RNA se una al promotor o que active 9
transcripcin. El represor se une a una secuencia
diana, el operador, que por lo general se encuentra
alrededor o en sentido ascendente con respecto 1
punto de inicio. Las secuencias operadoras son cor-
tas y con frecuencia son palindrmicas. El represor
a menudo es un homomultmero cuya simetra re-
fleja la de su diana.
La capacidad de la protena represora para unir-
se a su operador es regulada por una molcula pe-
quea. Un inductor impide la unin de un represor:
un correpresor lo activa. La unin del inductor
del correpresor a su sitio produce un cambio en \i
estructura del sitio de unin al DNA del represor.
Esta reaccin alostrica ocurre en las protenas re-
presoras libres y de manera directa en las protenas
represoras que ya se encuentran unidas al DNA. ]
La ruta de la lactosa opera por medio de induc-
cin, cuando un galactsido |3 inductor impide que
el represor se una a su operador; la transcripcin je
la traduccin del gen lacZ despus producen galac-
tosidasa 3, la enzima que cataboliza galactsidos :
La ruta del triptfano opera por represin; el ce -
represor (triptfano) activa la protena represora,
por lo que se une al operador e impide la expresii:
de los genes que codifican las enzimas que biosin-
tetizan el triptfano. Un represor puede controlar
mltiples dianas con copias de una secuencia de
consenso operadora.
328
CAPTULO 12 El Opern
Una protena con alta afinidad por una secuen-
;
iiana particular del DNA tiene menor afinidad
:
todo el DNA. La proporcin define la especi-
.
f.ad de la protena. Hay muchos ms sitios no
"
jcficos (cualquier secuencia de DNA) que sitios
;
na especficos en un genoma; en consecuencia,
.a protena de unin al DNA como un represor
-ina polimerasa de RNA es
"
almacenada
"
en el
NA. (Es probable que no exista protena en for-
i libre
, o que sea muy poca.) La especificidad por
secuencia diana debe ser lo suficientemente alta
:
-
:
a contrarrestar el exceso de sitios no especficos
. n respecto a los sitios especficos. El equilibrio de
;
protenas bacterianas es ajustado de tal mane-
que la cantidad de protena y su especificidad
rrmitan el reconocimiento especfico de la diana
.condiciones
"
encendidas
"
, pero permitan una
reracin casi completa de la diana en condiciones
"
pagadas
"
.
:
eferen cas
Introduccin
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ffl La sntesis de las protenas r es controlada
por medio de regulacin autgena
Artculo de revisin
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| La regulacin autgena se utiliza a menudo para
controlar la sntesis de ensambles macromoleculare;
Artculo de revisin
Gold, L. (1988). Posttranscriptional regulatory mechanismi
in E. coli. Annu. Rev. Biochem. 57, 199-223.
CAPTULO 12 EL Opern
RNA regulador
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
.
El RNA funciona como regulador al formar una regin de
estructura secundaria (intermolecular o intramolecular) que
cambia las propiedades de una secuencia diana.
Las estructuras secundarias alternativas controlan
la atenuacin
La terminacin de la transcripcin puede atenuarse si
se controla la formacin de la estructura de horquilla
necesaria en el RNA.
Los mecanismos ms directos de la atenuacin incluyen
proteinas que estabilizan o que desestabilizan a la
horquilla.
La terminacin de Los genes trp de Bacillus subtilis
es controlada por el triptfano y por el RNAtTrp
.
Una protena terminadora denominada TRAP es activada
por el triptfano para impedir la transcripcin de los genes
trp.
-
La actividad de la TRAP es inhibida (de manera indirecta)
por el RNAt1''' no cargado.
El opern triptfano de Escherichia coli es
controlado por medio de atenuacin
Un atenuador (terminador intrnseco) se localiza entre el
promotor y el primer gen del agrupamiento trp.
-
La ausencia de triptfano suprime la terminacin y
ocasiona que [a transcripcin aumente 10 veces.
La atenuacin puede ser controlada por La
traduccin
La regin lder del opern trp tiene un marco de lectura
abierto de 14 codones que incluye dos codones de
triptfano.
.
La estructura de RNA localizada en el atenuador depende
de la traduccin de este marco de lectura.
.
En presencia de triptfano, el lider es traducido y el
atenuador es capaz de formar la horquilla que provoca la
terminacin.
.
En ausencia de triptfano, el ribosoma se atasca en
los codones de triptfano y la estructura secundaria
alternativa impide la formacin de la horquilla, por lo que
la transcripcin contina.
fm
rana
El RNA antisentido puede ser utilizado para
desactivar la expresin gnica
.
Los genes antisentido bloquean la expresin de sus dianas
cuando son introducidos en las clulas eucariticas.
Las molculas pequeas de RNA son capaces de
regular la traduccin
.
Un RNA regulador funciona al formar una regin dplex con
un RNA diana.
.
La estructura dplex puede bloquear la iniciacin de la
traduccin, provocar la terminacin de la transcripcin o
crear una diana para una endonucleasa.
Las bacterias contienen RNA reguladores
.
Las molculas de RNA reguladoras bacterianas se
denominan sRNA.
.
Muchas de las molculas de sRNA estn unidas a la
proteina Hfq, la cual incrementa su efectividad.
.
El sRNA OxyS activa o reprime la expresin de ms de 10
loci en el nivel postraduccional.
Los microRNA son reguladores en numerosas
eucariotas
.
Los genomas de los animales y de las plantas codifican
numerosas molculas cortas de RNA (de ~22 bases)
denominadas microRNA.
.
Los microRNA regulan la expresin gnica por medio de
apareamiento de bases con secuencias complementarias en
los RNAm diana.
La interferencia de RNA est relacionada con el
silenciamiento de los genes
.
La interferencia de RNA desencadena la degradacin de los
RNAm complementarios a cualquier cadena corta de dsRNA.
.
El dsRNA puede provocar el silenciamiento de los genes
hospedadores.
Resumen
Contina en la siguiente pgina
331
Introduccin
Concepto principal
.
El RNA funciona como regulador al formar una regin de
estructura secundaria (intermolecular o intramolecular)
que cambia las propiedades de una secuencia diana.
El principio bsico de la regulacin en las bacterias
consiste en que la expresin gnica es controlada
por un regulador que interacta con una secuencia
o con una estructura especfica del DNA o del RNAm
en alguna etapa anterior a la sntesis protenica. La
etapa de la expresin que es controlada puede ser
la transcripcin, cuando la diana de regulacin es
el DNA, o el control puede ocurrir en la traduc-
cin, cuando la diana de la regulacin es el RNA.
Cuando el control sucede durante la transcripcin,
puede ocurrir en la iniciacin o en la terminacin.
El regulador puede ser una protena o un RNA. El
trmino "controlado" puede significar que el regula-
dor apaga (reprime) la diana o que la enciende (que
la activa). La expresin de numerosos genes puede
ser controlada de manera coordinada por un solo
gen regulador bajo el principio de que cada diana
contiene una copia de la secuencia o de la estructu-
ra a la cual reconoce el regulador. Los reguladores
pueden a su vez ser regulados, ms a menudo en
respuesta a molculas pequeas cuyo abastecimien-
to responde a condiciones ambientales. Los regula-
dores pueden ser controlados por otros reguladores
para formar circuitos complejos.
A continuacin se compara la forma en la que
trabajan los diferentes tipos de reguladores.
El RNA regulador se una al RNA diana
1 u
n
RNA diana
RNA regulador
t
ir
Regin dplex-
TI
Un RNA regulador es un RNA pequeo con una
regin de cadena individual que puede aparearse con una re-
gin de cadena individual en un RNA diana.
Los reguladores protenicos siguen principios
alostricos. La protena tiene dos sitios de unin
uno para una diana de cido nucleico y el otro pare
una molcula pequea. La unin de la molcula
pequea a su sitio cambia la conformacin de u.
manera que altera la afinidad del otro sitio por ei
cido nucleico. La forma en la cual sucede esto se
conoce en detalle en el caso del represor Lac. Los re-
guladores protenicos a menudo son multimricos
con una organizacin simtrica que permite que dos
subunidades hagan contacto con una diana palin-
drmica del DNA. Esto puede generar efectos de
unin cooperativos que crean una respuesta ms
sensible a la regulacin.
La regulacin por medio del RNA utiliza cam-
bios en la estructura secundaria como principio
rector. La capacidad de un RNA para cambiar de
conformacin con consecuencias reguladoras es |
alternativa del cido nucleico a los cambios alost-
ricos de la conformacin protenica. Los cambios de
estructura pueden provenir de interacciones intra-
moleculares o intermoleculares.
La funcin ms frecuente de los cambios intra-
moleculares es que una molcula de RNA asuma la?
estructuras secundarias alternativas al utilizar dife-
rentes esquemas de apareamiento de bases. Las pro-
piedades de las conformaciones alternativas puede-
ser diferentes. Los cambios en la estructura secun-
daria de un RNAm pueden modificar su capacida:
de ser traducido. La estructura secundaria tambir
sirve para regular la terminacin de la transcripcin
cuando la diferencia entre las estructuras alterna-
tivas radica en que permitan la terminacin o Q:
lo hagan.
En las interacciones intermoleculares, un regu-
lador de RNA reconoce su diana por el principK
familiar de apareamiento de bases complementa-
rias. La FIGURA 13.1 muestra que el regulador suele
ser una molcula pequea de RNA con estructura.
secundaria extensa, pero con una regin (o alguna;
regiones) de cadena individual complementaria s
una regin de cadena nica ubicada en su diana. Le.
formacin de una regin de doble hlice entre el re-
gulador y la diana puede tener dos consecuencias;
.
La formacin de la estructura de doble h-
lice puede ser suficiente por s misma. Er
algunos casos, la protena (o las protenas
puede unirse slo a la forma de cadena indi-
vidual de la secuencia diana y, por lo tantc
la formacin dplex le impide actuar. Er
otros casos, la regin dplex se transforma
en la diana para la unin; por ejemplo, en d
caso de las nucleasas que degradan el RNA
y, por lo tanto, impiden su expresin.
.
La formacin dplex puede ser importante
debido a que secuestra una regin del RNA
332
CAPTULO 13 RNA regulador
diana que de otra manera participara en
alguna estructura secundaria alternativa.
Las estructuras secundarias
alternativas controlan
la atenuacin
"
ceptos principales
.= terminacin de la transcripcin puede atenuarse si
:e controla la formacin de la estructura de horquilla
.
ecesaria en el RNA.
-:s mecanismos ms directos de la atenuacin incluyen
nrotenas que estabilizan o que desestabilizan a la
arquilla.
Ktructura del RNA ofrece una oportunidad para
.
"
rgulacin en las procariotas y en las eucariotas.
. :uncin ms comn se ejerce cuando la molcu-
-
fc RNA puede adquirir estructuras secundarias
-
rnativas mediante diferentes esquemas para el
- ;:
eamiento de bases intramolecular. Las propie-
-:
rs de las conformaciones alternativas pueden ser
eferentes. Este tipo de mecanismo puede servir para
r jular la terminacin de la transcripcin, cuando
liferencia entre las estructuras alternativas radi-
m que permitan la terminacin. Otro medio de
r.rrol de la conformacin (y, por lo tanto, de la
mcin) lo ofrece la divisin del RNA; al retirar un
segmento de una molcula de RNA, la conformacin
r. resto puede alterarse. Asimismo, es posible que
"
.a
, molcula de RNA (pequea) controle la activi-
-
ii de un RNA diana al aparearse con l; la funcin
RNA minsculo es directamente anloga a la de
iprotena reguladora (vase la seccin 13.7, Las
_
fculas pequeas de RNA son capaces de regu-
far ta traduccin). La capacidad que tiene un RNA
;:a cambiar de conformacin con consecuencias
reguladoras es la alternativa del cido nucleico a los
lirubios alostricos de conformacin que regulan la
-.
'
.cin protenica. Estos dos mecanismos permiten
.
"
.a interaccin en un sitio de la molcula para afec-
j: la estructura de otro sitio.
Numerosos operones son regulados por ate-
nuacin, un mecanismo que controla la capaci-
de la polimerasa de RNA de leer a travs de
atenuador, el cual es un terminador intrnseco
balizado al inicio de una unidad de transcripcin.
D vrincipio de la atenuacin consiste en que algn suceso
aterno controle la formacin de la horquilla necesaria
-
ya la terminacin intrnseca. Si se permite la forma-
don de la horquilla, la terminacin impide que la
r
-olimerasa de RNA transcriba los genes estructu-
rales. Si se impide la formacin de la horquilla, la
rolimerasa de RNA se alarga a travs del terminador
y los genes son expresados. Se utilizan diferentes
mecanismos en sistemas distintos para controlar la
estructura del RNA.
Las protenas que se unen al RNA pueden re-
gular la atenuacin para estabilizar o para desesta-
bilizar la formacin de la horquilla necesaria para
la terminacin. La muestra un ejemplo
en el cual una protena impide la formacin de la
horquilla terminadora. La actividad de dicha prote-
na puede ser intrnseca o responder a una molcula
pequea de la misma manera que una protena re-
presora responde a un correpresor.
QU La terminacin de los genes
trp de BaciUus subtiis
es controlada por el triptfano
y por el RNAtTrp
Conceptos principales
.
Una protena terminadora denominada TRAP es
activada por el triptfano para impedir la transcripcin
de los genes trp.
.
La actividad de la TRAP es inhibida (de manera
indirecta) por el RNAt1'11 no cargado.
El sistema de circuitos que controla la transcripcin
por medio de la terminacin puede utilizar medios
directos e indirectos para responder al nivel de sus-
tratos o productos de molculas pequeas.
pi:IIJiJI.MJI.I.I.!JIJJJJIM.I.I.|JJI.IJ11t-l-!B
Promotor -=*- Terminador
orquilla
Horquilla de terminacin
La terminacin es inhibida cuando no
formarse la horquilla
Promotor Terminador-
J m >\
Z7 c
La protena se une para
bloquear la horquilla
La atenuacin tiene lugar cuando se impide la
formacin de una horquilla terminadora en el RNA.
13 J La terminacin de los genes trp de Bacillus subtitis es controlada por el triptfano y por el RNAtTrp
333
La TRAP controla el opern rp de B. subtilis
Triptfano presente
n
@
Horquilla de terminacin
Triptfano ausente
Horquilla ausente
Estructura alternativa
FIGURA 13.:- La TRAP es activada por el triptfano y se une al
RNAm trp. Esto permite que se forme la horquilla de termina-
cin, lo cual da como resultado la terminacin de la polimerasa
de RNA y la falta de expresin de los genes. En ausencia de
triptfano, la TRAP no se une y el RNAm adopta una estructura
que impide que se forme la horquilla de terminacin.
En B. subtilis, una protena denominada pro-
tena atenuadora de unin al RNA en presencia de
triptfano (TRAP, tryptophan RNA-binding attenua-
tionprotein) (antes denominada MtrB) es activada
por el triptfano (Trp) para unirse a una secuencia
en el lder del transcrito naciente. La TRAP forma
un multmero de 11 unidades. Cada subunidad se
une a un solo triptfano y a un trinucletido (GAG
o UAG) de RNA. El RNA se enrolla en un crculo
alrededor de la protena. La FIGURA 13 muestra que
el resultado es garantizar la disponibilidad de las
regiones necesarias para formar la horquilla termi-
nadora. Despus, la terminacin de la transcripcin
impide la produccin de las enzimas biosintticas
de triptfano. En efecto, la TRAP es una protena
terminadora que responde al nivel de triptfano.
En ausencia de TRAP, una estructura secundaria
alternativa impide la formacin de la horquilla ter-
minadora.
Sin embargo, la TRAP, a su vez, tambin es con-
trolada por el RNAtTri'. La FIGURA 13.4 muestra que el
RNAtTrp no cargado se une al RNAm de una protena
denominada antiTRAP (AT). sta suprime la forma-
cin de una horquilla de terminacin en el RNAm.
El RNAtTrp no cargado tambin incrementa la tra-
duccin del RNAm. El resultado combinado de estas
dos acciones incrementa la sntesis de antiTRAP, la
cual se une a la TRAP y le impide reprimir al opern
de triptfano. Por medio de esta serie de sucesos
complejos, la ausencia de triptfano genera RNAt
AntiTRAP es controlado por el RNAtTrp
Triptfano presente
Gen antiTRAP
Triptfano ausente
RNAtTrP no cargado
ll/V,
TRAP
antiTRAP
En condiciones normales (en presencia deltr;
tfano) la transcripcin termina antes que el gen antiTRA?
Cuando no hay triptfano, el RNAtT,p se aparea con el 9hto
antiTRAP, lo que impide la formacin de la horquilla ternf"
dora y provoca la expresin de antiTRAP.
no cargado, el cual provoca la sntesis de antiTR.-
ste a su vez impide la funcin de la TRAP, la ai;
provoca la expresin de los genes del triptfano.
Por lo tanto, la expresin de los genes trp d
B
. subtilis es controlada por el triptfano y por
RNAtTrp. Cuando hay triptfano, no necesita ser s; -
tetizado. Esto se logra cuando el triptfano ac:
la TRAP e inhibe as la expresin de las enzigu
que sintetizan el triptfano. La presencia de RNAl?
no cargado indica que hay escasez de triptfano.
RNAt no cargado activa la antiTRAP y, por lo tar/
activa la transcripcin de los genes trp.
334 CAPTULO 13 RNA regulador
El opern triptfano de
Escherchia coli es contraLado
por medio de atenuacin
lonceptos principales
Jn atenuador (terminador intrnseco) se Localiza entre
el promotor y el primer gen del agrupamiento trp.
'
La ausencia de triptfano suprime La terminacin y
ocasiona que la transcripcin aumente 10 veces.
Er. E. coli se utiliza un sistema regulador complejo
m el cual se descubri por primera vez la atenua-
n). Los cambios de la estructura secundaria que
"
trolan la atenuacin son determinados por la
icin del ribosoma en el RNAm. La GURA 13.5
mestra que la terminacin requiere que el riboso-
pueda traducir un segmento lder que precede a los
ynes trp en el RNAm. Cuando el ribosoma traduce
-
regin lder se forma una horquilla de termina-
. - n en el terminador 1. Sin embargo, cuando se le
.r
.pide al ribosoma traducir el lder, la horquilla de
mninacin no se forma y la polimerasa de RNA
ranscribe la regin codificadora. En consecuencia,
este
:
::anismo de antiterminacin depende de la posibilidad
que las circunstancias externas influyan en el movi-
rimto del ribosoma en la regin lder.
El opern trp est formado por cinco genes es-
::
ucturales ordenados en una serie contigua, los
- -a
les codifican las tres enzimas que transforman el
do corsmico en triptfano. La FIGURA 13.6 mues-
r:a que la transcripcin inicia en un promotor que
r encuentra en el extremo izquierdo del agrupa-
uento. La expresin del opern trp es controlada
'
>r dos mecanismos independientes. La represin
e la expresin la ejerce una protena represora
zodificada por el gen trpR no ligado) que se une a
un operador adyacente al promotor. La atenuacin
rontrola el progreso de la polimerasa de RNA en el
pern al regular la posibilidad de que la termina-
n ocurra en un sitio que precede al primer gen
estructural.
La atenuacin se descubri por primera vez
ruando se observ que la delecin de una secuen-
ria localizada entre el operador y la regin codi-
.cadora trpE puede aumentar la expresin de los
renes estructurales. Este efecto es independiente
:.e la represin: los niveles de transcripcin basal
I deprimida se incrementan. Por lo tanto, este sitio
zrfluye en los sucesos que tienen lugar despus de
5u>e la polimerasa de RNA ha salido del promotor
(a pesar de las condiciones que prevalecen en la
niciacin).
Entre el promotor y el gen trpE se localiza un
itenuador (terminador intrnseco). ste proporciona
La traduccin puede controlar la terminacin de la transcripcin
TRADUCCIN + TERMINACIN Slo se transcribe el lder
< Lder i c Regin codificadora >
Promotor > Terminador 1 Terminador 2
Horquilla de terminacin i
TRADUCCIN Y TERMINACIN AUSENTES Se transcribe la regin
codificadora
Promotor Terminador 1 > Terminador 2
El ribosoma estacionario cambia
la estructura secundaria del RNAm
FIGURA 13.5 La terminacin puede controlarse con los cambios en
la estructura secundaria del RNA determinados por el movimiento ri-
bosmico.
La regin de control del opern Up codifica un ppt
Sintetasa de Sintetasa de triptfano
Protena Sintetasa de antranilato indol-glicerol Cadena B Cadena A
Gen trpE !.pD trpC trpB trpA t t'
Regin de control
Promotor Operador Lder Atenuador
pppN AUGAMGCMUUUUCGUACUGAAAGGUUSGUGGCGCACUUCCUGAN
26
'
43f
Pptido lder
Met Lys Ala lie Phe Val Leu Lys Giy Trp Trp Arg Thr Ser
UUUUUUUU
Horquilla rica en
6-C/cadena individua
1
rica en U
El opern rp est formado por cinco genes estructurales
contiguos precedidos por una regin de control que incluye el promotor,
el operador, la regin codificadora del pptido lder y el atenuador.
una barrera a la transcripcin en los genes estructu-
rales. La polimerasa de RNA termina ah,
in vivo o in
vitro, para producir un transcrito de base 140.
La terminacin en el atenuador responde al ni-
vel de triptfano, como se ilustra en la 1GURA 13.7,
La terminacin es eficiente en presencia de can-
tidades suficientes de triptfano. Sin embargo, en
13.4 El opern triptfano de Escherchia coli es controlado por medio de atenuacin
3
-
35
La transcripcin es controlada por la traduccin
TRANSCRIPCIN DE LA REGIN LDER
Promotor Pausa Atenuador trpE
La polimerasa inicia
La polimerasa hace una pausa
TRIPTFANO AUSENTE: LA TRANSCRIPCIN CONTINA EN ELQPERN
La polimerasa experimenta elongacin
Inicia la traduccin
TRIPTFANO PRESENTE: LA TRANSCRIPCIN TERMINA EN EL ATENUADOR
Se forma la horquilla de terminacin
La polimerasa termina
FIGURA 13.7 Un atenuador controla La progresin de La poLimerasa
de RNA en Los genes trp. La poLimerasa de RNA inicia en el promotor y
despus prosigue a La posicin 90, en donde hace una pausa antes de
seguir adelante hasta eL atenuador que se encuentra en La posicin 140.
En ausencia de triptfano, La poLimerasa de RNA contina en Los genes
estructurales (trpE comienza en +153). En presencia de triptfano hay
una probabilidad de ~90% de que la terminacin libere el RNA lder de
la base 140.
ausencia de triptfano, la polimerasa de RNA puede
continuar en los genes estructurales.
La represin y la atenuacin responden de la
misma manera al nivel de triptfano. Cuando ste
est presente, el opern es reprimido y la mayor
parte de las polimerasas de RNA que escapan del
promotor termina despus en el atenuador. Cuan-
do el triptfano es retirado, la polimerasa de RNA
tiene acceso libre al promotor y tambin deja de ser
obligada a terminar en forma anticipada.
La atenuacin tiene un efecto de aproximada-
mente 10 veces sobre la transcripcin. Cuando el
triptfano est presente, la terminacin es efectiva y
el atenuador permite que slo -10% de las polime-
rasas de RNA prosigan. En ausencia de triptfano,
la atenuacin permite que casi todas las polimerasas
continen. Junto con el incremento de 70 veces en
la iniciacin de la transcripcin que se deriva de la
liberacin de la represin, esto permite un intervalo
de regulacin del opern de unas 700 veces.
EtlH La atenuacin puede ser
controlada por La traduccin
Conceptos principales
La regin lder del opern trp tiene un marco de lectura
abierto de 14 codones que incluye dos codones de
triptfano.
La estructura de RNA localizada en el atenuador
depende de La traduccin de este marco de lectura.
En presencia de triptfano, el Lder es traducido y el
atenuador es capaz de formar la horquilla que provoca
La terminacin.
En ausencia de triptfano, el ribosoma se atasca en
Los codones de triptfano y la estructura secundaria
alternativa impide la formacin de La horquilla, por lo
que la transcripcin contina.
De qu forma puede responder la terminacin de
la transcripcin en el atenuador al nivel de trip-
tfano? La secuencia de la regin lder sugiere un
mecanismo. Tiene una secuencia codificadora corta
que podra representar a un pptido lder de 14
aminocidos. La Figura 13.6 muestra que contiene
un sitio de unin ribosmica cuyo codn AUG es
seguido por una regin codificadora corta que con-
tiene dos codones sucesivos de triptfano. Cuando
a la clula se le termina el triptfano, los ribosomas
inician la traduccin del pptido lder, pero se de-
tienen cuando alcanzan los codones de triptfano.
La secuencia del RJSAm sugiere que esta detencin
de los ribosomas influye en la terminacin en el
atenuador.
La secuencia lder puede escribirse en estructu-
ras apareadas de manera alternativa. La capacidad
del ribosoma de proseguir por la regin lder contro-
la las transiciones entre estas estructuras. La estruc-
tura determina si el RNAm puede proporcionar las
caractersticas necesarias para la terminacin.
La FIGURA 13.8 ilustra estas estructuras. En la
primera, la regin uno se aparea con la regin dos,
y la regin tres se aparea con la regin cuatro. El
apareamiento de las regiones tres y cuatro gene-
ra la horquilla que precede a la secuencia U
8
: sta
es la seal esencial de la terminacin intrnseca. Es
probable que el RNA adquiera esta estructura en
ausencia de cualquier intervencin externa.
Si se le impide a la regin uno aparearse con la
regin dos, se forma una estructura diferente. En
336
CAPTULO 13 RNA regulador
Las estructuras secundarias alternativas controlan la terminacin
U U A
GCGUAAA
C C
U
G C
U A
C
G CU
G G U
3
G L
G C
A L
U C
U A
A A
U C
9 uuuuuuuu uuuuuuuu
G C
G
8?
J
G C UlG
J
G 0
C3AAA G
3AG
8eA
Las regiones tres y cuatro ESTRUCTURAS ALTERNATIVAS Las regiones dos y tres se
se aparean para formar la La regin dos es compiementaria de las reglones uno y tres aparean; ia regin terminadora
horquilla terminadora La regin tres es compiementaria de ias regiones dos y cuatro es de cadena individual
La regln Lder trp puede existir en otras conformaciones apareadas. EL centro muestra Las cuatro regiones que
z.eden aparearse. La regin uno es complementaria de La regin dos. La cuaL es compLementaria de la regin tres, que a su
i?z es complementaria de la regin cuatro. En el lado izquierdo se encuentra la conformacin que se produce cuando la re-
rn uno se aparea con la regin dos y la regin tres se aparea con la regin cuatro. En el lado derecho est la conformacin
;:
quirida cuando la regin dos se aparea con la regin tres y deja las regiones uno y cuatro sin aparear.
le caso, la regin dos es libre de aparearse con la
wgin tres. Entonces, la regin cuatro no tiene un
;
mpaero de apareamiento disponible, por lo que
o obligada a permanecer como cadena individual.

"
consecuencia, la horquilla terminadora no podr
rmarse.
La FIGURA I muestra que la posicin del ri-
bosoma puede determinar qu estructura se forma,
je tal manera que la terminacin es atenuada slo
en ausencia de triptfano. La caracterstica crucial
es la posicin de los codones de Trp en la secuencia
;
. ficadora del pptido lder.
Cuando hay triptfano, los ribosomas son capa-
rs de sintetizar el pptido lder. Aqullos continan
:or la seccin lder del RNAm al codn UGA, el cual
:
mcuentra entre las regiones uno y dos. Como se
nestra en la parte inferior de la figura, al progre-
sar a este punto,
los ribosomas se extienden a la
"
riin dos e impiden que se realice el apareamiento
:
bases. El resultado es que la regin tres queda
fcponible para aparearse con la regin cuatro, lo
-
"
'
genera la horquilla terminadora. Por lo tanto,
si estas condiciones, la polimerasa de RNAtermina en
; itenuador.
Cuando no hay triptfano, los ribosomas se de-
BDen en los codones de Trp, los cuales son parte
:
3 regin uno, como se muestra en la parte su-
rerior de la figura. Por lo tanto, la regin uno es
c raestrada dentro del ribosoma y no puede formar
ires de bases con la regin dos. Esto significa que
. regiones dos y tres se aparean antes de que se
-
inscriba la regin cuatro. Esto obliga a la regin
El triptfano controla la posicin del ribosoma
TRIPTFANO AUSENTE
A u
U A
G
Trp Trp UUUUUU
UGGUGGCGAACUUCCUGAAAC G
\
G
GUAAUGAG
El ribosoma se detiene
en los codones Trp
TRIPTFANO PRESENTE
El ribosoma avanza >
Trp Trp
U . A
A U
UGGUGGCGAACUUCCUGAAAC GGGCAGUG C
/ A UUUUUU
El movimiento del ribosoma g g
interrumpe el apareamiento 2;3 c g
Q c
C ,Ga
El apareamiento 3:4 forma
z G
la horquilla de terminacin a h
Las alternativas de La polimerasa de RNA en el
atenuador dependen de La localizacin del ribosoma, el cual
determina si las regiones tres y cuatro se pueden aparear para
formar La horquilla terminadora.
; La atenuacin puede ser controlada por la traduccin 337
El RNAt-Trp controla de manera directa el
opern trp de . coli
Triptfano presente
Trp
Triptfano ausente
FIGURA 13.10 En presencia de RNAt triptfano, los riboso-
mas traducen el pptido lder y son liberados. Esto permite la
formacin de la horquilla, por lo que la polimerasa termina.
En ausencia de RNAt triptfano, el ribosoma es bloqueado, la
horquilla de terminacin no puede formarse y la polimerasa de
RNA contina.
cuatro a permanecer en forma de cadena indivi-
dual. En ausencia de la horquilla terminadora, la
polimerasa de RNA contina la transcripcin ms
all del atenuador.
El control por medio de atenuacin requiere
una organizacin cronolgica precisa de los sucesos.
Para que el movimiento ribosmico determine la
formacin de estructuras secundarias alternativas
que controlen la terminacin, la traduccin del lder
dehe ocurrir al mismo tiempo que la polimerasa de RNA
se aproxima al sitio terminador. Un episodio determi-
nante para el control cronolgico es la presencia
de un sitio que ocasione que la polimerasa de RNA
haga una pausa a 90 bases a lo largo del pptido
lder. La polimerasa de RNA permanece en pau-
sa hasta que un ribosoma traduce el pptido lder.
Despus, la polimerasa es liberada y se mueve hacia
el sitio de atenuacin. Cuando llega ah, la estruc-
tura secundaria de la regin de atenuacin ha sido
determinada.
La FIGURA 13.10 resume la funcin del RNAt-Trp
en el control de la expresin del opern. Al propor-
cionar un mecanismo para detectar la insuficiencia del
abastecimiento de RNAt-Trp, la atenuacin responde de
manera directa a la necesidad de triptfano de la clula
en la sntesis protenica.
Qu tan generalizado est el uso de la atenua-
cin como mecanismo de control de los operones
bacterianos? Se usa en al menos seis operones que
codifican enzimas implicadas en la biosntesis de
aminocidos. Por lo tanto, la retroalimentacin des-
de el nivel de aminocido disponible para la sntesis
protenica (como lo representa la disponibilidad de
'
.
RNAt aminoacilado) hasta la produccin de las en-
zimas puede ser comn.
El uso del ribosoma para controlar la estructura
secundaria del RNA en respuesta a la disponibili-
dad de RNAt aminoacilado establece una relacin
inversa entre la presencia de RNAt aminoacilado ij
la transcripcin del opern, la cual es equivalen-
te a la situacin en la cual el RNAt aminoaciladc
funciona como correpresor de la transcripcin. BJ
mecanismo regulador es mediado por cambios er.
la formacin de regiones dplex; por lo tanto, I
atenuacin proporciona un ejemplo sobresaliente
de la importancia de la estructura secundaria en I
terminacin y de su uso en la regulacin.
De este modo, E. coli y B. subtilis utilizan el mis-
mo tipo de mecanismo, el cual comprende el control
de la estructura del RNAm en respuesta a la presen-
cia o a la ausencia de un RNAt, pero han combinadc
las interacciones individuales de maneras distintas,
El resultado final es el mismo: inhibir la produc-
cin de las enzimas cuando hay un exceso en i
abastecimiento del aminocido y activar la produc-
cin cuando se indica escasez por la acumulacin
de RNAtTrp no cargado.
ftfl EL RNA antisentido puede
ser utilizado para desactivar
La expresin gnica
Concepto principal
.
Los genes antisentido bloquean la expresin de
sus dianas cuando son introducidos en las clulas
eucariticas.
El apareamiento de bases es un medio eficaz pars
que un RNA controle la actividad de otro. Hay nu-
merosos casos en las procariotas y en las eucario-
tas en donde un RNA de cadena individual (por lo
general bastante corto) se aparea con una regin
complementaria de un RNAmy como resultado im-
pide la expresin del RNAm. Uno de los primero;
ejemplos de este efecto lo proporcion la situacin
artificial en la cual los genes antisentido fueron
introducidos en clulas eucariticas.
Los genes antisentido se construyen al revertir
la orientacin de un gen con respecto a su promo-
tor, de tal manera que la cadena "antisentido
"
ei
transcrita, como se ilustra en la IGURA 13.11. La sn-
tesis de RNA antisentido puede desactivar un RNA
CAPTULO 13 RNA regulador
zsr.i en las clulas eucariticas o en las clulas pro-
iticas. Un RNA antisentido es en efecto un RNA
Hilador sinttico. Un gen antisentido de cinasa de
dina inhibe la sntesis de la cinasa de timidina
r parte del gen endgeno. La cuantificacin del
:::
o no es por completo confiable, pero parece
;
puede ser necesario un exceso (quizs consi-
;
ble) de RNA antisentido.
A qu nivel inhibe la expresin el RNA anti-
fcttnido? En principio podra impedir la transcrip-
:
r. del gen autntico, el procesamiento de su pro-
ao de RNA o la traduccin del mensajero. Los
rsultados de diferentes sistemas muestran que la
"
. bidn depende de la formacin de molculas
RNA-RNA dplex, pero esto puede ocurrir en
lcleo o en el citoplasma. En el caso de un gen
"
asentido establemente acarreado por una clula
.
"
ivada
, los dplex de RNA con sentido-RNA an-
mtido se forman en el ncleo, lo que impide el
cesamiento normal o el transporte del RNA con
-
.:
ido. En otro caso, la inyeccin de RNA en el in-
r or del citoplasma inhibe la traduccin al formar
i A dplex en la regin 5' del RNAm.
Esta tcnica ofrece una metodologa eficaz para
5gar los genes a voluntad; por ejemplo, la funcin
:
ju gen regulador puede investigarse si se intro-
- :e una versin antisentido. Una extensin de esta
-
- mica es colocar el gen antisentido bajo el control
- un promotor que est sujeto a regulacin. El gen
ma puede despus ser encendido y apagado al re-
j lar la produccin de RNA antisentido. Esta tcni-
i permite investigar la importancia de la cronologa
;
'
a expresin del gen diana.
Las moLcuLas pequeas
de RNA son capaces de regular
La traduccin
-onceptos principales
Un RNA regulador funciona al formar una regin dplex
con un RNA diana.
La estructura dplex puede bloquear la iniciacin de la
traduccin, provocar la terminacin de la transcripcin
o crear una diana para una endonucleasa.
:.3 represores y los activadores son protenas de
r.uacin en trans, no obstante el sistema de circui-
s formal de una red reguladora podra construirse
nuy bien al utilizar un RNA como regulador. De
echo, el modelo original del opern dej abier-
l la pregunta de si el regulador puede ser RNA o
.
-tena. En efecto, resulta que la construccin de
iplculas sintticas de RNA antisentido imita a una
La transcripcin del RNA antisentido genera un RNA-RNA dplex
Promotor Gen de tipo siivestre
5 \/\/\/\/\/\/\/\/\/\/\/3
Transcrito
Promotor Gen antisentido
Transcrito antisentido
RNA-RNA dplex
FIGURA 13.11 El RNA antisentido puede generarse si se revierte la
orientacin de un gen con respecto a su promotor y puede asociarse
con el transcrito de tipo silvestre para formar RNA dplex.
clase de reguladores de RNA cuya importancia ha
ido en aumento.
Igual que una protena reguladora, un RNA
regulador pequeo es una molcula sintetizada de
manera independiente que se difunde a un sitio
diana formado por una secuencia de nucletidos
especfica. La diana de un RNA regulador es una
secuencia de cido nucleico de cadena individual.
El RNA regulador funciona por complementariedad
con su diana, en la cual puede formar una regin
de doble cadena.
Es posible imaginar dos mecanismos generales
para la accin de un RNA regulador:
.
La formacin de una regin dplex con el
cido nucleico diana inhibe en forma direc-
ta su capacidad para funcionar al formar
o secuestrar un sitio especfico. La FIGURA
ilustra una situacin en la cual a una
protena que se une a un RNA de cadena
individual se le impide actuar a travs de
la formacin de un dplex. La FIGURA 13.13
muestra la relacin opuesta, en la cual la
formacin de una regin de doble cadena
crea un sitio diana para una endonucleasa
que destruye la diana de RNA.
.
La formacin de una regin dplex en
una parte de la molcula diana cambia la
conformacin de otra regin, lo que afecta
de manera indirecta su funcin. La -GURA
13.14 ilustra un ejemplo. El mecanismo es
en esencia similar al uso de la estructura se-
cundaria en la atenuacin (vase la seccin
13.2, Las estructuras secundarias alternati-
vas controlan la atenuacin), excepto que
las regiones que interactan se encuentran
13.7 Las molculas pequeas de RNA son capaces de regular la traduccin
339
El regulador excluye la unin de la proteina
La protena se une
a una regin de
cadena individual
en la diana
La protena no puede unirse
a la diana
2 Una protena que se une a una regin de cade-
na individual en un RNA diana podra ser excluida por un RNA
regulador que forma un dplex en esta regin.
La endonucleasa divide la diana dplex
Al unirse a un RNA diana para formar una re-
gin dplex, un RNA regulador puede crear un sitio que es
atacado por una nucleasa.
a diana tiene una conformacin alternativa
La estructura secundaria
se forma en ausencia del
regulador
13.14 El apareamiento de bases con un RNA regulador
puede impedir la formacin de la estructura secundaria surgida
por el apareamiento de bases entre dos regiones del RNA diana.
En este ejemplo, la capacidad del extremo 3' del RNA de apa-
rearse con el extremo 5
'
es inhibida por el regulador.
en molculas diferentes de RNA en vez e
ser parte de la misma molcula de RNA.
La caracterstica comn de ambos tipos de regulacitr
mediada por el RNA es que los cambios en la estrucu.
secundaria de la diana controlan su actividad.
Un regulador de RNA pequeo casi siempre
puede ser encendido al controlar la transcripcin : .
su gen o ser apagado por una enzima que degrada
el producto de regulador de RNA. Por lo general b
imposible regular de otra manera la actividad de u:
RNA regulador. De hecho, antes se pensaba que r
era posible que un RNA tuviera propiedades ak-
tricas; a diferencia de las protenas represoras c.
controlan los operones, un RNA por lo general :.
puede responder a molculas pequeas con camb;i-
su capacidad para reconocer su diana.
El descubrimiento del ribointerruptor con?:
tuye una excepcin a esta regla. La FIGURA 13.15 re-
sume la regulacin del sistema que produce el meu-
bolito GlcN6P. El gen glmS codifica una enzima que
sintetiza GlcN6P (glucosamina-6-fosfato) a partir :-
fructosa-6-fosfato y glutamina. El RNAm conier-
una larga regin 5
'
no traducida {untranslated regi:-.
UTR) antes del marco codificador. Dentro de la UT:
hay una ribozima (una secuencia de RNA queier.:
actividad cataltica) (vase la seccin 27.4, Las rib .
zimas tienen varias actividades catalticas). En es-
caso, la actividad cataltica la proporciona una en-
donucleasa que divide su propio RNA. Es activa,
por la unin del metabolito, GlcNP, a la riboziir.;
La consecuencia es que la acumulacin de GlcN:"
activa la ribozima, la cual divide el RNAm, el cua :
su vez evita la traduccin. ste es un anlogo exac
del control alostrico de una proteina represora p
el producto terminal de una ruta metablica. Hj
numerosos ejemplos de dichos ribointerruptoresen
las bacterias.
Otro mecanismo regulador que comprende
la transcripcin de RNA no codificador trab= .
de manera indirecta. La iniciacin en un promo: -
diana puede ser suprimida por la transcripcin : -
otro promotor localizado en sentido ascendente
l, como se muestra en la FIGURA 13.16. La caus
de la inhibicin es que la polimerasa de RNA c.
inicia en el promotor que se encuentra en sent;;
ascendente hace la ultralectura del promotor que
encuentra en sentido descendente, lo cual imp:_
que los factores de transcripcin y la polimer,i-;.;
de RNA se unan a l. Este tipo de efecto se ha de
mostrado en sistemas eucariticos y puede dept
der de la interrupcin de la estructura cromosm.:
en el promotor diana. El RNA que se transcribe : -
promotor (regulador) que se encuentra en seno-
do ascendente no tiene funcin codificadora.
puede explicar la presencia de algunos de los R? -
no codificadores en los ncleos eucariticos; no s
340 CAPTULO 13 RNA regulador
A reguladores, sino que son productos indirectos
un sistema regulador.
Las bacterias contienen RNA
reguladores
Conceptos principales
.
Las molculas de RNA reguladoras bacterianas se
denominan sRNA.
.
Muchas de las molculas de sRNA estn unidas a la
protena Hfq, la cual incrementa su efectividad.
.
El sRNA OxyS activa o reprime la expresin de ms de
10 loci en el nivel postraduccional.
1
-
. las bacterias, los RNA reguladores son molcu-
bs cortas que se conocen en conjunto como sRNA
-
'
-
.ortRNA, RNA corto); E. coli contiene al menos 17
-
JIA diferentes. Algunos de los sRNA son regula-
dores generales que afectan numerosos genes diana.
Estos funcionan por apareamiento de bases con los
-
RNA diana (por lo general molculas de RNAm)
para controlar su estabilidad o su funcin.
Un ejemplo de control de estabilidad lo ofrece el
-
equeo regulador antisentido RyhB, el cual regula
ris molculas de RNAm que codifican protenas
-
"
.iplicadas en el almacenaje del hierro en E. coli.
El regulador RyhB se aparea con cada uno de los
RNAm diana para formar regiones de doble cadena
ue son sustratos para la RNAasa E. Una caracters-
:
ca interesante del circuito es que la ribonucleasa
lestruye el RNA regulador y el RNAm.
El estrs oxidativo proporciona un ejemplo de
un sistema de control general en el cual el RNA es
t\ regulador. Cuando son expuestas a especies reac-
tivas del oxgeno, las bacterias responden inducien-
io genes antioxidantes de defensa. El perxido de
drogeno enciende el activador de la transcripcin
I'xyR, el cual controla la expresin de numerosos
enes inducibles. Uno de estos genes es oxyS, el cual
Dodica un RNA pequeo.
La FIGURA 13.17 muestra dos caractersticas so-
I resalientes del control de la expresin del gen oxyS.
Pn una bacteria silvestre que se encuentra en con-
liciones normales, no se expresa. El par de geles del
ado izquierdo de la figura muestran que se expresa
m niveles altos en una bacteria muante con un
;
en constitutivo oxyR activo. Esto identifica a oxyS
como diana para la activacin por oxyR. El par de
geles en el lado derecho de la figura muestran que
el RNA OxyS se transcribe en 1 min de exposicin
al perxido de hidrgeno.
El RNA OxyS es una secuencia corta (de 109
aucletidos) que no codifica una protena. Es un
regulador de actuacin en trans que afecta la expre-
La GlcN6P activa una rbozima que divide el RNAm
Ribozima
RNAm glmS
5
'
Regin codificadora
3
'
1
traduccin
Enzima glmS
actividad enzimtica
I
Fru6P GlcN6P
O
INhU
r
1NH
2
Divisin
r
El RNAm es desactivado
FIGURA 13. La regin 5' no traducida del RNAm de la enzi-
ma que sintetiza GlcN6P contiene una ribozima que es activada
por el producto metablico. La ribozima desactiva el RNAm al
dividirlo.
La ultralectura de la transcripcin puede controlar la iniciacin
Ausencia de
Promotor terminadores Promotor
regulador diana
La iniciacin en el promotor regulador hace la ultralectura del promotor diana
RNA no codificador
La ausencia de iniciacin permite que los factores de transcripcin se unan
al promotor diana
I Iniciacin en el promotor diana
RNA codificador
La transcripcin a partir de un promotor en sentido as-
cendente puede inhibir la iniciacin en un promotor que se encuentra en
sentido descendente a l, debido a que la lectura a travs del promotor
que se encuentra en sentido descendente impide que los factores de
transcripcin necesarios se unan a l. El RNA transcrito del promotor
localizado en sentido ascendente no tiene funcin codificadora.
13.8 Las bacterias contienen RNA reguladores
341
oxyS es controlado por el muta
oxyR y por el H202
Tipo Mulante
silvestre oxyR
Adicin de H202
RNAm
oxyR
RNA oxyS
(109 nts)
FIGURA 13.17 Los geles deL lado izquierdo muestran que el
RNA oxyS es inducido en un motante constitutivo oxyR. Los
geles del Lado derecho muestran que el RNA oxyS es inducido
en un minuto a partir de la adicin de perxido de hidrgeno
a un cultivo de tipo silvestre. Reproducida de Ce//, vol. 90,
Altuvia, S., et al., A small stable RNA ... , pp. 44-53. Copyrig-
ht 1997, con autorizacin de ELsevier. Fotografa cortesa de
Gisela Storz, National Institutes of Health.
Un lazo terminal 3' del RNA oxyS se aparea con el sitio
de iniciacin del RNAm lhA
RNAm flhA
5' UUUGCGGUGCUUUCCUGGAAGAACAAAAUG..
AGQAGCU
RNA oxyS
FIGURA 13.16 El RNA oxyS inhibe La traduccin del RNAm flhA por el
apareamiento de bases con una secuencia localizada justo en sentido
ascendente del codn de iniciacin AUG.
sin gnica a niveles postraduccionales. Tiene ms
de 10 loci diana; en algunos de ellos activa la expre-
sin; en otros la reprime. lA FIGURA 13.18 muestra
el mecanismo de represin de una diana, el RNAm
FlhA. Tres estructuras tallo-lazo sobresalen en la es-
tructura secundaria del RNAm OxyS y el lazo que
se encuentra cerca del extremo 3
'
es complementa-
rio a una secuencia que precede justamente al co-
dn de iniciacin del RNAm FlhA. El apareamiento
de bases entre RNA OxyS y RNA FlhA impide que
el ribosoma se una al codn de iniciacin y, por lo
tanto, reprime la traduccin. Asimismo, hay una se-
gunda interaccin de apareamiento que comprende
una secuencia localizada dentro de la regin codi-
ficadora de FlhA.
Otra diana de oxyS es rpoS, el gen que codifica
un factor alternativo (el cual activa una respuesta de
estrs general). Al inhibir la produccin del factor-a.
oxyS garantiza que la respuesta especfica al estrs
oxidativo no desencadene la respuesta apropiada
para otras condiciones de estrs. El gen rpoS tam-
bin es regulado por otros sRNA (el DsrA y el RprAi,
los cuales lo activan. Estos tres sRNA parecen ser los
reguladores globales que coordinan las respuestas a
varias condiciones ambientales.
Las acciones de los tres sRNA son asistidas por
una protena de unin al RNA denominada Hfq.
Esta protena fue identificada en un principio como
un factor hospedador bacteriano indispensable para
la replicacin del bacterifago de RNA Q[3. Est rela-
cionado con las protenas Sm de las eucariotas que
se unen a muchos de los snRNA {small nuclear RNA
RNA nucleares pequeos) que tienen funciones
reguladoras en la expresin gnica (vase la sec-
cin 26.5, Los snRNA son necesarios para el corte y
empalme). Las mutaciones de este gen tienen nu-
merosos efectos, los cuales la identifican como una
protena pleiotrpica. Hfq se une a muchas de las
molculas de sRNA de E. coli e incrementa la efec-
tividad del RNA OxyS al potenciar su capacidad de
unirse a sus RNAm diana. Es probable que el efecto
de la protena Hfq est mediado por la provocacin de
un pequeo cambio en la estructura secundaria
del RNA OxyS que mejora la exposicin de las se-
cuencias de cadena individual que se aparean con
los RNAm diana.
Los microRNA son reguladores
en numerosas eucariotas
Conceptos principales
Los genomas de los animales y de las plantas codifican
numerosas molculas cortas de RNA (de -22 bases)
denominadas microRNA.
Los microRNA regulan la expresin gnica por medio de
apareamiento de bases con secuencias complementarias
en Los RNAm diana.
Los RNA muy pequeos son reguladores de gene;
en numerosas eucariotas. El primer ejemplo se des-
cubri en el nematodo Caenorhabditis elegans como
resultado de la interaccin entre el gen regulado:
342
CAPTULO 13 RNA regulador
i y su gen diana, HnM. La FIGURA 13.19 ilustra el
Tiportamiento de este sistema regulador. El gen
na UnM regula el desarrollo larvario. La expre-
n de HnM es controlada por el gen lin4, el cual
iifica un transcrito pequeo de 22 nucletidos.
i transcritos del gen lin4 son complementarios a
.
i secuencia de 10 bases que se repite siete veces
.a regin no traducida 3
'
de lml4. La expresin
'
-
in4 reprime la expresin de UnM despus de la
tscripcin, sobre todo debido a que la reaccin
apareamiento de bases entre los dos RNA pro-
a la degradacin del RNAm. Este sistema es en
~
:
cular interesante por la implicacin del extre-
3
'
como un sitio de regulacin.
El RNA lin4 es un ejemplo de un microRNA
iRNA). Hay -80 genes en el genoma de C. elegans
t codifican molculas de miRNA con una longi-
;
de 21 a 24 nucletidos. Tienen patrones varia-
s de expresin durante el desarrollo y tienden a
:
reguladores de la expresin gnica. Muchos de
.TiiRNA de C. elegans estn contenidos en una
.
r:cula ribonucleoprotenica extensa (de 15S).
Muchos de los miRNA de C. elegans tienen ho-
. gos en los mamferos, por lo que el mecanismo
lede ser propagado. Tambin se encuentran en
| plantas. De las 16 molculas de miRNA que se
:-entran en Arabidopss, ocho estn por comple-
r jnservadas en el arroz
, lo cual sugiere que se
i propagado la conservacin de este mecanismo
ulador.
El virus SV40 codifica molculas de miRNA que
-
complementarias a los RNAm producidos du-
~
:e el periodo temprano de la infeccin vrica. Los
JIA son transcritos despus en el ciclo vrico,
zan apareamiento de bases con los RNAm tem-
inos y provocan su degradacin en este punto del
lo vital, cuando dejan de ser necesarios.
El mecanismo de la produccin de los miRNA
nbin se ha conservado de manera generaliza-
En el ejemplo de lin4, el gen es copiado en un
r.scrito que forma una regin de doble cadena
:
se convierte en diana para una nucleasa deno-
dada Dicer. sta tiene actividad helicasa terminal
-= cual le
permite desenrollar la regin de doble
lena, y dos dominios de nucleasa que estn rela-
jados con la ribonucleasa III bacteriana. En las
:
cas, en los gusanos y en las plantas se encuen-
r.
enzimas relacionadas. La divisin del transcrito
r
.a! genera el miRNA activo. La interferencia de
LCtividad enzimtica bloquea la produccin de los
lRNA y provoca defectos del desarrollo.
En las plantas se ha descrito otro paso en la
-
acin de los miRNA; en ellas, la ribosa del
i.etido terminal 3
'
es metilada por la enzima
-
.iltransferasa HEI. La metilacin estabiliza el
NA.
iM4 codifica una sola protena
//x/y/y/y/y/x
/\y\/\/>y>y\
i
/WXA
I
Iin4 codifica un RNA que desactiva In14
\ \ m
/\y\y>y\/>y\
\
/\/\/\/wy\\
Proteina ausente
FIGURA 13.19 El RNA m4 regula la expresin de ImlA cuando
se une a la regin no traducida 3
'
.
La interferencia de RNA
est reLacionada con eL
siLenciamiento de Los genes
Conceptos principales
La interferencia de RNA desencadena la degradacin de
los RNAm complementarios a cualquier cadena corta
de dsRNA.
El dsRNA puede provocar el silenciamiento de los genes
hospedadores.
La regulacin de los RNAm por los miRNA es emu-
lada por el fenmeno de interferencia del RNA
[RNA interference, RNAi). Este fenmeno se descu-
bri cuando se observ que los RNA con sentido
y los RNA antisentido pueden inhibir la expresin
gnica con la misma eficacia. La razn es que las
preparaciones de cualquier tipo de RNA de cadena
individual (al parecer) estn de hecho contamina-
das por pequeas cantidades de RNA de doble ca-
dena (double stranded RNA, dsRNA).
Las investigaciones con un sistema in vitro
muestran que el dsRNA es degradado por medio de
la divisin dependiente de ATP para formar oligo-
nucletidos de 21 a 23 bases. El RNA corto en oca-
siones se denomina RNA corto interferente [short
13.10 La interferencia de RNA est relacionada con el siLenciamiento de Los genes
343
El dsRNA es dividido -22 bases a partir de los
extremos 3 para generar siRNA
.21-23 bases .
21-23 bases ) |
5
'
<
TTT3
3
'
. -. - - - 5'
siRNA ae2.1 -23 bases con exiremos 3
'
sobresalientes
El siRNA que media la interferencia del RNA se genera
cuando se divide el dsRNA en fragmentos ms pequeos. La reaccin
de divisin tiene lugar a una distancia de 21 a 23 nucletidos a partir
del extremo 3'. El producto de siRNA tiene bases sobresalientes en sus
extremos 3
'
.
La RNAi funciona al generar siRNA
La nucleasa divide el dsNA, en siRNA
dsRNA //
"
s/v/v/S/vrs/x
siRNA
Ei siRNA se aparea con el RNAm
RNAm
Helicasa
/\rS*/\/\y\/\
\
La nucleasa divide el RNAm
FIGURA 13. La RNAi se genera cuando un dsRNA es dividido
en fragmentos que dirigen la divisin del RNAm correspon-
diente.
interfering RNA, siRNA). La FIGURA 13. muestra
que el mecanismo de divisin comprende la reali-
zacin de cortes en relacin a cada extremo 3
'
de un
dsRNA largo para generar fragmentos de siRNA con
extremos cortos sobresalientes 3
'
(de dos bases). La
misma enzima (el Dicer) que genera los miRNA se
encarga de la divisin.
La RNAi ocurre despus de la transcripcin
cuando un siRNA induce la degradacin de un
RNAm complementario. La 13.2; sugiere
que el siRNA puede proporcionar un molde que
lleva a una nucleasa a degradar molculas de RNAm
que son complementarias a una o a ambas cadenas,
quiz por medio de un proceso en el cual el RNAm
se aparea con los fragmentos. Es probable que se
necesite una helicasa que ayude en la reaccin de
apareamiento. El siRNA dirige la divisin del RNAir
en la mitad del segmento apareado. Estas reaccione
tienen lugar dentro de un complejo ribonucleopro
tenico denominado RISC (RNA-induced silencin.
complex, complejo de silenciamiento inducido po.
RNA). Las protenas de la familia Argonauta so;
componentes de este complejo y son indispensable
para la reaccin de la divisin. La metilacin de 1
ribosa 3
'
puede ser necesaria para que el miRNA se_
incorporado al complejo.
Todava hay incertidumbre con respecto a si t
complejo RISC silencia la expresin gnica (vase h
seccin 31.1, La heterocromatina depende de nter
acciones con las histonas). La actividad de la poli-
merasa de RNA es necesaria para la interferencia t
RNA, pero no queda claro si es directa (debido a qu
forma transcritos que son necesarios) o indirect
(porque participa en la unin del RNA interferent
[RNAi] a los transcritos o debido a que separa la
cadenas de DNA durante la transcripcin, lo qu
permite una interaccin con el RNAi).
La RNAi se ha convertido en una tcnica eficc_
para eliminar la expresin de un gen diana especf
co en las clulas de los invertebrados, sobre todo e
C. elegans y en Drosophila melanogaster. Sin embargr
la tcnica ha tenido escasa aplicacin en las clula
de los mamferos, los cuales tienen una respues:
ms generalizada al dsRNA que consiste en apaga
la sntesis protenica y degradar el RNAm. La FIGIJH
13.22 muestra que esto sucede debido a dos reaccio
nes. El dsRNA activa la enzima PKR, la cual desac-
tiva el factor de iniciacin de la traduccin eIF2a ai
fosforilarlo. Tambin activa la ciclasa de oligoader.
lato 2'5', cuyo producto activa la RNAasa L, la cua
degrada todos los RNAm. No obstante, resulta qiw
estas reacciones necesitan dsRNA cuya longitud e
mayor a 26 nucletidos. Si se introduce dsRNA ma
corto (de 21 o 23 nucletidos) a las clulas de k
mamferos, desencadena la degradacin especfic
de los RNA complementarios tal como sucede ce-
la tcnica de RNAi en los gusanos y en las mosca?
Con este avance, parece probable que la RNAi s<
transforme en el mecanismo universal de eleccicr
para desactivar la expresin de un gen especfico.
Como ejemplo del progreso que se ha realizad
con dicha tcnica, ha sido posible utilizar la RNA
para un anlisis sistemtico de la expresin gnic
en C. elegans. Los fenotipos de prdida de la funcir
pueden ser generados al alimentar gusanos con baa
ferias que expresan un dsRNA que es homlogo
un gen diana. Al hacer una genoteca de bacteric
en la cual cada bacteria expresa un dsRNA que ce
rresponde a un gen distinto, los gusanos han sic
tamizados por los efectos de la desactivacin de I
mayor parte de los genes (86%).
344 CAPTULO 13 RNA regulador
La interferencia del RNA se relaciona con pro-
rsos naturales en los cuales la expresin gnica es
enciada. Las plantas y los hongos exhiben silen-
iamiento de RNA (algunas veces denominado
ilenciamiento gnico postranscripcional), en el cual
:
dsRNA inhibe la expresin de un gen. La fuente
Es comn de RNA es un virus en replicacin. Este
-Mecanismo pudo haber evolucionado como defensa
tontra infecciones vricas. Cuando un virus infecta
una clula vegetal, la formacin de dsRNA desenca-
dena la supresin de la expresin del genoma de la
.anta. El silenciamiento de RNA tiene, adems,
i caracterstica notable de que no est limitado a la
plula en la cual ocurre la infeccin vrica: puede
iiseminarse por toda la planta de forma sistmica.
U parecer, la propagacin de la seal comprende
ji paso de RNA o de fragmentos de RNA. Puede
.equerir alguna de las mismas caractersticas que
Estn implicadas en el desplazamiento del virus
"
lismo. Es posible que el silenciamiento de RNA
involucre una amplificacin de la seal por un pro-
ceso de sntesis de RNA dependiente de RNA en el
cual una polimerasa novedosa utiliza siRNA como
:
ebador para sintetizar ms RNA en un molde de
-
NA complementario.
Un proceso relacionado es el fenmeno de la co-
mpresin, en el cual la introduccin de un trans-
Rn hace que el gen endgeno correspondiente sea
enciado. Esto se ha descrito de manera amplia
ai las plantas. El efecto es que el transgn debe for-
mar las copias de RNA antisentido y de RNA con sen-
ado
, que inhiben la expresin del gen endgeno.
El silenciamiento sucede por medio de inter-
acciones RNA-RNA. Tambin es posible que el
;->RNA inhiba la expresin gnica al interactuar con
e DNA. Si una copia de DNA de una secuencia de
INA viroide es insertada en el genoma de una plan-
b
, se metila cuando el RNA viroide se replica. Esto
:
agiere que la secuencia de RNA podra estar indu-
endo la metilacin de la secuencia de DNA. En las
piulas de las plantas se ha detectado una direccin
imilar de la metilacin del DNA que corresponde
a las secuencias representadas en el dsRNA. La me-
tilacin del DNA est asociada a la represin de la
:
ranscripcin, por lo que sta podra ser otra forma
de silenciar los genes representados en el dsRNA
vase la seccin 24.18
, La expresin gnica est
isociada a la desmetilacin). No se sabe nada sobre
rl mecanismo.
Resumen
-a expresin gnica puede experimentar una re-
culacin positiva por parte de los factores que ac-
:
:
-van un gen o negativa por parte de los factores
El dsRNA tiene efectos generales y especficos
dsRNA>26 nucletidos
PKR
elF2a
i
O
\
2
'
,
5
'
AS
RNAasa L
J
siRNA se dirige al
RNAm complementario
RNAm degradado
/
La sntesis protenica
no puede iniciarse
Degradacin de todo e) RNAm
El dsRNA inhibe la sntesis protenica, desencadena
la degradacin de todos los RNAm en las clulas de los mamferos y
tambin tiene efectos especficos de secuencia.
que reprimen un gen. El primer nivel de control, y
el ms frecuente, tiene lugar en la iniciacin de la
transcripcin, pero la terminacin de la transcrip-
cin tambin puede ser controlada. La traduccin
puede ser regida por medio de reguladores que in-
teractan con el RNAm. Los productos reguladores
pueden ser protenas, las cuales son controladas a
menudo por interacciones alostricas en respuesta
al ambiente, o molculas de RNA, las cuales funcio-
nan al aparearse con el RNA diana para cambiar su
estructura secundaria. Las redes reguladoras pue-
den crearse al ligar reguladores de tal manera que
la produccin, o la actividad, de un regulador es
controlada por otro.
La atenuacin es un mecanismo que se sustenta
en la regulacin de la terminacin para controlar
la transcripcin a travs de los operones bacteria-
nos. Se utiliza a menudo en los operones que co-
difican las enzimas implicadas en la biosntesis de
un aminocido. El RNAm policistrnico del ope-
rn comienza con una secuencia que puede for-
mar estructuras secundarias alternativas. Una de las
estructuras tiene una horquilla que constituye un
terminador intrnseco localizado en sentido ascen-
dente con respecto a los genes estructurales; la estruc-
tura alternativa carece de la horquilla. Varios tipos
de interaccin determinan si se forma la horquilla.
Una interaccin sucede cuando una protena se une
al RNAm para impedir la formacin de la estructura
alternativa. En el opern trp de B. subtilis la TRAP
tiene esta funcin; es controlada por el anTRAP
cuya produccin es controlada a su vez por el nivel
de RNAtTtp aminoacilado sin carga. En los operones
13.11 Resumen 345
trp (y en otros operones) de E. coli, la eleccin de la
estructura que se forma es controlada por el progre-
so de la traduccin a travs de una secuencia lder
corta que incluye los codones del aminocido, o de
los aminocidos, que son el producto del sistema.
En presencia de RNAt aminoacilado que porta dicho
aminocido (o dichos aminocidos), los ribosomas
traducen el pptido lder, el cual permite que se for-
me una estructura secundaria que respalda la termi-
nacin. En ausencia de este RNAt aminoacilado el
ribosoma se detiene, lo cual da como resultado una
estructura secundaria nueva en la cual la horquilla
indispensable para la terminacin no puede formar-
se. El abastecimiento del RNAt aminoacilado, por lo
tanto, controla (de manera inversa) la biosntesis de
los aminocidos.
Los RNA reguladores pequeos se encuentran
en las bacterias y en las eucariotas. E. coli tiene -17
especies de sRNA. El sRNA oxyS controla unos 10
loci diana en el nivel postraduccional; algunos de
ellos son reprimidos en tanto que otros son acti-
vados. La represin es provocada cuando el sRNA
se une a un RNAm diana para formar una regin
dplex que incluye el sitio de unin al ribosoma.
Los microRNA tienen una longitud de -22 bases y
se producen en numerosas eucariotas por medio de
la divisin de un transcrito ms largo. Funcionan al
realizar apareamiento de bases con los RNAm diana
para formar regiones dplex que son susceptibles a
la divisin mediada por las endonucleasas. La degra-
dacin del RNAm impide su expresin. La tcnica
de la interferencia del RNA se ha convertido en el
mtodo de eleccin para desactivar los genes eu-
cariticos. Dicha tcnica utiliza la introduccin de
secuencias cortas de dsRNA con una cadena com-
plementaria al RNA diana y funciona al inducir la
degradacin de las dianas. Este mtodo puede estar
relacionado con un sistema de defensa natural de
las plantas denominado silenciamiento de RNA.
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348 CAPTULO 13 RNA regulador
14
Estrategias de los fagos
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
EL desarroLLo Ltico se divide en dos periodos
El ciclo infeccioso de un fago se divide en periodo
temprano (antes de la repticacin) y periodo tardo
(despus del comienzo de la replicacin).
.
Una infeccin por fagos genera un banco de genomas
fgicos descendientes que se replican y se recombinan.
EL desarroLLo Ltico es controLado por una cascada
Los genes tempranos transcritos por la polimerasa de
RNA hospedadora despus de la infeccin incluyen, o
comprenden, reguladores necesarios para la expresin del
conjunto intermedio de genes fgicos.
El conjunto intermedio de genes incluye reguladores para
transcribir los genes tardos.
.
Esto da como resultado la expresin ordenada de los grupos
de genes durante la infeccin fgica.
La cascada Ltica es controLada por dos tipos de
sucesos reguLadores
Las protenas reguladoras utilizadas en las cascadas de los
fagos pueden facilitar la iniciacin en promotores nuevos
(de fagos) o provocar la ultralectura de los terminadores de
la transcripcin por parte de la polimerasa hospedadora.
Los genomas de Los fagos T4 y T7 presentan
agrupacin funcionaL
Los genes implicados en funciones relacionadas a menudo
estn agrupados.
.
Los fagos T4 y T7 son ejemplos de casos en los que se
presentan cascadas reguladoras en las cuales la infeccin
por fagos se divide en tres periodos.
Los genes X tempranos inmediatos y tempranos
retrasados son indispensabLes para La Lisogenia y
para eL cicLo Ltico
.
El fago X tiene dos genes tempranos inmediatos, W y ero, los
cuales son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora.
El gen N es necesario para expresar los genes tempranos
retrasados.
Tres de los genes tempranos retrasados son reguladores.
La lisogenia necesita los genes tempranos retrasados cIJy
cIII.
El ciclo ltico requiere el gen temprano inmediato ero y el
gen temprano retrasado Q.
EL cicLo Ltico depende de La antiterminacin
.
pN es un factor de antiterminacin que permite a la
polimerasa de RNA continuar la transcripcin ms all de
los extremos de los dos genes tempranos inmediatos.
.
pQ es el producto de un gen temprano retrasado y es
un antiterminador que permite a la polimerasa de RNA
transcribir a los genes tardos.
El DNA X forma un crculo despus de la infeccin; como
resultado, los genes tardos constituyen una sola unidad de
transcripcin.
La Lisogenia La mantiene una protena represora
Los mutantes con mutaciones en el gen el son incapaces
de mantener la lisogenia.
.
El gen el codifica una protena represora que acta en los
operadores y 0
R
para bloquear la transcripcin de los
genes temoranos inmediatos.
Los genes tempranos inmediatos activan una cascada
reguladora; como resultado, su represin impide que el
ciclo ltico prosiga.
SKI EL represor y sus operadores definen La regin de
inmunidad
Numerosos fagos de tipo X tienen diferentes regiones de
inmunidad.
Un fago lisognico confiere inmunidad contra infecciones
posteriores por cualquier otro fago con la misma regin de
inmunidad.
lEBIil La forma de unin aL DNA deL represor es un
dmero
Un monmero represor tiene dos dominios distintos.
.
El dominio terminal N contiene el sitio de unin al DNA
.
El dominio terminal C se dimeriza.
La unin al operador requiere la forma dimrica para que
los dos dominios de unin al DNA puedan establecer
contacto con el operador de manera simultnea.
La divisin del represor entre los dos dominios reduce la
afinidad por el operador e induce un ciclo ltico,
tESIl EL represor utiLiza un eLemento hLice-giro-hLice
para unirse aL DNA
.
Cada regin de unin al DNA localizada en el represor
contacta a una mitad de sitio en el DNA.
El sitio de unin al DNA del represor incluye dos 'regiones
cortas de hlice a que embonan en giros sucesivos del
surco mayor del DNA.
.
Un sitio de unin al DNA es una secuencia (en parte)
palindrmica de 17 bp.
fESB La hLice de reconocimiento determina La
especificidad por eL DNA
La secuencia de aminocidos de la hlice de
reconocimiento hace contactos con bases particulares en la
secuencia operadora a la cual reconoce.
Contina en la siguiente pgina
349
tema
BH3
fisa
Los dmeros represores se unen en
coLaboracin al operador
.
La unin del represor a un operador incrementa la
afinidad de unin de un segundo dmero represor al
operador adyacente.
.
La afinidad es 10 veces mayor por 0
L
1 y por 0
R
1 que
por otros operadores, por lo que la unin sucede
primero en ellos.
.
La colaboracin permite al represor unirse a los sitios
01/02 en concentraciones ms bajas.
El represor en 0
R
2 interacta con la polimerasa
de RNA en el P
m
.
La regin de unin al DNA del represor en 0
R
2 contacta
a la polimerasa de RNA y estabiliza su unin al P
m
.
'
sta es la base del control autgeno del
mantenimiento del represor.
El represor mantiene un circuito autgeno
.
La unin del represor a 0
l
bloquea la transcripcin del
gen N del PL.
.
La unin del represor a 0
R
bloquea la transcripcin de
ero, pero es indispensable para la transcripcin de el.
.
Por lo tanto, la unin del represor al operador bloquea
la entrada al ciclo ltico al tiempo que facilita su
propia sntesis.
Las interacciones de colaboracin incrementan
la sensibilidad de la regulacin
*
Los dmeros represores unidos a 0
L
1 y a 0
L
2
interactan con los dmeros unidos a 0
R
1 y a 0
R
2 para
formar octmeros.
.
La formacin del octmero aproxima a 0 a 0
R
3
,
lo
que permite interacciones entre los dmeros unidos a
dichas regiones.
Estas interacciones de colaboracin incrementan la
sensibilidad de la regulacin.
Los genes di y cIII son necesarios para
establecer la lisogenia
.
Los productos de los genes tempranos retrasados di
y cIII son necesarios para que la polimerasa de RNA
inicie la transcripcin en el promotor P
RE.
*
di acta de manera directa en el promotor y cIII
protege a di de La degradacin.
.
La transcripcin a partir del P
RIL
provoca la sntesis de.
represor e incluso bloquea la transcripcin del gen cr:
Un mal promotor requiere protena di
.
El promotor P
RE
tiene secuencias atpicas en -10 y er
-
35.
.
La polimerasa de RNA se une al promotor slo en
presencia de di.
*
di se une a secuencias cercanas a la regin -35.
La lisogenia requiere numerosos sucesos
.
di y cIII provocan que se establezca la sntesis del
represor y tambin desencadenan la inhibicin de la
transcripcin de los genes tardos.
.
El establecimiento del represor apaga la expresin de
los genes tempranos inmediatos y retrasados.
.
El represor activa el circuito de mantenimiento para n
propia sntesis.
.
El DNA X se integra al genoma bacteriano en la etap=
final del establecimiento de la lisogenia.
El represor Cro es necesario para la infeccin
Ltica
.
Cro se une a los mismos operadores que el represor,
pero con afinidades distintas.
.
Cuando Cro se une al sitio 0
R
3
, impide que la
polimerasa de RNA se una a Pm y bloquea el
mantenimiento del represor.
.
Cuando Cro se une a otros operadores en 0
R
o en 0
L,
impide que la polimerasa de RNA exprese a los genes
tempranos inmediatos, lo cual bloquea (de forma
indirecta) el establecimiento del represor.
Qu determina el balance entre La lisogenia ,
el ciclo ltico?
-
La etapa temprana retrasada cuando Cro y el represo"
estn siendo expresados es comn en la lisogenia y 5-
el ciclo ltico.
.
El evento crtico ocurre si di provoca la sntesis
suficiente de represor para superar la accin de Cro.
Resumen
EJJ Introduccin
Algunos fagos tienen una sola estrategia de supervi-
vencia. Al infectar un solo hospedador susceptible,
subvierten sus funciones con el fin de producir una
progenie de fagos ms numerosa. Como resultado
de esta infeccin ltica, la bacteria hospedadora
muere. En el ciclo ltico caracterstico, el DNA (o el
RNA) del fago entra a la bacteria hospedadora, sus
genes se transcriben en un orden predeterminado,
el material gentico del fago se replica y los compo-
nentes protenicos del fago se producen. Por ltimo,
la bacteria hospedadora se rompe (se lisa) para libe-
rar las partculas ensambladas de la progenie por el
proceso de lisis.
Otros fagos tienen una existencia doble. Pueden
perpetuarse mediante el mismo tipo de ciclo ltico
utilizando una estrategia abierta para producir el
mayor nmero de copias tan rpido como sea posi-
ble. No obstante, tambin tienen otra forma de exw
tencia en la cual el genoma del fago est presente n
la bacteria de un modo latente que se conoce con:
profago. Esta forma de propagacin se denomirj
lisogenia.
En una bacteria lisognica, el profago se inserta
en el genoma bacteriano y se hereda de la misir
manera que los genes bacterianos. El proceso por e
cual se transforma de un genoma independiente de
fago en un profago que es parte lineal del genoim
bacteriano se describe como integracin. Debic
que posee un profago, una bacteria lisognica tieiM
inmunidad contra infecciones provocadas por fagM
del mismo tipo. La inmunidad la establece un so.
profago integrado, por lo que, en general, un geno-
ma bacteriano contiene slo una copia de un profag
de cualquier tipo particular.
Entre las formas de existencia ltica y lisognla
ocurren transiciones. La GURA 14.1 muestra qu.
350 CAPTULO 14 Estrategias de los faqos
todo un fago producido por un ciclo lrico entra a
nueva clula bacteriana hospedadora, repite el
ltico o entra en estado lisognico. El resultado
'
-
nde de las condiciones de la infeccin y del ge-
cpo del fago y del genotipo de la bacteria.
Un profago es liberado de las restricciones de
ingenia por medio de un proceso denominado
duccin. Primero el DNA del fago es liberado
i cromosoma bacteriano por escisin; despus el
lA libre contina por la ruta ltica.
las otras formas de propagarse de estos fagos
:r
. determinadas por la regulacin de la trans-
icin. La lisogenia se mantiene por la interaccin
- n fago represor con un operador. El ciclo ltico
jiere una cascada de controles de la transcrip-
r_. La transicin entre los dos estilos de vida se
ra por el establecimiento de la represin (de ciclo
do a lisogenia) o por la liberacin de la represin
;
accin de fago lisognico a fago ltico).
Otro tipo de existencia en las bacterias lo re-
centan los plsmidos. stos son unidades au-
oraas que existen en la clula como genomas
;
tracromosomicos. Los plsmidos son molculas
. llares de DNA que se autorreplican y que se
r
.tienen en la clula en un nmero de copias es-
4e y caracterstico, es decir, el nmero permanece
Btante de una generacin a la otra.
Algunos plsmidos tambin tienen otros estilos
vida. Pueden existir en estado extracromosmico
tnomo o pueden estar insertados en el cromo-
r.a bacteriano; en este ltimo caso, son trans-
itados como parte del cromosoma de la misma
era que cualquier otra secuencia. Dichas unida-
ise conocen como episomas, pero en ocasiones
trminos "plsmido" y "episoma
"
se utilizan de
era indistinta.
En cuanto a los fagos lisognicos, los plsmidos
I episomas mantienen una posesin egosta de
bacteria y con frecuencia hacen imposible que se
ablezca otro elemento del mismo tipo. Este efecto
:i.bin se denomina inmunidad, aunque la base
de la inmunidad por plsmidos es diferente a la de
la inmunidad Iisognica. (Se aborda el control de la
perpetuacin de los plsmidos en el Captulo 15, El
replicn.)
La FIGURA 1 resume los tipos de unidades
genticas que pueden propagarse en las bacterias
como genomas independientes. Los fagos lticos
pueden tener genomas de cualquier tipo de cido
nucleico; se transfieren entre las clulas por libe-
Un fago puede seguir la ruta ltica o la ruta Iisognica
CICLO UTICO
V
_
DNA del fago
DNA bace
USOGENIA
(I ( ) ' V.
.
.
EI DNA del fago es integrado al genoma;
.
bacteriano; la bacteria tiene un final feliz.
La progenie del fago es liberada
de la bacteria Usada
.
A
*
, La bacteria Iisognica es
l inmune a infecciones
.
posteriores
i tCCN
El DNA del fago es
iiberado y entra al ciclo
ltico
FIGURA 14 El desarrollo ltico comprende la reproduccin de las
partculas del fago con la destruccin de la bacteria hospedadora, pero
la existencia Iisognica permite que el genoma del fago sea transportado
como parte de la informacin gentica bacteriana.
Los fagos y los plsmidos viven en las bacterias
Tipo de unidad ta.Tuctura genmica roirvia it3 propagacin
Consecuencias
Fago ltico
Fago lisognico
DNA o RNA ds o ss
lineal o circular
dsDNA
Infecta a un hospedador
susceptible
Secuencia lineal en el
cromosoma hospedador
Suele matar al hospedador
Inmunidad contra la infeccin
Plsmido Crculo de dsDNA Se replica en un nmero
definido de copias
Puede ser transmisible
Inmunidad contra plsmidos
del mismo grupo
Episoma
Crculo de dsDNA
Crculo libre o lineal integrado Puede transferirse al DNA hospedadoi
En las bacterias hay numerosos tipos de unidades genticas independientes.
K
.
l Introduccin 351
racin de partculas infecciosas. Los fagos lisogni-
cos tienen genomas de DNA de doble cadena, igual
que los plsmidos y que los episomas. Algunos pls-
midos y episomas se transfieren entre las clulas
por un proceso de conjugacin (que comprende el
contacto directo entre la clula receptora y la c-
lula donadora). Una caracterstica del proceso de
transferencia en ambos casos es que en ocasiones
algunos genes bacterianos hospedadores son trans-
feridos con el DNA del fago o del plsmido, por lo
que estos sucesos tienen una funcin importante
al permitir el intercambio de informacin gentica
entre las bacterias.
ran EL desarro LLo Ltco se divide
en dos periodos
Conceptos principales
.
EL ciclo infeccioso de un fago se divide en periodo
temprano (antes de la replicacin) y periodo tardo
(despus del comienzo de la replicacin).
.
Una infeccin por fagos genera un banco de genomas
fgicos descendientes que se replican y se recombinan.
Los genomas de los fagos son pequeos por nece-
sidad. Como sucede con todos los virus, estn res-
tringidos por la necesidad de empaquetar el cido
nucleico en el interior de una envoltura de protena.
Esta limitacin dicta muchas de las estrategias vri-
cas de reproduccin. Por lo general, un virus toma
control del mecanismo de la clula hospedadora, el
cual luego replica y expresa los genes del fago en
vez de los genes bacterianos.
En la mayor parte de los casos, el fago inclu-
ye genes cuya funcin es garantizar la replicacin
preferencial del DNA del fago. Estos genes tienen
que ver con la iniciacin de la replicacin e incluso
pueden contener una nueva polimerasa de DNA. Se
introducen los cambios en la capacidad de la clu-
la hospedadora para desempear la transcripcin.
Involucran el remplazo de la polimerasa de RNA o
la modificacin de su capacidad de iniciacin o de
terminacin. El resultado siempre es el mismo: las
molculas de RNAm del fago se transcriben de ma-
nera preferente. En cuanto a la sntesis protenica,
en su mayor parte el fago se satisface utilizando el
mecanismo del hospedador y redirige las actividades
de ste, sobre todo al remplazar el RNAm bacteriano
por el RNAm del fago.
El desarrollo ltico se logra a travs de una ruta
en la cual los genes del fago se expresan en un or-
den particular. Esto garantiza que haya la cantidad
correcta de cada componente en el tiempo adecua-
do. El ciclo puede dividirse en las dos partes gene-
rales que se ilustran en la :
Los fagos se reciroducen en desarrollo ltico
Partcula
del fago i,
Infeccin
El fago se
adhiere a una
bacteria
.
El DNA es
inyectado al
Interior de la
bacteria
Dfsarrollc)
temprano
Se fabrican las
enzimas necesarias
para la sntesis del
DNA
Comienza la
replicacin
-y
Dasaxrollo
Se fabrican los
genomas, las
cabezas y las
colas
El DNA es
empacado en las
cabezas; se adhieren
las colas
Lisis
La clula se rompe
para liberar la
progenie del fago
El desarrollo ltico tiene lugar cuando se prr
cen genomas del fago y partculas protenicas que son ens;
blados en los fagos de la progenie.
.
Lainteccin etnprana describe el peri.
que abarca desde la entrada del DNA h;
el inicio de su replicacin.
.
La infeccin tarda define el periodo I
transcurre desde el inicio de la replicar
hasta la etapa final, que consiste en la
de la clula bacteriana para liberar la prc,
nie del fago.
La fase temprana est dedicada a la produce
de las enzimas implicadas en la reproduccin i
DNA. stas incluyen las enzimas que participan:
la sntesis del DNA, en la recombinacin y, a |
ees, en la modificacin. Sus actividades prova;
la acumulacin de un hanco de genomas fgio
En este banco, los genomas se estn replicando
recombinando de manera continua, por lo que
episodios de un solo ciclo ltico involucran a una pobls
de genomas de fagos.
Durante la fase tarda se sintetizan los comr
nentes protenicos de las partculas fgicas. A m
nudo son necesarias numerosas protenas distin
para formar las estructuras de la cabeza y de la 00
CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
-
.o que la mayor parte del genoma del fago con-
r en fundones tardas. Adems de las protenas
micturales, las "protenas de ensamblaje" son in-
-
ensables para ayudar a construir la partcula,
mque no se incorporen a ella. Mientras los com-
"
rntes estructurales se estn ensamblando en ca-
:;
s y colas, la replicacin del DNA ha alcanzado
asa mxima. Luego, los genomas se insertan en
:
abezas de protena vacas, se agregan las colas
b clula hospedadora se lisa para permitir la libe-
on de las nuevas partculas vricas.
El desarrollo ltico es
controlado por una cascada
;:
-
ceptos principales
-os genes tempranos transcritos por la polimerasa de
:
NA hospedadora despus de la infeccin incluyen, o
;
omprenden, reguladores necesarios para la expresin
:
el conjunto intermedio de genes fgicos.
1 conjunto intermedio de genes incluye reguladores
:
ara transcribir los genes tardos.
Esto da como resultado la expresin ordenada de los
:
rupos de genes durante La infeccin fgica.
. rganizacin del mapa gentico del fago a menu-
refleja la secuencia del desarrollo ltico. El con-
acpto del opern se lleva a una clase de extremo, en
-
ual los genes que codifican protenas con fun-
iones relacionadas son agrupados para permitir su
.::
ol con la mxima economa. Esto permite que
ruta del desarrollo ltico sea controlada con un
"
Tiueo nmero de interruptores reguladores.
El ciclo ltico se encuentra bajo control positivo,
:
'
.al manera que cada grupo de genes del fago
pede expresarse slo cuando se proporciona la se-
;
decuada. La GURA 14. muestra que los genes
: - .iladores funcionan en una cascada, en la cual
tagen que se expresa en una etapa es indispensable
asa la sntesis de los genes que se expresan en la
.
"
- iente etapa.
La primera etapa de la expresin gnica tiene
.
t valerse del mecanismo de transcripcin de la
.
Sula hospedadora. En general, slo se expresan
;;.
nos genes en esta etapa. Sus promotores son
distinguibles de los de los genes hospedadores.
Hnombre de esta clase de genes depende del fago.
;
"
.a mayor parte de los casos, se conocen como
ines tempranos. En el fago X, se les llama ge-
r
-
i tempranos inmediatos. A pesar del nombre,
r.
stituyen slo un conjunto preliminar de genes
-
e representan apenas la parte inicial del periodo
~
e
~
prano. En ocasiones se dedican de manera ex-
cesiva a controlar la transicin al siguiente periodo.
El desarrollo tilico es una cascada reguladora
Etapa temprana: los genes de los fagos son
transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora
Tipos de productos gnicos
Gen(es) regulador(s):
polimerasa de RNA, factor
a o factor de antiterminacin
Etapa intermedia el producto temprano provoca
la transcripcin de los genes Intermedios
Gen(es) regulador(es):
; factor o o factor de
antiterminacin
Genes estructurales:
T enzimas de replicacin, etc.
Etapa tarda: el producto intermedio provoca la
transcripcin de los genes tardos
Genes estructurales:
componentes del fago
FIGURA 14.4 El desarrollo ltico del fago avanza por una cas-
cada reguladora, en la cual un producto gnico es necesario
en cada etapa para la expresin de los genes de la siguiente
etapa.
En todos los casos, uno de estos genes siempre codifica
una protena indispensable para la transcripcin de la
siguiente clase de genes.
Esta segunda clase de genes se conoce como el
grupo de genes tempranos retrasados o inter-
medios. Su expresin suele comenzar en cuanto
est disponible la protena reguladora codificada por
un gen temprano, o por ms de uno. De acuerdo
con la naturaleza del circuito de control, el conjunto
inicial de genes tempranos puede continuar expre-
sndose en esta etapa o no hacerlo. Si el control
tiene lugar en la iniciacin, los dos sucesos son in-
dependientes (vase la ) y los genes tem-
pranos pueden ser desactivados cuando se transcri-
ben los genes intermedios. Si el control sucede en
la terminacin, los genes tempranos deben seguir
expresndose (vase la FIGURA 14.6). A menudo,
la
expresin de los genes hospedadores disminuye. En
conjunto, los dos grupos de genes tempranos repre-
sentan todas las funciones requeridas por el fago,
excepto aquellas necesarias para el ensamblaje de
la envoltura y para la lisis de la clula.
Cuando la replicacin del DNA del fago co-
mienza, es el momento indicado para que los genes
143 El desarrollo ltico es controlado por una cascada
El control en la inciacio
de RNAm indei
_ Regin Regin _
temprana siguiente
Promotor Terminador Promotor
SIGUIENTE INICIACION
; EL controL en La iniciacin utiLiza unidades de
transcripcin independientes, cada una con su propio promotor
y con su propio terminador. Las cuales producen molculas de
RNAm independientes. Las unidades de transcripcin no nece-
sitan localizarse cerca una de La otra.
El control en la terminacin genera una
sola molcula de RNAm
-
Regin tempranal- -"Regin siguiente-
Promotor Terminador
ANTITERMINACIN
Regin temprana
FIGURA 14.6 EL controL en La terminacin requiere unidades
adyacentes, de modo que La transcripcin pueda Leer desde el
primer gen hasta el interior del siguiente gen. Esto produce un
solo RNAm que contiene ambos conjuntos de genes.
tardos sean expresados. Su transcripcin en esta
etapa por lo general se organiza al incrustar un gen
regulador ms dentro del conjunto de genes previo
(temprano retrasado o intermedio). Este regulador
puede ser otro factor de antiterminacin (como en
X) o puede ser otro factor o (como en SPOl).
Una infeccin ltica a menudo se divide en tres
etapas, como se muestra en la Figura 14.4. La prime-
ra etapa consiste en la transcripcin de los genes tem-
pranos por la polimerasa de RNA hospedadora (en
ocasiones los reguladores son los nicos productos
presentes en esta etapa). La segunda etapa consir
en la transcripcin de los genes bajo la direccin di
regulador producido en la primera etapa (la ma;
parte de estos genes codifican enzimas indispeny
bles para la replicacin del DNA del fago). La eta:
final consiste en la transcripcin de los genes qn
codifican los componentes del fago bajo la direcci
de un regulador sintetizado en la segunda etapa.
El uso de estos controles sucesivos, en los cuales c.::
conjunto de genes contiene un regulador que es necesa-
para la expresin del siguiente conjunto, crea una casca
en la cual los grupos de genes son activados (y en oca:
nes desactivados) en momentos determinados. Los med:
utilizados para construir cada cascada fgica son :
ferentes, pero los resultados son similares, come
muestra en las secciones siguientes.
EJJ La cascada Ltica es controlad
por dos tipos de sucesos
reguladores
Concepto principal
Las protenas reguladoras utilizadas en las cascadas de
los fagos pueden facilitar la iniciacin en promotores
nuevos (de fagos) o provocar la ultralectura de Los
terminadores de la transcripcin por parte de la
polimerasa hospedadora.
En cada etapa de la expresin fgica, uno o ms de
los genes activos es un regulador indispensable par
la etapa siguiente. El regulador puede adquirir l
forma de una polimerasa nueva, de un factor o qv
redirige la especificidad de la polimerasa de RN.
hospedadora (vase la seccin 11.18, Los factores
pueden organizarse en cascadas) o de un factor I
antiterminacin que le permite leer un nuevo grup
de genes (vase la seccin 11.23, La antiterminaci
es un evento regulador). En las dos figuras que s
mencionan a continuacin se compara el uso del in
tercambio en la iniciacin o en la terminacin pai
controlar la expresin gnica.
Un mecanismo para el reconocimiento de pn.
motores fgicos nuevos consiste en remplazar el fa.
tor a de la enzima hospedadora por otro factor qu
redirija su especificidad en la iniciacin (vase l
Figura 11.31). Otro mecanismo consiste en sinteti
zar una polimerasa de RNA fgica nueva. En ambe
casos, la caracterstica fundamental que distingue
nuevo conjunto de genes es que poseen promotou
diferentes a los reconocidos en un principio por la polinu
rasa de RNA hospedadora. La Figura 14.5 muestra qu
los dos conjuntos de transcritos son independiente:
en consecuencia, la expresin de los genes tempra
nos puede cesar despus de que se haya producid
la polimerasa o el factor a nuevos.
354
CAPTULO 14 Estrategias de Los fagos
La antiterminacin constituye un mecanismo
-lemativo para que los fagos controlen el cambio
e genes tempranos a la siguiente etapa de expre-
in. El uso de la antiterminacin depende de una
rganizacin particular de genes. La Figura 14.6
lestra que los genes tempranos se ubican al lado
.
los genes que deben expresarse despus, pero
an separados de ellos por sitios terminadores. Si
r anpide la terminacin en estos sitios, la polimerasa hace
tralectura y llega hasta los genes que se encuentran
ti otro lado. Por lo tanto, en la antiterminacin
s mismos promotores continan siendo reconocidos
r la polimerasa de RNA. Como resultado, los ge-
es nuevos se expresan slo al extender la cadena
t RNA para formar molculas que contienen las
Ecuencias de los genes tempranos en el extremo 5
'
5 secuencias de los genes nuevos en el extremo
los dos tipos de secuencias permanecen ligados
; or lo tanto, la expresin de los genes tempranos
ntina de manera inevitable.
El gen regulador que controla el cambio de la
presin temprana inmediata a temprana retrasa-
i rn el fago X es identificado por medio de muta-
iones en el gen N que pueden transcribir slo a los
paes tempranos inmediatos; no avanzan ms en el
..o infeccioso (vase la Figura 11.53). El mismo
rao se observa cuando se muta el gen 28 del fago
.
:
DI para impedir la produccin de a8p28 (vase
i Figura 11.40). Desde el punto de vista gentico,
k mecanismos de iniciacin y de antiterminacin
. evos son similares. Ambos son controles positivos en
rales el producto de un gen temprano debe ser creado
-
el fago para expresar el siguiente conjunto de genes.
kl emplear los factores a o las protenas de anti-
frminacin con diferentes especificidades, puede
wistruirse una cascada para la expresin gnica.
BH Los genomas de Los fagos T4
y T7 presentan agrupacin
funcional
I;nceptos principales
.
Los genes implicados en funciones relacionadas a
nenudo estn agrupados.
Los fagos T4 y T7 son ejemplos de casos en los que
se presentan cascadas reguladoras en las cuales la
infeccin por fagos se divide en tres periodos.
B genoma del fago T7 tiene tres clases de genes,
taa uno de los cuales constituye un grupo de loci
dy acentes. Como se muestra en la FIGURA 14. , los
jeues de clase I son de tipo temprano inmediato y
Bu expresados por la polimerasa de RNA hospeda-
iora en cuanto entra el DNA del fago a la clula.
Clase I Clase II Clase III
5 genes 7 genes 13 genes
Polimerasa de RNA
Interferencia dei
hospedador ; |
Y
Sntesis de DNA
Lisozima 1
r
Cabezas y colas
Maduracin del DNA
FIGURA 14.1 El fago T7 contiene tres clases de genes que se
expresan de forma secuencial. El genoma mide~38 kb.
Entre los productos de estos genes se encuentran
una polimerasa de RNA fgica y las enzimas que in-
terfieren con la expresin gnica del hospedador. La
polimerasa de RNA fgica se encarga de la expresin
de los genes de clase n (los cuales intervienen sobre
todo en las funciones de la sntesis de DNA) y de los
genes de clase in (los cuales tienen que ver con el
ensamble de la partcula fgica madura).
El fago T4 tiene uno de los genomas fgicos ms
largos (165 kb), el cual est organizado en agrupa-
mientos funcionales extensos de genes. La FIGURA
14.8 presenta su mapa gentico. Los genes esenciales
estn numerados: una mutacin en cualquiera de
estos loci impide que se complete el ciclo ltico. Los
genes no esenciales se indican con abreviaturas de tres
letras. (Se definen como no esenciales conforme a
las condiciones habituales de la infeccin. En reali-
dad no se entiende porqu se incluyen tantos genes
no esenciales, pero al parecer confieren una ventaja
selectiva en algunos de los hbitat del fago T4. En
genomas fgicos ms pequeos, la mayor parte o
todos los genes son esenciales.)
Hay tres fases de expresin gnica. En la FIGU-
RA 14.S se muestra un resumen de las funciones
de los genes expresados en cada etapa. Los genes
tempranos los transcribe la polimerasa de RNA
hospedadora. Los genes intermedios tambin son
transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora,
pero tambin se necesitan dos productos fgicos co-
dificados, MotA y AsiA. Los promotores intermedios
carecen de secuencia de consenso en la posicin -30
y en cambio tienen una secuencia de unin para el
producto MotA. La protena fgica es un activador
que compensa la deficiencia del promotor al ayudar
en la unin de la polimerasa de RNA hospedadora.
(Este mecanismo es similar al utilizado por el fago
X
, el cual se ilustra despus en la Figura 14.30). Los
genes tempranos e intermedios representan casi to-
das las funciones del fago implicadas en la sntesis
de DNA, la modificacin de la estructura celular y la
transcripcin y traduccin de los genes del fago.
14.5 Los genomas de los fagos T4 y T7 presentan agrupacin funcional
355
n agrupamiento funcional
RNA tardo 55
RNA tardo 45.
42 43 62 44
polmerasa de DNA, etc.
cabeza 40.
40
68 6? 47
primasa de DNA
topoisomerasa 35
rllA, ri/Sl
topoisomerasa 52
f
38 37 36 35 34
fibras de la cola
33
RNA tardo
sintetasa de
dTMP ligasa de DNA 50
plataforma 54 48
* cinasa de timidina
ctenyendonucleasa V
s ipil, iplll protenas internas
e lisozima
57 fibra de la cola
\\ 7 cinasa de dNMP
3 terminador de la lmina
\\ 2 conclusin de la cabeza
50 conclusin de la cabeza
n
55 conclusin de la cabeza

u 5 conector de l
a plataforma
6 7 8 9 70 72
cua de la plataforma
3 '5 Jr
wac caoeza
78 lmina 79 cola
20 67 68 27 22 23 24
hoc inh cabeza 27 51 26 26
conector de la
plataforma
El mapa del fago T4 es circular. Hay un agrupamiento extenso de los genes que codifican los componentes
procesos del fago, como la replicacin del DNA, pero tambin hay dispersin de los genes que codifican una variedad de fur:
enzimticas, entre otras. Los genes esenciales se indican con nmeros. Los genes no esenciales estn representados con letn
el mapa se muestran slo algunos genes representativos del fago T4.
Los dos genes esenciales dentro de la categora
de la "transcripcin" ejercen una funcin regulado-
ra: sus productos son necesarios para la expresin
de los genes tardos. La infeccin por el fago T4 de-
pende de una relacin mecnica entre la replicacin
y la expresin de los genes tardos. Slo el DNA
que est siendo replicado en forma activa puede
utilizarse como molde para la transcripcin de los
genes tardos. La conexin se genera al introducir
un factor a nuevo y tambin al hacer otras modifi-
caciones en la polmerasa de RNA hospedadora, de
modo que sea activa slo con un molde de DNA en
replicacin. Este vnculo establece una correlacin
entre la sntesis de los componentes protenicos del
fago y el nmero de genomas disponibles para el
empaquetamiento.
Los genes X tempranos
inmediatos y tempranos
retrasados son indispensables
para la lisogenia y para el
ciclo ltico
Conceptos principales
.
El fago X tiene dos genes tempranos inmediatos, N y
ero, los cuales son transcritos por la polmerasa de RNA
hospedadora.
.
El gen /V es necesario para expresar los genes tempranos
retrasados.
.
Tres de los genes tempranos retrasados son reguladores.
La lisogenia necesita los genes tempranos retrasados di
y cZI.
.
El ciclo ltico requiere el gen temprano inmediato oj
el gen temprano retrasado Q.
Una de las cascadas ms intrincadas se obsen
el fago X. La cascada para el desarrollo ltico dt
cho es bastante sencilla, con dos reguladores
controlan las etapas sucesivas del desarrollo.
embargo, el circuito del ciclo ltico est ntrela/
con el circuito utilizado para establecer la lisog
como se resume en la 10.
Cuando el DNA del fago X entra a una nuel
lula hospedadora, las rutas ltica y lisognica ini
de la misma manera. Ambas requieren la expre
de los genes tempranos inmediatos y tempranc
trasados, pero despus divergen: el desarrollo
contina s los genes tardos son expresados.
lisogenia tiene lugar si se establece la sntesis
represor.
El fago X tiene slo dos genes tempranc
mediatos, los cuales transcribe de manera inde;
diente la polmerasa de RNA hospedadora:
.
El gen N codifica el factor de antiterm.
cin cuya accin en los sitios tjm permite
proceda la transcripcin en los genes I
pranos retrasados (vase la seccin 11
La anttermnacin requiere sitios que
independientes de los terminadores).
.
El gen ero tiene dos funciones: impi
sntesis del represor (una accin nece,
s procede el ciclo ltico) y desactiva la
presin de los genes tempranos inmed
(los cuales no son necesarios despus
ciclo ltico).
356
CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
Los genes del fago T4 se dividen en
s generales
ETAPAS TEMPRANA
E INTERMEDIA
SNTESIS DE DNA
Replicacin
17 genes esenciales
7 genes no esenciales
Modificacin
3 genes no esenciales
PRECURSORES DE DNA
Rompimiento del
DNA hospedador
2 genes esenciales
5 genes no esenciales
'
stabolismo de nucletidos
3 genes esenciales
10 genes no esenciales
ESTRUCTURA CELULAR
iones de la membrana
12 genes no esenciales
Lisia
2 genes no esenciales
EXPRESIN GNICA
Traduccin
'
2 genes no esenciales
Transcripcin
2 genes esenciales
5 genes no esenciales
FASE TARDIA
ENSAMBLE DE
LA CABEZA
Cabeza y cuello
2 genes esenciales
1 gen no esencial
Componentes de la cpside
7 genes esenciales
1 gen no esencial
Ensamble de la cpside
5 genes esenciales
4 genes no esenciales
Empaque del DNA
3 genes esenciales
2 genes no esenciales
ENSAMBLE DE LA COLA
Componentes de la
plataforma
13 genes esenciales
Ensamble de la plataforma
5 genes esenciales
2 genes no esenciales
Tubo y lmina
4 genes esenciales
Fibras de la cola
7 genes esenciales
1 gen no esencial
UKA 14.'J La cascada ltica del fago T4 se divide en dos
~
s: las funciones tempranas se relacionan con la sntesis y
- ;-esin del DNA; las funciones tardas tienen que ver con
"
samble de la partcula.
los genes tempranos retrasados incluyen dos
i :s de replicacin (indispensables para la infec-
:
ltica), siete genes de recombinacin (algunos
Meados en la recombinacin durante la infeccin
.i y dos necesarios para integrar el DNA X en el
:
-
mosoma bacteriano para la lisogenia) y tres ge-
reguladores. Los reguladores tienen funciones
ctrarias:
.
Los reguladores di y clll son necesarios para
establecer la sntesis del represor.
.
El regulador Q es un factor de antitermina-
cin que permite que la polimerasa de RNA
hospedadora transcriba los genes tardos.
Por lo tanto, los genes tempranos retrasados
r
.plen dos propsitos; algunos son necesarios para
: l
-
1 fago entre en lisogenia y los dems tienen que
"
:on el control del orden del ciclo ltico.
El fago tiene dos estilos de vida
CASCADA LTICA ESTABLECIMIENTO
LISOGNICO
represin
Tempranos inmediatos
cro = regulador negativo
N = antiterminador
Tempranos retrasados
cll, clll reguladores
7 genes de recombinacin
.2 genes de replicacin
:
Q antiterminador
V
Tardos
10 genes de la cabeza
11 genes de la cola
2 genes de llsis
PROGENIE DEL FAGO
represin
"
artlvcn
opresor cA
MANTENIMIENTO
LISOGNICO
FIGURA 14.10 La cascada ltica del fago X est entrelazada
con el circuito de la lisogenia.
EL cicLo Ltico depende
de La antiterminacin
Conceptos principales
pN es un factor de antiterminacin que permite
a la polimerasa de RNA continuar la transcripcin
despus de los extremos de los dos genes tempranos
inmediatos.
pQ es el producto de un gen temprano retrasado y es
un antiterminador que permite a la polimerasa de RNA
transcribir los genes tardos.
El DNA X forma un crculo despus de la infeccin;
como resultado, los genes tardos constituyen una sola
unidad de transcripcin.
Para desenredar las dos rutas, se considerar pri-
mero slo el ciclo ltico. La GURA 14.11 muestra el
mapa del DNA del fago X. Un grupo de genes que
intervienen en la regulacin es rodeado por los ge-
nes necesarios para la recombinacin y para la re-
plicacin. Los genes que codifican los componentes
estructurales del fago estn agrupados. Todos los
genes necesarios para el ciclo ltico se expresan en
transcritos policistrnicos a partir de los tres pro-
motores.
14.7 El ciclo ltico depende de la antiterminacn
357
del fago K estn agrupados por funcio
Promotores del ciclo ltico
PLPB
Genes de la cabeza Genes de la cola Recombinacin Regulacin Replicacin Lisis
AWBCNu3DEFf UVGTHMLKIJ attintxisa$yclll N el ero ellO P QSR
Indispensables para:
lisogenia
llsogenia y lisis
lisogenia
lisis
lisogenia
lisis
elll mantiene cll
N activa los tempranos retrasados
el es un represor lisognico
ero apaga el represor
cll enciende el represor
Q activa los tardos
FIGURA 14.11 El mapa deL fago \ muestra el agrupamiento de funciones relacio-
nadas. EL genoma mide 48 514 bp.
Promotores
-
Retrasada.- lnmediata-
0 Terminadores
U: N ero (ri
X tiene unidades de transcripcin a la derecha y a la
izquierda
-Unidad de transcripcin.
a la izquierda
Inmediata-
Pl
Inmediata Retrasada -
_Unidad de transcripcin
.
derecha
Etapa temprana inmediata: slo N y ero son transcritos
RNAm N
\X\/"V/RNAm ero
pN extiende la transcripcin a los genes tempranos
retrasados
cm ,
t
t
ero f
i
v/\y\/
FIGURA 14.12 El fago Atiene dos unidades de transcripcin
temprana. En la unidad "que se dirige a la izquierda", La cadena
"
superior
"
se transcribe hacia La izquierda; en la unidad "que
se dirige a La derecha
"
,
La cadena "inferior" se transcribe hacia
La derecha. Los genes N y ero son Los elementos tempranos
inmediatos y estn separados de Los genes tempranos retrasa-
dos por Los terminadores. La sntesis de La proteina N permite
que la polimerasa de RNA deje atrs a Los terminadores u a La
izquierda y a los t
R1
a La derecha.
La FIGURA 14.12 muestra que los dos genes tem-
pranos inmediatos, N y ero, son transcritos por la
polimerasa de RNA hospedadora. El gen N se trans-
cribe hacia la izquierda y el gen ero hacia la dere-
cha. Cada transcrito es terminado en el extremo del
gen. El regulador pN permite que la transcripcic-'
contine en los genes tempranos retrasados. Es un
factor de antiterminacin que suprime el uso c
los terminadores f
L
y tR (vase la seccin 11.25, L i
factores de terminacin y de antiterminacin inter-
actan con la polimerasa de RNA). En presencia
del regulador pN, la transcripcin contina hacia U
izquierda del gen N dentro de los genes de recon:-
binacin y hacia la derecha del gen ero dentro de los
genes de replicacin.
El mapa que se muestra en la Figura 14.11
muestra la organizacin del DNA X como existe
en la partcula del fago. No obstante, poco despuc_
de la infeccin los extremos del DNA se unen par:
formar un crculo. La FIGURA 14.13 muestra el ver-
dadero estado del DNA X durante la infeccin. Le*
genes tardos estn soldados en un solo grupo, ,
cual contiene los genes de lisis S-R a partir del extre-
mo derecho del DNA lineal y los genes de la cabsi
y de la cola A-J a partir del extremo izquierdo.
Los genes tardos se expresan como una sol
unidad de transcripcin, comenzando desde un pro-
motor ?
R
, que se encuentra entre Q y 5. El promotor
tardo se utiliza de manera constitutiva. Sin embar-
go, en ausencia del producto del gen Q (el cual es d
ltimo gen hacia la derecha de la unidad temprans
retrasada), la transcripcin tarda termina en un s -
tio f
R3.
El transcrito que surge de este episodio di-
terminacin tiene una longitud de 194 bases; se !t
conoce como RNA 6S. Cuando pQ queda disponi-
ble, suprime la terminacin en
R3
y el RNA 6S se
extiende, lo cual da como resultado la expresin ct
los genes tardos.
La transcripcin de los genes tardos no parece
terminar en un sitio especfico, sino que contin
por todos los genes tardos hasta la regin que SI
encuentra despus. Un episodio similar tiene lugn
en la transcripcin temprana retrasada hacia la ir
quierda, la cual contina ms all de las funcin;
358
CAPTULO 14 Estrategias de Los fagos
El fago k tiene tres etapas de desarrollo
Estado del DNA %
Etapa y actividad
c
Sc!IIWc/e
'
cabezal
Temprana
La polimerasa
de RNA
hospedadora
transcribe N y
era desde PL
Temprana
retrasada
pN permite la
transcripcin
desde los mismos
promotores para
continuar despus
de /V y de ero
Tarda
La transcripcin
inicia en Pr'
(entre O y S) y
pQ le permite
continuar por
todos los genes
tardos
>
0
cabeza
l
La Lisogenia La mantiene
una protena represora
HJRA 14.13 EL DNA X forma un crculo durante la infeccin,
tal manera que el agrupamiento de genes tardos est intac-
pi una unidad de transcripcin.
recombinacin. Es probable que la transcripcin
i cada direccin termine antes de que las polime-
sas choquen entre s.
Conceptos principales
Los mutantes con mutaciones en el gen el son
incapaces de mantener la lisogenia.
El gen el codifica una protena represora que acta en
Los operadores 0
L
y 0R para bloquear la transcripcin de
los genes tempranos inmediatos.
Los genes tempranos inmediatos activan una cascada
reguladora; como resultado, su represin impide que el
ciclo ltico prosiga.
Al analizar la cascada ltica del fago A,, se ve que el
programa completo es puesto en movimiento por la
iniciacin de la transcripcin en los dos promotores
?
L
y PR para los genes tempranos inmediatos Ny ero.
El fago X utiliza la antiterminacin para proceder a
la siguiente etapa de expresin (temprana retrasa-
da); por lo tanto, los mismos dos promotores siguen
utilizndose durante el periodo temprano.
El mapa expandido de la regin reguladora que
se ilustra en la FIGURA 14.14 muestra que los promo-
tores P
L
y PR se encuentran a ambos lados del gen el.
A cada promotor se asocia un operador (0
L
y 0R) al
cual se une la protena represora para impedir que
la polimerasa de RNA inicie la transcripcin. La se-
cuencia de cada operador se superpone al promotor
que controla y debido a que esto ocurre con tanta
frecuencia estas secuencias se describen como las
regiones de control P
L
/0
Ly yC .
Como resultado de la naturaleza secuencial de
la cascada ltica, las regiones de control constitu-
yen un sitio de presin en el cual puede controlar-
se la entrada a todo el ciclo. Al denegar el acceso de
la polimerasa de RNA a estos promotores, una protena
represora impide que el genoma del fago entre al ciclo
Meo. El represor funciona de la misma forma que
los represores de los operones bacterianos: se une a
operadores especficos.
. tiene una regin reguladora compacta
Cll) N
PL/0L
nutL
el
PR/0R nut PRE
era
Elementos
de actuacin
en e/s
cll Genes
Regulador Antiterminador Represor Antirrepresor Regulador Funciones
positivo positivo
< Regin de inmunidad >
FIGURA 14.14 La regin reguladora de X contiene un agrupamiento de funciones de actuacin
en trans y elementos de actuacin en 05.
14.8 La lisogenia la mantiene una protena represora
359
Los mulantes c afectan la morfologa de las placas
Mutante c
las placas son claras
Silvestre
las placas son turbias
4
GURA 14.15 Los fagos X silvestres pueden distinguirse de
Los mutantes virulentos por sus tipos de placas. Reproducida
de Virology, vol. 1, Kariser, D., pp. 423-443. Copyright 1955.
Con autorizacin de Elsevier. Fotografas cortesa de Dale Kai-
ser, Stanford University School of Medicine.
La protena represora es codificada por el gen
cl. Los fagos con mutaciones en este gen no pueden
mantener la lisogenia, pero siempre entran al ciclo
Utico. Desde el aislamiento original de la protena
represora, su descripcin ha demostrado cmo sta
mantiene el estado lisognico y proporciona inmu-
nidad a un lisgeno contra infecciones por nuevos
genomas del fago X.
Cuando se infecta un cultivo bacteriano con un
fago, las clulas se Usan y generan regiones que pue-
den observarse en una caja de cultivo como reas
diminutas de aclaramiento denominadas placas.
En los fagos silvestres las placas son turbias o estn
nubladas porque contienen algunas clulas que han
establecido la lisogenia en vez de ser Usadas. El efecto
de una mutacin cl es impedir la sogenia, de modo
que las placas slo contienen clulas Usadas. Como
resultado, una infeccin de estas caractersticas ge-
nera slo placas claras, y tres genes [cl, di y cIII) se
nombraron por su implicacin en este fenotipo. La FI-
GURA 14.15 compara las placas silvestres y mutantes.
El gen cl se transcribe desde el promotor P
RM
que se encuentra en su extremo derecho. (El subn-
dice "RM" significa repressor maintenance, manteni-
miento del represor.) La transcripcin termina en
el extremo izquierdo del gen. El RNAm comienza
en el codn de iniciacin AUG; debido a la ausencia
del sitio de unin de ribosomas habitual, el RNAm
se traduce en forma ineficiente y produce un nivel
muy bajo de protena represora.
123 EL represor y sus operadores
definen La regin de inmunidad
Conceptos principales
.
Numerosos fagos de tipo X tienen diferentes regiones
de inmunidad.
.
Un fago lisognico confiere inmunidad contra
infecciones posteriores por cualquier otro fago con la
misma regin de inmunidad.
La presencia del represor explica el fenmeno de 1c
inmunidad. Si un segundo DNA de fago X entra a
la clula lisognica, la protena represora sintetizada
a partir del genoma del profago residente de inme-
diato se unir al 0
L
y al 0R en el genoma nuevo. Este
impide que el segundo fago entre al ciclo Utico.
Los operadores se identificaron en un principie
como dianas para la accin represora por medio de
mutaciones virulentas (Xvir). Estas mutaciones im-
piden que el represor se una al 0L o al 0R, con n
resultado de que el fago entra de manera inevitable
a la ruta ltica cuando infecta a una nueva bacteria
hospedadora. Ntese que los mutantes v/r pueden
crecer en lisgenos debido a que las mutaciones vi-
rulentas en el 0
L
y en el 0R permiten que el fago
entrante ignore al represor residente y, por lo tanto.
entre al ciclo Utico. Las mutaciones virulentas en los
fagos son equivalentes a las mutaciones constituti-
vas del operador en los operones bacterianos.
El profago es inducido a entrar al ciclo litio:
cuando se rompe el circuito lisognico. Esto tiem
lugar cuando el represor es desactivado (vase la
seccin 14.10, La forma de unin al DNA del repre-
sor es un dmero). La ausencia de represor permite
que la polimerasa de RNA se una al PL y al PR, cor
lo que se inicia el ciclo Utico como se muestra en H
parte inferior de la Figura 14.26.
La naturaleza autgena del circuito de mante-
nimiento del represor crea una respuesta sensible
La presencia de un represor es indispensable para su
propia sntesis; por lo tanto, la expresin del gen J
se detiene en cuanto se destruye el represor existen-
te. En consecuencia, no se sintetiza ningn represor
para remplazar a las molculas que han sido daa-
das. Esto le permite al ciclo Utico comenzar sin inter-
ferencia del circuito que mantiene la lisogenia.
La regin que incluye los operadores izquierdo
y derecho, el gen cl y el gen ero determina la inmv -
nidad del fago. Cualquier fago que posea esta regir::
tendr el mismo tipo de inmunidad debido a qifl
especifica a la protena represora y a los sitios en los cuales
acta el represor. En consecuencia, a sta se le denomi-
na regin inmunitaria (como se seala en la Figu-
ra 14.14). Cada uno de los cuatro fagos lambdoidc_
cp80, 21,434 y A, tiene una regin inmunitaria nica.
Cuando se indica que un fago lisognico confiere
inmunidad contra otro fago del mismo tipo, lo qi3
se quiere decir con mayor precisin es que la inmu-
nidad acta frente a cualquier otro fago que tenga
la misma regin inmunitaria (a pesar de que ha; ;
diferencias en otras regiones).
360
CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
2E La forma de unin aL DNA
del represor es un dmero
lonceptos principales
.
Jn monmero represor tiene dos dominios distintos.
.
El dominio terminal N contiene el sitio de unin al DNA.
.
El dominio terminal C se dimeriza.
.a unin al operador requiere la forma dimrica
3ara que los dos dominios de unin al DNA puedan
establecer contacto con el operador de manera
simultnea.
.
.a divisin del represor entre los dos dominios reduce
.a afinidad por el operador e induce un ciclo litico.
El represor tiene dos dominios
C
236 . -
Dimenzacion C c
132
Conector
92
Unin al DNA N N
11
FIGURA 14.16 Las regiones terminal N y terminal C del repre-
sor forman dominios independientes. Los dominios terminales
C se asocian para formar dmeros; los dominios terminales N
se une al DNA.
?ubunidad represora es un polipptido de 27 kD
r
_ dos dominios distintos, los cuales se ilustran en
.
El dominio terminal N, que abarca del resi-
duo 1 al 92, proporciona el sitio de unin al
operador.
.
El dominio terminal C, formado por los re-
siduos 132-236, se encarga de la formacin
de dmeros.
Los dos dominios estn unidos por un conector
-
40 residuos. Cuando el represor es digerido por
.
3 proteasa,
cada dominio es liberado como un
:
ment separado.
Cada dominio es capaz de ejercer su funcin con
:
ependenda del otro. El fragmento terminal C pue-
.:
irmar oligmeros. El fragmento terminal N puede
"
.rse a los operadores, aunque con menor afinidad
.:
el represor intacto. Por lo tanto, la informacin
r iispensable para establecer contacto especfico con
1 NA est contenida dentro del dominio terminal
pero la eficiencia del proceso mejora con la adhe-
n del dominio terminal C.
La estructura dimrica del represor es crucial en el
-
.unimiento de la lisogenia. La induccin de un
rago lisognico a entrar al ciclo ltico la provoca
:
:
-vlsin de la subunidad represora ubicada en la
gin conectora, localizada entre los residuos 111
. i 3. (sta es la contraparte del cambio alostrico
!a conformacin que ocurre cuando una peque-
:
molcula inductora desactiva al represor de un
c-rn bacteriano
, una capacidad que no tiene el
-
"
resor lisognico.) La induccin ocurre bajo cier-
;
ondiciones adversas, como la exposicin de las
-.erias lisognicas a radiacin UV, lo que conduce
2 desactivacin proteoltica del represor.
En el estado intacto, la dimerizacin de los do-
ios terminales C garantiza que cuando el re-
;or se une al DNA
,
sus dos dominios terminales
contacten de manera simultnea. Ntese, sin
jargo, que la divisin libera los dominios ter-
ii ii iii ii iTr
:lo ltico
Los monmeros se
encuentran en equilibrio
con los dmeros, los
cuales se unen al DNA
La divisin de los
monmeros altera el
equilibrio, por lo que los
dmeros se disocian
LISOGENIA
INDUCCIN
Divisin -
a:
k
it
a:
>
:t
Los dmeros represores se unen al operador. La
afinidad de los dominios terminales N por el DNA es controlada
por la dimerizacin de los dominios terminales C.
mnales C de los dominios terminales N. Como se
ilustra en la FIGURA , esto significa que los do-
minios terminales N ya no pueden formar dmeros,
lo cual altera el equilibrio entre monmeros y d-
meros. Como resultado, el represor se disocia del
DNA, lo cual permite que inicie la infeccin ltica.
(Otro parmetro relevante es la prdida de efectos
cooperativos entre los dmeros adyacentes.)
14.10 La forma de unin al DNA del represor es un dmero
361
El balance entre la lisogenia y el ciclo ltico de-
pende de la concentracin de molculas de represor.
El represor intacto est presente en una clula lisog-
nica a una concentracin suficiente para garantizar
que los operadores estn ocupados. No obstante, si el
represor es divido, esta concentracin ser inadecua-
da, debido a la baja afinidad del domino terminal N
(separado) por el operador. Una concentracin muy
alta de represor har imposible inducir el ciclo ltico
de esta manera; un nivel muy bajo, por supuesto,
imposibilitar el mantenimiento de la lisogenia.
El represor utiliza un elemento
hlice-giro-hlice para unirse
al DNA
Conceptos principales
Cada regin de unin al DNA localizada en el represor
contacta a una mitad de sitio en el DNA.
El sitio de unin al DNA del represor incluye dos
regiones cortas de hlice a que embonan en giros
sucesivos del surco mayor del DNA.
Un sitio de unin al DNA es una secuencia (en parte)
palindrmica de 17 bp.
El operador es un palndromo
TACCTCTGGCGGTGATA
ATGGAGAGCGCCACTAT
FIGURA 14.18 El operador es una secuencia de 17 bp que
tiene un eje de simetra en el par de bases central. Cada mitad
de sitio se marca en color azul claro. Los pares de bases que
son idnticos en cada mitad del operador estn coloreados en
azul oscuro.
Un dmero represor es la unidad que se une al DN-
Reconoce una secuencia de 17 bp que exhibe si-
metra parcial con respecto a un eje formado pe:
el par de bases central. La ' IGURA 14.18 muestra \M
ejemplo de un sitio de unin. Las secuencias que i j
encuentran a ambos lados del par de bases central
en ocasiones se denominan
"
mitades de sitio
"
.
Cada
regin terminal N individual contacta a una mita;
de sitio. Numerosas protenas de unin al DNA qv:
regulan la transcripcin bacteriana comparten u
modo similar de sujecin del DNA, en el cual i
dominio activo contiene dos regiones cortas de h-
lice a que hacen contacto con el DNA. (Alguno
factores de transcripcin de las clulas eucariticai
utilizan un elemento similar; vase la seccin 25.1-
Los homeodominos se unen a dianas relacionadas
en el DNA.)
El dominio terminal N del represor X contier.r
numerosos fragmentos de hlice a, los cuales est;
organizados como se ilustra en el diagrama de
FIGURA 14.19
. Dos de las regiones helicoidales se e/
cargan de la unin al DNA. El modelo hlice-gire
hlice para el contacto con el DNA se ilustra en
FIGURA 14.20
.
En cada monmero, la hlice a 3 e-'-i
formada por nueve aminocidos, cada uno de las
cuales forma un ngulo con la regin hlice a 2, i
siete aminocidos, que la precede. En el dmero, !.
dos regiones de hlice a yuxtapuestas estn sepis-
das una distancia de 34 , lo cual les permite cae:
en surcos mayores sucesivos del DNA. Las regione
de hlice 2 forman un ngulo que las coloca a t:?
vs del surco. La unin simtrica del dmero al sr
significa que cada dominio terminal N del dme:
hace contacto con un conjunto similar de bases
su mitad de sitio.
El represor tiene elementos hlice-glro-hlice
Se desconoce la
estructura del
dominio terminal C
El domino terminal
N est formado por
cinco hlices a
r 4
El represor se une al DNA por medio
de dos hlices i <
FIGURA 14.19 Los dominios terminales N de los represores
de X contienen cinco fragmentos de hlice a; las hlices 2 y
3 se unen al DNA.
Mitad de sitio Mitad de sitio
FIGURA 14.20 En el modelo de dos hlices para la uni'"
DNA, la hlice 3 de cada monmero yace en el surco mayor
la misma cara del DNA, y la hlice 2 atraviesa el surco.
362
CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
La hlice de reconocimiento
determina la especificidad
por el DNA
I ncepto principal
La secuencia de aminocidos de la hlice de
reconocimiento hace contactos con bases particulares
en la secuencia operadora a La cual reconoce.
i
-
;
formas relacionadas de los motivos helicoidales
empleados en el elemento hlice-giro-hlice del
:
resor A, se encuentran en numerosas protenas de
~
:
3n al DNA, como la protena receptora de AMP
r
'
.ico [cyclic AMP receptor protein, CRP), el represor
- y muchos otros receptores de los fagos. Al com-
:
rar la capacidad de unin al DNA de estas prote-
;
5. se pueden definir las funciones de cada hlice:
.
Los contactos entre la hlice 3 y el DNA
se basan en puentes de hidrgeno que se
realizan entre las cadenas de aminocidos
y las posiciones expuestas de los pares de
bases. Esta hlice se encarga de reconocer
la secuencia especfica de DNA diana y, por
lo tanto, tambin se le conoce como hlice
de reconocimiento.
.
Los contactos que se establecen entre la
hlice 2 y el DNA adquieren la forma de
puentes de hidrgeno que se conectan al
esqueleto de fosfato. Estas interacciones son
necesarias para la unin pero no controlan
la especificidad del reconocimiento de la
diana. Adems de estos contactos, una gran
parte de toda la energa de la interaccin
con el DNA la proporcionan las interaccio-
nes inicas con el esqueleto de fosfato.
Qu sucede si se manipula la secuencia codifi-
idora para construir una nueva protena al susti-
- la hlice de reconocimiento en un represor con
-
ecuencia correspondiente de un represor que
:
elacione de cerca? La especificad de la protena
;rida es la de su nueva hlice de reconocimiento.
i Kcuencia de aminocidos de este tipo de regin de-
-
lina las especificidades de secuencia de las protenas
--
-viduales y puede actuar en conjunto con el resto de la
-
-
:
na polipeptdica.
La FIGURA 14.21 muestra los detalles de la unin
1 NA de dos protenas que se unen a secuencias
:
Z NA similares. El represor A y la protena Cro tie-
fii una organizacin similar en el elemento hlice-
-
hlice, aunque sus especificidades individuales
:el DNA no son idnticas:
.
Cada protena utiliza interacciones simila-
res entre los aminocidos hidrfobos para
mantener las relaciones entre la hlice 2 y
la hlice 3: el represor tiene una conexin
Ala-Val y Cro tiene una asociacin Ala-He.
.
Los aminocidos que se encuentran en la
hlice 3 del represor forman contactos con
bases especficas en el operador. Tres ami-
nocidos localizados en el represor recono-
cen tres bases del DNA; los aminocidos que
se encuentran en estas posiciones, y tambin
en otras posiciones de la protena Cro, reco-
nocen cinco (o quiz seis) bases en el DNA.
Otros dos aminocidos que participan en el re-
conocimiento especfico son idnticos en el represor
y en Cro (Gln y Ser en el extremo N de la hlice), en
tanto que los otros contactos son diferentes (Ala en
el represor frente a Lis y el Asn adicional en Cro).
Adems, una Treo en la hlice 2 de Cro entra en
contacto directo con el DNA.
Las interacciones que se muestran en la Figura
14.21 representan la unin a la secuencia de DNA
que cada protena reconoce con mayor firmeza. Las
secuencias que se muestran en la parte inferior de
la figura con los puntos de contacto en color azul
difieren en tres de los nueve pares de bases. El uso
de contactos superpuestos, pero no idnticos, entre
los aminocidos y las bases muestra cmo hlices de
reconocimiento relacionadas reconocen secuencias
de DNA relacionadas. Esto le permite al represor y
a la protena Cro reconocer el mismo conjunto de
secuencias, pero con afinidades relativas diferentes
por miembros determinados del grupo.
Las bases contactadas por la hlice 3 del repre-
sor o de Cro se encuentran en una cara del DNA,
como puede observarse por las posiciones indicadas
en el diagrama helicoidal de la Figura 14.21. Ntese,
sin embargo, que el represor hace un contacto ms
La hlice 3 determina la especificidad
de la unin al D
REPRESOR 0R1
i1 t
t Hlice 3
Val ie
Snnii alLaiiAsi
CR0-0R3
i y
Hlice 3
Ser L*S
Brazo
TACCTCTG
ATGGAGACC
TATCTCTT
ATAGGGAAC
Dos protenas que utilizan la estructura de do-
ble hlice para establecer contacto con el DNA reconocen a los
operadores X con afinidades determinadas por la secuencia de
aminocidos de la hlice 3.
14.12 La hlice de reconocimiento determina la especificidad por el DNA
363
Los brazos terminales N envuelven el DNA
Brazo de hlice 1
2S
4
Cllr
2 Una vista posterior muestra que eL volumen
del represor entra en contacto con una cara del DNA, pero sus
brazos terminales N rodean el DNA y alcanzan la otra cara.
con la otra cara del DNA. Al retirar los ltimos seis
aminocidos terminales N (los cuales sobresalen de
la hlice 1) se eliminan algunos de los contactos.
Esta observacin fundamenta la idea de que el vo-
lumen del dominio terminal N entra en contacto
con una cara del DNA, mientras que los ltimos seis
aminocidos terminales N forman un "brazo" que se
extiende alrededor del DNA por la parte posterior.
La 'GURA 14. muestra una vista desde la parte
posterior. Los residuos de lisina que se encuentran
en el brazo hacen contacto con los residuos de G
localizados en el surco mayor y tambin con el es-
queleto de fosfato. La interaccin entre el brazo y el
DNA contribuye de manera importante a la unin
al DNA; la afinidad de un represor sin brazo por el
DNA disminuye ~1 000 veces.
Las bases que no son contactadas en forma di-
recta por la protena represora pueden tener un
efecto importante en la unin. El represor del fago
434 se une al DNA por medio de un elemento hlice-
giro-hlice y la estructura cristalina muestra que las
hlices 3 estn colocadas en cada mitad de sitio para
contactar a los cinco pares de bases externos, pero
no a los dos internos. Sin embargo, los operadores
con pares de bases A-T en las posiciones internas
se unen al represor 434 con mayor fuerza que los
operadores con pares de bases G-C en las mismas
posiciones. La razn es que la unin del represor 434
tuerce ligeramente al DNA en el centro del opera-
dor, lo cual ampla el ngulo entre las dos mitades de
sitio del DNA -3. Es probable que esto se requiera
para permitir que cada monmero del dmero repre-
sor haga contactos ptimos con el DNA. Los pares
de bases A-T permiten que esta torsin suceda con
mayor facilidad que los pares G-C, lo cual afecta la
afinidad del operador por el represor.
Los dmeros represores se un ?
en coLaboracin aL operador
Conceptos principales
La unin del represor a un operador incrementa la
afinidad de unin de un segundo dmero represor al
operador adyacente.
.
La afinidad es 10 veces mayor por 0
L1 y por 0 que
por otros operadores, por lo que la unin sucede
primero en ellos.
.
La colaboracin permite al represor unirse a los sitios
01/02 en concentraciones ms bajas.
Cada operador contiene tres sitios de unin al repr-
sor. Como puede observarse en la GURA 14.23
,
los
seis sitios de unin al represor individuales no son
idnticos, pero todos se adaptan a una secuencia de
consenso. Los sitios de unin localizados en cade
operador estn separados por espaciadores de 3 \
7 bp ricos en pares de bases A-T. Los sitios de caJ:
operador estn numerados, de tal manera que el I
est formado por una serie de sitios de unin O,
'
-
0
R
2-0
R
3
, mientras que el 0
L
est formado por la serie
0
L
1-0
L
2-C
'
L
3
. En cada caso, el sitio 1 se encuentra
ms cerca del punto de inicio de la transcripcin en !
promotor y los sitios 2 y 3 se encuentran ms lejos en
sentido ascendente.
De acuerdo con la triplicacin de los sitios de
unin en cada operador cmo decide el represor en
donde iniciar la unin? En cada operador, el sitio 1
tiene mayor afinidad (unas 10 veces superior) q; _
los otros sitios por el represor. Por lo tanto, el repte-
sor siempre se une primero al 0
L
1 y al 0
R
1
.
El represor X se une a sitios subsiguientes dentro
cada operador de manera colaboradora. La presencia de
un dmero en el sitio 1 incrementa en gran medL :
la afinidad con la cual un segundo dmero pu dc
unirse al sitio 2. Cuando los sitios 1 y 2 estn ocupa
dos, esta interaccin no se extiende al sitio 3. En Ifl
concentraciones habituales de represor observad
en cada lisgeno, los sitios 1 y 2 de cada operador
estn ocupados, pero el sitio 3 est libre.
Si el sitio 1 es desactivado (debido a una milt
cin), el represor se une con fines de colaboracin
a los sitios 2 y 3. Es decir, la unin al sitio 2 ayudfl e
otro dmero a unirse al sitio 3. Esta interaccin ocv -
rre de manera directa entre los dmeros represor
y no por un cambio de conformacin en el DKA
El dominio terminal C se encarga tanto de la inter-
accin colaboradora entre los dmeros, como de -i
formacin del dmero entre subunidades. La FIGUM
muestra que involucra a ambas subunidad;
de cada dmero, es decir, cada subunidad contar;
a su contraparte en el otro dmero y se forma un
estructura tetramrica.
Una consecuencia de la unin colaboradora E
el incremento de la afinidad efectiva del repres
por el operador en concentraciones fisiolgicas. Es:
permite la presencia de una concentracin meffll
de represor para lograr la ocupacin del operade '
sta es una consideracin importante en un sistemi
en el cual la liberacin de la represin tiene conse-
364
CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
Cada promotor se superpone a un operador
c Sitio de unin de la polimerasa de RNA PRM
'
::3na represora
_s Treo Ser Met NH2
lAAACACGAGUAppp
:
.Amdecl 0R3 0R2 0R
1
ITGTGCTCATACGTTAAATCTATCACGGCAAGGGATAMTATCTAACACCGTGCGTGTTGAGTATTTTAGCTCTGGCGQTGATAATGGTTGC
bwMCACGAGTATGCMTTTAGATAGTGGCGTTCCCTATTTATAGATTGTGGCACGCACAACTGATAAAATGGAGACCGCCACTATTAGCAAGG
pppAUG
RNAm de ero
Sitio de unin de la polimerasa de RNA PR >
0L3 0L2 0L1
CAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCA
GTCTATTGGTAGACGGCACTATTTA ATAGAGACGGCCACAACTGTATTTATGGTGACCGCCAGTATGAGTCGTGTAGT
pppAUCA
RNAm de W
Sitio de unin de la polimerasa de RNA PL=
JIRA 14.23 Cada operador contiene tres sitios de unin al represor y se superpone al promotor al cual se une la polimerasa de
.-
.Se ha invertido La orientacin de 0
L
con respecto a lo habitual para facilitar la comparacin con 0
R
.
-os represores de X se unen al DNA en colaboracin!
*
lEURA 14.24 Cuando Los dos dmeros represores deXse unen
coLaboracin, cada una de Las subunidades de un dmero
; contacto con una subunidad del otro dmero.
encas irreversibles. En un opern que codifica
mas metablicas, la imposibilidad de reprimir
ttD slo permitir la sntesis innecesaria de enzimas.
"
-em
bargo, la incapacidad de reprimir al profago
i
'
ovocar la induccin del fago y la lisis de la
.Sula.
Por las secuencias ilustradas en la Figura 14.23,
uede observar que 0
L
1 y 0
R
1 se encuentran ms
-enos en el centro de los sitios de unin de la
-vmerasa de RNA de P
L
y de PR, respectivamente.
ft?r Ja tanto, la ocupacin de 0
L
1-0
L
2 y de 0
R
1-0
R
2
loquea en trminos fsicos el acceso de la polime-
Bsa de RNA a los promotores correspondientes.
EL represor en 0
R
2 interacta
con La poLimerasa de RNA
en eL P
C" CL RM
Conceptos principales
.
La regin de unin al DNA del represor en 0
R
2 contacta
a la polimerasa de RNA y estabiliza su unin al P
RM.
.
sta es la base del control autgeno del mantenimiento
del represor.
En la transcripcin de d, se observa una relacin di-
ferente entre 0
R
y el promotor PRM. El sitio de unin
de la polimerasa de RNA es adyacente a 0
R
2
. Esto
explica la manera en la que el represor regula de for-
ma autgena su propia sntesis. Cuando dos dmeros
estn unidos a 0
R
I-0
R
2
, el dmero que se encuentra
en C'
R
2 interacta con la polimerasa de RNA (va-
se la Figura 14.26 de la seccin 14.15, El represor
mantiene un circuito autgeno). Este efecto reside
en el dominio amino terminal del represor.
Las mutaciones que eliminan el control positivo
se mapean en el gen el. Los miembros de una clase
interesante de mutantes mantienen la capacidad de
unirse al operador para reprimir la transcripcin,
pero no pueden estimular a la polimerasa de RNA
para que transcriba desde P . Se mapean entre un
14.14 EL represor en 0
R
2 interacta con la polimerasa de RNA en el P
,
365
La hlice 2 interacta con la poilmerasa de RNA
Mutaciones de control positivo,
'
r-
il mmxfe
Las mutaciones de control positivo identifican
una regin minscula de la hlice 2 que interacta de manera
directa con la polimerasa de RNA.
El represor mantiene la lisogenia, pero est
ausente durante el ciclo ltico
LISOQENM
dmero
represor
monmero
represor

/X/X/V/ RNAm de el
l

0L/Pl gen represor el
El represor impide
que la polimerasa
de RNA se una a Pi
Or/Pr
La polimerasa de El represor impide
RNA se une a PRM que ia polimerasa de
y transcribe el RNA se una a PR
RNAm de N CICLO LITICO
La polimerasa de RNA no puede
iniciar en PRM en ausencia del
represor
La polimerasa de
RNA inicia en PR
La polimerasa de
RNA inicia en P,
RNAm de cri/V/\
La lisogenia se mantiene por medio de un circuito aut-
geno (seccin superior). Si este circuito es interrumpido, el ciclo ltico
comienza (seccin inferior).
pequeo grupo de aminocidos que se localizan en
el exterior de la hlice 2 o en la vuelta que se en-
cuentra entre la hlice 2 y la hlice 3. Las mutacio-
nes reducen la carga negativa de la regin; por el
contrario, las mutaciones que incrementan la carga
negativa intensifican la activacin de la polimerasa
de RNA. Esto sugiere que el grupo de aminocidos
constituye una
"
zona cida
"
que funciona por me-
dio de una interaccin electrosttica con una reg'
bsica en la polimerasa de RNA.
La ubicacin de estas "mutaciones de cont
_
positivo
"
en el represor se indica en la
Se encuentran en un sitio localizado en el reprl
que est cerca de un grupo fosfato del DNA, el c;
tambin est cerca de la polimerasa de RNA. P
lo tanto, el grupo de aminocidos del represor c
participa en el control positivo se encuentra en u
posicin que le permite entrar en contacto cor.
polimerasa. El principio importante es que las ir.:
acciones protena-protena pueden liberar energa qiK
aprovecha para ayudar a iniciar la transcripcin.
El sitio diana de la polimerasa de RNA que ce
tacta el represor est en la subunidad a70, dent
de la regin que hace contacto con la regin -
del promotor. La interaccin entre el represor v
polimerasa es indispensable para que la polimer;
efecte la transicin de un complejo cerrado a
complejo abierto (vase tambin la Figura 14.31
Esto explica la manera como los niveles bajo?
represor regulan en forma positiva su propia skA
sis. Siempre que haya suficiente represor para lie:"
a 0 2
, la polimerasa de RNA continuar transe
biendo al gen el de P
RM.
Effi El- represor mantiene
un circuito autgeno
Conceptos principales
La unin del represor a 0
L
bloquea la transcripcin de,
gen N del Pv
La unin del represor a 0, bloquea la transcripcin de
ero, pero es indispensable para la transcripcin de el.
Por lo tanto, la unin del represor al operador bloque:
la entrada al ciclo ltico al tiempo que facilita su pro:-
sntesis.
El represor se une de manera independiente a I
dos operadores. Tiene una sola funcin en 0
2
, pe
tiene funciones dobles en 0
o.
stas se ilustran en
regin superior de la 'GURA 14.26.
En O
v
el represor tiene el mismo tipo de efe:
que se analiz en muchos otros sistemas: imp:
que la polimerasa de RNA inicie la transcripc
en P
L
. Esto detiene la expresin del gen N. P.
utilizado en todos los episodios de transcripcin i
los genes tempranos a la izquierda; como resulta:
esta accin impide la expresin de toda la unidad
transcripcin temprana a la izquierda. Por lo tan
el ciclo ltico es bloqueado antes de que pueda prosegm
las fases posteriores a la etapa temprana.
En 0
R
1
, la unin del represor impide el use
P
R
. De este modo, ero y los otros genes temprdn
a la derecha no pueden ser expresados. (Ms ad
366- CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
r se analizar porqu es importante impedir la
resin de ero durante el mantenimiento de la
enia.)
5:n embargo, la presencia del represor en 0
R
- r otro efecto. El promotor de la sntesis del re-
: - r, ?
KM,
es adyacente al operador 0
R
a la dere-
:
Resulta que la polimerasa de RNA puede iniciar
-
mera eficiente en P
m
slo cuando el represor est
-
s? a 0
R
. El represor acta como una protena
-
/.adora positiva necesaria para la transcripcin
en el (vase la seccin 14.14, El represor en
1 nteracta con la polimerasa de RNA en el P
RM
).
irresor es el producto del gen el; por lo tanto, esta
mnaedn crea un circuito autgeno positivo, en el cual
- senda del represor es indispensable para respaldar
'
:
pia sntesis continua.
la naturaleza de este circuito de control explica
raractersticas biolgicas de la existencia lisog-
f - La lisogenia es estable debido a que el circuito
:
mtrol garantiza que siempre que el nivel de
-
esor sea adecuado, habr una expresin conti-
iel gen el. El resultado es que 0
L
y 0R perma-
;;
n ocupados de manera indefinida. Al reprimir
:-
cada ltica completa, esta accin mantiene el
:;
jgo en su estado inerte.
Las interacciones
de colaboracin incrementan
La sensibilidad de La regulacin
~
"
ceptos principales
los dmeros represores unidos a 0
L
1 y a 0
L
2 interactan
:Dn los dmeros unidos a 0
R
1 y a 0
R
2 para formar
: dameros.
La formacin del octmero aproxima 0
L
3 a 0
R
3
, y p
ermite
fracciones entre dmeros unidos a dichas regiones.
Estas interacciones de colaboracin incrementan la
;
=nsibilidad de la regulacin.
b interacciones de colaboracin entre los dmeros
resores tienen lugar en el operador izquierdo y
el operador derecho, por lo que su condicin
-
mal cuando estn ocupados por el represor es
"
n dmeros en los sitios de unin 1 y 2. En efec-
;
ada operador tiene un tetrmero de represor.
embargo, ste no es el fin de la historia. Los
. :etrmeros interactan entre s para formar un
:;:Tiero. La interaccin ocurre entre los dominios
T .inales C
, los cuales pueden formar un octmero
~
o una estructura cristalina.
La FIGURA 14.27 muestra la distribucin de los re-
;
sores en los sitios operadores que estn ocupados
:
n lisgeno. Los represores estn ocupando 0
L
1
,
1 0
R
1 y 0
R
2
, y el represor ubicado en el ltimo de
Los represores que se encuentran en O
,
y en 0R interactan
para formar un octmero
0
,
3 0
,
2 0
,
1
N
TA/A/* <\/Ma/V<\/
Estado del gen el: encendido
.
el
0
R
3 0
R
2 0*1
ero
FIGURA 14.27 En el estado lisognico, los represores unidos a 0
L
1
y a 0L2 interactan con aquellos unidos a 0R1 y a 0R2. La polimerasa
de RNA se une a P
m
(el cual se superpone a 0R3) e interacta con
el represor unido a 0
R
2
.
Los represores se unen a 0
,
3 y a 0
R
3 en concentraciones mayores
0L3 0L2 0L1 JL
Estado del gen el: apagado
(
c; 0R3 0R2 0R1
ero
PRM
8 0
L
3 y 0
R
3 se aproximan por la formacin del octmero
represor y un incremento de la concentracin de represor permite que
Los dmeros se unan a estos sitios e interacten.
estos sitios est interactuando con la polimerasa de
RNA, la cual est iniciando la transcripcin en ?
RM.
La interaccin entre los dos operadores tiene
mltiples consecuencias. Estabiliza la unin del
represor, lo que permite al represor ocupar ope-
radores en concentraciones ms bajas. La unin a
CI
R
2 estabiliza la unin de la polimerasa de RNA
en P
, lo cual permite que concentraciones bajas
de represor estimulen de forma autgena su propia
produccin.
El DNA localizado entre los sitios 0
y 0R (es de-
cir, el gen el) forma un lazo extenso, el cual se man-
tiene unido por el octmero represor. El octmero
aproxima a los sitios 0
L
3 y 0
E
3
. En consecuencia,
dos dmeros represores pueden unirse a estos sitios
e interactuar entre s, como se muestra en la FIGURA
14.28. La ocupacin de 0
R
3 impide que la polimera-
sa de RNA se una a y, por lo tanto, desactiva la
expresin del represor.
Esto muestra de qu manera la expresin del
gen el se hace en extremo sensible a la concentra-
cin del represor. En las concentraciones ms bajas,
forma el octmero y activa a la polimerasa de RNA
1.4.16 Las interacciones de colaboracin incrementan la sensibilidad de la regulacin
367
en una regulacin autgena positiva. Un incremen-
to de la concentracin permite la unin a 0
L
3 y a
0
R
3 y desactiva la transcripcin en una regulacin
autgena negativa. El umbral de los niveles de re-
presor necesarios para cada uno de estos episodios
se reduce por las interacciones de colaboracin, lo
cual hace a todo el sistema regulador mucho ms
sensible. Cualquier cambio en el nivel de represor
desencadena la respuesta reguladora apropiada para
restaurar el nivel lisognico.
El nivel global de represor se ha reducido (unas
tres veces con respecto al nivel que sera necesario si
no hubiera efectos de colaboracin) y como resulta-
do hay menos represor que tiene que ser eliminado
cuando se hace necesario para inducir al fago. Esto
incrementa la eficiencia de la induccin.
BQ Los genes di y cIII son
necesarios para establecer
La Lisogenia
Conceptos principales
Los productos de los genes tempranos retrasados di y
cIII son indispensables para que la polimerasa de RNA
inicie la transcripcin en el promotor P .
di acta de manera directa en el promotor y cIII
protege a di de la degradacin.
La transcripcin a partir del provoca la sntesis del
represor e incluso bloquea la transcripcin del gen ero.
El circuito de control para mantener la lisogenia
plantea una paradoja. La presencia de la protena re-
presora es indispensable para su propia sntesis. Esto
explica cmo se perpeta la condicin lisognica.
Ahora bien, cmo comienza la sntesis del represor
en primer lugar?
Cuando un DNA X entra a una nueva clula
hospedadora, la polimerasa de RNA es incapaz de
El establecimiento del represor
utiliza un promotor especial
r
Polimerasa de RNA
Protena CU
Pl'Ol o PrmPr/Or ero
a de KIMA /
o ero v
La sntesis del represor se establece por La
accin de La protena di y de La polimerasa de RNA en P
para iniciar la transcripcin que se extiende desde la cadena
antisentido de ero hasta el gen el.
transcribir el gen el debido a que no hay represor
que le ayude a unirse a P . Sin embargo, esta mis-
ma ausencia de represor significa que P
L
y PR estn
disponibles. Por lo tanto, el primer suceso despus de
que el DNA \ infecta una bacteria tiene lugar cuando
los genes Ny ero se transcriben. Despus, pN permite
que se extienda la transcripcin. Esto permite que
cIII (y otros genes) sean transcritos en el lado izquier-
do, mientras que di (y otros genes) son transcritos
en el lado derecho (vase la Figura 14.14).
Los genes cll y cIII comparten con el la pro-
piedad de que las mutaciones en ellos dan lugar a
placas claras. No obstante, hay una diferencia. Los
mulantes el no pueden establecer ni mantener la
lisogenia. Los murantes cll y elll tienen ciertas difi-
cultades para establecer la lisogenia, pero una vez
que se ha establecido, son capaces de mantenerla
por medio del circuito autgeno el.
Esto implica que los genes cll y elll son regula-
dores positivos cuyos productos son necesarios para
un sistema alternativo para la sntesis de represor.
El sistema es necesario slo para iniciar la expresin
de c/y superar la incapacidad del circuito autgeno de
comenzar la sntesis de novo. No son necesarios para
la expresin continua.
La protena cll acta de manera directa en la
expresin gnica. Entre los genes ero y c77se localiza
otro promotor denominado P
RE.
(El subndice "RE"
significa repressor establishment, establecimiento de!
represor.) Este promotor puede ser reconocido por
la polimerasa de RNA slo en presencia de la prote-
na cll, cuya accin se ilustra en la FIGURA 14.29.
La protena cll es en extremo inestable in vivo,
debido a que es degradada como resultado de la
actividad de una protena hospedadora denominada
HfiA. La funcin de cIII es proteger a cll contra esta
degradacin.
La transcripcin a partir de ?
RE
facilita la lisoge-
nia de dos maneras. Su efecto directo consiste en la
traduccin de el en la protena represora. Un efecto
indirecto consiste en que la transcripcin prosigue
por el gen ero en la direccin
"
incorrecta". De este
modo, la regin 5
'
del RNA corresponde a un trans-
crito antisentido de ero; de hecho, se hbrida con el
RNAm ero autntico, el cual inhibe su traduccin.
Esto es importante porque la expresin de ero es
necesaria para entrar al ciclo ltico (vase la seccin:
14.20, El represor ero es necesario para la infeccin
lrica).
La regin codificadora el en el transcrito P
RE
se
traduce de manera muy eficiente, en contraste con
la traduccin dbil del transcrito P
RM.
De hecho, el
represor es sintetizado con una eficacia unas siete
a ocho veces mayor con la expresin a partir de Pm
que de PRM. Esto hace evidente el hecho de que el
CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
:anscrito tiene un sitio eficiente de unin al
:bosoma
, mientras que el transcrito carece de
60 de unin al ribosoma y en realidad comienza
n el codn de iniciacin AUG.
Un mal promotor requiere
proteina cll
Conceptos principales
.
El promotor P
K
tiene secuencias atpicas en -10 y en
-
35.
.
La polimerasa de RNA se une al promotor slo en
presencia de cll.
.
cll se une a secuencias cercanas a la regin -35.
El promotor P
R
se ajusta mal a la secuencia de con-
rnso localizada en la posicin -10 y carece de una
;cuencia de consenso en -35. Esta deficiencia ex-
lica su dependencia de cll. In vitro, el promotor no
uede ser transcrito por la polimerasa de RNA sola,
)ero puede ser traducido cuando se agrega cll. El
rgulador se une a una regin que se extiende ms
> menos desde -25 hasta -45. Cuando se agrega po-
..merasa de RNA se protege una regin ms, la cual
I extiende desde -12 hasta +13. Como se resume
90 la FIGUR> U.30, las dos protenas se unen a sitios
jperpuestos.
La importancia de las regiones -35 y -10 para
a funcin del promotor, a pesar de la carencia de
emejanza con el consenso, la indica la existencia
le las mutaciones cy. Estas mutaciones tienen efec-
tos similares a los de las mutaciones cll y dll en la
j hibicin del establecimiento de la lisogenia; no
ostante, actan en cis en vez de hacerlo en trans.
Se clasifican en dos grupos, cyL y cyR, los cuales se
localizan en las posiciones de consenso -10 y -35.
Las mutaciones cyL se localizan alrededor de
-
10 y es probable que impidan que la polimerasa
de RNA reconozca al promotor.
Las mutaciones cyR se localizan alrededor de
-
35 y se dividen en dos tipos, uno que afecta la
-
nin de la polimerasa de RNA y otro que afecta
b unin de la protena cll. Las mutaciones localiza-
das en el centro de la regin no afectan la unin de
c; al parecer impiden la unin de la polimerasa
|e RNA. A ambos lados de esta regin, las mutacio-
les que se presentan en repeticiones tetramricas
:ortas, TTGC, evitan la unin de c. Cada base del
firmero est separada 10 bp (una vuelta de h-
;
ce) de su homlogo en el otro tetrmero, por lo
ne cuando cll reconoce los dos tetrmeros, sta se
encuentra en una cara de la doble hlice.
El control positivo de un promotor implica que
.
'
.na protena accesoria ha incrementado la eficien-
1a con la cual una polimerasa de RNA inicia la
cll permite que la polimerasa de RNA se una a P
nE
Unin de
Cll sola
Unin conjunta de Cll y polimerasa
-50 -40-30 -20 -10 l +10
Secuencia
habitual
en-35
TTGACA
Punto de inicio
Secuencia
habitual
en-10
TATAAT
GCAACGCAAACAAACGTGCTTGGTATACATTCATAAAGGAATCTA
CGTTGCGTTTGTTTGCACGAAGCATATGTAAGTATTTCGTTAGAT
***** * ***. * * *
Mutaciones cyR Mutaciones cyL
*
unin de la polimerasa unin de la polimerasa
.
afecta la unin de cll
La polimerasa de RNA se une a P
RE
slo en pre-
sencia de cll, que entra en contacto con la regin localizada
en la posicin -35.
Promotor REGULADOR
Jnln de la polimerasa Conversin cerrado-abierto
(constante de (constante de
equilibrio, /<
a
) velocidad, /c)
RE
represor
Cll
ningn efecto
100x 100z
La regulacin positiva puede influir en la polimerasa de
RNA en cualquier etapa del inicio de la transcripcin.
transcripcin. La indica que una o las
dos etapas de la interaccin entre el promotor y la
polimerasa pueden ser el objetivo de la regulacin.
La unin inicial para formar un complejo cerrado
o convertirlo en un complejo abierto puede inten-
sificarse.
FBff! La lisogenia requiere
numerosos sucesos
Conceptos principales
cll y cIII provocan que se establezca la sntesis del
represor y tambin desencadenan la inhibicin de la
transcripcin de los genes tardos.
El establecimiento del represor apaga la expresin de
los genes tempranos inmediatos y retrasados.
El represor activa el circuito de mantenimiento para su
propia sntesis.
El DNA X se integra al genoma bacteriano en la etapa
final del establecimiento de la lisogenia.
14.19 La lisogenia requiere numerosos sucesos
369
La ruta lisognica conduce a la sntesis del represor

clll k N | rL/uL 01 rRM r

-
RE
PR/0Rcro i R
/v/v
P, /o, c/
ETAPA
TEMPRANA
INMEDIATA
N y cto son
transcritos
cll
t
era c//
I
ETAPA
TEMPRANA
RETRASADA
N produce
antiterminacin;
cll y c/// son
transcritos
ESTABLECIMIENTO
DELAiMSOGfm i
cll acta en P
RE
:
el es transcrito
I
PL/0L el f PRv1
Pr/Or
MANTEMMiENTO
DELAUSOSEMU
El represor se
une a 0
L
y a 0B;
el es transcrito
desde P
m.
FIGURA 14.32 Para establecer la lisogenia se requiere una cascada, pero este circuito es desac-
tivado despus y es remplazado por el circuito autgeno de mantenimiento del represor.
Ahora se puede ver cmo se establece la lisogenia
durante una infeccin. La FIGURA 14.32 recapitula
las etapas tempranas y muestra lo que sucede como
resultado de la expresin de los genes clll y cll. La
presencia de cll permite que se aproveche para
extender el transcrito a travs de el. La protena re-
presora se sintetiza en grandes cantidades a partir de
este transcrito y de inmediato se une a 0
L
y a 0R.
Al inhibir en forma directa la transcripcin a
partir de PL y PR, la unin del represor apaga la ex-
presin de todos los genes del fago. Esto detiene la
sntesis de cll y de clll, las cuales son inestables; fr
degradan con rapidez, lo cual ocasiona que PM p
no pueda ser utilizado. As, la sntesis del represor i
travs del circuito de establecimiento se detiene.
No obstante, ahora el represor est presente en
0
R
. ste activa el circuito de mantenimiento para U
expresin de ?
RM.
El represor contina siendo sinte-
tizado, aunque al nivel ms bajo tpico de la funcin.
de P
RM.
Por lo tanto, el circuito de establecimiem.'
inicia la sntesis de represor en un nivel alto. Luegj
el represor desactiva todas las dems funciones,;
37-1 CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
no que activa el circuito de mantenimiento, el
-
:
-
lunciona en el nivel bajo adecuado para man-
"
rrla lisogenia.
En este momento no se abordarn con detalle
iems funciones indispensables para establecer
-
_>gema, pero se subrayar de manera breve que
_ XA \ infeccioso debe ser insertado en el genoma
;:
'
.eriano (vase la seccin 19.17, La recombina-
n especializada comprende sitios especficos). La
L-rcin nece
sita el producto del gen int, el cual se
:
esa desde su propio promotor P
l,
en el cual tam-
:::
es necesaria la protena di. La secuencia de f-
. ~ :
be homologa con la de P
RE
en el sitio de unin
cll (aunque no en la regin -10). Las funciones
. ;esarias para establecer el circuito de control li-
cnico se encuentran, por lo tanto, bajo el mismo
r.trol que las funciones necesarias para integrar
DNA del fago al genoma bacteriano. En conse-
encia, el establecimiento de la lisogenia est bajo
"
control que garantiza que todos los episodios
rispensables tengan lugar en sincrona.
Con nfasis en la cualidad truculenta de la cas-
cada intricada de X, ahora se sabe que cll facilita la
. genia de otra forma indirecta. Respalda la trans-
- ipcin a partir de un promotor denominado P
nii.Q,
.
;ual se localiza en el gen Q. Este transcrito es una
rrsin antisentido de la regin Q, y se hbrida con
B RNAm Q para impedir la traduccin de la protena
cuya sntesis es esencial para el desarrollo ltico.
:
lo tanto, los mismos mecanismos que facilitan
-:
modo directo la lisogenia al provocar la transcrip-
n del gen represor el tambin ayudan de manera
.directa a la lisogenia al inhibir la expresin de los
;
enes cro (vase antes) y Q, los genes reguladores
q ecesarios para la ruta ltica antagnica.
JJg] EL represor Cro es necesario
para La infeccin Ltica
Conceptos principales
.
Cro se une a tos mismos operadores que el represor,
pero con afinidades distintas.
.
Cuando Cro se une al sitio 0
R
3
, impide que la
polimerasa de RNA se una a Pm y bloquea el
mantenimiento del represor.
.
Cuando Cro se une a otros operadores en 0
R
o en 0
U
impide que la polimerasa de RNA exprese los genes
tempranos inmediatos, lo cual bloquea (de forma
indirecta) el establecimiento del represor.
Lambda tiene como alternativas entrar en lisoge-
nia o comenzar una infeccin ltica. La lisogenia se
inicia cuando se establece un circuito de manteni-
miento autgeno que inhibe la cascada ltica com-
pleta al ejercer presin en dos puntos. El programa
para el establecimiento de la lisogenia pasa por al-
gunos de los mismos episodios necesarios para la
cascada ltica (es necesaria la expresin de los genes
tempranos retrasados a travs de la expresin del
gen N). Ahora surge un problema. Cmo entra el
fago al ciclo ltico?
La influencia clave en el ciclo ltico es la fun-
cin del gen cro, el cual codifica otro represor. Cro se
encarga de evitar la sntesis de la protena represora; esta
accin elimina la posibilidad de establecer la lisoge-
nia. Los mutantes cro suelen establecer la lisogenia
en vez de entrar a la ruta ltica, debido a que carecen
de la capacidad de desviar los sucesos y alejarlos de
la expresin del represor,
Cro forma un dmero pequeo (la subunidad es
de 9 kD) que acta dentro de la regin de inmuni-
dad. Tiene dos efectos:
.
Impide la sntesis del represor a travs del
circuito de mantenimiento; es decir, impide
la transcripcin por medio de ? .
.
Tambin inhibe la expresin de los genes
tempranos a partir de P
L
y de PR.
Esto significa que, cuando un fago entra a la
ruta ltica, Cro se encarga de evitar la sntesis del
represor y (de manera subsecuente) de inhibir la
expresin de los genes tempranos.
Cro ejerce su funcin al unirse a los mismos
operadores que la protena represora [el). Cro in-
cluye una regin con la misma estructura general
que el represor; una hlice 2 forma un ngulo con
respecto a la hlice 3 de reconocimiento. (El resto
de la estructura es diferente, lo cual demuestra que
el elemento hlice-giro-hlice puede operar en va-
rios contextos.) Igual que el represor, Cro se une en
forma simtrica a los operadores.
Las secuencias de Cro y del represor en la regin
hlice-giro-hlice estn relacionadas, lo cual explica
su capacidad de establecer contacto con las mismas
secuencias de DNA (vase la Figura 14.21). Cro for-
ma contactos similares a los que hace el represor,
pero se une a una sola cara del DNA; carece de los
brazos terminales N por medio de los cuales el re-
presor rodea la estructura duplohelicoidal.
Cmo pueden dos protenas tener los mismos
sitios de accin y tener efectos tan opuestos? La
respuesta se encuentra en las afinidades diferen-
tes que cada protena tiene por los sitios de unin
individuales dentro de los operadores. Se analizar
slo el operador 0
R,
del cual se tiene mayor cono-
cimiento y en donde Cro ejerce sus dos efectos. La
serie de sucesos se ilustra en la GURA 14. j . (Ntese
que las primeras dos etapas son idnticas a aquellas
del circuito lisognico que se muestra en la Figura
14.32.)
14,20 El represor Cro es necesario para la infeccin ltica
371
La ruta ltica conduce a la expresin de cro y de los genes tardos
t
el
RM
'
RF
Pf/0Rcro | R cll
ETAPA
TEMPRANA
INMEDIATA
N y cro son
transcritos
Oftt N
RM
ETAPA
TEMPRANA
RETRASADA
>'\>\> >> >
'
/\7V/\ N Produce
PR/ORcro
"
| di
cll y c/// son
transcritos
O (3
t I
Oltl N |
CONTINUACIN
DE LA ETAPA
TEMPRANA
RETRASADA
PVl
>\y\> \>\y\y\y\>\>\ c l, so une a
Pr/OhCtoI c//
ETAPA DE
PRM EXPRESIN
y\/\/ \y\/\/\/\y-y\
tarda
Cro repnme a c/ y
Pr/OrCto c// p
R, a todos los genes
tempranos; pQ
I activa la expresin
'
tarda
La cascada ltica necesita la protena Cro, la cuaL impide de manera directa ei
mantenimiento del represor a travs de P
m,
as como La desactivacin de la expresin de Los genes
tempranos retrasados. Lo que impide de manera indirecta el establecimiento del represor.
La afinidad de Cro por 0
R
3 es mayor que su
afinidad por 0
R
2 o que por 0
R
1
. Por lo tanto, se une
primero a 0 . Esto inhibe la unin de la polimerasa
de RNA a P
RM.
Como resultado, la primera accin
de Cro es impedir la participacin del circuito de
mantenimiento de la lisogenia.
Despus Cro se une a 0
R
2 o a 0
R
1.
Su afinidad
por estos sitios es similar y no hay efecto de colabo-
racin. Su presencia en cualquier sitio es suficiente
para impedir que la polimerasa de RNA utilice PR.
Esto a su vez detiene la elaboracin de los produc-
tos tempranos (incluso Cro). Como resultado de la
inestabilidad de cll, se inhibe cualquier uso de ?J
As, las dos acciones de Cro juntas bloquean toda la
produccin del represor.
En cuanto al ciclo ltico, Cro inhibe la expre-
sin de los genes tempranos (aunque no la elimina
por completo). Su efecto incompleto lo explica
afinidad por 0
R
1 y por 0
R
2
,
la cual es unas ocb
veces menor que la del represor. Este efecto de Cn
no ocurre hasta que los genes tempranos se han
vuelto ms o menos superuos, debido a la presen-
372
CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
de pQ; en este momento, el fago ha comenzado
xpresin de los genes tardos y se concentra en la
duccin de la progenie del fago.
Qu determina eL balance
entre La lisogenia y eL cicLo
Ltico?
inceptos principales
La etapa temprana retrasada cuando Cro y el represor
estn siendo expresados es frecuente en la lisogenia y
en el ciclo Utico.
El episodio determinante ocurre si cll provoca la snte-
sis suficiente de represor para superar [a accin de Cro.
. programas de la ruta lisognica y de la ruta
ra se relacionan tan de cerca que es imposible
-
decir el destino de un genoma fgico individual
ndo entra a una nueva bacteria hospedadora Se
Mver el antagonismo entre el represor y Cro al
ablecer el circuito de mantenimiento autgeno
e se muestra en la Figura 14.32, o al desactivar
ntesis del represor y entrar a la etapa tarda del
arrollo que se muestra en la Figura 14.33?
En ambos casos se sigue la misma ruta hasta
momento de la decisin. Las dos rutas implican
expresin de los genes tempranos inmediatos
a extensin en los genes tempranos retrasados.
;
diferencia entre ellos radica en la pregunta de
en obtendr la ocupacin de los dos operadores,
epresor o Cro.
La fase temprana durante la cual se toma la de-
n tiene una duracin limitada en ambos casos.
importar cual ruta siga el fago, la expresin de
os los genes tempranos ser interrumpida, dado
r P
L
y ?R son reprimidos y, como consecuencia
'
.a desaparicin de cll y de cIIL la produccin del
presor a travs de PRE cesar.
La pregunta determinante es si a la interrupcin
transcripcin desde le sigue la activacin de
y el establecimiento de la lisogenia, o si es
v;apaz de activarse y el regulador pQ obliga al fago
desarrollo ltico. La FIGURA 14.34 muestra la etapa
icial, en la cual el represor y Cro estn siendo
uetizados.
El episodio inicial en el establecimiento de la
ogenia es la unin del represor a CU o a 0
R
1. La
n en los primeros sitios es seguida con rapidez
:
la unin colaboradora de ms dmeros represo-
a 0
L
2 y a 0
R
2
.
Este suceso desactiva la sntesis de
,i e inicia la sntesis del represor a travs del P .
El episodio inicial en la entrada al ciclo ltico es
anin de Cro a 0
R
3. Esto detiene el inicio en
circuito de mantenimiento lisognico. Despus,
El represor determina la lisogenia y Cro determina el ciclo litico
Cro y el represor se expresan en la etapa temprana retrasada
El represor acta sobre
0
L
y sobre 0R
t I
clll t f
P, 10.
c acta
Cro acta sobre
0
L
y sobre 0R
I
cll
La lisogenia requiere que el represor ocupe O
l
y Or
CH tL N
\\<\r\.C\.t\o
I
PL/0L el Pfu Pre
9 AA/N/VV . v VA.<V<V!Vr.
PR/0R ero r cll
El ciclo ltico requiere que Cro ocupe 0
L
y Or
clll k P,/0L el PFM Pp
\r\.<v/\.<\C\.r\ rvrv.CvC\.<\j <\4\<\r\.<v
VOr ero r cll
I
La etapa determinante cuando se decide entre Lisogenia y
lisis tiene Lugar durante La expresin de Los genes tempranos retrasados.
Si cll provoca La sntesis suficiente de represor, habr Lisogenia porque el
represor ocupa los operadores. De otro modo, Cro ocupa Los operadores. Lo
cual da como resultado la expresin del ciclo ltico.
Cro debe unirse a 0
R
1 o a 0
R
2
, y
a 0
L
1 o a 0
L
2
, para
inhibir la expresin de los genes tempranos. La sus-
pensin de la produccin de cll y de cm conduce a
la interrupcin de la sntesis del represor desde P
.
El establecimiento del represor se desactiva cuando
las protenas inestables cll y clll son degradadas.
La influencia determinante sobre el cambio en-
tre lisogenia y ciclo ltico la ejerce la protena cll. Si
sta est activa, la sntesis del represor desde el pro-
motor de establecimiento es eficaz, y como resul-
tado, el represor logra ocupar los operadores. Si cll
est inactiva, el establecimiento del represor fracasa
y Cro se une a los operadores.
Los niveles de protena cll bajo cualquier cir-
cunstancia particular determinan el resultado de
una infeccin. Las mutaciones que incrementan la
estabilidad de cll aumentan la frecuencia de la liso-
genizacin. Dichas mutaciones ocurren en el gen di
o en otros genes. La causa de la inestabilidad de cll
es su susceptibilidad a la degradacin por las protea-
sas hospedadoras. Su nivel en la clula lo determina
cllly las funciones hospedadoras.
14.21 Qu determina el balance entre la Lisogenia y el ciclo Ltico?
373
El efecto de la protena cIII de X es secundario:
ayuda a proteger a di contra la degradacin. La pre-
sencia de cIII no garantiza la supervivencia de cll;
sin embargo, en ausencia de cIII, cll es desactivada
casi siempre.
Los productos gnicos del hospedador actan
en esta ruta. Las mutaciones en los genes hospe-
dadores hflA y hflB incrementan la Iisogenia (hfl
significa high frequency lysogenization, lisogenizacin
de alta frecuencia). Las mutaciones estabilizan la
protena cll porque desactivan la proteasa o las pro-
teasas hospedadoras que la degradan.
La influencia de la clula hospedadora sobre el
nivel de cll ofrece una ruta para que la bacteria in-
terfiera en el proceso de las decisiones. Por ejemplo,
las proteasas hospedadoras que degradan a cll se
activan por crecimiento en un medio rico. De esta
manera, X tiende a Usar las clulas que crecen de
manera adecuada, pero es ms probable que entre
en Iisogenia en las clulas sometidas a escasez de
nutrientes (las cuales carecen de los componentes
necesarios para un crecimiento ltico eficiente).
Resumen
Los fagos tienen un ciclo de vida ltico, en el cual a la
infeccin de una clula hospedadora le sigue la pro-
duccin de un gran nmero de partculas fgicas, la
lisis de la clula y la liberacin de los virus. Algunos
fagos tambin pueden existir en forma lisognica,
en la cual el genoma del fago se integra al cromoso-
ma bacteriano y se hereda de esta forma latente, e
inerte, como cualquier otro gen bacteriano.
En general, la infeccin ltica se divide en tres
fases. En la primera un pequeo nmero de genes
del fago es transcrito por la polimerasa de RNA del
hospedador. Uno o ms de estos genes es un regu-
lador que controla la expresin del grupo de genes
que estn activados en la segunda fase. El patrn se
repite en la segunda etapa, cuando un gen, o ms,
constituye un regulador necesario para la expresin
de los genes de la tercera fase. Los genes de las dos
primeras etapas codifican las enzimas indispensa-
bles para reproducir el DNA del fago; los genes de
la ltima fase codifican los componentes estructu-
rales de la partcula fgica. Es comn que los genes
muy tempranos estn apagados durante las etapas
posteriores.
En el fago \, los genes estn organizados en
grupos cuya expresin es controlada por episodios
reguladores individuales. El gen temprano inme-
diato N codifica un antiterminador que permite la
transcripcin de los grupos a la izquierda y a la de-
recha de los genes tempranos retrasados a partir de
los promotores tempranos ?
R
y PL. El gen temprano
retrasado Q tiene una funcin de antitermina-
'
similar que permite la transcripcin de todos k
genes tardos desde el promotor PR,. Se reprime
ciclo ltico y se mantiene el estado lisognico >2
la expresin del gen el cuyo producto es una pfc
tena represora que acta en los operadores 0 i
0
L
para impedir el uso de los promotores ?R y f
respectivamente. El genoma de un fago lisognki
expresa slo el gen d desde su promotor, P
transcripcin desde este promotor comprende l;-.
regulacin autgena positiva, en la cual el represJ
unido a 0
activa la polimerasa de RNA'en P
RiV,.
Cada operador est formado por tres sitios
unin para el represor. Cada sitio es palindrrr..
y est formado por mitades de sitio simtricas. 1
represor funciona como un dmero. Cada mitad di
sitio de unin es contactada por un monmero e-
presor. El dominio terminal N del represor contjj
un elemento hlice-giro-hlice que entra en contaq
to con el DNA. La hlice 3 es la hlice de reconiio-
miento y se encarga de hacer contactos especficoi
con los pares de bases localizados en el operadoL
La hlice 2 interviene en el posicionamiento d
hlice 3; tambin participa en el contacto de la po-
limerasa de RNA en P
RM.
El dominio terminal C i
necesario para la dimerizacin. La induccin es in-
vocada por la divisin entre los dominios terminsia
C y N, la cual impide que las regiones de unin aL
DNA funcionen de forma dimrica, lo que rede
su afinidad por el DNA e imposibilita el manteni.
miento de la Iisogenia. La unin represor-opejradc:
es de colaboracin, de tal manera que una vez que
un dmero se ha unido al primer sitio, un segure
dmero se une con mayor facilidad al sitio adya-
cente.
El elemento hlice-giro-hlice es utilizado r
otras protenas de unin al DNA, como la prote: .
Cro del fago X. Esta ltima se une a los mismos ope-
radores, pero tiene una afinidad diferente por Iqj
sitios operadores individuales, que est determimufa
por la secuencia de la hlice 3. Cro se une de ma-
nera individual a los sitios operadores, comenzuide
con 0
K
3
, en una forma que no es de colaboraci
Es indispensable para continuar por el ciclo ltka
Su unin a 0
R
3 impide primero la sntesis del re-
presor desde P , y luego su unin a 0R2 y a Oj
evita la expresin continua de los genes tempranos
un efecto tambin observado en su unin a 0
L
L
a 0
L
2
.
El establecimiento de la sntesis del represor in-
quiere el uso del promotor PRE, el cual es activad
por el producto del gen di. El producto del gentfi
es necesario para estabilizar el producto di y prou.
;-
gerlo contra la degradacin. Al apagar la expresk.
de di y de dll, la protena Cro impide la lisogent
374
CAPTULO 14 Estrategias de los fagos
iesactivar todas las transcripciones excepto la de
.
propio gen, el represor impide el ciclo lrico. En
:
a infeccin particular, la decisin entre lisis y li-
oenia depende de la ocupacin de los operadores
:
el represor o por Cro. La estabilidad de la pro-
.na di en la clula infectada es un determinante
"
mordial del resultado.
:
eferendas
La hlice de reconocimiento determina la
especificidad por el ONA
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Referencias 375
15
El replicn
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
Los replicones pueden ser lineales o circulares
.
Una regin replicada aparece como un ojo dentro del DNA
no replicado
.
En el ongen inicia una horquilla de replicacin y despus
se desplaza de forma secucncial por el DNA.
.
La replicacin es unidireccional cuando se crea upa sola
horquilla de replicacin en un origen.
.
La replicacin es bidireccional cuando un origen cea dos
horquillas de replicacin aue se desplazan en direcciones
opuestas.
Es posible elaborar el mapa de los orgenes con
autorradiografa y electroforesis
.
El desplazamierlo de la horquilla de replicacin puede
detectarse por medio de autorradiografa utilizando pulsos
radioactivos.
.
Las horquillas de replicacin crean estructuras en forma de
Y que aite-an la migracin electrofortica de los fragmentos
de ONA.
Regula la metilacin del origen a la iniciacin?
.
oriC contiene 11 repeticiones que estn metiladas en
la ader.'na en ambas cadenas
.
La replicacin produce DNA hemimetilado, el cual es
incapaz de ''niciar la replicacin.
.
Hay un retraso de 13 min antes de que las repeticiones
GJjJj sean metiladas de nuevo
.
Los orgenes pueden ser secuestrados despus de
la replicacin
.
SeqA se une al DNA hemimetilado y es necesaria para el
retraso de la replicac
'
n.
.
SeqA puede interactuar con DnaA.
.
Puesto que los orgenes estn hemimetilados, se unen a la
membrana celular y en ocasiones no estn a disposicin de
las metilasas.
.
La naturaleza de la conexin entre el origen y la membrana
an no es clara.
Cada cromosoma eucaritico contiene numerosos
replicones
.
Los replicones eucariticos tienen una longitud de 40 a
100 kb.
.
Un cromosoma se divide en numerosos replicones.
.
Los replicones individuales se activar en momentos
caractersticos durante La fase S.
.
Los patrones de activacin regional sugieren que los
replicones cercanos entre s soi activados al mismo
tiempo.
isa
fBSB
En las levaduras pueden aislarse los orgenes es
replicacin
.
Los orgenes de S. cerevisiae son secuencias cortas ricas i
A-
'
que tienen jna secuencia esencial ce 11 bp.
.
El ORC es un complejo de seis protenas que se une a
ARS.
El factor de competencia controla la replicad:-
eucaritica
.
El factor de competencia es indispensable para la inicad
de la replicacin en cada origen.
.
Est presente en el ncleo antes de la replicacin, pe- i
desactivado o destruido por la replicacin.
.
La iniciacin de otro ciclo de replicacin es posible it-
despus de que el factor de competencia entra de nu -
ncleo despus de la mitosis.
El factor de competencia est formado por
protenas MCM
.
El ORC es un complejo de protenas que est asociado i
orgenes de las levaduras durante todo el ciclo celulr
.
Cdc6 es una protena inestable que se sintetiza slo e-1
.
Cdc se une al ORC y permite la unin de las protens
MCM.
.
Cuando la replicacin se inicia, las protenas Cdc6 y
MCK son desplazadas. La degradacin de Cdc impic i
reiniciacin.
.
Algunas protenas MCM se encuentran en el ncleo o.?
el ciclo, pero otras pueden entrar slo despus de la
mitosis.
Los lazos D mantienen a los orgenes
mitocondriales
.
Las mitocondrias utilizan diferentes secuencias de
para iniciar la replicacin ae cada cadena del DNA.
.
La replicacin de la cadena H inicia en un lazo D.
.
La replicacin de >a cadena L inicia cuando su orige"
expuesto por el movimiento de la primera horquilla m
replicacin.
Resumen
376
Introduccin
a clula tiene un solo cromosoma (como en las
notas) o varios (como en las eucariotas), el ge-
completo debe ser replicado precisamente una
cada divisin celular De qu manera se vincu-
episodio de la replicacin con el ciclo celular?
je utilizan dos conceptos generales para com-
I el estado de replicacin con la condicin del
celular:
.
La iniciacin de la replicacin del DNA obliga a
a clula (procaritica o eucariotica) a experimen-
tar una divisin posterior. Desde este punto de
vista, el nmero de descendientes que genera
una clula est determinado por una serie de
decisiones en cuanto a iniciar o no la repli-
cacin del DNA. sta se controla en la etapa
de la iniciacin. Una vez que la replicacin ha
comenzado, contina hasta que se haya duplicado
el genoma completo.
.
Si la replicacin prosigue, no se puede per-
mitir que ocurra la divisin consiguiente
hasta que la replicacin haya sido comple-
tada. De hecho, la conclusin de la repli-
cacin puede desencadenar la divisin ce-
lular. Despus, los genomas duplicados son
segregados en cada clula hija. La unidad de
segregacin es el cromosoma.
En las procariotas, la iniciacin de la replicacin
episodio individual que involucra a un sitio ni-
el cromosoma bacteriano. El proceso de la divi-
PC logra mediante el desarrollo de un tabique que
I de la pared celular y que divide a la clula en
En las clulas eucariticas, la iniciacin de la re-
dn se identifica por el comienzo de la fase S, un
>do prolongado durante el cual ocurre la sntesis
'
NA y que comprende numerosos episodios indi-
ales de iniciacin. La divisin se logra por la reor-
zacin de la clula en la mitosis. En este captulo
Mrdar la regulacin de la replicacin del DNA.
z\o inicia un ciclo de replicacin? Qu controla
Egreso y cmo se sealiza su terminacin?
La unidad de DNA en la que tiene lugar un solo
de replicacin se denomina replicn. Cada re-
i "se activa
"
una sola vez, slo una, en cada ciclo
lar. El replicn se define por poseer los elementos
ntrol necesarios para la replicacin.
Tiene un
en en el cual se inicia la replicacin. Asimismo,
ie tener un trmino en el cual se detiene la re-
icin.
Cualquier secuencia adherida a un origen o,
minos ms precisos, no separada de un ori-
por un trmino, se replica como parte de ese
cn. El origen es un sitio de actuacin en cis,
z de afectar slo a la molcula de DNA en la
reside.
(La concepcin original del replicn [en ias pro-
cariotas] lo visualizaba como una unidad que posea
el origen y el gen que codifica la protena regula-
dora. Sin embargo, en la actualidad, en los cromo-
somas eucariticos, el trmino "replicn
"
se aplica
en general para describir una unidad de replicacin
que contiene un origen; las protenas reguladoras de
actuacin en trans pueden ser codificadas en cual-
quier otra parte.)
El genoma de una clula procaritica constituye
un solo replicn: por lo tanto, las unidades de repli-
cacin y de segregacin coinciden. La iniciacin en
un solo origen promueve la replicacin del genoma
completo, una vez en cada divisin celular. Cada
bacteria haploide contiene un solo cromosoma, por
lo que este tipo de control de replicacin se deno-
mina de una sola copia.
Las bacterias pueden contener ms informacin
gentica en la forma de plsmidos. Un plsmido es
un genoma autnomo de DNA circular que constituye un
replicn independiente (vase la Figura 14.2). El repli-
cn de un plsmido puede ser controlado por una
sola copia, lo que significa que se replica una sola
vez cada vez que se replica el cromosoma bacteria-
no, o puede estar bajo control de copias mlti-
ples, cuando est presente en un nmero de copias
mayor que el cromosoma bacteriano. Cada fago o
DNA de los virus tambin constituye un replicn
y, por lo tanto, es capaz de iniciar numerosas veces
durante un ciclo infeccioso. Quiz una mejor ma-
nera de considerar un replicn procaritico, por lo
tanto, sea invertir la definicin: cualquier molcula de
DNA que contiene un origen puede ser replicada de forma
autnoma en la clula.
En la replicacin se observa una diferencia fun-
damental en la organizacin de los genomas bacte-
rianos y eucariticos. Cada cromosoma eucaritico
contiene un gran nmero de replicones; por lo tan-
to, la unidad de segregacin incluye muchas uni-
dades de replicacin. Esto agrega otra dimensin al
problema del control: todos los replicones que se
encuentran en un cromosoma deben ser activados
durante un ciclo celular. Sin embargo, no se activan
de manera simultnea. Cada replicn debe ser acti-
vado en un periodo bastante prolongado y cada uno
debe ser activado no ms de una vez en cada ciclo celular.
Alguna seal debe distinguir entre los replicones
replicados y los no replicados para garantizar que
los replicones no se activen una segunda ocasin.
Numerosos replicones son activados de manera in-
dependiente, por lo que debe existir otra seal que
indique el momento en el cual se ha completado el
proceso de la replicacin de todos los replicones.
Ahora se ha comenzado a reunir informacin
sobre la construccin de los replicones individuales,
pero todava se tiene poca informacin sobre la re-
15.1 Introduccin
ladn que existe entre ellos. No se sabe si el patrn
de replicacin es el mismo en cada ciclo celular Se
utilizan siempre todos los orgenes o algunos son
silentes en algunas ocasiones? Los orgenes siem-
pre se activan en el mismo orden? Si hay diferentes
tipos de orgenes, qu los distingue?
En contraste con los cromosomas nucleares, los
cuales son controlados por una sola copia, el DNA
de las mitocondrias y de los cloroplasios puede ser
regulado ms como plsmidos que existen en copias
mltiples por bacteria. Hay numerosas copias de cada
DNA de los organelos por clula y el control de su
replicacin debe relacionarse con el ciclo celular.
En todos estos sistemas, la cuestin fundamen-
tal es definir las secuencias que funcionan como
orgenes y determinar cmo son reconocidas por
las protenas adecuadas del mecanismo de replica-
cin. Se comienza por considerar la construccin
bsica de los replicones y las diversas formas que
adquieren; despus de la consideracin del origen,
se plantea la pregunta de cmo la replicacin del gc-
noma se coordina con la divisin bacteriana y que se
encarga de segregar los genomas a la bacteria hija.
Los replicones pueden ser lineales
o circulares
Conceptos principales
Una regin replicada aparece como un ojo dentro del DNA
no replicado.
En el origen inicia una horquilla de replicacin y despus
se desplaza de forma secuencial por el DNA.
La replicacin es unidireccional cuando se crea una sola
horquilla de replicacin en un origen.
La replicacin es bidireccional cuando un origen crea dos
horquillas de replicacin que se desplazan en direcciones
opuestas.
Los oos de replicacin forman burbujas
DNA no
replicado
DNA no
replicado
Ojo de
replicacin
Aspecto
Estructura molecular
I
Una molcula de DNA comprometida en la reph-
cacin tiene dos tipos de regiones. La FIGURA 154!
muestra que cuando se observa el DNA en repfiJ
cacin mediante microscopia electrnica, la regie |
replicada aparece como un ojo de replicador
dentro del DNA no replicado. La regin no repli-
cada consiste en el dplex progenitor; ste se abrt
en la regin replicada en donde se han formado I
dos dplex hijos.
El sitio donde tiene lugar la replicacin se dg~
nomina horquilla de replicacin (en ocasiones
tambin se le conoce corno punto de crecimie
to). Una horquilla de replicacin se desplaza de fonn
set uencial por el DNA desde su punto de inicio en el ctiM
gen. El origen puede aprovecharse para comenii-
la replicacin unidireccional o la replicad
bidireccional. El tipo de episodio est determina
por la formacin de una o de dos horquillas de repl-
cacin en el origen. En la replicacin unidirecciona:
una horquilla de replicacin abandona el origen t
contina por el DNA. En la replicacin bidirecc -
nal, se forman dos horquillas de replicacin; stas se
alejan del origen en direcciones opuestas.
La aparicin del ojo de replicacin no disris-
gue entre replicacin unidireccional y bidirecc:
nal. Como se ilustra en la FIGURA 15.2, el ojo pue
representar cualquiera de las dos estructuras. Si!
genera por medio de replicacin unidireccional, t
Los ojos de replicacin pueden ser
unidireccionales o bidireccionales
REPLICACIN UNIDIRECCIONAL
ORIGEN
Horquilla de replicacin
/WA DNA replicado
DNA
progenitor
REPLICACIN BIDIRECCIONAL
ORIGEN
Horquilla de
replicacin
Horquilla de
replicacin
FIGURA 15.1 El DNA replicado se observa como un ojo de
replicacin flanqueado por DNA no replicado.
FIGURA 1E. Los replicones pueden ser unidireccional t
bidireccionales, segn la formacin de una o de dos horqu' e
de replicacin en el origen.
378 CAPTULO 15 El replicn
representa un origen fijo y una horquilla de
pticacin movible. Si se genera por replicacin bi-
tcccional, el ojo representa un par de horquillas
replicacin. En cualquier caso, el avance de la
plicacin expande el ojo hasta que termina por
arcar todo el replicn.
Cuando un replicn es circular, la presencia de
ojo forma la estructura 9, la cual se muestra en
bURA 15.3. Las etapas sucesivas de la replicacin
DNA circular del virus del polioma se ven a tra-
de microscopa electrnica en la figura ha.
Los oos de replicacin son visibles
mediante microscopa electrnica
Estructura de
replicacin e
Apariencia de la
estructura 9 por
medio de microscopa
electrnica
HMtA 15.3 Un ojo de replicacin forma una estructura 9 en
- A circular.
Los replicones circulares forman
estructuras o
feKURA El ojo de replicacin se agranda a medida que
b horquillas de replicacin prosiguen por el replicn. Ntese
te e. "ojo
"
se hace ms grande que el segmento no replicado.
-s dos lados del ojo pueden definirse porque ambos tienen
i misma longitud. Fotografa cortesa de Bcrnard Hirt, Swiss
l
-
stitutc for Experimental Cncer Research (ISREC).
Es posible elaborar el mapa
de los orgenes con
autorradiografa y
electroforesis
Conceptos principales
.
El desplazamiento de la horquilla de replicacin puede
detectarse por medio de autorradiografa utilizando
pulsos radioactivos.
.
Las horquillas de replicacin crean estructuras en forma
de Y que alteran la migracin electrofortica de los
fragmentos de DNA.
La cantidad de horquillas de replicacin que hay en
un ojo de replicacin puede determinarse de dos
formas. La eleccin del mtodo depende de que el
DNA sea una molcula definida o una regin no
identificada de un genoma celular.
Con una molcula lineal definida se puede uti-
lizar microscopa electrnica para medir la distancia
entre cada extremo del ojo y el extremo del DNA
y luego comparar las posiciones de los extremos de
los ojos en las molculas que tienen ojos de diferen-
tes tamaos. Si la replicacin es unidireccional, slo
uno de los extremos se mover; el otro es el origen
fijo. Si la replicacin es bidireccional, ambos se des-
plazarn: el origen es el punto medio entre ellos.
Con regiones no definidas de genomas exten-
sos se pueden utilizar dos pulsos de radioactividad
sucesivos para etiquetar el desplazamiento de las
horquillas de replicacin. Si un pulso tiene una eti-
queta ms intensa que el otro, pueden distinguirse
por las intensidades relativas del etiquetamiento.
Pueden distinguirse las formas de
replicacin
REPLICACIN UNIDIRECCIONAL
>
-
REPLICACIN BIDIRECCIONAL
<:
Etiqueta de densidad pesada (incorporada
primero)
Etiqueta de densidad ligera (incorporada en
segundo lugar)
Sin etiqueta (invisible en la autorradiografa)
FIGURA 15. Pueden utilizarse diferentes densidades de eti-
cuetamiento radioactivo para distinguir entre la replicacin
unidireccional y la replicacin bidireccional.
15.3 Es posible elaborar el mapa de los orgenes con autorradiografa y electroforesis
379
Los orgenes pueden localizarse por etectrotoresis
Y simple Y doble Buttiuja
Burbuja
asimtrica
El tamao del
fragmento se
duplica durante
la replicacin
La segunda
dimensin exagera
la contribucin de
la forma de tres
dimensiones
La primera dimensin separada por masa
TIGURA 15.6 La posicin del origen y el nmero de horquillas en replica-
cin determinan la forma de un fragmento de restriccin en replicacin,
la cual puede deducirse por su ruta electrofortica (linea continua). La
lnea punteada muestra la ruta del DNA lineal.
La metilasa Datn mantiene la cnetilacion
DNA DNA
metilado hemimetllado
Me
GATC 1
CTAG
G A T C Replicacin
Metilasa Dam
i GATC
0 TA G -1
FIGURA 15 La replicacin del DNA metilado origina DNA
hemimetilado, el cual mantiene su estado en los sitios GATC
hasta que la metilasa Dam restaura la condicin metilada por
completo.
stas pueden visualizarse por medio de auiorra-
diografa. La FIGURA 15. muestra que la replicacin
unidireccional hace que a una etiqueta le siga la otra
en un extremo del ojo. La replicacin bidireccional
produce un patrn (simtrico) en ambos extremos
del ojo. Este patrn se observa por lo general en los
replicones de los cromosomas eucariticos.
Un mtodo ms reciente para elaborar el mapa
de los orgenes con mayor resolucin se vale de
los efectos que tienen los cambios de la forma del
DNA sobre la migracin electrofortica. La FIGU-
RA 15.6 ilustra la tcnica de mapeo bidimensional,
en la cual los fragmentos de restriccin del DNA en
replicacin son sometidos a electroforesis en una
primera dimensin que los separa por masa y
una segunda dimensin en donde el movimie
es determinado sobre todo por la morfologa. Los
diferentes tipos de molculas en replicacin siguer.
rutas caractersticas, medidas por su desviacin de
la lnea que seguira una molcula lineal de DNA
del doble de tamao.
Una simple estructura Y, en la cual una horquilla
se desplaza por un fragmento lineal, sigue una ra
continua. Cuando las tres ramas tienen una misma
longitud ocurre un punto do inflexin y la estruc-
tura se desva ms del DNA lineal. Consideraciones
anlogas determinan las rulas de las estructuras do-
bles en forma de Y o de las burbujas. Una burbu-
ja asimtrica sigue una ruta interrumpida con una
rotura en el sitio donde la burbuja se convierte ea
estructura en forma de Y a medida que una horquilla
abandona el extremo.
Juntas, las diferentes tcnicas para describir c
DNA en replicacin muestran que los orgenes se
utilizan con mayor frecuencia para iniciar episodio
de replicacin bidireccional. A partir de este nivel de
resolucin, se debe avanzar ahora al nivel molecular
para identificar las secuencias de actuacin en m
que forman el origen y los factores de actuacin
tram que lo reconocen.
Tfl Regula La metilacin
deL origen La iniciacin?
Conceptos principales
onC contiene 11 repeticiones que estn metiladas
en la adenina en ambas cadenas.
La replicacin produce DNA hemimetilado, el cual es
incapaz de iniciar la replicacin.
Hay un retraso de 13 min antes de que las repeticione
sean metiladas de nuevo.
Qu caracterstica de un origen bacteriano (o pl
mido) garantiza que sea utilizado para iniciar la |
plicacin slo una vez en cada ciclo? La iniciad'.
se asocia a algn cambio que marca el origen de I
manera que un origen replicado pueda distinguir
de un origen no replicado?
Algunas secuencias que se utilizan para es
propsito estn incluidas en el origen. oriC cont>
ne 11 copias de la secuencia qjIq, la cual es m
diana de metilacin en la posicin N6 de la adenir
por la metilasa Dam. La reaccin se lustra en
FIGURA 15.7.
Antes de la replicacin, el sitio diana palindr:
mico es metilado en las adeninas de ambas cadeiu
La replicacin inserta las bases normales (no mod
380
CAPTULO 15 El replicn
das) en las cadenas hijas. Eslo genera DNA he-
netilado, en el cual una cadena est metilada
otra no. Por lo tamo, la replicacin convierte
sitios diana Dam de metilados por completo a
:
metilados.
Cul es la consecuencia de la replicacin? La
cidad que tiene un plsmido con base en oriC
replicarse en E. coli dam depende de su esta-
de metilacin. Si el plsmido est meiiiado se
ete a una sola ronda de replicacin y despus
productos hemimetilados se acumulan, como se
ribe en la FIGURA 15.8. Por lo tanto, un origen
imetilado no puede usarse para iniciar un ciclo
replicacin.
Esto sugiere dos explicaciones: la iniciacin
"
e requerir la nietilacin completa de los sitios
a Dam en el origen o puede ser inhibida por la
-imetilacin de estos sitios. La ltima posibilidad
-
ece ser la correcta porque un origen de DNA no
tilado puede funcionar de manera eficiente.
As, los orgenes hemimetilados no pueden ini-
de nuevo hasta que la metilasa Dam los haya
formado en orgenes metilados por completo.
sitios GATC localizados en el origen permanecen
'
metilados -13 min despus de la replicacin.
e largo periodo no es habitual porque en los sitios
JC tpicos en cualquier otro lugar del genoma.
remetilacin comienza de inmediato (<1,5 min)
z us de la replicacin. Otra regin acta como
T: el promotor del gen dnaA tambin muestra re-
ames de que comience la remetilacin.
El promotor del gen dnaA estar reprimido
liras est hemimetilado, lo cual reduce el nivel
la protena DnaA. Por lo tanto, el origen est
rte y la produccin de la protena iniciadora cru-
'
es reprimida durante este periodo.
3 Los orgenes pueden
ser secuestrados despus
de la replicacin
lanceptos principales
SeqA se une al DNA hemimetilado y es necesaria para
el retraso do la replicacin.
SeqA puede interactuar con DnaA.
Puesto que los orgenes estn hemimetilados,
se
unen a la membrana celular y en ocasiones no estn a
disposicin de las metilasas.
La naturaleza de la conexin entre el origen y la
membrana an no es clara.
I qu se debe el retraso de la remetilacin en oriC
m dnaA7 La explicacin ms probable es que estas
aones son secuestradas en una forma en la cual
a inaccesibles a la menlasa Dam.
Solo los orgenes metilados son funcionales
\/A/A/%/A/A/A// Origen activo
Replicacin |
\/A&jA0WJA// orgenes
\*A0J?i&J
inac,ivos
Metilasa Dam |
\/A/A/ /A/A/A// Origen activo
FIGURA 15 S Slo los orgenes metilados por completo pueden
iniciar la replicacin; los orgenes hijos hemimetilados no pue-
den utilizarse de nuevo hasta que hayan recuperado su estado
de metiiacin completa.
Un circuito encargado de controlar la reutiliza-
cin de los orgenes es identificado por mutaciones
en el gen seqA. Los mutantes reducen el retraso de la
remetilacin en orCy en dnaA. Como resultado, ini-
cian la replicacin del DNA demasiado pronto, con
lo que se acumula un nmero excesivo de orgenes.
Esto sugiere que seqA forma parte de un circuito re-
gulador negativo que impide que los orgenes sean
metilados de nuevo. La protena SeqA se une con
mayor fuerza al DNA hemimetilado que al DNA me-
tilado por completo. Puede iniciar la unin cuando
el DNA es hemimetilado, momento en que su pre-
sencia continua impide la formacin de un complejo
abierto en el origen. SeqA no tiene especificidad
por la secuencia fr/C y parece probable que sta sea
conferida por la protena DnaA. Esto explicara las
interacciones genticas entre seqA y dnaA.
La hemimetilacin de las secuencias GATC del
origen es indispensable para su asociacin con la
membrana celular in vitro. El DNA orC hemimeti-
lado se une a las membranas, pero el DNA que est
meiiiado por completo, no. Una posibilidad es que la
asociacin a la membrana tenga que ver en el con-
trol de la actividad del origen. Esta funcin podra
ser independiente de cualquier funcin que tenga la
membrana en la segregacin (vase la Figura 17.4).
La asociacin a la membrana podra impedir que
ocurriera la reiniciacin de manera prematura, de
forma indirec ta por el secuestro de los orgenes, o
directa por la inhibicin de la reaccin por parte de
algn componente en ia membrana.
Las propiedades de a fraccin de la membrana
sugieren que incluye componentes que regulan la
replicacin. Un inhibidor observado en esta fraccin
compite con la protena DnaA. Este inhibidor pue-
de impedir la iniciacin de la replicacin slo si es
15.5 los orgenes pueden ser secuestrados despus de la replicacin
381
Los orgenes hemimetilados se unen al inhibidor
Me
GATC MNNNNNM
CTAG NNNNNNN
El inhibidor unido a la
membrana se adhiere
al DNA hemimetilado
i
Me
GATC NNNNNNN El DNA es metilado
CTAG NNNNNNN
de nuevo y libera al
inhibidor
GATO NNNNNNN
CTAG NNNNNNN
Me
DnaA se une a oriC
FIGURA 15.9 Un inhibidor unido a la membrana se adhiere al
DNA hemimetilado en el origen y puede funcionar al impedir
la unin de DnaA. Es liberado cuando el DNA es metilado de
nuevo.
agregado antes que la protena DnaA a un sistema
in vitro. Esto sugiere el modelo que se muestra en la
FIGURA 15.9, en el cual el inhibidor reconoce de ma-
nera especfica el DNA hemimetilado e impide que
se una la protena DnaA. Cuando el DNA es meti-
lado de nuevo, el inhibidor es liberado y la protena
DnaA es libre de iniciar la replicacin. Si el inhibi-
dor est asociado a la membrana, es posible que la
asociacin y la disociacin del DNA a la membrana
tengan que ver con el control de la replicacin.
La extensin completa del sistema utilizado
para controlar la reiniciacin no es clara, pero es
posible que participen numerosos mecanismos: el
secuestro fsico del origen, el retraso de la remetila-
cin, la inhibicin de la unin de la protena DnaA
y la represin de la transcripcin del gen dnaA. No
es evidente cul de estos episodios ocasiona los de-
ms, y si sus efectos en la iniciacin son directos o
indirectos.
An se debe resolver el tema central de cul
caracterstica tiene el encargo fundamental de sin-
cronizar los sucesos. Una posibilidad es que la adhe-
sin a la membrana ocurre en la iniciacin y que sea
necesario el ensamble de alguna estructura extensa
para liberar el DNA. El periodo de secuestro parece
aumentar con la longitud del ciclo celular, lo cual
sugiere que refleja de manera indirecta el reloj que
controla la reiniciacin.
Como nico integrante del mecanismo de repli-
cacin indispensable slo en el origen, la protena
DnaA ha atrado mucha atencin. Esta protena es
la diana de numerosos sistemas reguladores. Es po-
sible que ninguno de estos sistemas sea suficiente
por s solo para controlar la frecuencia de la ini-
ciacin, pero que cuando se combinen logren el
resultado esperado. Algunas mutaciones en el ger
dnaA provocan replicacin asincrnica, lo cual s
giere que DnaA podra ser el
"
titulador" o el "relo;'
que mide el nmero de orgenes en relacin con U
masa celular. La sobreproduccin de DnaA da luga-
a resultados conflictivos, los cuales pueden varia:
desde no tener ningn efecto hasta causar que la
iniciacin suceda en una masa reducida.
lia sido difcil identificar los componentes pnv
tenicos que median la adhesin a la membrana. Un
indicio de que sta es una funcin de la proten:
DnaA lo constituye su respuesta a los fosfoh'pido?
stos facilitan el intercambio de ATP con el ADP
unido a la protena DnaA. Se desconoce la funcin
que tiene esto en el control de la actividad de DnaA
(la cual requiere ATP), pero la reaccin implica qut
es probable que DnaA interacte con la membrana
Ksto significara que ms de un episodio tiene que
ver en la asociacin a la membrana. Quiz un on-
gen hemimetilado est unido al inhibidor asociado
a la membrana, pero cuando el origen se metila pr*r
completo, el inhibidor es desplazado por la protena
DnaA asociada a la membrana.
Si DnaA es el iniciador que desencadena un d-
clo de replicacin, el suceso principal sera su acu-
mulacin en el origen en un nivel crtico. No hay-
variaciones cclicas en la expresin o en la concen-
tracin global de la protena DnaA, lo cual sugiere
que los sucesos locales deben ser los responsable*
Para que sea activa en la iniciacin de la replicacin
DnaA debe encontrarse en su forma unida a ATP. L
protena DnaA tiene una actividad intrnseca d
'
:
que transforma el ATP en ADP. Esta actividad Lr
intensifica la subunidad p de la polimerasa de DNA
III. Cuando la replicasa es incorporada al complejo
de replicacin, esta interaccin ocasiona la hidrlL-
del ATP unido a DnaA, lo que desactiva la protena
DnaA e impide que comience otro ciclo de replica-
cin. Esta reaccin ha sido denominada RIDA (re i-
latory inactivation ofDnaA, desactivacin regulador;
de DnaA). Es potenciada por una protena llamada
Hda. Todava no se sabe qu controla la cronologa
de la reactivacin de la protena DnaA.
Otro factor que controla la disponibilidad de
DnaA en el origen es la competencia por unirla ;
otros sitios del DNA. En particular, un locus deno-
minado dat tiene una gran concentracin de sitie
de unin a la protena DnaA. Se le une unas och
veces ms DnaA que al origen. La delecin de
hace que la iniciacin ocurra con mayor frecuencia
Esto reduce de manera significativa la cantidad c-
DnaA disponible para el origen, pero no se sabe con
exactitud qu funcin pueda tener en el control de
la cronologa de la iniciacin.
382 CAPTULO 15 El replicn
Cada cromosoma eucaritico
contiene numerosos replicones
ceptos principales
Los replicones eucariticos tienen una longitud de 40 a
kb.
cromosoma se divide en numerosos replicones.
replicones individuales se activar en momentos
ctersticos durante la fase S.
patrones de activacin regional sugieren que los
icones cercanos entre s son activados al mismo
-
po.
Las clulas eucariticas la replicacin del DNA
'
confinada a una parte del ciclo celular. La fase
le durar unas cuantas horas en una clula eu-
nica superior. La replicacin de la gran cantidad
i DNA contenido en un cromosoma eucaritico
L
ctgra al dividirlo en numerosos replicones indivi-
:
es. Slo algunos de estos replicones participan
a replicacin en un momento dado de la fase S.
parecer cada replicn es activado en un momen-
espccfico durante la fase S, aunque los datos que
sobre el tema no son decisivos.
El inicio de la fase S lo seala la activacin de
rimeros replicones. En las pocas horas siguien-
tes episodios de iniciacin tienen lugar en otros
licones de manera ordenada. Mucho de lo que
sabe sobre las propiedades de los replicones in-
iduales proviene de estudios autorradiogrficos
"
recurren en general a los tipos de protocolos
irados en la Figura 15.5 y en la Figura 15.6. Los
licones cromosmicos suelen mostrar replicacin
rcccional.
Qu tan grande es el replicn promedio y
r~
;
tos hay en el genoma? Una dificultad para
ibir la unidad individual es que los replicones
.
acentes pueden fusionarse y formar ojos repli-
j
s extensos, como se ilustra en la FIGURA 15.10.
metodologa utilizada en general para distinguir
ir los replicones individuales y los ojos fusio-
J
os consiste en utilizar fragmentos de DNA en
cuales puedan observarse numerosos replicones
vos, capturados al parecer en una etapa en la
todos han iniciado casi al mismo tiempo, pero
es de que se renan las horquillas de las unida-
adyaecntes.
En grupos de replicones activos, el tamao pro-
edio de la unidad se mide por la distancia que
-
y entre los orgenes (es decir, entre los pumos
medios de los replicones adyacentes). La velocidad
con la cual se desplaza la horquilla de replicacin
puede estimarse a partir de la distancia mxima que
recorren los rastros autorradiogrficos durante un
periodo determinado.
El tamao de los replicones puede medirse por los ojos adyacentes
1
-
c
1
Longitud medida de' replicn

Replicones fusionados
FIGURA 15.10 Para medir el tamao del replicn se necesita un frag-
mento de DNA en el cual los replicones adyacentes estn activos.
Los replicones individuales de los genomas eu-
cariticos son relativamente pequeos, por lo ge-
neral de -40 kb en las levaduras o en las moscas y
de -100 kb en las clulas animales. Sin embargo,
pueden variar ms de 10 veces en longitud dentro
de un genoma. La velocidad de replicacin es de
-
2 000 bp/min. la cual es mucho menor que la del
desplazamiento de la horquilla de replicacin bac-
teriana (50 000 bp/min).
Por la velocidad de replicacin, es evidente que
el genoma de un mamfero podra replicarse en cerca
de 1 h si todos los replicones funcionaran de manera
simultnea. Sin embargo, la fase S dura rns de 6 h
en una clula somtica tpica, lo cual implica que no
ms del 15% de los replicones tienden a estar acti-
vos en un momento dado. Hay casos excepcionales,
como las divisiones embrionarias tempranas de los
embriones de Drosophila, en donde la duracin de la
lase S se comprime por el funcionamiento simult-
neo de un gran nmero de replicones.
Cmo se seleccionan los orgenes para la ini-
ciacin en momentos distintos durante la fase S? En
Saccharomyces cerevisiae. parece ser que est prede-
terminado que los orgenes se repliquen temprano,
pero que las secuencias de actuacin en cis puedan
hacer que los orgenes ligados a ellas se repliquen
despus.
Los datos disponibles sugieren que los repli-
cones cromosmicos no tienen terminales en las
cuales las horquillas de replicacin interrumpan el
desplazamiento y (al parecer) se disocien del DNA.
Parece ms probable que la horquilla de replicacin
contine desde su origen hasta que encuentre una
15.6 Cada cromosoma eucaritico contiene numerosos replicones 383
Las horquillas de repllcacin forman tocos
FIGURA 15.11 Las horquillas de replicadn se organizan en
focos dentro del ncleo. Las clulas fueron etiquetadas con
BrdU. bl segmento izquierdo de la figura se tic con yoduro de
propidio para identificar la masa de ONA. El derecho se tino con
un anticuerpo contra BrdU para identificar el DNA en replica-
cin. Fotografa cortesia de Anthony D. Milis ard Ron Laskey,
Hutchinson/MRC Research Center, University of Cambridge.
horquilla que avance hacia ella desde el replicn ad-
yacen ic. Ya se ha mencionado el posible problema
topolgico de unir el DNA que acaba de sintetizarse
en la unin de las horquillas de replicadn.
La predisposicin de los replicones vecinos a
estar activos de manera simultnea podra expli-
carse por la presencia de controles
"
regionales
"
,
en
los cuales los grupos de replicones son iniciados de
modo ms o menos coordinado, al contrario ce un
mecanisnio en el cual los replicones individuales
son activados uno por uno en reas dispersas del
genoma. Dos caractersticas estructurales sugieren
la posibilidad de una organizacin a gran escala.
Regiones bastante extensas del cromosoma pueden
definirse como "de repllcacin temprana" o "de re-
plicadn tarda
"
, lo cual implica que hay poca dise-
minacin de replicones que se activan en momentos
tempranos o tardos. La visualizacin de las horqui-
llas de replicacin por medio de etiquetamicnio con
precursores de DNA identifica de 100 a 300 "focos
"
en vez de una tincin uniforme; es probable que
cada foco que se muestra en la riGURA if> | | conten-
ga >300 horquillas de replicacin. Los focos podran
representar estructuras fijas a travs de las cuales
debe moverse el DNA en replicadn.
nn En las levaduras pueden
aislarse Los orgenes
de repllcacin
Conceptos principales
.
Los orgenes de S. cerevisioe son secuencias cortas ricas
en A-T que tienen una secuencia esencial de 11 bp.
.
El ORC es un complejo de seis protenas que se une a
una ARS.
Cualquier segmento de DNA que tenga un origen
debe estar en condiciones de replicarse; por lo tan-
to, aunque los plsmidos son muy poco frecuente;
en las eucariotas, puede ser posible construirlos po:
medio de una manipulacin apropiada m vitro. Esto
se ha logrado en las levaduras, aunque no en las
eucariotas superiores.
Los minantes de S. cerevisiae pueden ser "trans-
formados" en su fenotipo silvestre con la adicin de
DNA que transporte una copia silvestre del gen. B
descubrimienio de los orgenes de las levaduras tuve
lugar cuando se observ que algunos fragmentos de
DNA de las levaduras (cuando forman un crculo
son capaces de transformar las clulas defectuosa*
con mucha eficiencia. Estos fragmentos pueden se
brevivir en la clula en estado no integrado (aute-
nomo), es decir, como plsmidos autorreplicante<-
Un fragmento transformante de alta frecuendi
posee una secuencia que le da la capacidad de repi-
carse eficientemente en las levaduras. Este segmen:
se denomina ARS (autonomoiisly replicating sequenx.
secuencia de replicacin autnoma). Los element >
ARS se derivan de orgenes de replicacin.
En los casos en los que los elementos ARS se
han mapcado de manera sistemtica en regionc
cromosmicas extensas, parece que slo algn
de ellos en realidad se aprovechan para inidarhi
replicacin. Los otros son silenciosos o quiz se uti-
licen con poca frecuencia. Si es verdad que alguns*
orgenes tienen probabilidades variables de ser u-
lizados, tampoco podra haber terminales fijas enuf
los replicones. En este caso, una regin dada de _t
cromosoma podra ser replicada desde orgenes ii-
tintos en ciclos celulares diferentes.
Un elemento ARS est formado por una regsa*
rica en A-T que contiene sitios discretos en los ais-
les las mutaciones afectan el funcionamiento
origen. La composicin de bases, ms que la secues-
cia, puede ser importante en el resto de la regjM
La figura 15.12 muestra un anlisis sistemtico
mutaciones a todo lo largo de un origen. El foal
cionamiento del origen es inhibido por compie
por mutaciones en una regin
"
nuclear
"
de 14 M
denominada dominio A, la cual contiene una m
cuencia de consenso de 11 bp formada por pares
bases A-T. Esta secuencia de consenso (en ocasicofl
denominada ACS, ARS comensus sequence, secueaaS
de consenso de a ARS) es la nica homologa era
los elementos ARS conocidos.
Las mutaciones en tres elementos adyaceia
numerados Bl a B3, disminuyen la funcin dei H
gen. Un origen puede funcionar de manera eoH
con dos elementos B cualesquiera, siempre y cuaaM
haya un elemento A funcional. (Las copias IrraoM
fectas del consenso nuclear, que suelen confomaaB
en las posiciones 9/11, se ubican cerca de, o
384 CAPTULO 15 El replicn
El factor de competencia controla la replicacin
Antes de la replicacin,
el ncleo contiene factor de
competencia activo
1) .
El ORC controla el origen
Despus de la replicacin, el factor de competencia
que se encuentra en el ncleo es inactivo; el factor ;
de competencia del citoplasma no puede entrar al :
ncleo
\
La disolucin de la membrana nuclear durante la
mitosis permite que el factor de competencia se
asocie al material nuclear
La divisin celular genera ncleos hijos competentes
para respaldar la replicacin
tURA 15.14 El factor de competencia que se encuentra en
"
cleo es desactivado despus de la replicacin. Un nuevo
istecimiento de factor de competencia puede entrar slo
;
-
do se rompe la membrana nuclear en la mitosis.
-
jrdese que el ORC es un complejo de 400 kD
fDe se une ala ARS de S. cerevisiae (vase la seccin
15.7, En las levaduras pueden aislarse los orgenes
replicacin). El origen {ARS) est formado por
-
i secuencia de consenso A y por tres elementos
B (vase la Figura 15.12). El ORC de seis prote-
nas (de las cuales todas son codificadas por genes
cendales) se une a la secuencia A y al elemento
-ivacente Bl
. Se necesita ATP para la unin, pero
ste no es hidrolizado hasta alguna etapa posterior.
factor de transcripcin ABF1 se une al elemento
. :
esto ayuda a la iniciacin, pero son los sucesos
ru tienen lugar en los elementos A y B1 los que en
realidad provocan la iniciacin. La mayor parte de
orgenes estn ubicados en las regiones que se
encuentran entre los genes, lo cual indica que quiz
.
tj importante para que la estructura de la cromati-
33 local est en una condicin no transcrita.
La caracterstica sobresaliente es que el ORC
Tcrmanece unido al origen en todo el ciclo celu-
r. No obstante
, los cambios ocurren en el patrn
:
t proteccin del DNA como resultado de la unin
Fase G1 temprana
Cdc6
// >V/V/V>
Fase G1
tarda
//V/
ORC
vywv/v/\ --
Complejo de
prerreplicacin
MCM
>/Y/\
Fase S
Complejo de
posreplicacin
-
v/v
ORC
Fase G2
/rsars/M/w* v *\ywww\
ORC
FIGURA 1S Las protenas del origen controlan la suscep-
tibilidad a la iniciacin.
de otras protenas al complejo ORC-origen. La
GURA 15.16 resume el ciclo de los sucesos que tienen
lugar en el origen.
Al final del ciclo celular, el ORC est unido a A-
Bl y genera un patrn de proteccin in vivo similar
al que se observa cuando se une al DNA libre m
vilro. En trminos bsicos, la regin que atraviesa
A
-BI est protegida contra la DNAasa, pero hay un
sitio hipersensible en el centro de Bl.
Durante Gl este patrn cambia, ms notable-
mente por la prdida del sitio hipersensible. Esto se
debe a la unin de la protena Cdc al ORC. En las
levaduras, Cdc es una protena muy inestable, con
una vida media de menos de 5 min. Se sinletiza du-
rante Gl y suele unirse al ORC entre la salida de la
miiosis y la etapa Gl tarda. Su rpida degradacin
significa que no hay protena disponible despus en
el ciclo. En las clulas de los mamferos, se controla
de manera distinta; est fosforilada durante la fase
S y como resultado es exportada desde el ncleo.
La protena Cdc proporciona la conexin entre el
ORC y un complejo de protenas que participa en
la competencia y en la iniciacin. Cdc tiene ac-
tividad ATPasa indispensable para que respalde la
iniciacin.
15.9 El factor de competencia est formado por protenas MCM
387
Ciertos mulantes de levaduras nos permiten co-
nocer el sistema que controla la disponibilidad del
factor de competencia. Las mutaciones que se pre-
sentan en el factor de competencia pueden impedir
la iniciacin de la replicacin. As es como las mu-
taciones actan en ias protenas de mantenimiento
de! minicromosoma (mmichromosome maintenance,
MCM) 2, 3 y 5. Las mutaciones que ocurren en el
sistema que desactiva el factor de competencia des-
pus del inicio de la replicacin deben permitir la
acumulacin de cantidades excesivas de DNA, por-
que la presencia continua de factor de competencia
permite que suceda la replicacin. Dichas mutacio-
nes se observan en los genes que codifican los com-
ponentes del sistema de ubiquitinacin encargado
de la degradacin de ciertas protenas. Esio sugiere
que el factor de competencia puede ser destruido
despus del inicio del ciclo de replicacin.
Las protenas MCM2, 3 y 5 son necesarias para
la replicacin y entran al ncleo slo durante la mi-
tosis. En las clulas animales se encuentran hom-
logos, en donde MCM3 est unida al material cro-
mosmico antes de la replicacin, pero es liberada
despus de la replicacin. El complejo MCM2, 3, 5
de la clula animal permanece en el ncleo durante
el ciclo celular, lo cual sugiere que puede ser un
componente del factor de competencia. Otro com-
ponente, capaz de entrar slo en la mitosis, puede
requerirse para que el complejo iMCM2, 3, 5 se aso-
cie al material cromosmico.
En las levaduras, la presencia de Cdc6 en el
origen permite que las protenas MCM se unan al
complejo. Su presencia es indispensable para que
ocurra la iniciacin en el origen. En consecuencia,
el origen entra a la fase S como un complejo de
prerreplicacin, el cual contiene el ORC y las pro-
tenas Cdc6 y MCM. Cuando ocurre la iniciacin,
Cdc y MCM son desplazadas y el origen regresa
al estado de complejo de posreplicacin, el cual
contiene slo el ORC. La protena Cdc es degra-
dada con rapidez durante la fase S; por lo tanto.
no est disponible para respaldar la recarga de las
protenas MCM y, en consecuencia, el origen no
puede ser utilizado para un segundo ciclo de inicia-
cin durante la fase S.
Si Cdc est disponible para unirse al origen
durante la fase G2 (por expresin ectpica), las pro-
tenas MCM no se unen hasta la siguienie fase Gl,
lo cual sugiere que hay un mecanismo secundario
que garantiza que se asocien a los orgenes slo en
el momento adecuado. sta podra ser otra parte del
control de la competencia. Al menos en S. cerevisiae,
este control no parece ejercerse en el nivel de la
entrada al ncleo, pero sta puede ser una diferen-
cia entre las levaduras y las clulas animales. Las
protenas MCM2-7 constituyen un complejo de seis
miembros en forma de anillo alrededor del DX-
Algunas de las protenas del ORC tienen similim-
des con las protenas de replicacin que cargan e
DNA con la polimerasa de DNA. Es posible que
el ORC utilice la hidrlisis de ATP para cargar c
DNA con el anillo MCM. En los extractos de Xen:
pus, la replicacin puede iniciarse si el ORC es elimi-
nado despus de que ha cargado las protenas Cdc-
y MCM. Esto muestra que la funcin principal de.
ORC es identificar el origen a las protenas Cdc .
MCM que controlan la iniciacin y la competenci
Las protenas MCM son indispensables para ls
elongacin y para la iniciacin, y continan fuo-
nando en la horquilla de replicacin. Su participa-
cin exacta en la elongacin no es clara, pero utu
posibilidad es que contribuyan a la actividad de 1=
helicasa que desenrolla el DNA. Otra posibilidad es
que acten como una defensa avanzada que acta
en la cromatina para permitir que una helicasa ac-
te en el DNA.
Los lazos D mantienen
Los orgenes mitocon dra Les
Conceptos principales
.
Las mitocondrias utilizan diferentes secuencias de ori-
gen para iniciar la replicacin de cada cadena del DNA.
.
La replicacin de la cadena H inicia en un lazo D.
.
La replicacin de la cadena L inicia cuando su origen
queda expuesto por el movimiento de la primera
horquilla de replicacin.
Los orgenes de los replicones en los cromosoma-
eucariticos y procariticos son estructuras estti-
cas: estn formadas por secuencias de DNA que -
reconocidas en su forma dplex y son utilizada
para iniciar la replicacin en el momento adecuade
La iniciacin requiere la separacin de las cadena
del DNA y el comienzo de la sntesis bidireccir-
nal del DNA. En las mitocondrias se observa una
organizacin diferente.
La replicacin comienza en un origen especfico
localizado en el DNA dplex circular. Sin embargo
en un inicio slo una de las dos cadenas progeiu-
toras (la cadena H en el DNA mitocondrial de los
mamferos) sirve como molde para la sntesis de \m
cadena nueva. La sntesis contina slo una distan-
cia corta y desplaza a la cadena compaera origir-i
(L), la cual permanece como cadena individual
como se ilustra en la FIGURA 15.16. La condicin <k
esta regin da origen a su nombre, lazo de desplaza-
miento, o lazo D.
Las polimerasas de DNA no pueden iniciar u
sntesis, sino que requieren un extremo 3
'
con
388 CAPTULO 15 El replicn
>1 ciclo de replicacion requiere (actores citoplsmicos
Inyeccin del ncleo al ovocito El DNA en el ncleo
a. tiene una densidad
ligera
El 3NA se replica en
presencia de precursores
pesados
densidad
La replicacion
semlconservadora
genera D A de
densidad hbrida
A
Permeabilizacion de la
envoltura nuclear
El segundo ciclo de
replicacin genera
DNA pesado y DNA
hbrido
FIGURA 15.13 Un ncleo inyectado en un ovocito de Xeno-
pus puede replicarse slo una vez a menos que la membrana
nuclear sea permeabilizada para permitir ciclos subsiguientes
de replicacion.
por la presencia de un represor que impida la replica-
cion repetida en los orgenes que han sido utilizados.
l as preguntas cruciales con respecto a la naturaleza
de este sistema regulador son: cmo determina el
sistema si un origen particular ha sido replicado? y
que componentes protenicos intervienen?
Se ha conocido un poco la naturaleza de los
componentes protenicos al utilizar un sistema en
el cual un DNA sustrato experimenta un solo ciclo
de replicacin. Los ovocitos de Xenopus tienen todos
los componentes necesarios para replicar el DNA
(en las primeras horas posteriores a la fertilizacin
realizan 11 ciclos de divisin sin la expresin de ge-
nes nuevos) y pueden replicar el DNA en un ncleo
que es inyectado al ovocito. La FIGURA 15.13 resume
las caractersticas de este sistema.
Cuando un espermatozoide o niicleo en nter-
fase es inyectado a un ovocito, su DNA se replica
slo una vez (este episodio puede rastrearse con
una etiqueta de densidad, del mismo modo que en
el experimento original en el que se defini la re-
plicacin semiconservadora, mostrado antes en la
Figura 1.12). Si en el ovocito se bloquea la sntesis
de protenas, la membrana alrededor del material
inyectado permanece intacta y el DNA no puede
replicarse de nuevo. No obstante, en presencia de
sntesis protenica, la membrana nuclear se rompe
del mismo modo como lo hara en una divisin ce-
lular normal, y en este caso pueden ocurrir ciclos
subsiguientes de replicacin. El mismo resultado
puede lograrse con agentes que permeabilicen la
membrana nuclear. Esto sugiere que el ncleo con-
tiene una protena (o protenas) indispensable para
la replicacin que se consume de alguna manera
por un.ciclo de replicacin, por lo que aunque haya
ms protena en el citoplasma del ovocito, sta slo
puede entrar al ncleo si la membrana nuclear se
rompe. En principio el sistema puede ser Uevadc
an ms lejos si se desarrolla in vitro un extracti
que respalde la replicacin nuclear y permita as e.
aislamiento de los componentes del extracto y I
identificacin de los factores relevantes.
La FIGURA 15.U explica el control de la reinicia-
cin al proponer que esta protena es un factor de
competencia. Est presente en el ncleo antes de la
replicacin. Un ciclo de replicacin desactiva o des-
truye el factor, y no puede ocurrir otro ciclo hasta
que se proporcione ms factor. El factor localizado
en el citoplasma puede acceder al material nuclear
slo en la mitosis subsiguiente cuando se rompa la
envoltura nuclear. Este sistema regulador cumpk
dos propsitos. Al eliminar un componente necesario
despus de la replicacin, impide que ocurra ms e
un ciclo de replicacin. Tambin constituye un lazc>
de retroaiimentadn que hace que la iniciacin deli
replicacin dependa del paso por la divisin clula-
EL factor de competencia est
formado por protenas MCM
Conceptos principales
El ORC es un complejo de protenas que est asociado
a los orgenes de las levaduras durante todo el ciclo
celular.
Cdc6 es una proteina inestable que se sintetiza slo el
Gl.
Cdc6 se une al ORC y permite la unin de las protenas
MCM.
Cuando la replicacin se inicia, las protenas Cdc6 y
MCM son desplazadas. La degradacin de Cdc6 impide
la reiniciacin.
Algunas protenas MCM se encuentran en el ncleo
durante el ciclo, pero otras pueden entrar slo despus
de la mitosis.
El episodio fundamental en el control de la rep
cacn es la actuacin del ORC en el origen. ?
386 CAPTULO 15 El replicn
.
.
Jad cebadora (vase la seccin 18.8, La actividad
cebadora es necesaria para comenzar la sntesis de
DNA). La replicacion en el origen de la cadena H
y? inicia cuando la polimerasa de RNA transcribe
an cebador. Los extremos 3
'
son generados en el
rebador por medio de una endonucleasa que di-
ie el hbrido de DNA-RNA en numerosos sitios
scretos. La endonucleasa es especfica para la es-
tructura triple formada por el hbrido de DNA-RNA
r.
s la cadena individual de DNA desplazada. Des-
pus, la polimerasa de DNA extiende el extremo 3
'
i interior del DNA.
En las mitocondrias de los mamferos se encuen-
tra un solo lazo D en forma de una abertura de 500
600 bases. La cadena corta que mantiene el lazo
D es inestable y se voltea; a menudo es degradada y
sntelizada de nuevo para mantener la abertura del
dplex en este sitio. Algunas molculas de DNA mi-
tocondriai poseen numerosos lazos , lo cual refleja
d uso de mltiples orgenes. E! mismo mecanismo
>e emplea en el DNA de los cloropiastos,
en donde
hay dos lazos D (en las plantas superiores).
Para replicar el DNA milocondrial de los ma-
mferos, la cadena corta localizada en el lazo D se
extiende. La regin desplazada de la cadena L ori-
ginal se alarga y ampla el lazo D. Esta expansin
contina hasta llegar a unos dos tercios del trayecto
alrededor del crculo. La replicacion de esta regin
expone un origen en la cadena L desplazada. La
sntesis de una cadena H inicia en este sitio, el cual
utilizado por una primasa especial que sintetiza
RNA corto. Despus, el RNA es extendido por la
limerasa de DNA y avanza alrededor del molde
.
la cadena individual L desplazada en la direccin
opuesta a la sntesis de la cadena L.
Como resultado del rezago en su inicio, la sn-
:esis de la cadena H habr avanzado slo un tercio
del trayecto alrededor del crculo cuando la sntesis
de la cadena L finalice. Esto libera un crculo dplex
completo y un crculo hendido, el cual permanece
parcialmente en forma de cadena individual hasta
que la sntesis de la cadena H concluye. Por ltimo,
Las cadenas nuevas se sellan para formar estructuras
imactas en trminos covalentes.
La existencia de los lazos D da lugar a un princi-
pio general: Un origen puede ser una secuencia de DNA
jue sirve para iniciar la sntesis de DNA utilizando una
cadena como molde. La abertura del dplex no siem-
pre conduce a la iniciacin de la replicacin en la
otra cadena. En el caso de la replicacin del DNA
mitocondrial, los orgenes para replicar las cadenas
complementarias se encuentran en localizaciones
diferentes. Los orgenes que facilitan la replica-
cin de slo una cadena tambin se encuentran en
la forma de replicacin del crculo rodante (vase la
La replicacion del DNA mitocondrial comienza en el lazo D
El cebador de RNA inicia Inicio de la sntesis de RNA
la replicacin en el origen /
en la cadena H
Cadena H
dividido
Cadena L
El DNA es sintetizado
La sntesis de una cadena
L nueva crea un lazo D al
desplazar a la cadena
progenitora
Cuando la cadena
desplazada pasa al
origen en la cadena L,
inicia la sntesis de la
nueva cadena H
El lazo D se expande
Origen de la cadena L
La conclusin de la cadena L nueva libera los genomas hijos
/ \
"
La conclusin El genoma
genera un
liberado es
crculo dplex parcia
lmente
replicado
La conclusin
genera un crculo
dplex
Se sellan las separaciones de
las cadenas nuevas
FIGURA 15.16 El lazo D mantiene una abertura en el DNA mi-
tocondrial de los mamferos, la cual separa los orgenes para la
replicacin de cada cadena.
seccin 16.4, Los crculos rodantes producen mult-
meros de un replicn).
Resumen
El cromosoma completo se replica una vez en cada
ciclo de divisin celular. La iniciacin de la repli-
cacin obliga a la clula a experimentar un ciclo
de divisin; la conclusin de la replicacin puede
desencadenar el proceso de divisin en s. El cro-
mosoma bacteriano est formado por un solo re-
plicn, pero un cromosoma eucaritico se divide
15.11 Resumen 389
en numerosos replicones que funcionan durante el
prolongado periodo de la fase S. El problema de re-
plicar los extremos de un replicn lineal se resuelve
en una variedad de formas, con mayor frecuencia al
convertir el replicn en una forma circular. Algunos
virus tienen protenas especiales que reconocen los
extremos. Los cromosomas eucariticos confrontan
este problema en sus replicones terminales.
El origen mriimo de E. coli est formado por
-
245 bp e inicia la replicacin de forma bidireccio-
nal. Cualquier molcula de DNA con esta secuencia
puede replicarse en E. coli. Dos horquillas de replica-
cin abandonan el origen y se desplazan alrededor
del cromosoma, al parecer hasta que se encuentran,
aunque se han identificado las secuencias terque ha-
ran que las horquillas terminaran despus de encon-
trarse. Las unidades de transcripcin estn organiza-
das de tal manera que la transcripcin prosigue casi
siempre en la misma direccin que la replicacin.
La replicacin eucaritica es al menos un orden
de magnitud ms lenta que la replicacin bacteria-
na. Los orgenes facilitan la replicacin bidireccional
y tal vez se utilicen en un orden predeterminado
durante la fase S. Los orgenes de S. cerevisiae tienen
una secuencia nuclear de consenso formada por 11
pares de bases, en su mayor parte A-T.
Despus de la divisin celular, los ncleos de las
clulas eucarlticas tienen un factor de competencia
indispensable para iniciar la replicacin. Su destruc-
cin despus de la iniciacin de la replicacin impi-
de que ocurran ciclos de replicacin posteriores en
las levaduras. El factor de competencia no puecie ser
importado al interior del ncleo desde el citoplasma
y puede ser remplazado slo cuando la membrana
nuclear se rompe durante la mitosis.
En las levaduras, el origen es reconocido por las
protenas del ORC, las cuales permanecen unidas
durante el ciclo celular en las levaduras. La protela
Cdc6 est disponible slo en la fase S. En las leva-
duras es sintetizada durante la fase S y se degrada
con rapidez. En las clulas animales se sintetiza de
manera continua, pero es exportada desde el ncleo
durante la fase S. La presencia de Cdc6 permite que
las protenas MCM se unan al origen. Las protenas
MCM son indispensables para la iniciacin. La ac-
cin de las protenas Cdc y MCM constituyen la
funcin de competencia.
Referencias
Introduccin
Artculo de investigacin
Jacob, F., Brenner, S., and Cuzin, F. (1963). On thc
regulation o DNA replication in bacteria. CoIdSpring
Harbor Symp. Quani. Rial. 28, 329-348.
Los replicones pueden ser lineales o circulares
Artculo de revisin
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Referencias 391
Replicones extracromosmicos
ESQUEMA DEL CAPTULO
UiBl Introduccin
l
.TM Los extremos deL DNA lineal representan un
problema para la replicacin
.
Para replicar [a cadena de DNA con un extremo 5' se
necesitan arreglos especiales.
USI Las protenas terminales permiten la iniciacin en
los extremos de los DNA vricos
.
Una protena terminal se une al extremo 5' del DNA y
proporciona un nucletido de citidina con un extremo
3
'
-
0H que ceba a la replicacin.
HiKfl Los crculos rodantes producen multmeros de un
replicn
.
Un crculo rodante genera multmeros de las cadenas de la
secuencia original.
BM Los crculos rodantes se utilizan para replicar los
genomas de los fagos
.
La protena (pX A es una relaxasa de actuacin en cis que
genera crculos de cadena individual a partir de la cola
producida por la replicacin por crculos rodantes.
lata El plsmido F es transferido por conjugacin entre
bacterias
.
Un factor F libre es un replicn que se mantiene en el nivel
de un plsmido por cromosoma bacteriano.
.
Un factor F puede integrarse al cromosoma bacteriano, en
cuyo caso, su propio sistema de replicacin es suprimido.
*
El factor F codifica a pili especficos que se forman en la
superficie de la bacteria.
.
Un pilus F permite que una bacteria F positiva contacte a
una bacteria F negativa y se inicie la conjugacin.
mvmm La conjugacin transfiere DNA de cadena
individual
.
La transferencia de un factor F inicia cuando la replicacin
por crculos rodantes empieza en orT.
.
El extremo 5' inicia la transferencia en la bacteria
receptora.
.
El DNA transferido se hace bicatenario en la bacteria
receptora.
*
Cuando un factor F est libre, la conjugacin "infecta" a la
bacteria receptora con una copia del factor F.
.
Cuando se integra un factor F, la conjugacin provoca
la transferencia del cromosoma bacteriano hasta que el
proceso es interrumpido por rotura (aleatoria) del contacto
entre el donador y la bacteria receptora.
EO El plsmido bacteriano Ti provoca la enfermeda
de agalla de Crown en las plantas
.
La infeccin por la bacteria A. tumefaciens puede
transformar las clulas de las plantas en tumores.
*
El agente infeccioso es un plsmido transportado por l
bacteria.
.
El plsmido tambin porta genes para sintetizar y
metabolizar las opinas (derivados de la arginina) que
utiliza la clula tumoral.
1X1 El T-DNA porta los genes necesarios para la
infeccin
Parte del DNA del plsmido Ti se transfiere al ncleo de
clula de la planta.
.
Los genes vir del plsmido Ti se localizan fuera de la 1
regin transferida y son necesarios para el proceso de ]
transferencia.
.
Los genes vir son inducidos por compuestos fenlicos i
liberados por las plantas en respuesta a lesiones.
.
La protena de membrana VirA se autofosforila en la
histidina cuando se une a un inductor.
-
La protena VirA activa a la protena VirG al transferirla
grupo fosfato.
.
VirA-VirG es uno ce los numerosos sistemas bacteriana
de dos componentes que utilizan un regulador de
fosfohistidina.
UBl La transferencia del T-DNA es semejante a la 1
conjugacin bacteriana
.
El T-DNA se genera cuando una hendidura en la frontefli
derecha crea un cebador para la sntesis de una nuev 1
cadena de DNA.
.
La cadena individual preexistente que es desplazada pj
la nueva sntesis es transferida al ncleo de la clula
planta.
.
La transferencia termina cuando la sntesis de DNA Viem
una hendidura en la frontera izquierda.
.
El T-DNA es transferido como un complejo de DNA de 1
cadena individual con la protena de unin a la cadena
individual VirE2.
*
El T-DNA de cadena individual es transformado en DNAj
bicatenario e integrado al genoma de la planta.
.
Se desconoce el mecanismo de integracin. El T-DNA M
ser utilizado para transferir genes al interior del ncls j
una clula vegetal.
Resumen
392
Introduccin
r-
bacteria puede ser el hospedador de unidades
::
ticas de replicacin independiente, adems de su
rnosoma. Estos genomas extracromosmicos son
:
dos tipos, plsmidos y bacterifagos (fagos). Algu-
;
plsmidos y todos los fagos tienen la capacidad de
-
iisferirse de una bacteria donadora a un receptor
:
un proceso infeccioso. Una distincin importante
"
.
re ellos es que los plsmidos existen slo como ge-
mas de DNA libres, mientras que los bacterifagos
n virus que empacan un genoma de cido nucleico
::.
una envoltura de protena y son liberados de la
; r.eria al final de un ciclo infeccioso.
Los plsmidos son molculas circulares de
I NA autorreplicantes que se mantienen en la clula
:
"
un nmero de copias estable y caracterstico, es
.
:dr, que se mantiene constante de generacin en
-
meracin. Los plsmidos de copia individual man-
men la misma cantidad respecto del cromosoma
:
;cteriano hospedador, uno por cada unidad bacte-
iana, y como el cromosoma hospedador, se basan
:.
-
un mecanismo especfico para ser segregados
ie manera equivalente en cada divisin bacteria-
a. De los plsmidos de copias mltiples hay varias
:
>r unidad bacteriana y pueden ser segregados a las
bacterias hijas de forma estocstica (es decir, hay
suficientes copias para que cada clula hija siempre
;
dquiera algunas en una distribucin aleatoria).
Los plsmidos y los fagos se definen por su capa-
::
dad para residir en las bacterias como unidades ge-
nticas independientes. No obstante, algunos pls-
midos y ciertos fagos tambin pueden existir como
secuencias en el genoma bacteriano, cuyo caso, la
misma secuencia que constituye al plsmido inde-
pendiente o al genoma del fago se encuentra dentro
del cromosoma y es heredada como cualquier otro
gen bacteriano. Se dice que los fagos que forman
parte del cromosoma bacteriano exhiben lisogenia,
en tanto que los plsmidos con capacidad de com-
portarse de esa manera se denominan episomas.
los fagos y los episomas utilizan procesos relacio-
nados para insertarse en el cromosoma bacteriano
y ser escindidos de l.
Una similitud entre los fagos lisognicos, los
Bsmidos y los episomas es que mantienen una po-
sesin egosta de su bacteria y con frecuencia impi-
den que otro elemento del mismo tipo se establezca,
Este efecto se denomina inmunidad, aunque la
base molecular de la inmunidad por plsmidos es
diferente de la lisognica y es consecuencia del sis-
tema de control de la replicacin.
En la Figura 14.2 se resumen los tipos de uni-
dades genticas que pueden ser propagadas en las
bacterias como genomas independientes. Los fagos
uticos pueden tener genomas de cualquier tipo de
cido nucleico y se transfieren entre las clulas por
la liberacin de partculas infecciosas. Los fagos li-
sognicos tienen genomas de DNA de doble cade-
na, igual que los plsmidos y los episomas. Algunos
plsmidos se transfieren entre las clulas mediante
un proceso de conjugacin (con contacto directo
entre las clulas donadoras y receptoras). Una ca-
racterstica del proceso de transferencia en ambos
casos es que ocasionalmente algunos genes hospe-
dadores bacterianos son transferidos con el DNA del
plsmido o con el fago, de modo que la funcin de
estos eventos es permitir el intercambio de informa-
cin gentica entre las bacterias.
La caracterstica fundamental en la determina-
cin del comportamiento de cada tipo de unidad
radica en cmo se utiliza su origen. En un cromo-
soma bacteriano o eucaritico, un origen permite
iniciar un solo evento de replicacin que abarca el
replicn, sin embargo, los replicones tambin pue-
den ser utilizados para fomentar otras formas de re-
plicacin. La alternativa ms comn es utilizada pol-
las pequeas unidades de replicacin independiente
de los virus. El objetivo de un ciclo de replicacin
vrica es producir muchas copias del genoma vrico
antes de que la clula hospedadora sea Usada para
liberarlas. Algunos virus se replican de la misma
forma que un genoma hospedador, con un evento
de iniciacin que da lugar a la produccin de copias
duplicadas, cada una de las cuales vuelve a repli-
carse despus, y as sucesivamente. Otros utilizan
una forma de replicacin en la cual se producen
numerosas copias a manera de matriz en tndem
despus de un solo evento de iniciacin. Los episo-
mas activan un evento similar cuando el DNA de
un plsmido integrado deja de ser inerte e inicia un
ciclo de replicacin.
Muchos replicones procariticos son circulares,
caracterstica necesaria para las formas de replica-
cin que producen mltiples copias en tndem. Sin
embargo, algunos replicones extracromosmicos
son lineales, en cuyo caso se tiene que considerar la
capacidad de replicar el extremo del replicn. (Ob-
viamente, los cromosomas eucariticos son lineales
,
de modo que en los replicones existe el mismo pro-
blema en cada extremo, aunque dichos replicones
tienen un sistema especial para resolverlo.)
| Los extremos deL DNA Lineal
representan un problema para
la replicacin
Concepto principal
.
Para replicar la cadena de DNA con un extremo 5' se
necesitan arreglos especiales.
16.2 Los extremos del DNA lineal representan un problema para la replicacin
393
_
replicacin de un extremo 5
'
es un problema
5
'
Trfrrrrrrr3
Extremo del DNA lineal
Cmo inicia una cadena
nueva en el extremo?
0
Cadena nueva sintetizada en
direccin 5'-3'
. 3'
Salida
111
FIGURA 16.1 La replicacin podria salir del extremo 3' de una cade-
na lineal recin sintetizada, pero podria iniciar en el extremo 5?
Ninguno de los replicones analizados hasta ahora
tiene un extremo lineal, todos son circulares (como
en los genomas de E. coli o de las mitocondrias) o
forman parte de unidades ms largas de segregacin
(como en los cromosomas eucariticos), pero s hay
replicones lineales, en algunos casos como unidades
extracromosmicas individuales y, por supuesto, en
los extremos de los cromosomas eucariticos.
La capacidad de todas las polimerasas conocidas
de los cidos nucleicos, DNA o RNA, para proceder
slo en direccin 5
'
-
3
'
, constituye problema para
sintetizar el DNA en el extremo de un replicn li-
neal. Considrense las dos cadenas progenitoras
ilustradas en la FIGURA 16.1; la cadena inferior no
tiene problema, puede actuar como molde para sin-
tetizar una cadena hija que llega directamente al
extremo, donde presumiblemente se desprende la
polimerasa. Sin embargo, para sintetizar un com-
plemento en el extremo de la cadena superior, la
sntesis debe comenzar justo en la ltima base, de
lo contrario, esta cadena se har ms corta en los
ciclos sucesivos de replicacin.
Se desconoce si la iniciacin justo en el extremo
del DNA lineal es posible, en general se piensa que
una polimerasa se une a un sitio que rodea a la posi-
cin en la cual debe incorporarse una base, de modo
que debe emplearse un mecanismo especial para la
replicacin de los extremos de los replicones linea-
les. Es posible imaginar numerosas soluciones para
dar cabida a la necesidad de copiar un trmino;
.
El problema puede ser evadido transfor-
mando un replicn lineal en una molcula
circular o multimrica, mecanismos utiliza-
dos por fagos como T4 o X (vase la seccin
16.4, Los crculos rodantes producen mul-
tmeros de un replicn).
.
El DNA puede formar una estructura in-
usual, por ejemplo, al crear una horquilla
en el trmino, de manera que no hay un
extremo libre. La formacin de una ligadura
cruzada est implicada en la replicacin del
DNA mitocondrial lineal de Paramecium.
El extremo puede ser variable y no deter-
minado con precisin. Los cromosomas e
cariticos suelen adoptar esta solucin, J
la cual cambia el nmero de copias de ura
unidad corta repetitiva, localizada en el e
tremo del DNA (vase la seccin 28.18, L:
telmeros son sintetizados por una enzirrj
ribonucleoprotenica). Un mecanismo pan
agregar o eliminar unidades hace innecesi
ria la replicacin hasta el extremo.
Una protena puede intervenir para hac:
posible la iniciacin en el extremo. Numer. -
sos cidos nucleicos vricos tienen protej
ligadas de manera covalente a la base termir.j.
5
'
. Los ejemplos mejor caracterizados sm
el DNA del adenovirus y el del fago (p29
adems del RNA del poliovirus.
Las protenas terminales
permiten La iniciacin en Los
extremos de Los DNA vricos
Concepto principal
Una protena terminal se une al extremo 5' del DNA y
proporciona un nucletido de citidina con un extremo
3
'
-
0H que ceba a la replicacin.
El DNA del adenovirus y el del fago (p29 son ejem-
plos de iniciacin en un extremo lineal, que de he-
cho se replican desde los dos extremos utilizando d
mecanismo de desplazamiento de cadena que ir
ilustra en la FIGURA 16.2. En cualquiera de los extre-
mos pueden tener lugar de manera independienir
los mismos eventos. La sntesis de una cadena nue-
va empieza en un extremo y desplaza a la cader;
homloga que previamente estaba apareada con el
dplex. Cuando la horquilla de replicacin llega c[
otro extremo de la molcula, la cadena desplazad;
se libera como una cadena individual libre, evento
que requiere de la formacin de un origen dple:;
por apareamiento de bases entre algunas secuen-
cias complementarias cortas de los extremos de h
molcula.
En varios virus que utilizan dichos mecanismos.
hay una protena adherida de forma covalente a
cada extremo 5
'
.
En el caso de los adenovirus, um.
protena terminal est ligada con el DNA vricc
maduro mediante un enlace fosfodister con la se-
rina, como se indica en la FIGURA 16.3.
Cmo supera la adhesin de la protena el pro-
blema de la iniciacin? La protena terminal tiene
dos actividades, transportar la citidina que propor-
ciona el cebador y estar asociada con la polimerasa
de DNA. De hecho, la ligadura de una protena ter-
minal a un nucletido es llevada a cabo por la poli-
394 CAPTULO 16 Replicones extracromosmicos
El DNA del adenovirus se replica por
desplazamiento de la cadena
DNA lineal
3
'
cUi
5
'
Miiimiiimtiiiiimiiiiiii
3'
5
'
La sntesis de DNA Inicia en el extremo 5'
"
. izquierdo
3,
La horquilla avanza I
5
'
TiTrrrrrrrrrn\
_
La cadena Individual es desplazada cuando la
horquilla llega al extremo
5
/
Trrrrrrrrrrrn'i i j 111 nTrrrnttiti 3'
'
iimimii..
Los trminos se aparean para formar un origen
dplex
\
La sntesis de DNA avanza
nCURA 16.2 La repLicacin deL DNA deL adenovirus se inicia
.caradamente en ambos extremos de la molcula y procede
:;
-
desplazamiento de La cadena.
~
erasa de DNA en presencia del DNA del adenovi-
~
_s
, fenmeno que sugiere el modelo ilustrado en la
RGURA 16.4. El complejo formado por la polimerasa
ie DNA y la protena terminal, que porta el nu-
iletido C cebador, se une al extremo del DNA del
adenovirus. El extremo 3
'
-OH libre del nucletido
I se utiliza para cebar la reaccin de la elongacin
mediante la polimerasa de DNA, lo cual genera una
nueva cadena cuyo extremo 5
'
se liga de manera
:
ovalente con el nucletido C iniciador. (De hecho,
reaccin implica el desplazamiento de la protei-
ca del DNA y no una nueva unin. El extremo 5
'
le DNA del adenovirus est unido a la protena
:
erminal utilizada en el ciclo previo de replicacin.
La protena terminal antigua es desplazada por la
-
ueva en cada nuevo ciclo de replicacin.)
La protena terminal se une a la regin que se
caliza entre los pares de bases 9 y 18 desde el ex-
remo del DNA. La regin adyacente, localizada en-
Una protena se une de forma covalente al
DNA del adenovirus
Serlna o
H
11
Pollpptldo Polipptido
CH2
Enlace DNA-protena
-
o-p = o
Citosina
?
CH,
0
\
V
0
;
-
Y
OH
I
3
'
i
DNA del adenovirus
FIGURA 16.3 El fosfato terminal 5' de cada extremo del DNA
deL adenovirus est ligado de manera covalente a una serina
de La protena de unin aL Ad de 55 kD.
I del ad
proporciona un cebador
terminal
-
dCTP
de DNA
-
C-OH
-
C-OH
i n
lIlAimilUIIIIIH
-
PPPA
Ser-C-OH
3
'
-
HO-GpTpApGpT-
La protena terminal del adenovirus se une al
extremo 5
'
del DNA y proporciona un extremo C-OH para cebar
la sntesis de una nueva cadena de DNA.
tre las posiciones 17 y 48, es esencial para la unin
de una protena hospedadora, el factor nuclear I,
que tambin es necesario para la reaccin de ini-
16.3 Las protenas terminaLes permiten La iniciacin en Los extremos de los DNA vricos
395
dacin. Por consiguiente, el complejo de iniciacin
puede formarse entre las posiciones 9 y 48, distancia
fija a partir del extremo del DNA.
ffl Los crculos rodantes producen
muLtmeros de un replicn
Concepto principal
.
Un crculo rodante genera multmeros de cadena
individual de la secuencia original.
Las estructuras generadas por el replicn dependen
de la reaccin que se produzca entre el molde y la
horquilla de replicacin. Las condicionantes funda-
mentales son si el molde es circular o lineal y si la
horquilla de replicacin est comprometida con la
sntesis de las dos cadenas del DNA o slo de una,
El crculo rodante replica al DNA
El molde es DNA dplex circular
Iv i
La iniciacin ocurre en una cadena
3'-OH
5
'
-
P
Hendidura en
el origen
Ei alargamiento de la cadena creciente
desplaza a la cadena antigua
Cadena creciente
5
'
Cadena desplazada
Despus de una revolucin, la cadena
desplazada llega a la longitud de una
unidad
La elongacin continua genera una
cadena desplazada de mltiples unidades
La replicacin de una sola cadena permite ger.:
rar copias de algunas molculas circulares. Una he'
didura abre una cadena y posteriormente el extrero
3
'
-
OH generado por la hendidura es ampliado p:
la polimerasa de DNA. La cadena recin sintetiza:
desplaza a la cadena progenitora original. Los ever
tos resultantes se describen en la PI 16.5.
Este tipo de estructura se denomina circu
rodante porque puede considerarse que el pun
de crecimiento rueda en torno a la cadena circ_
lar que funciona como molde; en principio podr.
hacerlo indefinidamente. Conforme se desplaza, 1
horquilla de replicacin extiende la cadena exterr.
y desplaza al compaero anterior. Vase la micrc
grafa electrnica de la 16.6.
El material recin sintetizado est ligado de rna
era covalente al material original, de modo que
cadena desplazada contiene al genoma original e
su extremo 5
'
. La unidad original va seguida de cu;
quier nmero de copias del genoma sintetizadas p
revoluciones continuas del molde. Cada revoluci:
desplaza al material sintetizado en el ciclo previo.
El crculo rodante tiene varios usos in vivo; q
la FIGURA 16.7 se muestran algunas de las rutas uti-
lizadas para replicar el DNA.
La divisin de una unidad de cola genera ui
copia del replicn circular original en forma linea
La estructura lineal puede mantenerse como cade
na individual o ser transformada en un dplex p
medio de la sntesis de la cadena complementan.
(cuya secuencia es idntica a la de la cadena mole
del crculo rodante original).
El crculo rodante proporciona el medio par
amplificar el replicn (la unidad) original, meca
nismo que se utiliza para generar DNA ribosmic-
(DNAr) amplificado en el ovocito de Xenopus. L
genes del RNA ribosmico (RNAr) se organizan e
Circuios rodantes en imgenes
Cola lineal.d&
eadena individual
Molde oircularde
-
doDle-cadna'
5 El crculo rodante genera una cola multimrica
de cadena individual.
En las imgenes por microscopa electrnica, l
crculo rodante se ve como una molcula circular de cola linea
Cortesa de Ross B. Inman, Institute of Molecular Viroloc
_
Bock Laboratory and Department of Biochemistry, Univers:"
of Wisconsin, Madson, Wsconsin, USA.
396 CAPTULO 16 Replicones extracromosmicos
el genoma como un gran nmero de repeticiones
[ nmiguas. Una sola unidad repetitiva del genoma se
ransforma en un crculo rodante. La cola desplaza-
da, que contiene numerosas unidades, se convierte
en DNA dplex; posteriormente se separa del crcu-
lo de manera que los dos extremos pueden unirse
?ara generar un gran crculo de DNAr amplificado,
por lo tanto, el material amplificado consta de gran
'
mero de unidades repetitivas idnticas.
0 Los crculos rodantes
se utUizan para replicar
los genomas de los fagos
Concepto principal
.
La protena 9X A es una relaxasa de actuacin en ds
que genera crculos de cadena individual a partir de la
cola producida por la replicacin por crculos rodantes.
La replicacin por medio de crculos rodantes es
comn entre los bacterifagos. Los genomas uni-
taiios pueden ser separados de la cola desplazada
v generar monmeros que es posible empacar en
partculas de fagos o utilizar para ciclos de replica-
cin posteriores. En la FIGURA : se muestra una
Los productos del crculo rodante son verstiles
Divisin de los Divisin en
multmeros la unidad
y \
Unidad de
cadena
Cadena individual individual
multimrica
i i
Dplex multimrico
Cadena
individual circular
\ y
Dplex circular
[lltURA 16." El destino de la cola desplazada determina el tipo
productos generados por los crculos rodantes. La divisin de
-
'
3 unidad genera monmeros, que pueden ser convertidos en
estructuras dplex o circulares. La divisin de los multmeros
liera una serie de copias repetidas en tndem de la unidad
:
"
ginal. Ntese que la conversin a cadena doble podra ocurrir
"
es de que la cadena se desprenda del crculo rodante.
perspectiva ms detallada de un ciclo de replicacin
fgico centrado en el crculo rodante.
El lago (pX174 est formado por un DNA circular
de cadena individual conocido como cadena positiva
(+); por otra parte, se sintetiza una cadena comple-
mentaria denominada cadena negativa (-). Por esta
accin se genera el crculo dplex que aparece en la
parte superior de la figura, el cual es replicado poste-
riormente por un mecanismo de crculo rodante.
El crculo dplex se transforma en una estruc-
tura cerrada de manera covalente, la cual se super-
cnrolla. Una protena codificada por el genoma del
fago, la protena A, hace una hendidura en la cadena
(+) del DNA dplex en un sitio especfico que define
el origen de la replicacin. Despus de que se forma
La protena A acta en c/s
.
El RF del DNA de (pX174 es un molde para sinte-
tizar crculos vricos de cadena individual. La protena A per-
manece unida al mismo genoma en un nmero indefinido de
revoluciones, haciendo una hendidura en el origen en la cadena
vrica (+) y transfirindose al extremo 5
'
nuevo en cada ciclo.
Al mismo tiempo, la cadena vrica liberada adquiere una forma
circular,
La protena A hace una hendidura en el origen
y se une al extremo 5
'
Cadena -
Cadena +
La replicacin del crculo rodante desplaza
a la cadena negativa
Sntesis de DNA
La horquilla de replicacin rebasa el origen;
la protena A hace una hendidura en el DNA
y se une a un.extremo 5
'
nuevo
La cadena positiva liberada forma un crculo
covalente
16.5 Los crculos rodantes se utilizan para replicar los genomas de los fagos
397
la hendidura en el origen, la protena A se mantiene
conectada con el extremo 5
'
que genera, mientras
que el 3
'
es extendido por la polimerasa de DNA.
La estructura del DNA tiene una funcin im-
portante en esta reaccin, pues slo puede ser hen-
dido cuando est superenrollado negativamente (p. ej.,
enrollado en su eje espacial en sentido opuesto a la
direccin de la doble hlice; vase la seccin 19.12,
El superenrollamiento afecta a la estructura del
DNA). La protena A es susceptible de unirse a un
fragmento decmero de cadena individual de DNA
que rodea al sitio de hendidura, lo cual sugiere que
el superenrollamiento es necesario para facilitar la
formacin de una regin de cadena individual que
proporciona a la protena A su sitio de unin. (Una
actividad enzimtica en la cual la protena divide al
DNA dplex y se une a un extremo 5' liberado se
denomina, en ocasiones, relaxasa.) La hendidura
genera un extremo 3-OH y uno 5
'
-
fosfato (adheri-
do de manera covalente a la protena A), los cuales
tienen un papel que desempear en la replicacin
de (pX174.
Utilizando el crculo rodante, el extremo 3'-OH
de la hendidura se extiende en una nueva cadena
que se alarga en torno a la cadena molde (-) circu-
lar hasta que llega al punto de inicio y desplaza al
origen, cuando la protena A vuelve a funcionar.
Permanece conectada al crculo rodante y tambin
al extremo 5
'
de la cola desplazada, de modo que
se mantiene cerca, mientras el punto creciente re-
gresa y rebasa al origen. Por consiguiente, la misma
protena A vuelve a estar disponible para reconocer
el origen y hendirlo, adhirindose ahora al extremo
generado por la nueva hendidura. El ciclo puede
repetirse indefinidamente.
Despus de este evento de formacin de la hen-
didura, la cadena individual (+) desplazada es libe-
rada en forma circular. La protena A participa en
la formacin del crculo, de hecho, la unin de los
extremos 3
'
y 5' de la cadena (+) producida se logra
a travs de ella como parte de la reaccin por la cual
es liberada al final de un ciclo de replicacin para
que empiece otro.
La protena A tiene una propiedad inusual po-
siblemente relacionada con estas actividades. In vivo
acta en configuracin cis. (No es posible reproducir
este comportamiento in vitro, como puede obser-
varse a partir de su actividad en cualquier molde
de DNA de un sistema sin clulas.) La implicacin
es que, in vivo, la protena A sintetizada por un geno-
ma en particular puede adherirse slo al DNA de dicho
genoma, pero se desconoce cmo. Sin embargo, su
actividad in vitro muestra cmo se mantiene aso-
ciada a la misma cadena molde (-) progenitora. La
protena A tiene dos sitios activos, lo cual le permite
dividir el origen "nuevo" mientras an conserva el
"
antiguo
"
; despus se liga a la cadena desplazada
en un crculo.
Una vez formada la estructura circular, la ca-
dena (+) desplazada puede tener dos destinos. Du-
rante la fase de replicacin de la infeccin vrica.
puede ser utilizada como molde para sintetizar la
cadena (-) complementaria; el crculo dplex pue-
de ser utilizado despus como crculo rodante para
generar ms progenie. Por otra parte, durante la
morfognesis del fago, la cadena (+) desplazada se
empaqueta en el virin fgico.
EL pLsmido F es transferido
por conjugacin
entre bacterias
Conceptos principales
Un factor F libre es un replicn que se mantiene en el
nivel de un plsmido por cromosoma bacteriano.
Un factor F puede integrarse al cromosoma bacteriano,
en cuyo caso, su propio sistema de replicacin es
suprimido.
El factor F codifica a pili especficos que se forman en
la superficie de la bacteria.
Un pilas F permite que una bacteria F positiva contacte
a una bacteria F negativa y se inicie la conjugacin.
Otro ejemplo de conexin entre la replicacin y la
propagacin de una unidad gentica es la conjuga-
cin bacteriana, en la cual el genoma de un plsmi-
do o un cromosoma hospedador es transferido de
una bacteria a otra.
La conjugacin depende del plsmido F, que
constituye un ejemplo clsico de episoma, elemento
que puede existir como plsmido circular libre o ser
integrado al cromosoma bacteriano como secuencia
lineal (como un bacterifago lisognico). El plsmi-
do F es una gran molcula de DNA circular con una
longitud de -100 kb.
El factor F puede integrarse en numerosos sitios
del cromosoma de E. coli, a menudo por eventos de
recombinacin que involucran a ciertas secuencUv
(denominadas secuencias IS; vase la seccin 21.5
Los transposones provocan la reestructuracin de;
DNA) presentes en el cromosoma hospedador y en
el plsmido F. En su forma libre (de plsmido), d
plsmido F utiliza a su propio origen de replicador.
(oriV) y a su propio sistema de control, y se man-
tiene una copia por cada cromosoma bacteriano
Cuando se integra a ste, dicho sistema es suprimido
y el DNA F se replica como parte del cromosoma.
La presencia del plsmido F, libre o integrado
tiene consecuencias importantes para la bacteria
hospedadora. Las bacterias F positivas son suscep-
398
CAPTULO 16 Replicones extracromosmicos
oles de conjugarse (o aparearse) con las bacterias
z ne
gativas. La conjugacin implica un contacto
entre la bacteria donadora (F positiva) y la bacte-
r
.a receptora (F negativa), el cual va seguido de la
transferencia del factor F. Si el factor F existe en
forma de plsmido libre en la bacteria donadora, es
transferido como plsmido y el proceso infeccioso
transforma al receptor F negativo en F positivo. Por
m contrario, si el factor F est presente en forma
integrada en el donador, el proceso de transferencia
:
-
mbin puede provocar que una parte o todo el
cromosoma bacteriano sea transferido. Numerosos
lismidos tienen sistemas de conjugacin que ope-
ran de forma similar, sin embargo, el factor F fue el
primero en ser descubierto y prevalece como para-
digma de este tipo de transferencia gentica.
Para la conjugacin se necesita una regin
extensa (de -33 kb) del plsmido F denominada
regin de transferencia, la cual contiene -40
genes necesarios para la transmisin del DNA; su
irganizacin se resume en la FIGURA 16.9. Los ge-
nes se llaman locus tra y locus trb, y la mayor parte
K expresa de forma coordinada, como parte de una
la unidad de transcripcin de 32 kb (la unidad
traY-I). traMy traJ se expresan separadamente. traJ
es un regulador que enciende a traM y a traY-I. En
la cadena opuesta, finP es un regulador que codifica
a un pequeo RNA antisentido que apaga a traJ.
Su actividad requiere de la expresin de otro gen,
finO. Slo cuatro de los genes tra de la unidad de
transcripcin mayor estn implicados directamente
[en la transferencia del DNA, casi todos tienen que
er con las propiedades de la superficie de la clula
bacteriana y con el mantenimiento de contactos en-
tre las bacterias en proceso de apareamiento.
Las bacterias F positivas poseen apndices de
Buperficie denominados pili (singular pilus) que son
codicados por el factor F. El gen traA codifica a la
Kubunidad protenica individual, la pilina, que es
Bolimerizada en el pilus. Cuando menos 12 genes tra
on necesarios para la modificacin y el ensamblaje
lae la pilina en el pilus. Los pili F son estructuras
similares a cabellos, de 2 a 3 pm de largo, que so-
bresalen de la superficie bacteriana. Una clula F
positiva tpica tiene dos o tres pili. Las subunidades
!de
pilina se polimerizan en un cilindro hueco de -8
mm de dimetro
, con un agujero axial de 2 nm.
El apareamiento se inicia cuando la punta del
pilus F entra en contacto con la superficie de la c-
lula receptora. En la FIGURA 16.10 se muestra un
ejemplo de clulas de E. coli que han empezado a
aparearse. Una clula donadora no contacta a otras
clulas que portan el factor F porque los genes traS
y traT codifican a protenas de
"
exclusin de su-
perficie" que convierten a la clula en un receptor
deficiente en dichos contactos, lo cual restringe efi-
El plsmido F tiene una regln discreta
que posee ge
Regin reguladora
Genes de transferencia
'
".' TraY Formacin de la hendidura y desenrollado del DNA Trai
TraJ
Exclusin
Pilina de superficie Canal?
A
oriTtraMJ YALEKBPVR GWU N trbCDE traF trbB traH G S T D l/Z
finP
9 La regin tra del plsmido F contiene los genes necesarios
para la conjugacin bacteriana.
Los pili F conectan a las bacterias
pareamiento
5 El contacto inicial de las bacterias en proceso
de apareamiento tiene lugar cuando los pili F del donador con-
tactan a la bacteria receptora. Imagen cortesa de Ron Skurray,
School of Biological Sciences, University of Sydney.
cientemente el apareamiento entre clulas donado-
ras y clulas F negativas. (La presencia de pili F tiene
consecuencias secundarias, proporcionan los sitios
a los cuales se adhieren los fagos de RNA y algunos
de DNA de cadena individual, de modo que las bac-
terias F positivas son susceptibles de infeccin por
estos fagos, mientras que las bacterias F negativas
son resistentes.)
El contacto inicial entre las clulas donado-
ras y las receptoras se interrumpe fcilmente, sin
embargo, otros genes tra estabilizan dicha asocia-
cin, lo cual aproxima a las clulas en proceso de
apareamiento. Los pili F son esenciales para que se
inicie el apareamiento, pero se retraen o desensam-
blan como parte del proceso por el cual las clulas
en apareamiento se acercan una a otra. Debe haber
un canal de transferencia del DNA, sin embargo, el
pilus no parece proporcionarlo. TraD es una protena
de membrana interna en las bacterias F+ necesaria
para el transporte del DNA que puede proporcionar
el canal o ser parte de l,
16.6 El plsmido F es transferido por conjugacin entre bacterias
399
La conjugacin transfiere DNA
de cadena individual
Conceptos principales
La transferencia de un factor F inicia cuando la
replicacin por crculos rodantes empieza en orT.
El extremo 5' inicia la transferencia en la bacteria
receptora.
El DNA transferido se hace bicatenario en la bacteria
receptora.
Cuando un factor F est libre, la conjugacin "infecta"
a la bacteria receptora con una copia del factor F.
Cuando se integra un factor F, la conjugacin provoca
la transferencia del cromosoma bacteriano hasta que
el proceso es interrumpido por rotura (aleatoria) del
contacto entre el donador y la bacteria receptora.
Los donadores F (+) se conjugan con los receptores F (->
DONADOR
TraY/1 crea una hendidura
en orT del DNA
RECEPTOR
El multmero TraY/l migra en
tomo al crculo, desenrollando
el DNA
La cadena
individual entra
ai receptor
Se sintetizan cadenas complementarias
Se cierra la hendidura
del donador
El receptor forma
el crculo
La transferencia del DNA ocurre cuando el fac-
tor F es hendido en onTy una cadena individual es conducida
por el extremo 5
'
al interior del receptor. Slo un tramo de la
unidad es transferido. La cadena individual que permanece en
el donador y la cadena transferida al interior del receptor son
sintetizadas con una cadena complementaria.
La transferencia del factor F inicia en un sitio llama-
do oriT, u origen de la transferencia, que se localiza
en uno de los extremos de la regin de transieren
cia. El proceso puede iniciarse cuando TraM identi-
fica que se ha formado una pareja; a continuacin.
TraY se une en las cercanas de oriT e induce la
unin de Tral. Esta ltima protena es una relaxa-
sa, como la protena A de (pX174. Tral hace un:
hendidura en oriT, en un sitio nico (llamado nio
y despus forma una ligadura covalente con el esd
tremo 5' que se ha generado. Tral tambin cataliz?
el desenrollamiento de -200 bp de DNA (actividad
helicasa; vase la seccin 18.7, El sistema del mi -
dlo (pX muestra la forma en que se genera DK-
de cadena individual por replicacin). En la FIGURA
,11 se muestra que el extremo 5' liberado muestra
el camino al interior de la bacteria receptora, en B
cual se sintetiza un complemento de la cadena in-
dividual transferida, que como resultado de ello, 9g|
transforma en F positiva.
En la bacteria donadora debe sintetizarse ur;
cadena complementaria para remplazar a la que h:
sido transferida. Si esto sucede de forma concomi-
tante con el proceso de transferencia, el estado d I
plsmido F ser semejante al crculo rodante de
Figura 16.5 (y no generar las regiones extensa-
de cadena individual que se muestran en la Figura
16.11). En general, el DNA en proceso de conjuga-
cin aparece como un crculo rodante, sin embargo.
la replicacin como tal no es necesaria para propor-
cionar la energa de conduccin, adems de que la
transferencia de la cadena individual es indepen-
diente de la sntesis de DNA. Una sola unidad de_
factor F es transferida a la bacteria receptora, lo cua.
implica que el proceso termina con alguna caracte-
rstica (no identificada) despus de una revolucin.
al cabo de lo cual se restaura la integridad covalente
del plsmido F.
Cuando un plsmido F integrado inicia la con-
jugacin, la orientacin de la transferencia es aleja-
da de la regin de transferencia, hacia el interior del
cromosoma bacteriano. En la FIGURA 1 12 se mues-
tra que el DNA bacteriano es transferido siguiendo a
una corta secuencia lder de DNA F y que el proces
contina hasta que es interrumpido por la rotur;
de los contactos formados entre las bacterias que se
aparean. Se necesitan -100 minutos para transferir
el cromosoma bacteriano completo, y en condicio-
nes normales, el contacto suele romperse antes de
la culminacin de la transferencia.
El DNA donador que entra a una bacteria recep-
tora se torna bicatenario y puede recombinarse con
el cromosoma receptor. (Ntese que son necesarios
dos eventos recombinantes para insertar el DNA
donador.) As pues, la conjugacin proporciona un
medio de intercambio de material gentico entre
400
CAPITULO 16 Replicones extracromosmicos
;
cterias (a diferencia de su crecimiento asexual ha-
:
ual). Una cepa de E. coli con un factor F integrado
espalda dicha recombinacin con bastante frecuen-
da respecto de las cepas que carecen de factores F
v.egrados); estas cepas se definen como Hft [high
frequency recombination, de recombinacin de alta
fccuencia). Cada posicin de integracin para el
;
ctor F origina una cepa diferente de Hfr, con un
: atrn caracterstico de transferencia de marcadores
bacterianos a un cromosoma receptor.
El contacto entre las bacterias en proceso de
;
njugacin suele romperse antes de que haya
terminado la transferencia del DNA, de modo que
.3 probabilidad de que una regin del cromosoma
bacteriano sea transferida, depende de su distancia
el oriT. Los genes bacterianos localizados cerca del
sitio de integracin de F (en direccin de la transfe-
rencia) entran primero a la bacteria receptora y se
encuentran con frecuencias mucho mayores que los
Realizados ms lejos y que entran despus. Esto da
.ugar a un gradiente de frecuencias de transferencia
en torno al cromosoma, que declina a partir de la
posicin de integracin de F. Las posiciones de los
marcadores localizadas en el cromosoma donador
pueden ser analizadas en funcin del tiempo que
tarda la transferencia, lo cual da lugar a la descrip-
cin estndar del cromosoma de E. coli como un
mapa dividido en 100 minutos. El mapa se refiere a
los tiempos de transferencia de una cepa especfica
de Hfr; el punto de inicio del gradiente de transfe-
rencia es diferente en cada una porque depende del
sitio en el cual el factor F se ha integrado al genoma
bacteriano.
iHTI EL plsmido bacteriano Ti
provoca La enfermedad de
agalla de Crown en Las plantas
Conceptos principales
La infeccin por la bacteria A. tumefaciens puede
transformar las clulas de las plantas en tumores.
El agente infeccioso es un plsmido transportado por la
bacteria.
El plsmido tambin porta genes para sintetizar y
metabolizar las opinas (derivados de la arginina) que
utiliza la clula tumoral.
La mayora de los eventos en que el DNA es rees-
tructurado o amplificado tienen lugar dentro de un
genoma, sin embargo, la interaccin entre las bacte-
rias y ciertas plantas implica la transferencia de DNA
del genoma bacteriano al genoma de la planta. La
enfermedad de agalla de Crown, que se muestra
en la : - , puede ser inducida en la mayora
El factor F inicia la transferencia de una sola cadena
bacteria donadora
FACTOR F
oriT regin tra
El factor F es
hendido en orT
g, g
,
Cromosoma de E. coli ',
BACTERiA receptora
El extremo 5' dirige a la cadena
individual al interior del receptor
Las cadenas individuales son transformadas en cadenas dobles
en ambas bacterias
V.
El DNA del donador se
recombina con el genoma
del receptor
FIGURA 16.12 La transferencia del DNA cromosmico ocurre
cuando un factor F integrado es hendido en orT. La transfe-
rencia del DNA se inicia con una secuencia corta de DNA F y
contina hasta que lo impide la prdida de contacto entre las
bacterias.
de las plantas dicotiledneas por la bacteria de tierra
Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria es un par-
sito que hace un cambio gentico en la clula euca-
ritica hospedadora, con consecuencias tanto para
el parsito como para el hospedador, pues mejora
las condiciones de supervivencia de aqul y provoca
que la clula de la planta crezca como un tumor.
Las agrobacterias son necesarias para inducir la
formacin del tumor, pero las clulas de ste no
requieren de la presencia continua de las bacterias.
Igual que en los tumores animales, las clulas de las
plantas han adquirido un estado en el cual nuevos
mecanismos rigen el crecimiento y la diferenciacin;
la transformacin dentro de la clula es provocada
por la expresin de la informacin gentica trans-
ferida de la bacteria.
El principio de induccin tumoral de Agrobacte-
rium reside en el plsmido Ti. perpetuado como un
replicn independiente en la bacteria. El plsmido
transporta a genes implicados en varias actividades
16.8 El plsmido bacteriano Ti provoca la enfermedad de agalla de Crown en las plantas 401
Los plsmidos T inducen la formacin
de feratomas en las plantas
.
Un Agrobacterium que porta un plsmido Ti
de nopalina induce la formacin de un teratoma, en el cual se
desarrollan estructuras diferenciadas. Imagen cortesa de la
sucesin de Jeff Schell. Reproducida con autorizacin de Max
Planck Institute for Plant Breeding Research, Cologne.
Los genes Ti funcionan en las bacterias y en las plantas
Locus Funcin Plsmido Ti
vir transferencia del DNA a todas
la planta
shi induccin de brotes todas
roi induccin de races todas
nos sntesis de nopalina nopalina
noc catabolismo de nopalina nopalina
oes sntesis de octopina octopina
occ catabolismo de octopina octopina
(ra genes de transferencia todas
bacteriana
Inc genes de incompatibilidad todas
orV origen de la replicacin todas
Los plsmidos Ti transportan a genes implica-
dos en las funciones de las bacterias y las plantas.
de las bacterias y de las clulas vegetales, incluidas
las necesarias para generar el estado transformado,
y un conjunto de genes implicados en la sntesis o
la utilizacin de las opinas (derivados novedosos
de la arginina).
Los plsmidos Ti (y por tanto las Agrobacteria
en que residen) pueden dividirse en cuatro grupos,
segn el tipo de opinas que producen:
.
Los plsmidos de nopalina portan genes
para la sntesis de sta en los tumores y para
utilizarla en la bacteria. Los tumores de no-
palina pueden diferenciarse en brotes con
estructuras anormales. Se les ha denomina-
do teratomas, por su analoga con ciertos
tumores de los mamferos que retienen la
capacidad de diferenciarse en estructuras
embrionarias tempranas.
.
Los plsmidos de octopina son similares 5
los de nopalina, pero la opina pertinente no
es la misma. Sin embargo, los tumores dt-
octopina en general no estn diferenciados
y no forman brotes de teratoma.
.
Los plsmidos de agropina portan gene-
para el metabolismo de sta; los tumores
no se diferencian, su desarrollo es pobre I
mueren pronto.
.
Los plsmidos Ri pueden inducir la enfer-
medad de races vellosas en algunas plan
y la de agalla de Crown en otras. Sus gene?
son de tipo agropina y pueden tener seg-
mentos derivados de los plsmidos de no>
palina y de octopina.
Los tipos de genes que transporta el plsmido T;
se resumen en la FIGURA 16.14. Los genes utilizado?
en la bacteria codifican la replicacin y la incompa-
tibilidad del plsmido, la transferencia entre bacte-
rias, la sensibilidad a los fagos y la sntesis de otro$
compuestos, algunos de los cuales son txicos par
otras bacterias de tierra. Los genes utilizados en las
clulas de las plantas codifican la transferencia de
'
.
DNA al interior de la planta, la induccin de estad.:
transformado y la induccin de brotes y races.
La especificidad de los genes de las opinas depen-
de del tipo de plsmido. Los genes necesarios para la
sntesis de las opinas estn vinculados con otros cuyos
productos catabolizan a la misma opina, de modo que
cada cepa de Agrobacterium provoca que las clulas
tumorales de agalla de Crown sinteticen opinas tiles
para la supervivencia del parsito. Las opinas pue-
den ser utilizadas como nica fuente de nitrgeno o
de carbono de la cepa de Agrobacterium inductora. 9
principio es que la clula vegetal transformada sinte-
tiza a las opinas que la bacteria puede utilizar.
EL T-DNA porta Los genes
necesarios para La infeccin
Conceptos principales
.
Parte del DNA del plsmido Ti se transfiere al ncleo de
la clula de la planta.
.
Los genes vir del plsmido Ti se localizan fuera de la
regin transferida y son necesarios para el proceso de
transferencia.
.
Los genes Wrson inducidos por compuestos fenlicos
liberados por las plantas en respuesta a lesiones.
*
La protena de membrana VirA se autofosforila en la
histidina cuando se une a un inductor.
.
La protena VirA activa a la protena VirG al transferirle
el grupo fosfato.
.
VirA-VirG es uno de los numerosos sistemas bacterianos
de dos componentes que utilizan un regulador de
fosfohistidina.
402 CAPTULO 16 Replicones extracromosmicos
interaccin entre Agrohacterium y una clula vege-
i
- se ilustra en la IGURA 16.15. La bacteria no entra
| la clula de la planta, sino que transfiere parte del
plsmido Ti al ncleo de la clula vegetal. La porcin
'
.ransferida del genoma Ti se denomina T-DNA, que
3 integra al genoma de la planta, en donde expresa
;
5 funciones necesarias para sintetizar opinas y para
"
ansformar a la clula de la planta.
La transformacin de las clulas de la planta
"
rquiere de tres tipos de funciones transportadas
la Agrohacterium:
.
Para la etapa inicial de la unin de la bac-
teria con la clula de la planta se necesitan
tres loci del cromosoma de Agrohacterium,
chvA, chvB y pscA, los cuales son responsa-
bles de la sntesis de un polisacrido en la
superficie celular de la bacteria.
.
La regin vir, que el plsmido Ti saca de la
regin T-DNA, permite liberar e iniciar
la transferencia del T-DNA.
.
El T-DNA es necesario para transformar la
clula de la planta.
La organizacin de los dos tipos principales de
plsmidos Ti se ilustra en la FIGURA 16.16. Aproxi-
r-
adamente el 30% del genoma Ti de -200 kb es
:
oran a los plsmidos de nopalina y octopina. Las
regiones comunes incluyen genes implicados en to-
das las etapas de la interaccin entre Agrohacterium
y una planta hospedadora, sin embargo, la rees-
3iicturacin de secuencias entre los plsmidos es
. :nsiderable.
La regin T ocupa -23 kb, de las cuales, unas
;
kb son iguales en los dos tipos de plsmidos. Los
:
'
.
smidos Ti portan genes para la sntesis de opinas
Nos u Oes) en la regin T, en tanto que los genes
correspondientes al catabolismo de las opinas {Noc
i Occ) residen en otras regiones del plsmido. Los
.smidos codifican funciones morfogenticas si-
gil
ares, pero no idnticas, como se observa en la
r-
duccin de tipos caractersticos de tumores,
Las funciones que afectan a la oncogenicidad,
capacidad para formar tumores,
no se limitan a la
-gin T, pues los genes ajenos a sta deben rela-
cionarse con el establecimiento del estado tumori-
;mco
, si bien sus productos no son necesarios para
erpetuarlo. Por otra pane, podran estar implica-
: s en la transferencia del T-DNA al ncleo de la
"
.anta, o quizs con funciones subsidiarias, como el
equilibrio hormonal de la planta en el tejido infec-
ido. Algunas de las mutaciones son especficas del
spedador, e impiden la formacin de tumores en
i
-unas especies de plantas, pero no en otras.
Los genes de virulencia codifican a las funciones
~
fcesaras para el proceso de transferencia. Seis loci
irA
, B, C, D, Ey G) residen en una regin de 40 kb
-
:.era del T-DNA, cuya organizacin se resume en la
El T-DNA se ntegra al genoma de la planta
Clula de la planta
Agrobacterium
[
Plsmido Ti
Genoma
La bacteria transfier
el T-DNA a la planta
DNA
Las clulas
de la planta ;
desarrollan ;
un tumor
El tumor sintetiza ijOj
opinas en las cuales
.,.
-
x
puede crecer la \ /
bacteria S-i' '
FIGURA 16.' EL T-DNA es transferido a partir de un Agrohac-
terium que transporta un plsmido Ti al interior de una clula
de la planta, donde se integra al genoma nuclear y ejerce fun-
ciones que transforman a la clula hospedadora.
Los plsmidos de nopalina y de octopina son similares
R l Nos
Rni OCS
OC
ra
OrV
Plsmido Ti Plsmido Ti
de nopalina de octopina
Vr
Vir
OrV Inc
FIGURA 16.16 Los plsmidos Ti de nopalina y de octopina
transportan una variedad de genes, incluidas las regiones T con
funciones que se traslapan.
FIGURA 16.
. Cada locus se transcribe como una sola
unidad, si bien algunos incluyen ms de un marco
de lectura abierto.
El proceso de transformacin puede dividirse
cuando menos en dos etapas:
.
Agrobacterium entra en contacto con una
clula vegetal y son inducidos los genes vir.
.
Los productos gnicos vir dan lugar a que el
T-DNA sea transferido al ncleo de la clula
de la planta, donde se integra al genoma.
16.9 El T-DNA porta los genes necesarios para la infeccin
403
Los genes vir transfieren el T-DNA al ncleo de la planta
Locus virA virB virG
Protenas VirA VirB1-11 VirG
Nivel basal bajo bajo
virC virD virE
VirC1-2 VirD1
,
D2 VirE2
Nivel inducido alto
Localizacin mem. mem.
alto
cito.
alto
cito.
alto alto
ncleo ncleo
Funcin
receptor
de
acetilsiringona
induce la
transcripcin
de otros
genes vir
r
implicado
en la
conjugacin
? Y
se une al la nucleasa protena
DNA de D2 hace una de unin
hendidura en con el
el T-DNA ssDNA |
sobre
marcha
La regin vir del plsmido Ti tiene seis Loci
responsables de transferir el T-DNA a una planta infectada.
Hi-llilflIT
ucen acet
C-CH
La acetosiringona (4-acetil-2,5-dimetoxifenol)
es producida porW. tabacum en respuesta a lesiones; induce la
transferencia del T-DNA de Agrobacterium.
Los genes vir se clasifican en dos grupos que
corresponden a estas etapas. virA y virG son regu-
ladores que responden a cambios de la planta al
inducir los otros genes, de modo que, en ellos,
las
mutaciones producen mutantes avirulentos que no
pueden expresar a los genes vzr restantes. Los genes
virB, C, D y E codifican a protenas implicadas en
la transferencia del DNA. Las mutaciones en virB
y virD producen mutantes avirulentos en todas las
plantas, si bien sus efectos en virC y en virE varan
en funcin del tipo de planta hospedadora.
virA y virG se expresan constitutivamente (en
un nivel bastante bajo). Las seales a las cuales res-
ponden provienen de compuestos fenlicos gene-
rados por las plantas como respuesta a las lesiones.
A-VirG es un sistema
de dos componentes
Acetosiringona
VirA (sensor)
El estmulo activa
la autofosforilacin
Q
Los fosfatos son
transferidos al efector
V
VirG (efector)
y La protena fosforilada
activa la transcripcin
EL sistema de dos componentes de VirA-Vi'
responde a seales fenlicas al activar la transcripcin de c
nes diana.
Vase el ejemplo de la 16.18, Nicotiana taba-
cum (planta del tabaco) genera las molculas acete
siringona e hidroxiacetosiringona a. La exposicir
a estos compuestos activa al gen virA, que acta ei
el virG, que a su vez induce la expresin de novo de
virB, C, D y E. Esta reaccin explica porqu la in-
feccin por Agrobacterium ocurre slo en las planta
lesionadas.
VirA y VirG son ejemplo de un sistema bacteria
no clsico en el cual la estimulacin de una protem
sensora da lugar a la autofosforilacin y transieren
cia del fosfato a la segunda protena. La relacin se
ilustra en la HCUR . El sistema VirA-VirG s
asemeja al EnvZ-OmpR que responde a la osme
laridad. La secuencia de virA est relacionada coo
la de envZ, en tanto que las de virG y ompR estn
estrechamente relacionadas, lo cual sugiere que la
protenas efectoras funcionan de manera similar.
VirA forma un homodmero localizado en k
membrana interna que puede responder a con:
puestos fenlicos en el espacio periplsmico. La ex
posicin a estos compuestos provoca qu
VirA s
404 CAPTULO 16 Replicones extracromosmicos
autofosforile en la histidina, y ms tarde, el grupo
fosfato es transferido a un residuo de Asp en VirG. El
producto VirG fosforilado se une a los promotores de
los genes virB, C, Dy E para activar la transcripcin.
Cuando virG es activado, su transcripcin es indu-
cida desde un nuevo punto de inicio, diferente del
utilizado por la expresin constitutiva, lo cual resulta
en el incremento de la cantidad de protena VirG.
De los loci vzr restantes, virD es el mejor carac-
lerizado; tiene cuatro marcos de lectura abiertos.
Dos de las protenas codificadas en virD, VirDl y
VirD2
, proporcionan una endonucleasa que inicia
el proceso de transferencia al hacer una hendidura
en un sitio especfico del T-DNA.
|2B La transferencia del T-DNA
es semejante
a La conjugacin bacteriana
Conceptos principales
.
El T-DNA se genera cuando una hendidura en la frontera
derecha crea un cebador para la sntesis de una nueva
cadena de DNA.
.
La cadena individual preexistente que es desplazada
por la nueva sntesis es transferida al ncleo de la
clula de la planta.
.
La transferencia termina cuando la sntesis de DNA
llega a una hendidura en la frontera izquierda.
.
El T-DNA es transferido como un complejo de DNA de
cadena individual con la protena de unin a la cadena
individual VirE2.
.
El T-DNA de cadena individual es transformado en DNA
bicatenario e integrado al genoma de la planta.
.
Se desconoce el mecanismo de integracin. El T-DNA
puede ser utilizado para transferir genes al interior del
ncleo de una clula vegetal.
De hecho, el proceso de transferencia selecciona
a la regin T para entrar a la planta. En la -IGURA
16.20 se muestra que el T-DNA de un plsmido de
nopalina es delimitado de las regiones flanqueantes
del plsmido Ti por repeticiones de 25 bp, las cuales
difieren en slo dos posiciones entre el extremo iz-
quierdo y el derecho. Cuando el T-DNA es integrado
al genoma de una planta, la unin derecha est bien
definida, la cual retiene 1 o 2 bp de la repeticin de-
recha. La unin izquierda es variable; la frontera del
T
-DNA en el genoma de la planta puede localizarse
en la repeticin de 25 bp o en alguno de los sitios
de una serie que cubre una longitud de ~ 100 bp en
el T-DNA. En ocasiones, en un solo sitio se integran
copias mltiples de T-DNA en tndem.
En la FIGURA 16.21 se ilustra un modelo para
la transferencia. En la repeticin de 25 bp del lado
derecho se forma una hendidura que proporciona
El T-DNA est unido por repeticiones directas
TGGCAGGATATATTGNNTGTAAAC TGACAGGATATATTGNNGGTAAAG
Repeticin izquierda Repeticin derecha
Plsmido Ti Transferencia
e integracin 1
del T-DNA
*
Plsmido Ti
DNA de la planta
La unin se encuentra a <100 bp
de la repeticin izquierda
~-m m m m m m
DNA de la planta
Se mantienen 1 a 2 bp
de la repeticin derecha
El T-DNA tiene repeticiones casi idnticas de 25 bp en
cada extremo del plsmido Ti. La repeticin de la derecha permite la
transferencia e integracin al genoma de una planta. El T-DNA que se
integra al genoma de una planta tiene una unin precisa que retiene
1 o 2 bp de la repeticin de la derecha, pero la unin de la izquierda
vara y puede estar a una distancia de hasta 100 bp de la repeticin
de la izquierda.
El T-DNA se genera como un circulo rodante
I
Primera hendidura
Endonucleasa
\
;
de DNA y
SSB E2
Sntesis
Segunda hendidura
T-DNA I berado
Hacia el ncleo de la clula de la planta ;
16.21 El T-DNA se genera por desplazamiento cuando
su sntesis empieza en una hendidura formada en la repeticin
de la derecha y termina con una hendidura ubicada en la repe-
ticin de la izquierda.
un extremo cebador para la sntesis de un DNA de
cadena individual. La sntesis de la cadena nueva
desplaza a la antigua, la cual se utiliza en el proceso
15.10 La transferencia del T-DNA es semejante a la conjugacin bacteriana
405
de transferencia. La transferencia termina cuando
la sntesis de DNA llega a una hendidura en la re-
peticin del lado izquierdo. Este modelo explica la
razn de que la repeticin derecha sea esencial y
represente la polaridad del proceso. Si no se produce
una hendidura en la repeticin del lado izquierdo, la
transferencia podra rebasar al plsmido Ti.
El proceso de transferencia implica la produc-
cin de una sola molcula de DNA de cadena in-
dividual en la bacteria infecciosa, la cual es trans-
ferida como un complejo formado por DNA y una
protena que suele llamarse complejo T. El DNA es
cubierto por la protena de unin a la cadena indi-
vidual VirE2, la cual tiene una seal de localizacin
nuclear y es responsable del transporte del T-DNA
al interior del ncleo de la clula de la planta. Una
sola molcula de la subunidad D2 de la endonuclea-
sa permanece unida al extremo 5'. El opern virB
codifica a II productos implicados en la reaccin
de transferencia.
Fuera del T-DNA, pero justo al lado del bor-
de derecho, se encuentra otra secuencia corta, de-
nominada de sobremarcha, la cual estimula en gran
medida el proceso de transferencia. Dicha secuencia
funciona como potenciador, debe encontrarse en la
misma molcula de DNA, pero hace ms eficiente
la transferencia, incluso si est separada del borde
por muchos miles de pares de bases. VirCl y posi-
blemente virC2 podran actuar en la secuencia de
sobremarcha.
Los plsmidos de octopina poseen un patrn
ms complejo de T-DNA integrado que los plsmi-
dos de nopalina, adems de que el patrn de las
cadenas T tambin es ms complejo, y pueden en-
contrarse muchas especies discretas que correspon-
den a elementos de T-DNA, lo cual sugiere que el
de octopina tiene numerosas secuencias que pro-
porcionan dianas para la realizacin de hendiduras
o la terminacin de la sntesis de DNA.
Este modelo de transferencia del T-DNA se ase-
meja bastante a los eventos implicados en la con-
jugacin bacteriana, en los cuales el cromosoma de
E
. coli es transferido de una clula a otra en forma
de cadena individual. Los genes del opern virB son
homlogos a los genes tra de ciertos plsmidos bac-
terianos implicados en la conjugacin (vase la sec-
cin 16.7, La conjugacin transfiere DNA de cadena
individual) pero una diferencia es que la transferen-
cia del T-DNA suele estar limitada por la frontera
de la repeticin del lado izquierdo, mientras que la
transferencia del DNA bacteriano es indefinida.
No se sabe cmo se integra el DNA transferido
al genoma de la planta. En alguna etapa, la cade-
na recin generada debe ser transformada en DNA
dplex. Los crculos de T-DNA de las clulas de las
plantas infectadas parecen ser generados por recom-
binacin entre las repeticiones izquierda y derecha
de 25 bp, pero no se sabe si son intermediarias;
probable que el evento real implique una recombi-
nacin no homologa, debido a que no hay homolo-
ga entre el T-DNA y los sitios de integracin.
Se integra el DNA al genoma de la planta comA
unidad integral? Cuntas copias son integradas
"
Qu sitios del DNA de la planta estn disponible:
para la integracin? Los genes que se encuentaU
en el T-DNA son regulados exclusivamente por fun-
ciones del segmento integrado? Estas preguntas son
fundamentales para definir el proceso por medio dd
cual el plsmido Ti transforma una clula de un;
planta en un tumor.
Cul es la estructura del sitio diana? Las se-
cuencias que flanquean al T-DNA integrado tien-
den a ser ricas en pares de bases A-T (caracterstic;
que exhiben los sitios diana de algunos elemento>
transponibles). Las reestructuraciones de secuencia
que ocurren en los extremos del T-DNA integrad-
dificultan el anlisis de la estructura; se desconoce si
el proceso de integracin genera en el DNA secuen-
cias nuevas comparables con las repeticiones dian;
creadas en la transposicin.
El T-DNA se expresa en este sitio de integra-
cin. La regin contiene numerosas unidades de
transcripcin, cada una de las cuales probablemente
contenga un gen expresado a partir de un solo pro-
motor cuyas funciones se relacionan con el estad-;
de la clula de la planta, el mantenimiento de sus
propiedades tumorignicas, el control de la forma-
cin de brotes y tallos, y en la supresin de la dife-
renciacin en otros tejidos; ninguno de estos gene;
es necesario para la transferencia del T-DNA.
El plsmido Ti presenta una interesante orga-
nizacin de funciones. Fuera de la regin T, porte-
genes necesarios para iniciar la oncognesis, de l3
cuales, cuando menos algunos estn involucrado
en la transferencia del T-DNA, y sera interesante
saber si otros funcionan en la clula de la plants
para influir en su comportamiento de esta etapa.
Por otra parte, fuera de la regin T se encuentran lo?
genes que permiten a Agrobacterium catabolizar
la opina que producir la clula de la planta. En la
regin T hay genes que controlan el estado trans-
formado de la planta, as como a los genes que pro-
vocan la sntesis de las opinas que beneficiarn al
Agrobacterium que originalmente proporcion el T-
DNA.
Desde un punto de vista prctico, la capacidad de
Agrobacterium para transferir el T-DNA al genoma
de la planta hace posible la introduccin de genes
nuevos en las plantas. La transferencia/integracin
y las funciones oncognicas son independientes, de
modo que es posible disear plsmidos Ti nuevos en
los cuales dichas funciones hayan sido remplazadas
406 CAPTULO 16 Replicones extracromosmicos
w otros genes cuyo efecto en la planta nos gustara
rvaluar. La existencia de un sistema natural para
ransmitir genes al genoma de la planta facilitara
rnormemente la ingeniera gentica de las plantas.
Resumen
El crculo rodante es una alternativa de replicacin
e las molculas circulares de DNA en las cuales un
rigen es hendido para proporcionar un extremo
-:bador. Desde este extremo se sintetiza una cadena
;
e DNA que desplaza a la cadena compaera ori-
nal, la cual es extrada en forma de cola. Muchos
;
enomas se producen por revoluciones continuas
le crculo.
Los crculos rodantes permiten replicar algunos
ages. La protena A que hace una hendidura en el
rigen (pX174 tiene la propiedad inusual de actuar
ID cis, y lo hace slo en el DNA del cual fue sinteti-
tada; se mantiene adherida a la cadena desplazada
aasta que se haya sintetizado una cadena comple-
a y despus vuelve a hacer una hendidura en el
rigen, con lo cual libera a la cadena desplazada y
rripieza otro ciclo de replicacin.
Los crculos rodantes tambin son caracters-
"
;os de la conjugacin bacteriana, la cual ocurre
:
.;
ando un plsmido F es transferido de un donador
i una clula receptora despus de la iniciacin del
:
'titacto entre las clulas por medio de los pili F.
od plsmido F libre infecta a clulas nuevas por
rite medio; un factor F integrado crea una cepa de
Br que podra transferir DNA cromosmico. En la
conjugacin, la replicacin permite sintetizar los
:
mplementos de la cadena que permanece en el
;
mador y de la que es transferida al receptor, pero
.
proporciona la fuerza motriz.
Las agrobacterias inducen la formacin de tu-
Tiores en las plantas lesionadas. Las clulas lasti-
m
adas secretan compuestos fenlicos que activan a
s genes vir que porta el plsmido Ti de la bacteria.
Los productos de dichos genes hacen que una mo-
lcula de DNA de cadena individual de la regin
iel T-DNA del plsmido sea transferida al ncleo de
clula de la planta. La transferencia se inicia en
na frontera del T-DNA, pero termina en diferentes
sitios. La cadena individual es convertida en una
cadena doble e integrada al genoma de la planta.
Los genes que estn en el T-DNA transforman a la
clula de la planta y hacen que produzcan opinas
especficas (derivados de la arginina). Los genes del
plsmido Ti permiten que las Agrobacteria metabo-
licen las opinas producidas por la clula transfor-
mada de la planta. El T-DNA ha sido utilizado para
desarrollar vectores de transferencia de genes a las
clulas de las plantas.
Referencias
Los crculos rodantes producen multmeros de un
replicn
Artcub de investigacin
Gilbert, W. and Dressler, D. (1968). DNA replication: the
rolling circle model. Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol. 33, 473-484.
El plsmido F es transferido por conjugacin entre
bacterias
Artculo de investigacin
Ihler, G. and Rupp, W. D. (1969). Strand-specific transfer
o donor DNA during conjugation in E. coli. Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 63, 138-143.
La conjugacin transfiere DNA de cadena individual
Fuentes de revisin
Frosr, L. S., Ippen-Ihler, K., and Skurray, R. A. (1994).
Analysis of the sequence and gene producs of the
transfer regin of the F sex factor. Microbiol. Rev. 58,
162-210.
Ippen-lhler, K. A. and Minkley, E. G. (1986). The
conjugation system of F, the fertity factor of E. coli.
Annu. Rev. Genet. 20, 593-624.
Lanka, E. and Wilkins, B. M. (1995). DNA processing
reactions in bacterial conjugation. Annu. Rev. Biochem.
64, 141-169.
Willetts, N. and Skurray, R. (1987). Structure and function
of the F factor and mechanism of conjugation. In
Neidhardt, F. C., ed. Bscherichia coli and Salmonella
typhimurium. Washington, DC: American Society for
Microbiology, pp. 1110-1133.
Referencias
I
La replicacin bacteriana 1 I
est conectada con el ciclo celular I
ESQUEMA DEL CAPTULO
UIU Introduccin
UBI La repLicacin est conectada con el ciclo celular
.
El tiempo de duplicacin de f. coli puede fluctuar en un
rango de hasta 10 veces, dependiendo de las condiciones
de crecimiento.
.
El cromosoma bacteriano tarda 40 min en replicarse (a
temperatura normal).
.
La culminacin del ciclo de replicacin desencadena una
divisin bacteriana 20 min despus.
Si el tiempo de duplicacin es menor a 50 min, se inicia un
ciclo de replicacin antes de la divisin resultante del ciclo
de replicacin previo.
? Por lo tanto
, las altas velocidades de crecimiento producen
cromosomas de horquillas mltiples.
.
Un ciclo de replicacin es iniciado en una proporcin
constante de masa/nmero de orgenes cromosmicos.
.
Hay un origen por clula unitaria de 1.7 pm de longitud.
UBI El septo divide una bacteria en bacterias hijas
que contienen cada una un cromosoma
.
La formacin del septo inicia en el anillo localizado en
torno a la clula donde se modifica la estructura de la
envoltura.
.
Nuevos anillos son iniciados a media distancia entre el
septo y los extremos de la bacteria.
.
Cuando la bacteria se divide, cada hija posee un anillo en
la porcin central.
.
La formacin del septo empieza cuando la clula llega a
una longitud predeterminada.
.
El septo est formado por los mismos peptidoglucanos que
constituyen la envoltura bacteriana.
EfO Las mutaciones de la divisin o la segregacin
modifican la forma de la clula
.
Los mutantes fts forman filamentos largos debido a que el
septo no se forma y no divide a la bacteria hija.
.
Las miniclulas se forman en los mutantes que producen
demasiados septos; son pequeas y carecen de DNA.
.
Las clulas anucleadas de tamao normal son generadas
por mutantes de particin en los cuales los cromosomas
duplicados no logran separarse.
WBB El producto FtsZ es necesario para la formacin
del septo
.
El producto de ftsZ es necesario para la formacin del septo
en sitios preexistentes
.
FtsZ es una GTPasa que forma un anillo en el interior de
la envoltura bacteriana y que est conectada con otros
componentes del citoesqueleto.
HH Los genes min regulan la localizacin del septo
*
La ubicacin del septo es controlada por minC, -D y -E.
'
El nmero y la localizacin de los septos depende de la
proporcin de MinE/MinC,D.
.
El septo se forma en donde MinE puede formar un anillo.
*
A concentraciones normales, MinC/D permite la formacin
de un anillo central, pero impide que se formen anillos
adicionales de MinE en los polos.
fESl La segregacin cromosmica puede requerir de
recombinacin especfica de sitio
.
El sistema de recombinacin especifica de sitio Xer acta
en una secuencia diana ubicada cerca del trmino del
cromosoma para recrear monmeros si un evento de
recombinacin generalizada ha transformado al cromosoma
bacteriano en un dimero.
fHH La particin implica la separacin de los
cromosomas
.
Los orgenes de los replicones pueden estar adheridos a la
membrana interna de la bacteria.
.
Los cromosomas realizan movimientos abruptos del centro
a las posiciones que se encuentran a V y a 3k de la
longitud total de la clula.
HB Los plsmidos de una sola copia tienen un
sistema de particin
*
Los plsmidos de una sola copia existen a razn de
una copia de plsmido por cada origen de cromosoma
bacteriano.
.
Los plsmidos de copias mltiples existen en ms de
una copia de plsmido por cada origen de cromosoma
bacteriano.
*
La recombinacin homloga entre los plsmidos circulares
genera dmeros y multimeros superiores.
.
Los plsmidos tienen sistemas de recombinacin especfica
de sitio que llevan a cabo la recombinacin intramolecula'
para regenerar monmeros.
.
Los sistemas de particin garantizan que los plsmidos
duplicados sean segregados a clulas hijas distintas
producidas por una divisin.
UAJ La incompatibilidad de los plsmidos depende de.
replicn
Los plsmidos que se encuentran en un solo grupo de
compatibilidad tienen origenes regulados por un sistema z-.
control comn.
408
Bl EL sistema de compatibilidad CoLEl es
controlado por un regulador de RNA
.
La replicacin de ColEl exige que la transcripcin pase
por el origen, donde el transcrito es dividido por la
RNAasa H para generar un extremo cebador.
.
El RNA I regulador es un RNA corto antisentido que
se aparea con el transcrito e impide la divisin
que genera el extremo cebador,
.
La proteina Rom potencia el apareamiento entre el
RNA I y el transcrito,
Cmo se replican y segregan las
mitocondrias?
.
La replicacin y la segregacin del DNAmt a las
mitocondrias hijas son eventos estocsticos,
.
La segregacin mitocondrial a las clulas hijas tambin
es un evento estocstico,
Resumen
BB Introduccin
la forma de controlar y vincular la replicacin con
d ciclo celular constituye una diferencia importante
ntre procariotas y eucariotas,
En las segundas, aplica lo siguiente:
. los cromosomas residen en el ncleo
.
cada cromosoma est formado por numero-
sos replicones
.
la replicacin requiere de la coordinacin de
estos replicones para reproducir el DNA du-
rante un periodo discreto del ciclo celular
.
la decisin de realizar o no la replicacin
depende de una ruta compleja que regula
el ciclo celular y
.
los cromosomas duplicados son segregados
a las clulas hijas durante la mitosis por un
mecanismo especial,
En la IGURA 1. se muestra que en las bac-
:
erias, la replicacin es activada en un solo origen
atando la masa celular se incrementa ms all del
umbral y la segregacin de los cromosomas hijos
::
ene lugar cuando se garantiza que se encuentren
en lados opuestos del septo que crece para dividir
a bacteria en dos,
Cmo sabe la clula cundo iniciar el ciclo de
replicacin? El evento de iniciacin ocurre en una
proporcin constante de masa celular respecto del
nmero de orgenes cromosmicos. Las clulas que
crecen ms rpido son ms grandes y poseen un
nmero mucho mayor de orgenes. El crecimiento
ie E. coli puede describirse en funcin de la clu-
la unitaria, una entidad de 1.7 pm de largo. Una
bacteria contiene un origen por clula unitaria; una
piula con dos orgenes que crece rpidamente, tie-
ne una longitud de 1.7 a 3.4 pm.
Cmo se titula la masa celular? Una protena
iniciadora podra ser sintetizada continuamente du-
rante todo el ciclo celular y la acumulacin de una
cantidad crtica activara la iniciacin, lo cual explica
norqu se necesita la sntesis protenica para el even-
to de iniciacin. Otra posibilidad es que una protena
inhibidora pudiera ser sintetizada en un punto fijo y
diluida por debajo de un nivel efectivo por el incre-
mento del volumen celular.
Algunos de los eventos de la particin de los
cromosomas hijos son consecuencia de la morfolo-
ga circular del cromosoma bacteriano. Se dice que
los cromosomas circulares estn encadenados cuando
uno pasa a travs de otro, conectndolos; para se-
pararlos son necesarias las topoisomerasas. Un tipo
de estructura alterno se forma cuando ocurre un
evento de recombinacin, una sola recombinacin
entre dos monmeros los convierte en un solo d-
mero. Esto se resuelve por un sistema de recom-
binacin especializado que recrea los monmeros
independientes. En esencia, el proceso de particin
es manejado por sistemas enzimticos que actan
directamente en secuencias discretas de DNA.
El crecimiento, la replicacin y la
segregacin se relacionan
Una clula unitaria tiene
un cromosoma circular
La replicacin inicia cuando
la clula rebasa un tamao
crtico
La replicacin genera
cromosomas hijos
encadenados
Los cromosomas hijos
se separan
El septo divide a la clula
\ Las clulas hijas se
\ separan
FIGURA 17.1 La replicacin inicia en el origen bacteriano
cuando una clula rebasa un umbral crtico de tamao. La
culminacin de la replicacin produce cromosomas hijos que
pueden ser ligados por recombinacin o encadenados y que se
separan y desplazan a lados opuestos del septo antes de que
la bacteria se divida en dos.
17.1 Introduccin 409
La repLicacin est conectada
con eL ciclo celular
Conceptos principales
.
El tiempo de duplicacin de E. coli puede fluctuar
en un rango de hasta 10 veces, dependiendo de las
condiciones de crecimiento.
.
El cromosoma bacteriano tarda 40 min en replicarse (a
temperatura normal).
.
La culminacin del ciclo de replicacin desencadena
una divisin bacteriana 20 min despus.
.
Si el tiempo de duplicacin es menor a 60 min, se
inicia un ciclo de replicacin antes de la divisin
resultante del ciclo de replicacin previo.
.
Por lo tanto, las altas velocidades de crecimiento
producen cromosomas de horquillas mltiples.
.
Un ciclo de replicacin es iniciado en una proporcin
constante de masa/nmero de orgenes cromosmicos.
Hay un origen por clula unitaria de 1.7 pm de
longitud.
Las bacterias tienen dos vnculos entre la replicacin
y el crecimiento celular:
.
La frecuencia de la iniciacin de los ciclos de
replicacin est ajustada para corresponder
con la velocidad a la cual la clula est cre-
ciendo.
.
La culminacin de un ciclo de replicacin
est conectada a la divisin de la clula.
La velocidad del crecimiento bacteriano se eva-
la mediante el tiempo de duplicacin, que es el
Las bacterias pueden tener cromosomas
con varas horquillas
Origen
Trmino
Divisin
35/0
30
\
25 Iniciacin10 --/
20 15 /
=
Terminacin
FIGURA 17.2 El intervalo fijo de 60 min entre la iniciacin
de la replicacin y la divisin celular produce cromosomas con
horquillas mltiples en las clulas que crecen rpidamente.
Ntese que slo se muestran las horquillas de replicacin que
se desplazan en una direccin; de hecho, el cromosoma es
replicado simtricamente por dos conjuntos de horquillas que
se mueven en direcciones opuestas en cromosomas circulares.
periodo necesario para que el nmero de clulas
duplique. Entre ms corto sea, mayor ser la ve' -
cidad de crecimiento. Las clulas de E. coli puedcr
crecer a tasas que oscilan entre 18 y 180 min. I
cromosoma bacteriano es un replicn individual, d
modo que la frecuencia de los ciclos de replicada:
es controlada por el nmero de eventos de inicia-
cin en el origen nico. El ciclo de replicacin pued:
ser definido en funcin de dos constantes:
.
C es el tiempo fijo, -40 min, necesario paia
replicar el cromosoma bacteriano complet
Esta duracin corresponde a una velocida ;
de desplazamiento de la horquilla de rep :-
cacin de -50 000 bp/minuto. (La velocida I
de la sntesis de DNA es ms o menos inva-
riable a temperatura constante, procede I
la misma velocidad a menos que el abaste-
cimiento de los precursores constituya un;
limitante, y hasta que ello suceda.)
.
D es el tiempo fijo, -20 min, que transcurra
entre la culminacin de un ciclo de replica-
cin y la divisin de la clula con la cual em
conectado. Este periodo puede represents-
el tiempo necesario para ensamblar los com-
ponentes requeridos para la divisin.
(Se puede considerar que las constantes C y D re-
presentan la velocidad mxima a la cual la bacte-M
puede llevar a cabo estos procesos; dichas constante -
se aplican en todas las velocidades de crecimienK
cuyo tiempo de duplicacin se encuentra entre 11
y 60 min, si bien las dos fases constantes se alarga::
cuando el ciclo celular ocupa >60 min.)
Un ciclo de replicacin cromosmica debe se:
iniciado en un tiempo fijo de C + i? = 60 min ante:
de una divisin celular. En las bacterias que se divi-
den a una frecuencia mayor de 60 min, un ciclo de
replicacin debe ser iniciado antes del final del cicle
de divisin precedente; podra decirse que una clu-
la ha nacido preada con la siguiente generacin.
Considrese un ejemplo de clulas que se divi-
den cada 35 min. El ciclo de replicacin conectado I
una divisin debi haberse iniciado 25 min antes de
la divisin precedente, situacin que se ilustra en I
FIGURA 17.2
, en la cual se muestra al complement'
cromosmico de una clula bacteriana a intervalo:
de 5 min durante el ciclo.
En la divisin (35/0 min), la clula recibe ur
cromosoma parcialmente replicado. La horquilla di
replicacin sigue avanzando. A los 10 min, cuan-
do esta horquilla de replicacin "antigua" an m
ha llegado a trmino, la iniciacin ocurre en ambo-
orgenes del cromosoma parcialmente replicado.
inicio de estas "nuevas" horquillas de replicacin di-
lugar a un cromosoma de horquillas mltiples
A los 15 min, esto es, 20 min antes de la si-
guiente divisin, la antigua horquilla de replicacin
410
CAPTULO 17 La replicacin bacteriana est conectada con el ciclo celular
Cga a trmino. Su llegada permite que los dos cro-
r. 'somas hijos se separen; cada uno de ellos ya ha
:
) replicado parcialmente por las nuevas horqui-
n de replicacin (las cuales ahora son las nicas
rquillas de replicacin) y siguen avanzando.
En el punto de divisin, los dos cromosomas
Mrcialmente replicados se segregan, con lo cual se
-
-
crea el punto en que se inici. La horquilla de
iplicacin individual se torna
"
antigua
"
,
termina
15 min y 20 despus tiene lugar una divisin.
?e observa que el evento de iniciacin ocurre l
25
:los celulares antes del evento de divisin con el
est asociado.
El principio general del vnculo entre la inicia-
:
Jn y el ciclo celular es que, conforme se acelera
crecimiento de las clulas (el ciclo se acorta), el
(rento de iniciacin ocurre a un nmero mayor de
lelos antes de la divisin relacionada, de modo que
lay ms cromosomas en la bacteria individual. Esta
elacin puede verse como la respuesta de la clula
;
su incapacidad para reducir los periodos de C y de
I para mantener el paso del ciclo ms corto.
BU EL septo divide
a una bacteria en bacterias
hijas que contienen
cada una un cromosoma
Conceptos principales
La formacin del septo inicia en el anillo localizado en
torno a la clula donde se modifica la estructura de la
envoltura.
Nuevos anillos son iniciados a media distancia entre el
septo y los extremos de la bacteria.
Cuando la bacteria se divide, cada hija posee un anillo
en la porcin central.
.
La formacin del septo empieza cuando la clula llega
a una longitud predeterminada.
El septo est formado por los mismos peptidoglucanos
que constituyen la envoltura bacteriana.
La segregacin cromosmica de las bacterias es
especialmente interesante debido a que el DNA est
implicado en el mecanismo de la particin, lo cual
contrasta con las clulas eucariticas, en las cuales
la segregacin se logra mediante el complejo me-
canismo de la mitosis. El mecanismo bacteriano es
bastante preciso, pero las clulas anucleadas consti-
tuyen <0.03% de una poblacin bacteriana.
La divisin de una bacteria en dos clulas hijas
se logra por la formacin de un septo, estructura
ormada en el centro de la clula a manera de una
invaginacin de la envoltura circundante. El septo
|orma una barrera impenetrable entre las dos partes
de la clula y constituye el sitio en que las dos c-
lulas hijas nalmente se separan por completo. Dos
preguntas relacionadas sealan la funcin del septo
en la divisin: Qu determina la ubicacin en la
cual se forma? Qu garantiza que los cromosomas
hijos se encuentren en lados opuestos a l?
La formacin del septo va precedida por la orga-
nizacin del anillo periseptal, que en E. coli o en
Salmonella typhimurium se observa como una zona
en la cual se modifica la estructura de la envoltura,
de manera que la membrana interna se conecta ms
estrechamente con la pared celular y la capa de la
membrana externa. Como sugiere su nombre, el
anillo rodea a la clula. En la FIGURA 17.3 se resume
su desarrollo.
La formacin del anillo empieza en el centro en
una clula nueva. Conforme la clula crece, ocurren
dos eventos, se forma un septo en la mitad de la
clula cuya posicin es definida por el anillo, y se
forman anillos nuevos a ambos lados del anillo ini-
cial. Estos nuevos anillos son desplazados del centro
y se trasladan a lo largo de la clula a posiciones
ubicadas a un cuarto y tres cuartos de la longitud de
la clula, que sern las posiciones centrales de sta
despus de la divisin siguiente. El desplazamien-
to del anillo periseptal a la posicin correcta puede
ser el evento crucial que garantice la divisin de la
El septo divide a la clula
T
I I
La clula empieza con
un anillo en el centro
Se generan nuevos
anillos
Los anillos nuevos se
desplazan hacia los
polos
Los anillos nuevos
dejan de moverse
El anillo central se
'
transforma en un septo
La clula se divide
La vista lateral muestra
que el anillo abarca la
circunferencia de la clula
El corte transversal
muestra que el anillo
conecta a las
membranas
Membrana externa
Pared celular
Membrana interna
FIGURA 17.3 La duplicacin y el desplazamiento del anillo
periseptal dan origen a la formacin de un septo que divide
a la clula.
17.3 El septo divide a una bacteria en bacterias hijas que contienen cada una un cromosoma
411
El DNA bacteriano puede
a la membrana

Orgenes de los
cromosomas en proceso
de replicacin adheridos
a la membrana
Cromosomas hijos
adheridos a la envoltura
El septo crece entre los
cromosomas
El septo divide a la clula
Cromosomas distribuidos
en las clulas hijas
-
La adhesin del DNA bacteriano a la membrana
podra proporcionar un mecanismo para la segregacin.
clula en clulas hijas de dimensiones equivalentes.
(Se desconoce el mecanismo de desplazamiento.)
La formacin del septo empieza cuando la clula
alcanza una longitud fija (2L) y la distancia entre
los nuevos anillos siempre ser L. No sabemos cmo
mide la clula la longitud, pero el parmetro perti-
nente parece ser la distancia lineal como tal (no el
rea ni el volumen).
El septo consta de los mismos componentes
que la envoltura celular, una capa rgida de pep-
tidoglucano en el periplasma, entre la membrana
interna y la membrana externa. El peptidoglucano
est formado por polimerizacin de unidades disa-
crido-tripptido o disacrido-pentapptido en una
reaccin que implica conexiones entre ambos tipos
de subunidades (transpeptidacin y transglicosila-
cin). La forma de varilla de la bacteria se mantiene
merced a un par de elementos, PBP2 y RodA, que
son protenas que interactan y son codificadas por
el mismo opern. RodA es un miembro de la familia
SEDS (por sus siglas en ingls, forma, elongacin,
divisin y esporulacin [shape, elongation,
divisin
and sporulation]), presente en todas las bacterias,
que tiene una pared celular de peptidoglucano.
Cada protena SEDS funciona con una transpeptida-
sa que cataliza la formacin de los enlaces cruzados
del peptidoglucano. La PBP2 (protena de unin a la
penicilina 2, penicillin-binding protein 2) es la trans-
peptidasa que interacta con RodA. Las mutaciones
del gen de cualquiera de las dos protenas provocan
que la bacteria pierda su forma alargada y se tor-
ne redonda, demostracin del importante principie
que asevera que la forma y la rigidez pueden ser de-
terminadas por la simple extensin de la estructura
polimrica. Otra enzima es responsable de generar
al peptidoglucano en el septo (vase la seccin 17.5.
El producto FtsZ es necesario para la formacin del
septo). Al principio, el septo se forma con una capa
doble de peptidoglucano y la protena EnvA es ne-
cesaria para dividir los enlaces covalentes formado?
entre las capas, de modo que las clulas hijas pue-
dan separarse.
El comportamiento del anillo periseptal sugiere
que el mecanismo utilizado para medir la posicin
se relaciona con la envoltura celular. Es plausible
suponer que la envoltura podra tambin ser utili-
zada para garantizar la segregacin de los cromoso-
mas. Un enlace directo entre el DNA y la membrana
podra explicar la segregacin. Si los cromosomas
hijos estn adheridos a la membrana, se separaran
fsicamente al formarse el septo. En la FIGURA 17.4 se
muestra que la formacin de un septo podra segre-
gar a los cromosomas en las diferentes clulas hijas
si los orgenes estn conectados con sitios que se
encuentran a ambos lados del anillo periseptal.
BH Las mutaciones de La divisin
o La segregacin modifican
La forma de La clula
Conceptos principales
.
Los mutantes/s forman filamentos largos debido a que
el septo no se forma y no divide a la bacteria hija.
.
Las miniclulas se forman en los mutantes que
producen demasiados septos; son pequeas y carecen
de DNA.
.
Las clulas anucleadas de tamao normal son
generadas por mutantes de particin en los cuales los
cromosomas duplicados no logran separarse.
Una dificultad para aislar a los mutantes que afectan
la divisin celular es que, en las funciones crticas,
las mutaciones pueden ser letales o pleiotrpicas.
Por ejemplo, si la formacin del anillo tiene lugar
en un sitio esencial para el crecimiento general de
la envoltura, sera difcil distinguir entre las muta-
ciones que interfieren especficamente con la for-
macin del anillo y las que inhiben el crecimiento
general de la envoltura. La mayora de las mutacio-
nes del mecanismo de divisin han sido identifica-
das como mutantes condicionales (en cuya divisin
inciden condiciones no permisibles; habitualmente
son sensibles a la temperatura). Las mutaciones
que afectan a la divisin celular o a la segregacin
de los cromosomas provocan cambios fenotpicos
412
CAPTULO 17 La replicacin bacteriana est conectada con el ciclo celular
Los mulantes fts generan
filamentos largos
Panel superior, clulas de tipo silvestre. Panel
-
feriar, la falla de la divisin celular a temperaturas no per-
-
sibles genera filamentos multinudeares. Imgenes cortesa
le Sota Hiraga, Kyoto University.
Los mutantes par ori
clulas anuclead
f
. coi; genera clulas anucleadas cuando la se-
:
'
5gacin cromosmica falla. Las clulas con cromosomas se
ren de azul
, a diferencia de las clulas hijas que carecen de
i
'
Dmosomas. Este campo muestra clulas del mutante mukB;
;-ede observarse la divisin normal y la anormal. Imagen cor-
esa de Sota Hiraga, Kyoto University.
asombrosos. En las y I se ilustran
;
-
s consecuencias opuestas de falla en el proceso de
divisin y de falla en la segregacin:
.
Los filamentos largos se forman al inhibirse la
formacin del septo, pero la replicacin cro-
mosmica no resulta afectada. La bacteria
sigue creciendo, incluso sigue segregando
a sus cromosomas hijos, pero no se forma
el septo. As pues, la clula consiste en una
estructura filamentosa bastante larga con los
nucleoides (cromosomas bacterianos) distri-
buidos regularmente a lo largo de la misma.
Este fenotipo es el de los mutantes fts (as
llamados por su filamentacin sensible a la
temperatura, temperature sensitive filamenta-
tion) que identifican los defectos que yacen
en el proceso de divisin mismo.
Las miniclulas se crean cuando el septo
se forma con demasiada frecuencia o en un
lugar no adecuado, de modo que a una de
las clulas hijas le falta un cromosoma. La
miniclula es bastante pequea y carece de
DNA, pero por otra parte parece morfolgi-
camente normal. Las clulas anucleadas se
forman cuando la segregacin es aberrante,
y como las miniclulas, carecen de cromo-
soma, pero como la formacin del septo es
normal, su tamao no sufre modificaciones.
Este fenotipo es provocado por los mutantes
par, de particin (as llamados por sus defec-
tos en la segregacin cromosmica).
El producto FtsZ es necesario
para; La formacin del septo
jotos principales
.
El producto de ftsZ es necesario para la formacin del
septo en sitios preexistentes.
.
FtsZ es una GTPasa que forma un anillo en el interior
de la envoltura bacteriana y que est conectada con
otros componentes del citoesqueleto.
El gen ftsZ tiene un papel fundamental en la di-
visin; sus mutaciones bloquean la formacin del
septo y generan filamentos. La expresin excesiva
induce la formacin de miniclulas al incrementar-
se el nmero de eventos de formacin septal por
masa de clula unitaria. Los mutantes ftsZ actan
en etapas que van del desplazamiento de los anillos
periseptales a la morfognesis septal, de modo que
un FtsZ es un producto necesario para la utilizacin
de los sitios preexistentes para la formacin del sep-
to, pero en s, no afecta la formacin de los anillos
periseptales o su localizacin.
FtsZ funciona en una de las primeras etapas
de la formacin del septo. Al principio del ciclo de
divisin se localiza en todo el citoplasma, y confor-
me se alarga la clula y empieza a constreirse en
el centro, se localizar en un anillo en torno a la
circunferencia. En ocasiones, a la estructura se le
llama anillo Z. En la se muestra que
se encuentra en la posicin del anillo central de la
Figura 17.3. La formacin de este anillo es el paso
que limita la velocidad de formacin del septo. En
un ciclo de divisin celular tpico, se forma en el
centro de la clula de 1 a 5 min despus de la divi-
sin, perdura durante 15 min y despus se constrie
para dividir a la clula en dos.
17.5 El producto FtsZ es necesario para la formacin del septo
413
FtsZ forma al anillo Z en . coU
i
FIGURA 17.7 La inmunofluorescencia con un anticuerpo con-
tra FtsZ muestra que se localiza en el centro de la clula. Ima-
gen cortesa de William Margolin, University of Texas Medical
School at Houston.
La estructura de FtsZ es semejante a la de la
tubulina, lo cual sugiere que el ensamble del anillo
puede parecerse a la formacin de los microtbu-
los de las clulas eucariticas. FtsZ tiene actividad
GTPasa y la divisin por GTP se utiliza para res-
paldar la oligomerizacin de sus monmeros en la
estructura anular. El anillo Z es una estructura di-
nmica en la cual hay un intercambio continuo de
subunidades con acervo citoplsmico,
Otras dos protenas necesarias para la divisin,
ZipA y FtsA, interactan directamente y de forma
independiente con FtsZ. ZipA es una protena inte-
gral de membrana localizada en la membrana inter-
na de las bacterias que proporciona los medios para
ligar a FtsZ con la membrana. Esta ltima es una
protena citosolica, pero suele estar asociada con
la membrana. El anillo Z puede formarse en au-
sencia de ZipA o de FtsA, pero no si ambas estn
ausentes, lo cual sugiere que sus funciones se tras-
lapan con la estabilizacin del anillo Z y quiz con
la vinculacin con la membrana.
Los productos de muchos otros genes/ix se unen
al anillo Z en un orden definido despus de que la
protena FtsA ha sido incorporada, todas son pro-
tenas transmembrana. A la estructura final suele
llamrsele anillo septal, y est formado por un
complejo multiprotenico que se presume tiene la
capacidad de constreir la membrana. Uno de los
ltimos componentes en ser incorporado al anillo
septal es FtsW, una protena que pertenece a la fa-
milia SEDS./fVKse expresa como parte de un ope-
rn con ftsl, el cual codifica a una transpeptidasa
(tambin conocida como PBP3 [protena de unin
a la penicilina 3, penidllin-hinding protein 3]), pro-
tena unida a la membrana cuyo sitio cataltico se
encuentra en el periplasma. FtsW es responsable de
incorporar a Ftsl en el anillo septal, lo cual sugiere
un modelo para la formacin del septo en el que
la actividad transpeptidasa provoca que el peptido-
glucano crezca hacia adentro, empujando as a la
membrana interna y jalando a la externa,
FtsZ es el principal componente del citoesque-
leto para la formacin del septo; es comn en las
bacterias y tambin se encuentra en los cloroplas-
17.8 La inmunofluorescencia con anticuerpos contr
las protenas FtsZl y FtsZ2 de Arabidopsis muestra que se I
calizan en el punto medio del cloroplasto (panel superior). L
imagen de campo brillante (panel inferior) muestra el esquer"
del cloroplasto con mayor claridad. Fotografas cortesa de Ke
therine Osteryoung, Michigan State University.
tos. En la Fl 17.8 se muestra la localizacin di
los homlogos de las plantas en un anillo, en t
punto medio del cloroplasto. Los cloroplastos tan
bin tienen otros genes relacionados con los de I
divisin bacteriana. Aparentemente se ha conse
vado el mecanismo de divisin, y coincide con la
orgenes evolutivos comunes de las bacterias
los cloroplastos.
Las mitocondrias, que tambin comparten uf
origen evolutivo con las bacterias, usualmente c
recen de FtsZ; en cambio, utilizan una variante di
la protena dinamina involucrada en el estrang_
lamiento de las vesculas desde las membranas de
citoplasma eucaritico, la cual funciona desde e
exterior del organelo, comprimiendo la membra-
para generar una constriccin.
As pues, la caracterstica comn en la divisic:
de las bacterias, los cloroplastos y las mitocondri;
es el uso de una protena citoesqueltica que forra.
un anillo en torno al organelo y jala o empuja a |
membrana para formar una constriccin.
414 CAPTULO 17 La replicacin bacteriana est conectada con el ciclo celular
Los genes min regulan
La LocaLizacin deL septo
Conceptos principales
La ubicacin del septo es controlada por minC, -D y -f.
El nmero y la localizacin de los septos depende de la
proporcin de MinE/MinC,D.
El septo se forma en donde MinE puede formar un
anillo.
A concentraciones normales, MinC/D permite la
formacin de un anillo central, pero impide que se
formen anillos adicionales de MinE en los polos.
las minicluias mutantes proporcionan informa-
cin respecto de la localizacin del septo. La mu-
tacin original de las minicluias se encuentra en
el locus minB, cuya delecin genera minicluias al
permitir que tenga lugar la separacin en los polos
y (o en vez de) a mitad de la clula; esto sugiere que
la clula posee la capacidad de iniciar la formacin
del septo a la mitad o en los polos, y que la funcin
del locus minB de tipo silvestre es suprimir la for-
aacion de septos en estos ltimos. En funcin de
.os eventos ilustrados en la Figura 17.3, esto implica
que una clula recin nacida tiene sitios potencia-
les de formacin de septos asociados con el anillo
central y con los polos. Uno de los polos se form
del septo de la divisin previa, mientras que el otro
representa al septo de la divisin anterior a ella.
Uuiz los polos retienen remanentes de los anillos
de los cuales fueron derivados y estos remanentes
pueden nuclear la formacin del septo.
El locus minB est formado por tres genes, minC,
'
dnD y minE cuyas funciones se resumen en la
WRA 17.9. Los productos de minCy z minD forman
d inhibidor de la divisin. MinD es necesaria para
activar a MinC, que impide que FtsZ se polimerice
en el anillo Z.
La expresin de MinCD en ausencia de MinE, o
..
a expresin excesiva incluso en presencia de MinE,
provoca una inhibicin generalizada de la divisin.
El resultado es que la clulas crecen como filamen-
tos largos, sin septo. La expresin de MinE en ni-
veles comparables a MinCD confina la inhibicin a
.as regiones polares, restaurando as el crecimiento
normal. MinE protege de la inhibicin a los sitios de
mitad de la clula. La expresin excesiva de MinE
.aduce la formacin de minicluias porque el exceso
le la misma contrarresta la inhibicin en los polos
y a mitad de la clula, permitiendo que se formen
los septos en ambas ubicaciones.
El determinante de la formacin de los septos
en el sitio adecuado (a mitad de la clula) es, por lo
:
anto, la proporcin de MinCD respecto de MinE.
MnC/D es controlado por MinE
Anillos

i
|
Septo
Polos derivados del septo
de la divisin anterior a la
ltima
Polos derivados
del septo de la
ltima divisin
fi
J
Capacidad de formacin del septo
Formacin
del septo
Inhibidor
AinC/D
Capacidad de formacin del septo
FIGURA 17.9 MinC/D es un inhibidor de la divisin cuya ac-
cin se limita a los sitios polares por MinE.
El nivel silvestre impide la formacin de septos en
los polos, pero la permite a mitad de la clula. Los
efectos de MinC/D y de MinE estn relacionados
inversamente; la ausencia de MinCD o el exceso
de MinE provoca la formacin indiscriminada de
septos, crendose minicluias; asimismo, una gran
cantidad de MinCD o la ausencia de MinE inhibe
los sitios de mitad de la clula y los de los polos, lo
cual resulta en filamentacin.
MinE forma un anillo en la posicin septal, pero
su acumulacin suprime la accin de MinCD en las
cercamas, permitiendo as la formacin del anillo sep-
tal (el cual incluye FtsZ y ZipA). Curiosamente, para
la formacin del anillo MinE, se necesita MinD.
ua segregacin crotnosomica
puede requerir
de recombinacin
especfica de sitio
Concepto principal
El sistema de recombinacin especfica del sitio
Xer acta en una secuencia diana ubicada cerca del
trmino del cromosoma para recrear monmeros si un
evento de recombinacin generalizada ha transformado
al cromosoma bacteriano en un dmero.
17,7 La segregacin cromosmica puede requerir de recombinacin especfica de sitio 41
'
Los genomas de los plasmidos pueden
recombinarse
Circuios monomricos
Recombinacin
Crculo dimrico
Recombinacl
Crculos monomricos
\J> \J
FIGURA 17.10 La recombinacin intermolecular fusiona mo-
nmeros para formar dmeros, en tanto que la recombinacin
intramolecular libera unidades individuales de los oligmeros.
Los cromosomas hijos deben segregarse
La clula tiene un solo cromosoma circular
Empieza la replicacin bidireccional
La replicacin se mueve en torno al cromosoma
/
Sin recombinacin
\
Recombinacin general
Los cromosomas
hijos se alejan
El movimiento es
constreido
Los cromosomas La recombinacin
hijos se segregan especfica de sitio libera
a los cromosomas
Los cromosomas hijos
se segregan
Un cromosoma circularse replica para producir
dos hijos monomricos que se segregan a las clulas hijas. Sin
embargo, un evento de recombinacin generalizada crea una
sola molcula dimrica que puede separarse en dos monmeros
por una recombinacin especfica de sitio.
Las mltiples copias de un plsmido en una bacteria
constan de las mismas secuencias de DNA, de mod'
que son capaces de recombinarse. En la FIGURA 17.10
se demuestran las consecuencias. Un solo eventj
de recombinacin intermolecular entre dos crcu-
los genera un crculo dimrico, y la recombinacin
posterior puede generar formas multimricas supe-
riores. Un evento de tales caractersticas reduce 9
nmero de unidades fsicamente separadas. En
el caso extremo de un plsmido de una sola copia
recin replicado, la formacin de un dmero por re-
combinacin significa que la clula slo tiene uns
unidad para segregar y, por lo tanto, el plsmidc
debe ser eliminado inevitablemente de una cluk
hija. Para contrarrestar este efecto, los plsmido?
suelen tener sistemas de recombinacin espec-
fica de sitio que actan en secuencias particulares
para promover una recombinacin intramolecular
que restablece la condicin monomrica.
Los mismos eventos pueden ocurrir con el cro-
mosoma bacteriano. En la 1GURA 17 se muestra
la forma en que afectan a su segregacin. Si no hav
recombinacin, no hay problema, y los cromosomas
hijos pueden segregarse a las clulas hijas, pero er
caso de recombinacin homloga entre los cromo-
somas hijos producidos por un ciclo de replicacin.
se producir un dmero. Si ha ocurrido un evento de
replicacin de estas caractersticas, los cromosomas
hijos no podrn separarse, en cuyo caso se requiere
de un segundo evento de recombinacin para lograr
la resolucin de la misma forma que un dmero de
plsmido.
La mayor parte de las bacterias con cromosomas
circulares cuenta con el sistema de recombinacin
especfica de sitio Xer. En E. coli est formado por
dos recombinasas, XerC y XerD, las cuales actan
en un sitio diana de 28 bp, denominado dif, que se
localiza en la regin terminal del cromosoma. El uso
del sistema Xer se relaciona con la divisin celular
de manera interesante. Los eventos destacados se
muestran en la FIGURA 17.12. XerC puede unirse a
un par de secuencias rf/fy formar una unin Ho-
lliday. El complejo puede formarse poco despus
de que la horquilla de replicacin pase por la se-
cuencia dif, lo cual explica la forma en que las dos
copias de la secuencia diana pueden encontrar otra
de forma consistente. Sin embargo, la resolucin de
la unin para producir recombinantes, ocurre slo
en presencia de FtsK, una protena localizada en el
septo que es necesaria para la segregacin de los
cromosomas y la divisin celular. Adems, la se-
cuencia diana (/
"
debe localizarse en una regin de
-
30 kb, pero si es desplazada fuera de sta, no podr
respaldar la reaccin.
As pues, hay una recombinacin especfica
de sitio disponible cuando la secuencia termina]
416 CAPTULO 17 La replicacin bacteriana est conectada con el ciclo celular
del cromosoma est cerca del septo. No obstante,
B bacteria desea tener una recombinacin slo
cuando ya ha tenido lugar un evento de recombi-
nacin para generar un dmero (de otra manera la
recombinacin especfica de sitio creara el dmero!)
Cmo sabe el sistema si un cromosoma hijo existe
en forma de monmeros independientes o ha sido
recombinado en un dmero?
La respuesta puede ser que la segregacin de
los cromosomas empieza poco despus de la repli-
cacin. Si no ha habido recombinacin, los dos cro-
mosomas se alejan uno del otro. Sin embargo, la ca-
pacidad de las secuencias pertinentes para apartarse
una de otra, puede ser constreida si se ha formado
un dmero, lo cual las fuerza a permanecer cerca del
septo, donde estn expuestas al sistema Xer.
Las bacterias con sistema Xer siempre tienen un
homlogo de FtsK y viceversa, lo cual sugiere que el
sistema ha evolucionado de manera tal, que la reso-
lucin est conectada al septo. FtsK es una protena
iransmembrana extensa cuyo dominio terminal N
est asociado con la membrana y hace que sta se
localice en el septo. Su dominio terminal C tiene dos
funciones, provocar que Xer separe a un dmero en
dos monmeros, adems de una actividad ATPasa
que puede utilizar para transferirse a lo largo del
DNA in vitro
, que podra utilizarse para bombear el
DNA a travs del septo, de la misma forma en que
SpoIIIE transporta al DNA del compartimiento ma-
dre a la pre-espora durante la esporulacin. (Vase
la seccin 17,8, La particin implica a la separacin
de los cromosomas.)
m La particin implica la
separacin de los cromosomas
Conceptos principales
Los orgenes de los replicones pueden estar adheridos a
la membrana interna de la bacteria.
Los cromosomas realizan movimientos abruptos del
centro a las posiciones que se encuentran a % y a %
de la longitud total de la clula.
La particin es el proceso por el cual los dos cromo-
somas hijos se ubican uno a cada lado de la posicin
en que se forma el septo, y para que sea adecuada,
se necesitan dos tipos de eventos:
.
Los dos cromosomas hijos deben ser libera-
dos uno del otro para que puedan segregar-
se despus de la terminacin, para lo cual
es necesario el desenrollado de las regiones
del DNA enrolladas una con otra cerca del
trmino. La mayor parte de las mutaciones
incide en el mapeo de los genes que codifi-
Xer requiere de FtsK para separar a los
genomas ligados
Los cromosomas son ligados
en el sitio de recombinacin
dif
La recomblnasa Xer forma
una unin en dif
dif
0
2)
FtsK es necesaria para la
separacin
FIGURA 17.12 Un evento de recombinacin crea dos cromo-
somas ligados. Xer crea una unin Holliday en el sitio dif, pero
puede separarla slo en presencia de FtsK.
can a las topoisomerasas con capacidad para
pasar de una cadena de DNA a otra. Las mu-
taciones impiden que los cromosomas hi-
jos se segreguen, con el resultado de que el
DNA se localice en una sola masa extensa,
a mitad de la clula. Posteriormente, con
la formacin del septo se libera una clula
anucleada y una que incluye ambos cromo-
somas hijos, indicio de que la bacteria debe
ser capaz de desenrollar sus cromosomas de
forma topolgica para poder segregados en
diferentes clulas hijas.
.
Las mutaciones que afectan el proceso de
particin son raras, pero suelen encontrarse
dos clases; las mutaciones de actuacin en
ds deben ocurrir en las secuencias de DNA
que fungen como diana para el proceso de
particin, en tanto que las mutaciones
de actuacin en trans se presentarn en
los genes que codifican a las protenas que
provocan la segregacin, los cuales pueden
incluir protenas que se unen al DNA o a
actividades que controlan la localizacin en
17.8 La particin implica la separacin de los cromosomas
la envoltura, a las cuales puede adherirse el
DNA. Ambos tipos de mutaciones han sido
encontrados en los sistemas responsables de
la particin de los plsmidos, pero en el cro-
mosoma bacteriano slo se han encontrado
las funciones de actuacin en trans. Por otra
parte, las mutaciones en los sistemas de re-
combinacin especfica de sitio de plsmidos
incrementan la prdida del plsmido (de-
bido a que la clula en proceso de divisin
tiene slo un dmero para la particin, y no
dos monmeros), de modo que su fenotipo
es similar al de los mutantes de particin.
La forma original del modelo de segregacin
cromosmica que se muestra en la Figura 17.8 su-
giere que la envoltura crece por insercin de ma-
terial entre los sitios de adhesin de los dos cro-
mosomas, apartndolos. De hecho, la pared celular
y la membrana crecen de forma heterognea en
toda la superficie celular. Ms an, los cromosomas
replicados son capaces de moverse abruptamente a
sus posiciones finales localizadas a un cuarto y a tres
cuartos de la longitud total de la clula. Si se inhibe
la smtesis protenica antes de la terminacin de la
replicacin, los cromosomas no pueden segregarse y
permanecen cerca de la mitad de la clula. Sin em-
bargo, cuando a la sntesis protenica se le permite
reiniciar, los cromosomas se mueven a las posicio-
nes ubicadas en uno y tres cuartos de la longitud
en ausencia de cualquier elongacin posterior de la
envoltura, lo cual sugiere que un proceso activo, es
decir, que requiere de la sntesis protenica, puede
desplazar a los cromosomas a ubicaciones especfi-
cas. La segregacin es interrumpida por mutacio-
nes de clase muk, las cuales originan una progenie
anucleada cada vez con mayor frecuencia y los dos
cromosomas hijos permanecen en el mismo lado
del septo, en vez de segregarse. Las mutaciones que
suceden en los genes muk no son letales y permiten
identificar a los componentes del mecanismo que
MukB vuelve a condensar a los nucleoides
despus de la replicacin
progenitor
Hijo
conansao
Hijo
oondensado
0000
Replicacin
MukB'
FIGURA 17.13 El DNA de un solo nucleoide progenitor se des-
condensa durante la replicacin. El mukB es un componente
esencial del mecanismo que condensa de nuevo los nucleoides
hijos.
segrega a los cromosomas. El gen mukA es idntic
al de una protena de membrana extema conoci
da (tolC), cuyo producto podra estar implicado con
la adhesin del cromosoma a la envoltura. El ger.
mukB codifica a una protena globular extensa (1S;
kD) que tiene el mismo tipo general de organizacir
que los dos grupos de protenas de mantenimien-
to estructural de los cromosomas (SMC, structur:
maintencmce ofchromosomes) involucrados en la con-
densacin y el mantenimiento de la unin de los
cromosomas eucariticos (vase la seccin 31.6, La
condensacin de los cromosomas es provocada por
las condensinas). En otras bacterias tambin han
sido encontradas protenas de tipo SMC.
El conocimiento de la funcin de MukB se de-
riv del descubrimiento de que algunas mutaciones
en mukB pueden ser suprimidas por mutaciones en
topA, gen que codifica a la topoisomerasa I. MukE
forma un complejo con otras dos protenas, MukE
y MukF, de modo que se considera que el complej
MukBEF es un anlogo de la condensina para la;
condensinas eucariticas. Utiliza un mecanismo de
superenrollamiento para condensar al cromosom
Un defecto de esta funcin es la causa de la incapa-
cidad para segregar apropiadamente, el cual puede
compensarse al impedir que las topoisomerasas re-
lajen los superenrollados negativos; el incremente
resultante en la densidad del superenrollado ayud;
a restaurar el estado de condensacin apropiado y
por lo tanto, permite la segregacin.
Todava se desconoce cmo se posicionan lo-;
genomas en la clula, pero el proceso puede estar
relacionado con la condensacin. En la FIGURA 17.13
se muestra un modelo actual. El genoma progenitoi:
est en el centro, y debe ser descondensado pare
atravesar el mecanismo de replicacin. Los cromo-
somas hijos emergen de la replicacin, son desen-
rollados por las topoisomerasas y despus, en un
estado no condensado, pasan a MukBEF, de modc
que formen masas no condensadas en posiciones
que llegarn a ser los centros de las clulas hijas.
Durante aos se ha sospechado que existe un
vnculo fsico entre el DNA de las bacterias y la mem-
brana, pero las evidencias siguen siendo ambiguas,
El DNA bacteriano suele encontrarse en fracciones
de membrana, las cuales tienden a ser abundantes
en marcadores genticos cerca del origen, la hor-
quilla de replicacin y el trmino. Las protenas pre-
sentes en dichas fracciones de membrana pueden
ser afectadas por mutaciones que interfieren con
el inicio de la replicacin. El sitio de crecimiento
podra ser una estructura de la membrana a la cual
debe adherirse el origen para la iniciacin.
Durante la esporulacin en Bacillus subtilis, ur
cromosoma hijo debe ser segregado en el peque-
41S
CAPTULO 17 La replicacin bacteriana est conectada con el ciclo celular
compartimiento de la pre-espora (vase la Fig.
..
41). Se trata de un proceso inusual que implica
transferencia del cromosoma a travs del septo
iciente. Uno de los genes de esporulacin, spoIIIE,
necesario para el proceso. La protena SpoIIIE se
caliza en el septo y probablemente tiene una fun-
.
n de translocacin que bombea el DNA a travs
I compartimiento de la pre-espora.
Los plsmidos de una soLa
copia tienen un sistema
de particin
Conceptos principales
'
Los plsmidos de una sola copia existen a razn de
una copia de plsmido por cada origen de cromosoma
bacteriano.
.
Los plsmidos de copias mltiples existen en ms de
una copia de plsmido por cada origen de cromosoma
bacteriano.
.
La recombinacin homloga entre los plsmidos
circulares genera dmeros y multmeros superiores.
.
Los plsmidos tienen sistemas de recombinacin
especfica de sitio que llevan a cabo la recombinacin
intramolecular para regenerar monmeros.
.
Los sistemas de particin garantizan que los plsmidos
duplicados sean segregados a clulas hijas distintas
producidas por una divisin.
3 tipo de sistema que utiliza un plsmido para ga-
rantizar que se distribuya entre las dos clulas hi-
jas en la divisin depende del tipo de sistema de
teplicacin. Cada tipo de plsmido conserva en su
/
-ospedador bacteriano un nmero de copias ca-
iBcterstico:
.
Los sistemas de control de una sola copia
son semejantes al del cromosoma bacteria-
no y resultan en una replicacin por divi-
sin celular. Un plsmido de una sola copia
conserva de manera efectiva la paridad con
el cromosoma bacteriano.
.
Los sistemas de control de copias mltiples
permiten varios eventos de iniciacin por
ciclo celular, lo cual resulta en numerosas
copias del plsmido por bacteria, siempre un
nmero caracterstico (tpicamente de 10 a
20) por cromosoma bacteriano.
El nmero de copias se debe principalmente al
:
ipo de mecanismo de control de la replicacin. El
sistema responsable de iniciar la replicacin deter-
mina cuantos orgenes puede haber en la bacteria.
Cada plsmido est formado por un solo replicn,
de modo que el nmero de orgenes es igual al n-
mero de molculas de plsmido.
Los plsmidos de una sola copia cuentan con
un sistema para el control de la replicacin cuyas
consecuencias son similares a las del sistema de re-
plicacin que gobierna al cromosoma bacteriano.
Un origen individual puede ser replicado una sola
vez y los orgenes hijos son segregados a las diferen-
tes clulas hijas.
Los plsmidos de copias mltiples tienen un
sistema de replicacin que permite que exista
un acervo de orgenes. Si el nmero es suficiente-
mente grande (en la prctica, ms de 10 por bacte-
ria), no se necesita un sistema de segregacin acti-
va, pues incluso una distribucin estadstica de los
plsmidos respecto de las clulas hijas resultara en
la prdida de plsmidos a frecuencias de <10"6.
Los plsmidos se mantienen en las poblaciones
bacterianas con rangos de prdida muy bajos (t-
picamente <10"7 por divisin celular, incluso para
los plsmidos de una sola copia). Los sistemas que
controlan la segregacin de los plsmidos se pue-
den identificar por mutaciones que incrementan
la frecuencia de la prdida, pero que no inciden
en la replicacin misma. Para garantizar la supervi-
vencia de un plsmido en la poblacin bacteriana
se utilizan diversos mecanismos. Es comn que el
plsmido porte numerosos sistemas, a menudo de
diferente tipo, que actan de manera independiente
para garantizar su supervivencia. Algunos lo hacen
de manera indirecta, mientras que otros participan
directamente en la regulacin del evento de par-
ticin. Sin embargo, en funcin de la evolucin,
todos tienen el mismo fin: ayudar a garantizar la
perpetuacin del plsmido en el nmero mximo
de bacterias de progenie.
Los plsmidos de una sola copia requieren de
sistemas de particin para asegurar que las copias
duplicadas se ubiquen en lados opuestos del septo
en la divisin celular, de modo que son segregados
a una clula hija distinta. De hecho,
las funciones
involucradas en la particin fueron identificadas por
primera vez en los plsmidos. En la FIGURA 17.14 se
ilustran los componentes de un sistema comn; en
general hay dos loci de actuacin en trans (parA y
Par A y ParB actan en parS
parA parB
X
parS
O
FIGURA 17.14 Un sistema de segregacin comn est formado
por los genes parA y parB y por el sitio diana porS.
17.9 Los plsmidos de una sola copia tienen un sistema de particin
419
El complejo de particin se forma en parS
Sitio
IHFa
/
de unin
al IHF
ParB
C IHFP
boxA
El complejo de particin se forma cuando el IHF
se une al DNA en parS y lo dobla para que ParB pueda unirse
a los sitios que se encuentran a ambos lados. El complejo es
iniciado por un heterodmero de IHF y un dimero de ParB y
despus se unen ms dmeros de ParB.
parB) y un elemento de actuacin en cis (parS) lo-
calizados justo en flujo descendente respecto de los
dos genes. ParA es una ATPasa que se une a ParB,
y sta, a su vez, con el sitio parS del DNA. Una dele-
cin en cualquiera de los tres loci impide la particin
adecuada del plsmido. Se han caracterizados siste-
mas de este tipo en los plsmidos F, P1 y R1. A pesar
de sus similitudes generales, no hay homologa de
secuencia significativa entre los genes correspon-
dientes ni entre los sitios de actuacin en cis.
La funcin de parS en el plsmido equivale a la
del centrmero en una clula eucaritica. Su unin
con la protena ParB crea una estructura que segre-
ga las copias del plsmido a clulas hijas opuestas.
Una protena bacteriana, IHF, tambin se une con
este sitio para integrarse a la estructura. El comple-
jo formado por ParB e IHF con parS se denomina
complejo de particin. parS es una secuencia de 34
bp que contiene el sitio de unin con IHF y est
flanqueada en ambos lados por secuencias denomi-
nadas boxA y boxB, unidas por ParB,
IHF es el factor hospedador de integracin
(integration host factor), as llamado por la funcin
en la cual se descubri (formando una estructura
implicada en la integracin del DNA del fago X al
cromosoma hospedador). IHF es un heterodmero
con capacidad para formar una estructura gran-
de en la cual envuelve el DNA en la superficie. La
funcin del IHF es doblar el DNA para que ParB
pueda unirse simultneamente a los sitios boxA y
boxB separados, como se indica en la
La formacin del complejo se inicia cuando parS es
unida por un heterodmero de IHF con un dmero
de ParB, lo cual permite que ms dmeros de ParB
se unan de forma cooperativa. La interaccin de
ParA con la estructura del complejo de particin es
esencial, pero transitoria.
El complejo protena-DNA que se ensambla en
el IHF durante la integracin del fago X se une a dos
molculas de DNA para permitirles recombinam
(vase la seccin 19.19, La recombinacin del fag
X ocurre en un intasoma). La funcin del complejc
de particin es diferente, garantizar que dos mol-
culas de DNA se segreguen separadas una de otn
An se desconoce de qu manera la formacin di
complejo individual logra llevar a cabo dicha tare;
Una posibilidad es que adhiere el DNA a un si:;
fsico, por ejemplo, la membrana, y despus los s!--
tios de adhesin sean segregados por crecimienic
del septo.
En numerosas bacterias se encuentran protL -
as relacionadas con ParA y ParB; en B. subtilis H
denominan Soj y SpoOJ, respectivamente. Las mv-
taciones de estos loci impiden la esporulacin debi-
do a una falla de segregacin de un cromosoma hijc
dentro de la pre-espora (vase la Fig. 11.42). En !ai
clulas en proceso de esporulacin, SpoOJ se loes-
liza en el polo y podra ser responsable de localiz.v
ah el origen. SpoOJ se une a una secuencia presen-
te en mltiples copias dispersas en -20% del cromo-
soma, cerca del origen. Por otra parte, es posible que
se una a orgenes nuevos y antiguos, manteniendo
un estado equivalente al apareamiento cromse -
mico, hasta que los cromosomas sean segregados
los polos opuestos. En Caulobacter crescentus, ParA y
ParB localizan a los polos de la bacteria y ParB une
secuencias cercanas al origen, de modo de localiz :
al origen en el polo. Estos resultados sugieren qM
un mecanismo especfico es responsable de ubica'
el origen en el polo. La siguiente etapa del anlisis
consistir en identificar los componentes celulares
con los cuales interacta el mecanismo.
La importancia del plsmido para garantizar qiic
todas las clulas adquieran rplicas del plsmido
subraya por la existencia de mltiples sistemas inde-
pendientes en plsmidos individuales que garantiza
la particin apropiada. Los sistemas de adiccin
cuya operacin se basa en la expresin
"
andarfla
juntos o andamos separados", garantizan que un
bacteria que porta un plsmido pueda sobreviv:
slo mientras lo retenga. Hay muchas formas de g-
rantizar que una clula muera si es
"
curada
"
de Vm
plsmido, las cuales comparten el principio ilustrade
en la de que el plsmido produce I
veneno y el antdoto. El veneno es una sustanc;
asesina relativamente estable, mientras que el ant-
doto consta de una sustancia que bloquea la accir
asesina, pero cuyo lapso de vida es relativamente
corto. Cuando el plsmido se ha perdido, el antdo:
se degrada, de modo que la sustancia asesina pro-
voca la muerte de la clula. As pues, las bacteria?
que pierden el plsmido mueren inevitablemente -
la poblacin est condenada a retener el plsmicL
de manera indefinida. Estos sistemas asumen varias
formas. Una de las especificadas por el plsmido ?
420
CAPTULO 17 La replicadn bacteriana est conectada con el ciclo celular
Un plasmido crea un asesino y un antdoto
El plsmido
crea al * Asesino
asesino y
al antidoto Andoto
La prdida del
/
"
'
l
''
*
plsmido deja a J
Asesino
un asesino ya c _ -
un antdoto AnTidoto
: =
El antdoto es Asesino
degradado s
El asesino destruye Asesino
a la clula
FIGURA 17.16 Los plsmidos podrian asegurar que las bacte-
rias no sobrevivan sin ellos al sintetizar a un asesino de larga
.
-
"
da y a un antdoto de vida corta.
consiste en protenas asesinas y bloqueadoras. El
smido Rl tiene un asesino que es el RNAm para
una protena txica; el antdoto es un RNA antisen-
ndo pequeo que impide la expresin del RNAm.
252 La incompatibUidad
de Los plsmidos depende
del replicn
Concepto principal
Los plsmidos que se encuentran en un solo grupo
de compatibilidad tienen orgenes regulados por un
sistema de control comn.
El enmeno de la incompatibilidad de los plsmidos
-
.
.
st relacionado con la regulacin del nmero de
copias del mismo y con la segregacin. Un grupo
de compatibilidad se define como un conjunto de
lsmidos cuyos miembros son incapaces de coexis-
K en la misma clula bacteriana. La razn de esta
incompatibilidad es que no es posible distinguir uno
.le otro en alguna etapa esencial para el manteni-
miento del plsmido; esto sera aplicable en la repli-
:
acin y segregacin del DNA.
Plsmidos incompatibles pertenecen al mismo grupo de distribucin
Ciclo celular de un plsmido Ciclo celular de plsmidos
incompatibles
La clula crece
La clula crece y pero los plsmidos
el plsmido se
f no se replican
replica porque ya hay dos
orgenes
La clula se divide La clula se divide
Cada clula tiene una copia del
Los plsmidos incompatibles
mismo plsmido
se han distribuido en clulas
diferentes
FIGURA 17.17 Dos plsmidos son incompatibles (pertenecen al mismo
grupo de compatibilidad) si sus orgenes no se diferencian en la etapa
de iniciacin. El mismo modelo podra aplicarse a la segregacin.
El modelo de control negativo para la incompa-
bilidad de los plsmidos se deriva de la idea de que
el nmero de copias logra controlarse al sintetizar
un represor que mide la concentracin de orgenes.
(Formalmente, es el mismo que el modelo de titula-
cin para la replicacin reguladora del cromosoma
bacteriano.)
La introduccin de un nuevo origen como se-
gundo plsmido del mismo grupo de compatibilidad
imita el resultado de la replicacin del plsmido re-
sidente, de modo que habr dos orgenes. Por tanto,
se impide cualquier replicacin posterior hasta que
los dos plsmidos hayan sido segregados a clulas
diferentes para crear el nmero correcto de copias
previas a la replicacin, como se ilustra en la FIGURA
El efecto sera similar si el sistema de segrega-
cin de los productos a las clulas hijas no pudiera
distinguir entre dos plsmidos. Por ejemplo, si dos
plsmidos tienen los mismos sitios de particin de
actuacin en ds, la competencia entre ellos asegu-
rara que fueran segregados a clulas diferentes, y
no podran sobrevivir en la misma lnea.
La presencia de un miembro de un grupo de
compatibilidad no afecta directamente la supervi-
vencia de un plsmido perteneciente a un grupo
diferente. Slo un replicn de un grupo de compati-
bilidad dado (plsmido de una sola copia) puede ser
mantenido en la bacteria, pero no interacta con los
replicones de otros grupos de compatibilidad.
17.10 La incompatibilidad de los plsmidos depende del replicn
421
EL sistema de compatibiLidad
CoLEl es controlado
por un regulador de RNA
Conceptos principales
.
La replicacin de ColEl exige que la transcripcin pase
por el origen, donde el transcrito es dividido por la
RNAasa H para generar un extremo cebador.
.
El RNA I regulador es un RMA corto antisentido que se
aparea con el transcrito e impide la divisin que genera
el extremo cebador.
.
La protena Rom potencia el apareamiento entre el RNA
I y el transcrito.
El nmero de copias y el sistema de incompati-
bilidad mejor caracterizados son los del plsmido
ColEl, plsmido de copias mltiples que se man-
tiene en un nivel estable de -20 copias por cada
clula de E. coli. El sistema para conservar el nmero
de copias depende del mecanismo para iniciar la
replicacin en el origen ColEl, como se ilustra en
la FIGURA 17.18.
La replicacin empieza con la transcripcin de
un RNA que inicia 555 bp de flujo ascendente del
origen. La transcripcin contina a travs del ori-
a replicacin
Iniciacin del cebador de RNA
/V/V/V/VT
La transcripcin rebasa al origen
/x/v/x/x/ /
La RNAasa H divide al RNA
/v/v
Hbrido de RNA-DNA persistente
Empieza la sntesis
de DNA
FIGURA 17.18 La replicacin del DNA ColEl se inicia al divi-
dir el RNA cebador para generar un extremo 3'-0H. El cebador
forma un hbrido persistente en la regin de origen.
gen. La enzima RNAasa H (cuyo nombre refleja su
especificidad por un sustrato de RNA hibridado con
DNA) divide al transcrito en el origen, lo cual gene-
ra un extremo 3-OH que se utiliza como
"
cebador
"
.
en el cual inicia la sntesis de DNA (el uso de los
cebadores se discute con mayor detalle en la seccin
18.8, La imprimacin es necesaria para iniciar la
sntesis de DNA). El RNA cebador forma un hbrid;
persistente con el DNA. El apareamiento entre el
RNA y el DNA ocurre justo en flujo ascendente 5
partir del origen (ms o menos en la posicin -20
y tambin ms lejos, en flujo ascendente (cerca de
la posicin -265).
Dos sistemas reguladores ejercen sus efectos er
el cebador de RNA, uno involucra la sntesis de ur.
RNA complementario al cebador y el otro implica I
una protena codificada por un locus cercano.
La especie reguladora de RNA I es una molcdj
de -180 bases codificada por la cadena opuesta a la
especfica del cebador de RNA. La relacin entre e
RNA cebador y el RNA I se ilustra en la FIGURA 17.19.
La molcula de RNA I inicia en la primera regin I
termina cerca del sitio en que inicia el RNA cebador
de modo que el RNA I es complementario de la re-
gin terminal 5
'
del RNA cebador. El apareamiento
de bases entre las dos molculas de RNA control
la disponibilidad del RNA cebador para iniciar r-
delo de replicacin.
Una molcula de RNA, como el RNA I, que
funciona gracias a su complementariedad con otro
RNA codificado en la misma regin, se denomina
contratranscrito. Este tipo de mecanismo, por su
puesto, es otro ejemplo del uso del RNA antisentid-
(vase la seccin 13.7, Las molculas pequeas de
RNA son capaces de regular la traduccin).
Las mutaciones que reducen o eliminan la com-
patibilidad entre plsmidos pueden obtenerse al selec-
cionar a plsmidos del mismo grupo por su capacidac
para coexistir. Las mutaciones de incompatibilidad en
ColEl se mapean en la regin de superposicin entre
el RNA I y el RNA cebador. Esta regin se representi
en dos RNA distintos, de tal manera que uno o ambe
podran estar involucrados en el efecto.
Cuando el RNAI es agregado a un sistema par;
replicar DNA ColEl in vitro, inhibe la formacin de
RNA cebador activo, pero la presencia de RNA I no
El RNA I es complementario del RNA cebador
RNA! (108 bases)
< Origen
RNA cebador (555 bases)
FIGURA 17.19 La secuencia del RNA I es complementaria
la regin 5' del RNA cebador.
422
CAPTULO 17 La replicacin bacteriana est conectada con el ciclo celular
:.hibe la iniciacin ni la elongacin de la sntesis
le RNA cebador, lo cual sugiere que el RNA I im-
pide que la RNAasa H genere al extremo 3' del RNA
.
"
rbador. Este efecto se basa en el apareamiento de
;
ases entre el RNA I y el RNA cebador,
Las dos molculas de RNA tienen la misma es-
tructura secundaria potencial en esta regin, con
:
s horquillas dplex que terminan en lazos de
;
adena individual. Las mutaciones que reducen la
-
compatibilidad se localizan en dichos lazos,
lo cual
rugiere que el paso inicial del apareamiento de ba-
zi entre el RNA I y el RNA cebador es un contacto
r.nre los lazos no apareados.
De qu manera el apareamiento con el RNA I
mpide la divisin para formar el RNA cebador? En
h FIGURA 17.20 se ilustra un modelo. En ausencia
:
e RNA I, el RNA cebador forma su propia estruc-
ra secundaria (que involucra lazos y tallos). Sin
embargo, cuando el RNA I est presente,
las dos
molculas se aparean y forman una estructura de
doble cadena a todo lo largo del RNA I. La nueva
estructura secundaria impide la formacin del ceba-
r
, probablemente porque afecta la capacidad del
TXA
para formar el hbrido persistente.
El apareamiento RNA I-cebador controla la divisin
SIN APAREAMIENTO
Cebador de RNA
Divisin
APAREAMIENTO
RNA I
, Inicia el apareamiento de bases
11S1S2S \
m m m
La transcripcin contina
/
RNA dplex
GURA 17.20 E[ apareamiento de bases con el RNA I pue-
rambiar la estructura secundaria de la secuencia del RNA
:
ador y, por lo tanto, impedir la divisin para generar un
:
-
emo 3
'
-0H.
El modelo se asemeja al mecanismo implica-
do en la atenuacin de la transcripcin, en el cual
los apareamientos alternativos de una secuencia de
RNA permiten o impiden la formacin de la estruc-
tura secundaria necesaria para la terminacin por
la polimerasa de RNA (vase la seccin 13.2,
Las
estructuras secundarias alternas controlan la ate-
nuacin). La accin del RNA I es ejercida por su
capacidad para afectar a regiones distantes del pre-
cursor del cebador.
Formalmente, el modelo equivale a postular un
circuito de control que implica dos especies de RNA.
Un precursor de un RNA cebador de gran tamao
es un regulador positivo, necesario para iniciar la
replicacin. El RNA I pequeo es un regulador ne-
gativo susceptible de inhibir la accin del regulador
positivo.
Por su capacidad para actuar en cualquier pls-
mido presente en la clula, el RNA I proporciona un
represor que impide que funcione el DNA reciente-
mente inducido, funcin anloga a la del represor
lisognico de X (vase la seccin 14.9, El represor y
sus operadores definen la regin de inmunidad). En
vez de una protena represora que se une al DNA
nuevo, un RNA une al precursor recin sintetizado
al cebador de RNA.
La unin entre el RNA I y el RNA cebador puede
ser influida por la protena Rom, la cual es codificada
por un gen que se encuentra en flujo descenden-
te respecto del origen. La protena Rom potencia la
unin entre los transcritos de RNA I y de RNA ceba-
dor de >200 bases. El resultado es la inhibicin de la
formacin del cebador,
Cmo afectan las mutaciones de los RNA a la
incompatibilidad? En la FIGURA 17.21 se muestra una
El RNA I acta slo en
El RNA I acta en cualquier cebador de RNA
codificado por su propio genoma
iii ra
Tipo I
WSU Tipo II
III III III >
MM
El RNA I con secuencia diferente no puede
actuar en el cebador de RNA
Tipo I + tipo II
Divisin
FIGURA 17.21 Las mutaciones de la regin que codifica al
RNA I y al precursor del cebador no necesitan incidir en su
capacidad para aparearse; sin embargo, pueden impedir el
apareamiento con el RNA complementario codificado por un
plsmido diferente.
17.11 El sistema de compatibilidad ColEl es controlado por un regulador de RNA
423
situacin en que una clula contiene dos tipos de
secuencia RNA I/RNA cebador. El RNA I y el RNA
cebador creados a partir de un tipo de genoma pue-
den interactuar, pero el RNA I de un genoma no in-
teracta con el RNA cebador del otro genoma. Esta
situacin se originara cuando una mutacin en la
regin comn al RNA I y al RNA cebador ocurriera
en una ubicacin implicada en el apareamiento de
bases entre ellos. Cada RNA I seguira aparendose
con el RNA del cebador codificado por el mismo
plsmido, pero podra ser incapaz de aparearse con
el RNA cebador codificado por el otro, lo cual pro-
vocara que el plsmido original y el mutante se
comportaran como miembros de grupos de compa-
tibilidad diferentes,
mrr Cmo se replican y segregan
las mitocondras?
Conceptos principales
.
La replicacin y la segregacin del DNAmt a las
mitocondrias hijas son eventos estocsticos.
.
La segregacin mitocondrial a las-clulas hijas tambin
es un evento estocstico.
Las mitocondrias deben duplicarse durante el ciclo
celular y segregarse a las clulas hijas, se entiende
una parte de la mecnica de este proceso, pero no
su regulacin.
En cada etapa de la duplicacin de las mito-
condrias, replicacin y segregacin del DNA para
duplicar las mitocondrias, as como a segregacin
de los organelos a las clulas hijas, el proceso parece
ser estocstico, regido por una distribucin aleatoria
de cada copia. En este caso, la teora de la distribu-
cin es anloga a la de los plsmidos bacterianos de
copias mltiples, con la misma conclusin de que
>10 copias son necesarias para garantizar que cada
clula hija adquiera al menos una copia (vase la
seccin 17.9, Los plsmidos de una sola copia tie-
nen un sistema de particin). Cuando hay molcu-
las de DNAmt con variaciones allicas (por herencia
de progenitores distintos o por mutaciones), la dis-
tribucin estocstica puede generar clulas con slo
uno de los alelos.
La replicacin del DNAmt puede ser estocstica
porque no hay un control por el cual se repliquen
copias especficas, de manera que en un ciclo, al-
gunas molculas de DNAmt pueden replicarse ms
veces que otras.
El nmero total de copias del genoma puede
ser controlado por titulacin de masa en una forma
similar a las bacterias (vase la seccin 17.2, La re-
plicacin est conectada con el ciclo celular),
Una mitocondria se divide al desarrollar u::
anillo en torno al organelo que lo estrangula para
dividirlo en dos mitades. En principio, el mecanismo
es similar al implicado en la divisin de las bacterias
El mecanismo que se utiliza en las mitocondrias de
las clulas vegetales es similar al de las bacterias I
utiliza un homlogo de la protena bacteriana FtsZ
(vase la seccin 17.5, El producto FtsZ es necesaric
para la formacin del septo). El mecanismo mole-
cular es diferente en las mitocondrias de las clulas
animales, y utiliza la protena dinamina, implicada
en la formacin de vesculas membranosas. Un or-
ganelo individual puede tener ms de una copia de
su genoma.
Se desconoce si hay un mecanismo de particin
para segregar las molculas de DNAmt del interior
de la mitocondria, o si son simplemente heredadas
por las mitocondrias hijas, segn la mitad de la mi-
tocondria en que se encuentren. En la FIGURA 17.22
La replicacin del DNAmt es estocstica
I
I La constriccin forma un punto medio
i
. Nucleoides de DNAmt
2 El DNA mitocondrial se replica al incrementarse;
el nmero de genomas respecto de la masa mitocondrial, per:
sin garantizar que cada genoma se replique el mismo nmero
veces, lo cual puede provocar cambios en la representaci"
de los alelos de las mitocondrias hijas.
424
CAPTULO 17 La replicacin bacteriana est conectada con el ciclo celular
E muestra que la combinacin de los mecanismos
:
o replicacin y de segregacin puede resultar en la
lignacin estocstica del DNA en cada una de las
Bopias, es decir, que la distribucin de uno de los
genomas mitocondriales a la mitocondria hija no
:
epende de sus orgenes progenitores.
La asignacin de las mitocondrias a las clulas
rijas tambin parece ser aleatoria. De hecho, fue la
fabservacin de la variacin somtica en las plantas
la que sugiri inicialmente la existencia de genes
le podran perderse de una de las clulas hijas
morque no se heredaban segn las leyes de Mendel
<vase la Fg. 4.15).
En algunas situaciones, una mitocondria tiene
lelos de ambos progenitores, lo cual tiene dos con-
dicionantes: que ambos padres proporcionen alelos
i cigoto (que por supuesto no es el caso cuando hay
lerenda materna. Vase la seccin 4.9, Los organe-
los contienen DNA), y que los alelos progenitores
se encuentren en la misma mitocondria. Para ello,
las mitocondrias de los progenitores deben haberse
fusionado.
El tamao de una mitocondria podra no de-
finirse con precisin. De hecho, hay una interro-
gante sin resolver respecto de que una mitocondria
individual represente a una copia nica y discreta
del organelo o se encuentre en un flujo dinmico
en que puede fusionarse con otras mitocondrias.
Se sabe que las mitocondrias pueden fusionarse en
las levaduras debido a que despus de que se han
apareado dos cepas haploides de levaduras para pro-
ducir una cepa diploide, pueden ocurrir eventos de
recombinacin entre las molculas de DNAmt, lo
cual implica que los dos DNAmt deben haber estado
expuestos uno al otro en el mismo compartimiento
mitocondrial. Se han hecho intentos de evaluacin
de la incidencia de eventos similares en clulas ani-
males en pos de una complementacin entre alelos
despus de que dos clulas se han fusionado, pero
los resultados no son contundentes.
Resumen
Para replicar al cromosoma de E. coli se necesita
un tiempo fijo de 40 min, adems de que deben
transcurrir otros 20 antes de que la clula pueda
dividirse. Cuando las clulas se dividen en menos de
60 min, se inicia un ciclo de replicacin antes del
final del ciclo de divisin precedente, lo cual da
lugar a cromosomas con horquillas mltiples. El
evento de iniciacin depende de la titulacin de la
masa celular, probablemente al acumular una pro-
tena iniciadora. La iniciacin puede tener lugar en
la membrana de la clula debido a que el origen
tiene relacin con la membrana durante un periodo
corto posterior a la iniciacin,
El septo que divide a la clula crece en una ubi-
cacin definida por al anillo periseptal preexistente;
un locus de tres genes (minC, D y E) codifica a los
productos que regulan el uso del anillo periseptal de
la mitad de la clula o los sitios polares derivados
de anillos previos para la formacin del septo. El
que no se forme un septo, genera filamentos mul-
tinucleares; un exceso en la formacin de septos
genera miniclulas anucleadas.
Muchas protenas transmembrana interactan
para formar el septo. ZipA se localiza en la mem-
brana interna de la bacteria y se une a FtsZ, que
es una protena tipo tubulina que puede polime-
rizarse en una estructura filamentosa denominada
anillo Z. FtsA es una protena citoslica que se une
a FtsZ. Muchos otros productos/fs, todos protenas
transmembrana, se unen al anillo Z en un proceso
ordenado que genera un anillo septal. Las ltimas
protenas que se unen SEDS FtsW, y la transpepti-
dasa ftsl (PBP3), las cuales funcionan en conjunto
para producir los peptidoglucanos del septo. Los
cloroplastos utilizan un mecanismo de divisin re-
lacionado que tiene una protena tipo FtsZ, a dife-
rencia de las mitocondrias, que utilizan un proceso
diferente en el cual la membrana es constreida por
una protena del tipo de la dinamina.
Los plsmidos y las bacterias tienen sistemas
de recombinacin especfica de sitio que regeneran
pares de monmeros al separar a dmeros creados
por recombinacin general. El sistema Xer acta
en una secuencia diana localizada en la regin del
trmino del cromosoma. El sistema se activa slo
en presencia de la protena FtsK del septo, lo cual
puede garantizar que acte slo cuando un dmero
necesite ser separado.
La particin implica la interaccin de la prote-
na ParB con el sitio diana parS para construir una
estructura que incluya la protena IHF. Este com-
plejo de particin garantiza que los cromosomas
replicados se segreguen a clulas hijas distintas. El
mecanismo de segregacin puede implicar el des-
plazamiento del DNA, posiblemente por la accin
de MukB en la condensacin de cromosomas en
masa en diferentes ubicaciones conforme emergen
de la replicacin.
Los plsmidos tienen una variedad de sistemas
que garantizan la particin, o que colaboran para
que tenga lugar, y un plsmido individual puede
portar sistemas de muchos tipos. El nmero de co-
pias de un plsmido describe si se presenta en el
mismo nivel que el cromosoma bacteriano (uno por
clula unitaria) o en cantidades mayores. La incom-
patibilidad de los plsmidos puede ser consecuencia
de los mecanismos implicados en la replicacin o la
particin (para plsmidos de una sola copia). Dos
plsmidos que comparten el mismo sistema de con-
1713 Resumen 425
trol para la replicacin son incompatibles, debido
a que el nmero de eventos de replicacin garan-
tiza que haya un solo plsmido para cada genoma
bacteriano.
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Referencias 427
18
Replicacin del DNA
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
Las poh'merasas de DNA son enzimas que
sintetizan DNA BO
.
El DNA se sintetiza por replicacin semiconservadora y en
reacciones de reparacin.
.
Una bacteria o una clula eucaritica tiene varias
polimerasas de DNA diferentes.
.
Una polimerasa de DNA bacteriana realiza replicacin
semiconservadora; las otras intervienen en reacciones de
reparacin.
.
Los ncleos eucariticos, las mitocondrias y los
cloroplastos tienen una polimerasa de DNA individual
necesaria para la replicacin, as como otras polimerasas
de DNA que participan en actividades auxiliares o de
reparacin.
Las polimerasas de DNA tienen varias actividades
de nucleasa
.
La polimerasa de DNA I tiene una actividad exonucleasa
5
'
-
3' i
ndividual que puede combinarse con la sntesis de
DNA para realizar el desplazamiento de hendidura.
Las poLimerasas de DNA controlan la fidelidad de
La replicacin
*
Las polimerasas de DNA a menudo tienen actividad
exonucleasa 3-5
'
que es utilizada para escindir bases
apareadas de manera incorrecta.
.
La fidelidad de la replicacin mejora con la correccin en
un factor de ~100.
Las polimerasas de DNA tienen una estructura
comn
.
Muchas polimerasas de DNA tienen una gran hendidura
compuesta por tres dominios que se asemejan a una mano.
.
El DNA yace en la "palma de la mano", en un surco creado
por los
"
dedos" y el "pulgar".
La sntesis de DNA es semidiscontinua
.
La replicasa del DNA avanza en forma continua cuando
sintetiza la cadena lder (en sentido 5-3
'
), p
ero sintetiza
la cadena retrasada al formar pequeos fragmentos que se
unen unos a otros despus.
El modelo 9X muestra cmo se genera el DNA de IEW1
cadena individual para la replicacin
.
La replicacin requiere que una helicasa separe las cadenas
de DNA con la energa que proviene de la hidrlisis de ATP.
.
Una protena de unin a la cadena individual es necesaria
para mantener las cadenas separadas.
.
La combinacin de helicasa, SSB y protena A separa un
dplex de 9X174 en un crculo de cadena individual y una
cadena individual lineal.
La actividad cebadora es necesaria para iniciar la
sntesis de DNA
.
Todas las polimerasas de DNA requieren un extremo cebador
3
'
-
0H para iniciar la sntesis de DNA.
.
El extremo cebador puede ser proporcionado por un
cebador de RNA, por una hendidura en el DNA o por una
protena cebadora.
.
Para la replicacin del DNA, una polimerasa de RNA
especial llamada primasa sintetiza una cadena de RNA que
proporciona el extremo cebador.
.
f. co/i tiene dos tipos de reacciones cebadoras, las cuales
ocurren en el origen bacteriano (or/C) y en el origen 9XI74.
.
La actividad cebadora de la replicacin en el DNA de doble
cadena siempre requiere una replicasa, una SSB, y una
primasa.
DnaB es la replicasa que desenrolla el DNA para la
replicacin en f. coii.
La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres
subcomplejos
.
La replicasa de f. coli polimerasa de DNA III es un
complejo de 900 kD con una estructura dimrica.
.
Cada unidad monomrica tiene un ncleo cataltico,
una subunidad de dimerizacin y un componente de
procesividad.
Un cargador de pinza coloca las subunidades de
procesividad en el DNA, en donde forman una pinza circular
alrededor del cido nucleico.
.
Un ncleo cataltico est asociado a cada una de las
cadenas de molde.
La pinza controla la asociacin de la enzima
central con el DNA
.
El ncleo en la cadena lder es procesivo debido a que su
pinza lo mantiene en el DNA.
.
La pinza asociada al ncleo en la cadena retrasada se
disocia al final de cada fragmento de Okazaki y se ensambla
de nuevo para el siguiente fragmento.
.
La helicasa DnaB se encarga de interactuar con la primasa
DnaG para iniciar cada fragmento de Okazaki.
Coordinacin de la sntesis de la cadena lder y de
la cadena retrasada
.
Se requieren diferentes unidades enzimticas para
sintetizar las cadenas lderes y retrasadas.
.
En f. co/i, ambas unidades contienen la misma subunidad
cataltica (DnaE).
428
me Los fragmentos de Okazaki estn unidos por La
En otros organismos pueden necesitarse diferentes
subunidades cataliticas para cada cadena.
Los fragmentos de Okazaki estn unidos por La
-
Cada fragmento de Okazaki inicia con un cebador y se
detiene antes del siguiente fragmento.
ta polimerasa de DNA I elimina el cebador y lo
remplaza con DNA en una accin semejante al
desplazamiento de hendidura.
ta ligasa de DNA realiza el enlace que conecta el
extremo 3
'
de un fragmento de Okazaki al inicio 5' del
siguiente fragmento.
itaiM PoLimerasas de DNA eucariticas
independientes reaLizan La iniciacin y La
eLongacin
Una horquilla de replicacion tiene un complejo
formado por polimerasa de DNA a/primasa y dos
complejos de polimerasa de DNA S o E.
El complejo polimerasa de DNA a/primasa inicia la
sintesis de las dos cadenas del DNA,
ta polimerasa de DNA 5 alarga la cadena lder y una
segunda polimerasa de DNA 8, o polimerasa de DNA e,
alarga la cadena retrasada.
IhMH El fago T4 proporciona su propio mecanismo
de replicacion
El fago T4 proporciona su propio mecanismo de
replicacion, que est formado por una polimerasa de
DNA, por el gen 32 SSB, por una helicasa, por una
primasa y por protenas accesorias que incrementan la
velocidad y la procesividad.
lt;MM Creacin de Las horquillas de replicacin en el
origen
ta iniciacin en o requiere el ensamble secuencial
de un gran complejo de protenas.
.
DnaA se une a secuencias cortas repetitivas y forma un
complejo oligomrico que desnaturaliza el DNA.
. Seis monmeros de DnaC se unen a cada hexmero de
DnaB, y este complejo se une al origen.
Un hexmero de DnaB forma la horquilla de
replicacin. ta girasa y la SSB tambin son necesarias.
Sucesos comunes en el cebamiento de la
replicacin en el origen
.
El principio general de la iniciacin bacteriana es que
el origen es reconocido en un inicio por una protena
que forma un gran complejo con el DNA.
.
Una regin corta de DNA enriquecida con A-T es
desnaturalizada.
.
DnaB se une al complejo y crea la horquilla de
replicacin.
iEHH EL primosoma es necesario para reiniciar la
replicacin
ta iniciacin de la replicacin de cpX requiere que el
complejo del primosoma desplace a la SSB del origen.
.
Una horquilla de replicacin se detiene cuando llega al
DNA daado.
.
Despus que el dao ha sido reparado, el primosoma es
indispensable para reiniciar la replicacin.
ta protena Tus se une a los sitios tery detiene el
desenrollamiento del DNA mediado por DnaB, lo cual
ocasiona que la replicacin termine.
Bwa Resumen
gm Introduccin
La replicacin del DNA dplex es un proceso com-
plejo que comprende un conglomerado de activi-
dades enzimticas. Diferentes actividades tienen
lugar en las etapas de iniciacin, elongacin, y ter-
minacin.
.
La iniciacin implica el reconocimiento de
un origen por un complejo de protenas.
Antes de que la sntesis de DNA empiece,
las cadenas progenitoras deben separarse y
(de manera transitoria) estabilizarse en el
estado de una sola cadena. Despus de esta
etapa, la sntesis de las cadenas hijas puede
iniciarse en la horquilla de replicacin.
.
La elongacin la realiza otro complejo de
protenas. El replisoma existe slo como
un complejo de protenas asociado a la es-
tructura particular que asume el DNA en la
horquilla de replicacin. No existe como una
unidad independiente (p. ej., como un ribo-
soma). A medida que el replisoma se mueve
por el DNA, las cadenas progenitoras se des-
enrollan y las cadenas hijas son sintetizadas.
.
Al final del replicn, las reacciones de unin
o de terminacin son indispensables. Des-
pus de la terminacin, los cromosomas
duplicados deben separarse uno del otro, lo
cual requiere la manipulacin de la estruc-
tura compleja del DNA.
La incapacidad para replicar el DNA es letal para
el crecimiento de la clula. Por lo tanto, los mulan-
tes afectados en la replicacin slo pueden obtenerse
como letales condicionales. stos son capaces de lo-
grar la replicacin bajo condiciones permisivas (pro-
vistas por la temperatura normal de incubacin),
pero son defectuosos en condiciones no permisivas
(temperaturas mayores de 420C). Una serie extensa
de dichos mutantes sensibles a la temperatura en B.
coli permite identificar un conjunto de loci llamados
genes ina. Los mutantes dna permiten distinguir
dos etapas de replicacin por su comportamiento
cuando la temperatura se incrementa:
.
La clase mayor de mutantes de detencin
rpida interrumpe la replicacin en cuanto
aumenta la temperatura. Presentan defec-
tos en los componentes del mecanismo de
replicacin, por lo general en las enzimas
necesarias para la elongacin (pero tambin
incluyen defectos en el suministro de pre-
cursores esenciales).
.
La clase ms pequea de mutantes de de-
tencin lenta concluyen el ciclo de repli-
cacin actual, pero no pueden iniciar otro.
18.1 Introduccin 429
Tienen defectos en los episodios compren-
didos en el inicio de un ciclo de replicacin
en el origen.
Un anlisis importante utilizado para identificar
los componentes del mecanismo de replicacin se
llama anlisis de complementacin in vitro. Se
prepara un sistema para la replicacin in vitro a par-
tir de un mutante dna y se pone en marcha en con-
diciones en las cuales el producto gnico mutante
es inactivo. Se evala la capacidad de los extractos
de clulas de tipo silvestre para restaurar la activi-
dad. La protena codificada por el locus dna puede
purificarse si se identifica el componente activo del
extracto.
Cada uno de los componentes del mecanismo
de replicacin bacteriana queda ahora en condicio-
nes de ser estudiado in vitro como producto bio-
qumicamente puro, y es implicado in vivo por mu-
taciones en sus genes. Los sistemas de replicacin
eucaritica estn altamente purificados y en general
tienen componentes anlogos a las protenas bac-
terianas, pero eso no significa que hayan alcanzado
la etapa en la que cada uno de los componentes ha
sido identificado.
Cada cadena progenitora de DNA es un molde
5
'
3
'
MIMIII
3
'
n
-
5'
5
'
3
'
5
'
IT
3
''
3
'
5
'
FIGURA 18. La replicacin semiconservadora sintetiza dos
cadenas nuevas de DNA.
La sntesis reparadora remplaza un
fragmento corto de DNA
5
'
3
'
5
'
3
'
Hll
jlIHHI
3
'
5
'
Base daada I
mm
5
'
La sntesis reparadora remplaza un fragmento
corto de una cadena de DNA que contiene una base daada.
Las poLimerasas de DNA son
enzimas que sintetizan DNA
Conceptos principales
El DNA se sintetiza por replicacin semiconservadora y
en reacciones de reparacin.
Una bacteria o una clula eucaritica tiene varias
polimerasas de DNA diferentes.
Una polimerasa de DNA bacteriana realiza replicacin
semiconservadora; las otras intervienen en reacciones
de reparacin.
Los ncleos eucariticos, las mitocondrias y los
doroplastos tienen una polimerasa de DNA individual
necesaria para la replicacin, asi como otras
polimerasas de DNA que participan en actividades
auxiliares o de reparacin.
Existen dos tipos bsicos de sntesis de DNA.
La FIGURA 18.1 muestra el resultado de la re-
plicacin semiconservadora. Las dos cadenas del
dplex progenitor son separadas y cada una sirve
como molde para la sntesis de una nueva cadena.
El dplex progenitor es remplazado por dos dplex
hijos, cada uno de los cuales tiene una cadena pro-
genitora y una cadena recin sintetizada.
La FIGURA 18.2 muestra las consecuencias de
una reaccin de reparacin. Una cadena de DNA
ha sido daada. Es escindida y se sintetiza nuevo
material para remplazara. Una enzima que puede
sintetizar una nueva cadena de DNA a partir de una
cadena molde se denomina polimerasa de DNA.
Las clulas procariticas y eucariticas contienen
actividades mltiples de polimerasa de DNA. Slo
algunas de estas enzimas en realidad experimentan
la replicacin; aquellas que lo hacen en ocasiones
se denominan replicasas de DNA. Las dems en-
zimas desempean funciones subsidiarias en la re-
plicacin o participan en la sntesis reparadora.
Todas las polimerasas de DNA procariticas y
eucariticas comparten el mismo tipo fundamental
de actividad sinttica. Cada una puede extender una
cadena de DNA al agregar nucletidos, uno a la vez,
a un extremo 3
'
-
OH, como se ilustra en la IGURA
18.3. La eleccin del nucletido que ser agregado
a la cadena depende del apareamiento de bases con
la cadena molde.
Algunas polimerasas de DNA funcionan como
enzimas independientes, pero otras (sobre todo las
replicasas) son incorporadas en ensambles de pro-
tenas ms extensos. La subunidad sintetizadora de
DNA es slo una de varias funciones de la replicasa,
la cual por lo general tiene muchas otras actividades
relacionadas con el desenrollamiento del DNA, el
inicio de la sntesis de nuevas cadenas, etc.
430
CAPTULO 18 Replicacin del DNA
La sntesis de los cidos nucleicos avanza de 5 a 3
El molde tiene un extremo 3-OH libre
5
' p p p p p OH 3
'
3
'
p P :p :> p
_
p I, P P P P
El nucletido entrante tiene tres grupos fosfato
en la posicin 5
'
S
'
ppp
.
OH 3'
T
pppppppp:ppp
3' . _ 5
'
Un difosfato es liberado cuando se agrega
el nucletido a la cadena
5
'
3
'
-B- p E E P-
r
3'OH
!p :p1p1p i p !p|p|p!1p|p:|p
5
'
FIGURA 18.3 El DNA es sintetizado aL agregar nucLetidos al ex-
tremo 3-OH de la cadena creciente, de tal manera que la cadena
nueva crece en direccin 5
'
->3
'
. El precursor para la sntesis de
DNA es un nuclesido trifosfatado, el cual pierde los dos grupos
fosfato terminales en la reaccin.
La FIGURA 18.4 resume las polimerasas de DNA
que se han definido en E. coli. La polimerasa de
DNA III, una protena con mltiples subunidades,
es la replicasa encargada de la sntesis de novo de
cadenas nuevas de DNA. La polimerasa de DNA
I (codificada por polA) participa en la reparacin
del DNA daado y, en una funcin subsidiaria,
en la replicacion semiconservadora. La polimera-
sa de DNA II es indispensable para el reinicio de
una horquilla de replicacin cuando su progreso es
bloqueado por dao en el DNA. Las polimerasas de
DNA IV y V permiten que la replicacion pase por
alto ciertos tipos de dao.
Cuando se evala la capacidad de los extractos
de E. coli para sintetizar DNA, la actividad enzim-
tica predominante es la de la polimerasa de DNA I.
Su actividad es tal que impide detectar las activida-
des de las enzimas que en realidad se encargan de
la replicacin del DNA. Para desarrollar sistemas in
vitro en los cuales la replicacin pueda estudiarse,
los extractos se preparan a partir de clulas con mu-
taciones en polA.
Algunos fagos codifican polimerasas de DNA.
Entre stos se encuentran los fagos T4, T5, T7, y
SPOl. Todas las enzimas poseen actividades sintti-
cas 5
'
-
3
'
y actividades de correccin de exonucleasa
3
'
-
5'
(vase la seccin 18.3, Las polimerasas de DNA
tienen varias actividades de nucleasa). En cada caso,
una mutacin en el gen que codifica un solo poli-
E. coli tiene cinco polimerasas de DNA
Enzima Gen Funcin
i polA enzima importante de
reparacin
II polB reinlcio de la replicacin
III po/C replicasa
IV dinB
replicacin translesin
V umtvD'jC replicacin translesln
FIGURA 18.4 Slo una polimerasa de DNA es la replicasa. Las otras
participan en la reparacin del DNA daado y reinician las horqui-
llas de replicadn varadas o eluden el dao en el DNA.
pptido del fago impide que ste se desarrolle. Cada
polimerasa del fago se asocia a otras protenas, del
propio fago o del hospedador, para hacer la enzima
intacta.
Varias clases de polimerasas de DNA eucariti-
cas han sido identificadas. Las polimerasas de DNA
5 y e son indispensables para la replicacin nuclear;
la polimerasa de DNA a tiene que ver con el proceso
de cebamiento (iniciacin) de la replicacin. Otras
polimerasas de DNA intervienen en la reparacin
del DNA nuclear daado ([3 e incluso e) o la repli-
cacin del DNA mitocondrial (y)-
nn Las polimerasas de DNA tienen
varias actividades de nucLeasa
Concepto principal
La polimerasa de DNA I tiene una actividad exonucleasa
5
'
-
3'
individual que puede combinarse con la sntesis
de DNA para realizar el desplazamiento de hendidura.
Las replicasas a menudo tienen actividades de nu-
cleasa adems de la capacidad para sintetizar DNA.
Una actividad de exonucleasa 3'-5' se utiliza por lo
general para recortar bases que han sido agregadas
al DNA de manera incorrecta. Esto ofrece un siste-
ma de
"
correccin
"
para el control de errores (vase
la seccin 18.4, Las polimerasas de DNA controlan
la fidelidad de la replicacin).
La primera enzima sintetizadora de DNA que
se describi fue la polimerasa de DNA I, que es un
polipptido nico de 103 kD. La cadena puede divi-
dirse en dos partes por tratamiento proteoltico. Dos
tercios de la protena se encuentran en el extremo
C y contienen el sitio activo de la polimerasa; el
tercio restante de la protena est en el extremo N
y contiene la exonucleasa de correccin.
El producto ms grande de la divisin (de 68 kD)
se llama fragmento Klcnow. Se utiliza en reacciones
18.3 Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa
El desplazamiento de hendidura remplaza una cadena
rrr.HInlInnilnllli
3
'
5
'
5
'
La hendidura genera los grupos 3'-OH y 5'-P
4
OH P
3
'
liimiimiimimiii
= 3
'
li
5
'
5
'
3
'
La sntesis de DNA extiende el extremo 3';
la cadena antigua es degradada
\ OH P
HhiHnHIi
5
'
El desplazamiento de hendidura remplaza una
parte de la cadena preexistente de DNA dplex con material
recin sintetizado.
sintticas in vitro. Contiene la polimerasa y las activi-
dades de exonucleasa 3'-5'. Los sitios activos estn
separados de la protena -30 , lo cual indica que
existe una separacin espacial entre la base que se
agrega y la que se elimina.
El fragmento pequeo (de 35 kD) posee activi-
dad exonucleoltica 5'-3' que desprende pequeos
grupos de nucletidos, hasta -10 bases a la vez. Esta
actividad se coordina con la actividad sinttica/co-
rrectora. Proporciona polimerasa de DNA I con una
habilidad exclusiva para iniciar la replicacin in vitro
en una hendidura en el DNA. (Ninguna otra poli-
merasa de DNA tiene esta capacidad.) En el sitio
donde se ha roto un enlace fosfodister en un DNA
de doble cadena, la enzima extiende el extremo
3
'
-
OH. A medida que se sintetiza el nuevo segmen-
to de DNA, desplaza la cadena homologa existente
en el dplex.
Este proceso de desplazamiento de hendi-
dura se ilustra en la 'jURA . La cadena despla-
zada es degradada por la actividad exonucleoltica
5
'
-
3' d
e la enzima. Las propiedades del DNA no se
alteran, excepto que un segmento de una cadena
ha sido remplazado con material recin sintetizado
y la posicin de la mella ha sido desplazada a lo
largo del dplex. Esto tiene un gran uso prctico;
el desplazamiento de hendidura ha constituido una
tcnica importante para introducir nucletidos con
marcas radioactivas en el DNA in vitro.
La accin 5'-3' sinttica/3'-5' exonucleoltica
es probable que sea utilizada in vivo sobre todo para
rellenar regiones cortas de cadena individual en el
DNA de doble cadena. Estas regiones emergen du-
rante la replicacin y cuando las bases daadas son
eliminadas del DNA.
Las poLimerasas de DN
controlan La fideLidad
de La replicacin
Conceptos principales
Las polimerasas de DNA a menudo tienen actividad
exonucleasa 3
'
-
5
'
que se utiliza para escindir bases
apareadas de manera incorrecta.
La fidelidad de la replicacin mejora con la correccin
en un factor de ~100.
La fidelidad de la replicacin plantea el mismo pro-
blema que se observa cuando se tiene en cuenta.
por ejemplo, la precisin de la traduccin. Se basa
en la especificidad del apareamiento de bases. Sin
embargo, cuando se consideran las interacciones
comprendidas en el apareamiento de bases, se espe-
ra que ocurran errores con una frecuencia de ~10
-3
por pares de bases replicadas. La tasa actual en las
bacterias parece ser de -lO-8 a lO-10. Esto corres-
ponde a -1 un error por genoma por 1000 ciclos
de replicacin bacteriana, o ~10"6 por gen por ge-
neracin.
Se pueden dividir los errores que la polimera-
sa de DNA comete durante la replicacin en dos
clases:
.
Los cambios del marco de lectura ocurren
cuando un nucletido extra es insertado u
omitido. La fidelidad con respecto al cambio
del marco de lectura se altera con la proce-
sividad de la enzima: la tendencia a perma-
necer en un solo molde en vez de disociarse
y reasociarse. Esto es en particular impor-
tante para la replicacin de un fragmento
homopolimrico (p. ej., una secuencia larga
de dT
n
:dA
n
,
en la cual "el deslizamiento de
la replicacin" puede cambiar la longitud
del segmento homopolimrico. Como regla
general, un incremento de la procesividad
reduce la probabilidad de tales episodios.
En las polimerasas de DNA multimricas, la
procesividad suele aumentar por una sub-
unidad particular que no es necesaria para
la actividad cataltica per se.
. Las sustituciones ocurren cuando se incor-
pora un nucletido equivocado (apareado
de manera errnea). El nivel de error lo de-
termina la eficiencia de la correccin, en
donde la enzima explora los pares de bases
que acaban de formarse y elimina el nucle-
tido si est apareado de forma errnea.
Todas las enzimas bacterianas poseen activi-
dad exonucleoltica 3'-5' que procede en direccin
inversa a la sntesis de DNA. Esto proporciona la
432 CAPTULO 18 Replicacin del DNA
funcin de correccin ilustrada en el esquema de
la FIGURA 18.6. En el paso de la elongacin de la ca-
dena, un nucletido precursor entra en la posicin
localizada al final de la cadena creciente. Se forma
un enlace. La enzima se desplaza un par de bases y
entonces est lista para que entre el siguiente nu-
cletido precursor. No obstante, si ocurre un error
la enzima utiliza la actividad exonucleoltica para
escindir la ltima base que fue agregada.
Diferentes polimerasas de DNA manejan la re-
lacin entre las actividades de polimerizacin y de
correccin de distintas maneras. En algunos casos
las actividades son parte de la misma subunidad,
pero en otros estn contenidas en diferentes sub-
unidades. Cada polimerasa de DNA tiene una tasa
de error caracterstica que se reduce por su acti-
vidad correctora. La correccin suele disminuir la
tasa de error de la replicacin de -lO-5 a ~ lO 7 por
par de bases replicado. Los sistemas que reconocen
los errores y los corrigen despus de la replicacin
eliminan entonces algunos de los errores y llevan la
tasa global a <f O-9 por par de bases replicado (vase
la seccin 20.7, Control de la direccin de la repa-
racin de apareamientos errneos).
La actividad replicasa de la polimerasa de DNA
III se descubri en un principio por una mutacin
letal del locus dnaE, que codifica la subunidad a
de 130 kD que posee la actividad sintetizadora de
DNA. La actividad de correccin exonucleoltica
3
'
-
5
'
se encuentra en otra subunidad, e, codificada
por dnaQ. La funcin bsica de la subunidad e en
el control de la fidelidad in vivo se demuestra por el
efecto de las mutaciones en dnaQ. La frecuencia con
la que las mutaciones ocurren en la cepa bacteriana
se incrementa >103 veces.
Las polimerasas de DNA tienen
una estructura comn
Conceptos principales
Muchas polimerasas de DNA tienen una gran hendidura
compuesta por tres dominios que se asemejan a una
mano.
El DNA yace en la "palma de la mano", en un surco
creado por los
"
dedos" y el "pulgar".
La FIGURA ,7 muestra que todas las polimerasas de
DNA comparten algunos rasgos estructurales comu-
nes. La estructura de la enzima puede dividirse en
varios dominios independientes, los cuales se descri-
ben por la analoga con una mano derecha humana.
El DNA se une a una extensa hendidura compuesta
por tres dominios. El dominio de la
"
palma
"
tiene
importantes elementos de secuencias conservadas,
Las polimerasas de DNA tienen actividad
de exonucleasa
La enzima agrega una base a la cadena
creciente
5' oh 3
JJjjJiii
3
'
5' . - oh 3
'
3
' 11
La enzima se desplaza si la base nueva es
correcta
mu
OH 3
'
La base es hidrolizada y expulsada si es
incorrecta
OH 3
'
JJiJiil
FIGURA 18.6 Las polimerasas de DNA bacterianas exploran el
par de bases en el extremo de la cadena creciente y escinden
el nucletido agregado en caso de un desajuste.
Las polimerasas de DNA tienen una estructura comn
Sitios activos
Dominio de
exonucleasa
Dominio
terminal N
Palma
FIGURA 18 La organizacin comn de las polimerasas de
DNA tiene una palma que contiene el sitio cataltico, un pulgar
que se une al DNA y que es importante en la procesividad, un
dominio de exonucleasa con su propio sitio activo y un dominio
terminal N.
secuencias que forman el sitio cataltico activo. Los
"
dedos" intervienen en la colocacin correcta del
molde en el sitio activo. El
"
pulgar
"
se une al DNA
a medida que sale de la enzima y es importante en
la procesividad. Las regiones conservadas ms im-
18.5 Las polimerasas de DNA tienen una estructura comn
433
La cadena molde es distorsionada
V
I
FIGURA 18. . La estructura cristalina de la polimerasa de DNA
del fago T7 muestra que la cadena molde da un giro agudo que
la expone al nucletido entrante. Fotografa cortesa de Char-
les Richardson and Thomas Ellenberger, Washington University
School of Medicine.
portantes de cada uno de estos tres dominios con-
vergen para formar una superficie continua en el
sitio cataltico. La actividad exonucleasa reside en
un dominio independiente con su propio sitio cata-
ltico. El dominio terminal N se extiende dentro del
dominio de la nucleasa. Las polimerasas de DNA se
dividen en cinco familias con base en la homologa
de sus secuencias; la palma est bien conservada
entre ellas, pero el pulgar y los dedos ofrecen ele-
mentos anlogos de estructura secundaria de dife-
rentes secuencias.
La reaccin cataltica en una polimerasa de DNA
ocurre en un sitio activo en el cual un nucletido
trifosfatado se aparea con una cadena individual
de DNA (no apareada). El DNA yace a travs de la
palma de la mano en un surco creado por el pulgar
y los dedos. La FIGURA 18.8 muestra la estructura
cristalina de la enzima T7 formando un complejo
con el DNA (en la forma de un cebador asociado
a una cadena de molde) y un nucletido entrante
que est a punto de ser agregado al cebador. El DNA
se encuentra en la forma B dplex clsica hasta los
dos ltimos pares de bases en el extremo 3' del ce-
bador, las cuales se encuentran en la forma A ms
abierta. Una vuelta aguda en el DNA expone la base
molde al nucletido entrante. El extremo 3
'
del ce-
bador (al cual se agregan las bases) es anclado por
los dedos y por la palma. Al DNA lo mantienen en
su posicin los contactos que se forman sobre todo
con el esqueleto de fosfodisteres de la cadena (lo
que permite que la polimerasa funcione con DNA
de cualquier secuencia).
En las estructuras de las polimerasas de DNA de
esta familia que estn formando complejos slo con
el DNA (es decir, que carecen del nucletido entran-
te), la orientacin de los dedos y del pulgar en rela-
cin con la palma de la mano es ms abierta, con la
hlice O (O, 01, 02; vase la Figura 18.8) girada ha-
cia afuera de la palma. Esto sugiere que el giro hacia
adentro de la hlice O ocurre para capturar el nucle-
tido entrante y crear el sitio activo cataltico. Cuando
un nucletido se une, el dominio de los dedos gira
60hacia la palma de la mano y las puntas de los de-
dos se mueven 30 . El dominio del pulgar tambin
gira hacia la palma 8o. Estos cambios son cclicos: se
revierten cuando el nucletido es incorporado a la
cadena de DNA, la cual despus se transfiere a travs
de la enzima para recrear un sitio vaco.
La actividad exonucleasa se encarga de eliminar
las bases apareadas de manera errnea. No obstan-
te, el sitio cataltico del dominio de exonucleasa se
encuentra lejos del sitio activo del dominio cata-
ltico. La enzima alterna entre las modalidades de
polimerizacin y edicin, segn lo determine la
competencia entre los dos sitios activos por el extre-
mo cebador 3
'
del DNA. Los aminocidos en el sitio
activo entran en contacto con la base entrante de tal
manera que la estructura de la enzima es afectada
por una base apareada en forma errnea. Cuando
una base mal apareada ocupa el sitio cataltico, los
dedos no pueden girar hacia la palma. Esto deja el
extremo 3
'
libre para unirse al sitio activo en el do-
minio de exonucleasa, lo cual se logra por un giro
del DNA en la estructura de la enzima.
2 La sntesis de DNA
es semidiscontinua
Concepto principal
'
La replicasa del DNA avanza en forma continua
cuando sintetiza la cadena lder (en sentido 5-3
'
),
pero sintetiza la cadena retrasada al formar pequeos
fragmentos que se unen unos a otros despus.
La estructura antiparalela de las dos cadenas del
DNA dplex plantea un problema para la replica-
dn. A medida que la horquilla avanza, las cadenas
hijas deben ser sintetizadas en las dos cadenas indivi-
duales progenitoras expuestas. La horquilla se mue-
ve en direccin 5
'
-
3
'
en una cadena y en direccin
3-5
'
en la otra. No obstante, los cidos nucleicos se
sintetizan slo a partir de un extremo 5
'
hacia un
extremo 3
'
. El problema se resuelve con la sntesis de
la cadena que crece en general de 3'-5' en una serie
de pequeos fragmentos, cada uno de los cuales se
sintetiza en realidad en la direccin
"
opuesta
"
,
es
decir, con la polaridad convencional 5-3'.
Considrese la regin que se encuentra inmedia-
tamente detrs de la horquilla de replicacin, como
se ilustra en la FIGURA 18.9. Los sucesos se describen
434
CAPTULO 18 Replicacin del DNA
Las dos cadenas nuevas de DNA tienen caractersticas diferentes
Sntesis de la cadena lder
Nucletidos agregados de manera continua ai extremo 3'
3
'
5
'iliJ
3
'
[cun
5
'
n 11111 n
Cadena lder
T
5
'
.3
'
Fragmento anterior ltimo fragmento Cadena individual DNA progenitor
Sntesis de la cadena retrasada
FIGURA 18.9 La cadena lder se sintetiza de forma continua, mientras que
la cadena retrasada se sintetiza de manera discontinua.
en trminos de las propiedades diferentes de cada
una de las cadenas que acaban de sintetizarse:
.
En la cadena lder la sntesis de DNA pue-
de proceder en forma continua en direccin
5
'
-
3'
a medida que el dplex progenitor es
desenrollado.
.
En la cadena retrasada un fragmento de
cadena individual de DNA progenitor debe
ser expuesto y despus un segmento es sin-
tetizado en direccin inversa (en relacin
con el movimiento de la horquilla). Una
serie de estos fragmentos se sintetiza, cada
uno en direccin 5
'
-
3
'
; y despus son unidos
para crear una cadena retrasada intacta.
La replicacin discontinua puede ser rastreada
por el destino de una marca radioactiva muy bre-
ve. La etiqueta entra al DNA recin sintetizado en
forma de fragmentos cortos, que sedimentan en los
lmites de 7S a 11S, lo cual corresponde a una lon-
gitud de ~1 000 a 2 000 bases. Estos fragmentos
de Okazaki se encuentran en el DNA en proceso
de replicacin en las procariotas y en las eucariotas.
Despus de largos periodos de incubacin, la marca
entra a segmentos ms largos de DNA. La transicin
es resultado de la formacin de enlaces covalentes
entre los fragmentos de Okazaki.
La cadena retrasada debe ser sintetizada en forma
de fragmentos de Okazaki. Durante mucho tiempo
no quedaba claro si la cadena lder se sintetizaba de
la misma forma o de manera continua. Todo el DNA
recin sintetizado se encuentra como fragmentos
cortos en E. coli. Visto de un modo superficial, esto
sugiere que ambas cadenas se sintetizan de manera
discontinua. Sin embargo, resulta que no toda la
poblacin de los fragmentos representa fragmentos
de Okazaki autnticos, algunos son seudofragmen-
tos que han sido generados por rompimiento en una
cadena de DNA que de hecho fue sintetizada como
una cadena continua. La fuente de esta rotura es la
incorporacin de algunos uracilos dentro del DNA
en lugar de timina. Cuando el uracilo es elimina-
do por un sistema de reparacin, la cadena lder se
rompe hasta que una timina es insertada.
Por lo tanto, la cadena retrasada se sintetiza de
manera discontinua y la cadena lder se sintetiza
de forma continua. Esto se llama replicacin se-
midiscontinua.
TH1 EL modeLo cpX muestra cmo
se genera eL DNA de cadena
individual para La replicacin
Conceptos principales
.
La replicacin requiere que una helicasa separe las
cadenas de DNA con energa que proviene de la
hidrlisis de ATP.
.
Una protena de unin a la cadena individual es
necesaria para mantener las cadenas separadas.
.
La combinacin de helicasa, SSB y protena A separa
un dplex de (pX174 en un crculo de cadena individual
y una cadena individual lineal.
A medida que avanza la horquilla de replicacin,
desenrolla el DNA dplex. Una de las cadenas mol-
de es convertida de inmediato en DNA dplex a
medida que la cadena lder hija es sintetizada. La
otra permanece en forma individual hasta que se
ha expuesto la longitud suficiente para iniciar la
sntesis de un fragmento de Okazaki de la cadena
retrasada en la direccin contraria. Por lo tanto, la
generacin y el mantenimiento de un DNA de cade-
na individual es un aspecto crucial de la replicacin.
Se requieren dos tipos de fundn para convertir el
DNA de doble cadena en cadenas individuales:
.
Una helicasa es una enzima que separa las
cadenas de DNA y que por lo general utiliza
la hidrlisis del ATP para proporcionar la
energa necesaria.
.
Una protena de unin a la cadena indi-
vidual (SSB, single-strand binding protein) se
18.7 El modelo cpX muestra cmo se genera el DNA de cadena individual para la replicacin
435
Las helcasas utilizan la hidrlisis de
P para desenrollar e
La helicasa
rodea una
sola cadena
La helicasa se
une al DNA
dplex
Los pares de
bases se
separan; la
helicasa libera
al dplex
ATP AOP
\
FIGURA 18.10 Una helicasa hexamrica se desplaza a lo largo
de una cadena de DNA. Es probable que cambie de conforma-
cin cuando se une al dplex, utilice hidrlisis de ATP para
separar las cadenas y despus regrese a la conformacin que
tena cuando estaba unida slo a una cadena individual.
une al DNA de cadena individual e impide
que se vuelva a formar el dplex. La SSB se
une como un monmero, pero por lo ge-
neral de una forma colaboradora en la cual
la unin de otros monmeros al complejo
existente se incrementa.
Las helicasas separan las cadenas de un cido
nucleico dplex en una variedad de situaciones, que
oscilan desde la separacin de las cadenas en el sitio
de crecimiento de una horquilla de replicacin hasta
la catlisis de la migracin de las uniones HoUiday
(de recombinadn) a lo largo del DNA. Hay 12 heli-
casas diferentes en E. coli. Una helicasa casi siempre
es multimerica. Una forma comn de helicasa es un
hexmero. ste por lo general se transfiere a lo largo
del DNA utilizando su estructura multimrica para
proporcionar mltiples sitios de unin al DNA.
La FIGURA 18.10 muestra un modelo esquemti-
co generalizado para la accin de una helicasa hexa-
mrica. Es probable que tenga una conformacin
que se una al DNA dplex y otra que se una al DNA
de cadena individual. La alternancia entre ellas con-
duce el motor que disgrega al dplex y requiere la
hidrlisis de ATP; en general se hidroliza un ATP por
cada par de bases que es desenrollado. Una helicasa
suele iniciar el desenrollamiento en una regin de
cadena individual adyacente a un dplex. Puede
funcionar con una polaridad particular y prefiere el
DNA de cadena individual con un extremo 3' (heli-
casa 3
'
-
5
'
) o con un extremo 5' (helicasa 5'-3').
La conversin del DNA de doble cadena (pX174
en cadenas individuales ilustra las caractersticas
del proceso de separacin de cadenas. La 'GURA
8.
11 muestra que una cadena individual es des-
pegada de la cadena circular, semejante al modelo
del crculo rodante descrito antes en la Figura 16.6.
Tres protenas desenrollan el DNA i(>Xl74
Cadena.
Protena A
3
'
-OH
Protena Rep
Protena SSB
FIGURA 18.11 El DNA (pX174 puede separarse en cadenas in-
dividuales por los efectos combinados de tres funciones: for-
macin de hendidura con una protena A, desenrollamiento por
Rep y estabilizacin de la cadena individual por SSB.
La reaccin puede ocurrir en ausencia de la sntesis
de DNA cuando las tres protenas apropiadas son
provistas in vitro.
La protena A fgica mella la cadena viral (+) en
el origen de replicacin. En la presencia de dos pro-
tenas hospedadoras (Rep y SSB) y de ATP, el DNA
mellado se desenrolla. La protena Rep proporciona
una helicasa que separa las cadenas; la SSB las atra-
pa en forma de cadena individual. La SSB de E. coli es
un tetrmero de 74 kD que se une en colaboracin
al DNA de cadena individual,
La importancia de la forma colaboradora de
unin es que la unin de una molcula protenica
hace mucho ms fcil la unin de otra. Entonces,
una vez que ha empezado la reaccin de unin en
una molcula de DNA particular, se extiende con
rapidez hasta que todo el DNA de cadena individual
est cubierto por la protena SSB. Ntese que esta
protena no es una protena que desenrolla el DNA;
su funcin es estabilizar el DNA que ya se encuentra
en forma de cadena individual.
436 CAPTULO 18 Replicacin del DNA
En circunstancias normales in vivo, las reaccio-
nes de desenrollamiento, recubrimiento y replica-
cin proceden en tndem. La SSB se une al DNA
a medida que avanza la horquilla de replicacin,
manteniendo las dos cadenas progenitoras separa-
das para que se encuentren en la condicin apro-
piada para actuar como moldes. La SSB se necesi-
ta en cantidades estequiomtricas en la horquilla
de replicacin. Se requiere en ms de una etapa de
la replicacin; los mutantes ssb tienen un fenotipo
de detencin rpida y son defectuosos en la repara-
cin, en la recombinacin y en la replicacin (algunos
fagos usan diferentes protenas SSB, sobre todo Ti-
esto demuestra que pueden existir interacciones es-
pecficas entre los componentes del mecanismo de re-
plicacin y las SSB, vase la seccin 18.14, El fago T4
proporciona su propio mecanismo de replicacin).
fffl La actividad cebadora
es necesaria para iniciar
La sntesis de DNA
Conceptos principal
.
Todas Las poLimerasas de DNA requieren un extremo
cebador 3-OH para iniciar la sntesis de DNA.
.
EL extremo cebador puede ser proporcionado por un
cebador de RNA, por una hendidura en el DNA o por
una protena cebadora.
.
Para la replicacin del DNA, una polimerasa de RNA
especial Llamada primasa sintetiza una cadena de RNA
que proporciona el extremo cebador.
.
f. coli tiene dos tipos de reacciones cebadoras, las
cuales ocurren en el origen bacteriano {orC) y en el
origen (pX174.
.
La actividad cebadora de la replicacin en el DNA de
doble cadena siempre requiere una replicasa, una SSB,
y una primasa.
.
DnaB es la replicasa que desenrolla el DNA para la
replicacin en E. coli.
Una caracterstica comn en todas las polimerasas
de DNA es que no pueden iniciar la sntesis de una
cadena de DNA de novo. La I6URA 18 muestra las
caractersticas necesarias para la iniciacin. La sn-
tesis de la cadena nueva puede iniciar slo desde un
extremo 3
'
-
OH preexistente y la cadena molde debe
ser convertida en una cadena individual.
El extremo 3'-OH se denomina cebador. ste
puede adoptar varias formas. Los tipos de reacciones
de cebamiento se resumen en la FIGURA 18.13:
.
Una secuencia de RNA se sintetiza en el
molde, de modo que el extremo 3
'
-
OH li-
bre de la cadena de RNA se extiende por la
Un extremo 3 -OH es necesario para el cebamiento
5
'
3
'
<
Extremo cebador
3'-OH
'"'lilil
5
'
Molde de cadena individual
FIGURA 18.12 Una polimerasa de DNA requiere un extremo
3
'
-
0H para iniciar la replicacin.
Las polimerasas de DNA no pueden iniciar la sntesis de
DNA en molculas de DNA dplex o de cadena individual
sin un cebador /
"
mimiimnmni
5 itiiinmimimiii3
,
5
'
3
'
El cebador de RNA es sintetizado
(o proporcionado por apareamiento de bases)
r wi
.
RNA --DNA
"""inni
i
5
'
El DNA dplex es mellado para proporcionar un
extremo libre para la polimerasa de DNA
Hendidura \
5' FP Wi wmrm 3'
3
'
5
'
Mi
fTTTTTm
mi!f'o.)Trm
5
'
3
'
5
'
Un nucletido cebador es proporcionado por una
protena que se une al DNA
nnmnimni..
Hay muchos mtodos que proporcionan el ex-
tremo 3-OH que necesita La polimerasa de DNA para iniciar la
sntesis de DNA.
polimerasa de DNA. Esto suele utilizarse en
la replicacin del DNA celular y por algunos
virus (vase la Figura 17.18 de la seccin
18.8 La actividad cebadora es necesaria para iniciar la sntesis de DNA 437
17.11, El sistema de compatibilidad ColEl
es controlado por un regulador de RNA).
Un RNA preformado se aparea con el molde,
lo que permite que su extremo 3'-OH sirva
para cebar la sntesis de DNA. Este mecanis-
mo es usado por los retrovirus para cebar
la transcripcin inversa del RNA (vase la
Figura 22.6 en la seccin 22.4, El DNA viral
se genera por transcripcin inversa).
Un extremo cebador se genera dentro del
DNA dplex. El mecanismo ms comn es
la introduccin de una hendidura, utilizada
para iniciar la replicacin del crculo rodante
(vase la Figura 16.5). En este caso, la cade-
na preexistente es desplazada por la nueva
sntesis. (Ntese la diferencia con respecto al
desplazamiento de hendidura que se mues-
tra en la Figura 18.5, en el cual la polimerasa
de DNA I de manera simultnea sintetiza y
degrada DNA desde una hendidura).
Una protena ceba la reaccin en forma direc-
ta al presentar un nucletido a la polimerasa
SSB y primasa
Helicasa DnaB 5'-3' helicasa (5'-3')
ADP
SSB protena de unin a la cadena individual
(-60/horquilla)
PriA (slo (fX)
reconoce el sitio de ensamblaje del primosoma
y desplaza a la SSB
Primasa DnaG, sintetiza RNA
3
'
-
OH
La iniciacin requiere numerosas actividades
enzimticas, como helicasas, protenas de unin a la cadena
individual y la sntesis del cebador.
de DNA. Esta reaccin es utilizada por cier-
tos virus. (Vase la Figura 16.4 en la seccin
16.2
, Los extremos del DNA lineal represen-
tan un problema para la replicacin.)
La actividad cebadora es indispensable para pro-
porcionar extremos 3
'
-
OH que inicien la sntesis de
las cadenas de DNA en la cadena lder y en la ca-
dena retrasada. La cadena lder requiere slo uno
de estos episodios de iniciacin, el cual ocurre en el
origen. No obstante, debe haber una serie de suce-
sos de iniciacin en la cadena retrasada porque cada
fragmento de Okazaki requiere su propio inicio de
novo. Cada fragmento de Okazaki empieza con una
secuencia cebadora de RNA de -10 bases de largo
que proporciona el extremo 3
'
-
OH para la exten-
sin mediada por la polimerasa de DNA.
Se requiere una primasa para catalizar la re-
accin cebadora. La proporciona una actividad es-
pecial de polimerasa de RNA, el producto del gen
dnaG. La enzima es un polipptido individual de
60 kD (mucho ms pequeo que la polimerasa
de RNA). La primasa es una polimerasa de RNA que
se utiliza slo en circunstancias especficas, es decir,
para sintetizar fragmentos cortos de RNA que sirven
de cebadores para la sntesis de DNA. La primasa
DnaG se asocia en forma transitoria al complejo de
replicacin y en general sintetiza un cebador de 11 o
de 12 bases. Los cebadores comienzan con la secuen-
cia pppAG colocada al lado contrario de la secuencia
3
'
-
GTC-5' en el molde.
Algunos sistemas utilizan elementos alternati-
vos a la primasa de DnaG. En los ejemplos de los
dos fagos MI3 y G4, los cuales se utilizaron en
los primeros trabajos sobre la replicacin, surgi
una diferencia interesante. El cebamiento en G4 usa
DnaG, en tanto que el cebamiento en MI 3 utiliza
polimerasa de RNA bacteriana. Estos fagos tienen
otra caracterstica poco comn: el sitio de ceba-
miento est indicado por una regin de estructura
secundaria.
Existen dos tipos de reacciones de cebamiento
en E. coli:
.
El sistema oriC, llamado as por el origen
bacteriano, comprende en trminos gene-
rales la asociacin de la primasa DnaG con
el complejo protenico en la horquilla de
replicacin.
.
El sistema (pX, nombrado as por el fago
cpX174, requiere un complejo de iniciacin
formado por componentes adicionales, lla-
mado primosoma (vase la seccin 18.17,
El primosoma es necesario para reiniciar la
replicacin).
En ocasiones se dice que los replicones son de
tipo cpX o de tipo oriC.
438
CAPTULO 18 Replicacin del DNA
Los tipos de actividades comprendidas en la re-
accin de iniciacin se resumen en la FIGURA 18.14.
Aunque otros replicones en E. coli pueden tener
alternativas para algunas de estas protenas parti-
culares, se necesitan los mismos tipos generales de
actividad en cada caso. Una helicasa es indispensa-
ble para generar cadenas individuales, una protena
de unin a la cadena individual es necesaria para
mantener el estado de cadena individual y la prima-
sa sintetiza el cebador de RNA.
DnaB es el componente central en los replico-
nes cpX y oriC. Proporciona la actividad de helicasa
5
'
-
3
'
que desenrolla el DNA. La energa requerida
la suministra la rotura del ATP. Bsicamente, DnaB
es el componente activo del punto de crecimiento.
En los replicones oriC, DnaB es en un inicio cargado
al origen como parte de un gran complejo (vase la
seccin 18.15, Creacin de las horquillas de replica-
cin en el origen). Forma el punto de crecimiento
en el cual las cadenas de DNA se separan a medida
que avanza la horquilla de replicacin. Es parte del
complejo de la polimerasa de DNA e interacta con
la primasa de DnaG para iniciar la sntesis de cada
fragmento de Okazaki en la cadena retrasada.
| La hoLoenzima poLimerasa de
DNA tiene tres subcompLejos
Conceptos principales
La replicasa de f. coli poLimerasa de DNA III es un
complejo de 900 kD con una estructura dimrica.
Cada unidad monomrica tiene un ncleo cataltico,
una subunidad de dimerizacin y un componente de
procesividad.
Un cargador de pinza coloca las subunidades de
procesividad en el DNA, en donde forman una pinza
circular alrededor del cido nucleico.
Un ncleo cataltico est asociado a cada una de las
cadenas de molde,
Ahora se puede relacionar la estructura de la sub-
unidad de la polimerasa de DNA III de E. coli con
las actividades requeridas para la sntesis de DNA y
proponer un modelo para su accin. La holoenzima
es un complejo de 900 kD que contiene 10 protenas
organizadas en cuatro tipos de subcomplejos:
.
Existen dos copias del ncleo cataltico.
Cada ncleo cataltico contiene la subuni-
dad a (la actividad de polimerasa de DNA),
la subunidad e (la exonucleasa de correccin
3
'
-
5
'
) y la subunidad 9 (la cual estimula a la
exonucleasa).
.
Hay dos copias de la subunidad de dimeri-
zacin, t, que unen a los dos ncleos cata-
lticos.
.
Hay dos copias de la pinza, que se encarga
de mantener los ncleos catalticos sobre sus
cadenas molde. Cada pinza est formada por
un homodmero de las subunidades [3 que
se unen alrededor del DNA y garantiza la
procesividad.
.
El complejo y es un grupo de cinco prote-
nas que forman el cargador de pinza; ste
coloca la pinza en el DNA.
En la FIGURA 18.15 se muestra un modelo para el
ensamble de la polimerasa de DNA III. La holoenzi-
ma se ensambla en el DNA en tres etapas:
.
Primero el cargador de pinza usa la hidr-
lisis del ATP para unir las subunidades (3 al
complejo molde-cebador.
. La unin al DNA cambia la conformacin
del sitio en (3 que se une al cargador de pin-
za, y como resultado ahora tiene mayor afi-
nidad por el ncleo de la polimerasa. Esto
permite al ncleo de la polimerasa unirse y
ste es el medio por el cual el ncleo de la
polimerasa es llevado al DNA.
Un dmero sintetiza la cadena retrasada
y la cadena lder
El cargador de pinza rompe ATP para cargar el DNA
con la pinza
r*
'
i
Cargador de pinza-
Pinza
ATP- ADP + P
3 P - 'p*
La enzima central se une
r
Enzima central-
tau + segundo ncleo se une para formar un dmero
simtrico
Sntesis de la Sntesis de la
cadena lder -,,, 7 cadena retrasada
--
Las subunidades t
mantienen la
estructura aimrica
FIGURA 18.15 La holoenzima polimerasa de DNA III se ensam-
bla en etapas y genera un complejo enzimtico que sintetiza
el DNA de las dos cadenas nuevas.
18.9' La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos
439
.
Un dmero x se une al ncleo de la poli-
merasa y proporciona una fundn de di-
merizacin que une un segundo ncleo
de polimerasa (asociado a otra pinza (3). La
holoenzima es asimtrica porque slo tiene
un cargador de pinza. ste se encarga de
agregar un par de dmeros [3 a cada cadena
progenitora de DNA.
Cada uno de los complejos nucleares de la holo-
enzima sintetiza una de las cadenas nuevas de DNA.
El cargador de pinza es tambin necesario para des-
cargar el complejo P del DNA; como resultado, los
dos ncleos tienen diferentes habilidades para di-
sociarse del DNA. Esto corresponde a la necesidad
de sintetizar una cadena lder continua (en donde
la polimerasa permanece asociada al molde) y una
cadena retrasada discontinua (en donde la polime-
rasa se disocia y reasocia de manera repetida). El
cargador de pinza est asociado al ncleo de la po-
limerasa que sintetiza la cadena retrasada y tiene
una funcin clave en la capacidad para sintetizar
fragmentos de Okazaki individuales.
La pinza controla La asociacin
de La enzima centraL
con eL DNA
Conceptos principales
.
El ncleo en la cadena lder es procesivo debido a que
su pinza lo mantiene en el DNA.
La pinza asociada al ncleo en la cadena retrasada
se disocia al final de cada fragmento de Okazaki y se
ensambla de nuevo para el siguiente fragmento.
.
La helicasa DnaB se encarga de interactuar con la
primasa DnaG para iniciar cada fragmento de Okazaki.
El dmero p hace a la holoenzima altamente proce-
siva. La subunidad P est unida con fuerza al DNA,
pero se puede deslizar a lo largo de una molcula
dplex. La estructura cristalina de P muestra que
crea un dmero en forma de anillo. El modelo que
se muestra en la f muestra el anillo P
en relacin con una doble hlice de DNA. El anillo
tiene un dimetro externo de 80 y una cavidad
interna de 35 , casi el doble del dimetro de la do-
ble hlice de DNA (20 ). El espacio entre el anillo
protenico y el DNA se llena de agua. Cada una de
las subunidades p tiene tres dominios globulares con
una organizacin similar (aunque sus secuencias
son diferentes). Como resultado, el dmero tiene
una simetra sxtuple que se refleja en 12 hlices a
que se alinean en el interior del anillo.
El dmero rodea el dplex y da origen a la
"
pinza deslizante
"
que le permite a la holoenzima
;
FIGURA 18.16 La subunidad (3 de la holoenzima polimerasa
de DNA III est formada por un dmero, en donde la cabeza de
un monmero se une a la cola del otro (las dos subunidades
se muestran en color rojo y en color naranja), que forma un
anillo que rodea por completo a un DNA dplex (se ilustra en
el centro). Reimpresin de Ce//, vol. 59, Kong, X. P., et al.,
pp. 425-437. Copyright 1992, con autorizacin de Elsevier.
Fotografas cortesa de John Kuriyan, University of California,
Berkeley.
deslizarse por el DNA. La estructura explica la alta
procesividad, no hay manera de que la enzima se
desprenda. Las hlices a localizadas en el interior
tienen algunas cargas positivas que pueden interac-
tuar con el DNA a travs de las molculas de agua
intermediarias. La pinza protenica no hace contacto
directo con el DNA, por lo que puede "patinar" por
el DNA, formando y rompiendo contactos por me-
dio de las molculas de agua.
De qu forma aborda la pinza al DNA? La
pinza es un crculo de subunidades que rodea al
DNA; por lo tanto, su ensamblaje o eliminacin re-
quiere un proceso dependiente de energa por par-
te del cargador de pinza. El cargador de pinza j es
una estructura pentamrica circular que se une a una
forma abierta del anillo P inductor para cargarlo al
DNA. En efecto, el anillo es abierto en una de las in-
terfases entre las dos subunidades P por medio de la
subunidad 6 del cargador de pinza. ste se une en
la parte superior de una pinza circular cerrada, con
su sitio de ATPasa yuxtapuesto a la pinza, y utiliza
la hidrlisis de ATP para proporcionar la energa
440 CAPTULO 18 Replicacin del DNA
necesaria para abrir el anillo de la pinza e inserta
DNA dentro de la cavidad central.
La relacin entre la pinza |3 y el cargador de pin-
za y es un paradigma para sistemas similares utili-
zados por las replicasas de DNA que van desde los
bacterifagos hasta las clulas animales. La pinza es
un hetermero (o puede ser un dmero o un trme-
ro) que forma un anillo alrededor del DNA con un
conjunto de 12 hlices a que forman una simetra
sxtuple para la estructura en su conjunto. El carga-
dor de pinza tiene algunas subunidades que hidroli-
zan ATP para proporcionar energa a la reaccin.
El principio bsico que establece el modelo de
la polimerasa dimrica afirma que, mientras una
subunidad de polimerasa sintetiza la cadena lder de
manera continua, la otra inicia y termina en forma
cclica los fragmentos de Okazaki de la cadena retra-
sada dentro de un lazo extenso de cadena individual
formado por su cadena de molde. La FIGURA 18.17
muestra un modelo genrico de la operacin de tal
replicasa. La horquilla de replicacin es creada por
una helicasa (la cual forma por lo general un anillo
hexamrico) que transfiere en direccin 5'-3' en
un molde para la cadena retrasada. La helicasa se
conecta a dos subunidades catalticas de polimerasas
de DNA, cada una de las cuales est asociada a una
pinza deslizante.
Se puede describir este modelo de la polimerasa
de DNA III en trminos de los componentes indivi-
duales del complejo enzimtico, como se ilustra en
la FIGURA 18.18. Un ncleo cataltico est asociado
a cada cadena molde del DNA. La holoenzima se
desplaza de manera continua por el molde para la
cadena lder; el molde para la cadena retrasada es
"
empujado
"
, lo que crea un lazo en el DNA. DnaB
crea el punto de desenrollamiento y se transfiere a
lo largo del DNA hada "adelante".
DnaB entra en contacto conla(s) subumdad(es)
x del cargador de pinza. Esto establece una conexin
directa entre el complejo helicasa-primasa y los n-
cleos catalticos. Esta unin tiene dos efectos. Uno es
que incrementa la velocidad de la sntesis de DNA
al aumentar 10 veces la velocidad del movimiento
del ncleo de la polimerasa de DNA. El segundo es
que impide que la polimerasa de la cadena lder se
desprenda, es decir, incrementa su procesividad.
La sntesis de la cadena lder crea un lazo de
DNA de cadena individual que proporciona el molde
para la sntesis de la cadena retrasada, y este lazo se
agranda a medida que el punto de desenrollamiento
avanza. Despus de la iniciacin de un fragmento de
Okazaki el complejo nuclear de la cadena retrasada
jala el molde de cadena individual a travs de la pin-
za p mientras sintetiza la cadena nueva. El molde de
cadena individual se debe extender a todo lo largo
de al menos un fragmento de Okazaki antes de que
la polimerasa retrasada complete un fragmento y
est lista para empezar el siguiente.
Qu pasa cuando el fragmento de Okazaki se
completa? Todos los componentes del mecanismo
de replicacin funcionan de manera procesiva (es
decir, permanecen asociados al DNA), excepto por
la primasa y por la pinza (3. La FIGURA 18. l muestra
que se disocian cuando la sntesis de cada fragmento
concluye y se libera el lazo. Una pinza [3 nueva es
entonces reclutada por el cargador de pinza para
iniciar el prximo fragmento de Okazaki. La poli-
merasa de la cadena retrasada se transfiere de una
pinza p a la siguiente en cada ciclo, sin disociarse del
complejo de replicacin.
Qu se encarga de reconocer los sitios para ini-
ciar la sntesis de los fragmentos de Okazaki? En los
replicones oriC, la conexin entre el cebamiento y
la horquilla de replicacin la proporcionan las pro-
piedades dobles del producto DnaB: es la helicasa
que propulsa la horquilla de replicacin e interacta
con la primasa DnaG en un sitio apropiado. Despus
de la sntesis del cebador, se libera la primasa. La
longitud del RNA cebador es de apenas unas ocho
a 14 bases. Al parecer, la polimerasa de DNA III se
encarga del desplazamiento de la primasa.
Las replicasas de DNA tienen un conjunto comn de funciones
Fragmento de Okazaki previo
La helicasa
desenrolla
el DNA
conector une
a helicasa a
dos unidades de
polimerasa
Subunidades
catalticas de la
polimerasa de DNA
La pinza deslizante
rodea al DNA
Sitio de
niciacin
Fragmento para el
de Okazaki siguiente
actual fragmento
de Okazaki/
5' 3
'
V
3'5'
Las puntas
de las flechas
indican el
extremo 3
'
Cargador
de pinza
Primasa
FIGURA 18.17 La helicasa en proceso de formacin de la horquilla de
replicacin est conectada a dos subunidades catalticas de la polime-
rasa de DNA, cada una de las cuales es mantenida en el DNA por una
pinza deslizante. La polimerasa que sintetiza la cadena lder se desplaza
de forma continua. La polimerasa que sintetiza la cadena retrasada se
disocia al final de un fragmento de Okazaki y despus se reasocia con
un cebador ubicado en el lazo molde de cadena individual para sintetizar
el siguiente fragmento.
18.10 La pinza controla la asociacin de la enzima central con el DNA
441
Las cadenas lder y retrasada se coordinan

DnaB
Pnmasa
bn a
t
Pol III a
Pol III a
Cadena hder
a
SSB
I
3' 5
Extremo 5' del
fragmento de
Okazaki anterior
3' 5' 3' 5'
FIGURA 18.18 Cada ncleo cataltico de Pol III sintetiza una
cadena hija. DnaB se encarga del movimiento hacia adelante
en La horquilla de replicacin.
TWI Coordinacin de la sntesis
de La cadena Lder
y de La cadena retrasada
Conceptos principales
.
Se requieren diferentes unidades enzimticas para
sintetizar las cadenas Lderes y retrasadas.
.
En E. coli, ambas unidades contienen la misma
subunidad cataltica (DnaE).
.
En otros organismos pueden necesitarse diferentes
subunidades catalticas para cada cadena.
Cada cadena de DNA nueva es sintetizada por una
unidad cataltica individual. La GURA 18.muestra
que el comportamiento de estas dos unidades es
diferente porque las nuevas cadenas de DNA estn
creciendo en direcciones contrarias. Una unidad
enzimtica se desplaza con el punto de desenrolla-
miento y sintetiza la cadena lder en forma conti-
nua. La otra unidad se mueve hacia
"
atrs
"
en rela-
cin con el DNA, a lo largo de la cadena individual
expuesta. Slo segmentos cortos de molde estn
expuestos en un momento dado. Cuando la sn-
tesis de un fragmento de Okazaki ha concluido, es
necesario que la sntesis del siguiente fragmento de
Okazaki comience en una nueva localizacin ms
o menos en la vecindad del punto de crecimiento
de la cadena lder. Esto requiere una translocacin
relativa al DNA de la unidad enzimtica que est
sintetizando la cadena retrasada.
Con el trmino "unidad enzimtica" se evita el
problema de si la polimerasa de DNA que sintetiza
la cadena lder es el mismo tipo de enzima que la
polimerasa de DNA que sintetiza la cadena retrasa-
da. En el caso mejor conocido, E. coli, existe un solo
tipo de subunidad cataltica de polimerasa de DNA
usada en la replicacin, la protena DnaE. La repli-
casa activa es un dmero y cada mitad del dmero
contiene DnaE como subunidad cataltica. La DnaE
recibe el apoyo de otras protenas (que difieren en-
tre las cadenas lder y retrasada).
Sin embargo, el uso de un solo tipo de sub-
unidad cataltica puede ser atpico. En la bacteria
Bacillus subtilis hay dos subunidades catalticas dife-
rentes. PolC es la homologa de DnaE de E. coli y se
encarga de la sntesis de la cadena lder. Una pro-
tena relacionada, DnaE
BS,
es la subunidad cataltica
que sintetiza la cadena retrasada. Las polimerasas de
DNA eucariticas tienen la misma estructura gene-
ral, y diferentes unidades enzimticas sintetizan las
cadenas lder y retrasada, pero no se sabe con cer-
teza si se utilizan los mismos tipos, o tipos distintos,
de subunidades catalticas (vase la seccin 18.13,
Polimerasas de DNA eucariticas independientes
realizan la iniciacin y la elongacin).
Un problema importante del modo discontinuo
de replicacin surge del uso de diferentes unidades
enzimticas para sintetizar cada cadena de DNA
nueva: cmo se coordina la sntesis de la cadena
retrasada con la sntesis de la cadena lder? A medida
que el replisoma se desplaza por la cadena de DNA
y desenrolla las cadenas progenitoras, una unidad
enzimtica extiende la cadena lder. De manera pe-
ridica, la actividad primosoma inicia un fragmento
de Okazaki en la cadena retrasada y la otra unidad
enzimtica debe, entonces, moverse en la direccin
contraria para sintetizar el DNA. La FIGURA 18.21
propone dos tipos de modelos para lo que le sucede
a esta unidad enzimtica cuando completa la snte-
sis de un fragmento de Okazaki. El mismo complejo
puede reutilizarse para la sntesis de fragmentos de
Okazaki sucesivos. Otra posibilidad es que el com-
plejo podra disociarse del molde, por lo que tendra
que ensamblarse un nuevo complejo para alargar
el siguiente fragmento de Okazaki. En la seccin
18.10, La pinza controla la asociacin de la enzima
central con el DNA, se ve que es el primer modelo
el que se aplica.
CAPTULO 18 Replicacin del DNA
Los fragmentos de Okazaki
estn unidos por La Ligasa
El ncleo de la polimerasa y la pinza se reciclan
Conceptos principales
Cada fragmento de Okazaki inicia con un cebador y se
detiene antes del siguiente fragmento.
.
La poh'merasa de DNA I elimina ei cebador y lo
remplaza con DNA en una accin semejante al
desplazamiento de hendidura.
La Ligasa de DNA realiza el enlace que conecta el
extremo 3
'
de un fragmento de Okazaki al inicio 5' del
siguiente fragmento.
Ahora se conoce mejor lo que ocurre en la unin
de los fragmentos de Okazaki, como se ilustra en
la FIGURA 18.22. El orden completo de los sucesos es
incierto, pero debe involucrar la sntesis del cebador
de RNA, su extensin con el DNA, la eliminacin del
cebador de RNA, su sustitucin por un fragmento
de DNA y la unin covalente de los fragmentos de
Okazald adyacentes.
La figura indica que la sntesis de un fragmento
de Okazaki termina justo antes del inicio del ce-
bador de RNA del fragmento precedente. Cuando
el cebador es eliminado, se forma un espacio. Este
espacio se llena con la polimerasa de DNA I; los
mutantes polA no consiguen unir sus fragmentos
de Okazaki de manera apropiada. La actividad exo-
nucleasa 5
'
-
3'
elimina el cebador de RNA al tiempo
que lo remplaza con una secuencia de DNA exten-
dida desde el extremo 3'-OH del siguiente fragmen-
to de Okazaki. Esto equivale al desplazamiento de
hendidura, excepto que el DNA nuevo remplaza un
fragmento de RNA en vez de un tramo de DNA.
En los sistemas de los mamferos (en donde la
polimerasa de DNA no tiene una actividad exonu-
cleasa 5
'
-
3
'
), los fragmentos de Okazald se conec-
tan por un proceso de dos pasos. La sntesis de un
fragmento de Okazaki desplaza al cebador de RNA
del fragmento anterior en la forma de un "alern".
La FIGURA 18.23 muestra que la enzima FEN1 divide
la base del alern. En esta reaccin FEN1 funcio-
na como una endonucleasa, pero tambin es una
enzima con actividad de 5
'
-
3' exonucleasa. En las
reacciones de reparacin del DNA, FEN1 puede rea-
lizar la divisin cerca de un nucletido desplazado
y luego usar su actividad exonucleasa para eliminar
el material adyacente.
La imposibilidad de eliminar un alern con ra-
pidez puede tener consecuencias importantes en
regiones de secuencias repetidas. Las repeticiones
directas pueden ser desplazadas y alineadas en for-
ma incorrecta con el molde; las secuencias palindr-
micas pueden formar horquillas. Estas estructuras
pueden cambiar el nmero de repeticiones (vase
1. Inicio del fragmento
de Okazaki
2. Terminacin del
fragmento de Okazaki
DnaB
fB DhaG
PoJll a Pol Ill a
3
'
5
' \
5
'
4. La pinza (3 se asocia
3.
La pinza se disocia
Pinza B
3
'
5
'
3
'
5
'
3
'
5
'
FIGURA 18.19 El ncleo de La polimerasa y La pinza p se
disocian cuando concluye La sntesis del fragmento de Okazaki
y se reasocian al inicio.
Unidades enzimticas independientes sintetizan
las cadenas retrasada y lder
La enzima lder realiza la elongacin de manera continua
.
i i i
La enzima retrasada comienza fragmentos nuevos
lllllillill
FIGURA 18.20 Las poLimerasas de La cadena Lder y de La cadena
retrasada se mueven de manera independiente.
la Figura 6.28). La importancia general de FEN1
radica en que impide que los alerones del DNA ge-
neren estructuras que pueden provocar deleciones
o duplicaciones del genoma.
Una vez que el RNA ha sido retirado y rem-
plazado, los fragmentos de Okazald cercanos deben
unirse. El extremo 3
'
-
OH de un fragmento es adya-
cente al extremo 5
'
-
fosfato del fragmento anterior,
La responsabilidad de sellar esta hendidura recae
en la enzima ligasa de DNA. Las ligasas estn pre-
sentes en las procariotas y en las eucariotas. En los
mutantes lig" persisten los fragmentos desconecta-
dos porque son incapaces de unir los fragmentos
de Okazald.
Las ligasas de E. coli y de T4 comparten la pro-
piedad de poder sellar las hendiduras que tienen
18.12 Los fragmentos de Okazaki estn unidos por La ligasa
443
Recircula la polime
dena retrasada?
La misma subuniciad cataltica es reutilizada
imiiiiiiimiiiiiiiiimt
iiiin
'
nr'iii
1
7
Se u'.'Vza una subunidac' catL'"'3a c'" trente
FIGURA 18.21 El modelo para la accin de la polimerasa de
la cadena retrasada, que aparece en la parte superior de la
figura, muestra que cuando una unidad enzimtica completa un
fragmento de Okazaki, se desplaza a una posicin nueva para
sintetizar el siguiente fragmento. El modelo inferior muestra
que la poLimerasa de La cadena retrasada se disocia cuando
completa un fragmento de Okazaki y una nueva unidad enzi-
mtica se asocia al DNA para sintetizar el siguiente fragmento
de Okazaki.
extremos 3
'
-
OH y 5'-fosfato, como se muestra en
la FIGURA 18.24. Ambas enzimas emprenden una re-
accin de dos pasos en la que participa un complejo
AMP-enzima. (Las enzimas de E. coliy de T4 utilizan
cofactores diferentes. La enzima de E. coli utiliza el
NAD [nicotinamida adenina dinucletido] como
cofactor, en tanto que la enzima de T4 utiliza ATP.)
El AMP del complejo enzimtico se une al fosfato
5' d
e la hendidura y despus se forma un enlace
fosfodister con el grupo terminal 3'-OH de la hen-
didura, con lo que se libera la enzima y el AMP.
PoLimerasas de DNA eucari-
ticas independientes realizan
La iniciacin y La elongacin
Conceptos principales
Una horquilla de replicacin tiene un complejo formado
por polimerasa de DNA a/primasa y dos complejos de
polimerasa de DNA 6 o e,
EL complejo poLimerasa de DNA a/primasa inicia la
sntesis de las dos cadenas del DNA.
.
La polimerasa de DNA 5 alarga la cadena lder y una
segunda polimerasa de DNA 5, o polimerasa de DNA e,
alarga la cadena retrasada.
Las clulas eucariticas tienen un gran nmero de
polimerasas de DNA. stas pueden dividirse a gran-
des rasgos en aquellas indispensables para la repli-
cacin semiconservadora y aquellas que intervie-
nen en la sntesis de material para reparar el DNA
daado. La replicacin del DNA nuclear requiere
las polimerasas de DNA a, 5 y e. Las polimerasas de
DNA nuclear remanentes participan en la sntesis
de fragmentos nuevos de DNA para remplazar el
material daado. La FIGURA 18.25 muestra que todas
las replicasas nucleares son enzimas heterotetram-
ricas grandes. En cada caso, una de las subunidades
se encarga de la catlisis y las dems estn relaciona-
das con funciones auxiliares, como la actividad ce-
badora, la procesividad o la correccin. Todas estas
enzimas replican DNA con alta fidelidad, igual que
la enzima mitocondrial un poco menos compleja.
Las polimerasas reparadoras tienen estructuras mu-
cho ms sencillas, las cuales a menudo consisten
en una sola subunidad monomrica (aunque puede
funcionar en el contexto de un complejo de otras
enzimas reparadoras). De las enzimas que partid-
pan en la reparacin, slo la polimerasa de DNA [3
tiene una fidelidad cercana a la de las replicasas:
todas las dems tienen tasas de error mucho mayo-
res. Toda la sntesis del DNA mitocondrial, incluidas
las reacciones de reparacin, de recombinacin y de
replicacin, la realiza la polimerasa de DNA y.
Cada una de las tres replicasas de DNA nuclear
tiene una funcin distinta:
.
La polimerasa de DNA a inicia la sntesis de
cadenas nuevas.
.
Las polimerasa de DNA 5 alarga la cadena
lder.
.
La polimerasa de DNA e puede intervenir
en la sntesis de la cadena retrasada, pero
tambin tiene otras funciones.
La polimerasa de DNA a es poco comn porque
tiene la capacidad de iniciar una cadena nueva. Se
utiliza para iniciar tanto la cadena lder como la ca-
dena retrasada. La enzima existe como un complejo
formado por una subunidad cataltica de 180 kD,
que est asociada a la subunidad B que parece ser
necesaria para el ensamble, y por dos protenas ms
pequeas que proporcionan una actividad primasa.
Por su capacidad doble de cebar y extender las cade-
nas, en ocasiones se le denomina primasa pol a.
La enzima primasa/pol a se une al complejo de
iniciacin en el origen y sintetiza una cadena corta
formada por -10 bases de RNA seguidas de 20 a 30
bases de DNA (algunas veces llamada iDNA). Lue-
go es remplazada por una enzima que extender la
cadena. En la cadena lder, sta es la polimerasa de
DNA 5. A este suceso se le denomina intercambio
de pol. Comprende interacciones entre numerosos
componentes del complejo de iniciacin.
La polimerasa de DNA 5 es una enzima muy
procesiva que sintetiza de manera continua la ca-
dena lder. Su procesividad se debe a su interaccin
con otras dos protenas, RF-C y PCNA.
444
CAPTULO 18 Replicacin del DNA
Las fundones de RF-C y del PCNA son anlogas
a las de la unidad [3 de procesividad y del cargador
de pinza y de E. coli (vase la seccin 18.10, La pinza
controla la asociacin de la enzima central con el
DNA). RF-C es un cargador de pinza que cataliza
una carga del PCNA al DNA. Se une al extremo
3' d
e la cadena IDNA y utiliza la hidrlisis de ATP
para abrir el anillo de PCNA de tal forma que pueda
crear la estructura circular alrededor del DNA. La
procesividad de la polimerasa de DNA 8 la mantie-
ne el PCNA, que amarra a la polimerasa de DNA 6
al molde. (La protena PCNA es llamada antgeno
nuclear de clulas en proliferacin [por sus siglas en
ingls: proliferating cell nuclear antigen] por razones
histricas.) La estructura cristalina del PCNA se pa-
rece mucho a la subunidad P de E. coli: un trmero
forma un anillo que rodea al DNA. La secuencia y
la organizacin de las subunidades son diferentes a
las de la pinza dimrica [3; sin embargo, es probable
que la funcin sea similar.
Se tiene menos certeza sobre lo que sucede en la
cadena retrasada. Una posibilidad es que la polime-
rasa de DNA 5 tambin alargue la cadena retrasada.
Tiene capacidad para formar dmeros, lo que sugiere
un modelo anlogo al comportamiento de la repli-
casa de E. coli (vase la seccin 18.9, La holoenzima
polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos). Sin
embargo, hay algunos indicios de que la polimerasa
de DNA e puede alargar la cadena retrasada, aunque
tambin ha sido identificada con otras fundones.
Un modelo general sugiere que la horquilla de
replicacin contiene un complejo de polimerasa
de DNA a-primasa y otros dos complejos de polime-
rasas de DNA. Una es la polimerasa de DNA 5 y la
otra es una segunda polimerasa de DNA 5 o puede
ser una polimerasa de DNA e. Los dos complejos
de polimerasa de DNA 5-8 actan de la misma ma-
nera que los dos complejos de polimerasa de DNA
ni en el replisoma de E. coli: uno sintetiza la cadena
lder y el otro sintetiza los fragmentos de Okazaki en
la cadena retrasada. La exonucleasa MF1 elimina los
cebadores de RNA de los fragmentos de Okazaki. La
enzima ligasa de DNA I se requiere de manera espe-
cfica para sellar las hendiduras entre los fragmentos
de Okazaki concluidos.
EL fago T4 proporciona
su propio mecanismo
de replicacin
Concepto principal
EL fago T4 proporciona su propio mecanismo de replica-
cin, formado por una polimerasa de DNA, el gen 32
SSB, una helicasa, una primasa y por protenas acce-
sorias que incrementan la velocidad y la procesividad.
Cada fragmento de Okazaki se sintetiza en forma individual
"iii
nnmni
iiiHiiiiiiiiii"in>
imniiuitmnimiin
La primasa
sintetiza RNA
iiiminimnmmiirmiimnn
i La polimerasa de DNA III
I extiende al cebador de RNA
*
en un fragmento de Okazaki
i Ui 1 LLuJIliii l.
"
LLlLLi'lI.I. 1 l rgulen'rf'agmento de
I Okazaki es sintetizado
miiminiinmi
In.llInll.ni.
'
niInlInJInin,,!: ''' '
I
La polimerasa de DNA I
utiliza el desplazamiento de
hendidura para remplazar al
cebador de RNA con DNA
Imniillil
| La ligasa sella la hendidura
iimmmimimiiimmi
La sntesis de los fragmentos de Okazaki requiere ce-
bamiento, extensin, eliminacin del RNA, rellenado de los espacios y
ligamiento de la hendidura.
Cuando un fago T4 infecta una clula de E. coli,
aporta numerosas funciones propias que remplazan
o que potencian las funciones del hospedador. El
fago depende poco de la expresin de las funciones
del hospedador. La degradacin del DNA del hospe-
dador es importante para la liberacin de nucleti-
dos que son reutilizados en la sntesis del DNA del
fago. (El DNA del fago difiere en la composicin de
bases del DNA celular en que utiliza hidroximetilci-
tosina en lugar de la citosina acostumbrada.)
Las funciones codificadas por el fago implicadas
en la sntesis de DNA en la clula infectada pueden
identificarse por medio de mutaciones que impi-
den la produccin de fagos maduros. Las funciones
esenciales del fago se identifican por medio de mu-
taciones letales condicionales, que se dividen en tres
clases fenotpicas:
.
Aquellas en las cuales no hay sntesis de
DNA en absoluto identifican genes cuyos
productos son componentes del mecanismo
de replicacin o participan en la provisin de
precursores (en especial hidroximetilcitosi-
na).
18.14 El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicacin
445
La endonucleasa de alern FENl separa
adores de RNA
La ligasa de DNA utiliza un AMP intermediario
Cebador Cebador
de RNA de RNA
flllllftlllllflfl
UJ l
I El fragmento de Okazaki
T es sintetizado
El cebador es desplazado
mm
Fen1 separa al cebador
iiiTifuniliMu
''
nfl'iiiiiHi. 'J!
l'!lu
La ligasa sella el espacio
FIGURA 18.23 FENl es una exo/endonucleasa que reconoce La
estructura que se crea cuando una cadena de DNA es desplazada de
un dplex como un
"
alern
"
. En la replicacin hace una divisin en
la base del alern para eliminar el cebador de RNA.
.
Aquellas en las cuales el comienzo de la sn-
tesis de DNA se retrasa tienen que ver con
la iniciacin de la replicacin.
.
Aquellas en las que la sntesis de DNA co-
mienza pero despus se interrumpe inclu-
yen funciones reguladoras, la ligasa de DNA
y algunas de las enzimas relacionadas con la
degradacin del DNA del hospedador.
.
Tambin existen genes no esenciales rela-
cionados con la replicacin, como aquellos
involucrados en la glucosilacin de la hi-
droximetilcitosina en el DNA.
La sntesis del DNA del fago T4 es catalizada
por un agregado multienzimtico ensamblado con
los productos de un pequeo grupo de genes esen-
ciales.
La protena del gen 32 (gp32) es una prote-
na muy colaboradora de unin al DNA de cadena
individual, que se necesita en cantidades estequio-
mtricas. Fue el primer ejemplo de este tipo que se
describi. La geometra de la horquilla de replica-
cin de T4 puede requerir de manera especfica la
protena codificada por el fago, porque la SSB de
E
. coli no puede sustituirla. La protena gp32 forma
un complejo con la polimerasa de DNA de T4; esta
-
o-p-o
OH O
m
Enzima + AMP
I
Enzima + NAD \
Enzima-AMP
\ 9
Adenina-Ribosa-O-P-0

"
O-P-Q
-
OHO
M
FIGURA 18.24 La ligasa de DNA sella Las hendiduras que se
encuentran entre nucletidos prximos al emplear un interme-
diario enzima-AMP.
interaccin podra ser importante en la construccin
de la horquilla de replicacin.
El sistema de T4 utiliza un episodio de ceba-
miento de RNA similar al de su hospedador. Con un
DNA de cadena individual de T4 como molde, los
productos de los genes 41 y 61 actan juntos para
sintetizar cebadores pequeos. Su comportamiento
es anlogo al de DnaB y DnaG en E. coli. La protena
del gen 41 es la contraparte de la protena DnaB. Es
una helicasa hexamrica que utiliza la hidrlisis del
GTP con el fin de proporcionar energa para desen-
rollar al DNA. El complejo p41/p61 se desplaza en
forma procesiva en direccin 5'-3' en la sntesis de
la cadena retrasada e inicia de manera peridica los
fragmentos de Okazaki. Otra protena, el producto
del gen 59, carga al DNA con el complejo p41/p61;
es necesaria para desplazar la protena p32 y permi-
tir que la helicasa se ensamble en el DNA.
La protena del gen 61 se necesita en cantidades
mucho menores que la mayor parte de las protenas
de replicacin de T4. Existen desde 10 copias de
gp61 por clula. (Esto ha impedido su caracteriza-
cin. Se requiere en cantidades tan pequeas que en
un principio no se identific como un componente
indispensable, debido a que la preparacin de gp32
estaba contaminada con esta protena, y ejerca su
funcin.) La protena del gen 61 tiene actividad de
primasa, la cual es anloga a la del producto DnaG
de E. coli. La primasa reconoce la secuencia molde
446 CAPTULO 18 Replicacin del. DNA
Las polimerasas de DNA realizan
replicacin y reparacin
Polimerasa Funcin Estructura
de DNA
Replicasas de alta
fidelidad
a
Replicacin nuclear
Tetrmero de 350 kD
S
ii
Tetrmero de 250 kD
e
'i
Tetrmero de 350 kD
7 Replicacin
mitocondrial
Reparacin de alta
fidelidad
Dmero de 200 kD
P Reparacin de escisin
Monmero de 39 kD
de bases
Reparacin de baja
fidelidad
c Puente de dmero de
timina
Hetermero
1 Reparacin de dao
de bases
Monmero
i Necesaria para la
Monmero
meiosis
-- Delecin y sustitucin
Monmero
de bases
FIGURA 18.25 Las clulas eucariticas tienen muchas polime-
rasas de DNA. Las enzimas replicativas operan con alta fideli-
dad. Excepto por la enzima |3, todas las enzimas de reparacin
tienen baja fidelidad. Las enzimas replicativas tienen estructu-
ras extensas, con subunidades independientes para actividades
distintas. Las enzimas de reparacin tienen estructuras mucho
ms sencillas.
3
'
-
TTG-5' y sintetiza pentarribonucletidos ceba-
dores que tienen la secuencia general pppApCpNp-
NpNp. Si est presente el mecanismo de replicacin
completo, estos cebadores se extienden y forman
cadenas de DNA.
La polimerasa de DNA del gen 43 tiene la ac-
tividad sinttica 5'-3' habitual, que est asociada
a la actividad correctora de exonucleasa 3
'
-
5
'
. Ca-
taliza la sntesis de DNA y elimina a los cebadores.
Cuando la polimerasa de DNA de T4 utiliza un DNA
de cadena individual como molde, su velocidad de
progreso es desigual. La enzima se mueve con ra-
pidez por las regiones de cadena individual, pero lo
hace con mucho ms lentitud por las regiones que
tienen una estructura secundaria con apareamiento
de bases entre las cadenas. Las protenas accesorias
ayudan a la polimerasa de DNA a pasar por estas
barricadas y mantenga as su velocidad.
Las tres protenas restantes se conocen como
"
protenas accesorias de la polimerasa
"
.
Incre-
mentan la afinidad de la polimerasa de DNA por
el DNA y tambin aumentan la procesividad y la
velocidad. El producto del gen 45 es un trmero que
acta como una pinza deslizante. La estructura del
trmero se parece a la del dmero [3 de E. coli, en que
forma un crculo alrededor del DNA que sostiene
la subunidad de la polimerasa de DNA con mayor
fuerza en el molde.
18.14
La replicacin requiere un conjunto comn de funciones
Funcin E. coli HLa/SV40 Fago ~
Helicasa DnaB
Antgeno T
41
Carga helicasa'primasa
DnaC
Antgeno T
59
Mantenimiento de la cadena SSB RPA 32
individual
Actividad cebadora DnaG
Pola/primasa 61
Pinza deslizante
P
PCNA 45
Carga de la pinza (ATPasa) Complejo y8
RFC 44/62
Catlisis Ncleo Pol III Pol5 43
Dimerizacin de la i
?
43
holoenzima
Eliminacin del RNA Poli MF1 43
Ligamiento Ligasa Ligasa 1 Ligasa T4
FIGURA 18.26 Funciones similares son necesarias en todas las
horquillas de replicacin.
Los productos de los genes 44 y 62 forman un
fuerte complejo que tiene actividad de ATPasa. Son
el equivalente al complejo de pinza y su funcin
es cargar a p45 sobre el DNA. Cuatro molculas de
ATP son hidrolizadas cuando se carga el DNA con la
pinza p45 y con la polimerasa de DNA p43.
La estructura global del replisoma es muy simi-
lar a la de E. coli. Est formada por dos complejos de
holoenzimas acoplados, uno que sintetiza la cadena
lder y el otro que sintetiza la cadena retrasada. En
este caso, la dimerizacin comprende una interac-
cin directa entre las subunidades de la polimerasa
de DNA P43, y p32 tiene una funcin en la coordi-
nacin de las acciones de las dos unidades de poli-
merasa de DNA.
Hasta ahora se ha examinado la replicacin
del DNA en lo que se refiere a la progresin de la
horquilla de replicacin. La necesidad de otras fun-
ciones la demuestran los mutantes de retraso de la
sntesis del DNA y los de detencin de la sntesis
del DNA. Tres de los cuatro genes de los mutantes
de retraso de la sntesis del DNA son el 39
, el 52 y
el 60, los cuales codifican las tres subunidades de la
topoisomerasa n de T4, una actividad necesaria para
eliminar superenrollamientos en el molde (vase la
seccin 19.13, Las topoisomerasas relajan o intro-
ducen superenrollamientos en el DNA). La funcin
esencial de esta enzima sugiere que el DNA de T4
no permanece en forma lineal, sino que ms bien
se constrie topolgicamente durante alguna etapa
de la replicacin. La topoisomerasa podra necesi-
tarse para que la rotacin del DNA dejara atrs la
horquilla de replicacin.
La comparacin del mecanismo del fago T4 con
el mecanismo de E. coli sugiere que la replicacin
del DNA plantea una serie de problemas que se re-
suelven de formas anlogas en diferentes sistemas.
Ahora se pueden comparar las actividades enzim-
ticas y estructurales observadas en la horquilla de
El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicacin 447
replicacion en E. coli, en T4 y en las clulas HeLa
(humanas). La FIGURA 18.2 resume las funciones
y las asigna a protenas individuales. Se pueden
interpretar las propiedades conocidas de las prote-
nas de los complejos de replicacion en trminos de
funciones similares que comprenden las reacciones
de desenrollamiento, de cebamiento, de catlisis
y de formacin de sellos. Los componentes de cada
sistema interactan de maneras restringidas, como
lo demuestra el hecho de que el fago T4 requiere sus
propias helicasa, primasa, pinza, etc., y por el hecho
de que las protenas bacterianas no pueden sustituir
a sus contrapartes fgicas.
EJE Creacin de Las horquillas
de replicacin en eL origen
Conceptos principales
La iniciacin en orC requiere el ensamble secuencial de
un gran complejo de protenas.
.
DnaA se une a secuencias cortas repetitivas y forma un
complejo oligomrico que desnaturaliza al DNA.
.
Seis monmeros de DnaC se unen a cada hexmero de
DnaB, y este complejo se une al origen.
Un hexmero de DnaB forma la horquilla de replicacin.
La girasa y la SSB tambin son necesarias.
llama la atencin por ser la nica involucrada de
manera exclusiva en la iniciacin frente a la elon-
gacin. DnaB y DnaC proporcionan la
"
maquinaria
"
de iniciacin en el origen.
La primera etapa en la formacin del complejo
es la unin de la protena DnaA a oriC. La reaccin
comprende la accin en dos tipos de secuencias: las
repeticiones de 9 bp y las repeticiones de 13 bp. Jun-
tas, estas dos ltimas secuencias denen los lmites
del origen mnimo de 245 bp, como se indica en la
FIGURA 18.27. Un origen es activado por la secuencia
de episodios que se resumen en la FIGURA 18.28, en
la cual, a la unin de DnaA le sigue la asociacin
con las otras protenas.
Las cuatro secuencias de consenso de 9 bp sobre
el lado derecho de oriC proporcionan los sitios de
El origen tiene dos conjuntos de repeticiones
L M R 1 2 3 4
repeticio- repeticiones de 9 bp
nesdeISbp ,
FIGURA 18.27 El origen mnimo se define por la distancia
que hay entre los miembros externos de las repeticiones de
13 bp y de 9 bp.
Para comenzar un ciclo de replicacin de un DNA
dplex se necesitan varias actividades sucesivas:
.
Las dos cadenas de DNA deben pasar por su
separacin inicial. Es decir, en efecto, sufrir
una desnaturalizacin en una regin corta.
.
Un punto de desenrollamiento comienza a
desplazarse por el DNA; esto indica la ge-
neracin de la horquilla de replicacin, la
cual continua movindose durante la elon-
gacin.
.
Los primeros nucletidos de la nueva cade-
na deben ser sintetizados para formar el ce-
bador. Esta accin se necesita una vez en la
cadena lder, pero se repite en el comienzo
de cada fragmento de Okazaki en la cadena
retrasada.
Por lo tanto, algunos de los sucesos que son in-
dispensables para la iniciacin ocurren slo en el ori-
gen; otros se repiten con la iniciacin de cada frag-
mento de Okazaki durante la fase de elongacin,
Se han utilizado plsmidos que portan la se-
cuencia oriC de E. coli para desarrollar un sistema sin
clulas para la replicacin. In vitro, la iniciacin de la
replicacin en oriC empieza con la formacin de un
complejo que requiere seis protenas: DnaA, DnaB,
DnaC, HU, girasa y SSB. De las seis protenas com-
prendidas en el precebamiento, la protena DnaA
La separacin de las cadenas inicia
El origen tiene tres
repeticiones de 13 bp
y cuatro repeticiones
de 9 bp
GATCTNTTNTTTT nMNCANA.
8*1
Los monmeros
de DnaA se
unenaias \
'
\.<\. \.<~V<
repeticiones
de 9 bp
DnaA se une a ias
repeticiones de
13 bp
Las cadenas del
DNA se separan
en las repeticiones
de13bp
DnaB y DnaC se
unen al complejo
y forman horquillas
de replicacin
FIGURA 18.28 El precebamiento comprende la formacin de
un complejo por asociacin secuencial de protenas, lo cual
provoca la separacin de las cadenas del DNA.
448 CAPTULO 18 Replicacin del DNA
El complejo de precebamlento
origen
La burbuja de replicacin se forma
en el origen
n-
.
'
tf'
'
..> ,. '-U -i-i''
FIGURA 18.29 El complejo en orC puede apreciarse con mi-
croscopa electrnica. Los dos complejos se visualizaron con
anticuerpos contra la protena DnaB. Fotografa superior re-
producida de Funnel, B. E., et al. J. Biol. Chem. 1987. 262:
10327-10334. Copyright 1987 by American Society for Bioche-
mistry & Molecular Biology. Fotografa cortesa de Barbara E.
Funnell
, University of Toronto. Fotografa inferior reproducida
de Barker, T. A., et al. J. Biol. Chem. 1987. 252: 6877-6885. Co-
pyright 1987 by American Society for Biochemistry & Molecular
Biology. Fotografa cortesa de Barbara E. Funnell, University
of Toronto.
unin iniciales para DnaA. sta se une en colabo-
racin para formar un ncleo central alrededor del
cual el DNA de onC forma una envoltura. Despus,
DnaA acta sobre tres repeticiones, en tndem, de
13 bp ricas en A-T, que se encuentran en el lado
izquierdo de oriC. En presencia de ATP, DnaA des-
naturaliza las cadenas del DNA en cada uno de estos
sitios para formar un complejo abierto. Las tres re-
peticiones de 13 bp deben ser desnaturalizadas para
que la reaccin prosiga a la siguiente etapa.
En general, de dos a cuatro monmeros de
DnaA se unen al origen y recluan dos complejos
de "precebamlento" de DnaB-DnaC para unirse, por
lo que hay uno para cada una de las dos horqui-
llas de replicacin (bidireccionales). Cada complejo
de DnaB-DnaC est formado por seis monmeros de
DnaC unidos al hexmero de DnaB. Cada complejo
de DnaB-DnaC transfiere un hexmero de DnaB a
una cadena opuesta de DNA. DnaC hidroliza ATP
para liberar a DnaB.
El complejo de precebamlento genera un agre-
gado protenico de 480 kD, que corresponde a una
esfera con un radio de 6 nm. La formacin de un
complejo en oriC es detectable por la presencia de
un gran glbulo protenico que se observa en la <
GURA 18.29. Cuando la replicacin comienza, una
burbuja de replicacin se hace visible al lado del
glbulo.
La regin de la separacin de la cadena en el
complejo abierto tiene el tamao suficiente para
que se puedan unir ambos hexmeros de DnaB, lo
cual inicia las dos horquillas de replicacin. A medi-
da que se une DnaB, desplaza a DnaA de las repeti-
ciones de 13 bp y extiende la longitud de la regin
abierta. Despus utiliza su actividad de helicasa para
extender la regin de desenrollamiento. Cada DnaB
activa una primasa de DnaG (en un caso para iniciar
la cadena lder y en el otro para iniciar el primer
fragmento de Okazaki de la cadena retrasada).
Dos protenas ms son necesarias para apoyar la
reaccin de desenrollamiento. La girasa proporciona
un eslabn giratorio que permite que una cadena
gire alrededor de la otra (una reaccin que se ana-
liza con ms detalle en la seccin 19.15, La girasa
funciona por inversin del enrollamiento); sin esta
reaccin, el desenrollamiento generara tensin
por torsin en el DNA. La protena SSB estabiliza
al DNA de cadena individual a medida que se va
formando. La longitud del DNA dplex que por lo
general se desenrolla para iniciar la replicacin es
tal vez <60 bp.
La protena HU es una protena general de unin
al DNA en E. coli. Su presencia no es indispensable
para iniciar la replicacin in vitro, pero estimula la
reaccin. La HU tiene la capacidad de plegar el DNA
y tiene que ver con la construccin de la estructura
que conduce a la formacin del complejo abierto.
La entrada de energa en forma de ATP es nece-
saria en numerosas etapas para la reaccin de pre-
cebamlento y para el desenrollamiento del DNA.
La accin helicasa de DnaB depende de la hidrlisis
de ATP y la accin rotatoria de la girasa tambin
consume ATP. Este ltimo tambin se necesita para
la accin de la primasa y para activar la polimerasa
de DNA Ih.
Despus de la generacin de la horquilla de re-
plicacin, como se indica en la Figura 18.28, tiene
lugar la reaccin de cebamiento para generar una
cadena lder. Se sabe que para la actividad cebado-
ra se utiliza la sntesis de RNA, pero los detalles de
la reaccin se desconocen. Algunas mutaciones en
dnaA pueden ser suprimidas por mutaciones en la
polimerasa de RNA, lo cual sugiere que DnaA po-
dra participar en un paso de iniciacin que requiere
la sntesis de RNA in vivo.
La polimerasa de RNA podra necesitarse para
leer el origen desde las unidades de transcripcin
adyacentes; al terminar en sitios ubicados en el orl-
;
. ; C
reacin de las horquillas de replicacin en el origen
449
gen, podra proporcionar los extremos 3
'
-
OH que
ceban a la polimerasa de DNA IIL (Un ejemplo lo
constituye el uso de lazos D en los orgenes mito-
condriales, como se analiza en la seccin 15.10
,
Los
lazos D mantienen los orgenes mitocondriales.)
Una alternativa es que el acto de la transcripcin
estuviera asociado a un cambio estructural que ayu-
de a la iniciacin. Esta ltima idea es respaldada por
observaciones que sustentan que la transcripcin no
tiene que pasar por el origen; es eficaz hasta a 200
bp de distancia del origen y puede usar cualquiera
de las dos cadenas del DNA como molde in vitro. El
episodio de la transcripcin se relaciona de manera
inversa con la necesidad de superenrollamiento in
vitro, lo cual sugiere que acta cambiando la estruc-
tura local del DNA para facilitar la desnaturalizacin
del DNA.
[22 Sucesos comunes
en eL cebamiento
de La repLicacin en eL origen
Conceptos principales
El principio general de la iniciacin bacteriana es que el
origen es reconocido en un inicio por una protena que
forma un gran complejo con el DNA.
.
Una regin corta de DNA enriquecida con A-T es desna-
turalizada.
.
DnaB se une al complejo y crea la horquilla de replicacin.
Otro sistema para investigar las interacciones en el
origen lo proporciona el fago X. En la FIGURA 18.30
se muestra un mapa de la regin. La iniciacin de
la replicacin en el origen de X requiere "la activa-
La transcripcin activa un promotor
PrIOr
col
0/7
La transcripcin
debe iniciar aqu
Para que la replicacin
inicie aqu
FIGURA 18.30 La iniciacin de la transcripcin en P
8
es ne-
cesaria para activar el origen del DNA de X.
cin
"
, con el inicio de la transcripcin a partir de P
R
.
Igual que en los sucesos en oriC, esto no significa
que el RNA proporcione un cebador para la cadena
lder. Analogas entre estos sistemas sugieren que la
sntesis de RNA podra participar en la estimulacin
de algn cambio estructural en la regin.
La iniciacin requiere los productos de los genes
O y P del fago, as como numerosas funciones del
El origen de X es activado por la proteina O
Sitios de unin para la
protena O de 18 bp
Regin rica en A-i
,
i
,
IV lll II I 40 bp
La protena O se une |
El DNA es desnaturaliza::
FIGURA 18.31 El origen de A, para la replicacin comprende i;
regiones. Los episodios tempranos son catalizados por la prote;-;
la cual se une a una serie de cuatro sitios y despus el DNA es de;
turalizado en la regin cercana rica en A-T. El DNA se dibuja cor:
dplex recto; sin embargo, en realidad est plegado en el orige-
hospedador. La protena O del fago se une al origen
de X, la protena P fgica interacta con la protena
O y con protenas bacterianas. El origen se encuen-
tra dentro del gen O, de modo que la protena acta
cerca de su sitio de sntesis.
Las variantes del fago llamadas Xdv consisten
en genomas ms cortos que portan toda la infor-
macin necesaria para la replicacin, pero carecen
de funciones infecciosas. El DNA Xdv sobrevive en
la bacteria como un plsmido y puede ser replicado
in vitro por un sistema formado por las protenas O
y P codificadas por el fago junto con las funciones
de replicacin bacterianas.
Las protenas de X O y P forman un complejo
junto con DnaB en el origen de X, ork. El origen
est formado por dos regiones, como se ilustra en la
FIGURA 18.31: una regin que comprende una serie
de cuatro sitios de unin para la protena O est
prxima a una regin rica en A-T.
La primera etapa en la iniciacin es la unin
de O para generar una estructura casi esfrica con
un dimetro de ~ 11 nm, una estructura llamada en
ocasiones O-soma. ste contiene -100 bp o 60 kD
de DNA. Hay cuatro sitios de unin de 18 bp para la
protena O, de -34 kD. Cada sitio es palindrmico y
es probable que se una a un dmero O simtrico. Las
secuencias de DNA de los sitios de unin a O parecen
estar plegados, y la unin de la protena O induce un
plegamiento mayor.
Si el DNA est superenrollado, la unin de la
proteina O provoca un cambio estructural en el ori-
gen. La regin rica en A-T contigua a los sitios de
unin se hace susceptible a la nucleasa SI, una en-
zima que reconoce de manera especfica al DNA no
apareado. Esto sugiere que junto al complejo de pro-
tenas O ocurre una reaccin de desnaturalizacin.
450 CAPTULO 18 Replicacin del DNA
La funcin de la protena O es anloga a la de
DnaA en oriC: prepara al origen para la unin
de DnaB. Lambda proporciona su propia protena
P que sustituye a DnaC y lleva a DnaB aJ origen.
Cuando se agregan la protena P de X y las protenas
DnaB bacterianas, el complejo se hace ms grande y
simtrico. Incluye ms DNA (un total de -160 bp),
as como algunas otras protenas. La protena P de X
tiene una funcin especial; inhibe la accin de he-
licasa de DnaB. El movimiento de la horquilla de
replicacin se desencadena cuando la protena P es
liberada del complejo. Este episodio precede al ceba-
miento y a la sntesis de DNA.
Algunas protenas son esenciales para la repli-
cacin sin que participen de manera directa en la
sntesis de DNA. Las protenas DnaK y DnaJ son
ejemplos interesantes. La protena DnaK es un cha-
pern y est relacionada con una protena de estrs
comn de las eucariotas. Su capacidad para interac-
tuar con otras protenas de un modo dependiente
de la conformacin es importante en muchas activi-
dades celulares, como la replicacin. La funcin de
Dnak y DnaJ puede ser desensamblar el complejo
de precebamiento: al causar la liberacin de la pro-
tena P, permiten el comienzo de la replicacin.
Las reacciones de iniciacin en oriC y en oriX
son similares. Comprenden las mismas etapas y se
basan en componentes comunes. El primer paso es
el reconocimiento del origen por una protena que
se une para formar un complejo con el DNA (DnaA
para oriC y la protena O para ork). Una regin corta
de DNA rica en A-T es desnaturalizada. Despus
DnaB es cargada; esto requiere funciones distintas
en oriC y en oriX (no obstante, se requieren otras
protenas para esta etapa en otros orgenes). Cuan-
do la helicasa DnaB se une al complejo, se crea una
horquilla de replicacin. Por ltimo, se sintetiza un
cebador de RNA, despus de lo cual comienza la
replicacin.
El uso de oriC y oriX ofrece un modelo general
para la activacin de los orgenes. Una serie simi-
lar de episodios ocurre en el origen del virus SV40
en las clulas de los mamferos. Dos hexmeros de
antgeno T, una protena codificada por el virus,
se unen a una serie de sitios repetidos en el DNA.
En presencia de ATP, ocurren cambios en la estruc-
tura del DNA, que culminan en una reaccin de
desnaturalizacin. En el caso de SV40, la regin des-
naturalizada es bastante corta y no es rica en A-T,
pero tiene una composicin atpica en la cual una
cadena est formada casi de manera exclusiva de pi-
rimidinas y la otra de purinas. Cerca de este sitio se
encuentra otra regin esencial. Consiste en pares de
bases A-T, en los cuales el DNA est plegado; el DNA
es entonces desenrollado por la unin del antgeno
T
.
Una diferencia interesante con el sistema de las
procariotas es que el antgeno T posee la actividad
helicasa necesaria para extender el desenrollamien-
to, de modo que no se requiere un equivalente de
la protena DnaB.
|2J EL primosoma es necesario
para reiniciar La repLicacin
Conceptos principales
La iniciacin de La replicacin de cpX requiere que el
complejo del primosoma desplace a La SSB del origen.
.
Una horquilla de repLicacin se detiene cuando Llega al
DNA daado.
.
Despus que el dao ha sido reparado, el primosoma es
indispensable para reiniciar La repLicacin.
.
La protena Tus se une a Los sitios ter y detiene el
desenrolLamiento del DNA mediado por DnaB, lo cual
ocasiona que la replicacin termine.
En trabajos anteriores sobre la replicacin se hizo
amplio uso del fago (pX174 y llevaron al descubri-
miento de un sistema complejo de cebamiento. El
DNA de (pX174 no constituye por s mismo un sus-
trato para el mecanismo de replicacin porque el
DNA desnudo no proporciona un molde apropiado.
No obstante, una vez que la forma de cadena indi-
vidual ha sido cubierta con la SSB, la replicacin
puede proseguir. Un primosoma se ensambla en
un nico sitio del DNA de cadena individual lla-
mado sitio de ensamblaje {primosome assembly site,
pas). El pas es el equivalente de un origen para la
sntesis de la cadena complementaria del q)X174. El
primosoma est formado por seis protenas: priA,
PriB, PriC, DnaT, DnaB y DnaC. El suceso clave en
la localizacin del primosoma es la habilidad de PriA
de desplazar a la protena SSB del DNA de cade-
na de individual.
El primosoma se forma en un inicio en el pas
sobre el DNA del (pX174; sin embargo, los cebadores
se inician en una variedad de sitios. PriA se trans-
fiere a lo largo de la molcula de DNA y desplaza a
SSB para alcanzar otros sitios en los cuales ocurre
el cebamiento. Al igual que en los replicones oriC,
DnaB tiene una funcin fundamental en el desen-
rollamiento y en el cebamiento en los replicones
(pX. La funcin de PriA consiste en cargar la protena
DnaB para formar una horquilla de replicacin.
Siempre ha sido desconcertante que los orgenes
de cpX deban usar una estructura compleja que no
es necesaria para replicar el cromosoma bacteriano
Por qu la bacteria proporciona este complejo?
La respuesta se encuentra en el destino de las
horquillas de replicacin varadas. La FIGURA 18.32
compara una horquilla de replicacin que avanza
18.17 EL primosoma es necesario para reiniciar La repLicacin
451
Los daos en el DNA pueden detener la replicacion
La horquilla de replicacion avanza en el DNA normal
La recombinacin repara una horquilla varada
Cadena lder
"'"nuil iiininiim
i iilinrX
PERO la sntesis de la cadena se detiene en el dao
m
T1
11
.
1111
iUJ
ifHifinm
O tiene lugar una rotura de la doble cadena en la hendidura
TnWTQ X
LLLU
iiiiiiiiiinmi
La replicacion se interrumpe por una base da-
ada o por una hendidura en el DNA.
con lo que sucede cuando existe un dao en una
base en el DNA o una hendidura en una de las ca-
denas. En ambos casos la sntesis de DNA se detie-
ne y la horquilla de replicacion queda varada o se
deteriora. No est claro si los componentes de la
horquilla permanecen asociados al DNA o se des-
ensamblan. Que una horquilla de replicacion quede
varada parece ser bastante comn; las estimaciones
de la frecuencia de este suceso en E. coli sugieren
que de 18 a 50% de las bacterias confrontan un
problema durante un ciclo de replicacion.
La situacin se resuelve con un episodio de re-
combinacin que escinde y remplaza el dao o pro-
porciona un dplex nuevo para sustituir la regin
que contiene la rotura en la doble cadena (vase la
Figura 20.20 en la seccin 20.8, Sistemas de repara-
cin por recombinacin en E. coli). El principio del
episodio de reparacin es aprovechar la redundan-
cia de informacin incorporada entre las dos cade-
nas de DNA. La FIGURA 18.3 muestra los episodios
fundamentales de dichos sucesos de reparacin. En
trminos bsicos, la informacin del DNA dplex
hijo no daado se utiliza para reparar la secuencia
daada. Esto crea una unin de recombinacin t-
pica que resuelven los mismos sistemas que llevan
a cabo la recombinacin homloga. De hecho, algu-
nos opinan que la importancia principal de estos sis-
temas para la clula radica en la reparacin del DNA
daado en las horquillas de replicacin varadas.
un
iHKfnfffii
La replicacin se detiene en el dao
TTTTI i
mi
lUiiMiii
m
El dao es escindido
l'HlJllilljiill..1"1
mHiiHliliHiiiHiii
La cadena individual invade desde el otro dplex hijo
!"1im,llnlii.Ln.ln,
El entrecruzamiento es resuelto
TT nTiTTM.r~
r"niiiliHiii nnnmii
La replicacin reinicia
'
"'
lill.".."!.!....,..!,,.
11111
IGURA 18.33 Cuando la replicacin se detiene en el DNA
daado, la secuencia afectada es escindida y la cadena comple-
mentaria (recin sintetizada) del otro dplex hijo se entrecruza
para reparar la abertura. Ahora puede reanudarse la replicacin
y llenarse los espacios.
Despus que el dao ha sido reparado, la hor-
quilla de replicacin debe ser reiniciada. La FIGURA
18.34 muestra que esto puede lograrse mediante el
ensamblaje del primosoma, que en efecto recarga
el DnaB para que la accin de helicasa pueda con-
tinuar.
La reactivacin de la horquilla de replicacin es
una reaccin frecuente (y, por lo tanto, importan-
te). Es posible que se requiera en la mayor parte de
los ciclos de replicacin cromosmica. Es inhibida
por las mutaciones en cualquiera de los sistemas de
recuperacin que remplazan el DNA daado o en
los componentes del primosoma.
Las horquillas de replicacin deben parar y des-
ensamblarse en la terminacin de la replicacin.
Cmo se logra esto?
Las secuencias que detienen el movimiento
de las horquillas de replicacin se han identificado
como elementos ter del cromosoma de E. coli (vase
la FIGURA 18.3: ) o secuencias equivalentes en al-
gunos plsmidos. La caracterstica comn de estos
elementos es una secuencia de consenso de 23 bp
que constituye el sitio de unin para el producto del
452 CAPTULO 18 Replicacin del DNA
Una horquilla de replicacion varada puede reiniciar
La horquilla de replicacion queda varada
en el DNA daado
imuimiiimi'
31
JJ_--UJ
llliillillli
El mecanismo de replicacion es desactivado
inniinnnnn wnn
*
mi
iVHimHniHi
J
-
illlllllllllll-X
El dao es reparado y el primosoma se une
llllilllilllllllll
LLLLU
iHHlllll
La replicacion se reanuda
J ililllil
RGURA 18.34 El primosoma es necesario para reiniciar una
horquilla de replicacin varada despus de que el DNA ha sido
reparado.
gen tus, una protena de 36 kD que es indispensable
para la terminacin. Tus se une a la secuencia de
consenso, en donde ejerce una actividad de con-
tra-helicasa e inhibe el desenrollamiento del DNA
mediado por DnaB. La cadena lder contina sinte-
tizndose justo hasta el elemento ter, en tanto que
la cadena retrasada ms cercana es iniciada de 50 a
100 bp antes de alcanzar al elemento ter.
El resultado de esta inhibicin es detener el
movimiento de la horquilla de replicacin y (al pa-
recer) causar un desensamblaje del mecanismo de
replicacin. La FIGURA 18.36 permite recordar que
Tus detiene el movimiento de la horquilla de repli-
cacin slo en una direccin. La estructura cristalina
de un complejo Tus-ter muestra que la protena Tus
se une al DNA en forma asimtrica; las hlices a de
la protena sobresalen alrededor de la doble hlice
en el extremo que bloquea a la horquilla de termi-
nacin. Al parecer, una horquilla que avanza en la
direccin contraria puede desplazar a Tus y de esta
manera continuar. Una dificultad para entender el
funcionamiento del sistema in vivo es que parece
ser prescindible, debido a que las mutaciones en los
sitios ter o en tus no son letales.
Resumen
La sntesis de DNA ocurre por replicacin semidis-
continua, en la cual la cadena lder del DNA que
Las horquillas por lo general se encuentran
antes de la terminacin
Las horquillas
se encuentran
AATTaq
Horquilla de
replicacin 2
Origen
Horquilla de
replicacin 1
FIGURA 18.35 Los extremos de La replicacin en E. coli se
localizan ms all del sitio donde las horquillas de replicacin
se encuentran.
Tus acta de
DNA accesible
La replicacin
prosigue
DNA bloqueado
La replicacin termina
Tus
-
X
-
DnaB
L
FIGURA 18.36 Tus se une a eren forma asimtrica y bloquea
la replicacin slo en una direccin.
crece en direccin 5
'
-
3
'
se extiende en forma con-
tinua; en contraste, la cadena retrasada que cre-
ce por lo general en la direccin contraria, 3
'
-
5
'
,
es creada con fragmentos cortos de Okazaki, cada
uno sintetizado en direccin 5
'
-
3
'
.
La cadena lder
y cada fragmento de Okazaki de la cadena retrasada
inician con un cebador de RNA que es extendido
por la polimerasa de DNA. Las bacterias y las euca-
riotas poseen ms de una actividad de polimerasa
de DNA. La polimerasa de DNA III sintetiza tanto
la cadena lder como la cadena retrasada en E. coli.
Se requieren muchas protenas para la accin de la
polimerasa de DNA III y varias constituyen parte del
replisoma dentro del cual funciona.
El replisoma contiene un dmero asimtrico de
polimerasa de DNA III; cada cadena nueva de DNA
es sintetizada por un complejo nuclear diferente que
contiene una subunidad cataltica (a). La procesivi-
dad del complejo nuclear se conserva por la pinza (5,
la cual forma un anillo alrededor del DNA. El DNA
18.18 Resumen 453
es cargado con la pinza por el complejo cargador de
pinza. Los pares cargador de pinza/pinza con ca-
ractersticas estructurales similares se observan de
manera generalizada en los sistemas de replicacin
de las procariotas y de las eucariotas.
El modelo de formacin de lazos para la hor-
quilla de replicacin propone que, conforme una
mitad del dmero avanza para sintetizar la cadena
lder, la otra mitad del dmero jala el DNA como un
solo lazo que proporciona el molde para la cade-
na retrasada. La transicin entre la culminacin de
un fragmento de Okazaki y el inicio del siguiente
requiere que la subunidad cataltica de la cadena
retrasada se disocie del DNA y despus se una de
nuevo a una pinza (3 en el sitio de cebamiento para
el siguiente fragmento de Okazaki.
DnaB proporciona la actividad de helicasa en la
horquilla de replicacin; esto depende de la divisin
de ATP. DnaB puede funcionar por s sola en los re-
plicones oriC y proporcionar la actividad de primo-
soma al interactuar en forma peridica con DnaG,
que proporciona la primasa que sintetiza el RNA.
El fago T4 codifica un mecanismo de replicacin
formado por siete protenas: polimerasa de DNA,
helicasa, protena de unin a la cadena individual,
elementos con actividades cebadoras y protenas ac-
cesorias. En otros sistemas de replicacin se necesi-
tan fundones similares, incluido el sistema de clulas
HeLa que replica el DNA de SV40. Encimas diferentes
(polimerasa de DNA a y polimerasa de DNA 5) ini-
cian y alargan las cadenas nuevas de DNA,
La actividad cebadora (pX tambin requiere
DnaB, DnaC y DnaT. PriA es el componente que
define el sitio de ensamble del primosoma (pas)
para los replicones (pX; desplaza a SSB del DNA en
una accin que comprende la rotura de ATP. PriB y
PriC son otros componentes del primosoma. La im-
portancia del primosoma para la clula bacteriana
es que se utiliza para reiniciar la replicacin en las
horquillas que quedan varadas cuando encuentran
DNA daado.
El modo comn de activacin del origen im-
plica una desnaturalizacin inicial limitada de la
doble hlice, seguida por un desenrollamiento ms
general para crear las cadenas individuales. Varias
protenas actan de forma secuencial en el origen
de E. coli. La replicacin se inicia en oriC en E. coli
cuando DnaA se une a una serie de repeticiones de
9 bp. Esto es seguido por la unin a una serie de re-
peticiones de 13 bp, en donde utiliza la hidrlisis del
ATP para generar la energa necesaria para separar
las cadenas del DNA. El complejo de precebamiento
de DnaC-DnaB desplaza a DnaA. DnaC es libera-
da en una reaccin que depende de la hidrlisis de
ATP; DnaB es unida por la enzima replicasa, y la
replicacin es iniciada por dos horquillas que corren
en direcciones contrarias. Sucesos similares tiener;
lugar en el origen de X, donde las protenas fgicas O
y P son las contrapartes de las protenas bacterianas
DnaA y DnaC, respectivamente. En la replicacin &
SV40, muchas de estas actividades se combinan en
las funciones del antgeno T.
La disponibilidad de DnaA en el origen es un
componente importante del sistema que determina
cundo deben iniciar los ciclos de replicacin. Des-
pus de la iniciacin de la replicacin, DnaA hidro-
liza su ATP bajo los estmulos de la pinza deslizante
p, lo que genera una forma inactiva de la protena.
Adems, oriC debe competir con el sitio dat por la
unin de DnaA.
En el origen de E. coli hay numerosos sitios que
son metilados por la metilasa Dam, como los sitios
de unin de 13 bp para DnaA. El origen permanece
hemimetilado y se encuentra en un estado secues-
trado durante -10 min despus de la iniciacin de
un ciclo de replicacin. Durante este periodo est
asociado a la membrana y la reiniciacin de la repli-
cacin es reprimida. La protena SeqA interviene en
el secuestro y puede interactuar con DnaA.
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456 CAPTULO 18 RepLicacin del DNA
Recombnacin homologa
y especfica de sitio
ESQUEMA DEL CAPTULO
Esa
mm
Introduccin
Ocurre recombinacin homLoga entre
cromosomas en sinapsis
.
Los cromosomas deben entrar en sinapsis (aparearse)
para que se formen los quiasmas, donde tiene lugar el
entrecruzamiento.
.
Se pueden correlacionar las etapas de la meiosis con los
sucesos moleculares que ocurren en el DNA.
Rotura y reunin afectan el DNA heterodplex
* El suceso clave de la recombinacin entre dos molculas de
DNA dplex es el intercambio de cadenas nicas.
*
Cuando una sola cadena de una estructura dplex desplaza
a su contraparte en la otra, crea una estructura ramificada.
.
El intercambio genera una cadena de DNA heterodplex
constituida por una cadena de cada progenitor.
.
Se necesitan dos intercambios (reciprocos) para generar
una molcula articulada.
La molcula articulada se resuelve en dos molculas dplex
independientes mediante una hendidura en dos de las
cadenas que se conectan.
.
El que se formen recombinantes depende de que las
cadenas participantes en el intercambio original, o el otro
par, presenten muescas durante la resolucin.
Las roturas de la doble cadena inician la
recombinacin
La recombinacin se inicia con una rotura de la doble
cadena en una cadena de DNA dplex (receptora).
.
La actividad de la exonucleasa genera extremos 3'
de cadena nica que invaden la otra cadena dplex
(donadora).
.
La sintesis nueva de DNA sustituye el material que ha sido
degradado.
.
Esto genera una molcula de articulacin recombinante
donde las dos cadenas de DNA dplex estn conectadas por
DNA heterodplex.
Los cromosomas en recombinacin se conectan
por el complejo sinaptonmico
.
Durante la primera parte de la meiosis, los cromosomas
homlogos se aparean en el complejo sinaptonmico.
.
La masa de cromatina de cada cromosoma homlogo est
separada de la otra por un complejo proteinceo.
El complejo sinaptonmico se forma despus de
roturas de la doble cadena
.
Las roturas de la doble cadena que inician la recombinacin
ocurren antes de que se forme el complejo sinaptonmico.
tcmti
rom
.
Si se bloquea la recombinacin, el complejo sinaptonmico
no puede formarse.
EL apareamiento y la formacin del complejo
sinaptonmico son independientes
.
Pueden ocurrir mutaciones durante el apareamiento
cromosmico o la formacin del complejo sinaptonmico
sin afectar el otro proceso.
Las secuencias chi estimulan el sistema RecBCD
bacteriano
.
El complejo RecBCD tiene actividades de nucleasa y
helicasa.
.
Se une al DNA en sentido descendente respecto de una
secuencia chi, desenrolla la cadena dplex y degrada una
cadena de 3
'
a 5' conforme se desplaza hacia el sitio chi.
.
El sitio chi desencadena la prdida de la subunidad RecD y
la actividad de nucleasa.
Las protenas de transferencia de cadenas
catalizan la asimilacin de una sola cadena
. La RecA forma filamentos con el DNA de una o dos cadenas
y cataliza la capacidad de un DNA de una sola cadena con
un extremo libre 3
'
de desplazar a su contraparte en una
estructura dplex de DNA.
El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday
.
El complejo Ruv acta sobre uniones recombinantes.
.
La RuvA reconoce la estructura de la unin y la RuvB es
una helicasa que cataliza la migracin de ramas.
*
La RuvC escinde uniones para generar productos
intermedios de recombinacin.
La conversin gnica contribuye a la
recombinacin interallica
.
El DNA heterodplex creado por recombinacin puede tener
secuencias con apareamiento errneo, donde los alelos
recombinantes no son idnticos.
.
Los sistemas de reparacin pueden retirar apareamientos
errneos si cambia una de las cadenas, de modo que su
secuencia sea complementaria a la otra.
El superenrollamiento afecta la estructura del DNA
.
Ocurre superenrollamiento slo en un DNA cerrado sin
ningn extremo libre.
.
Un DNA cerrado puede ser una molcula circular o una
lineal donde ambos extremos se anclan a una estructura
proteinica.
Contina en la siguiente pgina
457
.
Cualquier molcula de DNA cerrada tiene un nmero
de enlace que corresponde a la suma del nmero de
contorsiones y del nmero de torcimientos.
.
Los plegamientos se pueden repartir entre el nmero
de contorsiones y el nmero de torcimientos, de
manera que un cambio en la estructura de la doble
hlice puede compensar una modificacin de su
enrollamiento en el espacio.
.
El nmero de enlace puede modificarse slo con la
rotura y la formacin de enlaces en el DNA.
fEBEl Las topoisomerasas relajan o introducen
superhlices en el DNA
.
Las topoisomerasas cambian el nmero de enlace
cuando rompen enlaces en el DNA, modifican la
conformacin de la doble hlice en el espacio y
vuelven a formar los enlaces.
Las enzimas de tipo I actan al romper una cadena
nica de DNA; las de tipo II causan roturas de dos
cadenas.
iBiiEi Las topoisomerasas rompen y resellan cadenas
.
Las topoisomerasas de tipo I actan al formar un
enlace covalente con uno de los extremos rotos, mover
una cadena alrededor de la otra y, despus, transferir
el extremo de enlace al otro extremo roto. Los enlaces
se conservan y, en consecuencia, no se requiere aporte
de energa.
mma La girasa funciona por la inversin de hlice
.
La girasa de E. cot es una topoisomerasa de tipo II
que utiliza la hidrlisis de ATP para proveer la energa
necesaria a fin de introducir superhlices negativas en
el DNA.
nata La recombinacin especializada involucra
sitios especficos
.
La recombinacin especializada comprende una
reaccin entre sitios especficos que no tienen que ser
homlogos.
.
El fago X se integra al cromosoma bacteriano por
recombinacin entre un sitio del fago y el sitio a en
el cromosoma de E. coli.
.
El fago se escinde del cromosoma por recombinacin
entre los sitios en el extremo del profago lineal.
.
El gen int del fago X codifica una integrasa que
cataliza la reaccin de integracin.
1BM La recombinacin especfica de sitio
comprende rotura y reunin
.
Se hacen escisiones a intervalos de 7 bp en los genes
attB y attP y los extremos se unen en forma cruzada.
IEBE La recombinacin especfica de sitio simula la
actividad de La topoisomerasa
.
Las integrasas tienen relacin con las topoisomerasas
y la reaccin de recombinacin se parece a la accin
de la topoisomerasa, excepto que las cadenas con
hendidura de estructuras dplex diferentes se sellan
juntas.
.
La reaccin conserva la energa al utilizar una
tirosina cataltica en la enzima para romper un enlace
fosfodister y enlazarse con el extremo 3' roto.
.
Dos unidades enzimticas se unen a cada sitio de
recombinacin y los dos dimeros hacen sinapsis para
formar un complejo donde ocurren las reacciones de
transferencia.
tMBSH La recombinacin X ocurre en un intasoma
La integracin X tiene lugar en un gran complejo que
tambin incluye a la protena IHF del hospedador.
.
La reaccin de escisin requiere Int y Xis y reconoce
los extremos de DNA del profago como sustratos.
iiaiai
iBIWii
miwa
rara
Las Levaduras pueden cambiar Loci silentes y
activos por el tipo de apareamiento
.
El locus MAT del tipo de apareamiento en levaduras
porta el genotipo MATa o MATa.
. Las levaduras con el alelo dominante HO cambian su
tipo de apareamiento con una frecuencia de ~10"6.
. El alelo en MAT se denomina cartucho activo.
.
Hay tambin dos cartuchos silentes, HMLa y HMRa.
.
Ocurre cambio si MATa es sustituido por HMLa o MATa
es sustituido por HMRa.
EL locus MAT codifica protenas reguladoras
En clulas haploides de tipo a, MATa activa los
genes requeridos para especificar las funciones a '
indispensables para el apareamiento y desactiva los
requeridos para el tipo de apareamiento a.
.
En las clulas de tipo a no se requiere MATa.
.
En clulas diplodes, los productos de al y a2
cooperan para reprimir genes especficos de clulas
haploides.
Se reprimen los cartuchos silentes en HML y
HMR
.
Los elementos silenciadores reprimen HML y HMR
.
Los loci requeridos para mantener el silenciamiento .!
incluyen SIR1-4, RAP1 y los genes de la histona H4.
Se necesita la unin de ORC (complejo de
reconocimiento del origen) a los silenciadores para la
desactivacin.
El locus MAT receptor inicia La transposicin |
unidireccional
.
El cambio del tipo de apareamiento se inicia por una
rotura de la doble cadena hecha en el locus MAT por .1
endonucleasa HO.
La regulacin de la expresin de HO controla
el cambio
0 La endonucleasa HO se sintetiza en clulas madre
haploides, de manera que un episodio de cambio hace
que ambas cadenas hijas tengan el nuevo tipo de
apareamiento.
Resumen
458
CAPTULO 19 Recombinacin homologa y especfica de sitio
Introduccin
La evolucin no podra haber ocurrido sin recom-
rinacin gentica. Si no fuese posible intercambiar
material entre los cromosomas (homlogos), el con-
'
.enido de cada cromosoma individual estara fijo
de manera irrecuperable en sus alelos particulares.
Cuando se presentasen mutaciones no sera posible
;
eparar los cambios favorables y desfavorables. La
. mgitud de la diana para el dao por mutacin au-
mentara de manera eficaz desde el gen hasta el cro-
mosoma. Al final, un cromosoma acumulara tantas
.T.utaciones deletreas que dejara de funcionar.
Por la mezcla de los genes, la recombinacin
permite separar mutaciones favorables y desfavo-
rables y probarlas como unidades individuales en
nuevos ensamblajes. Constituye un medio de es-
cape y dispersin de alelos favorables y pretende
rliminar un alelo desfavorable sin afectar a todos
'
.os dems genes con los que est vinculado. sta es
I base de la seleccin natural.
La recombinacin tiene lugar entre secuencias
en correspondencia precisa, de manera que no se
agrega o pierde un par de bases de los cromosomas
recombinantes. Tres tipos de recombinacin com-
parten la caracterstica de que el proceso comprende
intercambio fsico de material entre DNA dplex:
.
La recombinacin que comprende una re-
accin entre secuencias homlogas de DNA
se denomina recombinacin homloga o
generalizada. En las eucariotas se presenta en
la meiosis, por lo general tanto en machos
(durante la espermatognesis) como en
hembras (durante la oognesis). Hay que
recordar que sucede en la etapa de
"
cuatro
cadenas
"
de la meiosis y afecta slo a dos de
las cuatro (vase seccin 2.7, Ocurre recom-
binacin por intercambio fsico de DNA).
.
Otro tipo de suceso apoya la recombinacin
entre pares especficos de secuencias, descri-
to por primera vez entre eucariotas donde
la recombinacin especializada, tambin
conocida como recombinacin especfi-
ca de ciclo, se encarga de la integracin de
genomas de fago al cromosoma bacteriano.
El episodio de recombinacin comprende
secuencias especficas del DNA del fago y el
bacteriano, que incluyen un segmento corto
con homologa. Las enzimas participantes en
el suceso actan slo en el par de secuencias
diana particular en una reaccin intermole-
cular. Algunas reacciones intramoleculares
relacionadas se encargan de regenerar dos
cromosomas circulares monomricos duran-
te la divisin bacteriana, cuando se gener
un dmero por recombinacin generalizada.
Esta ltima clase tambin incluye episodios
de recombinacin que invierten regiones
especficas del cromosoma bacteriano,
.
Un tipo diferente de suceso permite insertar
una secuencia del DNA en otra sin depender
de la homologa de secuencia. La transposi-
cin constituye un medio por el que ciertos
elementos pasan de una localizacin cromo-
smica a otra. Los mecanismos involucrados
en la transposicin dependen de la rotura y
reunin de cadenas de DNA y, por tanto, se
relacionan con el proceso de recombinacin
(vase el Captulo 21, Transposones, y Ca-
ptulo 22, Retrovirus y retroposones).
.
En circunstancias especiales, se utiliza la
reestructuracin gnica para controlar
la expresin, que puede crear nuevos ge-
nes indispensables para la expresin en cir-
cunstancias particulares, como en el caso de
las inmunoglobulinas. La reestructuracin
puede tambin encargarse de cambiar la
expresin de un gen preexistente en otro,
como en el ejemplo del tipo de apareamien-
to de las levaduras, donde la secuencia en
un locus activo puede ser sustituida por una
secuencia de un locus silente. Ambos tipos
de reestructuracin comparten similitudes
mecnicas con la transposicin; de hecho, se
pueden considerar como casos de transposi-
cin dirigidos de manera especial.
.
Los virus RNA utilizan otro tipo de recom-
binacin, donde la polimerasa cambia de un
molde a otro mientras sintetiza RNA. Como
resultado, la molcula recin sintetizada
conjunta informacin de secuencias de dos
progenitores diferentes. Ese tipo de meca-
nismo de recombinacin se llama seleccin
de copias y se aborda de manera sucinta en
la seccin 22.4, El DNA vrico es generado
por transcripcin inversa,
Considrense la naturaleza y las consecuencias
de las reacciones de recombinacin generalizada y
especializada,
En la FIGURA 19 ' se ilustra que la recombinacin
generalizada tiene lugar entre dos cadenas dplex
de DNA homlogas y puede presentarse en cual-
quier punto de su longitud. Los dos cromosomas se
cortan en sitios equivalentes y, despus, cada uno se
une al otro para generar recombinantes recprocos.
El entrecruzamiento (marcado por la X) es el sitio
donde una cadena se une a la otra. No cambia la
organizacin global del DNA; los productos tienen
la misma estructura que sus predecesores y tanto
progenitores como productos son homlogos.
19.1 Introduccin 459
gos pueden reco
en cualquier lugar
Un dmero genera dos monmeros
Lugar 1
Lugar 2
Lugar 3
Puede ocurrir recombinacin generalizada en
cualquier punto de las longitudes de dos DNA homlogos.
Un crculo se inserta en el DNA lineal
I
Ocurre recombinacin especfica de sitio entre
dos secuencias especficas (identificadas en color verde). Las
otras secuencias en los dos DNA recombinantes no son homo-
logas.
/ \
FIGURA 19.3 Se puede usar la recombinacin especfica d
sitio para generar dos crculos monomricos a partir de _
crculo dimrico,
La recombinacin especializada ocurre slo en
tre sitios especficos. Los resultados dependen de
'
.t
localizaciones de los dos sitios de recombinacin. Ee
la FIGURA 19.2 se muestra que una recombinaci
intermolecular entre un DNA circular y uno Une;
inserta al primero en el segundo. En la IGURA 19J
se muestra que una recombinacin intramolecub
entre dos sitios de un DNA circular libera dos DN
circulares, ms pequeos. La recombinacin esp-:
cializada se usa a menudo para hacer cambios coir_
stos en la organizacin del DNA. El cambio en
organizacin es una consecuencia de las localizadi
nes de los sitios recombinantes. Se cuenta con ur.
gran cantidad de informacin acerca de las enzima
que realizan la recombinacin especializada y tier
relacin con las topoisomerasas, que cambian el sv
perenrollamiento del DNA en el espacio.
Ocurre recombinacin
homologa entre cromosomas
en sinapsis
Conceptos principales
Los cromosomas deben entrar en sinapsis (aparearse)
para formar quiasmas, donde tiene lugar el
entrecruzamiento.
Se pueden correlacionar las etapas de la meiosis con
los sucesos moleculares que ocurren en el DNA.
La recombinacin homloga es una reaccin entr
dos cadenas dplex de DNA. Su caracterstica deter
minante es que las enzimas encargadas pueden use
cualquier par de secuencias homlogas como su?
460
CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
rato (aunque algunos tipos de secuencia tal vez se
.
.
ean favorecidos con respecto a otros). La frecuen-
cia de recombinacin no es constante en todo el
-rnoma, pero influyen en ella los efectos globales y
locales. La frecuencia global puede ser diferente en
.
odios y espermatozoides; la recombinacin ocurre
ten el doble de frecuencia en mujeres y varones.
Dentro del genoma, su frecuencia depende de la
tstructura cromosmica; por ejemplo, el entrecru-
:
miento se suprime en la vecindad de las regiones
:ondensada e inactiva de la heterocromatina.
Ocurre recombinacin durante la prolongada
rrofase de la meiosis. En la
"
IGURA 19.A se compara
progreso visible de los cromosomas por las cinco
r:apas de la profase meitica con las interacciones
moleculares comprendidas en el intercambio de
material entre cadenas dplex de DNA.
El inicio de la meiosis lo marca el sitio donde los
cromosomas individuales se vuelven visibles. Cada
uno de estos cromosomas se replic antes y consta
ie dos cromtidas hermanas
,
cada una con una ca-
dena dplex de DNA. Los cromosomas homlogos
:
e acercan entre s, empiezan a aparearse en una o
ms regiones y forman bivalentes. El apareamien-
::.
se extiende hasta que toda la longitud de cada
cromosoma est en aposicin con su homlogo. El
proceso se denomina sinapsis o apareamiento
cromosomico. Cuando concluye el proceso, los
cromosomas tienen relacin lateral en forma de un
complejo sinaptonmico, el cual tiene una es-
tructura caracterstica en cada especie, si bien varan
mucho los detalles entre las especies.
La recombinacin entre cromosomas compren-
ce un intercambio fsico de las partes, por lo general
representado como rotura y reunin, donde dos
cromtidas no hermanas (cada una con una cadena
cplex de DNA) han sido rotas y despus unidas
entre s. Cuando los cromosomas empiezan a sepa-
rarse, se puede observar que se mantienen unidos
en sitios bien definidos llamados quiasmas. El n-
mero y la distribucin de los quiasmas simulan las
caractersticas del entrecruzamiento gentico. En el
anlisis usual se afirma que un quiasma representa
el proceso de entrecruzamiento (FIGURA 19.5). Los
quiasmas se mantienen visibles cuando los cromo-
omas se condensan y las cuatro cromtidas se ha-
cen evidentes.
Cul es la base molecular de estos sucesos?
Zada cromtida hermana contiene una sola cadena
ie DNA dplex, de modo que cada bivalente cons-
ta de cuatro molculas dplex de DNA. La recom-
cinacin requiere un mecanismo que permita a la
cadena dplex de DNA de una cromtida hermana
mteractuar con la correspondiente de su contrapar-
te en el otro cromosoma. Debe ser posible que esta
recombinacin ocurre en etapas es
Avance por la meiosis
Los cromosomas
condensados se
tornan visibles, a
menudo unidos a la
envoltura nuclear
Cigoteno
Los cromosomas
inician el
apareamiento en
una o varias regiones
limitadas
El complejo
sinaptonmico se
extiende por toda la
longitud de los
cromosomas
apareados
Diploteno
Los cromosomas se
separan, pero
permanecen juntos
en los quiasmas
iacinesis
Los cromosomas se
condensan, se
desprenden de la
envoltura; los
quiasmas persisten.
Las cuatro cromtides
se tornan visibles
mumr.'ttm.mm
Interacciones moleculares
Cada cromosoma
\/V /"\/V'\/ se ha replicado y
consta de dos
\yA.tVA/A.<A//
hermanaS'
\JM\frJ7s/\// Iniciacin
\/MJsy\/M\// Intercambio de
, _ . _ cadenas
s/ v/ \.' vy v' se intercambian
/ cadenas nicas
Asimilacin
n r, /i /- /
Se extiende la
v/v /w./
regn de cadenas
_
A . intercambiadas
VX<\/V\V-' Resolucin
\/7\//ASK///
FIGURA 19. La recombinacin tiene lugar durante la primera profase
de la meiosis. Las etapas de la profase se definen por el aspecto de
los cromosomas, cada uno constituido por dos rplicas (cromtidas
hermanas), si bien el estado duplicado se hace visible slo al final. Las
interacciones moleculares en cualquier episodio de entrecruzamiento
individual comprenden dos de los cuatro DNA dplex.
reaccin ocurra entre cualquier par de secuencias
correspondientes de las dos molculas en una forma
muy especfica, que permita el intercambio de ma-
terial con precisin en el mbito de pares de bases
individuales.
Se sabe de slo un mecanismo para que los ci-
dos nucleicos se reconozcan entre s con base en
la secuencia: la complementariedad entre cadenas
nicas. La Figura 19.5 muestra un modelo general
de la participacin de cadenas nicas en la recombi-
nacin. El primer paso para la provisin de cadenas
nicas es hacer una rotura en cada cadena dplex
del DNA. Una o ambas de ese par de cadenas pue-
den entonces liberarse. Si (al menos) una cadena
desplaza a la correspondiente en el otro par, las dos
molculas dplex se conectarn de manera espe-
cfica en secuencias correspondientes. Si el inter-
19.2. Ocurren recombinaciones homlogas entre cromosomas en sinapsis
461
Las recombinantes tienen DNA hbrido
Molculas de DNA progenitoras
mmmnmmmM
i
Productos intermedios de la recombinacin
Trm111 hTi i pniiin
m.
.TTTTTTTf
f
. TinnT
i
Recombinantes
Tfninmiimiim
ni..11111111111111111
FICURA 19.: La recombinacin implica apareamiento entre
cadenas complementarias de los dos DNA progenitores.
cambio de cadenas se extiende, puede haber una
conexin ms amplia entre las cadenas dplex. Si
se intercambian ambas cadenas y luego se cortan, es
posible conectar las molculas dplex progenitoras
mediante el entrecruzamiento que corresponda a
las demandas de una rotura y reunin.
No se pueden correlacionar de manera riguro-
sa estos sucesos moleculares en tal unin con los
cambios que se observan en el mbito de los cromo-
somas. No hay informacin detallada acerca de los
sucesos moleculares involucrados en la recombina-
cin en clulas eucariticas superiores (en las que
se ha observado ms de cerca la meiosis). En fecha
reciente, no obstante, el aislamiento de mutantes
en las levaduras ha permitido correlacionar algunos
de los pasos moleculares con etapas aproximadas de
la meiosis. Se dispone de informacin detallada del
proceso de recombinacin en las bacterias, donde se
sabe que las actividades moleculares pueden causar
intercambio gentico entre molculas dplex. Sin
embargo, la reaccin bacteriana comprende una in-
teraccin entre las regiones restringidas del genoma,
ms que un apareamiento ntegro de los genomas.
La sinapsis de los cromosomas eucariticos sigue
siendo la etapa ms difcil de explicar en el mbito
molecular.
ron Rotura y reunin afectan
el DNA heterodplex
Conceptos principales
.
El suceso clave de la recombinacin entre dos
molculas de DNA dplex es el intercambio de cadenas
nicas.
.
Cuando una sola cadena de una estructura dplex
desplaza a su contraparte en la otra, crea una
estructura ramificada.
.
El intercambio genera un segmento de DNA
heterodplex, constituida por una cadena de cada
progenitor.
.
Se necesitan dos intercambios (recprocos) para
generar una molcula articulada.
.
La molcula articulada se resuelve en dos molculas
dplex independientes mediante una hendidura en dos
de las cadenas que se conectan.
.
El que se formen recombinantes depende de que las
cadenas participantes en el intercambio original, o el
otro par, presenten hendiduras durante la resolucin.
El acto de conectar dos molculas dplex de DN-
es el meollo del proceso de recombinacin. El an-
lisis molecular de la recombinacin, por tanto, s-
inicia con la expansin del concepto del uso dj
apareamiento de bases entre cadenas nicas com-
plementarias. Es conveniente imaginar la reaccin
de recombinacin en trminos de intercambios de
una sola cadena (aunque se ver que en la realidad
no tiene que ser as como se inicia), debido a que las
propiedades de las molculas creadas en esa forrm
son medulares para comprender los procesos invo-
lucrados en la recombinacin.
En la FIGURA 19.6 se ilustra un proceso que se
inicia con la rotura de los puntos correspondiente?
de dos cadenas homologas de DNA apareadas. 9
rotura permite el movimiento de los extremos libres
creados por las hendiduras. Cada cadena deja a sv
contraparte y se cruza para aparearse con su com-
plemento en la otra cadena dplex.
El intercambio recproco crea una conexin
entre las dos cadenas dplex de DNA. El par de ca-
denas dplex conectado se llama molcula articu-
lada. El sitio donde una cadena individual de DNA
se cruza de una cadena dplex a la otra se llama
articulacin recombinante.
En el sitio de recombinacin, cada cadena d
plex tiene una regin constituida por una cadena
de cada una de las molculas de DNA progenitoras.
regin que se denomina DNA hbrido o DNA he-
terodplex.
Una caracterstica importante de una articula-
cin recombinante es su capacidad de desplazarse
462 CAPTULO 19 Recombinacin homologa y especfica de sitio
Una reaccin de recombinacion tiene dos
posibles resultados
Los sitios de ramificacin pueden migrar
Los DNA dplex
se aparean
Las cadenas
homologas son
asiento de
hendiduras
Las cadenas
rotas se
intercambian
entre las dplex
iimimimimim
[rrmrmminirm
iniiiiiitiiiiiiiiiii
L
iii inummiH
jjjjiLiiiiiiliill
i
El punto de
entrecruzamiento
"
se desplaza por j
migracin de
rama
mrrrmmmrrmf
Se sellan
las hendiduras
mwmmmui
nnmmmiL.
Se hacen segundas
t(
/ V Se hacen segundas
hendiduras en la *
*
hendiduras en la otra
misma cadena cadena
hiiinimiiimiim
Se sellan I
las hendiduras
*
tHfrrmrrHfmn
iiiitiiiiiitiiiiiiiii
Los genomas no son
recombinantes, pero
contienen una regin
heteroduplex
iimiiiiiiimiiliii
111; i 11:111111 w h i
Las segundas
cadenas se cruzan 1
entre cadenas dplex
:
.iu.nm
iniHii in
HllilNtlIHINII
iiiitfiiinirmii
Se generan genomas
recombinantes recprocos
6 La recombinacin entre dos DNA dplex aparea-
Sos podra comprender el intercambio recproco de una sola
;;
dena, migracin de ramas y hendiduras.
por la cadena dplex. Esta movilidad se denomina
migracin de rama. En la Fl se ilustra la
migracin de una cadena nica en una dplex. El
unto de ramificacin puede emigrar en cualquier
direccin a medida que una cadena desplaza a la
tra.
La migracin de rama es importante por mo-
Vos tericos y prcticos. A manera de principio,
confiere una propiedad dinmica a las estructuras
recombinantes. Como caracterstica prctica, su
existencia indica que no puede establecerse el punto
jk ramificacin con el examen de una molcula in
Uro (porque la rama podra haber emigrado desde
que se aisl la molcula).
i
i
FIGURA 19.7 Puede ocurrir migracin de ramas en cualquier
direccin cuando una cadena no apareada desplaza a una apa-
reada.
La migracin de rama podra permitir que el
punto de entrecruzamiento en el intermedio de la
recombinacin se mueva en cualquier direccin. La
velocidad de migracin es incierta pero, como se
observa in vitro, tal vez sea insuficiente para /es-
paldar la formacin de regiones extensas de D.TA
heterodplex en condiciones naturales. Cualquier
migracin extensa de rama in vivo debe, por tanto,
ser catalizada por una enzima de recombinacin.
La molcula articulada formada por e! inter-
cambio de cadenas debe resolverse en dos molculas
dplex separadas. La resolucin requiere un par
de hendiduras ms. Se puede visualizar el resultado
con la mayor facilidad si se observa la molcula
articulada en un plano como la unin Holliday,
la se ilustra en la '.8
, y que representa la
estructura de la Figura 19.6 con una cadena d-
plex girada con relacin a la otra. El resultado de
la reaccin depende de qu par de cadenas tiene la
hendidura.
Si se hacen las hendiduras en el par de cadenas
que en un principio no las tenan (el par que no
inici el intercambio de cadenas), las cuatro cadenas
originales habrn sido motivo de hendidura. Esto
libera molculas de DNA recombinantes con em-
palme. La cadena de DNA dplex de un progenitor
se enlaza de manera covalente a la del otro median-
te un segmento de DNA heterodplex. Ha habido
un episodio de recombinacin convencional entre
marcadores localizados a cada lado de la regin he-
terodplex.
19.3 Rotura y reunin afectan el DNA heterodplex
463
ibinacin tiene resoluciones alterna!
Ls rotacin muestra la
estructura de la unin
Holliday
Las hendiduras en otras
cadenas liberan
recombinantes de escisin
Las hefididura.s controlan
los resultados
Las hendiduras en las
mismas cadenas liberan
recombinantes en parches
FIGURA 19.8 La resoLucin de una unin Holliday puede ge-
nerar cadenas dplex progenitoras o recombinantes, depen-
diendo de cules sean asiento de una hendidura. Ambos tipos
de producto tienen una regin de DNA heterodplex.
Si las mismas dos cadenas involucradas en las
hendiduras originales son objeto de hendiduras otra
vez, las dos cadenas adicionales se mantienen in-
tactas. Las hendiduras liberan las cadenas dplex
progenitoras originales, que se mantienen intactas,
con excepcin de que cada una tiene un residuo del
suceso en forma de una longitud de DNA heterod-
plex. A estas estructuras se les denomina recombi-
nantes en parche.
Estas resoluciones alternativas de la molcula
articulada establecen el principio de que un inter-
cambio de cadenas entre DNA dplex siempre deja una
regin de DNA heterodplex como residuo, pero el inter-
cambio no siempre se acompaa de la recombinacn de
las regiones en los flancos.
Cul es la longitud mnima de la regin in-
dispensable para establecer la conexin entre las
cadenas dplex recombinantes? Los experimentos
en los que se introdujeron secuencias homologas
cortas de plsmidos o fagos en bacterias sugieren
que la tasa de recombinacin es sustancialmente
menor si la regin homologa es <75 bp. Esta distan-
cia es bastante ms larga que los -10 bp requeridos
para el vnculo entre regiones complementarias de
cadena nica, lo que sugiere que la recombinacn
impone demandas que rebasan la hibridacin de las
complementaras como tales.
ITEl Las roturas de La doble cadena
inician La recombinacin
Conceptos principales
.
La recombinacin se inicia con una rotura de la doble
cadena en una cadena de DNA dplex (receptora).
.
La actividad de La exonucleasa genera extremos 3'
de cadena nica que invaden la otra cadena dplex
(donadora).
.
La sntesis nueva de DNA sustituye el material que ha
sido degradado.
.
Esto genera una molcula de articulacin recombinante
donde las dos cadenas de DNA dplex estn conectadas
por DNA heterodplex.
El modelo general de la Figura 19.4 muestra q?
se puede hacer una rotura en una cadena dplex i
fin de generar un sitio a partir del cual se puedan
desenrollar cadenas nicas que participen en el in-
tercambio gnico. Ambas cadenas de una estructura
dplex deben romperse para lograr un intercambi
gnico. La Figura 19.6 muestra el modelo donde
ocurren roturas sucesivas individuales en cadenas
nicas. El intercambio gnico, sin embargo, se inicis
en realidad por una rotura de la doble cadena
(double-strand break, DSB). El modelo se ilustra er,
la FIGURA 19.9.
La recombinacn la inicia una endonucleas;
que escinde una de las cadenas dplex del DNA
progenitor,
"
receptor
"
.
El corte crece hasta tomar-
se en una brecha por la accin de la exonucleasa
La exonucleasa corta una cadena a cada lado de !a
rotura y genera extremos 3
'
de una sola cadena
Uno de los extremos 3' libres invade entonces una
regin homloga en la otra cadena dplex de DNA
(
"donador
"
), lo que se denomina invasin por una
cadena nica. La formacin de DNA heterodplex
genera una hlice D, donde se desplaza una cadenfl
dplex del DNA donador. El hlice D se extientt
por la sntesis del DNA de reparacin, utilizando el
extremo 3
'
libre como molde para generar DNA de
doble cadena.
En un momento dado, el hlice D alcanza ei
tamao suficiente para corresponder a la longitu:
total de la brecha en la cromtida receptora. Cuandc
la cadena nica expulsada alcanza el lado distan-
te de la brecha, las secuencias complementarias de
una sola cadena se hibridan. Ahora hay un DNA
464
CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
Una rotura de doble cadena inicia la recombinacion
Rotura de doble cadena
hecha en el receptor
UTimnnniimimmni
La rotura crece hasta
formar una brecha con
extremos 3
'
iiiiimmmiiiimimii
nmur iiiimil
El extremo 3' migra a otra
cadena dplex
Hlice D
lll
La sntesis desde el extremo
3
'
desplaza a una cadena
en la brecha
lllllllll
m
-
Mil
ii
La cadena desplazada
migra a otra cadena dplex
IMil' tiiiminn
m
mu
Ocurre sntesis de DNA
desde otro extremo 3'
HM Mil
uuuu
La brecha es sustituida por la secuencia J
donadora
itiiiiiiiihi
TTTTT
ijlli
La migracin recproca
genera un doble
entrecruzamiento
heterodplex a cada lado de la brecha y sta est
representada por el hlice D de una sola cadena.
La integridad dplex de la regin con brecha
se puede restablecer con la sntesis de reparacin
utilizando el extremo 3' en el lado izquierdo de la
brecha como cebador. En formal global, la brecha
ha sido reparada por dos rondas individuales de sn-
tesis de cadenas nicas de DNA.
La migracin de ramas convierte esta estructura
en una molcula con dos articulaciones recombi-
nantes que deben resolverse por corte.
Si ambas articulaciones se resuelven en la mis-
ma forma, se liberarn las molculas originales sin.
entrecruzamientos, cada una con una regin de
informacin gentica alterada que es vestigio del
episodio de intercambio. Si las dos articulaciones
se resuelven en formas contrarias tiene lugar un
entrecruzamiento gnico.
La estructura de la molcula con dos articula-
ciones antes de su resolucin ilustra una diferencia
determinante entre el modelo de rotura de doble
cadena y aquellos que comprenden slo intercam-
bios de una cadena.
.
Despus de la rotura de la doble cadena
se ha formado DNA heterodplex en cada
extremo de la regin que interviene en el
intercambio. Entre los dos segmentos he-
terodplex se encuentra la regin corres-
pondiente a la brecha que ahora tiene la
secuencia del DNA donador en ambas mo-
lculas (Figura 19.9). As, la estructura de
las secuencias heterodplex es asimtrica
y parte de una molcula se ha convertido a
la secuencia de la otra (motivo por el que la
cromtida de inicio se llama receptora).
.
Despus del intercambio recproco de una
sola cadena, cada DNA dplex tiene mate-
rial heterodplex que cubre la regin desde
su sitio inicial de intercambio hasta la rama
emigrante (Figura 19.6). En variantes del
modelo de intercambio de una sola cadena,
donde el DNA se degrada y resintetiza, la
cromtida de inicio es la donadora de infor-
macin gentica.
El modelo de rotura de doble cadena no dismi-
nuye la importancia de la formacin del DNA hete-
rodplex, que sigue siendo el nico mtodo posible
por el que dos molculas dplex pueden interactuar.
No obstante, cambiar la responsabilidad de iniciar
la recombinacin de roturas de cadena nica a las
de cadena doble influye en la manera de percibir la
capacidad de la clula de actuar sobre el DNA.
La participacin de las roturas de doble cadena
al principio parece sorprendente. Una vez que se
ha hecho una rotura a travs de una molcula del
DNA no hay retorno. Comprense los sucesos de
La recombinacin se inicia con la rotura de
una doble cadena, seguida de la formacin de extremos 3
'
de una sola cadena, uno de los cuales emigra a una cadena
dplex homloga.
las Figuras 19.6 y 19.9. En ningn punto conlleva
prdida de informacin el modelo de intercambio
de una sola cadena. No obstante, en el modelo de
rotura de doble cadena, la escisin inicial es seguida
de inmediato por prdida de la informacin. Cual-
quier error en la recuperacin de la informacin
podra ser letal. Por otro lado, la capacidad misma
de recuperar la informacin perdida por resntesis
a partir de otra cadena dplex constituye una red
importante de seguridad para la clula.
tm los cromosomas
en recombiftaddn se conectan
por eL complejo sinaptonmico
Conceptos principales
.
Durante la primera parte de la meiosis, los cromosomas
homlogos se aparean en el complejo sinaptonmico.
.
La masa de cromatina de cada cromosoma homlogo
est separada de la otra por un complejo proteinceo.
Una paradoja bsica en la recombinacin es que los
cromosomas progenitores nunca parecen tener un
contacto bastante cercano para que ocurra la re-
combinacin del DNA. Los cromosomas entran a la
meiosis en forma de pares replicados (cromtidas
19.5 Los cromosomas en recombinacin se conectan por el complejo sinaptonmico
465
lejo sinaptonmico se extiende de manera longitudinal
siHS ,:? MI-
FIGURA 19.10 El complejo sinaptonmico ubica a los cromosomas
en yuxtaposicin. Reproducida de D. von Wettstein. 1971. Proc.
Nati Acad. Sci. USA. 68: 851-855. Fotografa por cortesa de D. von
Wettstein, Washington State University.
El complejo sinaptonmico enlaza los pares homlogos
Hlice de DNA dplex
ms protenas
Eje de
cohesinas
!/ )/ )/ V
m
Las protenas
zip conectan
pares
homlogos
Cromtidas
hermanas
Cromtidas
"
hermanas
Elemento lateral
Elemento central
Elemento lateral
Cada par de cromtidas hermanas tiene un eje for-
mado por cohesinas. Las hlices de la cromatina se proyectan desde
el eje. El complejo sinaptonmico se forma con el enlace de los ejes
a travs de protenas zip.
hermanas), visibles como masa de cromatina. Se
aparean para formar el complejo sjunaptonml-
cc y se ha supuesto durante muchos aos que ello
representa alguna etapa involucrada en la recombi-
nacin, tal vez un prembulo necesario para el in-
tercambio de DNA. El punto de vista ms reciente es
que el complejo sinaptonmico es una consecuencia
ms que una causa de la recombinacin, pero an
se tiene que definir cmo la estructura del complejo
sinaptonmico se relaciona con los contactos entre
molculas de DA.
La sinapsis se inicia cuando cada cromosoma
(par de cromtidas hermanas) se condensa alrede-
dor de una estructura llamada elemento $3lal
,
que al parecer es proteinceo. A continuacin, se
alinean los elementos axiales de cromosomas co-
rrespondientes y se forma el complejo sinaptonmi-
co como estructura tripartita, donde los elemento?
axiales, ahora llamados elementos laterales, estn
separados entre s por un elemento central. En I
FIGURA 19.10 se muestra un ejemplo.
En esta etapa cada cromosoma parece una mas;
de cromatina unida limitada por un elemento la-
teral. Los dos elementos laterales estn separado;
entre s por un elemento central fino, pero denso,
El triplete de cadenas densas paralelas yace en ur.
solo plano que se encorva y gira sobre su eje. Le-
distancia entre los cromosomas homlogos es con-
siderable en trminos moleculares, de ms de 20
nm (el dimetro del DNA es de 2 nm). As, un
problema importante para comprenderla participa-
cin del complejo es que si bien alinea cromosomas
homlogos, est bastante lejos de poner en contaa
molculas homlogas de DNA.
El nico vnculo visible entre los dos lados del
complejo sinaptonmico lo constituyen estructuras
-
esfricas o cilindricas que se observan en hongo*
e insectos. Yacen a travs del complejo y se deno-
minan nodos o nodulos de recombinacin; st
presentan con la misma frecuencia y distribucin
que los quiasmas. Su nombre refleja la esperanza
de que pudiesen demostrar que son los sitios de i
recombinacin.
A partir de mutaciones que afectan la forma-
cin del complejo sinaptonmico se pueden rela-
cionar los tipos de protenas que participan en su
estructura. En la IGURA 19.11 se ilustra una visr
molecular del complejo sinaptonmico. Sus carac-
tersticas estructurales distintivas se deben a d<l
grupos de protenas:
.
Las cohesinas forman un solo eje lineal par:
cada par de cromtidas hermanas desde
donde se extienden hlices de cromatin?-
Esto equivale al elemento lateral de la Fi-
gura 19.10. (Las cohesinas pertenecen a m
grupo general de protenas que intervienen
en la conexin de cromtidas hermanas, I
modo que se segreguen en forma apropiad;
en la mitosis de la meiosis.)
.
Los elementos laterales se conectan median-
te filamentos transversos que equivalen I
elemento central de la Figura 19.10, consti-
tuidos por protenas Zip.
Las mutaciones en las protenas necesarias pare
que se formen los elementos laterales se encuentrar.
en los genes que codifican las cohesinas. Las cohe-
sinas que se utilizan en la meiosis incluyen SmcS
(que tambin se utiliza en la mitosis) y RecSp (qur
es especfica de la meiosis y se relaciona con la cobe=
sina mittica Scclp). Las cohesinas parecen unirse
466 CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
I sitios especficos a lo largo de los cromosomas du-
rante la mitosis y la meiosis. Es probable que tengan
ana participacin estructural en la segregacin de
Es cromosomas. En la meiosis, a veces se requiere
la formacin de elementos laterales para las etapas
ms avanzadas de la recombinacin, porque si bien
;
stas mutaciones no impiden la formacin de ro-
turas de doble cadena, bloquean la formacin de
recombinantes.
La mutacin zipl permite que se formen y ali-
neen los elementos laterales, pero no que presenten
sinapsis estrecha. El dominio terminal N de la pro-
tena Zipl se localiza en el elemento central, pero
el dominio terminal C se localiza en los elementos
laterales. Otras dos protenas, Zip2 y Zip3, tambin
se ubican con Zipl. El grupo de protenas Zip forma
ilamentos transversos que conectan los elementos
laterales de los pares de cromtidas hermanas.
RTl EL complejo sinaptonmico
se forma despus de roturas
de doble cadena
Conceptos principales
.
Las roturas de la doble cadena que inician la
recombinacin ocurren antes de que se forme el
complejo sinaptonmico.
.
Si se bloquea la recombinacin, el complejo
sinaptonmico no puede formarse.
Hay pruebas slidas en levaduras de que las ro-
turas de la doble cadena inician la recombinacin
tanto en la forma homloga como en la especfica
de sitio. En un inicio se pens que las roturas de la
doble cadena tenan que ver con el cambio del tipo
de apareamiento, que comprende la sustitucin de
una secuencia por otra (vase la seccin 19.23,
La transposicin unidireccional es iniciada por el
locus MAT receptor). Tambin ocurren roturas de
doble cadena en las primeras etapas de la meiosis,
en sitios que constituyen puntos calientes (puntos
Bie referencia) para la recombinacin. Sus localiza-
ciones no son especficas de secuencia. Tienden a
presentarse en regiones promotoras y, en general,
a coincidir con regiones ms accesibles de la cro-
matina. La frecuencia de recombinacin desciende
en un gradiente a uno o ambos lados del punto
caliente. El punto caliente identifica el sitio donde
se inicia la recombinacin y el gradiente refleja la
probabilidad de que se puedan esparcir los sucesos
de la recombinacin a partir de l.
Ahora se puede interpretar la participacin de
las roturas de doble cadena en trminos molecula-
res. Los extremos romos creados por la rotura de
La Spo11 genera roturas de doble cadena
Escisin reversible
r
>\A\AV 5
Spoll
i
r/
A/A/A
Disociacin
del complejo
Spo11
Retiro de Spo11 >
seguido por ataque I
de nucleasa
*
5
'
5
'
La Spoll se une en forma covalente a los
tremos 5' de las roturas de cadena doble.
ex-
la doble cadena se convierten con rapidez a ambos
lados en extremos 3' largos de cadenas nicas, como
se muestra en el modelo de la Figura 19.9. Una mu-
tacin de las levaduras {rad50) que bloquea la con-
versin del extremo de flujo en una protrusin de
una sola cadena tiene defectos en la recombinacin.
Esto sugiere que las roturas de doble cadena son
indispensables para la recombinacin. El gradiente
est determinado por la probabilidad cada vez me-
nor de que se genere una regin de una sola cadena
a medida que aumenta la distancia con el sitio de la
rotura de la doble cadena.
En los murantes radSO, los extremos 5' de las
roturas de la doble cadena se conectan con la pro-
tena Spoll, que es homloga de las subunidades
catalticas de una familia de topoisomerasas de tipo
II. Esto sugiere que Spoll tal vez sea una enzima
similar a la topoisomerasa que genera roturas de
la doble cadena. En la figura se muestra el
modelo de esta reaccin que sugiere que Spol 1 in-
teracta de manera reversible con el DNA; la rotura
se convierte en una estructura permanente por la
interaccin con otra protena que disocia el comple-
jo Spoll. Al retiro de Spoll le sigue, entonces, la
accin de la nucleasa. Se requieren al menos otras
nueve protenas para procesar las roturas de la do-
ble cadena. Se necesita un grupo de protenas para
convertir la rotura de la doble cadena en extremos
3
'
-
OH protruyentes de una sola cadena. Luego, otro
grupo permite que los extremos de una cadena ni-
ca invadan el DNA dplex homlogo.
19.6 El complejo sinaptonmico se forma despus de roturas de doble cadena
467
La sincronizacin de los epis
la melosis p
ulares y morfolgicos
tener relacin
Productos sin Molculas
entrecruzamiento recombinantes
t t
Sucesos moleculares
Tiempo (minutos)
Roturas de doble cadena Molculas articuladas
Desapa-
Aparecen recen Persisten
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
t
Sucesos citolgcos' Termina la Se forman Se forman los Se disocian lo?
replicacin elementos complejos complejos
del DNA axiales sinaptonmicos sinaptonmicc-?
Etapa de la meiosis Leptoteno Cigoteno Paquiteno Diploteno
FIGURA 19.13 Las roturas de cadena doble aparecen cuando se forman y desaparecen
elementos axiales durante la expansin de los complejos sinaptonmicos. Aparecen mol-
culas articuladas y persisten hasta que se detectan recombinantes de DNA en el extremo
del paquiteno.
La correlacin entre la recombinacin y la for-
macin del complejo sinaptonmico est bien es-
tablecida y estudios recientes han demostrado que
todas las mutaciones que anulan el apareamiento
cromosmico en el gnero Drosophila o en levaduras
tambin impiden la recombinacin. El sistema para
generar las roturas de doble cadena que inician la
recombinacin suele conservarse. Los homlogos
Spoll se han identificado en varias eucariotas su-
periores y una mutacin en el gen de Drosophila
bloquea toda recombinacin meitica.
Hay pocos sistemas donde es posible comparar
los sucesos moleculares y citolgicos en la recombi-
nacin, pero en fecha reciente se ha avanzado en los
anlisis de la meiosis en Saccharomyces cerevisiae. En
la FIGURA se resume la sincronizacin relativa
de los sucesos.
Aparecen roturas de doble cadena y luego des-
aparecen en un periodo de 60 min. Las primeras
molculas articuladas que son intermediarias puta-
tivas de la recombinacin aparecen poco despus de
que desaparecen las roturas de la doble cadena. La
secuencia de sucesos sugiere que las roturas de la
doble cadena, las reacciones individuales de aparea-
miento y la formacin de estructuras recombinantes
tienen lugar de manera sucesiva en el mismo sitio
cromosmico.
Las roturas de la doble cadena aparecen durante
el periodo en que se forman los elementos axiales y
desaparecen en el momento en que los cromosomas
apareados se convierten en complejos sinaptonmi-
cos. Esta sincronizacin relativa de sucesos sugiere
que la formacin del complejo sinaptonmico es
resultado del inicio de la recombinacin a travs
de la introduccin de roturas de doble cadena y 5.
conversin en intermediarios posteriores de la re-
combinacin. Esta idea se sustenta en la observa-
cin de que la mulante rad50 no puede convertir
elementos axiales en complejos sinaptonmicos, k
que refuta la opinin habitual de que el compkk
sinaptonmico representa en la meiosis la necesida ;
de que el apareamiento cromosmico preceda a los
sucesos moleculares de la recombinacin.
Ha sido difcil determinar si ocurre recombin; -
cin en la etapa de la sinapsis, porque la recombi-
nacin se valora por la aparicin de recombinante;
despus de concluir la meiosis. No obstante, cuando
se valora la aparicin de recombinantes en levadu -
ras, directamente en trminos de la produccin de
molculas de DNA que contienen sitios de restriccir
diagnsticos, se ha podido demostrar que los recom-
binantes aparecen al final de la etapa de paquiteno.
Esto indica con claridad que el episodio de recom-
binacin concluye despus de la formacin de k>5
complejos sinaptonmicos.
As, el complejo sinaptonmico se forma des-
pus de las roturas de doble cadena que inician V
recombinacin y persiste hasta la formacin de mo-
lculas recombinantes. No parece ser necesario pars
la recombinacin en s, porque algunos mutante?
que carecen de un complejo sinaptonmico norma!
pueden generar recombinantes. Sin embargo, la;
mutaciones que suprimen la recombinacin tampo-
co pueden estructurar un complejo sinaptonmico.
Esto sugiere que el complejo sinaptonmico se for-
ma como consecuencia de la recombinacin, des-
pus del apareamiento de los cromosomas, y que el-
indispensable para etapas posteriores de la meiosi?-
468
CAPTULO 19 Recombinacin homologa y especfica de sitio
Desde que se propuso el modelo de recombi-
nacin a travs de la estructura Holliday, se ha su-
puesto que la resolucin de esa estructura da origen
a productos sin entrecruzamiento (con un segmento
residual de DNA hbrido) o a entrecruzamientos (re-
combinantes), de acuerdo con las cadenas que par-
ticipen en la resolucin (vase la Figura 19.8). Las
mediciones recientes del tiempo de produccin de
molculas con y sin entrecruzamiento, no obstante,
sugieren que tal vez esto no sea cierto. Los entre-
cruzamientos no aparecen hasta bastante despus de
que aparecen por primera vez las molculas articu-
ladas, en tanto la ausencia de entrecruzamientos se
observa casi de manera simultnea con esas mol-
culas (vasela Figura 19.13). Sin embargo, si ambos
tipos de productos provinieran del mismo proceso
de resolucin, se esperara que aparecieran al mismo
tiempo. La discrepancia en la sincronizacin sugie-
re que los entrecruzamientos se producen como se
pens antes, por resolucin de molculas articula-
das, pero que podra haber alguna otra va para la
aparicin de ausencia de entrecruzamientos.
El apareamiento y La formacin
deL complejo sinaptonmico
son "independientes
Concepto principal
.
Pueden ocurrir mutaciones durante el apareamiento
cromosmico o la formacin del complejo
sinaptonmico sin afectar el otro proceso.
Se pueden distinguir el proceso de apareamiento y
el de formacin del complejo sinaptonmico por los
efectos de dos mutaciones, cada una de las cuales
bloquea uno de los procesos sin afectar el otro,
La mutacin zip2 permite que los cromosomas
se apareen, pero no que formen complejos sinapto-
nmicos. As, el reconocimiento entre homlogos es
independiente de la recombinacin o la formacin
del complejo sinaptonmico.
La especificidad del vnculo entre cromosomas
homlogos la controla el gen hop2 en S. cerevisiae. En
los mulantes de hop2 se forman cantidades norma-
les de complejos sinaptonmicos en la meiosis, pero
los complejos individuales contienen cromosomas
no homlogos, lo que sugiere que la formacin de
complejos sinaptonmicos como tal es independien-
te de la homologa (y, por tanto, no puede basarse
en comparaciones extensas de secuencias de DNA).
La funcin habitual de Hop2 es impedir la interac-
cin de cromosomas no homlogos.
Se forman roturas de doble cadena en los cro-
mosomas con apareamiento errneo en los com-
plejos sinaptonmicos de los mutantes hop2, pero
no se reparan. Esto indica que si la formacin del
complejo sinaptonmico requiere roturas de doble
cadena, no necesita ninguna reaccin extensa de
estas roturas con el DNA homlogo.
No se sabe lo que en general ocurre durante el
paquiteno, antes de que se observen las recombi-
nantes del DNA. Tal vez este periodo se ocupa con
los pasos subsiguientes de recombinacin, que com-
prenden la extensin del intercambio de cadenas, la
sntesis de DNA y la resolucin.
En la siguiente etapa de la meiosis (diploteno),
los cromosomas desmiembran el complejo sinapto-
nmico; los quiasmas se hacen visibles, entonces,
como puntos donde los cromosomas estn conec-
tados. Se cree que esto indica la aparicin de un in-
tercambio gentico, pero se desconoce la naturaleza
molecular del quiasma. Es posible que represente el
residuo de un intercambio concluido o la conexin
entre cromosomas homlogos donde an no se ha
resuelto un intercambio gentico. Ms adelante en
la meiosis, los quiasmas se desplazan hacia los extre-
mos de los cromosomas. Esta flexibilidad sugiere que
representan algn residuo del episodio de recombi-
nacin ms que constituir el intermediario real.
Los episodios de recombinacin ocurren en si-
tios bien definidos en los cromosomas meiticos,
pero no se puede an correlacionar su aparicin con
las estructuras bien definidas que se han observado,
esto es, nodulos de recombinacin y quiasmas. Los
discernimientos de las bases moleculares de la for-
macin de estructuras discontinuas, sin embargo,
son provistos por la identificacin de las protenas
involucradas en la recombinacin de las levaduras,
que pueden localizarse en sitios bien definidos. s-
tos incluyen MSH4 (que tiene relacin con prote-
nas bacterianas involucradas en la reparacin de
apareamientos errneos) y Dmcl yRadSl (que son
homlogas de la protena RecA de E. coli). An no se
establecen las fundones exactas de estas protenas
en la recombinacin.
Los episodios de la recombinacin estn sujetos
a un control general. Slo una mnima parte de las
interacciones en realidad maduran como entrecru-
zamientos, pero se distribuyen de manera tal que,
en general, cada par de homlogos requiere slo
uno a dos entrecruzamientos y, sin embargo, la pro-
babilidad de 0 entrecruzamientos para un par ho-
mlogos es muy baja (<0.1%). Este proceso tal vez
sea resultado de un control de entrecruzamiento
nico, porque la no aleatoriedad de los entrecru-
zamientos suele desaparecer en ciertos mutantes.
Es ms, es necesaria la aparicin de recombinacin
para el avance en la meiosis y hay un sistema de
"
punto de revisin
"
que bloquea la meiosis si no
ha ocurrido recombinacin. (El bloqueo se levanta
cuando se ha concluido con buenos resultados la
19.7 El apareamiento y la formacin del complejo sinaptonmico son independientes
469
recombinacin; este sistema constituye una salva-
guarda que garantiza que las clulas no traten de
segregar sus cromosomas hasta que haya ocurrido
la recombinacin.)
Ql Las secuencias chi estimulan
el sistema RecBCD bacteriano
Conceptos principales
El complejo RecBCD tiene actividades de nucleasa y
helicasa.
Se une al DNA en sentido descendente respecto de una
secuencia chi, desenrolla la cadena dplex y degrada
una cadena de 3
'
a 5' conforme se desplaza hacia el
sitio chi.
.
El sitio chi desencadena la prdida de la subunidad
RecD y la actividad de nucleasa,
La naturaleza de los episodios comprendidos en el
intercambio de secuencias entre molculas de DNA
fue descrita por primera vez en sistemas bacterianos,
Ah, la reaccin de reconocimiento es parte insepa-
rable del mecanismo de recombinacin e involucra
regiones restringidas de molculas del DNA ms que
cromosomas ntegros. No obstante, el orden general
de los episodios moleculares es similar:,
una cade-
na nica de una molcula rota interacta con su
contraparte dplex; la regin de apareamiento se
extiende; y una endonucleasa resuelve las contra-
partes dplex. Se conocen las enzimas que parti-
cipan en cada etapa, aunque es probable que slo
constituyan algunos de los componentes requeridos
para la recombinacin,
Las enzimas bacterianas que intervienen en la
recombinacin se identificaron por la aparicin de
mutaciones rec
~
en sus genes. El fenotipo de los
mutantes rec" es la imposibilidad de llevar a cabo
la recombinacin generalizada. Se han identificado
de 10 a 20 loci.
Las bacterias no suelen intercambiar grandes
cantidades de DNA dplex, pero debe haber varias
vas para iniciar la recombinacin en las procariotas,
En algunos casos, el DNA puede estar disponible
con extremos 3
'
libres de una sola cadena: el DNA
puede ser provisto en forma de una cadena nica
(como en la conjugacin; vase la seccin 16.10, En
la conjugacin se transfiere DNA de una sola cade-
na); se pueden generar brechas de cadena nica con
dao por irradiacin; o se pueden generar colas de
cadena nica por genomas de fagos en proceso de
replicacin por un crculo rodante. Sin embargo,
en circunstancias que comprenden dos molculas
dplex (como en la recombinacin durante la meio-
sis en eucariotas), deben generarse regiones de una
sola cadena y extremos 3
'
,
Se descubri un mecanismo para la generacu
de extremos adecuados como resultado de la ex: -
tencia de ciertos puntos calientes que estimulan :
recombinacin. Estos puntos, que se descubriere
en el fago X en forma de mutantes llamados ch
tienen cambios de pares de bases nicos que crear.
secuencias que estimulan la recombinacin. Est
sitios conducen a la funcin de otras protenas qi:.
intervienen en la recombinacin.
Dichos sitios comparten una secuencia no sim-
trica de 8 bp constante:
5' GCTGGTGG 3'
3' CGACCACC 5'
La secuencia chi ocurre de manera natural en j
DNA de E. col cerca de una vez cada 5 a 10 kb. S.
ausencia del DNA \ de tipo silvestre y tambin cr
otros elementos genticos muestra que no es indis-
pensable para la recombinacin.
Una secuencia chi estimula la recombinacin er
su vecindad general, es decir, dentro de una distan-
cia de hasta 10 kb respecto del sitio. Un sitio efe
'
se
puede activar con una rotura de la doble cadeii
a varios kb de distancia de un lado particular (a \i
derecha de la secuencia mostrada antes). Esta de-
pendencia de la orientacin sugiere que el aparate
de recombinacin debe vincularse con el DNA er.
un extremo roto y luego puede desplazarse por la
cadena dplex slo en una direccin.
Los sitios chi son dianas para la accin de ur;
enzima codificada por los genes recBCD, complel
que ejerce varias actividades. Es una nucleasa po-
tente que degrada al DNA y en un principio se iden-
tific como actividad de exonucleasa V. Tiene acti-
vidades de helicasa que pueden desenrollar el DNA
dplex en presencia de una protena de unin a un?
sola cadena (SSB) y tiene actividad de trifosfatasa de
adenosina. Su participacin en la recombinacin ta]
vez sea la de proveer una regin de una sola cadenr
con un extremo 3
'
libre.
La FIGURA 19.14 muestra cmo esas reaccionen
se coordinan en un DNA sustrato que tiene un sitio
chi. La RecBCD se une al DNA en un extremo de
doble cadena. De sus subunidades, dos tienen acti-
vidades de helicasa; la RecD funciona con polaridad
5
'
-
3
'
y la RecB funciona con polaridad 3'-5'. La
translocacin a lo largo del DNA y el desenrolladc
de la doble hlice son impulsados en un inicio po-
la subunidad RecD. A medida que avanza RecBCD
degrada la cadena nica liberada con el extremo
3
'
.
Cuando alcanza el sitio chi, reconoce la cadena
superior de ese sitio en forma de una sola cadena.
lo que hace que la enzima entre en pausa. Despus.
escinde la cadena superior del DNA en una posi-
cin entre cuatro y seis bases a la derecha de chi. El
reconocimiento del sitio chi hace que la subunidi
470 CAPTULO 19 Recombinacin homologa y especfica de sitio
La RecBCD desenrolla el DNA y escinde en chi
La RecBCD 5'-
une una rotura .
de doble cadena
imiimmimiiiimm
TJ
iii
La RecBCD se
desenrolla y
degrada el DNA
La subunidad RecD transloca 5'-3'
La RecBCD
escinde una
cadena nica
en chi
La RecD se
disocia
5 tntnaloca 3'-S' "..
La RecBC
contina como
helicasa
La subunidad RecB transioca 3'-5'
FIGURA 19.14 La nucleasa RecBCD se acerca a una secuencia
desde un lado y degrada el DNA a medida que avanza; en el
io chi hace un corte endonucleolitico, pierde RecD y conserva
;5lo la actividad de helicasa.
RecD se disocie o se desactive, en cuyo momento la
enzima pierde su actividad de nucleasa. No obstan-
m, sigue funcionando como helicasa (ahora slo con
.a subunidad RecB para impulsar la translocacin) a
cerca de la mitad de la velocidad anterior. El resul-
tado global de esta interaccin es generar un DNA
de cadena nica con un extremo 3' en la secuencia
chi. ste es un sustrato de la recombinacin.
Las protenas de transferencia
de cadenas catalizan
La asimilacin de una sola cadena
Conceptos principales
.
La RecA forma filamentos con el DNA de una o dos
cadenas y cataliza la capacidad de un DNA de una
sola cadena con un extremo 3
'
libre de desplazar a su
contraparte en una cadena dplex de DNA.
La protena RecA de E. coli fue el primer ejemplo
ie una protena de transferencia de DNA que se
descubri. Es el paradigma de un grupo que incluye
varias otras protenas bacterianas y arcaicas (Rad51
en S. cerevisiae) y la protena de eucariotas superiores
Dmcl. El anlisis de los mulantes rad51 de las leva-
duras muestra que esta clase de protena desempe-
a una funcin esencial en la recombinacin. Acu-
mulan roturas de doble cadena y no logran formar
complejos sinaptonmicos normales. Esto refuerza
la idea de que el intercambio de cadenas entre mo-
lculas dplex de DNA participa en la formacin del
complejo sinaptonmico y da lugar a la posibilidad
de que la sinapsis de los cromosomas tenga relacin
con la reaccin de asimilacin de cadenas en las
bacterias.
La RecA en bacterias tiene dos tipos bastante
diferentes de actividad: puede estimular la reaccin
de proteasa en la respuesta SOS (vase la seccin
20.10, La RecA desencadena el sistema SOS) y pue-
de facilitar el apareamiento de bases entre una sola
cadena de DNA y su complemento en una molcula
dplex. Ambas actividades son estimuladas por el
DNA de cadena nica en presencia de ATP.
La actividad de manejo del DNA de RecA per-
mite que una sola cadena desplace a su homloga
en una molcula dplex por una reaccin que se de-
nomina captacin o asimilacin de una sola ca-
dena. La reaccin de desplazamiento puede ocurrir
entre molculas de DNA en varias configuraciones
y cumple con tres condiciones generales.
. Una de las molculas de DNA debe tener
una regin de una sola cadena.
.
Una de las molculas debe tener un extremo
3' libre.
La regin de una sola cadena y el extremo
3' d
eben localizarse dentro de una zona que
es complementaria entre las molculas.
La reaccin se ilustra en la FIGURA 19.15. Cuando
una cadena lineal sola invade a una dplex, desplaza
a su contraparte original hacia su complementaria.
La reaccin puede seguirse con ms facilidad con el
marcado del donador o el receptor en una molcula
circular. La reaccin procede de 5
'
a 3' a lo largo de
la cadena cuya contraparte est siendo desplazada
y sustituida, esto es, la reaccin comprende un in-
tercambio donde (al menos) una de las cadenas de
intercambio tiene un extremo 3' libre,
La asimilacin de una sola cadena tiene una
posible relacin con el inicio de la recombinacin.
Todos los modelos requieren un intermediario don-
de una o ambas cadenas se cruzan de una molcula
dplex a otra (vanse las Figuras 19.6 y 19.9). La
RecA podra catalizar esta etapa de la reaccin. En el
contexto bacteriano, la RecA acta sobre sustratos
generados por RecBCD. El desenrollado y la escisin
mediados por RecBCD pueden servir para generar
extremos que inicien la formacin de articulaciones
heterodplex. La RecA puede tomar la cadena ni-
ca con el extremo 3
'
que se libera cuando RecBCD
corta en chi, usarla para reaccionar con una secuen-
cia dplex homloga y crear as una molcula de
articulacin.
Todas las protenas bacterianas y arcaicas de la
familia de RecA pueden agregarse en filamentos
largos con el DNA de cadena nica o dplex. Hay
19.9 Las protenas de transferencia de cadenas catalizan la asimilacin de una sola cadena
471
La RecA cataliza el intercambio de cadenas entre molculas dplex y de cadena nica
FIGURA 19.15 La RecA facilita la asimilacin de cadenas nicas invasoras en el DNA dplex,
siempre y cuando una de las cadenas reactivas tenga un extremo libre.
seis monmeros de RecA por giro del filamento,
que tiene una estructura helicoidal con un surco
profundo que contiene el DNA. La estequiometra
de la unin es de tres nucletidos (o pares de ba-
ses) por monmero de RecA. El DNA se mantiene
en una forma extendida 1.5 veces en relacin con
el DNA B dplex, lo que hace que ocurra un giro
cada 18.6 nucletidos (o pares de bases). Cuando el
DNA dplex se une, entra en contacto con RecA a
travs de su surco menor y deja el surco mayor ac-
cesible para una posible reaccin con una segunda
molcula de DNA.
La interaccin entre dos molculas de DNA tie-
ne lugar dentro de estos filamentos. Cuando una
sola cadena se asimila a una dplex, el primer paso
es que RecA se una a la cadena nica dentro de un
filamento. Despus se incorpora la cadena dplex,
tal vez formando algn tipo de estructura de tres
cadenas. En este sistema, la sinapsis antecede al in-
tercambio fsico de material, porque la reaccin de
apareamiento puede ocurrir incluso en ausencia
de extremos libres, cuando es imposible el inter-
cambio de cadenas. Se requiere un extremo libre
3
'
para el intercambio de cadenas. La reaccin tie-
ne lugar dentro del filamento y RecA se mantiene
unida a la cadena que en un principio era nica, de
modo que al final de la reaccin RecA se encuentra
unida a la molcula dplex.
Todas las protenas en esta familia pueden fa-
cilitar el proceso bsico de intercambio de cadenas
sin necesidad de energa. No obstante, la RecA au-
menta su actividad con el uso de hidrlisis por ATP.
Se hidrolizan grandes cantidades de ATP durante la
reaccin. El ATP puede actuar mediante un efecto
alostrico sobre la conformacin de RecA. Cuando
est unido a ATP, el sitio de unin de RecA al DNA
tiene una alta afinidad por el DNA; esto es indispen-
sable para unirse al DNA y para la reaccin de apa-
reamiento. La hidrlisis del ATP convierte el sitio de
unin en uno de baja afinidad, el cual se necesita
para liberar el DNA heterodplex.
Se puede dividir la reaccin que cataliza RecA en-
tre DNA de una sola cadena y dplex en tres fases:
.
una fase presinptica lenta, donde RecA se po-
limeriza sobre el DNA de una sola cadena;
.
una reaccin de apareamiento rpido entre
el DNA de una sola cadena y su comple-
mentario en la cadena dplex para producir
una articulacin heterodplex; y
.
un desplazamiento lento de una caden;
desde la estructura doble para producir una
regin larga de DNA heterodplex.
La presencia de SSB estimula la reaccin al ase-
gurar que el sustrato carece de estructura secundaria
Todava no se sabe con certeza de qu manera SSB I
RecA pueden actuar ambas sobre el mismo segmen-
to de DNA. Al igual que SSB, se requiere RecA er.
cantidades estequiomtricas, lo que sugiere que su
accin sobre la asimilacin de cadenas comprende
unirse de manera colaboradora al DNA para formar
una estructura relacionada con el filamento.
Cuando una molcula de una sola cadena re-
acciona con un DNA dplex, la molcula dplex se
desenrolla en la regin de la articulacin recombi-
nante. La regin inicial de DNA heterodplex tal vez
ni siquiera se encuentre en la forma de doble hli-
ce convencional, sino que consista en dos cadenas
relacionadas en forma lateral. Una regin de este
tipo se conoce como articulacin paranmica
(en comparacin con la relacin plectonmica, de
entretejido usual de cadenas en una doble hlice).
Una articulacin paranmica es inestable; para que
la reaccin siga avanzando necesita convertirse a la
forma de doble hlice. Esta reaccin es equivalente
472 CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
La RecA crea un producto intermedio
de la recombinacin
A/VA/VV
La cadena libre inicia
el intercambio
La cadena desplazada
se aparea con la
complementaria
ii rm 11 1111 IT 11
Concluye el intercambio
de cadenas
vvvvvw
\/A/A/A/y\/A/A//
FIGURA 19.16 El intercambio de cadenas mediado por RecA
entre el DNA parcial y completamente dplex genera una mo-
.cula articular con la misma estructura que un producto inter-
nedio de la recombinacin.
B retiro de superhlices negativas y en ocasiones re-
quiere una enzima que resuelva el problema de des-
enrollado/reenrollado mediante roturas transitorias
que permitan a las cadenas girar sobre s mismas.
Todas las reacciones que se han analizado hasta
ahora constituyen slo una parte del episodio de re-
combinacin potencial: la invasin de una molcula
dplex por una nica. Dos molculas dplex pue-
den interactuar entre s bajo el patrocinio de RecA,
siempre que una de ellas tenga una regin de una
sola cadena de al menos 50 bases. La regin de
una sola cadena puede adoptar la forma de una cola
sobre una molcula lineal o de una brecha en una
molcula circular.
La reaccin entre una molcula parcialmente
dplex y una por completo dplex conduce al in-
tercambio de cadenas. En la FIGURA 19.16 se incluye
un ejemplo. La asimilacin se inicia en un extremo
de la molcula lineal, donde la cadena nica inva-
sora desplaza a su homloga de la cadena dplex
en la forma acostumbrada. No obstante, cuando la
reaccin alcanza la regin que es dplex en ambas
molculas, la cadena invasora se separa de su com-
paera, que despus se aparea con la otra cadena
desplazada.
En esta etapa la molcula tiene una estructura
indistinguible de la articulacin recombinante in-
cluida en la Figura 19.8. La reaccin impulsada in
vitro por RecA puede generar uniones Holliday, lo
que sugiere que la enzima puede mediar la trans-
ferencia recproca de cadenas. Se sabe menos acer-
ca de la geometra de los productos intermedios de
cuatro cadenas unidos por RecA, pero al parecer
dos molculas dplex pueden yacer lado a lado en
una forma compatible con los requerimientos de la
reaccin de intercambio.
Las reacciones bioqumicas descritas in vitro de-
jan abiertas muchas posibilidades para las funciones
de las protenas de transferencia de cadenas in vivo.
Su participacin la desencadena la disponibilidad
de un extremo 3' de una sola cadena. En las bac-
terias, esto con toda probabilidad se genera cuando
RecBCD procesa una rotura de doble cadena para
originar un extremo de una sola cadena. Una de
las principales circunstancias en las que se invoca
esto puede ser cuando un triplete de replicacin
se detiene en un sitio daado del DNA (vase la
seccin 20.9, La recombinacin es un mecanismo
importante para la recuperacin despus de errores
en la replicacin). La introduccin de DNA durante
la conjugacin, cuando se requiere RecA para la
recombinacin con el cromosoma hospedador, se
relaciona ms de cerca con la recombinacin con-
vencional. En las levaduras, las roturas de la doble
cadena pueden generarse por dao al DNA o como
parte del proceso normal de recombinacin. En
cualquier caso, al procesamiento de la rotura para
generar un extremo 3
'
de cadena nica le sigue la
descarga de la cadena nica en un filamento con
Rad51 y luego la bsqueda de secuencias dplex
complementarias. Esto se puede usar tanto en reac-
ciones de reparacin como de recombinacin.
{22 EL sistema Ruv resuelve
Las uniones HoLLiday
Conceptos principales
.
El complejo Ruv acta sobre uniones recombinantes.
.
La RuvA reconoce la estructura de la unin y la RuvB es
una helicasa que cataliza la migracin de ramas.
.
La RuvC escinde uniones para generar productos
intermedios de recombinacin.
Uno de los pasos ms determinantes en la recom-
binacin es la resolucin de la unin Holliday, la
19.10 El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday
473
La RuvAB cataliza la migracin de rama
El tetrmero RuvA hace
/
"
contacto con las cuatro
\/\/\A
s
/ cadenas ,
El hexmero RuvB
__
/
se une como anillo
alrededor del DNA
Migracin
de rama
FIGURA 19.17 La RuvAB es un complejo asimtrico, el cual
estimula la migracin de ramas de una unin Holliday.
Las enzimas bacterianas catalizan la recombinacin
Brecha generada por MjJJ1JJ]
la replicaoin del DNA
daado
mninii
RecA
Intercambio de cadena
nimumrmmm
mukmimmim
Segundo
intercambio
de cadena
immuiHmmm
i iiniiiiiii
Ttn
Polimerasa de DNA
La brecha se llena por
la sntesis de DNA
RuvA.B
Migracin de rama
RuvC
Se escinde la unin
Holliday
mtnnnntiniim
miniiiiii tiittiii
iiiiiiiiiiriiiniiii
1
muunmnmi
immiiiiiiiiriii
FIGURA 19.18 Las enzimas bacterianas pueden catalizar todas
las etapas de la recombinacin en la va de reparacin despus
de la produccin de molculas sustrato de DNA adecuadas.
cual determina si hay una recombinacin recproca
o una reversin de la estructura que deja slo un
segmento corto de DNA hbrido (vanse las Figuras
19.6 y 19.8). La migracin de ramas desde el sitio
de intercambio (vase la Figura 19.7) determina la
longitud de la regin de DNA hbrido (con o sin re-
combinacin). Las protenas que intervienen en la
estabilizacin y resolucin de las uniones Holliday
se han identificado como los productos de los genes
ruv en E. coli. RuvA y RuvB aumentan la formacin
de estructuras heterodplex. La RuvA reconoce la
estructura de la unin Holliday. La RuvA se une
a las cuatro cadenas del DNA en el punto de en-
trecruzamiento y forma dos tetrmeros que ubican
al DNA como en un emparedado. La Ruv es una
helicasa hexamrica con actividad de trifosfatasa de
adenosina que constituye el motor para la migra-
cin de ramas. Los anillos hexamricos de RuvB
se unen alrededor de cada cadena dplex de DNA
en sentido ascendente respecto del punto de en-
trecruzamiento. En la FIGURA 19.17 se muestra un
esquema del complejo.
El complejo RuvAB puede hacer que la rama
emigre a una velocidad de hasta 10 a 20 bp/s. Otra
helicasa, la RecG, provee una actividad similar. La:
RuvAB desplaza a RecA del DNA durante su ac-J
cin. Las actividades de RuvAB y RecG pueden in-j
cidir ambas sobre uniones Holliday, pero si las dosj
presentan mutacin, la E. coli tiene una actividai
recombinante por completo defectuosa.
El tercer gen, ruvC, codifica una endonucleasl
que reconoce de manera especfica las uniones Hoj
Uiday. Puede fragmentar las uniones in vitro para
resolver productos intermedios de recombinacin.]
Una secuencia tetranucleotdica comn provee ura
punto caliente para que RuvC resuelva la unin Ho-|
lliday. El tetranucletido (ATTG) es asimtrico y, pon
tanto, puede dirigir la resolucin con respecto a qua
par de las cadenas tiene hendidura. Esto determina
si el resultado es la formacin de un parche recom
binante (sin recombinacin global) o la formacifl
de un recombinante por corte y empalme (recom-
binacin entre marcadores flanco). Las estructuras
cristalinas de RuvC y otras enzimas de resolucin de
unin muestran que hay poca similitud estructural
en el grupo, a pesar de tener la misma funcin.
Todo esto sugiere que la recombinacin utiliza
un complejo
"
resolvasoma
"
que incluye enzimas que
catalizan la migracin de ramas, as como actividades
de resolucin de unin. Es posible que las clulas de
los mamferos contengan un complejo similar.
Ahora se pueden sealar las etapas de la recom-
binacin en E. coli en trminos de protenas indivi-
duales. En la FIGURA 19.18 se muestran los sucesos
que tienen lugar cuando se usa la recombinacin
para reparar una brecha en una cadena dplex me-
diante la recuperacin de material de la otra cadena
dplex. La principal desventaja cuando se aplican
estas conclusiones a la recombinacin en eucariotas
es que la recombinacin bacteriana en general com-
prende la interaccin entre un fragmento de DNA
y un cromosoma completo. Ocurre como reaccin
de reparacin estimulada por el dao al DNA, pen
no equivale por completo a la recombinacin entre
genomas durante la meiosis. No obstante, participar
actividades moleculares similares en la manipula-
cin del DNA.
474 CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
Se describi otro sistema de resolvasas en leva-
duras y mamferos. Las murantes mus81 en S. cere-
kiae tienen recombinacin defectuosa. La MusSl
I un compuesto de endonucleasa que resuelve las
uniones Holliday en estructuras dplex. La resolva-
es importante tanto en la meiosis como para el
reinicio de horquillas de replicacin varadas (vase
I seccin 20.9, La recombinacin es un mecanismo
importante para la recuperacin despus de errores
de replicacin).
La conversin gnica
contribuye a La recombinacin
interaLLica
Conceptos principales
El DNA heterodplex creado por recombinacin puede
tener secuencias con apareamiento errneo, donde los
alelos recombinantes no son idnticos.
Los sistemas de reparacin pueden retirar apareamien-
tos errneos si cambian una de las cadenas, de modo
que su secuencia sea complementaria a la otra.
La participacin del DNA heterodplex explica las
caractersticas de la recombinacin entre alelos; de
necho
, la recombinacin allica estimul el perfec-
::
onamiento del modelo heterodplex. Cuando se
-.escubri la recombinacin entre alelos, lo natural
:
ue pensar que ocurra por el mismo mecanismo de
la recombinacin recproca, que involucra loci ms
distantes. Es decir, un episodio de rotura y reunin
individual tiene lugar en el locus para generar un
ar recproco de cromosomas recombinantes. Sin
pibargo, en las partes cercanas de un solo gen, la
formacin del propio DNA heterodplex suele en-
rargarse del suceso de recombinacin.
Los episodios de recombinacin individuales
Reden estudiarse en los hongos del grupo de asco-
micetos porque los productos de una sola meiosis se
mantienen juntos en una gran clula llamada asea
o
, menos a menudo, lt.rada). Es todava mejor
que en algunos hongos los cuatro ncleos haploides
roducidos por la meiosis se dispongan en un alelo
lineal (en la actualidad ocurre una mitosis despus
le la produccin de estos cuatro ncleos, lo que da
-rigen a una serie lineal de ocho ncleos haploides).
En la FIGURA 19.19 se muestra que cada uno de estos
ncleos representa, en efecto, el carcter gentico
Je uno de los ocho segmentos de los cuatro cromo-
somas producidos por la meiosis.
La meiosis en un organismo heterocigoto que
enerara cuatro copias de cada alelo, lo que se ob-
irva en la mayor parte de las especies. No obstante,
hay algunas esporas con relaciones anormales, que
p explican por la formacin y correccin de DNA
Las tetradas de ascomicetos tienen esporas ordenadas
:
Sin recombinacin
-
DNA hbrido
:
Persiste
= un hbrido
Ambos
hbridos
convierten
a rojo
9
HJ
9
a
Ifi
Proporcin
parental 4:4
Segregacin
posmeitica 3:5
Conversin
del gen 2:6
FIGURA 19.19 La formacin de esporas en los ascomicetos permite la
determinacin de la constitucin gentica de cada una de las cadenas
de DNA involucradas en la meiosis.
heterodplex en la regin donde los alelos difie-
ren. La figura ilustra un episodio de recombinacin
donde una longitud de DNA hbrido se presenta en
uno de los cuatro cromosomas meiticos, un posible
resultado de la recombinacin iniciada por la rotura
de la doble cadena.
Supngase que dos alelos difieren por un solo
punto de mutacin. Cuando ocurre intercambio de
cadenas para generar el DNA heterodplex, las dos
de este ltimo tendrn apareamiento errneo en el
sitio de la mutacin. As, cada cadena de DNA porta
diferente informacin gentica. Si no se hace nin-
gn cambio en la secuencia, las cadenas se separan
en la siguiente replicacin y dan origen cada una a
una dplex que perpeta su informacin. Este suce-
so se denomina segregacin posmejtca, porque
refleja la separacin de las cadenas del DNA despus
de la meiosis. Su importancia es que demuestra de
manera directa la existencia del DNA heterodplex
en alelos recombinantes.
Otro efecto se observa cuando se revisa la recom-
binacin entre alelos: los porcentajes de alelos difie-
ren de la relacin inicial de 4:4. Este efecto se llama
conversin gnica. Describe una transferencia no
recproca de informacin de una cromtida a otra.
La conversin gnica es resultado del intercam-
bio de cadenas entre molculas de DNA, y el cambio
en la secuencia puede tener cualquiera de dos cau-
sas en el mbito molecular:
.
Como se indica con el modelo de rotura de
doble cadena en la Figura 19.9, una cadena
dplex de DNA puede actuar como donado-
ra de informacin gentica, que sustituye en
forma directa las secuencias correspondien-
19.11 La conversin gnica contribuye a la recombinacin interallica
475
tes en la cadena dplex receptora por un pro-
ceso de generacin de brechas, intercambio
de cadenas y llenado de la brecha.
.
Como parte del proceso de intercambio se
genera DNA heterodplex cuando una sola
cadena de una dplex se aparea con su com-
plementaria en la otra cadena dplex. Los
sistemas de reparacin reconocen pares de
bases con apareamiento errneo con el DNA
heterodplex y pueden,
entonces, escindir
y sustituir una de las cadenas para restable-
cer la compiementariedad. Tal suceso con-
vierte la cadena de DNA representante de un
alelo en una secuencia del otro alelo.
La conversin gnica no depende del entre-
cruzamiento, pero se correlaciona con l. Una gran
proporcin de las aseas aberrantes muestra la re-
combinacin gentica entre dos marcadores a cada
lado de un sitio de conversin gnica interallica.
Esto es exactamente lo que podra predecirse si las
relaciones aberrantes fueran resultado del inicio
del proceso de recombinacin,
como se muestra
en la Figura 19.6, pero con una probabilidad casi
equivalente de resolver la estructura con o sin re-
combinacin (como se indica en la Figura 19.8). El
efecto es que los cromosomas micticos inician el
entrecruzamiento casi con el doble de la frecuencia
que se esperara respecto de la correspondiente de
la recombinacin entre genes distantes.
Se observan varias tendencias cuando se revi-
sa la recombinacin en el mbito molecular. Cual-
quier direccin de la conversin gnica puede tener
la misma probabilidad, o los efectos especficos de
alelos pueden propiciar una preferencia por una di-
reccin. Los gradientes de recombinacin pueden
alejarse de los puntos calientes. Hoy se sabe que los
puntos calientes representan sitios donde se inician
las roturas de la cadena doble y que el gradiente se
correlaciona con el grado hasta el cual una brecha
en el punto caliente aumenta y origina extremos
largos de cadena nica (vase la seccin 19.6,
El
complejo sinaptonmico se forma despus de las
roturas de la doble cadena).
Las secuencias de los integrantes de agrupa-
ciones gnicas ofrecen un poco de informacin so-
bre el grado de conversin gnica. Por lo general,
los productos de un episodio de recombinacin se
separarn y no podrn analizarse las secuencias del
DNA. No obstante, cuando un cromosoma porta
dos genes (no allicos) que tienen relacin, pueden
recombinarse mediante un episodio de "entrecru-
zamiento no equivalente
"
(vase la seccin 6.7, El
entrecruzamiento no equivalente reestructura gru-
pos de genes). Todo lo que se necesita observar por
ahora es que se puede formar un DNA heterodplex
entre dos genes allicos. La conversin gnica con-
El DNA circular puede
superenrollarse
FIGURA 19.20 El DNA lineal est extendido (a),
un DNA c--
cular se mantiene extendido si es relajado (no superenrollad:
(b), pero el DNA superenrollado tiene una forma condensa
da con torsin (c). Fotografas por cortesa de Nirupam R:
Choudhury, International Centre for Genetic Engineering ar:
Biotechnology (ICGEB).
vierte, en efecto, uno de los genes no allicos en |
secuencia del otro.
La presencia de ms de un gen en el misnl;
cromosoma constituye un vestigio que permite
rastrear estos sucesos. Por ejemplo, si se formar
un DNA heterodplex y hubiera conversin gnice-
sobre parte de un gen, esa parte podra tener un;
secuencia idntica a la del otro gen, o muy relacio-
nada, en tanto la porcin restante mostrara m?
divergencia. Las secuencias disponibles sugieren
que los episodios de conversin pueden extender-
se distancias considerables, de hasta unos cuantc
miles de bases.
3 EL superenroLLamiento afecta
La estructura deL DNA
Conceptos principales
Ocurre superenrollamiento slo en un DNA cerrado, sin
ningn extremo libre.
Un DNA cerrado puede ser una molcula circular de
DNA, o una lineal donde ambos extremos se anclan a
una estructura protenica.
Cualquier molcula de DNA cerrado tiene un nmero
de enlace, que corresponde a la suma del nmero de
contorsiones y del nmero de torcimientos.
476
CAPTULO 19 Recombinacin homologa y especfica de sitio
.
Los plegamientos se pueden repartir entre el nmero de
contorsiones y el nmero de torcimientos, de manera
que un cambio en la estructura de la doble hlice
puede compensar una modificacin de su enrollamiento
en el espacio.
.
El nmero de enlace puede modificarse slo con la
rotura y la formacin de uniones en el DNA.
La oscilacin de las dos cadenas del DNA entre s
en la estructura de la doble hlice permite cambiar
la estructura si se influye en su conformacin en el
espacio. Si los dos extremos de la molcula de DNA
estn fijos, se puede enrollar la doble hlice alrede-
dor de s misma en el espacio, lo que se denomina
superenrollamiento. Se puede imaginar el efecto
como el de una liga que se enrolla sobre s misma. El
ejemplo ms simple de un DNA sin extremos libres
es el de la molcula circular. El efecto del superen-
rollamiento puede observarse cuando se compara
el DNA circular no superenrollado que yace plano
en la FIGURA 19.20, con la molcula circular super-
enrollada que forma torsiones y, por tanto, est ms
condensada.
Las consecuencias del superenrollamiento de-
penden de que el DNA gire en torno a s mismo en el
mismo sentido que las dos cadenas dentro de la do-
ble hlice (como las manecillas del reloj) o en el sen-
tido contrario. El enrollamiento en el mismo sentido
produce superenrollamiento positivo, que tiene el efec-
to de hacer que las cadenas del DNA se tuerzan en-
tre s de un modo ms estrecho, de modo que haya
ms pares de bases por giro. El enrollamiento en el
sentido contrario produce superenrollamiento negati-
vo, que hace que las cadenas de DNA giren una en
torno a la otra menos apretadamente, de modo que
haya menos pares de bases por giro. Se puede pensar
que el superenrollamiento negativo crea tensin en
el DNA, que es aliviada por el desenrollamiento de la
doble hlice. El efecto final del superenrollamiento
negativo es generar una zona donde las dos cadenas
de DNA se han separado; en trminos formales, hay
cero pares de bases por giro.
La manipulacin topolgica del DNA es un
aspecto central de todas sus actividades funciona-
les, recombinacin, replicacin y transcripcin, as
como de la organizacin de estructuras de orden
ms elevado. Todas las actividades sintticas en las
que participa el DNA de cadena doble requieren la
separacin de las cadenas, que no yacen simplemen-
te una al lado de otra, sino que estn entretejidas.
Su separacin, por tanto, requiere que una gire en
torno a la otra en el espacio. Algunas posibilidades
para la reaccin de desenrollamiento se ilustran en
la FIGURA 19.21.
Podra visualizarse la estructura del DNA en
trminos de un extremo libre que permitiese a las
cadenas girar sobre el eje de la doble hlice para des-
enrollarse. No obstante, dada la longitud de la doble
hlice, esta accin implicara la separacin de las ca-
denas en un grado considerable de fragmentaciones,
lo que parece poco probable en los confines de la
clula.
Se logra un resultado similar si se coloca un
aparato para controlar la rotacin del extremo li-
bre. Sin embargo, el efecto tiene que transmitirse
por una distancia considerable, lo que implica, de
nuevo, la rotacin de una longitud inmoderada
de material.
Considrense los efectos de separar las dos ca-
denas en una molcula cuyos extremos no estn en
libertad de girar. Cuando dos cadenas entretejidas se
jalan para separarlas de un extremo, se incrementa
el enrollamiento de una en torno a la otra en una
mayor distancia de la molcula. El problema puede
superarse si se introduce una hendidura transitoria
en una cadena. Un extremo libre interno permite
que la cadena con hendidura gire alrededor de la
cadena ntegra, despus de lo cual se puede sellar
dicha hendidura. Cada vez que se repite la reaccin
de hendidura y sellado se libera un giro de la su-
perhlice.
La separacin de la cadena requiere cambios
en la topologa
Rotacin cerca ci un extremo libra
Rotacin en extremos fijos
La separacin & cadenas se compensa con
ol s'psrenrollaiTiiento positivo
Produccin de hendidura, rotacin y ligadura
Hendidura
FIGURA 19.21 Se puede lograr la separacin de las cadenas
de una hlice de DNA doble en varias formas.
19.12 El superenrollamiento afecta la estructura del DNA 477
Se puede definir una molcula de DNA cerrada
por su nmero de enlaces, el nmero de veces
que una cadena cruza sobre la otra en el espacio.
Las molculas de DNA cerradas de secuencia idn-
tica pueden tener diferentes nmeros de enlaces, lo
que refleja diferentes grados de superenrollamiento.
Las molculas de DNA que son iguales, excepto por
sus nmeros de enlaces, se denominan ismeros
topolgicos.
El nmero de enlaces est constituido por dos
componentes: el nmero de torcimientos (W) y el
nmero de contorsiones (T).
El nmero de contorsiones, T, es una pro-
piedad de la estructura misma de doble hlice que
representa la rotacin de una cadena alrededor de
la otra. Corresponde al nmero total de giros de la
cadena dplex y est determinada por el nmero de
pares de bases por giro. Para un DNA circular ce-
rrado relajado, que yace plano, el giro corresponde
al nmero total de pares de bases dividido entre el
nmero de pares de bases por giro.
El nmero de torcimientos, W, representa el
giro del eje de la cadena dplex en el espado. Corres-
ponde al concepto intuitivo del superenrollamien-
to, pero no tiene exactamente la misma definicin
cuantitativa o medicin. Para una molcula relajada
W = 0, y el nmero de enlace equivale al giro.
A menudo interesa el cambio en el nmero de
enlace, AL, expresado en la ecuacin
AL = AW + AT
La ecuacin seala que cualquier cambio del n-
mero total de revoluciones de una cadena de DNA
alrededor de la otra se puede expresar como la suma
de modificaciones en el enrollamiento del eje de la
cadena dplex en el espacio (AW) y las de los giros
de la doble hlice misma (AT). En una molcula de
DNA libre, W y T pueden ajustarse con libertad y es
probable que cualquier AL (cambio en el nmero de
enlace) se exprese por un cambio en W, es decir, por
una variacin en el superenrollamiento.
Un decremento en el nmero de enlace, esto
es, un cambio -AL corresponde a la introduccin
de alguna combinacin de superenrollamiento ne-
gativo, subenrollamiento, o ambos. Un aumento en
el nmero de enlace, determinado como cambio de
+AL, corresponde a una reduccin en el superenro-
llamiento negativo o subenrollamiento.
Se puede describir el cambio en el estado de
cualquier DNA por la diferencia especfica de en-
lace, a = AL/L
0,
donde L
0
es el nmero de enla-
ce cuando el DNA est relajado. Si todo el cambio
en el nmero de enlace se debe a la modificacin en
W (esto es AT = 0), la diferencia especfica de enlace
equivale a la densidad del superenrollamiento. En
efecto, puede asumirse que a definida en trminos
de AL/L
0
corresponde a la densidad de la superhlice
siempre y cuando la estructura de la doble hlice mis-
ma se mantenga constante.
La caracterstica determinante del uso del n-
mero de enlace es que este parmetro es una pro-
piedad invariable de cualquier molcula de DNA
individual cerrado. El nmero de enlace no puede
cambiar por alguna deformacin diferente de aque-
lla que implique la rotura y reunin de cadenas.
Una molcula circular con un nmero de enlace
particular puede expresar el nmero en trminos de
diferentes combinaciones de T y W, pero no puede
cambiar su suma en tanto las cadenas no se rompan.
(De hecho, la particin de L entre T y W impide la
asignacin de valores fijos a los ltimos parmetros
para una molcula de DNA en solucin.)
El nmero de enlace se relaciona con los su-
cesos enzimticos reales por los que se hacen cam-
bios en la topologa del DNA. El nmero de enlace
de una molcula cerrada particular puede cambiar
slo si se rompen una o dos cadenas, utilizando el
extremo libre para girar una alrededor de la otra y
reuniendo los extremos rotos. Cuando una enzimg
realiza tal accin, el nmero de enlace debe cam-
biar por un entero; este valor puede determinarse
como una caracterstica de la reaccin. Entonces se
podrn analizar los efectos de este cambio en tr-
minos de AW y AT.
Las topoisomerasas relajan
o introducen superhlices
en el DNA
Conceptos principales
.
Las topoisomerasas cambian el nmero de enlace
cuando rompen enlaces en el DNA, modifican la
conformacin de la doble hlice en el espacio y
vuelven a formar los enlaces.
.
Las enzimas de tipo I actan al romper una cadena
nica de DNA; las de tipo II causan roturas de dos
cadenas.
Los cambios en la topologa del DNA pueden oca-
sionarse en varias formas. La FIGURA 19.22 mues-
tra algunos ejemplos. Para iniciar la replicacin
o transcripcin deben desenrollarse las dos cadenas
de DNA. En el caso de la replicacin, las dos cade-
nas se separan de manera permanente y cada una
forma una cadena dplex con la hija recin sinteti-
zada. En el caso de la transcripcin, el movimientc
de la polimerasa de RNA crea una regin de super-
enrollamiento positivo al frente y una de superen-
rollamiento negativo detrs de la enzima. Esto debe
resolverse antes de que las superhlices positiva-
478
CAPTULO 19 Recombinadn homologa y especfica de sitio
La estructura cambia con la sntesis del c
-
Las cadenas deben separarse para la replicacin
La transcripcin crea superenroliamiento positivo
La replicacin produce DNA encadenados
FIGURA 19. La estructura topolgica del DNA cambia du-
rante la replicacin y la transcripcin. La separacin de las
cadenas requiere que se desenrolle un giro del DNA. La trans-
cripcin crea superhlices positivas adelante de la polimerasa
de RNA. La replicacin de un molde circular produce dos moldes
hijos encadenados.
impidan el movimiento de la enzima (vase la sec-
cin 11.15, El superenroliamiento es una caracte-
rstica importante de la transcripcin). Cuando se
replica una molcula de DNA circular, los produc-
tos vinculados pueden estar encadenados, de modo
que uno pasa a travs del otro. Deben separarse en
orden para que las molculas hijas se segreguen
en clulas hijas independientes. Otra situacin don-
de el superenroliamiento es importante es el plega-
miento del DNA en una cadena de nucleosomas del
ncleo eucaritico (vase la seccin 29.6, La perio-
dicidad del DNA cambia en el nucleosoma). Todas
las situaciones se resuelven con las acciones de las
topoisomerasas.
Las topoisomerasas del DNA son enzimas que
catalizan cambios en la topologa del DNA con la
rotura transitoria de una o ambas cadenas, donde
las cadenas que no se rompieron pasan a travs de
la brecha que despus se sella. Los extremos que se
generan con la rotura nunca estn libres, sino que,
en su lugar, son manipulados de manera exclusiva
dentro de los confines de la enzima; de hecho, tie-
nen enlace covalente con ella. Las topoisomerasas
actan sobre el DNA sin importar su secuencia, pero
algunas enzimas involucradas en la recombinacin
especfica de sitio actan del mismo modo y tam-
bin cumplen con la definicin de topoisomerasas
(vase la seccin 19.18, La recombinacin especfica
de sitio simula la actividad de topoisomerasa).
Las topoisomerasas se dividen en dos clases, de
acuerdo con la naturaleza de los mecanismos que
emplean. Las topoisomerasas de tipo I actan
haciendo una rotura transitoria en una cadena
de DNA. Las topoisomerasas de tipo II actan
cuando introducen una rotura transitoria de la do-
ble cadena. Las topoisomerasas en general varan
con respecto a los tipos de cambio topolgico que
introducen. Algunas topoisomerasas pueden relajar
(retirar) slo superhlices negativas del DNA; otras
pueden relajar superhlices negativas y positivas.
Las enzimas que pueden introducir superhlices
negativas se denominan girasas; aquellas que pue-
den introducir superhlices positivas se denominan
girasas inversas.
Hay cuatro topoisomerasas en E. coli: las topoiso-
merasas I, m y TV y la girasa de DNA. Las topoisome-
rasas I y El del DNA son enzimas de tipo I. La girasa
y la topoisomerasa IV del DNA son enzimas de tipo
n
. Cada una de las cuatro enzimas es importante en
una o ms de las situaciones descritas en la Figura
19.22:
.
El nivel global de superenroliamiento nega-
tivo en el nucleoide bacteriano es resultado
de un equilibrio entre la introduccin de su-
perhlices por la girasa y su relajacin por
las topoisomerasas I y IV. ste es un aspecto
crucial de la estructura del nucleoide (vase
la seccin 28.4, El genoma bacteriano est
superenrollado) y afecta el inicio de la trans-
cripcin en ciertos promotores (vase la sec-
cin 11.15, El superenroliamiento es una ca-
racterstica importante de la transcripcin).
.
Las mismas enzimas participan en la resolu-
cin de los problemas creados por la trans-
cripcin; la girasa convierte las superhlices
positivas que se generan delante de la poli-
merasa de RNA en superhlices negativas,
y las topoisomerasas I y IV retiran las super-
hlices negativas que quedan detrs de la
enzima. De manera similar, pero ms com-
pleja, ocurren efectos durante la replicacin
y las enzimas tienen actuaciones similares
para enfrentarlos.
.
A medida que avanza la replicacin, las
cadenas dobles hijas pueden torcerse una
alrededor de la otra, en una etapa conoci-
da como precatenacin. Las estructuras de
la precatenacin se retiran por la accin de la
topoisomerasa IV, que tambin desencadena
cualquier genoma encadenado que queda al
trmino de la replicacin. Las funciones de la
topoisomerasa ni se superponen de manera
parcial con las de la topoisomerasa IV.
19.13 Las topoisomerasas relajan o introducen superhlices en el DNA
479
Las fopoisomerasas de tipo I actan
sobre cadenas nicas
n
Unen Hacen Hacen pasar Se sella la
cadenas hendiduras en la cadena hendidura
separadas una cadena y intacta a travs
aseguran los de la brecha
extremos
3
'
-
OH
S
'
-
P
-
Las topoisomerasas bacterianas de tipo I reco-
nocen segmentos parcialmente desenrollados de DNA y pasan
una cadena a travs de una rotura hecha en la otra.
Las enzimas en eucariotas siguen los mismos
principios, si bien la divisin detallada de sus fun-
ciones puede ser diferente. No muestran similitud
de secuencias o estructurales con las enzimas pro-
cariticas. Casi todas las eucariotas contienen una
sola enzima topoisomerasa I, que se requiere tanto
para el movimiento del triplete de replicacion como
para relajar las superhlices generadas por la trans-
cripcin. Se requiere una enzima topoisomerasa
II para desenlazar los cromosomas despus de la
replicacin. Se ha sealado a otras topoisomerasas
individuales en las actividades de recombinacin y
reparacin.
Las topoisomerasas rompen
y resellan cadenas
Concepto principal
.
Las topoisomerasas de tipo I actan al formar un
enlace covalente con uno de los extremos rotos, mover
una cadena alrededor de la otra y, despus, transferir el
extremo de enlace al otro extremo roto. Los enlaces se
conservan y, en consecuencia, no se requiere aporte de
energa.
La accin que comparten todas las topoisomerasas
es enlazar un extremo de cada cadena rota a una
molcula de tirosina en la enzima. Una enzima de
tipo I se une a una sola cadena rota; una enzima
de tipo n se une a un extremo de cada cadena rota.
Las topoisomerasas se subdividen en grupos A y B,
si el enlace se hace con un fosfato 5
'
o un fosfato
3
'
.
El uso del enlace transitorio fosfodister-tirosina
sugiere un mecanismo para la accin de la enzi-
ma; transfiere un enlace fosfodister del DNA a la
protena, manipula la estructura de una o ambas
cadenas de DNA y, despus, rene los enlaces en
la cadena original.
Las enzimas de E. coli son todas de tipo A y
utilizan enlaces con el 5
'
fosfato. ste es el patrn
general para las bacterias, donde casi no hay to-
poisomerasas de tipo B. Los cuatro posibles tipos
de topoisomerasas (IA, IB, HA y IIB) se encuentran
en eucariotas.
En la FIGURA 19.23 se incluye un modelo para la
accin, de la topoisomerasa IA. La enzima se une a
una regin donde el DNA dplex se separa en sus
cadenas constitutivas. La enzima rompe entonces
una cadena, jala la otra hacia la brecha y luego se-
lla la brecha. La transferencia de enlaces del cido
nucleico a la protena explica cmo la enzima puede
actuar sin necesitar de ningn aporte de energa.
No ha habido hidrlisis irreversible de enlaces; su
energa se ha conservado durante las reacciones de
transferencia. El modelo est respaldado por la es-
tructura cristalina de la enzima.
La reaccin cambia el nmero de enlace en pa-
sos de una unidad. Cada vez que una cadena pasa
por la rotura en la otra hay un AL de +1. La figu-
ra ilustra la actividad enzimtica en trminos del
movimiento de las cadenas individuales. En una
molcula superenrollada libre, la posibilidad de in-
tercambio de W y T debera permitir que el cambio
de nmero de enlace tuviera lugar por un cam-
bio de +1 en AW, es decir, un giro menos del su-
perenrollamiento negativo.
La reaccin es equivalente a la rotacin ilus-
trada en la parte inferior de la Figura 19.21, con
la restriccin de que la enzima limita la reaccin
CAPTULO 19 Recombinacin homologa y especfica de sitio
Las topoisomerasas tipo II manejan cadenas dobles
Las cadenas dplex de DNA son puestas en aposicin
\
La enzima hace una rotura en ambas cadenas
de un DNA dplex
/A/ASS
\/A/A/A/?VA//

La cadena dplex no rota se hace pasar a travs de

los extremos de la rotura
Se sella la rotura y la enzima libera el DNA
FIGURA 19.24 Las topoisomerasas de tipo 11 pueden pasar un
DNA dplex por una rotura de cadena doble en otra dplex.
a un paso de cadena individual por episodio. (Por
el contrario, la introduccin de una hendidura en
una molcula superenrollada permite la rotacin de
la cadena libre para aliviar toda la tensin con las
rotaciones mltiples.)
La topoisomerasa de tipo I tambin puede pasar
un segmento de un DNA de una cadena a travs de
otro. Esta reaccin de paso de una sola cadena
puede introducir nudos en el DNA y encadmar
dos molculas circulares, de manera que se conec-
ten como eslabones, No se comprenden los usos (si
los hay) que estas reacciones tienen in vivo.
Las topoisomerasas de tipo II en general relajan
tanto superhlices negativas como positivas. La re-
accin requiere ATP, con hidrlisis de una molcula
por cada episodio cataltico. Como se ilustra en
GURA 19.24 la reaccin es mediada por la rotura de
una cadena doble dentro de un DNA doble. La doble
cadena es escindida, con un peldao de cuatro bases
entre los extremos, y cada subunidad de la enzima
dimrica se une a un extremo roto que hace protru-
sin. Despus se hace pasar otra regin dplex por
la rotura. Se utiliza el ATP en el siguiente paso de re-
ligadura/liberacin, cuando los extremos se renen
y se liberan las cadenas dplex de DNA. ste es el
motivo por el que inhibir la actividad de la enzima
trifosfatasa de adenosina produce un
"
complejo sus-
ceptible de escisin
"
que contiene DNA roto.
Una consecuencia formal de la transferencia de
dos cadenas es que el nmero de enlace siempre
cambia en mltiplos de dos. La actividad de topoiso-
merasa II tambin permite, en ocasiones, introducir
o resolver crculos dplex encadenados y molculas
anudadas.
Es probable que la reaccin represente un re-
conocimiento inespecfico del DNA dplex, donde
la enzima se une a cualquier segmento de dos ca-
denas que cruce entre ambas. La hidrlisis de ATP
se puede usar para impulsar a la enzima a pasar por
los cambios de conformacin que proveen la fuerza
indispensable para empujar una cadena dplex de
DNA a travs de esa rotura hecha en la otra. Como
resultado de la topologa del DNA superenrollado, la
relacin de los segmentos cruzados permite retirar
superhlices de los crculos con superenrollamiento
positivo o negativo.
fTin?, La girasa funciona
por La inversin de hlice
Concepto principal
.
La girasa de E. coli es una topoisomerasa de tipo II
que usa la hidrlisis del ATP para proveer la energa
necesaria a fin de introducir superhlices negativas en
el DNA.
La girasa de DNA bacteriana es una topoisomerasa
de tipo II que tiende a introducir superhlices ne-
gativas en una molcula circular cerrada, relajada.
La girasa de DNA se une al DNA circular dplex y
lo superenrolla de manera progresiva y cataltica,
al tiempo que contina introduciendo superhli-
ces a la misma molcula de DNA. Una molcula de
girasa de DNA puede introducir ~I00 superhlices
por minuto.
La forma superenrollada del DNA tiene una
energa libre ms alta que la forma relajada, y la
energa necesaria para la conversin se obtiene de
la hidrlisis del ATP. En ausencia de ATP, la girasa
puede relajar superhlices negativas, no as las posi-
tivas, aunque a una velocidad > 10 veces menor que
la usada para introducir superhlices.
La girasa de DNA en E. coli es un tetrmero
constituido por dos tipos de subunidad, cada una
de las cuales es diana de antibiticos (el usado con
ms frecuencia es el cido nalidxico, que acta so-
bre GyrA, y la novobiocina, que acta sobre GyrB).
Los frmacos inhiben la replicacin, lo que sugiere
19.15 La girasa funciona por la inversin de hlice 481
La girasa acta al invertir una superhlice
v
(+) (-)
Estabiliza el nodo
positivo con giros
oompensadores
I
Rompe un
segmento
posterior
Resella la rotura
en el lado frontal
(-) (-)
5 La girasa de DNA puede introducir superh-
lices negativas en el DNA dplex al invertir una superhlice
positiva.
que la girasa de DNA es necesaria para que proceda
la sntesis de DNA. Las mutaciones que confieren
resistencia a los antibiticos identifican los loci que
codifican las subunidades.
La girasa se une a su sustrato de DNA alrededor
del exterior del tetrmero de protenas. La girasa
protege -140 bp de DNA de la digestin por parte
de la nucleasa del micrococos. En la FIGURA 19.25
se ilustra el modelo de inversin de signo de la
accin de la girasa. La enzima se une al DNA en una
configuracin cruzada y equivale a una superhli-
ce positiva. Ello induce una superhlice negativa
de compensacin en el DNA no unido. La enzima
rompe, entonces, la doble cadena en el cruce de la
superhlice positiva, pasa a travs de la otra cadena
dplex y sella la rotura.
La reaccin invierte de manera directa el signo
de la superhlice: se ha convertido de +1 giro a -1
giro. As, el nmero de enlace ha cambiado por AL =
-
2
, lo que cumple con la demanda de que todos los
episodios con un paso de doble cadena deben cam-
biar el nmero de enlace por un mltiplo de dos,
La girasa libera, despus, uno de los segmentos
de cruce de la superhlice unida (ahora negativa);
esto permite que los giros negativos se redistribuyan
por el DNA (como un cambio en T, W, o ambas) y el
ciclo vuelve a iniciarse. El mismo tipo de manipula-
cin topolgica se encarga de los encadenamientos
y el anudado.
Al liberar la superhlice invertida, la conforma-
cin de la girasa cambia. Para que la enzima inicie
otro ciclo de superenrollamiento debe restablecerse
su conformacin original, proceso que se denomina
recambio enzimtico. Se cree que lo impulsa la
hidrlisis del ATP, porque la sustitucin del ATP por
un anlogo que no puede hidrolizarse permite que
la girasa introduzca slo una inversin (-2 superh-
lices) por sustrato. As, la enzima no necesita ATP
para la reaccin de superenrollamiento, pero s para
realizar un segundo ciclo. La novobiocina interfiere
con las reacciones dependientes de ATP de la gira-
sa al impedir que el ATP se una a la subunidad B.
La reaccin de relajacin independiente del ATP es
inhibida por el cido nalidxico, lo que implica a la
subunidad A en la reaccin de rotura y reunin. El
tratamiento de la girasa con cido nalidxico permite
al DNA recuperarse en forma de fragmentos genera-
dos por una escisin por etapas a travs de la cadena
dplex. Todos los extremos poseen un grupo 3'-OH
libre y una extensin de una sola cadena de cuatro
bases en el extremo 5' unida en forma covalente
a la subunidad A. El enlace covalente conserva la
energa del enlace fosfato; sta se puede usar para
impulsar la reaccin de sellado, que explica porqu
la girasa puede presentar relajacin sin ATP. Los
sitios de escisin son bastante especficos y se pre-
sentan cerca de una vez cada 100 bp.
La recombinacin
especiaLizada involucra sitios
especficos
Conceptos principales
.
La recombinacin especializada comprende una
reaccin entre sitios especficos que no tienen que ser
homlogos.
.
El fago X se integra al cromosoma bacteriano por
recombinacin entre un sitio del fago y el sitio att en
el cromosoma de E. coli.
.
El fago se escinde del cromosoma por recombinacin
entre los sitios en el extremo del profago lineal.
.
El gen int del fago X codifica una integrasa que
cataliza la reaccin de integracin.
La recombinacin especializada implica una reac-
cin entre dos sitios especficos. Las longitudes de
los sitios diana son cortas y por lo general de 14 a
50 bp. En algunos casos los dos sitios tienen la mis-
ma secuencia, pero en otros no son homlogos. La
reaccin se usa para insertar un fago libre de DNA
en el cromosoma bacteriano o extirpar un fago de
DNA integrado del cromosoma, y en ese caso las
dos secuencias recombinantes son diferentes entre
482
CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
s. Tambin se usa antes de la divisin para generar
cromosomas circulares monomricos a partir de un
dmero, que se ha creado por un suceso de recombi-
nacin generalizada (vase la seccin 17.7, La segre-
gacin cromosmica puede requerir recombinacin
especfica de sitio). En este caso las secuencias de
recombinacin son idnticas.
Las enzimas que catalizan la recombinacin es-
pecfica de sitio en general se denominan recombi-
nasas y hasta ahora se conocen ms de 100. Las que
participan en la integracin del fago o se relacionan
con estas enzimas tambin se conocen como familia
de integrasas, de la que son miembros importantes
el prototipo Int del fago X, el Cre del fago Pl y la
enzima FLP de las levaduras (que cataliza una in-
versin cromosmica).
El fago X ilustra el modelo clsico de recombi-
nacin especfica de sitio. La conversin del DNA
X en sus diferentes formas de vida implica dos tipos
de sucesos. El patrn de la expresin gnica es regu-
lado como se describe en el Captulo 14, Estrategias
de los fagos. La situacin fsica del DNA es diferente
en los estados lisognico y ltico:
.
En el estilo de vida ltico, el DNA \ se en-
cuentra como molcula circular indepen-
diente en la bacteria infectada.
.
En el estado lisognico, el DNA del fago es
parte integral del cromosoma bacteriano
(llamado profago).
La transicin entre estos estados implica una
recombinacin especfica del sitio:
.
Para ingresar al estado lisognico, el DNA
libre debe insertarse en el DNA del hospe-
dador, proceso llamado integracin.
.
Para liberarse de la lisogenia hacia el ciclo l-
tico, el DNA del profago debe liberarse desde
el cromosoma, lo que se llama escisin.
La integracin y la escisin ocurren por la re-
combinacin en loci especficos en los DNA bacte-
riano y de fago, llamados sitios de unin {att). El
sitio de unin en el cromosoma de la bacteria se
llama att1 en la gentica bacteriana. El locus se de-
fine por mutaciones que impiden la integracin del
X; es ocupado por el profago X en cepas lisognicas.
Cuando el sitio att1 sufre delecin en el cromosoma
de E. coli, un fago X infectante puede establecer li-
sogenia por integracin en otro punto, aunque la
eficacia de la reaccin es menor de 0.1% de la fre-
cuencia de integracin en att. Esta integracin in-
eficaz tiene lugar en sitios de unin secundaria,
que simulan secuencias att autnticas,
Para describir las reacciones de integracin, es-
cisin o ambas, el sitio de unin bacteriana {attx)
se llama attB, constituido por los componentes de
secuencia BOB
'
. El sitio de unin del fago attP cons-
ta de los componentes POP'. En la FIGURA 19.26 se
esquematiza la reaccin de recombinacin entre
estos dos sitios. La secuencia O es comn a attB y
attP. Se denomina secuencia central y es asiento
del episodio de recombinacin. Las regiones flanco
5
, 5' y ?, P' se conocen como brazos; cada una tie-
ne diferente secuencia. El DNA del fago es circular
por lo que el suceso de recombinacin lo inserta en
el cromosoma bacteriano como secuencia lineal. El
profago est limitado por dos nuevos ciclos att: los
productos de recombinadn llamados attLy attR.
Una consecuencia importante de la constitucin
de los ciclos att es que las reacciones de integracin
y escisin no involucran al mismo par de secuencias
reactivas. La integracin requiere el reconocimiento
entre attPy attB, en tanto la escisin requiere el reco-
nocimiento entre attL y attR. El carcter direccional
de la recombinacin especfica de sitio es controlado
por la identidad de los sitios recombinantes.
El episodio de recombinacin es reversible, pero
prevalecen condiciones diversas para cada direccin
de la reaccin. sta es una caracterstica importante
en la vida del fago, porque ofrece un medio para
asegurar que un suceso de integracin no se revierta
de manera inmediata por una escisin y viceversa.
La diferencia en los pares de sitios que reac-
cionan en la integracin y la escisin se refleja por
una discrepancia en las protenas que median las
dos reacciones.
.
La integracin (attB x attP) requiere el pro-
ducto del gen int del fago que codifica una
La integracin y escisin requieren recombinacin
Fago de DNA
DNA bact6X15.10
attB
requiere Int e IHF
1
BOP'
attL
Profago
La escisin requiere
Int, Xis e IHF
POjB'
attR
FIGURA 19.26 El DNA del fago circular se convierte en un
profago integrado por una recombinacin recproca entre attP
y attB; el profago se escinde por la recombinacin recproca
entre attL y attR.
19.16 La recombinacin especializada implica sitios especficos
483
enzima integrasa, as como una protena
bacteriana llamada factor de integracin del
hospedador (IHF).
.
La escisin {attL x attR) requiere el producto
del gen xis del fago adems de Int y IHF.
Por lo tanto, se requieren Int y IHF para ambas
reacciones. El xis tiene una participacin importan-
te en el control de la direccin; se requiere para la
escisin, pero inhibe la integracin,
Un sistema similar, pero con requerimientos
algo ms sencillos para los componentes de secuen-
cia y protenico se encuentran en el bacterifago
Pl. La recombinasa Cre codificada por el fago cata-
liza una recombinacin entre dos secuencias diana,
A diferencia del fago X, para el que las secuencias
de recombinacin son diferentes, en el fago Pl son
idnticas. Cada una consta de una secuencia de 34
bp de longitud llamada loxP. La recombinasa Cre es
suficiente para la reaccin; no se requieren prote-
nas accesorias. Como resultado de su simplicidad y
eficacia, lo que ahora se conoce como sistema Cre/
lox se ha adaptado para su uso en clulas eucariti-
cas, donde se ha convertido en una de las tcnicas
estndar para llevar a cabo la recombinacin espe-
cfica de sitio.
La recombinacin especfica
de sitio comprende rotura
y reunin
Cmo ocurre la recombinacin especializada?
Concepto principal
.
Se hacen escisiones a intervalos de 7 bp en los genes
attB y attP y los extremos se unen en forma cruzada.
Los sitios att tienen distintos requerimientos de se-
cuencia y el attP es mucho ms grande que attB. La
funcin de attP requiere un segmento de 240 bp,
en tanto que la funcin de attB la puede ejercer el
fragmento de 23 bp que se extiende de -11 a +11,
donde hay slo 4 bp a cada lado de la porcin cen-
tral. La disparidad en sus tamaos sugiere que attP
y attB tienen diferentes participaciones en la recom-
binacin, donde attP ofrece la informacin adicional
necesaria para distinguirla de attB.
Prosigue la reaccin por un mecanismo con-
certado donde se cortan e intercambian de manera
simultnea las cadenas en attP y attB? O, se inter-
cambian las cadenas, un par a la vez, donde el prime-
ro genera una unin Holliday y el segundo ciclo de
hendidura y ligadura ocurre para liberar la estructu-
ra? Las alternativas se incluyen en la FIGURA 19.27.
La reaccin de recombinacin se ha detenido
en etapas intermedias mediante el uso de
"
sustratos
suicidas
"
, donde la secuencia central presenta hen-
attB
Intercambio de secuencias Corte concertado
/ \
O o
\ /
Avanza la recombinacin entre attP y attE
por el intercambio secuendal o el corte concertado?
diduras, lo que interfiere con el proceso de recom-
binacin y permite identificar las molculas donde
comenz dicho proceso pero no ha concluido. La
estructuras de estos productos intermedios sugierer
que pueden ocurrir intercambios de cadenas nica--
de manera secuencial.
El modelo ilustrado en.la FIGURA 19.28 muestra
que si los sitios attP y attB son cada uno asiento de
la misma escisin escalonada, podran disponerse
de los extremos complementarios de una sola cade-
na para hibridacin cruzada. La distancia entre los
puntos de entrecruzamiento ?t es de 7 bp, y la reac-
cin genera extremos 3
'
-
fosfato y 5'-OH. La reac-
cin se muestra, para fines de simplicidad, como ge-
neradora de superposicin de extremos de una sola
cadena que se hibridan, pero que en realidad ocurre
por un proceso similar a la recombinacin ilustrada
en la Figura 19.6. Las cadenas correspondientes de
cada estructura dplex se cortan en la misma po-
sicin, se intercambian los extremos 3
'
libres entre
cadenas dplex, la rama emigra una distancia de 7
bp a lo largo de la regin de homologa y, despus
la estructura se resuelve con el corte del otro par de
cadenas correspondientes.
La recombinacin especfica
de sitio simuLa la actividad
de La topoisomerasa
Conceptos principales
Las integrasas tienen relacin con las topoisomerasas y
la reaccin de recombinacin se parece a la accin de
la topoisomerasa, excepto que las cadenas con hendi-
dura de estructuras dplex diferentes se sellan juntas.
484
CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
La recombinacin especifica de sitio puede considerarse como rotura y reunin escalonadas
Los DNA de fago y bacteriano se alinean
DNA de fago
Las escisiones escalonadas llevan a un
apareamiento cruzado
GCTTTTTTATACTAA
CGAAAAAATATGA TT
GCTTTTTTATACTAA
CGAAAAAATATGATT
DNA bacteriano
Las uniones recombinantes se sellan para generar un DNA de profago integrado
GCTTTTTTATACTAA
C G A A A A A A T A T G ATT
'
GCTTTTTTATACTAA
CGAAAAAATATGATT
FIGURA 19.28 Las escisiones escalonadas en la secuencia central comn de attP y attB permiten
la reunin cruzada para generar uniones recombinantes recprocas.
.
La reaccin conserva la energa al utilizar una
tirosina cataltica en la enzima para romper un enlace
fosfodister y enlazarse con el extremo 3' roto.
.
Dos unidades enzimticas se unen a cada sitio de
recombinacin y los dos dmeros hacen sinapsis para
formar un complejo donde ocurren las reacciones de
transferencia.
Las integrasas utilizan un mecanismo similar al de
las topoisomerasas de tipo I, donde se hace una ro-
tura en una cadena de DNA a la vez. La diferencia
es que la recombinasa vuelve a unir los extremos en
forma cruzada, en tanto la topoisomerasa realiza la
rotura, manipula los extremos y despus vuelve a
unir los extremos originales. El principio bsico del
sistema es que se requieren cuatro molculas de la
recombinasa para cortar cada una de las cuatro cade-
nas de las dos dplex que estn recombinndose.
La FIGURA 19.29 muestra la naturaleza de la re-
accin catalizada por una integrasa. La enzima es
una protena monomrica que tiene un sitio activo
capaz de cortar y ligar el DNA. La reaccin com-
prende el ataque de una tirosina en un enlace fos-
fodister. El extremo 3' de la cadena de DNA se
enlaza mediante una unin fosfodister con una
tirosina en la enzima, lo que deja un extremo 5'
hidroxilo libre.
Dos unidades enzimticas se unen a cada uno
de los sitios de recombinacin. En ellos, slo una de
las unidades ataca al DNA. La simetra del sistema
asegura que se rompan las cadenas complemen-
tarias en cada sitio de recombinacin. El extremo
5
'
-
OH en cada sitio ataca al enlace 3'-fosfotirosina
en el otro sitio, lo que genera una unin Holliday.
La estructura se resuelve cuando las otras dos
unidades enzimticas (que no haban participado
en el primer ciclo de rotura y reunin) actan sobre
otro par de cadenas complementarias.
Las interacciones sucesivas logran un inter-
cambio conservador de cadenas, donde no hay
deleciones o adiciones de nucletidos en el sitio
de intercambio y tampoco se necesita un aporte de
energa. El enlace 3
'
fosfotirosina transitorio entre
la protena y el DNA conserva la energa del enlace
fosfodister roto.
La FIGURA 19.30 muestra la reaccin intermedia
con base en la estructura cristalina. (Fue posible el
atrapamiento del producto intermedio mediante un
"
sustrato suicida
"
, que consta de una cadena dplex
de DNA sinttica donde falta un enlace fosfodister
,
de manera que el ataque de la enzima no genera
un extremo 5
'
-
OH libre). La estructura del com-
plejo Cxe-lox muestra dos molculas de Cre, cada
una unida por una longitud de 15 bp al DNA. El
DNA es doblado casi 100 en el centro de simetra.
Dos de esos complejos se ensamblan en forma anti-
paralela para constituir una estructura de protena
tetramrica unida a dos molculas de DNA en la
sinapsis. El intercambio de cadenas tiene lugar en
19.18 La recombinacin especfica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa
485
1. Dos subunidades enzimticas se unen a
cada DNA dplex
5
'
3
'
Tir
Tir
3
'
5
'
2. Cada cadena doble se escinde en una cadena
para generar un enlace P-Tir y un extremo -OH
Tir HO
5
'
3
'
Tir
Tir
3
'
5
'
3
'
5
'
3. Cada hidroxilo ataca el enlace Tir-fosfato en la
otra cadena doble
3
'
5
'
3
'
5
'
4. Las reacciones se repiten en las otras subunidades
para unir las otras cadenas
5' 3'
3 1 - ="5'
5
'
3
'
1 t
Tir
Tir
Tir
3
'
5
'
FIGURA 19.29 Las integrases catalizan la recombinacin por
un mecanismo similar al de las topoisomerasas. Se hacen cor-
tes escalonados en el DNA y el extremo 3' fosfato se enlaza
de manera covalente con una tirosina en la enzima. El grupo
hidroxilo libre de cada cadena ataca, entonces, el enlace P-Tir
de la otra cadena. El primer intercambio que se muestra en la
figura genera una estructura Holliday. La estructura se resuelve
cuando se repite el proceso con el otro par de cadenas.
una cavidad central de la estructura de la protena
que contiene las seis bases centrales de la regin de
entrecruzamiento.
La tirosina que se encarga de escindir el DNA
en cualquier sitio mitad particular es provista por
la subunidad enzimtica que se une a dicho sitio.
ste es el llamado corte en configuracin cis, vlido
tambin para la integrasa Int y la recombinasa XerD.
No obstante, la recombinasa FLP produce escisin
en configuracin trans, lo que implica un mecanis-
mo donde la subunidad enzimtica que proporciona
la tirosina no corresponde a la subunidad unida a
ese sitio mitad, sino ms bien se trata de una de las
otras subunidades.
.
(OH) (OH)
FIGURA 19.30 Un complejo de recombinacin en sinapsis de
loxA tiene un tetrmero de recombinasas Cre, con un monmero
de enzimas unido en cada sitio mitad. Dos de los cuatro sitios
activos estn en uso y actan sobre cadenas complementarias
de los dos sitios de DNA.
La recombinacin X ocurre
en un intasoma
Conceptos principales
.
La integracin X tiene lugar en un gran complejo que
tambin incluye a la protena THF del hospedador.
.
La reaccin de escisin requiere Int y Xis y reconoce
los extremos de DNA del profago como sustratos.
A diferencia del sistema de recombinacin Cre/lox
que requiere slo la enzima y los dos sitios de re-
combinacin, la recombinacin del fago X ocurre en
una gran estructura y tiene diferentes componentes
para cada direccin de la reaccin (integracin vea
sus escisin).
Se requiere una protena del hospedador llama-
da IHF para la integracin y escisin. La IHF es una
protena de 20 kD con dos subunidades diferentes
que son codificadas por los genes himA y himD. La
IHF no es una protena esencial en E. coli y no se
requiere para la recombinacin bacteriana homo-
loga. Es una de las varias protenas con capacidad
de cubrir con DNA una superficie. Las mutaciones
en los genes him impiden la recombinacin X espe-
cfica de sitio y pueden suprimirse con mutaciones
en lint, lo que sugiere que IHF e Int interactan. Se
puede lograr la recombinacin especfica de sitio por
Int y IHF in vitro.
La reaccin in vitro requiere superenrrollamien-
to en attP, no as en attB. Cuando se realiza la reac-
cin in vitro entre dos molculas de DNA superen-
rollado, casi todo el superenrollamiento se conserva
en los productos. As, no puede haber producto?
486
CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
Porcin central
-140-120-100 -80 -60 -40 -20 20 40 60 80
Int +*
CAGCTTTTTTTATACTAAGTTG
GTCGAAAAAAATATGATTCAAG
Sitio de unin Sitio de unin
de Int de Int
FIGURA 19.31 La Int y la IHF se unen a diferentes sitios en
attP. Las secuencias de reconocimiento de Int en la regin
: central incluyen los sitios de corte.
intermedios libres donde podra haber rotacin de
las cadenas. ste fue uno de los primeros indicios
de que la reaccin prosigue a travs de una unin
Holliday. Hoy se sabe que las reacciones proceden
por el mecanismo habitual de esta clase de enzi-
mas, el cual tiene relacin con el mecanismo de la
topoisomerasa I (vase la seccin 19.18, La recom-
binacin especfica de sitio simula la actividad de la
topoisomerasa).
La Int tiene dos diferentes modos de unin. El
dominio terminal C acta como la recombinasa Cre.
Se une a sitios invertidos en la secuencia central y
se coloca para realizar las reacciones de escisin
y ligadura de cada cadena en las posiciones ilustra-
das en la . .El dominio terminal N se une
a sitios en los brazos de attP que tienen una dife-
rente secuencia de consenso. Esta unin se encar-
ga de la agregacin de subunidades al intasoma. Es
probable que los dos dominios se unan de manera
simultnea al DNA, lo que acerca los brazos de attP
a la porcin central.
La IHF une las secuencias de -20 bp en attP.
Los sitios de unin estn cercanos a aquellos don-
de se adhiere Int. Xis se une a dos sitios cercanos
entre s en attP, de manera que la regin protegida
se extiende sobre 30 a 40 bp. Juntos, Int, Xis e IHF
cubren casi todo el attP. La unin de Xis cambia la
organizacin del DNA, de manera que se torna iner-
te como sustrato para la reaccin de integracin.
Cuando Int e IHF se unen a attP generan un
complejo donde todos los sitios de unin se llevan
juntos hacia la superficie de una protena. Se re-
quiere superenrollamiento de attP para la formacin
de este intasoma. Los nicos sitios de unin en
attB son los dos Int en la parte central. No obstante,
Int no se une de manera directa a attB en forma
de DNA libre. El intasoma es el intermediario que
Intasoma
J
attP
1
Mltiples copias de la protena Int pueden or-
ganizar a attP en un intasoma, el cual inicia la recombinacin
especfica de sitio al reconocer attB en el DNA libre.
captura a attB, como se indica esquemticamente
en la FIGURA 19.32.
De acuerdo con este modelo
,
el reconocimien-
to inicial entre attP y attB no depende de manera
directa de la homologa del DNA, sino que en su
lugar, est determinada por la capacidad de las pro-
tenas Int de reconocer ambas secuencias att. Los
dos sitios att se unen, entonces, en una orientacin
predeterminada por la estructura del intasoma. La
homologa de secuencia se vuelve importante en
esta etapa, cuando se requiere para la reaccin de
intercambio de cadenas.
La asimetra de las reacciones de integracin y
escisin se muestra por el hecho de que Int puede
formar un complejo similar con attR slo si se agrega
Xis. Este complejo puede aparearse con un complejo
condensado que Int forma en attL. No se necesita
IHF para esa reaccin. Una diferencia significativa
entre las reacciones de integracin/escisin X y de
recombinacin catalizadas por Cre o Flp es que las
reacciones catalizadas por Int unen las secuencias
reguladoras en los brazos de los sitios diana,
do-
blando el DNA y permitiendo interacciones entre
los sitios brazo y central, que llevan cada reaccin
a su conclusin. Es por esto que cada reaccin X es
irreversible, en tanto la recombinacin catalizada
19.15 La recombinacin X ocurre en un intasoma 487
por Cre o Flp es reversible. Las estructuras cristali-
nas de los tetrmeros X-lnt muestran que, al igual
que otras recombinasas, el tetrmero tiene dos
subunidades activas y dos inactivas que cambian
sus funciones durante la recombinacin. Las inter-
acciones alostricas desencadenadas por la unin al
brazo controlan las transiciones estructurales en el
tetrmero que impulsan la reaccin.
Gran parte de la complejidad de la recombina-
cin especfica de sitio puede deberse a la necesidad
de regular la reaccin, de manera que la integra-
cin ocurra de manera preferente cuando un virus
ingresa al estado lisognico, en tanto se prefiere la
escisin cuando el profago est entrando al sitio l-
tico. Mediante el control de las cantidades de Int y
Xis, ocurrir la reaccin apropiada.
fffff Las Levaduras pueden cambiar
Loci silentes y activos
por eL tipo de apareamiento
Conceptos principales
.
EL locus MATei tipo de apareamiento en Levaduras
porta el genotipo MATa o MATa.
.
Las Levaduras con el alelo dominante HO cambian su
tipo de apareamiento con una frecuencia de ~10 .
.
El alelo en MAT se denomina cartucho activo.
.
Hay tambin dos cartuchos silentes, WAa y HMRa.
.
Ocurre cambio si MATa es sustituido por HMLa o MATa
es sustituido por HMRa.
La levadura S. cerevisiae puede propagarse en esta-
do haploide o diploide. La conversin entre esos
estados ocurre por apareamiento (fusin de clulas
haploides para formar una diploide) y esporulacin
(meiosis de diploides para producir esporas haploi-
des). La posibilidad de participar en estas actividades
la determina el tipo de apareamiento de la cepa,
que puede ser a o a. Las clulas haploides de tipo
a pueden aparearse slo con las clulas haploides
de tipo a para generar clulas diploides de tipo a/a,
Las clulas diploides pueden presentar esporulacin
para regenerar esporas haploides de cualquiera de
esos tipos.
La conducta de apareamiento est determina-
da por la informacin gentica presente en el locus
MAT. Las clulas que portan el alelo MATa en este
locus son de tipo a; de manera similar, las clulas
que portan el alelo MATa son de tipo a. El recono-
cimiento entre clulas con un tipo de apareamien-
to opuesto se logra mediante la secrecin de fero-
monas; las clulas a secretan el factor polipptido
pequeo a; las clulas a secretan el factor a. Una
clula de un tipo de apareamiento porta un recep-
tor de superficie para la feromona del tipo opuesto.
Cuando una clula a y una clula a se encuentran.
sus feromonas actan en sus receptores para de-
tener a las clulas en la fase Gl del ciclo celular y
surgen varios cambios morfolgicos. Cuando el apa-
reamiento se logra, a la detencin del ciclo celular le
sigue la fusin celular y nuclear para producir una
clula diploide a/a.
El apareamiento es un proceso simtrico que
se inicia con la interaccin de feromonas secretadas
por un tipo celular con el receptor que porta el otro
tipo celular. Los nicos genes que se requieren de
manera exclusiva para la va de respuesta en u|
tipo de apareamiento particular son los que codifi-
can los receptores. La interaccin factor a-receptor
o factor a-receptor activa la misma va de respuesta.
Las mutaciones que eliminan pasos en la va comn
tienen los mismos efectos en ambos tipos celulares.
La va consta de una cascada de transduccin de
seal que conduce a la sntesis de productos que
hacen los cambios necesarios en la morfologa ce-
lular y la expresin gnica para que tenga lugar el
apareamiento.
Gran parte de la informacin acerca de la va
del tipo de apareamiento en las levaduras se dedujo
a partir de las propiedades de las mutaciones que
eliminan la capacidad de las clulas a, a, o ambas,
de aparearse. Los genes identificados por tales mu-
taciones se llaman STE (por estril). Las mutaciones
en los genes para las feromonas o los receptores son
especficas de los tipos de apareamiento individua-
les, en tanto las mutaciones en los otros genes STE
eliminan el apareamiento en ambas clulas, a y a.
Esta situacin se explica por el hecho de que los
episodios que siguen a la interaccin del factor con
el receptor son idnticos para ambos tipos.
Algunas cepas de levaduras tienen la capacidad
notoria de cambiar los tipos de apareamiento. Estas
cepas portan un alelo HO dominante y cambian con
frecuencia su tipo de apareamiento, hasta una vez
en cada generacin. Las cepas con el alelo recesivo
HO tienen un tipo de apareamiento estable que est
sujeto a cambios con una frecuencia de ~10
"6
.
La presencia de HO hace que cambie el genotipo
de la poblacin de levaduras. Sin importar el tipo
inicial de apareamiento, en unas cuantas generacio-
nes hay un gran nmero de clulas con ambos tipos
de apareamiento, que conducen a la formacin de
diploides MATa/MATa que constituyen la poblacin.
La produccin de diploides estables a partir de una
poblacin haploide puede considerarse la razn de
ser del cambio.
La existencia del cambio sugiere que todas las
clulas tienen la informacin potencial necesaria
para ser MATa o MATa, pero expresan slo un tipo.
De dnde procede la informacin para cambiar los
tipos de apareamiento? Se necesitan dos loci para
488 CAPTULO 19 Recombinacin homologa y especfica de sitio
el cambio. Se requiere HMLa para el cambio que
ia lugar al tipo MATa; se necesita HMRa para el
:
ambio que origina el tipo MATa. Estos loci yacen
rn el mismo cromosoma que porta MAT. El HML
Bt bastante a la izquierda, el HMR est bastante
1 la derecha.
El modelo de cartucho para el tipo de aparea-
miento se ilustra en la FIGURA 19.33. Propone que
'
AT tiene un cartucho activo para los tipos a o a.
-
vinbos
, HML y HMR, tienen cartuchos silentes. En
general, HML porta un cartucho a, en tanto HMR
porta uno a. Todos los cartuchos contienen infor-
macin que codifica el tipo de apareamiento, pero el
cartucho activo slo se expresa en MAT. El cambio
de tipo de apareamiento tiene lugar cuando el car-
racho activo es sustituido por la informacin de un
rartucho silente. Entonces, se expresa el cartucho
:ue acaba de instalarse.
El cambio no es recproco; la copia en HML o
HMR sustituye al alelo en MAT. Esto se sabe porque
pierde una mutacin en iVMTde manera perma-
nente cuando es sustituida por un cambio; no se
ntercambia con la copia que la sustituye.
Si la copia silente presente en HML o HMR tiene
mutacin, el cambio introduce un alelo mutante en
i locus MAT. La copia mutante en HML o HMR per-
manece durante un nmero indefinido de cambios.
Como en la transposicin replicativa, el elemento
donador genera una nueva copia en el sito receptor
mientras se mantiene a s mismo intacto,
El cambio del tipo de apareamiento es un su-
:
so dirigido, donde hay un solo receptor (MAT)
pero dos donadores potenciales (HML y HMR). El
rambio suele comprender la sustitucin de MATa
I xr la copia de HMLa o la de MATa por la copia de
miRa. En 80 a 90% de los cambios, el alelo MAT
es sustituido por uno del tipo contrario, lo que est
ieterminado por el fenotipo de las clulas. Las c-
lulas con un fenotipo a eligen de manera preferente
;
HML como donador; las clulas con el fenotipo a
prefieren elegir a HMR.
Varios grupos de genes participan en el estable-
pmiento y cambio de tipo de apareamiento. Ade-
ms de los genes que determinan de manera directa
el tipo de apareamiento, incluyen los indispensables
para reprimir cartuchos silentes, cambiar el tipo de
;
;7areamiento o ejecutar las funciones involucradas
ra el apareamiento.
Cuando se comparan las secuencias de los car-
nschos silentes (MHLa y HMRa) con las de los dos
vmos de cartucho activo (MATa y MATa), se pue-
ien definir las secuencias que determinan el tipo
de apareamiento. En la FIGURA 19.3'. se resume la
rganizacin de los loci del tipo de apareamiento.
Zada cartucho contiene secuencias en comn que
manquean una regin central que difiere en los tipos
Hay cartuchos silentes para el tipo de apareamiento
i Cartucho silente Cartucho activo Cartucho silente
HMLa MATa HMRa
| Frecuente |
Ocurre cambio del tipo
de apareamiento cuando
un cartucho a sustituye
' '
a un cartucho a
HMLa. MATa HMRa
Frecuente
Ocurre cambio del tipo
de apareamiento cuando
un cartucho a sustituye a
un cartucho a
_
HMLa MATa
__
H/Wfla
[ Raro |
No ocurre ningn cambio
del tipo de apareamiento
cuando un cartucho del
mismo tipo sustituye al
cartucho activo
HMLa. MATa HMRa
Ocurren cambios en el tipo de apareamiento
cuando cartuchos silentes sustituyen a cartuchos activos de
genotipo opuesto; cuando ocurren transposiciones entre cartu-
chos iguales, el tipo de apareamiento se mantiene inalterado.
Todos los cartuchos tienen secuencias similares
Los cartuchos inactivos no sintetizan RNA
Ya . HMLa
HMRa
Los cartuchos activos sintetizan productos especficos
del tipo de apareamiento
Ya *mm MATa
RNAm a2 RNAm a1
Ya . MATa
RNAm al
500 1000 1500 2000 bp
FIGURA 19.34 Los cartuchos silentes tienen las mismas se-
cuencias que los cartuchos activos correspondientes, excepto
por la ausencia de las secuencias de flanco extremas en HMRa.
Slo la regin Y cambia entre los tipos aya.
:
19.20 Las levaduras pueden cambiar loci silentes y activos por el tipo de apareamiento
489
aya (llamados Ya o 7a). A cada lado de esta regin,
las secuencias flanqueadoras son casi idnticas,
aun-
que ms cortas en HMR. El cartucho activo en MAT
se transcribe desde un promotor en la regin Y.
rTT? EL Locus MAT codifica protenas
reguladoras
Conceptos principales
.
En clulas haploides de tipo a, el MATa activa los
genes requeridos para especificar las funciones a
indispensables para el apareamiento y desactiva los
genes requeridos para el tipo de apareamiento a.
.
En las clulas de tipo a, no se requiere MATa.
.
En clulas diploides, los productos deal y a2 cooperan
para reprimir genes especficos de clulas haploides.
La funcin bsica del locus MAT es controlar
la expresin de los genes de feromonas y recep-
tores, as como otras funciones comprendidas en
el apareamiento. El MATa codifica dos protenas,
al y a2. El MATa codifica una sola protena, ai.
Las protenas aya controlan de manera directa
la transcripcin de varios genes diana; actan por
regulacin positiva y negativa. Lo hacen de manera
independiente en las clulas haploides y de manera
conjunta en las diploides. Sus interacciones se re-
sumen en el cuadro del lado derecho en la IGURA
19.35
, en trminos de tres grupos de genes diana:
.
Los genes especficos a se expresan de ma-
nera constitutiva en clulas a; estn repri-
midos en las clulas a. Los genes especficos
a incluyen el gen estructural del factor a |
STE2, que codifica el receptor del factor
As, el fenotipo a se vincula con la dispc r
cin para reconocer la feromona produddi
por el tipo de apareamiento opuesto.
.
Las funciones especficas a se inducen t
clulas a, pero no se expresan en las ch ;
a. Incluyen el gen estructural del facto:
y el gen del receptor del factor a, STE3. I
nuevo, la expresin de la feromona de i
tipo se vincula con la expresin del recep::
de la feromona del tipo contrario.
.
Las funciones haploides especficas incluya
los genes indispensables para la transen;
cin de la feromona y los genes receptort
el gen HO que participa en el cambio y RME-
un represor de la esporulacin. Se expresar
de manera constitutiva en ambos tipos de
clulas haploides, pero estn reprimidas a
las diploides a/a. Como resultado, las fun-
ciones especficas aya tambin se mantie-
nen sin expresin en clulas diploides.
Ahora se revisarn las funciones de los regula-
dores y sus dianas desde la perspectiva de las fur
ciones de MAT expresadas en clulas de levadura
haploides y diploides, como se seala en el esquer:,
del lado izquierdo de la Figura 19.35. Los tipos -
apareamiento aya son regulados por diferente-:
mecanismos:
.
En clulas haploides a, las funciones ; _
apareamiento se expresan de manera cons-
titutiva. Las funciones de los productos ct
MATa en la clula a (si las hay) se descon:
genes a genes a funciones haploides
Se desconocen sus funciones
1
HMLa MATa HMRa
1 1 1
a a:
co 55
.g Repnme m
c genes a1 J
"
| especficosa 2 m
g
.
haploides i g.
ce ce
1 1
HMLa HMLa HMRa
a.1 ( -1 l ) a 2
Induce Reprime
funciones de funciones de
apareamiento a apareamiento a
a
haploide
constitutivo no
expresado
constitutivas
diploide
no
expresado
no
expresado
reprimido
a
haploide
reprimido
inducido constitutivas
En las clulas diploides las protenas al y a2 colaboran para reprimir
Las funciones especficas hapLoides. En Las clulas hapLoides a las funciones de apa-
reamiento son constitutivas. En las hapLoides a, La protena a2 reprime funciones de
apareamiento a, en tanto que La protena al induce funciones de apareamiento a.
490
CAPTULO 19 Recombinacin homologa y especfica de sitio
cen. Pueden requerirse slo para reprimir
las funciones de clulas haploides en las c-
lulas diploides.
.
En las clulas haploides a, el producto al
activa genes especficos a cuyos productos
son necesarios para el apareamiento de tipo
a. El producto a2 reprime los genes encar-
gados de producir el tipo de apareamien-
to a mediante la unin a una secuencia de
operador localizada en sentido ascendente
respecto de los genes diana.
.
En clulas diploides, los productos al y a2
cooperan para reprimir genes haploides es-
pecficos. Se combinan para reconocer una
secuencia de operador diferente de la diana
para slo a2.
La posibilidad de que las protenas a2, al y al
regulen la transcripcin depende de algunas inter-
acciones interesantes de las protenas entre s y con
otras. El patrn del control gnico en las clulas a,
a y diploides se resume en la FIGURA 19.36.
Una protena llamada factor de transcripcin del
receptor de feromonas (PRTF) (que es inespecfica
del tipo de apareamiento) participa en muchas de
estas interacciones. La PRTF se une a una secuen-
cia de consenso corta llamada caja P. La funcin de
PRTF en la regulacin gnica puede ser bastante
amplia, ya que se encuentran cajas P en una di-
versidad de ubicaciones. En algunos de estos sitios
se requiere una caja P para activar al gen; en otros
loci, se necesita PRTF para la represin. Sus efectos
pueden, por tanto, depender de otras protenas que
se unen en sitios cercanos a la caja P.
Slo PRTF puede activar los genes especficos de
a
, lo que es adecuado para asegurar su expresin en
una clula haploide a.
Los genes especficos a se reprimen en una clu-
la a haploide por la accin combinada de la protena
a2 y PRTF. La protena al contiene dos dominios.
El dominio terminal C se une a elementos palindr-
micos cortos en los extremos de una secuencia de
consenso operador de 32 bp. Sin embargo, la unin
de este fragmento al DNA no causa represin. El
dominio terminal N se necesita para la represin
y se encarga de hacer contacto con PRTF. El sitio
de unin para PRTF es una caja P en el centro del
operador. De hecho, a y PRTF se unen de manera
colaboradora al operador.
La expresin de genes a especficos requiere otra
pequea protena llamada activador al, que tiene
175 aminocidos de longitud. Las secuencias que
actan en configuracin cis, que confiere transcrip-
cin a espeafica, tienen 26 bp de longitud y pueden
dividirse en dos partes. Las primeras 16 bp forman la
caja P, donde se une PRTF; la secuencia adyacente de
10 bp forma el sitio de unin para al. El factor al se
une slo cuando PRTF est presente para unirse a la
caja P. Ninguna protena sola puede unirse a su caja
blanco, pero juntas se pueden unir al DNA, al parecer
como resultado de interacciones entre protenas.
Los factores a y u controlan la expresin gnica
genes a especficos genes a especficos
haploide a
PRTF activa a los genes de manera
constitutiva
PRTF PRTF
CCATGTAATTACCCAAAAAGGAAATTTACATGG
Genes desactivados: PRTF no puede
unirse sin al
PRTF
TTTCCTAATTAGTNCNTCAATGNCAG
haploide a
a2 + PRTF reprimen genes especficos a
a2 a2
c PRTF PRTF c
CCATGTAATTACCCAAAAAGGAAATTTACATGG
al + PRTF activan genes diana
PRTF PRTF a1
I I IUCTAATTAGTNCNTCAATGNCAG
diploide a/a
a2 + al reprimen genes haploides especficos
a2 a1 a?.
CCATGTNANTNNTACATGG
FIGURA 19.36 Las combinaciones de PRTF, al, al y a2, activan o reprimen grupos especficos
de genes que corresponden aL tipo de apareamiento de La cluLa.
19.21 El locus /Wcodifica protenas reguladoras
491
Los genes especficos a se desactivan en forma
predeterminada en clulas haploides a porque en
ausencia de la protena al, el PRTF no puede unirse
para activarlos.
La protena a2 puede tambin colaborar con
la protema al. La combinacin de estas protenas
reconoce a un operador diferente. El operador com-
parte las secuencias palindrmicas externas, y slo
al reconoce la secuencia, pero es ms corto porque
la secuencia entre ellas es diferente. La combinacin
al/a2 reprime los genes con este segmento en las
clulas diploides.
La principal reflexin que se deriva ele estos re-
sultados es que el fenotipo de cada tipo de clula (a
o a haploide, o a/a diploide) est determinado por
la combinacin de protenas aya que se expre-
san. Un aspecto es la distincin entre los fenotipos
haploide y diploide; otro es la distincin entre los
fenotipos aya haploide. Este ltimo se extiende a
la expresin de los genes correspondientes al tipo
de apareamiento apropiado y la determinacin de la
direccin del cambio de tipo de apareamiento (va-
se la Figura 19.33). Las clulas MATa activan un
potenciado!" de recombinacin en el brazo izquierdo
del cromosoma III, lo que aumenta la recombina-
cin sobre una regin de 40 kb que incluye HML.
Las clulas MATa desactivan el extremo izquierdo
del cromosoma III.
Se reprimen Los cartuchos
silentes en HML y HMR
Conceptos principales
.
Los elementos silenciadores reprimen HML y HMR.
.
Los loci requeridos para mantener el silenciamiento
incluyen SIR1-4, RAP1 y los genes de la histona H4.
Se necesita la unin de ORC (complejo de
reconocimiento del origen) a los silenciadores para la
desactivacin.
El mapa de transcripcin en el Figura 19.34 reve-
la una caracterstica intrigante: la transcripcin de
MATa o MATa se inicia dentro de la regin Y. Slo
el locus MAT se expresa; sin embargo, la misma re-
gin 7est presente en el cartucho correspondiente
no transcrito (HML o HMR), lo que implica que la
regulacin de la expresin no se acompaa del re-
conocimiento directo de algn sitio superpuesto al
promotor. Un sitio fuera de los cartuchos debe distinguir
HML y HMR de MAT.
El anlisis de delecin muestra que se necesitan
los sitios a cada lado de HML y HMR para detener su
expresin y se llaman silenciadores. Los sitios del
lado izquierdo de cada cartucho se llaman silencia-
dores E y los del lado derecho silenciadores I. Estos
sitios de control pueden funcionar a cierta distancie
(hasta 2.5 kb de un promotor) y en cualquier orien-
tacin; actan como potenciadores negativos (ios
potenciadores son elementos distantes del promoior
que activan la transcripcin; vase la seccin 24.15
Los potenciadores contienen elementos bidimensio-
nales que ayudan a la iniciacin).
Se puede encontrar la base del control de la
actividad del cartucho si se identifican los genes que
se encargan de mantener los cartuchos silentes? Se
esperara que los productos de estos genes actuasen
sobre los silenciadores. Un anlisis conveniente par
la mutacin en tales genes lo proporciona el hechi
de que cuando una mutacin permite a los cartu-
chos que en general estn silentes en HML y HMR
expresarse, se producen tanto funciones a como a.
de manera que las clulas actan como diploide
MATa/MATa.
Las mutaciones en varios loci suprimen el silen-
ciamiento y llevan a la expresin de HML y HMR
Los primeros en descubrirse fueron los cuatro loci
SIR (reguladores de la informacin silentes [ Vewfm-
formation regulators]). Los cuatro loci de SIR de tipo
silvestre son indispensables para mantener a HML I
HMR en estado de represin. La mutacin en cual-
quiera de estos loci para dar un alelo sir~ tiene dos
efectos. Tanto HML como HMR se pueden transcri-
bir, y ambos cartuchos silentes se vuelven dianas
de reposicin por cambio. De este modo, el mismo
episodio regulador sirve para reprimir un cartuchr
silente y para impedir que sea receptor de reposi-
cin para otro cartucho.
Otros loci requeridos para el silenciamiento in-
cluyen RAPl (que tambin se necesita para man-
tener la heterocromatina telomrica en su estadi
inerte) y los genes que codifican la histona H4. Las
deleciones del extremo N de la histona H4 o las
mutaciones puntiformes individuales activan los
cartuchos silentes. Los efectos de estas mutaciones
pueden contrarrestarse con la introduccin de nue-
vas mutaciones en S1R3 o la sobreexpresin de SIRi.
lo que sugiere que hay una interaccin especfica
entre H4 y las protenas SIR.
El modelo general sugerido por estos resultados
es que las protenas SIR actan sobre la estructura
de la cromatina para prevenir la expresin gnica.
Las mutaciones en las protenas SIR tienen los mis-
mos efectos en los genes que se han desactivado
debido a la proximidad de la heterocromatina telo-
mrica, por lo que parece probable que las protenas
SIR participen, en general, en la interaccin con las
histonas para formar estructuras heterocromticas
(inertes) (vase la seccin 31.3, La heterocromatina
depende de interacciones con histonas).
492
CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
El complejo de silenciamiento se ensambla en ars
ORC se une a ars
Sirl se une a ORC
i
El complejo de
silenciamiento se
une a Sirl
I
EL Locus MAT receptor inicia
La transposicin unidireccionaL
El silenciamiento en HMR depende de reclutar
Sirl.
Hay una conexin interesante entre la represin
en los silenciadores y la replicacin del DNA. Cada
silenciador contiene una secuencia ARS (un origen
de la replicacin). La ARS se une al ORX (complejo
de reconocimiento del origen) que participa en el
inicio de la replicacin. Las mutaciones en los genes
ORC impiden el silenciamiento, lo que indica que se
requiere la unin de la protena ORC al silenciador
para el silenciamiento,
Hay dos tipos diferentes de conexin entre el
silenciador y el aparato de replicacin:
.
es necesaria la presencia de Sirl y
.
se requiere replicacin.
Si se localiza una protena Sirl en el silenciador
(mediante el enlace con otra protena unida ah), ya
no se requiere la unin de ORC. Esto significa que
la participacin de ORC es tan slo para llevar al
interior a Sirl; no se necesita para iniciar la replica-
cin. Como se ilustra en la GURA 19.3 7, la funcin
de ORC pudiese, por tanto, consistir en proveer un
centro de inicio a partir del cual se pueda dispersar
el efecto del silenciamiento. La ORC provee la es-
tructura a la cual se une Sirl y sta recluta, enton-
ces, a las otras protenas SIR. Esto es diferente de su
funcin en la replicacin.
Sin embargo, el paso por la fase S es necesa-
rio para que se establezca el silenciamiento. Esto
no requiere que la iniciacin tenga lugar en el ARS
del silenciador. El efecto podra depender del paso
de la horquilla de replicacin por el silenciador, tal
vez para permitir que la estructura de la cromatina
cambie,
Concepto principal
.
El cambio del tipo de apareamiento se inicia por una
rotura de la doble cadena hecha en el locus MAT por la
endonucleasa HO.
Se logra un cambio del tipo de apareamiento con
una conversin gnica donde el sitio receptor
(MAT) adquiere la secuencia de tipo donador {HML
o HMR). Los sitios necesarios para la transposicin
se han identificado por mutaciones en MAT que
impiden el cambio. La naturaleza unidireccional del
proceso la indica la falta de mutaciones en HML o
HMR.
Las mutaciones identifican un ciclo en el lmite
derecho de 7en MAT que es crucial para el suceso de
cambio. La naturaleza del lmite se demuestra cuan-
do se analizan las localizaciones de estas mutaciones
puntiformes con relacin al sitio de cambio (lo que
se hace revisando los resultados de los cambios muy
poco frecuentes que ocurren a pesar de la muta-
cin). Algunas mutaciones yacen dentro de la regin
que es sustituida (y, por tanto, desaparecen de MAT
despus de un cambio), en tanto que otras yacen
apenas afuera de la regin sustituida (y, por tanto,
continan impidiendo el cambio). De este modo,
se necesitan secuencias dentro y fuera de la regin
sustituida para el episodio de cambio.
El cambio se inicia con una rotura de la doble
cadena cerca del lmite Y-Z, que coincide con un sitio
que es sensible al ataque por una desoxirribonuclea-
sa (una caracterstica comn de los sitios cromos-
micos que participan en el inicio de la transcripcin
o recombinacin). Se reconoce por una endonu-
cleasa codificada en el locus HO. La endonucleasa
HO produce la rotura de doble cadena escalonada
apenas por la derecha del lmite Y. La escisin genera
extremos de una sola cadena de cuatro bases, que se
ejemplifican en la . La nucleasa no ataca
lociMATmutantes que no pueden cambiar. El an-
lisis de la delecin muestra que se requiere casi toda
la secuencia de 24 bp que rodea al sitio de unin
Y
, o toda, para la escisin in vitro. El sitio de reco-
nocimiento es relativamente grande para una nu-
cleasa y se presenta slo en los tres cartuchos del
tipo de apareamiento.
Slo el locus MAT, no as el HML o los lociHMR,
es diana de la endonucleasa. Parece posible que los
mismos mecanismos que mantienen a los cartuchos
silentes sin transcribir tambin los mantengan in-
accesibles a la endonucleasa HO. Tal inaccesibilidad
asegura que el cambio sea unidireccional.
19.23 El locus MAT receptor inicia la transposicin unidireccional
493
La endonucleasa HO escinde una diana de 24 bp
Regin Y
TTTCAGCTTTCCGCAACAGTATA
AAAGTCGAAAGGCGTTGTCATAT
Endonucleasa HO
TTTGAGCTTTGCGCAACA
AAAGTCGAAAGGCG
GTATA
TTGTCATAT
La endonucleasa HO escinde AMr apenas a la
derecha de la regin Y, lo que genera extremos pegajosos con
un colgajo de cuatro bases.
de apareamiento cambia con u
rotura de la doble cadena
Receptor
MAT
Corte en el lmite Y
Apareamiento N
con el donador
Donador HMR o HML
i
Degradacin de MAT
Sntesis de DNA nuevo
El DNA receptor ha cambiado el tipo de
apareamiento
El DNA donador no cambia
9 Se inicia la sustitucin del cartucho con una
rotura de doble cadena en el locus receptor (MAT), que puede
comprender el apareamiento de cualquier lado de la regin Y
con el locus donador (HMR o HML).
La reaccin desencadenada por la escisin se
ilustra en la FIG ; en trminos de la reacci'
general entre las regiones receptora y donadora. En
trminos de las interacciones de las cadenas indi-
viduales de DNA, sigue el esquema de recombine-
cin a travs de una rotura de doble cadena que
incluye en la Figura 19.9, y las etapas siguientes al
corte inicial requieren las enzimas involucradas en
la recombinacin general. Las mutaciones en algu-
nos de estos genes impiden el cambio.
Supngase que el extremo libre de MATmvadt
el locus HML o HMR y se aparea con la regin de
homologa en el lado derecho. La regin 7 de MAt
se degrada hasta exponer una regin con homolo-
ga en el lado izquierdo. En ese punto, una MAT se
aparea con HML o HMR en ambos lados, izquierd:
y derecho. La regin 7de HML o HMR se copia pan
sustituir la regin perdida de MAT (que podra ex-
tenderse y rebasar los lmites del mismo Y). Los loe
apareados se separan (el orden de los sucesos podr;
ser diferente).
Al igual que en el modelo de rotura de dob-r
cadena para la recombinacin, el proceso lo inicii
MAT, el locus que se va a remplazar. En ese sentido
la descripcin de HML y HMR como loci donadore I
se refiere a su funcin final, pero no al mecanism;
del proceso. Como en la transposicin replicativa
el sitio donador no se afecta, pero ocurre un cambi:
de secuencia en el receptor. A diferencia de la trans-
posicin, el locus receptor sufre una sustitucin m
que una adicin de material.
La regulacin de la expresin
de HO controla el cambio
Concepto principal
*
La endonucleasa HO se sintetiza en clulas madre
haploides, de manera que un episodio de cambio hace
que ambas cadenas hijas tengan el nuevo tipo de
apareamiento.
La produccin de la endonucleasa HO es regulada
en el mbito de la transcripcin gnica. Hay tre?
sistemas de control distintos:
.
El HO est bajo el control del tipo de aparea-
miento. No se sintetiza en clulas diploide?
MATa/MATa. Tal vez el motivo sea que nc
hay necesidad de cambio cuando ambos ale-
les MAT se expresan de cualquier forma.
.
El HO se transcribe en las clulas originales.
pero no en las hijas.
.
La transcripcin de HO tambin responde al
ciclo celular. El gen se expresa slo al trmi-
no de la fase Gl de una clula original.
494
CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
La sincronizacin de la produccin de la nuclea-
sa explica la relacin entre cambio y linaje celular.
La GUR muestra que el cambio se detecta
slo en los productos de una divisin; ambas clulas
hijas tienen el mismo tipo de apareamiento, que
cambia con respecto al de la que les dio origen. El
motivo es que la restriccin de la expresin de HO
a la fase Gl asegura que el tipo de apareamiento
cambie antes de que se replique el locus MAT, con
el resultado de que toda la progenie tiene el nuevo
tipo de apareamiento.
Los sitios de accin en configuracin cis que con-
trolan la transcripcin de HO residen a 1500 bp en
sentido ascendente con respecto del gen. El patrn
general de control consiste en que la represin en
slo uno de muchos sitios que responden a varios
circuitos reguladores puede impedir la transcripcin
de HO. En la IGURA 19.41 se resumen los tipos de
sitios que participan.
El control del tipo de apareamiento se asemeja
al de otros genes haploides especficos. La transcrip-
cin la impide (en las clulas diploides) el represor
al/a2. Hay 10 sitios de unin para el represor en
la regin en sentido ascendente, que varan en su
conformidad con respecto a la secuencia de consen-
so. No se sabe cules y cuntos de ellos se requieren
para la represin haploide especfica.
El control de la transcripcin de HO implica la
interaccin de una serie de episodios de activacin
y represin. Se requieren los genes SWII-5 para la
transcripcin de HO. Actan al impedir que los pro-
ductos de los genes SINI-6 repriman HO. Los genes
SWI se descubrieron primero como mutantes in-
capaces de cambiar; los genes SIN se descubrieron
despus por su capacidad de liberar los bloqueos
ocasionados por mutaciones particulares de SWI.
Las interacciones SWI-SIN participan tanto en el
control del ciclo celular como en la restriccin de la
expresin en las clulas originales.
Algunos de los genes SWI y SIN no se encargan
de manera especfica del tipo de apareamiento, sino
que son reguladores globales de la transcripcin
cuyas funciones son indispensables para la expre-
sin de muchos loci que incluyen el complejo de
remodelado de cromatina SW1ISNF que contiene
Swil S y los loci SINI-4, que codifican protenas
cromosmicas o cromatina en los reguladores. Su
participacin en la expresin del tipo de aparea-
miento es incidental. El regulador
"
real
"
es, por tan-
to, la protena Swi, que contrarresta el sistema de
represin general de manera especfica en el locus
HO.
El control del ciclo celular es conferido por nue-
ve copias de una secuencia octanucleotdica llamada
URS2. Una copia de la secuencia de consenso puede
Slo las clulas originales pueden cambiar el tipo de apareamiento
Ocurre cambio en una a
original, ambas hijas
son a
Las clulas no pueden cambiar otra '% J'
vez en la primera generacin V
despus del ltimo cambio >* X
a a
Ocurre cambio en una a v63
.
original, ambas hijas son a \
a
/ \
.
o
\
a
/ \
Ocurre cambio slo en las clulas originales; ambas
clulas hijas tienen un nuevo tipo de apareamiento. Una clula hija
debe pasar por un ciclo entero antes de convertirse en una clula
madura y poder cambiar de nuevo.
.a transcripcin de HO tiene tres controles
Represin en diploides
Represor a1/a2 \ :
\(KfMf v v/ v
Expresin especfica de G1
Control del
Represor ciclo celular Activador
Sin6 odc28
.
Swi4,6
UHS2 URS2
Represin especfica de hija
Activador
.
Swi5
'
V/vf/W
URS1
Represor Activador
Astil Swi5
\*/A*/
URS1
Los tres sistemas reguladores actan sobre la
transcripcin del gen HO, la cual ocurre slo cuando se elimina
toda represin.
conferir control del ciclo celular a un gen al que
est unida. Un gen vinculado con esta secuencia
es reprimido, excepto durante un periodo transito-
rio hacia el final de la fase Gl. Los activadores que
liberan la represin en URS2 son Swi4 y Swi6. Su
actividad depende de la funcin del regulador del
ciclo celular Cdc28, que ejecuta la decisin que lleva
a las clulas a dividirse.
La diana para la expresin de la restriccin en
generaciones alternas es el activador Swi5 (que an-
tagoniza a un sistema de represin general ejercido
19.24 La regulacin de la expresin de HO controla el cambio 93
por Sm3,4). En los mulantes que carecen de es-
tas funciones, HO se transcribe muy bien en clu-
las originales e hijas. Este sistema acta sobre los
elementos de URS1 en la regin lejana en sentido
ascendente.
La SWI5 no es en s misma el regulador de la
especificidad de las clulas originales, pero es anta-
gonizado por Ashlp, un represor que se acumula
de manera preferente en las clulas hijas al final de
la anafase. Las mutaciones en ASHl permiten a las
clulas hijas cambiar el tipo de apareamiento. La lo-
calizacin de Ashlp depende del transporte de su
RNAm desde la clula original a travs de filamentos
de actina hacia la yema hija (vase la seccin 7.16, El
RNAm puede localizarse de manera especfica). Su
presencia impide que SWI5 active el gen HO. Acta
al unirse a muchas copias de una secuencia de con-
senso que se distribuyen en las regiones reguladoras
URS1 y URS2. Cuando la clula hija crece para con-
vertirse en una clula madura, la concentracin de
Ashlp se diluye y entonces es posible expresar de
nuevo el gen HO.
gBffi Resumen
La recombinacin comprende el intercambio fsico
de partes entre las molculas de DNA correspon-
dientes, lo que origina un DNA dplex donde dos
regiones de origen opuesto se conectan por un seg-
mento de DNA hbrido (heterodplex), en el cual
una cadena es derivada de cada progenitora. Los
episodios de correccin pueden ocurrir en sitios con
apareamiento errneo dentro de un DNA hbrido.
El DNA hbrido tambin puede formarse sin que
haya recombinacin entre marcadores a ambos
lados. La conversin gnica tiene lugar cuando se
forma una regin extensa del DNA hbrido durante
la recombinacin normal (o entre genes no allicos
en un episodio aberrante) y se corrige a la secuencia
de slo una cadena progenitora, en cuyo punto un
gen toma la secuencia del otro.
La recombinacin se inicia con una rotura de la
doble cadena en el DNA, que aumenta hasta formar
una brecha con un extremo de una sola cadena;
el extremo de una sola cadena libre forma, enton-
ces, un heterodplex con la secuencia allica. El
DNA donde ocurre la rotura en realidad incorpora
la secuencia del cromosoma que invade, de modo
que el DNA de inicio se llama receptor. Los puntos
calientes para la recombinacin son sitios donde se
inician roturas de doble cadena. Se determina un
gradiente de la conversin gnica por la posibilidad
de que una secuencia cercana al extremo libre se
convierta en cadena nica; esto disminuye con la
distancia a partir de la rotura.
La recombinacin en las levaduras la inicia
Spoll, una enzima similar a la topoisomerasa que
se enlaza con los extremos 5
'
libres del DNA. La DSB
se procesa, entonces, con la generacin de DNA de
cadena nica que puede hibridarse con su comple-
mentara en el otro cromosoma. Las mutaciones de
las levaduras que bloquean la formacin del com-
plejo sinaptonmico muestran que se requiere re-
combinacin para su formacin. La formacin del
complejo sinaptonmico puede iniciarse con las ro-
turas de la doble cadena y puede persistir hasta que
concluya la recombinacin. Las mutaciones en los
componentes del complejo sinaptonmico bloquean
su formacin, pero no impiden el apareamiento cro-
mosmico, de manera que el reconocimiento de ho-
mlogos es independiente de la recombinacin y la
formacin del complejo sinaptonmico.
Las protenas Rec y Ruv de E. coli pueden llevar
a cabo el conjunto completo de acciones requeridas
para la recombinacin. La nucleasa RecBCD gene-
ra una regin de una sola cadena con un extremo
libre. La enzima se une al DNA en un lado de la se-
cuencia c//y despus se desplaza hacia la secuencia
chi, desenrollando el DNA a medida que avanza. Se
hace una rotura de una sola cadena en la secuen-
cia chi. Las secuencias chi proveen puntos calientes'
para la recombinacin. La cadena nica aporta un
sustrato para RecA, que tiene la capacidad de hacer
sinapsis de molculas de DNA homlogos al facili-
tar una reaccin donde una cadena nica de una
molcula invade a una dplex de la otra molcula.
Se forma DNA heterodplex por desplazamiento de
una de las cadenas originales de la dplex. Estas
acciones crean una unin de recombinacin que re-
suelven las protenas Ruv. Las RuvA y RuvB actan
en una heterodplex y RuvC escinde las uniones
Holliday.
La recombinacin, a semejanza de la replicacin
y (tal vez) de la transcripcin, requiere manipula-
cin topolgica del DNA. Las topoisomerasas pue-
den relajar (o introducir) superhlices en el DNA y
son indispensables para desenmaraar las molcu-
las de DNA que se han encadenado por recombi-
nacin o replicacin. Las topoisomerasas de tipo l
causan una rotura en una cadena del DNA dplex:
las topoisomerasas de tipo II hacen roturas de dos
cadenas. La enzima se enlaza con el DNA por una
unin de la tirosina al extremo 5
'
fosfato (enzimas
de tipo A) o al extremo de 3' fosfato (enzimas de
tipo B).
Las enzimas involucradas en la recombinacin
especfica de sitio tienen acciones relacionadas cor
las de las topoisomerasas. En esta clase general de
recombinasas, aquellas dedicadas a la integracin
de fagos forman la subclase de integrasas. El sistema
CAPTULO 19 Recombinacin homloga y especfica de sitio
Cre/lox utiliza dos molculas de Cre para unirse a
cada sitio lox, de manera que el complejo recombi-
nante es un tetrmero. ste es uno de los sistemas
estndar para insertar el DNA en un genoma extra-
o. La integracin del fago X requiere las protenas
Int del fago y la IHF del hospedador e implica una
rotura y reunin precisas en ausencia de sntesis de
DNA. La reaccin implica envolver con la secuencia
attP del DNA del fago la estructura de nucleopro-
ena del intasoma, que contiene varias copias de
bit e IHF; se une, entonces, la secuencia attB del
hospedador y ocuri la recombinacin. La reaccin
en direccin inversa requiere la protena Xis del
fago. Algunas integrasas funcionan por escisin en
Configuracin cis, donde una tirosina que reaccio-
na con el DNA en un sitio mitad es provista por la
Bubunidad de enzima unida a ese sitio mitad; otras
tuncionan por escisin en configuracin trans, para
lo que una subunidad protenica diferente provee
la tirosina.
La levadura S. cerevisiae puede propagarse en es-
tado haploide o diploide. La conversin entre estos
'
estados ocurre por apareamiento (fusin de clulas
haploides para producir una diploide) y esporula-
cin (la meiosis de clulas diploides para dar espo-
ras haploides). La posibilidad de participar en estas
actividades la determina el tipo de apareamiento
de la cepa. El tipo de apareamiento lo determina
la secuencia del locus MAT y puede cambiar por
kun episodio de recombinaci
n, que sustituye una
'
secuencia diferente en este locus. El suceso de re-
combinacin se inicia con una rotura de la doble
cadena, como un suceso de recombinacin hom-
iloga, pero luego los pasos subsecuentes aseguran
una reposicin unidireccional de la secuencia en el
locus MAT.
La reposicin es regulada de manera que MATa
suele ser sustituida por la secuencia de HMLa, en
tanto MATa suele ser sustituida por la secuencia de
HMRa. La endonucleasa HO desencadena la reac-
cin cuando reconoce un sitio diana nico en MAT.
La HO es regulada en el mbito de la transcripcin
por un sistema que asegura su expresin en clulas
originales pero no en sus hijas, con la consecuencia
de que toda la progenie tiene el mismo tipo de apa-
reamiento (nuevo).
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4S CAPTULO 19 Recombinacin homLoga y especfica de sitio
I
Sistemas de reparacin
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
Los sistemas de reparacin corrigen el dao del
DNA
.
Los sistemas de reparacin reconocen las secuencias de
DNA que no cumplen con los pares de bases estndar.
. Los sistemas de escisin retiran una cadena de DNA del
sitio daado y despus la sustituyen.
.
Los sistemas de reparacin por recombinacin utilizan la
recombinacin para sustituir la regin de doble cadena que
ha sido daada.
.
Todos estos sistemas son susceptibles de introducir errores
durante el proceso de reparacin.
.
La fotorreactivacin es un sistema de reparacin no
mutagnico que acta de manera especfica en dimeros de
pirimidinas.
mmcm Sistemas de reparacin por escisin en E. coli
. El sistema Uvr hace incisiones a ~12 bases de distancia de
ambos lados del DNA daado, retira el DNA entre ellas y
vuelve a sintetizar el DNA nuevo.
mm Vas de reparacin por escisin en clulas de
mamferos
.
La reparacin por escisin en los mamferos se
desencadena con la eliminacin directa de una base daada
del DNA.
.
El retiro de las bases desencadena la eliminacin y
sustitucin de un segmento de polinucletidos.
. La naturaleza de la reaccin de la eliminacin de las bases
determina cul de las dos vas de reparacin por escisin
se activa.
.
La va pol8/E sustituye un segmento largo de
polinucletidos; la va poip sustituye un segmento corto.
Las metilasas y las gLucosiLasas "lanzan" las bases
.
Las glucosilasas reconocen y retiran de manera directa del
DNA las bases alquiladas y el uracilo.
.
Los dimeros de pirimidina se revierten por la rotura de los
enlaces covalentes entre ellos.
Las metilasas agregan un grupo metilo a la citosina.
.
Todos estos tipos de enzimas actan al lanzar la base fuera
de la doble hlice donde, de acuerdo con la reaccin, es
retirada o modificada y regresada a la hlice.
-
ct Reparacin susceptible de error y fenotipos
mutadores
.
El DNA daado que no ha sido reparado causa que la
polimerasa III de DNA se detenga durante la replicacin.
.
Las polimerasas V (codificada por umuCD) o IV del DNA
(codificada por dinB) pueden sintetizar un complemento de
la cadena daada.
.
El DNA sintetizado por la polimerasa de reparacin de DNA
a menudo tiene errores en su secuencia.
.
Los genes mutadores pueden identificar protenas que
afectan la fidelidad de la replicacin, donde el cambio
de secuencia causa una mayor tasa de mutaciones
espontneas.
Bfl Control de la direccin de la reparacin de
apareamientos errneos
.
Los genes mut codifican un sistema de reparacin de
apareamientos errneos que se encarga de las bases mal
apareadas.
.
Hay una tendencia en la seleccin de qu cadenas sustituir
en los apareamientos errneos.
.
Por lo general, se sustituye la cadena que carece de
mediacin en un segmento hemimetilado.
.
Este sistema de reparacin se usa para eliminar errores en
una cadena de DNA recin sintetizada. En los apareamien-
tos errneos G-T y C-T, se retira de preferencia la T.
KJftl Sistemas de reparacin por recombinacin en
f
.
coli
.
Los genes rec de E. coli codifican el principal sistema de
recuperacin.
.
El principal sistema de recuperacin acta cuando la repli-
cacin deja una brecha en una cadena recin sintetizada
que se encuentra frente a una secuencia daada.
.
Se utiliza la cadena nica de otro segmento dplex para
sustituir la brecha.
.
Se retira entonces la secuencia daada y se presenta una
nueva sntesis.
Wniu La recombinacin es un mecanismo importante de
recuperacin ante errores de replicacin
.
Una horquilla de replicacin puede quedarse varada cuando
encuentra un sitio daado o una hendidura en el DNA.
.
Una horquilla varada puede revertirse por el apareamiento
entre las dos cadenas recin sintetizadas.
.
Una horquilla varada puede reiniciar la reparacin del dao
y utilizar una helicasa para poder avanzar,
.
La estructura de la horquilla varada es la misma que la
unin Holliday y puede convertirse en una cadena dplex y
DSB por la accin de las resolvasas.
fchllil La protena RecA desencadena el sistema SOS
.
El dao al DNA causa que la protena RecA desencadene la
respuesta SOS, que consta de genes que codifican muchas
enzimas de reparacin.
Contina en la siguiente pgina
499
.
La RecA impulsa la actividad de escisin propia de
LexA.
.
La LexA reprime el sistema SOS; su escisin propia
activa esos genes.
Las clulas eucariticas tienen sistemas de
reparacin conservados
.
Las mutaciones RAD en levaduras, identificadas por
fenotipos sensibles a la radiacin, ocurren en genes
que codifican sistemas de reparacin.
.
La xerodermia pigmentosa (XP) es una enfermedad
humana causada por mutaciones en cualquiera de
varios genes de reparacin.
.
Un complejo de protenas, que incluyen productos XP
y el factor de transcripcin TFI1H, provee un mecanismo
de reparacin por escisin en Los seres humanos.
i Los genes con actividad transcripcional se reparan de
manera preferente.
latniM Un sistema comn repara las roturas de la
doble cadena
.
La via NHEJ puede ligar extremos romos de DNA
dplex.
. Las mutaciones en la via NHEJ causan enfermec;:-
en [os seres humanos.
B5I11 Resumen
m Introduccin
Cualquier episodio que introduzca una desviacin
de la estructura habitual de doble hlice del DNA
representa una amenaza para la constitucin gen-
r.l.U.I.HLM
Reversin directa del dao: ms de un gen.
ino tiene muchos genes de reparacin
Reparacin por escisin de bases: 15 genes.
Reparacin por escisin de nucletidos: 28 genes.
11
I
Reparacin por escisin del apareamiento errneo:
11 genes.
nrm
Reparacin por recombinacin: 14 genes.
Unin de extremos no homlogos: cinco genes.
Subunidades catalticas de polimerasas de DNA:
16 genes.
un
FIGURA 20. Los genes de reparacin se pueden clasificar en
vas que utilizan mecanismos diferentes para revertir el dao
al DNA o pasarlo por alto.
tica de la clula. Las lesiones del DNA dismim
al mnimo gracias a los sistemas que reconoce:
corrigen el dao. El sistema de reparacin es i
complejo como el aparato de replicacin mism..
:
que indica su importancia para la supervivencid
la clula. Cuando un sistema de reparacin rene
un cambio ocurrido al DNA, no hay consecuenc
No obstante, puede haber una mutacin cuand
consigue hacerlo. La tasa medida de mutaciones;
fleja un equilibrio entre el nmero de sucesor
dao que ocurre en el DNA y el nmero de los :
se han corregido (o corregido mal).
Los sistemas de reparacin a menudo recoi
cen una variedad de distorsiones en el DNA c;;
seales para actuar y es posible que una clula te-
varios sistemas capaces de corregir un dao al DN
La importancia de la reparacin del DNA en la I
cariotas lo indica la identificacin de >L30 {
de reparacin en el genoma humano. Se pued
dividir los sistemas de reparacin en varios
generales, como se resumen en la FIGURA 20.1.
.
Algunas enzimas revierten de manera dir;
ta tipos especficos de dao al DNA.
.
Hay vas para la reparacin por escisin
bases o nucletidos, y del apareamie:
errneo, todas las cuales actan medii-
el retiro y la sustitucin de material.
.
Hay sistemas que usan la recombinac
para obtener una copia no daada a::
utiliza luego para sustituir una secuci-
dplex daada.
.
Una va de unin de extremos no hom
gos vuelve a unir extremos de cadena c- .
rotos.
.
Varias polimerasas de DNA diferentes I
den resintetizar segmentos de DNA de
titucin.
La reparacin directa sucede muy pocas vc..-
comprende la reversin o el simple retiro del *
500
CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
ment daado. Es un buen ejemplo la fotorreacti-
.:
dn de dmeros de pirimidina, donde los enlaces
:
ovalentes lesivos son revertidos por una enzima
:
cpendiente de la luz.
Este sistema est muy generalizado en la na-
turaleza y ocurre en todos los mamferos, excepto
los placentados, y parece muy importante en las
dantas. En Escherichia coli depende del producto de
m gen nico [phr) que codifica una enzima llamada
otoligasa.
Los apareamientos errneos entre cadenas de
DNA constituyen una de las principales dianas de los
.
eternas de reparacin. La reparacin de apareamien-
:
s errneos se logra mediante la bsqueda de bases
ni aposicin mal apareadas en el DNA. Los aparea-
mientos errneos que surgen durante la replicadn
p corrigen al distinguir entre las cadenas "nuevas
"
"
antiguas
"
y corregir de preferencia la cadena que
acaba de sintetizarse. Otros sistemas abordan apa-
reamientos errneos generados por conversiones de
izases, como en el caso de la desaminacin. La im-
portancia de estos sistemas queda de manifiesto por
hecho de que el cncer en poblaciones humanas
K consecuencia de la mutacin de genes relacio-
r.ados con los que participan en la reparacin de
apareamientos errneos en las levaduras.
Los apareamientos errneos suelen corregirse
Don la reparacin por escisin; sta la inicia una enzi-
ma de reconocimiento que detecta una base daada
real o un cambio en la va espacial del DNA. Hay dos
:
ipos de sistemas de reparacin por escisin.
.
Los sistemas de reparacin por escisin de bases
retiran de manera directa la base daada y
la sustituyen en el DNA. Un buen ejemplo
es la glucosilasa de uracilo del DNA, que
retira uracilos mal apareados con guaninas
(vase la seccin 20.5, Las metilasas y glu-
cosilasas usan el aleteo de bases).
.
Los sistemas de reparacin por escisin de nu-
cletidos retiran una secuencia que incluya
la, o las, bases daadas; despus se sintetiza
una nueva cadena de DNA para sustituir
el material eliminado. En la FIGURA 20.2 se
resumen los principales episodios del fun-
cionamiento de tal sistema. Estos sistemas
son comunes. Algunos reconocen el dao
general del DNA; otros actan sobre tipos
especficos de bases daadas. A menudo hay
mltiples sistemas de reparacin por esci-
sin en un solo tipo celular.
En los sistemas de recombinacin-reparacin se
manejan situaciones donde el dao persiste en una
molcula hija y se ha forzado la replicacin para pa-
sar por alto el sitio, lo que por lo general crea una
brecha en la cadena hija. Un sistema de recupera-
cin utiliza la recombinacin para obtener otra copia
de la secuencia a partir de una fuente no daada;
luego la copia se utiliza para reparar la brecha.
Una caracterstica importante de la recombina-
dn y reparacin es la necesidad de abordar roturas
de doble cadena (DSB). Las DSB inician entrecruza-
mientos en recombinadn homloga. Tambin pue-
den crearse por problemas en la replicacin, donde
tal vez desencadenen el uso de sistemas de repara-
cin por recombinacin. Cuando se crean DSB por
dao ambiental (p. ej., el causado por la radiacin) o
son producto del acortamiento de telmeros, pueden
causar mutaciones. Un sistema para corregir DSB
puede unir extremos de DNA no homlogos.
Las mutaciones que afectan la capacidad de las
clulas de E. coli de contribuir a la reparacin del
DNA entran en grupos que corresponden a varias
vas de reparacin (que no tienen que ser indepen-
dientes). Las principales vas conocidas son el sis-
tema uvr de reparacin por escisin, el sistema de
reparacin de apareamientos errneos dirigido por
metilos, y las vas de recombinacin recB y recF as
como las de reparacin-recombinacin. Las activi-
dades enzimticas comprendidas en estos sistemas
son de endonucleasas y exonucleasas (importan-
tes para retirar el DNA daado), resolvasas (endo-
nucleasas que actan de manera especfica sobre
uniones recombinantes), helicasas para desenrollar
el DNA y polimerasas de DNA para sintetizar nuevo
DNA. Algunas de estas actividades enzimticas son
exclusivas de determinadas vas de reparacin, en
tanto otras participan en mltiples vas.
El aparato de replicacin presta mucha atencin
al control de calidad. Las polimerasas de DNA utili-
zan la correccin de lectura para verificar la secuen-
cia de la cadena hija y eliminar errores. Algunos de
los sistemas de reparacin son menos precisos cuan-
do sintetizan DNA para sustituir un material daado.
Por este motivo, a dichos sistemas se les conoce his-
tricamente como sistemas susceptibles de error.
La escisin-reparacin sustituye el DNA daado
Hmiiinmin
El DNA es daado
nmiimiiim
Se elimina el dao
TTTiiinn.frnT
Se sintetiza DNA de reposicin
nmiiiinmil
En la reparacin por escisin se sustituye de
manera directa el DNA daado y Luego sintetiza de nuevo un
segmento de reposicin para sustituir la cadena daada.
20.1 Introduccin 501
Los sistemas de reparacin
corrigen el dao deL DNA
Conceptos principales
Los sistemas de reparacin reconocen las secuencias de
DNA que no cumplen con los pares de bases estndar.
Los sistemas de escisin retiran una cadena de DNA del
sitio daado y despus la sustituyen.
Los sistemas de reparacin por recombinacin utilizan
la recombinacin para sustituir la regin de doble
cadena que ha sido daada.
Todos estos sistemas son susceptibles de introducir
errores durante el proceso de reparacin.
La fotorreactivacin es un sistema de reparacin no
mutgeno que acta de manera especfica en dmeros
de pirimidinas.
Los tipos de dao que desencadenan sistemas de re-
paracin se pueden dividir en dos clases generales:
.
Los cambios de una sola base afectan la se-
cuencia del DNA, pero no su estructura glo-
La sustitucin de U con C revierte la desaminacin
Naturaleza de la mutacin
Citosina
H H
Uracilo
O
DesaminacinA
Consecuencias
U
-G sustituye a G-G
Se corrige por
sustitucin de
U con C
La desaminacin de la citosina crea un par de
bases U-G. Se retira de preferencia el uracilo del par con apa-
reamiento errneo.
bal. No afectan la transcripcin o replic; r.
cuando se separan las cadenas dple:-.
DNA. As, estos cambios ejercen sus z.z
tos lesivos en generaciones futuras pe r
consecuencias del cambio en la secuer.:
del DNA. La causa de este tipo de efecto*
la conversin de una base en otra que i
aparea mal con su contraparte. Los can::
de una sola base pueden ocurrir come --
sultado de la mutacin de una base ir.
o por errores de replicacin. La FIGURA a
muestra que la desaminacin de la citoai
para producir uracilo (en forma espontne
o por un mutgeno qumico) crea un parT
G con apareamiento errneo. La 1GURA
muestra que es posible que un error de :
plicadn cause la insercin de una adenil
en lugar de una citosina para crear un 7
A-G
. Tal vez haya consecuencias simils-
de la adicin covalente de un pequeo gn
po a una base que modifica su capacidac :
apareamiento. Estos cambios pueden ca
sar una distorsin estructural muy peque:
(como en el caso de un par U-G) o una rr.
dificacin bastante significativa (como en
caso de un par A-G), pero la caractera
ca comn es que el apareamiento errn;
persiste slo hasta la siguiente replica c:
Por lo tanto, slo se dispone de poco tierr.:
para reparar el dao antes de que se fije :
replicacin.
Las distorsiones estructurales puec,-;
constituir un impedimento fsico para la r
plicacin o transcripcin. La introduccir.
enlaces covalentes entre las bases de una :
dena de DNA o en cadenas opuestas inhil
la replicacin y la transcripcin. En la FIG
5 se muestra un ejemplo de irradiac.
llli ll l Ill
'
iill'J iltS
Naturaleza de la mutacin
Citosina
H H
N Errores de la
J
replicacin
Consecuencias
Un pardepurinas
Adenina distorsiona la
H H
cadena dplex
--
1
4
-A G
Se corrige por
retiro de A o G
en la cadena
recin sintetizada
Un error de replicacin crea un par con aparea-
miento errneo, que tal vez se corregirla con la sustitucin de
una base; si no se corrige, la mutacin se fija en una cadena
dplex hija.
Naturaleza de la mutacin
CH,n) CH.,9
Ij
J
Timina
Tmma
Radiacin
ultravioleta
Consecuencia;
El dmero de
timina
distorsiona la
cadena dpie
Se corrige
por escisin
La irradiacin ultravioleta causa la formacic-
dmeros entre timinas cercanas. El dmero bloquea la replif
cin y la transcripcin.
502 CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
ultravioleta (UV) donde se introducen en-
laces covalentes entre dos bases de timina
cercanas, lo que da lugar a un dmero de
pirimidina intracatenario. La
muestra que puede haber consecuencias si-
milares si se aade un agregado voluminoso
o una base que distorsiona la estructura de
la doble hlice. Como se muestra en la
RA 20.7, una hendidura en una sola cadena
o el retiro de una base impiden que una
cadena sirva como molde apropiado para
la sntesis de RNA o DNA. La caracterstica
comn de todos estos cambios es que el seg-
mento de agregacin daado se mantiene
en el DNA y continua causando problemas
estructurales, induce mutaciones, o ambas
cosas, hasta que se retira.
Cuando se eliminan los sistemas de reparacin,
: > clulas se vuelven en extremo sensibles a la irra-
Sacin ultravioleta. La introduccin de dao indu-
.:
o por UV ha constituido una prueba importante
Mra los sistemas de reparacin, por lo que cuando
C valoran sus actividades y eficacias relativas debe
recordarse que el nfasis podra ser diferente si se es-
piaran otros segmentos de agregacin daados.
La metilacion puede distorsionar la estructura del DNA
Naturaleza de la mutacin
Guanina Metilguanina
N
JkN Alquilacin N /
Consecuencias
El grupo metilo
distorsiona la
doble hlice
1 1
=
1 1
Se corrige por
desalquilacin
IRA La metilacin de una base distorsiona la doble
ilice y causa apareamiento errneo en la replicacin. La es-
slla seala el grupo metilo.
la sustit
Naturaleza de la mutacin
Adenina
N
Despurinacin
Consecuencias
No hay purina
Se corrige por
insercin
La despurinacin retira una base del DNA y blo-
.iea la replicacin y la transcripcin.
Sistemas de reparacin
por escisin en f. coli
Concepto principal
. El sistema Uvr hace escisiones a -12 bases de distancia
de ambos lados del DNA daado, retira el DNA entre
ellas y vuelve a sintetizar el DNA nuevo.
Los sistemas de reparacin por escisin varan en su
especificidad, pero comparten las mismas caracters-
ticas generales. Cada sistema retira bases daadas o
mal apareadas del DNA y luego sintetiza una nueva
cadena de DNA para sustituirlas.
El principal tipo de va para la reparacin me-
diante la escisin se ilustra en la jURA
En el paso de la incisin, una endonucleasa
reconoce la estructura del sitio daado y corta la
cadena de DNA a ambos lados.
En el paso de la escisin, una 5'-3' exonucleasa
retira un segmento de la cadena daada.
una cadena daada
Dao
La base mulante se aparea en forma errnea o
distorsiona la estructura
iiimiiim
Incisin |r
La endonucleasa escinde ambos lados de la
base daada
TnTMrnTrrnTT
Escisin
La exonucleasa retira el DNA entre las hendiduras
TlTTimiiiinllim
Sntesis \
La polimerasa sintetiza el DNA de reposicin
iiimniunTmiT
La ligasa sella la hendidura
rrr
En la reparacin por escisin se retira un segmen-
to de DNA que incluye las bases daadas y se sustituye.
20.3 Sistemas de reparacin por escisin en E. coli
503
El sistema Uvr elimina el material daado
Deformacin del DNA
UVrA UvrB
UvrA reconoce el
dao y se une con
UvrB
UvrC UvrB
Se libera UvrA;
se une UvrC
UvrC UvrB
UvrC hace
l hendiduras en
ambos lados del
DNA daado
UvrD desenrolla la
regin y libera el
segmento daado
El sistema Uvr acta por etapas donde UvrAB
reconoce el dao, UvrBC hace una hendidura en el DNA y UvrD
desenrolla la regin marcada.
En el paso de la sntesis, la regin de cadena
nica resultante sirve como molde para que una
polimerasa de DNA sintetice una secuencia en sus-
titucin de la extirpada. (La sntesis de una nueva
cadena podra vincularse con el retiro de la antigua
en una accin coordinada.) Por ltimo, la ligasa de
DNA une de manera covalente el extremo 3' de la
nueva cadena al DNA original.
El sistema de reparacin por escisin uvr in-
cluye tres genes, uvrA, -B y -C, que codifican los
componentes de una endonucleasa de reparacin.
Sus funciones en las diversas etapas se indican en
la FIGURA 20.9. Primero, la combinacin UvrAB re-
conoce dmeros pirimidnicos y otras alteraciones
voluminosas. A continuacin, la UvrA se disocia
(lo que requiere trifosfato de adenosina [ATP]) y la
UvrC se une a UvrB. La combinacin UvrBC hace
una incisin a cada lado, una a siete nucletidos
del extremo 5' del sitio daado y la otra alejada de
tres a cuatro nucletidos del sitio 3', lo que tambin
requiere ATP. La UvrB es una helicasa que ayuda
a desenrollar el DNA para permitir la liberacin de
la cadena nica entre los dos cortes. La enzima que
corta la cadena daada de DNA es la polimerasa de
DNA I. Es posible que la enzima involucrada en la
sntesis de reparacin tambin sea la polimerasa I
de DNA (aunque las polimerasas II y III de DNA
pueden sustituirla). Los episodios son en esencia
los mismos, si bien su orden es diferente en lo que
se refiere a la va de reparacin eucaritica : _
muestra en la Figura 20.23.
Casi todos los sucesos de reparacin por es:
en E. coli corresponde a la reparacin por me:
UvrABC. En la mayor parte de los casos (99:
longitud promedio del DNA sustituido es de ~: 1
cletidos. (Por ese motivo, esta reparacin a mel
se describe como en parche corto). El 1% re-
de los casos implica la reposicin de segmen:
DNA, en su mayor parte de ~1 500 mide
de longitud, pero llegan a extenderse hasta >:
nucletidos (a veces denominada reparadoc
parche largo). No se sabe porqu algunos su:
desencadenan la forma de parche largo en luga
la de parche corto.
Otras protenas pueden dirigir el compleja
hada sitios daados. El dao del DNA puede Ui
dir la transcripcin, pero la situadn la resuelv -
protena llamada Mfd, que desplaza a la polirtte
de RNA y recluta al complejo Uvr (vase la I
ra 24.19 en la seccin 24.12, Una conexin j
transcripcin y reparacin).
EH Vas de reparacin por escis
en clulas de mamferos
Conceptos principales
La reparacin por escisin en los mamferos se
desencadena con la eliminacin directa de una base
daada del DNA.
.
El retiro de las bases desencadena la eliminacin ;.
sustitucin de un segmento de polinucletidos.
.
La naturaleza de la reaccin de retiro de bases
determina cul de las dos vas de reparacin por
escisin se activa.
.
La va pol5/e sustituye un segmento largo de polin._
.
cletidos; la va poip sustituye un segmento corto.
El principio general de la reparacin por escisi
las clulas de mamferos es similar al de las |:
rias. No obstante, el proceso por lo general se |
en una forma diferente, con el retiro de una
daada individual. Esto sirve como desencader
para activar las enzimas que cortan un fragir
del DNA que incluye el sitio daado y lo su
ven.
Las enzimas que retiran bases del DNA se ]e
glucosilasas y liasas. En la se m_
que una glucosilasa escinde el enlace entre la
daada o mal apareada y la de desoxirribo?;
la N 1 se muestra que algunas glucc;
son tambin liasas que pueden adelantar la res:
una etapa ms con el uso de un grupo amino
'
504
CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
Se retira el uracilo del DNA
0=P-0
Uracilo
9
0
= -0
o
Base faltante
Glucosilasa
9
o=f;-o
-
o
o=p-o
-
0 Una glucosilasa retira una base del DNA tre-
la escisin del enlace con la desoxirribosa.
Las glucosilasas retiran bases
Glucosilasa
r
Ligasa
CURA 20.11 Una glucosilasa hidroliza el enlace entre la
se y la desoxirribosa (con Wi), pero una liasa contina
reaccin al abrir el anillo del azcar (con NH
2
).
ira atacar el anillo de la desoxirribosa. Por lo gene-
J
, a esto le sigue una reaccin que introduce una
endidura en la cadena polinucleotdica.
La FIGURA 20.12 muestra que la forma exacta
;
la va depende de que la base daada se retire por
accin de una glucosilasa o una liasa.
El retiro de bases desencadena
la reparacin por escisin
Glucosilasa
i
ncisin
APE1
/ \
Accin de liasa
Trn.mr un
i.
Traduccin Sustitucin
de la hendidura del nucietido
PolSe aAPE1 PolB
Endonucleasa
FEN1
Sellado de
la brecha
min
XRGC1/
Lig3_
Sellado de la brecha
Ligl
l
Va de parche largo Va de parche corto
FIGURA 20.12 El retiro de las bases por la actividad de la glu-
cosilasa o la liasa desencadena vas de reparacin por escisin
en los mamferos.
A la accin de la glucosilasa le sigue la de la
endonucleasa APE1, que corta la cadena polinucleo-
tdica en el lado 5'. Esto, a su vez, atrae un complejo
de replicacin que incluye la polimerasa 5/e del DNA
y componentes auxiliares, que llevan a cabo un pro-
ceso de traduccin de la hendidura que se extiende
de dos a 10 nucletidos. El material desplazado es
retirado por la endonucleasa FEN1. La enzima liga-
sa-1 sella la cadena, lo que corresponde a la llamada
va de parche largo.
Cuando en el retiro inicial hay una accin de
liasa, la endonucleasa APE1 se combina con la poli-
merasa [3 de DNA para sustituir un solo nucietido.
La hendidura se sella entonces por la accin de la
ligasa de XRCCl/ligasa-3. A esto se le llama va de
parche corto.
20.4 Vas de reparacin por escisin en clulas de mamferos
505
Las met Lasas y Las gLucosi Lasas
"
Lanzan" Las bases
Conceptos principales
.
Las glucosilasas reconocen y retiran de manera directa
del DNA las bases alquiladas y el uraciio.
.
Los dmeros de pirimidinas se revierten por la rotura de
Los enlaces covalentes entre ellos.
.
Las metilasas agregan un grupo metilo a la citosina.
.
Todos estos tipos de enzima actan al lanzar la base
fuera de la doble hlice donde, de acuerdo con la
reaccin, es retirada o modificada y regresada a la
hlice.
Varias enzimas que retiran o modifican bases indivi-
duales en el DNA utilizan una reaccin notoria don-
de una base es "lanzada" fuera de la doble hlice.
Este tipo de interaccin se demostr por primera vez
en las transferasas de metilos, enzimas que aaden
un grupo metilo a la citosina en el DNA. La metilasa
lanza por completo fuera de la hlice a la citosi-
na diana. En la se muestra que entra
a una cavidad en la enzima, donde es modificada.
Despus, regresa a su posicin normal dentro de la
hlice. Todo esto ocurre sin aporte de una fuente
energtica externa.
Una de las reacciones ms frecuentes donde se
retira una base de manera directa del DNA es la
catalizada por la glucosilasa de uracilo-DNA. Por lo
general, el uraciio se encuentra en el DNA debido a
una desaminacin (espontnea) de la citosina, que
la glucosilasa reconoce y relira. La reaccin es simi-
lar a la de la metilasa. El uraciio es lanzado fuera
Una metilasa "lanza" la citosina diana fuera
de la doble hlice para modificarla. Fotografa por cortesa de
Sanjay Kumar, New England Biolabs.
de la hlice y hacia el sitio activo de la glucos;.i .
Otras glucosilasas y liasas, como las que recor.. ..
bases daadas en el DNA de los mamferos, ac:
de manera similar.
Las bases activadas (por lo general aqv.
donde se ha agregado un grupo metilo) se re
por un mecanismo similar. Una enzima hurr.;
nica, la glucosilasa del alquil-adenilo DNA (.-_-
reconoce y retira una variedad de sustratos ale .
dos que incluyen 3-metilademna, 7-metilgu;;"
e hipoxantina.
En contraste con este mecanismo, la 1 -rr.:
adenina es corregida por una enzima que utfi
un mecanismo de oxigenacin (eodilicado en
por el gen alkB, que tiene homlogos muy d:
sos en la naturaleza, incluidos tres genes humar
El grupo metilo es oxidado para formar un gr
CH
2
OH, y despus, la liberacin del segmento HG
(formaldehdo) restablece la estructura de la a;:
na. Un avance muy interesante es el descubrinrx-
de que la enzima bacteriana, y una de las enz.r
humanas, tambin pueden reparar la misma :.
daada en el RNA. En el caso de la enzima huir.i
la principal diana puede ser el RNA ribosmico Z
es el primer episodio de reparacin conocido C
RNA como diana.
Otra enzima que "lanza" bases es la fotoaa
que revierte los enlaces entre dmeros de pirim:zr_
(vase la Figura 20.5). El dmero de pirimidi:--
lanzado al interior de una cavidad en la enr:r._
Cerca de esta cavidad se encuentra un sitie i -
vo que contiene un donador de electrones, qu z
provee para romper los enlaces. La energa par:
reaccin proviene de la luz dentro de la longir::
onda visible.
La caracterstica que comparten estas enz r
es el lanzamiento de la base diana al interi: r
la estructura enzimtica. La endonucleasa Ve-."
utiliza una variacin de este esquema, ahora r.
brado T4-pdg (glucosilasa del dmero de pin-
nas) para reflejar su forma de accin. Lanza la r-s*-
adenina complementaria de la timina en el sitio 5
dmero de pirimidinas. Por lo tanto, en este
la diana para la accin cataltica de la enzima ..
siendo el DNA dplex, y la enzima utiliza el lanzi
miento como un mecanismo indirecto para obtea*
acceso a su diana.
Despus de que se retira una base del DNA
ne lugar una escisin de la columna fosfodister -
una endonucleasa, la sntesis de DNA por un;
limerasa de DNA para llenar la brecha y la liga: .
por una ligasa para restablecer la integridad de.
dena polinucleotdica, como se describe para "._=
de reparacin por escisin en los mamferos
la seccin 20.4, Vas de reparacin por escisior -
clulas de mamferos).
506 CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
Reparacin susceptible de
error y fenotipos mutadores
lonceptos principales
El DNA daado que no ha sido reparado hace que
la polimerasa III de DNA se detenga durante la
replicacin.
La polimerasa V de DNA (codificada por umuCD) o la
polimerasa IV de DNA (codificada por dinB) pueden
sintetizar un complemento de la cadena daada.
El DNA sintetizado por la polimerasa de reparacin de
ONA a menudo tiene errores en su secuencia.
Es posible que las protenas que afectan la fidelidad de
La replicacin sean identificadas por genes mutadores,
en los que la mutacin ocasiona una mayor tasa de
mutaciones espontneas.
:
existencia de sistemas de reparacin que parti-
:
an en la sntesis del DNA hace surgir la interro-
:
re de si su control de calidad es comparable con
:
e la replicacin del DNA. Hasta donde se sabe,
B todos los sistemas, incluido el de reparacin por
cisin controlado por uvr, no difieren de mane-
iignificativa en la frecuencia de errores respecto
-
la replicacin del DNA. Sin embargo, en E. coli
::
re sntesis de DNA susceptible de errores en
(Das circunstancias.
La caracterstica de susceptibilidad de error se
:
erv por primera vez cuando se encontr que
:
eparacin del DNA daado del fago A. se acom-
baba de la induccin de mutaciones cuando se
ttoduca el fago en las clulas que antes se haban
Eadiado con UV. Esto sugiere que la radiacin UV
iiospedador activ funciones que generan mu-
- mes. La respuesta mutagnica tambin acta en
DNA del hospedador bacteriano.
:Cul es la verdadera actividad susceptible de
~
:r? Es una polimerasa de DNA que inserta bases
::
rrectas, que representan mutaciones, cuando
i por cualquier sitio donde no puede introducir
rs de bases complementarios en la cadena hija.
- funciones involucradas en esta va susceptible
rror se identifican por las mutaciones en los
-
rs umuD y umuC, que suprimen la mutagne-
nducida por UV. Esto implica que las protenas
-
C y UmuD causan mutaciones que tienen lugar
F us de la irradiacin UV. Los genes constituyen
ern umuDC cuya expresin es inducida por el
del DNA. Sus productos forman un complejo
tuD'
C que consta de dos subunidades de una
Ttena truncada UmuD y una subunidad UmuC.
muD es escindida por RecA, la cual es activada
-
e dao del DNA (vase la seccin 20.10, La
"
\ desencadena el sistema SOS).
El complejo UmuD'
2
C tiene actividad de poli-
merasa de DNA. Se llama polimerasa V de DNA y se
encarga de la sntesis del nuevo DNA para sustituir
secuencias que han sido daadas por la luz UV. Esta
es la nica enzima en E. coli que puede pasar por
alto los dmeros de pirimidinas habituales produci-
dos por luz UV (u otros productos voluminosos). La
actividad de la polimerasa es susceptible de error.
La mutacin de umuC o umuD desactiva a la enzima,
lo que hace letal la irradiacin UV. Algunos pls-
midos portan genes llamados mucA y mucB que son
homlogos de umuD y umuC y cuya introduccin a
una bacteria aumenta su resistencia a la eliminacin
por UV y la susceptibilidad a la mutagnesis.
Cmo gana acceso al DNA una polimerasa de
DNA alternativa? Cuando la replicasa (polimerasa
m de DNA) encuentra un bloqueo, como un dmero
de timidinas, se detiene. Despus es desplazada de
la horquilla de replicacin y sustituida por la po-
limerasa V de DNA. De hecho, la polimerasa V de
DNA utiliza las mismas protenas auxiliares que la
polimerasa DI de DNA. La misma situacin es vlida
para la polimerasa IV de DNA, producto de dinB,
que es otra enzima que acta sobre el DNA daado.
Las polimerasas IV y V de DNA son parte de una
familia ms grande, que incluye las polimerasas de
DNA eucariticas cuyos miembros participan en la
reparacin del DNA daado (vase la seccin 20.11,
Las clulas eucariticas tienen sistemas de repara-
cin conservados).
Control de la direccin de
la reparacin
de apareamientos errneos
Conceptos principales
.
Los genes mut codifican un sistema de reparacin de
apareamientos errneos que se encarga de las bases
mal apareadas.
.
Hay una tendencia en la seleccin de qu cadenas
sustituir en los apareamientos errneos.
.
Por lo general, se sustituye la cadena que carece de
mutilacin en un segmento hemimetilado.
.
Este sistema de reparacin se usa para eliminar
errores en una cadena de DNA recin sintetizada. En
los apareamientos errneos de G-T y C-T se retira de
preferencia la T.
Los genes cuyos productos participan en el control
de la fidelidad de la sntesis del DNA durante la re-
plicacin o reparacin pueden identificarse por las
mutaciones que tienen un fenotipo matador. Un
mutante de mutador tiene una mayor frecuencia de
mutacin espontnea. Cuando se identifica en un
20.7 Control de la direccin de la reparacin de apareamientos errneos
507
, M, Y actan sobre la guanina oxidada
MutT hidroliza el 8-oxo-dGTP
dGTP
V MutT O
dGTP-
Hidrlisis
MutM retira G=0 que se aparea con C
G -
0
Replicacin
9
G
G
I
MutM
C
Glucosilasa Insercin
deG
G
C
La MutY retira A que est apareada con G=0.
O MutY O O
G
A
O
11
G
Glucosilasa Insercin
deC
FIGURA 20.14 El retiro preferente de bases en pares que
tienen guanina oxidada est diseado para disminuir al mnimo
[as mutaciones.
principio a un gen por el fenotipo mutador, se le des-
cribe como mut; no obstante, a menudo se observa
ms tarde que un gen mut equivale a una actividad
de replicacin o reparacin conocida.
Los tipos generales de actividades identificadas
por los genes mut se dividen en dos grupos:
.
El grupo principal consta de componentes
de sistemas de reparacin de apareamientos
errneos. Cuando no se elimina un par de
bases daado o mal apareado antes de la re-
plicacin puede inducirse una mutacin. Las
funciones de este grupo incluyen la metilasa
dam, que identifica la diana para reparacin,
y las enzimas que participan de manera di-
recta o indirecta en la eliminacin de tipos
particulares de dao (mutH, -S, -L, - Y).
.
Un grupo ms pequeo, tipificado por dnaQ
(que codifica una subunidad de la polime-
rasa III de DNA), se encarga de la precisin
de la sntesis del nuevo DNA.
Cuando se retira una distorsin estructural del
DNA, se restablece la secuencia del tipo silvestre. En
casi todos los casos, la distorsin se debe a la crea-
cin de una base que no se encuentra de manera
natural en el DNA y que, por tanto, es reconocida
y retirada por el sistema de reparacin.
Surge un problema si la diana para la repara-
cin es una asociacin mal apareada de bases (nor-
males) que se crea cuando una tena mutacin. El
sistema de reparacin no tiene medios intrnsecos
para conocer cul es la base de tipo silvestre y cul la
murante. Todo lo que detecta es un par de bases mal
apareadas, cualquiera de las cuales puede proveer
la diana para la reparacin por escisin.
Si se retira la base mutada, la secuencia de i
silvestre se restablece. No obstante, si sucede (fl
retir la base original (de tipo silvestre), la q
secuencia (murante) se torna fija. Sin embar;.
menudo la direccin de la reparacin por escis
no es aleatoria, sino que en su lugar tiene uns -
dencia tal que puede llevar al restablecimieffl
la secuencia de tipo silvestre.
Se toman algunas precauciones para gui:
reparacin en la direccin correcta. Por ejeraj
para casos como la desaminacin de la 5-metiIc
sina para obtener timina, hay un sistema espe
que restablece la secuencia apropiada (vase
bin la seccin 1.15, Muchos puntos calientes I
resultado de bases modificadas). La desaminac
genera un par G-T y el sistema que acta sobre U.
pares tiende a corregirlos a pares G-C (en vez de
res A-T). El sistema que se encarga de esta reata
incluye MutL, los productos S que retiran las T
los apareamientos errneos G-T y C-T.
El sistema mutT, M, Y se encarga de las ce"
cuencias del dao oxidativo. Un tipo importa]
de dao qumico lo ocasiona la oxidacin de G c
produce 8-oxo-G. En la nGUR/ 20.14 se mue
que el sistema acta en tres niveles. La protena M
hidroliza al precursor daado (8-oxo-dGTP), lo
evita que se incorpore al DNA. Cuando la guan:
est oxidada en el DNA, su contraparte es la cito?;
y MutM retira de manera preferente la 8-oxo-G
los pares 8-oxo-G-C. La guanina oxidada se apa
mal con A y, por ello, cuando persiste la 8-oxo-G >
replica, genera un par 8-oxo-G-A. La MutY elim
la A de estos pares. MutM y MutY son glucosik
que retiran de manera directa una base del DNA
que crea un sitio apurnico al que reconoce una
donucleasa cuya accin desencadena la participac
del sistema de reparacin por escisin.
Cuando ocurren errores de apareamiento 1
rante la replicacin en E. coli, es posible distinj
la cadena original del DNA. En cuanto termirv
replicacin del DNA metilado, slo la cadena I
genitora original porta grupos metilo. Cuand<
cadena que acaba de sintetizarse est esperai
la introduccin de grupos metilos se pueden dis1
guir las dos cadenas.
Esto constituye la base de un sistema pa
correccin de errores de replicacin. El gen :
codifica una metilasa cuya diana es la adenina
la secuencia (vase la Figura 15.7). El ese
hemimetilado permite distinguir orgenes con i
replicacin. Un sistema de reparacin relacin.
con la replicacin usa los mismos sitios diana.
La muestra que el DNA que e
tiene pares de bases unidos en forma errne
repara de manera preferente mediante la esets
508
CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
La metilacin distingue las cadenas de DNA
Replicacin
Me
GATC
El error de replicacin genera
apareamiento errneo A-C
Me
mte . GATC A
CTAG 0
La adenina no metilada hace
blanco en la cadena para reparacin
1
Me
GATO
CTAG
La cadena no metilada
se fragmenta
l
Me
GATC
CTAG
A
T
Metilacin de Dam
i
Me
GATC
CTAG -
Me
La sntesis de
DNA corrige el
error
A
memT
Las secuencias GATC son dianas para la meti-
a Dam despus de La repLicacin. Durante eL periodo anterior
asta metiLacin, La cadena no metiLada es La diana para la
jaracin de bases con apareamiento errneo.
'
la cadena que carece de metilacin. La escisin es
istante amplia; se pueden reparar de preferencia
s apareamientos errneos de hasta >1 kb alrede-
pE de un sitio GATC. El resultado es que la cadena
dn sintetizada se corrige hacia la secuencia de la
dena progenitora.
Las mutantes de danr en E. coli muestran una
iyor tasa de mutaciones espontneas. Este siste-
a de reparacin, por tanto, ayuda a disminuir el
imero de mutaciones causadas por errores en la
plicacin. Consta de varias protenas codificadas
ir genes mut. La protena MutS se une al par mal
>areado y se agrega MutL. La MutS puede utilizar
s sitios de unin al DNA, como se ilustra en la
KJRA 20.1 . En el primero se reconocen de ma-
rra especfica apareamientos errneos. El segundo
es especfico para la secuencia o estructura y se
;
iiiza para translocacin junto con el DNA hasta
icontrar una secuencia GATC. Se utiliza hidrlisis
j ATP para impulsar la translocacin. La MutS se
le al sitio de apareamiento errneo y al DNA a
edida que se transloca y, como resultado,
crea un
ice en el DNA.
MutSL se une a apareamientos errneos en
cadenas de DNA no metiladas
El dmero MutS se une al
apareamiento errneo
El dmero MutL se une al MutS
GATC
MutS se transloca a GATC
GATC
MutH se une al complejo
en la secuencia GATC
GATC
El MutS reconoce un apareamiento errneo y
Lo transloca a un sitio GATC. La MutH escinde la cadena no
metilada en el GATC. Las endonucleasas fragmentan la cadena
desde GATC hasta el sitio de apareamiento errneo.
El reconocimiento de la secuencia GATC origina
que la endonucleasa MutH se una a MutSL. Luego,
la endonucleasa fragmenta la cadena no metilada.
Esta cadena es despus escindida del sitio GATC
hacia el sitio de apareamiento errneo. La escisin
puede ocurrir en direccin 5
'
-
3
'
(con uso de RecJ o
exonucleasa VII), o 3
'
-
5'
(con uso de exonucleasa
I), y es asistida por la helicasa UvrD. La polimerasa
III de DNA sintetiza la nueva cadena de DNA.
El sistema de reparacin MSH de Sacharomyces
cerevisiae es homlogo del sistema mut en E. coli.
La Msh2 es el bastidor para el aparato que recono-
ce apareamientos errneos. Las protenas Msh3 y
Msh6 proveen factores de especificidad. El complejo
Msh2-Msh3 es hlices con apareamiento errneo de
dos a cuatro nucletidos, y el complejo Msh2-Msh6
se une a apareamientos errneos de una sola base,
inserciones o deleciones. Despus se requieren otras
protenas para el proceso mismo de reparacin.
Tambin se encuentran homlogos del sistema
MutSL en clulas de eucariotas superiores. Adems
de la reparacin de apareamientos errneos de
pares de bases nicos, se encargan de la de apa-
reamientos errneos que surgen como resultado
de deslizamientos en la replicacin. En una regin
como un microsatlite, donde una secuencia muy
corta se repite varias veces, la realineacin entre
la cadena hija recin sintetizada y su molde puede
llevar a "tartamudeos" donde la polimerasa de DNA
20.7 Control de la direccin de La reparacin de apareamientos errneos
509
Muf S/MutL repara deslizamientos de la replicacin
TCAGTGTGTGTGT
AGTCAGACAGAGA
S
El deslizamiento de
la replicacin genera
una hlice de una sola
cadena
MutS se une al
apareamiento
errneo
Se une MutL
El apareamiento
errneo lo retira una
exonucleasa, una
helicasa, una
polimerasa de DNA
y una ligasa
I
El sistema MutS/MutL inicia la reparacin de
apareamientos errneos producidos por el deslizamiento de la
replicacin.
se desliza hacia atrs y sintetiza unidades de repeti-
cin adicionales. Estas unidades en la cadena hija se
expulsan como una hlice de cadena nica desde la
doble hlice (vase la Figura 6.28). Los homlogos
del sistema MutSL las reparan, como se muestra en
la FIGURA 20.17.
La importancia del sistema MutSL para la repara-
cin de apareamientos errneos queda de manifiesto
por la elevada tasa con la que se encuentra que es de-
fectuoso en los cnceres humanos. La prdida de este
sistema lleva a un mayor ndice de mutaciones.
| Sistemas de repanacfnn
por recombmadn en E. ooli
Conceptos principales
Los genes rec de E. coli codifican el principal sistema
de recuperacin.
El principal sistema de recuperacin acta cuando
la replicacin deja una brecha en una cadena recin
sintetizada que se encuentra frente a una secuencia
daada.
Se utiliza la cadena nica de otro segmento dplex
para sustituir la brecha.
Se retira entonces la secuencia daada y se presenta
una nueva sntesis.
La reparacon-recombinacn utiliza
dos cadenas dplex
Dao
Las bases en una cadena de DNA estn daadas
La replicacin genera una copia con una brecha
frente al dao y una copia normal
Recuperacin
Se repara la brecha cuando se recupera una
secuencia de una copia normal
I
imiimii
Se repara la brecha en una copia normal
iiiiiiiiimiiimi
8 Un sistema de recuperacin de E. coli aS z
una cadena normal para sustituir La brecha dejada en urn
dena que acaba de sintetizarse frente a un sitio de da=:
reparado.
Los sistemas de reparacin por recombinacin .
lizan actividades que se superponen con las c; i
prendidas en la recombinacin gentica. A vea
tambin se denominan de "reparacin por repiic-j
cin
"
porque actan despus de la replicacin. 7_
sistemas son eficaces para abordar los defectos ~:
ducidos en cadenas hijas dplex por la replicac
de un molde que contiene bases daadas. En la
se incluye un ejemplo. El reinicio de
horquillas de replicacin varadas podra tener u i
funcin importante en los sistemas de reparac
por recombinacin (vase la seccin 18.17, Es ne
sario el primosoma para reiniciar la replicacin
Considrese una distorsin estructural, coa
un dmero de pirimidinas, en una cadena de a
doble hlice. Cuando se replica el DNA, el din:-
impide que el sitio daado acte como molde. U
replicacin se ve forzada a pasar por alto ese sitie 1
probable que la polimerasa de DNA avance has:;
dmero de pirimidinas, o cerca, y luego cesa la sfc
sis de la cadena hija correspondiente. La replicac
se reinicia a distancia ms adelante. Queda una t
cha sustancial en la cadena recin sintetizada.
510 CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
Las cadenas dplex hijas resultantes tienen na-
turalezas diferentes. Una posee la cadena progeni-
fera que contiene el segmento daado frente a una
.adena de sntesis reciente con una brecha larga. El
aro duplicado tiene la cadena progenitora sin dao,
que se ha copiado en una cadena complementaria
normal. El sistema de recuperacin saca ventaja de
.
2 cadena hija normal.
La brecha opuesta al sitio daado en la prime-
ra cadena dplex se llena mediante la sustraccin
:
e la cadena nica homloga de DNA de la dplex
normal. Despus de este intercambio de una sola
cadena
, la forma dplex receptora tiene una cadena
y rogenitora (daada) frente a una de tipo silvestre.
La forma dplex donadora tiene una cadena pro-
genitora norma
l frente a una brecha; entonces, la
:
recha puede llenarse mediante la sntesis de repara-
dn en la forma habitual, lo que genera una cadena
iplex normal. As, el dao se confina a la distorsin
riginal (si bien los mismos episodios de reparacin o
recombinacin deben repetirse despus de cada ciclo
de replicacin hasta que el dao se remedie con un
.:
stema de reparacin por escisin).
La principal va de reparacin por recombina-
dn de E. coli se identifica por los genes rec (vanse
as Figuras 19.13a 19.15).En . co/z con una repara-
cin por escisin defidente, la mutacin del gen recA
"
.iprime en esencia todos los recursos de reparacin
recuperacin restantes. Los intentos por replicar
e! DNA en clulas wvr recA-producen fragmentos
ie DNA cuyo tamao corresponde a la distancia es-
m
erada entre los dmeros de timinas. Este resultado
r
.iplica que los dmeros constituyen un obstculo
;
tal para la replicacin cuando RecA no funciona, lo
que explica porqu la bacteria con la doble mutacin
no puede tolerar ms de uno a dos dmeros en su
senoma (en comparacin con la capacidad de una
bacteria de tipo silvestre de manejar hasta 50).
Una va rec implica a los genes recBC y est bien
descrita; la otra involucra a recF y no est tan
bien definida. Cumplen funciones diferentes in vivo.
La va RecBC participa en el reinicio de las horqui-
as de replicacin varadas (vase la seccin 20.9,
La recombinacin es un importante mecanismo
paxa recuperarse de errores de la replicacin). La
Ma RecF participa en la reparacin de brechas de la
:
adena hija que quedan despus de la replicacin
ns all de un dmero de pirimidinas.
Las vas RecBC y RecF funcionan ambas antes
r la intervencin de RecA (aunque en diferentes
;
. rmas). Conducen al vnculo de RecA con un DNA
e cadena nica. La capacidad de RecA de intercam-
:
iar cadenas nicas le permite llevar a cabo el paso
:
e recuperacin de la Figura 20d 8. A continuacin,
as actividades de nucleasa y polimerasa concluyen
a actividad de reparacin.
La va RecF contiene un conjunto de tres genes:
recF, recO y recR. Las protenas forman dos tipos de
complejos, RecOR y RecOF. Facilitan la formacin
de filamentos RecA en el DNA de cadena nica.
Una de sus funciones es permitir que los filamentos
se ensamblen a pesar de la presencia del SSB, que
es inhibitoria. Se cree que funcionan en las brechas;
sin embargo, la reaccin in vitro requiere un extre-
mo 5
'
libre.
Las designaciones de genes de reparacin y re-
combinacin se basan en los genotipos de las imi-
tantes, pero a veces una mutacin aislada en un
conjunto de circunstancias y denominada locus uvr
parece estar aislada en otro conjunto de circunstan-
cias como locus rec. Esta incertidumbre es importan-
te. An no se define cuntas funciones pertenecen a
cada va o cmo interactan ambas. Las vas uvr y rec
no son por completo independientes porque las mu-
lantes de uvr muestran menor eficacia en la repara-
cin por recombinacin. Se debe esperar encontrar
una red de nucleasa, polimerasa y otras actividades,
que constituyen sistemas de reparacin superpues-
tos de manera parcial (o donde una enzima por lo
general utilizada para proveer alguna funcin puede
ser sustituida por otra de una va diferente).
j g La recombinacin es un
mecanismo importante de
recuperacin ante errores
de repLicacin
Conceptos principales
.
Una horquilla de repLicacin puede quedarse varada
cuando encuentra un sitio daado o una hendidura en
el DNA.
.
Una horquilla varada puede revertirse por el
apareamiento entre las dos cadenas recin sintetizadas.
.
Una horquilla varada puede reiniciar la reparacin del
dao y utilizar una helicasa para poder avanzar.
.
La estructura de la horquilla varada es la misma que
la unin Holliday y puede convertirse en una cadena
dplex y DSB por la accin de las resolvasas.
Todas las clulas tienen muchas vas para reparar
el dao en el DNA. La va que se utilice depender
del tipo de dao y las circunstancias. Las vas de
reparacin por escisin pueden, en principio, usar-
se en cualquier momento, pero las de reparacin
por recombinacin se pueden usar slo cuando hay
una segunda cadena dplex con una copia de la
secuencia daada, esto es, despus de la replicacin.
Se presenta una circunstancia especial cuando se
replica el DNA daado porque la horquilla de repli-
cacin puede quedarse varada en el sitio del dao.
20.9 La recombinacin es un mecanismo importante de recuperacin ante errores de replicacin
511
Una horquilla de replicacin se colapsa en
La horquilla de repiicacin se queda varada
en el sitio daado
La horquilla de replicacin se revierte y colapsa
Se repara el dao
La helicasa restablece la horquilla de replicacin
Una horquilla de replicacin se queda varada
cuando alcanza un sitio daado en el DNA. La reversin de La
horquilla permite que las dos cadenas hijas se apareen. Despus
de que se ha reparado el dao, se restablece la horquilla por la
migracin de rama en avance catalizada por una helicasa. Las
puntas de flecha indican los extremos 3
'
.
Las vas de reparacin por recombinacin permiten
el restablecimiento de la horquilla despus de que se
ha reparado el dao, o que lo pasen por alto.
La FIGURA muestra un posible resultado
cuando se detiene una horquilla de replicacin.
La horquilla deja de avanzar cuando encuentra el
dao. El aparato de replicacin se desensambla, al
menos en forma parcial, lo que permite que ocurra
migracin de ramas cuando la horquilla se desplaza
hacia atrs de manera eficaz y las nuevas cadenas
hijas se aparean para formar una estructura dplex.
Despus de que se ha reparado el dao, una helicasa
hace girar hacia adelante la horquilla para restable-
cer su estructura. Despus, el aparato de replicacin
se puede reensamblar y se reinicia el proceso (vase
la seccin 18.17, El primosoma es necesario para
reiniciar la replicacin). Se requiere polimerasa n de
DNA para el reinicio de la replicacin, que despus
es sustituida por la polimerasa III de DNA.
Se pueden generar DSB en horquillas varadas
La horquilla de replicacin se detiene en el sitio daaac
La horquilla de replicacin se revierte y colapsa
Una resolvasa corta en la unin
Se ha creado un DSB
Se crea otro DSB si el dao consiste en una hendidura
La estructura de una horquilla de replicar;
varada se asemeja a una unin de Holliday y las resolvs:;
pueden resolverla en la misma forma. El resultado depende :
que el sitio daado contenga una hendidura o no. El resul:-;
1 muestra que se genera una rotura de doble cadena cuanc: .
corta un par de cadenas en la unin. El resultado 2 muestra :.
se genera un segundo DSB en el sitio del dao si contiene
hendidura. Las puntas de flecha indican los extremos 3'.
La va para el manejo de una horquilla de repB
cacin varada requiere enzimas de reparacin. Eu\
E
. coli los sistemas RecA y RecBC tienen una func
importante en esta reaccin (de hecho, sa put:
ser su principal funcin en la bacteria). Una postbl
va es que RecA estabilice el DNA de cadena n
mediante su unin en la horquilla de replicaci
varada y quiz al actuar como sensor que detecta
suceso de detencin. El RecBC participa en la re;;
racin del dao por escisin. Despus de que se >
reparado el dao, se puede reiniciar la replicacin
Otra va puede usar la reparacin por rece-
binacin, quiz las reacciones de intercambio d
cadenas de RecA. La
'
l&URA 20.20 muestra que
512 CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
La recombinacin reinicia la replicacion
La horquilla de replicacion se queda varada en
el sitio daado
Una cadena progenitora no daada presenta
entrecmzamiento
La cadena desplazada se aparea con la complementaria
Ocurre un segundo entrecruzamiento
La resolvasa acta en las uniones
Se reinicia la replicacion
TCURA 20. Cuando una horquilla de replicacion se queda
Bada, una reparacin por combinacin puede colocar una
Hdena sin dao frente al sitio daado, lo que permite que
intine la replicacin.
tructura de la horquilla varada es en esencia la
lisma que la de una unin Holliday creada por
:
-
recombinacin entre dos DNA dplex, lo que la
onvierte en una diana para las resolvasas. Se ge-
era una rotura de la doble cadena si una resolvasa
scinde cualquier par de cadenas complementarias.
-dems, si el dao es, de hecho, una hendidura, se
rea otra rotura de la doble cadena en este sitio.
Se pueden rescatar las horquillas de replicacin
radas mediante la reparacin por recombinacin.
No se conoce la secuencia exacta de los sucesos,
pero en la FIGURA 20.21 se ilustra una posibilidad.
El principio es que el episodio de recombinacin
ocurre a cada lado del sitio daado, lo que permite
que la cadena nica no daada se aparee con la
daada. Ello permite que la horquilla de replicacin
se reconstruya de manera que la replicacin pueda
continuar y evite de manera ecaz el sitio daado.
La Rec desencadena
el sistema SOS
Conceptos principales
El dao del DNA causa que RecA desencadene la
respuesta SOS, que consta de genes que codifican
muchas enzimas de reparacin.
i La RecA impulsa la actividad de escisin propia de
LexA.
.
La LexA reprime el sistema SOS; su escisin propia
activa esos genes.
La participacin directa de la protena RecA en la
reparacin por recombinacin es slo una de sus
actividades. Esta extraordinaria protena tiene tam-
bin otra funcin bastante distintiva. Se puede acti-
var con muchos tratamientos que daan el DNA o
inhiben la replicacin en la E. coli, lo que hace que
desencadene una serie compleja de cambios fenot-
picos llamados respuesta SOS, que incluye la ex-
presin de muchos genes cuyos productos abarcan
funciones de reparacin. Estas actividades dobles
de la protena RecA hacen difcil saber si una de-
ciencia en la reparacin de clulas mutantes para
recA se debe a la prdida de la funcin de intercam-
bio de cadenas del DNA de RecA o a alguna otra
funcin cuya induccin dependa de la actividad de
proteasa.
La induccin del dao puede adoptar la forma
de irradiacin ultravioleta (el caso ms estudiado) o
deberse al enlace cruzado o a agentes alquilantes. La
inhibicin de la replicacin por cualquiera de varios
medios, como la privacin de timina, la adicin de
frmacos o mutaciones en varios de los genes dna,
tiene el mismo efecto.
La respuesta adopta la forma de una mayor ca-
pacidad de reparacin del DNA daado, que se logra
mediante la induccin de la sntesis de los compo-
nentes del sistema de reparacin por escisin de
parche largo y las vas de reparacin por recombi-
nacin Rec. Adems, se inhibe la divisin celular,
Se pueden inducir profagos lisognicos,
El episodio inicial de la respuesta es la activacin
de RecA por el tratamiento daino. No se sabe mu-
cho de la relacin entre el suceso daino y el cambio
20.10 La RecA desencadena el sistema SOS
LexA y ecA tienen una relacin antagonista reciproca
CIRCUITO REGULADOR GENES DIANA
1
l l
Gen recA reprimido Gen lexA Gen diana reprimido
INDUCCIN DE RecA
El RecA desencadena la
escisin de LexA
1 1
1 1
RecA activado
Gen recA inducido Gen fexA
Gen diana expresado
FIGURA 20.22 La protena LexA reprime muchos genes,
incluso las
funciones de reparacin, recA y lexA. La activacin de RecA lleva a la
escisin proteoltica de LexA e induce a todos estos genes.
sbito en la actividad de RecA. Una diversidad de
episodios lesivos puede inducir la respuesta SOS; por
ello, el trabajo actual se centra en la idea de que la
RecA se activa por la presencia de algn producto
intermedio comn en el metabolismo del DNA.
Bs probable que la seal inductora consista en
una pequea molcula liberada del DNA o alguna
estructura formada en el DNA mismo. In vitro, la
activacin del RecA requiere la presencia de DNA
de cadena nica y ATP. De este modo, la seal de
activacin podra ser la presencia de una regin
de cadena nica en un sitio de dao. Cualquiera que
sea la forma que adopte la seal, su interaccin con
RecA es rpida: la respuesta SOS ocurre en unos
cuantos minutos despus de iniciar el tratamiento
lesivo.
La activacin de RecA causa la escisin pro-
teoltica del producto del gen lexA. La LexA es una
protena pequea (22 kD) relativamente estable en
clulas no tratadas, donde acta como represora
en muchos operones. La reaccin de escisin es in-
usitada; la LexA tiene una actividad latente de pro-
teasa activada por RecA. Cuando se activa la RecA,
hace que LexA realice una escisin autocataltica;
esto desactiva la funcin del represor LexA e induce
de manera coordinada a todos los operones a los
que se uni. La va se ilustra en la FIGURA 20.22.
Los genes diana para la represin por LexA in-
cluyen muchas funciones de reparacin. Algunos
de estos genes SOS son activos en clulas tratadas;
otros son activos en clulas no tratadas, pero el gra-
do de expresin aumenta con la escisin de Le
En el caso de uvrB, que es componente del siste
de reparacin por escisin, el gen tiene dos pre-
tores; uno acta de manera independiente de Le .
el otro est sujeto a su control. As, despus de i
escisin de LexA, el gen se puede expresar desc :
segundo promotor y tambin desde el primero
La protena LexA reprime sus genes diana
unirse a un segmento de 20 bp del DNA lian:; ;
caja SOS, que incluye una secuencia de conser
con ocho posiciones absolutamente conservadas.
Como ocurre con otros operadores, las cajas 5 '
se superponen con los promotores respectivos. E
el locus lexA, sujeto de la represin autgena, ::
dos cajas SOS cercanas.
En el circuito SOS RecA y LexA son dianas
mutuas: la RecA desencadena la escisin de L
que reprime a recA y a s misma. La respuesta S
por tanto, causa amplificacin de la protena Re J
as como del represor LexA. Los resultados no ;
tan contradictorios como podran parecerlo al prin-
cipio.
El aumento de la expresin de la protena R
es necesario (al parecer) para su participacin di:;
ta en las vas de reparacin por recombinacin. C
la induccin, la concentracin de RecA aumer
respecto de su cifra basal de ~1200 molculas/c
hasta por 50 tantos. Su alta concentracin en cz..
las inducidas indica que hay suficiente RecA ;
asegurar que se fragmente toda la protena Le
lo que debera impedir que LexA restableciera
represin de los genes diana.
No obstante, la principal importancia de e.-
circuito para la clula yace en su capacidad de :
tornar con rapidez a la normalidad. Cuando se re:
la seal de induccin, la protena RecA pierde .
capacidad de desestabilizar a LexA. En este morr.; -
to, el gen lexA se est expresando en un grado a
'
:
en ausencia de RecA activada, la protena LexA .
acumula con rapidez en la forma no fragmen:i.
y desactiva los genes SOS, lo que explica porque
respuesta SOS se revierte con libertad.
La RecA tambin desencadena la escisin de
otras dianas celulares, a veces con consecuenc;
ms directas. La protena UmuD se escinde cu:
do se activa la RecA; el episodio de escisin ac:
UmuD y el sistema de reparacin susceptible .
errores. El modelo actual para la reaccin es que
complejo UmuD
2
UmuC se una al filamento Red
cerca de un sitio de dao, RecA active el comp!:
mediante la escisin de UmuD para generar Umu [
y el complejo, entonces, sintetice un segmento de
DNA para sustituir el material daado.
La activacin de RecA tambin causa esci:
de algunas otras protenas represoras, como las
514
CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
.
arios profagos. Entre ellas est el represor A, (con
el que se descubri la actividad de proteasa), lo que
explica porqu se induce A, por irradiacin ultra-
violeta; se fragmenta el represor lisognico, lo que
'
.ibera el fago para ingresar al ciclo ltico.
Esta reaccin no es una respuesta celular SOS,
sino que ms bien significa que el profago reconoce
que la clula est en problemas. Entonces, la super-
vivencia se asegura de la mejor forma mediante el
ingreso al ciclo ltico para generar una progenie de
:
agos. En este sentido, la induccin de profagos se
apoya en el sistema celular al responder al mismo
indicador (activacin de RecA).
Las dos actividades de RecA son relativamente
independientes. La mutacin recA441 permite que
ocurra la respuesta SOS sin tratamiento de induc-
dn, tal vez porque RecA se mantiene de manera
espontnea en el estado activado. Otras mutaciones
suprimen la posibilidad de activacin. Ningn tipo
de mutacin afecta la capacidad de RecA de manejar
el DNA. El tipo inverso de mutacin, que desactiva
la funcin de recombinacin pero deja intacta la ca-
pacidad de inducir la respuesta SOS, permitira des-
enmaraar los efectos directo e indirecto de RecA
en las vas de reparacin.
222 Las clulas eucanticas
tienen sistemas de reparacin
conservados
Ccnceptos principales
.
Las mutaciones RAD de levaduras, identificadas por
fenotipos sensibles a la radiacin, ocurren en genes
que codifican sistemas de reparacin.
.
La xerodermia pigmentosa (XP) es una enfermedad
humana causada por mutaciones en cualquiera de
varios genes de reparacin.
.
Un complejo de protenas, que incluye productos de XP
y el factor de transcripcin TF H, provee en los seres
humanos un mecanismo de reparacin por escisin.
.
Los genes con actividad transcripcional se reparan de
manera preferente.
Los tipos de funciones de reparacin reconocidas
en E. coli los comparten una amplia variedad de or-
ganismos. Los sistemas eucariticos mejor descritos
.
ion las levaduras, donde Rad51 es la contraparte
ie RecA. En las levaduras, la principal funcin de
la protena de transferencia de cadenas es la recom-
Tinacin homloga.
Muchos de los sistemas de re-
paracin que se observan en las levaduras tienen
contrapartes directas en las clulas eucariticas su-
periores, y en varios casos estos sistemas tienen que
ver con enfermedades humanas.
Los genes RAD intervienen en las funciones de
reparacin; se han descrito en trminos genticos
en las levaduras por su sensibilidad a la radiacin.
Hay tres grupos generales de genes de reparacin
en la levadura S. cerevisiae, identificados por el grupo
RAI)3 (involucrado en la reparacin por escisin), el
grupo RAD6 (indispensable para la reparacin pos-
terior a la replicacin) y el RAD52 (encargado de
mecanismos similares a la recombinacin). El grupo
RAD52 se divide en dos subgrupos por una dife-
rencia de fenotipos mutantes. Un subgrupo afecta
la recombinacin homloga, como se observa por
la disminucin de la recombinacin mittica en
RAD50, RAD51, RAD54, RAD55 y RAD57. Estas pro-
tenas Rad forman un complejo multiprotenico en
una rotura de la doble cadena. Despus de que una
exonucleasa ha actuado en los extremos libres para
generar colas de una sola cadena, la Rad51 inicia el
proceso al unirse al DNA de cadena nica para for-
mar un filamento de nucleoprotenas. Las protenas
Rad52, Rad55 y Rad54 se unen entonces de manera
secuencial al filamento. Por el contrario, los ndices
de recombinacin se incrementan en las mutantes
RAD59, MRE11 y XRS2; este subgrupo no tiene de-
ficiencia en la recombinacin homloga, pero s en
las reacciones de unin al DNA no homlogas.
Una superfamilia de polimerasas de DNA que
interviene en la sntesis de DNA para sustituir el
material en los sitios daados se identifica por los
genes dinB y umuCD que codifican las polimerasas
IV y V de DNA en E. coli, el gen RAD30 que codifica
una polimerasa r\ de DNA en S. cerevisiae y el gen
XPV, que codifica el homlogo humano. Algunas
veces se les llama polimerasas de DNA translesin.
Una diferencia entre las enzimas bacteriana y euca-
ritica es que la ltima no es susceptible de error en
los dmeros de timinas; introducen con exactitud un
par A-A en oposicin a un dmero T-T. Sin embargo,
cuando se replican en otros sitios de dao, son ms
susceptibles de introducir errores.
Una caracterstica interesante de la reparacin
que se ha descrito mejor en las levaduras es su co-
nexin con la transcripcin. Los genes con actividad
transcripcional se reparan de manera preferente. La
consecuencia es que la cadena transcrita se repara
de manera preferente (lo que elimina el impedi-
mento de la transcripcin). La causa parece ser una
conexin mecnica entre el aparato de reparacin
y la polimerasa de RNA. La protena Rad3, que es
una helicasa indispensable para el paso de la esci-
sin, es un componente de un factor de transcrip-
cin vinculado con la polimerasa de RNA (vase la
seccin 24.12, Una conexin entre transcripcin y
reparacin).
Las clulas de los mamferos muestran hetero-
geneidad en la cantidad de DNA resintetizado en
20.11 Las clulas eucariticas tienen sistemas de reparacin conservados
515
Un sistema de reparacin se vincula con Tf H
El DNA est daado
TFH
XPD XPB
hecasas endonucleasas
XPG XPF ERCC1
TF||H abre la doble hlice
\/A/A// %K/A//
XPG XPF ERCC1
XPG escinde el extremo 3' de la lesin
XPF ERGC1
XPF/EHCC1 escinde el sitio 5' de la lesin
fAJAJ/ Km//
Una helicasa desenrolla el DNA en un sitio da-
ado, las endonucleasas cortan a ambos lados de la lesin y se
sintetiza un nuevo DNA para sustituir el segmento extirpado.
meros de timinas. En la FIGURA 20.23 se muestra
participacin en la va de reparacin. El compl
se une al DNA en un sitio de dao, tal vez por
mecanismo que implica la accin colaboradora
varios de sus componentes. Las cadenas de DW
desenrollan entonces casi 20 bp alrededor dei s
daado. Esta accin la emprende la actividad de i
helicasa del factor de transcripcin TF
jj
H
,
en s n
mo un gran complejo que incluye los productor
varios genes XP y que participa en la reparacin
DNA daado que encuentra la polimerasa de R
durante la transcripcin. Despus, las endonucl
sas codificadas por genes XP hacen cortes a c
lado de la lesin. El segmento de una sola cad(
que incluye las bases daadas puede, entonces, I
tituirse mediante la sntesis de una de reposicid
En casos donde la replicacin se encuentra
un dmero de timinas que no ha sido retirado,
requiere la actividad de polimerasa \\ de DNA I
avanzar y dejar atrs el dmero, el cual es codific
por XPV. Los cnceres de piel que ocurren er,
mulantes de XPV se deben, al parecer, a la prc
de la polimerasa de DNA.
Un sistema comn repara
Las roturas de doble cadena
Conceptos principales
.
La va NHEJ puede Ligar extremos romos de DN
dplex.
.
Las mutaciones en la va NHEJ causan enfermedades
los seres humanos.
cada lesin despus de un dao. No obstante, los
parches son siempre relativamente cortos, de menos
de 10 bases.
Ciertas enfermedades hereditarias humanas
ofrecen indicios de la existencia y la importancia
de los sistemas de reparacin en los mamferos. La
que mejor se ha investigado es la xerodermia pig-
mentosa (XP), un trastorno recesivo que causa hi-
persensibilidad a la luz del sol, y en particular a su
fraccin ultravioleta. La deficiencia causa trastornos
cutneos (y a veces defectos ms graves).
La enfermedad se debe a una deficiencia en la
reparacin por escisin. Los fibroblastos de los pa-
cientes con XP no pueden cortar dmeros de pirim-
dinas y otros productos voluminosos. Las mutacio-
nes se encuentran en ocho genes conocidos como
XP-A a XP-G. Tienen homlogos en los genes RAB
de las levaduras, lo que muestra que esta va se usa
en forma generalizada en las eucariotas.
Un complejo protenico que incluye productos
de varios genes XP se encarga de la escisin de d-
Ocurren roturas de cadena doble en las ck
bajo diversas circunstancias. Inician el proceso
recombinacin homloga y son intermediarias
la recombinacin de los genes de inmunoglobuli
(vase la seccin 23.10, Las protenas RAG catali.
la rotura y reunin). Tambin se presentan co
consecuencia del dao al DNA; por ejemplo,
irradiacin. El principal mecanismo para repu-
estas roturas se denomina unin flfe extremos
homlogos (NHEJ) y consiste en juntar y ligar
extremos romos.
Los pasos comprendidos en NHEJ se resur
en la 24. El mismo complejo enzima
realiza el proceso en NHEJ y la recombinacin
munitaria. La primera etapa es el reconocimienlt
los extremos rotos por un heterodmero constitu
por las protenas Ku70 y Ku80, que forman un l
tidor que mantiene juntos los extremos y pern
que otras enzimas acten sobre ellos. Un com
neme clave es la cinasa de protenas dependienn
DNA (DNA-PKcs), que es activada por el DNA p
CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
-
iorilar dianas protenicas. Una de estas dianas es
protena Artemis, que en su forma activada tiene
. nciones de exonucleasa y endonucleasa, y puede
rtar extremos colgantes y escindir las horquillas
eneradas por recombinacin de genes de inmuno-
obulinas. No se conoce la actividad de la polimera-
i de DNA que llene cualquier protrusin restante
r una sola cadena. La unin real de los extremos de
:
doble cadena la realiza la ligasa IV del DNA, que
- .Ta junto con la protena XRCC4. Las mutaciones
::
cualquiera de estos componentes pueden hacer
.as clulas eucariticas ms sensibles a la radia-
in. Algunos de los genes de estas protenas tienen
vatacin en pacientes con enfermedades debidas a
:
cficiencias en la reparacin del DNA.
El heterodmero Ku es el sensor que detecta el
iao del DNA mediante la unin a los extremos
ros. La estructura cristalina en la FIGURA 20.25
uestra que se une slo a los extremos. El cuerpo
z la protena se extiende casi dos giros sobre una
cara del DNA (inferior), pero un puente estrecho
ifAre las subunidades localizado en el centro de la
tructura rodea por completo al DNA, lo que sig-
:
ka que el heterodmero necesita deslizarse hacia
n extremo libre.
El Ku puede unir extremos rotos al enlazar dos
alenlas de DNA. La capacidad de los heterod-
eros de Ku de vincularse entre s, sugiere que la
.accin tal vez ocurra como se ilustra en la FIGU-
IA 20.26. Esto presagiara que la ligasa actuase por
-nin en la regin entre los puentes de heterod-
jros individuales. Al parecer, Ku debe cambiar su
;
:
ructura para ser liberado del DNA.
La deficiencia en la reparacin del DNA causa
;
rias enfermedades humanas. El rasgo comn es
:
.:
e una imposibilidad de reparar roturas de doble
cadena en el DNA lleva a la inestabilidad cromo-
smica. La inestabilidad se revela por aberraciones
I raiosmicas, que se vinculan con una mayor tasa
e mutaciones, lo que a su vez conduce a una mayor
sceptibilidad al cncer en los pacientes afectados.
La causa bsica puede ser la mutacin en vas que
:
ntrolan la reparacin del DNA o en genes que co-
- ican enzimas de los complejos de reparacin. Los
motipos pueden ser muy similares, como en el caso
r la telangiectasia con ataxia (AT), que se debe a
un fracaso de la va de punto de revisin del ciclo
Elular, y el sndrome de rotura de Nijmegan (NBS),
e es causado por una mutacin de una enzima de
-
eparacin. Una de las lecciones que se han aprendi-
do de la descripcin de las vas de reparacin es que
;
conservan en mamferos, levaduras y bacterias.
La enfermedad recesiva humana llamada sn-
.
come de Bloom es producto de mutaciones en un
jen de helicasa (llamado BLM) que es homlogo
;
r recQ de E. coli. La mutacin causa una mayor fre-
La NHEJ requiere varias reacciones
5
'
N N N N N
3'NNNNNNNNN
N N N N N N 3'
N N N N 5'
Reconocimiento D(mero Ku
1
del extremo T
5
'
N N N N
3' N N N N N H N N N
-
' M N N N 3'
N N N N 5'
Artemis
Recorte
+ DNA.pK j,
5
'
N N N hU'
3
'
NNNNN.
N N 3'
N N N N 5'
, , . Enzima
Llenad0 desconocida \
5
'
NNNNNN
3
'
N N N N N N N
_
N N N N 3'
. N N N N 5'
Ligasa IV de 1
Ligacin DNa
+ XRCC4|
5
'
N NNNNNNNNNN3'
3
'
NNNNNNN NNNN5'
FIGURA 20.2'! Para La unin de extremos no homlogos es
indispensable el reconocimiento de los extremos rotos, el re-
corte de los extremos colgantes, el llenado, o ambos, seguidos
de la Ligacin.
Ku rodea el DNA segn se observa en el corte transversal
Ku80 u70
r
Ku se extiende dos giros helicoidales a lo largo del DNA
El heterodmero Ku70-K80 se une a lo largo de
dos giros de la doble hlice del DNA y la rodea en el centro del
sitio de unin. Fotografa por cortesa de Jonathan Goldberg,
Memorial Sloan-Kettering Cncer Center.
cuencia de roturas cromosmicas e intercambios de
cromtidas hermanas. La BLM se vincula con otras
protenas de reparacin como parte de un complejo
grande. Una de las protenas con las que interacta
20.12. Un sistema comn repara las roturas de doble cadena 517
dos heferodmeros
Accesible a -
otras protenas
Si dos heterodmeros de Ku se unen al DNA,
la distancia entre los dos puentes que rodean el DNA es de
-
12 bp.
es hMLHl, que repara apareamientos errneos y
es homologa humana de la mutL bacteriana. Los
homlogos de levaduras de estas dos protenas, Sgsl
y MLH1 tambin se asocian, lo que identifica a sus
genes como parte de una va de reparacin bien
conservada.
El sndrome de rotura de Nijmegan es producto
de mutaciones en un gen que codifica una protena
(llamada de manera variable Nibrina, p95, o NBS1)
que es un componente del complejo de reparacin
Mrell/Rad50. Su participacin en la reparacin de
roturas de la doble cadena queda de manifiesto por
la formacin de focos que contienen el grupo de
protenas cuando se irradian clulas humanas con
agentes que inducen roturas de doble cadena. Des-
pus de la irradiacin, la cinasa ATMP (codificada
por el gen AT) fosforila a NBS1; esto activa el com-
plejo, que se localiza en sitios de DNA daado. Los
pasos siguientes comprenden el desencadenamiento
de un punto de revisin (un mecanismo que impide
que el ciclo celular avance hasta que se repare el
dao) y el reclutamiento de otras protenas que se
requieren para reparar el dao.
Resumen
Las bacterias contienen sistemas que mantienen la
integridad de sus secuencias del DNA ante daos
o errores de replicacin y que distinguen entre el
DNA y secuencias de una fuente extraa.
Los sistemas de reparacin pueden reconocer
bases mal apareadas, alteradas o faltantes en el
DNA, as como otras distorsiones estructurales de la
doble hlice. Los sistemas de reparacin por escisin
fragmentan el DNA cerca del sitio del dao, retiran
una cadena y sintetizan una nueva secuencia para
sustituir el material extirpado. El sistema Uvr cons-
tituye la principal va de reparacin por escisin en
E
. coli. El sistema dam participa en la correccin de
apareamientos errneos generados por la incorpo-
racin de bases incorrectas durante la replicacin
y acta al retirar de manera preferente la ba-.
la cadena de DNA que no est mediada en
cuencia diana dam. Los homlogos eucariticc
sistema MutSL de E. coli participan en la repar;:
de apareamientos errneos que provienen de". :
lizamiento de la replicacin; las mutaciones er. -
va son frecuentes en ciertos tipos de cncer.
Los sistemas de reparacin por recombina :
obtienen informacin a partir de un DNA dp
la utilizan para reparar una secuencia que he
daada en ambas cadenas. Las vas RecBC y ? :
actan ambas antes de RecA, cuya funcin de tm
ferencia de cadenas participa en toda recombina :
bacteriana. Un uso importante de la reparacin
recombinacin puede ser recuperarse de la circ_ :
tancia creada cuando se queda varada una horq.
de replicacin.
La otra capacidad de RecA es la de induc.-
respuesta SOS. La RecA es activada por el DNA :
ado en una forma desconocida. Desencadens
escisin de la protena represora LexA, que as li:;
la represin de muchos loci e induce la sntesis
enzimas de las vas de reparacin por escisin \ :
paracin por recombinacin. Los genes bajo cor.::
de LexA poseen una caja SOS operador. La Re
tambin activa de manera directa algunas forrr:
de reparacin. La escisin de represores de fag
lisognicos puede inducir a los fagos a entrar al ce
ltico.
Los sistemas de reparacin pueden conectara
con la transcripcin en procariotas y eucariotas. 1;
enfermedades humanas se deben a mutaciones e
los genes que codifican actividades de reparac:
que se asocian al factor de transcripcin TFnH. T..
nen homlogos en los genes RAD de las levadur;
lo que sugiere que este sistema de reparacin ty
muy generalizado.
La unin de extremos no homlogos (NHEJi :
una reaccin general para la reparacin de extrerr.
rotos del DNA (eucaritico). El heterodmero K
rene los extremos rotos de manera que pued;
ligarse. Varias enfermedades humanas sonproduc.
de mutaciones en enzimas de esta va.
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Un sistema comn repara las roturas de la doble
cadena
Articulo de revisin
D
'
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520
CAPTULO 20 Sistemas de reparacin
I
Transposones
ESQUEMA DEL CAPTULO
BD Introduccin
nma Las secuencias de insercin son mdulos de
transposicin sencillos
.
Una secuencia de insercin es un transposn que codifica
las enzimas necesarias para la transposicin, flanqueadas
por repeticiones terminales invertidas cortas.
.
El sitio diana donde se inserta el transposn se duplica
durante el proceso de insercin para formar dos
repeticiones en orientacin directa en los extremos del
transposn.
.
La longitud de la repeticin directa es de 5 a 9 bp y es
caracterstica para cualquier transposn particular
wutm Los transposones compuestos tienen mdulos IS
.
Los transposones pueden portar otros genes adems de los
que codifican la transposicin.
.
Los transposones compuestos tienen una regin central
flanqueada por un elemento IS en cada extremo.
Cada uno o ambos elementos IS de un transposn
compuesto pueden realizar la transposicin.
.
Un transposn compuesto puede actuar como unidad, pero
un elemento IS activo en cualquier extremo tambin puede
realizar la transposicin de manera independiente.
mtwm La transposicin ocurre por mecanismos
replicativos y no replicativos
.
Todos los transposones utilizan un mecanismo comn
donde se hacen hendiduras escalonadas en el DNA diana, el
transposn se une a los extremos prominentes y se llenan
las brechas.
.
El orden de los episodios y la naturaleza exacta de las
conexiones entre el transposn y el DNA diana determinan
si la transposicin es replicativa o no replicativa.
mmm Los transposones causan reestructuracin del DNA
.
La recombinacin homologa entre mltiples copias de un
transposn causa reestructuracin del DNA hospedador.
.
La recombinacin homloga entre las repeticiones de un
transposn puede llevar a la escisin precisa o imprecisa.
w Intermediarios comunes para la transposicin
.
La transposicin se inicia con la formacin de un complejo
de transferencia de cadenas donde el transposn se conecta
con el sitio diana a travs de una cadena en cada extremo.
.
La transposasa Mu forma el complejo por sinapsis de los
extremos del DNA de Mu, seguida de la formacin de hendi-
duras y luego una reaccin de transferencia de cadena.
.
Ocurre a continuacin transposicin replicativa si el
complejo se reproduce, y transposicin no replicativa si se
repara.
mmm La transposicin replicativa avanza a travs de un
cointegrado
.
La replicacin de un complejo de transferencia de cadenas
genera un cointegrado, que es una fusin de los replicones
donador y diana.
.
El cointegrado tiene dos copias del transposn que yacen
entre los replicones originales.
.
La recombinacin entre las copias del transposn regenera
los replicones originales, pero el receptor ha ganado una
copia del transposn.
.
La reaccin de recombinacin es catalizada por una
resolvasa codificada por el transposn.
mm:u La transposicin no replicativa avanza por rotura
y reunin
.
La transposicin no replicativa ocurre cuando se hace una
hendidura en una estructura entrecruzada en el par no roto
de las cadenas donadoras y se ligan las cadenas diana a
cada lado del transposn.
.
Dos vas para la transposicin no replicativa difieren de
acuerdo a que el primer par de cadenas del transposn se
una al sitio diana antes de que se corte el segundo par
(Tn5), o que las cuatro cadenas se corten antes de unirse a
la diana (TnlO).
mtmsm La transposicin de TnA requiere transposasa y
resolvasa
.
La transposicin replicativa de TnA requiere que una
transposasa forme la estructura cointegrada y una resolvasa
libere los dos replicones.
.
La accin de la resolvasa se asemeja a la proteina Int
X y pertenece a la familia general de reacciones de
recombinacin especficas de sitio similares a las de
topoisomerasa, que pasan por un intermediario donde la
proteina se une de manera covalente al DNA.
PillM La transposicin de TnlO tiene mltiples
controles
.
La inhibicin de copias mltiples reduce la tasa de
transposicin de cualquier copia de un transposn cuando
se introduce otras del mismo transposn en el genoma.
.
Mltiples mecanismos afectan la tasa de transposicin.
Umi Los elementos de control en el maz causan
roturas y reestructuraciones
.-
Se descubri la transposicin en el maz por los efectos de
las roturas cromosmicas generadas por la transposicin de
"
elementos de control
"
.
.
La rotura genera un cromosoma que tiene un centrmero y
un extremo roto, as como un fragmento acntrico.
Contina en la siguiente pgina
521
.
El fragmento acntrico se pierde durante [a mitosis;
lo que puede detectarse por La desaparicin de alelos
dominantes en un heterocigoto.
.
La fusin entre los extremos rotos del cromosoma
genera cromosomas dicntricos, que presentan ms
ciclos de rotura y fusin.
.
El ciclo fusin-rotura-puente se encarga de la
aparicin de la variegacin somtica.
Los elementos de control forman familias de
transposones
'
Cada familia de transposones en el maiz tiene
elementos de control, autnomos y no autnomos.
.
Los elementos de control autnomos codifican
protenas que les permiten realizar la transposicin.
.
Los elementos de control no autnomos tienen
mutaciones que eliminan su capacidad de catalizar
La transposicin, pero pueden realizarla cuando
un elemento autnomo proporciona las protenas
necesarias.
.
Los elementos de control autnomos tienen cambios
de fase cuando sus propiedades se alteran como
resultado de cambios en el estado de metilacin.
Los elementos Spm influyen en la expresin
gnica
Los elementos Spm afectan la expresin gnica en sus
sitios de insercin, cuando la protena TnpA se une a
sus sitios diana en los extremos del transposn.
.
Los elementos Spm se desactivan por metilacin.
BBD Intervencin de los elementos susceptibles de
transposicin en la disgenesia hbrida
*
Los elementos P son transposones que portan las
cepas P de Drosophila melanogaster, no as las
cepas M.
.
Cuando un macho P se cruza con una hembra M, se
activa la transposicin.
.
La insercin de elementos P en sitios nuevos en esas
cruzas desactiva muchos genes y las hace infecundas.
BHEI Los elementos P se activan en la lnea
germinal
.
Los elementos P se activan en la lnea germinal de
cruzas de macho P con hembras M, porque un episod':
de corte y empalme especfico de tejido retira un
intrn que genera la secuencia de codificacin de la
transposasa.
'
El elemento P tambin produce un represor de la
transposicin, que se hereda por va materna en el
citoplasma.
*
La presencia del represor explica porqu las cruzas de
machos M con hembras P se mantienen fecundas.
BSQ Resumen
Las reestructuraciones del DNA
tienen muchas causas
TTWl Introduccin
Los genomas evolucionan por la adquisicin de
nuevas secuencias y la reestructuracin de las exis-
tentes.
La introduccin sbita de nuevas secuencias
se debe a la capacidad de los vectores de llevar in-
formacin entre los genomas. Los elementos ex-
tracromosmicos llevan la informacin en sentido
horizontal al mediar la transferencia (por lo general
bastante corta) de material gentico. En las bacterias,
los plsmidos se mueven por conjugacin (vase la
seccin 16.10, La conjugacin transfiere DNA de
cadena nica), en tanto los fagos se diseminan por
infeccin (vase el Captulo 14, Estrategias de los
fagos). Plsmidos y fagos en ocasiones transfieren
genes hospedadores junto con su propio replicn.
La transferencia directa de DNA tiene lugar entre
algunas bacterias mediante transformacin (vase
la seccin 1.2, El DNA es el material gentico de
las bacterias). En eucariotas, algunos virus, sobre
todo retrovirus, pueden transferir informacin ge-
ntica durante un ciclo infeccioso (vase la seccin
22.6, Los retrovirus pueden transducir secuencias
celulares).
Las reestructuraciones son patrocinadas por
procesos internos del genoma. Dos de las principa-
les causas se resumen en la FIGURA 21.1.
El transposn genera una nueva copia en un
sitio aleatorio
i
Ocurre entrecruzamiento no equivalente
entre secuencias relacionadas
x
FIGURA 21.1 Una causa importante del cambio de secuendr
dentro del genoma es el desplazamiento de un transposn a UT'
nuevo sitio. En ocasiones esto tiene consecuencias directas e-
la expresin gnica. EL entrecruzamiento no equivalente entH
secuencias relacionadas causa reestructuraciones. Las copias C5
transposones pueden ofrecer dianas para tales sucesos.
522 CAPTULO 21 Transposones
La recombinacin no equivalente es producto
iel apareamiento errneo por los sistemas celulares
?ara la recombinacin homologa. La recombinacin
no recproca da como resultado la duplicacin o re-
estructuracin de loci (vase la seccin 6.7, El en-
:
recruzamiento no equivalente reestructura grupos
ie genes). La duplicacin de las secuencias dentro
de un genoma constituye una fuente importante de
nuevas secuencias. Una copia de la secuencia puede
retener su funcin original, en tanto la otra evolu-
ciona hacia una nueva funcin. Es ms, se encuen-
dan diferencias significativas entre genomas indivi-
duales en el mbito molecular debido a variaciones
polimrficas causadas por la recombinacin. Como
se apreci en la seccin 6.14, Los minisatlites son
tiles para el mapeo gentico, esa recombinacin
entre minisatlites se ajusta en su longitud, de ma-
nera que cada genoma individual sea diferente.
Otra causa importante de variacin la consti-
.uyen los elementos susceptibles de transposi-
cin o transposones: se trata de secuencias bien
definidas en el genoma, que son mviles y pueden
:
ransportarse a s mismas a otras localizaciones den-
tro del genoma. La marca distintiva de un transpo-
sn es que no utiliza una forma independiente del
elemento (como DNA de fago o plsmido), sino que
se traslada de manera directa de un sitio del genoma
a otro. A diferencia de casi todos los dems procesos
comprendidos en la reestructuracin del genoma, la
transposicin no depende de alguna relacin entre
las secuencias de los sitios donador y receptor. Los
transposones slo pueden moverse a s mismos, y
a veces a otras secuencias, hacia sitios nuevos en
otra parte dentro del mismo genoma; son, por tanto,
la contraparte interna de los vectores, que puede
transportar secuencias de un genoma a otro. Es po-
sible que constituyen la principal fuente de muta-
ciones en el genoma.
Los transposones pertenecen a dos clases ge-
nerales. El grupo de transposones revisado en este
captulo corresponde a secuencias de DNA que co-
difican protenas que pueden manipular el DNA, de
inanera que se propaguen a s mismas dentro del
genoma. Los transposones revisados en el Captulo
22, Retrovirus y retrotransposones,
tienen relacin
con los retrovirus y la fuente de su movilidad es la
capacidad de hacer copias del DNA de sus productos
de transcripcin del RNA; las copias de DNA se inte-
gran entonces a nuevos sitios en el genoma.
Los transposones que se movilizan por medio
del DNA se encuentran en procariotas y eucariotas.
Cada transposn bacteriano porta genes que co-
difican las actividades enzimticas indispensables
para su propia transposicin, si bien en ocasiones
tambin requieren funciones auxiliares del genoma
donde reside (como la polimerasa o la girasa del
DNA). Hay sistemas semejantes en las eucariotas, si
bien sus funciones enzimticas no estn tan bien de-
finidas. Un genoma puede contener elementos fun-
cionales y no funcionales (defectuosos). A menudo,
la mayor parte de los elementos de un genoma eu-
caritico tiene defectos y ha perdido la capacidad de
transposicin independiente, aun cuando todava
las enzimas producidas por transposones funcio-
nales pueden reconocerlos como sustratos para la
transposicin. Un genoma eucaritico contiene un
nmero y una variedad grande de transposones. El
genoma de la mosca tiene >50 tipos de transposo-
nes, con un total de varios cientos de elementos
individuales,
Los elementos susceptibles de transposicin
pueden facilitar las reestructuraciones del genoma
de manera directa o indirecta:
.
El episodio mismo de la transposicin puede
causar deleciones o inversiones, o conducir
al movimiento de una secuencia de hospe-
dador hacia una nueva localizacin.
.
Los transposones sirven como sustratos
para los sistemas de recombinacin celular
cuando actan como
"
regiones porttiles de
homologa"; dos copias de un transposn en
diferentes localizaciones (incluso en cromo-
somas distintos) pueden proporcionar sitios
para la recombinacin recproca. Tales in-
tercambios ocasionan deleciones, insercio-
nes, inversiones o translocaciones.
Las actividades intermitentes de un transposn
parecen ofrecer una diana algo nebulosa para la se-
leccin natural. Esa preocupacin ha dado lugar a
indicios de que los elementos susceptibles de trans-
posicin (al menos algunos) no confieren ventaja o
desventaja al fenotipo, pero quiz constituyen un
"
DNA egosta", aquel interesado slo en su propia
propagacin. Adems, cuando se considera la trans-
posicin un episodio diferente del de los otros siste-
mas de recombinacin celular, se acepta de manera
tcita la opinin de que el transposn es una enti-
dad independiente que reside en el genoma.
Tal relacin del transposn con el genoma se
asemejara a la de un parsito con su hospedador. Al
parecer, la propagacin de un elemento por trans-
posicin se equilibra con el dao que hace si un
episodio de transposicin desactiva un gen indis-
pensable o si el nmero de transposones se con-
vierte en una carga para los sistemas celulares. No
obstante, se debe recordar que cualquier suceso de
transposicin que confiere una ventaja selectiva,
por ejemplo, una reestructuracin gentica, llevar
a la supervivencia preferente del genoma que porta
el transposn activo.
21.1 Introduccin 523
Las secuencias de insercin
son mdulos de transposicin
sencillos
Conceptos principales
Una secuencia de insercin es un transposn que
codifica las enzimas necesarias para la transposicin,
flanqueadas por repeticiones terminales invertidas
cortas.
El sitio diana donde se inserta el transposn se duplica
durante el proceso de insercin para formar dos
repeticiones en orientacin directa en los extremos del
transposn.
La longitud de la repeticin directa es de 5 a 9 bp y es
caracteristica para cualquier transposn particular.
Los elementos susceptibles de transposicin se iden-
tificaron por primera vez en el mbito molecular en
forma de inserciones espontneas en operones bac-
terianos. Ese tipo de insercin impide la transcrip-
cin, traduccin o ambas, del gen donde se inserta.
Se han descrito hasta ahora muchos tipos diferentes
de elementos susceptibles de transposicin.
Los transposones tienen repeticiones invertidas
y generan repeticiones diana
123456789 987654321
/
* 123456789 987654321
Gen de transposasa
ATGCA
TACGT
DNA del hospedador Sitio diana
1
DNA del hospedador
ATGCA123456789 987654321 ATGCA
TACGTi 23456789 987654321 TACGT
Repeticin Repeticin Repeticin
diana invertida invertida diana
Repeticin Repeticin Longitud
Seleccin
Transposon
diana (bp) invertida (bp) global (bp)
de diana
IS1 9 23 768 aleatoria
IS2 5 41 1327
puntos calientes
IS4 11-13 18 1428
AAAN201 I I
IS5 4 16 1195
puntos calientes
IS10R 9 22 1329 NGCTNAGCN
IS50R 9 9 1531 puntos calientes
IS903 9 18 1057 aleatoria
21.2 Los transposones tienen repeticiones terminales inver-
tidas y generan repeticiones directas del DNA de los flancos en el sitio
diana. En este ejemplo, la diana es una secuencia de 5 bp. Los extremos
del transposn constan de repeticiones de 9 bp invertidas donde los
nmeros uno a nueve indican una secuencia de pares de bases.
Los transposones ms sencillos se llaman s:
cuencias de insercin (lo que refleja la forma
que se detectan). Cada tipo recibe el prefijo IS seg
do de un nmero que lo identifica. (Las clases or _
nales se enumeraron de IS1 a IS4; las clases pc
riores tienen nmeros que reflejan los anteceden-;
del aislamiento, pero que no corresponden a la c:
total de elementos hasta entonces aislados.)
Los elementos IS son constituyentes norr-
ias de los cromosomas bacterianos y plsmidos. E
probable que una cepa estndar de E. coli conten,
varias copias (menos de 10) de cualquiera de
elementos IS ms comunes. Para describir una :
sercin en un sitio particular se utiliza el signo
de manera que ?t::ISl describe la insercin de
elemento IS1 en el fago X.
Los elementos IS son unidades autnomas, c;.
una de las cuales codifica slo las protenas im-
pensables para patrocinar su propia transposicii r
Cada elemento IS tiene diferente secuencia, pe
comparten algunas caractersticas en su organirj
cin. La estructura de un transposn genrico am i
y despus de la insercin en un sitio diana se ilus::
en la FIGURA 21.2, que tambin resume los deta :
de algunos elementos IS comunes.
Un elemento IS termina en repeticiones ta
minales invertidas cortas; por lo general, las dos
copias de la repeticin tienen una relacin estre
ms que ser idnticas. Como se ilustra en la figura.
la presencia de repeticiones terminales invert : -
indica que se encuentra la misma secuencia ava i
zando hacia el elemento desde el DNA del flanc.
ambos lados.
Cuando un elemento IS realiza transposicin.
se duplica una secuencia del DNA hospedador .
el sitio de insercin. La naturaleza de la duplic:
cin queda de manifiesto cuando se compara .
secuencia del sitio diana antes y despus de qn-
ha ocurrido una insercin. La Figura 21.2 mus.:
que en el sitio de insercin el DNA de IS siemprt
est flanqueado por repeticiones directas mu\
cortas. (En este contexto,
"
directo" indica que \:
dos copias de una secuencia se repiten en la misir. -
orientacin, no que sean cercanas.) No obstante, en
el gen original (antes de la insercin), el sitio diar.
tiene la secuencia de slo una de esas repeticiones.
En la figura, el sitio diana consta de la secuenc;
tacgt
Despus de la transposicin hay una cof -
de esta secuencia a cada lado del transposn.
La secuencia de la repeticin directa vara en:::
episodios individuales de transposicin realizad
por un transposn, pero la longitud es constar:
para cualquier elemento IS particular (reflejo d.
mecanismo de transposicin). La longitud ms f-n
cuente es de 9 bp para las repeticiones directas.
524 CAPTULO 21 Transposones
Por lo tanto, un elemento IS muestra una estruc-
tura caracterstica donde sus extremos se identifican
por las repeticiones terminales invertidas, mientras
que los extremos cercanos del DNA del hospeda-
dor en los flancos se identifican por las repeticiones
directas cortas. Cuando se observa ese tipo de or-
ganizacin en una secuencia de DNA, se considera
como diagnstico de un transposn e indica que la
secuencia se origin en un suceso de transposicin.
Casi todos los elementos 1S se insertan en una
diversidad de sitios en el interior del DNA del hospe-
dador; algunos, no obstante, muestran preferencia
(grados variables) por puntos calientes particulares.
Las repeticiones invertidas definen los extremos
de un transposn. El reconocimiento de los extre-
mos es comn a los sucesos de transposicin patro-
cinados por todos los tipos de transposn. Las mu-
taciones que actan en configuracin cis e impiden
la transposicin se localizan en los extremos, que las
protenas encargadas de la transposicin reconocen.
Las protenas se llaman transposasas.
Todos los elementos IS, excepto IS1, contienen
una sola regin de codificacin larga, que se inicia
apenas en el interior de la repeticin invertida en un
extremo y termina apenas antes o dentro de la repe-
ticin invertida en el otro extremo, el cual codifica
la transposasa. La IS1 tiene una organizacin ms
compleja, con dos marcos de lectura independien-
tes; la transposasa es producto de la estructuracin
de un marco durante la traduccin para permitir el
uso de ambas estructuras.
La frecuencia de la transposicin vara entre los
diversos elementos. El ndice global de transposicin
es de ~ICr3a casi lO por elemento por generacin.
Las inserciones de dianas individuales tienen lugar
en un grado semejante al de la tasa de mutacin
espontnea, por lo general -lO-5 a lO-7 por genera-
cin. La reversin (por escisin precisa del elemento
IS) suele ser infrecuente, con una variacin de 10
a 10"10 por generacin, que es ~103 veces menos
frecuente que la insercin.
HKI Los transposones compuestos
tienen mduLos IS
Conceptos principales
Los transposones pueden portar otros genes adems de
Los que codifican la transposicin.
Los transposones compuestos tienen una regin central
flanqueada por un elemento IS en cada extremo.
Cada uno o ambos elementos IS de un transposn
compuesto pueden realizar la transposicin.
Un transposn compuesto puede actuar como unidad,
pero un elemento IS activo en cualquier extremo
tambin puede realizar la transposicin de manera
independiente.
Algunos transposones portan marcadores de resis-
tencia farmacolgica (u otros) adems de sus funcio-
nes relativas a la transposicin. Esos transposones se
denominan Tn seguido de un nmero. Una clase de
los transposones ms grandes se denomina de ele-
mentos compuestos, porque una regin central
que porta el marcador farmacolgico es flanqueada
por
"
brazos" que constan de elementos IS.
Los brazos pueden tener la misma orientacin
(lo ms frecuente) o invertida. As, un transposn
compuesto con brazos que corresponden a repeti-
ciones directas tiene la estructura
ArmL
Regin central
ArmR
Si los brazos tienen repeticiones invertidas, la
estructura es
ArmL
Regin central
ArmR
Las flechas indican la orientacin de los brazos,
que se identifican como L y R de acuerdo con una
orientacin (arbitraria) del mapa gentico del trans-
posn, de izquierda a derecha. La estructura de un
transposn compuesto tiene dos elementos IS
Los mdulos IS se repiten
r
ISR = derecho
ISL = izquierdo
Marcadoras del liansposn
El mdulo IS tiene
repeticiones invertidas
El modulo IS tiene
repeticiones invertidas
Ejemplo
Tn9 ISf cam
R
Mdulos IS idnticos,
ambos funcionales
Los mdulos IS estn invertidos
P <H Uarcadoies de Iransposon p
Ejemplo
Extremo
izquierdo
Marcadores Extremo derecho
Tn903 IS903 kanH Ambos extremos
IS son funcionales
Tn10 IS10L
feR
IS10R
no funciona funcional
Tn5 IS50L
kan*
IS50R
no funcional func;ional
FIGURA 21. Un transposn compuesto tiene una regin
central que porta los marcadores (como el de resistencia a
frmacos) flanqueados por mdulos IS, que tienen repeticiones
terminales invertidas cortas. Si los mdulos mismos estn en
orientacin invertida, las repeticiones terminales cortas inver-
tidas en los extremos del transposn son idnticas.
21.3 Los transposones compuestos tienen mdulos IS
525
Los elementos IS pueden movilizar otras secuencias
Tn10
El transposn
se integra al
DNA circular
fe
IS10L IS10R
Re; ji'h ' 1 Rt ' 2
El transposn TnlO se desplaza otra vez
El nuevo transposn creado por movilizacin
de mdulos IS10 en orientacin alternativa
FIGURA 21.4 Dos mdulos IS10 crean un transposn com-
puesto que puede movilizar cualquier regin del DNA que yace
entre ellos. Cuando TnlO es parte de una molcula circular
pequea, las repeticiones IS10 pueden tener transposicin a
cada lado del crculo.
transposn compuesto se ilustra con mayor detalle
en la IGURA ,.3, donde tambin se resumen las
propiedades de algunos transposones compuestos
comunes.
Los brazos constan de mdulos IS y cada uno
tiene la terminacin habitual de la estructura de
repeticiones invertidas; como resultado, el trans-
posn compuesto tambin termina con las mismas
repeticiones invertidas cortas.
En algunos casos, los mdulos de un transposn
compuesto son idnticos, como Tn9 (repeticiones
directas delSl) oTn903 (repeticiones invertidas de
IS903). En otros casos, los mdulos tienen relacin
estrecha, pero no son idnticos. Por tanto, se pueden
distinguir los mdulos L y R en TnlO o en Tn5.
Un mdulo IS funcional puede hacer transpo-
sicin de s mismo o de todo el transposn. Cuando
los mdulos de un transposn compuesto son idn-
ticos, parece que cualquiera de ellos puede patroci-
nar el movimiento del transposn, como en el caso
de Tn9 o Tn903. Cuando los mdulos son distintos,
tal vez difieran en su capacidad funcional, de mane-
ra que la transposicin quiz dependa por completo
o de manera principal de uno de ios mdulos, como
en el caso de TnlO o Tn5.
Se asume que los transposones compuesto?
evolucionaron cuando dos mdulos en un principio
independientes se vincularon con la regin centraL
Tal situacin pudiese surgir cuando un elemento 1
se transpone a un sitio receptor cercano al sitio do-
nador. Dos mdulos idnticos pueden mantenerse
iguales o diferenciarse. La capacidad de un solo me -
dulo de realizar transposicin de todo el elemento
compuesto explica la falta de presin selectiva sobn;
ambos mdulos para mantenerse activos.
Qu se encarga de la transposicin de u:
transposn compuesto en lugar de slo el mdulo
individual? Esta pregunta es en especial problem-
tica cuando ambos mdulos son funcionales. En |
ejemplo de Tn9 donde los mdulos son elementos
IS1, parece que cada uno es activo por su propia
cuenta, as como en nombre del transposn com-
puesto. Por qu se conserva el transposn en
totalidad, en lugar de que cada secuencia de inser-
cin vea por s misma?
Dos elementos IS, de hecho, pueden hacer
transposicin de cualquier secuencia que resida en-
tre ellos, as como en ellos mismos. La FIGURA 21.4
muestra que si TnlO reside en un replicn circular,
se puede considerar que sus dos mdulos flanquean
al gen tetR del TnlO original o la secuencia en la or::
parte del crculo. As, en un episodio de transpoa-
cin puede participar el transposn original Tm
(marcado por el movimiento de tetR) o la creacin
de un nuevo transposn "volteado al revs" con la
regin central alternativa.
Ntese que los transposones original y "vdj
teado al revs" tienen mdulos invertidos, pero
evidente que estos mdulos pueden funcionar en
cualquier orientacin con respecto a la regin ce:
tral. La frecuencia de transposicin de los transpos: -
nes compuestos desciende con la distancia entre los
mdulos. Por lo tanto, la dependencia de la longiti; _
es un factor que determina los tamaos de los trans-
posones compuestos comunes.
Una fuerza importante que apoya la transp(
cin de transposones compuestos es la seleccin _
marcadores que realiza la regin central. Un n:
dulo IS10 est libre de trasladarse por s mismo |
se moviliza un orden de magnitud ms a men:
que TnlO. No obstante, TnlO se mantiene conjur
tado por la seleccin de tetR, de manera que ha
condiciones selectivas, la frecuencia relativa dt
transposicin del TnlO intacto aumenta mucho.
Los elementos IS codifican las actividades i
transposasa que se encargan de la creacin de un sitio
diana o el reconocimiento de los extremos del tra/
posn. Slo se necesitan los extremos para que _
transposn acte como sustrato en la transposici-
CAPTULO 21 Transposones
La transposicin ocurre
por mecanismos repLicativos
y no repLicativos
Las repeticiones directas se generan por insercin
Conceptos principales
Todos Los transposones utiLizan un mecanismo comn
donde se hacen hendiduras escalonadas en eL DNA
diana, eL transposn se une a Los extremos prominentes
y se llenan las brechas.
El orden de Los episodios y la naturaleza exacta de Las
conexiones entre el transposn y el DNA diana determi-
nan si La transposicin es replicativa o no replicativa.
En la FIGURA 21 se ilustra la insercin de un trans-
posn en un nuevo sitio. Consiste en hacer roturas
escalonadas en el DNA diana, uniendo el transposn
a los extremos de cadena nica prominentes y lle-
nando las brechas. La generacin y el llenado de los
extremos escalonados explican la aparicin de repe-
ticiones directas de DNA diana en el sitio de inser-
cin. Los escalones entre los cortes en las dos cadenas
determina la longitud de las repeticiones directas; de
este modo, la repeticin diana caracterstica de cada
transposn refleja la geometra de la enzima involu-
crada en el corte del DNA diana.
El uso de extremos escalonados es comn a
todos los medios de transposicin, pero se pueden
distinguir tres tipos diferentes de mecanismo por el
que se desplaza un transposn:
.
En la transposicin replicativa, el ele-
mento se duplica durante la reaccin, de
manera que la entidad de transposicin es
una copia del elemento original. En la GURA
21.6 se resumen los resultados de tal trans-
posicin. El transposn se copia como parte
de su movimiento. Una copia se mantiene
en el sitio original en tanto la otra se inser-
ta en un nuevo sitio. As, la transposicin
se acompaa de un aumento del nmero
de copias del transposn. La transposicin
replicativa comprende dos tipos de activi-
dad enzimtica: una transposasa que acta
sobre los extremos del transposn original
y una resolvasa que acta sobre las copias
duplicadas. Un grupo de transposones re-
lacionados con TnA se desplaza slo por
transposicin replicativa (vase la seccin
21.7, La transposicin replicativa avanza a
travs de un cointegrado).
.
En la transposicin no replicativa, el
elemento de transposicin se traslada como
una entidad fsica de manera directa de un
sitio a otro y se conserva. Las secuencias de
insercin y los transposones compuestos
Sitio diana
i.
iiiiiiiiiiiliimim
ATGCA
1
mu
ATGCA
TACGT
i
'
TACGT
TACGT
ATGCA
nnnn
imiiiiiiiimiiiirmiiri
\
1
Repeticiones diana
Hendiduras
escalonadas
hechas en el
sitio diana
El transposn
se une a
extremos de
cadena nica
Las brechas en
el sitio diana se
llenan y sellan
FIGURA 21.5 Las repeticiones directas de la diana del DNA
que fLanquean un transposn se generan con La introduccin
de cortes escalonados cuyos extremos prominentes se enlazan
al transposn.
El transposn se copia a un nuevo sitio
Donador
LUI-LUI
imiimmmi
Receptor
llllllllllll
mmi
El donador se
mantiene inalterado
IHiilTmiiimil
El receptor gana una
copia del transposn
FIGURA 21 La transposicin replicativa crea una copia del
transposn que se inserta en un sitio receptor. El sitio donador
se mantiene sin cambio, por Lo que tanto el donador como el
receptor tienen una copia del transposn.
TnlO y Tn5 utilizan el mecanismo que se
muestra en la GURA 21 y que comprende
la liberacin del transposn del DNA do-
nador flanqueador durante la transferen-
cia. Este tipo de mecanismo requiere slo
una transposasa. Otro mecanismo utiliza la
conexin de secuencias de DNA donadora
y diana, y comparte algunos pasos con la
transposicin replicativa (vase la seccin
21.6, Intermediarios comunes de la trans-
posicin) . Ambos mecanismos de la transpo-
sicin no replicativa hacen que el elemento
se inserte en el sitio diana y se pierda del
sitio donador. Qu pasa con la molcula
21.4 La transposicin ocurre por mecanismos repLicativos y no repLicativos 527
Donador
-
Receptor
1
1
miiiiiiniiiiiiiiiiiiii
El donador tiene una
rotura en el sitio del
transposn
El receptor gana una
copia del transposn
La transposicin no replicativa permite que un
transposn se desplace como una entidad fsica de un sitio do-
nador a uno receptor. Esto deja una rotura en el sitio donador,
que es letal, a menos que se pueda reparar.
El movimiento con
Donador
Receptor
imiiimmi
iitmmiimamim "iiiiii
miiiit
3 La transposicin conservadora implica desplaza-
miento directo sin prdida de enlaces nucleotdicos; comprese
con la integracin y escisin \.
donadora despus de una transposicin no
replicativa? Su supervivencia requiere que
los sistemas de reparacin del hospedador
reconozcan la rotura de la doble cadena y
la reparen.
La transposicin conservadora describe
otro tipo de episodio no replicativo donde
se escinde el elemento de un sitio donador
y se inserta en un sitio diana gracias a una
serie de sucesos donde se conservan todos
los enlacen nucleotdicos. En la
se resumen los resultados de un episodio de
conservacin. ste simula de manera exacta
el mecanismo de la integracin X abordado
en la seccin 19.16, La recombinacin espe-
cfica del sitio comprende rotura y reunin,
y las transposasas de tales elementos se re-
lacionan con la familia de la integrasa X. Los
elementos que usan este mecanismo son
grandes y pueden mediar la transferencia
no slo del elemento mismo, sino tambin
del DNA donador de una bacteria a otra.
Tales elementos se clasificaron en un prin-
cipio como transposones, pero pueden con-
siderarse de manera ms apropiada come
episomas.
Algunos transposones utilizan un solo tipo cu
va para la transposicin, en tanto otros pueder:
utilizar mltiples vas. Los elementos IS1 e IS90
emplean las vas no replicativa y replicativa, y h
sido bien descrita la capacidad del fago Mu de cam
biar a cualquier tipo de va desde una intermediar;
comn (vase la seccin 21.6, Intermediarios com;
nes de la transposicin).
Los mismos tipos bsicos de reaccin participa:
en todas las clases de episodios de transposicin. Le
extremos del transposn se desconectan del DN.-
donador por reacciones de escisin que genera;
extremos 3
'
-
OH. Los extremos expuestos se une:
despus al DNA diana por reacciones de transferen
cia, que comprenden la transesterificacin, done
el extremo 3
'
-
OH ataca de manera directa el DNV
diana. Estas reacciones tienen lugar dentro de un
complejo nucleoprotenico que contiene las enz;
mas indispensables y ambos extremos del transpe
sn. Los transposones difieren en cuanto a si se re
conoce el DNA diana antes o despus de la escisir.
del transposn mismo.
La seleccin del sitio diana la realiza en efec-
to la transposasa. En algunos casos, virtualmentr
se elige la diana en forma aleatoria. En otros, hj
especificidad por una secuencia de consenso o a
"
guna otra caracterstica en el DNA. La caracters
'
ca puede adoptar la forma de una estructura en I
DNA, como el DNA exionado, o de un comple;
protena-DNA. En el ltimo caso, la naturaleza c.
complejo diana puede hacer que el transposn i
inserte en promotores especficos (como Tyl o Ty;
que seleccionan promotores pol III en las levadu
ras), regiones inactivas del cromosoma o DNA e;
proceso de replicacin.
Los transposones causan
reestructuracin deL DNA
Conceptos principales
.
La recombinacin homloga entre mltiples copias
de un transposn causa reestructuracin del DNA
hospedador.
La recombinacin homloga entre las repeticiones
de un transposn puede llevar a la escisin precisa o
imprecisa.
Adems de la transposicin intermolecular "sjq
pie
"
, que da como resultado la insercin en un nu
vo sitio, los transposones estimulan otros tipos di
reestructuraciones del DNA. Algunos de estos suc-
sos son consecuencias de la relacin entre mltip!-
CAPTULO 21 Transposones
copias del transposn. Otros representan resulta-
dos alternativos del mecanismo de transposicin
y dejan indicios sobre la naturaleza de los sucesos
subyacentes.
Puede haber reestructuraciones del DNA hos-
pedador cuando un transposn inserta una copia
en un segundo sitio cerca de su localizacin ori-
ginal. Los sistemas de hospedador pueden realizar
la recombinacin recproca entre las dos copias del
transposn; cuyas consecuencias dependen de que
las repeticiones tengan la misma orientacin o una
invertida.
La FIGURA 21.9 ilustra la regla general de que la
recombinacin entre cualquier par de repeticiones
directas causar delecin del material entre ellas.
La regin interpuesta se extirpa como un crculo
de DNA (que se pierde de la clula); el cromosoma
conserva una copia de la repeticin directa. Una
recombinacin entre los mdulos IS de repeticin
directa del transposn compuesto Tn9 sustituira al
transposn IS1 de un solo mdulo.
La delecin de secuencias cercanas a un trans-
posn pudiese, por tanto, ser producto de un pro-
ceso de dos etapas; la transposicin genera una
repeticin directa de un transposn y ocurre re-
combinacin entre las repeticiones. Sin embargo,
la mayor parte de las deleciones que surgen en la
vecindad de los transposones tal vez sea resultado
de una variacin en la va, seguida del episodio de
transposicin mismo.
En la FIGURA 21.10 se muestran las consecuen-
cias de la recombinacin recproca entre un par de
repeticiones invertidas. La regin entre las repeti-
ciones se invierte; las repeticiones mismas perma-
necen disponibles para facilitar ms inversiones. Un
transposn compuesto cuyos mdulos se invierten
es un componente estable del genoma, si bien la
direccin de la regin central con respecto a los m-
dulos pudiese invertirse por recombinacin.
La escisin no es apoyada por los transposones
mismos, pero puede ocurrir cuando las enzimas
bacterianas reconocen regiones homlogas en los
transposones, algo importante porque la prdida
de un transposn puede restablecer la funcin en
el sitio de insercin. La escisin precisa requiere el
retiro del transposn ms una copia de la secuencia
duplicada. Esto sucede muy pocas veces; se presenta
con una frecuencia de ~10-6para Tn5 y ~10-9para
TnlO. Es probable que implique una recombinacin
entre sitios diana de 9 bp duplicados.
La escisin imprecisa deja un residuo de
transposn que puede ser suficiente para impedir
la reactivacin del gen diana, pero tal vez sea insufi-
ciente para causar efectos polares en genes cercanos,
de manera que ocurre un cambio en el fenotipo. La
Las repeticiones directas se recombinan
para escindir material
Repeticiones directas
Apareamiento
de repeticiones
directas
La recombinacin
ibera material
entre repeticiones
como una molcula
circular
La recombinacin recproca entre repeticiones
directas escinde eL material entre ellas; cada producto de re-
combinacin tiene una copia de la repeticin directa.
La recombinacin de
invertidas invierte el material
Repeticiones invertidas
i
1
1
Las repeticiones
invertidas se aparean
Regin invertida
La recombinacin recproca entre repeticiones
invertidas invierte La regin entre ellas.
escisin imprecisa se presenta con una frecuencia
de -lO-6 para TnlO. Comprende la recombinacin
entre secuencias de 24 bp en los mdulos IS 10; estas
secuencias son repeticiones invertidas, pero como
los mdulos IS10 mismos estn invertidos, forman
repeticiones directas en TnlO.
La mayor frecuencia de escisin imprecisa en
comparacin con la precisa tal vez refleje el aumen-
to de la longitud en las repeticiones directas (24 bp
en contraposicin a 9 bp). Ningn tipo de escisin
depende de funciones codificadas por el transposn,
pero se desconoce el mecanismo. La escisin es in-
dependiente de RecA y pudiese ocurrir por algunos
mecanismos celulares que generan deleciones es-
pontneas entre secuencias repetidas con espacios
reducidos entre s.
21.5 Los transposones causan reestructuracin del DNA
529
Intermediarios comunes
para La transposicin
Conceptos principales
La transposicin se inicia con la formacin de un
complejo de transferencia de cadenas donde el
transposn se conecta con el sitio diana a travs de
una cadena en cada extremo.
La transposasa Mu forma el complejo por sinapsis de
los extremos del DNA de Mu, seguida de la formacin
de hendiduras y luego una reaccin de transferencia de
cadena.
Ocurre a continuacin transposicin replicativa si el
complejo se reproduce, y transposicin no replicativa si
se repara.
Muchos elementos mviles del DNA se transponen
de una localizacin cromosmica a otra por un me-
canismo en esencia semejante. Incluyen elementos
IS, transposones procariticos y eucariticos y el
bacterifago Mu. La insercin de la copia de DNA
La transposicin se i nicia por
hendiduras en los extremos
Transposn
Diana
j
Hendidura

Sinapsis de los extremos

Los extremos con
hendidura se unen
Equivalente
no plegado
FIGURA 21. : : La transposicin se inicia con hendiduras en [os
extremos del transposn y del sitio diana, y con [a unin de
los extremos con hendidura a un complejo de transferencia
de cadenas.
del RNA retrovrico utiliza un mecanismo similar
(vase la seccin 22,2, El ciclo vital de los retro-
virus comprende sucesos similares a la transposi-
cin). Las primeras etapas de la recombinacin de
inmunoglobulinas tambin son similares (vase !e
seccin 23.10, Las protenas RAG catalizan la rotura
y reunin).
La transposicin se inicia con un mecanism
comn de unin del transposn a su diana. En la
FIGURA 21.11 se muestra que el transposn tiene
hendiduras en ambos extremos, y el sitio diana
en ambas cadenas. Los extremos con hendidura s.
unen en forma cruzada para generar una conexin
covalente entre el transposn y la diana. Los di:
extremos del transposn se juntan en este procesa
para que sea ms sencillo seguir las escisiones, la
etapa de sinapsis se muestra despus de la escisin
pero en realidad ocurre antes.
Gran parte de esta va fue descubierta por pri-
mera vez en el fago Mu, que utiliza el proceso de
transposicin en dos formas. Al infectar una clui
hospedadora, el Mu se integra al genoma grada
a una transposicin no replicativa; durante el si-
guiente ciclo ltico, el nmero de copias se amplifk;
por transposicin replicativa. Ambos tipos de trans-
posicin implican el mismo paradigma de reaccin
entre el transposn y su diana, pero las reaccione?
siguientes son diferentes.
La transposasa MuAhace las operaciones inicia -
les del fago de DNA. Tres sitios de unin MuA con
consenso de 22 bp se localizan en cada extremo de!
DNA de Mu. Ll, L2 y L3 estn en el extremo izquier-
do, mientras que Rl, R2 y R3 estn en el extrenr.
derecho. Un monmero de MuA puede unirse a cace
sitio. La MuA tambin se une a un sitio interno en
el genoma del fago. La unin de MuA en los extre-
mos izquierdo y derecho, adems del sitio interno.
forma un complejo. La participacin del sitio intenfl
no es clara, parece necesaria para la formacin dei
complejo, pero no para la escisin de cadenas y V-
pasos posteriores.
La unin del transposn Mu de DNA a un siti
diana pasa por las tres etapas ilustradas en la FIGURA
21.12
. Esto comprende slo los dos sitios ms cerca-
nos a cada extremo del transposn. Las subunidader
MuA unidas a estos sitios forman un tetrmero, lo
que logra la sinapsis de los dos extremos del trans-
posn. El tetrmero ahora acta en una forma que
asegura una reaccin coordinada de ambos extre-
mos del DNA de Mu. El MuA tiene dos sitios para la
manipulacin del DNA y su modo de accin impa
a subunidades de transposasa a aduar en config- -
racin trans. El sitio de unin de consenso se une I
las secuencias de 22 bp que constituyen los sitios Ll.
L2, Rl y R2. El sitio activo fragmenta las cadena?
de DNA de Mu en posiciones cercanas a los sitios
530
CAPTULO 21 Transposones
m unin Ll y Rl de MuA. El sitio activo no puede
escindir la secuencia de DNA que es adyacente a
i secuencia de consenso en el sitio de unin de
consenso. No obstante, puede escindir la secuencia
apropiada en un segmento diferente de DNA.
De este modo, los extremos del transposn son
escindidos por subunidades MuA que actan en
configuracin trans. La forma de accin en configu-
racin trans indica que los monmeros en realidad
unidos a Ll y Rl no escinden los sitios cercanos. Uno
ie los monmeros unidos al extremo izquierdo hace
una hendidura en el sitio en el lado derecho y vice-
versa (no se sabe qu monmero est activo en esta
etapa de la reaccin). La reaccin de transferencia de
cadenas tambin tiene lugar en configuracin trans;
el monmero en Ll transfiere la cadena en Rl y vi-
ceversa. Pudiese ocurrir que diferentes monmeros
catalizaran las reacciones de escisin y transferencia
de cadenas para un extremo determinado.
Una segunda protena, MuB, ayuda a la re-
accin. Influye en la seleccin de sitios diana. La
Mu tiene preferencia para la transposicin al sitio
La transpasasa Mu cataliza la reaccin
L1 L2 R2R1
Extremo
izquierdo MuA I
Sinapsis
Extremo
derecho
Escisin en configuracin trans
O bien
V
3
'
-
OH 3'-OH T 3'-OH 3'-OH
Transferencia de cadena
FIGURA 21.12 La transposicin Mu pasa por tres etapas esta-
bles. La transposasa MuA forma un tetrmero que hace sinapsis
con los extremos de un fago Mu. Las subunidades de transpo-
sasa actan en configuracin trans para hacer una muesca en
cada extremo del DNA, y despus, una segunda accin en confi-
guracin trans une Los extremos con hendidura al DNA diana.
diana alejado ms de 10 a 15 kb de la insercin
original. sta es la llamada
"
inmunidad de diana".
Se demuestra en una reaccin in vitro que incluye
plsmidos donadores (que contienen Mu) y diana
(deficientes en Mu), protenas MuA y MuB, prote-
na HU de E. coli, Mg2+ y ATP. La presencia de MuB y
ATP restringe la transposicin de manera exclusiva
al plsmido diana. El motivo es que cuando MuB
se une al DNA del complejo MuA-Mu, MuA hace
que MuB hidrolice el ATP, despus de lo cual se li-
bera MuB. No obstante, la MuB se une (de manera
inespecfica) al DNA diana, donde estimula la activi-
dad de recombinacin de MuA cuando se forma un
complejo de transposicin. En efecto, la presencia
previa de MuA
"
elimina
"
a MuB del donador, lo que
da preferencia para la transposicin al sitio diana.
El producto de estas reacciones es un comple-
jo de transferencia de cadenas donde el transposn
se conecta al sitio diana por medio de una cadena
en cada extremo. El siguiente paso de la reaccin
difiere y determina el tipo de transposicin. En las
siguientes dos secciones se observa cmo la estruc-
tura comn puede ser sustrato para la replicacin
(lo que conduce a la transposicin replicativa), o
usarse de manera directa para rotura y unin (lo
que conduce a una transposicin no replicativa).
La transposicin replicativa
avanza a travs
de un cointegrado
Conceptos principales
La replicacin de un complejo de transferencia de
cadenas genera un cointegrado, que es una fusin de
los replicones donador y diana,
El cointegrado tiene dos copias del transposn que
yacen entre los replicones originales.
La recombinacin entre las copias del transposn
regenera los replicones originales, pero el receptor ha
ganado una copia del transposn.
La reaccin de recombinacin es catalizada por una
resolvasa codificada por el transposn.
Las estructuras bsicas involucradas en la transposi-
cin replicativa se ilustran en la -IGUR :
.
Los extremos 3' del complejo de transferen-
cia de cadenas sirven como cebadores para
la replicacin, lo que genera una estructu-
ra llamada cottitegrado, que representa la
fusin de las dos molculas originales. El
cointegrado tiene dos copias del transpo-
sn, una en cada unin entre los replicones
originales, orientados como repeticiones
directas. El entrecruzamiento se forma por
21.7 La transposicin replicativa avanza a travs de un cointegrado
531
m
Transposn
dor y receptor se fusionan
cointegrado
Fusin
O
Cointegrado
Resolucin
O
La transposicin puede fusionar un replicn
donador y uno receptor en un cointegrado. La resolucin libera
dos replicones, cada uno con una copia del transposn.
accin de la transposasa, como se describi
en la seccin anterior. Su conversin en el
cointegrado requiere funciones de replica-
cin del hospedador.
.
Una recombinacin homloga entre las dos
copias del transposn libera dos replico-
nes individuales, cada uno con una copia
del transposn. Uno de los replicones es
el replicn donador original. El otro es un
replicn diana que ha ganado un transpo-
sn flanqueado por repeticiones directas
cortas de la secuencia diana del hospedador.
La reaccin de recombinacin se llama re-
solucin; la actividad enzimtica encargada
se llama resolvasa.
Las reacciones comprendidas en la generacin
de un cointegrado se han definido con detalle para
el fago Mu y se ilustran en la Fl . El proce-
so se inicia con la formacin del complejo de trans-
ferencia de cadenas (a veces llamado tambin com-
plejo de entrecruzamiento). Las cadenas donadoras
y diana estn ligadas de manera que cada extremo
de la secuencia del transposn se une a una de las
cadenas nicas prominentes generadas en el sitio
diana. El complejo de transferencia de cadenas ge-
nera una estructura de forma cruzada que se man-
tiene junta en el transposn doble. El destino de la
estructura de entrecruzamiento determina el modo
de transposicin.
La transposicin Mu utiliza un intermediario
del entrecruzamiento
Transposn
Diana
Formacin de hentiduras
Los cortes de una sola cadena generan extremos
escalonados tanto en el transposn como en la
diana
Estructura entrecruzada (complejo de
transferencia de cadena):
Los extremos con hendidura del transposn se
unen a los extremos con hendidura del sitio diana
La repVoacin de extremois 3' libres genera
un cointegrado: La molcula nica tiene dos
copias del transposn
El cointegrado dibujado como va continua muestra
que los transposones estn en las uniones entre
replicones
La transposicin Mu genera una estruct.
entrecruzada que se convierte, por replicadn, en un ce-
legrado.
El principio de la transposicin replicativa
que la replicacin por medio del transposn lo c
plica, lo que crea copias en los sitios diana y don
dor. El producto es un cointegrado.
La estructura del entrecruzamiento contie;
una regin de una sola cadena en cada uno de i
extremos escalonados. Estas regiones son horquiL
de seudorreplicacin que ofrecen un molde para
sntesis de DNA. (El uso de los extremos como c
badores para la replicacin implica que debe ocuci
rotura de la cadena con una polaridad que geni
un extremo 3
'
-
OH en ese punto.)
Si la replicacin contina desde ambas horquiL
de seudorreplicacin, avanzar por el transposn
532 CAPTULO 21 Transposones
parando sus cadenas y terminando en sus extremos.
La replicacin tal vez se logre por fundones codifi-
cadas por el hospedador. En esta juntura, la estruc-
mra se ha convertido en un cointegrado, que posee
repeticiones directas del transposn en las uniones
entre los replicones (como puede observarse por el
rastreo de la va alrededor del cointegrado).
HW1 La transposicin no repLicativa
avanza por rotura y reunin
Conceptos principales
La transposicin no replicativa ocurre cuando se hace
una hendidura en una estructura entrecruzada en el par
no roto de las cadenas donadoras y se ligan las cadenas
diana a cada lado del transposn.
Dos vas para la transposicin no replicativa difieren de
acuerdo a que el primer par de cadenas del transposn
se una al sitio diana antes de que se corte el segundo
par (Tn5) o que las cuatro cadenas se corten antes de
unirse al sitio diana (TnlO).
L
a estructura de entrecruzamiento puede usarse
l
ambin en la transposicin no replicativa. El prin-
cipio de la transposicin no replicativa por este me-
canismo es que una reaccin de rotura y reunin
permite reconstruir el sitio diana, con excepcin del
pransposn; el donador se mantiene roto. No se for-
ma un cointegrado.
La FIGURA 21.15 muestra los episodios de esci-
Bion que generan una transposicin no replicativa
[del fago Mu. Una vez que a las cadenas no rotas del
idonador se les hacen hendiduras, se pueden ligar
las cadenas diana a cada lado del transposn. Las
regiones de cadena nica generadas por los cortes
escalonados deben llenarse mediante sntesis de re-
paracin. El producto de esta reaccin es un repli-

cn diana donde se ha insertado el transposn entre

repeticiones de la secuencia creada por las hendidu-
ras de cadena nica originales. El replicn donador
.tiene una rotura de doble cadena a travs del sitio
donde originalmente se localizaba el transposn.
Las transposiciones no replicativas pueden tam-
hin ocurrir por una va alternativa, donde se ha-
cen hendiduras en el DNA diana pero tambin una
rotura de doble cadena a cada lado del transposn,
lo que lo libera por completo de las secuencias do-
nadoras de los flancos (como se observa en la Figura
.
21.7). Esta va de "corte y pegado" es utilizada por
TnlO, como se ilustra en la FIGURA 21.16.
Un experimento certero demostr que las trans-
posiciones no replicativas de TnlO hicieron uso
de un heterodplex sintetizado de manera artifi-
cial de TnlO que contena apareamientos errneos
FIGURA 21.15 La transposicin no replicativa tiene lugar
cuando se libera una estructura de entrecruzamiento por la
formacin de una hendidura, lo que inserta el transposn en el
DNA diana, flanqueado por las repeticiones directas de la diana,
y se deja al donador con una rotura de doble cadena.
21.16 Ambas cadenas de TnlO se escinden en forma
secuencial, y despus, el transposn se une al sitio diana con
hendidura.
de una sola base. Si la transposicin implica repli-
cacin, el transposn en el nuevo sitio contendr
informacin de slo una de las cadenas TnlO pro-
genitoras. No obstante, si la transposicin ocurre
por movimiento fsico del transposn existente, se
conservarn los apareamientos errneos en el nue-
vo sitio
, lo cual qued demostrado en este caso.
21.8 La transposicin no replicativa avanza por rotura y reunin 533
La transposicin puede causar ese
La transposasa se une a ambos extremos de Tn
Los extremos transferidos son objeto de produccin
de hendiduras
Otras cadenas son objeto de El receptor es objeto de
produccin de hendiduras produccin de hendiduras
Se libera el donador Tn se une al sitio diana
Tn5 se escinde del DNA de los flancos
3'0H
i
Horquilla
H,0
i
FIGURA 21.17 La escisin de Tn5 del DNA de los flancos com-
prende la formacin de una hendidura, la reaccin intercatena-
ria y la escisin de la horquilla.
Los extremos del transposn se unen
Extremo
izquierdo
Transposn
Extremo
dfirecho
I
Extremo derecho
Contacto
Sitio -
activo
-
Sitio activo
'Contacto
Lxtremo izquierdo
FIGURA 21.18 Cada subunidad de la transposasa Tn5 tiene un
extremo del transposn localizado en su sitio activo y tambin
hace contacto en un sitio diferente con el otro extremo del
transposn.
La diferencia bsica en la Figura 21.16 respecto
del modelo de la Figura 21.15 es que ambas cadenas
de TnlO se escinden antes de cualquier conexin
con el sitio diana. El primer paso en la reaccin es el
reconocimiento de los extremos del transposn por
la transposasa, que forman una estructura protei-
ncea dentro de la que ocurre la reaccin. En cada
extremo del transposn, las cadenas son escindidas
en un orden especfico: la cadena transferida (la que
se va a conectar con el sitio diana) se escinde prime-
ro, seguida de la otra. (ste es el mismo orden de la
transposicin Mu de las Figuras 21.14y21.15.)
La Tn5 tambin hace transposicin no replica-
tiva, y en la FIGURA 21.17 se muestra la interesante
reaccin de escisin que separa el transposn de
las secuencias de los flancos. La primera cadena
de DNA es objeto de una hendidura. El extremo
3
'
-
OH que se libera ataca entonces a la otra cadena
del DNA, lo que libera la secuencia del flanco y ur I
las dos cadenas del transposn en una horquilla
Luego, una molcula de agua activada ataca a fl
horquilla para generar extremos libres para cae;
cadena del transposn.
En el siguiente paso se libera el DNA donador
escindido y el transposn se une a los extremos ce -
hendidura en el sitio diana. El transposn y el sl;
diana se mantienen constreidos en la estructur:
proteincea creada por la transposasa (y otras pn -
tenas). La escisin de doble cadena en cada extre-
mo del transposn impide cualquier transposicin
de tipo replicativo y obliga a la reaccin a avanz?
por transposicin no replicativa, lo que arroja e
mismo resultado que se muestra en la Figura 21.14
pero con pasos de escisin y unin individuales qu
tienen lugar en un orden diferente.
Las transposasas Tn5 y TnlO actan ambas
como dmeros. Cada subunidad en el dmero tien.
un sitio activo que cataliza de manera sucesiva
rotura de doble cadena de las dos en un extremo dd
transposn y despus cataliza la escisin escalonada
del sitio diana. En la FIGURA 21.18 se ilustra la es-
tructura de la transposasa Tn5 unida al transposi
'
r
escindido. Cada extremo del transposn se localiza
en el sitio activo de una subunidad. Un extremo de
la subunidad tambin hace contacto con el otro ex-
tremo del transposn, lo que controla la geometra
de la reaccin de transposicin. Cada uno de los
sitios activos escindir una cadena del DNA diana.
Es la geometra del complejo lo que determina |
distancia entre estos sitios en las dos cadenas diar :
(nueve pares de bases en el caso de Tn5).
La transposicin de TnA
requiere transposasa
y resoLvasa
Conceptos principales
.
La transposicin replicativa de TnA requiere que una
transposasa forme la estructura cointegrada y una
resolvasa libere los dos replicones.
.
La accin de la resolvasa se asemeja a la protena
Int X y pertenece a la familia general de reacciones
de recombinacin especficas de sitio similares a la
topoisomerasa, que pasan por un intermediario donde
la protena est unida de manera covalente al DNA.
La transposicin replicativa es la nica fon:
de movilidad de la familia de TnA, que consta
transposones grandes (~5 kb). No son compues:
dependientes de los mdulos de transposicin d
tipo IS, sino que ms bien constituyen unidac_
534 CAPTULO 21 Transposones
independientes que portan los genes para la trans-
posicin, as como para caractersticas del tipo de la
resistencia a frmacos. La familia TnA incluye varios
transposones relacionados, de los que Tn3 y Tnl 000
(tambin conocidos como yS) son los mejor caracte-
rizados. Tienen la caracterstica terminal habitual de
las repeticiones invertidas con relacin estrecha, en
general de -38 bp de longitud. Las deleciones que
actan en configuracin cis en cualquier repeticin
impiden la transposicin de un elemento. Se genera
una repeticin directa de 5 bp en el sitio diana. Por-
tan marcadores de resistencia como amp'.
Las dos etapas de la transposicin mediada por
TnA se realizan a travs de la transposasa y la resol-
vasa
, cuyos genes (tnpA y tnpR) se identifican por
mutaciones recesivas. La etapa de transposicin in-
volucra a los extremos del elemento, como lo hace
en los elementos de tipo IS. La resolucin requiere
un sitio interno especfico, caracterstica exclusiva
de la familia TnA.
Las mutaciones en tnpA no permiten realizar
la transposicin. El producto del gen es una trans-
posasa que se une a una secuencia de -25 bp lo-
calizada dentro de los 38 bp de la repeticin ter-
minal invertida. Existe un sitio de unin para la
protena IHF de E. coli cercano al sitio de unin de
la transposasa, y la transposasa se une de manera
colaboradora con IHF. La transposasa reconoce los
extremos del elemento y tambin hace las roturas
escalonadas de 5 bp en el DNA diana donde se va
a insertar el transposn. La IHF es una protena de
unin de DNA que a menudo participa en el en-
samblaje de grandes estructuras en E. coli; es posible
que su participacin en la reaccin de transposicin
no sea esencial.
El producto del gen tnpR tiene funciones dobles.
Acta como represor de la expresin gnica y pro-
vee la funcin de resolvasa.
Las mutaciones en tnpR aumentan la frecuencia
de la transposicin. El motivo es que TnpR reprime
la transcripcin en tnpA y su propio gen. De este
modo, la desactivacin de la protena TnpR permite
una mayor sntesis de TnpA, lo que da como re-
sultado una frecuencia ms alta de transposiciones.
Esto implica que la cantidad de la transposasa TnpA
debe ser un factor limitante de la transposicin.
Los genes tnpA y tnpR se expresan de manera
divergente desde una regin de control intercistr-
nica rica en A-T que se indica en el mapa de Tn3
incluido en la FIGURA 21.19. Ambos efectos de TnpR
son mediados por su unin en esa regin.
En su capacidad como resolvasa, la TnpR parti-
cipa en la recombinacin entre repeticiones directas
de Tn3 en una estructura cointegrada. Un cointegra-
do puede, en principio, resolverse con una recom-
binacin homologa entre cualquier par de puntos
La organizacin del transposn TnA se conserva
Unidades de transcripcin
IR res IR
tnpA tnpR ampR
tnpA 1 11 III tnpR
Transcripcin >
FIGURA 21.19 Los transposones de la familia TnA tienen re-
peticiones terminales invertidas, un sitio res interno y tres
genes conocidos.
correspondiente en las dos copias del transposn.
Sin embargo, la reaccin de resolucin de Tn3 tiene
lugar slo en un sitio especfico,
El sitio de la resolucin se llama res. Se identi-
fica por deleciones que actan en configuracin cis
e impiden concluir la transposicin, lo que causa la
acumulacin de cointegrados. En ausencia de res,
la reaccin de resolucin puede sustituirse con la
recombinacin general mediada por RecA, pero es
mucho menos eficaz.
Los sitios unidos por la resolvasa TnpR se resu-
men en la porcin inferior de la Figura 21.19. Ocurre
unin independiente en cada uno de tres sitios, de
30 a 40 bp de longitud cada uno. Los tres sitios
de unin comparten una homologa de secuencia
que define a una secuencia de consenso con sime-
tra doble.
El sitio I incluye la regin definida en trminos
genticos como sitio res; en su ausencia, la reaccin
de resolucin no avanza en absoluto. No obstante, la
resolucin tambin comprende la unin en los sitios
11 y m, porque la reaccin avanza poco si cualquiera
de estos sitios presenta delecin. El sitio I se superpo-
ne con el punto de inicio de la transcripcin de tiipA.
El sitio n se superpone con el punto de inicio para
transcripcin de tnpR; una mutacin de operador se
ubica apenas en el extremo izquierdo del sitio.
Interactan los sitios? Una posibilidad es que
se requiera la unin a los tres sitios para mantener
el DNA en una topologa apropiada. La unin en un
solo conjunto de sitios puede reprimir la transcripcin
de tnpA y tnpR sin introducir cambios en el DNA.
En un anlisis de resolucin in vitro se usa una
molcula cointegrada similar al DNA como sustrato.
El sustrato debe ser superenrollado; su resolucin
produce dos crculos encadenados, cada uno con un
sitio res. La reaccin requiere grandes cantidades de
2.1
.9 La transposicin de TnA requiere transposasa y resolvasa
535
la resolvasa TnpR; no se necesitan factores del hos-
pedador. La resolucin ocurre en una gran estructu-
ra nucleoprotenica. La resolvasa se une a cada sitio
res y, despus, los sitios unidos se conjuntan para
formar una estructura de -10 nm de dimetro, a ve-
ces llamada sinaptosoma, que contiene seis dmeros
de resolvasa y dos sitios res. Ocurren cambios en el
superenrollado durante la reaccin y el DNA se do-
bla en los sitios res por la unin de la transposasa.
Se han determinado varias estructuras crista-
linas de la y5 resolvasa. La enzima aislada puede
formar un dmero de dmeros, esto es, una subuni-
dad tiene una interfase que facilita la formacin de
dmeros y el dmero entonces utiliza una segunda
interfase para formar un tetrmero. El dmero pue-
de unirse al sitio I y formar una estructura donde
los segmentos catalticos estn distantes de los sitios
diana de escisin en el DNA. La estructura cristalina
del sinaptosoma, donde un tetrmero de resolvasa
se enlaza a travs de Ser10 con dos DNA dplex es-
cindidos en el sitio I muestra que los sitios diana en
las cadenas dplex que van a recombinarse yacen
en sitios opuestos del tetrmero. Esto indica que
un dmero debe girar 180

con relacin al otro para

reubicar el DNA con el fin de lograr la reaccin de
recombinacin. Esta parte del mecanismo es dife-
rente de la empleada por las recombinasas de tirosi-
na (como Cre o Flp) donde la enzima, en trminos
bsicos, junta los DNA recombinantes en forma de
una unin Holliday (vase la seccin 19.18, La re-
combinacin especfica de sitio simula la actividad
de la topoisomerasa).
Ocurre la resolucin por rotura y reunin de
enlaces, sin aporte de energa. La escisin se logra
por una reaccin de transesterificacin que une de
forma covalente la Ser10 de una subunidad de resol-
vasa con un fosfato 5
'
en el enlace diana del sitio I.
El producto consta de una resolvasa unida en forma
covalente a ambos extremos 5
'
de los cortes de do-
ble cadena hechos en el sitio res. La escisin ocurre
de manera simtrica en una regin palindrmica
corta para generar dos extensiones de bases. Se pue-
de describir la reaccin de corte con expansin de la
imagen de la regin de entrecruzamiento localizada
en el sitio I de la siguiente forma:
5
'
TTATAA3'
3
'
AATATT5'
f
5
'
TTAT + protena-AA3'
protena 3
'
AA TATT5'
La reaccin se asemeja a la actividad de Int X
en los sitios att (vase la seccin 19.16, La recombi-
nacin especfica de sitio implica rotura y reunin).
De hecho, 15 de los 20 bp del sitio res son idnticas
a las bases de posiciones correspondientes en att,
lo que sugiere que la recombinacin especfica c:
sitio de X y la resolucin de TnA han evolucionad
a partir de un tipo comn de reaccin de recomhM
nacin. De hecho, se observa en la seccin 23.10:
Las protenas RAG catalizan la rotura y reunin.
que la recombinacin que involucra a los genes c:
inmunoglobulinas tiene la misma base. La carac-
terstica que comparte todas estas reacciones es ;
transferencia del extremo roto a la protena cata-
ltica como etapa intermedia, antes de su reunii:
con otro extremo roto (vase la seccin 19.18, Jm
recombinadn especfica de sitio simula la actividi;
de la topoisomerasa).
Las reacciones mismas son anlogas en trmi-
nos de manipulacin del DNA, aunque slo ocurrr
resolucin entre sitios intramoleculares, en tanto
recombinacin entre sitios att es intermolecular |
direccional (como se observa por las diferencias en
los sitios attB y attP). El mecanismo de la accin pro-
tenica, no obstante, es diferente en cada caso. H
resolvasa acta en una forma en la que se unen cua-
tro subunidades a los sitios res recombinantes. Cada
subunidad hace una escisin de una sola cadena-
Una reorganizacin de las subunidades con relacicr
a las otras desplaza entonces, en trminos fsicos, le-
cadenas de DNA y las coloca en una conformacir-
recombinada. Esto permite a las hendiduras sellars;
junto con la liberacin de la resolvasa.
La transposicin de TnlO tiene
mLtipLes controles
La inhibicin de copias mltiples reduce la tasa de
transposicin de cualquier copia de un transposn
cuando se introducen otras del mismo transposn en el
genoma.
Mltiples mecanismos afectan la tasa de transposicin.
El control de la frecuencia de transposiciones 1
importante para la clula. Un transposn debe so-
capaz de mantener cierta frecuencia mnima de mt
vimiento a fin de sobrevivir, pero una frecuencia
muy alta pudiese ser lesiva para la clula hospe-
dadora. Cada transposn parece tener mecanismos
que controlan su frecuencia de transposicin, a
han caracterizado diversos mecanismos para TnlO.
El TnlO es un transposn compuesto, donde d
elemento IS10R proporciona el mdulo activo. 1:
organizacin del IS10R se resume en la FIGURA 21.20.
Se encuentran dos promotores cerca del lmite ex-
terno. El promotor se encarga de la transcripcic r
de IS10R. El promotor P
0UT
hace que la transcrip-
cin avance hacia el DNA del flanco adyacente, n
536 CAPTULO 21 Transposones
O tiene dos p
fe
TnlO
I
m
Superposicin
de 36 bases
Transposasa
FIGURA
Dos promotores en orientacin contraria yacen
cerca del lmite extemo de IS10R. El fuerte promotor P
ml
im-
pulsa la transcripcin hacia el ONA hospedador de los flancos.
El promotor P
m
ms dbil, ocasiona la transcripcin de un
RNA que extiende La longitud de IS10R y se traduce en La
transposasa.
transcripcin suele terminar dentro del transposn,
pero en ocasiones contina en el interior del DNA
del hospedador; a veces esa transcripcin leda en
forma completa se encarga de activar genes bacte-
rianos adyacentes.
El fenmeno de la "inhibicin de copias ml-
tiples" revela que la expresin del gen de la trans-
posasa IS10R est regulada. La transposicin de un
elemento TnlO en el cromosoma bacteriano dismi-
nuye cuando se introducen ms copias de IS10R a
travs de un plsmido de copias mltiples. La inhi-
bicin requiere el promotor P
0UI
y se ejerce en el
mbito de la traduccin. La base del efecto radica
en la superposicin de las regiones terminales 5
'
de
los productos de transcripcin de y P
our
El RNA
OUT es un producto de transcripcin de 69 bases,
presente a ms de lOOx la concentracin de RNA
IN por dos motivos: ?
0VT
es un promotor mucho
ms fuerte que P
IN
; y el RNA OUT es ms estable
que el RNA IN.
El RNA OUT acta como RNA en sentido opues-
to (vase la seccin 13.7, Las molculas pequeas
de RNA pueden regular la traduccin). La concen-
tracin de RNA OUT no tiene efecto en la situacin
de una sola copia, pero s presenta uno significativo
cuando estn presentes ms de cinco copias. Suele
haber ~5 copias de RNA OUT por copia de IS10 (que
corresponde a -150 copias de RNA OUT en una
situacin de copias mltiples usuales). El RNA OUT
aparea sus bases con el RNA IN y el exceso de RNA
OUT asegura que el RNA IN se una con rapidez,
antes de que pueda adherirse un ribosoma. As, el
RNA IN apareado no puede traducirse.
La cantidad de la protena transposasa a me-
nudo es un rasgo crucial. El TnlO cuya transpo-
sasa se sintetiza en la baja concentracin de 0.15
molcula por clula por generacin, muestra varios
La frecuencia de la transposicin es controlada
La transposasa acta en configuracin cis
sobre el molde de DNA
IN
Tn10
El apareamiento
impide la -4-
traduccin del
RNA IN
La metilacin impide la unin
de la transposasa al DNA -
i
CUT
La metilacin impide la
sntesis de la transposasa-
FIGURA 21. Varios mecanismos restringen La frecuencia de
transposicin de TnlO mediante La afectacin de La sntesis o
el funcionamiento de La protena transposasa. La metilacin
restringe la transposicin de un transposn individual para que
ocurra slo despus de La replicacin. En situaciones de copias
mltiples, La preferencia por la configuracin cis restringe La
seleccin de La diana, y el apareamiento de RNA OUT/IN inhibe
La sntesis de La transposasa.
mecanismos interesantes. La resume
los diversos efectos que influyen en la frecuencia
de transposicin.
Un marco de lectura continuo en una cadena
de IS10R codifica la transposasa. La concentracin
de la transposasa limita la tasa de transposicin. Las
mutaciones en este gen pueden complementarse en
configuracin trans por otro elemento ISIO de tipo
silvestre, pero slo con alguna dificultad. Esto re-
fleja una fuerte preferencia de la transposasa por la
actividad en configuracin cis; la enzima acta de
manera eficaz slo con el molde de DNA del que
fue transcrita y traducida. La preferencia por la con-
figuracin cis es un rasgo comn de las transposa-
sas codificadas por elementos IS. (Otras protenas
que muestran preferencia por la configuracin cis
influyen sobre la protena A involucrada en la re-
plicacin (pXI74; vase la seccin 16.15, Se utilizan
crculos rodantes para replicar genomas de fagos.)
Refleja la preferencia por la configuracin cis
una capacidad de la transposasa de reconocer me-
jor aquellas secuencias diana de DNA que yacen
ms cerca del sitio donde se sintetiza la enzima?
Una posible explicacin es que la transposasa se
une al DNA con tal fuerza despus de la sntesis
de protenas (o incluso durante ella), que tiene una
probabilidad muy baja de difundirse a otro sitio.
Otra posibilidad es que la enzima pudiese ser ines-
table cuando no est unida al DNA, de modo que las
molculas de protena que no se unen con rapidez
(y, por tanto, cerca), nunca tienen posibilidad de
hacerse activas.
21.10 La transposicin de TnlO tiene mltiples controles
537
Juntos, los resultados de la preferencia por la
configuracin cis y la inhibicin de copias mltiples,
aseguran que un aumento del nmero de copias de
TnlO en un genoma bacteriano no cause una mayor
frecuencia de transposicin que pudiese daar al
genoma.
Los efectos de la metilacin constituyen el siste-
ma ms importante de regulacin de un elemento
individual. Disminuye la frecuencia de la transpo-
sicin y (de mayor importancia) acoplan la trans-
posicin al paso de la horquilla de replicacin. La
capacidad de IS10 de transposicin tiene relacin
con el ciclo de replicacin por la respuesta del trans-
posn al estado de metilacin en dos sitios. Un sitio
est dentro de la repeticin invertida en el extre-
mo IS10R donde se une la transposasa. El otro sitio
es el promotor P
IN,
del que se transcribe el gen de
transposasa.
Ambos sitios estn metilados por el sistema dam
descrito en la seccin 15.5, Regula el inicio la me-
tilacin en el origen? La metilasa Dam modifica la
adenina en la secuencia GATC de una cadena recin
sintetizada generada por replicacin. La frecuencia
de la transposicin TnlO aumenta 1 000 tantos en
cepas dam- donde los dos sitios diana carecen de
grupos metilo.
El paso de una horquilla de replicacin sobre
estos sitios genera secuencias hemimetiladas; ello
activa al transposn por una combinacin de trans-
cripcin del gen de transposasa ms a menudo des-
de P
IN
y un aumento de la unin de la transposasa
al final de IS10R. En una bacteria de tipo silvestre,
los sitios se mantienen hemimetilados durante un
periodo breve despus de la replicacin.
Por qu debera ser deseable que ocurriese la
transposicin poco despus de la replicacin? El me-
canismo no replicativo de la transposicin de TnlO
coloca al DNA donador en riesgo de destruccin
(vase la Figura 21.7). Las posibilidades de super-
vivencia de la clula pueden aumentar si la repli-
cacin acaba de ocurrir para generar una segunda
copia de la secuencia del donador. El mecanismo
es eficaz porque slo una de las copias que acaban
de replicarse da origen al suceso de transposicin
(determinado por qu cadena de transposn no est
metilada en los sitios dam).
Un transposn selecciona sus sitios diana en
forma aleatoria y, como resultado, hay una proba-
bilidad razonable de que pudiese llegar a un ope-
ren activo. Continuar la transcripcin desde el
exterior a travs del transposn y as activar a la
transposasa cuya produccin puede, a su vez, llevar
a un grado alto de transposicin, tal vez letal? El
TnlO se protege contra tales sucesos por medio de
dos mecanismos. La transcripcin a travs del extre-
mo IS10R disminuye su actividad, al parecer porque
inhibe su capacidad de unirse a la transposasa, y i
RNAm que se extiende en sentido ascendente des-
de el promotor es poco traducido porque tiene ur.i
estructura secundaria donde el codn de iniciacir
es inaccesible.
25Jj Los eLernentos de control
en eL maz causan roturas
y reestructuraciones
Conceptos principales
.
Se descubri la transposicin en el maz por los
efectos de las roturas cromosmicas generadas por la
transposicin de "elementos de control".
.
La rotura genera un cromosoma que tiene un
centrmero y un extremo roto, as como un fragmento
acntrico.
.
El fragmento acntrico se pierde durante la mitosis;
lo que puede detectarse por la desaparicin de alelos
dominantes en un heterocigoto.
.
La fusin entre los extremos rotos del cromosoma
genera cromosomas dicntricos, que presentan ms
ciclos de rotura y fusin.
.
El ciclo de fusin-rotura-puente se encarga de la
aparicin de la variegacin somtica.
Una de las consecuencias ms visibles de la existen-
cia y movilidad de los transposones ocurre duran-
te el desarrollo de las plantas, cuando se presenta
variacin somtica, la cual se debe a cambios en I
localizacin o conducta de los elementos de con-
trol (el nombre que recibieron los transposones cr
el maz antes de que se descubriera su naturaleza
molecular).
Dos caractersticas del maz han ayudado a se-
guir los sucesos de transposicin. Los elementos ce
control a menudo se insertan cerca de genes q-_ _
tienen efectos visibles pero no letales sobre el fe-
notipo. El maz muestra desarrollo clonal, lo q\:z
significa que la aparicin y la sincronizacin de un
episodio de transposicin se pueden visualizar com
se muestra en la FIGURA 21.22.
La naturaleza del episodio no importa; pudiesr
ser una mutacin puntiforme, una insercin, ur:
escisin o una rotura cromosmica. Lo que impona
es que tiene lugar en una clula heterocigota pa:;
alterar la expresin de un alelo. Los descendientes
de una clula que ha sufrido el suceso presentar
despus un nuevo fenotipo, en tanto los descen-
dientes de clulas no afectadas por el suceso cor:-
nan mostrando el fenotipo original.
Las originadas por mitosis de una clula deter-
minada se mantienen en la misma localizacin
538 CAPTULO 21 Transposones
dan origen a un sector del tejido. El cambio en
el fenotipo durante el desarrollo somtico recibe el
nombre de variegacin; se descubre por un sector
del nuevo fenotipo que reside dentro de un teji-
do del fenotipo original. El tamao del sector de-
pende del nmero de divisiones del linaje que le
dio origen, de manera que el tamao de la nueva
zona del nuevo fenotipo se determina por el mo-
mento en que ocurre el cambio en el genotipo.
Cuanto ms temprano haya ocurrido en el linaje
celular mayor ser el nmero de descendientes y,
por tanto, el tamao del parche en el tejido ma-
duro. Esto se observa de forma ms clara en la
variacin del color del meollo, cuando aparecen
parches de un color dentro de otro.
La insercin de un elemento de control puede
afectar la actividad de los genes cercanos. Las dele-
dones, duplicaciones, inversiones y translocaciones
se presentan todas en los sitios donde hay elemen-
tos de control. La rotura cromosmlca es una conse-
cuencia comn de la presencia de algunos elemen-
tos. Una caracterstica nica del sistema en el maz
es que las actividades de los elementos de control
se regulan durante el desarrollo. Los elementos pre-
sentan transposicin y facilitan reestructuraciones
gnicas en momentos y frecuencias caractersticos
durante el desarrollo de las plantas.
La conducta caracterstica de los elementos de
control en el maz se tipifica por el elemento Ds,
que en un principio se identific por su capacidad
de ofrecer un sitio para la rotura cromosmica. Las
consecuencias se ilustran en la . .. Con-
sidrese una clula heterocigota donde Ds yace en
un homlogo entre el centrmero y una serie de
marcadores dominantes. El otro homlogo carece
de Ds y presenta marcadores recesivos (C, t e y wx).
La rotura en Ds genera un freigmento acntrico
que porta los marcadores dominantes. Como resul-
tado de su falta de un centrmero, este fragmento
se pierde en la mitosis. As,
las clulas descendien-
tes slo tienen los marcadores recesivos que porta
el cromosoma ntegro. Esto da el tipo de situacin
cuyo resultado se muestra en la Figura 21.22.
La FIGURA 21.24 muestra que la rotura en Ds
conduce a la formacin de dos cromosomas desusa-
dos, generados por la unin de los extremos rotos
de los productos de la replicacin. Uno es un frag-
mento acntrico o en forma de U constituido por las
cromtidas hermanas unidas en la regin distal a Ds
(a la izquierda, como se ilustra en la figura). El otro
es un cromosoma dic.ntrico con forma de U que
incluye a las cromtidas hermanas proximales a Ds
(a la derecha en la figura). Esta ltima estructura
conduce al ciclo clsico de rotura-fisin-puente
ilustrado en la figura.
Las transposiciones son heredadas en forma clona!
La rotura de un cromosoma
causa prdida de un alelo dominante
O
"
* .
o o
hhhh
> .*
A A
OOOOOOOO
oooooooo
Las clulas de un genotipo
original muestran fenotipo
dominante
La clona descendente de
una mutante muestra un
fenotipo recesivo
Meollo con un sector de
fenotipo recesivo
El anlisis clonal identifica un grupo de clulas
provenientes de un solo ancestro, donde un episodio media-
do por transposicin alter el fenotipo. La sincronizacin del
episodio durante el desarrollo la indica el nmero de clulas;
la especificidad hstica del suceso puede estar indicada por la
localizacin de las clulas.
Los fragmentos acntricos se pierden
( Cl Bz Wx Ds
Centrmero Fenotipo celular
( C bz wx D
Cl Bz Wx
Rotura en Ds
Fragmento acntrico
( Cl Bz Wx
'
1
( G bz
wx
J
i Mitosis
( C bz wT
C bz wx
FIGURA 21.23 Una rotura en un elemento de control causa la
prdida de un fragmento acntrico; si el fragmento porta los
marcadores dominantes de un heterocigoto, su prdida cambia
el fenotipo. Los efectos de los marcadores dominantes, Cl, Bz
,
y Wx pueden visualizarse por el color de las clulas o con una
tincin apropiada.
21.11 Los elementos de control en el maz causan roturas y reestructuraciones 539
Ds A B C
Rotura en Os
ABC
Replicacin
ABC )
ABC
Primer ciclo de rotura de fusin-puente
Fusin de cromtides hermanas
ABC
[ABC
El fragmento
acntrico se
pierde
Los centrmeros se
separan en la mitosis
C B A A B C
Rotura
c
C B A A B C
Cromosoma con
duplicacin de A
Segundo ciclo de rotura de fusin-puente
Cromosoma con
delecin de A
BC
B C
C B B C
( C B B| [C )
Cromosoma con
duplicacin de S
Cromosoma con
delecin de 6
El Ds provee un sitio para el inicio del ciclo de
rotura-fusin-puente de cromtidas. Los productos se pueden
seguir por anlisis clonal.
Obsrvese el destino del cromosoma dicntri-
co cuando intenta segregarse en el huso mittico.
Cada uno de sus dos centrmeros jala hacia el polo
opuesto. La tensin rompe el cromosoma en un sitio
aleatorio entre los centrmeros. En el ejemplo de la
figura la rotura tiene lugar entre los lod A y B con el
resultado de que un cromosoma hijo tiene duplica-
cin de A en tanto el otro presenta su delecin. Si A
es una marcador dominante, las clulas con la dupli-
cacin conservarn un fenotipo, pero las clulas con
la delecin mostrarn el fenotipo a recesivo.
El ciclo de rotura-fusin-puente contina a tra-
vs de ms generaciones celulares y permite que los
cambios genticos persistan en los descendientes.
Por ejemplo, considrese el cromosoma con dele-
cin que perdi A. En el siguiente ciclo ocurre un
rotura entre B y C, de manera que los descendiente-
se dividen en aquellos con una duplicacin de B
quienes presentan su delecin. Las prdidas sucesi-
vas de marcadores dominantes se descubren por I
presencia de subsectores dentro de los sectores.
Los elementos de control
forman familias
de transposones
Conceptos principales
Cada familia de transposones en el maz tiene
elementos de control autnomos y no autnomos.
Los elementos de control autnomos codifican
protenas que les permiten realizar la transposicin.
Los elementos de control no autnomos tienen
mutaciones que eliminan su capacidad de catalizar
la transposicin, pero pueden realizarla cuando
un elemento autnomo proporciona las protenas
necesarias.
Los elementos de control autnomos tienen cambios de
fase cuando sus propiedades se alteran como resultado
de cambios en el estado de metilacin.
El genoma del maz contiene varias familias de ele
mentos de control. Los nmeros, tipos y localiz;
dones de los elementos son caractersticos de cae
cepa individual de maz. Pueden ocupar una paru
significativa del genoma. Los miembros de cada fa
milia se dividen en dos clases:
.
Los elementos de control autnomo:
tienen la capacidad de realizar escisin I
transposicin. Como resultado de la activ:
dad continua de un elemento autnomo, si
insercin en cualquier locus crea un alele
inestable o "mutable". La prdida del ele
ment autnomo mismo o de su capacida
de transposicin convierte a un alelo mura
ble en un alelo estable,
.
Los elementos de control no autno
mos son estables; no presentan transpe
sicin o sufren otros cambios espontnea
de su condicin. Se tornan inestables s<i
cuando un miembro autnomo de la mis
ma familia est presente en otro sitio de
genoma. Cuando est complementado ei
configuracin trans por un elemento aut
nomo, un elemento no autnomo muestn
la variacin habitual de actividades vincula
das con los elementos autnomos, como L
capacidad de transposicin a nuevos sitios
Los elementos no autnomos se derivan c
540 CAPTULO 21 Transposones
elementos autnomos porque pierden las
funciones en configuracin trans indispen-
sables para la transposicin.
Las familias de elementos de control se definen
por las interacciones entre elementos autnomos y
no autnomos. Una familia consta de un solo tipo
de elemento autnomo acompaado por muchas
variedades de elementos no autnomos. Un ele-
mento no autnomo se ubica en una familia por su
capacidad de ser activado en configuracin trans por
los elementos autnomos. Las principales familias
de elementos de control en el maz se resumen en
la FIGURA 21.25.
Descritos en el mbito molecular, los transposo-
nes del maz comparten la forma habitual de orga-
nizacin (repeticiones invertidas en los extremos y
repeticiones cortas y directas en el DNA diana adya-
cente), por lo dems, varan el tamao y capacidad
de codificacin. Todas las familias de transposones
comparten el mismo tipo de relacin entre elemen-
tos autnomos y no autnomos. Los elementos au-
tnomos tienen marcos de lectura abiertos entre las
repeticiones terminales, en tanto los elementos no
autnomos no codifican protenas funcionales. A
veces, las secuencias internas se relacionan con las
de elementos autnomos que en otros momentos
han tenido divergencia completa.
El transposn mutador es uno de los elementos
ms sencillos. El elemento autnomo MuDR codi-
fica los genes mudrA (que codifica la transposasa
MURA) y mudrB (que codifica una protena acceso-
ria no esencial). Los extremos de los elementos es-
tn marcados por repeticiones invertidas de 200 bp.
Los elementos no autnomos, en trminos bsicos
cualquier unidad que tenga repeticiones invertidas,
que pudiesen no tener ninguna relacin de secuen-
cia interna con MuDR, tambin son movilizados por
MURA.
Por lo general, hay varios miembros comunes
i
~10) de cada familia de transposones en un ge-
noma vegetal. Mediante el anlisis de elementos
autnomos y no autnomos de la familia Ac/Ds se
cuenta con informacin molecular acerca de mu-
chos ejemplos individuales de estos elementos. En
la FIGURA 21.26 se resumen sus estructuras.
La mayor parte de la longitud del elemento au-
tnomo Ac es ocupada por un solo gen constituido
por cinco exones. El producto es la transposasa. El
elemento mismo termina en repeticiones invertidas
de 11 bp y se duplica una secuencia diana de 8 bp
en el sitio de insercin.
Los elementos Ds varan en longitud y secuen-
cia pero tienen relacin con Ac. Terminan en las
mismas repeticiones invertidas de 11 bp. Son ms
cortos que Ac y la longitud de la delecin es varia-
ble. En un extremo, el elemento Ds9 tiene una dele-
Los transposones son autnomos y no autnomos
Autnomo No autnomo
Presenta Activacin en
Requiere un
transposicin configuracin trans
e|ernento
autnomo
independiente
1
Se traslada a un nuevo sitio Se traslada a un nuevo sitio
Familias de transposones del maz
Ac (activador)
Mp (modulador)
Ds (disociacin)
Spm (mutador-supresor)
En (potenciador)
dSpm {Spm defectuoso)
/ (inhibidor)
Di (punteado)
Sin nombre
MuDR (mutador)
Mu
;
Cada familia de elementos de control tiene
miembros autnomos y no autnomos. Los elementos aut-
nomos estn aptos para la transposicin. Los elementos no
autnomos son deficientes en la transposicin. Los pares de
elementos autnomos y no autnomos se pueden clasificar en
>4 familias
.
Los elementos Os surgen por deleciones de 4c
CAGGGATGAAA TTTCATCCCTA
! !
-
-i im-m
Exn 1 2 3 4 5
500 bp
Ds9
Ds2d7
Ds2d2
Ds6
FIGURA 21,26 EL elemento/4c tiene cinco exones que codifican
una transposasa; los elementos Ds tienen deleciones internas.
cin de slo 194 bp. En una delecin ms extensa, el
elemento Ds6 conserva la longitud de slo 2 kb, que
representa un kb desde cada extremo de Ac. Un ele-
mento Ds doble complejo tiene una secuencia Ds6
insertada en orientacin inversa dentro de otra.
Los elementos no autnomos carecen de se-
cuencias internas, pero poseen las repeticiones ter-
minales invertidas (y quiz otras caractersticas de
secuencia). Los elementos no autnomos se derivan
de elementos autnomos por deleciones (u otros
cambios) que desactivan la transposasa que acta
en configuracin trans, pero dejan intactos los sitios
21.12 Los elementos de control forman familias de transposones
(incluidos los extremos) donde acta la transposasa.
Sus estructuras varan de mutaciones menores (pero
inactivantes) de Ac hasta secuencias que presentan
deleciones mayores o reestructuraciones.
En el otro extremo, los miembros de la familia
Dsl incluyen secuencias cortas cuya nica relacin
con Ac radica en que poseen repeticiones termi-
nales invertidas. Los elementos de esa clase no
necesitan derivarse de manera directa de Ac, pero
pudiesen hacerlo por cualquier suceso que genere
repeticiones invertidas. Su existencia sugiere que la
transposasa reconoce slo las repeticiones invertidas
terminales o tal vez las repeticiones terminales en
conjuncin con alguna secuencia interna corta.
La transposicin de Ac/Ds ocurre por un meca-
nismo no replicativo y se acompaa de su desapari-
cin en la localizacin del donador. El anlisis clonal
sugiere que la transposicin de Ac/Ds casi siempre
ocurre poco despus de que el elemento donador se
ha replicado. Estas caractersticas se asemejan a la
transposicin del elemento bacteriano TnlO (vase
la seccin 21.10, La transposicin de Tnl 0 tiene ml-
tiples controles). La causa es la misma; la transposi-
cin no tiene lugar cuando el DNA del transposn
est metilado en ambas cadenas (el estado habitual
antes de la metilacin), y se activa cuando el DNA es
hemimetilado (el estado habitual en cuanto termina
la replicacin). El sitio receptor con frecuencia est
en el mismo cromosoma que el sitio donador, y a
menudo bastante cerca.
La replicacin genera dos copias de un donador
potencial Ac/Ds, pero por lo general slo una copia
en realidad presenta transposicin Qu pasa con
el sitio donador? Las reestructuraciones que se en-
cuentran en sitios desde los que se han perdido ele-
mentos de control podran explicarse en trminos
de las consecuencias de una rotura cromosmica,
como se ilustr antes en la Figura 21.23.
Los elementos autnomos y no autnomos, es-
tn sujetos a una variedad de cambios en su condi-
cin. Algunos de estos cambios son genticos; otros,
epigenticos.
El principal cambio es (por supuesto) la conver-
sin de un elemento autnomo a uno no autno-
mo, pero pueden ocurrir otros cambios en ios ele-
mentos no autnomos. Los defectos de la actuacin
en configuracin cis pueden hacer a un elemento
no autnomo impermeable a los elementos aut-
nomos. As, un elemento no autnomo puede vol-
verse estable de manera permanente porque ya no
puede ser activado para efectuar la transposicin.
Los elementos autnomos estn sujetos a "cam-
bios de fase" que son alteraciones hereditarias, pero
tambin relativamente inestables, de sus propieda-
des. Adoptan la forma de una desactivacin rever-
sible donde un elemento oscila entre estados acth
e inactivo durante el desarrollo de la planta.
Los cambios de fase en los tipos Ac y Mu
elemento autnomo son resultado de cambios en
metilacin del DNA. Las comparaciones de las su
ceptibilidades de los elementos activos e inartiv
a las enzimas de restriccin sugieren que la forn
inactiva del elemento es metilada en la secuenCn
diana . Hay varios sitios diana de cada elemen
y no se sabe cules controlan el efecto. En el ca
de MuDR, la desmetilacin de las repeticiones te
mnales aumenta la expresin de la transposasa.
que sugiere que el efecto pudiese ser mediado por
control del promotor para el gen de la transposa?
Sera conveniente saber qu controla la metilaci':
y desmetilacin de los elementos.
El efecto de la metilacin es en general com"
entre los transposones de las plantas. La mejor c-
mostracin del efecto de la metilacin sobre la aC-
vidad proviene de las observaciones hechas cor
mutante ddml de Arabidopsis que causa una prd:
de metilacin en la heterocromatina. Entre las di
as que pierden grupos metilo est una familia <
transposones relacionados con MuDR. El anlh
directo de las secuencias genmicas muestra cr
la desmetilacin causa sucesos de transposicin. L
metilacin tal vez es el principal mecanismo uti
zado para impedir que los transposones daen
genoma por transposicin muy frecuentes.
Puede haber controles autorregulados e
transposicin, anlogos a los efectos de la inmur:
dad mostrados por los transposones bacterianos. Q
aumento del nmero de elementos Ac en el genoffl
disminuye la frecuencia de la transposicin. El tV
ment Ac puede codificar un represor de la transp
sicin; es posible que la actividad la realice la mis::
protena que provee la funcin de transposasa.
Los elementos Sprn influyen
en La expresin gnica
Conceptos principales
"
Los elementos Spm afectan la expresin gnica en st
sitios de insercin, cuando la protena TnpA se une e
sus sitios diana en los extremos de los transposones.
*
Los elementos Spm se desactivan por metilacin.
Los elementos autnomos Spm y En son casi icif:
ticos; difieren en menos de 10 posiciones. En k
GURA 21.2"se resume su estructura
. Las repetidc -
terminales invertidas de 13 bp son indispensa
'
i
para la transposicin, segn indica el fenotipo ;
transposicin defectuosa de deleciones en los-
542 CAPTULO 21 Transposones
tremos. Los transposones relacionados con Spm
se encuentran en otras plantas y se definen como
miembros de la misma familia por su organizacin
semejante, en trminos generales. Todos comparten
repeticiones terminales invertidas casi idnticas y
generan duplicaciones de 3 bp del DNA diana con
la transposicin. Nombrados por sus similitudes
terminales, se conocen como el grupo CACTA de
transposones.
Se transcribe una secuencia de 8 300 bp a partir
de un promotor en el extremo izquierdo del ele-
mento. Los 11 exones contenidos en el producto
de transcripcin se escinden en un mensajero de
2500 bases. El RNAm codifica una protena de 621
aminocidos. El gen se denomina tnpA y la protena
se une a una secuencia de consenso de 12 bp, pre-
sente en mltiples copias en las regiones terminales
del elemento. Se requiere la funcin de tnpA para la
escisin, pero en ocasiones no es suficiente.
Todos los elementos no autnomos de esta fa-
milia (sealados como dSpm para Spm defectuoso)
tienen mucha relacin en su estructura con el ele-
mento Spm mismo. Presentan deleciones que afec-
tan a los exones de tnpA.
Otros dos marcos de lectura abiertos (ORF1 y
ORF2) se localizan dentro del primer intrn largo
de ttipA. Estn contenidos en un RNA de 6000 bases
alternativamente escindido, presente en 1 % de la
concentracin del RNAm de tnpA. La funcin que
contienen los ORF1 y 2 se llama tnpB. Puede pro-
porcionar la protena que se une a las repeticiones
invertidas terminales de 13 bp para escindir los ex-
tremos para transposicin.
Adems del elemento Spm activo por completo,
hay derivados Spm-w que muestran actividad ms
dbil en la transposicin. El ejemplo provisto en la
Figura 21.27 tiene una delecin que elimina tanto a
ORF1 como a ORF2, lo que sugiere que la necesidad
de transposicin de tnpB puede pasarse por alto o
cambiarse.
Las inserciones de Spm pueden controlar la ex-
presin de un gen en el sitio cuando ocurren. Un
locus receptor pudiese quedar bajo control positivo
o negativo. Un locus susceptible de supresin por
Spm presenta inhibicin de la expresin. Un locus
dependiente de Spm se expresa slo con la ayuda de
Spm. Cuando el elemento insertado es un dSpm, la
supresin de la dependencia responde a la funcin
de accin en configuracin trans provista por un
Spm autnomo. Cul es la base de estos efectos
opuestos?
Un alelo susceptible de supresin dSpm contie-
ne una insercin de dSpm dentro de un exn del
gen. Esa estructura hace surgir la pregunta inme-
diata, cmo un gen con una insercin dSpm en un
exn puede llegar a expresarse? La secuencia dSpm
Los elementos dSpm tienen deleciones de Spm
TTTTCTTGTAG
ORF1 O
Exn 1 23 4 5 67891011
-
Transcripcin >
1 kb
Spm-w-8011
dSpm-7995
dSpm-7997B
dSpm-8004
FIGURA 21,27 lSpm/En tiene dos genes. El tnpA consta de 11
exones que se transcriben en un RNAm de 2 500 bases, con corte
y empalme. El tnpB puede constar de un RNAm de 6 000 bases
que contiene 0RF1 + 0RF2.
puede escindirse del producto de transcripcin por
el uso de secuencias en sus extremos. El suceso de
escisin puede dejar un cambio en la secuencia del
RNAm que explica as un cambio en las propiedades
de la protena que codifica. Se ha descubierto una
capacidad similar de escisin a partir de un producto
de transcripcin para algunas inserciones de Ds.
El tnpA provee la funcin supresora por la que
en un principio se nombr al elemento Spm. La pre-
sencia de un elemento defectuoso puede disminuir-
la expresin de un gen donde reside, pero no elimi-
narla. La introduccin de un elemento autnomo
que posea un gen tnpA funcional, no obstante, pue-
de suprimir por completo la expresin del gen diana.
La supresin es causada por la capacidad de tnpA de
unirse a sus sitios diana en el elemento defectuoso,
que bloquea el avance de la transcripcin.
Un alelo dependiente de dSpm contiene una in-
sercin cerca de un gen, pero no en su interior. La
insercin parece proveer un potenciador que activa
al promotor del gen en el locus receptor.
La supresin y dependencia de elementos en
dSpm parecen estar sujetas a la misma interaccin
entre el producto de actividad en configuracin
trans del gen tnpA del elemento autnomo de Spm
y los sitios de accin en configuracin cis en los ex-
tremos del elemento. As, una interaccin simple
entre la protena y los extremos del elemento supri-
me o activa un locus diana, dependiendo de que el
elemento se localice en sentido ascendente o dentro
del gen receptor.
Los elementos Spm se encuentran en una va-
riedad de estados, que van desde actividad completa
hasta crpticos. Un elemento crptico es silente y no
presenta transposicin por s mismo ni activa los
elementos dSpm. Un elemento crptico puede reac-
21.13 Los elementos Spm influyen en la expresin gnica
543
tivarse de manera transitoria o convertirse al estado
activo por la interaccin con un elemento Spm por
completo activo. La desactivacin es causada por
metilacin de secuencias en la vecindad del punto
de inicio de la transcripcin. La naturaleza de los
sucesos que se encargan de la desactivacin de un
elemento por metilacin nueva o de la activacin
por desmetilacin (o porque se evita la metilacin)
no se conoce an.
Intervencin de Los elementos
susceptibles de transposicin
en la disgenesia hbrida
Conceptos principales
.
Los elementos P son transposones que portan las cepas
P de Drosophila melanogaster, no as las cepas M.
Cuando un macho P se cruza con una hembra M se
activa la transposicin.
.
La insercin de elementos P en sitios nuevos en esas
cruzas desactiva muchos genes y las hace infecundas.
Ciertas cepas de D. melanogaster encuentran dificul-
tades en las cruzas. Cuando se cruzan las moscas
de dos de esas cepas, la progenie muestra "rasgos
disgenticos", una serie de defectos que incluye
mutaciones, aberraciones cromosmicas, segrega-
cin distorsionada en la meiosis y esterilidad. La
aparicin de estos defectos correlacionados se llama
disgenesia hbrida.
Se han identificado dos sistemas encargados de
la disgenesia hbrida en D. melanogaster. En el prime-
ro, las moscas se dividen en los tipos I (inductor) y R
(reactivo). La fecundidad disminuida se observa en
cruzas de machos I con hembras R, pero no en sen-
Las cruzas de machos P por hembras
M son infecundas
Macho Hembra Macto Hentora
P M M
i i
El hbrido parece
normal pero es
estri
NDHAtPROGENIE
FIGURA 21.28 La disgenesia hbrida es asimtrica; es induci-
da por cruzas de machos P con hembras M, pero no por la de
machos M con hembras P.
tido opuesto. En el segundo sistema las moscsis
dividen en los dos tipos, P (de contribucin patetnali
y M (de contribucin materna). En la FIGURA
se ilustra la asimetra del sistema; una cruza er -
an macho P y una hembra M causa disgenesia,
la cruza inversa no lo hace.
La disgenesia es sobre todo un fenmeno dd
clulas germinativas. En las cruzas que involucra
el sistema P-M, las moscas hbridas Fl tienen teja-
dos somticos normales. No obstante, sus gnsdas
no se desarrollan. El defecto morfolgico sobre
desarrollo de los gametos data de la etapa en la c - -=
comienzan las divisiones celulares rpidas en la
nea germinal.
Cualquiera de los cromosomas de un macho P
puede inducir la disgenesia en una cruza con yr
hembra M. La construccin de cromosomas recom-
binantes muestra que varias regiones dentro de cada
cromosoma P pueden causar disgenesia, lo que
giere que un macho P tiene secuencias en muchas
localizaciones cromosmicas diversas que pu(k
inducir disgenesia. Las localizaciones difieren ennr
cepas P individuales. Las secuencias P especficas i
tn ausentes de los cromosomas de las moscas .M-
La naturaleza de las secuencias especficas Pa
identific primero por mapeo del DNA de mutar v
w encontradas entre los hbridos disgenticos. To-
das la mutaciones son resultado de la insercin
DNA en el locus w. (La insercin desactiva el gen
y da origen al fenotipo de ojos blancos por el q. :
recibe su nombre el locus.) La secuencia inser?
se denomina eletento P.
Las inserciones del elemento P forman un s*
tema de transposicin clsico. Los elementos in!--
viduales varan en longitud, pero tienen secuenfi
homloga. Todos los elementos P poseen repetic:
nes terminales invertidas de 31 bp y generan TT-
peticiones directas del DNA diana de 8 bp coa I*
transposicin. Los elementos P ms largos tienen
-
2
.9 kb de longitud y presentan ruatro marcos .
lecturas abiertos. Los elementos ms cortos suret-
al parecer con bastante frecuencia, por delecior.:
internas de un factor P de longitud total. Al meflc*
algunos de los elementos P ms cortos han pefi-
do la capacidad de producir la transposasa, perc I
probable que los active la enzima codificada por v
elemento P completo en configuracin trans.
Una cepa P porta de 30 a 50 copias del eleme-
P
, casi 33% de ellas de longitud completa. Los c-k--
mentos estn ausentes de las cepas M. En una ce'-; -
P
, se portan los elementos como componentes iner-
tes del genoma, pero se activan para la transposicj1. -
cuando un macho P se cruza con una hembra M
Los cromosomas de las moscas hbridas disger -
ticas P-Mtienen elementos P insertados en muchos
sitios nuevos. Las inserciones desactivan a los geno
544 CAPTULO 21 Transposones
donde se localizan y a menudo causan roturas cro-
mosmicas. El resultado de la transposicin es, por
tanto, desactivar al genoma.
BEB Los elementos P se activan
en La Lnea germinaL
Conceptos principales
Los elementos P se activan en La lnea germinal de
-cruzas de machos P con hembras M porque un episodio
de corte y empalme especfico de tejido retira un
intrn que genera la secuencia de codificacin de la
transposasa.
El elemento P tambin produce un represor de la
transposicin, que se hereda por va materna en el
citoplasma.
La presencia del represor explica por qu las cruzas de
machos M con hembras P se mantienen fecundas.
La activacin de los elementos P es especfica de teji-
do; ocurre slo en la lnea germinativa. No obstante,
los elementos P se transcriben tanto en la lnea ger-
lininal como en tejidos somticos. La especificidad
stica es conferida por un cambio en el patrn de
corte y empalme.
En la FIGURA 21.29 se muestra la organizacin
del elemento y sus productos de transcripcin. El
:producto de transcripcin primaria se extiende 2.5
'
kb o 3.0 kb; la diferencia tal vez refleje slo la sus-
ceptibilidad de escurrimiento del sitio de termina-
cin. Puede haber dos productos protenicos:
.
En tejidos somticos slo se escinden los
primeros dos intrones, lo que crea una re-
gin de codificacin de ORF0-ORF1-ORF2.
La traduccin de este RNA da lugar a una
protena de 66 kD, que corresponde a un
represor de la actividad del transposn.
.
En tejidos de la lnea germinal tiene lugar
otro episodio de corte y empalme que retira
el intrn 3. Esto conecta los cuatro marcos
de lectura abiertos en un RNAm que se tra-
duce para generar una protena de 87 kD,
que es la transposasa.
Dos tipos de experimento han demostrado que es
pjecesario el corte y empalme del tercer intrn para
la transposicin. Primero, si las uniones de corte y
empalme se mutan in vitro y el elemento P se rein-
ftroduce a las moscas, su actividad de transposicin
Be elimina. En segundo trmino, si el tercer intrn
[presenta delecin, de modo que ORF3 se incluya
Be manera constitutiva en el RNAm de todos los
ejidos, ocurre transposicin en tejidos somticos,
s como en la lnea germinal. Por tanto, siempre
ijue ORF3 es objeto de corte y empalme al marco
Me lectura anterior, el elemento P se activa. ste es
El corte y empalme del elemento
P es especif i
Intrn 1 Intrn 2 Intrn 3
Elemento P ORFS ORF11 ORF2 ORF3 4
i Transcripcin
RNA corto
RNA largo
Permanece el
intrn 3
RNAm
somtico Marco de lectura' -
Represor de 66 kD
Lnea
germinativa ., , , ,
RNAm
-Marco de lectura-
Transposasa de 87 kD
9 El elemento P tiene cuatro exones; los primeros
tres se cortan y empalman juntos en la expresin somtica;
los cuatro se cortan y empalman juntos en la expresin de la
lnea germinal.
un suceso regulador crucial y suele presentarse slo
en la lnea germinal.
Qu se encarga del corte y empalme especfi-
cos de tejido? Las clulas somticas contienen una
protena que se une a la secuencia del exn 3 para
prevenir el corte y empalme del ltimo intrn (va-
se la seccin 26.12, El corte y empalme alternativos
implican el uso diferencial de las uniones de corte
y empalme). La ausencia de esta protena en las
clulas de la lnea germinal permite que el corte y
empalme generen el RNAm que codifica la trans-
posasa.
La transposicin de un elemento P requiere
~
I50 bp de DNA terminal. La transposasa se une a
secuencias de 10 bp que estn cercanas a las repe-
ticiones invertidas de 31 bp. La transposicin ocu-
rre por un mecanismo no replicativo de
"
corte y
pegado
"
que se asemeja al de TnlO. (Contribuye a
una disgenesia hbrida en dos formas: la insercin
del elemento con transposicin en un nuevo sitio
puede causar mutaciones y la rotura que se deja
en el sitio donador [vase la Figura 21.7], tienen
efecto adverso.)
Es interesante que en un porcentaje significa-
tivo de los casos, la rotura en un DNA donador se
repare con el uso de la secuencia del cromosoma
homlogo. Si el homlogo tiene un elemento P, su
presencia en el sitio donador puede restablecerse
(de manera que el episodio simula el resultado de
21.15 Los elementos P se activan en la lnea germinal
545
una transposicin replicativa). Si el homlogo ca-
rece de un elemento P, la reparacin puede generar
una secuencia que carece de dicho elemento, por
lo que al parecer se provee una escisin precisa (un
suceso desusado en otros sistemas susceptibles de
transposicin).
La dependencia de una disgenesia hbrida sobre
la orientacin sexual de una cruza muestra que el
citoplasma es importante, as como los propios fac-
tores P. La contribucin del citoplasma se describe
como citotipo: una lnea de moscas que contienen
elementos P tiene citotipo P, en tanto una lnea de
moscas que carece de elementos P tiene citotipo M.
Ocurre disgenesia hbrida slo cuando los cromo-
somas que contienen factores P se encuentran en
el citotipo M, es decir, cuando el macho progenitor
tiene elementos P y la hembra no.
El citotipo muestra un efecto citoplsmico here-
dable; cuando tiene lugar una cruza entre el citotipo
P (el progenitor femenino tiene elementos P), la
disgenesia hbrida se suprime por varias generacio-
nes de cruzas con progenitores femeninos M. As,
algo en el citotipo P, que se puede diluir despus de
varias generaciones, suprime la disgenesia hbrida.
El efecto del citotipo se explica en trminos mo-
leculares por el modelo de la FIGURA 30. Depende
de la capacidad de la protena de 66 kD de reprimir
Un represor controla los elementos P
Lnea P (cruza de macho P con hembra P)
Cromosomas
del macho
Elemento P
ORF0 ORF2
Cromosomas
de la hembra
Elemento P
Citotipo
Represor
de 66 kD
1 < >
ORF! ORF3
< 66K
El represor
impide la
transposicin
de todos los
elementos P
Cruza de macho P con hembra M
Cromosomas
del macho
Elemento P
Cromosomas
de la hembra
Sin elementos
Citotipo
Ninguno
El elemento P
sintetiza la
transposasa
Y
Disgenesia
hbrida
Cruza de macho M con hembra P
Cromosomas
del macho
Sin elementos
Cromosomas
de la hembra
Elemento P
I ! -
Citotipo
Represor
de 66 kD
66K
El represor
impide la
transposicin
de todos los
elementos P
FIGURA 21.30 Las interacciones entre los elementos P del genoma y un
represor de 66 kD en el citotipo determinan la disgenesia hbrida.
la transposicin. La protena es provista como un
factor materno en el oocito. En una lnea P de":
haber suficiente protena para impedir la transpo? -
cin, aunque haya elementos P. En cualquier cru::
que involucre a una hembra P, su presencia impic-
la sntesis y actividad de la transposasa. No obstan-
te, cuando el progenitor femenino es de tipo V
no hay represor en el oocito y la introduccin c.
un elemento P del progenitor masculino da cor
-
resultado la actividad de transposasa en la lint:
germinal. La capacidad del citotipo P de ejercer un
efecto por ms de una generacin sugiere que debe
haber suficiente protena represora en el oocito.
con la suficiente estabilidad, para pasar a travs Cr
adulto y estar presente en los oocitos de la siguienl
generacin.
Las cepas de D. melanogaster descendientes :
moscas atrapadas en estado silvestre hace ms de 30
aos son siempre M. Las cepas procedentes de mos-
cas capturadas en los ltimos 10 aos son casi siem -
pre P. Significa esto que la familia de elementos 7
ha invadido poblaciones silvestres de D. melanogastt
en aos recientes? Los elementos P son, de hecho.
muy invasores cuando se introducen en una nueva
poblacin; la fuente del elemento invasor tendn;
que haber sido otra especie.
La disgenesia hbrida disminuye las cruzas, p: ;
lo que constituye un paso en la va hacia la especia-
cin. Supngase que se crea un sistema disgentic:
por un elemento susceptible de transposicin en al-
guna localizacin geogrfica. Otro elemento puect
crear un sistema diferente en alguna otra localiza-
cin. Las moscas en las dos reas seran disgenticas
para los dos sistemas (o quiz ms). Si esto las ha
estriles entre ellas y las poblaciones se aislan er
trminos genticos, puede ocurrir una separacin
adicional. Mltiples sistemas disgenticos, por ta--
to, conducen a la imposibilidad de apareamiento, y
a la especiacin.
ETWfl Resumen
Las clulas procariticas y eucariticas contienen ur |
variedad de transposones que se desplazan cuandc;
mueven o copian secuencias de DNA. El transpose
-
puede identificarse slo como una entidad dentro
del genoma; su movilidad no implica una forna
independiente. El transposn pudiese ser de DN.-_
egosta, interesado slo en la perpetuacin propia
dentro del genoma residente; si confiere cualquier
ventaja selectiva sobre el genoma, sta ser indirecta
Todos los transposones tienen sistemas que limitar
la extensin de la transposicin porque cuando es
irrefrenable parece ser lesiva, pero los mecanismos
moleculares son diferentes en cada caso.
546 CAPTULO 21 Transposones
El arquetipo de transposn tiene repeticio-
nes invertidas en los extremos y genera repeticiones
directas de una secuencia corta en el sitio de inser-
cin. Los tipos ms sencillos son las secuencias de
insercin (IS) bacterianas, que constan en esencia
de las repeticiones terminales invertidas en los
flancos y un marco de codicacin cuyo producto
proporciona actividad de transposicin. Los trans-
posones compuestos tienen mdulos terminales que
constan de elementos IS; uno o ambos mdulos IS
ofrecen actividad de transposasa y las secuencias
entre ellos (que a menudo portan resistencia a los
antibiticos) se tratan como pasajeros.
La generacin de repeticiones diana en los flan-
cos de un transposn refleja una caracterstica fre-
cuente de la transposicin. El sitio diana es escindi-
do en puntos escalonados de cada cadena de DNA
por una distancia fija (a menudo cinco o nueve pa-
res de bases). El transposn es en efecto insertado
entre los extremos de cadena nica prominentes
generados por los cortes escalonados. Las repeticio-
nes diana se generan por el llenado de regiones de
cadena nica.
Los elementos IS, los transposones compuestos
y los elementos P se desplazan por transposicin no
replicativa, donde el elemento se mueve de manera
directa de un sitio donador a un sitio receptor. Una
enzima transposasa nica cataliza la reaccin. Ocu-
rre por un mecanismo de "corte y pegado", donde
el transposn se separa del DNA en los flancos. La
escisin de los extremos del transposn, las hendi-
duras en el sitio diana y la conexin de los extremos
del transposn a las hendiduras escalonadas, tienen
lugar todos en un complejo nucleoprotenico que
contiene a la transposasa. La prdida del transposn
del donador crea una rotura de doble cadena cuyo
destino no es claro. En el caso de TnlO, la transposi-
cin es posible en cuanto concluye la replicacin del
DNA, cuando los sitios reconocidos por el sistema de
mediacin dam son hemimetilados de manera tran-
sitoria. Esto exige la existencia de dos copias del sitio
donador, que tal vez aumenten las posibilidades de
supervivencia de la clula.
La familia de transposones TnA se moviliza por
transposicin replicativa. Despus de que el trans-
posn en el sitio donador se conecta con el sitio dia-
na, la replicacin genera una molcula cointegrada
que tiene dos copias del transposn. Una reaccin
de resolucin, que comprende la recombinacin
entre dos sitios particulares, libera entonces las dos
copias del transposn, de manera que una se man-
tiene en el sitio donador y otra aparece en el sitio
diana. Se requieren dos enzimas codificadas por el
transposn: la transposasa reconoce los extremos
del transposn y los conecta al sitio diana, y la re-
solvasa proporciona una funcin de recombinacin
especfica de sitio.
El fago Mu experimenta transposicin replica-
tiva por el mismo mecanismo que TnA. Tambin
puede usar su intermediario cointegrado para la
transposicin por un mecanismo no replicativo. La
diferencia entre esta reaccin y la transposicin no
replicativa de elementos IS es que los episodios de
escisin se aparecen en un orden diferente.
Los transposones mejor descritos en plantas son
los elementos de control del maz, que se dividen
en varias familias. Cada familia contiene un solo
tipo de elemento autnomo que es anlogo de los
transposones bacterianos en su capacidad de movi-
lizacin. Una familia tambin contiene muchos ele-
mentos no autnomos diferentes que provienen de
mutaciones (por lo general deleciones del elemento
autnomo). Los elementos no autnomos carecen
de la capacidad de transposicin, pero muestran
actividad de transposicin y otras habilidades del
elemento autnomo cuando est presente uno para
proporcionar las funciones necesarias de accin en
configuracin trans.
Adems de las consecuencias directas de in-
sercin y escisin, es posible que los elementos del
maz tambin controlen las actividades de los genes
en o cerca de los sitios donde se insertan; este con-
trol puede estar sujeto a la regulacin del desarrollo.
Los elementos del maz insertados en genes pudie-
sen extirparse de los productos de transcripcin, lo
que explica porqu no tan slo impiden la activi-
dad gnica. El control de la expresin del gen diana
comprende una variedad de efectos moleculares,
como la activacin al ofrecer un potenciador y la
supresin al interferir en los episodios posteriores
a la transcripcin.
La transposicin de elementos del maz (en
particular Ac) no es replicativa y es probable que
requiera slo una enzima transposasa nica codi-
ficada por el elemento. La transposicin ocurre de
preferencia despus de la replicacin del elemento.
Es posible que haya mecanismos que limiten la fre-
cuencia de la transposicin. Las reestructuraciones
ventajosas del genoma del maz pudiesen haberse
conectado con la presencia de los elementos.
Los elementos P en D. melanogaster se encargan
de la disgenesia hbrida, que tal vez sea el precur-
sor de la especiacin. Una cruza entre un macho
que porta el elemento P y una hembra que carece
de l genera hbridos estriles. Un elemento P tie-
ne cuatro marcos de lectura abiertos
, separados por
intrones. El corte y empalme de los tres primeros
ORE genera un represor de 66 kD y se presenta en
todas las clulas. El corte y empalme de los cuatro
ORF para generar la transposasa de 87 kD ocurre
21.16 Resumen 547
slo en la lnea germinal por un episodio de corte
y empalme especfico de tejido. Los elementos P se
desplazan cuando estn expuestos al citoplasma que
carece del represor. El brote de sucesos de transposi-
cin desactiva al genoma mediante inserciones alea-
torias. Slo un elemento P completo puede generar
la transposasa, pero la enzima puede movilizar los
elementos defectuosos en configuracin trans.
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Referencias 549
similar
melanogast
direct
genoma
s
R
Retrovirus y retroposones
ESQUEMA DEL CAPTULO
tfMM Introduccin
WSSM El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos
similares a la transposicin
.
Un retrovirus tiene dos copias de su genoma de RNA de
cadena nica.
.
Un provirus integrado es una secuencia de DNA de cadena
doble.
.
Un retrovirus genera un provirus mediante transcripcin
inversa del genoma retrovrico.
Los genes retrovricos codifican poliprotenas
.
Un retrovirus caracterstico tiene tres genes: gag, pol y env.
.
Las protenas Gag y Pol se traducen a partir de un producto
de transcripcin de longitud completa del genoma.
.
La traduccin de Pol requiere un cambio de marco por el
ribosoma.
.
Env se traduce a partir de un RNAm individual que se
genera por fragmentacin.
.
Cada uno de los tres productos protenicos es procesado
por proteasas para dar origen a mltiples protenas.
El DNA vrico se genera por transcripcin inversa
.
Se repite una secuencia corta (R) en cada extremo del RNA
vrico, de manera que los extremos 5
'
y 3' corresponden a
R
-U5 y U3-R, respectivamente.
.
La transcrptasa inversa inicia la sntesis cuando un RNAt
cebador se une a un sitio distante de 100 a 200 bases del
extremo 5
'
.
.
Cuando la enzima alcanza el extremo, las bases 5'
terminales del RNA se fragmentan, lo que expone el
extremo 3
'
del producto DNA.
.
Los pares de bases expuestos del extremo 3' se aparean con
el extremo 3
'
de otro genoma de RNA.
.
La sntesis contina y genera un producto donde las
regiones 5
'
y 3' se repiten, lo que da a cada extremo la
estructura U3-R-U5.
.
Ocurren episodios similares de cambio de cadenas cuando
la transcrptasa inversa utiliza el producto DNA para
generar una cadena complementaria.
.
El cambio de cadenas es un ejemplo del mecanismo de
seleccin de copias de la recombinacin.
v*M!* El DNA vrico se integra al cromosoma
.
La organizacin del DNA provirico en un cromosoma
es la misma que en un transoosn, donde el provirus
es flanqueado por repeticiones directas cortas de una
secuencia en el sitio diana.
.
El DNA lineal se inserta en forma directa en el cromosoma
del hospedador gracias a la accin de la enzima integrasa
retrovrica.
.
Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extre
la secuencia retrovrica durante la reaccin de nteg
Los retrovirus pueden hacer transduccin de
secuencias celulares
.
Los retrovirus en proceso de transformacin se gene
un suceso de recombinacin donde una secuencia di
celular sustituye a una parte del RNA retrovrico.
Los elementos Ty de las levaduras se asemej
los retrovirus
.
Los transposones )y tienen una organizacin simlai
los retrovirus endgenos.
.
Los transposones Ty son retroposones con actividad
transcrptasa inversa que realizan transposicin a tr
un intermediario de RNA.
Muchos elementos susceptibles de transposi
residen en Drosophila meanogaster
.
Copia es un retroposn abundante en D. melonogast
Los retroposones son de tres clases
.
Los retroposones de la superfamilia vrica son trans
que se desplazan a travs de un RNA que no constit
partcula infecciosa.
.
Algunos retroposones se asemejan de manera direct
retrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tiene
.
Se pueden encontrar otros elementos que fueron ge
por un episodio de transposicin mediada por RNA,
por si mismos no codifican enzimas que puedan cat
transposicin.
.
Los transposones y retroposones constituyen casi la
del genoma humano.
La familia Alu tiene muchos miembros
muy dispersos
.
Una parte importante del DNA repetitivo en genoma
mamfero est constituida por repeticiones de una s
familia, organizadas como transposones y derivadas
productos de transcripcin de la polimerasa III de R
Los seudogenes procesados se originaron co
sustratos para la transposicin
.
Un seudogn procesado se deriva de una secuencia
RNAm por transcripcin inversa.
Las LINES utilizan una endonucleasa para gf
un extremo con actividad cebadora
.
Las LINES no tienen LTR y para cebar la transcripci
inversa requieren que el retroposn codifique una
endonucleasa que genere una hendidura.
Resumen
550
EHEI Introduccin
La transposicin que comprende un intermediario
obligatorio de RNA es una propiedad exclusiva de
las eucariotas y proviene de la capacidad de los re-
trovirus de insertar copias de DNA (provirus) de
un genoma vrico RNA en los cromosomas de una
clula hospedadora. Algunos transposones eucari-
ticos se relacionan con provirus retrovricos en su
organizacin general y experimentan transposicin
a travs de intermediarios de RNA. Como clase, es-
tos elementos se llaman retroposones (o a veces
retrotransposones).
Los retroposones ms sencillos no tienen acti-
vidad de transposicin, pero presentan secuencias
que los elementos activos reconocen como sustratos
para la transposicin. Por lo tanto, los elementos
que usan una transposicin independiente de RNA
van desde los retrovirus mismos (que tienen capa-
cidad para infectar con libertad clulas hospedado-
ras), hasta secuencias con transposicin a travs de
RNA, y hasta aquellos que por s mismos no tienen
la capacidad de transposicin. Comparten con todos
los txansposones la caracterstica diagnstica de ge-
nerar repeticiones cortas directas de DNA diana en
el sitio de una insercin.
Incluso en genomas donde no se han detecta-
do los transposones activos se encuentran vestigios
de episodios antiguos de transposicin en forma de
repeticiones diana directas que flanquean secuen-
cias repetitivas dispersas. Las caractersticas de estas
secuencias a veces comprenden una secuencia de
RNA corno progenitora de la secuencia geonmica
i DNA), lo que sugiere que el RNA debe haberse
convertido en una copia de DNA dplex que se in-
sert en el genoma por un suceso similar a la trans-
posicin.
Como cualquier otro ciclo de reproduccin, el
de un retrovirus o retroposn es continuo; es arbi-
trario considerar como "inicio
"
el punto donde se
interrumpe. No obstante, la manera de ver estos
elementos es parcial, por la forma en que suelen
observarse (FIGURA 22.1).
Los retrovirus se consideraron primero part-
culas vricas infecciosas capaces de realizar trans-
misin entre clulas y por ello se cree que el ciclo
intracelular (que comprende un DNA dplex) es
un medio de reproduccin de virus RNA. Los re-
troposones se descubrieron como componentes del
genoma, y las formas de RNA se han definido en su
mayor parte por sus funciones como RNAm. As,
los autores consideran a los retroposones como se-
cuencias genmicas (de DNA dplex) que pueden
realizar transposicin dentro de un genoma; no mi-
gran entre clulas.
EL ciclo vital de los retrovirus
comprende sucesos similares
a la transposicin
Conceptos principales
.
Un retrovirus tiene dos copias de su genoma de RNA de
cadena nica.
.
Un provirus integrado es una secuencia de DNA de
cadena doble.
.
Un retrovirus genera un provirus mediante transcripcin
inversa del genoma retrovrico.
Los retrovirus tienen genomas de RNA de cadena
nica que se replican gracias a un intermediario de
DNA de doble cadena. El ciclo vital de un virus com-
prende una etapa obligatoria en la que se inserta
DNA de doble cadena en el genoma del hospedador
por un episodio similar a la transposicin y que ge-
nera repeticiones directas cortas de DNA diana.
La importancia de esta reaccin rebasa la per-
petuacin del virus. Algunas de sus consecuencias
son que:
.
Una secuencia retrovrica integrada en la
lnea germinativa se mantiene dentro del
genoma celular como provirus endgeno.
Al igual que un bacterifago lisognico, un
provirus acta como parte del material ge-
ntico del organismo.
FIGURA 22.1. En los ciclos reproductivos de los retrovirus y los
retroposones se alterna la transcripcin inversa de RNA a DNA
con la transcripcin de DNA a RNA. Slo los retrovirus pueden
generar partculas infectantes. Los retroposones se confinan a
un ciclo intracelular.
o los retrovirus existen
l'rlililliHI'l
\/\AV/\/RNA
Provirus '
\/\/\A/\/\/Rna :
l
i
INTRACELULAR '
m
m
EXTRACELULAR
Retrovirus
22.2 El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transposicin
RNAX/VX/X/X/X/X/X/' VV
I Transcripcin
| inversa
LTR LTR
DNA lineal Ql\/7V/\/\A/\
Integracin
Provirus \/X3aJAJ7\/A/\/P>JAMfA//
Transcripcin
RNAx/x/x/x/x/xy-v/x/x/x/v
FIGURA 22.2 El ciclo vital retrovtrico procede por transcrip-
cin inversa del genoma del RNA en DNA dplex, que se inserta
en el genoma del hospedador para ser transcrito en RNA.
.
En ocasiones se recombinan secuencias ce-
lulares con la secuencia retrovrica y des-
pus se transportan juntas; estas secuencias
pueden insertarse en el genoma como se-
cuencias dplex en nuevas localizaciones.
.
Las secuencias celulares que experimen-
tan transposicin por un retrovirus pueden
cambiar las propieciades de una clula cuan-
do se infecta con el virus.
Las particularidades del ciclo de vida de los re-
trovirus se ilustran en la FIGURA 22.2. Los pasos cru-
ciales son que el RNA vrico se convierte en DNA,
el DNA se integra al genoma del hospedador, y des-
pus, el provirus de DNA de transcribe en RNA.
La enzima encargada de generar la copia inicial
de DNA a partir del RNA es la transcriptasa in-
versa. La enzima convierte el RNA en una cadena
dplex lineal de DNA en el citoplasma de la clula
infectada. El DNA tambin se convierte en formas
circulares, pero stas no parecen involucradas en
la replicacin.
El DNA lineal se abre camino hacia el ncleo.
Una o ms copias de DNA se integran al genoma del
hospedador. Una sola enzima, llamada integrasa,
se encarga de la integracin. El provirus es transcri-
to por la maquinaria del hospedador para producir
RNA vrico, que sirve como RNAm y como geno-
mas para empaquetamiento dentro de viriones. La
integracin es una parte normal del ciclo vital, in-
dispensable para la transcripcin.
Dos copias del genoma RNA se empaquetan en
cada virin, lo que hace a la partcula vrica indi-
vidual eficazmente diploide. Cuando una clula es
infectada de manera simultnea por dos virus dife-
rentes, pero relacionados, es posible que genere par-
tculas vricas heterocigotas que portan un genoir.:
de cada tipo. La diploida puede ser importante para
permitir al virus adquirir secuencias celulares. Las
enzimas transcriptasa inversa e integrasa se trans-
portan con el genoma dentro de la partcula vrica
EEfl Los genes retrovricos
codifican poliprotenas
Conceptos principales
.
Un retrovirus caracterstico tiene tres genes: gag, po/y
env.
.
Las protenas Gag y Pol se traducen a partir de un
producto de transcripcin de longitud completa del
genoma.
.
La traduccin de Pol requiere un cambio de marco por
el ribosoma.
.
Env se traduce a partir de un RNAm individual que se
genera por fragmentacin.
.
Cada uno de los tres productos protenicos es
procesado por proteasas para dar origen a protenas
mltiples.
Una secuencia retrovrica usual contiene tres o cua-
tro "genes". (En este contexto el trmino genes st
usa para identificar regiones codificantes, cada um
de las cuales en realidad da origen a mltiples pro-
tenas por reacciones de procesamiento.) Un geno-
ma retrovrico habitual con tres genes se organiza
en la secuencia gag-pol-env, como se indica en la
FIGURA 22.3.
El RNAm retrovrico tiene una estructura con-
vencional; presenta una cubierta en el extremo 5
'
y
est poliadenilado en el extremo 3
'
. Se representa
en dos RNAm. Se traduce la longitud total de RNAr-
para dar lugar a las poliprotenas Gag y Pol. El pro-
ducto Gag se traduce mediante la lectura desde e
codn de iniciacin hasta el primer codn de ter-
minacin. Este ltimo debe ser pasado por alto para
que Pol se exprese.
Diferentes virus utilizan mecanismos diverso?
para avanzar y dejar atrs al codn de terminacin
gag, conforme a la relacin entre los marcos de
lectura gag y pol. Cuando gag y pol se continan, la
supresin por un glutamil-RNAt que reconoce ei
codn de terminacin permite la generacin de una
sola protena. Cuando gag y pol estn en diferente
marcos de lectura, tiene lugar un cambio de maro
ribosmico que genera una sola protena. Por lo ge-
neral, la lectura completa es -5% eficaz, de manera
que la protena Gag supera por casi 20 tantos a la
protena Gag-Pol.
552
CAPTULO 22 Retrovirus y retroposones
Los genes retrovircos se procesan para producir muchas protenas
10-80
80-100
U5 gag
-2000
Traduccin
Procesamiento I
Genoma vrico
170-1260
pol
-2900
W** U3
-1800
El empalme produce
RNA subgenmico
Traduccin
1
Supresin o cambio
de marco en el
extremo de gag
Procesamiento
Procesamiento
I
Cada gen genera varios productos profenicos
q MA = matriz (entre la nucleocpside y la envoltura vrica) a
CA = cpside (principal componente estructural)
NC = nucleocpside (que empaqueta el dmero de RNA)
PR = proteasa (escinde Gag-Pol y Env)
RT = transcriptasa inversa (sintetiza DNA)
IN = integrasa (integra el provirus DNA al genoma)
Env su = proteina de superficie (las espigas sobre el virin
interactan con el hospedador)
TM = transmembrana (media la fusin virus-hospedador)
FIGURA 22.3 Los genes de los retrovirus se expresan como poli protenas, que son procesadas hacia
productos individuales.
El VIH presenta gemacin a partir
de la membrana
La poliprotena Env se expresa por otros me-
dios: el empalme genera un mensajero subgenmico.
ms corto, que se traduce en el producto Env.
El gen gag da origen a los componentes prote-
nicos del centro nucleoprotenico del virin. El gen
pol codifica funciones encargadas de la sntesis y re-
combinacin de cidos nucleicos. El gen 7V codifica
componentes de la envoltura de la partcula, que
tambin secuestra componentes de la membrana
citoplsmica de la clula.
Los productos Gag, Gag-Pol y Env son polipro-
tenas fragmentadas por una proteasa para liberar
las protenas individuales que se encuentran en los
viriones maduros. La actividad de proteasa es co-
dificada por el virus en diversas formas: puede ser
parte de Gag o Pol y a veces adquiere la forma de un
marco de lectura independiente adicional.
La produccin de una partcula retrovrica com-
prende el empaquetamiento del RNA en el centro,
su rodeo por protenas de la cpside y la extraccin
por presin de un segmento de membrana de la
clula del hospedador. En la FIGURA 22. se muestra
la liberacin de partculas infecciosas por ese me-
dio. El proceso se revierte durante la infeccin: un
virus infecta una nueva clula al fusionarse con su
membrana plasmtica y luego liberar el contenido
del virin.
1. Se inicia la gemacin
2. La gema presenta
elongac
3. Se libera el virus 4. El virus madura
0
.1 |jm
FIGURA 22.-. Los retrovirus (VIH) experimentan gemacin des-
de la membrana plasmtica de una clula infectada. Fotos por
cortesa de Matthew A. Gonda, Ph.D., Chief Executive Officer,
International Medical Innovations, Inc.
22.3 Los genes retrovricos codifican poliprotenas
553
Los genomas retrovricos existen como secuencias de RNA y DNA
RNA vrico
10-80-RU5 gag pol U3 R-10-80
-2 000 -2 900 -1 800
80-100 170-1260
Forma lineal del DNA vrico
U3 RUS gag pol U3 RUS
1_
!
I i
!
I
LTR LTR
250-1400 bp
Forma de DNA vrico integrado
U3 ha perdido 2 bp US ha perdido 2 bp
Hospedador U3 RUS gag pol US RUS Hospedadot
Repeticin de 4-6 bp Repeticin de 4-6 bp
del DNA diana del DNA diana
FIGURA 22 El RNA retrovrico termina en repeticiones directas (R); el
DNA lineal libre termina en LTR y el provirus concluye en LTR, acortados
cada uno por un par de bases.
rm El DNA vrico se genera
por transcripcin inversa
Conceptos principales
.
Se repite una secuencia corta (R) en cada extremo del
RNA vrico, de manera que los extremos 5' y 3' sean
R
-U5 y U3-R, respectivamente.
.
La transcriptasa inversa inicia la sntesis cuando un
RNAt cebador se une a un sitio distante de 100 a 200
bases del extremo 5'.
.
Cuando la enzima alcanza el extremo, las bases 5'
terminales del RNA se fragmentan, lo que expone el
extremo 3
'
del producto DNA.
.
Los pares de bases expuestos del extremo 3' se aparean
con el extremo 3
'
de otro genoma de RNA.
.
La sntesis contina y genera un producto donde las
regiones 5
'
y 3
'
se repiten, lo que da a cada extremo la
estructura U3-R-U5.
.
Ocurren episodios similares de cambio de cadenas
cuando la transcriptasa inversa utiliza el producto DNA
para generar una cadena complementaria.
.
El cambio de cadenas es un ejemplo del mecanismo de
seleccin de copias de la recombinadn.
Los reirovirus se denominan virus de cadena
positiva porque el propio RNA vrico codifica los
productos protenicos. Como su nombre lo indica,
la transcriptasa inversa se encarga de convertir el
genoma (cadena RNA positiva) en una cadena com-
plementaria de DNA que se denomina cadena de
DNA negativa. La transcriptasa inversa tambin
cataliza etapas posteriores de la produccin del DNA
dplex. Tiene una actividad de polimerasa que
permite sintetizar un DNA dplex a partir del pro-
ducto de transcripcin inversa de una sola cade-
na del RNA. La segunda cadena de DNA en esi
estructura dplex se denomina cadena de DNI
positiva. Como adyuvante indispensable de efu
actividad, la enzima tiene una actividad de RNAa-;
H
, que puede degradar la porcin RNA del hbric
RNA-DNA. Todas las transcriptasas inversas reon
vricas comparten similitudes considerables de la*
secuencias de aminocidos y se pueden reconocer
secuencias homologas en algunos otros retropo
nes.
En la FIGURA 22.5 se comparan las estructuras e
las formas de DNA del virus con el RNA. El RNA
vrico tiene repeticiones directas en sus extremos
Esos segmentos R varan de 10 a 80 nucletidos c-
diferentes cepas de virus. La secuencia del extreme-
5' d
el virus es R-U5 y la secuencia en el extremo ?
es U3-R. Los segmentos R se usan durante la conver-
sin de la forma de RNA a la de DNA para generar
las repeticiones directas ms extensas que se obser-
van en el DNA lineal (FIGURA 22.6 y FIGURA 22.7). 9
acortamiento de 2 bp en cada extremo de la forma
integrada es consecuencia del mecanismo de integra-
cin (vase la Figura 22.9).
Ai igual que con otras polimerasas de DNA. la
transcriptasa inversa requiere un cebador. El ceba-
dor natural es el RNAl. Hay un RNAt del hospeda-
dor, sin carga, en el virin. Se aparea una secuencia
de 18 bases en el extremo 3' del RNAt con las co-
rrespondientes en un sitio que se encuentra a 10C a
200 bases de distancia del extremo 5' de una de la*
molculas de RNA vrico. El RNAt puede tambier.
aparear sus bases con un sitio cercano al extreme
5' d
el otro RNA vrico, lo que ayuda a la formacici
de un dmero entre los RNA vricos.
He aqu un dilema: la transcriptasa inversa ir-
cia la sntesis del DNA en un sitio apenas 100 a 2C:
bases en sentido descendente respecto del extreme
5
'
. Cmo puede generarse el DNA que represente
el genoma intacto de RNA? (sta es una variair.r
extrema del problema general en la replicacin de
los extremos de cualquier cido nucleico lineal; va-
se la seccin 16.2, Los extremos del DNA lineal so-
un problema para la replicacin.)
La sntesis in vitro avanza hasta el final y ge-
nera una secuencia de DNA breve llamada DNA
de detencin fuerte-negativo. Esta molcula no se
encuentra fn vivo porque la sntesis contina por \i
reaccin ilustrada en la Figura 22.6. La transcriptasa
inversa cambia de moldes y se lleva al DNA nadenH
con ella a un nuevo molde. ste es el primero de
dos saltos entre moldes.
En esta reaccin, la regin R en el extremo 5
del molde de RNA es degradada por la activida;
554
CAPTULO 22 Retrovirus y retroposones
La sntesis de ra cadena negativa
requiere transferencia
El retrovirus provee la cadena positiva de RNA
vm
.MMiiiiMiiii.Vgiifli
El RNAt cebador hibridiza al sitio
de unin sobre el RNA *
retrovrico fe
5
frrrtrrrrnrrxi
La transcriptasa inversa inicia la sntesis del DNA
de cadena negativa U_
-
Cadena negativa-
3
'
s' imiiiimiif utum o-
Las enzimas alcanzan el extremo del molde y
generan un DNA fuerte de
detencin negativo .
De detencin .ia?
i
fuerte negativo
3
'
Se degrada la regin 5'
terminal de la cadena
de RNA
JL
5
'
rf"T"1ll"1
T
Nuevo -
extremo
LiutiuiiiiMDHUlI 3'
La regin R de DNA de una sola cadena se aparea
con el extremo 3
'
con otro RNA retrovrico
en el primer salto
Apareamiento
nnnniitiiHmm ffimni
La transcriptasa inversa reanuda la I
sntesis de DNA de cadena negativaT
La transferencia de la cadena positiva
requiere un salto
FIGURA 22.6 Se genera la cadena DNA negativa por medio del
cambio de molde durante la transcripcin inversa.
de RNAasa H de la transcriptasa inversa. Su retiro
permite que la regin R en el extremo 3
'
realice
apareamiento de bases con el DNA recin sintetiza-
do. La transcripcin inversa contina despus por
la regin U3 hacia el cuerpo del RNA.
El origen de la regin R que se aparea con el
DNA de detencin fuerte-negativo puede estar en
el extremo 3
'
de la misma molcula de RNA (apa-
reamiento intramolecular), o el extremo 3
'
de una
molcula diferente de RNA (apareamiento intermo-
lecular). Se usa el cambio a un molde diferente de
RNA en la figura porque hay datos de que la se-
cuencia del RNAt cebador no se hereda en un ciclo
de vida del retroposn. (Si ocurriese apareamiento
intramolecular, se esperara que la secuencia se he-
redara porque ofrecera la nica fuente para la se-
cuencia de unin del cebador en el siguiente ciclo.
El apareamiento intermolecular permite que otro
RNA retrovrico provea esta secuencia.)
3
'
lili
umuiuiimi
5
'
aiHiiiaa
Se retira el RNAt cebador
3
'
Ji
Se degrada el RNA y quedan fragmentos
residuales para cebar la sntesis de DNA
3
'
jpTTTrmjjnrn
Se sintetiza la cadena positiva de
detencin fuerte del DNA
3
'
rrrrrrrrrrjprn
El DNA de cadena positiva se transfiere
al otro extremo de la cadena negativa
en el segundo salto
5
'
TTTTtTTTtTTTITTTT
Concluye la sntesis de la cadena
positiva de DNA
,,,
3' rrrrrrrrrrrfrrrrr
Concluye la sntesis del DNA de
cadena negativa
3 TTTTTTn IIIIIIIII llllllll
5
'111 iminim
5
'
5
'
5'
3
'
5
'
3
'
5
'
3
'
5
'
3
'
LTR-
FIGURA 22, La sntesis de la cadena positiva de DNA requiere
un segundo salto.
El resultado del cambio y la extensin es la adi-
cin de un segmento U3 al extremo 5
'
. El segmen-
to de secuencia U3-R-U5 se denomina repeticin
terminal larga (LTR) porque una serie similar de
episodios aade un segmento U5 al extremo 3
'
y da
lugar a la misma estructura de U5-R-U3. Su longi-
tud vara de 250 a 1 400 bp (vase la Figura 22.5).
Ahora se necesita generar la cadena de DNA
positiva y la LTR en el otro extremo. La reaccin se
muestra en la Figura 22.7. La transcriptasa inversa
ceba la sntesis de la cadena positiva de DNA a par-
tir de un fragmento de RNA que queda despus de
degradar la molcula original de RNA. Se genera
una cadena de DNA de detencin fuerte-positivo
cuando la enzima alcanza el extremo del molde.
Este DNA se transfiere entonces al otro extremo de
una cadena negativa, donde tal vez se libere gracias
a una reaccin de desplazamiento cuando ocurra
una segunda ronda de sntesis de DNA a partir de
un fragmento cebador en ubicacin ms alta (a su
izquierda en la figura). Se hace uso de la regin
R para el apareamiento con el extremo 3' de una
cadena de DNA negativa. Este DNA de doble cade-
na requiere entonces concluir ambas cadenas para
generar una LTR dplex en cada extremo.
22.4 El DNA vrico se genera por transcripcin inversa
555
La transferencia de cadenas causa recombinacion
La transcriptasa inversa
sintetiza la cadena de DNA
La enzima se disocia
del molde
i
'
.
3
'
y n.rnrrrtrrrtmnu
irrtrWr-
1
La enzima se une a
un nuevo molde
5
'
- .
y iiurimnini
Se reinicia la
transcripcin
inversa
3
'
i
3
'
FIGURA 22.8 La recombinacion con seleccin de copias tiene
lugar cuando la transcriptasa inversa libera su molde y reinicia
la sntesis de DNA utilizando uno nuevo. Es probable que la
transferencia entre las cadenas del molde ocurran de manera
directa, pero aqu se muestra en pasos independientes para
ilustrar el proceso.
Cada pancula retrovrica porta dos gen ornas
de RNA. Esto hace posible que ocurra la recombi-
nacion durante un ciclo vital vrico. En principio,
esto pudiese presentarse durante la sntesis de las
cadenas negativa, positiva, o de ambas.
.
El apareamiento intermolecular que se
muestra en la Figura 22.6 permite que ocu-
rra una recombinacin entre secuencias de
los dos moldes sucesivos de RNA cuando
se sintetiza la cadena de DNA negativa. La
recombinacin retrovrica es en su mayor
parte debida a la transferencia de cadenas
en esa etapa, cuando se traslada la cadena
naciente de DNA de un molde de RNA a
otro durante la transcripcin inversa.
.
Se puede sintetizar DNA de cadena positi-
va de manera discontinua en una reaccin
que comprende varias iniciaciones internas.
Puede haber tambin transferencia de ca-
denas durante esta reaccin, pero es menos
frecuente.
La caracterstica comn de ambos episodios es
que la recombinacin es consecuencia de un cambio
de molde durante el acto de la sntesis de DNA. ste
es un ejemplo general de un mecanismo de la re-
combinacin llamado seleccin de copia. Durante
muchos aos se consider como un posible meca-
nismo para la recombinacin en general. Es poct
probable que se emplee en sistemas celulares, per
constituye una base comn para la recombinadee
durante la infeccin por virus RNA, incluso aque-
llos que se replican de manera exclusiva a travs de
formas RNA, como los de la poliomielitis.
El cambio de cadenas ocurre con cierta frecuen-
cia durante cada ciclo de transcripcin inversa, e*
decir, adems de la reaccin de transferencia qu-
es forzada en el final de la cadena del molde. El
principio se ilustra en la FIGURA 22.8, si bien no >t
sabe mucho del mecanismo. Ocurre transcripcin
inversa in vivo en un complejo de ribonudeoprote:-
nas, donde la cadena molde de RNA se une a com-
ponentes del virin, incluida la principal proter;
de la cpside. En el caso del VIH, la adicin de esra
protena (NCp7) a un sistema in vitro causa recombi-
nacin. El efecto es probablemente indirecto: NCp
~
afecta la estructura del molde de RNA, lo que a s -
vez altera la posibilidad de que la transcriptasa in-
versa cambie de una cadena molde a otra.
PTH EL DNA vrico se integra
al cromosoma
Conceptos principales
La organizacin del DNA provrico en un cromosoma es
la misma que en un transposn, donde el provirus es
flanqueado por repeticiones directas cortas de una
secuencia en el sitio diana.
El DNA lineal se inserta en forma directa en ei
cromosoma del hospedador gracias a la accin de la
enzima integrasa retrovrica.
Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extremo
de la secuencia retrovrica durante la reaccin de
integracin.
La organizacin del provirus integrado se asemeja
a la del DNA lineal. Las LTR en cada extremo del
provirus son idnticas. El extremo 3
'
de U5 cons-
ta de una repeticin corta invertida con relacin
al extremo 5
'
de U3, de manera que la LTR misma
termina en repeticiones cortas invertidas. El DNA
provrico integrado es como un transposn: la se-
cuencia provrica termina en repeticiones inverti-
das y flanqueada por repeticiones cortas directas del
DNA diana.
Se genera el provirus cuando se inserta de ma-
nera directa un DNA lineal a un sitio diana. (Ade-
ms del DNA lineal hay formas circulares de las
secuencias vricas.) Una tiene dos secuencias LTR
adyacentes generadas por la unin de los extremos
lineales. La otra tiene slo una LTR, al parecer ge-
nerada por un episodio de recombinacin y que en
realidad constituye la mayor parte de los crculos.
556
CAPTULO 22 Retrovirus y retroposones
La Integrasa cataliza todas las etapas de la integracin
1. La integrasa genera dos extremos 2. La Integrasa genera extremos
3' con retraso de dos bases en LTR escalonados en el DNA diana
LTR LTR
HHIlJllIllllUllS
\
3. La integrasa vincula los extremos 3'
con retraso de LTR a los extremos 5
'
escalonados de la diana
Durante mucho tiempo pareci que el crculo po-
dra ser una integracin intermedia (por analoga
con la integracin del DNA X; hoy se sabe que se
usa la forma lineal para la integracin).
La integracin del DNA lineal es catalizada por
un producto vrico nico, la integrasa, que acta en
el DNA lineal rctrovrico y el DNA diana. La reac-
cin se ilustra en la FIGURA 22.9.
Los extremos del DNA vrico son importantes.
Por ejemplo, las mutaciones en los extremos de los
transposones impiden la integracin. La caractersti-
ca ms conservada es la presencia de una secuencia
del dinucletido CA cerca del extremo de cada re-
peticin invenida. La integrasa une los extremos del
DNA lineal en un complejo ribonucleoprotenico y
despus convierte los extremos romos en otros en
recesin por el retiro de bases ms all del CA que
se conserva. En general esto implica la prdida de
dos bases.
Se eligen sitios diana en forma aleatoria con
respecto a la secuencia. La integrasa hace cortes es-
calonados en un sitio diana. En el ejemplo de la
Figura 22.9 los cortes estn separados por 4 bp. La
longitud de una repeticin diana depende del virus
particular; puede ser de 4, 5 o 6 bp. Al parecer se
determina por la geometra de la reaccin de la in-
tegrasa con el DNA diana.
Los extremos 5' generados por la fragmenta-
cin del DNA diana presentan unin covalcnte con
ios extremos 3' en recesin del DNA vrico. En ese
punto ambos extremos del DNA vrico se unen por
una cadena al DNA diana. La regin de una sola ca-
dena es reparada por enzimas de la clula del hos-
pedador, y durante esta reaccin se retiran las dos
bases que protruyen en cada extremo 5' del DNA
vrico. El resultado es que el DNA vrico integrado
ha perdido 2 bp en cada LTR; esto corresponde a
:
a prdida de 2 bp desde el extremo izquierdo del
U3 terminal y a la prdida de 2 pb desde el extre-
mo derecho del U5 3
'
terminal. Hay una repeticin
caracterstica corta directa del DNA diana en cada
extremo de un genoma retrovrico integrado.
El DNA vrico se integra al genoma del hospeda-
ior en sitios seleccionados en forma aleatoria. Una
clula infectada recibe de una a 10 copias del provi-
rus. (Un virus infeccioso entra al citoplasma, por su-
puesto, pero la forma de DNA se integra al genoma
en el ncleo.) Los retrovirus pueden replicarse slo en
clulas proliferantes porque el ingreso al ncleo re-
quiere que la clula pase por la mitosis, cuando el
enoma vrico logra el acceso al material nuclear.
La regin U3 de cada LTR porta un promotor.
El promotor en la LTR izquierda se encarga del ini-
cio de la transcripcin del provirus. Recurdese que
se requiere la generacin del DNA provrico para
ubicar una secuencia de U3 en la LTR izquierda;
FIGURA 22.9 La integrasa es la nica protena vrica necesaria
para la reaccin de integracin, donde cada LTR pierde 2 bp y
se inserta entre repeticiones de 4 bp del DNA diana.
por lo tanto, se observa que el promotor es, de he-
cho, generado por la conversin del RNA en DNA
dplex.
A veces (tal vez con muy poca frecuencia), el
promotor en la LTR derecha facilita la transcripcin
de las secuencias del hospedador cercanas al ciclo
de integracin. La LTR tambin lleva un reforzador
(una secuencia que activa a los promotores veci-
nos), que puede actuar sobre las secuencias celular
y vrica. Tal vez a la integracin de un retrovirus se
deba que una clula hospedadora pase a un estado
tumorigenico cuando se activan ciertos tipos de ge-
nes en esta forma. Se pueden escindir del genoma
los provirus integrados? Podra ocurrir recombina-
cin homloga entre las LTR de un provirus; hay
LTR solitarias presentes en algunos genomas celu-
lares que podran constituir vestigios de un episodio
de escisin.
Hasta ahora se han analizado los retrovirus en
trminos del ciclo infectante, donde se necesita in-
tegracin para la produccin de ms copias de RNA.
No obstante, cuando un DNA vrico se integra a
la lnea germinativa se convierte en un "provirus
endgeno
"
originado en el organismo. Los virus en-
dgenos por lo general no se expresan, pero en oca-
siones son activados por episodios externos, como
una infeccin con otro virus.
22.5 El DNA vrico se integra al cromosoma
557
Los retrovirus pueden hacer
transducdon de secuencias
celulares
Concepto principal
Los retrovirus transformantes se generan por un
episodio de recombinacin donde una secuencia de
RNA celular sustituye parte del RNA retrovrico.
Una informacin interesante acerca del ciclo vital
vrico surge de la aparicin de virus de transduc-
cin, que son variantes que han adquirido secuen-
UI.UJ.IIJJ.i.l-IILi.ll.UI.MJJ
Virus defectuoso
RUS gag U3 R
Virus auxiliar
RUS gag pol
I
*
=ffW"U3 R
Las protenas del
virus auxiliar
cvppueden lograr-"'
'
'
la replicacin del
virus defectuoso
FIGURA 22.10 Los virus en transformacin con replicacin
defectuosa presentan sustitucin de una secuencia celular por
una parte de la secuencia vrica. El virus defectuoso puede
replicarse con la ayuda de un virus auxiliar que realiza las
funciones naturales.
Los virus con replicacin defectuosa se generan por delecion
i Provirus-
LTR gag pol env
t i gen c-onc
LTR Exn Inlrn Exn
DELECIN
Transcripcin a partir del I
provirus con delacin
I Transcripcin de
f otro provirus
Empalme
/
Recombinacin del RNA
O
1
Empaquetado en el virin
Se pueden generar genes con replicacin defectuosa
mediante la integracin y delecin de un genoma virico para obtener
un producto de transcripcin celular-vrica unido, que se empaqueta
con un genoma normal de RNA. Se necesita recombinacin no homologa
para generar el genoma de transformacin con replicacin defectuosa.
das celulares en la forma ilustrada en la FIGUR
22.10. Parte de la secuencia vrica ha sido sustituic
por el gen v-onc. La sntesis de protenas genera ur.i
Gag-v-Onc en lugar de las protenas usuales Gag.
Pol y Env. El virus resultante presenta un defec-
to de la replicacin; no puede mantener un ciclo
infectante por s mismo. Sin embargo, puede per-
petuarse en compaa de un virus auxiliar, q:-.
proporciona las funciones vricas fallantes.
Las siglas Onc constituyen una abreviatura c-.
oncognesis, la capacidad de transformar clulas
cultivadas de manera que se liberen de la regulad. -
habitual del crecimiento y sea posible su divisk-
irrestricta. Los genes onc vrico y celular pueden ser
causa de la aparicin de clulas lumorignicas.
Un gen v-onc confiere a un virus la capacidad de
transformar un cierto tipo de clula hospedados
Los loci con secuencias homlogas que se encuen-
tran en el genoma del hospedador corresponden a
genes c-onc. Cmo adquieren los retrovirus gene-
onc? Una caracterstica reveladora es la discrepan-
cia en las estructuras de los genes c-onc y v-onc. L
genes c-onc por lo general son interrumpidos por ir.-
trones, en tanto los v-onc no son interrumpidos. E:
sugiere que los genes v-onc se originan de copias de
los genes c-onc empalmadas al RNA.
En la FIGURA 22.11 se ilustra un modelo para li
formacin de los virus en transformacin. Un re-
trovirus presenta integracin cerca de un gen c-cr.
Tiene lugar una delecin que origina fusin del pr -
virus al gen c-onc; la transcripcin genera entonces
un RNA unido que contiene secuencias vricas en
un extremo y secuencias celulares onc en el otra
El empalme retira los inirones de las partes vrki
y celular del RNA. El RNA tiene las seales apro-
piadas para el empaquetamiento dentro del viricr
se generarn viriones si la clula tambin contierse
otra copia intacta del provirus. En este punto, alg:
de las panculas vricas diploides puede contener ur
RNA fusionado y un RNA vrico.
Una recombinacin entre estas secuencias po-
dra generar el genoma de transformacin, donde
hay repeticiones vricas en ambos extremos. (Ocu-
rre con frecuencia alta la recombinacin por va-
rios medios durante el ciclo infecante renovrio:
No se sabe nada acerca de sus requerimientos
homologa en los sustratos, pero se supone que
reaccin no homloga entre un genoma vrico |
la parte celular del RNA fusionado procede por !
mismos mecanismos que se encargan de la recom-
binacin vrica.)
Las caractersticas comunes do todas las clases
de retrovirus sugieren que pueden derivarse de ur
ancestro nico. Los elementos de las secuencias x
insercin (IS) primordiales podran haber rodead
a un gen de polimerasa de cido nucleico del hc~
558
CAPTULO 22 Retrovirus y retroposones
pcdador; la unidad resultante tendra la forma de
LTR-pol-LTR, que pudiese evolucionar hacia un vi-
rus infctame por la adquisicin de habilidades ms
complejas para manipular sustratos tanto de DNA
como de RNA, incluida la incorporacin de genes
cuyos productos permitieran el empaquetamiento
del RNA. Otras funciones, como la transformacin
de genes, podran incorporarse despus. (No hay
motivo para suponer que el mecanismo involucrado
en la adquisicin de funciones celulares sea exclusi-
vo de los genes onc; no obstante, es posible que los
virus que portan estos genes tengan una ventaja
selectiva debido a su efecto estimulador del creci-
miento celular.)
gan Los elementos Ty
de Las levaduras se asemejan
a los retrovirus
Conceptos principales
.
Los transposones Ty tienen una organizacin similar a
la de los retrovirus endgenos.
.
Los transposones Ty son retroposones con actividad
de transcriptasa inversa que realizan transposicin a
travs de un intermediario de RNA.
Los elementos Ty constituyen una familia de se-
cuencias repetitivas dispersas de DNA que se en-
cuentran en sitios diversos de cepas dismiles de
levaduras. Las siglas Ty corresponden a una abre-
viatura de
"
transposones de levadura
"
(del ingls,
iransposon yeasl. Ty). Un episodio de transposicin
da origen a un vestigio caracterstico: 5 bp del DNA
diana se repiten a cada lado del elemento Ty in-
sertado. Los elementos Ty son retroposones que
realizan la transposicin por el mismo mecanismo
que los retrovirus. La frecuencia de la transposicin
Ty es menor que la de gran parte de los transposones
bacterianos, --10"M0"8.
Hay mucha divergencia entre los distintos ele-
memos Ty. Casi todos entran en una de dos clases
principales llamadas Tyl y Ty97. Tienen la misma
organizacin general ilustrada en la FIGURA 22.12.
Cada elemento tiene 6.3 kb de longitud; los ltimos
330 bp en cada extremo constituyen repeticiones
directas llamadas 5. Cada uno de los elementos Ty
de cada tipo tiene muchos cambios respecto del pro-
totipo de su clase, como las sustituciones, insercio-
nes y deleciones de pares de bases. Hay -30 copias
del tipo Tyl y ~6 del tipo Ty917 en un genoma carac-
terstico de levadura. Adems, hay -100 elementos
delta independientes llamados 5 solo.
Las secuencias delta tambin muestran mucha
heterogeneidad, si bien es posible que las dos repe-
Los elementos Ty tienen dos genes
5 tyA tyB
.
RNA de 5.7 kb -
RNA de 5.0 kb-
S
Proteina TyA
Cambio de marco
FIGURA 22,12 Los elementos Ty terminan en repeticiones
directas cortas y se transcriben en dos RNA superpuestos. Tie-
nen dos marcos de lectura con secuencias relacionadas con los
genes retrovricos gag y pol.
liciones de un elemento individual Ty sean idnticas,
o al menos con una relacin muy cercana. Las se-
cuencias delta vinculadas con elementos Ty muestran
mayor conservacin de secuencias de los elementos
delta solo, lo que sugiere que el reconocimiento de las
repeticiones participa en la transposicin.
El elemento Ty se transcribe en dos especies de
RNA poli(A)*, que constituyen >5% del RNAm total
de una clula haploide de levadura. Ambas especies
inician en el interior de un promotor en el elemento
5 en el extremo izquierdo. Uno termina despus de
5 kb; el otro lo hace despus de 5.7 kb, dentro de la
secuencia 8 en el extremo derecho.
La secuencia del elemento Ty tiene dos marcos
de lectura abiertos que se expresan en la misma
direccin, pero se leen en fases diferentes y se su-
perponen por 13 aminocidos. La secuencia de TyA
hace pensar que codifica una protena de unin al
DNA. La secuencia de TyB contiene regiones con
homologas con las secuencias transcriptasa inversa,
proteasa e imegrasa de los retrovirus.
La organizacin y las funciones de TyA y TyB
son anlogas de la conducta de las funciones yag y
pol retrovricas. Los marcos de lectura TyA y TyB se
expresan en dos formas. La protena TyA representa
el marco de lectura TyA y termina en su extremo.
Sin embargo, el marco de lectura TyB se expresa slo
como parte de una proteina de unin, donde la re-
gin TyA se fusiona con la regin TyB gracias a un
episodio especfico de cambio de marco, que permite
pasar por alto el codn de terminacin. (Esto es an-
logo a la traduccin de gag-pol en los retrovirus.)
La recombinacin entre elementos Ty parece
ocurrir en salvas; cuando se detecta un episodio
hay una mayor probabilidad de encontrar otros.
22.7 Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovirus
559
La Ty hace transposicin por medio de
una forma de RNA escindido
Elemento Ty de inicio
Se marca una unidad delta
Sustitucin de bases
El promotor precede al elemento; se agrega
el intrn
Promotor Intrn
>
Los elementos con transposicin tienen
deltas notorias, sin intrn
*
. ,
*
FIGURA 22.13 Un elemento Ty nico sometido a procesos de
ingeniera para contener un intrn, experimenta transposicin
para formar copias que carecen del intrn. Las copias poseen
repeticiones terminales idnticas, que se generan desde uno
de los extremos del elemento Ty original.
Hay conversin gentica entre elementos Ty en di-
ferentes localizaciones, con el resultado de que uno
es
'
sustituido
"
por la secuencia del otro.
Los elementos Ty pueden escindirse mediante
recombinacin homloga entre las secuencias delta
de repeticin directa. Es posible que el gran nmero
de elementos 8 solo constituya un vestigio de dichos
episodios. Una escisin de esta naturaleza puede
asociarse a la reversin de una mutacin causada
por la insercin de Ty; el grado de reversin puede
depender de las secuencias delta exactas que que-
daron atrs.
Es una paradoja que ambos elementos delta
tengan la misma secuencia y, no obstante, un pro-
motor est activo en el delta de un extremo y un
terminador est activo en el delta del otro extremo.
(Se encuentra una caracterstica similar en otros
elementos susceptibles de transposicin, incluidos
los retrovirus.)
Los elementos Ty son retroposones caracters-
ticos, ya que realizan transposicin a travs de un
intermediario de RNA. En la FIGURA 22.13 se incluye
un esquema ingenioso que permite detectar este
episodio. Se insert un intrn en un elemento para
generar una secuencia Ty exclusiva. Esta secuencia
se coloc bajo el control de un promotor GAL en un
plsmido y se introdujo en las clulas de levaduras.
La transposicin da como resultado la aparicin z-
mltiples copias del transposn en el genoma de
levadura, pero todas las copias carecen del intrn
Se conoce slo una forma de retirar intrones: e
empalme de RNA, lo que hace pensar que la trans-
posicin tiene lugar por el mismo mecanismo q.r
en los retrovirus. El elemento Ty se transcribe a ur
RNA que es reconocido por el aparato de desdobii-
miento. Una transcriptasa inversa reconoce el R:
"
-
desdoblado y regenera una copia de DNA dplex
La analoga con los retrovirus contina todav
ms. El elemento Ty original tiene una dierencu
de secuencia entre sus dos elementos delta. Sin em-
bargo, los elementos donde ocurri transposidoz
poseen secuencias delta idnticas, que se derivan c:
delta 5' del elemento original. Si se considera a ia
secuencia delta exactamente como una LTR, con-
sistente en las regiones U3-R-U5, el RNA de Tysc
extiende de una regin R a otra. As como se mus
tra para los retrovirus en las Figuras 22.3 a 22.6. s
regenera la LTR completa cuando se agrega un U5
al extremo 3
'
y un U3 al extremo 5'.
La transposicin es controlada por genes der
tro del elemento Ty. El promotor GAL utilizado para
controlar la transcripcin del elemento Ty marcao
es inducible: se activa con la adicin de galactosa. Le
induccin del promotor tiene dos efectos. Es nece-
sario activar la transposicin del elemento marcac
y sta tambin aumenta la frecuencia de transposi-
cin de los dems elementos Ty en el cromosoma
de la levadura, lo que implica que los productos cr
elemento Ty pueden actuar en conformacin tm*?
sobre otros elementos (en realidad sobre sus RNA
El elemento Ty no da origen a partculas infec-
ciosas, pero se acumulan partculas similares a viru?
(del ingls virus-like particles, VLP) en el interior de
las clulas donde se ha inducido la transposicin
Las partculas, que se pueden observar en la FIGUH
22.14, contienen RNA de longitud completa, DNA
de doble cadena, actividad de transcriptasa invem
y un producto TyB con actividad de integrasa. El
producto TyA es fragmentado como un precursor
gag para producir las protenas centrales madur;
del VLP. Esto aumenta todava ms la analoga entre
el transposn Ty y los retrovirus. En resumen, el
elemento Ty acta como un retrovirus que perd-
su gen env y, por tanto, no puede empaquetar bier.
su genoma.
No todos los elementos Ty de cualquier genoma
de levadura estn activos: la mayor parte de ellos la
perdido la capacidad de transposicin (y son an-
logos a provirus endgenos inertes). No obstante
estos elementos
"
muertos
"
conservan las repeticio-
nes delta y, en consecuencia, proveen dianas para
la transposicin en respuesta a las protenas sinte-
tizadas por un elemento activo.
560
CAPTULO 22 Retrovirus y retroposones
Los elementos Ty se asemejan a virus
FIGURA 22.14 Los elementos Ty generan partculas similares a
virus. Reproducida de J. Mol. BioL, vol. 292, AL-Khayat, H. A.,
et al., Yeast Ty retrotransposons..., pp. 55-73. Copyright 1999,
con autorizacin de Elsevier. Foto por cortesa del Dr. Hind A.
AL-Khayat, Imperial College London, United Kingdom.
rm Muchos elementos susceptibles
de transposicin residen
en Drosophila melanogaster
Concepto principal
.
Copia es un retroposn abundante en Drosophila
melanogaster.
La presencia de elementos susceptibles de transpo-
sicin en D. melanogaster se dedujo por primera vez
despus de observaciones anlogas a aquellas con
que se identificaron las primeras secuencias de inser-
cin en E. coli. Se encuentran mutaciones inestables
que revierten al tipo silvestre por delccin, o que
generan deleciones del material de los flancos con
un punto terminal en el sitio de origen de la muta-
cin. Son causadas por varios tipos de secuencias
susceptibles de transposicin, que se ilustran en la
FIGURA 22.15. Estas secuencias incluyen al retropo-
sn copia, la familia FB y los elementos P analizados
antes en la seccin 21.14, Participacin de los ele-
memos susceptibles de transposicin en la disgenesia
de hbridos.
La familia mejor descrita de retroposones es
copia. Su nombre refleja la presencia de un gran
nmero de secuencias relacionadas muy de cerca
que codifican abundantes RNAm. La familia copia
se loma como paradigma para varios otros tipos de
elementos con secuencias que no tienen relacin,
pero cuya estructura y conducta general parecen
similares.
El nmero de reproducciones del elemento Co-
ria depende de la cepa de la mosca; por lo general es
de entre 20 y 60. Los integrantes de la familia estn
D. melanogaster tiene varios transposones
Repeticiones directas
5146 bp
Copia
20-60 copias
Repeticiones invertidas
Repeticiones invertidas largas
500-5000 bp
FB
-
30 copias
Repeticiones invertidas cortas
2900 bp
0 o -50 copias
FIGURA 22.15 Tres tipos de elementos de transposicin en D.
melanogaster tienen diferentes estructuras.
bastante dispersos. Las localizaciones de los elemen-
tos copia muestran un espectro diferente (si bien con
superposicin) en cada cepa de D. melanogaster.
Estas diferencias han surgido durante periodos
evolutivos. Las comparaciones de cepas que han
tenido divergencia en fechas recientes (durante los
ltimos 40 aos) como resultado de su propagacin
en el laboratorio revelan pocos cambios. No se pue-
de calcular el ritmo del cambio, pero la naturaleza
de los sucesos subyacentes queda de manifiesto por
el resultado de las clulas que crecen en cultivo. E!
nmero de elementos copia por genoma aumenta
de manera sustancial, hasta el triple. Los elementos
adicionales representan inserciones de secuencias
copia en sitios nuevos. La adaptacin al cultivo en al-
guna forma desconocida aumenta de manera tran-
sitoria la tasa de transposicin dentro de los lmites
de 10"' a 10-1 episodios por generacin.
El elemento copia tiene -5 000 bp de longitud,
con repeticiones directas terminales idnticas de 276
bp. Cada una de las repeticiones directas termina en
repeticiones invertidas relacionadas. Una repeticin
directa de 5 bp de DNA diana se genera en el sitio
de insercin. La divergencia entre cada uno de los
integrantes de la familia copia es pequea, de <5%;
las variantes suelen contener pequeas deleciones.
Todas estas caractersticas son comunes a otras fa-
milias similares a copia, si bien sus miembros indi-
viduales muestran mayor divergencia.
La identidad de las dos repeticiones directas de
cada elemento copia indica que interactan para
permitir sucesos de correccin o que ambas son ge-
neradas a partir de una de las repeticiones directas
de un elemento progenitor durante la transposicin.
22.8 Muchos elementos susceptibles de transposicin residen en Drosophila melanogaster
561
Como en el caso similar de los elementos Ty, esto
hace pensar en una relacin con los retrovirus.
Los elementos copia en el genoma siempre estn
intactos; no se han detectado copias individuales de
las repeticiones terminales (aunque sera de esperar
que se generasen si la recombinacin produjese de-
lecin del material interpuesto). En ocasiones se en-
cuentran elementos copia en forma de DNA circular
libre; al igual que los crculos de DNA retrovrico, su
forma ms prolongada tiene dos repeticiones termi-
nales y la ms corta tiene slo una. Se han comuni-
cado partculas que contienen RNA de copia.
La secuencia copia contiene un solo marco de
lectura largo de 4227 bp. Hay homologas entre
partes del marco de lectura abierta de copia y las
secuencias gag y pol de los retrovirus. Es notable
la ausencia de las homologas de alguna relacin
con secuencias retrovricas env indispensables para
la envoltura del virus, lo que significa que es poco
probable que copia pueda generar partculas simi-
lares a virus,
Los productos de transcripcin copia se encuen-
tran como RNAm poli(A)", que representa produc-
tos de transcripcin de longitud total y parcial. Los
RNAm tienen un extremo 5' comn derivado de
la iniciacin a la mitad de una de las repeticiones
terminales. Se producen varias protenas, tal vez
gracias a episodios como el empalme de RNA y la
fragmentacin de poliprotenas,
No se cuenta con pruebas directas del modo de
transposicin de copia; como resultado, hay tantas
similitudes con la organizacin retrovrica que pare-
ce inevitable que copia tenga un origen relacionado
con los retrovirus. Es difcil decir cuntas funciones
retrovricas posee copia. Se sabe, por supuesto, que
efecta transposicin, pero (como en el caso de los
elementos 7 no hay pruebas de que tenga alguna
capacidad infecciosa.
Los retroposones
son de tres clases
Conceptos principales
.
Los retroposones de la superfamilia vrica son
transposones que se desplazan a travs de un RNA que
no constituye una partcula infecciosa.
.
Algunos retroposones se asemejan de manera directa a
retrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tienen
LTR.
.
Se pueden encontrar otros elementos que fueron
generados por un episodio de transposicin mediada
por RNA, pero por s mismos no codifican enzimas que
puedan catalizar la transposicin.
.
Los transposones y retroposones constituyen casi la
mitad del genoma humano.
Se define a los retroposones por su uso de mecanis
mos de transposicin que comprenden la transen:
cin inversa de RNA en DNA. Se conocen tres clase
de retroposones, incluidos en la Fl 22.16:
.
Los miembros de la superfamilia vrica c
difican actividades de transcriptasa inver--;
integrasa. o ambas, Al igual que otros retro
posones, se reproducen de la misma mar.t-
ra que los retrovirus, pero difieren de ellc
porque no pasan por una forma infecciosi
independiente. Se describen mejor en 1
elementos Ty y copia de levaduras y moscaj
.
Las secuencias repetidas largas dispersa
(LINES) tambin tienen actividad de tran-
criptasa inversa (y pueden, por tanto, con
siderarse como constitutivas de miembn-
ms distantes de la superfamilia vrica
pero carecen de LTR y usan un mecanisn:
diferente al de los retrovirus para cebar
reaccin de transcriptasa inversa. Proviene
Los qenomas eucahticos tienen Ires tipos de retropo
Superfamilia vrica LINES Superfamilia no vrica
Tipos frecuentes Ty (S. cerevisiae) L1 (humano) SINES (mamferos)
copia (D, melanogaster)
B1, B2 ID, B4
Seudogenes de
(ratn) productos de transcripcin
de pol III
Terminaciones Repeticiones terminales Sin repeticiones Sin repeticiones
largas
Repeticiones en 4-6 bp
7
-21 bp
7
-21 bp
dianas
Actividades Transcriptasa inversa, Transcriptasa inversa Ninguna (o ninguna que
enzimticas Integrasa, o ambas
o endonucleasa
codifique productos de
transposones)
Organizacin Puede contener inirones
Uno o dos ORF Sin intrones
(retirados en el RNAm ininterrumpidos
subgenmico)
Los retroposones pueden dividirse en las superfamilias vricas, que son similares
a retrovirus o LINES, y superfamilias no vricas, que no ejercen funciones de codificacin.
562
CAPTULO 22 Retrovirus y retroposones
de productos de transcripcin de ia polime-
rasa II de RNA. Una muy escasa parte de los
elementos en el genoma tiene funcin com-
pleta y puede efectuar transposicin de ma-
nera autnoma; otros presentan mutaciones
y por ello slo pueden hacer transposicin
como resultado de un elemento autnomo
que acta en configuracin tr-aus.
.
Los miembros de la superfamilia no vri-
ca se identifican por caractersticas externas
e internas que sugieren que provienen de
secuencias de RNA. Sin embargo, en estos
casos slo se puede especular acerca de como
se gener una copia de DNA. Se supone que
eran diana de un episodio de transposicin
por un sistema enzimtico codificado en otro
sitio, o sea, siempre carecieron de autonoma.
Se originaron en productos de transcripcin
celular. No codifican protenas con funcio-
nes de transposicin. El componente ms
prominente de esta familia recibe el nom-
bre de secuencias repetidas dispersas cortas
(SINES). Estos componentes se derivan de
producios de transcripcin de la polimerasa
III de RNA.
La FIGURA 22.17 muestra las relaciones de orga-
nizacin y secuencia de los elementos que codifican
la transcriptasa inversa. Al igual que los retrovirus,
los retroposones que contienen LTR se pueden
clasificar por grupos de acuerdo con el nmero de
marcos de lectura independiente para gqg, pole mi y
d orden de los genes. A pesar de esas diferencias su-
perficiales de organizacin, la caracterstica comn
es la presencia de actividades de transcriptasa inver-
sa e integrasa. Los elementos I.INES de mamferos
comunes tienen dos marcos de lectura; uno codifica
una protena de unin de cido nucleico y la otra la
actividad de transcriptasa inversa y endonudeasa.
Los elementos que contienen LTR pueden va-
riar de retrovirus integrados a retroposones que han
perdido la capacidad de generar panculas infeccio-
sas. Los genomas de levadura y mosca tienen ele-
mentos Ty y copia que no pueden generar partculas
infecciosas. Los genomas de mamfero contienen
retrovirus endgenos que, cuando estn activos,
pueden generar partculas infecciosas. El genoma
de ratn tiene varios retrovirus endgenos activos
que son capaces de generar partculas que propagan
infecciones horizontales. Por contraste, casi todos
los retrovirus endgenos perdieron su actividad
hace casi 50 millones de aos en el linaje humano
I el genoma tiene hoy en su mayor parte restos
inactivos de los retrovirus endgenos.
Las LINES y SINES constituyen una parte im-
portante del genoma animal. En un principio se
definieron por la existencia de un gran nmero de
secuencias relativamente cortas relacionadas entre
s (constituidas por el DNA con repeticin moderada
descritas en la seccin 4.6, Genomas eucariticos
que contienen secuencias de DNA repetitivas y no
repetitivas. Las LINES incluyen secuencias dispersas
largas y las SINES, secuencias dispersas cortas. (Se
describen como secuencias dispersas o repeticio-
nes dispersas, por su presencia comn y distribu-
cin generalizada).
Las plantas contienen otro tipo de elemento
mvil pequeo llamado MITE (que corresponde
a un elemento invenido de transposicin repetida
en miniatura). Tales elementos terminan en repe-
ticiones invertidas, tienen una secuencia diana de
2 o 3 bp, no presentan secuencias de codificacin y
tienen de 200 a 500 bp de longitud. Hay al menos
nueve de tales familias (por ejemplo) en el genoma
del arroz. A menudo se encuentran en regiones que
flanquean genes que codifican protenas. No tienen
relacin con SINES o LINES.
Las LINES y SINES constituyen una parte signi-
ficativa del DNA repetitivo de los genomas animales.
En muchos genomas eucariticos elevados ocupan
-
50% del DNA total. En la FIGURA 22.18 se resume la
distribucin de los diferentes tipos de transposones,
que constituyen casi la mitad del genoma humano.
Excepto por las SINES, que casi siempre carecen de
funcin, los otros tipos de elementos estn consti-
tuidos por representantes funcionales y otros que
han sufrido dcleciones que eliminaron parte de los
marcos de lectura que codifican las protenas nece-
sarias para la transposicin. Los porcentajes relati-
vos de estos tipos de transposones son, en general,
similares en el genoma de ratn.
Una LINES comn en genomas de mamferos
se denomina Ll. El miembro usual tiene ~ 6500
bp y termina en un segmento rico en A. Los dos
marcos de lectura abierta de un elemento de longi-
tud total se denominan ORFI y ORF2. El nmero
Los retroposones tienen transenptasas inversas
trovirusj
gag mwm ym
LTR LTR
Ty ryA | * 9BBI
Copia i - ORF
LTR
"
LTR
UNES | ]ORFl| ORF2
Homologa con gag pol mmint
Los retroposones que se relacionan muy de cer-
ca con los retrovirus tienen una organizacin similar, pero las
UNES comparten slo la actividad de transcriptasa inversa.
22.9 Los retroposones son de tres clases
563
Relrovirus y Iransposones constituyen la mitad del genoma humano
Elemento
Organizacin Longitud (Kb) Genoma humano
Relrovirus /retroposn
LINES (autnomo), p. ej. L1
SINES (no autnomo), p. ej., Alu
Transposn de DNA
Nmero Fraccin
gag pol
'
. 5131 450 000 8%
ORF1 (pol) ICiMM 6-8 850 000 17%
>> <0 3 1 500 0C0 15%
Transposasa i 2-3 300 000 3%
2.18 Cuatro tipos de elementos de transposicin constituyen casi la mitad del genoma
humano.
de elementos de longitud total suele ser pequeo
(-50) y el resto de las copias son truncas. Se pue-
den encontrar productos de transcripcin. Como lo
indica su presencia en el DNA repetitivo, la familia
LINES muestra variacin de secuencias entre miem-
bros individuales. Sin embargo, los integrantes de
la familia dentro de una especie son relativamente
homogneos en comparacin con la variacin ob-
servada entre dos especies. Ll es el nico miembro
de la familia LINBS que ha estado activo en los lina-
jes de ratn o humano. Parece haber permanecido
muy activo en el ratn, pero ha declinado en el
linaje humano.
Slo ha habido una SINES activa en el linaje
humano, el elemento comn Alu. El genoma de
ratn liene una contraparte de este elemento, Bl, y
tambin otros SINES (B2, ID, B4) que han presenta-
do actividad. El Alu humano y el SINES Bl de ratn
tal vez provengan del RNA 7SL (vase la seccin
22.10, La familia Alu tiene muchos miembros muy
dispersos). El otro SINES de ratn parece haberse
originado de un producto de transcripcin inversa
de RNAt, Es probable que la transposicin de SINES
se deba a que un elemento activo Ll las reconoce
como sustratos.
gjg La familia ALu tiene muchos
miembros muy dispersos
Concepto principal
.
Una parte importante del DNA repetitivo en genomas
de mamferos consta de repeticiones de una sola
familia, organizadas como transposones y derivadas ce
productos de transcripcin de la polimerasa III de RNA.
Las SINES ms notorias incluyen miembros de una
sola familia. Su breve longitud y alto grado de repe-
ticin las hacen comparables al DNA de secuencias
simples (satlite), excepto que los miembros indi-
viduales de la familia estn dispersos en el genoma
en lugar de confinados a grupos seriados. De nuevo,
hay similitud significativa entre los miembros
una especie en comparacin con la variacin
especies.
En el genoma humano, una gran parte del E |
moderadamente repetitivo se encuentra como s
cuencias de -300 bp que estn entremezcladas!
DNA no repetitivo. Al menos la mitad del mate:
doble desnaturalizado es fragmentado por la enz
de restriccin AluI en un solo sitio localizado 170!
adelante en la secuencia. Las secuencias fragr
tadas pertenecen todas a una sola familia conoce
como familia Alu, de acuerdo con los medii
identificacin. Hay ~300 000 miembros en el ge-
noma haploide (equivalentes a un miembro pe:
kb de DNA). Las secuencias individuales Alu tier-tr
dispersin amplia. Hay una familia de secuenc
relacionadas presente en el ratn (donde los 50
miembros se denominan familia Bl) en el cric
chino (donde se llama familia equivalente Alm.
en otros mamferos.
Cada uno de los miembros de la familia
tiene relacin ms que ser idnticos. La familia
mana parece haberse originado por una duplica-
en serie de 130 bp con una secuencia no relacior.i;_
de 31 bp insertados en la mitad derecha del d"'
Las dos repeticiones a veces se denominan
izquierda" y "mitad derecha" de la secuencia
Cada integrante de la familia Alu liene una ide
dad promedio de 87% con la secuencia de cons
La unidad de repeticin Bl de ratn tiene 130
de longitud y corresponde a un monmero de
unidad humana. Tiene homologa de 70 a 80% i
la secuencia humana.
La secuencia Alu tiene relacin con el RNA 7S
un componente de la partcula de reconocimiento
seal (vase la seccin 10.9, La SRP interacta
el receptor SRP). El RNA 7SL corresponde a la:
izquierda de una secuencia Alu con una inserc
en medio. As, las 90 bases terminales 5
'
del RXa
7SL son homlogas con el extremo izquierdo
Alu, las 160 bases centrales del RNA 7SL no tie
homologa con Alu y las 40 bases terminales 3'
564
CAPTULO 22 Retrovirus y retroposones
RNA de 7SL son homologas con el extremo derecho
de Alu. El RNA 7SL es codificado por genes que la
polimerasa m de RNA transcribe de manera activa.
Es posible que estos genes (u otros relacionados con
ellos) den origen a las secuencias inactivas Alu.
Los miembros de la familia Alu se asemejan a
transposones porque estn flanqueados por repe-
ticiones directas cortas. Muestran, no obstante, la
curiosa caracterstica de que las longitudes de re-
peticin son diferentes para cada miembro de la
familia. Se derivan de productos de transcripcin
de la polimerasa III de RNA y, como resultado, es
posible que cada miembro porte promotores activos
internos.
Se ha encontrado una diversidad de propieda-
des de la familia Alu, y su ubicuidad ha originado
muchos indicios respecto de su funcin. No obstan-
te, an no es posible discernir su funcin real.
Al menos algunos miembros de la familia AJu
pueden transcribirse en RNA independientes. En el
criceto chino algunos (aunque no todos) miembros
de la familia equivalente a Alu parecen tener trans-
cripcin in vivo. Se encuentran unidades de transcrip-
cin de ese tipo en la vecindad de otras unidades de
transcripcin.
Los miembros de la familia Alu pueden incluir-
se dentro de unidades de transcripcin de genes es-
tructurales, segn se observa por su presencia en el
RNA nuclear largo. La presencia de copias mltiples
de la secuencia Alu en una sola molcula nuclear
puede generar la estructura secundaria. De hecho,
la presencia de miembros de la familia Alu en forma
de repeticiones invertidas se encarga de la mayor
parte de la estructura secundaria que se encuentra
en el RNA nuclear de los mamferos.
Los seudogenes procesados
se originaron como sustratos
para La transposicin
Concepto principal
Un seudogn procesado proviene de una secuencia de
RNAm por transcripcin inversa.
Cuando una secuencia generada por transcripcin
inversa de un RNAm se inserta en el genoma, se
puede reconocer su relacin con el gen a partir del
cual se transcribi el RNAm. Tal secuencia se deno-
mina seudogn procesado para reflejar el hecho
de que se proces a partir del RNA y es inactivo.
En la FIGURA 22.19 se comparan las caractersticas
especficas de un seudogn procesado con las del
gen original y el RNAm. La figura muestra todas las
Transcripcin inversa + insercin = seudogn
Exn 1 Inlrn Exn 2 Intrn Exn 3
i
rrumpido
X 7 A>A>7
RNA nuclear X/X/ /Ay
j
X/X/A/X/X/XX
El extremo 3' tiene
un segmento A-T
El extremo 5' corresponde
con el RNAm
Seudogn /}J /A/K/ /A/*J S/ft
procesado | _ Tira continua de exones -
Repeticin corta directa
del DNA diana
Repeticin corta directa
del DNA diana
FIGURA 22.19 Pueden surgir seudogenes por transcripcin inversa a
partir del RNA para formar DNA dplex, que se integran al genoma.
caractersticas diagnsticas importantes, de las que
slo algunas se encuentran en cualquier ejemplo
individual. Cualquier producto de transcripcin
de la polimerasa II de RNA pudiese, en principio,
dar origen a tal seudogn y hay muchos ejemplos
que incluyen los seudogenes procesados de globi-
na, que fueron los primeros en descubrirse (vase
la seccin 3.11, Los seudogenes son callejones sin
salida de la evolucin).
El seudogn puede iniciarse en el punto equi-
valente al extremo 5
'
del RNA, circunstancia que
sera de esperar slo si el DNA se hubiese originado
del RNA. Varios seudogenes constan de secuencias
exnicas unidas de manera precisa; no se conocen
mecanismos para reconocer intrones en el DNA, por
lo que esta circunstancia constituye un argumen-
to a favor de una etapa mediada por el RNA. El
seudogn puede terminar en un segmento corlo de
pares de bases A-T al parecer derivadas de la cola
poli(A) del RNA. A cada lado del seudogn hay una
repeticin corta directa que parece haberse genera-
do por un episodio similar a la transposicin. Los
seudogenes procesados residen en localizaciones no
relacionadas con sus sitios de origen supuestos.
Los seudogenes procesados no portan ninguna
informacin que pudiera servir para respaldar un
suceso de transposicin (o llevar a cabo la transcrip-
cin inversa precedente del RNA). Esto hace pensar
que el RNA era sustrato para otro sistema y codifi-
cado por un retroposn. De hecho, parece que los
elementos LINES activos proveen gran parte de la
actividad de transcriptasa inversa y que se encargan
no slo de su propia transposicin, sino tambin de
actuar sobre las SINES y generar seudogenes pro-
cesados.
22.11 Los seudogenes procesados se originaron como sustratos para la transposicin
565
Las LINES utilizan
una endonucLeasa para generar
un extremo con actividad
cebadora
La actividad cebadora se ongina en una hendidura
Concepto principal
Las LINES no tienen LTR y para cebar la transcripcin
inversa requieren que el retroposn codifique una
endonucleasa que genere una hendidura.
Los elementos de LINES y algunos otros no terminan
en las LTR caractersticas de los elementos retrov-
ricos. Esto lleva a la interrogante: Cmo se ceba
la transcripcin inversa? No comprende la reaccin
comn donde el cebador de RNAm se aparea con
el LTR (vase la Figura 22.6). Los marcos de lectura
abierta en estos elementos carecen de muchas de las
funciones retrovricas, como dominios de proteasa
o integrasa, pero por lo general tienen secuencias
similares a la transcriptasa inversa y codifican una
actividad de endonucleasa. En la LINES LI humana,
ORF1 es una protena unida a DNA y ORF2 tiene
actividades tanto de transcriptasa inversa como de
endonucleasa; ambos productos son indispensables
para la transposicin.
La FIGURA 22.20 muestra cmo estas actividades
sostienen la transposicin. Se hace una hendidura
en el sitio diana del DNA por actividad de una endo-
nucleasa codificada por el retroposn. El producto
RNA del elemento se vincula con la protena unida
en la hendidura. La hendidura provee un extre-
mo 3
'
-
OH que ceba la sntesis de DNAc sobre el
molde de RNA. Se requiere un segundo episodio
de escisin para abrir la otra cadena de DNA, y el
hbrido RNA/DNA se vincula con el otro extremo de
la hendidura en esta etapa, o despus de que se ha
convertido en una cadena doble de DNA. Algunos
imrones mviles utilizan un mecanismo semejante
(vase la Figura 27.12).
Cuando se originan elementos a partir de la
transcripcin de la polimerasa II de RNA, las se-
cuencias genmicas son necesariamente inactivas:
carecen del promotor que se encontraba en un sitio
ascendente respecto del punto de origen inicial de
transcripcin. stos suelen poseer las caractersticas
de un producto de transcripcin maduro, por lo que
se denominan seudogenes procesados.
Uno de los motivos por lo que los elementos de
LINES son tan eficaces radica en su mtodo de pro-
pagacin. Cuando se traduce un RNAm de LINES,
los productos protenicos muestran una preferencia
cis para unirse al RNAm a partir del cual se tradu-
jeron. La FIGURA 22.21 muestra que el complejo de
La hendidura proporciona
un extremo de cebacin
i
i
-
RNA
El DNAc crece a partir
_
de 3'-OH
El RNA es el
molde
El DNA sustituye
QMA
al RNA
Se crea un intrn
por recombinacin
i
1
1
i
FIGURA 22.20 La retrotransposicin de elementos diferente;
a LTR ocurre por formacin de una hendidura en la diana cc-
el fin de proveer un cebador para la sntesis de DNAc sobre 9
molde de RNA. Las puntas de flecha indican extremos 3
'
.
Las protenas LINES actan en cis
'
ncleo
Transposn
V/ RNA
Insercin de
w
una copia
de un DNA
CITOSOL
en un sitio
nuevo
O
FIGURA 22.21 Se transcribe una LINES hacia un RNA que -z
traduce en protenas que se ensamblan en un complejo cr-
e RNA. El complejo se transloca al ncleo, donde inserta d
copia de DNA en el genoma.
566 CAPTULO 22 Retrovirus y retroposones
Los elementos autnomos actan
sobre los no autnomos
, Transposn
no funcional
Transposn
\
wyRNA
Y
CITOSOL
Un transposn se transcribe hacia un RNA que
;
e traduce en protenas que se desplazan de manera indepen-
riente hacia el ncleo, donde actan sobre cualquier par de
epeticiones invertidas con la misma secuencia que en el trans-
:
osn original.
ribonucleoproienas se traslada entonces al ncleo,
ionde las protenas insertan una copia del DNA en
el genoma. La transcripcin inversa a menudo no
avanza por completo hasta el final, de modo que la
copia es inactiva. Sin embargo, hay posibilidades de
insercin de una copia activa porque las protenas
actan sobre un producto de transcripcin del ele-
mento activo original.
En contraste, las protenas producidas por ios
:
ransposones de DNA deben importarse al nticleo
despus de su sntesis en el citoplasma, pero no
cuentan con mtodos para distinguir entre trans-
posones de longitud completa y transposones inac-
tivos con dclccin. La (GURA muestra que en
iugar de distinguir estos dos tipos de transposones,
las protenas reconocern de manera indiscriminada
cualquier elemento por virtud de las repeticiones
que marcan sus extremos. Esto disminuye mucho
su posibilidad de actuar sobre un elemento de lon-
gitud completa en contraposicin a uno que ha te-
nido delecin. La consecuencia es que los elementos
inactivos se acumulan y, en un momento dado, la
familia desaparece porque una transposasa tiene
pocas posibilidades de hallar una diana que sea un
transposn por completo funcional.
Estn ocurriendo en la actualidad sucesos de
transposicin en estos genomas, o slo se observan
vestigios en sistemas antiguos? Esto vara con la es-
pecie. Hay slo unos cuantos transposones activos
en la actualidad en el genoma humano pero, en
contraste, se conocen varios transposones activos
en el genoma de ratn. Esto explica el hecho de
que las mutaciones espontneas causadas por in-
serciones de LINES se presentan con una tasa de
-
3% en el ratn, pero de slo 0.1% en el hom-
bre. Parece haber de -10 a 50 elementos activos de
LINES en el genoma humano. Se pueden sealar
algunas enfermedades humanas como resultado de
la transposicin de LI a los genes y otras derivadas
de episodios no equivalentes de cnirecruzamiento,
donde participan copias repelidas de LI. Un sistema
modelo en el que ocurre la transposicin de LINES
en clulas de cultivo hstico hace pensar que un
suceso de transposicin puede introducir varios ti-
pos de dao colateral, as como la insercin en un
nuevo sitio; el dao comprende reestructuraciones
y deleciones cromosmicas. Dichos sucesos podran
considerarse como agentes del cambio gentico. Ni
los transposones de DNA ni los retroposones cua-
si retrovricos parecen haber tenido actividad en el
genoma humano durante 40 a 50 millones de aos,
pero se encuentran ejemplos activos de ambos en
el ratn.
Ntese que para que las transposiciones persis-
tan deben presentarse en la lnea germinativa. Al
parecer, episodios similares tienen lugar en clulas
somticas, pero stas no sobreviven ms de una ge-
neracin.
Resumen
La transcripcin inversa es el mecanismo unificador
de la reproduccin de retrovirus y perpetuacin de
retroposones. El ciclo de cada tipo de elemento es
en principio similar, aunque los retrovirus suelen
considerarse desde la perspectiva de la forma vrica
libre (RNAm), en tamo los retroposones se consi-
deran desde el punto de vista de la forma genmica
(DNA doble).
Los retrovirus tienen genomas de RNA de cade-
na nica que se replican mediante un intermediario
de DNA de doble cadena. Un retrovirus individual
contiene dos copias de su genoma. El genoma con-
tiene los genes gay, pol y env, que se traducen en po-
liprotcnas, cada una de ellas fragmentada en pro-
tenas funcionales ms pequeas. Los componentes
Gag y Env se encargan del empaquetamiento del
RNA y la generacin del virin; los componentes
Pol participan en la sntesis de cidos nucleicos.
La transcriptasa inversa es el principal compo-
nente de Pol y se encarga de la sntesis de una copia
de DNA (cadena negativa) del RNA vrico (cadena
positiva). El producto de DNA es ms largo que el
molde de RNA; mediante el cambio de moldes, la
transcriptasa inversa copia desde la secuencia de 3
'
de RNA hasta el extremo 5' del DNA y desde la
secuencia 5
'
del RNA hasta el extremo 3' del DNA,
lo que genera las LTR caractersticas (repeticiones
terminales largas) del DNA. Ocurre un cambio simi-
22.13 Resumen 567
lar de moldes cuando se sinteiiza la cadena positiva
del DNA utilizando la cadena negativa como molde.
El DNA doble lineal se inserta en el genoma de un
hospedador gracias a la participacin de la enzima
integrasa. La transcripcin del DNA integrado desde
un promotor en la LTR izquierda genera ms copias
de la secuencia de RNA.
Los cambios de molde durante la sntesis de
cidos nucleicos permiten que ocurra la recombi-
nacin por seleccin de copias. Durante un ciclo
infeccioso, un retrovirus puede intercambiar pane
de su secuencia habitual por una secuencia celular.
El virus resultante suele tener defectos de replica-
cin, pero puede perpetuarse durante la evolucin
de una infeccin conjunta con un virus auxiliar.
Muchos de los virus defectuosos han adquirido una
versin RNA (v-onc) de un gen celular (c-onc). La se-
cuencia onc puede ser de cualquiera de varios genes
cuya expresin en la forma v-onc hace que la clula
se transforme hacia un fenotipo tumorignico.
El episodio de integracin genera repeticiones
diana (como transposones que se desplazan a travs
del DNA). Por lo tanto, un provirus insertado posee
terminaciones directas repetidas de LTR, flanquea-
das por repeticiones cortas de DNA diana. Los geno-
mas de mamferos y aves tienen provirus endgenos
(inactivos) con dichas estructuras. Se han encon-
trado otros elementos con esa organizacin en una
diversidad de genomas, de manera ms notoria en
S
. cerevisiaey D. nelanogaster. Los elementos Ty de las
levaduras y los elementos de copia de las moscas tie-
nen secuencias de codificacin con homologa con
la transcriptasa inversa y se desplazan a travs de
una forma de RNA. Pueden generar partculas que
simulan virus pero no tienen capacidad infectante.
Las secuencias LINES de los genomas de mamferos
se retiran an ms de los retrovirus, pero conser-
van diferentes similitudes que sugieren un origen
comn. Utilizan un tipo diferente de actividad ceba-
dora para iniciar la accin de la transcriptasa inver-
sa, donde una actividad de endonucleasa vinculada
con la transcriptasa inversa forma una hendidura
que provee un extremo 3
'
-
OH para la sntesis de
cebacin sobre un molde de RNA. La frecuencia
de transposiciones de LINES aumenta porque sus
productos protenicos tienen actividad en as; se vin-
culan con el RNAm del que fueron traducidas para
formar un complejo ribonucleoprotenico que se
transporta al ncleo.
Los miembros de otra clase de retroposones
cuentan con todos los puntos calientes de la trans-
posicin a travs de RNA, pero no tienen secuen-
cias de codificacin (o al menos ninguna que simule
funciones retrovricas). Pueden haberse originado
como pasajeros en un episodio de transposicin se-
mejante a la retrovrica, donde un RNA fue diana
de una transcriptasa inversa. Los seudogenes proce-
sados surgen por dichos episodios. Una familia par-
ticularmente notoria que parece haberse originado
por un suceso de procesamiento es la familia Alu.
Algunos RNAsn, incluido el RNAsn 7SL (un compo-
nente de SRP) tienen relacin con esta familia.
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Referencias 569
Diversidad inmunitara
i
ESQUEMA DEL CAPTULO
/
B Introduccin
m*WM La seleccin clonal amplifica Linfocitos que
responden a antgenos individuales
Cada linfocito B expresa una sola inmunoglobulina y cada
[nfodto T, un solo receptor de clulas T.
.
Hay una gran variedad de inmunoglobulinas de clulas B y
receptores de clulas T.
.
La unin de un antgeno con una inmunoglobulina de
clulas B o un receptor de clulas T desencadena la
multiplicacin clonal.
w Los genes de las inmunoglobulinas se ensamblan
en los linfocitos a partir de sus constituyentes
.
Una inmunoglobulina es un tetrmero de dos cadenas
ligeras y dos pesadas.
.
Las cadenas ligeras pertenecen a las familias X y k; las
cadenas pesadas forman una sola familia,
.
Cada cadena tiene una regin terminal N variable (V) y una
regin terminal C constante (C).
.
El segmento V reconoce al antgeno y el C provee la
respuesta efectora.
.
Los segmentos V y C son codificados separadamente por
segmentos de los genes V y C.
.
Para unir un segmento del gen V con uno del gen C, por
recombinacin somtica se genera un cdigo gnico de una
cadena integra de inmunoglobulina.
BD Las cadenas ligeras se ensamblan por
recombinacin simple
Una cadena ligera X se ensambla por recombinacin simple
entre un gen V y un segmento del gen J-C.
.
Un segmento del gen V tiene un exn lder, un intrn y una
regin de codificacin variable.
.
El segmento del gen J-C tiene un exn corto de
codificacin J, un intrn y una regin de codificacin C.
.
Una cadena ligera k se ensambla por recombinacin simple
entre un segmento de gen V y uno de los cinco segmentos
J que preceden al gen C.
WM Las cadenas pesadas se ensamblan mediante dos
recombinaciones
.
Las unidades de recombinacin de cadenas pesadas son un
gen V, un segmento D y un segmento del gen J-C.
.
La primera recombinacin une a D con J-C.
.
La segunda recombinacin une V con D-J-C.
.
El segmento C consta de varios exones.
acn.i La recombinacin genera una gran diversidad
.
Un locus de cadena ligera produce ms de 1 000 cadenas
por ia combinacin de 300 genes V con cuatro a cinco
genes C.
.
Un locus H puede producir ms de 4 000 cadenas por
combinacin de 300 genes V, 20 segmentos D y cuatro
segmentos J.
wcm La recombinacin inmunitaria utiliza dos tipos de
secuencias de consenso
.
La secuencia de consenso utilizada para la recombinacin
es un heptmero separado de un nonmero por 12 o 23
pares de bases.
.
La recombinacin ocurre entre dos secuencias de consenso
con espaciamientos diferentes.
WJtw.m La recombinacin genera deleciones o inversiones
.
La recombinacin se debe a roturas de la doble cadena en
los heptmeros de dos secuencias de consenso.
.
Los extremos seal del fragmento entre roturas suelen
unirse para generar un fragmento circular escindido.
.
Los extremos de codificacin se enlazan de manera
covalente para unir V a J-C (cadena L) o D a J-C y V a D-J-C
(cadena H).
.
Si se invierten los genes recombinantes en lugar de unirse
en orientacin directa, hay una inversin y no una delecin
de un crculo escindido.
atua La exclusin allica es desencadenada por
rearreglo productivo
.
La recombinacin para generar un gen ntegro de
inmunoglobulina es productiva si lleva a la expresin de
una protena activa.
.
Un rearreglo productivo impide que ocurra cualquier rearre-
glo adicional, a diferencia del rearreglo no productivo.
.
La exclusin allica se aplica separadamente a las cadenas
ligeras (slo puede rearreglarse de manera productiva
una cadena k o X.) y a las pesadas (una cadena pesada se
rearregla de manera productiva).
wcmn Las protenas RAG catalizan la rotura y la nueva
unin
.
Las protenas RAG son necesarias y suficientes para la
reaccin de corte y empalme.
570
.
La RAG1 reconoce las secuencias de consenso
nonamricas para la recombinacin. La RAG2 se une a
RAG1 y se corta y empalma en el heptmero.
.
La reaccin se asemeja a la de resolucin tipo
topoisomerasa que ocurre en la transposicin.
.
Una de las histonas avanza a travs de un
intermediario en horquilla en el extremo de
codificacin; la abertura de la horquilla se encarga de
la insercin de bases adicionales (nucletidos T) en el
gen recombinado.
.
La transferasa de dexosinuclesidos inserta nucletidos
N adicionales en el extremo de codificacin.
.
La secuencia del codn del sitio de ta reaccin de
unin V-(D)J es muy variable y codifica el aminocido
95 en el sitio de unin del antgeno.
.
Las roturas de la doble cadena en las uniones de
codificacin son reparadas por el mismo sistema
involucrado en la unin de extremos no homlogos del
DNA daado.
.
Un reforzador del gen C activa al promotor del gen V
despus de que la recombinacin ha generado el gen
integro de inmunoglobulina.
wtmi La expresin de La cadena pesada temprana
puede cambiar por procesamiento
del RNA
.
Todos los linfocitos empiezan por sintetizar la forma
de IgM unida a la membrana.
.
Un cambio en el empalme del RNA hace que sea
remplazado por la forma secretada cuando la clula B
se diferencia.
watrj El cambio de clase es producto
de la recombinacin del DNA
.
Las inmunoglobulinas se dividen en cinco clases,
segn el tipo de regin constante de la cadena pesada.
.
El cambio de clase para modificar la regin C
H
se debe
a una recombinacin entre las regiones S que lleva a la
delecin de la regin entre la antigua C
H
y la nueva.
.
Pueden presentarse mltiples recombinaciones de
cambios sucesivos.
waiM El cambio se debe a una nueva reaccin de
recombinacin
.
Habr un cambio por una rotura de la doble cadena
seguida de la reaccin de unin no homloga de
extremos.
.
La caracterstica importante de una regin de cambio
son las repeticiones invertidas.
.
El cambio requiere de activacin de los promotores que
estn en direccin ascendente respecto de los sitios de
cambio.
muta La mutacin somtica genera otras diferencias
en el ratn y el ser humano
.
Los genes activos de inmunoglobulina tienen regiones
V con secuencias que cambian respecto de la lnea
germinativa por mutacin somtica.
.
Las mutaciones ocurren como sustituciones de bases
individuales.
.
Los sitios de mutacin se concentran en los sitios de
unin de antigeno.
.
El proceso depende del reforzador que activa la
transcripcin en el locus Ig.
wemvt la desaminasa de citidina y la glucosilasa de
uracilo inducen la mutacin somtica
.
Para la mutacin somtica y para el cambio de clase se
requiere de una desaminasa de citidina.
.
La actividad de glucosilasa de uracilo-DNA influye en
el patrn de mutaciones somticas.
.
Una hipermutacin puede empezar por la accin
secuencial de esas enzimas.
ntmvt Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a
partir de seudogenes
.
En el pollo, un gen de inmunoglobulina se genera
copiando una secuencia de uno de los 25 seudogenes
del gen V de un locus activo nico.
ntmw La clula B de memoria permite una respuesta
secundaria rpida
.
La respuesta primaria a un antgeno es montada por
las clulas B, que no sobreviven despus del periodo
de respuesta.
.
Se producen clulas B de memoria con especificidad
para el mismo antgeno, pero estn inactivas.
.
Una reexposicin al antgeno origina la respuesta
secundaria, en la cual las clulas de memoria se
activan rpidamente.
EMlBl Los receptores de las clulas T tienen relacin
con las inmunoglobulinas
.
Las clulas T usan un mecanismo similar de unin
V(D)J-C a las clulas B para producir uno de los dos
tipos de receptor de clulas T.
.
En > 95% de los linfocitos T se encuentra TCR ap; la
TCR 78 se encuentra en < 5 por ciento.
taill El receptor de la clula T acta con el MHC
.
El TCR reconoce a un pptido corto unido en un surco
de una protena del MHC en la superficie de la clula
presentadora.
Kfffpj El locus de histocompatibUidad mayor codifica
muchos genes del sistema inmunitario
.
El locus del MHC codifica las protenas de clases I y II,
as como otras del sistema inmunitario.
.
Las protenas de clase I son los antgenos de
trasplante encargados de distinguir entre tejidos
"
propios
"
y "ajenos".
.
Una protena de clase I del MHC acta como
heterodmero con la P
2
microglobulina.
.
Las protenas de clase II participan en las
intervenciones entre clulas T.
.
Una protena de clase II del MHC es un heterodmero
de cadenas a y p.
EMMl La inmunidad innata utiliza las vas de seal
conservadas
.
La inmunidad innata se desencadena por receptores
que reconocen segmentos (PAMP) altamente
conservados en bacterias u otros agentes infectantes
.
Suelen usarse receptores similares a tragamonedas
para activar la va de respuesta
.
Las vas se conservan mucho de invertebrados a
vertebrados y se encuentra una va anloga en las
plantas.
mw*i Resumen
CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria 571
Introduccin
Es un axioma de la gentica que todas las clulas
somticas del organismo heredan la constitucin
gnica creada en el cigoto por la combinacin de
espermatozoide y oocito. Para explicar los diferentes
fenotipos de clulas somticas especficas se observa
un control diferencial de la expresin gnica, ms
que cambios en el contenido del DNA.
Sin embargo, hay situaciones excepcionales en
que la reorganizacin de ciertas secuencias de DNA
regula la expresin gnica o crea nuevos genes.
El sistema inmunitario es un caso sorprendente y
amplio en el que el contenido del genoma cambia
cuando la recombinacin origina genes activos en
los linfocitos. Otros casos se deben a la sustitucin
de una secuencia por otra para modificar el tipo
de apareamiento de las levaduras o generar nuevos
antgenos de superficie por los tripanosomas.
La respuesta inmunitaria de los vertebrados
proporciona un sistema de proteccin que distingue
las protenas extraas de las propias del organismo
y reconoce la materia extraa (o parte) como cons-
tituyente de un antgeno. Por lo general, el antge-
no es una protena (o una molcula aadida a una
Los anticuerpos interactan con a
La secrecin de anticuerpos por la cluia B
requiere de clulas T auxiliares
Clula B, Clula T
Anticuerpos
51
Antgeno
Complejo
antgeno-anticuerpo
El macrfago
engulle al complejo
Complemento
FIGURA 23.1. La inmunidad humoral es conferida por La unin
de anticuerpos Libres y antgenos para formar complejos ant-
geno-anticuerpo eliminados de la corriente sangunea por los
macrfagos o que son atacados directamente por Las protenas
del complemento.
protena) que ha ingresado a la corriente sangunea
del animal, por ejemplo, la cubierta protenica de un
virus infeccioso. La exposicin a un antgeno inicia
la produccin de una respuesta inmunitaria, que
especficamente reconoce al antgeno y lo destruye.
Las reacciones inmunitarias son tarea de los
leucocitos, los linfocitos B y T y los macrfagos. Los
linfocitos reciben su nombre de los tejidos que los
producen. En los mamferos, las clulas B maduran
en la mdula sea, en tanto las clulas T maduran en
el timo. Cada clase de linfocito utiliza el rearreglo de DNA
como mecanismo para producir las protenas que le permiten
participar en la respuesta inmunitaria.
El sistema inmunitario tiene muchas formas
de destruir a un invasor antignico, pero convie-
ne considerarlas en dos clases generales. El tipo de
respuesta que monte el sistema inmunitario cuan-
do encuentra una estructura extraa depende, en
parte, de la naturaleza del antgeno. La respuesta se
define en funcin de que sea ejecutada principal-
mente por clulas B o por clulas T.
La respuesta humoral depende de las clulas
B y es mediada por la secrecin de anticuerpos, que
son protenas inmunoglobulnicas. La produccin
de un anticuerpo especfico para una molcula extraa
es el suceso principal del reconocimiento de un antgeno,
que implica que el anticuerpo se una a una pequea
regin de la estructura en el antgeno.
En la FIGURA 23.1 se representa la funcin de
los anticuerpos. La materia extraa que circula en
la sangre, por ejemplo, una toxina o una bacteria
patgena, tiene una superficie que presenta antge-
nos, los cuales son reconocidos por los anticuerpos
que forman complejos antgeno-anticuerpo. Dichos
complejos atraen despus la atencin de otros com-
ponentes del sistema inmunitario.
La respuesta humoral depende de esos otros
componentes en dos formas. Primero, las clulas
B necesitan seales de las clulas T para secretar
anticuerpos. Dichas clulas T se llaman clulas T
auxiliares porque facilitan la tarea de las clulas
B
. Segundo, la formacin del complejo antgeno-
anticuerpo es desencadenada por el antgeno que se
va a destruir. La principal va es la de la accin del
complemento, componente cuyo nombre refleja
su capacidad de constituir un
"
complemento
"
de la
accin del anticuerpo mismo. El complemento es un
conjunto de casi 20 protenas que acta en una serie
de actividades proteolticas. Si el antgeno blanco
es parte de una clula, por ejemplo, una bacteria
infectante, la accin del complemento culmina con
la lisis de la clula diana. La accin del complemen-
to tambin constituye un medio para atraer a los
macrfagos, que ingieren las clulas blanco o sus
productos; una alternativa es que el complejo activo
572 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
de un anticuerpo sea captado directamente por los
macrfagos (clulas carroeras) y destruido.
La respuesta mediada por clulas depende
de una clase de linfocitos T llamados clulas T ci-
totxicas (o clulas T asesinas). En la FIGURA 23.2
se indica la funcin bsica de la clula T en el reco-
nocimiento de un antgeno blanco. Por lo general,
ante un parsito intracelular, como un virus que
infecta las clulas del propio cuerpo, se produce
una respuesta mediada por clulas. Como resulta-
do de la infeccin vrica se exponen fragmentos de
antgenos extraos (vricos) en la superficie de la
clula. Dichos fragmentos son reconocidos por el
receptor de la clula T (TCR), que en la clula
T es el equivalente del anticuerpo producido por
una clula B.
Una caracterstica clave de esta reaccin de re-
conocimiento es que el antgeno debe ser presentado
por una protena celular integrante del MHC (com-
plejo mayor de histocompatibilidad). Dicha
protena tiene un surco en la superficie que se une
a un fragmento peptdico derivado del antgeno ex-
trao. La combinacin del fragmento peptdico y
la protena del MHC es reconocida por el receptor
de la clula T. Todo individuo tiene un conjunto
caracterstico de protenas del MHC importantes en
las reacciones ante un injerto; el injerto de tejido de
un individuo a otro es rechazado por la diferencia
de las protenas del MHC del donador y el receptor,
problema de gran importancia mdica. La necesidad
de que los linfocitos T reconozcan tanto al antgeno
extrao como a la protena del MHC asegura que la
respuesta mediada por clulas se produzca slo en
las clulas del hospedador que han sido infectadas
por un antgeno extrao. (La divisin de las prote-
nas del MHC en los tipos generales de clases I y II se
describe ms adelante, en la seccin 23.20, El locus
de histocompatibilidad mayor codifica los mltiples
genes del sistema inmunitario.)
El propsito de cada tipo de respuesta inmu-
nitaria es atacar un blanco extrao, y el reconoci-
miento de dicho blanco es prerrogativa de las inmu-
noglobulinas de las clulas B y los receptores de las
clulas T. Un aspecto crucial de su funcin yace en
la capacidad de distinguir lo "propio" de lo "ajeno".
Nunca deben ser atacadas las protenas y clulas del
cuerpo mismo, pero los blancos extraos deben ser
destruidos por completo. La propiedad de no atacar-
se
"
a s mismo
"
se llama tolerancia, cuya prdida
produce una enfermedad autolnmunitaria, en
la que el sistema inmunitario ataca al propio cuerpo,
a menudo con consecuencias desastrosas.
Qu impide que la reserva de linfocitos res-
ponda ante las protenas
"
propias
"
? Probablemente
la tolerancia aparece muy temprano en el desarrollo
de los linfocitos, cuando se destruyen las clulas B
y T que reconocen a los antgenos
"
propios
"
,
fen-
meno conocido como delecin clonal. Adems de
esa seleccin negativa, hay tambin una seleccin
positiva de clulas T que portan ciertos conjuntos
de receptores.
Un corolario de la tolerancia es que puede ser
difcil obtener anticuerpos con protenas que tengan
una relacin estrecha con las del propio organis-
mo. En la prctica, por lo tanto, puede ser difcil
usar (por ejemplo) ratones o conejos para obtener
anticuerpos contra protenas humanas que se han
conservado bien durante la evolucin de los ma-
mferos. La tolerancia del ratn o el conejo ante su
propia protena podra extenderse a las protenas
humanas en tales casos.
Cada uno de los tres grupos de protenas reque-
ridos por la respuesta inmunitaria, inmunoglobuli-
nas, receptores de clulas T y protenas del MHC,
son diferentes. El anlisis de un nmero importante
de individuos permiti encontrar muchas variantes de
cada protena, cada una de las cuales es codificada
por una gran familia de genes; en el caso de los an-
ticuerpos y los receptores de clulas T,
la diversidad
El receptor de la clula T se une
a fragmentos del antgeno
La clula blanco infectada
fragmenta el antgeno
f
\
Clula T asesina
O
1
El MHC "presenta" el antgeno al receptor de
la clula T
i
Clula T asesina
O
El linfocito T reconoce al
fragmento antignico + MHC
FIGURA 23.2 En la inmunidad mediada por clulas,
las clulas
T asesinas utilizan el receptar de clulas T para reconocer un
fragmento del antgeno extrao que la protena del MHC pre-
senta en la superficie de la clula blanco.
23.1 Introduccin 573
de las poblaciones aumenta por rearreglos del DNA
en los linfocitos importantes.
Las inmunoglobulinas y los receptores de las
clulas T son contrapartes directas, cada una pro-
ducida por su propio tipo de linfocito. La estruc-
tura de las protenas est relacionada, y sus genes
se relacionan en cuanto a organizacin; el origen
de dichas variaciones es similar. Las protenas del
MHC comparten tambin algunas caractersticas
comunes con los anticuerpos, igual que otras pro-
tenas especficas de linfocitos. As pues,
al abordar
la organizacin gnica del sistema inmunitario se
enfrenta una serie de familias de genes relaciona-
dos, de hecho una superfamilia que podra haber
evolucionado a partir de un ancestro comn que
representa una respuesta inmunitaria primitiva.
El reconocimiento del antigeno desencadena
la expansin clonal
-
nT .nrr -nr*
\ y
(
El linfocito
reconoce al
antgeno
Expansin
clonal
La reserva de linfocitos inmaduros contiene clu-
las B y T que forman anticuerpos y receptores con diversas es-
pecificidades. Su reaccin con un antigeno lleva a la expansin
clonal del linfocito con el anticuerpo (clula B) o el receptor
(clula T) que puede reconocer al antgeno.
La seLeccin cLonaL amplifica
Linfocitos que responden
a antgenos individuales
Conceptos principales
Cada linfocito B expresa una sola inmunoglobulina y
cada linfocito T, un solo receptor de clulas T.
Hay una gran variedad de inmunoglobulinas de clulas
B y receptores de clulas T.
La unin de un antgeno con una inmunoglobulina de
clulas B o un receptor de clulas T desencadena la
multiplicacin clonal.
El nombre de la respuesta inmunitaria describe una
de sus caractersticas medulares. Despus de que un
organismo se ha expuesto a un antgeno, se vuelve
inmune a los efectos de una nueva infeccin. Antes
de exponerse a un antgeno en particular, el orga-
nismo carece de la capacidad para enfrentar cuales-
quiera de sus efectos txicos, la cual adquirir du-
rante la respuesta inmunitaria. Una vez eliminada
la infeccin, el organismo conserva la capacidad de
responder rpidamente en caso de reinfeccin.
Esas caractersticas se ajustan a la teora de la
seleccin clonal ilustrada en la flGURA 23.3. La re-
serva de linfocitos contiene clulas B y T que portan
una gran variedad de inmunoglobulinas o recepto-
res de clulas T. Cualquier linfocito B individual pro-
duce una inmunoglobulina susceptible de reconocer slo
un antgeno, igual que un linfocito T individual produce
slo un receptor particular de clulas T.
En la reserva de linfocitos inmaduros, las c-
lulas B y T no estimuladas son morfolgicamente
indistinguibles, pero ante la exposicin a un ant-
geno, una clula B cuyo anticuerpo puede unirse
al antgeno, o una clula T cuyo receptor puede
reconocerlo, se estimula para dividirse, tal vez por
alguna retroalimentacin desde la superficie, don-
de ocurre la reaccin anticuerpo/receptor-antgeno.
Las clulas estimuladas se desarrollan entonces ha-
cia linfocitos B o T maduros, lo cual incluye cam-
bios morfolgicos que involucran, por ejemplo, un
aumento de tamao (especialmente pronunciado
en las clulas B).
La expansin inicial de una poblacin especfica
de clulas B o T ante la primera exposicin a un an-
tgeno se llama respuesta inmunitaria primaria,
la cual da lugar a la produccin de un gran nmero
de linfocitos B o T con especificidad para el antge-
no blanco. Cada poblacin representa un clon de la
clula de respuesta original. Las clulas B secretan
anticuerpos en grandes cantidades, e incluso po-
dran dominar a la poblacin de anticuerpos.
574 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
de las poblaciones aumenta por rearreglos del DNA
en los linfocitos importantes.
Las inmunoglobulinas y los receptores de las
clulas T son contrapartes directas, cada una pro-
ducida por su propio tipo de linfocito. La estruc-
tura de las protenas est relacionada, y sus genes
se relacionan en cuanto a organizacin; el origen
de dichas variaciones es similar. Las protenas del
MHC comparten tambin algunas caractersticas
comunes con los anticuerpos, igual que otras pro-
tenas especficas de linfocitos. As pues, al abordar
la organizacin gnica del sistema inmunitario se
enfrenta una serie de familias de genes relaciona-
dos, de hecho una superfamilia que podra haber
evolucionado a partir de un ancestro comn que
representa una respuesta inmunitaria primitiva.
El reconocimiento del antigeno desencadena
la expansin clonal
I
El linfocito
reconoce al
antgeno
Expansin
clonal
La reserva de linfocitos inmaduros contiene clu-
las B y T que forman anticuerpos y receptores con diversas es-
pecificidades. Su reaccin con un antgeno lleva a la expansin
clonal del linfocito con el anticuerpo (clula B) o el receptor
(clula T) que puede reconocer al antgeno.
La seLeccin donaL amplifica
Linfocitos que responden
a antgenos individuales
Conceptos principales
Cada linfocito B expresa una sola inmunoglobulina y
cada linfocito T, un solo receptor de clulas T.
Hay una gran variedad de inmunoglobulinas de clulas
B y receptores de clulas T.
La unin de un antgeno con una inmunoglobulina de
clulas B o un receptor de clulas T desencadena la
multiplicacin clonal.
El nombre de la respuesta inmunitaria describe una
de sus caractersticas medulares. Despus de que un
organismo se ha expuesto a un antgeno, se vuelve
inmune a los efectos de una nueva infeccin. Antes
de exponerse a un antgeno en particular, el orga-
nismo carece de la capacidad para enfrentar cuales-
quiera de sus efectos txicos, la cual adquirir du-
rante la respuesta inmunitaria. Una vez eliminada
la infeccin, el organismo conserva la capacidad de
responder rpidamente en caso de reinfeccin.
Esas caractersticas se ajustan a la teora de la
seleccin clonal ilustrada en la GURA 23.3. La re-
serva de linfocitos contiene clulas B y T que portan
una gran variedad de inmunoglobulinas o recepto-
res de clulas T. Cualquier linfocito B individual pro-
duce una inmunoglobulina susceptible de reconocer slo
un antgeno, igual que un linfocito T individual produce
slo un receptor particular de clulas T.
En la reserva de linfocitos inmaduros, las c-
lulas B y T no estimuladas son morfolgicamente
indistinguibles, pero ante la exposicin a un ant-
geno, una clula B cuyo anticuerpo puede unirse
al antgeno, o una clula T cuyo receptor puede
reconocerlo, se estimula para dividirse, tal vez por
alguna retroalimentacin desde la superficie, don-
de ocurre la reaccin anticuerpo/receptor-antgeno.
Las clulas estimuladas se desarrollan entonces ha-
cia linfocitos B o T maduros, lo cual incluye cam-
bios morfolgicos que involucran, por ejemplo, un
aumento de tamao (especialmente pronunciado
en las clulas B).
La expansin inicial de una poblacin especfica
de clulas B o T ante la primera exposicin a un an-
tgeno se llama respuesta inmunitaria primaria,
la cual da lugar a la produccin de un gran nmero
de linfocitos B o T con especificidad para el antge-
no blanco. Cada poblacin representa un clon de la
clula de respuesta original. Las clulas B secretan
anticuerpos en grandes cantidades, e incluso po-
dran dominar a la poblacin de anticuerpos.
574 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
Despus de que se ha montado una respuesta
inmunitaria primaria exitosa, el organismo conser-
va clulas B y T que portan el anticuerpo o recep-
tor correspondiente. Estas clulas de memoria
representan un estado intermedio entre la clula
madura y la inmadura; no han adquirido todas las
caractersticas de las clulas maduras, pero tienen
una vida prolongada y rpidamente pueden llegar a
serlo. Su presencia permite montar una respuesta
inmunitaria secundaria rpidamente si el animal
es expuesto otra vez al mismo antgeno.
La reserva de linfocitos inmaduros del mam-
fero contiene ~1012 clulas, algunos con especifi-
cidades nicas (porque nunca han encontrado un
antgeno correspondiente), en tanto que otros estn
representados hasta por 10
6
clulas (porque la se-
leccin clonal ha expandido la reserva celular para
responder al antgeno).
Qu caractersticas se reconocen en un an-
tgeno? Los antgenos suelen ser macromolecula-
res, y si bien las molculas pequeas pueden tener
determinantes antignicos y ser reconocidas por
anticuerpos, por lo general no son eficaces para
provocar una respuesta inmunitaria (por su redu-
cido tamao); no obstante, la provocan cuando se
conjugan con una molcula portadora ms grande
(por lo general una protena). La molcula pequea
utilizada para provocar una respuesta mediante esos
mecanismos se llama hapteno.
En realidad, slo una pequea parte de la su-
perficie de un antgeno macromolecular es reco-
nocida por alguno de los anticuerpos. El sitio de
unin consta de slo cinco o seis aminocidos, pero,
obviamente, una protena en particular puede tener
ms de uno de esos sitios de unin, en cuyo caso,
produce anticuerpos con especificidad para diferen-
tes regiones. La regin que provoca una respuesta se
denomina determinante antignico o eptopo.
Cuando un antgeno contiene varios eptopos, algu-
nos suelen ser ms eficaces que otros para provocar
la respuesta inmunitaria; de hecho, pueden ser tan
eficaces como para que dominen por completo la
respuesta.
Cmo encuentran antgenos blanco los linfo-
citos y dnde ocurre su maduracin? Los linfocitos
son clulas peripatticas que se desarrollan a partir
de clulas madre inmaduras localizadas en la m-
dula sea del adulto y que emigran a los tejidos lin-
foides perifricos (bazo, ganglios linfticos), ya sea
en forma directa por la corriente sangunea (si son
clulas B), o a travs del timo (donde se convierten
en clulas T). Los linfocitos tienen recirculacin en-
tre sangre y linfa; el proceso de dispersin asegura
que un antgeno ser expuesto a los linfocitos de to-
das las especificidades posibles. Cuando un linfocito
encuentra un antgeno que se une a su anticuerpo
o receptor, la expansin clonal inicia la respuesta
inmunitaria.
Los genes
de Las inmunoglobulinas
se ensambLan en los linfocitos
a partir de sus constituyentes
Conceptos principales
.
Una inmunoglobulina es un tetrmero de dos cadenas
ligeras y dos pesadas.
.
Las cadenas ligeras pertenecen a las familias X y k; las
cadenas pesadas forman una sola familia.
.
Cada cadena tiene una regin terminal N variable (V) y
una regin terminal C constante (C).
.
EL segmento V reconoce al antgeno y el C provee la
respuesta efectora.
Los segmentos V y C son codificados separadamente
por segmentos de los genes V y C.
.
Para unir un segmento del gen V con uno del gen
C
, por recombinacin somtica se genera un cdigo
gnico de una cadena ntegra de inmunoglobulina.
Una caracterstica notoria de la respuesta inmuni-
taria es la capacidad de un animal de producir un
anticuerpo apropiado siempre que se exponga a
un nuevo antgeno. Cmo puede el organismo es-
tar preparado para producir anticuerpos protenicos,
cada uno diseado especficamente para reconocer
un antgeno, cuya estructura no puede preverse?
Para fines prcticos, suele considerarse que un
mamfero tiene la capacidad de producir de 106 a
108anticuerpos diferentes, cada uno de los cuales es
un tetrmero de inmunoglobulina, constituido por
dos cadenas ligeras (L) y dos cadenas pe3aidas
(H) idnticas. Si una cadena ligera puede vincularse
con una pesada para producir de 106 a 108 anticuer-
pos potenciales, se requieren de 10' a 104 cadenas
ligeras y de 103 a 10*1 cadenas pesadas diferentes.
Hay dos tipos de cadenas ligeras y -10 tipos de
cadenas pesadas. Las diferentes clases de inmunoglo-
bulinas tienen funciones efectoras diversas. La clase
depende de la regin constante de la cadena pesada,
que ejerce la funcin efectora (vase la Fig. 23.17).
La estructura del tetrmero de inmunoglobuli-
na se ilustra en la FIGURA 23.4 Las cadenas ligeras y
las pesadas comparten el mismo tipo general de or-
ganizacin, donde cada cadena protenica consta de
dos regiones principales, la regin v.-aiiabte (regin
V) N terminal y la regin conytrite jTvgifin C)
C terminal, definidas originalmente por compara-
cin de las secuencias de aminocidos de diferentes
23.3 Los genes de las inmunoglobulinas se ensamblan en los linfocitos a partir de sus constituyentes
Un anticuerpo tetramrico tiene dominios definidos
Dominio V
Unin de antigeno
V
H1
Dominio C1 L
Bisagra
Cadena ligera
Dominio 02
H2
Dominio C3
He
Funciones
efectoras
/
Cadena pesada
HGURA 23.4 Las cadenas pesadas y ligeras se combinan para
formar una inmunoglobulina con varios dominios bien defi-
nidos.
cadenas de inmunoglobulinas. Como los nombres
sugieren, las regiones variables muestran cambios
considerables en la secuencia de una protena a la
siguiente, en tanto que las constantes muestran se-
mejanzas sustanciales.
Las regiones correspondientes de las cadenas li-
geras y pesadas se vinculan para generar dominios
diferentes en la protena inmunoglobulina.
El dominio variable (V) se genera por la vin-
culacin entre las regiones variables de las cadenas
ligera y pesada. El dominio V se encarga del reconoci-
miento del antgeno. Una inmunoglobulina tiene una
estructura con forma de Y, donde los brazos son
idnticos y cada uno tiene una copia del dominio
V
. La produccin de dominios V de diferentes es-
pecificidades da lugar a la capacidad de responder
a diversos antgenos. El nmero total de regiones
variables para las protenas de cadena ligera o pe-
sada se mide en cientos; as, la protena muestra la
mxima versatilidad en la regin encargada de la unin
del antgeno.
El nmero de regiones constantes es bastante
ms reducido que el de regiones variables, por lo
general, slo hay una a diez regiones C en un tipo
especfico de cadena. Las regiones constantes de las
subunidades del tetrmero de inmunoglobulina se
relacionan para generar varios dominios C indivi-
duales, el primero de los cuales es resultado de la
relacin entre la regin constante nica de la cade-
na ligera (C
L
) y la parte CH] de la regin constante
de la cadena pesada. Las dos copias de este dominio
completan los brazos de la molcula en forma de Y.
El vnculo entre las regiones C de las cadenas pesa-
das genera los dominios C restantes, cuyo nmero
vara segn el tipo de cadena pesada.
Al comparar las caractersticas de la regin va-
riable y la constante se llega al dilema central de
la estructura del gen de inmunoglobulina. Cmo
codifica el genoma un conjunto de protenas donde
una cadena polipeptdica individual debe tener una
de menos de diez posibles regiones C, pero puede
tener alguna de varios cientos de posibles regiones
V? Resulta que el nmero de secuencias de codifica-
cin para todo tipo de regin refleja su variabilidad.
Hay muchos genes que codifican regiones V, pero
slo unos cuantos codifican regiones C.
En ese contexto, "gen " significa una secuencia del
DNA que codifica una parte definida del polipptido final
de inmunoglobulina (cadena pesada o ligera). As, los
genes V codifican regiones variables y los genes
C
, regiones constantes, si bien ninguno se expre-
sa como unidad independiente. Para construir una
unidad que pueda expresarse en forma de una cade-
na ligera o pesada autntica, un gen V debe unirse
fsicamente a un gen C. En ese sistema, dos "genes"
codifican un polipptido; para evitar confusiones, se
har referencia a estas unidades como "segmentos
de gen", ms que "genes".
Las secuencias que codifican las cadenas ligeras
y pesadas se ensamblan de la misma forma, uno de
muchos segmentos del gen V puede unirse a uno de unos
cuantos segmentos del gen C. Esta recombinacin so-
mtica ocurre en el linfocito B, donde se expresa el anti-
cuerpo. El gran nmero de segmentos disponibles del
gen V se encarga de la mayor parte de la diversidad
de las inmunoglobulinas, si bien no toda la diver-
sidad est codificada en el genoma, parte se genera
por cambios que se presentan durante el proceso de
construccin de un gen funcional.
En esencia, la misma descripcin se aplica a la
formacin de genes funcionales que codifican las
cadenas protenicas del receptor de las clulas T,
que puede ser de dos tipos, uno constituido por dos
variantes de cadena llamadas a y P y otro constitui-
do por cadenas yy b. Como los genes que codifican
las inmunoglobulinas, los que codifican las cadenas
individuales de receptores de clulas T constan de
partes separadas, que incluyen regiones V y C, las
cuales se unen en una clula T activa (ver seccin
23.18, Los receptores de las clulas T tienen relacin
con las inmunoglobulinas).
As pues, el hecho crucial acerca de la sntesis de
las inmunoglobulinas es que el arreglo de los segmentos
de los genes Yy C es diferente en las clulas que producen
las inmunoglobulinas (o receptores de clulas T) del de
todas las otras clulas somticas o germinativas.
La construccin del gen de una inmunoglobu-
lina o un receptor de clula T funcionales pudiese
576 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
parecer un proceso de Lamarck, que representa un
cambio en el genoma que responde a una caracte-
rstica particular del fenotipo (el antgeno). Al na-
cer, el organismo no posee el gen funcional para
producir un anticuerpo o receptor de clula T en
particular, sino un gran nmero de segmentos del
gen V y un nmero ms pequeo de segmentos
del gen C. La construccin subsiguiente de un gen
activo con esas partes permite la sntesis del anti-
cuerpo o receptor, de manera que est disponible
para reaccionar con el antgeno. La teora de selec-
cin clonal implica que ese rearreglo del DNA tenga
lugar antes de la exposicin al antgeno, que enton-
ces da lugar a la seleccin de las clulas que portan
una protena susceptible de unirse al antgeno. El
proceso completo ocurre en las clulas somticas y
no afecta a las de la lnea germinativa, por tanto,
la respuesta a un antgeno no es heredada por la
progenie del organismo.
Hay dos familias de cadenas ligeras de inmu-
noglobulinas, k y ?i, y una que contiene todos los
tipos de cadena pesada (H). Cada familia reside en
un cromosoma diferente y consta de su propio con-
junto de segmentos de genes V y C, el denominado
patrn de lnea germinativa, que se encuentra en la
lnea germinativa y en las clulas somticas de todos
los linajes diferentes al sistema inmunitario.
No obstante, en una clula que expresa un anti-
cuerpo, cada una de sus cadenas, una de tipo ligero
(k o A,) y una de tipo pesado, es codificada por un
gen integro nico. El suceso de recombinacin que
lleva a un segmento del gen V a unirse con uno del
gen C crea un gen activo constituido por exones que
corresponden precisamente a los dominios funcio-
nales de la protena. Los intrones se retiran en la
forma usual por empalme del RNA.
La recombinacin entre segmentos de los genes
V y C para dar loci funcionales ocurre en una pobla-
cin de linfocitos inmaduros. Un linfocito B suele
tener slo un rearreglo productivo de segmentos del
gen de cadena ligera (k o 1) y uno de los segmentos
del gen de cadena pesada, igual que un linfocito T
rearregla de manera productiva un gen a y uno [3,
o un gen 5 y uno y. El anticuerpo o receptor de c-
lula T producido por cualquier clula depende de la
configuracin particular de segmentos de los genes
V y C que se han unido.
Los principios por los que se ensamblan los ge-
nes funcionales son los mismos en cada familia, pero
hay diferencias en los detalles de la organizacin de
los segmentos de los genes V y C, as como en la re-
accin de recombinacin entre ellos. Adems de los
segmentos de los genes V y C, en los loci somticos
funcionales se incluyen otras secuencias cortas de
DNA (incluidos los segmentos J y D).
Las cadenas Ligeras
se ensamblan
por recombinacin nica
Conceptos principales
.
Una cadena ligera X se ensambla por recombinacin
simple entre un gen V y un segmento del gen J-C.
Un segmento del gen V tiene un exn lder, un intrn y
una regin de codificacin variable.
.
El segmento del gen J-C tiene un exn corto de codifi-
cacin J, un intrn y una regin de codificacin C.
Una cadena ligera k se ensambla por recombinacin
simple entre un segmento de gen V y uno de los cinco
segmentos J que preceden al gen C.
Una cadena ligera X se ensambla a partir de dos
porciones, como se ilustra en la FIGURA 23.5. El seg-
mento del gen V consta del exn lder (L) separado
del segmento variable (V) por un solo intrn. El
segmento del gen C consta del segmento J, separado
por un solo intrn del exn constante (C).
El nombre del segmento J es una abreviatu-
ra de juntura, porque identifica la regin en que
se conecta con el segmento V. As,
la reaccin de
juntura no implica directamente a los segmentos
de los genes V y C, sino que se presenta a travs
del segmento J; cuando se describe la unin de dos
"
segmentos de genes V y C" de cadenas ligeras,
en
realidad se hace referencia a la unin V-JC.
El segmento J es corto y codifica los ltimos
aminocidos de la regin variable,
como definen sus
secuencias. En el gen ntegro generado por recom-
binacin, el segmento V-J constituye un solo exn
que codifica a la regin variable completa.
Las consecuencias de la reaccin de juntura k se
ilustran en la IGURA 23 . Una cadena ligera k tam-
bin se ensambla a partir de dos porciones, pero hay
una diferencia en la organizacin del segmento del
gen C. Un grupo de cinco segmentos J se dispersa en
una regin de 500 a 700 bp, separados por un intrn
de 2 a 3 kb del exn C
K
. En el ratn, el segmento J
central no es funcional (\i/J3). Un segmento pue-
de unirse a cualquiera de los segmentos J.
Sea cual sea el segmento J utilizado, se convier-
te en la parte terminal del exn variable ntegro.
Cualquier segmento J a la izquierda del segmento
de recombinacin J se pierde (en la figura se ha
perdido Jl).
El segmento J ubicado a la derecha del segmen-
to J recombinante se trata como parte del intrn
situado entre el exn variable y el constante (en
la figura, J3 se incluye en el intrn que se empal-
ma).
23.4 Las cadenas ligeras se ensamblan por recombinacin nica
577
n generados por recombina
Gen V Gen 0
Lder Intrn Variable Segmento J Intrn Constante
Codones V'\ V\ \ V\<\<\.
< \'\'\ :C
de lnea -193-4 -4 a+97 98 a 110 IIOaCOOH
germinativa
Reccmbinacin
somtica
DNA de llnfocito
Transcripcin
RNA nuclear
RNAm
"
Unin V-J
Empalme
Traduccin
Cadena ligera de inmunogiobuiina
Variable Constante
FIGURA 23.5 EL segmento gnico C /l es precedido por un segmento J, de manera que la recom-
binacin V-J genera un gen de cadena Ligera X funcional.
Los genes k se generan por recombinacion V-J
Lder Intrn Variable J1
Lnea germinativa
Reccmbinacin somtica en J2
1
J2 J3 J3 J3 Intrn Constante
DNA de llnfocito sl'X'X* \F/MBBM
Transcripcinj
\
Un.,n
RNA nuclear
RNAm
Cadena ligera de
inmunogiobuiina
V-J
J2 J3
Empalme de J2 a C
i
Traduccin
Variable Constante
FIGURA 23, El segmento gnico C k es precedido por mltiples segmentos J en la linea germinati-
va. La unin V-J reconoce a cualquiera de los segmentos J, que despus se empalma con el segmento
gnico C, durante el procesamiento del RNA.
5?5 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
Todos los segmentos J funcionales poseen una
seal en el lmite izquierdo que hace posible la re-
combinacin con el segmento V; tambin poseen
una seal en el lmite derecho que se puede usar
para el empalme con el exn C. Cualquier segmen-
to J reconocido en la unin D-J del DNA utiliza su
seal de empalme en el procesamiento del RNA.
gna Las cadenas pesadas se
ensambLan mediante
dos recombinaciones
Conceptos principales
.
Las unidades de recombinacin de cadenas pesadas son
un gen V, un segmento D y un segmento del gen J-C.
.
La primera recombinacin une a D con J-C.
.
La segunda recombinacin une a V con D-J-C.
.
El segmento C consta de varios exones.
La construccin de la cadena pesada implica un seg-
mento adicional. El segmento D (por diversidad)
se descubri merced a la presencia de dos a trece
aminocidos adicionales en la protena, entre las
secuencias codificadas en los segmentos V y J. Un
arreglo de >10 segmentos D yace en el cromosoma,
entre los segmentos V
H
y los cuatro JH.
La unin V-D-J ocurre en dos etapas, como se
ilustra en la FIGURA 23.7. El primero de los segmen-
tos D se recombina con un segmento J
H
; un seg-
mento V
H
se auna entonces con el segmento com-
binado DJ
H
. La reconstruccin lleva a la expresin
del segmento C
H
adyacente (que consta de varios
exones). (En la seccin 23.12, El cambio de clase es
producto de la recombinacin del DNA, se analiza
el uso de los diferentes segmentos del gen C
H
; por
ahora, slo se considerar la reaccin en cuanto
a la conexin con uno de varios segmentos J que
preceden al segmento del gen CH.)
Los segmentos D se organizan en forma seriada.
El locus de cadena pesada del ratn contiene 12 seg-
mentos D de longitud variable, en tanto que el locus
humano tiene -30 segmentos D (no necesariamente
todos activos). Algn mecanismo desconocido debe
garantizar que el mismo segmento D participe en las
reacciones de unin D-J y V-D (cuando se describe
la unin de los segmentos de los genes V y C para
cadenas pesadas se supone que el proceso ha sido
concluido por reacciones de unin V-D y D-J).
Los segmentos V de las tres familias de inmuno-
globulinas son similares en cuanto a organizacin.
El primer exn codifica las secuencias de seal (im-
plicadas en la unin con la membrana) y el segun-
do, la porcin principal de la propia regin variable
(<100 codones de longitud), el resto proviene del
segmento D (slo en la familia H) y de un segmento
J (en las tres familias).
La estructura de la regin constante depende
del tipo de cadenas. Para ambas cadenas ligeras, k
o X, dicha regin es codificada por un exn nico
(que se convierte en el tercer exn del gen activo
reconstruido). Para las cadenas H, la regin cons-
tante es codificada por varios exones; de manera
equivalente, en la cadena protenica que se mues-
tra en la Figura 23.4, diversos exones codifican las
lan por reco
Lder Intrn Variable D1-D10 J1-J4 Intrn Constante
Lnea germinativa
Unin D-J
-
Unin D-J
Unin V-D |
Unin V-D
DNA de linfocito
La estructura actual del gen C se interrumpe
CH1 Bisagra CH2 CH3
intrn Intrn Intrn
FIGURA 23.7 Los genes de las cadenas pesadas se ensamblan por reacciones secuenciales de unin.
Primero, un segmento D se une a un segmento J, y despus un segmento gnico V se une al seg-
mento D.
23.5 Las cadenas pesadas se ensamblan por dos recombinaciones
579
regiones C
H1/
de bisagra, C
H2
y CH3. Cada exn CH
tiene -100 codones de longitud y la bisagra es ms
corta. Los intrones suelen ser relativamente peque-
os (-300 bp).
La recombinacin genera una
gran diversidad
Conceptos principales
Un Locus de cadena Ligera produce ms de 1 000
cadenas por la combinacin de 300 genes V con cuatro
a cinco genes C.
Un Locus H puede producir ms de 4 000 cadenas por
combinacin de 300 genes V, 20 segmentos D y cuatro
segmentos J.
Ahora deben revisarse los diferentes tipos de seg-
mentos de los genes V y C para ver qu tanta di-
versidad se adapta a la variedad de regiones de co-
dificacin que porta la lnea germinativa. En cada
familia del gen de cadena ligera de Ig, muchos seg-
mentos del gen V se vinculan con un nmero mu-
cho menor de segmentos del gen C.
/, tiene genes V y segmentos J-C
Segmentos gnicos
i ii i iii i*fi
J
X1
C
A1
J
X2
C
X2
J
).3
C
X3
'
.
I ! l!
2 en el ratn 4 segmentos gnicos J-C en el ratn
-
300 en el hombre >6 segmentos J-C en el hombre
FIGURA 23.8 La familia X consta de segmentos gnicos V uni-
dos a un nmero pequeo de segmentos gnicos J-C.
La familia k tiene slo un gen C
36 V
.
40 V
.
Mi
J
1-5
mil
9 Las familias k humana y de ratn constan de
segmentos gnicos V unidos a cinco segmentos J conectados
a un solo segmento gnico C.
El locus de la cadena pesada de Ig ocupa vanos cientos de kb
Genes V
H -Segmentos DJ
-300 -20 6 .uf
P lili .
Segmentos del gen C-
f Y1 VE"1 VY f y B a2
11 11
kb 300 250 200 150 100 50
3.10 Un solo grupo gnico humano contiene toda la infor-
macin para el ensamblaje del gen de cadena pesada.
En la FIGURA 23.8 se muestra que el locus X tiend
~
6 segmentos del gen C, cada uno precedido poa
su propio segmento J. En el ratn, el locus X tieJ
ne mucho menos diversidad que el locus humanal
la principal diferencia es que en el ratn hay soleo
dos segmentos del gen V
,
,
cada uno enlazadcH
con dos regiones J-C. De los cuatro segmentos del!
gen Cl, uno est inactivo. En algn punto en el paJ
sado, el ratn sufri una delecin catastrfica de la
mayor parte de los segmentos del gen V
x
de lneiJ
germinativa.
En la FIGURA 23.9 se muestra que el locus k tiene?
slo un segmento del gen C, si bien es precedidoa
por cinco segmentos J (uno de ellos inactivo). LoS
segmentos del gen V
k
ocupan un gran grupo deM
cromosoma, en direccin ascendente respecto de laj
regin constante. El grupo humano tiene dos regioJ
nes; inmediatamente antes del segmento del gen Cj
una regin de 600 kb contiene los cinco segmento
J
K
y 40 segmentos del gen V . Una hendidura de 800';
kb separa esa regin de otro grupo de 36 segmentse
del gen V
k
.
Los segmentos del gen V
k
se pueden subdividir-
en familias que se definen segn el criterio de que
los miembros de una familia tienen >80% de iden-
tidad de los aminocidos. La familia del ratn es
desusadamente grande (~1 000 genes), y hay -isj
familias Y
K
, cuyo tamao vara de 2 a 100 miem-
bros. Como en otras familias de genes relaciona-
dos, los segmentos del gen V relacionados forman
subgrupos generados por duplicacin y divergencia
a partir de los miembros ancestrales individuales.
Sin embargo, muchos de los segmentos V son seu-
dogenes inactivos, y <50 posiblemente se usen para
generar inmunoglobulinas.
Un linfocito determinado genera ya sea una ca-
dena ligera k o una X para relacionarse con la ca-
dena pesada. En el hombre, -60% de las cadenas
ligeras es k y -40% es X. En el ratn, el 95% de
las clulas B expresa el tipo k de la cadena ligera,
supuestamente porque el nmero de segmentos del
gen X es menor.
El locus nico para la produccin de cadenas
pesadas en el hombre consta de varias secciones de-
finidas, como se resume en la FIGURA 23.10, y es si-
milar en el ratn, donde hay ms segmentos del gen
V
H,
menos segmentos D y J y una ligera diferencia
en el nmero y la organizacin de los segmentos del
gen C. El miembro 3
'
del grupo V
H
est separado por
slo 20 kb del primer segmento D. Los segmentos
D se distribuyen en -50 kb, seguidos del grupo de
segmentos J. En los siguientes 220 kb se encuentran
todos los segmentos del gen C
H,
de los cuales, nueve
son funcionales, y dos seudogenes. La organizacin
sugiere que un segmento del gen y debe haberse du-
580 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
plicado para producir el subgrupo y-y-e-a, despus
de lo cual se duplic el grupo entero.
Hasta qu grado la diversidad de la informa-
cin de lnea germinal genera la variedad de la re-
gin V de las protenas inmunoglobulinas? Combi-
nando cualquiera de los -50 segmentos del gen V
con cualquiera de los cuatro a cinco segmentos J,
un locus usual de cadena ligera tiene el potencial
de producir casi 250 cadenas; el locus de la cadena
H est todava ms diversificado. Por la combina-
cin de cualquiera de los -50 segmentos V
H/
20 seg-
mentos D y cuatro segmentos J, el genoma podra
producir 4 000 regiones variables para acompaar
cualquier segmento del gen C
H
. En los mamferos,
se es el punto de partida de la diversidad, pero
hay mecanismos adicionales que introducen ms
cambios. Cuando se analizan variantes estrechamente
relacionadas de las inmunoglobulinas, a menudo hay
ms protenas de las que pudiera pensarse por el nme-
ro de segmentos correspondientes del gen V. Los nuevos
miembros son creados por cambios somticos en los
genes individuales, durante o despus del proceso
de recombinacin (ver seccin 23.14, La mutacin
somtica genera diversidad adicional en el ratn y
el hombre),
La recombinacin inmunitaria
utiliza dos tipos de secuencia
de consenso
Conceptos principales
.
La secuencia de consenso utilizada para la
recombinacin es un heptmero separado de un
nonmero por 12 o 23 pares de bases.
.
La recombinacin ocurre entre dos secuencias de
consenso con espaciamientos diferentes.
El ensamblaje de genes de la cadena ligera y la pesa-
da implica el mismo mecanismo (aunque el nmero
de partes es diferente), se encuentran las mismas
secuencias de consenso en los lmites de todos los
segmentos de la lnea germinativa que participan en
las reacciones de unin. Cada secuencia de consen-
so consta de un heptmetro separado de un non-
mero por 12 o 23 bp.
En la FIGURA 23.11 se ilustra la relacin de las
secuencias de consenso en los loci de Ig de ratn.
En el locus k, cada segmento del gen va seguido
de una secuencia de consenso con un espaciamien-
to de 12 bp; cada segmento J es precedido por una
secuencia de consenso con espaciamiento de 23 bp;
la orientacin de las secuencias de consenso V y J
est invertida. En el locus X, cada segmento del gen
V
,
va seguido de una secuencia de consenso con
espaciamiento de 23 bp, y cada segmento del gen
3-
k
es precedido por una secuencia de consenso de
12 bp de tipo espaciador.
La regla que rige la reaccin de juntura es que
una secuencia de consenso con un tipo de espaciamien-
to puede unirse slo a una secuencia de consenso con el
otro tipo de espaciamiento. Las secuencias de consenso
de los segmentos V y J pueden estar en cualquier
orden, de modo que los diferentes espaciamientos
no imparten ninguna informacin direccional,
sino
que sirven para evitar que un segmento del gen V o
J se recombine con otro igual.
Este concepto se confirma por la estructura de
los componentes de los segmentos del gen de la ca-
dena pesada. Cada segmento del gen V
H
va seguido
de una secuencia de consenso de tipo espaciador de
23 bp. Los segmentos D son flanqueados a uno y
otro lado por secuencias de consenso de tipo espa-
ciador de 12 bp. Los segmentos J
H
son precedidos
por secuencias de consenso de tipo espaciador de
23 bp. As, el segmento del gen V debe unirse a un
segmento D, y ste, a un segmento J. Un segmento
del gen V no puede unirse directamente con un
segmento J, porque ambos poseen el mismo tipo de
secuencia de consenso.
El espaciamiento entre los componentes de las
secuencias de consenso corresponde casi a uno o
dos giros de la doble hlice, lo cual podra reflejar
una relacin geomtrica en la reaccin de combina-
cin. Por ejemplo, las protenas de recombinacin
pueden acercarse al DNA lateralmente, de la misma
forma que la polimerasa de RNA y los represores
se aproximan a los elementos de reconocimiento,
como promotores y operadores.
heptmetro-espaciador-nonmero
Heptmetro Nonmero Nonmero Heptmetro
CACAGTG ACAAAAACC GGTTTTTGTCACTGTG
GTGTCACTGTTTTTGG CCAAAAAC AG T G A C A C
Espaciador
de 12 bp
Espaciador
de 23 bp
FIGURA 23.11 Las secuencias de consenso estn presentes en orienta-
cin invertida en cada par de sitios de recombinacin. En un miembro
de cada par, el espaciamiento entre sus componentes es de 12 bp, y en
el otro, de 23 bp.
23.7 La recombinacin inmunitaria utiliza dos tipos de secuencia de consenso 581
La recombinacin genera
deLeciones o inversiones
Conceptos principales
La recombinacin se debe a roturas de La doble cadena
en los heptmeros de dos secuencias de consenso.
Los extremos seal del fragmento entre roturas suelen
unirse para generar un fragmento circular escindido.
Los extremos de codificacin se enlazan de manera
covalente para unir V a J-C (cadena L) o D a J-C y V a
D
-J-C (cadena H).
Si se invierten los genes recombinantes en lugar de
unirse en orientacin directa, hay una inversin y no
una delecin de un circulo escindido.
La recombinacin de los componentes de los genes
de inmunoglobulina se logra mediante un rearre-
glo fsico de secuencias que implica rotura y nue-
va unin, pero el mecanismo es diferente del de
la recombinacin homologa. En la IGURA 23.12 se
ilustran las caractersticas generales de la reaccin
para una cadena X ligera. (La reaccin es similar en
el locus de la cadena pesada, con la salvedad de que
hay dos sucesos de recombinacin, primero D-J y
despus, V-DJ.)
La rotura y nueva unin tienen lugar como re-
acciones independiente; hay una rotura de la doble
cadena de los hectmeros que yacen en los extre-
Los extremos de los heptmeros identifican los
extremos de codificacin
Espaciador
de 12 bp
Escisin
Espaciador
de 23 bp
Extremo seal Extremo seal
-
Extremo de
codificacin
Extremo de
codificacin
Juntura'
Juntura de
codificacin
/Juntura seal
FIGURA 23.12 La rotura y nueva unin en secuencias de con-
senso genera genes de inmunoglobulinas.
mos de las unidades de codificacin, lo cual lber?
todo el fragmento entre el segmento del gen V I
el del gen J-C; los puntos terminales de ese frag-
mento se denominan trminos seal. El extreme
fragmentado de los loci V y J-C se llama trmino
de codificacin. Los dos extremos de codificacin
tienen enlace covalente para formar una unin de
codificacin, la cual enlaza los segmentos V y J si
tambin se conectan los dos extremos seal, el frag-
mento escindido formara una molcula circular.
Se ha demostrado que los loci V y J-C estn
organizados con la misma orientacin, de modo que
el corte de cada secuencia de consenso libera entre
ellos una regin como fragmento lineal. Si se ne-
los extremos seal, se forma una molcula circular.
como se indica en la Figura 23.12. La delecin par-3
liberar un crculo escindido es el modo predomi-
nante de recombinacin en los loci de inmunoglo-
bulinas y TCR.
En algunos casos excepcionales, la orientacin
del segmento del gen V est invertida en el cromo-
soma, respecto de los loci J-C. En tal caso, la rotura
y nueva unin invierte el material interpuesto, en
lugar de eliminarlo. Los resultados de la delecin
respecto de la inversin son los mismos mostrado?
antes para la recombinacin homloga entre la re--
peticin directa o la invertida en las Figuras 21.9 y
21.10, con la salvedad adicional de que la recombl-
nacin con un segmento del gen V hace necesaric1
que los extremos seal se unan, de otra manera.
habr una rotura en el locus. En la recombinacirj
de TCR, se produce una inversin y, en ocasiones.
tambin en el locus de la cadena ligera k.
REI La exclusin aLLica
es desencadenada
por un rearregLo productivo
Conceptos principales
.
La recombinacin para generar un gen ntegro de
inmunoglobulina es productiva si lleva a la expresin
de una protena activa.
.
Un rearreglo productivo impide que ocurra cualquier
rearreglo adicional, a diferencia del. rearreglo no
productivo.
.
La exclusin allica se aplica separadamente a las
cadenas ligeras (slo puede rearreglarse de manera
productiva una cadena k o /V) y a las pesadas (una
cadena pesada se rearregla de manera productiva).
Cada clula B expresa un solo tipo nico de cadena
ligera y uno de cadena pesada, porque nada ms
tiene lugar un rearreglo productivo de cada tipo en
un linfocito dado para producir un gen con una
582 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
cadena ligera y una pesada. Cada suceso involucra
a los genes de slo uno de los cromosomas hom-
logos, de modo que los alelos del otro cromosoma no se
expresan en la misma clula; este fenmeno se conoce
como exclusin allica.
La exclusin allica complica el anlisis de la
recombinacin somtica; una sonda que reacciona
con una regin en que ha tenido lugar el rearreglo
de un homlogo, tambin detectar las secuencias
allicas del otro homlogo, de modo que se tiene la
obligacin de analizar los diferentes destinos de los
dos cromosomas juntos.
El patrn usual mostrado por un gen activo con
rearreglo puede interpretarse segn una delacin
del material entre los loci V y C recombinantes.
En las clulas activas se observan dos tipos de
organizacin gnica;
.
Las sondas para el gen activo suelen revelar
una copia con rearreglo y una de la lnea
germinativa, de modo que se supone que la
unin ocurri en un cromosoma, mientras
que el otro se mantuvo sin cambios.
.
Pueden encontrarse dos patrones diferen-
tes de rearreglo, lo cual indica que los cro-
mosomas han experimentado rearreglos
independientes. En algunos de estos casos,
el material entre los segmentos de los ge-
nes V y C recombinantes est por completo
ausente de la lnea celular, lo cual explica
muy fcilmente por la aparicin de delecio-
nes independientes (resultado de recombi-
naciones) en cada cromosoma.
Cuando dos cromosomas carecen del patrn de
lnea germinativa, por lo general uno de ellos ha
pasado por un rearreglo productivo para generar
un gen funcional y el otro ha experimentado un
rearreglo no productivo, lo cual podra asumir
varias formas, pero en cada caso, la secuencia del
gen no se expresara como cadena de inmunoglobu-
lina. (Puede ser incompleto, por ejemplo, porque se
produjo la unin D-J, pero no la consiguiente unin
V-D
, o bien ser aberrante, con el proceso concluido,
pero sin generar un gen que codique una protena
funcional.)
La coexistencia de rearreglos productivos y no
productivos sugiere que hay un asa de retroalimen-
tacin que controla el proceso de recombinacin,
modelo esbozado en la GURA 23.13. Supngase que
cada clula inicia con dos loci en una configuracin
Ig0de lnea germinativa sin rearreglo, cualquiera de
esos loci puede pasar por un rearreglo para generar
un gen productivo, Ig
+
, o uno no productivo, Ig-.
Si el rearreglo es productivo, la sntesis de una
cadena activa provee un desencadenante para evitar
el rearreglo del otro alelo, y la clula activa tendr
una configuracin Ig
0/I
g
+
.
Si el rearreglo es no productivo, se crear una
clula con la configuracin Ig
0/I
g
"
. No hay impedi-
mento para el rearreglo del alelo de lnea germinal
restante, que de ser productivo, la clula expresada
tendr una configuracin IgVIg". Tambin en este
caso, la presencia de una cadena activa suprime la
posibilidad de rearreglos adicionales.
La clula Ig"/Ig"es producto de rearreglos su-
cesivos no productivos. En algunos casos, este tipo
de clula puede intentarlo otra vez; en ocasiones,
los patrones de DNA observados slo pueden haber
sido generados por arreglos sucesivos.
La esencia del modelo es que la clula sigue
tratando de recombinar segmentos de los genes V y
C hasta lograr un rearreglo productivo. La exclusin
allica es causada por la supresin de rearreglos adi-
cionales tan pronto como se produce una cadena ac-
tiva. El uso de este mecanismo in vivo se demuestra
por la creacin de ratones transgnicos, cuya lnea
germinativa tiene un gen de inmunoglobulina con
rearreglo. La expresin del transgn en las clulas B
suprime el rearreglo de genes endgenos.
La exclusin allica es independiente para los
loci de las cadenas pesadas y ligeras. En general,
los genes de las cadenas pesadas son los prime-
ros en pasar por un rearreglo. La exclusin allica
de las cadenas ligeras debe aplicarse de manera
equivalente a ambas familias (las clulas pueden
tener cadenas ligeras activas koX). Es posible que
La exclusin allica limita el rearreglo exitoso a un solo alelo
:
El rearreglo productivo culmina en
lg<W
Genes de lnea germinativa (IgO/lgO)
s-sa
El rearreglo no productivo culmina
en IgO/lg-
Transcripcin
>. .
SSffSS
El segundo alelo puede
recombinarse para dar lg+/ig
"
La expresin de Ig impide
rearreglos adicionales Transcripcin
FIGURA 23.13 Un rearregLo exitoso para producir una cadena activa
ligera o pesada evita rearreglos adicionales del mismo tipo y da como
resultado la exclusin allica.
23.9 La exclusin allica es desencadenada por un rearreglo productivo
583
la clula rearregle primero sus genes k y trate de
rearreglar los k slo si ambos intentos con los k no
tienen xito.
Una paradoja interesante de esta serie de su-
cesos es que las mismas secuencias de consenso y
la misma recombinasa V (DJ) participan en las re-
acciones de recombinacin en los loci H, k y A,, y
sin embargo, los tres loci se rearreglan en un orden
establecido. Qu asegura que el rearreglo de cade-
nas pesadas preceda al de cadenas ligeras, y que el
rearreglo k preceda al X? Los loci pueden volverse
accesibles a la enzima en diferentes momentos, tal
vez como resultado de la transcripcin, la cual ocu-
rre incluso antes del rearreglo, si bien, por supuesto,
los productos no tienen funcin de codificacin. La
transcripcin puede cambiar la estructura de la cro-
matina, lo cual pone a disposicin de la enzima las
secuencias de consenso para la recombinacin.
Las protenas RAG catalizan
La rotura y La nueva unin
Conceptos principales
.
Las protenas RAG son necesarias y suficientes para la
reaccin de corte y empalme.
.
La RAG1 reconoce las secuencias de consenso
nonamricas para la recombinacin. La RAG2 se une a
RAG1 y se corta y empalma en el heptmero.
.
La reaccin se asemeja a la de resolucin tipo
topoisomerasa que ocurre en la transposicin.
.
Una de las histonas avanza a travs de un
intermediario en horquilla en el extremo de
codificacin; la abertura de la horquilla se encarga de
la insercin de bases adicionales (nucletidos T) en el
gen recombinado.
.
La transferasa de desoxinuclesidos inserta nucletidos
N adicionales en el extremo de codificacin.
.
La secuencia del codn del sitio de la reaccin de
unin V-(D)J es muy variable y codifica el aminocido
95 en el sitio de unin del antgeno.
.
Las roturas de la doble cadena en las uniones de
codificacin son reparadas por el mismo sistema
involucrado en la unin de extremos no homlogos del
DNA daado.
.
Un reforzador del gen C activa al promotor del gen V
despus de que la recombinacin ha generado el gen
ntegro de inmunoglobulina.
Las protenas RAG1 y RAG2 son necesarias y sufi-
cientes para seccionar el DNA en la recombinacin
V(D)J; son codificadas por dos genes, separados por
<10 kb en el cromosoma, cuya transfeccin a fibro-
blastos produce un sustrato de DNA adecuado para
que en l ocurra la reaccin de juntura V(D)J. Los
ratones que carecen de RAG1 o RAG2 no pueden x-.
combinar sus inmunoglobulinas ni sus receptores de
clulas T, y como resultado, portan linfocitos de B -.
T inmaduros. Las protenas RAG juntas emprende r
las reacciones catalticas de rotura y nueva unin de
DNA y tambin proveen una red estructural en
cual ocurren las reacciones.
La RAG1 reconoce las seales de heptmero
nonmero con el espaciamiento apropiado 12/23
y recluta a RAG2 para el complejo. El nonmerc
proporciona el sitio para el reconocimiento inicia]
y el heptmero dirige el sitio de corte.
En la FIGURA 23.14 se muestran las reacdone5
involucradas en la recombinacin. El complejo pro-
duce una hendidura en una cadena de cada unin,
la cual tiene extremos 3'-OH y 5'-P. El extremo
libre 3-OH ataca entonces la unin fosfato en H
posicin correspondiente de la otra cadena de la m
tructura doble, lo cual da lugar a horquilla en el ex-
tremo de codificacin donde la terminacin 3' m
una cadena se enlaza de manera covalente con la
terminacin 5' de la otra, de modo que se produce
una prdida de continuidad roma de doble cadene-
en el extremo seal.
Este segundo corte es una reaccin de transes-
terificacin en la cual se conservan las energas de-
enlace y que simula las reacciones similares a la
de topoisomerasa catalizadas por las protenas re-
solvasa de transposones bacterianos (vase seccin
21.9, La transposicin TnA requiere de transposasa
y resolvasa). La semejanza con estas reacciones es
respaldada an ms por una homologa entre RAGi
y las protenas invertasa bacterianas (que invierteu,
segmentos especficos del DNA por reacciones de
recombinacin similares). De hecho, las protenas
pueden insertar un DNA donador cuyos extremos
libres constan de las secuencias seal apropiadas
(heptmetro-12/espaciador nonmero-23) en un
DNA blanco no relacionado en una reaccin de
transposicin in vitro. Esto sugiere que la recombi-
nacin somtica de genes inmunitarios evolucion
a partir de un transposn ancestral y tambin que
las protenas RAG se encargan de las translocaciones
cromosmicas donde se conectan loci de Ig o TCR
con otros loci.
Las horquillas de los extremos de codificacin
proporcionan el sustrato para la siguiente etapa de
la reaccin. Si se introduce una seccin de una sola
cadena cerca de la horquilla, en el extremo, una
reaccin de desapareamiento genera la protrusin
de una sola cadena. La sntesis de un complemento
para la cadena nica expuesta convierte entonces
el extremo de codificacin en una estructura do-
ble ampliada, reaccin que explica la introduccin
de nucletidos P en los extremos de codificacin;
constan de unos cuantos pares de bases adicionales
584 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
Durante la unin VC se genera diversidad
Gen V Gen J-C
TA CACAGTG
AT GTGTCAC
ir-ipiAC AAAAACC
i'- TGTTTTTGG
GQTTTTTGTrpoiCACTGTt CCG
CCAA A AAC Al
J'
GTG AC AC GGC
Hendidura en una
cadena
H
o p
TA CACAGTG
AT GTGTCAC
Extremo de codificacin Extremo seal
en horquilla \
/romo
c a c T G T g CCG
G T G A C A C GGC
> >H
RAG1
,
2 hace una
hendidura en una cadena
de cada unin
TA O
AT-P
t
ta-c;
AT-F
T
ATA
P-CAC/
HO-GTGTCAC GTGACAC-P
P-CCG
O-GGC
l
i
(?-cce
o-G0f;
Recorte
QQCCG
Adicin c
Extremo de codificacin 1
Extremo de
Codificacin
TA
AT
Extremos de
codificacin
unidos
NNGGCCC
NNCCGGC
Nucletidos P
TA NNGGCCG
AT NNCCGG C
El -OH libre ataca el
enlace en otra cadena
y crea horquillas en los
extremos de codificacin
Se escinde una cadena
adyacente a la horquilla
La cadena escindida se
separa para generar un
extremo libre (las bases
afectadas se muestran
en negro)
Recorte del extremo,
adicin aleatoria de
nucletidos (N) o ambos
Se llenan los extremos
de una sola cadena
Los extremos de
codificacin se unen
Nucletidos N'
EL procesamiento de Los extremos de codificacin introduce variabilidad en La
unin.
relacionados con el extremo de codificacin origi-
nal, pero de orientacin invertida.
Tambin pueden insertarse algunas bases adi-
cionales aparentemente con secuencias aleatorias
entre los extremos de codificacin que se conocen
como nucletidos N. La insercin se debe a la acti-
vidad de la enzima transferasa de desoxinuclesido
(que se sabe es un componente activo de los linfoci-
tos) en el extremo libre de codificacin 3' generado
durante el proceso de unin.
As pues, los cambios en la secuencia durante la
recombinacin son consecuencia de los mecanismos
enzimticos implicados en la escisin y nueva unin
del DNA. En la recombinacin de la cadena pesada
se pierden pares de bases o se insertan en las uniones
V -D, D-J, o ambas; tambin ocurren deleciones en
H
la unin V
-
J
, pero la insercin en esas uniones es
desusada. Los cambios de secuencia afectan al ami-
nocido codificado en las uniones V-D y D-J de las
cadenas pesadas o en la unin V-J de las ligeras.
Estos diferentes mecanismos, juntos, aseguran que
una unin de codificacin puede tener una secuencia di-
ferente de la pronosticada por la unin directa de los ex-
tremos de codificacin en las regiones V, D, y J.
Los cambios de secuencia de la unin hacen
posible codificar una gran variedad de aminocidos
en este sitio. Es interesante que el aminocido de
la posicin 96 es creado por la reaccin de juntura
V
-J; forma parte del sitio de unin del antgeno y
puede tambin involucrarse en el logro del contacto
entre las cadenas ligeras y las pesadas, de modo que
la mxima diversidad se genera en el sitio que hace
contacto con el antgeno blanco.
Los cambios en el nmero de pares de bases de
la unin de codificacin afectan el marco de lectura.
El proceso de unin parece ser aleatorio respecto del
marco de lectura, de manera que probablemente
slo el 33% de las secuencias unidas conserva el
marco apropiado de lectura de unin a unin. Si
la regin V-J se une de manera que el segmento J
23.10 Las protenas RAG catalizan La rotura y la nueva unin
585
quede desfasado, la traduccin termina prematura-
mente con un codn de finalizacin en el marco in-
correcto. La formacin de genes aberrantes se puede
considerar como el precio que la clula debe pagar
por tener una mayor diversidad, la cual es obtenida
al ajustar la secuencia en el sitio de unin.
En las reacciones de unin que involucran al
segmento D de la cadena pesada se genera una di-
versidad similar, incluso mayor; el resultado obser-
vado es el mismo respecto del marco de lectura; los
genes no productivos son generados por sucesos de
unin que ubican a J y C fuera de fase respecto del
segmento gnico V precedente.
La reaccin de unin que funciona en el extre-
mo de codificacin utiliza la misma va de unin
terminal no homloga (NHEJ) con que se reparan
secciones de la doble cadena en las clulas (vase
seccin 20.11, Las clulas eucariticas han conser-
vado sistemas de reparacin). Las etapas iniciales de
la reaccin fueron identificadas por el aislamiento
de productos intermedios de linfocitos de ratn con
la mutacin de inmunodeficiencia combinada grave
{SCID), que da lugar a un grado muy disminuido de
actividad en la recombinacin de inmunoglobulinas
y TCR. Los ratones SCID acumulan molculas rotas
que terminan en prdidas de continuidad de la do-
ble cadena en los extremos de codificacin, de modo
que no son competentes para concluir algunos as-
pectos de la reaccin de juntura. La mutacin SCID
desactiva una cinasa de protenas dependiente del
DNA (DNA-PK). La cinasa es reclutada en el DNA
por las protenas Ku70 y KuSO, que se unen a los
extremos del DNA. La DNA-PK produce fosforila-
cin de la protena Artemis, que provoca una hen-
didura en los extremos en horquilla y, por tanto, la
La recombinacion activa a un promotor del gen V
Promotor
inactivo
Exn V
Reforzador
Exones C
t
Promotor
| Recombinacin
Activacin ;
Reforzador
-
Transcripcin
desactiva (tambin tiene actividad de exonucleas
y endonucleasa en la va NHEJ). La unin real es
realizada por la ligasa IV de DNA y tambin requk
re de la protena XRCC4. Como resultado, en ]i
protenas Ku y XRCC4 o en la ligasa IV de DX_-
de pacientes humanos con enfermedades prodtic.
das por deficiencias en la reparacin del DNA. |
encuentran mutaciones que producen una mayor
sensibilidad a la radiacin.
Cul es la relacin entre la unin de los ce-
mentos gnicos V y C y su activacin? Los segmenten
del gen V sin rearreglo no se presentan de manera.
it-
tiva en el RNA. No obstante, cuando un segmento df
gen V se une de manera productiva a un segmem.:
de C la unidad resultante se transcribe. La secuen-
cia de direccin ascendente de un segmento del gec
V no se modifica con la reaccin de unin; com:
resultado el promotor tendr que ser el mismo en los. ;.
nes sin rearreglo, o con rearreglo, ya sea no productiv:
productivo.
En direccin ascendente de cada segmento c _
gen V se encuentra un promotor, pero est inactivo.
y para que se active, debe relocalizarse en la regin C
El efecto depender de secuencias en direccin des-
cendente. Cul sera su participacin? Un reforzad..:
localizado en el segmento del gen C, o en direccir
descendente respecto del mismo, activa al promotor
en el segmento del gen V. El reforzador es especfic
de tejidos y est activo slo en clulas B. Su existend
sugiere el modelo ilustrado en la FIGURA 23.15, donde
el promotor del segmento del gen V es activado cuan-
do se lleva dentro de los lmites del reforzador.
La expresin de La cadena
pesada temprana puede
cambiar por procesamiento
del RNA
FIGURA 23.15 Un promotor gnico V est inactivo hasta que
la recombinacin lo lleva cerca de un reforzador del segmento
del gen C. El reforzador est activo slo en los linfocitos B.
Conceptos principales
.
Todos los linfocitos empiezan por sintetizar La forma de
IgM unida a la membrana.
.
Un cambio en el empalme del RNA hace que sea
remplazado por la forma secretada cuando la clula B
se diferencia.
El periodo de sntesis de IgM con que se inicia el
desarrollo del linfocito consta de dos partes, durar-
te las cuales se sintetizan versiones diferentes de L
regin constante p:
.
Conforme una clula madre se diferencia e::
un pre-linfocito B, se sintetiza una cader.=
ligera acompaante y aparece la molcul;
de IgM (L
2y2
) en la superficie de la cluL-
Esa forma de IgM contiene la versin p de
586 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
la regin constante (la m indica que la IgM
est localizada en la membrana). La locali-
zacin en la membrana puede relacionarse
con la necesidad de iniciar la proliferacin
celular en respuesta al primer reconoci-
miento de un antgeno.
. Cuando el linfocito B se diferencia ms en
direccin de clula plasmtica, se expresa la
versin p
s
de la regin constante. La IgM en
realidad es secretada como un pentmero
IgM
5
J donde J es un polipptido de unin
(sin conexin con la regin J) que forma en-
laces disulfuro con las cadenas p. La secre-
cin de la protena va seguida de la respuesta
humoral que se muestra en la Figura 23.1.
Las versiones p
m
y ps de la cadena pesada p di-
fieren slo en el extremo terminal C. La cadena p
m
termina en una secuencia hidrofbica que proba-
blemente la fije en la membrana. Dicha secuencia
El empalme cambia los exones 3'
El gen C tiene 6 exones
m1 m2 m3 m4 MI M2
Etapa unida a a membrana
El RNA nuclear termina en M2
Los exones MI y M2 estn presentes en RNAm
AAAA
Empalme
Etapa secretora
El RNA nuclear termina despus del exn 4
El RNAm tiene slo cuatro exones
i
AAAA
Empalme
FIGURA 23.16 El extremo 3' controla el uso de uniones de
empalme, de manera que se expresen formas alternas del gen
de cadena pesada.
es sustituida por una secuencia hidroflica ms corta
en p
s
; la sustitucin permite que la cadena pesada p
pase a travs de la membrana. El cambio en el ex-
tremo C se logra por un suceso de empalme alterno
controlado por el extremo 3
'
del RNA nuclear, como
se ilustra en la FIGURA 23.16.
En la etapa de unin con la membrana, el RNA
termina despus del exn M2, y la regin constan-
te se produce por el empalme de seis exones. Los
primeros cuatro codifican a los cuatro dominios de
la regin constante, en tanto que los ltimos dos,
MI y M2, codifican el segmento hidrofbico de 41
bases de la regin C terminal, que es un remolque
no traducido. La unin de empalme 5
'
con el exn
4 se enlaza con la unin de empalme 3' en el inicio
de MI.
En la etapa de secrecin, el RNA nuclear termi-
na despus del exn 4. Se ignora la unin de empal-
me 5
'
en ese exn, la cual haba estado relacionada
con la forma MI en la membrana, de modo de per-
mitir que el exn se extienda otros 20 codones.
En otras regiones constantes se encuentra una
transicin similar de la forma de membrana a la se-
cretada. La conservacin de las estructuras de exn
sugiere que el mecanismo es el mismo.
gB EL cambio de dase es producto
de La recombnadn del DNA.
Conceptos principales
.
Las inmunoglobulinas se dividen en cinco clases, segn
el tipo de regin constante de La cadena pesada.
.
EL cambio de clase para modificar la regin C
H
se debe
a una recombinacin entre las regiones S que Lleva a La
delecin de la regin entre la antigua C
H
y La nueva.
.
Pueden presentarse mltiples recombinaciones de
cambios sucesivos.
La clase de inmunoglobulina se define por el tipo
de regin C
H
. En la FIGURA 23.17 se resumen las cin-
co clases de Ig. La IgM (primera inmunoglobulina
producida por alguna de las clulas B) y la IgG.(la
conocida) poseen la capacidad medular de activar al
Hay cinco tipos de cadena pesada
Tipo IgM IgD IgG gA igE
Cadena pesada
u S
7
a e
Estructura
5 e2L
2
Proporcin
5% 1% 80% 14% <1%
Funcin electora Activa el Desarrollo de Activa el Se encuentra
Respuesta
complemento tolerancia (?) complemento
en las secreciones
alrgica
i
FIGURA 23.1 EL tipo y funcin de La inmunoglobulina dependen de la cadena pesada. La J es una
protena de unin en la IgM; todos los dems tipos de Ig corresponden a tetrmeros.
23.12 EL cambio de clase es producto de La recombinacin del DNA
587
complemento, y de ah la destruccin de las clulas
invasoras. La IgA se encuentra en las secreciones
(como la saliva) y la IgE se vincula con la respuesta
alrgica y la defensa contra los parsitos.
Todos los linfocitos inician su vida productiva
como clulas inmaduras que participan en la sntesis
de IgM, las clulas que la expresan tienen el arreglo de
grupo del segmento del gen CH de lnea germinativa
que se muestra en la Figura 23.10. La reaccin de
juntura V-D-J desencadena la expresin del seg-
mento del gen C . En general, un linfocito produce
slo una clase de inmunoglobulina en un momento
dado, pero dicha clase puede cambiar en el linaje
celular, dicho cambio se llama cambio de clase y
se debe a la sustitucin del tipo de regin C
H
que se
expresa. El cambio puede ser simulado por efectos
ambientales, por ejemplo, el factor de crecimiento
TGFp causa un cambio de C a C
o
.
El cambio se produce slo en el segmento del gen C
H
;
el mismo segmento V
H
sigue expresndose, de modo que
un segmento dado del gen V
H
puede expresarse con
xito en combinacin con ms de un segmento del
gen CH. La misma cadena ligera contina expresn-
dose en todo el linaje de la clula, por lo tanto, el
cambio de clase permite modificar el tipo de res-
puesta efectora (mediada por la regin CH), mientras
se mantiene la misma capacidad de reconocimiento
de antgeno (mediada por las regiones V).
La recombinacn logra el cambio de clase por escisin de DNA
VDJ n 8
Genes
Regiones su
de cambio i
y3
y1 T2? f
a a1 a
2
SV3 sy1 s7 2b s,/2ase sa1sa2
T
Sp Recombinacin Syi
I
Expresin del gen yl
VDJ
'
v1 T2? T2
! "
3
o. t a' o
DNA
circuiar
escindido
S|V/1 Vb sT2aS %1 S02
s(i,Yl Recombinacin sai i -
7
Se expresa ei gen 0.1
VDJ a1 a2
FIGURA 23.18 Puede haber un cambio de clase de genes de cadena
pesada por recombinacin entre regiones de cambio (S), con delecin
del material entre los sitios S de recombinacin. Los cambios pueden
ser sucesivos.
Los cambios en la expresin de segmentos del
gen CH son de dos tipos; la mayor parte ocurre por
sucesos adicionales de recombinacin del DNA que
implican un sistema diferente del encargado de la
juntura V-D-J (que puede funcionar slo en etapas
posteriores del desarrollo de la clula B). El otn1
tiene lugar en el mbito del procesamiento del RNA.
que en general se relaciona con el cambio de la se-
cuencia C terminal de la regin C
H
, ms que con un
cambio de clase (ver seccin 23.11, La expresin
temprana de la cadena pesada puede cambiar por
procesamiento del RNA).
Las clulas que se expresan en direccin des-
cendente respecto de los segmentos del gen C
H
tie-
nen deleciones de y de los otros segmentos gni-
cos que preceden al segmento expresado de dicho
gen. El cambio de clase se debe a una recombina-
cn para ubicar un nuevo segmento del gen C
H
er
yuxtaposicin con la unidad V-D-J expresada. Lac
secuencias de las unidades V-D-J-C
u
modificadas
muestran que los sitios de cambio,
denominados
regiones S, estn en sentido ascendente respecto
de los segmentos del propio gen C
H
.
En la FIGURA
23.18 se muestran dos cambios sucesivos
.
En el primer cambio, la expresin de va se-
guida por la de C7l, segmento gnico que es llevadr
a la posicin expresada por recombinacn entre los
sitios y S
yl
. El primero yace entre los segmentas
gnicos V-D-J y CM, y SYl, en direccin ascenden-
te respecto del segmento del gen C
yl
;
entre los das
sitios de cambio, la secuencia de DNA se escinde
como molcula circular. El modelo de delecin li-
neal impone una restriccin al locus del gen de la
cadena pesada, una vez que se ha hecho un cambio A
clase, es imposible expresar cualquier segmento gnico C.
que hubiera residido entre C( y el nuevo segmentognicc
C
H
. En el ejemplo de la Figura 23.18, las clulas que
expresan C
Yl
deberan ser capaces de originar clulas
que expresaran Cv3, que ha sido eliminado.
No obstante, debera ser posible realizar otro
cambio a cualquier segmento del C
H
en sentido des-
cendente respecto del gen expresado. En la Figura
23.18 se muestra un segundo cambio a la expre-
sin de C
a
logrado por recombinacin entre Sal y
la regin de cambio S generada con el cambie
original.
Se supone que todos los segmentos gnicos C.
tienen regiones S en direccin ascendente respecte
de las secuencias de codificacin, pero no se sabe
si hay alguna restriccin en el uso de las regiones
S
, que experimentan cambios secuenciales, si bien
se ignora si son optativos u obligatorios para pro-
ceder hacia los segmentos posteriores del gen C
K
.
Tambin sera interesante saber si la IgM puede
cambiar directamente a cualquier otra clase. Las re-
giones S yacen en los intrones que preceden a las
588 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
regiones de codificacin del gen C
H,
de modo que
con el cambio no se modifica el marco de lectura
de la traduccin.
PEKB EL cambio se debe a una nueva
reaccin de recombinacin
Conceptos principales
.
Habr un cambio por una rotura de la doble cadena
seguida de la reaccin de unin no homologa de
extremos.
.
La caracterstica importante de una regin de cambie
son las repeticiones invertidas.
.
El cambio requiere de activacin de los promotores que
estn en direccin ascendente respecto de los sitios de
cambio.
Se sabe que los sitios de cambio no se definen de
una sola manera, pues diferentes clulas que ex-
presan el mismo segmento gnico CH han mostrado
recombinacin en puntos diferentes. La longitud de
las regiones de cambio vara (segn definen los lmi-
tes de los sitios implicados en la recombinacin) de
1 a 10 kb; contienen grupos de repeticiones cortas,
invertidas, cuya longitud flucta entre 20 y 80 uni-
dades de nucletidos. La secuencia primaria de la
regin de cambio no parece ser importante, lo que
interesa son las repeticiones invertidas.
Una regin S suele localizarse ~2 kb en direc-
cin ascendente respecto de un segmento del gen
C
.
La reaccin de cambio libera el material escin-
dido entre los sitios de cambio como una molcula
de DNA circular, para lo cual se requieren dos de
las protenas que intervienen en la fase de unin
de la recombinacin de VDJ (y tambin en la va de
unin general de extremos no homlogos, NHEJ),
Ku y DNA-PKcs, lo cual sugiere que la reaccin de
unin podra usar la va NHEJ. Bsicamente, esto
implica que la reaccin se debe a una fractura de la
doble cadena seguida de una nueva unin de los
extremos separados. En la generacin de la fractura
de la doble cadena se pueden conjuntar las carac-
tersticas de la reaccin para proponer un modelo
cuyos puntos crticos son:
.
Se requiere transcripcin a travs de la re-
gin S;
.
las repeticiones invertidas son cruciales, y
.
la fractura puede ocurrir en muchos sitios
diferentes de la regin S.
En la FIGURA 23.19 se muestran las etapas de la
reaccin de cambio de clase. Un promotor (I) yace
inmediatamente en direccin ascendente respecto
de cada regin de cambio que implica la transcrip-
cin desde ese promotor. Este ltimo podra res-
ponder a los activadores, que a su vez responden a
las condiciones ambientales, como la estimulacin
por citocinas, lo cual da lugar a un mecanismo para
regular el cambio. As pues, la primera etapa en el
cambio es la activacin de los promotores I que es-
tn en direccin ascendente respecto de cada una
de las regiones de cambio que participan. Cuando
esos promotores se activan, generan productos de
transcripcin estriles que se empalman para unir a
la regin I con la correspondiente regin constante
de la cadena pesada.
La clave para descifrar el mecanismo del cam-
bio fue descubrir la necesidad de la enzima AID
(desaminasa de citidina inducida por activacin),
pues sin ella, el cambio de clase se interrumpe an-
tes de la etapa de produccin de la hendidura. La
mutacin somtica tambin resulta obstaculizada,
lo cual muestra una conexin interesante entre
dos procesos fundamentales para la diversificacin
inmunitaria (vase la seccin 23.15, La mutacin
somtica es inducida por la desaminasa de citidina
y la glucosilasa de uracilo).
La AID se expresa slo en una etapa especfica
durante la diferenciacin de los linfocitos B, lo cual
restringe los procesos de cambio de clase y mutacin
somtica a esta etapa. La AID es miembro de una
clase de enzimas que acta en el RNA para conver-
tir una citidina en uridina (vase seccin 27.10, La
El cambio de clase implica expresin, escisin y unin
Expresin
VDJ n
e
Genes .'j i i
nmm*,
,
l JI~~m
Regiones de 1 S
IS
:
cambio |
Productos de || VDJ i
transcripcin
empalmados
Escisin
Escisin
1
Escisin
1
VDJ | (i
i
e
--
* +--!-
Unin
VDJ e
-
. wn
i
1
Productos de transcripcin VDj
empalmados
El cambio de clase pasa por etapas bien definidas. Los
promotores I inician la transcripcin de productos estriles. Las regiones
de cambio se escinden. Las regiones escindidas se unen.
23.13 El cambio se debe a una nueva reaccin de recombinacin 589
La transcripcin permite la formacin de horquillas
Repeticiones invertidas
Transcripcin
Horquilla
Cadena que no es molde
I .
Cadena molde
RNA
FIGURA 23.20 Cuando en La transcripcin se separan las ca-
denas del DNA, una puede formar una repeticin invertida si la
secuencia es palindrmica.
edicin del RNA ocurre en las bases individuales),
pero su especificidad diferente y acta en el DNA
de una sola cadena.
Para el cambio de clase y la mutacin som-
tica tambin se requiere de otra enzima, la UNG,
una glucosilasa de uracilo del DNA que elimina el
uracilo que genera la AJD por desaminacin de la
citidina. En los ratones con deficiencia de UNG, el
cambio de clase disminuye 10 veces, lo cual sugiere
un modelo en que las acciones sucesivas de AED y
UNG crean sitios que han perdido una base en el
DNA, con consecuencias diferentes en el cambio de
clase y los sistemas de mutacin somtica.
La fuente del DNA de una sola cadena, blanco
de la AID, se genera por el proceso de transcrip-
cin estril, muy probablemente por exposicin de
la cadena de DNA que no es molde y que es des-
plazada cuando la otra se usa como molde para la
sntesis de RNA. Este fenmeno es respaldado por
la observacin de que la AID hace blanco preferen-
temente en citidinas de la cadena que no funciona
como molde.
Para dar lugar a un cambio de clase, estos sitios
se convierten en roturas de la cadena nucleotdi-
ca que proporcionan los sucesos de escisin que se
muestran en la Figura 23.19. Los extremos rotos
se unen con la va NHEJ, sistema de reparacin que
incide en las roturas de la doble cadena del DNA
(vase la seccin 20.12, Un sistema comn repara
las roturas de la doble cadena). No se sabe an cmo
los sitios sin bases se convierten en roturas de do-
ble cadena; podra necesitarse el sistema de hidrato
de silicato de magnesio (MSH) que participa en la
reparacin de apareamientos incorrectos del DNA,
pues las mutaciones del gen MSH2 aminoran los
cambios de clase.
Una caracterstica no explicada es la participa-
cin de las repeticiones invertidas; quiz se formen
horquillas por la interaccin entre las repeticiones
invertidas de la cadena desplazada que no sirve de
molde, como se muestra en la iGURA 23.20, lo cual
combinado con la generacin de sitios sin bases en
esa cadena, podra llevar a la rotura.
Dos interrogantes crticas siguen sin respuesta:
Cmo hace blanco el sistema en las regiones apro-
piadas del locus de la cadena pesada? Qu controla
el uso de los sitios de cambio?
La mutacin somtica genera
otras diferencias en eL ratn
y eL ser humano
Conceptos principales
.
Los genes activos de inmunoglobulina tienen regiones
V con secuencias que cambian respecto de la lnea
germinativa por mutacin somtica.
.
Las mutaciones ocurren como sustituciones de bases
individuales.
.
Los sitios de mutacin se concentran en los sitios de
unin de antgeno.
.
El proceso depende del reforzador que activa la
transcripcin en el locus Ig.
Las comparaciones entre las secuencias de los genes
de inmunoglobulina expresados y los segmentos
gnicos V correspondientes de la lnea germinativa
muestran que en la poblacin expresada aparecen
nuevas secuencias. Parte de esa diversidad adicional
es resultado de los cambios de secuencia en las jun-
turas V-J o V-D-J ocurridos durante el proceso de
recombinacin, mientras que otros se presentan en
ubicacin ascendente en sitios del dominio variable.
Los cambios en las secuencias gnicas V despus
de que se ha obtenido un gen funcional de inmu-
noglobulina por rearreglo son generados por dos
tipos de mecanismos. En el ratn y el ser humano,
dicho mecanismo es la induccin de mutaciones
somticas en localizaciones especficas del gen, en
especial en el linfocito activo. El proceso suele lla-
marse hipermutacin. En pollos, conejos y cerdos,
un mecanismo diferente aprovecha la conversin
gnica para cambiar un segmento del gen V expre-
sado en la secuencia correspondiente de un gen V
diferente (ver seccin 23.16, Las inmunoglobulinas
aviarias se ensamblan a partir de seudogenes).
Para identificar los fragmentos correspondientes
de la lnea germinativa se puede usar una sonda que
represente un segmento gnico V expresado, cuyas
secuencias deben identificar el repertorio completo
disponible para el organismo. Cualquier gen expre-
sado cuya secuencia sea diferente, debe haber sido
generado por cambios somticos.
590 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
Asegurar que cada contribuyente potencial de
los segmentos gnicos V de la lnea germinativa en
realidad ha sido identificado constituye un proble-
ma, el cual se resuelve con la sencillez del sistema de
cadena X en el ratn. En una encuesta entre pacien-
tes con mieloma, que producen cadenas A,
,
,
se ob-
serv que muchos tienen la secuencia del segmento
nico de lnea germinativa, pero otros tienen nuevas
secuencias que deben haberse generado por mutacin del
segmento gnico de la lnea germinativa.
Para determinar la frecuencia de la mutacin
somtica en otros casos es necesario revisar gran
nmero de clulas en que se exprese el mismo seg-
mento gnico V. Un procedimiento prctico para
identificar a ese grupo es caracterizar las inmuno-
globulinas de una serie de clulas, todas con expre-
sin de una respuesta inmunitaria ante un antgeno
en particular.
Los eptopos utilizados para este fin son peque-
as molculas, haptenos, cuya estructura definida
posiblemente provoque una respuesta coherente, a
diferencia de una protena grande, de la cual, dife-
rentes partes producen anticuerpos diversos. Un hap-
teno se conjuga con una protena no reactiva para
formar el antgeno. Las clulas se obtienen por inmu-
nizacin de ratones con el antgeno y recuperacin
de linfocitos reactivos y, en ocasiones, por la fusin
de esos linfocitos con el mieloma (tumor inmortal)
para generar un hibridoma, que sigue expresando
de manera indefinida el anticuerpo deseado.
En un ejemplo, 10 de 19 lneas celulares dife-
rentes que producen anticuerpos dirigidos contra el
hapteno fosforilcolina, tenan la misma secuencia
V
H,
que era el segmento TI 5 del gen V de la lnea
germinativa, uno de los cuatro genes VH relaciona-
dos. Los otros nueve segmentos gnicos expresados
diferan entre s y de los cuatro miembros de lnea
germinativa de la familia; tenan una relacin ms
estrecha con la secuencia de lnea germinal TI 5 que
con cualquiera de las otras, y sus secuencias flanco
eran las mismas que rodean a TI5, lo cual sugiri
que se originaron en un miembro TI 5 por mutacin
somtica.
En la IGURA 23.21 se muestra que los cambios
de secuencia se localizan en torno al segmento g-
nico V, con extensin en una regin desde ~150 bp
en direccin descendente respecto del promotor del
gen V y abarcando -1.5 kb; toman la forma de sus-
tituciones de pares de nucletidos individuales. Por
lo general, hay ~3 a -15 sustituciones, que corres-
ponden a <10 cambios de aminocidos en la prote-
na. Se concentran en el sitio de unin de antgeno
(generando as la mxima diversidad para reconocer
antgenos nuevos). Slo algunas de las mutaciones
afectan la secuencia de aminocidos, pues otras ya-
En VDJ ocurren mutaciones somticas I
Transcripcin
VDJ 2 kb C
>\>\>\>\>\>\>\>\>\
La mutacin somtica tiene Lugar en la regin
que circunda al segmento V y se extiende sobre los segmentos
VDJ unidos.
cen en posiciones de codificacin de tercera base,
as como en regiones no traducidas.
La gran proporcin de mutaciones ineficaces
sugiere que la mutacin somtica es ms o menos
aleatoria en una regin que incluye el segmento
gnico V y que va ms all. Algunas mutaciones
muestran la tendencia a recurrir muchas veces, y
podran representar puntos calientes como resulta-
do de alguna preferencia intrnseca del sistema.
Al parecer, durante la proliferacin clonal, la
mutacin somtica ocurre con una frecuencia de
~
10-3/bp por generacin celular. Casi la mitad de las
clulas de la progenie gana una mutacin, de mane-
ra que las clulas que expresan anticuerpos mutados
se convierten en una fraccin elevada del clon.
En muchos casos se usa de manera sistemtica
una sola familia de segmentos gnicos V para res-
ponder a un antgeno en particular. Supuestamente,
ante la exposicin a un antgeno, la regin V con
afinidad intrnseca ms alta proporciona el punto de
inicio, de modo que la mutacin somtica aumenta
el repertorio. Las mutaciones aleatorias tienen efec-
tos impredecibles en la funcin protenica; algunas
la desactivan, en tanto otras le confieren alta especi-
ficidad para un antgeno especfico. La proporcin y
la eficacia de los linfocitos que responden aumentan
por seleccin en la poblacin de linfocitos de las c-
lulas que tienen anticuerpos en los cuales una muta-
cin ha aumentado la afinidad por el antgeno.
La desaminasa de dtidina
y la glucosilasa de uracilo
inducen La mutacin somtica
Conceptos principales
Para La mutacin somtica y para el cambio de clase se
requiere de una desaminasa de citidina.
La actividad de glucosilasa de uracilo-DNA influye en el
patrn de mutaciones somticas.
Una hipermutacin puede empezar por la accin
secuencial de esas enzimas.
23.15 La desaminasa de citidina y la glucosilasa de uracilo inducen la mutacin somtica 591
La mutacin somtica tiene muchos de los mismos
requisitos que el cambio de clase (vase seccin
23.13, El cambio ocurre por una reaccin de re-
combinacin nueva):
.
La transcripcin debe ocurrir en la regin
blanco (como en este caso, por la demanda
del reforzador, que activa la transcripcin
en cada locus Ig);
.
se necesitan las enzimas AID y UNG, y
.
participa el sistema de reparacin de aparea-
miento errneos de MSH.
La forma en que el retiro de la base desaminada
lleva a la mutacin somtica es sugerida por el expe-
rimento que se resume en la FIGURA 23.2;. Cuando
la AID desamina a la citosina, genera uracilo, que
entonces es retirado del DNA por la UNG. Normal-
mente, todas las posibles sustituciones ocurren en
el sitio sin bases, pero si se obstruye la accin de la
glucosilasa de DNA-uracilo, el resultado ser dife-
rente. Si no se retirara el uracilo del DNA, tendra
que aparearse con la adenina durante la replicacin,
y en ltima instancia, el resultado sera la sustitu-
cin de un par original C-G con uno T-A. La glu-
cosilasa de DNA-uracilo se puede bloquear intro-
duciendo en las clulas la codificacin gnica para
una protena que inhiba la enzima. (El gen es un
componente del bacterifago PSB-2, cuyo genoma
es poco comn porque contiene uracilo, de manera
que es necesario bloquear la enzima durante una
infeccin por fago.) Cuando se introduce el gen en
una lnea de clulas linfocticas es notorio el cambio
en el patrn de mutaciones, pues casi todas inclu-
yen la transicin pronosticada de C-G a A-T.
La clave de la generacin de una variedad alea-
toria de mutaciones es, por tanto, crear el sitio sin
bases, y despus se recluta el sistema de reparacin
MSH para escindir y sustituir la tira de DNA que
contiene el sitio daado. La posibilidad ms sencilla
es que si se sustituye por una poiimerasa de DNA
sujeta a error, podra haber mutaciones. Otra posi-
bilidad es que se creen tantos sitios sin bases, que
los sistemas de reparacin se vean rebasados. En
caso de replicacin, esto podra llevar a la insercin
aleatoria de bases frente a los sitios sin bases. No se
sabe an qu limita la accin de este sistema a la
regin blanco para la hipermutacin.
La diferencia en los sistemas es al final del
proceso, cuando se introducen roturas de la doble
cadena en el cambio de clase, pero se crean muta-
ciones puntuales individuales durante la mutacin
La hipermutacin es desencadenada por la desaminasa de cilidina
y la glucosilasa de DNA-uracilo
La desaminasa de
citidina crea un
par U-G C
Resultados
experimentales
La glucosilasa de
DNA-uracilo crea un
sitio sin bases
En la replicacin se
insertan bases en forma
aleatoria en direccin
opuesta a la hendidura
Patrn normal
de mutacin
G -> A = 48%
G 0 = 39%
G T = 12%
La replicacin de un par
U-G causa transicin
de G a A
La glucosilasa
de DNA-uracilo
ES BLOQUEADA
G -> A = 84%
G C = 16%
FIGURA 23.22 Cuando la accin de la desaminasa de citidina (arriba) va seguida de la accin
de la glucosilasa de DNA-uracilo se crea un sitio sin bases. La replicacin ms all de ese sitio
debe insertar las cuatro bases de forma aleatoria en la cadena hija (centro). Si no se elimina el
uracilo del DNA, su replicacin causa transicin de C-6 a T-A.
CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
somtica. No se sabe con exactitud donde divergen
los sistemas. Una posibilidad es que las roturas se
introduzcan en sitios sin bases durante el cambio de
clase, pero que se reparen de manera errtica en la
mutacin somtica, o bien, que se introduzcan las
roturas en ambos casos, pero se reparen en una for-
ma susceptible de error en la mutacin somtica.
gIB Las inmunogLobuLinas aviarias
se ensamblan a partir
de seudogenes
Ccncepto principal
.
En el pollo, un gen de inmunoglobulina se genera
copiando una secuencia de uno de los 25 seudogenes
del gen V de un locus activo nico.
El sistema inmunitario del pollo es el paradigma
para conejos, vacas y cerdos, que dependen del uso
de la diversidad codificada en el genoma. Un me-
canismo similar es utilizado por el locus nico de
cadena ligera (de tipo X) y el de la cadena H. En
la FIGURA 23.25 se incluye una interpretacin de la
organizacin del locus X; slo tiene un segmento g-
nico V funcional, y los segmentos J y C. En direccin
ascendente respecto del segmento V
Xl
se encuentran
2 5 seudogenes organizados en cualquier orien-
tacin, los cuales han sido clasificados as porque
presentan delecin de un segmento de codificacin
en uno o en ambos extremos, carecen de seales
apropiadas para la recombinacin, o ambos. Esta
asignacin se confirma por el hecho de que slo el
segmento gnico V
?a
se recombina con el segmento
gnico J-Cr
Sin embargo, las secuencias de los segmentos
gnicos Vx-J-Cx con rearreglo muestran diferencias
considerables. Un gen rearreglado tiene una o ms
posiciones en que han ocurrido varios cambios de
secuencia. Casi siempre se puede encontrar una se-
cuencia idntica a la nueva en uno de los seudoge-
nes (que no cambian). Las secuencias excepciona-
les que no se encuentran en un seudogen siempre
representan cambios en la unin de la secuencia
original y la modificada.
As, para generar diversidad se emplea un me-
canismo nuevo. Las secuencias de los seudogenes,
de entre 10 y 120 bp de longitud, se introducen
en la regin V
X1
activa por conversin gnica, en
tanto que la misma no modificada no se expresa,
ni siquiera en las primeras etapas tempranas de la
respuesta inmunitaria. Es posible que un suceso de
conversin tenga xito cada diez a veinte divisiones
celulares en todas las secuencias con rearreglo.
Al trmino del periodo de maduracin inmunitaria,
una secuencia con esas caractersticas cuenta con
cuatro a seis segmentos compartidos que abarcan
toda su longitud y que se derivan de diversos seudo-
genes donadores. Si todos los seudogenes participa-
ran, las combinaciones posibles seran 2.5 x 108!
La base enzimtica para el copiado de secuen-
cias de seudogenes en el locus expresado depende
de las enzimas involucradas en la recombinacin,
adems de que se relaciona con el mecanismo de
hipermutacin somtica que introduce diversidad
en el ratn y el hombre. Para el proceso de conver-
sin gnica se necesitan algunos de los genes im-
plicados en la recombinacin; por ejemplo, se evita
por la delecin RAD54. Por otra parte, la delecin
de diferentes genes recombinantes (XRCC2, XRCC3,
y RAD51B) tiene otro efecto muy interesante, la mu-
tacin somtica del gen V en el locus expresado.
La frecuencia de las mutaciones somticas es -10
mayor que la tasa usual de conversin gnica.
Estos resultados muestran que la ausencia de
mutacin somtica en el pollo no se debe a una de-
ficiencia de los sistemas enzimticos correspondiente
del ratn y el hombre; la explicacin ms probable
para una conexin (o su carencia) entre la recom-
binacin y la mutacin somtica, es que las roturas
no apareadas en el locus desencadenan la induccin
de mutaciones. As pues, el motivo de la mutacin
somtica en el ratn y el hombre, pero no en el pollo,
puede estar en los detalles de la operacin del sistema
de reparacin que acta en las roturas del locus. Es
ms eficiente en el pollo, de manera que el gen se
repara por conversin antes de que puedan inducirse
mutaciones.
La diversidad de lg del pollo es producto de conversin
gnica mediante seudogenes
25 seudogenes V
,
1
,
VV J C
Juntura V-J
m w
La secuencia del seudogn
sustituye la parte correspondiente
de VJ
El locus X de cadena ligera del pollo tiene 25 seu-
dogenes V en direccin ascendente respecto de la regin funcional
nica V-J-C. Las secuencias derivadas de los seudogenes,
sin em-
bargo, se encuentran en genes activos V-J-C con rearreglo.
23.16 Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes
593
La clula B de memoria
permite una respuesta
secundaria rpida
Las clulas B se expanden y liberan antigeno
Conceptos principales
.
La respuesta primaria a un antgeno es montada por tas
clulas B, que no sobreviven despus del periodo de
respuesta,
.
Se producen clulas B de memoria con especificidad
para el mismo antgeno, pero estn inactivas.
.
Una reexposicin al antgeno origina la respuesta
secundaria, en la cual las clulas de memoria se
activan rpidamente.
En este momento ya es posible resumir la relacin
entre la generacin de anticuerpos muy afines y
la diferenciacin de la clula B. En la FIGURA 23.24
se muestra que las clulas B se derivan de una po-
blacin autorrenovable de clulas madre de la m-
dula sea. La maduracin para producir clulas B
depende del rearreglo del gen Ig, que requiere de
las funciones de los genes SCID y RAG1,2 (adems
de otros). Si se bloquea el rearreglo gnico no se
producen clulas B maduras. La especificidad de los
anticuerpos que portan las clulas B depende de las
combinaciones particulares de las regiones V(D)J y
de cualquier nucletido adicional incorporado du-
rante el proceso de unin.
La exposicin a un antgeno desencadena dos
aspectos de la respuesta inmunitaria; la respues-
ta nraunaria primaria se debe a la expansin
clonal de clulas B en respuesta a un antgeno, con
lo cual se genera un nmero importante de clulas
plasmticas especficas del antgeno; hay un cambio
de isotipo para generar el tipo apropiado de res-
puesta efectora. La poblacin de clulas encarga-
das de la respuesta primaria constituye un punto
terminal, pues no viven ms all de la respuesta
primaria misma.
El fenmeno de la memoria de la clula B
permite preparar para una respuesta inmunitaria
seaxoiaria. La mutacin somtica genera clulas B
con mayor afinidad por el antgeno que no desenca-
denan una respuesta inmunitaria en ese momento,
aunque podran presentar cambios en el isotipo para
seleccionar otras formas de la regin C
H
;
se alma-
cenan como clulas de memoria con especificidad
apropiada y tipo de respuesta efectora, pero no estn
activas, se activan cuando hay una nueva exposicin
al mismo antgeno; el antgeno las selecciona de an-
temano, de modo que pueden montar una respuesta
secundaria muy rpida, sencillamente por expansin
clonal; durante la respuesta secundaria no hay ms
mutaciones somticas ni cambios de isotipo.
Ciuias madre en la
mdula sea
SCID
RAG1,2
etc.
Clulas B
Rearreglo del
gen de Ig
Clula B de memoria
f \
Antgeno
Respuesta primaria
Mutacin
somtica
Cambio
Expansin
clonal y
cambio de
isotipo t
de isotipo \
Clulas de
memoria
f \
Respuesta secundaria
Expansin J
clonal T
>
Clulas plasmticas
FIGURA 23.24 La diferenciacin de la clula B se encarga
de la inmunidad adquirida. Las clulas pre-B se convierten en
clulas B por rearreglo del gen de Ig. La exposicin inicial a un
antgeno provoca la respuesta primaria y el almacenamiento de
clulas de memoria. La exposicin subsiguiente a un antigeno
provoca la respuesta secundaria de las clulas de memoria.
Las vas que se resumen en la Figura 23.24
muestran el desarrollo de la inmunidad adquirida,
esto es, la respuesta a un antgeno. Adems de estas
clulas, hay un conjunto independiente de clulas B
llamado de clulas Ly-1, las cuales han pasado por
un proceso de rearreglo del gen V y aparentemente
se seleccionan para la expresin de un repertorio
particular de especificidades de anticuerpos. No pre-
sentan mutacin somtica ni respuesta de memoria,
si bien podran participar en la inmunidad natural,
esto es, tener una capacidad intrnseca para respon-
der ante ciertos antgenos.
La FIGURA 23.2'. es una descripcin ms detalla-
da del desarrollo de la clula B. El primer paso es la
594. CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
y etapas especificas en el
desarrollo de la clula B
C ula
madre
0
Recombinacin i
n i
D
h
-J
h
Clula pre-B
grande
Recombinacin
1 x 107 clulas ,
Clula pre-B
pequea
2 x 107 clulas
Ciuia B Inmadura
2x 107 clulas
Clula B madura
2x10 clulas
Se expresa la
cadena ligera
subrogada
Receptor pre-B
'
de la cadena
pesada; cadena
ligera p subrogada
\i expresada
Receptor B de
cadena pesada;
cadena ligera p:
Receptor B de
cadena pesada:
cadena ligera
P O K 0 X
FIGURA 23.25 EL desarrolLo de La cLula B procede en etapas
secuenciales.
recombinacin de los segmentos D y J de la cadena
pesada p, que se logra por recombinacin de V-D,
que genera una cadena pesada ]i. Como se mostr
antes, en la Figura 23.13, pueden tener lugar varios
sucesos de recombinacin, incluida una sucesin de
rearreglos no productivos y productivos. Estas clu-
las expresan una protena que simula una cadena
X
, llamada cadena ligera subrogada (SL), la cual se
expresa en la superficie y se vincula con la cadena
pesada p para formar el receptor pre-B; es similar a
un complejo de inmunoglobulinas, pero no se com-
porta como ellas.
La produccin de la cadena p reprime la sntesis
de la cadena SL y las clulas se dividen para con-
vertirse en clulas pre-B pequeas. A continuacin,
se expresa la cadena ligera y aparece una inmuno-
globulina funcional en la superficie de las clulas B
inmaduras; se presentan divisiones celulares adicio-
nales y se aade la expresin de la cadena 5 pesada
El anticuerpo forma un complejo de membrana
Inmunoglobulma
A
El receptor de antgenos de la clula B consta
de un tetrmero de inmunoglobulina (H ) enlazado con dos
copias del heterodmero de transduccin de seal (Igcxp),
a la de la cadena p, conforme las clulas se tornan
B maduras,
Las inmunoglobulinas actan tanto por secre-
cin en las clulas B, como por expresin superfi-
cial. En la : se muestra que el complejo
activo de la superficie celular se llama receptor
de la clula B (BCR) y consta de una inmuno-
globulina vinculada con protenas transmembra-
na llamadas Iga y Igp, las cuales proporcionan los
componentes de sealizacin que desencadenan las
vas intracelulares en respuesta a una unin ant-
geno-anticuerpo. La activacin de BCR tambin es
influida por interacciones con otros receptores, por
ejemplo, para mediar la interaccin de clulas B ac-
tivadas con antgeno y clulas T auxiliares.
Los receptores de Las cLuLas
T tienen relacin
con Las inmunogLobuLinas
Conceptos principales
.
Las clulas T usan un mecanismo similar de unin
V(D)J-C a las clulas B para producir uno de los dos
tipos de receptor de clulas T.
.
En >95% de los Linfocitos T se encuentra TCR af>; La
TCR yS se encuentra en <5 por ciento.
El linaje linfoctico constituye un ejemplo de opor-
tunismo evolutivo; tanto en las clulas B como en
las T se utiliza un procedimiento similar para gene-
rar protenas con una regin variable susceptible
de dar lugar a una diversidad significativa, en tan-
23.18 Los receptores de las clulas T tienen relacin con las inmunoglobulinas
595
Hay dos tipos de receptor de clulas T
Timocito
*
99 5!?
\
-
Sntesis de f
D ,
_
Sin rearreglo
Sin rearreglo
Sntesis de ap-
FIGURA 23.27 EL receptor y5 se sintetiza al principio del de-
sarrollo de La clula T; el TRC ap se sintetiza ms adelante y se
encarga de la inmunidad
"
clsica
"
mediada por clulas, en la
cual se reconocen juntos los antgenos blanco y de histocom-
patibilidad del hospedador.
El locus TcR u tiene genes u y
Organizacin de ratn y humana
Va1-48V5VC[ Dg J5 C5 Ja1-100

mi tm
kb 140 120 100 80 60 40
Resumen del a humano: 42 V 61 J
20
FIGURA 23.28 EL Locus del TCRa humano tiene segmentos a
y 6 dispersos. Un segmento V5 se localiza en el grupo Vo. Los
segmentos D-J-C
5 yacen entre los segmentos gnicos Vy J-Ca.
El Locus del ratn es similar, pero tiene ms segmentos V..
El locus TcR|< es similar en el ratn y el hombre
Organizacin de ratn y hombre P1 P2
V
<60
500 kb
DJC DJC V
1
_
6
_
1 171 1
ill ll i
280 kb 30 20 10 0
Resumen del p humano: 47 V, 2 D, 13 J
FIGURA 23.29 El Locus del TCR(3 contiene muchos segmentos
gnicos V dispersos en ~500 kb que se encuentran ~280 kb en
direccin ascendente respecto de los dos grupos D-J-C.
to que las regiones constantes son ms limitadas
contribuyen a una pequea variedad de funciones
efectoras. Las clulas T producen uno de dos tipcs
de receptor de clulas T; estos receptores de clulas
T se sintetizan en momentos diferentes durante e
.
desarrollo de las clulas T, como se resume en La
FIGURA 23.27.
El receptor 78 se encuentra en <5% de los linfo
citos T; es sintetizado slo en las primeras etapas de.
desarrollo de las clulas T. En ratones, es el unic
receptor detectable con <15 das de gestacin, pero
virtualmente se ha perdido para el momento de;
nacimiento, en el da 20.
El TCR aP se encuentra en >95% de los lir-
focitos; se sintetiza ms tarde que el yd, durante e' .
desarrollo de las clulas T. En ratones, empieza a ser
detectable entre los das 15 y 17 de gestacin. Psr
el nacimiento, es el receptor predominante, el ni
es sintetizado por un linaje independiente de 1=
clulas involucradas en la sntesis de TCR yb; implic
eventos de rearreglo independientes.
Como las inmunoglobulinas, un TCR debe reco-
nocer un antgeno extrao de estructura imprede-
cible. El problema del reconocimiento de antgen..
por las clulas B y T se resuelve en la misma ferial
y la organizacin de los receptores de la clula T < .
asemeja a la de los genes de inmunoglobulinas et:
el uso de regiones variables y constantes. Cada le-
se organiza en la misma forma que los genes de inmu-
noglobulina, con segmentos separados que se juntan pc-r
una reaccin de recombinacin especfica del linfocito. L( s
componentes son los mismos que se encuentran er.
las tres familias de Ig.
La organizacin de las protenas del TCR simuU
la de las inmunoglobulinas; las secuencias V tienj
la misma organizacin interna general tanto en Ui
protenas Ig como en el TCR. La regin C de este
ltimo se relaciona con las regiones constantes de
Ig y presenta un solo dominio constante, seguid,
de porciones transmembrana y citoplsmicas. La es-
tructura exn-intrn tiene relacin con la funcin
protenica.
Las similitudes de organizacin de los genes dt,
TCR y con los de Ig es notoria. Como se resume eat.
laFIGURA 23.28, la organizacin del TCR a es similar
a la de Ig k, con segmentos del gen V separados di
un conjunto de segmentos J que precede a un sok
segmento del gen C. La organizacin del locus s
similar en el ser humano y el ratn, con slo algu-
nas diferencias en cuanto a nmero de segmente.;
del gen V
o
y de Ja. (Adems de los segmentos o.
este locus tambin contiene segmentos , que se
describen brevemente.)
Los componentes de TCR [3 son similares a los
de IgH. En la FIGURA 23.29 se observa que la qj-
ganizacin es diferente, con segmentos del gen V
596 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
separados por dos grupos, cada uno de los cuales
contiene un segmento D, varios segmentos J y un
segmento del gen C. Tambin en este caso, las ni-
cas diferencias entre el ser humano y el ratn yacen
en el nmero de unidades V
p y
J .
La diversidad es generada por los mismos meca-
nismos que en las inmunoglobulinas; la intrnseca
es resultado de la combinacin de una variedad de
segmentos V, J, D, y C; ciertas diferencias adiciona-
les resultan de la introduccin de nuevas secuencias
en las uniones entre dichos componentes (en forma
de nucletidos P y N; vase la Fig. 23.14). Algunas
cadenas TCR P incorporan dos segmentos D, gene-
rados por uniones D-D (dirigidas por una organi-
zacin apropiada de las secuencias de nonmero y
heptmero). Una diferencia entre TCR e Ig es que la
mutacin somtica no ocurre en los loci de TCR. Las
determinaciones del grado de diversidad muestran
que las 1012 clulas T del ser humano contienen
2
.
5 x 1 o7 cadenas a diferentes, relacionadas con 106
cadenas p diferentes.
Posiblemente los mismos mecanismos partici-
pen en las reacciones de recombinacin de genes
de Ig en clulas B y genes de TCR en clulas T. Los
segmentos del TCR recombinados son rodeados por
secuencias de consenso nonamricas y heptamri-
cas, idnticas a las que utilizan los genes de Ig, lo
cual lleva a pensar seriamente que participan las
mismas enzimas. La mayor parte de los rearreglos
quiz tenga lugar por el modelo de delecin (va-
se la Fig. 23.12). No se sabe cmo se controla el
proceso de que los loci de Ig se rearreglan en las
clulas B, en tanto que los receptores de clulas T
se rearreglan en clulas T.
La organizacin del locus y se asemeja a la de
IgA,, con segmentos gnicos V separados de una se-
rie de segmentos J-C. En la FIGURA 23.30 se muestra
que ese locus tiene relativamente poca diversidad,
con ~8 segmentos V funcionales. La organizacin
es diferente en el hombre y el ratn; en el ratn
tiene 3 loci J-C funcionales, pero con algunos seg-
mentos de orientacin invertida, mientras que en
el ser humano tiene mltiples segmentos J por cada
segmento del gen C.
La subunidad 5 es codificada por segmentos que
se encuentran en el locus TCRa, como se mostr
en la Figura 23.28. Los segmentos D
6
-D
s
-J
5
-C
6 y
acen
entre los segmentos del gen V y los de J
a
-C
c(
. Am-
bos segmentos D pueden incorporarse a la cadena
5 para dar la estructura VDDJ. La naturaleza de los
segmentos gnicos V usados en el rearreglo 5 es in-
teresante, muy pocas secuencias V se encuentran
en cadenas TCR 5 activas. En el ser humano, slo
un segmento del gen V se utiliza de manera general
para el rearreglo 5. En el ratn se encuentran varios
TcR tiene menos diversidad
Ratn
V
i \ H ti .
C2J2
Si . .
J4C4
Direccin de la expresin
Ser humano
V
4 i t | f
Jl C1
I
J2 O2
i
J
I
kb 100 80 60 40 20
FIGURA 23.30 EL Locus TCRy contiene un pequeo nmero de
segmentos funcionaLes deL gen V (y tambin algunos seudo-
genes no ilustrados) en direccin ascendente respecto de Los
Loci J-C.
segmentos V
5
, algunos exclusivos del rearreglo 5,
pero otros tambin se encuentran en rearreglos a.
Se desconoce la base de la especificidad para la se-
leccin de segmentos V en los rearreglos a y p; una
posibilidad es que muchos de los segmentos del gen
V
a
pueden unirse al segmento DDJ8, pero que slo
algunos (definidos, por lo tanto, como V
g) p
uedan
proporcionar protenas activas.
Por el momento, los elementos V que se en-
cuentran en las cadenas 5 han sido etiquetados
como segmentos del gen V
s;
sin embargo, no es po-
sible juzgar si son realmente exclusivos del rearre-
glo 5. El arreglo disperso de genes implica que la
sntesis de los receptores TCR aP y el receptor y5 es
mutuamente exclusiva en cualquier alelo, pues el
locus 8 se pierde por completo cuando se presenta
el rearreglo V
a
-J
a
.
Los rearreglos en los loci de TCR, como los de
los genes de inmunoglobulina, pueden ser produc-
tivos o no productivos. El locus p muestra exclusin
allica, muy parecida a la de los loci de las inmuno-
globulinas; el rearreglo se suprime una vez que se
ha generado un alelo productivo. El locus a puede
ser diferente; varios casos de rearreglo continuo
sugieren la posibilidad de que la sustitucin de se-
cuencias podra continuar despus de la genera-
cin de un alelo productivo.
gjg El receptor de La clula T acta
con el MHC
Concepto principal
.
EL TCR reconoce un pptido corto unido a un surco
de una protena deL MHC en La superficie de La cLuLa
presentadora.
Las clulas T con receptores aP se dividen en varios
subtipos con diversas funciones conectadas con in-
23.19 EL receptor de La cLuLa T acta con eL MHC
597
teracciones entre clulas implicadas en la respuesta
inmunitaria. Las clulas T citotxicas poseen la ca-
pacidad de lisar una clula blanco infectada, en tan-
to que las clulas T auxiliares facilitan la eliminacin
del blanco mediada por la clula T o la interaccin
antgeno-anticuerpo mediada por la clula B.
Una diferencia importante entre los anticuerpos
de las clulas B y los receptores de las clulas T es la
forma en que manejan el antgeno. Un anticuerpo
reconoce una regin corta (eptopo) en un antge-
no. El receptor de la clula T se une a un pptido
pequeo, de cuatro a cinco aminocidos de longi-
tud, procesado a partir del antgeno por reacciones
de escisin. El fragmento peptdico es "presentado"
a la clula T por una protena del MHC, de modo
que la clula T reconoce de manera simultnea al
antgeno extrao y a una protena del MHC que
porta la clula transportadora, como se ilustr an-
tes en la Figura 23.2. Tanto las clulas T auxiliares
como las T asesinas actan de esta forma
, pero tie-
nen diferentes requerimientos para la presentacin
del antgeno; en cada caso se utilizan tipos diversos
de protena del MHC (vase la seccin 23.20,
El lo-
cus de histocompatibilidad mayor codifica muchos
genes del sistema inmunitario). Las clulas T auxi-
mtTiifiii-i-nfTinrniiiin'i
i
CD4- CD8-
Recombinacin
mediada por RAG
Expresin de TCRp
TCRp se une a la.
cadena a subrogada
Expresin de preTCRa
Se expresan
CD4+ CD4 y CD8
CD8+
Expresin de TCRp
secuendales.
EL desarrollo de la clula T procede en etapas
liares requieren de la presentacin del antgeno pi :
una protena del MHC de clase II, en tanto que a Is
T asesinas les debe ser presentado por una proteni
de clase I del MHC.
El receptor TCR aP se encarga de la funcin de
las clulas T auxiliares en la inmunidad humoral
de las clulas T asesinas en la inmunidad mediad;
por clulas, de modo que tiene que reconocer tall3
to el antgeno extrao como la protena del MH'Z
del hospedador. La protena del MHC se une a m
pptido corto derivado del antgeno extrao y d
TCR reconoce entonces al pptido en un surco ck
la superficie del MHC. Se dice que el MHC presen-
ta el pptido al TCR (el pptido se genera cuande
el proteosoma fragmenta la protena extraa par;
producir segmentos de 8 a 10 molculas de longi-
tud). Determinado TCR tiene especificidad para un;
protena del MHC en particular, as como para 9
antgeno extrao. La base para esa doble capacidad
es uno de los aspectos ms interesantes que estn
por definirse acerca del TCR a|3.
La recombinacin para generar cadenas de TCF
funcionales se vincula con el desarrollo del linfocitP
T
, segn se resume en la FIGURA 23.31. La primera
etapa es el rearreglo para formar una cadena TCE
(3 activa, que se une a una cadena a subrogada |
sin rearreglo, llamada pre-TCR a. En esta etapa,
el linfocito no ha expresado las protenas de su-
perficie CD4 ni CD8. El heterodmero pre-TCR se
une entonces al complejo de seal CD3 (vase ms
adelante). Las seales del complejo desencadenan
varios ciclos de divisin celular durante los cuales
se rearreglan las cadenas a y los genes CD4 y CDS
se activan, de modo que el linfocito se convierte de
CD4-CD8-a CD4+CD8+, momento del desarrollo que
se denomina seleccin P y genera timocitos DP.
El rearreglo de la cadena a contina en los ti-
mocitos DP y el proceso de maduracin procede por
seleccin positiva (para complejos de TCR maduros
susceptibles de unir un ligando) y por seleccin ne-
gativa (contra complejos que interactan con ligan-
dos, propios, inadecuados). Ambos tipos de selec-
cin implican la interaccin con protenas del MHC.
Los timocitos DP mueren despus de ~3 das o se
convierten en linfocitos maduros como resultado
del proceso selectivo. El heterodmero de superfi-
cie TCR cep presenta enlaces cruzados durante la
seleccin positiva (lo que rescata a los timocitos de
la muerte). Si los timocitos sobreviven a la seleccin
negativa subsiguiente, dan origen a las clases defini-
das de linfocitos T que son CD4+CD8-y CD4-CD8+.
El receptor de las clulas T se vincula con un
complejo de protenas llamado CD3 que partici-
pa en la transmisin de una seal que parte de la
superficie de la clula hacia el interior cuando su
598 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
receptor relacionado se activa por la unin con el
antgeno. La imagen actual de los componentes del
complejo receptor de una clula T se ilustran en la
FIGURA 23.32. El punto importante es que la interac-
cin de las regiones variables del TCR con el ant-
geno provoca que las unidades , del complejo CD3
activen la respuesta de la clula T. La activacin del
CD3 constituye el medio por el que los TCR o jb
sealan que han reconocido un antgeno, fenme-
no comparable con la constitucin del receptor de
la clula B, en el que la inmunoglobulina se vincula
con las cadenas de seal Igap (vase la Fig. 23.26).
An no se resuelve un dilema clave sobre la
funcin de la clula T. La inmunidad mediada por
clulas implica dos procesos de reconocimiento;
el del antgeno extrao requiere de la capacidad
de responder a estructuras nuevas, en tanto que
el de la protena del MHC se limita, por supuesto,
a una de las codificadas por el genoma, pero an
as, hay muchas protenas del MHC diferentes, de
modo que en ambas reacciones de reconocimiento,
la diversidad requerida es considerable. Tanto las
clulas T auxiliares como las asesinas dependen de
diferentes clases de protenas del MHC; sin embar-
go, utilizan la misma reserva de segmentos gni-
cos a y [3 para ensamblar sus receptores. Incluso
teniendo en cuenta la introduccin de variaciones
adicionales durante el proceso de regeneracin de
TCR, no se sabe cmo se ponen a la disposicin
suficientes versiones diferentes del receptor de c-
lulas T como para satisfacer todas esas exigencias.
El TcR se une a un complejo de sealizacin
La regin V del TCR
reconoce al antgeno
TCR
CD3
5
CD3
S
-S CD3
6
S--S
02'0
CITOSOL
A
CD3I
i
La cadena es electora
FIGURA 23.32 Las dos cadenas del receptor de la clula T se
vinculan con los polipptidos del complejo CD3. Las regiones
variables delTCR estn expuestas en la superficie de la clula.
Los dominios citoplasmticos de las cadenas de CD3 desem-
pean una funcin efectora.
EL Locus de histocompatibiLidad
mayor codifica muchos genes
deL sistema inmunitario
Conceptos principales
El locus del MHC codifica las protenas de clases I y II,
as como otras del sistema inmunitario.
.
Las protenas de clase I son los antigenos de trasplante
encargados de distinguir entre tejidos
"
propios
"
y
"
ajenos
"
.
.
Una protena de clase I del MHC acta como
heterodmero con la |3
Z
microglobulina.
.
Las protenas de clase II participan en las
intervenciones entre clulas T.
Una protena de clase II del MHC es un heterodmero
de cadenas ce y p.
El locus de histocompatibilidad mayor ocupa un pe-
queo segmento de un cromosoma en el ratn (que
se llama locus H2) y en el hombre (Uamado locus
HLA); en dicho segmento hay muchos genes que
codifican funciones relacionadas con la respuesta
inmunitaria. En loci gnicos individuales cuyos
productos han sido identificados se encontraron
muchos alelos en la poblacin; el locus se describe
como altamente polimrfico, es decir, que cada ge-
noma tal vez sea diferente de los dems. Los genes
que codifican otras funciones tambin se localizan
en esa regin.
Los antgenos de histocompatibilidad se clasi-
fican en tres tipos, segn sus propiedades nmu-
nitarias, adems de que otras protenas que se
encuentran en linfocitos y macrfagos tienen una
estructura relacionada y son importantes para la
funcin de las clulas del sistema inmunitario:
Las protenas de clase I del MHC son antge-
nos de trasplante y se encuentran en todas las
clulas de los mamferos. Como su nombre sugiere,
se encargan del rechazo de tejidos extraos, que se
reconocen como tales en virtud de su arreglo es-
pecfico de antgenos de trasplante. En el sistema
inmunitario deben estar en clulas blanco para la
respuesta mediada por clulas. Las protenas de cla-
se I se definen serolgicamente (por sus propiedades
antignicas). La clase I de genes murinos codifica
las protenas H2-K y H2-D/L. Cada cepa de ratones
tiene uno de varios posibles alelos para cada una de
esas funciones. Las funciones de la clase I humana
incluyen los antgenos de trasplante usuales, HLA-
A
, B y C.
Las protenas II del MHC se encuentran en
la superficie de los linfocitos B y T, as como de
los macrfagos. Estas protenas participan en la co-
municacin entre clulas, necesaria para ejecutar
23.20 El locus de histocompatibilidad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario
599
la respuesta inmunitaria; en particular, son necesa-
rias para la funcin de las clulas T auxiliares. Las
funciones de la clase n murina se definen gentica-
mente como I-A e I-E. La regin de clase 11 humana
(tambin llamada HLA-D) est dispuesta en cuatro
subregiones, DR, DQ, DZ/DO, y DP.
Las protenas del complemento se codifican
en un locus que tambin se conoce como regin S,
por suero, o sea que son componentes sricos. Su
funcin es interactuar con complejos antgeno-an-
ticuerpo para dar lugar a las lisis de clulas en la va
clsica de la respuesta humoral.
Las protenas de los loci Qa y Ta se encuentran
en clulas hematopoyticas murinas; se les cono-
ce como antgenos de diferenciacin porque cada
una se encuentra slo en un subgrupo especfico
de clulas sanguneas, supuestamente relacionada
con su funcin. Tienen vnculos estructurales con
las protenas H2 de clase I y, como ellas, son poli-
mrficas.
Ahora es posible relacionar los tipos de prote-
nas con la organizacin de los genes que las codifi-
can. La regin del MHC originalmente se defini por
va gentica en el ratn, donde la regin clsica H2
ocupa 0.3 unidades de mapa. Aunada a la regin ad-
yacente, donde tambin se encuentran mutaciones
que afectan a la funcin inmunitaria, corresponde
a una regin de ~2 000 kb del DNA, la cual ha sido
secuenciada completamente en varios mamferos,
as como en aves y peces. Comparando estas se-
cuencias se llega a la conclusin de que, en general,
la organizacin ha sido conservada.
En la FIGURA 23.33 se resume la organizacin
gentica del ratn y del hombre. Las regiones ge-
nmicas en que se localizan los genes de clases I ]
II marcan los lmites originales del locus (que v:-::
en direccin de telmero a centrmero; de derechi
a izquierda, como se muestra en la figura). Los ge-
nes de la regin que separa a los de clase I y los -
clase II codifican para muy diversas funciones, e.
la llamada regin de clase III. La definicin de lei
extremos del locus vara en funcin de la especie
,
y la regin que se encuentra ms all de los gene:
de clase I, del lado telomrico, se denomina regin
extendida de clase I. Asimismo, la regin que es::
ms all de los genes de clase II, del lado centro-
mrico, se denomina regin extendida de clase
La principal diferencia entre el ratn y el hombre
es que, en el ratn, la regin extendida de clase Q
contiene algunos genes de clase I (H2-K).
En las regiones del MHC de los mamferos hay
varios cientos de genes, pero es posible que muchos
menos sean los que proporcionan las funciones dc
MHC, como en el caso del pollo, que tiene 92 kb y
slo nueve genes.
Como en las comparaciones de otras familia-
gnicas, hay diferencias en cuanto al nmero exac-
to de genes dedicados a cada funcin. El locus de!
MHC muestra amplias variaciones entre individuo
de modo que el nmero de genes puede ser dife-
rente en sujetos diferentes. Como regla general, sin
embargo, el genoma de ratn tiene menos gene?
H2 activos que el humano. Los genes de clase II son
exclusivos de los mamferos (excepto un subgrupo i
y como regla, en aves y peces, diferentes genes ocu-
pan su lugar. Hay ~8 genes de clase I funcionales en
el ser humano y -30 en el ratn. La regin de cla r
I tambin incluye muchos otros genes. Las regiones
Las protenas del MHC son codificadas por regiones homologas muy largas en mamferos
Ratn
Codifica ia
clase I del
MHC
480 Mb 700 Mb 860 Mb
Codifica la
clase II del
V1HC
Codifica muchos genes
no relacionados
Codifica la
clase 1 del MHC
Clase i
extendida
Regin 11
extendida
845 Mb 700 Mb 960 Mb
100 kb Humano Telmero
FIGURA 23.33 La regin del MHC cubre >2 Mb. Las protenas del MHC de clases I y II son co-
dificadas por dos regiones separadas. La regin de clase III se define como el segmento que las
separa. Las regiones extendidas describen segmentos sintnicos a cada lado del grupo. La principal
diferencia entre el ratn y el ser humano son los genes H2 de clase I en la regin extendida, a la
izquierda. El locus marino se localiza en el cromosoma 17 y el humano, en el 6.
600 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
de clase III son muy similares en seres humanos y
ratones.
Todas las protenas del MHC son dmeros loca-
lizados en la membrana plasmtica, con una parte
importante que protruye en el lado extracelular. Las
estructuras de las protenas de clases I y II del MHC
estn relacionadas, aunque presentan diferentes
componentes, como se resume en la FIGURA 23.34.
Los antgenos de clase II constan de dos cade-
nas, a y p, cuya combinacin genera una estructura
global en la cual hay dos dominios extracelulares.
Todas las protenas de clase I del MHC constan
de un dmero entre la propia cadena de clase I y la
protena P2-microglobulma. La cadena de clase I es
un componente transmembrana de 45 kD con tres
dominios externos (cada uno de -90 aminoci-
dos de longitud, uno de los cuales interacta con la
P2-microglobulma), una regin transmembrana
de -40 fragmentos y un dominio citoplsmico de
-
30 fragmentos que reside en el interior de la c-
lula.
La p2 microglobulina es una protena secretada
de 12 kD necesaria para transportar la cadena de
Las clases I y II del MHC tienen
estructuras similares
Clase i Clase II
Cadena a Cadena (3
3
3
FIGURA 23.34 Los antgenos de histocompatibilidad de cia-
ses I y II tienen una estructura relacionada. Los antigenos de
clase I constan de un solo polipptido (a) con tres dominios
externos (al, a2, a3) que interacta con la microglobulina
(32 (|32m). El antgeno de clase II consta de dos polipptidos
(a y |3), cada uno con dos dominios (al y a2, (31 y (32) y una
estructura global similar.
clase I a la superficie de la clula. Los ratones que
carecen del gen P2 de la microglobulina no tienen
antgeno de clase I del MHC en la superficie celu-
lar.
La organizacin de los genes de clase I, resu-
mida en la FIGURA 23.35-, coincide con la estructura
protenica. El primer exn codifica una secuencia
seal (escindida de la protena durante el paso por
la membrana). Los siguientes tres exones codifican
a cada uno de los dominios externos, mientras que
el quinto hace lo propio con el dominio transmem-
brana. Los ltimos tres exones, bastante pequeos,
codifican juntos al dominio citoplsmico. La nica
diferencia en los genes de antgenos de trasplante
humanos es que su dominio citoplsmico es codifi-
cado slo por dos exones.
El exn que codifica el tercer dominio externo
de los genes de clase I est muy conservado respec-
to de los otros, y quiz represente la regin que in-
teracta con la [32 microglobulina, lo cual explica la
necesidad de una estructura constante. Ese dominio
tambin muestra homologas con los dominios de la
regin constante de las inmunoglobulinas.
Qu se encarga de generar el alto grado de po-
limorfismo de esos genes? Casi todas las variaciones
de secuencias entre alelos ocurre en el primero y
segundo dominios externos, a veces asumiendo la
forma de un grupo de sustituciones de bases en una
pequea regin. Un mecanismo implicado en su ge-
neracin es la conversin entre genes de clase I; hay
tanto seudogenes como genes funcionales.
El gen de la [32 microglobulina se localiza en un
cromosoma separado; tiene cuatro exones, el pri-
mero de los cuales codifica una secuencia seal; el
segundo, para la mayor parte de la protena (de los
aminocidos 3 a 95); el tercero para los ltimos cua-
tro aminocidos y parte del remolque no traducido,
y el resto, para la parte restante del remolque.
i Exones de los genes del MHC = dominios proteinicos
Clase 1 a
. iP.
Clase II a
Clase II p m - - i-
B microglobulina
m m -
Exones
m Lderes b No traducidos
Extracelulares Citoplasmticos
Transmembrana
FIGURA 23.35 Cada clase de genes del MHC tiene una organi-
zacin caracterstica en que los exones representan dominios
proteinicos individuales.
23.20 El locus de histocompatibilidad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario
601
La longitud de la P2 microglobulina es similar a
la de un gen V de inmunoglobulina, con ciertas si-
militudes en cuanto a constitucin de aminocidos,
y algunas homologas (limitadas) de la secuencia de
nucletidos entre la $2 microglobulina y los domi-
nios constantes de Ig o el tercer dominio externo del
gen de tipo I. Todos los grupos de genes descritos en
este captulo pueden haber descendido de un ances-
tro comn que codificaba un dominio primitivo.
La inmunidad innata utiliza
Las vas de seal conservadas
Conceptos principales
.
La inmunidad innata se desencadena por receptores
que reconocen segmentos (PAMP) altamente
conservados en bacterias u otros agentes infectantes.
.
Suelen usarse receptores similares a tragamonedas para
activar la va de respuesta.
.
Las vas se conservan mucho de invertebrados a
vertebrados y se encuentra una va anloga en las
plantas.
La respuesta inmunitaria descrita en este captulo
comprende un conjunto de reacciones que se pre-
sentan ante un patgeno por seleccin de linfocitos
(clulas B o T) cuyos receptores (anticuerpos o TCR)
tienen gran afinidad por el patgeno, La base de
este proceso selectivo es la generacin de un nme-
ro muy considerable de receptores, como para dar
lugar a una elevada posibilidad de reconocer una
molcula extraa. Los receptores que reconocen las
protenas propias del cuerpo son motivo de exclu-
sin en etapas tempranas del proceso. La activa-
cin de los receptores de las clulas B desencadena
las vas de la respuesta humoral, en tanto que la
de receptores de las clulas T, desencadena las vas
Organismo
Los PAMP son ubicuos
Patgeno
Localizacin
Todas las
bacterias
La mayor parte
de las bacterias
Formilmetionina
Peptidoglucano
Bacterias Lipopolisacrido
gramnegativas
Levaduras
Zymosan
Casi todas
las protenas
Pared celular
Pared celular
Pared celular
FIGURA 23.36 Los patrones moleculares relacionados con pa-
tgenos (PAMP) son compuestos comunes a muchas variedades
de bacterias o levaduras; se exponen en caso de infeccin.
de la respuesta mediada por clulas. La respucaw
global ante un antgeno a travs de la seleccin
receptores de los linfocitos se denomina inmuni-
dad adaptativa (o inmunidad adquirida). Z
general, la respuesta se monta durante varios . ;
despus de la activacin inicial de las clulas B
que reconocen el patgeno extrao. El organisu*
conserva una memoria de respuesta que le permitt
reaccionar ms rpidamente si vuelve a exponcrw
al mismo patgeno. Los principios de la inmunidr
adaptativa son similares en todos los vertebrad -
aunque varan en detalles.
Otro tipo de respuesta inmunitaria ocurre m*
rpidamente y se encuentra en una mayor variedi
|
de animales (entre otros, los que no tienen innio-
nidad adaptativa). La inmunidad innata depen:-
del reconocimiento de ciertos patrones predefinic
en los patgenos extraos, los cuales se han coi>-
servado patgenos porque son esenciales para 93
funcin, pero no se encuentran en las eucariotas
ms elevadas. Por lo general, el segmento es reo:-
nocido por un receptor dedicado a desencaden-
la respuesta innata ante una infeccin, el cual
encuentra en clulas como los neutrfilos y los m-
crfagos, que hacen que el patgeno sea fagocitac
y eliminado. La respuesta es rpida porque el cnr.-
junto de receptores ya est en las clulas y no tiene
que amplificarse por seleccin, est muy conservad
y se encuentra en todo tipo de organismos, desde
moscas hasta el ser humano. Cuando la respue u
innata puede enfrentar eficazmente una infeccin
la respuesta adaptativa no se desencadena. Hay cier-
ta superposicin entre las respuestas porque activ;:
algunas de las mismas vas, de manera que las clu-
las activadas por la respuesta innata pueden partici-
par despus en la respuesta adaptativa.
Los segmentos que desencadenan la inmunidac
innata suelen denominarse patrones moleculares
relacionados con patgenos (PAMP), y en laFIG URA
23.36 se observa que estn ampliamente distribuido-;
en una amplia gama de organismos. La formilme-
tionina se usa para iniciar casi todas las protenas
bacterianas, pero no se encuentra en las eucariotas.
El peptidoglucano de la pared celular es exclusivo
de las bacterias, en tanto que el lipopolisacrido
(LPS) es un componente de la membrana externe
de la mayor parte de las bacterias gramnegativas.
que tambin se conoce como endotoxina; caus4
del sndrome de choque sptico.
Un descubrimiento clave de la naturaleza de la
inmunidad innata fue la participacin de los recep-
tores de peaje (TLR); el que se relaciona con el
receptor IL1 de los mamferos, desencadena la vii
en el gnero Drosophila, donde controla el desarrolle
dorsal-ventral. Esto lleva a la activacin del factor
CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
de transcripcin dorsal, miembro de la familia Re
que se vincula con el factor NP-kB de los mamferos.
La va de la inmunidad innata es paralela a la va de
peaje, con componentes similares. De hecho, uno
de los primeros indicios de la naturaleza de la in-
munidad innata en la mosca fue el descubrimiento
del factor de transcripcin Dif (factor inmunitario
relacionado-dorsal), que es activado por una de esas
vas.
Las moscas no tienen sistema de inmunidad
adaptativa pero son resistentes a las infecciones mi-
crobianas porque sus sistemas inmunitarios innatos
desencadenan la sntesis de potentes pptidos anti-
microbianos, de los cuales se han identificados siete
diferentes en el gnero Drosophila, que se sintetizan
en el cuerpo graso (rgano equivalente al hgado);
dos de los pptidos son antimicticos y cinco actan
sobre todo en bacterias. La forma en que general-
mente actan es asesinar el organismo blanco por
permeabilizacin de su membrana. Estos pptidos
se codifican en genes cuyos promotores responden
a los factores de transcripcin de la familia Re. En
la FIGURA 23.37 se resumen los componentes de las
vas innatas del gnero Drosophila.
En el gnero Drosophila actan dos vas de
respuesta innata; una responde principalmente a
hongos, en tanto que la otra hace lo propio sobre
todo contra bacterias gramnegativas; las bacterias
grampositivas pueden desencadenar ambas vas. En
la FIGURA 23.38 se resumen los pasos de cada una.
Los hongos y las bacterias grampositivas activan una
cascada que genera pptidos activadores de TLR, va
similar a la de NF-kB. El receptor de peaje activa
al factor de transcripcin Dif (pariente del NF-kB),
que en ltima instancia conduce a la activacin del
pptido antimictico, drosomisina. Las bacterias
gramnegativas desencadenan una va a travs de un
receptor diferente que activa el factor de transcrip-
cin Relish, que lleva a la produccin del pptido
bactericida, actacina. Esta va se denomina Imd por
uno de sus componentes, una protena que tiene un
"
dominio mortal" relacionado con los encontrados
en las vas de la apoptosis.
Los agentes clave de la respuesta a las bacterias
son protenas llamadas PGRP debido a su gran afi-
nidad con los peptidoglucanos bacterianos, de las
cuales hay dos tipos. Las PGRP-SA son protenas
extracelulares cortas que probablemente actan por
activacin de proteasas que desencadenan la va de
peaje. Las PGRP-LC son protenas transmembrana
con un dominio extracelular PGRP pero su funcin
exacta se desconoce.
La respuesta inmunitaria innata est muy con-
servada. Los ratones resistentes al choque sptico
presentan mutaciones en el receptor de peaje TLR4
La inmunidad innata destruye patgenos
La bacteria tiene PAMP
Pptidos activados
LLR extracelular
(Regin rica en leucina)
Receptor de peaje (TLR)
Factor de transcripcin
de la familia Re
Pptidos bactericidas
y antimicticos
Los pptidos
permeabilizan
la bacteria
\
FIGURA 23.37 La inmunidad innata es desencadenada por
PAMP. En la mosca da Lugar a La produccin de pptidos que
activan Los receptores de peaje. Los receptores conducen a una
va que activa un factor de transcripcin de La familia ReL. Los
genes bLanco para ese factor incLuyen pptidos bactericidas y
antimicticos, que actan por permeabilizacin de la membra-
na del organismo patgeno.
Drosophila tiene dos vas de inmunidad innata
Hongos
Bacterias Bacterias
grampositivas gramnegativas
PGRP-SA
Proteasas
Pptidos
PGRP-SA
Peaje
Va similar a la de NF-kB
Dorsal
\
ar
Receptor de
peaje (TLR)
Va Imd
Factor de
transcripcin
de la familia Re
a ir
i
I
Relish
tf hj*} Pptidos
. . bactericidas y
Drosomicma . '
antimicticos
Atacina
FIGURA 23.38 Una de Las vas de inmunidad innata del gnero
Drosophila tiene relacin estrecha con La va para la activacin
NF-kB de Los mamferos; La otra tiene componentes relaciona-
dos con Las vas de la apoptosis.
23,21 La inmunidad innata utiliza las vas de seal conservadas 603
cuando son tratados con LPS. Un homlogo hu-
mano del receptor de peaje puede activar algunos
genes de respuesta inmunitaria, lo cual sugiere que
la va de la inmunidad innata puede tambin fun-
cionar en el hombre. La va de direccin descen-
dente respecto de TLR suele ser similar en todos los
casos y por lo general lleva a la activacin del factor
de transcripcin NF-kB. An no se sabe si la va de
direccin ascendente se conserva y, en particular, si
los PAMP actan por generacin de ligandos que a
su vez activan los TLR, o si podran interactuar di-
rectamente con ellos. La va de direccin ascendente
de TLR es diferente en mamferos y moscas porque
los patgenos activan directamente los TLR de los
mamferos. En el caso del LPS, el patgeno se une
a la protena CD14 de superficie, lo cual permite
que CD14 active a TLR4 y desencadene la va de
respuesta innata. Hay -20 receptores en la clase TLR
del genoma humano, indicio de cuantos patgenos
pueden desencadenar la respuesta innata.
Las plantas tienen amplios mecanismos de de-
fensa, entre los cuales hay vas anlogas a la res-
puesta innata en animales. Es aplicable el mismo
principio de que los PAMP son segmentos que iden-
tifican al agente como patgeno. Las protenas que
responden a los patgenos son codificadas por una
clase de genes llamada de resistencia a la enferme-
dad, muchos de los cuales codifican para receptores
que comparten una propiedad con la clase TLR de
receptores en animales, el dominio extracelular tie-
ne un segmento llamado regin rica en leucina
(LLR). El mecanismo de respuesta difiere del de
las clulas animales y se dirige a la activacin de una
cascada cintica de protenas activadas por mitge-
nos (MAPK). Muchos patgenos diferentes activan
la misma cascada, lo cual sugiere que diversas inte-
racciones patgeno-receptor convergen en la acti-
vacin del primer MAPK, o antes.
mm Resumen
Las inmunoglobulinas y los receptores de clulas
T son protenas con funciones anlogas en la par-
ticipacin de las clulas B y T en el sistema inmu-
nitario. Una Ig o una protena TCR se genera por
rearreglo del DNA en un solo linfocito; la exposicin
a un antgeno reconocido por Ig o por TCR lleva a
la expansin clonal para generar muchas clulas
con la misma especificidad que la original. Muchos
rearreglos ocurren en etapas tempranas del desa-
rrollo del sistema inmunitario, de modo que se crea
un gran repertorio de clulas de diferentes especi-
ficidades.
Cada protena inmunoglobulina es un tetrn.:-
ro que contiene dos cadenas ligeras idnticas y c
cadenas pesadas idnticas. Un TCR es un dmero
que contiene dos cadenas diferentes. Cada cadena
polipeptdica se expresa por un gen creado por
lace de uno de muchos segmentos V a travs .:.
segmentos D y J con uno de unos cuantos segmen-
tos C. Las cadenas Ig L (k o A,) tienen la estrucr. -
ra general de V-J-C; las Ig H tienen una estructr.:;
V-D-J-C
, en tanto que TCR a y y tienen comp -
nentes del tipo de las cadenas Ig L; TCR 8 y [3 s
similares a las cadenas H de Ig.
Cada tipo de cadena es codificado por un grac
grupo de genes V separados del grupo de segmen:
D
, J y C. Los nmeros de cada tipo de segmento y 5
organizacin son diferentes para cada tipo de cacr-
na, pero el principio y el mecanismo de la recombi-
nacin parecen ser iguales. Las mismas secuencia?
de consenso de nonmero y heptmero particip?:"
en cada recombinacin; la reaccin siempre im-
plica unin de un consenso con espaciamiento de
23 bp y un consenso con espaciamiento de 12 b
La reaccin de escisin es catalizada por las prote-
nas RAGI y RAG2, en tanto que la de unin lo 9
por la misma va NHEJ que repara las roturas ct
doble cadena en las clulas. El mecanismo de ac-
cin de las protenas RAG tiene relacin con \i
accin de recombinacin especfica de sitio cataliza-
da por las resolvasas.
Por la unin de diferentes segmentos V, D, I
J a un segmento C se genera una gran diversidad-
sin embargo, durante el proceso de recombinacion
se introducen variaciones adicionales en forma de
cambios en las uniones en tres segmentos, as como
tambin se inducen cambios en los genes de inmu-
noglobulina por mutacin somtica, que requiere
las acciones de la desaminasa de citidina y la glu-
cosilasa de uracilo. Las mutaciones inducidas por
la desaminasa de citidina posiblemente lleven a \.
eliminacin del uracilo por la glucosilasa de uracilo.
seguida de la induccin de mutaciones en los sitios
donde hay ausencia de bases.
La exclusin allica asegura que un linfocito
determinado sintetice slo una Ig o un TCR. Ur.
rearreglo productivo inhibe la aparicin de rearre-
glos adicionales. El uso de la regin V depende del
primer rearreglo productivo, pero las clulas B de-
jan de usar los genes CH de la cadena p inicial por
una de las cadenas H codificadas ms adelante en
direccin descendente. Ese proceso implica un tipo
diferente de recombinacin en el que las secuencia?
entre la regin VDJ y el nuevo gen C
H
presentan
delecin. El uso del gen C
H
da lugar a ms de un
cambio. El cambio de clase exige la misma desami-
nasa de citidina que se necesita para la mutacin so-
604 CAPTULO 23 Diversidad Inmunitaria
mtica, pero se desconoce su funcin. En una etapa
previa de la produccin de Ig, se pasa de la sntesis
de una versin unida a membrana de la protena a
una versin de secrecin. Esos cambios se logran
por escisin alterna del producto de transcripcin.
La inmunidad innata es una respuesta desen-
cadenada por receptores cuya especificidad est
predeterminada para ciertos segmentos comunes
en bacterias y otros agentes infecciosos. El receptor
que desencadena la va es por lo general miembro
de la clase de peaje y la va simula la desencadenada
por esos receptores durante el desarrollo embriona-
rio. La va culmina con la activacin de factores de
transcripcin que dan lugar a la expresin de genes
cuyos productos desactivan al agente infeccioso, en
general por permeabilizacin de su membrana.
La recombinacin inmunitaria utiliza dos tipos de
secuencias de consenso
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C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4
gene. Science 282, 2085-2088.
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complex antibacterial gene regulation in Drosophila
host defense. EMBO J. 16, 6120-6130.
608 CAPTULO 23 Diversidad inmunitaria
Promotores y potenciadores
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
Las poh'merasas de RNA eucariticas constan de
muchas subunidades
.
La polimerasa de RNA I sintetiza RNAm en el nuclolo.
.
La polimerasa de RNA II sintetiza RNAm en el nucleoplasma.
.
La polimerasa de RNA III sintetiza RNA pequeos en el
nucleoplasma.
.
Todas las polimerasas de RNA eucariticas tienen -12
subunidades y son agregados de >500 kD.
.
Algunas subunidades son comunes a los tres tipos de
polimerasas de RNA.
.
La subunidad ms grande de la polimerasa de RNA II
tiene un dominio carboxilo terminal (CTD) constituido por
mltiples repeticiones de un heptmero.
Los elementos promotores se definen por
mutaciones y vestigios
.
Los promotores se definen por su capacidad para provocar
la transcripcin de una secuencia agregada a un sistema de
prueba apropiado in vitro o in vivo.
La polimerasa de RNA I tiene un promotor
bipartido
.
El promotor de la polimerasa de RNA I consta de un
promotor medular y un elemento de control en flujo
ascendente (UPE).
.
El factor UBF1 envuelve al DNA con una estructura
protenica para acercar el centro y el UPE.
.
El SL1 incluye el factor TBP que participa en el inicio por
las tres polimerasas.
.
La polimerasa de RNA se une al complejo UBF1-SL1 en e[
promotor medular.
La polimerasa de RNA III utiliza promotores
en flujo ascendente y descendente
La pohmerasa de RNA III tiene dos tipos de promotores.
Los promotores internos tienen secuencias de consenso
cortas dentro de la unidad de transcripcin y producen
inicio a una distanda fija de flujo ascendente.
.
Los promotores de flujo ascendente contienen tres secuen-
cias de consenso cortas en flujo ascendente respecto del
punto de inicio, donde se unen los factores de transcripcin.
El TF
m
B es el factor de encargo para
los promotores de la Pol III
.
El TF
,,
y TFjjjC se unen a la secuencias de consenso y
permiten al TF,, unirse en los puntos de inicio.
El TF
ln
B tiene a TBP como una de sus subunidades y
permite la unin de la polimerasa de RNA.
El punto de inicio de la polimerasa de RNA II
La polimerasa de RNA II requiere de factores generales de
transcripcin (llamados TF X) para iniciar la transcripcin.
.
Los promotores de la polimerasa de RNA II tienen una
secuencia corta conservada Py
j
CAPy
j
(el InR de Inicio) en
el punto de inicio.
La caja TATA es un componente comn de los promotores
de la polimerasa de RNA II y est constituido por un
octmero rico en A-T localizado ~25 bp en flujo ascendente
respecto del punto de inicio.
.
El DPE es un componente comn de los promotores de la
polimerasa de RNA 11 que no tiene caja TATA.
Un promotor medular de la polimerasa de RNA II incluye el
InR y la caja TATA o un DPE.
La TBP es un factor universal
.
La TBP constituye un componente del factor de
posicionamiento necesaria para que cada tipo de
polimerasa de RNA se una a su promotor.
El factor para la polimerasa de RNA II es T D, que consta
de TBP y 11 TAF, con una masa total de -800 kD.
La TBP se une al DNA de forma inusual
.
El TBP se une a ta caja TATA en el surco menor del DNA
.
Forma una silla de montar en torno al DNA y lo dobla ~80.
Algunos de los TAF simulan histonas y podran formar una
estructura parecida a un octmero de histona.
EL aparato basal se ensambla en el promotor
.
La unin de Jf
u
D a la caja TATA es el primer paso del inicio.
Otros factores de transcripcin se unen al complejo en un
orden definido, aumentando, as, la longitud de la regin
protegida en el DNA.
.
Cuando la polimerasa de RNA II se une al complejo,
empieza la transcripcin.
El inicio va seguido de la depuracin
del promotor
.
Para disolver el DNA y permitir el traslado de la polimerasa,
se necesitan TF
nE y T H.
"
La fosforilacin del CTD podra ser necesaria para que se
inicie la elongacin.
.
Para terminar un inicio abortivo, se requiere de
fosforilacin adicional del CTD en algunos promotores.
.
El CTD puede coordinar el procesamiento del RNA con la
transcripcin.
Contina en la siguiente pgina
609
Una conexin entre transcripcin y reparacin
.
tos genes transcritos se reparan de manera preferencia!
cuando se daa el DNA.
.
El TF
n
H proporciona ligamiento para un complejo de
enzimas de reparacin.
.
Las mutaciones del componente XPD de TF
n
H causan
tres tipos de enfermedades humanas.
Los elementos de secuencia corta se unen a
activadores
.
Los elementos de secuencia corta conservados se
dispersan en la regin que precede al punto de inicio.
.
Los elementos en flujo ascendente aumentan la
frecuencia del inicio.
.
Los factores que se unen a ellos para estimular la
transcripcin se llaman activadores.
La estructura deL promotor es flexible, pero el
contexto puede ser importante
.
Ningn elemento individual de flujo ascendente es
indispensable para la funcin del promotor, si bien
uno o ms deben estar presentes para que el inicio sea
eficaz.
.
Algunos elementos son reconocidos por muchos
factores, y un factor utilizado en un promotor en
particular puede ser determinado por el contexto de
los otros factores unidos.
Los potenciadores contienen elementos
bidireccionales que facilitan el inicio
.
Un potenciador activa al promotor ms cercano, es
decir, a cualquier distancia en flujo ascendente o
descendente respecto del promotor.
.
Un UAS (secuencia de activador ascendente) de
las levaduras se comporta como potenciador, pero
funciona slo en flujo ascendente respecto del
promotor.
.
En potenciadores y promotores se encuentran
elementos de secuencia similares.
.
Los potenciadores forman complejos de activadores
que actan directa o indirectamente con el promotor.
Los potenciadores contienen los mismos
elementos encontrados en los promotores
.
Los potenciadores estn hechos del mismo tipo
elementos de secuencia que se encuentran en 1c;
promotores.
.
La densidad de los componentes de secuencia es -
en el potenciador que en el promotor.
Los potenciadores actan aumentando la
concentracin de los activadores cerca de.
promotor
.
Los potenciadores suelen funcionar slo en
configuracin ds con un promotor diana.
.
Es posible hacer que los potenciadores funcione- i
configuracin trans por ligamiento del DNA conter
en el promotor diana con DNA contenido en el
potenciador mediante un puente protenico o pe-
concatenacin de las dos molculas.
.
El principio es que un potenciador funciona en
cualquier situacin en que est constreido a la -
proximidad que el promotor.
La expresin gentica se vincula con la
desmetilacin
.
La desmetilacin en el extremo 5' del gen es nec;
para su transcripcin.
Los islotes CpG son dianas reguladoras
.
Los islotes CpG rodean a los promotores de genes
expresin constitutiva donde no estn metilados.
.
Los islotes CpG tambin se encuentran en los
promotores de algunos genes regulados por tejic:;
.
Hay ~29 000 islotes CpG en el genoma humano.
.
La metilacin de un islote CpG impide la activar:
un promotor en su interior.
.
La unin de protenas a pares de CpG metilados "i
en represin.
Resumen
1711 Introduccin
Para que empiece la transcripcin se necesita la en-
zima polimerasa de RNA y factores de transcrip-
cin. Cualquier protena necesaria para el inicio de
la transcripcin pero que, en s, no es parte de la
polimerasa de RNA, se define como factor de trans-
cripcin, muchos de los cuales actan reconociendo
sitios de accin ds en el DNA. La unin al DNA, sin
embargo, no es su nico medio de accin. Un factor
puede reconocer a otro, a la polimerasa de RNA o,
tal vez, incorporarse a un complejo de inicio slo en
presencia de varias otras protenas. La prueba final
para la participacin del aparato de transcripcin
es funcional, debe requerirse de una protena para
que la transcripcin tenga lugar en un promotor o
conjunto de promotores especfico.
Una diferencia significativa en la transcripcin
del RNAm eucariticc y el procaritico es que el
inicio en un promotor eucaritico implica a gran
nmero de factores que se unen con diversos -
montos que actan en configuracin cis. El pre-
tor se define como la regin que contiene todos
sitios de unin, esto es, todos los sitios de unin ;.
pueden sostener la transcripcin con la eficacia r
mal y el control apropiado. As, la principal cara r :
rstica de un promotor de un RNAm eucaritic
la localizacin de los sitios de unin para los fac:: -
de transcripcin. La misma polimerasa de RNA
une cerca del punto de inicio, pero no hace con:; -
directo con la regin extendida de flujo ascender
del promotor. Por el contrario, los promotores: :
terianos descritos en el Captulo 11, Transcripc -
se definen, en gran medida, segn el sitio de uvca
de la polimerasa de RNA en la vecindad inmedia
del punto de inicio.
La transcripcin en clulas eucariticas sedfl
de en tres clases, cada una transcrita por unapoi
merasa de RNA diferente:
610 CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
.
La polimerasa de RNA I transcribe RNAr.
.
La polimerasa de RNA n transcribe RNAm.
.
La polimerasa de RNA III transcribe RNAt y
otros RNA pequeos.
Para el inicio se necesitan factores de transcrip-
cin, pero no despus. En el caso de las tres enzimas
eucariticas, los factores, ms que las polimerasas de
RNA mismas, son los principales encargados de re-
conocer al promotor, lo cual difiere de la polimerasa
de RNA bacteriana, en cuyo caso, es la enzima la
que reconoce las secuencias promotoras. Para to-
das las polimerasas de RNA eucariticas, los facto-
res crean una estructura en el promotor de modo
de proporcionar la diana que reconoce la enzima,
Para las polimerasas de RNA I y III, esos factores
son relativamente sencillos, pero para la polimerasa
II, forman un grupo de dimensiones considerables
conocido colectivamente como basal, o en general,
como factores. Los factores bsales se unen con la
polimerasa de RNA 11 para formar un complejo que
rodea el punto de inicio y determinan su sitio; por
otra parte, junto con la polimerasa de RNA consti-
tuyen el aparato de transcripcin basal.
Los promotores de las polimerasas de RNA I y
se encuentran (principalmente) en flujo ascendente
respecto del punto de inicio, pero algunos de la de
RNA III estn en flujo descendente. Cada promotor
incluye conjuntos caractersticos de secuencias cortas
conservadas reconocidas por la clase apropiada de
factores. Las polimerasas de RNA I y III reconocen
cada una un conjunto relativamente restringido de
promotores y dependen de un pequeo nmero
de factores accesorios.
Los promotores utilizados por la polimerasa de
RNA II muestran ms variacin en secuencias y su
organizacin es modular. Los elementos de secuen-
cia corta reconocidos por factores de transcripcin
se encuentran en flujo ascendente respecto del pun-
to de inicio. Esos sitios de accin con configuracin
cis suelen estar dispersos en una regin >200 bp.
Algunos de esos elementos y los factores que los
reconocen son comunes; se encuentran en una va-
riedad de promotores y se usan de manera consecu-
tiva, mientras que otros son especficos, identifican
ciertas clases de genes y su uso es regulado. Los
elementos se presentan en diferentes combinacio-
nes en cada promotor.
Todos los promotores de la polimerasa de RNA
Q tienen elementos de secuencia cerca del punto
de inicio, los cuales se unen al aparato basal y esta-
blecen dicho sitio. Las secuencias ms alejadas en
lujo ascendente determinan si el promotor se ex-
presa en todos los tipos de clulas o es regulado de
manera especfica. Los promotores que se expresan
de manera constitutiva (sus genes a veces se llaman
genes domsticos) tienen elementos de secuencia de
flujo ascendente reconocidos por activadores ubi-
cuos. Ninguna combinacin de elemento/factor es
un componente indispensable del promotor, lo cual
sugiere que el inicio de la polimerasa de RNA puede
ser promovido de muchas formas. Los promotores
que se expresan slo en ciertos momentos o luga-
res tienen elementos de secuencia que requieren
de activadores disponibles slo en esos momentos
o lugares.
Los componentes de secuencia del promotor
se definen de manera operacional por la demanda
de que deben estar ubicados en las cercanas del
punto de inicio y de que se necesitan para ste. El
potenciador es otro tipo de sitio involucrado en
el inicio, el cual se identifica por secuencias que
estimulan el inicio, pero que se localizan a conside-
rable distancia del punto de inicio. Los elementos
potenciadores suelen ser dianas de la regulacin
temporal especfica de tejido. En la FIGURA 24.1 se
muestran las propiedades generales de promotores
y potenciadores.
Los componentes de un potenciador se parecen
a los del promotor, ya que constan de diversos ele-
mentos modulares, sin embargo, estn muy apreta-
dos y actan como los del promotor. El potenciador
no necesita estar cerca del punto de inicio.
Las protenas unidas a elementos del potencia-
dor interactan con protenas unidas a elementos
del promotor. La diferencia entre promotores y po-
tenciadores es operativa, ms que implicar una dife-
rencia fundamental en el mecanismo. Esta perspec-
tiva es reforzada por el hecho de que algunos tipos
de elementos se encuentran tanto en promotores
como en potenciadores.
La transcripcin eucaritica muy a menudo est
bajo regulacin positiva. Con control especfico del
tejido se proporciona un factor de transcripcin que
activa a un promotor o a un conjunto de promoto-
res que contienen una secuencia diana comn; la
regulacin o represin especfica de un promotor
diana es menos frecuente.
En general, una unidad de transcripcin euca-
ritica contiene un solo gen, y la terminacin tiene
lugar una vez concluida la regin de codificacin.
La terminacin carece de la importancia reguladora
necesaria para sistemas procariticos. Las polimera-
sas de RNA I y III terminan en secuencias y reaccio-
nes definidas, pero no est clara la forma de termi-
nacin de la polimerasa de RNA II. No obstante, el
suceso significativo en la generacin del extremo 3
'
de un RNAm no es propiamente un suceso de ter-
minacin, resulta de una reaccin de escisin en el
producto primario de transcripcin (vase Captulo
26, Escisin, empalme y procesamiento del RNA).
Introduccin 611
La transcripcin es controlada por un promotor y un potenciador
Potenciador
I
-
*
-~
100 bp-*-
Contiene varios
elementos de
secuencia, muy
juntos, que se
unen a factores
de transcripcin
Promotor
Gen
La separacin
entre potenciador
y promotor puede
ser de varias kb
-
200 bp en flujo ascendente
respecto del punto de inicio
Contiene elementos de secuencia dispersos
que unen factores de transcripcin
Slo la localizacin de los elementos muy
cercanos (<50 bp) al punto de inicio de la
transcripcin es fija
FIGURA 24.1 Un gen comn transcrito por La polimerasa de RNA II tiene un promotor que, en
flujo ascendente, parte del sitio donde se inicia la transcripcin, el cual contiene varios elemen-
tos de secuencia cortos (<10 bp) que se unen a factores de transcripcin dispersos en >200 bp.
Un potenciador con un arreglo ms estrechamente empaquetado de elementos que tambin se
unen a los factores de transcripcin puede localizarse a varios kb de distancia. (El DNA puede
ser ensortijado o estar reestructurado desde otro punto de vista, de manera que los factores de
transcripcin de uno y otro interacten para constituir un gran complejo protenico.)
Las polimerasas de RNA
eucariticas constan
de muchas subunidades
Conceptos principales
.
La polimerasa de RNA I sintetiza RNAm en el nuclolo.
La polimerasa de RNA II sintetiza RNAm en el
nucleoplasma.
.
La polimerasa de RNA III sintetiza RNA pequeos en el
nucleoplasma.
.
Todas las polimerasas de RNA eucariticas tienen ~12
subunidades y son agregados de >500 kD.
.
Algunas subunidades son comunes a los tres tipos de
polimerasas de RNA.
.
La subunidad ms grande de la polimerasa de RNA II
tiene un dominio carboxilo terminal (CTD) constituido
por mltiples repeticiones de un heptmero.
Las tres polimerasas de RNA eucariticas se ubican
de manera diferente en el ncleo, en fundn de los
genes que transcriben,
La actividad preponderante es la de la enzima
polimerasa de RNA I, que reside en el nuclolo y se
encarga de la transcripcin de genes que codifican
RNAr; contribuye en la mayor parte de las sntesis
de RNA celular (en cuanto a cantidad).
La otra enzima primordial es la polimerasa de
RNA II, localizada en el nucleoplasma (la parte del
ncleo que no es el nuclolo). Representa prctica-
mente toda la actividad celular restante y se encarga
de sintetizar el RNA nuclear heterogneo (RNAhn),
precursor del RNA.
La polimerasa de RNA III es una actividad I
mtica menor. Esta enzima nucleoplsmica sinte
RNAt y otros RNA pequeos.
Todas las polimerasas de RNA eucariticas
protenas grandes que aparecen como agreg;
>500 kD y por lo general tienen -12 subunida,
La enzima codificada puede llevar a cabo la 9
cripcin dependiente de un molde del RNA, p
no iniciarla selectivamente en los promotores.
constitucin general de una enzima polimerasa
RNA II eucaritica, como se tipifica en Sacchasoa:
cerevisiae, se ilustra en la 24.2. Las dos sub
dades ms grandes son homologas de las subun
des [3 y (3' de la polimerasa de RNA bacteriana;
de la subunidades restantes son comunes a toda
polimerasas de RNA, esto es, son tambin cor:
nemes de la I y la III.
La subunidad ms grande de la polimeras
RNA II tiene un dominio carboxilo termi
(CTD) constituido por mltiples repeticioaej
una secuencia de consenso de siete aminock
que es exclusiva de dicha polimerasa. Hay -m
peticiones en levaduras y casi 50 en mamferos
nmero de repeticiones es importante porque
deleciones que suelen eliminar ms de la mitai
las repeticiones, son mortales (en levaduras). El (
puede estar altamente fosforilado en molcula
serina o treonina, fenmeno que forma parte I
reaccin de inicio (vase la seccin 24.11, El a
va seguido de la eliminacin del promotor).
Las polimerasas de RNA de mitocondrias y
roplastos son ms pequeas y simulan la polime
de RNA bacteriana, ms que alguna de las enz;
nucleares. Por supuesto, los genomas de los orga
los son mucho ms pequeos, la polimerasa resic
612
CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
La polimerasa de RNA tiene >10 subunidades
kD
200
'
100
50
25
Relacionada con la subunldad P'
bacteriana
Une DNA
Tiene CTD = (YSPTSPS)n
[levadura, n = 26; ratn, n = 52]
s R
elacionada con la subunidad (3
bacteriana
Une nucletidos
-Relacionada con la subunidad a
bacteriana
-
Comn a las tres polimerasas
-
Comn a las tres polimerasas
-
Comn a las tres polimerasas
FIGURA 2 . Algunas subunidades son comunes a todas las
clases de polimerasas de RNA eucariticas y otras se relacionan
con la polimerasa de RNA bacteriana.
te necesita transcribir relativamente pocos genes y el
control de la transcripcin posiblemente sea mucho
ms sencillo (si es que existe). As, esas enzimas son
anlogas de las de fagos, que no necesitan la capaci-
dad para responder a un ambiente ms complejo.
Una distincin prctica importante entre las
enzimas eucariticas depende de su respuesta al
octapptido dicclico a amanitina. Bsicamente en
todas las clulas eucariticas, la actividad de la po-
limerasa de RNA es inhibida rpidamente por las
bajas concentraciones de amanitina alfa, pero la
polimerasa de RNA I no se inhibe. La respuesta de
la polimerasa de RNA III a la amanitina alfa est
menos bien conservada y en clulas animales es
inhibida por altas concentraciones, si bien en leva-
duras e insectos no se inhibe.
|2| Los elementos promotores
se definen por mutaciones
y vestigios
Concepto principal
Los promotores se definen por su capacidad para
provocar la transcripcin de una secuencia agregada a
un sistema de prueba apropiado, in vitro o in vivo.
El primer paso de la caracterizacin de un promotor
es definir la longitud global del DNA que contiene
:odos los elementos de secuencia necesarios. Para
ello, se necesita un sistema de prueba en el que
tn promotor se encargue de la generacin de un
producto fcilmente analizable. Tradicionalmente
-
;
e han aplicado varios sistemas:
.
En el sistema del oocito se inyecta un mol-
de de DNA en el ncleo de un oocito de
Xenopus laevis. El producto de transcripcin
del RNA puede recuperarse y analizarse. La
principal limitacin de este sistema es que se
restringe a las condiciones que prevalecen
en el oocito. Permite la caracterizacin de
secuencias de DNA, pero no de los factores
que normalmente se unen ellas.
.
Los sistemas de transfeccin permiten introdu-
cir DNA exgeno a una clula cultivada y
expresada. El sistema es genuinamente in
vivo, en el sentido de que la transcripcin
la lleva a cabo el mismo aparato encargado
de expresar el genoma propio de la clula.
Sin embargo, difiere de la situacin natural
porque el molde est constituido por un gen
que normalmente no sera transcrito en la
clula hospedadora. La utilidad del sistema
puede ampliarse utilizando diversas clulas
hospedadoras,
.
Los sistemas transgenicos implican agregar un
gen a la lnea germinativa de un animal. La
expresin de un trajisgn puede ser seguida
en uno o todos los tejidos del animal. Algunas
limitaciones comunes son aplicables a los sis-
temas transgnicos y a la transfeccin, pues el
gen adicional a menudo est presente en ml-
tiples copias y se integra en una localizacin
diferente del gen endgeno. Las discrepancias
en la expresin de un gen in vitro y su ex-
presin como transgn pueden proporcionar
informacin importante acerca de la partici-
pacin del contexto genmico del gen.
.
El sistema in vitro adopta el abordaje clsico
de purificar todos los componentes y mani-
pular las condiciones hasta que se observa
un inicio confiable. Por inicio
"
confiable
"
se entiende la produccin de un RNA que
inicie en el sitio correspondiente del extre-
mo 5
'
del RNAm (o los precursores RNAr o
RNAt), lo cual, en ltima instancia, permite
caracterizar los elementos de la secuencia
individual en el promotor y los factores de
transcripcin que se le unen.
Cuando se analiza un promotor, es impor-
tante que slo la secuencia del promotor cambie.
En la FIGURA 24.3 se muestra que siempre se coloque
la misma secuencia larga, ascendente, cerca del pro-
motor para asegurar que se encuentre siempre en el
mismo contexto. La terminacin no ocurre propia-
mente en sistemas in vitro, de modo que el molde se
corta a cierta distancia del promotor (por lo gene-
ral -500 bp en flujo descendente), lo cual garantiza
que todas las polimerasas
"
se viertan
"
en el mismo
punto, generando, as, un producto de transcripcin
identificable.
24.3 Los elementos promotores se definen por mutaciones y vestigios 613
n ambiente constante
La secuencia de flujo
ascendente es siempre
la misma
Slo el promotor
de prueba difiere
La longitud del
producto de
transcripcin es
definida
i
FIGURA 24.3 Un promotor se pone a prueba modificando la secuencia
que se conecta con una secuencia de flujo ascendente constante y a una
unidad de transcripcin constante de flujo descendente.
I.MI.MI-MM.I
Flujo ascendente Promotor Transcrito
Delecin y reconexin
Transcripcin
An se produce RNA:
Lai tfa'Eicin no entra al promotor
X
Delecin y reoonexin
Ya no se produce RNA: la delecin
ha entrado al promotor
El lmite de flujo ascendente del promotor yace
entre los extremos de las deleciones
FIGURA 24. - Los lmites del promotor se determinan mediante
deleciones que eliminan progresivamente ms material de un
lado. Cuando una delecin no puede impedir la sntesis de
RNA, pero la siguiente detiene la transcripcin, el lmite del
promotor debe estar entre ambas.
Se empieza con un fragmento especfico de
DNA con el que puede dar principio la transcripcin
en uno de estos sistemas, de manera que los lmites
de la secuencia que constituye al promotor pueden
determinarse restando la longitud del fragmento de
cada extremo hasta que cese su actividad en algn
punto, como se ilustra en la FIGURA 24.4. El lrr,
ascendente se puede identificar eliminando progr
sivamente el material de dicho extremo hasta que
pierda la funcin del promotor. Para probar el ln:
descendente, es necesario reconectar el promcrt
acortado a la secuencia por transcribir, ya que t
otra manera no habra producto qu analizar.
Una vez que los lmites del promotor se h
definido, es posible determinar la importancia
las bases especficas que tiene en su interior in::
duciendo mutaciones puntuales u otras reestr.
turaciones en la secuencia. Como en el caso d-
polimerasa de RNA bacteriana, stas pueden car;
terizarse como mutaciones ascendentes o descender.'-
Algunas de esas reestructuraciones afectan slol
velocidad de inicio, en tanto que otras inciden en
sitio donde ocurre, como se observa en un camh
de punto de inicio. En todo caso, para asegurarse
que se trata de productos comparables, es necess -
caracterizar el extremo 5
'
del RNA.
Para identificar los componentes de secue:::
de un promotor (o cualquier otro sitio del DNA
pueden aplicar varios criterios:
.
Las mutaciones en el sitio impiden las fu
clones in vitro o in vivo. (Hoy se cuenta ;
muchas tcnicas para introducir mutacioQ
puntuales en pares de bases particularef
en principio, es posible mutar todas las pe*
clones de un promotor y estudiar la seaid
ca con mutacin in vitro o in vivo.)
.
Las protenas que actan por unin cor _
sitio pueden ser identificadas en l; deber
haber una correlacin entre la capac;:,
de las mutaciones para evitar la fund;:
promotor y la unin del factor.
.
Cuando un sitio reconocido por un faetc:
particular se encuentra en varios promo:
res, debera ser posible derivar una secu -
ela de consenso que se una al factor. \
nuevo promotor tendr que encargarse
ese factor cuando se introduzca una c,::
apropiada del elemento.
m\ La poLimerasa de RNA I
tiene un promotor bipartido
Conceptos principales
El promotor de la polimerasa de RNA I consta de un
promotor medular y un elemento de control en fluj
ascendente (UPE).
El factor UBF1 envuelve al DNA con una estructura
protenica para acercar el centro y el UPE.
El SL1 incluye el factor TBP que participa en el inic:
por las tres polimerasas.
La polimerasa de RNA se une al complejo UBFl-SLl i-
el promotor medular.
614
CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
La polimerasa de RNA I transcribe a partir de un
slo tipo de promotor los genes del RNA ribosmico.
El producto de transcripcin incluye secuencias de
RNAr grandes y pequeos que despus se liberan
por escisin y procesamiento. Hay muchas copias
de la unidad de transcripcin, las cuales alternan
con espaciadores no transcritos y se organizan en
un conjunto, segn se describi en la seccin 6.8,
Los genes de RNAr forman repeticiones en serie. La
)rganizacin del promotor y los sucesos implicados
en el inicio se incluyen en la FIGURA 24.5.
El promotor consta de dos regiones separadas.
El promotor medular rodea al punto de inicio con
una extensin de -45 a +20, suficiente para que
se inicie la transcripcin. En general, es rico en G-
C (algo desusado para un promotor), excepto por
el nico elemento conservado de la secuencia, una
secuencia corta, rica en A-T, que rodea el punto
de inicio, llamada Inr. Sin embargo, la eficacia del
promotor medular aumenta mucho por la partici-
pacin del elemento promotor ascendente (UPE),
otra secuencia rica en G-C y relacionada con la del
promotor medular que abarca de -180 a -107. Este
:
ipo de organizacin es comn a los promotores Pol
I de muchas especies, si bien las secuencias en s
varan ampliamente.
La polimerasa de RNA I requiere de dos factores
auxiliares; el que se une al promotor medular consta
de cuatro protenas. (Se denomina SL1, TIF-IB, y
Ribl, en diferentes especies). Uno de sus componen-
tes, la protena unidora de TATA (TBP), es un factor
que tambin necesitan para el inicio las polimerasas
de RNA II y III (vase la seccin 24.8, La TBP es un
factor universal.) La TBP no se une directamente con
el DNA rico en G-C y la unin de DNA es responsa-
bilidad de los otros componentes del factor de unin
medular. Es posible que la TBP interacte con la
polimerasa de RNA, tal vez mediante una subunidad
comn o una caracterstica que se ha conservado
entre las polimerasas. El factor de unin medular
permite a la polimerasa de RNA I iniciar a partir del
promotor con una frecuencia basal baja.
El factor de unin medular tiene como respon-
febilidad prioritaria garantizar que la polimerasa de
RNA est adecuadamente localizada en el punto de
inicio. En pocas palabras, las polimerasas RNA U y IH
desempean una funcin similar mediante un factor
que consta de TBP relacionada con otras protenas.
As pues, una caracterstica comn del inicio por las
tres polimerasas es confiar en un factor de "posi-
cionamiento" constituido por TBP relacionado con
protenas especficas de cada tipo de promotor.
Para el inicio de alta frecuencia, se requiere del
iactor UBF
, polipptido sencillo que se une a un ele-
mento del UPE rico en G-C. Un indicio de la forma
en que el UBF interacta con el factor de unin me-
Los promotores de pol I tienen dos componentes de secuencia
Rico en G-C Rico en A-T
Inr
Punto de nK:io
ciemento promotor de fiujo ascendente Promotor meduiar
-170 -160 -!50 -140 -130 -120 -110 -40 -30 -20 -10
El UBF se une al elemento promotor de flujo ascendente
+10 +20
La holoenzima polimerasa de RNA I incluye un factor de unin central
(SL1) que se une ai promotor meduiar
TBP
FIGURA 24,5 Las unidades de transcripcin de la polimerasa de
RNA I tienen un promotor medular separado por ~70 bp del elemen-
to promotor de flujo ascendente. La unin de UBF a UPE aumenta
La capacidad del factor central de unin de aunarse al promotor
medular. El factor de unin central (SL1) ubica a la polimerasa de
RNA I en el punto de inicio.
dular es la importancia del espaciamiento entre el
UPE y el promotor medular, lo cual puede cambiarse
por distancias que implican nmeros enteros de gi-
ros de DNA, pero no por distancias que introduzcan
medios giros. El UBF se une con la hendidura menor
del DNA y lo envuelve en un asa de casi 360, de
modo que pone al ncleo muy cerca del UPE,
En la Figura 24.5 se observa el inicio como una
serie de interacciones en secuencia, pero la polime-
rasa de RNA I existe como una holoenzima que con-
tiene la mayor parte de los factores necesarios para
el inicio, si no es que todos, y que probablemente
es reclutada directamente al promotor.
iag La polimerasa de RNA III
utiliza promotores en flujo
ascendente y descendente
Conceptos principales
.
La polimerasa de RNA III tiene dos tipos de promotores.
.
Los promotores internos tienen secuencias de consenso
cortas dentro de la unidad de transcripcin y producen
inicio a una distancia fija de flujo ascendente.
.
Los promotores de flujo ascendente contienen tres
secuencias de consenso cortas en flujo ascendente
respecto del punto de inicio, donde se unen los
factores de transcripcin.
El reconocimiento de los promotores por la polime-
rasa de RNA III ilustra de manera sorprendente la
participacin relativa de los factores de transcripcin
24.5 La polimerasa de RNA III utiliza promotores en flujo ascendente y descendente
615
y la enzima polimerasa. Los promotores se clasifican
en dos clases generales, reconocidas en diferentes
formas por diversos grupos de factores. Los promo-
tores de los genes 5S y de RNAt son internos y se en-
cuentran en flujo descendente respecto del punto de
inicio. Los promotores de los genes del RNAsn (RNA
nuclear pequeo) yacen en flujo ascendente respec-
to del punto de inicio, a la manera ms convencional
de otros promotores. En ambos casos, cada elemento
es necesario para las fundones del promotor que
corresponden exclusivamente a secuencias recono-
cidas por factores de transcripcin que,
a su vez, di-
rigen la unin de la polimerasa de RNA
Antes de que se identificara al promotor de los
genes del RNA 5S en X laevis, en todos los intentos
por identificar secuencias de promotores se supo-
na que podran encontrarse en flujo ascendente
respecto del punto de inicio. El anlisis de delecin,
sin embargo, mostr que el producto RNA 5S sigue
Los promotores pol III pueden estar en flujo
descendente respecto del punto de Inicio
Punto de inicio Promotor
Flujo
ascendente Regin transcrita
RNA
\ La delecin que elimina secuencias en flujo ascendente
respecto del promotor permite que la transcripcin
empiece en la posicin correspondiente al punto de
:
inicio usual
RNA
FIGURA 24. EL anlisis de delecin muestra que el promotor
de los genes de RNA 5S es interno; el inicio ocurre a una distan-
cia fija (~55 bp) en flujo ascendente respecto del promotor.
Punto de inicio
Caja A Caja C
Caja A Caja B
Oct PSE TATA
Los promotores de la polimerasa de RNA III po-
dran consistir en secuencias bipartidas en flujo descendente
respecto del punto de inicio, con la caja A separada de las cajas
C o B, o estar constituidos por secuencias separadas en flujo
ascendente respecto del punto de inicio (Oct, PSE, TATA).
sintetizndose cuando se elimina toda la secue :
del gen en flujo ascendente!
Cuando las deleciones continan en el gen
gue sintetizndose un producto muy similar er.
mao al RNA 5S usual, mientras la delecin tenr -
antes de la base +55. En la se mu;
que la primera parte del producto RNA correspc :
a un plsmido de DNA, la segunda represen::
segmento restante de la secuencia usual de RNA 5
Sin embargo, cuando la delecin rebasa la posi r
+ 55, no hay transcripcin, de modo que el prc /
tor yace en flujo descendente respecto de dicha pos::- -
pero hace que la polimerasa de RNA III inic;
transcripcin a una distancia ms o menos fiir
flujo ascendente.
Cuando la delecin parte del extremo dista! e
gen, la transcripcin no se afecta si los primerc:
bp quedan intactos, pues una vez que la dele ~
hace un corte en esa regin, la transcripcin :r
de modo que la posicin lmite en flujo descendc =
del promotor es casi +80.
As pues, el promotor de la transcripcin del ?
55 yace entre las posiciones +55 y +80, dentro de.
Un fragmento que contenga esa regin puede : t
paldar el inicio de cualquier DNA donde quiera :
se coloque, desde un punto de inicio a -55 b;
distancia en flujo ascendente (el punto de inicie
vestre es nico; en deleciones que no lo tiene::
transcripcin se inicia en la base purnica ms ct r;
na a la posicin 55 bp en flujo ascendente res- : :
del promotor).
En la F 7 se resumen las estrucT
.
.:;
de los tres tipos de promotores de la polmeras;
RNA. Hay dos tipos de promotor interno,
cada _
de los cuales contiene una estructura bipartida er-
que dos elementos de secuencia corta estn se : : -
dos por una secuencia variable. El tipo 1 cons::
una secuencia de caja A separada de una secuer
de caja C, y el 2, de una secuencia de caja A se: ;:
da de una secuencia de caja B. La distancia en-
caja A y la caja B en un promotor de tipo 2 p: ;
variar ampliamente, pero, en general, dichas ;:
no pueden acercarse mucho sin abolir su fur;:
Un grupo comn de promotores de tipo 3 tiene -
elementos de secuencia en flujo ascendente rest 6
del punto de inicio.
Efl EL TFjjjB es eL factor de encare:
para Los promotores de La Pol
Conceptos principales
El TF
IU
A y TF
C se unen a la secuencias de consen;:
permiten al T B unirse en los puntos de inicio.
El TF
in
B tiene a TBP como una de sus subunidades
_
permite la unin de la polimerasa de RNA.
616
CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
Las interacciones detalladas son diferentes en los
ios tipos de promotor interno, pero el principio es el
nismo. El TF
m
C se une en flujo descendente respec-
:
del punto de inicio, ya sea de manera indepen-
diente (promotores tipo 2) o en combinacin,
con
TF
m
A (promotores de tipo 1). La presencia de TF
m
C
:
crmite al factor de posicionamiento TF
m
B unirse
tn el punto de inicio. A continuacin se recluta la
rolimerasa de RNA.
En la i IGURA 24.t se resumen las etapas de la
reaccin en los promotores internos de tipo 2. El
TF
j
C se une a las cajas A y B, lo cual permite a TF
m
B
HBurse en el punto de inicio. En ese punto se puede
-.
"
.ir la polimerasa de RNA III,
La diferencia en los promotores internos de tipo
es que TF
m
A debe unirse a una caja A para per-
itir que TF
m
C se una a la caja C. En la FIGURA 24.9
e muestra que una vez que se ha unido TF
m
C
,
los
:
esos siguen el mismo curso que con todos los pro-
motores de tipo 2, con unin de TF
UI
B en el punto
Be inicio y la polimerasa de RNA III unindose al
complejo. Los promotores de tipo I se encuentran
alo en los genes del RNAr 5S.
TF
in
A y TF
nr
C son factores de ensamblaje
aya nica funcin es facilitar la unin de TF
m
B en
a localizacin correcta. Una vez que se une TF ,
-
< pueden eliminar TF
ra
A y TF
m
C del promotor (por
a concentracin de sales in vitro) sin afectar la
fcaccin de inicio. El TF
I!
B se mantiene unido en la
~
ndad del punto de inicio y su presencia es suficiente
o para permitir que la polimerasa de RNA III se una
d punto de inicio. As, TF
m
B es el nico factor de
cio real requerido por la polimerasa de RNA m.
Esta secuencia de sucesos explica cmo las cajas de
bs promotores en flujo descendente pueden hacer
pe la polimerasa de RNA se una en el punto de
-
.
icio, en una ubicacin algo ms alejada en flujo
rendente. Aunque la capacidad de transcribir es-
tos genes es conferida por el promotor interno, los
ombios en la regin inmediata en flujo ascendente
specto del punto de inicio pueden alterar la efica-
nta de la transcripcin.
El TF
m
C es un gran complejo protenico (>500
D), comparable en tamao a la propia polimerasa
*
RNA que contiene seis subunidades. El TF
m
A es
Bembro de una clase interesante de protenas que
asduye un segmento de unin de cidos nucleicos
Limado dedo de zinc (vase la seccin 25.9, Un seg-
fcento de dedo de zinc es un dominio de unin del
NA.). El factor de posicionamiento, TF
ra
IB, cons-
ie tres subunidades; incluye la misma protena,
presente en el factor de unin medular de los
WJmotores de Pol I y tambin en el factor de trans-
pcin (TFjjD) correspondiente de la polimerasa de
:
-
-
'
A II, Asimismo, incluye Brf, que tiene relacin
n el factor TF
jj
B utilizado por la polimerasa de
: Los promotores internos de tipo 2 usan TFmC
Punto de inicio
Caja A Caja B
TFmC TFmC
TFmB
1
1
Pol III
3
.
FIGURA 24. Los promotores internos de pol III, tipo 2, uti-
lizan la unin de TF
in
C con las secuencias de las cajas A y B
para reclutar al factor de posicionamiento TF,, , que a su vez
recluta a la polimerasa de RNA III.
Los promotores de tipo 1 de pol III utilizan TFmA/C
Punto de inicio
Caja A CajaC
TFmA
TFmC
TFmB
Los promotores internos de pol III, tipo 1, utili-
zan los factores de ensamblaje TF
ni
A y TF
m
C en las cajas A y C
para reclutar al factor de posicionamiento TFmB, que a su vez
recluta a la polimerasa de RNA III.
RNA. La tercera subunidad se llama B", prescin-
dible si el DNA doble se disuelva parcialmente, lo
cual sugiere que su funcin es iniciar la burbuja
de transcripcin; la participacin de B" puede ser
comparable con la correspondiente del factor sigma
24.6 El TFniB es el factor de encargo para los promotores de la Pol III 617
en la polimerasa de RNA bacteriana (vase la sec-
cin 11.16, La sustitucin de factores sigma puede
controlar el inicio).
La regin de flujo ascendente desempea un
papel convencional en la tercera clase de promoto-
res de la polimerasa de RNA El. En el ejemplo de la
Figura 24.8 hay tres elementos de flujo ascendente
que tambin se encuentran en promotores de los
genes de RNAsn transcritos por la polimerasa de
RNA 11. (Los genes de algunos RNAsn son trans-
critos por la polimerasa de RNA 11 y otros por la de
RNA III.) Los elementos de flujo ascendente actan
de manera similar en promotores de ambas.
El inicio en un promotor de flujo ascendente de
la polimerasa de RNA ni puede tener lugar en una
regin corta inmediatamente anterior al punto de
inicio y contiene slo el elemento TATA. La eficacia
de la transcripcin, sin embargo, aumenta mucho
por la presencia de elementos PSE y OCT. Los fac-
tores que se unen a dichos elementos interactan
de manera cooperativa. (El elemento PSE puede ser
indispensable en los promotores usados por la poli-
merasa de RNA 11, en tanto es estimulador en pro-
motores utilizados por la polimerasa de RNA IH; su
nombre significa elemento de secuencia proximal.)
El elemento TATA confiere especificidad para
el tipo de polimerasa (II o III) reconocida por un
promotor de RNAsn; est unido a un factor que in-
cluye TBP, que en realidad reconoce la secuencia
en el DNA. La TBP se vincula con otras protenas
especficas del tipo de promotor. La funcin de TBP
y las protenas vinculadas es colocar correctamen-
te la polimerasa de RNA en el punto de inicio, lo
cual se describe en ms detalle para la polimerasa
de RNA II (vase la seccin 24.8, La TBP es un factor
universal).
Los factores actan en la misma forma para am-
bos tipos de promotores de la polimerasa de RNA
III, se unen en el promotor antes, que la propia polimerasa
de RNA se pueda unir y forman un complejo de
preiniciacin que dirige la unin de polimerasa de
RNA. La polimerasa de RNA m de por s no reco-
noce la secuencia del promotor, pero se une junto
a factores que de suyo estn unidos apenas en flujo
ascendente respecto del punto de inicio. Para los
promotores internos de tipo 1 y 2, los factores de
ensamblaje aseguran que TF (que incluye TBP)
se una justo en ubicacin ascendente respecto del
punto de inicio, de modo de proporcionar infor-
macin de posicin. Para los promotores de flujo
ascendente, el TF
in
B se une directamente con la
regin que incluye la caja TATA, lo cual significa
que independientemente de la localizacin de las
secuencias del promotor, cerca del punto de inicio
se unen factores para dirigir la unin de la polime-
rasa de RNA III.
EL punto de inicio
de la polimerasa de RNA II
Conceptos principales
.
La polimerasa de RNA II requiere de factores generales
de transcripcin (llamados TF
n
X) para iniciar la
transcripcin.
.
Los promotores de la polimerasa de RNA II tienen una
secuencia corta conservada Py
2
CAPy
5
(el InR de inicio)
en el punto de inicio.
.
La caja TATA es un componente comn de los
promotores de la polimerasa de RNA II y est
constituido por un octmero rico en A-T localizado -i
bp en flujo ascendente respecto del punto de inicio.
.
El DPE es un componente comn de los promotores : s
la polimerasa de RNA II que no tiene caja TATA.
.
Un promotor medular de la polimerasa de RNA II
incluye el InR y la caja TATA o un DPE.
La organizacin bsica del aparato de transcripc; :
de genes que codifican protenas fue revelada fi
el descubrimiento de que la polimerasa de RNa
rificada puede catalizar la sntesis de RNAra, pe
no iniciar la transcripcin, a menos que se agrejj
un extracto adicional. La purificacin de ese exta
to llev a la definicin de los factores genera.,
transcripcin, un grupo de protenas que nece
polimerasa de RNA n para el inicio en todos los ym
motores. Junto con esos factores, la polimer; :
RNA 11 constituye el aparato basal de transcripci
necesario para transcribir cualquier promot r -
factores generales se describen como TF
jj
X
,
dos
"
X
"
es una letra que identifica al factor indivicr
Las subunidades de polimerasa de RNA II y los
tores generales de transcripcin se conserv;
eucariotas.
El punto de partida del anlisis de la orga
zacin de los promotores es definir al pro-
medular como la secuencia ms corta en que
polimerasa de RNA 11 puede iniciar la transes
cin. En principio, un promotor medular pac
expresarse en cualquier clula, y comprende l
cuencia mnima que permite a los factore?
rales de transcripcin ensamblarse en el puma
inicio. Los promotores medulares participan c
mecnica de unin del DNA y permiten (jue .
limerasa de RNA n inicie la transcripcin; por a
parte, su accin es nicamente de baja eficaci;
se necesitan otras protenas, llamadas activ;:
para lograr un grado apropiado de funcionamii
(vase la seccin 24.13, Los elementos de sec.
corta se unen a activadores). Los activadores i
describen de manera sistemtica, pero tiene/
bres informales que reflejan los antecedentes
identificacin.
618
CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
Un promotor mnimo de pol II tiene slo dos elementos
Punto de nielo
TATAA N20 YYCAYYYYY N24 AGAC
Caja TATA Inr DPE
:
-
Promotor medular
que contiene TATA
Promotor medular
Sin TATA
FIGURA 24.10 EL promotor mnimo de pol II puede tener una
:
3ja TATA a ~25 bp en flujo ascendente respecto de Inr. La caja
"
ATA contiene la secuencia de consenso de TATAA. El InR tiene
;
:
rinnidinas (Y) que rodean a CA en el punto de inicio. La DEP
est en flujo descendente respecto de este ltimo. La secuencia
"
jestra la cadena de codificacin.
Podra esperarse que cualquier componente de
secuencia implicado en la unin de la polimerasa
de RNA y los factores generales de transcripcin
fcera conservado en casi todos los promotores, o
pi todos. Como sucede con los promotores bacte-
rianos
, al comparar los de la polimerasa de RNA II,
las homologas en las regiones cercanas al punto de
inicio se limitan a secuencias bastante cortas que
equivalen a las secuencias implicadas en la funcin
.e los promotores por mutacin. En la FIGURA 24.10
,
:
e muestra la estructura de un promotor medular
de pol 11 tpico.
En el punto de inicio no hay gran homologa de
secuencias, pero s una tendencia a que la primera
r ase de RNAm sea A, flanqueada a ambos lados por
"
irimidinas. (Esta descripcin tambin es vlida para
k secuencia de Inicio CAT de los promotores bacte-
r
.anos.) Dicha regin se denomina iniciador (Inr),
en general, puede describirse como Py
2
CAPy
5
.
El Inr est contenido entre las posiciones - 3 y +5.
'
luchos promotores tienen una secuencia llamada
:
aja TATA, que en las eucariotas superiores suele
localizarse -25 bp en flujo ascendente respecto del
:
unto de inicio y que constituye el nico elemento
pcl promotor de flujo ascendente con localizacin
-
"
dativamente fija respecto de dicho punto. La se-
raencia medular es TATAA, y suele ir seguida de
:
ras tres pares de bases A-T. La caja TATA tiende
i ser rodeada por secuencias ricas en G-C, que po-
:na ser un factor de su funcin. Es casi idntica a
a secuencia -10 de los promotores bacterianos; de
hecho, podra pasar por uno de ellos, excepto por la
diferencia de localizacin, en -25 y no en -10.
Las sustituciones de una sola base en la caja
"
ATA actan como mutaciones descendentes s-
-ias; algunas invierten la orientacin de un par
I
rT, de manera que la sola composicin de bases
"
es suficiente para su funcin. As, la caja TATA
instituye un elemento cuya conducta es anloga
al concepto de promotor bacteriano, una secuen-
cia corta, bien definida, apenas en flujo ascenden-
te respecto del punto de inicio, necesaria para la
transcripcin.
Los promotores que no contienen un elemento
TATA se llaman promotores sin TATA. Los ras-
treos de secuencias de promotores sugieren que el
50%, o ms, pueden carecer de TATA. Cuando un
promotor no incluye una caja TATA, suele contar
con otro elemento, el DPE (elemento promotor de
flujo descendente), que se localiza entre +28 y +32.
Casi todos los promotores medulares constan de
una caja TATA ms InR o un InR ms DPE.
gan La TBP es un factor universal
Conceptos principales
.
La TBP constituye un componente del factor de
posicionamiento necesaria para que cada tipo de
polimerasa de RNA se una a su promotor.
.
El factor para la polimerasa de RNA II es TF
jj
D
, q
ue
consta de TBP y 11 TAF, con una masa total de ~800 kD.
El primer paso en la formacin de un complejo en
un promotor que contenga una caja TATA, es la
unin del factor TF
n
D
, que tiene dos tipos de com-
ponente, con una regin en flujo ascendente res-
pecto de la secuencia TATA. El reconocimiento de
dicha caja es conferido por la protena de unin a
TATA (TBP), una pequea protena de -30 kD. Las
otras subunidades se llaman TAF (factores vincula-
dos con TBF), algunas de las cuales tienen relacin
estequiomtrica con TBP; otras estn presentes en
cantidades menores. Los TF
n
D que contienen dife-
rentes TAF, podran reconocer diferentes promoto-
res; algunos TAF (subestequiomtricos) son espec-
ficos de tejidos. En general, la masa total de TF
jj
D
es de -800 kD, contiene TBP y 11 TAF, con una
variacin de masa de entre 30 y 250 kD. Los TAF
de TF
n
D reciben el nombre de TAF
u
00, donde "00"
incluye la masa molecular de la subunidad.
Los factores de posicionamiento, que constan
de TBP vinculada con un conjunto de TAF, se en-
cargan de la identificacin de todas las clases de pro-
motores. Se podra considerar que elTP (para los
promotores de pol III) y el SL1 (para los de pol I) es-
tn constituidos por TBP relacionada con un grupo
particular de protenas que sustituye a los TAF que
se encuentran en TF
n
D
. La TBP es el componente
clave, y se incorpora a cada tipo de promotor por
un mecanismo diferente. En el caso de promotores
de la polimerasa de RNA II, un factor clave de po-
sicionamiento es la distancia fija de la caja TATA
respecto del punto de inicio.
24.8 La TBP es un factor universal 619
Las polimerasas se unen a travs de factores de encargo
Promotores
de pol III
j
TFmB
TFiC
i f Polimerasa de RNA
Promotores
TBP
de pol I
UBF1
Polimerasa de RNA I
Promotores
de pol II
TBP
I TF11D
TATA
Punto de inicio
-
40-30
-
20 -10 (-10+20
| /Polimerasa de RNA II
Las polimerasas de RNA se posicionan en todos
los promotores por un factor que contiene TBP.
En la FIGURA se muestra que el factor de
posicionamiento reconoce al promotor de mane-
ra diferente en cada caso. En los promotores de la
polimerasa de RNA III, TFmB se une junto a TFmC.
En los promotores de la polimerasa de RNA I, SL1
se une junto con UBF. El TF
n
D slo est encargado
de reconocer promotores de la polimerasa de RNA
II. En un promotor que tiene un elemento TATA,
la TBP se une especficamente con el DNA, pero en
otros, puede hacerlo por vnculo con otras protenas
que se unen al DNA. Cualquiera que sea el medio
de entrada al complejo de inicio, tiene el propsito
comn de interactuar con la polimerasa de RNA.
El TF
jj
D es ubicuo, pero no nico. Todas las
eucariotas multicelulares tambin expresan un
complejo alterno que contiene TLF (factor similar
al TBP en -60%) y no TBP. Probablemente inicie
la formacin del complejo mediante el conjunto
usual de factores TF
n,
pero el TLF no se une a la
caja TATA, y no se sabe como acta. En el gnero
Drosophila tambin hay un tercer factor, TRF1, que
En una vista transversal se observa qi
rodea al DNA del lado del surco estrecho. La TBP const
dos dominios conservados relacionados (idnticos hasta s
40%) que se muestran en azul claro y oscuro. La regin terr?
N vara ampliamente, y se representa en verde. Las dos cack
de DNA de doble hlice son de color gris, claro y oscuro. I-;
cortesa de Stephen K. Burley.
se comporta de la misma forma que TBP y apon
propio conjunto de TAF para formar un comr
que acta como alternativa de TE D en un con;.
especfico de promotores.
m La TBP se une at DNA
de forma inusual
Conceptos principales
.
El TBP se une a la caja TATA en el surco menor del 1
.
Forma una silla de montar en torno al DNA y lo do:_;
-80.
.
Algunos de los TAE simulan histonas y podran forr;-
una estructura parecida a un octmero de histona.
La TBP tiene la propiedad inusual de unse al I
en el surco menor (virtualmente todas las pr
as de unin a DNA conocidas se unen en el;
mayor). La estructura cristalina de la TBP sugks
un modelo detallado de unin. En la
se muestra que rodea una cara del DNA y fonn
una
"
silla de montar
"
en tono a la doble hlice
hecho, la cara interna de la TBP se une al DX-
la superficie externa, ms grande, queda disp
para extender contactos en direccin de otras -
tenas. El sitio de unin del DNA consta de un a
minio terminal C, que se conserva entre espec.
cola terminal N variable est expuesta para inten
tuar con otras protenas. Como medida de cons -
cin del mecanismo de inicio de la transcripcir
secuencia de unin de TBP con DNA perdura :
en 80% entre las levaduras y los seres humanos
La unin de TBP puede no concordar c .
presencia de nucleosomas, los cuales se for.
620 CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
sobre todo, colocando las secuencias ricas en A-T
con los surcos menores hacia el interior, de modo
ie evitar la unin de TBP, fenmeno que podra
explicar porqu los nucleosomas impiden el inicio
le la transcripcin.
La TBP se une al surco menor y dobla al DNA
-
80, como se ilustra en la -URA 24.1-. La caja TATA
se dobla hacia el surco mayor y ensancha el menor.
La dispersin se restringe a los 8 bp de la caja TATA;
en cada extremo de la secuencia, el surco menor
tienen su ancho usual de ~5 , pero en el centro
es de >9 , lo cual constituye una deformacin de
la estructura, pero no separa realmente las cadenas
de DNA porque se mantiene el apareamiento de las
bases. La extensin del doblez puede variar respecto
Je la secuencia exacta de la caja TATA y se correla-
;
iona con la eficacia del promotor.
Dicha estructura tiene varias implicaciones fun-
cionales, pues si se modifica la organizacin espacial
M DNA a cada lado de la caja TATA, los factores
ie transcripcin y la polimerasa de RNA formarn
un vnculo ms estrecho del que sera posible con el
DNA lineal. El doblez de la caja TATA corresponde
al desdoblamiento de casi un tercio de giro del DNA
y es compensado por una rotacin positiva.
La TBP en el surco menor, combinada con la
unin de otras protenas en el surco mayor, estable-
;
e contactos de alta densidad de protena-DNA en
esa regin. In vitro, la unin de TBP purificada con
DNA protege ~1 giro de la doble hlice en la caja
TATA
, que por lo general abarca de -37 a -25. No
hstante, la unin del complejo TF
y
D en la reaccin
ie inicio suele proteger la regin de -45 a -10, y
Bmbin va ms all en flujo ascendente, respecto
fet punto de inicio. La TBP es el nico factor gene-
ral de transcripcin que hace contacto especfico de
ecuencia con el DNA.
Dentro del TF
,
como complejo protenico li-
:re, el factor TAF
n
230 se une a TBP, donde ocupa
a superficie cncava de unin al DNA. De hecho, la
Estructura del sitio de unin que yace en el dominio
erminal N de TAF
n
230 simula la superficie del sur-
co menor del DNA. Esa similitud molecular permite
a TAF
]I
230 controlar la capacidad de TBP de unirse
con el DNA; el dominio terminal N de TAF
n
230 debe
:
esplazarse de la superficie de unin del DNA de
"
3P para que TF
jj
D se una al DNA.
Algunos TAF simulan histonas, en particular
TAF
U
42 y TAF
n
62 parecen ser homlogos (distantes)
ie las histonas H3 y H4, y forman un heterodmero
utilizando el mismo segmento (pliegue de histona)
be las histonas para su interaccin. (Las histonas
r
'
3 y H4 forman el meollo del octmero de histonas,
complejo bsico que se une al DNA en la cromatina
eucaritica; vase la seccin 29.7, Organizacin del
octmero de histonas.) Junto con otros TAF, TAF
n
42
La estructura cocristalina de TBP con DNA de
-
40 al punto de inicio muestra un doblez en la caja TATA que
ensancha el surco estrecho donde se une TBP. Imagen cortesa
de Stephen K. Burley.
y TAFJJ62 pueden formar la base de la estructura
que simula un octmero de histonas, estructura que
puede encargarse de las interacciones inespecficas
de secuencia de TF
,
con el DNA. Los pliegues de
histonas tambin se usan en interacciones pareadas
entre otros TAF
II.
Algunos de los TAF
n
pueden encontrase en
otros complejos, as como en TF
n
D
.
Particularmente
los TAF
n
similares a histonas se encuentran tambin
en complejos protenicos que modifican la estructu-
ra de la cromatina
'
antes de la transcripcin (vase
seccin 30.7, Las acetilasas se vinculan con los ac-
tivadores).
El aparato basaL se ensambla
en eL promotor
Conceptos principales
. La unin de TF
jj
D a la caja TATA es el primer paso del
inicio.
.
Otros factores de transcripcin se unen al complejo en
un orden definido, aumentando, asi, la longitud de la
regin protegida en el DNA.
.
Cuando la polimerasa de RNA II se une al complejo,
empieza la transcripcin.
El inicio implica que los factores de transcripcin ac-
ten en un orden definido para constituir un com-
plejo que se une a la polimerasa de RNA. La serie de
sucesos se defini inicialmente por seguimiento del
24.10 El aparato basal se ensambla en el promotor 621
Los factores se ensamblan en un complejo de inicio
FACTOR COMPLEJO DE TRANSCRIPCIN
Punto de inicio
TATA
TFiiD
TBP
-40-30-20-10 1 +10 +20
i
TAFs
Unin en el
surco menor
mi"
TFmB
i:
C >
TFiiF
Polimerasa
TFiiE
r
Un complejo de inicio se ensambla en los pro-
motores de la polimerasa de RNA II mediante una secuencia
ordenada de vnculo con factores de transcripcin.
tamao creciente del complejo protenico relacio-
nado con el DNA, pero ahora pueden definirse con
mayor detalle en funcin de las interacciones reve-
ladas por las estructuras cristalinas de los diversos
factores y de la polimerasa de RNA unida al DNA.
El vestigio de las regiones de DNA protegidas
por cada complejo sugiere el modelo que se resume
en la . Conforme cada factor T
u
se une
al complejo, se cubre una longitud cada vez mayor
de DNA, la polimerasa de DNA se incorpora en la
ltima etapa.
El encargo a un promotor se inicia cuando el
TF
n
D se une con la caja TATA. (El TF
n
D tambin
reconoce la secuencia InR en el punto de inicio.)
Cuando el TF
n
A se une al complejo, el TF
n
D ad-
quiere la capacidad de proteger una regin que se
extiende ms adelante en flujo ascendente. El TF
n
A
puede activar la TBP al aliviar la represin causada
por TAFn230.
La adicin de TF
Q
B protege parcialmente la re-
gin de la cadena molde en las cercanas del punto
de inicio, de -10 a +10, lo cual sugiere que TF
n
B se
une en flujo descendente desde la caja TATA, tal vez
en relacin laxa con el DNA y orientado de manera
asimtrica respecto de las dos cadenas. La estructura
Dos imgenes del complejo ternario de
TBP-DNA muestran que el TF
,
se une a lo largo de la S
flexin del DNA. Las dos cadenas del DNA son de color
y amarillo, la TBP es azul y el TFnB, rojo y prpura. Ims
cortesa de Stephen K. Burley.
cristalina que se muestra en la 24.1E an
dicho modelo. El TF
n
B se une al lado de TBP
extiende para prolongar el contacto en una de
caras del DNA; hace contacto con el surco me
en flujo descendente respecto de la caja TATA v
el mayor en flujo ascendente, respecto de la
TATA, en una regin llamada BRE. En organi:
arcaicos, el homlogo de TF
n
B en realidad estab;
contactos especficos de secuencia con el pront:
en la regin BRE. El TF
n
B proporcionara la sd
ficie, que a su vez es reconocida por la polime
de RNA, de modo que se encarga de la direccir
unin de la enzima.
La estructura cristalina de TF
n
B con la po'::
rasa de RNA muestra que tres dominios dei
interactan con la enzima. Como se ilustra ea j
mticamente en la i-
'
16, un listn de z\r.
terminal de TF
n
B hace contacto con la enzima o
del sitio donde sale el RNA, de modo que esto
dra interferir con la salida del RNA y con el cair
de inicio abortivo a escape promotor. Un "it
alargado de TF
n
B se inserta en el centro activo
polimerasa. El dominio terminal C interactu
la polimerasa de RNA y TF
D
B para orientar el I
tambin determina la va del DNA donde entr
contacto con los factores TF
U
E
,
TF
n
F y TF
U
H
.
pueden alinearlos en el complejo del factor bas
622 CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
El factor TF
,,
? es un heterotetrmero constitui-
do por dos tipos de subunidad, de las cuales, la ms
grande (RAP74) tiene una actividad de helicasa de
DNA dependiente de ATP, que podra participar en
la solubilizacin del DNA en el inicio. La subunidad
ms pequea (RAP38) tiene cierta homologa con
las regiones del factor sigma bacteriano que hacen
contacto con la polimerasa medular, y se une estre-
chamente con la polimerasa de RNA II, que el TF
n
F
puede llevar hacia complejo de ensamblaje de la
transcripcin y proporcionar el medio por el que se
une. El complejo de TBP y TAF puede interactuar
con la cola CTB de la polimerasa de RNA, y la in-
teraccin con TF
n
B tal vez tambin sea importante
cuando TF
F/polimerasa se unen al complejo.
La unin de la polimerasa extiende los sitios
protegidos en flujo descendente hasta +15 en la
cadena molde y +20 en la que no es molde. La en-
zima abarca la longitud total del complejo porque
se observa proteccin adicional en el lmite de flujo
ascendente.
Qu sucede con los promotores sin TATA? Se
requieren los mismos factores generales de la trans-
cripcin,
incluido TF
n
D
. El Inr proporciona el ele-
mento de posicionamiento y el TF
n
D se une a l por
la capacidad de uno o ms TAF de reconocer direc-
tamente el Inr. Otros TAF en TF
n
D tambin recono-
cen el elemento DPE en flujo descendente respecto
del punto de inicio. La funcin de la TBP en esos
promotores es ms parecida a la que tiene lugar en
!os promotores de la polimerasa de RNA I y en los
promotores internos de la polimerasa de RNA III.
El ensamblaje del complejo de inicio de la po-
Hmerasa de RNA II proporciona un contraste in-
teresante con la transcripcin procaritica. La po-
limerasa de RNA bacteriana es esencialmente un
agregado coherente con capacidad intrnseca de
unirse al DNA; el factor sigma, necesario para el
jicio pero no para la elongacin, se vuelve parte de
ia enzima antes de que se una al DNA, aunque ms
::
rde es liberada. La polimerasa de RNA II puede
Ttirse al promotor pero slo despus de que se han
unido factores de transcripcin separados. Los facto-
hes tienen una participacin anloga a la del factor
.ma bacteriano, permitir que la polimerasa bsica
reconozca especficamente al DNA en las secuencias
nomotoras, pero ha evolucionado de manera ms
dependiente. De hecho, los factores se encargan
Bbre todo de la especificidad del reconocimiento
el promotor y slo algunos participan en los con-
tactos protena-DNA (slo TBP hace contactos es-
pecficos de secuencia); por tanto, las interacciones
protena-protena son importantes para el ensam-
rkje del complejo.
Cuando hay una caja TATA, determina la loca-
.tzacin del punto de inicio, y su delecin hace que
El TFUB ayuda a posiclonar la polimerasa de RNA II
DNA en flujo DNA en flujo
ascendente descendente
Salida de RNA
Pin/a
TF D
Me
1 F,,B (N-erminal)
Pared
TF
I
Movimiento
TF
n
B (C-terminal) enzimatico
Pared
Nucletidos
EL TF
U
B se une al DNA y entra en contacto con
la polimerasa de RNA cerca del sitio de salida del RNA y en el
centro activo, y la orienta sobre el DNA. Comprese con la Fi-
gura 24.17 que muestra la estructura de la polimerasa implicada
en la transcripcin.
ste se torne errtico, si bien cualquier disminucin
global de la transcripcin es relativamente pequea.
En realidad, algunos promotores sin TATA carecen
de puntos de inicio nicos y el inicio tiene lugar
en cualquiera de un grupo de puntos de inicio. La
caja TATA alinea a la polimerasa de RNA (por la
interaccin con TF
jj
D y otros factores), de manera
que se inicie en el sitio apropiado. Esto explica que
la localizacin sea fija respecto del punto de inicio.
La unin de TBP y TATA es la caracterstica pre-
dominante del reconocimiento del promotor, pero
tambin dos grandes TAF (TAF
n
250 y TAF
j,
! 50) ha-
cen contacto con el DNA cerca del punto de inicio e
influyen en la eficacia de la reaccin.
Si bien in vitro el ensamblaje puede ocurrir en
el promotor medular, esa reaccin no es suficiente
para la transcripcin in vivo, en la cual se requieren
conexiones con activadores que reconocen a los ele-
mentos ms alejados en flujo ascendente. Los acti-
vadores interactuan con el aparato basal en diversas
etapas durante su ensamblaje (vase seccin 25.5,
Los activadores interactan con el aparato basal).
2 EL inicio va seguidlo
de la depuracin del promotor
Conceptos principales
.
Para disolver el DNA y permitir el traslado de la
polimerasa, se necesitan TFjjE y TF H.
.
La fosforilacin del CTD podra ser necesaria para que
se inicie la elongacin.
.
Para terminar un inicio abortivo, se requiere de
fosforilacin adicional del CTD en algunos promotores.
.
El CTD puede coordinar el procesamiento del RNA con
la transcripcin.
24.11 El inicio va seguido de la depuracin del promotor
La mayor parte de los factores generales de trans-
cripcin son necesarios slo para unir la polimerasa
de RNA al promotor, pero algunos actan en una
etapa posterior. La unin de TF
n
E hace que el lmite
de la regin protegida en flujo descendente se ex-
tienda por otro giro de la doble hlice, hasta +30.
Despus de TF
a
E se unen al complejo dos factores
adicionales, TF
U
H y TF , que no cambian el patrn
de unin con el DNA.
EL TF
n
H es el nico factor general de transcrip-
cin que tiene varias actividades enzimticas inde-
pendientes, entre otras, la de ATPasa, helicasas con
ambas polaridades y cinasa que puede fosforilar la
cola CTD de la polimerasa de RNA II. Este factor es
excepcional en el sentido de que tambin puede
participar en la elongacin. Su interaccin con el
DNA en flujo descendente respecto del punto de
inicio es necesaria para que la polimerasa del DNA
escape del promotor, adems de que tambin par-
ticipa en la reparacin de daos del DNA (vase la
seccin 24.12, Una conexin entre transcripcin y
reparacin).
El CTD es fosforilado en el Inicio
TF11J y TFmH
La cola del CTD
se fosforlla
La polimerasa de RNA transcriba
mBEmt
[YSPTSPS]n
FIGURA 24- Para liberar a la polimerasa de RNA y que inicie
la transcripcin, puede necesitarse fosforilacin del CTD por
actividad de cinasa delTF
n
H
.
La reaccin de inicio, definida por la forma:
del primer enlace fosfodister, ocurre una vez c:
ha unido la polimerasa de RNA. En la GURA
se propone un modelo donde se necesita la fosfe
lacin de la cola para la liberacin de la polinm
de RNA II respecto de los factores de transcripc
de modo que pueda hacer la transicin a la f -
elongada. Gran parte de los factores de transcripc
se libera del promotor en esta etapa.
En un molde lineal, para el movimiento :
polimerasa se requiere de la hidrlisis de ATF
TF
jj
E y la actividad de helicasa de TF
n
H (provista |
la subunidad XPB). Este requisito es pasado por i
por un molde superenrollado, lo cual sugiere
se necesitan TF
n
E y TF
n
H para solubilizar el DN
permitir el inicio del movimiento de la polimec
La actividad de helicasa de la subunidad XPB
TF
H se encarga de la solubilizacin en s del DB
La polimerasa de RNA II vacila en algunt ;
nes cuando inicia la transcripcin. (El resultac
es distinto del inicio abortivo de la polimerasi
RNA bacteriana descrito en la seccin 11.11, E>
tor sigma controla la unin con el DNA, aun
el mecanismo es diferente.) En muchos genes
polimerasa de RNA n termina despus de un
tramo y se fragmenta rpidamente. Para exter.
la elongacin hacia el gen, se requiere de un;
nasa llamada P-TEFb, miembro de la familia i
que regula el ciclo celular. La P-TEFb acta I
CTD para fosforilarlo an ms. No se sabe pe -
es necesario ese efecto en algunos promotores y
en otros, tampoco cmo se regula.
El CTD tambin puede estar implicado direa
indirectamente con el procesamiento del RNA I
pus de que ha sido sintetizado por la polimen
de RNA II. En la se resumen las re
ciones de procesamiento en que puede partid;
La enzima de cobertura (transferasa), que ag:
el fragmento G al extremo 5
'
de un RNAm rt:
sintetizado, se une a la forma fosforilada del C
lo cual podra ser importante para la modifica .:
del extremo 5' tan pronto como se sintetice, i
conjunto de protenas llamadas SCAF se une al C
y, a su vez, podran unirse con factores de cor
empalme, el cual sera, quiz, un medio de c
dinacin de la transcripcin y el corte y empa:
Algunos componentes del aparato de fragmei
cin/poliadenilacin tambin se unen al CTD.
traamente en el momento de inicio, de modo*
la polimerasa de RNA est lista para las reaccin
de procesamiento del extremo 3' tan pronto co
se establece! Todo ello sugiere que el CTD puede
un punto de concentracin general para cone.
otros procesos con la transcripcin. En los caso'
formacin de capuchn, corte y empalme, el (
624 CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
Para modificar el RNAm se necesita CTD
Formacin de capuchn en el extremo 5'
-
Compiejo del capuchn
Los SCAF reclutan factores de corte y empalme
SCAF 3f
i
v/v
SCAF
j:\rx
Factores de rotura
y empalme
Poliadenilacin y fragmentacin del extremo 3'
s
ssm
AAAA
FIGURA 24.18 EL CTD es importante para redutar enzimas que
edifican eL RNA.
Binciona de manera indirecta para promover la for-
macin de complejos protenicos que llevan a cabo
Las reacciones
, si bien en la generacin del extremo
p suele participar directamente en la reaccin.
El proceso general de inicio es similar al catali-
fedo por la polimerasa de RNA bacteriana. La unin
le una polimerasa de RNA genera un complejo
cerrado que, en una etapa posterior, se convierte
en un complejo abierto, en el cual se han separa-
do las cadenas del DNA. En la reaccin bacteriana,
a formacin del complejo abierto concluye con el
nmbio estructural necesario para el DNA; una dife-
rencia en la reaccin eucaritica es que se necesita
un desenrollado ms amplio del molde despus de
esta etapa.
Una conexin entre
transcripcin y reparacin
Conceptos principales
.
Los genes transcritos se reparan de manera preferencial
cuando se daa el DNA.
.
El TF
jj
H proporciona Ligamiento para un complejo de
enzimas de reparacin.
.
Las mutaciones del componente XPD de TF
n
H causan
tres tipos de enfermedades humanas.
En bacterias y otras eucariotas hay un vnculo di-
recto entre la polimerasa de RNA y la activacin de
la reparacin. El fenmeno bsico fue descubierto
porque se da preferencia a la reparacin de los genes
transcritos; ms tarde se supo que es slo la cadena
molde del DNA la que constituye la diana, y que la
cadena que no es molde se repara a la misma velo-
cidad que la mayor parte del DNA.
En las bacterias, la actividad de reparacin es
tarea del sistema de escisin-reparacin uvr (vase
la seccin 20.3, Sistemas de reparacin y escisin
en E. coli.). La reparacin preferencial se elimina
por mutaciones en el gen de mfd, cuyo producto
proporciona el ligamiento de la polimerasa de RNA
a las enzimas Uvr,
En la FIGURA 24.19 se muestra un modelo del
vnculo entre la transcripcin y la reparacin. Cuan-
do la polimerasa de RNA encuentra daos del DNA
en la cadena molde, se detiene porque no puede
usar las secuencias daadas como molde porque
no puede dirigir el apareamiento de bases comple-
mentarias. Esto explica la especificidad del efecto en
dicha cadena (los daos en la que no es molde no
impiden el avance de la polimerasa de RNA).
La protena Mfd tiene dos funciones. La prime-
ra implica el desplazamiento del complejo temario
de polimerasa de RNA del DNA, y la segunda hace
que la enzima UvrABC se una al DNA daado, lo
cual conduce a la reparacin del DNA por el meca-
nismo de escisin-reparacin (vase la Fig. 20.11).
Despus de que se ha reparado el DNA, la siguiente
polimerasa de RNA que atraviesa el gen puede ori-
ginar un producto de transcripcin normal.
Un mecanismo similar, si bien depende de otros
componentes, se usa en las eucariotas, pues se da
preferencia a la reparacin de la cadena molde de
un gen transcrito despus del dao inducido por
UV. El factor general de transcripcin TF
D
H participa
y se encuentra en formas alternas constituidas por
un centro relacionado con otras subunidades.
El TF
n
H tiene una funcin comn en el inicio
de la transcripcin y la reparacin del dao. La mis-
ma subunidad de helicasa (XPD) crea la burbuja de
24.12 Una conexin entre transcripcin y reparacin
625
transcripcin inicial y solubiliza el DNA en el sitio
daado. Sus otras funciones difieren entre trans-
cripcin y reparacin, segn la forma apropiada del
complejo.
La muestra que el factor bsico
implicado en la transcripcin consta de un centro
(de cinco unidades) relacionado con otras subuni-
dades con actividad de cinasa; ese complejo tambin
incluye una subunidad de reparacin. La subunidad
cataltica de cinasa que fosforila el CTD de la poli-
merasa de RNA pertenece al grupo de cinasas que
participa en el control del ciclo celular. Es posible
que esa conexin influya en la transcripcin como
respuesta a la etapa del ciclo celular.
El complejo alterno consiste en el centro rela-
cionado con un gran grupo de protenas codifica-
de RNA detenida
La polimerasa de RNA se detiene en el sitio
daado del molde
El Mfd se une a la polimerasa de RNA detenida
Mfd
'
V
Se liberan la polimerasa de RNA y el producto
de transcripcin
Mfd
La UvrAB inicia la reparacin de la escisin
Mfd
UvrA UvrB
l'M'fnl'M'ITIII1
El Mfd reconoce a una polimerasa de RNA de-
tenida y dirige La reparacin correspondiente hacia la cadena
molde daada.
das por genes de reparacin (el modelo bsic
muestra en la Figura 20.25). Las protenas de rt"
racin incluyen una subunidad (XPC) que recor
al DNA daado, desempea la funcin de aor
miento y permite que se d preferencia a la rer;;
cin de una cadena molde cuando la polmeras;
RNA se detiene en el DNA daado. Otras prote- -
vinculadas con el complejo son las endonucleaa
(XPG, XPF y ERCC1). En los complejos de levad".
(donde a menudo se identifican por mutaciones
defectuosas en la reparacin) y en el ser hun:;
(porque se identifican con mutaciones que caus
enfermedades resultantes de deficiencias en la
paracin del DNA daado) se encuentran prou
homlogas. Las subundades que llevan el or;
de XP son codificadas por genes en los cualt;
mutaciones causan xerodermia pigmentosa (vt:
la seccin 20.11, Las clulas eucariticas han :
servado los sistemas de reparacin).
El complejo de cinasa y el de reparacin pueie
vincularse y disociarse de manera reversible rei; -
to del TF
U
H central, lo cual sugiere un modelo i
que para el inicio se requiere de la primera for
de TF
U
H
, pero puede ser sustituido por la otra
ma (tal vez como respuesta a los daos encontr;
en el DNA). El TF
U
H se disocia de la polmera?;
RNA en una de las primeras etapas de la elongac
(despus de la transcripcin de -50 bp); su nuia
unin en un sitio de DNA daado puede exigir c :
ponentes de acoplamiento adicionales.
El TF H desempea diversas funciones
El TF|(H proporciona una cinasa en el inicio
El TF||H
medular
Cinasa
El TF||H proporciona un complejo de
reparacin en la elongacin
Complejo de
reparacin
Daos en el DNA
El centro TF
n
H puede vincularse con une r i
en el inicio y con un complejo de reparacin cuando nc.i i
DNA daado.
626 CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
La funcin para reparacin puede requerir de
modificacin o fragmentacin de la polimerasa
de RNA, cuya subunidad grande se fragmenta cuan-
do la enzima se detiene en los sitios de dao por UV.
Se desconoce la conexin entre el aparato de trans-
cripcin/reparacin como tal y la fragmentacin
de la polimerasa de RNA, quiz sea necesario elimi-
nar la polimerasa una vez que se estanca.
Esa fragmentacin de la polimerasa de RNA es
deficiente en clulas de pacientes con el sndrome
de Cockayne (trastorno de la reparacin), causado
por mutaciones en uno de dos genes (CSA y CSB)
cuyos productos parecen ser parte de TF
n
H o unirse
a l. Dicho sndrome tambin suele ser provocado
por mutaciones en XPD.
Otra enfermedad que puede ser causada por
mutaciones en XPD es la tricotiodistrofia, que tie-
ne poco en comn con XP o con el sndrome de
Cockayne (incluye retraso mental y son notorios
los cambios en la estructura del pelo). Todo ello
apunta a que XPD sea una protena pleiotrpica,
en la cual diversas mutaciones pueden afectar a di-
versas funciones. De hecho
, para la estabilidad del
complejo TF
n
H durante la transcripcin se requiere
de XPD, pero la actividad de helicasa como tal no
es necesaria. Las mutaciones que impiden que XPD
estabilice el complejo causan la tricotiodistrofia. La
funcin de reparacin necesita la actividad de heli-
casa, y las mutaciones que afectan su actividad dan
lugar a deficiencias en la reparacin que origina el
sndrome de Cockayne o en XP.
Los eLementos de secuencia
corta se unen a activadores
Conceptos principales
.
Los elementos de secuencia corta conservados se
dispersan en la regin que precede al punto de inicio.
.
Los elementos en flujo ascendente aumentan la
frecuencia del inicio.
.
Los factores que se unen a ellos para estimular la
transcripcin se llaman activadores.
Un promotor de la polimerasa de RNA II consta de
dos tipos de regin; el punto de inicio mismo se
identifica por la cercana con Inr, la caja TATA, o
ambos. Aunada a los factores generales de transcrip-
cin, la polimerasa de RNA II forma un complejo
de inicio que rodea al punto de inicio, como ya se
describi. Sin embargo, la eficacia y la especificidad
con que se reconoce un promotor, depende de se-
cuencias cortas ms alejadas en flujo ascendente,
las cuales se identifican por un grupo diferente de
factores, llamados activadores.
En general, las secuencias diana estn ~I00 bp
en flujo ascendente respecto del punto de inicio,
pero en ocasiones estn ms lejos. La unin de ac-
tivadores con dichos sitios puede influir en la for-
macin del complejo de inicio (probablemente) en
cualquiera de varias etapas.
En la FIGl I se resume el anlisis de un
promotor tpico. Se introducen sustituciones de ba-
ra
0)
ra
1
0)
0)
-
100 -80 -60 -40 -20 1
CGTAGAjCCACACCCTGGTAAGjGCCAATCTGCTGACACAGGATAGAGAGGGCAGGAGCGAGGGCAGGC, ggtgaggtaggatcagttgctcctcaca
1 La mutagnesis de saturacin de la regin de flujo ascendente del promotor de la p globina identifica tres regiones
Has (centradas a -30, -75 y -90) necesarias para el inicio de la transcripcin que corresponden a las cajas TATA
, CAAT y GC.
24.13 Los elementos de secuencia cortos se unen a activadores 627
ses individuales en casi todas las posiciones de las
100 bp en flujo ascendente respecto del punto de
inicio de la (3 globina, y el sorprendente resultado es
que casi ninguna de las mutaciones afecta la capacidad
del promotor para iniciar la transcripcin. Por otra par-
te, ocurren mutaciones descendentes en tres loca-
lizaciones correspondientes a tres elementos cortos
bien definidos.
Los dos elementos en flujo ascendente produ-
cen un efecto mayor en el grado de transcripcin
que aqul ms cercano al punto de inicio. Adems,
se produce mutacin ascendente slo en uno de
los elementos. Se concluye que las tres secuencias
cortas centradas en -30, -75 y -90 constituyen el
promotor, y cada una de ellas corresponde a la se-
cuencia de consenso para un tipo comn de ele-
mento promotor,
La caja TATA (centrada en -30) es el componen-
te menos eficaz del promotor, segn se determina
por la disminucin en la transcripcin provocada por
las mutaciones. Ntese que aunque no se impide el
inicio cuando hay mutacin en la caja TATA, vara
la localizacin usual precisa del punto de inicio, lo
cual confirma la participacin de dicha caja como
componente crucial del posicionamiento del promo-
tor medular,
Los elementos bsales y los que se encuentran
en ujo ascendente respecto de ellos tienen diferen-
tes funciones. Los elementos bsales (la caja TATA
e Inr) determinan principalmente la localizacin del
punto de inicio, pero pueden respaldar el inicio slo
en un nivel bastante bajo; identifican la localizacin en
que los factores generales de transcripcin se ensam-
blan para formar el complejo basal. Los elementos
de secuencia en flujo ms ascendente influyen en la
frecuencia de inicio, con toda probabilidad al actuar
de manera directa en los factores generales de trans-
cripcin a fin de promover la eficacia del ensamblaje
en un complejo de inicio (vase la seccin 25.5, Los
activadores interactan con el aparato basal),
La secuencia en -75 es la caja CAAT, as llama-
da por su secuencia de consenso, que fue uno de los
primeros elementos comunes en ser descrito. A me-
nudo se localiza cerca de -80, pero puede funcionar
a distancias que varan considerablemente respecto
del punto de inicio y en cualquier orientacin. Su
susceptibilidad a las mutaciones sugiere que par-
ticipa de manera importante en la determinacin
de la eficacia del promotor, pero no influye en su
especificidad.
La caja GC en -90 contiene la secuencia
GGGCGG; a menudo hay mltiples copias en el
promotor, en cualquier orientacin. Esta caja tam-
bin es un componente relativamente comn del
promotor.
La estructura deL promotor
es exibLe, pero el contexto
puede ser importante
Conceptos principales
Ningn elemento individual de flujo ascendente es ir-
dispensable para la funcin del promotor, si bien une
ms deben estar presentes para que el inicio sea eficn
Algunos elementos son reconocidos por muchos
factores, y un factor utilizado en un promotor en
particular puede ser determinado por el contexto de te
otros factores unidos.
Los promotores se organizan segn un principii :
"
mezcla y apareamiento
"
. Diversos elementos pu:
den contribuir a la funcin del promotor, pero n:
guno es indispensable para todos. En la Fl
se incluyen algunos ejemplos. Entre esos promow
res se encuentran en total cuatro tipos de elememos
cajas TATA, GC, CAAT y el octmero (un elemen
de 8 bp). Los elementos encontrados en cualqu:--
de esos promotores difieren en nmero, localizad
y orientacin, ninguno es comn a todos. Si b !
el promotor conduce informacin direccional
transcripcin procede slo en flujo descender:t
las cajas GC y CAAT parecen tener la capacidad :
actuar en cualquier orientacin, lo cual implica :
los elementos funcionan slo como sitios de un
de DNA para acercar los factores de transcripc:
al punto de inicio; la estructura de un factor C;:
ser suficientemente flexible como para permn: -
establecer contactos protena-protena con el :
rato basal, independientemente de la forma en -
el dominio de unin de DNA est orientado y c t
distancia exacta del punto de inicio.
Se supone que los activadores, que son mj
menos ubicuos, estn disponibles para cualcy ;
Los promotores tienen modul
de mezcla y apareamiento
Punto de inicio
SV40 temprano
Cinasa de timidina
Histona H2B
-
140-120-100-80 -60 -40 -20 bp
Tipos de *
mdulo Octmero CAAT GC TATA
Los promotores contienen diferentes comt
ciones de cajas TATA, CAAT, GC y otros elementos.
CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
promotor que tenga una copia del elemento que
reconocen, entre los que se incluyen las cajas CAAT
y GC, y el octmero. Todos los promotores podran
necesitar uno o ms de esos elementos para funcio-
nar eficazmente. Un activador suele unirse a una
secuencia de consenso de <10 bp, pero en realidad
cubre una longitud de -20 bp del DNA. Dado el
tamao de los activadores y la longitud del DNA
que cubre a cada uno, es de esperar que las diversas
protenas cubran juntas toda la regin en flujo as-
cendente a partir del punto de inicio en que residen
los elementos.
En general, una secuencia de consenso en parti-
cular es reconocida por el activador correspondiente
(o por un miembro de una familia de factores). Sin
embargo, en ocasiones, una secuencia de promotor
especfica puede ser reconocida por uno de varios
activadores. Un activador ubicuo, el Oct-1, se une
con el octmero para activar el gen de la histona H2B
(y posiblemente tambin otros); es el nico factor
de unin octmero en clulas no linfoides. Sin em-
bargo, en clulas linfoides, un activador diferente, el
Oct-2, se une al octmero para activar el gen de la
cadena ligera kappa de inmunoglobulina, As, Oct-2
es un activador especfico de tejido, en tanto Oct-1
es ubicuo. No es tan importante conocer los detalles
exactos del reconocimiento, como el hecho de que
diversos activadores reconocen las cajas CAAT.
El uso del mismo octmero en el gen H2B de
expresin ubicua y en los genes de inmunoglobuli-
na especficos de linfoides constituye una paradoja,
por qu el Oct-1 ubicuo no puede activar los genes
de inmunoglobulina en tejidos no linfoides? El con-
texto debe ser importante; tal vez se requiera Oct-2
ms que Oct-1 para interactuar con otras protenas
que se unen en el promotor. Estos resultados indi-
can que no es posible pronosticar si un gen ser ac-
tivado por un activador en particular sencillamente
con base en la presencia de elementos especficos
en su promotor,
Los poten da dores contienen
elementos bidireccionaLes
que facilitan eL inicio
Conceptos principales
Un potenciador activa al promotor ms cercano, es
decir, a cualquier distancia en flujo ascendente o
descendente respecto del promotor.
Un UAS (secuencia de activador ascendente) de las
levaduras se comporta como potenciador, pero funciona
slo en flujo ascendente respecto del promotor.
En potenciadores y promotores se encuentran
elementos de secuencia similares.
Los potenciadores forman complejos de activadores que
actan directa o indirectamente con el promotor.
Hasta ahora se ha considerado al promotor como
una regin aislada que se encarga de la unin de la
polimerasa de RNA, pero los promotores eucariti-
cos no necesariamente actan solos; cuando menos
algunos casos, la actividad del promotor aumenta
enormemente por la presencia de un potenciador,
que consta de otro grupo de elementos, pero se lo-
caliza a distancia variable de los considerados como
parte constitutiva del promotor mismo.
El concepto de que el potenciador es distinto
del promotor refleja dos caractersticas; no es ne-
cesario que la posicin del potenciador respecto del
promotor sea fija, sino que puede variar sustancial-
mente. En la FIGURA 24.23 se muestra que puede
ser de flujo ascendente o descendente, adems de
que suele actuar en cualquier orientacin respecto
del promotor (es decir, puede estar invertido). Las
manipulaciones del DNA muestran que el potencia-
dor puede estimular a cualquier promotor que est
cerca; en genomas silvestres pueden estar dentro
de los genes (esto es, apenas en flujo descendente
del promotor) o a decenas de kilobases en cualquier
direccin de flujo.
Para fines operativos, en ocasiones conviene
definir al promotor como una o varias secuencias del
DNA que deben estar en una localizacin (relativamente)
fija respecto del punto de inicio, definicin que incluye
a la caja TATA y otros elementos de flujo ascen-
dente, pero se excluye al potenciador, si bien esta
definicin es de trabajo, ms que una clasificacin
rgida.
En las levaduras se encuentran elementos an-
logos a los potenciadores llamados secuencias ac-
tivadoras en flujo ascendente (UAS), los cuales
cin del potenciador es i
te de la localizacin
El potenciador de flujo ascendente activer
I promotor Promotor
Potenciador
1 Transcripcin
Promotor f El potenciador de flujo descendente activert
-~ al promotor )
Potenciador
J
'-
/\/\/'... ~ - ' W"
j
-O Transcripcin
FIGURA 24.23 Un potenciador puede activar a un promotor desde lo-
calizaciones de flujo ascendente o descendente y su secuencia se puede
invertir respecto del promotor.
24.15 Los potenciadores contienen elementos bidireccionales que facilitan el inicio
629
pueden actuar en cualquier orientacin y a distan-
cias variables en flujo ascendente respecto del pro-
motor, pero no en flujo descendente. Su funcin
es regulatoria; en varios casos, la UAS est unida a
las protenas reguladoras que activan los genes en
flujo descendente.
Los experimentos de reconstruccin en que
se elimina la secuencia del potenciador del DNA
y despus se inserta en otro sitio, muestran que es
posible mantener la transcripcin normal en tan-
to se encuentre en cualquier punto de la molcula del
DNA, pero si se coloca un gen de p-globina en una
molcula de DNA que contiene un potenciador,
su
transcripcin aumenta, in vivo, ms de 200 veces,
incluso si el potenciador est varios kb en flujo as-
cendente o descendente respecto del punto de ini-
cio, en cualquier orientacin; todava no se sabe a
qu distancia deja de actuar el potenciador.
Los potenciadores contienen
los mismos elementos
encontrados en Los promotores
Conceptos principales
Los potenciadores estn hechos del mismo tipo de
elementos de secuencia que se encuentran en los
promotores.
.
La densidad de los componentes de secuencia es mayor
en el potenciador que en el promotor.
Una diferencia entre el potenciador y un promotor
comn es la densidad de los elementos regulado-
res. En la FIGURA 2 se resume la sensibilidad del
potenciador SV40 a los daos provocados por una
mutacin, y se observa que un porcentaje mucho
mayor de sus sitios influye directamente en su ftu
cin, a diferencia de lo que ocurre con el promoti
analizado en la misma forma en la Figura 24.;
Hay un incremento equivalente en la densidad i
los sitios de unin de protenas, de los cuales,
un
chos son elementos comunes, por ejemplo, API
el octmero.
La especificidad de la transcripcin puede *
controlada por un promotor o un potenciador.
"
_
promotor puede ser especficamente regulad
un potenciador cercano se utilizar para aun:?:
tar la eficacia del inicio; o bien, un promotor
de carecer de regulacin especfica pero activar
slo cuando un potenciador cercano es activ-s
especficamente. Un ejemplo son los genes de i
munoglobulinas, que portan potenciadores dcv-
de la unidad de transcripcin. Los potenciadores i
las inmunoglobulinas parecen estar activos slo i
los linfocitos B, donde se expresan los genes de i
inmunoglobulinas. Tales potenciadores proporc
nan parte de la red regulatoria mediante la cus
'
.
controla la expresin gnica.
Una diferencia entre potenciadores y promoi
res puede ser que aqullos se muestran ms cooz
rativos entre la unin de factores. Un complejo :
se ensambla en el potenciador y que responde a 15
(interfern) y se ensambla de manera coopera
para formar una estructura funcional llamada p*
tenciadorsoma. La unin de la protena no llis
na HMGI (Y) dobla al DNA en una estructura c
despus se une a varios activadores (NF-kB, IRF
ATF-Jun). A diferencia de la estructura de "me:;
y apareamiento
"
de los promotores, todos esos c: -
ponentes son necesarios para crear una estrucv.
activa del potenciador; no se unen directameill
la polimerasa de RNA, sino que crean una sup j
ficie que se une a un complejo de coactivacin. Dic
80
60
0)
a) 40
ra
20
CXAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCAtCTCAATTAGTCAGCAAC
GGTCGACACCTTACACACAGTCAATCCCACACCTTTCAGGGGTGCGAGGGGTCGTCCGTCTTCATACGTTTCGTACGTAGAGTTAATCAGTGGTTG
AP4 AP1 AP3 AP2 Octmero AP1
FIGURA 24.24 Un potenciador contiene varios segmentos estructurales. En el histograma se ilustra el efecto
de todas las mutaciones que reducen la funcin del potenciador a <75% del tipo silvestre. Los sitios de unin
para las protenas se indican abajo del histograma.
630
CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
complejo ayuda al complejo de preiniciacin de los
factores de transcripcin basal que se ensamblan en
el promotor para reclutar a la polimerasa de RNA.
En la seccin 25.5, Los activadores interactan con
el aparato basal, se describe en detalle la funcin de
los coactivadores.
Los potendadores actan
aumentando La concentracin
de Los activadores
cerca deL promotor
Conceptos principales
.
Los potenciadores suelen funcionar slo en
configuracin cis con un promotor diana.
.
Es posible hacer que los potenciadores funcionen en
configuracin trans por ligamiento del DNA contenido
en el promotor diana con DNA contenido en el
potenciador mediante un puente protenico o por
concatenacin de las dos molculas.
.
El principio es que un potenciador funciona en
cualquier situacin en que est constreido a la misma
proximidad que el promotor.
Cmo puede un potenciador estimular el inicio en
un promotor que puede estar localizado a cualquier
distancia de uno y otro lado? Cuando se descubrie-
ron los potenciadores, se tomaron en cuenta varias
posibilidades respecto de su accin como elementos
claramente diferentes de los promotores.
.
Un potenciador podra cambiar la estructura
global del molde, por ejemplo, influyendo
en la densidad del superenrollado.
.
Podra encargarse de localizar el molde en
un sitio especfico dentro de la clula, por
ejemplo, al unirlo a la matriz nuclear.
.
Un potenciador podra proporcionar un
"
sitio de entrada
"
, un punto en que la po-
limerasa de RNA (o alguna otra protena
esencial) se vincula inicialmente con la cro-
matina.
Ahora se considera que la funcin del poten-
ciador implica el mismo tipo de interaccin con el
aparato basal que las interacciones dependientes
Je elementos promotores de flujo ascendente. Los
potenciadores son modulares, igual que los promo-
tores. Ciertos elementos se encuentran tanto en
potenciadores como en promotores, y algunos de
is que se encuentran en los promotores, compar-
:
en con los potenciadores la capacidad de actuar
I diferentes distancias y en cualquier orientacin.
As, se desdibuja la distincin entre potenciadores y
promotores; los primeros podran ser considerados
como portadores de elementos del promotor, por-
que se agrupan estrechamente, y porque tienen la
capacidad de actuar a distancias mayores, respecto
del punto de inicio.
La funcin esencial del potenciador podra ser
aumentar la concentracin del activador cerca del
promotor (cercama, en este sentido, es un trmino
relativo). Dos tipos de experimentos ilustrados en la
sugieren que eso es lo que ocurre.
Un fragmento de DNA que incluye un poten-
ciador en un extremo y un promotor en el otro, no
se transcribe de manera eficaz, pero el potenciador
puede estimular la transcripcin desde el promotor
cuando se conectan mediante un puente protenico.
Los efectos estructurales del tipo de los cambios en
el superenrollado, no podran transmitirse a travs
de tal puente, lo cual sugiere que la caracterstica
clave es acercar mucho a potenciador y promotor.
Un potenciador bacteriano proporciona un sitio
de unin para el regulador NtrC, que acta sobre la
polimerasa de RNA utilizando promotores recono-
cidos por o54. Cuando el potenciador se coloca en
un crculo de DNA concatenado (enlazado) con un
crculo en que se encuentre el promotor, el inicio
es casi tan eficaz como cuando el potenciador y el
promotor estn en la misma molcula circular. Sin
embargo, no hay inicio si el potenciador y el promo-
tor estn separados. Tambin en este caso se sugiere
que la caracterstica ms importante es la localiza-
cin de la protena unida con el potenciador, lo cual
aumenta la posibilidad de que este ltimo entre en
contacto con una protena unida al promotor.
La actividad del potenciador implica que el promotor est cerca
Estructuras inactivas
1 Promotor Po'enciador
Estructuras activas
Puente protenico
Crculos concatenados
FIGURA 24.25 Un potenciador puede actuar acercando protenas al
promotor. Si bien no acta en un promotor en el extremo opuesto de un
DNA lineal largo, se torna eficaz cuando el DNA se integra a un crculo
mediante un puente protenico. Cuando el potenciador y el promotor se
encuentran en DNA circulares diferentes no interactan, pero pueden
hacerlo cuando las dos molculas se concatenan.
24.17 Los potenciadores actan aumentando la concentracin de los activadores cerca del promotor
631
Si las protenas unidas en un potenciador a va-
rios kb de distancia de un promotor interactan di-
rectamente con protenas unidas cerca del punto de
inicio, la organizacin del DNA debe ser suficiente-
mente flexible como para permitir que potenciador
y promotor se ubiquen cerca uno del otro, para lo
cual es necesario que el DNA interpuesto se pueda
expulsar como una
"
asa
"
grande. Tales asas se han
observado directamente en el caso de un potencia-
dor bacteriano.
Una interesante excepcin a la regla de que los
potenciadores actan en configuracin cis en cir-
cunstancias naturales es el fenmeno de la transfec-
cin. El apareamiento de los cromosomas somticos
permite a un potenciador de un cromosoma activar
a un promotor del cromosoma homlogo,
lo cual
refuerza el punto de vista de que los potenciadores
actan por proximidad.
Qu limita la actividad de un potenciador? Por
lo general, acta sobre el promotor ms cercano,
pero hay circunstancias en que un potenciador est
entre dos promotores y activa slo a uno de ellos
con base en contactos especficos protena-protena
entre los complejos unidos con los dos elementos.
La accin de un potenciador puede ser limitada por
un aislador, elemento del DNA que impide al po-
tenciador actuar en los promotores ms all de su
ubicacin (vase la seccin 29.14,
Los aisladores
bloquean las acciones de los potenciadores y de la
heterocromatina).
No se ha definido an qu tan general es el
potenciamiento; se desconoce qu porcentaje de los
promotores celulares requiere de un potenciador
para alcanzar su grado usual de expresin, y tam-
bin qu tan a menudo un potenciador constituye
una diana para la regulacin. Algunos potenciado-
res se activan slo en los tejidos en que actan sus
genes, pero otros podran estar activos en todas las
clulas.
2Sg La expresin gentica se
vincula con La desmetiLacin
Concepto principal
La desmetilacin en el extremo 5' del gen es necesaria
para la transcripcin.
La metilacin del DNA es uno de varios sucesos re-
guladores que influyen en la actividad de un pro-
motor; su efecto impide la transcripcin, y los gru-
pos metilo deben ser eliminados para que se active
el promotor. Dicho efecto est bien caracterizado
en los promotores de las polimerasas I y 11 de RNA.
De hecho, la metilacin es un suceso regulatorio
reversible desencadenado por modificaciones de
histonas que incluyen desacetilacin y metilac -
protenicas (vase la seccin 30.9, La metilacin :
las histonas y el DNA est relacionada).
La metilacin es tambin un suceso epigenr
co, en cuyo caso, puede dar lugar a modificacic-
especficas del espermatozoide o el oocito, de rrr ;
que tal vez habra una diferencia entre dos alele; -
la siguiente generacin. El resultado de esto podr_:
:
ser diferencias en la expresin de los alelos patear
y materno (vase la seccin 31.8, La metilacin : -
DNA es la causa de la impresin).
En este captulo se abordan los medios por _
que la metilacin influye en la transcripcin, c, -
son los mismos si se agregan o eliminan grupos ~
tilo como suceso regulatorio local, o epigentio_
La metilacin en los promotores de la poliflaBH
rasa de RNA fl ocurre en pares CG. La distribuc
de los grupos metilo puede realizarse aprovechano'
las enzimas de restriccin que rompen sitios diam
que contienen pares CG. En la iGURA 24. se ce"
paran dos tipos de actividades de restriccin. Es:
isoesquizmeros son enzimas que fragmentar
misma secuencia diana del DNA, pero responder :
manera diferente ante su estado de metilacin.
La enzima Hpalf fragmenta la secuencia CCG '.
(escribiendo la secuencia de slo una cadena
DNA). Sin embargo, si la segunda C est metilad :
enzima ya no podr reconocer el sitio. No obstar/-
s enzimas de restriccin difieren
en los sitios metilados
Los sitios son escindidos independientemente
de la metilacin

MsP' N
o motilado
CCGG CCGG
GGCC GGCC
V i
CCGG
Y
9<mm m/j mam
GGCC
Me
El sitio motilado
no se escinde
El sitio no metilad
se escinde
FIGURA 24.26 La enzima de restriccin MspI fragmenta te::.
las secuencias CCGG, metiladas o no, en la segunda C,
Hpall fragmenta slo los tetrmeros CCGG no metilados.
632 CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
la enzima MspI fragmenta el mismo sitio diana, in-
dependientemente el estado de metilacin en esa C, de
modo que se puede usar MspI para identificar todas
las secuencias CCGG y usar Hpall para determinar
si estn metiladas.
Con un sustrato de DNA no metilado, las dos
enzimas generaran las mismas bandas de restric-
cin. No obstante, en el DNA metilado, las posicio-
nes modificadas no son fragmentadas por la Hpall;
para cada una de dichas posiciones, un segmento
mayor de Hpall sustituye a dos segmentos de MspI.
Vase el ejemplo de la FIGURA 24.27.
Muchos genes muestran un patrn en que el
estado de metilacin es constante en casi todos los
sitios, pero vara en otros; algunos de los sitios estn
metilados en todos los tejidos revisados, a diferencia
de otros. Una mnima parte de los sitios est metilada en
los tejidos en que el gen no se expresa, pero no est meti-
lada en sitios en que el gen no est activo. Por tanto, se
puede describir a un gen activo como suhmetilado.
Los experimentos con el frmaco 5-azacitidi-
na aportan pruebas indirectas de que la desme-
tilacin puede dar como resultado la expresin
gentica. Dicho frmaco se incorpora al DNA, no
a la citidina, y no puede metilarse porque la posi-
cin 5
'
est obstruida, lo cual lleva a la aparicin
de sitios desmetilados en el DNA como consecuen-
cia de la replicacin (segn el esquema de la dere-
cha de la Figura 15.7).
Los efectos fenotpicos de la 5-azacitidina inclu-
yen la induccin de cambios en el estado de dife-
renciacin celular. Por ejemplo, se induce a clulas
musculares a desarrollarse a partir de precursores
celulares diferentes del msculo. El frmaco tam-
bin activa genes en un cromosoma X silencioso,
La digestin por enzimas de restriccin
permite analizar la metilacin
Producto de Producto de
digestin de MspI digestin de Hpall
Una banda exclusiva
de Hpall sustituye a
las bandas de MspI
_
p
- Bandas exclusivas de
MspI = sitios metilados
"
1 Banda en la misma
posicin = sitio no metilado
FIGURA 24.27 Los resultados de MspI y Hpall se comparan
3or electroforesis en gel de Los fragmentos.
lo cual resulta en la posibilidad de que el estado de
metilacin podra estar relacionado con la inactivi-
dad cromosmica.
Revisando el estado de metilacin de los genes
residentes, es posible comparar los resultados de la
introduccin de DNA metilado, o no, a nuevas clu-
las hospedadoras, experimentos que muestran una
clara correlacin: el gen metilado est inactivo, pero el
no metilado est activo.
Qu extensin tiene la regin submetilada? En
el grupo de genes de a globina del pollo de clulas
eritroides adultas, la submetilacin se confina a los
sitios que van de -500 bp en flujo ascendente res-
pecto del primero de dos genes a de adultos, a -500
bp en flujo descendente del segundo. Los sitios de
submetilacin se encuentran en la misma regin,
incluido el espaciador intermedio. La regin de sub-
metilacin coincide con la de sensibilidad mxima a
la desoxirribonucleasa I. Con esto se argumenta que
la submetilacin es la caracterstica de un dominio
que contiene un gen transcrito o varios. Como con
otros cambios de la cromatina, parece probable que
los grupos metilo se relacionen con la capacidad de
transcripcin, ms que con la transcripcin en s.
El problema de la interpretacin del vnculo ge-
neral entre la activacin del gen y la submetilacin
es que slo participa una minora de los sitios meti-
lados (en ocasiones muy pequea). Es posible que el
estado de metilacin sea crtico en sitios especficos
o en una regin restringida, como tambin lo es que
una disminucin en el grado de metilacin (o inclu-
so la eliminacin total de grupos metilo de alguna
cadena del DNA) sea parte de algn cambio estruc-
tural que permite que avance la transcripcin.
En particular, la desmetilacin del promotor
podra ser necesaria para que est disponible para
el inicio de la transcripcin. En el gen de y globina,
por ejemplo, la presencia de grupos metilo en la re-
gin que rodea al punto de inicio, entre -200 y +90,
suprime la transcripcin. La eliminacin de los tres
grupos metilo localizados en flujo ascendente res-
pecto del punto de inicio, o de los tres grupos metilo
en flujo descendente, no alivia la supresin, pero la
eliminacin de todos los grupos metilo permite que
el promotor funcione. Por lo tanto, la transcripcin
puede implicar una regin sin metilos en el pro-
motor (vase la seccin 24.19, Los islotes CpG son
dianas reguladoras). Hay excepciones a esta relacin
general.
Algunos genes pueden expresarse incluso si
estn muy metilados, as que cualquier de las co-
nexiones entre metilacin y expresin no son uni-
versales en un organismo, pero la regla general es
que la metilacin impide la expresin gnica y que
se necesita desmetilacin para lograr la expresin.
24.18 La expresin gentica se vincula con la desmetilacin
633
Los islotes CpG son dianas
reguladoras
Conceptos principales
Los islotes CpG rodean a los promotores de genes con
expresin constitutiva donde no estn metilados.
Los islotes CpG tambin se encuentran en los
promotores de algunos genes regulados por tejidos.
.
Hay ~29 000 islotes CpG en el genoma humano.
.
La metilacin de un islote CpG impide la activacin de
un promotor en su interior.
.
La unin de protenas a pares de CpG metilados resulta
en represin.
La presencia de islotes CpG en las regiones 5' de
algunos genes se relaciona con el efecto de la me-
tilacin en la expresin gentica. Dichos islotes se
detectan por una mayor densidad de la secuencia
dinucleotdica CpG (CpG = 5'-CG-3').
El par CpG se encuentra en el DNA de ios ver-
tebrados con apenas una frecuencia del -20% de
lo que se esperara a partir del porcentaje de pares
de bases G-C (quiz porque los pares CpG estn
metilados en C y la desaminacin espontnea de la
metil-C la transforma en T, con lo que se introduce
una mutacin que elimina al par), pero en ciertas
regiones, la densidad de los pares CpG llega al valor
Los islotes CpG tienen grupos de pares CpG
y-globina
5' imm - mmm
Exn Exn
1 2
500 1000 bp
APRT
III IIII JIliUMIilttfett
Exn Exn
1 2
La concentracin usual de los pares CpG en el
DNA de mamfero es -1/100 bp, como en el caso de un gen de
gamma globina. En un islote rico en CpG la densidad aumenta
a >10 pares/100 bp. El islote del gen APRT se inicia -100 bp en
flujo ascendente respecto del promotor y cubre ~400 bp hacia
el gen. Cada lnea vertical representa un par CpG.
pronosticado; de hecho, aumenta 10 veces, respec
del resto del genoma. En esas regiones, los par.
CpG no estn metilados.
En estos islotes ricos en CpG, el contenido pro-
medio de G-C es de -60%, respecto del promedi
de 40% de la mayor parte del DNA; asumen
forma de cadenas de DNA, por lo general de 1 a
kb de longitud. Hay -45 000 de ellos en el genom
humano, algunos en elementos repetidos Alu, qv
z como consecuencia de su elevado contenido d
G-C. En la secuenciacin del genoma humano >
confirm que, descartados stos, hay -29 000 isK
tes, y son menos en el genoma de ratn, -15 5C j
Ms o menos 10 000 de los islotes pronosticados ei
ambas especies parecen residir en un contexto d
secuencia que se conserva entre especies, lo cu 3
sugiere que podran corresponder a aquellos qv
tienen importancia reguladora. La estructura de |
cromatina en esas regiones presenta cambios vir
culados con la expresin gnica (vase la seccic
30.11, La activacin del promotor implica una ?;
re ordenada de sucesos), disminuye el contenic
de la histona Hl (lo cual probablemente signifk
que la estructura es menos compacta); las otR
histonas estn ampliamente acetiladas (carac:;
rstica que tiende a vincularse con la expresi< r
gnica) y hay sitios hipersensibles (como sera di
esperar de los promotores activos).
En varios casos, los islotes ricos en CpG empie
zan justo en flujo ascendente respecto de un pr
motor y se extienden en flujo descendente hacia L
regin transcrita, antes de desaparecer. En la FIGUBi
se compara la densidad de los pares CpG ei
una regin
"
general
"
del genoma con un islote CpC
identificado a partir de la secuencia del DNA; ea
ltimo rodea la regin 5' del gen APRT, que tic::
expresin constitutiva.
Todos los genes "domsticos" que se expresan
de manera constitutiva tienen islotes CpG, es decSj
casi la mitad; la otra mitad se presenta en los promo
tores de genes regulados por tejidos, y slo una pe
quea parte (<40%) de esos genes tiene islotes, ce
cuyo caso, no estn metilados, independientemen:
del estado de expresin del gen. Los islotes ric
en CpG no metilados pueden ser necesarios pe
por lo tanto, es insuficiente para la transcripcir
As, la presencia de islotes CpG no metilados puec
tomarse como indicio de que un gen es potencia
'
.
mente activo, que ser transcrito inevitablemente
Muchos islotes no metilados en animales, se torna
metilados en lneas celulares de cultivos de tejido:
lo cual podra relacionarse con la imposibilidad c
esas lneas para expresar todas las funciones usual
del tejido del que se derivan.
La metilacin de un islote CpG puede afectar j
transcripcin por uno de dos mecanismos:
634
CAPTULO 24 Promotores y potenciadores
.
La metilacin de un sitio de unin para al-
gn factor puede evitar su unin, como en
el caso de la unin con un sito regulador di-
ferente del promotor (vase la seccin 31.9,
Los genes con impresin opuesta pueden
ser controlados por un solo centro).
.
La metilacin puede hacer que represores
especficos se unan al DNA.
La represin se debe a uno de dos tipos de pro-
tenas que se unen a las secuencias CpG metiladas.
La protena MeCPl requiere de varios grupos metilo
para unirse al DNA, en tanto que MeCP2 y una
familia de protenas relacionadas se pueden unir a
k
m solo par de bases CpG metiladas. Esto explica
porqu se necesita una zona sin metilacin para el
I
nicio de la transcripcin. La unin de protenas de
[
cualquier tipo impide la transcripcin in vitro por un
extracto nuclear.
La MeCP2, que reprime directamente la trans-
cripcin por interaccin con complejos en el promo-
tor, se une tambin al complejo represor Sin3, que
Biene actividad de desacetilasa de histonas (vase
la Figura 30.16). Esta observacin constituye una
conexin directa entre dos tipos de modificaciones
represivas, la metilacin del DNA y la desacetilacin
lie histonas.
La ausencia de grupos metilo se vincula con la
expresin gnica, si bien hay algunas dificultades
para sustentar que el estado de metilacin consti-
uya un medio general de control de la expresin
Bnica. En el caso de Drosopha melanogaster (y otros
insectos dpteros), el DNA est escasamente metila-
do (si bien hay un gen que posiblemente codifique
lina metiltransferasa) y en el nematodo Clostridium
legans el DNA no est metilado. Las otras diferen-
cias entre la cromatina inactiva y la activa parecen
S
er las mismas que en especies que presentan meti-
lacin. As, en esos organismos, cualquiera que sea
la organizacin de la metilacin en los vertebrados,
es sustituida por algn otro mecanismo.
En genes activos se producen tres cambios:
.
Se establece uno o varios sitios hipersensi-
bles cerca del promotor.
.
Los nucleosomas de un dominio que incluye
la regin transcrita se tornan ms sensibles
a la desoxirribonucleasa I.
.
El DNA de la misma regin est submetila-
do.
Todos esos cambios son necesarios para la trans-
cripcin.
Resumen
De las tres polimerasas de RNA eucariticas, la I
transcribe del DNAr y contribuye a la mayor parte
de las actividades; la H transcribe genes estructurales
para RNAm y tiene los productos ms variados, en
tanto que la m, transcribe RNA pequeos. Las en-
zimas tienen estructuras similares, con dos grandes
subunidades y muchas subunidades ms pequeas;
hay algunas subunidades comunes entre enzimas.
Ninguna de las tres polimerasas de RNA reco-
noce directamente a sus promotores. Un principio
unificador es que los factores de transcripcin tie-
nen la responsabilidad primaria de reconocer los
elementos de secuencia caractersticos de cualquier
promotor en particular y sirven, a su vez, para unir-
se a la polimerasa de RNA y posicionarla correcta-
mente en el punto de inicio. En cada tipo de pro-
motor, el complejo de inicio se ensambla por una
serie de reacciones en que los factores individuales
se unen al complejo (o lo abandonan). El factor TBP
es necesario en las tres polimerasas de RNA para el
inicio; en cada caso proporciona una subunidad de
un factor de transcripcin que se une en las cerca-
nas del punto de inicio.
Un promotor consta de varios elementos de
secuencia cortos en la regin en flujo ascendente
respecto del punto de inicio, cada uno de los cuales
est unido a un factor de transcripcin. El aparato
basal, que consiste en los factores TF
n,
se ensambla
en el punto de inicio y permite que se una la poli-
merasa de RNA. La caja TATA (si la hay), cercana
al punto de inicio, y la regin iniciadora, ubicada
justo en ste, se encargan de la seleccin del punto
de inicio exacto en los promotores de la polimerasa
de RNA n. La TBP se une directamente con la caja
TATA, en su caso; en los promotores que carecen de
ella, se localiza cerca del punto de inicio por unin
a DPE en flujo descendente. Despus de la unin de
TF
n
D
, los otros factores generales de transcripcin
de la polimerasa de RNA II ensamblan el aparato de
transcripcin basal en el promotor. Otros elementos
del promotor localizados en flujo ascendente res-
pecto de la caja TATA se unen a activadores que
interactan con el aparato basal. Los activadores y
los factores bsales son liberados cuando la polime-
rasa de RNA inicia la elongacin.
El CTD de la polimerasa de RNA II es fosfo-
rilado durante la reaccin de inicio. El TF
n
D y las
protenas SRB pueden interactuar con el CTD, as
como proporcionar un punto de contacto para las
protenas que modifican el producto de transcrip-
cin del RNA, incluida la enzima de estructuracin
del capuchn 5', los factores de corte y empalme y
el complejo de procesamiento 3
'
.
Los promotores pueden ser estimulados por po-
tenciadores, secuencias que pueden actuar a grandes
distandas y en cualquier orientacin, a uno y otro
lado de un gen. Los potenciadores tambin constan
24.20 Resumen
de conjuntos de elementos, si bien su organizacin
es ms compacta. Algunos elementos se encuen-
tran tanto en promotores como en potenciadores.
Los potenciadores tal vez acten ensamblando un
complejo protenico que interacta con las prote-
nas unidas en el promotor, lo cual implica que el
DNA interpuesto forme "asas".
Los islotes CpG contienen concentraciones
de pares CpG; a menudo rodean a los promotores de
genes con expresin constitutiva, aunque tambin
se encuentran en los promotores de los genes re-
gulados. El islote que incluye a un promotor debe
estar no metilado para que dicho promotor pueda
iniciar la transcripcin. Una protena especfica se
une a los pares CpG mediados y evita el inicio de la
transcripcin.
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Referencias 639
Activacin de la transcripcin
ESQUEMA DEL CAPTULO
4.n Introduccin
.
La expresin del gen eucaritico suele controlarse en el
mbito del inicio de la transcripcin.
wvwm Hay varios tipos de factores de transcripcin
El aparato basal determina el punto de inicio de la
transcripcin.
.
Los activadores determinan la frecuencia de la
transcripcin.
.
Los activadores actan estableciendo contactos proteina-
protena con los factores bsales.
.
Los activadores pueden actuar a travs de coactivadores.
.
Algunos componentes del aparato de transcripcin actan
modificando la estructura de la cromatina.
wxmm Dominios independientes se unen con el DNA y
activan la transcripcin
.
La actividad de unin con DNA y activacin de la transcrip-
cin son obra de dominios independientes de un activador.
.
La funcin de la unin del dominio con el DNA es acercar
el dominio de activacin de la transcripcin al promotor.
BEKl El anlisis de dos hbridos detecta interacciones
protena-protena
.
El anlisis de dos hbridos acta solicitando una
interaccin entre dos protenas, donde una tiene un
dominio de unin con DNA y la otra un dominio de
activacin de la transcripcin.
wvn Los activadores interactan con el aparato basal
.
El principio que regula la funcin de los activadores es que
el dominio de unin con el DNA determina la especificidad
para el promotor o potenciador diana.
.
El dominio de unin con DNA se encarga de localizar el
dominio de activacin de la transcripcin en las cercanas
del aparato basal.
.
Un activador que acta directamente tiene un dominio de
unin con el DNA y uno de activacin,
.
Un activador que no tiene un dominio de activacin puede
actuar unindose a un coactivador, que s lo tiene.
.
Varios factores del aparato basal son dianas con las que
interactan activadores o coactivadores.
.
La polimerasa de RNA puede vincularse con diversos
conjuntos alternos de factores de transcripcin en forma de
un complejo holoenzimtico.
wvKm Algunas protenas de unin con promotor
corresponden a represores
La represin suele lograrse por afectacin de la estructura
de la cromatina, pero hay represores que actan por unin
con promotores especficos.
ESO Los elementos de respuesta son reconocidos ::
los activadores
.
Los elementos de respuesta pueden localizarse en
promotores o potenciadores.
.
Cada elemento de respuesta es reconocido por un acr i
especfico.
.
Un promotor puede tener muchos elementos de respuem
que, a su vez, pueden activar la transcripcin de ma-e~
independiente o en ciertas combinaciones.
aata Hay muchos tipos de dominios de unin con I
Los activadores se clasifican de acuerdo con el tipo ce
unin con DNA.
.
Los miembros del mismo grupo tienen variaciones de
secuencia de un segmento especfico que les confiere-
especificidad para sitios diana especficos.
aatj El segmento de dedo de zinc es un dominio ce
unin con DNA
.
Un dedo de zinc es un asa de ~23 aminocidos que
sobresale de un sitio de unin de zinc formado por los
aminocidos His y Cis.
.
Una protena con dedos de zinc suele tener varios.
.
La porcin C terminal de cada dedo forma un a hlice :.-
se une a un giro del surco mayor del DNA.
.
Algunas protenas de dedos de zinc se unen con el Ru-
no al DNA, o adems de al DNA.
watiti Los receptores de esteroides sen activadores
.
Los receptores de esteroides son ejemplos de activadee;
de respuesta a ligandos que se activan por unin con
esferoide (u otras molculas relacionadas).
.
Hay dominios separados de unin con DNA y de unir ;: -
ligandos.
warn Los receptores de esteroides tienen dedos de z -
.
El dominio de unin con DNA de un receptor de esterG::-
es un tipo de dedo de zinc que tiene la porcin Cis, pe-:
la His.
.
Los receptores de glucocorticoides y estrgenos tienen
dos dedos de zinc cada uno, el primero de los cuales
determina la secuencia diana del DNA.
Los receptores de esteroides se unen al DNA como dime-::
wmvA La unin con elemento de respuesta es activada
por La unin con ligando
La unin del ligando con el dominio C terminal aumente i
afinidad del dominio de unin con DNA por su sitio dia'e
especfico en el DNA.
640
Los receptores de asteroides reconocen a
Los elementos de respuesta por un cdigo
combinatorio
.
Un elemento de respuesta a esteroides consta de dos
sitios mitad cortos, paLindrmicos o de repeticin
directa.
.
Hay slo dos tipos de sitios mitad.
.
Un receptor reconoce su elemento de respuesta por la
orientacin y el espaciamiento de los sitios mitad.
.
La secuencia de los sitios mitad es reconocida por el
primer dedo de zinc.
.
El segundo dedo de zinc se encarga de la dimerizacin,
que determina la distancia entre subunidades.
.
La separacin de las subunidades en el receptor
determina el reconocimiento del espaciado en el
elemento de respuesta.
.
Algunos receptores de esteroides actan como
homodmeros, en tanto que otros forman
heterodimeros.
.
Los homodimeros reconocen elementos de respuesta
palindrmicos; los heterodimeros reconocen elementos
de respuesta de sitios mitad con repeticin directa.
Los homeodominios se unen con dianas
relacionadas en el DNA
. El homeodominio es un dominio de DNA de 60
aminocidos que tiene tres a hlices.
.
El C terminal del a hlice 3 tiene 17 aminocidos y se
une con el surco mayor del DNA.
.
El brazo N terminal del homeodominio se proyecta
hada el surco menor del DNA.
.
Las protenas que contienen homeodominios pueden
corresponder a activadores o represores de la
transcripcin,
nasa
Las protenas hlice-asa-hlice interactan
por vinculo combinatorio
.
Las protenas hlice-asa-hlice tienen un segmento
de 40 a 50 aminocidos que incluye dos a hlices
antipticas de 15 a 16 aminocidos, separados por un
asa.
.
Las hlices se encargan de la formacin de dmeros.
.
Las protenas bHLH tienen una secuencia bsica
adyacente al segmento HLH, que se encarga de la
unin con el DNA.
.
Las protenas de clase A bHLH son de expresin
ubicua, en tanto que las de clase B bHLH son
especficas de tejido.
.
Una protena de clase B por lo general forma un
heterodmero con una protena de clase A.
.
Las protenas HLH que carecen de regin bsica
impiden que la contraparte bHLH de un heterodmero
se una con el DNA.
.
Las protenas HLH forman vnculos combinatorios que
podran cambiar durante el desarrollo por la adicin o
la eliminacin de protenas especficas.
Las cremalleras de leucina participan en la
formacin de dmeros
.
La cremallera de leucina es una hlice antiptica que
presenta dimerizacin.
.
La cremallera es adyacente a una regin bsica que se
une con el DNA.
.
La dimerizacin forma el segmento bZIP donde se unen
en forma simtrica dos regiones bsicas a repeticiones
invertidas del DNA.
Resumen
rfi [ntroducdn
.
La expresin de Los genes eucariticos suele
controlarse en el mbito del inicio de La transcripcin.
-;
-
5 diferencias fenotpicas que distinguen a los di-
irsos tipos de clulas en una eucariota superior se
:
eben en gran parte a diferencias en la expresin
r genes que codifican protenas, esto es, las trans-
itas por la polimerasa II de RNA. En principio, la
expresin de esos genes podra ser regulada en una
r varias etapas. Se pueden distinguir (cuando me-
s) cinco puntos de control posibles que forman
.
2 serie siguiente:
Activacin de la estructura del gen
i
Inicio de la transcripcin
i
Procesamiento del producto de transcripcin
i
Transporte al citoplasma
i
Traduccin del RNAm
Como se observa en la IGURA 25.1, la expresin
gnica en eucariotas es controlada sobre todo al ini-
ciarse la transcripcin. Para la mayor parte de los
genes, es el principal punto de control de su expre-
sin, el cual implica cambios de la estructura de la
cromatina del promotor (vase la seccin 30.11, La
activacin del promotor implica una serie ordenada
de sucesos), acompaada de la unin del aparato
basal de transcripcin (que incluye la polimerasa
II de RNA) al promotor. (La regulacin en etapas
subsiguientes de la transcripcin es rara en clulas
eucariticas. En algunos genes se observa termina-
cin prematura, la cual es contrarrestada por una
cinasa, P-TEFb, pero por lo dems, no parece que
se emplee el proceso anti terminacin.)
El producto primario de la transcripcin es mo-
dificado por un capuchn en el extremo 5' y, en
general, tambin es transformado por la poliadeni-
lacin del extremo 3'. Se deben extirpar los miro-
nes de los productos de transcripcin de los genes
interrumpidos y el RNA maduro debe exportarse
del ncleo al citoplasma. La regulacin de la expre-
sin gnica por seleccin de secuencias en el mbito
del RNA nuclear podra implicar una o todas esas
etapas, pero la que ms ha tenido preocupado, en
cuanto a pruebas, se refiere a cambios en el corte
25.1 Introduccin 641
Control del inicio de la transcripcin: usado por casi
todos los genes
La estructura local del gen cambia
El aparato general de transcripcin se une con
el promotor
El RNA se modifica y procesa:
puede controlar la expresin de productos gnicos alternos
AAAA
El RNAm se exporta del ncleo al citoplasma:
no regulado
AAAA =
Ncleo
Citoplasma
Se traduce el RNAm:
regulado en el desarrollo de anfibios
La expresin gnica es controlada principalmen-
te al inicio de la transcripcin, y es raro que los pasos subsi-
guientes permitan determinar si se expresa un gen, aunque se
puede usar un control del proceso para definir la forma del gen
se representa en el RNAm.
y empalme; algunos genes expresan mediante pa-
trones alternos de corte y empalme cuya regulacin
controla el tipo de producto protenico (vase la
seccin 26.12, El corte y empalme alterno implica el
uso diferencial de uniones de corte y empalme).
En ltima instancia, la traduccin de un RNAm
en el citoplasma puede controlarse de manera espe-
cfica. Si bien el empleo de ese mecanismo es raro
en las clulas somticas del adulto, se presenta en
algunas situaciones embrionarias, lo que implicara
la localizacin del RNAm en sitios especficos donde
se expresa el bloqueo del inicio de la traduccin por
factores protenicos especficos o ambos.
La regulacin de la transcripcin gnica espec-
fica de tejidos constituye el meollo de la diferencia-
cin eucaritica. Un factor de transcripcin regula-
torio sirve para el control comn de gran nmero
de genes diana y se ha intentado responder a dos
interrogantes acerca de esa forma de regulac::
Cmo identifica el factor de transcripcin su grjsi
de genes diana? Cmo se regula la actividad mi?-rji
del factor de transcripcin en respuesta a seata
intrnsecas o extrnsecas?
Hay varios tipos de factores
de transcripcin
Conceptos principales
El aparato basal determina el punto de inicio de la
transcripcin.
Los activadores determinan la frecuencia de la
transcripcin.
Los activadores actan estableciendo contactos
protena-protena con los factores bsales.
Los activadores pueden actuar a travs de
coactivadores.
Algunos componentes del aparato de transcripcin
actan modificando la estructura de la cromatina.
El inicio de la transcripcin implica muchas i
acciones protena-protena entre factores de TTazs
cripcin unidos con el promotor o un potencia -
as como con la polimerasa de RNA. Los factccu
requeridos para la transcripcin se pueden divic::
varias clases, las cuales se describen en la sigui*
lista. En la FIGURA 25.2 se resumen sus propiedacfe
.
Los factores bsales, aunados a la polimea
sa de RNA, se unen con el punto de inicu
de la caja TATA (vase la seccin 24.10.
aparato basal se ensambla en el promc:
.
Los activadores son factores de transa
cin que reconocen elementos de consf-
especficos, cortos y que se unen con y. .
del promotor o de activadores (veas*
seccin 24.13, Los elementos de secuenta
cortos unen activadores). Su accin impSi
aumentar la eficacia del aparato basal paa
unirse con el promotor, de modo que in;
mentan la frecuencia de la transcripci- :
se necesitan para que un promotor aa :
un nivel adecuado. Algunos activador :
tan de manera constitutiva (son ubicu|
en tanto a otros tienen un papel regul;
y se sintetizan o activan en momentos l
pecficos o en tejidos especficos, de r;
que se encargan del control de los patr: -
de transcripcin en tiempo y espacie. 1
secuencias a las que se unen se llamar, e -
mentos de respuesta.
.
Los miembros de otros grupos de fac::--
para la transcripcin eficaz, en s, no l
642
CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
Varios tipos de
. _
Potenciador
transcripcin
La polimerasa de
RNA y los factores
bsales se unen con
el promotor
VAAAZK ffiSS
Promotor
Los activadores
se unen con el
promotor
Los activadores se
unen con sitios
distales en el
promotor o con
potenciadores
Los coactivadores
conectan a los
activadores con
los factores bsales
Los coactivadores
o reguladores
actan en la
estructura local
del gen
unen con el DNA. Los coactivadores pro-
porcionan una conexin entre activadores y
aparato basal (vase la seccin 25.5, Los ac-
tivadores interactan con el aparato basal);
actan por interacciones protena-protena
y forman puentes entre los activadores y el
aparato basal de transcripcin.
.
La accin de algunos activadores y otros re-
guladores provoca cambios en la cromatina
(vase la seccin 30.7, Las acetilasas se re-
lacionan con activadores).
La diversidad de los elementos a partir de los
cuales puede construirse un promotor funcional
as variaciones en cuanto a su localizacin, res-
p
ecto del punto de inicio, sugieren el argumen-
"
de que los activadores tienen capacidad para
ueractuar entre s o en interacciones protena-pro-
rina en mltiples formas. No parece haber restric-
rlones en cuanto a relaciones potenciales entre los
elementos. La naturaleza modular del promotor se
iustra mediante experimentos en que se han inter-
:
3mbiando regiones equivalentes de promotores
erentes. Los promotores hbridos, por ejemplo,
tetre los genes de la timidina cinasa D y los genes de
J globulina beta funcionan bien, lo cual sugiere que
r; principal propsito de los elementos es acercar los
ctivadores a los que se unen, al complejo de ini-
ciacin
, donde las interacciones protena-protena
:eterminan la eficacia de la reaccin de inicio.
La organizacin de los promotores de la poli-
nerasa II de RNA contrasta con la de los promo-
lores bacterianos, en la cual todos los factores de
ranscripcin deben actuar directamente con la po-
-imerasa de RNA. En el sistema eucaritico
,
slo
os factores bsales interactan directamente con la
mzima. Los activadores pueden Lnteractuar con los
actores bsales o con coactivadores que, a su vez,
nteractan con los factores bsales. La construccin
le aparato en capas de interaccin explica la flexi-
pldad con que los elementos pueden disponerse y
J distancia en que pueden dispersarse.
R3PI Dominios independientes
se unen con el DNA y activan
La transcripcin
Conceptos principales
.
La actividad de unin con DNA y activacin de la
transcripcin son obra de dominios independientes de
un activador.
.
La funcin de la unin del dominio con el DNA es
acercar el dominio de activacin de la transcripcin al
promotor.
FIGURA 25.2 Los factores involucrados en la expresin gnica
incluyen la polimerasa de RNA y el aparato basal,
activadores
que se unen directamente con el DNA en el promotor o con
potenciadores; coactivadores que se unen tanto a los activa-
dores como al aparato basal, y reguladores que actan en la
estructura de la cromatina.
Los activadores y otras protenas reguladoras nece-
sitan dos tipos de capacidad;
.
Reconocen secuencias diana especficas lo-
calizadas en activadores
, promotores u otros
elementos reguladores que afectan a un gen
diana particular.
.
Una vez unido con el DNA, un activador
ejerce su fundn al unirse con otros com-
ponentes del aparato de transcripcin.
Es posible caracterizar dominios en el activa-
dor que se encargan de esas actividades? A menudo
un activador tiene dominios separados que unen
DNA y activan la transcripcin. Cada dominio se
comporta como un mdulo independiente que ac-
ta por su cuenta cuando se enlaza con un dominio
:25.
,
3 Dominios independientes se unen con el DNA y activan la transcripcin
643
de otro tipo. La geometra del complejo de transcrip-
cin global debe permitir al dominio de activacin
entrar en contacto con el aparato basai, sin importar-
la localizacin exacta y la orientacin del dominio
de unin del DNA.
Los elementos de direccin ascendente respec-
to del promotor deben estar a una distancia apre-
ciable desde el punto de inicio y en muchos casos
orientados en cualquier direccin. Los activadores
incluso pueden estar ms lejos, y siempre muestran
independencia de orientacin. Esta organizacin
tiene implicaciones tanto para el DNA como para
las protenas. El DNA puede presentar asas o con-
densarse de alguna forma para permitir la forma-
cin del complejo de transcripcin. Por otra parte,
los dominios del activador pueden conectarse de
forma flexible como se ilustra esquemticamente
Un activador tiene dominios independientes
Dominio conector
\
Dominio activador
Dominio de unin con DNA
Las funciones de unin con DNA y su activacin
en un factor de transcripcin pueden incluir dominios indepen-
dientes de la protena.
en la IGURA 2b . Lo principal en este caso es
los dominios de unin y de activacin del DNA
independientes, y se conectan de forma que pe:
ten que el dominio de activacin interacte c
aparato basal, independientemente de la orie:
cin y la localizacin exacta del dominio de 9
de DNA.
La unin con DNA es necesaria para la ac
cin de la transcripcin, pero la activacin depe;
de un dominio de unin de DNA en particular?
En la FIGURA se ilustra un experimento p
responder a esta pregunta. El activador Gal4 i
un dominio de unin de DNA que reconoce un
y un dominio de activacin que estimula el in
en el promotor diana. El represor bacteriano h
tiene un dominio de unin de DNA terminal 9
reconoce un operador especfico. Cuando Lex-
une a este operador, reprime al promotor adyac
te. En un experimento de "trueque", el domini
unin de DNA de LexA puede ser sustituido
el de DNA de Gal4, de manera que el gen hbi
pueda introducirse en la levadura con un gen d:
que contenga UAS o un operador LexA.
Una protena Gal4 autntica puede activa:
gen diana slo si tiene un UAS. Obviamente, el
presor LexA por s mismo carece de la capac:
para activar cualquier tipo de diana, y el hb
LexA-Gal4 ya no puede activar un gen con
pero ahora puede activar al gen que porta el
rador LexA!
La especificidad para la activacin depende del dominio de unin con ONA
UASG Promotor Operador LexA Promotor
Activador Gal4
Unin de Gal4
con DNA
Unin y transcripcin
Sin unin
Activador Gal4
Unin de LexA
con DNA
Sin unin
Unin y transcripcin
La capacidad de Gal4 para activar la transcripcin es independiente de su espe-
cificidad para La unin con DNA. Cuando el dominio de unin con DNA Gal4 es sustituido por
el de unin con DNA LexA, la protena hbrida puede activar la transcripcin cuando se coloca
un operador LexA cerca de un promotor.
644 CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
Este resultado concuerda con el punto de vista
T.odular de la transcripcin. El dominio de unin
;:
n DNA sirve para llevar la protena hacia la loca-
zacin correcta. No tiene importancia cmo o dn-
- -
se une precisamente al DNA, pero una vez ah,
dominio de transcripcin-activacin puede ejer-
;
rr su accin. De acuerdo con este punto de vista,
no importa si el dominio de activacin de la trans-
lipcin se acerca al promotor por reconocimiento
- e un UAS, a travs del dominio de unin de DNA
de Gal4 o por reconocimiento de un operador LexA,
i travs del mdulo de especificidad de LexA; la ca-
"
acidad de ambos tipos de mdulo para actuar en
las protenas hbridas sugiere que cada dominio de
la protena se pliega de manera independiente en
-
ina estructura activa en la cual no influye el resto
re la protena.
La idea de que los activadores tienen dominios
"
dependientes que se unen con el DNA y que la
activacin de la transcripcin se refuerza por la ca-
:
acidad de la protena tat del VIH para estimular el
micio sin unin alguna de DNA. La protena tat se
une a una regin de la estructura secundaria en el
producto RNA; la parte del RNA requerida para la
iccin de tat se llama secuencia tur. En la IGURA
25.5 se muestra un modelo del funcionamiento de
la. interaccin tat-far en la estimulacin de la trans-
pcion.
La secuencia tar se localiza justo en direccin
sscendente del punto de inicio, de manera que
cuando se une a tar
, se acerca al complejo de ini-
aacin, lo cual es suficiente para asegurar que su
ominio de activacin est lo suficientemente cerca
del complejo de iniciacin. El dominio de activacin
nteracta con uno o ms de los factores de trans-
.ripcin unidos con el complejo de la misma forma
fae una activador. (Obviamente el primer producto
de transcripcin puede formarse en ausencia de tat,
de modo de proporcionar el sitio de unin.)
Ciertas estructuras en que se obtuvo tat por
ageniera gentica constituyen una demostracin
extrema de la independencia de los dominios de
-
jcalizacin y activacin, de manera que el dominio
de activacin se conectara con el dominio de unin
del DNA y no con la secuencia de unin usual tar.
Cuando se colocaba un sitio diana apropiado en el
promotor, el dominio de activacin tat poda activar
la transcripcin, lo cual sugiere que debera pen-
sarse que la unin de DNA (o en este caso la unin
:
e RNA) proporciona una funcin
"
de sostn", cuyo
principal propsito es asegurar que el dominio de activa-
::
5n est cerca del complejo de inicio.
La nocin de sostn a manera de correa cons-
ituye un ejemplo ms especfico de la idea general
de que el inicio requiere de una elevada concentra-
cin de factores de transcripcin en las cercanas del
promotor, lo cual puede lograrse cuando los activa-
dores se unen con los potenciadores en el entorno
general cuando se unen a componentes del promo-
tor de direccin ascendente, o en un caso extremo,
con el producto de RNA por sostn a manera de
correa. La exigencia comn en todos estos casos es
la flexibilidad del arreglo tridimensional exacto del
DNA y las protenas. El principio de los dominios
independientes es comn en los activadores de la
transcripcin. Se podra considerar que la funcin
del dominio de unin de DNA es acercar el dominio
de activacin al punto de inicio. Esto explica porqu
las localizaciones exactas de los sitios de unin con
DNA pueden variar en el promotor.
EL anlisis de dos hbridos
detecta interacciones
protena-protena
Concepto principal
El anlisis de dos hbridos funcionan por requerimiento
de una interaccin entre dos protenas donde una tiene
un dominio de unin de DNA y la otra un dominio de
activacin de la transcripcin.
El modelo de independencia de dominio es la base
de un anlisis muy til para la deteccin de inter-
acciones protenicas. De hecho, el dominio de co-
nexin de la Figura 25.3 se sustituye con la inter-
accin protena-protena, principio que se ilustra en
Por lo general tat se une a la secuencia tar del RNA
,
Dominio de unin con RNA
Dominio de activacin
Producto de
transcripcin
Transcripcin
Un dominio de activacin tat enlazado con frecuencias de unin
con DNA acta de la misma forma
Dominio de activacin
Complejo de inicio
Dominio de unin con DNA
El dominio de activacin de la protena TATA de VIH puede
estimular la transcripcin si se inserta cerca por unin con un producto
de RNA de una ronda previa de transcripcin. La activacin es indepen-
diente del medio de insercin, como se muestra por la sustitucin de un
dominio de unin con DNA por el dominio de unin con RNA.
25.4 El anlisis de dos hbridos detecta interacciones protena-protena
645
la FIGURA 25.6. Una de las protenas en estudio se
fusiona con un dominio de unin de DNA, y la otra,
con uno de activacin de la transcripcin. (Esto se
logra enlazando las secuencias de codificacin apro-
piadas para caso y creando protenas sintticas por
expresin de los genes hbridos.)
Si las dos protenas que se estudian pueden in-
teractuar entre s, las dos protenas hbridas harn
lo propio, lo cual se refleja en el nombre de la tc-
nica, anlisis de dos hbridos. La protena con el
dominio de unin de DNA se fusionan con un gen
reportero que tiene un promotor simple con su sitio
diana, pero no puede activar el gen por s mismo. La
activacin ocurre slo si el segundo hbrido se une
con el primero para llevar el dominio de activacin
al promotor. Se puede usar cualquier gen reporte-
ro cuando el producto es fcilmente analizable, y
esta tcnica ha dado origen a varios procedimientos
automticos para probar rpidamente interacciones
protena-protena.
La eficacia de la tcnica ilustra de manera sor-
prendente la naturaleza modular de las protenas.
Incluso cuando se ha unido a otra protena, el do-
minio de unin con DNA puede fusionarse con el
El anlisis de dos hbridos determina
la interaccin de protenas
DBD
Participantes /
i Protena 1 Protena 2
fusionada
con un dominio de
unin con DNA
AD
fusionada "
con un dominio
de activacin
Sistema de reporte
Sitio de unin con protenas Gen reportero
CAT u otro producto del reportero
Las protenas no Interactan: no hay expresin
Las protenas interactan y activan la expresin
y
-"
i A'
La tcnica de dos hbridos estudia la capacidad
de dos protenas de interactuar al incorporarlas a protenas
hbridas donde una tiene un dominio de unin con DNA y la
otra un dominio de activacin de la transcripcin.
DNA y el dominio de activacin de la transcripci:
puede hacer lo propio. En consecuencia, la capa
cidad de interaccin de las dos protenas en estu
dio no es inhibida por la unin de los dominios d
unin con DNA o de activacin de la transcripcir
(Obviamente hay excepciones en que no son apli
cables estas sencillas reglas y la interferencia entr
los dominios de la protena hbrida impide que 1,
tcnica funcione.)
La utilidad de este anlisis es que slo tequie:
que las dos protenas estudiadas pueden interac
tuar entre s, no necesitan tener nada qu ver con
transcripcin. Como resultado de la independencia c
los dominios de unin con DNA y de activado:
de la transcripcin, todo lo que se requiere es qw
se unan, lo cual suceder en tanto las dos prote:
as en estudio puedan interactuar en el mbito de
ncleo.
Los activadores interactan
con el aparato basaL
Conceptos principales
El principio que regula la funcin de los activadores
es que el dominio de unin con el DNA determina la
especificidad para el promotor o potenciador diana.
El dominio de unin con DNA se encarga de localizar
el dominio de activacin de la transcripcin en las
cercanas del aparato basal.
Un activador que acta directamente tiene un dominic
de unin con el DNA y uno de activacin.
Un activador que no tiene un dominio de activacin
puede actuar unindose a un coactivador, que s lo
tiene.
Varios factores del aparato basal son dianas con las qu
interactan activadores o coactivadores.
La polimerasa de RNA puede vincularse con diversos
conjuntos alternos de factores de transcripcin en
forma de un complejo holoenzimtico.
Un activador puede actuar directamente cuand
consta de un dominio de unin con DNA enlazad
con uno de activacin de la transcripcin, como !
ilustra en la Figura 25.3. En otros casos, el activa
dor no tiene en s un dominio de activacin de I
transcripcin, pero se une a otra protena, un coa:
tivador, que s lo tiene. En la FIGURA 25.7 se muestr,
la accin de este tipo de activador. Los activadore
pueden considerarse como factores de transcripci"
cuya especificidad es conferida por la capacidad d
unirse con factores de transcripcin del DNA y n
directamente con el DNA. Un activador en parta:
lar puede necesitar un coactivador especfico.
646
CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
Si bien los componentes protenicos se organi-
zan de manera diferente, el mecanismo es el mismo.
.
n activador que establece contacto directo con el
aparato basal tiene un dominio de activacin unido
ra forma covalente con el dominio de unin con
1 NA. Cuando un activador acta a travs de un co-
ctivador
, las conexiones implican una unin no co-
siente entre subunidades de protenas (compren-
r las Figs. 25.3 y 25.7). Las mismas interacciones
:
e encargan de la activacin, independientemente
de que los diversos dominios estn presentes en la
misma subunidad protenica o divididos en varias
ie esas subunidades.
Un dominio de activacin de la transcripcin
acta a travs de lograr contactos protena-protena
I m los factores de trascripcin general que promue-
ven el ensamblaje del aparato basal. Se puede hacer
Lontacto con el aparato basal en cualquiera de los
Aferentes factores bsales, pero en general ocurre
; m TF
n
D
,
TF
ir
B o TF
U
A; los cuales participan en
r:apas tempranas del ensamblaje del aparato basal
vase la Fig. 24.14). En la se ilustra la
situacin en que se hace un contacto de ese tipo,
B principal efecto de los activadores es influir en el
ensamblaje del aparato basal.
El TF
jj
D puede ser la diana ms frecuente de los
activadores
, que pueden contactar a cualquiera de
arios TAF. De hecho, una accin importante de los
TAF es proporcionar la conexin del aparato basal
i los activadores
, lo cual explica porqu la TBP sola
ustenta la transcripcin de nivel basal, pero se re-
:uieren TAF o TF
n
D para niveles ms altos de trans-
rripcin estimulados por activadores. Los diferentes
TAF de TF
n
D pueden proporcionar superficies de
-nteraccin con diferentes activadores
,
de los cuales,
algunos interactan slo con TAF individuales,
en
tanto que otros lo hacen con varios. Se supone que
!a interaccin ayuda a la unin de TF con la caja
TATA o con otros activadores en torno al complejo
TF -caja TATA. En cualquier caso, la interaccin
establece el complejo de transcripcin basal, que
celera el proceso de inicio y, por tanto,
aumenta
el uso del promotor.
Los dominios de activacin de los activadores de
.evaduras Gal4 y Gcn4 tienen mltiples cargas ne-
gativas, lo que llev a describirlos como "activadores
cidos
"
. Otro activador de este tipo, particularmente
eficaz
, es el que porta la protena Vpl6 del virus del
aerpes simple (VP16 no tiene de por s un dominio
ie unin con DNA
, pero interacta con el aparato
de transcripcin a travs de una protena interme-
iia). Se han hecho experimentos para caracterizar
las funciones del activador cido en que frecuente-
mente se utiliza la regin activadora de VP16 enla-
zada a un segmento de unin con DNA.
Los activadores cidos actan por incremento
de la capacidad de TF
n
B de unirse al complejo de ini-
cio basal. En experimentos in vitro se ha demostrado
que la unin de TFnB con un complejo de inicio en
un promotor de adenovirus es estimulada por la
presencia de los activadores GAL4 o VP16 cido, y
que este ltimo puede unirse a TFnB. El ensamblaje
de TF
jj
B en el complejo de su promotor es, por tan-
to, una limitante de la velocidad estimulada por la
presencia de un activador cido.
La resistencia de un promotor de la polimerasa
II de RNA ante la reestructuracin de elementos y
su indiferencia incluso ante los elementos particula-
res presentes sugieren que los sucesos que la activan
son relativamente de naturaleza general. Cualquier
activador cuya regin de activacin se pone al al-
cance del inicio basal tiene la capacidad de estimular
su formacin. Algunos ejemplos sorprendentes de
tal versatilidad se han logrado por la estructuracin
de promotores constituidos por nuevas combina-
ciones de elementos. As pues, cuando un elemento
UAS
C
de levadura se inserta cerca del promotor de
un gen eucaritico superior, ste puede ser activado
por Gal4 en una clula de mamfero cultivada. Por
Un activador puede usar un coactivador
Coactivador
Activador
Un activador puede unirse a un coactivador que
hace contacto con el aparato basal.
os activadores hacen contacto
con el aparato basal
El activador hace contacto con TAF en TF||D
El activador hace contacto con TFmB
FIGURA 25. Los activadores pueden actuaren diferentes eta-
pas del inicio por contacto con TAF de TFnD o con TFyB.
25.5 Los activadores interactan con el aparato basal
647
La polimerasa de RNA es una holoenzima
Los activadores y
factores bsales
se unen
Se une la holoenzima
polimerasa de RNA
FIGURA 25.v La polimerasa de RNA es una holoenzima que
contiene muchos activadores.
tanto, cualquiera que sea el medio que Gal4 utiliza
para activar al promotor parece haberse conserva-
do entre las levaduras y las eucariotas de ms alta
jerarqua. La protena Gal4 debe reconocer alguna
caracterstica del aparato de transcripcin de los
mamferos que simula sus contactos normales en
levaduras.
Cmo estimula la transcripcin un activador?
Se pueden imaginar dos tipos generales de modelo:
.
El modelo de reclutamiento seala que su
solo efecto es aumentar la unin de la poli-
merasa de RNA con el promotor.
.
Un modelo alterno supone que en el com-
plejo de transcripcin se induce algn cam-
bio, por ejemplo de la conformacin de la
enzima, que aumenta su eficacia,
En una prueba de esos modelos, en un caso de
levaduras, se demostr que el reclutamiento puede
contribuir a la activacin. Cuando la concentracin
de la polimerasa de RNA se aument lo suficiente, el
activador no pudo producir ningn aumento de la
transcripcin, lo cual sugiere que su nico efecto es
aumentar la concentracin eficaz de la polimerasa
de RNA en el promotor.
Cuando se suman todos los componentes re-
queridos para la transcripcin eficaz, factores bsa-
les, polimerasa de RNA, activadores y coactivadores,
se obtiene un aparato muy grande que consta de
>40 protenas. Es factible que ese aparato se en-
samble en el promotor? Algunos activadores, coac-
tivadores y factores bsales pueden ensamblarse de
manera gradual, pero entonces tal vez se unan a un
complejo muy grande constituido por la polimerasa
de RNA previamente ensamblada con activad
y coactivadores adicionales, como se ilustra rr
Se han encontrado varias formas de polime:;
de RNA en que la enzima se vincula con far.
de transcripcin. El "complejo de holoenzimas
levaduras ms notorio (definido como capaz de /
ciar la transcripcin sin componentes adicin;
consta de la polimerasa de RNA vinculada ce"
complejo de 20 subunidades llamado mediad :-
que incluye productos de varios genes dond;
mutaciones impiden la transcripcin, incluid1:;
gunos lod SRB (as llamados porque muchos dt . j
genes originalmente se identificaron como supr-
res de mutaciones en la polimerasa B de RNA
nombre fue sugerido por su capacidad para meia
los efectos de los activadores. El mediador es r-
sario para la transcripcin de casi todos los gene*
levaduras, en tanto que para la transcripcin e
genes eucariticos ms elevados se requieren o: r
piejos homlogos. El mediador presenta un ca:r
de conformacin cuando interacta con el d :
nio terminal (CTD) de la polimerasa de RNA rv -
transmitir efectos de activacin o represin cV
componentes de flujo ascendente hacia la poln:
sa de RNA. Probablemente es liberado cuande
_
polimerasa inicia la elongacin. Algunos fact:
de transcripcin influyen directamente en ella pa
interaccin con la polimerasa de RNA o el apari
basal, pero otros actan por modificacin de la
tructura de la cromatina (vase la seccin 30,3
remodelado de la cromatina es un proceso aa.
ggfl Algunas protenas de unin
con promotor corresponden
a represores
Concepto principal
.
La represin suele lograrse por afectacin de la
estructura de la cromatina, pero hay represores que
actan por unin con promotores especficos.
La represin de la transcripcin en eucariotai
logra en general en el mbito de influencia er
estructura de la cromatina; las protenas regu,;
ras que actan como represores bacteriano? :
actividad en configuracin trans para bloque; -
transcripcin son relativamente raras, pero su
nocen algunos ejemplos. Un caso es el del re-
sor global NC2/Drl/DRAPl, heterodmero q!
une con TBP para impedir su interaccin con otn
componentes del aparato basal. La importanc:
esta interaccin es sugerida por la letalidad di
648
CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
Un represor puede controlar la caja CAAT
Activa
E! complejo de transcripcin se ensambla en el testculo
{no se ilustran todos los componentes del aparato basal)
CAAT CAAT TATA Punto de inicio
Octmero Octmero
'
>
wwwv
Oct-1 CTF Oct-1
Inactiva
La CDP impide que otros factores se unan a la caja
CAAT y los factores bsales no pueden unirse
CDP CDP
Un complejo de transcripcin implica el reco-
-
ocimiento de varios elementos del promotor H2B del erizo
de mar en el testculo. La unin del factor de desplazamiento
1AAT en el embrin impide que el factor de unin CAT se una,
de manera que no puede formarse un complejo activo,
nutaciones nulas en los genes que codifican al re-
presor en levaduras. Los represores que as actan,
participan activamente en la inhibicin de la fun-
dn del aparato basal.
En un caso ms especfico, la secuencia CAAT
es diana de la regulacin. En el promotor de un gen
rara la histona H2B se encuentran dos copias de ese
elemento (vase Fig. 24.22), que se expresa slo du-
rante la espermatognesis del erizo de mar. Los fac-
tores de unin de CAAT pueden extraerse del tejido
sticular y tambin de tejidos embrionarios, pero
slo el del primero se puede unir a la caja CAAT. En
ios tejidos embrionarios, otra protena, llamada de
;
esplazamiento de CAAT (CDP), se une a las cajas
CAAT, evitando as, que el activador las reconozca.
En la FIGURA 25.10 se ilustran las consecuencias
de la expresin gentica. En los testculos, el promo-
"
r se une a los factores de transcripcin de la caja
TATA
, las cajas CAAT y las secuencias octamricas.
En tejidos embrionarios, la exclusin del factor de
Inin de CAAT desde el promotor evita el ensam-
::
aje de un complejo de transcripcin. La analoga
con el efecto de un represor bacteriano para impedir
d inicio por la polimerasa de RNA en el promotor
es obvia. Estos resultados tambin concuerdan con
el hecho de que no puede suponerse la funcin de
ma protena en la unin con un elemento promo-
:
conocido: puede ser un activador, un represor o
kiduso carecer de importancia para la transcripcin
le un gen.
Los elementos de respuesta
son reconocidos
por Los activadores
Conceptos principales
.
Los elementos de respuesta pueden localizarse en
promotores o potenciadores.
.
Cada elemento de respuesta es reconocido por un
activador especfico.
.
Un promotor puede tener muchos elementos de
respuesta que, a su vez, pueden activar la transcripcin
de manera independiente o en ciertas combinaciones.
El principio derivado de la caracterizacin de genes
controlados en comn es que comparten un elemento
promotor (o potenciador) reconocido por un activador. Un
elemento que hace que un gen responda a tal factor
se denomina elemento de respuesta, como el HSE
(elemento de respuesta al choque trmico); el
GRE (elemento de respuesta a glucocorticoi-
des), y el SER (elemento de respuesta srico).
Los elementos de respuesta contienen secuencias
de consenso cortas; las copias de los elementos de
respuesta encontrados en diferentes genes tienen
relacin estrecha, pero no necesariamente son idn-
ticas. La regin a la que se une el factor cubre una
distancia corta a un lado y otro de la secuencia de
consenso. En los promotores, los elementos no es-
tn presentes a distancias fijas respecto del punto
de inicio, en general se encuentran a <200 bp en
flujo ascendente respecto de l. La presencia de un
slo elemento suele ser suficiente para conferir la
respuesta reguladora, pero a veces se encuentran
varias copias.
Los elementos de respuesta pueden localizarse
en promotores o potenciadores. En general, algu-
nos tipos de elementos se encuentran en uno, ms
que en el otro; normalmente, un HSE se encuentra
en un promotor, en tanto un GRE se encuentra en
un potenciador. Se supone que todos elementos de
respuesta actan por el mismo principio general,
se requiere la unin de un activador al elemento
de respuesta para permitir a la polimerasa de RNA
iniciar la transcripcin. La diferencia respecto de
los activadores constitutivamente activos es que la
protena est disponible o est activa slo en deter-
minadas condiciones, las cuales determinan cundo
se va a expresar el gen.
Ejemplo de una circunstancia en que muchos
genes son controlados por un solo factor es la res-
puesta de choque trmico, comn a una amplia va-
riedad de procariotas y eucariotas, la cual implica
mltiples controles de la expresin gnica. Un au-
mento en la temperatura interrumpe la transcrip-
25.7 Los elementos de respuesta son reconocidos por los activadores
649
cin de algunos genes, activa la transcripcin de los
genes de choque trmico, y provoca cambios en
la produccin del RNAm. El control de los genes
de choque trmico ilustra las diferencias entre las
formas de control eucariticas y procariticas. En las
bacterias se sintetiza un nuevo factor sigma que diri-
ge a la holoenzima polimerasa de RNA a reconocer
una secuencia alterna -10 comn a los promotores
de genes de choque trmico (vase la seccin 11.16,
La sustitucin de los factores sigma puede controlar
el inicio). En las eucariotas, los genes de choque
trmico tambin poseen una secuencia de consenso
comn (HSE), pero se localiza en diversas posicio-
nes respecto del punto de inicio y es reconocida por
un activador independiente, el factor de transcrip-
cin de choque trmico (HSTF). La activacin de
este factor, por tanto, constituye un medio de inicio
de la transcripcin en el grupo especfico de -20
genes que la secuencia diana apropiada contiene
en su promotor.
Los genes de choque trmico de Drosophila me-
lanogaster contienen mltiples copias de HSE. El
HSTF se une de manera cooperativa con los ele-
mentos de respuesta adyacentes. Tanto HSE como
HSTF han sido conservado durante la evolucin y
es sorprendente cmo un gen de choque trmico
de D. melanogaster se pueda activar en especies tan
distantes como los mamferos o los erizos de mar.
Las protenas HSTF de la mosca de la fruta y las
levaduras parecen similares, y muestran el mismo
patrn vestigial del DNA que contiene secuencias
de HSE. El HST de levaduras se fosforila cuando las
clulas entran en choque trmico, modificacin que
se encarga de la activacin de la protena.
El gen de la metalotionena (MT) constituye un
ejemplo de cmo un solo gen puede ser regulado
por muchos circuitos diferentes. La protena meta-
lotionena protege a la clula de concentraciones
excesivas de metales pesados unindose con ;
eliminndolos de la clula. El gen se expresa en
grado basal, pero es inducido a niveles ms elev
de expresin por los iones de los metales pes
(como el cadmio) o por los glucocorticoides. L-
gin de control combina varios tipos de elemt
reguladores.
En la se resume la organiza
del promotor para un gen MT. Una caractet
importante de ese mapa es la elevada concentra
de elementos que pueden activar la transcrip.,
Las cajas TATA y GC estn en sus posiciones u
les, bastante cerca del punto de inicio. Para el g
basal de expresin tambin son necesarios los
elementos de nivel basal (BLE) que coinciden o
descripcin formal de potenciadores. Aunque k
zados cerca del punto de inicio, se pueden trasl.
a cualquiera otro sin perder su efecto; contiener
cuencias relacionadas con las encontradas en I
potenciadores y se unen a protenas que se fusk
con el potenciador SV40.
El elemento de respuesta TPA (TRE) es
secuencia de consenso presente en varios po
dadores, incluido un BLE de metalotionena I
repeticiones de 72 bp del virus SV40. El TRE :
un sitio de unin para el factor API, interaccin
forma parte del mecanismo para la expresin a
titutiva, de la que API es un activador. La ur
de API tambin tiene una segunda funcin, el
confiere una respuesta a los steres de forbol, I
el TPA (agente que promueve tumores), y esa
puesta es mediada por la interaccin de API
TRE. Esta reaccin de unin es una forma I
que no necesariamente la nica) de que los st
de forbol desencadenen una serie de cambios C
transcripcin.
La respuesta inductiva ante los metales es
ferida por secuencias mltiples del elemento de
T1.;H1,0:.::1;; Ul.l,.,-..n..:M.lM:, .....;..H.l.. ll..l.M-,..:.|..-..
Eiemanins respuesta
mre mre
GRE Caja-E BLE MRE TRE GC MRE TATA
-
260 -240 -220 -200 -180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0
Unin de proeha
Receptorde USF Ap2 MTF1 AP2 API SP1
esferoides
MTF1
BLE = elemento de grado basal
GRE = elemento de respuesta a glucocorticoides
MRE = elemento de respuesta a metales
TRE = elemento de respuesta a TPA
1 La regin reguladora del gen de metalotionena humano contiene elementos
reguladores en el promotor y el potenciador. El promotor tiene elementos para la induccin por
metales; un potenciador tiene un elemento de respuesta a los glucocorticoides. Los elementos
promotores se muestran arriba del mapa y abajo, las protenas que se unen a ellos.
650
CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
puesta a metales MRE, que actan como elementos
:
Dmotores. La presencia de un JVLRE confiere la
opacidad de responder ante un metal pesado, y con
l inclusin de varios elementos se logra un mayor
rado de induccin. El factor MTF1 se une con MRE
en respuesta a los iones metlicos.
La respuesta a las hormonas esteroides es re-
blada por un GRE localizado a 250 bp en flujo as-
:
rndente respecto del punto de inicio, que se com-
porta como potenciador. La delecin de esa regin
no afecta el grado basal de expresin o inducido por
rres metlicos
, pero es absolutamente necesaria
;
ra la respuesta a esteroides.
La regulacin de la metalotionena ilustra el
principio general de que cualquiera de los elementos
balizados en un potenciador o promotor puede activar
-
manera independiente al gen. La ausencia de un
emento necesario para un modo de activacin no
iecta la activacin en los otros modos. La diver-
-;
ad de elementos, su independencia de accin y
flexibilidad al parecer ilimitada de sus reestruc-
:
raciones relativas sugiere que es posible que un
:
ctor de unin con cualquier elemento aumente
.
c manera independiente la eficacia del inicio por
d aparato basal de transcripcin, probablemente en
rtud de una interaccin protena-protena que es-
oiliza la formacin de un complejo de inicio o lo
bcilita de alguna otra forma.
Hay muchos tipos de dominios
de unin con DNA
Conceptos principales
.
Los activadores se clasifican de acuerdo con el tipo de
unin con DNA.
.
Los miembros del mismo grupo tienen variaciones de
secuencia de un segmento especfico que les confieren
especificidad para sitios diana especficos.
B frecuente que un activador tenga una estructura
nodular en la cual diferentes dominios se encargan
:
la unin con DNA y la activacin de la transcrip-
son, y los factores suelen clasificarse de acuerdo
"
\ dicho tipo de dominio. En general, un segmen-
relativamente corto del mismo se encarga de la
lin con DNA:
.
El segmento dedo de zinc constituye un
dominio de unin con DNA que se detect
por primara vez en el factor TFmA, el cual
es necesario para que la polimerasa III de
RNA transcriba los genes de RNAr 5S. Desde
entonces, se ha identificado en otros fac-
tores de transcripcin (y supuestos factores
de transcripcin). Tambin se encuentra en
una forma diferente en el segmento de re-
ceptores de esteroides.
.
Los receptores de esteroides se definen
como grupo por una relacin funcional,
cada uno es activado por la unin con un
esferoide en particular. El receptor de gluco-
corticoides es el que ha sido analizado ms
a fondo. Adems de otros, como el de la
hormona tiroidea o el del cido retinoic,
los receptores de esteroides son miembros
de la superfamilia activada por ligandos, con
el mismo modo de accin general: el factor pro-
tenico est inactivo hasta que no se une con un
pequeo ligando.
.
El segmento hlice-giro-hlice se identi-
fic originalmente como dominio de unin
con DNA de los represores de fagos. Una
hlice a yace en el surco mayor del DNA y
la otra en ngulo, atravesndolo. Una for-
ma relativa del segmento est presente en el
homeodominio, secuencia caracterizada
por primera vez en varias protenas codifi-
cadas por genes encargados de la regulacin
del desarrollo en el gnero Drosophila, as
como en genes de factores de transcripcin
de mamferos.
.
El segmento anfiptico hlice-asa-hlice
(HLH) se identific en algunos regulado-
res del desarrollo y en genes que codifican
protenas eucariticas de unin con DNA.
Cada hlice antiptica presenta una cara de
molculas hidrfobas en un lado y cargadas
en el otro. La longitud del asa de conexin
vara de 12 a 28 aminocidos, segmento que
permite la dimerizacin de las protenas, y
una regin bsica cercana hace contacto con
el DNA.
.
Las cremalleras de leucina constan de
una cadena de aminocidos con una mo-
lcula de leucina en cada sptima posicin.
Una cremallera de leucina de un polipptido
interacta con la de otro polipptido para
formar un dmero. La cadena de molculas
con carga positiva adyacente a cada crema-
llera participa en la unin con DNA.
La actividad de un activador inducible puede ser
regulada en una de varias formas, como se ilustra
esquemticamente en la FIGURA 25.12;
.
Un factor es especfico de un tejido porque
se sintetiza en determinado tipo de clula,
lo cual es comn en los factores que regulan
el desarrollo, como las protenas de homeo-
dominio.
.
La actividad de un factor puede ser con-
trolada directamente por modificacin. El
25.8 Hay muchos tipos de dominios de unin con DNA
651
Los factores de transcripcin son activados en varias formas
Estado inactivo Mecanismo de activacinEstado activo
Sin protena Se sintetiza
la protena
Ejemplo
Homeo-
protelnas
Protena -
'
. I M
Protena inactiva i fosforilada
HSTF
v/ H \./ i/ v/ Protena - -
Protena inactiva
desfosforilada
Unin de
'~~~ '
'
-
ilmr
ligando
Protena inactiva
Receptores
de
esferoides
'
Liberacin
Protelna inactiva po
r el inhibidor
Inhibidor O
NF-k-B
Protelna inactiva Cambio de
Contraparte contraparte
Inactiva 'W
HLH
(MyoD/D)
Se libera el '=!=>'
factor activo
3
por escisin
Protena unida a membrana
Respuesta
de esteral
FIGURA 25.12 La actividad de un factor de transcripcin regulador
puede ser controlada por la sntesis de protenas, por modificacin cova-
lente de las protenas, unin de ligandos o por unin de inhibidores que
secuestran a La protena o afectan su capacidad de unin con el DNA.
contrapartes alternas se aparean,
mente las protenas HLH.
.
El factor puede ser fragmentado a {
un precursor inactivo. Se prodiicc o
vador como protena unida a la en
nuclear y el retculo endoplsmic
sencia de esterles (como el colestt:
que el dominio citoslico se fragrr.s
modo que se traslada al ncleo y con
la forma activa del activador.
A continuacin se analizan en detalle \
ciones de unin y activacin del DNA proB
por algunas de esas clases de protenas.
El. segmento dedo de zinc
un dominio de unin con
Conceptos principales
.
Un dedo de zinc es un asa de ~23 aminocidos I
sobresale de un sitio de unin de zinc formado p
aminocidos His y Cis.
.
Una protena con dedos de zinc suele tener vari:
.
La porcin C terminal de cada dedo forma un a li
que se une a un giro del surco mayor del DNA,
.
Algunas protenas de dedos de zinc se unen con
y no al DNA, o adems de al DNA.
r
HSTF se convierte a la forma activa por fos-
forilacin. La API (heterodmero entre las
subunidades Jun y Fes) se convierte a la for-
ma activa por fosforilacin de la subunidad
Jun.
.
Un factor es activado o desactivado por
unin con un ligando, como los receptores
de esferoides, que son ejemplos selectos. La
unin del ligando puede influir en la loca-
lizacin de la protena (que provoca el tras-
lado del citoplasma al ncleo), as como en
la determinacin de su capacidad de unin
con DNA.
.
La disponibilidad de un factor puede variar;
por ejemplo, el factor NF-kB (que activa los
genes k de inmunoglobulinas en los linfoci-
tos |3), presente en muchos tipos de clulas,
pero es secuestrado en el citoplasma por la
protena inhibidora I-kB. En los linfocitos
B
, el NF-kB es liberado de I-kB y se dirige
al ncleo, donde activa la transcripcin.
.
Un factor dimrico puede tener contrapartes
alternas, una de las cuales provoca su inac-
tividad; la sntesis de la contraparte activa
puede desplazar a la inactiva. Esas situacio-
nes se amplifican en mallas en que diversas
Los dedos de zinc reciben su nombre de la a
tura ilustrada en la FIGURA 25.13, en la que \
queo grupo de aminocidos conservados S
con un ion zinc para constituir un dominio i
pendiente en la protena. Dos tipos de proteo
unin con DNA tienen estructuras de ese tip
protenas de
"
dedos de zinc" usuales y los rece
de esferoides.
Una "protena de dedos" por lo gener
una serie de dichos dedos, como se muestra en
gura. La secuencia de consenso de un slo del
Cis-X
2.4
-
Cis-X
3
-Phe-X
5
-Leu-X
2
-His-X
3
-H
-
;
;
El segmento toma su nombre del asa de
nocidos que sobresale del sitio de unin cor.:
se denomina dedo Cis
2
/His
2
. El zinc se mantif:
una estructura tetradrica formada por las ir-
las de His y Cis conservadas; el dedo mismo t
de -23 aminocidos y el enlace entre dedo-
tener de siete a ocho.
Los dedos de zinc son segmentos comn
las protenas de unin con DNA que por lo a
se organizan como una serie nica de repetri
aunque a veces hay ms de una. La extensin
dedos va de nueve repeticiones, que ocupan ;
totalidad de la protena (como en TF
,
),
a m
652
CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
'
equeo dominio constituido por dos dedos (como
fD el regulador ADR1 del genero Drosophila). El ac-
.vador Spl tiene un dominio de unin con DNA
pe consta de tres dedos de zinc.
La estructura cristalina del DNA unido a una
protena con tres dedos sugiere la forma ilustrada
riquemticamente en la FIGURA 25.14. La parte ter-
minal C de cada dedo forma a hlices que se unen
;
:n el DNA, la parte terminal N forma una hoja j3.
Para simplificar, la hoja [3 y la localizacin del ion
de zinc no se muestran en la parte inferior de la
gura.) Las tres cadenas a-helicoidales se ajustan
m un giro del surco mayor; cada a-hlice (y, por
hnto, cada dedo) hace dos contactos especficos de
secuencia con el DNA (indicados por las flechas).
Se considera que los aminocidos no conservados
BD el sitio terminal C de cada dedo se encargan del
. rconocimiento de sitios diana especficos.
Sabiendo que los dedos de zinc se encuentran
en activadores autnticos que ayudan a las polime-
rasas de II y III de RNA, es posible analizar a las pro-
tenas de los dedos desde una perspectiva inversa.
Cuando se observa que una protena tiene varios de
:
>tos dedos, a primera vista hay cuando menos una
pzn para investigar su posible participacin como
factor de transcripcin. Ese tipo de identificacin
mugiere que varios loci implicados en el desarrollo
embrionario de D. melanogaster son reguladores de
la transcripcin.
Es necesario ser cauteloso en la interpretacin
le la presencia de (supuestos) dedos de zinc, espe-
::
almente cuando la protena contiene un segmento
de slo uno de ellos. Los dedos suelen participar
En la unin con RNA, ms que con DNA, o tal vez
ni siquiera tengan actividad de unin con cidos
-
.ucleicos. Por ejemplo, el prototipo de protena de
dedos de zinc, TF
ra
A
, se une tanto al gen 5S como
;
su producto, RNAr 5S. Un factor de inicio de la
aduccin, eIF2p, tiene un dedo de zinc, y las mu-
niciones en esa estructura influyen en el reconoci-
miento de los codones de inicio. Las protenas de la
:
pside retrovrica tienen un segmento relacionado
con el dedo, que podra participar en la unin con
"
NA vrico.
TfW Los receptores de esteroides
son activadores
Conceptos principales
.
Los receptores de esteroides son ejemplos de activado-
res de respuesta a ligandos que se activan por unin
con un esferoide (u otras molculas relacionadas).
.
Hay dominios separados de unin con DNA y de unin
con ligandos.
Los dedos de zinc se basan en Csl His Zn++
i
Zn++
.
:
Zn++ Zn++
Cis His Phe Leu
FIGURA 25.13 El factor de transcripcin SP1 tiene una serie
de tres dedos de zinc, cada uno con un patrn caracterstico de
molculas de cistena e histidina que constituyen el sitio de unin
del zinc.
El dedo de Zn es un segmento de unin con DNA
J
J
j
JO
Zn Zn Zn
.ir
fe*
Forma una Forma una
hoja (3 a-hlice
I
FIGURA 25.14 Los dedos de zinc pueden formar hlices alfa
que se insertan en el surco mayor, relacionado con las hojas
beta del otro lado.
Las hormonas esteroides se sintetizan en respuesta
a diversas actividades neuroendocrinas y ejercen
efectos importantes en el crecimiento, el desarrollo
de los tejidos y la homeostasia corporal en el mundo
animal. En la GURA 25.15 se clasifican los principa-
les grupos de esteroides y algunos otros compuestos
con actividades (moleculares) relacionadas.
25.10 Los receptores de esteroides son activadores
653
Una variedad de llgandos hidrfobos activa a los factore
de transcripcin
Cortlcoides (esteroides suprarrenales)
Los glucocorticoides aumentan Los mineralocorticoides
la glucemia y tambin tienen CH
2OH
mantienen el equilibrio de
accin antiintlamatoria I agua y sales
c=o
OH n OH OH
Cortisol
Hormonas esteroides sexuales
C = 0
Aldosterona
Los estrogenos participan
en el desarrollo sexual
femenino
P
-estradiol
Los androgenos son necesarios
para el desarrollo sexual ql, OH
masculino -
estosterona
Desarrollo y morfognesis
El cido retinoico es un morfgeno Para el desarrollo seo y el
metabolismo del calcio se CH3
requiere vitamina D I
ch2-CH2-CH2
_
CH
CH3CH3
Vitamina D3
Hormonas tiroideas
Las hormonas tiroideas regulan la tasa metablica basal
/ V '00H
7
-CH
2
-CH
NH
Triyodotironina (T3)
C-CH
3
C-CH
3
COOH
cido (trans) retinoico
Varios tipos de molculas hidrfobas pequeas activan
los factores de transcripcin.
La glndula suprarrenal secreta > 30 esteroi-
des, los dos grupos principales son glucocorticoides
y mineralocorticoides. Los esteroides proporcionan
las hormonas reproductivas (sexuales masculinas o
androgenos y sexuales femeninas o estrogenos). Se
requiere vitamina E para el desarrollo seo.
Otras hormonas que tienen estructuras y pro-
psitos fisiolgicos no relacionados funcionan en el
mbito molecular de manera similar a las hormonas
esteroides. Las hormonas tiroideas, que se basan en
formas yodadas de la tirosina, controlan la tasa me-
tablica basal en animales. Las hormonas esteroides
y tiroideas pueden tambin ser importantes para la
metamorfosis (los ecdiesteroides en insectos y las
hormonas tiroideas en ranas).
El cido retinoico (vitamina A) es un rv
geno encargado de la diferenciacin del eje
roposterior en la yema de extremidad del pe
desarrollo. Su metabolito, el cido 9-cis retino*
se encuentra en tejidos que son sitios imporWM
para el almacenamiento y metabolismo de le
mina A.
Se podran considerar esas diversas actividades - :
minos de vas para la regulacin para la expresin
Esos diversos compuestos comparten una forr
accin comn: cada uno es una pequea molcula
se une a un receptor especfico que activa la transe :.
gnica. (
"
Receptor" puede ser nombre equivoa ;
la protena es un receptor para la hormona es::
de o tiroidea en el mismo sentido que el reprci
Lac es un receptor de un [3-galactsido; es dec:
es receptor en el sentido de contener una prr ;:
unida a la membrana que se expone en la supe
celular.)
Los receptores para los diversos grupos de bo
monas esteroides, tiroideas y el cido retinoico 1
presentan una nueva "superfamilia
"
de regula
gnicos, los activadores de respuesta a ligande
dos los receptores tienen dominios independic
para la unin con DNA y a las hormonas que
en las mismas localizaciones relativas. Su orgar.
cin general se resume en la FIGURA 25.16.
La parte central de la protena es el dominio i
unin con DNA. Esa regin tiene relacin estn ;
con los diversos receptores de esteroides (desdi
par ms estrechamente relacionado, con iden!:;
de secuencia del 94%, hasta el par menos bien "
lacionado, con identidad de 42%). El acto de ir:
con DNA no puede desconectarse de la capacida -
activar la transcripcin, porque las mutaciones
ese dominio afectan ambas actividades.
Las regiones terminales N de los recept
muestran la ms baja conservacin de secuenc?
incluyen otras regiones necesarias para activa-
transcripcin.
Los dominios terminales C se unen a las horrn
as. Aquellos en la familia de receptores de estei
des muestran identidades que van desde 30 h;
57%, lo que refleja la especificidad para hormn
individuales. Sus relaciones con los otros red
tores son mnimas y reflejan la especificidad pa
una diversidad de respuestas, hormonas tiroid .
vitamina D, cido retinoico, y as sucesivameir
Este dominio tambin contiene los segmentos e
cargados de la dimerizacin y uno involucrado
la activacin de la transcripcin.
Algunos ligandos tienen mltiples recepto
con relacin estrecha, como los tres receptores
cido retinoico (RARa, (3, y y) y los tres recepte
del cido 9-r-retinoico (RXR a, (3, y y).
654 CAPTULO1' Activacin de la transcripcin
Los receptores que responden a ligandos comparten
rales
Unin de DNA y activacin de
la transcripcin (la identidad
vara de 94 a 42%)
Las regiones terminales Regiones de unin de hormonas
y dimerizacin (la identidad vara
de 57 a 15%)
N tienen <15% de
identidad (necesaria
para activar la
transcripcin)
94 57
90 55
76 50
52 30
47 17
42 <15
45 15
40 15
Glucocorticoides
Mineralocorticoides
Progesterona
Andrgenos
Estrgenos
Triyodotironina
Vitamina D
cido retinoico
cido 9-c/s retinoico
Aminocidos especficos controlan
la unin y el espaciado
i - Los receptores de muchas hormonas esteroides
Tiroideas tienen una organizacin similar, con una regin ter-
~:
na[ N individual, una regin de unin con DNA conservada y
ma regin terminal C de unin con hormonas. Las identidades
::n relativas a GR.
Los receptores de esteroides
tienen dedos de zinc
Conceptos principales
.
El dominio de unin con DNA de un receptor de
esteroides es un tipo de dedo de zinc que tiene la
porcin Cis, pero no la His.
.
Los receptores de glucocorticoides y estrgenos tienen
dos dedos de zinc cada uno, el primero de los cuales
determina la secuencia diana del DNA. Los receptores
de esteroides se unen con el DNA como dimeros.
.
Los receptores de esteroides se unen al DNA como
dimeros.
- >s receptores de esteroides (y algunas otras prote-
as) tienen un tipo de dedo de zinc diferente del de
ps,/His2 y su estructura se basa en una secuencia
n el consenso de unin de zinc:
Cis-X
2
-Cis-X
I3
-
Cis-X
2
-Cis
Estas secuencias se llaman dedos Cis
2
/Cis
2,
que
.;
elen no ser repetitivos, a diferencia de la repe-
rin seriada de los de tipo Cis
2
/His
2
.
Los sitios de
ftin con DNA (cuando se conocen) son cortos y
ilndromos.
Los receptores de glucocorticoides y estrgenos
rnen dos dedos cada uno, ambos con un tomo de
- nc en el centro de un tetraedro de cisternas. Los
- s dedos forman a-hlices que se pliegan juntas
Zn++ Zn++
Unin con DNA .
Espaciado
El primer dedo de un receptor de esteroides
regula qu secuencias se unen (las posiciones se muestran en
color prpura); el segundo dedo controla el espaciado entre las
secuencias (las posiciones se muestran en azul).
para formar un dominio globular grande. Los ani-
llos aromticos de dichas hlices y una hoja P que
conecta las dos hlices constituyen un sitio hidr-
fobo. Un lado de la hlice terminal N hace contacto
con el surco mayor del DNA, de tal forma que dos
receptores de glucocorticoides presentan dimeriza-
cin al unirse al DNA, y cada uno participa en un
giro sucesivo del surco mayor que se adapta a la
naturaleza palindrmica del elemento de respuesta
(vase la seccin 25.13, Los receptores de esteroides
reconocen elementos de respuesta por un cdigo
combinatorio).
Cada dedo controla una propiedad significativa
del receptor. En la URA se identifican los
aminocidos importantes; los del lado derecho del
primer dedo determinan la secuencia diana en el
DNA y los de la izquierda del segundo dedo contro-
lan el espaciado entre los sitios diana reconocidos
por cada subunidad en el dmero (vase la seccin
25.i3, Los receptores de esteroides reconocen ele-
mentos de respuesta por un cdigo combinatorio).
La prueba directa de que el primer dedo se une
con DNA se deriv de un experimento de
"
trueque
de especificidad" en el cual se detect el dedo del re-
ceptor de estrgenos y se sustituy con la secuencia
del receptor de glucocorticoides. La nueva protena
reconoca la secuencia GRE (diana usual del recep-
tor del glucocorticoides) y no ERE (diana usual del
receptor de estrgenos), de modo que esa regin
establece la especificidad para reconocer el DNA.
Las diferencias entre los dedos de los receptores
de glucocorticoides y estrgenos yacen sobre todo
en la base de esas estructuras; la sustitucin en dos
posiciones que se muestra en la permi-
te al receptor de glucocorticoides unirse a un ERE
y no a un GRE.
Los receptores de esteroides tienen dedos de zinc
655
Un trueq
e identifica a dos aminocidos
muy importantes
Misma secuencia en
ambos receptores
O Diferente secuencia en
cada receptor
c c
G > 0
c-
Especificidad Especificidad
GRE ERE
FIGURA 25.18 La discriminacin entre las secuencias diana
GRE y ERE depende de dos aminocidos de la base del primer
dedo de zinc del receptor.
Los ligandos activan a
de esferoides
Esferoide
Receptor
CITOPLASMA
NCLEO
Promotor GRE/potenciador
Activacin
Transcriiioiri
vwwv
5.
19 Los glucocorticoides regulan la transcripcin
gnica al hacer que su receptor se una a un potenciador, cuya
accin es necesaria para la correspondiente del promotor.
La unin con eL eLemento
de respuesta se activa
por La unin con Ligando
Concepto principal
.
La unin del ligando con el dominio C terminal
aumenta la afinidad del dominio de unin con DN- :
su sitio diana especifico en el DNA.
Se sabe mucho acerca de la interaccin de 1c; .
cocorticoides con su receptor, ilustrada en la I
25.1.. Una hormona esteroide puede pasar a tra- :
la membrana e ingresar a la clula por difusin sirnp
y ya dentro de la clula, un glucocoiticoide se un z i
receptor. (Los trabajos sobre el receptor de gluc :
ticoides se han basado en la dexametasona, horr
_
esteroide sinttica). No se ha denido la localiz; -
de los receptores libres, que podra estar en equr :
entre el ncleo y el citoplasma. No obstante, o:;:
la hormona se une con el receptor, la protena se ;
vierte a su forma activada, que tiene mayor afir
por el DNA, de manera que el complejo horr.; -
receptor siempre se localiza en el ncleo.
El receptor activado reconoce una secuenc;
consenso especfica que identifica al GRE, el :
suele localizarse en un potenciador que tal vez _
varios kb en ujo ascendente o descendente i
pecto del promotor. Cuando el complejo est::
de-receptor se une con el potenciador, se acti j
promotor cercano y ah empieza la transcripc;
La activacin del potenciador proporciona el m,
nismo general por el que los esferoides regula::
amplio conjunto de genes diana.
La regin terminal C regula la actividac
receptor de forma que vara respecto del receptor
dividual. Si el dominio terminal C del receptor de gi
cocorticoides presenta delecin, la protena termi
N restante se activa de forma constitutiva porque
requiere de esferoides para su actividad, lo cual
giere que sin stos, el dominio de unin de estero!"
evita que el receptor reconozca a GRE y acta 9
regulador interno negativo. La adicin de esteroi<
desactiva la inhibicin, dejando libre la capacidad
receptor de unirse a GRE y activar la transcripcin.
base para la represin podra ser interna, depender
interacciones con otra parte del receptor o tal vez
producto de una interaccin con alguna otra prote
que se desplaza cuando se une el esteroide.
La interaccin entre los dominios es difere
en el receptor de estrgenos; si el dominio de uri
con hormonas presenta delecin, la protena no
tivar la transcripcin aunque contina unind
a GRE, regin que, por lo tanto, es necesaria p
estimular la actividad ms que para reprimirla.
656 CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
Los receptores de esteroides
reconocen a Los elementos
de respuesta por un cdigo
combinatorio
El homodmero se une al palndromo cabeza con cabeza
TGTTCT 0_
4 bp AGAACA
ACAAGA TCTTGT
Conceptos principales
.
Un elemento de respuesta a esteroides consta de dos
sitios mitad cortos, palindrmicos o de repeticin
directa.
Hay slo dos tipos de sitios mitad.
.
Un receptor reconoce su elemento de respuesta por la
orientacin y el espaciamiento de los sitios mitad.
.
La secuencia de los sitios mitad es reconocida por el
primer dedo de zinc.
El segundo dedo de zinc se encarga de la dimerizacin,
que determina la distancia entre subunidades.
.
La separacin de las subunidades en el receptor
determina el reconocimiento del espaciado en el
elemento de respuesta.
Algunos receptores de esteroides actan como
homodmeros, en tanto que otros forman heterodmeros.
.
Los homodmeros reconocen elementos de respuesta
palindrmicos; los heterodmeros reconocen elementos
de respuesta de sitios mitad con repeticin directa.
Cada receptor reconoce a un elemento de respuesta
constituido por dos repeticiones cortas (o sitios mi-
tad), lo cual sugiere de inmediato que el receptor
se une como dmero, de modo que cada mitad de
la secuencia de consenso entra en contacto con una
subunidad (que recuerda la interaccin operador
X
-represor descrita en la seccin 14.11, El represor
utiliza un segmento hlice-giro-hlice para unirse
con el DNA).
Los sitios mitad pueden disponerse como es-
tructuras palndromas o repeticiones con la misma
orientacin; estn separados por 0 a 4 pares de ba-
ses cuya secuencia carece de importancia. Slo dos
tipos de sitio mitad son utilizados por los diversos
receptores, y su orientacin y espaciado determinan
qu receptor reconoce al elemento de respuesta, de
modo que los elementos de respuesta con secuen-
cias de consenso restringidas sern reconocidos es-
pecficamente por una variedad de receptores. Las
reglas que norman el reconocimiento no son abso-
lutas, podran modificarse por contexto, y tambin
hay casos en que los elementos de respuesta paln-
dromos son reconocidos de manera permisible por
ms de un receptor.
Los receptores pertenecen a dos grupos:
.
Los receptores de glucocorticoides (GR),
mineralocorticoides (MR), andrgenos (AR)
y progesterona (PR) forman homodmeros
Glucocorticoide (GR)
Mineralocorticoide (MR)
Andrgeno (AR)
Progesterona (PR)
FIGURA 'i 2f
Los elementos de respuesta formados en el
sitio mitad palindrmico TGTTCT son reconocidos por varios
receptores diferentes, dependiendo del espaciado entre los
sitios mitad.
El heterodimero se une a repeticiones directas
TGACCT n_c unTGACCT
ACTGGA AGTGGA
RXR
1 bp - RXR
3 bp - VDR
4 bp - T3R
5bp - RAR
Los elementos de respuesta con la repeticin
directa TGACCT son reconocidos por heterodmeros, de los cua-
les es miembro RXR.
y reconocen elementos de respuesta cuyos
sitios mitad tienen la secuencia de consen-
so TGTTCT; en la IGURA 25.20 se muestra
que se disponen de manera palindrmica
y que el espaciamiento entre ellos determi-
na el tipo de elemento. El receptor de estr-
genos (ER) acta de la misma forma, pero
tiene la secuencia TGACCT del sitio mitad.
El receptor del cido 9-ds-retinoico (RXR)
forma homodmeros y tambin heterodme-
ros con -15 receptores adicionales, incluido
el tiroideo (T3R), el de la vitamina D (VDR)
y el del cido retinoico (RAR). En la FIGURA
25.21 se muestra que los dmeros recono-
cen a los medios elementos con la secuencia
TGACCT; estos ltimos se disponen como
repeticiones directas y su reconocimiento
es controlado por el espaciado entre ellos.
Algunos de los receptores heterodimricos
se activan cuando el ligando se une a su
contraparte por RXR, en tanto que otros se
pueden activar por unin de ligandos, ya
sea a esta subunidad o a la subunidad RXR.
Esos receptores tambin pueden formar ho-
modmeros que reconocen secuencias pa-
lndromas.
25.13 Los receptores de esteroides reconocen a los elementos de respuesta por un cdigo combinatorio
657
Ahora ya es posible entender las bases de la
especificidad del reconocimiento. Recurdese que
la Figura 25.17 muestra cmo el reconocimiento
de la secuencia del sitio mitad es conferido por la
secuencia de los aminocidos en el primer dedo,
mientras que la especificidad para el espaciamiento
entre los sitios mitad reside en los aminocidos del
segundo dedo. La estructura del dmero determi-
na la distancia entre subunidades, que se establece
en giros sucesivos del surco mayor y as controla
la respuesta del espaciado de los sitios mitad. Las
posiciones exactas de las molculas encargadas de
la dimerizacin difieren de las combinaciones indi-
viduales pareadas,
Cmo activan la transcripcin los receptores
de esteroides? No actan directamente en el aparato
basal, ms bien a travs de un complejo activador.
El coactivador tiene varias actividades, entre otras,
el componente comn CBP/p300, una de cuyas
funciones es modificar la estructura de la cromatina
por acetilacin de histonas (vase la Fig. 30.14).
Todos los receptores de la superfamilia son ac-
tivadores de la transcripcin que dependen del li-
gando, pero algunos tambin pueden reprimir la
transcripcin. Los receptores TR y RAR se unen a
ciertos loci en forma de heterodmeros con RXR en
ausencia de un ligando y reprimen la transcripcin
mediante su capacidad de interaccin con una pro-
tena correpresora, que acta por el mecanismo in-
verso al usado por los coactivadores, es decir, inhibe
la funcin del aparato de transcripcin basa!
de cuyas acciones es la desacetilacin de his:
(vase la Fig. 30.16). Se desconoce la impon;
relativa de la actividad del represor frente a la ; -
vacin dependiente del ligando en la respuesta
siolgica a la hormona.
El efecto de la unin del ligando con el red
es la conversin de un complejo represor en
activador, como se muestra en la URA 25.2 .1
hay un ligando, el receptor se une a un com; .
correpresor; el componente del correpresor qu .
une con el receptor es SMRT y la unin del liga-
produce un cambio de conformacin que lo desph
za, lo cual permite que el coactivador se una.
H3ro Los homeodominios se uner
con dianas retacionadas
en eLDNA
Conceptos principales
.
EL homeodominio es un dominio de DNA de 60
aminocidos que tiene tres a-hlices.
.
EL C terminal del a-hlice 3 tiene 17 aminocidos .. a
une con el surco mayor del DNA.
.
El brazo N terminal del homeodominio se proyecta
hacia el surco menor del DNA.
.
Las protenas que contienen homeodominios puede-
corresponder a activadores o represores de la
transcripcin.
La represin prevalece en ausencia del ligando
Correpresor
SMRT
\ \>\>\>\>\/\>\
Receptor de esteroides
adena la activacin 14111.1 l.i.M.i'f
Coactivadores Aparato basa!
PCAF
CBP/p300
Ligando
Polimerasa de RNA
Los receptores de esteroides TR y RAR se unen
con el correpresor SMRT en ausencia de un ligando. El promotor
no se expresa. Cuando el SMRT es desplazado por la unin de
un Ligando, el receptor se une a un complejo coactivador, lo
cual conduce a la activacin de la transcripcin por el aparato
basal.
La homeocaja es una secuencia que codificj
dominio de 60 aminocidos en las protema- ;
muchos organismos eucariticos cuyo nomb.;
deriva de su identificacin original en los loci r.
meticos de Drosopha (cuyos genes determina i
identidad de las estructuras corporales). Se encuc-
tra en muchos de los genes que regulan el de
rrollo temprano en el gnero Drosopha, as c ~
en segmentos relacionados de genes de una an:;
variedad de eucariotas superiores. El homeodoir -
se encuentra en muchos genes encargados de k n
gulacin del desarrollo, y las secuencias relacin,- :
con l forman parte de varios tipos de factore. ;
transcripcin de animales.
En los genes hometicos del gnero Drosop,::
a menudo el homeodominio est cerca del extre::
terminal C. En la se resumen algur.
ejemplos de genes con homeocaja. Con IVcc,
ca, la conservacin de las secuencias en los ger:
es escasa, excepto en la homeocaja, en la cua! :
variable. Un grupo importante de genes del ge::.
ro Drosopha que la incluyen, tiene una secue- :
bien conservada, con similitudes del 80% al 9;
658 CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
tn comparaciones pareadas, mientras que en otros
'
.
as homeocajas tienen una relacin menos estrecha.
El homeodominio suele combinarse con otros seg-
mentos en factores de transcripcin animales,
como
en las protenas Oct (de unin de octmero),
donde
..na cadena conservada de 75 aminocidos, llamada
regin Pou, se localiza cerca de una regin que si-
mula el homeodominio. Las homeocajas del grupo
T
i ni de protenas cuya relacin es menos estrecha
con el grupo original constituyen la extensin ms
alejada de la familia.
El homeodominio se encarga de la unin con
-
NA y los experimentos de trueque de homeodo-
minios entre protenas sugieren que la especificidad
el reconocimiento del DNA yace en el homeodo-
minio, pero como con los represores de fagos,
no se
puede deducir un cdigo simple que relacione las
secuencias de protenas y el DNA. La regin termi-
lal C del homeodominio es homlogo al segmento
nlice-giro-hlice de los represores procaricos.
En
.
a seccin 14.11, El represor utiliza un segmento
hlice-giro-hlice para unirse al DNA, ya se hizo
referencia a que el represor 1 tiene una "hlice de
reconocimiento" (hlice a-3) que hace contacto en
el surco mayor del DNA, en tanto que otra (hlice
1
-2) yace en un ngulo que atraviesa el DNA.
El
nomeodominio puede organizarse en tres regiones
helicoidales potenciales; en la : se com-
paran las secuencias de los tres ejemplos; la parte
mejor conservada de la secuencia yace en la tercera
hlice. La diferencia entre dichas estructuras y las
iel represor procaritico se encuentra en la longitud
;
e la hlice que reconoce al DNA, hlice-3, que tie-
ne 17 aminocidos de longitud en el homeodominio
respecto de los nueve del represor X.
En la FIGURA 2 se representa esquemtica-
mente la estructura de la protena dentada del ho-
meodominio de D. melanogaster. La hlice 3 se une
en el surco mayor del DNA y establece el mayor
nmero de contactos entre la protena y el cido
nucleico, de los cuales, muchos de los que orientan
la hlice en el surco mayor son con la columna de
fosfatos, de manera que no son especficos para la
secuencia del DNA, sino que se encuentran sobre
todo en una cara de la doble hlice y flanquean las
bases con las que se hacen contactos especficos.
Los contactos restantes son del brazo terminal N del
homeodominio, secuencia inmediata a la primera
El homeodominio es un mdulo definido
Homeodominio
Antp
en
eve 400
Hox
Oct-1 Bi
.
763
Oct-2 S 467
Regin Pou
El homeodominio puede ser el nico segmento
de unin con DNA en un regulador transcripcional, o podra
combinarse con otros segmentos. Representa una parte bien
definida (60 molculas de la protena).
hlJi,.' M.JJiJ!IM, |l|!Tl.i.:,|i,l|i.H.J.i..|
1 Brazo N terminal 10 Hlice 1 20
En GluLisArpProArgTreoAia PheSerSerGIuGInLeuAla Arg Leu Lis .ArgGlu'F'ne Asn Glu
Antp Arg Lis ArgGli ArgGinTrsoTirTreoArg TirGInTreoLeuGlu'LeuGlu's GluP.
hf Hls Phe
Oct-2 ArgArciLsLis ArgTreoSerile GluTreoAsnVal ArgPheAla LeuGluUs Ser.Ph? Leu Ala
30 Hlice 2 40
En Asn ArgTirLeuTreoGluArgArgArgGluGlu Le-SerSerGIu LeviGli Leu
Antp Asn ArgTirLeuTreoArgArgArgArglie Glu lie AlaHIs Ala LeuCis Leu
Oct-2 AsnGluLisProTreoSerGIuGlulle LeuLeu
.Ue Ala Glu Gln Leu-lis Met
41 50 Hlices qq
En Asn Glu AlaGIn lie Lis lie TrpPheGInAsnLis ArgAla Lis lie Lis Lis Ser Asn
Antp TreoGluArgGIn lie Lis, lie TrpPheGlwAsnArgArgMetLis Trp'Lis Lis Glu Asn
Oct-2 Glu Lis GluVallle ArgVaiTrpPneCis AsnArgArgGIn s Glu Lis Arglle .As.n
.
-
.. El homeodominio de un gen del gnero/Anennopec/a representa el principal
grupo de genes con homeocajas en el gnero Drosophila; el dentado {en) representa otro tipo
de gen hometico, y el factor 0ct-2 de mamifero, a un grupo de factores de transcripcin con
relacin distante. El homeodominio se numera de manera convencional del 1 al 50
. Se inicia
con el brazo terminal N y las tres regiones helicoidales ocupan las posiciones 10-22, 28-38 y
42-58. Los aminocidos sealados en azul se conservan en las tres muestras
.
li.' .d Los homeodominios se unen con dianas relacionadas en el DNA 659
El homeodominio tiene tres hlices o
El brazo terminal N
yace en el surco menor
Las hlices 1 y 2 yacen sobre el DNA
\
37j
28 42
10
,
,
22
5
La hlice 3 yace en el surco mayor
FIGURA 25.25 La hlice 3 del homeodominio se une con el
surco mayor del DNA, con las hlices 1 y 2 fuera de la doble
hlice. La hlice 3 hace contacto con la columna de fosfatos
y las bases especficas. El brazo terminal N yace en el surco
menor y hace contactos adicionales.
hlice, y se proyecta hacia el surco menor. As, las
regiones terminal N y terminal C del homeodomi-
nio son las principales encargadas de hacer contacto
con el DNA.
Una demostracin sorprendente de la generali-
dad de este modelo se deriva de una comparacin de
la estructura cristalina del homeodominio de la pro-
tena dentada con la de la protena de apareamiento
a2 de las levaduras. El dominio de unin con DNA
de esta protena semeja un homeodominio, puede
formar tres hlices similares y su estructura en el
surco de DNA puede estar superpuesta casi exac-
tamente sobre la del homeodominio dentado. Esas
similitudes sugieren que todos los homeodominios
se unen con el DNA de la misma forma, lo cual
significa que el nmero relativamente pequeo de
molculas de la hlice-3 y el brazo terminal N se
encarga de la especificidad de los contactos con el
DNA.
Un grupo de protenas con un homeodominio
es el de las protenas Hox, que se unen con el DNA
con una especificidad de secuencia bastante baja y
han constituido un enigma en cuanto a su forma de
presentar diferentes especificidades; de ah se de-
riva que las protenas Hox a menudo se unen con
el DNA como heterodmeros con una contraparte
(llamada Exd en moscas y Pbx en los vertebrados).
El heterodmero tiene una especificidad ms restrin-
gida in vitro que una protena Hox, por lo general,
se une a la secuencia de 10 bp TGATNNATNN, pero
esto no basta para explicar las diferencias de especi-
ficidad de las protenas Hox. Una tercera protena,
Hth, necesaria para localizar a Exd en el ncleo,
tambin forma parte del complejo que se une con
DNA y puede restringir an ms los sitios de unin.
Las mismas contrapartes (Exd y Hth) estn pre:
tes con cada protena Hox en el complejo trim:
por lo que sigue siendo un enigma la forma en
se manifiesta la especificidad de cada una de a
Las protenas del homeodominio pueden o
tituir activadores o represores de la transcripc
pero la naturaleza del factor depende de otro u o
dominios, pues el homeodominio se encarga gm
la unin con DNA. El dominio activador o el re
sor actan ambos por influencia en el aparato b.
Los dominios activadores pueden interactuar
coactivadores, que a su vez se unen a los coa
nentes del aparato basal, en tanto que los domi
del represor tambin interactan con el apara:
transcripcin (esto es, no actan impidiendo e]
ceso al DNA como tal). El represor Eve, por ejern
interacta directamente con TF
n
D
.
EEfC Las protenas
hLice-asa-hlice interactuar
por vnculo combinatorio
Conceptos principales
.
Las protenas hlice-asa-hlice tienen un segmente
de 40 a 50 aminocidos que incluye dos a hlices
antipticas de 15 a 16 aminocidos, separados por.
asa.
.
Las hlices se encargan de la formacin de dmeros.
.
Las protenas bHLH tienen una secuencia bsica
adyacente al segmento HLH, que se encarga de la
unin con el DNA.
.
Las protenas de clase A bHLH son de expresin ubic
en tanto que Las de clase B bHLH son especficas de
tejido.
.
Una protena de clase B por lo general forma un
heterodmero con una protena de clase A.
.
Las protenas HLH que carecen de regin bsica
impiden que la contraparte bHLH de un heterodme-
se una con el DNA.
.
Las protenas HLH forman vnculos combinatorios qu
podran cambiar durante el desarrollo por la adicir
la eliminacin de protenas especficas.
Dos caractersticas comunes de las protena
unin con DNA son las regiones helicoidales
se unen con el DNA y la capacidad de dimeriza
de la protena, ambas representadas en el grup
protenas hlice-asa-hlice (HLH) que compa
un tipo de segmento de secuencia, una cadena I
a 50 aminocidos que contiene dos a hlices anl
ticas separadas por una regin de enlace (el asa
longitud variable. (Una hlice antiptica forma
caras, una que presenta aminocidos hidrfob
otra que presenta aminocidos cargados.) Las
560
CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
Las protenas HLH tienen dos regiones helicoidales
MyoD Ala Asp Arg Arg LisAla Ala Treo Met Arg Gin Arg Arg Arg Regin bsica
Id Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Gln Glu Qlu Val Asn Val Leu Seis molculas conservadas
estn ausentes de Id
MyoD Leu Ser Lis Val Asn Gln Ala Phe Gln Treo Leu Lis Arg Gis Treo Hlice 1
Id Leu Tir Asp Met Asn Gil Gis Tir Ser Arg Leu Lis Gln Leu Val Se encuentran molculas
conservadas tanto en Myod
como en Id
MyoD Lis Val Gln lie Leu Arg Asn Ala He Arg Tir lie Gln Gil Leu Glu Hlice 2
Id Lis Val Gln lie Leu Glu His Val lie Asp Tir lie Arg Asp Leu Glu
FIGURA 25.26 Todas Las protenas HLH tienen regiones que corresponden a Las hLices 1 y 2,
separadas por una asa de 10 a 24 aminocidos. Las protenas bsicas HLH tienen una regin
con cargas positivas conservadas, inmediatamente adyacentes a la hlice 1.
tenas de ese grupo forman homodmeros y hetero-
imeros mediante interacciones entre los fragmen-
los hidrfobos de la cara correspondiente de ambas
hlices. Las regiones helicoidales tienen de 15 a 16
aminocidos de longitud y cada una incluye varios
::
agmentos conservados. En la GURA 25. se com-
paran dos ejemplos. La capacidad de formar dme-
ros reside en estas hlices anfipcas y es comn a
:
odas las protenas HLH. El asa probablemente sea
suportante slo para dar libertad de interaccin in-
dependiente a dos regiones helicoidales.
Casi todas las protenas HLH contienen una
regin adyacente al segmento del mismo nombre
:
ue, en s, es altamente bsico, y se necesita para la
unin con DNA. Hay ~6 molculas conservadas en
una cadena de 15 aminocidos (vase la Fig. 25.26).
Los miembros del grupo que la tienen, se llaman
protenas bHLH. Un dmero en que ambas sub-
.midades tienen la regin bsica, puede unirse al
DNA. Los dominios HLH probablemente orientan
de manera correcta las dos regiones bsicas aporta-
das por las subunidades individuales.
Las protenas bHLH forman parte de dos grupos
generales. La clase A consta de protenas con ex-
presin ubicua, incluida la E12/E47 de mamfero,
en tanto que la B est formada por protenas que
se expresan en forma especfica de tejido, incluidas
MyoD, miogenina y Myf-5 de mamfero (grupo de
activadores que participa en la miognesis [forma-
cin de msculo]). Una forma de accin frecuente
de una protena bHLH especfica de tejido es formar
un heterodmero con una contraparte ubicua. Hay
"
.ambin un grupo de productos gnicos que espe-
pfican el desarrollo del sistema nervioso de D. me-
wtogaster (donde Ac-S es el componente especfico
de tejido y da el componente ubicuo). Las protenas
Myc (contraparte celular de productos oncogni-
cos que participan en la regulacin del crecimiento)
:
orman una clase aparte de protenas bHLH, cuyas
contrapartes y dianas son diferentes.
Los dmeros formados a partir de protenas
bHLH difieren en su capacidad de unin con el
DNA; por ejemplo, los homodmeros E47 y los hete-
rodmeros EI2-E47 y MyoD-E47 se forman eficaz-
mente y se unen con fuerza al DNA; E12 presenta
buena homodimerizacin, pero se une mal al DNA,
en tanto que MyoD apenas presenta homodimeri-
zacin. As, tanto la formacin de dmeros como
la unin con DNA pueden representar importan-
tes puntos reguladores. En ese contexto, es posible
definir grupos de protenas HLH cuyos miembros
forman diversas combinaciones pareadas, pero a
partir de las secuencias no es posible pronosticar la
fortaleza de la formacin de dmeros y de la unin
con DNA. En ese grupo, todos los dmeros que se
unen con el DNA reconocen la misma secuencia
de consenso, pero no se sabe an si diferentes ho-
modmeros y heterodmeros tienen preferencia por
sitios dianas ligeramente diversos relacionados con
sus funciones.
Las diferencias en el resultado de la unin con
el DNA dependen de las propiedades de la regin
del segmento HLH o cercana a sta; por ejemplo,
El2 difiere de E47 porque posee una regin inhibi-
dora muy cerca de la regin bsica, que impide que
el DNA se una a homodmeros. Algunas protenas
HLH carecen de la regin bsica, contienen molcu-
las de prolina, o ambos, lo cual parece modificar su
funcin. En la Figura 25.26 se muestra el ejemplo
de la protena Id, que tiene la misma capacidad de
formar dmeros que las protenas bHLH, pero un
dmero que contiene una subunidad de ese tipo ya
no puede unirse de manera especfica con el DNA,
lo cual constituye una demostracin convincente
de la importancia de la duplicacin del segmento de
unin con DNA en protenas de unin con DNA.
La importancia de la diferenciacin entre las
protenas HLH y bHLH no bsicas es sugerida por
las propiedades de dos pares de protenas HLH, el par
da-Ac-S/emc y el par MyoD/Id. En la FIGURA 25.27 se
25.15 Las protenas hlice-asa-hlice interactan por vnculo combinatorio
661
Las protenas HLH forman dos tipos de ciunems
Las protenas bHLH
presentan dimerizacin
y se unen con el DNA
HLH i
"
V
"
Regin bsica
MyoD/E12 /
o Ac-S/da
\/A/A/A/A//
Las protenas HLH no
bsicas Impiden la
unin con DNA
, A
J :
Sin regin bsica
A E12/ld
y o AC-S/emc
Y
Afinidad Insuficiente
para jnirse al DNA
Un dmero HLH donde ambas subunidades son
de tipo bHLH se puede unir al DNA, a diferencia de uno en que
una subunidad carece de regin bsica.
ilustra un modelo de sus fundones en la formacin
de una red regulatoria.
En D. melanogaster el gen eme (extramaeroehae-
tae) es necesario para establecer el patrn espacial
normal de los rganos sensoriales del adulto; acta
suprimiendo la funcin de varios genes, incluidos da
(sin hermana) y achaetescute (complejo Ac-S). Ac-S y
da son genes de tipo bHLH. El supresor eme codifica
una protena HLH que carece de la regin bsica,
y se supone que en ausencia de una funcin eme,
las protenas da y Ac-S forman dmeros que activan
la transcripcin de genes diana apropiados, pero la
produccin de la protena eme da lugar a la sntesis
de heterodmeros que no pueden unirse al DNA,
as que es necesaria la produccin de dicha protena
en las clulas apropiadas para suprimir la funcin
de Ac-S/da.
La formacin de clulas musculares es desen-
cadenada por un cambio en el programa de trans-
cripcin que requiere varias protenas bHLH, entre
otras, MyoD, la cual es producida especficamente
en clulas migenas, adems de que la sobreexpre-
sin en otras clulas puede inducirlas a iniciar un
programa miognico. El desencadenante de la di-
ferenciacin muscular es tal vez un heterodmero
constituido por MyoD-E12 o Myo-E47, ms que un
homodmero de MyoD. Antes de que se inicie la
miognesis, un miembro de tipo no bsico de HLH,
la protena Id, se puede unir a MyoD, El2, o am-
bas, y E47, para formar heterodmeros que no se
pueden unir al DNA; se une mejor a E12/E47 que
a MyoD y, por tanto, podra actuar por secuestro
de la contraparte bHLH ubicua. La sobreexpresin
de Id puede evitar la miognesis, de modo que su
eliminacin podra desencadenar la liberac:
MyoD para iniciar la miognesis.
Un activador de bHLH, como MyoD, pued z
trolarse en varias formas; se evita su unin ;
DNA cuando es secuestrado por una contr:
HLH, como Id y suele activar la transcripcin v :
a una contraparte bHLH, como E12 o E47. Tar
puede actuar como represor especfico de sitio m
a otra contraparte; la protena bHLH MyoR :
un dmero MyoD-MyoR en los mioblastos en
ceso de proliferacin, que reprime la transen- .
(en los mismos loci diana donde MyoD-EIl ;
activa la transcripcin).
El comportamiento de las protenas HLH_
tanto, ilustra dos principios generales de la r,
lacin de la transcripcin. Un pequeo mime-
protenas forma vnculos combinatorios. Las ;
binaciones particulares tienen funciones difer .
respecto de la unin con DNA y la reguladql
la transcripcin. La diferenciacin puede depe:-
de la presencia o eliminacin de contrapartes
ticulares.
Las cremalleras de leudna
participan en la formacin
de. dmeros
Conceptos principales
La cremallera de leucina es una hlice anfiptica que
presenta dimerizacin.
La cremallera es adyacente a una regin bsica que se
une con el DNA.
La dimerizacin forma el segmento bZIP donde se ure-
en forma simtrica dos regiones bsicas a repeticiones
invertidas del DNA.
Las interacciones entre protenas son un tenj
frecuente en la estructuracin de un complejo i
transcripcin, y un segmento que se encuentra .
varios activadores (y otras protenas) participa en\:
interacciones de homodmeros y heterodmeros. t
cremallera de leucina es una cadena de aminocic
rica en molculas de leucina que proporciona v
segmento de dimerizacin. La formacin del dmer
en s surgi como principio comn a la accin d
las protenas que reconocen secuencias especfia
de DNA, y en el caso de la cremallera de leucina,
s
relacin con la unin con DNA es particularmea
clara, porque se puede ver cmo la dimerizacin 5
yuxtapone a las regiones de unin con DNA de cad
subunidad. En la URA 25
.28 se presenta de mane:
esquemtica la reaccin.
En la estructura de una a hlice anfiptica, k
grupos hidrfobos (incluida la leucina) estn en I
662
CAPTULO ?') Activacin de la transcripcin
Las cremalleras de leucinas
ntan dimerza
Las leucinas de las caras hidrfobas
de las hlices interactan
48
La regin bsica La regin bsica
se une con DNA \ma nwa
Subunidad 1
se une con DNA
Subunidad 2
& f) @ @
ddo y los cargados en el otro. Una cremallera de
"
.encina forma una hlice antiptica en que las mo-
lculas de leucina de la cremallera de la protena po-
dran sobresalir del a hlice e interdigitarse con las
jucinas de la cremallera de otra protena en para-
elo, de modo de formar un asa ensortijada. Las dos
rlices dextrgiras se enredan una en torno a la otra
:
on 3.5 molculas por giro, de manera que el patrn
e repite integralmente cada siete molculas.
Cmo se relaciona esta estructura con la unin
con DNA? La regin adyacente a las leucinas repeti-
das es altamente bsica en cada una de las protenas
le cremallera y podra constituir un sitio de unin
ron DNA. De hecho, las dos cremalleras de leucina
forman una estructura en Y en la que las primeras
constituyen el tronco y las dos regiones bsicas se
adhieren para formar los brazos que se unen con
el DNA, lo cual se conoce como segmento estruc-
:
ural bZIP y explica porqu las secuencias diana
;ara tales protenas son repeticiones invertidas sin
-
eparacin.
Para fomentar la formacin de homodmeros
o heterodmeros se pueden usar cremalleras, son
egmentos largos. La leucina (u otro aminocido
hidrfobo) ocupa cada sptima posicin de la cre-
Tiallera potencial. Hay cuatro repeticiones en la cre-
nallera (Leu-X
6
) de la protena C/EBP (factor que
;
e une como dmero tanto a la caja CAAT como al
rotenciador central SV40) y cinco repeticiones en
Bs factores Jun y Pos (que forman un activador
.leterodimrico, API).
El API fue identificado por primera vez mer-
;ed a su unin con una secuencia de DNA en el
potenciador SV40 (vase la Fig. 24.24). La prepa-
racin activa de API incluye varios polipptidos.
Un componente importante es Jun, producto del
;
en c-jun, identificado por su relacin con el on-
:
ogn c-jun que porta el virus del sarcoma aviario.
El genoma del ratn contiene una familia de genes
relacionados, c-jun (aislado originalmente), junB y
junD (identificados por homologa de secuencias con
jun). Las tres protenas Jun muestran considerables
similitudes en su secuencia; tienen cremalleras de
lucina que pueden interactuar para formar homo-
imeros o heterodmeros.
El otro componente importante de API es el
producto de un gen adicional con una contrapar-
B oncognica. El gen c-fos es el homlogo celular
el oncogn v-fos que porta el virus del sarcoma
-Tiurino. La expresin de c-fos activa genes cuyos
promotores o potenciadores poseen un sitio diana
API y cuyo producto es una fosfoprotena nuclear
que pertenece a un grupo de protenas. Las otras
se describen como antgenos relacionados con Pos
FRA) y constituyen una familia de protenas simi-
lares a Pos,
FIGURA 25.. Las regiones bsicas del segmento bZIP se man-
tienen juntas por la dimerizacin de la regin en cremallera
adyacente cuando las caras hidrfobas de dos cremalleras de
Leucina interactan en orientacin paralela.
La protena Eos tambin tiene una cremallera de
leucina, no puede formar homodmeros, pero s un
heterodmero con Jun; para la reaccin se requiere
de una cremallera de leucina en cada protena. La
capacidad de formar dmeros es una parte crucial
de la interaccin de estos factores con el DNA, y
la protena Pos no puede en s unirse al DNA, tal
vez por su imposibilidad de formar un dmero. Sin
embargo, el heterodmero Jun-Fos puede unirse
al DNA con la misma especificidad de diana que
el dmero Jun-Jun, y ese heterodmero se une con
sitio API con una afinidad ~I0x respecto de la del
homodmero Jun.
Resumen
Los factores de transcripcin incluyen a bsales, acti-
vadores y coactivadores. Los factores bsales interac-
tan con la polimerasa de RNA en el punto de inicio;
los activadores se unen a elementos de respuesta
cortos especficos (Res) localizados en promotores
o potenciadores y los activadores actan mediante
interacciones protena-protena con el aparato basal,
Algunos activadores interactan directamente con el
aparato basal, en tanto que otros requieren de coac-
tivadores para mediar la interaccin. Los activadores
a menudo tienen una estructura modular con do-
minios independientes encargados de la unin con
DNA y la activacin de la transcripcin. La principal
fundn del dominio de unin con DNA puede ser
insertar el dominio activador cerca del complejo de
unin. Algunos elementos de respuesta estn pre-
sentes en muchos genes y son reconocidos por fac-
tores ubicuos, otros se encuentran en unos cuantos
25.17 Resumen 663
genes y son reconocidos por factores especficos de
tejidos.
Los promotores de la polimerasa de II de RNA
contienen una variedad de elementos de accin
cortos en configuracin cis, cada uno reconocido
por un factor de accin en configuracin trans. Los
elementos de accin en configuracin cis se locali-
zan en flujo ascendente respecto de la caja TATA
y pueden presentarse en cualquier orientacin y a
diferentes distancias respecto del punto de inicio.
Los elementos de flujo ascendente son reconocidos
por activadores que interactan con el complejo de
transcripcin basal para determinar la eficacia con
que se usa un promotor. Algunos activadores inter-
actan directamente con componentes del aparato
basal, y otros, a travs de un intermediario llamado
coactivador. Las dianas del aparato basal son TAF
de TF
jj
D
,
TF
n
B o TF
n
A
.
La interaccin estimula el
ensamblaje del aparato basal.
Otro segmento implicado en la unin con DNA
es el dedo de zinc, que se encuentra en protenas
que se unen con el DNA o el RNA (y en ocasiones
con ambos). Un dedo tiene molculas de cistena
que se unen con el zinc. Un tipo de dedo se encuen-
tra en repeticiones mltiples de algunos factores de
transcripcin, y el otro, en repeticiones nicas o
dobles de otros.
Se han identificado varios grupos de factores
de transcripcin por homologa de secuencias. El
homeodominio es una secuencia de 60 molculas
que se encuentra en genes que regulan el desarrollo
de insectos y gusanos, as como en factores de trans-
cripcin de mamferos; se relaciona con el segmento
procaritico hlice-giro-hlice y proporciona el seg-
mento por el que los factores se unen con el DNA.
La cremallera de leucina contiene una cadena
de aminocidos rica en leucina que participa en la
dimerizacin de los factores de transcripcin. Una
regin bsica adyacente se encarga de la unin con
DNA.
Los receptores de esteroides fueron los prime-
ros miembros identificados de un grupo de factores
de transcripcin en que la protena se activa por
unin con una pequea hormona hidrfoba. El fac-
tor activado se localiza en el ncleo y se une a su
elemento de respuesta especfico, donde activa la
transcripcin. El dominio de unin con DNA tiene
dedos de zinc. Los receptores son homodmeros o
heterodmeros. Los primeros reconocen todos los
elementos de respuesta palindrmicos con la mis-
ma secuencia de consenso; la diferencia entre los
elementos de respuesta es el espaciado de las re-
peticiones invertidas. Los heterodmeros reconocen
repeticiones directas, que se distinguen asimismo
por el espaciado entre repeticiones. El segmento
de unin con DNA de esos receptores incluye
dedos de zinc; el primero determina qu secue::
de consenso se reconoce y el segundo responde
espaciado entre las repeticiones.
Las protenas HLH (hlice-asa-hlice) tiea
hlices antipticas encargadas de la dimerizacir.
adyacentes a regiones bsicas que se unen cor
DNA. Las protenas bHLH tienen una regin b .
que se une con DNA y pertenecen a uno de :
grupos, de expresin ubicua y especficas de tejic
Una protena activa suele ser un heterodmero :
dos subunidades, una de cada grupo. Cuando
dmero tiene una subunidad sin regin bsica,
puede unirse al DNA, de manera que las subun
des pueden evitar la expresin gnica. Los vnci:
combinatorios de subunidades forman redes re;
ladoras.
Muchos factores de transcripcin actan cor
dmeros, y es frecuente que haya mltiples mi
bros de una familia que forman heterodmero
homodmeros, lo cual da lugar al potencial de
rigir la expresin gentica para las combinador
complejas. En algunos casos, una familia inch:
miembros inhibitorios, cuya participacin en la fe
macin de dmeros impide que su contraparte ac
la transcripcin.
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664 CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
25.5 Los activadores interactan con el aparato basaL
25.8
Hay muchos tipos de dominios de unin con DNA
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Las cremalleras de leucna participan en la forn
de dmeros
Artculo de revisin
Vinson, C. R., Sigler, P. B., and McKnight, S. L. (1989
Scissors-grip model for DNA recognition by a farml
leucine zipper proteins. Science 246, 911-916.
Artculo de investigacin
Landschulz, W. H., Johnson, P. F., and McKnight, S. L
(1988). The leucine zipper: a hypothetical structu;
common to a new class of DNA binding proteins.
Science 240, 1759-1764.
Las protenas hlice-asa-hlice interactan por
vnculo combinatorio
Artcub de revisin
Weintraub, H. (1991). The MyoD gene family: nodal point
during specification of the muscle cell lineage. Science
251, 761-766.
666
CAPTULO 25 Activacin de la transcripcin
Corte, empalme
y procesamiento del RNA
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
Las uniones de corte y empalme nucleares son
secuencias cortas
.
Los sitios de corte y empalme son las secuencias que
rodean inmediatamente los limites de exn-intrn. Se
nombran de acuerdo con sus posiciones respecto de intrn.
El sitio de corte y empalme 5' del extremo 5' (izquierdo) del
intrn incluye la secuencia de consenso GU.
El sitio de corte y empalme 3' est en el extremo 3'
(derecho) del intrn e incluye la secuencia de consenso AG.
"
La regla GU-AG (originalmente llamada regla GT-AG segn
la secuencia de DNA) describe la necesidad de esos
dinucletidos constantes en las dos primeras y las dos
ltimas posiciones de los intrones en los pre-RNAm.
Las uniones de corte y empalme se leen por pares
El corte y empalme depende slo del reconocimiento de
pares de uniones de corte y empalme.
Todos los sitios de corte y empalme 5' son funcionalmente
equivalentes, igual que los sitios de corte y empalme 3
'
.
El corte y empalme del pre-RNAm procede a travs
de un lazo
.
El corte y empalme requiere de los sitios 5' y 3' y de un sitio
de ramificacin justo en flujo ascendente respecto del 3'.
.
La secuencia de ramificacin se conserva en levaduras, pero
est menos bien conservada en eucariotas superiores.
.
Cuando el intrn se escinde en el sitio de corte y empalme
5
'
y este ltimo se une en la posicin 2' de una A, en el
sitio de ramificacin dentro del intrn, se forma un lazo.
.
El intrn se libera como lazo cuando se escinde en el
sitio de corte y empalme 3
'
; despus se juntan los exones
izquierdo y derecho.
.
Las reacciones ocurren por transesterificacin, donde un
enlace es transferido de una localizacin a otra.
Se requieren RNAsn para el corte y empalme
.
Los cinco RNAsn implicados en el corte y empalme son Ul,
U2, 5, U4 y U6.
.
Con algunas protenas adicionales, las RNPsn forman el
empalmosoma.
.
Todas las RNPsn, excepto U5, contienen una secuencia
conservada que se une a protenas Sm, reconocidas
por anticuerpos generados durante una enfermedad
autoinmunitaria.
La RNPsn Ul inicia el corte y empalme
.
La RNPsn Ul inicia el corte y empalme por unin con el
sitio 5
'
mediante una reaccin de apareo RNA-RNA.
.
El complejo E contiene RNPsn Ul unida al sitio 5', la
protena U2AF unida a una va de pirimidina entre el sitio
de ramificacin y el de corte y empalme 3', y protenas SR
que conectan la RNPsn Ul con la U2AF.
El complejo E puede formarse por definicin de
intrn o exn
.
La va directa de formacin de un complejo E es para RNPsn
Ul unirse al sitio de corte y empalme 5' y para U2AF,
unirse a una va de pirimidina entre el sitio de ramificacin
y el de corte y empalme 3
'
.
.
Otra posibilidad es que el complejo se forme entre U2 AF
en la va de pirimidina y RNPsn Ul en el sitio 5
'
de corte y
empalme de flujo descendente.
.
El complejo E se torna en A cuando la RNPsn U2 se une con
el sitio de ramificacin.
.
Si se forma un complejo E utilizando el sitio 5' de corte y
empalme de flujo descendente, ste es sustituido por el
correspondiente 5
'
de flujo ascendente cuando el complejo
E se convierte en el complejo A.
.
Los sitios de corte y empalme 3' dbiles pueden requerir
un potenciador de corte y empalme localizado en el exn
de flujo descendente para unirse directamente con las
protenas SR.
Cinco RNPsn forman el empalmosoma
.
La unin de las RNPsn U5 y U4/U6 convierte al complejo
A en el empalmosoma Bl, que contiene todos los
componentes necesarios para el corte y empalme.
.
El empalmosoma pasa a travs de una serie de complejos
adicionales conforme avanza el proceso.
.
La liberacin de la RNPsn Ul permite al RNAsn U6
interactuar con el sitio de corte y empalme 5' y convierte
al empalmosoma Bl en empalmosoma B2.
.
Cuando U4 se disocia de la RNPsn U5, este ltimo puede
aparearse con el RNAsn U2 para formar el sitio cataltico
activo.
Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza
diferentes RNPsn
.
Una va alterna de corte y empalme utiliza otro conjunto
de RNPsn que constituyen el empalmosoma U12.
Contina en la siguiente pgina
667
.
Los intrones diana se definen por secuencias de
consenso ms largas en las uniones de corte y
empalme, pero, en general, incluyen las mismas
uniones AU-AC.
.
Ciertos intrones tienen las uniones de corte y empalme
AU-AC, incluidos algunos dependientes de DI y otros,
de U12.
Winm EL corte y empalme est relacionado con la
exportacin del RNAm
.
Las protenas REF se unen a las uniones de corte y
empalme por un vnculo con el empalmosoma,
.
Despus del corte y empalme se mantienen adheridas
al RNA en la unin exn-exn.
.
Interactan con la protena de transporte TAP/Mex,
que exporta el RNA a travs de un poro nuclear.
waiii Los intrones del grupo II se cortan y
empalman a s mismos por La formacin de un
Lazo
Los intrones del grupo II se escinden por s mismos
del RNA mediante un proceso de corte y empalme
autocataltico.
Las uniones y el mecanismo de corte y empalme de
los intrones del grupo II son similares a los de los
intrones nucleares.
.
Un intrn del grupo II se pliega en una estructura
secundaria que genera un sitio cataltico que simula la
estructura del intrn nuclear U6-U2.
nmn EL proceso de corte y empalme alternativo
implica el uso diferencial de uniones de corte
y empalme
.
Los exones especificos pueden excluirse o incluirse en
el RNA producido mediante el uso, o no, de un par de
uniones de corte y empalme.
.
Los exones pueden extenderse cambiando una de
las uniones de corte y empalme para usar una unin
alternativa.
.
La determinacin del sexo en el gnero Drosophila
implica una serie de sucesos de corte y empalme
alternativos en genes que codifican productos
sucesivos de una via.
Los elementos P del gnero Drosophila muestran corte
y empalme alternos especficos de la linea germinal.
w
.hm Las reacciones de corte y empalme en
configuracin trans utilizan RNA pequeos
-.
Las reacciones de corte y empalme suelen ocurrir slo
entre uniones de corte y empalme en configuracin as
de la misma molcula de RNA.
.
En los tripanosomas y gusanos ocurren corte y
empalme en configuracin trans en el sitio en que una
secuencia corta (RNA SL) se empalma con los extremos
5
'
de muchos RNAm precursores.
. La estructura del RNA SL simula el sitio de unin
Sm de los RNAsn U y podra tener una participacin
anloga en la reaccin.
nmti El corte y empalme del RNAt en levaduras
implica escisin y reunin
.
El corte y empalme de RNAt se debe a reacciones
sucesivas de escisin y ligadura.
WiHia La endonucLeasa de corte y empalme reconoce
al RNAt
< Una endonucleasa escinde los precursores de RNAt en
ambos extremos del intrn.
. La endonucleasa de las levaduras es un
heterotetrmero con dos subunidades catalticas
(relacionadas).
.
Utiliza un mecanismo de medicin para determinar.:,
sitios de escisin por sus posiciones relativas resper
de un punto de la estructura del RNAt.
.
La nucleasa antigua tiene una estructura ms send._E
y reconoce segmentos estructurales de protuberanc:-
hlice-protuberancia en el sustrato.
Mima La escisin y Ligadura del RNAt son reacciona
separadas
.
La liberacin del intrn genera dos mitades de RNA:
que se unen para formar la estructura madura.
.
Las mitades tienen los extremos singulares 5' hidrc
y 2
'
-
3' fosfato ciclico.
.
El extremo 5'-0H es fosforilado por una cinasa de
polinucletidos; la fosfodiesterasa abre el grupo
fosfato cclico para producir un extremo 2' fosfato . .
-
grupo 3
'
-
0H; los extremos de los exones se unen p:-
accin de una ligasa de RNA y el 2
'
fosfato es retir;:
por una fosfatasa.
w
.hm La respuesta de La protena no plega
da tiere
relacin con el corte y empalme del RNAt
.
La Irelp es una protena interna de la membrana
nuclear con su dominio terminal-N en la luz del Ef
terminal-C en el ncleo.
.
La unin al dominio terminal-N de una protena
no plegada activa la nucleasa terminal-C por
autofosforilacin.
.
La nucleasa activada escinde al RNAm Hacl para
liberar un intrn y generar exones que se unen -pe
ligasa de RNAt.
. El RNAm Hacl escindido codifica un factor de trar.i'
criocin que activa genes codificadores de chape-:
oue ayudan a olegar las protenas no plegadas.
tiHIM Los extremos 3' de los productos de
transcripcin pol I y pol III se generan por I
terminacin
.
La polimerasa I de RNA termina la transcripcin cz'
una secuencia finalizadora de 18 bases.
.
La polimerasa III de RNA termina la transcripci- i'
secuencia poli (U)4 de una secuencia rica en G-C.
MKH Los extremos 3' del RNAm se generan por
escisin y poliadenilacin
.
La secuencia AAUAAA es una seal para la escisi;-
que genera un extremo 3
'
del RNAm poliadenilad.
.
La reaccin requiere de un complejo protenico c.
contiene un factor de especificidad, una endonuc
y una polimerasa poli(A).
El factor de especificidad y la endonucleasa esd-:r
el RNA en flujo descenoente respecto de AAUAA.
.
El factor de especificidad y la polimerasa poli(A)
agregan continuamente ~200 molculas de A al
extremo 3
'
.
.
En el gnero Xenopus, las secuencias ricas en A-U de s
cola 3
'
controlan la poliadenilacin o desadenilar:-
citoplasmtica curante el desarrollo embrionario.
wawii La escisin del extremo 3
'
del RNAm de
histonas puede requerir de un RNA peque-;
.
Los RNAm oe nistonas no estn poliadenilados; s.;
extremos 3
'
se generan por una reaccin de escisi*
que depende de la estructura del RNAm.
668 CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
.
La reaccin de escisin exige [a unin de SLBP a una
estructura de tallo-asa y que se aparee el RNAsn U7
con una regin adyacente monocatenaria.
BHI La produccin de RNAr requiere de sucesos de
escisin
.
El RNAr grande y el pequeo se liberan por escisin a
partir de un RNA precursor comn.
rom Se requieren RNA pequeos para el
procesamiento del RNAr
.
Para modificar la posicin 2' de la ribosa con un grupo
metilo se requiere del grupo C/D de RNAsno.
Para convertir la uridina en seudouridina se necesita el
grupo H/ACA de RNAsno.
Para generar una estructura usual, sustrato de la
modificacin, en todos los casos, la base del RNAsno
se aparea con una secuencia de RNAr que contiene la
base diana.
wawtl Resumen
CTl Introduccin
Todas las clases de organismos tienen genes inte-
rrumpidos, los cuales representan un porcentaje
menor de los genes de las eucariotas inferiores, pero
m mayor parte de los genes de genomas de euca-
otas superiores. Los genes varan ampliamente en
funcin del nmero y la longitud de los intrones,
pero un gen tpico de mamfero tiene de siete a ocho
exones dispersos en -16 kb. Los exones son relati-
vamente cortos (-100 a 200 bp) y los intrones,
re-
lativamente largos (>1 kb) (vase la seccin 3.6, Los
genes muestran una amplia variedad de tamaos).
La discrepancia entre la organizacin ininte-
rrumpida de un gen y aquella no interrumpida de
su RNAm requiere del procesamiento del produc-
to primario de transcripcin, el cual tiene la mis-
ma organizacin que el gen y suele denominarse
preRNAm. La eliminacin de los intrones del pre
RNAm deja un mensajero usual de -2.2 kb median-
te un denominado corte y empalme del RNA.
La eliminacin de los intrones constituye una parte
importante de la produccin del RNA en todas las
iucariotas. (Aunque los genes interrumpidos son
ielativamente raros en las eucariotas inferiores
,
lomo las levaduras, en el porcentaje global se sub-
estima la importancia de los intrones, pues la mayor
parte de los genes interrumpidos codifica protenas
relativamente abundantes. El corte y empalme, por
tanto, participa en la produccin de un mayor por-
centaje total del RNAm del que sera aparente al
analizar el genoma, tal vez hasta el 50%.)
Una de las primeras claves sobre la naturaleza
lie la discrepancia de tamao entre los genes nuclea-
res y sus productos en eucariotas superiores provie-
ne de las propiedades del RNA nuclear. Su tamao
promedio es mucho mayor que el de RNAm, es muy
inestable y la complejidad de su secuencia es mucho
mayor. Dada su amplia distribucin, se le denomin
RNA nuclear heterogneo (RNAhn), e incluye
al pre-RNAm, pero podra tambin abarcar otros
productos de la transcripcin (esto es, aquellos que
El RNPhn se organiza en partculas de 40S
RNPhn.:
200 40S
RNA de 500-800 bases
Protenas medulares (-30-40 kD)

Al A2 B1 B2 C1 C2
FIGURA 26.1 El RNAhn es una partcula de ribonucleoprotena
organizada como una serie de cuentas.
finalmente no llegan a RNAm durante el procesa-
miento).
La forma fsica del RNAhn es de ribonucleopro-
tena (RNPhn), donde el RNAhn est unido a pro-
tenas. Segn se caracteriz in vitro, una partcula
de RNPhn asume la forma de cuentas conectadas
por un hilo, estructura que se resume en la FIGURA
26.1. Las protenas ms abundantes de la partcu-
la son protenas nucleares, pero hay otras con una
estequiometra menor que constituyen un total de
-
20. Por lo general, las protenas estn presentes
en ~10s copias por ncleo, respecto del ~106 del
RNAhn. En algunos casos su participacin puede ser
estructural en el empaquetado del RNAhn, y se sabe
que varias viajan entre el ncleo y el citoplasma y
participan en la exportacin del RNA o controlan
su actividad.
El corte y empalme ocurre en el ncleo, aunado
a otras modificaciones que experimentan los RNA
recin sintetizados. En la FIGURA 26.2 se revisa el
proceso de expresin de un gen interrumpido. El
producto de la transcripcin tiene un capuchn en
el extremo 5
'
(vase la seccin 7.9, El extremo 5' del
RNAm eucaritico tiene capuchn),
ha sido motivo
de eliminacin de intrones y est poliadenilado en
26.1 Introduccin 669
El RNAm eucari
Exn 1 Intrn 1 Exn 2 Intrn 2 Exon 3 Intrn 3 Exn 4 Intrn 4 Exn 5
Transcripcin
Capuchn del extremo 5'
Poli(A) del extremo 3'
Modificacin terminal V.
XA
20o
Corte y empalme
Exn Intrn Exn
Se rompen las uniones exn-intrn
I
Se unen los exones
i
Tranaporte
200 NCLEO
Traduccin
CITOPLASMA
Apnn
FIGURA 2t: El RNA se modifica en el ncleo por adiciones al extremo
5'
y al 3
'
y por corte y empalme para eliminar los intrones. El suceso
de corte y empalme implica la rotura de las uniones exn-intrn y la
reunin de los extremos de los exones. El RNAm maduro se transporta a
travs de poros nucleares hacia el citoplasma, donde se traduce.
el extremo 3
'
(vase la seccin 7.10, El extremo 3'
est poliadenilado). El RNA se transporta entonces
a travs de los poros nucleares hacia el citoplasma,
donde se encuentra disponible para su traduccin.
Respecto de las diversas reacciones de procesa-
miento que ocurren en el ncleo, debera saberse
en qu punto ocurre el corte y empalme ante las
otras modificaciones del RNA, en una localizacin
especfica del ncleo y se conectan con otros suce-
sos, como el transporte del ncleo al citoplasma?
Qu importancia tiene en la expresin de los genes
interrumpidos el que no se produzca?
Respecto de la reaccin de corte y empalme en
s, uno de los principales enigmas es cmo se contro-
la su especificidad. Qu asegura que los extremos
de cada intrn se reconozcan en pares, de manera
que se retire la secuencia correcta del RNA? Se
escinden los intrones de un precursor en un orden
en particular? Se utiliza la maduracin del RNA
para regular la expresin gnica por discriminacin
entre los precursores disponibles o por cambio del
patrn de corte y empalme?
Se pueden identificar varios tipos de sistemas
de corte y empalme:
.
Los intrones se retiran del preRNAm de las
eucariotas superiores por un sistema que re-
conoce slo secuencias de consenso con
conservadas en los lmites exn-intrn
interior del intrn. Esa reaccin requiere
un gran aparato de corte y empalme q
asume la forma de un arreglo de protei
y ribonucleoprotenas y que acta como'
gran complejo particulado (empalmosoa
El mecanismo de corte y empalme impi
transesterificacin, adems de que el cea
cataltico incluye el RNA y protenas.
Ciertos RNA tienen la capacidad de esdn
sus intrones de manera autnoma, los a
les forman dos grupos, segn su estrucn
secundaria o terciaria; ambos usan reacc
nes de transesterificacin en que el Rsa
el agente cataltico (vase Captulo 2
"
RNA cataltico).
La eliminacin de intrones de los prea
sores RNAt nucleares de levaduras imp)
actividades enzimticas que manejan e s
trato en forma similar a la de las enzimasi
procesamiento del RNAt, en cuyo caso, u
caracterstica crtica es la conformacin i
precursor del RNAt. Estas reacciones de c
te y empalme son catalizadas por enzir
que dan lugar a escisin y ligadura.
Las uniones de corte
y empalme nucleares
son secuencias cortas
Conceptos principales
.
Los sitios de corte y empalme son las secuencias qL
rodean inmediatamente los lmites de exn-intrn. S
nombran de acuerdo con sus posiciones respecto de.
intrn.
.
El sitio de corte y empalme 5' del extremo 5' (izquig--
do) del intrn incluye La secuencia de consenso GU.
.
El sitio de corte y empalme 3' est en el extremo 3'
(derecho) del intrn e incluye La secuencia de conse- .
AG.
.
La regla GU-AG (originalmente Llamada regla GT-AG -i-
gn la secuencia de DNA) describe la necesidad de r
dinucletidos constantes en Las dos primeras y las dos
ltimas posiciones de Los intrones en los pre-RNAm.
Para centrarse en los sucesos moleculares imiic.|
dos en el corte y empalme de los intrones nudeaBrJ
se debe considerar la naturaleza de los sitios dr
corte y empalme, los dos lmites exn-intrn,<|bc
incluyen los sitios de escisin y nueva unin.
Si se compara la secuencia nucleotdica dd
RNAm con la del gen estructural, las uniones eoor
exones e intrones pueden ser asignadas. Losck
670
CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
Los lmites intron-xn tienen secuencias de consenso cortas en el intrn
Sitio izquierdo (5') Sitio derecho (3')
Exn A 4G73Gioo
U
ioo
A
62
A
68
G 12PyN C
65
A
100
G
100
Exn N
Intrn
Los extremos de los intrones nucleares se definen por la regla GU-AG.
ixiremos de un intrn no son homlogos ni amplia-
m
ente complementarios, las uniones, sin embargo,
Denen secuencias de consenso bien conservadas,
iunque bastante cortas.
Es posible asignar un extremo especfico a cada
ntrn, dependiendo de la conservacin de las unio-
nes exn-intrn, que pueden ser alineadas para
:
'
instituir la secuencia de consenso que se incluye
tn la FIGURA 26.3.
Los subndices indican el porcentaje de aparicin
Je la base especfica en cada posicin de consenso;
.3 conservacin es elevada slo inmediatamente dentro
intrn en las supuestas imiones, de modo que la
iecuencia de un intrn genrico se identifica como:
GU. .
AG
El intrn definido de esta manera se inicia con
i dinucletido GU y termina con el AG, de modo
je a menudo se dice que las uniones cumplen con
regla GT-AG (lo cual refleja el hecho de que las
secuencias se analizaron originalmente en funcin
le DNA, pero, obviamente, el GT de la secuencia
de codificacin del DNA se convierte en GU en el
fcsTA).
Ntese que ambos sitios tienen diferentes se-
raencias, por tanto, definen los extremos de un in-
"
rn de manera direccional. Se nombran de izquierda
;
derecha, a lo largo del intrn, como sitio de corte y
rmpalme 5
'
(a veces llamado sitio izquierdo o dona-
dor) y sitio de corte y empalme 3' (tambin llamado
?;tio derecho o aceptor). Las secuencias de consenso
s; sealan como sitios reconocidos por mutaciones
puntiformes en el corte y empalme, que in vivo e in
itro
, impiden dicho corte y empalme.
Las uniones de corte
y empalme se Leen por pares
Conceptos principales
El corte y empalme dependen slo del reconocimiento
de pares de uniones de corte y empalme.
Todos los sitios de corte y empalme 5' son
funcionalmente equivalentes as como los sitios
de corte y empalme 3'.
Un RNAm tpico de mamfero tiene muchos intro-
nes. El problema bsico del corte y empalme del pre
RNAm resulta de la sencillez de los sitios respectivos
y se ilustra en la FIGURA 26. : Qu garantiza que se
corten y se empalmen los pares de sitios correctos?
Los pares GU-AG correspondientes deben recorrer
grandes distancias (algunos intrones tienen >10 kb
de longitud), de modo que es posible imaginar dos
tipos de principio que podran encargarse del apa-
reamiento de los sitios 5
'
y 3' apropiados:
.
Tal vez sea una propiedad intrnseca del RNA
conectar los sitios en los extremos de un in-
trn en particular, lo cual implicara aparear
secuencias o estructuras especficas.
.
Podra ser que todos los sitios 5' fuesen
equivalentes desde el punto de vista fun-
cional, y todos los 3
'
, indistinguibles, pero
el corte y empalme podra seguir reglas que
garanticen que el sitio 5
'
siempre se conecte
con el siguiente sitio 3
'
del RNA.
Los sitios de corte y empalme y las regiones cir-
cundantes no tienen secuencias complementarias,
lo cual descarta modelos de apareamiento de bases
complementarias entre los extremos de los intrones.
El corte y empalme correcto elimina tres intrones por
reconocimiento de pares de las uniones
El apareamiento de uniones equivocadas eliminara los exones
wr lili mi
GU AG. GU
AG GU AGC=
Las uniones de corte y empalme se reconocen slo en las
combinaciones de pares correctas.
26.3 Las uniones de corte y empalme se leen por pares
6711
Los experimentos con precursores de RNA hbridos
muestran que cualquier sitio de corte y empalme
5'
puede, en principio, conectarse con uno 3
'
. Por
ejemplo, cuando el primer exn de una unidad de
transcripcin temprana de SV40 se enlaza con el
tercer exn de la P-globina de ratn, se puede ex-
tirpar el intrn hbrido para generar una conexin
perfecta entre el exn de SV40 y el de P-globina.
De hecho, esa posibilidad de intercambio es la base
de la tcnica de atrapamiento de exones descrita
antes, en la Figura 4.11. Tales experimentos ponen
en claro dos puntos generales:
.
Los sitios de corte y empalme son genricos; no
presentan especificidad por precursores in-
dividuales de RNA, y los precursores indivi-
duales no confieren informaciq'n especfica
(como la estructura secundaria) indispensa-
ble para el corte y empalme,
.
El aparato de corte y empalme no es especfico de
un tejido; en general, cualquier clula puede
escindir y empalmar un RNA apropiada-
mente, sea o no sintetizado normalmente
por ella. (En la seccin 26.12, El corte y
empalme alternativos implican el uso dife-
rencial de uniones de corte y empalme, se
analizan excepciones en que hay patrones
alternativos de corte y empalme especficos
de tejidos.)
He aqu una paradoja. Es posible que todos los
sitios de corte y empalme 5
'
parezcan similares al
aparato de corte y empalme, lo mismo que todos los
sitios de corte y empalme 3
'
. En principio, cualquier
sitio de corte y empalme 5
'
puede reaccionar con cual-
quier sitio de corte y empalme 3
'
, pero en circunstancias
normales, el corte y empalme ocurre slo entre los
sitios 5
'
y 3' del mismo intrn. Qu reglas aseguran
que el reconocimiento de sitios de corte y empalme se res-
trinja de manera que slo los sitios 5' y 3' del mismo
intrn se corten y empalmen?
Se retiran los intrones en un orden especfi-
co de un RNA en particular? Mediante pruebas de
manchado de RNA se pueden identificar RNA nu-
cleares que representan productos intermedios de
los que se han eliminado algunos intrones. En la
se muestra una mancha de los precur-
sores del RNAm ovomucoide. Hay una serie bien
definida de bandas que sugiere que el corte y em-
palme ocurre por vas determinadas (si se retiraran
los siete intrones de manera totalmente aleatoria,
habra ms de 300 precursores con diferentes com-
binaciones de intrones y no se veran bandas bien
definidas).
No parece haber una va nica, pues se pue-
den encontrar productos intermedios donde se han
retirado combinaciones diversas de intrones. No
obstante, hay pruebas de la presencia de una o va-
El procesamiento del RNAm es ordenado
1 2 3 m4 mi 5 6 71
i
RNAm = 1.1 kb
Producto primario de
transcripcin (5.5 kb)
i
Carece de intrones 5 y 6
1
Carece de intrones 4, 5, 6 y 7
.
Contiene sio el intrn 3
i
RNAm (1.1 kb)
26.5 Estudio Northern del RNA nuclear con una so
ovomucoide que identifica precursores definidos del RNAm,
indican los contenidos de las bandas ms prominentes. Ima
cortesa de Bert W. O
'
Malley, Baylor College of Medicine. *
rias vas preferidas. Cuando slo se ha perdido
intrn, esto ocurre prcticamente siempre en e
o 6, cualquiera puede ser el que se pierda prime
Una vez que se han perdido los dos intrones, ;
6
, vuelven a ser los ms frecuentes, pero hay o:
combinaciones. El intrn 3 nunca (o cuando me$
muy rara vez) se pierde en uno de los primeros t
pasos del corte y empalme. A partir de ese patr
se observa que hay una va preferida por la que
eliminan los intrones en el orden 5/6, 7/4, 2/1
pero hay otras, puesto que (por ejemplo) en algur
molculas el ltimo intrn en perderse es 4 i
con la salvedad de que en la interpretacin de es
resultados no se cuenta con pruebas de que to:
esos productos intermedios en realidad conduz;
a un RNAm maduro.
La conclusin general sugerida por este anli
es que la confirmacin del RNA influye en la acc
bil dad de los sitios de corte y empalme. Conforme
retiran intrones especficos, la conformacin carr.
y se dispone de nuevos pares de sitios de corte y e:
672
CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
palme. Sin embargo, la capacidad del precursor para
cfiminar sus intrones en ms de un orden sugiere
e se dispone de conformaciones alternas en cada
z;apa. Por supuesto, mientras mayor sea la molcu-
la, ms opciones estructurales brindar, y cuando se
ronsideran genes ms grandes, se dificulta ver qu
in especficamente podran controlar la reaccin
s estructuras secundarias. Una conclusin impor-
ante de este anlisis es que la reaccin no avanza
::
uencialmente a lo largo del precursor.
Un modelo sencillo para controlar el reconoci-
miento de los sitios de corte y empalme sera que
d aparato respectivo actuase de manera progresiva.
Habiendo reconocido un sitio 5'
, podra recorrer el
I NA en la direccin apropiada hasta encontrar el si-
raiente sitio 3
'
, lo cual restringira el corte y empalme
i sitios adyacentes. Ese modelo,
no obstante, ha sido
descartado por experimentos que muestran que el
:
wte y empalme pueden ocurrir en configuracin
wans, en circunstancias especiales, como la reaccin
ntermolecular (vase la seccin 26.13, Las reaccio-
nes de corte y empalme en configuracin trans utili-
zan RNA pequeos),
o en molculas de RNA donde
arte de la cadena nucleotdica es sustituida por un
tnlazador qumico; esto significa que no puede exi-
grse un rastreo estricto a lo largo del RNA desde el
irio de corte y empalme 5
'
hasta el 3' correspon-
diente. Otro problema con el modelo de rastreo es
;ue no explica la existencia de patrones de corte y
rmpalme alternativos, donde (por ejemplo), un sitio
:
mn 5' se empalme con ms de un sitio 3'. La base
para el reconocimiento apropiado de los pares de si-
tios de corte y empalme correctos sigue sin definirse
nalmente.
El corte y empalme
del pre-RNAm procede
a travs de un lazo
El corte y empalme procede a travs de un lazo
Cqnceptos principales
El corte y empalme requiere de los sitios 5' y 3' y de un
sitio de ramificacin justo en flujo ascendente respecto
del 3'.
La secuencia de ramificacin se conserva en levaduras,
pero est menos bien conservada en eucariotas
superiores.
Cuando el intrn se escinde en el sitio de corte y
empalme 5
'
y este ltimo se une en la posicin 2' de
una A, en el sitio de ramificacin dentro del intrn, se
forma un lazo.
El intrn se libera como lazo cuando se escinde en
el sitio de corte y empalme 3
'
; despus se juntan los
exones izquierdo y derecho.
Las reacciones ocurren por transesterificacin, donde
un enlace es transferido de una localizacin a otra.
5
'
Sitio 5' Sitio 3'
3
'
GU UACUAAC AG
PY
aO N PySO
PV
ST
PU
75 A Py
95
Consenso animal
Corte en ei sitio 5' y formacin de un lazo por enlace
15'-2' que conecta el intrn 5'-G con el lugar 2' de A en
el sitio de ramificacin
5
'
3
' 5
'
UACUAACAG
2
'
:3
'
Corte en el sitio 3' y unin de exones; el Intrn se
libera como lazo
U
5
'
G
5
'
3
'
UACUAACAG
2
'
3
'
I
5
'
3
'
Desramificacin del intrn
5'GU
UACUAACAG 3'
FIGURA 26.'. El corte y empalme ocurre en dos etapas, primero
se escinde el exn 5
'
y despus se une con el exn 3'.
El mecanismo de corte y empalme ha sido carac-
terizado in vitro mediante sistemas que permiten
la eliminacin de intrones de precursores de RNA.
Los extractos nucleares pueden cortar y empalmar
precursores de RNA purificados, lo cual demuestra
que la accin no est vinculada con el proceso de
transcripcin. En RNA que no tienen capuchn es
posible el corte y empalme, o bien, la poliadenila-
cin. Las reacciones de corte y empalme como tales
son independientes de la transcripcin o modifica-
cin del RNA, sin embargo, ocurren normalmente
en forma coordinada y su eficacia puede ser influida
por otros sucesos de procesamiento.
Las etapas del corte y empalme in vitro se ilus-
tran en la va de la FIGURA 26.6. Se analiza la reac-
cin respecto de las especies individuales de RNA
identificables, pero recurdese que, in vivo, las que
contienen exones no se liberan como molculas li-
bres, se mantienen unidas por el aparato de corte
y empalme,
El primer paso es escindir en el sitio de corte
y empalme 5
'
, separando el exn izquierdo de la
molcula de intrn-exn derecha; el exn izquierdo
asume la forma de una molcula lineal y la molcula
intrn-exn derecha forma un lazo
,
en el cual el
26.4 El corte y empalme del pre-RNAm procede a travs de un lazo
673
extremo 5
'
generado en el final del intrn se une
por enlace 5
'
-2' con una base, dentro del intrn. La
base diana es una A en una secuencia llamada sitio
de ramificacin.
La escisin en el sitio 3' de corte y empalme li-
bera al intrn libre con forma de lazo; el exn dere-
cho se liga (corta y empalma) con el exn izquierdo.
Por claridad, las reacciones de escisin y ligadura se
muestran separadamente en la figura, pero en reali-
dad ocurren como una transferencia coordinada.
El lazo es entonces "desramificado" para obte-
ner un intrn lineal escindido, que se degrada r-
pidamente.
Las secuencias necesarias para el corte y empalme son
las cortas de consenso de los sitios 5' y 3' y del de ramifica-
cin. Ya sabiendo que la mayor parte de las secuen-
cias de un intrn pueden ser motivo de delecin sin
impedir el corte y empalme, se silbe que el intrn (o
exn) no necesita una conformacin especfica.
El sitio de ramificacin
, muy conservado en
las levaduras y con la secuencia de consenso UA-
CUAAC, tiene una participacin importante en la
identificacin del sitio de corte y empalme 3'. Por
el contrario, en eucariotas superiores no est bien
conservado y tiene preferencia por purinas o piri-
midinas en cada posicin, adems de conservar el
nucletido diana A (vase la Fig. 26.6).
El sitio de ramificacin yace a una distancia de
18 a 40 nucletidos en flujo ascendente respecto
del sitio 3' de corte y empalme, en el cual, las muta-
El corte y empalme usa la transesterificacin
Exn 1 O-P-0 GU
-
OExn 2
Exn 1-OH
U G-0
P-OExn 2
Exn 1 O-P-0 Exn 2
U G-0
P
-OH
EL corte y empalme nuclear se debe a dos reac-
ciones de transesterificacin, en las cuales un grupo OH ataca
a un enlace fosfodister.
dones o deleciones impiden el corte y empalir.:
levaduras. En eucariotas superiores, las restriccor
en su secuencia son ms relajadas, lo cualle conl
re la capacidad de usar secuencias relacionada?
madas sitios crpticos) cuando la cadena autr.:
sufre delecin. La proximidad con el sitio 3
'
de c
y empalme parece importante, pues el crptico s>-
pre est cerca del sitio autentico; el crptico st
slo cuando el sitio de la ramificacin est de-;
vado. Cuando la secuencia de rama crptica se l
de esa forma, el corte y empalme parecen nonr;
desde otra prespectiva, y los exones dan origen i
mismos productos que los de tipo natural. LafltM
del sitio de ramificacin, por tanto, es identificar el si:
de corte y empalme como diana para la conexin :
el sitio 5
'
de corte y empalme. Esto puede expl:-::
se porque ocurre una interaccin entre compit
protenicos que se unen a esos dos sitios.
El enlace constituido por el lazo va, de la r
cin 5
'
de la G invariable que estaba en el extr--
5' d
el intrn a la posicin 2
'
de la A invariable
sitio de ramificacin, que corresponde a la ter,
molcula A de la caja UACUAAC de las levadun
Las reacciones qumicas proceden por transa
terificacin; un enlace es, de hecho, transfer.-.:
una localizacin a otra. En la
"
se mue'
que el primer paso es un ataque nucleoflico p
extremo 2
'
-
OH de la A invariable de la secue
UACUAAC en el sitio 5' de corte y empalme. Er
segundo paso, el extremo 3
'
-OH libre del exn ':.
rado por la primera reaccin, ataca ahora el enl,
del sitio 3' de corte y empalme. Ntese que se c:
serva el nmero de enlaces fosfodister. Origin.
mente haba dos enlaces 5
'
-
3
'
en los sitios de c
y empalme exn-intrn, pero uno ha sido sustiu;
por el enlace 5
'
-
3
'
entre los exones y el otro, per
enlace 5
'
-
2
'
que forma el lazo.
gflH Se requieren RNAsn
para eL corte y empalme
Conceptos principales
Los cinco RNAsn implicados en el corte y empalme se
Ul, U2, U5, U4y U6.
Con algunas protenas adicionales, las RNPsn forman i
empalmosoma.
Todas las RNPsn, excepto U6, contienen una secueno
conservada que se une a protenas Sm, reconocidas
por anticuerpos generados durante una enfermedad
autoinmunitaria.
Los sitios de corte y empalme 5' y 3', y la secuen
de ramificacin, son reconocidos por componen
del aparato de corte y empalme que se ensamb
674
CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
"
ara formar un gran complejo, el cual une los sitios
5
'
y 3' de corte y empalme antes de que ocurra
;
ualquier reaccin, lo que explica porqu una de-
ciencia en cualquiera de esos sitios puede impedir
el inicio de la reaccin. El complejo se ensambla de
manera secuencial en el pre-RNAm y los complejos
rraccionadores de diferentes tamaos pueden reco-
nocer diversos intermediarios. El corte y empalme
.
iene lugar slo despus de que todos los compo-
nentes se han ensamblado.
El aparato de corte y empalme contiene tan-
10 protenas como RNA (adems del pre-RNAm).
Los RNA adoptan la forma de pequeas molculas
"
resentes a manera de ribonucleoprotenas. Tanto
p ncleo como el citoplasma de las clulas euca-
"
ticas contienen muchas especies pequeas bien
iefinidas de RNA
, cuyo tamao va de 100 a 300
;
ases en eucariotas superiores y hasta -1000 bases
en las levaduras. Tambin la cantidad vara con-
- Jerablemente, de 105 a 106 molculas por clula
"
asta concentraciones demasiado bajas como para
?er detectadas de manera directa.
Los restringidos al ncleo se llaman RNA nu-
cleares pequeos (RNAsn), y los del citoplasma,
RNA citoplasmticos pequeos (RNAsc). En su
ritado natural se presentan como partculas de ribo-
nucleoprotenas (RNPsn y RNPsc); coloquialmente
b les llega a llamar snurps y scyrps. Tambin hay
una clase de RNA pequeos en el nuclolo,
llama-
ios RNAsno, que participan en el procesamiento
le RNA ribosmico (vase la seccin 26.22, Se re-
auieren RNA pequeos para el procesamiento del
-
XAr).
Las RNPsn involucradas en el corte y empal-
me, adems de muchas otras protenas, forman un
pan complejo especfico llamado empalmosoma.
-
islado in vitro de los sistemas de corte y empalme,
:
?: constituido por una partcula de ribonucleopro-
tenas de 50 a 60 S
, y puede formarse en etapas,
oonforme se unen las RNPsn a travs de "varios
complejos de corte y empalme". El empalmosoma
es una gran estructura, con una masa mayor que
i del ribosoma.
En la JRA 2t se resumen sus componentes.
-;
s cinco RNAsn contribuyen con ms del 25% de
s masa
, y con sus 41 protenas vinculadas, consti-
lyen casi la mitad de la masa. Algunas de las 70
protenas que se encuentran en el empalmosoma se
tscriben como factores de corte y empalme, que
'
:luyen las necesarias para el ensamblaje del em-
palmosoma y para unirlo al sustrato RNA, adems
;
r las implicadas en sucesos catalticos. Por otra par-
:
se han sealado otras -30 protenas vinculadas
:
n el empalmosoma que participan en otras etapas
:
c la expresin gnica, lo cual sugiere que puede
i;er las veces de aparato de coordinacin.
El empalmosoma se forma en el RNA precursor
intacto y pasa a travs de un estado intermedio en el
cual contiene la molcula lineal individual del exn
5
'
y el lazo-intrn-exn derecho. El complejo tiene
muy poco producto de corte y empalme, lo cual su-
giere que suele liberarse de inmediato, despus de la
escisin del sitio 3
'
y la ligadura de los exones.
Se puede pensar que las partculas de RNPsn
participan en la estructuracin del empalmosoma.
Como el ribosoma, el empalmosoma depende de
interacciones RNA-RNA, as como protena-RNA y
protena-protena. Algunas de las reacciones en que
participan las RNPsn requieren que el RNA aparee
sus bases directamente con secuencias del RNA que
se corta y empalma, en tanto que otras requieren
del reconocimiento entre RNPsn o entre sus prote-
nas y otros componentes del empalmosoma.
La importancia de las molculas de RNAsn pue-
de probarse directamente en levaduras, provocan-
do mutaciones en sus genes. Las mutaciones en los
cinco genes de RNAsn son mortales, e impiden el
corte y empalme. Todos los RNAsn involucrados en
el corte y empalme se pueden reconocer en formas
conservadas en clulas animales, de aves e insectos.
En las levaduras, los RNA correspondientes a me-
nudo son bastante ms grandes, pero las regiones
conservadas incluyen caractersticas similares a las
de RNAsn de las eucariotas superiores.
Las RNPsn implicadas en el corte y empalme
son UI, U2, U5, U4 y U6, nombrados de acuerdo
con los RNAsn presentes. Cada RNPsn contiene un
slo RNAsn y varias protenas (<20). Las RNPsn U4
y U6 suelen encontrarse como una sola partcula
(U4/U6). Un centro estructural comn para cada
ia partcula grande
30 protenas
adicionales
2.
1 MDa
5 RNAsn
17% de la
3.3 MDa
masa
27% de la masa
70 factores de
41 protenas
corte y empalme
en RNPsn
4.7 MDa
2
,2 MDa
38% de la masa
18% de la
masa
El empalmosoma mide -12 MDa. Cinco RNPsn
contribuyen con casi la mitad de la masa; el resto de las pro-
tenas incluye factores de corte y empalme conocidos,
as como
las implicadas en ambas etapas de la expresin gnica.
26.5 Se requieren RNAsn para el corte y empalme 675
RNPsn consta de un grupo de ocho protenas,
to-
das reconocibles por un antisuero autoinmunitario
llamado anti-Sm; las secuencias conservadas en
las protenas forman la diana de los anticuerpos,
en tanto que las otras son exclusivas de ella. Las
protenas Sm se unen a la secuencia conservada
PuAU
3 6
Gpu, presente en todos los RNAsn, excep-
to U6, que en su lugar contiene un conjunto de
protenas similares a Sm (Lsm). Las protenas Sm
deben participar en la reaccin autoinmunitaria, si
bien no se ha aclarado su relacin con el fenotipo
de la enfermedad autoinmunitaria.
Algunas de las protenas de la RNPsn pueden
participar directamente en el corte y empalme,
mientras que otras tal vez sean necesarias para ac-
tividades estructurales o slo para el ensamblaje o
las interacciones entre partculas de RNPsn. Casi el
33% de las protenas involucradas en el corte y em-
palme son componentes de las RNPsn. Pruebas cada
vez ms numerosas de la participacin directa del
RNA en la reaccin de corte y empalme sugieren
que relativamente pocos factores de corte y em-
palme participan directamente en la catlisis, casi
todos participan en actividades estructurales o de
ensamblaje.
El RNAsn U1 aparea sus bases con la juntura de corte
y empalme del donador
Dominio D
i/c
G C
CG
GCU
AU
U
G C
G C
Dominio C
, ,
GAC
Dominio B
Cucr 11
A GGAUG GCU CCCUG
,
GGGAC
G U
Unin G
de Sm O S'
O
. o,
o
.5
UGC
GACGGUCC A U U C A U ApppGme 5'
C G Exn 5'GUAAGUA Intron 3'
CG
U A
G C
g
g
U\
gcaC
Dominio A
Apareamiento
de intrones
El RNAsn Ul tiene una estructura de bases apa-
readas que forma varios dominios. El extremo 5
'
se mantiene
con una sola cadena y puede aparear sus bases con el sitio de
corte y empalme 5
'
.
La RNPsn Ul inicia eL corte
y empalme
Conceptos principales
.
La RNPsn Ul inicia el corte y empalme por unin co-
el sitio 5
'
mediante una reaccin de apareo RNA-RN
.
El complejo E contiene RNPsn Ul unida al sitio 5',
La protena U2AF unida a una va de pirimidina entre
el sitio de ramificacin y el de corte y empalme 3
'
,
\
protenas SR que conectan la RNPsn Ul con la U2AF.
En general, el corte y empalme se puede dividir ;
dos etapas:
.
En primer trmino se reconocen las seo:. -
das de consenso del sitio 5' de corte y -
palme, la secuencia de ramificacin y la i
adyacente de pirimidina. Se ensambla tai
complejo que contiene todos los compone- -
tes de corte y empalme.
.
Las reacciones de escisin y ligadura cambia*
entonces la estructura del sustrato RNA. 1
componentes del complejo se liberan o reor-
ganizan conforme avanzan las reaccionen
corte y empalme.
El punto importante es que todos os componentes :
corte y empalme estn ensamblados y tienen aseguraa
sitios de corte y empalme disponibles antes de que se /:.-
algn cambio irreversible en el RNA.
El reconocimiento de las secuencias de cousl.
so involucra al RNA y a las protenas. Ciertos RNA;r
tienen secuencias complementarias de las de a n -
senso o entre s, y el apareamiento de bases en: -
RNAsn y pre-RNAm, o entre varios RNAsn, tier.:
un papel importante en el corte y empalme.
La RNPsn Ul humana contiene ocho protenas.
adems de RNA. En la FIGURA 26.9 se muestra s
estructura secundaria, que tiene varios dominios. Z
sitio de unin Sm es necesario para la interaccin
con las protenas usuales de la RNPsn. Los domin:
identificados por estructuras individuales de tallo-
asa proporcionan sitios de unin para protenas ex-
clusivas de la RNPsn Ul.
La unin de la RNPsn Ul con el sitio 5' de cor.
y empalme es el primer paso de dicho proceso. Z
reclutamiento de RNPsn UI implica una interaccin
entre una de sus protenas (Ul-70k) y la protena
ASF/SF2 (factor general de corte y empalme de cla-
se SR; vase ms adelante). El RNAsn Ul aparea su-
bases con el sitio 5' mediante una regin de una sola
cadena en su extremo 5
'
, que suele incluir una fila
de cuatro a seis bases, complementaria de la del sitio
de corte y empalme.
Las mutaciones del sitio 5' de corte y empai-
me y en el RNAsn Ul se pueden usar para proba:
676 CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
directamente la necesidad de que se apareen entre
ellas. Los resultados de tal experimento se muestran
en la FIGURA 26.10. La secuencia de tipo natural del
sitio de corte y empalme del pre-RNAm del ade-
novirus 12S se aparea en cinco de seis posiciones
con el RNAsn Ul. Un mutante del RNA 12S que no
puede escindirse ni empalmarse tiene dos cambios
de secuencia; las fracciones GG de las posiciones 5
a 6 del intrn cambian a AU. La mutacin modifica
el patrn de apareamiento de bases entre el RNAsn
Ul y el sitio de corte y empalme 5',
si bien no mo-
difica la extensin global del apareamiento (puesto
que se pierde complementariedad en una posicin
y se gana en otra). El efecto en el corte y empal-
me sugiere que la interaccin base-apareamiento
es importante.
Cuando se introduce una mutacin en el RNAsn
Jl que restablece el apareamiento en la posicin 5',
se recuperan el corte y empalme normales. Otros
casos en que se producen mutaciones correspon-
dientes en el RNAsn Ul para ver si es posible su-
primir la mutacin en el sitio de corte y empalme
sugieren la regla general: es necesaria la comple-
mentariedad entre RNAsn Ul y el sitio 5
'
de corte
y empalme para que ste se lleve a cabo, pero su
eficacia depende slo del nmero de pares de bases
que pueden formarse. La reaccin de apareamiento
e estabiliza por las protenas de RNPsn Ul.
En la FIGURA 26.11 se muestran las etapas tem-
pranas del corte y empalme. El primer complejo
lormado durante esta actividad es el E (corte y em-
palme tempranos), que contiene RNPsn Ul, el fac-
er de corte y empalme U2AF y miembros de una
familia llamada de protenas SR, que comprende
Di grupo importante de factores de corte y empal-
ne y reguladores, los cuales toman su nombre de
una regin rica en Arg-Ser, de longitud variable. Las
protenas SR interactan entre s a travs de dichas
regiones, y tambin se unen al RNA; constituyen
B componente indispensable del empalmosoma y
forman una malla sobre el sustrato de RNA; conec-
fen a U2AF con Ul (FIGURA 26.12)-. El complejo E
iele denominarse complejo de asignacin,
debido
r que su formacin identifica a un pre-RNAm como
sustrato para la formacin del complejo de corte y
rmpalme.
En el complejo E, el U2AF se une a la regin
intre el sitio de ramificacin y el 3
'
de corte y em-
alme. El nombre refleja su aislamiento original
como factor auxiliar U2. En casi todos los organis-
-
os tiene una subunidad grande (U2AF 65) que
ace contacto con una va de pirimidina de flujo
descendente respecto del sitio de ramificacin; una
rquea subunidad (U2AF35) hace contacto direc-
to con el dinucletido AG en el sitio 3' de corte y
:-:
ipalme. En Saccharomyces cerevisiae,
esa funcin
es realizada por la protena Mud2, contraparte de
U2AF65, y se une slo a la va de pirimidina,
lo
cual marca una diferencia en el mecanismo de corte
y empalme entre S. cerevisiae y otros organismos.
En las levaduras, el sitio 3' de corte y empalme no
participa en las primeras etapas de formacin del
complejo de corte y empalme, pero s en todos los
dems casos conocidos.
Otro factor de corte y empalme, llamado SF1
en mamferos y BBP en levaduras, conecta U2AF/
Mud2 con la RNPsn Ul unida en el sito 5' de corte
y empalme. La formacin del complejo mejora con
las reacciones cooperativas de las dos protenas; SF1
y U2AF (o BBP y Mud2) se unen al sustrato de
RNA con -10 ms eficacia que cualquiera por s
sola. Dicha interaccin tal vez se encarga de hacer
la primera conexin entre los dos sitios de corte y
empalme a travs del intrn.
El complejo E se convierte en complejo A cuan-
do la RNPsn U2 se une con el sitio de ramificacin,
para lo cual se requieren tanto RNPsn Ul como
U2AF/Mud2. El RNAsn U2 incluye secuencias com-
plementarias del sitio de ramificacin. Una secuen-
El RNAsn Ul selecciona la unin
RNA U1 de tipo silvestre y pre-RNAm de 12S
Corte y empalme normal
CAUUCA.U. 5'
xn 5' G U G A Q G intrn 3'
Sitio de corte y empalme del
adenovirus 12S
RNAsn U1 de tipo silvestre y mutante de pre-RNAm de 12S
No hay corte y empalme
GAUUCAU 5'
Etn 5' G U G A A U Inttn 9
Sitio de corte y empalme
con mutacin
RNAsn Ul y RNA 12S con mutacin
Se restablece el corte
y empalme
Mutacin en RNAsn U1
O AUU U A U 5'
L:,win6' GUSA A U Intrn 3'
FIGURA 26.10 Las mutaciones que inhabilitan la funcin del
sitio de corte y empalme 5
'
pueden ser suprimidas por mu-
taciones compensatorias en el RNAsn Ul, que restablecen el
apareamiento de bases.
26.6 La RNPsn Ul inicia el corte y empalme
677
da cercana al extremo 5' del RNAsn aparea sus bases
con la secuencia de ramificacin en el intrn. En
las levaduras, implica generalmente la formacin de
una estructura doble con la caja UACUAAC (vase
la Fig. 26.14). Varias protenas de la RNPsn U2 se
unen con el sustrato RNA justo en flujo ascendente
respecto del sitio de ramificacin. La adicin de la
RNPsn U2 al complejo E genera el complejo A previo
al corte y empalme, para la cual se requiere de la
hidrlisis de ATP y asigna un pre-RNAm para la va
de corte y empalme.
El complejo E se forma por Interacciones que Involucran
EL complejo de asignacin (E) se forma por
adicin sucesiva de RNPsn Ul al sitio de corte y empalme 5
'
,
LI2AF a la va de pirimidina/sitio de corte y empalme 3', y la
protena puente SF1/BBP.
EL complejo E puede formarse
por definicin de intrn o e :
Conceptos principales
.
La va directa de formacin de un complejo E es pw
NRPsn Ul unirse al sitio de corte y empalme 5' y ::-
U2AF, unirse a una va de pirimidina entre el sitio
ramificacin y el de corte y empalme 3
'
.
.
Otra posibilidad es que el complejo se forme entre .
:
AF en la va de pirimidina y RNPsn Ul en el sitio 5 :
corte y empalme de flujo descendente.
.
El complejo E se torna en A cuando la RNPsn U2 se .
con el sitio de ramificacin.
.
Si se forma un complejo E utilizando el sitio 5' de :
y empalme de flujo descendente, ste es sustituid ;
el correspondiente 5
'
de flujo ascendente cuando el
complejo E se convierte en el complejo A.
.
Los sitios de corte y empalme 3' dbiles pueden
requerir un potenciador de corte y empalme
localizado en el exn de flujo descendente para L" -
directamente con las protenas SR.
Hay ms de una forma de constituir el compl :
en la Figura 26.12 se ilustran algunas posibilii;:
La reaccin ms directa es que ambos sitios de ;
y empalme se reconozcan en el intrn. La presi-
de RNPsn Ul en el sitio 5' de corte y empalirit
indispensable para la unin de U2AF en la v: =
pirimidina en flujo descendente respecto del si:;
ramificacin, lo cual hace posible que los extr:-
5' d
el intrn se unan en ese complejo. El comr -
E se convierte en A cuando la RNPsn U2 se un ;
el sitio de ramificacin. La caracterstica bsica ...
va de corte y empalme es que los dos sitios de corte;
a ambos sitios de corte y empalme
Exn intrn
5
-
ACU
Py-AG
Exn
RNPsn U1 y
factor ASF/SF2
se unen con el
sitio de corte y
empaime 5
'
U2 AF se une con
la va Py y el m
sitio de corte y
| empalme 3'
SF1/BBP
conecta RNPsn U1
con U2AF
Sitio de corte y empalme
ASF/SF2
GU
Sitio de Va Py Sitio de
ramificacin corte y
empalme 3
'
Ul RNPsn
UACUAAC
Py-AG
(
U2AF65 U2AF35
I /
UACUAAC Py-AG
i SF1/BBP
UACUAAC
Definicin de intrn
Exn intrn
30
Exn
Sitio 5' Sitio de ramificacin
Definicin de exn
Exn Intrn Exn Intrn
UACIj'AAC Py AG GU
Sitio 5' sti0 de Sitio 3' Sitio 5
ramificacin
Protenas SR
SF1
GU UAOJAAC P" AG
U2AF Compteio B
Ul
-
GU UACUAAC Py AG GU
GU UACUAAC Pv AG GU
Complejo A
GU UACUAAC Py 91;
FIGURA 26.12 Puede haber mltiples vas para el reconocimiento inicial de los
sitios 5
'
y 3' de corte y empalme.
678
CAPTULO 25 Corte, empalme y procesamiento del RNA
palme son reconocidos sin necesidad de semencias ajenas
al intrn, proceso llamado definicin de intrn.
En un caso extremo, las protenas SR pueden
permitir a U2AF/RNPsn U2 unirse in vitro sin Ul, lo
cual da lugar a la posibilidad de que hubiera una va
independiente de Ul para el corte y empalme,
Cuando los intrones son largos y los sitios de
corte y empalme dbiles, puede seguirse una ruta
alterna para formar el empalmosoma. Como se
muestra a la derecha de la figura, el sitio 5
'
de corte
I empalme es reconocido por el RNAsn Ul en la
forma usual, no obstante que el 3' se reconoce como
parte de un complejo formado a travs del siguiente
exn, en cuyo caso, el siguiente sitio 5
'
de corte y
empalme tambin est unido al RNAsn Ul, el cual
es conectado con el U2AF por las protenas SR en
la va de pirimidina. Cuando se une RNPsn U2 para
generar el complejo A, hay una reestructuracin
por la cual el sitio 5
'
de corte y empalme correcto
(el del extremo izquierdo) desplaza al de flujo des-
rendente del complejo. La caracterstica importante
de esa va de corte y empalme es que se requieren
secuencias de flujo descendente respecto del intrn
mismo, que por lo general incluyen el sitio 5
'
de
corte y empalme siguiente, proceso denominado
definicin de exn. Este mecanismo no es uni-
versal
, no se encuentran protenas SR ni definicin
de exn en S. cerevisiae.
Los sitios 3' de corte y empalme "dbiles" no se
unen a U2AF y RNPsn U2 de manera eficaz; se ne-
cesitan secuencias adicionales para unir las prote-
pas SR, que ayudan a U2AF en su unin con la va
de pirimidina. Tales secuencias se llaman "potencia-
dores de corte y empalme", y se encuentran muy
Ifrecuentemente en un exn en flujo descendente
:
especto del sitio 3
'
de corte y empalme.
B23 Cinco RNPsn forman
eL empalmosoma
Conceptos principales
La unin de los RNPsn U5 y U4/U6 convierte al com-
plejo A en el empalmosoma Bl, que contiene todos los
componentes necesarios para el corte y empalme.
El empalmosoma pasa a travs de una serie de
complejos adicionales conforme avanza el proceso.
La liberacin de la RNPsn Ul permite al RNAsn U6
interactuar con el sitio de corte y empalme 5' y
convierte al empalmosoma Bl en empalmosoma B2.
Cuando U4 se disocia de la RNPsn IJ6, este ltimo
puede aparearse con el RNAsn U2 para formar el sitio
cataltico activo.
I espus de la formacin del complejo E, los de-
ms RNPsn y los factores involucrados en el corte y
empalme se vinculan con el complejo en un orden
definido. En la FIGURA 26.13 se muestran los com-
ponentes de los complejos identificables conforme
avanza la reaccin.
El complejo Bl se forma cuando un primer ri-
bete que contiene las RNPsn U5 y U4/U6 se une
con el complejo A que contiene RNPsn Ul y U2;
este complejo se considera empalmosoma porque
tiene los componentes necesarios para la reaccin
de corte y empalme; se convierte en complejo B2
despus de que se libera Ul, disociacin necesaria
para permitir que otros componentes se yuxtapon-
gan con el sitio 5
'
de corte y empalme, sobre todo
con el RNAsn U6. En ese punto, el RNAsn U5 cam-
bia de posicin, pues inicialmente est cerca de las
secuencias exnicas del sitio 5
'
de corte y empalme,
pero se traslada cerca de las secuencias del intrn.
La reaccin cataltica es desencadenada por la
liberacin de U4, que implica la hidrlisis de ATP.
un empalmosom compieios
ASF
/SF2
~
,U1
UG
SF1
'
/BBP
JACUAAC Py AG =Complejo E
,
\
T U2
UG
UAGUAAC Py AG
1
/ U6
UG / U2AF
U4-
UACUAAC Py AG
UG
UAGUAAC Py AG =
I Hidrlisis de ATP
i
U
G
UAGUAAC Py AG
\ Hidrlisis de ATP
UAGUAAC
I
G ACUAAC Py AG
Complejo A
U2 se une con sitio de ramificacin
Complejo Bl
Se une el recortador U5/U4/U6
U5 se une con el exn en el sitio 5'
U6 se une a U2
Complejo B2
Se libera U1
U5 cambia de exn a intrn
U6 se une en el sitio de corte y empalme 5'
Complejo C1
Se libera U4
U6/U2 cataliza la transesterificacin
U5 se une con el exn en el sitio de corte y
empalme 3
'
Se escinde el sitio 5' y se forma un lazo
Complejo C2
U2/U5/U6 se mantienen unidos
con el lazo
El sitio 3' se escinde y se ligan los exones
El RNA escindido se libera
El lazo se desramifica
FIGURA 26.13 La reaccin de corte y empalme pasa por definidas
en las cuales la formacin del empalmosoma implica la interaccin de
componentes que reconocen a las secuencias de consenso.
25.8 Cinco RNPsn forman el empalmosoma
679
NAsn U6 puede aparearse con U4 o U2
o
5
'
3' ExnS GA
Sitio de corte
y empalme
3
' (derecho)
Centro
cataltico
UGAUC f- q&
A
ACUAG
AU
G UGUAGUA
ACAUCAU
A
Sitio de
ramificacin
3
'
M2
3
'
ugexqilI 5:
Sitio de corte y empalme
5
' (izquierdo)
FIGURA 26.14 El apareamiento de U6-U4 es incompatible con el de
U6-U2. Cuando U6 se une con el empalmosoma, est apareada con
U4, cuya liberacin permite un cambio de conformacin de U6; una
parte de la secuencia liberada forma una horquilla (gris oscuro) y la
otra parte (negro) se aparea con U2. Una regin adyacente de U2 ya
est apareada con el sitio de ramificacin, lo cual conduce a U5 a una
yuxtaposicin con el sitio de ramificacin. Ntese que el sustrato RNA
se invierte respecto de su orientacin usual y se muestra de 3
'
a 5'.
La funcin del RNAsn U4 puede ser secuestrar al
RNAsn U6 hasta que se necesite. En la FIGURA 26-14
se muestran los cambios que ocurren en las inte-
racciones de apareamiento de bases entre RNAsn
durante el corte y empalme. En la RNPsn U6/U4
una longitud continua de 26 pares de bases de U6
se aparea con dos regiones independientes de U4,
que cuando se disocia, la regin que se libera en
U6 queda a la disposicin para captar otra estruc-
tura. La primera parte de ella se aparea con U2 y
la segunda forma una horquilla intramolecular. La
interaccin entre U4 y U6 es mutuamente incom-
patible con la interaccin entre U2 y U6, por lo que
la liberacin de U4 controla la capacidad de avance
del empalmosoma.
Por claridad, en la figura se muestra el sustrato
RNA extendido, pero el sitio 5' de corte y empalme
en realidad est cerca de la secuencia U6 inmediata
al lado 5
'
de la cadena unida a U2. Esta secuencia
del RNAsn U6 se aparea con secuencias del intrn
justo en flujo descendente respecto del GU conser-
vado en el sitio 5
'
de corte y empalme (las muta-
ciones que potencian tal apareamiento mejor;:
eficacia del corte y empalme).
As pues, varias reacciones de apareamic
entre RNAsn y el sustrato RNA ocurren duranii
corte y empalme, las cuales se resumen en la Fl
15. Las RNPsn tienen secuencias que se apa;
con el sustrato y entre s, adems de regiones ;
nocatenarias en asas muy cercanas a secuencias
sustrato, que tienen una participacin importar
a juzgar por la capacidad de las mutaciones de
asas para bloquear el corte y empalme.
El apareamiento de bases entre U2 y el punic
ramificacin, y entre U2 y U6, crea una estrufl
que simula el centro activo de los intrones del gn
II de autocorte y empalme (vase la Fig. 26.2l
cual sugiere la posibilidad de que el compone
cataltico incluyera una estructura de RNA genet
por la interaccin U2-U6. La U6 se aparea cor
sitio 5
'
de corte y empalme, y los experiment;;
enlaces cruzados muestran que un asa del RW
U5 es inmediato a las posiciones de primeras H
en ambos exones. Aunque se pueden definir 1; ;
cania del sustrato (el sitio 5
'
de corte y empa!::;_
el sitio de ramificacin) y los snurps (U2 y U6) 7;
centro cataltico (como se muestra en la Fig. 26
los componentes que realizan las transesterific;
nes no han sido identificados de manera direc:;
La formacin del lazo en el sitio de ram:;;
cin se encarga de determinar el uso del sitio 3
corte y empalme, porque la secuencia de conse
3' ms cercana al lado 3
'
de la ramificacin se I
vierte en diana para la segunda transesterifice.c
La segunda reaccin de corte y empalme se prea
ta inmediatamente despus, reaccin que requi
de la unin de RNPsn U5 con el sitio 3' de con
empalme, pero no hay pruebas de una reaccin
apareamiento de bases.
La conclusin importante sugerida por I
resultados es que los componentes RNAsn del a- f::
de corte y empalme interactan tanto entre s como ca
sustrato RNA mediante interacciones de apareamienu
bases, interacciones que permiten cambios en la estrud
que podran llevar a la aposicin de grupos reactive
inclusive, a crear centros catalticos. Es ms, los ca
bios de conformacin de los RNAsn son reversi;
por ejemplo, no se usa RNAsn U6 en una reacc
de corte y empalme, y al concluir, debe liberarse
U2 de manera que pueda volver a formar la esi:
tura doble con U4 para iniciar otro ciclo de con
empalme.
Se han descrito reacciones individuales en
cada RNPsn participa, pero como se esperara
una serie compleja de reacciones, cualquier RN
en particular puede tener ms de una participac
en el corte y empalme. As, la capacidad de la RN
Ul de promover la unin de RNPsn U2 con el s
680 CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
El apareamiento de RNAsn es importante
para el corte y empalme
U1 se aparea con el sitio de corte y empalme 5'
3
'
OCCAUUCA
5
'
AGGUAUGU
Sitio de corte
y empalme 5
'
U2 se aparea con el sitio de ramificacin
U2
3'
:
5
'
3
'
AUjGAiL.5
'
5
'
-U A C U A A C -AG~3
'
Sitio de ramificacin
U6 se aparea con el sitio de corte y empalme 5'
U6
3
'
.gaSaca 5
'
S
'
aggua"
3'
Sitio de corte y empalme 5'
U5 est cerca de ambos exones
El exn 1 en +1
Exn 2 en +1 u u .
c U5 a
G C
c
FIGURA 26.15 El corte y empalme utiliza una serie de reac-
riones de apareamiento de bases entre RNAsn y los sitios de
corte y empalme.
de ramificacin es independiente de su capacidad de
unin con el sitio 5
'
de corte y empalme; de la mis-
ma manera se pueden definir diferentes regiones de
RNPsn U2 necesarias para la unin con el sitio de
ramificacin y la interaccin con otros componentes
de corte y empalme.
Se ha hecho un extenso anlisis de las muta-
ciones en las levaduras para identificar los compo-
nentes de RNA y los componentes protenicos del
empalmosoma. Las mutaciones necesarias en los
genes para el corte y empalme se identifican por la
acumulacin de precursores no empalmados. Una
serie de loci que identifica a genes potencialmente
codificadores de protenas implicadas en el corte y
empalme, originalmente se llamaron RNA, pero hoy
se conocen como mulantes PRP (por procesamiento
Jel pre-RNA). Varios de los productos de esos genes
tienen segmentos que los identifican como prote-
nas de unin a RNA, y algunos parecen relacionarse
con una familia de helicasas de RNA dependientes
del ATP. Se supone que adems de las interaccio-
nes RNA-RNA, las interacciones protenas-RNA son
importantes para crear o liberar estructuras en los
componentes pre-RNAm o RNAsn de los empal-
mosomas.
Algunas de las protenas PRP son componen-
tes de partculas RNPsn, pero otras actan como
factores independientes. Un ejemplo interesante es
PRP16, helicasa que hidroliza el ATP y se vincula
transitoriamente con el empalmosoma para parti-
cipar en el segundo paso cataltico. Otro ejemplo es
PRP22, helicasa dependiente de ATP necesaria para
liberar el RNAmmaduro del empalmosoma. La con-
servacin de enlaces durante la reaccin de corte y
empalme indica que no es necesaria la introduccin
de energa para impulsar la formacin del enlace en
s, lo cual implica la necesidad de hidrlisis del ATP
para otros fines. El que PRP 16 y PRP22 utilicen ATP,
puede ser ejemplo de un fenmeno ms general, el
uso de la hidrlisis de ATP para producir los cam-
bios conformacionales necesarios para el avance del
corte y empalme.
Un aparato alternativo
de corte y empalme utiliza
diferentes RNPsn
Conceptos principales
.
Una va alterna de corte y empalme utiliza otro conjun-
to de RNPsn que constituyen el empalmosoma U12.
.
Los intrones diana se definen por secuencias de con-
senso ms largas en las uniones de corte y empalme,
pero, en general, incluyen las mismas uniones AU-AC.
.
Ciertos intrones tienen las uniones de corte y empalme
AU-AC, incluidos algunos dependientes de Ul y otros,
de U12.
Los intrones GU-AG son la gran mayora, >98%
de las uniones de corte y empalme en el genoma
humano; menos del 1 % utilizan uniones relacio-
nadas GC-AG y despus, hay una clase menor de
intrones marcados por los extremos AU-AC que
representan el 0.1 por ciento. El descubrimiento
del primero de ellos requiri un aparato de corte y
empalme alternativo llamado empalmosoma U12,
constituido por Ull y U12 (relacionados con Ul y
U2, respectivamente), una variante U5 y los RNAsn
U4atac y Uatac. La reaccin de corte y empalme es
esencialmente igual a la de los intrones GU-AG y los
RNAsn actan de manera anloga. Se desconoce si
hay diferencias en los componentes protenicos de
este aparato.
Ahora resulta que la dependencia del tipo de
empalmosoma recibe tambin la influencia de se-
cuencias en el interior del intrn, por lo que hay
algunos intrones AU-AC con escisin y empalme
26.9 Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza diferentes RNPsn
681
por empalmosomas de tipo U2 y otros GU-AG con
corte y empalme por los de tipo U12. Una secuen-
cia de consenso fuerte del extremo de la izquier-
da define el tipo de intrn dependiente de U12:
5
'G
A
UAUCCUUU 3TyAG
c
.
De hecho, casi todos
los intrones dependientes de U12 tienen termina-
ciones GU AG, adems de un punto de rami-
ficacin muy conservado, UCCUUPuAPy, que se
aparea con un U12, motivo por el cual se usa la
denominacin intrn dependiente de U12, en vez
de intrn AU-AC.
Ambos tipos de intrones coexisten en una varie-
dad de genomas, y en algunos casos se encuentran
en el mismo gen, si bien los intrones dependientes
de U12 tienden a ser anqueados por intrones de-
pendientes de U2. Lo que se sabe acerca de la filo-
genia de estos intrones es que los dependientes de
AU-AG U12 tal vez fueron ms frecuentes en algn
momento, pero tienden a convertirse en extremos
GU-AG y a la dependencia de U2 durante la evo-
lucin. La evolucin comn de los sistemas resalta
por el hecho de que utilizan conjuntos anlogos de
apareamiento de bases entre RNAsn y con el sus-
trato pre RNAm.
La participacin de RNPsn en el corte y empal-
me es un ejemplo de su intervencin en las reac-
ciones de procesamiento del RNA, pues es necesario
para varias acciones durante el procesamiento del
RNA nuclear hacia RNAr maduros. En especial por
la demostracin de que los intrones del grupo I son
de corte y empalme propios y que el RNA de la ri-
bonucleasa P tiene actividad cataltica (como se des-
cribe en el Cap. 27, RNA cataltico), es posible que
las acciones RNA-RNA sean importantes en muchos
sucesos del procesamiento del RNA.
EL corte y empalme est
reLacionado con La exportacin
deL RNAm
Conceptos principales
.
Las protenas REF se unen a las uniones de corte y
empalme por un vnculo con el empalmosoma.
.
Despus del corte y empalme se mantienen adheridas al
RNA en la unin exn-exn.
.
Interactan con la protena de transporte TAP/Mex, que
exporta el RNA a travs de un poro nuclear.
Despus de que se ha sintetizado y procesado el
RNAm, se exporta del ncleo al citoplasma a mane-
ra de un complejo ribonucleoprotenico. Las prote-
nas encargadas del transporte
"
van y vienen
"
entre
ncleo y citoplasma, slo permanecen brevemente
en el compartimiento. Dos aspectos importantes
son cmo reconocen esas protenas sus sustratos de
DNA y qu garantiza que slo se exporten RN -
completamente procesados. Las respuestas se ~ : .
cionan, en parte, con el momento relativo er.
ocurren los sucesos: los empalmosomas tal \ ::
formen para eliminar intrones antes de haber ;
cluido la transcripcin, aunque tambin puede
ber una conexin directa entre corte y empalme
exportacin.
Los intrones podran impedir la exportacir :
RNAm porque se vinculan con el aparato de cort-
empalme, si bien el empalmosoma tambin pi::
proporcionar el punto inicial de contacto con el i:
rato de exportacin. En la FIGURA 26.16 se muesa
un modelo en que el complejo protenico se _
con el RNA a travs del aparato de corte y empalia
dicho complejo consta de >9 protenas y se Hais
EJC (complejo de juntura de exones).
El EJC participa en varias funciones de R>-
empalmados en las cuales participan directam.::
ciertas protenas del EJC y otras reclutan prou
adicionales para funciones especficas. El pr;-
contacto en el ensamblaje de EJC es con uno de
factores de corte y empalme, y despus, el EJ I
mantiene unido al RNAm justo en flujo aseen
te respecto de la juntura exn-exn. El EJC no i
vincula con el RNA transcrito de genes que can-;
de intrones, por lo que su participacin en el proces
es exclusiva para los productos empalmados.
En caso de delecin de intrones en un ger
producto se exporta mucho ms lentamente al l
El corte y empalme es necesario para
la exportacin del RNAm
ExOn Intrn Etn
, Corte y empalme
La proteina se une con
el complejo de corte y
'
empalme
.
,4
La proteina se mantiene
'
en la unin exn-exn
El complejo (EJC) se
. ensambla en la unin
exn-exn
i
Ei EJC se une a protenas implicadas en la
exportacin, localizacin y decadencia del RNA
FIGURA 26.16 El EJC (complejo de unin de exones) se une :
RNA por reconocimiento del complejo de corte y empalme.
682
CAPITULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
REF y TAP son protenas clave para
La protena REF (Aly) es parte del EJC
REF
El faetor de transporte TAP/Mex se une a REF
R/Mex
TAP/Mex(,
El TAP/Mex lleva el RNAm a travs del poro nuclear
TAP/Me:
: NCLEO
CITOPLASMA
| Se libera TAP/Mex
FIGURA 26.17 Una protena REF se une a un factor de corte y
empalme y se queda con el producto RNA. El REF se une a un
''
actor de exportacin que se une con el poro nuclear.
plasma, lo cual sugiere que el intrn puede propor-
cionar una seal de unin al aparato de exportacin.
Ahora se puede abordar ese fenmeno segn una
serie de interacciones protenicas, como se muestra
en la FIGURA 26.17. El EJC incluye un grupo de pro-
tenas llamado familia REF (cuyo miembro mejor
caracterizado es Aly). Las protenas REF, a su vez,
interactan con una protena de transporte (cuyo
nombre vara, TAP o Mex), que se responsabiliza
directamente de la interaccin con los poros nu-
cleares.
Para definir un RNA con corte y empalme, se
puede usar un sistema similar, de manera que las
mutaciones de terminacin previas al ltimo exn
desencadenen su degradacin en el citoplasma (va-
se la seccin 7.14, Las mutaciones de terminacin
desencadenan un sistema de vigilancia).
22! Los intrones del grupo II se
cortan y empalman a s mismos
por la formacin de un lazo
Conceptos principales
Los intrones del grupo II se escinden del RNA por un
suceso autocataltico.
Las uniones y el mecanismo de corte y empalme en
intrones del grupo II son similares a Los de los intrones
nucleares.
Un intrn del grupo II se pliega en una estructura
secundaria que genera un sitio cataltico similar a la
ordenacin del intrn nuclear U6-U2.
Los intrones de genes que codifican protenas
(de hecho, excepto los nucleares de codificacin
de RNAt) pueden dividirse en tres clases generales.
Los intrones nucleares pre-RNAm se identifican slo
por la posesin de dinucletidos GIL... AG en los
extremos 5
'
y 3' y el sitio de ramificacin/va de pi-
rimidina cerca del extremo 3
'
, no muestran ninguna
caracterstica comn en la estructura secundaria.
Los intrones de los grupos I y n se encuentran en
organelos y bacterias (los del grupo I tambin estn
en el ncleo de eucariotas inferiores) y se clasifican
de acuerdo con su organizacin interna; cada uno
puede plegarse en un tipo usual de estructura se-
cundaria.
Por otra parte, tienen la notable capacidad de
escindirse de un RNA, lo que se llama autoescisin.
Los intrones del grupo 1 son ms comunes que los
del grupo 11, y hay poca relacin entre ambas clases,
pero en cada caso el RNA puede hacer la reaccin
de escisin in vitro por s mismo, sin necesidad de
actividades enzimticas provistas por protenas; sin
embargo, casi no hay duda de in vivo se requieren
para ayudar al plegamiento (vase Cap. 27, RNA
cataltico).
En la FIGURA 26.18 se muestra que mediante
dos transesterificaciones sucesivas se escinden tres
clases de intrones (mostradas antes en la Fig. 26.6,
para los intrones nucleares). En la primera reac-
cin, la unin exn-intrn 5
'
es atacada por un
grupo hidroxilo libre (proporcionado por una posi-
cin 2
'
-
OH interna en los intrones nucleares y del
grupo II, y por un nucletido de guanina libre en
los del grupo I). En la segunda reaccin, el 3'-OH
libre en el extremo del exn liberado ataca a su vez
la unin intrn-exn 3'.
Hay paralelismos entre los intrones del grupo II
y el corte y empalme del pre-RNAm. Los intrones
mitocondriales del grupo n se escinden por el mis-
mo mecanismo que los pre-RNAm nucleares, a tra-
vs de un lazo que se mantiene unido por un enlace
5
'
-
2
'
. En la FIGURA 26.ir se muestra un ejemplo del
lazo producido por corte y empalme de un intrn
del grupo II. Cuando un RNA de grupo II aislado se
incuba in vitro, sin componentes adicionales, puede
presentar una reaccin de corte y empalme, lo cual
significa que la secuencia misma del intrn de RNA
del grupo n puede llevar a cabo las dos reacciones
de transesterificacin que se muestran en la Figura
26.18. El nmero de enlaces fosfodister se mantie-
ne en la reaccin y, como resultado, no se necesita
un aporte externo de energa, lo cual podra haber
sido una caracterstica importante en la evolucin
del corte y empalme.
En una estructura secundaria que contiene va-
rios dominios formados por tallos de pares de ba-
25.11 Los intrones del grupo II se cortan y empalman a s mismos por la formacin de un lazo
683
El corte y empalme hacen uso de la transesteriflcacin
RNA nuclear
Primera
transferencia
Exn 1
Segunda
transferencia
OH
A G:
Exn 2
Grupo II
d6
Segunda / 'ik OH
transferencia
'
Exn 1 Exn 2
Grupo I
G--OH
.
Primera
P5 pfi Segunda
transferencia
transferencia
Exon 1
Exon 2
FIGURA 26.18 Son tres las clases de reacciones de corte y
empalme que tienen lugar mediante dos esterificaciones. En
primer trmino, el grupo OH libre ataca la unin exn l-intrn
y despus, el OH creado en el extremo del exn 1 ataca La unin
intrn-exn 2.
ses y asas de una sola cadena, se forma un intrn
del grupo II. El dominio 5 est separado del 6 por
dos bases; este ltimo contiene una molcula de A
que dona el grupo 2
'
-
OH para la primera transes-
teriflcacin y constituye un dominio cataltico en
el RNA. La FIGURA 26.2c muestra una comparacin
de esa estructura secundaria con la formada por la
combinacin de U6 con U2 y de U2 con el sitio de
ramificacin. La similitud sugiere que U6 puede te-
ner actividad cataltica.
Las caractersticas del corte y empalme del gru-
po II sugieren que el proceso evolucion a partir de
una reaccin autocataltica de una molcula indi-
vidual de RNA, en la cual se lograba una delecin
controlada de una secuencia interna. Es posible que
dicha reaccin implique que el RNA se pliegue en
FIGURA 26.19 El corte y empalme libera un intrn delg-.;
mitocondrial en forma de lazo estable. Tomada de Van De- 7
R
., et al EMBOO. 1987. 6:1079-1084. Imagen cortesa de
A
. Grivell, European Molecular Biology Organisation.
una conformacin especfica o en una serie de :
formaciones, lo cual ocurrira exclusivamen
..
configuracin cis.
La capacidad de los intrones del grupo II - :
eliminarse a s mismos por un suceso de cor::
empalme autocataltico contrasta con la neces:.
de intrones nucleares para un aparato de corte i
empalme complejo. Los RNAsn del empalmos :
pueden ser considerados como compensadorc-
la falta de informacin de secuencias en el intr
adems de que proporcionan la informaciD .
querida para formar estructuras particulares en d
RNA. Las funciones del RNAsn pueden haber c. -
lucionado a partir del sistema autocataltico origj;-1
Estos RNAsn actan en configuracin trans se': :
el sustrato pre-RNAm; se podra imaginar que :
capacidad de UI para aparearse con el sitio de conr
y empalme 5
'
,
o de U2 con la secuencia de ramifk;
cin, sustituy a una reaccin similar que requ.: i
que el intrn portara la secuencia importante. ?
tanto, los RNAsn pueden presentar reacciones c
el sustrato pre-RNAm y entre s, las cuales han su .
tituido a una serie de cambios conformacionales c.:
se presentan en el RNA que se corta y empalma r :
mecanismos del grupo II. De hecho, esos camb:
han liberado al sustrato pre-RNAm de la obligacii
de portar las secuencias necesarias para patrocina:
la reaccin. Conforme el aparato de corte y empe -
rne se ha tomado ms complejo (y el nmero :.
-
sustratos potenciales ha aumentado), las proteoai
han tenido un papel ms importante.
684
CAPTULO 25 Corte, empalme y procesamiento del RNA
El corte y empalme nucleares
y del grupo II son similares iF'llli'J'ii'llIP '*'""
El corte y empalme nucleares estructuran
un sitio activo por apareamiento entre U6-U2
y U2-intrn
CAU
G A
U A
C G
3A
i
U G A U C
AA C U A G
AU
U2
3
'
G A
G UG UAG UA
A C
A
A U C A U
H
Exn 1-G U
El corte y empalme del grupo II originan un centro
activo a partir de las regiones de apareamiento de
bases de los dominios 5 y 6
Dominio |>-qV
RAGCNNNR
YA
q
YUUGNNNY
r G
-
u RRRR RR
Y Y Y Y A Y Y
CP
OH
I
Dominio 6
Exn 1-G U
IGURA 26.20 El corte y empalme nuclear y el del grupo II
"
pilcan La formacin de estructuras secundarias similares. Las
;:
uencias son ms especficas en el proceso nuclear; el del
Tupo II hace uso de posiciones que podran ser ocupadas por
urinas (R) o pirimidinas (Y).
EL proceso de corte y empaLme
alternativo implica el uso
diferencial de uniones de corte
y empalme
Conceptos principales
Los exones especficos pueden excluirse o incluirse en
el RNA producido mediante el uso, o no, de un par de
uniones de corte y empaLme.
Los exones pueden extenderse cambiando una de
as uniones de corte y empaLme para usar una unin
alternativa.
La determinacin del sexo en el gnero Drosophila
implica una serie de sucesos de corte y empalme
alternativos en genes que codifican productos
sucesivos de una va.
Los elementos P del gnero Drosophila muestran corte y
empaLme alternos especficos de la lnea germinal.
Cuando un gen interrumpido se transcribe en un
RNAsn que da origen a un solo tipo de RNAm con
corte y empalme, no hay ambigedad en la asig-
nacin de exones e intrones. Los RNA de algunos
genes, sin embargo, siguen patrones de corte y em-
palme alternativos que se presentan cuando un solo
gen da origen a ms de una secuencia de RNAm.
En algunos casos, el patrn ltimo de expresin es
dictado por el transcrito primario, debido a que el
uso de diferentes puntos de inicio o la generacin de
extremos alternativos 3
'
modifica el patrn de corte
y empalme. En ciertos casos, un solo transcrito pri-
mario se corta y empalma en ms de una forma, y
se sustituyen, agregan o eliminan exones internos,
mientras que en otros, los mltiples productos son
sintetizados en la misma clula, aunque en otros el
proceso es regulado, de manera que hay patrones
de corte y empalme especficos solo en condiciones
tambin especficas.
Una de las cuestiones ms importantes acerca
del corte y empalme, es determinar qu controla
el uso de tales vas alternas. Las protenas que in-
tervienen para desviar el uso de ciclos alternativos
de corte y empalme se han identificado de dos ma-
neras. En algunos sistemas de mamferos ha sido
posible caracterizar el corte y empalme alternativo
in vitro, e identificar las protenas que se requieren
para el proceso. En la D. melanogaster, las aberracio-
nes en el corte y empalme alternativo pueden ser
producto de mutaciones en los genes que sufren el
proceso, o de aquellos cuyos productos son necesa-
rios para la reaccin.
En la FIGURA .21 se muestran ejemplos de cor-
te y empalme alternos, en los cuales, el sitio respec-
tivo se mantiene constante, mientras que el otro
vara. Los antgenos T grande/t pequea de SV40
y el producto de la regin de El A adenovrico se
generan por conexin de un 5
'
variante con un 3'
constante, mientras que en el caso de los antgenos
T/t el sitio 5' utilizado para el antgeno T elimina
un codn de terminacin presente en el RNAm del
antgeno t, de manera que el antgeno T es ms
grande que el antgeno t. En el caso de los produc-
tos de transcripcin de E1A, uno de los sitios 5' se
conecta con el ltimo exn en un marco de lectura
diferente, nuevamente a travs de un cambio sig-
nificativo en la parte terminal-C de la protena. En
estos ejemplos, todos los sucesos de corte y empal-
me importantes ocurren en todas las clulas donde
se expresa el gen, de manera que se hacen todos los
productos protenicos.
Hay diferencias en la relacin de antgenos T/t
en diferentes tipos de clulas. La protena extrada de
clulas que producen relativamente ms antgeno t
pequeo, puede dar lugar a la produccin preferen-
cial de RNA de t pequeo en extractos de otros tipos
26.12 El proceso de corte y empalme alternativo implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme
685
li|IJ,.l-Ml..l
alternos generan mu
Los antgenos T/t de SV40 cortan y empalman dos
sitios 5' con el sitio 2' usual
1 2 3 Exones
La El A de adenovirus corta y empalma sitios variables
5' a un sitio 3' comn
12 3 4 Exones
"
289 aminocidos
243 aminocidos
13S
55 aminocidos
Marcos de lectura alternos
El tra de D. melanogaster corta y empalma el sitio 5'
con sitios 3' alternos
1 2 3 Exones
A
A
.
Macho y hembra
?Sin protena
Slo la hembra
:200 aminocidos
1 Las formas alternativas de corte y empalme
pueden generar diversos productos proteinicos a partir de un
gen individual. El cambio de los sitios de corte y empalme pue-
de introducir codones de terminacin (marcados con asteriscos)
o cambiar los marcos de lectura.
celulares. Esta protena, llamada ASF (factor de cor-
te y empalme alternativo), resulta ser la misma que
el factor de corte y empalme SF2, necesario para los
primeros pasos del ensamblaje del empalmosoma y
para la primera reaccin de escisin-ligacin (vase
la Fig. 26.13). La ASF/SF2 es una protena de unin
de RNA de la familia SR. Cuando un pre-RNAm
tiene ms de un sitio de corte y empalme 5' que
precede a un solo sitio de corte y empalme 3
'
,
el
aumento de concentracin de ASF/SF2 promueve
el uso del sitio 5
'
ms cercano al 3', a expensas del
otro, efecto que puede ser contrarrestado por otro
factor de corte y empalme, SF5.
An se desconoce la funcin molecular exacta
de los factores en el control de la limitacin del corte
y empalme, pero en trminos generales, se observa
que el corte y empalme alternativos que implican a
diferentes sitios 5' puede ser influido por protenas
involucradas en el ensamblaje del empalmosoma.
En el caso de los antgenos T/t, el efecto tal vez yace
en una mayor unin de las protenas SR con el sitio
preferido. El corte y empalme alternativo tambin
puede ser influido por la represin de un sitio. Los
exones 2 y 3 del gen T de troponina de ratn son
mutuamente excluyentes, se usa el 2 en el ms.
liso y 3 en los otros tejidos. El msculo liso ccr
protenas que se unen a elementos repetidos I:
zados a cada lado del exn 3 que impiden el 0
los sitios 3' y 5' necesarios para incluirlo.
La va de determinacin del sexo en D. md
gaster implica interacciones en una serie de g
donde sucesos de corte y empalme alternos dis
guen a machos y hembras. La va toma la :
ilustrada en la 26.22, en la cual, la xt.i
de cromosomas X con autosomas determina M
presin de sxl y los cambios de expresin pasa
cuencialmente a travs de los otros genes hac;
el ltimo de la va.
La va se inicia con el corte y empalme tr
fleo de sexo de sxl. El exn 3 del gen sxl cor"
un codn de terminacin que impide la sntesi
una protena funcional, adems de estar incluidi
el RNAm producido en los machos, pero se pa 11
alto en las hembras. (Otro ejemplo de la evi::
de exones se ilustra la .) Como resc
do, slo las hembras producen la protena Sxl
concentracin de aminocidos bsicos simula *
otras protenas de unin de RNA.
La presencia de la protena Sxl cambia e! ;
y empalme del gen transformador (tra). En la n
26.21 se muestra que dicho proceso implica e] ;
y empalme de un sitio 5
'
constante con sitio? i
nativos 3
'
. El patrn de corte y empalme se pres
en machos y hembras, y da como resultado ur_
con un codn temprano de terminacin. La pres
ca de la protena Sxl inhibe el uso del sitio nor
de corte y empalme 3' por unin con la va de
lipirimidina, en su sitio de ramificacin. Cuand
pasa por alto ese sitio, se utiliza el siguiente s
:
.:;
con lo cual se genera un RNAm especfico fem:
que codifica a una protena.
As pues, tra produce una protena slo en
bras, que es un regulador de corte y empalme, t
2 tiene una fundn similar en las hembras
tambin se expresa en la lnea germinativa n:;
lina). Las protenas Tra y Tra2 son factores de
te y empalme SR que actan directamente a
productos de transcripcin diana, adems de co
rar (en las hembras) en la modificacin del co:
empalme de dsx.
En la Figura 26.23 se muestran ejemplos el!
los sitios de corte y empalme se usan para ag
o sustituir exones o intrones, con la consigu:
sintetizacin, otra vez, de diferentes producto
tenicos. En el gen de doble sexo {dsx), en las 1:
bras empalman el sitio 5' del intrn 3 con el
3' d
e ese mismo intrn, de modo que la tradut
termina al final del exn 4. En los machos, d
5' d
el intrn 3 se empalma directamente con !
tio 3' del intrn 4, de modo que se omite el ex
686 CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
del RNAm, y se permite a la traduccin continuar
hasta el exn 6. El resultado del corte y empalme
alternativos es que se producen diferentes prote-
nas en cada sexo. El producto masculino bloquea
P diferenciacin sexual femenina, en tanto que el
producto femenino reprime la expresin de genes
Especficos del macho.
El corte y empalme alternativos de RNA dsx es
controlado por la competencia entre sitios de corte
\l empalme 3'. El RNA dsx contiene un elemento de
mijo descendente en el sitio de corte y empalme 3',
en el extremo izquierdo, el cual se une a Tra2; las
protenas Tra y SR se vinculan con Tra2 en el sitio,
que se convierte en un promotor de la unin de
U2AF con la va adyacente de pirimidina, fenmeno
que asigna el sitio 3
'
para la formacin del empal-
mosoma en las hembras, ms que el sitio alternativo
3
'
. Las protenas reconocen al promotor de manera
cooperativa, tal vez dependiendo de la formacin
de alguna estructura secundaria, as como de la se-
;uencia en s.
As pues, la determinacin del sexo tiene una
simetra complaciente: la va se inicia con un su-
ceso especfico de corte y empalme femenino que
provoca la omisin de un exn que tiene un codn
de terminacin y termina con un suceso de corte y
empalme especfico femenino que lleva a la inclu-
sin de un exn que tiene un codn de terminacin.
tos sucesos tienen diferentes bases moleculares; en
el primer punto de control, Sxl inhibe el patrn de
corte y empalme predeterminado, y en el ltimo,
Tra y Tra2 cooperan para promover el corte y em-
palme especfico femenino.
Las protenas Tra y Tra2 no son necesarias para
el corte y empalme normales, pues en su ausen-
cia
, las moscas se desarrollan normalmente (como
machos). Como reguladores especficos, no necesa-
riamente necesitan participar en la mecnica de la
reaccin de corte y empalme, a ese respecto difieren
ie SF2, que es un factor general requerido para el
;
orte y empalme, pero tambin puede influir en la
seleccin de sitios alternos.
Los elementos P de B. melanogaster muestran
un patrn de corte y empalme especfico de tejido.
En las clulas somticas hay dos sucesos de corte
y empalme, pero en la lnea germinativa, un su-
ceso adicional elimina otro intrn. Un codn de
lerminacin yace en el intrn especfico de lnea
germinativa, de modo que se produce una protena
'
ms larga (con diferentes propiedades) en la lnea
terminativa. En la seccin 21.15, Los elementos P
K activan en la lnea germinativa, se analizan las
consecuencias del control de la transposicin, pero
or ahora, se seala que la especificidad de tejido
B resultado de diferencias en el aparato de corte y
rmpalme.
La determinacin del sexo se controla por diferencias
en el corte y empalme
Va .nascu::. .a Va _:.ier..:.a
ajos . C(
Razn X:A
sin producto
Corte y empalme
predeterminados
sin producto
Corte y empalme
predeterminados
sin producto
Protena Dsx
especfica
masculina
mpide la diferenciacin
femenina (y promueve
el desarrollo masculino)
i Mortal respecto -
del sexo
+
Alta
e Ae Protenas,,.
Transformador
. ransformador 2
Ooble sexo
Protena Tra
Promueve el corte
y empalma femeninos
9 0\ Protena Tra2
S K Protena "sx
V
:
"
acho
espec.
'
.
'
a
femenina
Suprime los genes
masculinos (y promueve
el desarrollo femenino)
. ..._ra
Z La determinacin del sexo en D. melanogaster implica
una va en que tienen lugar diferentes sucesos de corte y empalme
en las hembras. El bloqueo en cualquier etapa de la va da lugar al
desarrollo masculino.
El corte y empalme alternativos puede sustituir exones
El Dsx de D. melanogaster pasa por alto un exn
A A A
A A
Hembra
Macho
El a tropomiosina corta y empalma exones alternativos
Msculo liso
Otros tejidos
Los elementos P escinden un intrn adicional
A A >
Protena somtica
66K
Protena de lnea
germinativa 87K
3 Los sucesos de corte y empalme alternos que
involucran ambos sitios pueden dar lugar a adicin o sustitu-
cin de exones.
La va de corte y empalme predeterminada del
preRNAm del elemento P es el patrn germinativo,
cuando el RNA es sometido a un extracto de corte y
26.12 El proceso de corte y empalme alternativo implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme
68"
empalme heterlogo (humano) en el cual se escinde
el intrn 3. Los extractos de clulas somticas de D.
melanogaster, sin embargo, contienen una protena
que inhibe la escisin de dicho intrn. La protena se
une a secuencias del exn 3, y si esas secuencias pre-
sentan delecin, el intrn se escinde, de modo que la
funcin de la protena quiz sea reprimir el vnculo
del empalmosoma con el sitio 5' del intrn 3,
PTffl Las reacciones de corte
y empalme en configuracin
trans utilizan RNA pequeos
Conceptos principales
.
Las reacciones de corte y empalme suelen ocurrir slo
entre uniones de corte y empalme en configuracin cis
de la misma molcula de RNA.
En los tripanosomas y gusanos ocurren corte y
empalme en configuracin trans en el sitio en que una
secuencia corta (RNA SL) se empalma con los extremos
5
'
de muchos RNAm precursores.
.
La estructura del RNA SL simula el sitio de unin Sm de
[os RNAsn U y podra tener una participacin anloga
en la reaccin.
Desde una perspectiva tanto mecanstica como evo-
lutiva, el corte y empalme se considera como una
reaccin intramolecular que resulta esencialmente
en una delecin controlada de las secuencias de in-
trn en el mbito del RNA. Desde un punto de vista
gentico, el corte y empalme ocurre slo en confi-
guracin cis, lo cual significa que slo las sec:.:
de la misma molcula de RNA pueden cortarse y t -
marse juntas. En la parte superior de la FIGURA 2
se muestra la situacin normal, los intronei -
den eliminarse de cada molcula de RNA de .
de permitir el corte y empalme simultneo : _
exones, pero no hay corte y empalme interr::
lar de exones entre molculas de RNA. No Se
de decir que nunca ocurra un corte y empaln f
configuracin cis, entre productos de transen; :
pre-RNAm del mismo gen, pero se sabe que
ser excesivamente raro, pues si fuese frecuente
exones del gen podran complementarse gene
mente, en vez de pertenecer a un solo grupo
complementacin.
Algunas manipulaciones pueden generar
te y empalme en configuracin trans; en el eje:
de la parte inferior de la Figura 26.24 se intre ;
ron secuencias complementarias en los intron :
dos RNA. El apareamiento de bases entre los :
plementos debera crear una molcula con forr:;
H
, que podra empalmarse en configuracin :
para conectar exones de las molculas de RNA
tapuestas; ambas reacciones ocurren in vitro.
Otra situacin en que es posible un corte y :
palme en configuracin trans in vitro se presrr
cuando se proporcionan substratos de RNA. _
-
que contiene un sitio de corte y empalme 5
'
y
con un sitio de corte y empalme 3
'
,
aunados a
cuencias d flujo descendente apropiadas (ya sea
siguiente sitio de corte y empalme 5
'
, o un p
dador de corte y empalme). De hecho, ste sin
Exn 1
El corte y empalme normal ocurre slo en configuracin cis
Intrn Exn 2 Exn 3 Intrn Exn 4
Puede ocurrir corte y empalme en configuracin trans si se introducen secuencias
complementarias en los intrones
Exn 1
.
Intrn Exn 2
Exn 3 Intrn Exn 4
Productos de corte y empalme
en configuracin cis
Productos de corte y empalme
en configuracin trans
El corte y empalme suele ocurrir slo en configuracin ci5 entre exones de
la misma molcula fsica de DNA, pero en configuracin trans que soportan el apareamiento
de bases entre intrones.
588 CAPTULO 26 Corte
, empalme y procesamiento del RNA
el corte y empalme por definicin del exn (vase
parte derecha de la Figura 26.12) y muestra que, in
piro, no es necesario que los sitios de corte y empal-
me izquierdo y derecho se encuentren en la misma
molcula de RNA.
Estos resultados demuestran que no hay impe-
dimento mecanstico para el ensamblaje en confi-
guracin trans y descartan modelos de corte y em-
palme que exijan el movimiento progresivo de un
empalmosoma a lo largo del RNA; por otra parte,
el empalmosoma debe ser capaz de reconocer los
sitios de corte y empalme 5
'
y 3' de diferentes RNA,
cuando estn muy cerca.
Aunque el corte y empalme en configuracin
trans es raro in vivo, ocurre en circunstancias espe-
ciales. Uno se revela por la presencia de una secuen-
cia lder de 35 bases al final de numerosos RNAm,
en el tripanosoma, si bien la secuencia lder no se
codifica en flujo ascendente respecto de las unida-
des de transcripcin individual. Por el contrario, se
transcribe en un RNA independiente que porta se-
cuencias adicionales en el extremo 3
'
,
desde una
unidad repetitiva localizada en otra parte del ge-
noma. En la IGURA 26.25 se muestra que ese RNA
corta la secuencia lder de 35 bases seguida de una
secuencia de sitio de corte y empalme 5
'
. Las se-
cuencias de codificacin del RNAm portan un sitio
de corte y empalme 3' inmediatamente anterior a la
secuencia que se encuentra en el RNAm maduro.
Cuando se conectan la secuencia lder y el
RNAm mediante una reaccin de corte y empal-
me en configuracin trans, efectivamente la regin
3
'
*
del RNA lder y la 5' del RNAm constituyen las
mitades 5
'
y 3' de un intrn. Al ocurrir el corte y
empalme, se forma un enlace 5
'
-
2'
por la reaccin
usual entre GU del intrn 5
'
y la secuencia de ra-
mificacin cercana al AG del intrn 3
'
; no hay un
enlace covalente entre ambas partes del intrn, y
feor ello generan una molcula en forma de Y, no
un lazo.
La situacin similar es con la expresin de genes
de actina en el Clostridium elegans; tres RNAm de
actina (y algunos ms de RNA) comparten la misma
secuencia lder de 22 bases en el extremo 5
'
. La se-
cuencia lder no est codificada en el gen de actina,
pero se' transcribe de manera independiente como
parte de un RNA de 100 bases, codificado por un
gen en otra parte. El corte y empalme en configura-
cin trans tambin ocurre en los cloroplastos.
El RNA que dona el exn 5' para el corte y em-
hpalme en configuracin trans, se denomina RNA
SL (RNA lder con corte y empalme). Los RNA
SL que se encuentran en varias especies de tripa-
nosomas
, y tambin en el nematodo (C. elegans),
presentan algunas caractersticas comunes; se plie-
gan en una estructura secundaria comn que tiene
tres tallos-lazos y una regin de una sola cadena
que simula el sitio de unin de Sm, de manera que
se presentan como RNPsn que forman parte de la
clase Sm de RNPsn. Los tripanosomas poseen los
RNAsn U2, U4 y U6, no as Ul o U5. La ausencia
de RNAsn Ul se puede explicar por las propiedades
del RNA SL, susceptible de realizar las funciones
que el RNAsn Ul suele desempear en el sitio de
corte y empalme 5
'
, de modo que el RNA SL cons-
ta efectivamente de una secuencia de RNAsn que
posee funcin Ul enlazada al sitio de exn-intrn
que reconoce.
Hay dos tipos de RNA SL en C. elegans; el RNA
SL1 (primero en ser descubierto) se utiliza para cor-
te y empalme de secuencias de codificacin prece-
didas slo por regiones 5' no traducidas (situacin
ms frecuente), en tanto que el RNA SL2 se usa en
casos en que un pre-RNAm contiene dos secuencias
de codificacin; se corta y empalma a la segunda
liberndose de la primera y permitiendo que se uti-
lice como RNAm independiente. Cerca del 15% de
los genes de C. elegans estn organizados en unida-
des de transcripcin que incluyen ms de un gen
(lo ms frecuente es que sean de dos a tres). An
no se define el significado de esa forma de organi-
zacin para el control de la expresin gnica. En
general, esas unidades de transcripcin no simulan
operones, en los cuales los genes actan de manera
coordinada en una va.
El SL RNA se corta y empalma en configuracin trans
Repeticiones seriadas Unidades de transcripcin
de la unidad lder individuales
rde
100 bases
35 bases
- GU
Secuencia de RNAm
A AG===
Intrn izquierdo? Intrn derecho?
\ Lder
G Molcula con forma de Y
- AG -
Lder de Secuencia de RNAm
35 bases
6.25 El SLRNA proporciona un exn conectado con el
primer exn de un RNAm por corte y empalme en configuracin
trans. La reaccin implica las mismas interacciones que el corte
y empalme en configuracin cis nuclear, pero genera un RNA
con forma de Y, en vez de un lazo.
26.13 Las reacciones de corte y empalme en configuracin trans utilizan RNA pequeos
689
La reaccin de corte y empalme en configura-
cin trans del RNA SL puede representar un avance
en la evolucin del aparato de corte y empalme pre-
RNAm. En configuracin cis, el RNA SL proporciona
la capacidad de reconocer el sitio de corte y empal-
me 5
'
, probabilidad que depende de la conformacin
especfica del RNA; las fundones restantes requeri-
das para el corte y empalme provienen del RNPsn.
Por otra parte, el RNA SL puede actuar sin partici-
pacin de las protenas, como las RNPsn en Ul, lo
cual sugiere que el reconocimiento del sitio de corte
y empalme 5
'
depende directamente del RNA.
EL corte y empaLme deL RNAt
en Levaduras impLica escisin
y reunin
Concepto principal
El corte y empalme de RNAt se debe a reacciones
sucesivas de escisin y reunin.
Casi todas las reacciones de corte y empalme de-
penden de secuencias de consenso cortas y ocurren
por transesterificacin, donde se coordina la rotura
y estructuracin de enlaces, en tanto que el corte
y empalme de los genes de RNAt se logra por un
mecanismo diferente, que depende de reacciones
independientes de escisin y reunin.
Unos 59 de los 272 genes de RNAt nuclear de la
levadura S. cerevisiae estn interrumpidos; cada uno
tiene un solo intrn localizado apenas un nucleti-
do ms all del sitio 3' del anticodn. La longitud de
los intrones flucta entre 14 y 60 bp; los de genes
de RNAt relacionados tienen vnculos en secuencia,
pero los intrones de genes de RNAt que representan
diferentes aminocidos no estn relacionados. No
hay secuencia de consenso que pueda ser reconocida por las
enzimas de corte y empalme, lo cual tambin es vlido
para los genes nucleares de RNAt interrumpidos en
plantas, anfibios y mamferos.
Todos los intrones incluyen una secuencia com-
plementaria a la del anticodn de RNAt, lo cual da
lugar a una conformacin alternativa para el brazo
del anticodn, en la que sus bases se aparean para
formar una extensin del brazo usual, como en el
ejemplo de la FIGURA 26.26, slo se afecta el brazo
del anticodn, el resto de la molcula conserva su
estructura usual.
La secuencia y el tamao exacto del intrn care-
cen de importancia, casi ninguna mutacin impide el
corte y empalme; el corte y empalme del RNAt depende
sobre todo del reconocimiento de una estructura secundaria
comn en el RNAt, ms que de una secuencia comn del
intrn. Las regiones de varias partes de la molcula
El corte y empalme del RNAt reconoce
una estructura especifica
RNAt maduro RNAt precursor
C G
G A
AU
G C
A? A
'
/Apareamiento
GG
A U
C A
U a
A
Anticodn
m
GC
GUC
El intrn se aparea
con el asa anticodn
El intrn en el RNAt de levaduras apare
bases con el anticodn para cambiar la estructura del
anticodn; el apareamiento entre una base excluida del
y el asa del intrn del precursor puede ser necesario p,
corte y empalme.
son importantes, incluido el segmento entre el b
aceptor y el brazo D, del brazo C TF, y especialr
te el brazo anticodn. Esto recuerda las exige;
estructurales impuestas al RNAt para la sntesi
protenas (vase Cap. 8, Sntesis de protenas).
Sin embargo, el intrn no carece por comp
de importancia, se necesita el apareamiento o
una base del asa del intrn y una base no par
del tallo para el corte y empalme. Las mutacic
en otras posiciones que influyen en dicho ap;
miento (por ejemplo, para generar patrones i
nativos de apareamiento) intervienen en el [
y empalme. Las reglas que rigen la disponib:
de precursores de RNAt para el corte y empalnu
asemejan a las que dirigen el reconocimiento ]
las sintetasas de aminoacil-RNAt (vase la sec
9
.
9
, Los RNAt son cargados con aminocidos
las sintetasas).
En un mutante de levadura sensible a la te:
ratura, que no puede eliminar los intrones, le?
cursores interrumpidos se acumulan en el nc.
pueden ser usados como sustratos por un sist
libre de clulas extrado de las de tipo silvestn
lo cual puede resultar el corte y empalme de-
cursor, en virtud de la disminucin de tama.
sultante. Esto se observa en la electroforesis e:
por un cambio en la posicin de la banda, con
ilustra en la 26.27. La disminucin de
o se discierne por la aparicin de una bandr
representa al intrn.
El extracto libre de clulas puede fraccio
se probando la capacidad de corte y empabn-
RNAt. La reaccin in vitro requiere de ATP. L,
racterizacin de las reacciones que ocurren cor
ATP muestra que dos etapas separadas de la rer
son catalizadas por diferentes enzimas.
690
CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
El corte y empalme de RNAt libera
el inirn RNAt+
Incubacin con
extracto de corte y
empalme in vitro
Electroforesis en ge!
1 i
Precursor
RNAt
Intrn
FIGURA 26.27 EL corte y empalme del RNAt de levaduras in
vitro puede ir seguido del anlisis del RNA precursor y Los pro-
ductos por electroforesis en gel.
El primer paso no requiere de ATP; implica
rotura del enlace fosfodister por una reac-
cin de nucleasa inusual; es catalizada por
una endonucleasa.
El segundo paso requiere de ATP e implica la
formacin de un enlace, es una reaccin de
ligadura, y la enzima encargada de esa acti-
vidad se describe como una RNA ligasa.
La endonucleasa de corte
y empalme reconoce al RNAt
Conceptos principales
Una endonucleasa escinde Los precursores de RNAt en
ambos extremos del intrn.
La endonucleasa de las levaduras es un heterotetrmero
con dos subunidades catalticas (relacionadas).
Utiliza un mecanismo de medicin para determinar los
sitios de escisin por sus posiciones relativas respecto
de un punto de la estructura del RNAt.
La nucleasa antigua tiene una estructura ms sencilla
y reconoce segmentos estructurales de protuberancia-
hlice-protuberancia en el sustrato.
La endonucleasa se encarga de la especificidad del
reconocimiento del intrn y de escindir al precursor
en ambos extremos del mismo. La endonucleasa de
la levadura es una protena heterotetramrica cuyas
actividades se ilustran en la . Las sub-
unidades relacionadas Sen 34 y Sen2 escinden los
sitios de corte y empalme 3' y 5', respectivamente.
La subunidad Sen54 puede determinar los sitios de
El complejo de endonucleasa tiene
cuatro protenas
I
Par de
bases
Anticodn
Escisin 3'
Sen34
Escisin 5'
Sen2
Sen15-
0= Par de bases anticodn-intrn (Al)
.
28 Las escisiones 3' y 5' del pre-RNAt de 5. ce-
revisiae son catalizadas por diferentes subunidades de endo-
nucleasa; otra subunidad puede determinar la localizacin de
los sitios de escisin determinando la distancia a partir de la
estructura madura. El par de bases AI tambin es importante.
EL pre-RNAt se corla y em
en las protuberancia
5' 3
'
G c
Pu Py
Pu
-
Protuberancia
C G
C G
7
Hlice
Pu
-
Protuberancia
Pu Py
Pu Py
FIGURA 26.29 La endonucleasa de corte y empalme del RNAt
arcaico escinde las cadenas que sobresalen en un segmento
protrusin-hlice-protrusin.
escisin
"
midiendo
"
la distancia desde un punto de
la estructura del RNAt que se encuentra en el codo
de la estructura en forma de L (madura). Se desco-
noce la participacin de la subunidad Senl5, pero
su gen es indispensable en las levaduras, pues se
requiere el par de bases que forma entre la primera
base del asa del anticodn y la base precedente del
sitio de corte y empalme 3
'
para el sitio de escisin
del corte y empalme 3'.
Una profundizacin interesante en la evolucin
del corte y empalme del RNAt proviene de las endo-
nucleasas arcaicas, homodmeros u homotetrmeros
en que cada subunidad tiene un sitio activo (aun-
que slo dos de ellos funcionan en el tetrmero) que
fragmenta uno de los sitios de corte y empalme. La
subunidad tiene secuencias relacionadas con las se-
Z6AS La endonucleasa de corte y empalme reconoce al RNAt
691
cuencias de sitios activos de las subunidades Sen34
y Sen2 de la enzima de levaduras. Sin embargo, la
enzima arcaica reconoce su sustrato de forma dife-
rente, y en lugar de medir la distancia a partir de
secuencias especficas, reconoce la caracterstica es-
tructural llamada protrusin-hlice-protrusin. En
la FIGURA 26.29 se muestra que la escisin ocurre en
ambas protrusiones.
As, el inicio del corte y empalme del RNAt pre-
cede a la separacin de las enzimas arcaicas y las
eucariotas, si se origin a raz de la insercin del
intrn en el RNAt, debe haber sido un suceso muy
antiguo.
ffin La escisin y La Ligadura cleL
RNAt son reacciones separadas
Conceptos principales
La liberacin delintrn genera dos mitades de RNAt
que se unen para formar la estructura madura.
Las mitades tienen los extremos singulares 5' hidroxilo
y 2-3
'
fosfato cclico.
El extremo 5'-0H es fosforilado por una cinasa de
polinucletidos; la fosfodiesterasa abre el grupo fosfato
cclico para producir un extremo 2
'
fosfato y un grupo
3
-OH; los extremos de los exones se unen por accin
de una ligasa de RNA y el 2' fosfato es retirado por una
fosfatasa,
El corte y empalme del RNAt tienen etapas
de escisin y ligacin separadas
Nucleasa
2
'
-3' P
2
'
-3
/
P
Plegamiento
La fosfodiesterasa abre el anillo fosfato
Cadena
RNAt
0
Base
Ligasa
OH 5'
La cinasa fosforila el extremo 5'-OH
Cadena
-
x /
- OH 0
2
'
-3
'
fosfato 3'-HO, 2' fosfato
cclico RNAt
Base
Cadena
Base
26.30 El corte y empalme del RNAt requiere de actividades se-
paradas de nucleasa y ligasa. Los lmites de exn-intrn son escindidos
por la nucleasa para generar fosfato cclico de 2
'
a 3' y un extremo 5'
OH. El fosfato cclico se abre para generar los grupos 3'-0H y 2' fosfato;
el 5
'
-
0H est fosforilado. Despus de liberar al intrn,
las mitades de
molculas de RNAt se pliegan en una estructura similar al RNAt, que
ahora tiene una rotura 3
'
-
0H, 5'-P, sellada por una ligasa.
La reaccin total del corte y empalme del RNAi
resume en la !:IGUR/ 26.30. Los productos de k
cisin son un intrn lineal y dos medias molc-
de RNAt.
Cada extremo 5' termina en un grupo hidrr
y cada extremo 3
'
en un grupo fosfato cclico 2'.
(Todas las dems enzimas de corte y empalme
RNA escinden el otro sitio del enlace fosfato.)
Las dos mitades de RNAt aparean sus bases |
formar una estructura similar al RNAt
, y cuandc
agrega ATP se presenta la segunda reaccin. Am
extremos inusuales generados por la endonuck
deben ser modificados, de modo que el grupo fos
cclico se abre para generar un extremo 2
'
fos:
reaccin que requiere de la actividad de la fosfod
terasa cclica. El producto tiene un grupo 2' ios:
y uno 3
'
-
OH.
El grupo 5-OH generado por la nucleasa c
ser fosforilado para dar uno 5
'
fosfato, lo que cr
na un sitio en el que el grupo 3
'
-
OH est cerca
5
'
fosfato. La integridad covalente de la cadem
polinucletidos se restablece entonces por acc
de una ligasa.
Las tres actividades, fosfodiesterasa, cinasa
polinucletidos y sintetasa de adenilato (que d
empea la funcin de ligasa) se disponen en
rentes dominios funcionales en una sola proter.
actan en forma seriada para unir las dos mita
de RNAt.
La molcula empalmada ahora es ininterni
pida, con un enlace 5
'
-
3' fosfato en el sitio de e
sin, pero tambin un grupo 2
'
fosfato que ms
el suceso. El grupo sobrante debe ser eliminado
una fosfatasa.
Durante la reaccin de corte y empalme
RNAt en plantas y mamferos tambin se gener
fosfato cclico 2', 3'; la reaccin en plantas parem
misma que en las levaduras, pero las reacciones I
micas detalladas son diferentes en los mamfer>
Los precursores de RNAt en levaduras tambi
pueden presentar corte y empalme en un ext:
to obtenido de la vescula germinal (ncleo) de
oocitos del gnero Xenopus, fenmeno que mu:
que la reaccin no es especfica de una especie, ?
que el gnero Xenopus debe contar con enzimas
paces de reconocer los intrones de los RNAt de
levaduras.
La capacidad de corte y empalme de los prod
tos de los genes de RNAt est, por tanto, bien c
servada, pero es posible que su origen sea diferei
del de otras reacciones de corte y empalme (o
el del pre-RNAm nuclear). La reaccin de corti
empalme de RNAt hace uso de escisin y sntesi?
enlaces y depende de las secuencias ajenas al int:
En otras reacciones de corte y empalme se utiliz
transesterificacin, en la cual se transfieren dire>
592
CAPTULO 25 Corte, empalme y procesamiento del RNA
mente los enlaces, y las secuencias requeridas para
la reaccin yacen en el intrn.
mre La respuesta de La protena no
plegada tiene relacin con el
corte y empalme del RNAt
Conceptos principales
.
La Irelp es una protena interna de La membrana
nuclear con su dominio terminaL-N en la Luz del ER y eL
terminaL-C en el ncleo.
.
La unin al dominio terminaL-N de una protena
no plegada activa La nucleasa terminaL-C por
autofosforilacin.
.
La nucleasa activada escinde al RNAm Hacl para Liberar
un intrn y generar exones que se unen por una ligasa
de RNAt.
. El RNAm Hacl escindido codifica un factor de
transcripcin que activa genes codificadores de
chaperones que ayudan a plegar las protenas no
plegadas.
tena a una forma ms estable, la cual proporciona
el factor de transcripcin funcional que activa los
genes con UPRE.
En esta reaccin participan componentes in-
usuales de corte y empalme. La Irelp tiene activi-
dad de endonucleasa, que acta directamente en el
RNAm de Hacl para escindir las dos uniones de corte
y empalme, las cuales estn unidas por la ligasa de
RNAt, la cual acta en la va de corte y empalme
de RNAt. La reaccin de endonucleasa simula la es-
cisin del RNAt durante el corte y empalme.
Dnde ocurre la modificacin del RNAm Hacl?
Es probable que la Irelp est en la membrana inter-
na del ncleo, con el dominio sensor terminal-N en
la luz del ER y el terminal-C cinasa/nucleasa en el
ncleo, lo cual le permitira actuar directamente en
el RNA de Hacl antes de que se exporte al citoplas-
ma, adems de facilitar el acceso a la RNAt ligasa.
No hay una relacin aparente entre la actividad de
nucleasa de Irelp y la de endonucleasa de corte y
empalme del RNAt, de modo que no es obvio cmo
evolucion este sistema especializado.
Un sistema de corte y empalme desusado relacio-
nado con el corte y empalme del RNAt media la
respuesta a las protenas no plegadas de las leva-
duras. La acumulacin de este tipo de protenas en
la luz del retculo endoplsmico (ER) desencadena
una va de respuesta qu lleva al aumento de la
transcripcin de genes que codifican chaperones,
los cuales facilitan el plegamiento de las protenas
en el ER, de modo que debe trasmitirse una seal
de la luz del ER al ncleo.
El censor que activa la va es la protena Irelp,
protena integral de membrana de tipo cinasa (Ser/
Treo) que tiene dominios a cada lado de la mem-
brana del ER. El dominio terminal-N, en la luz del
ER, detecta las protenas no plegadas, supuestamen-
te por unin con los segmentos expuestos, lo cual
provoca la agregacin de monmeros y activa el
dominio terminal-C en el otro lado de la membrana
por autofosforilacin.
Los genes activados por esta va tienen un ele-
mento promotor comn llamado UPRE (elemento
de respuesta de protena no plegada), al cual se une
el factor de transcripcin Haclp para producir una
respuesta a la acumulacin de protenas no plega-
das; el desencadenante de la produccin de Haclp
es la accin de Irelp en el RNAm de Hacl.
La operacin de la va se resume en la FIGURA
26.31. En condiciones normales, cuando la va no
est activada, el RNAm de Hacl se traduce en una
protena que se fragmenta rpidamente. La acti-
vacin de Irelp da origen al corte y empalme del
RNAm de Hacl que cambiar la secuencia de la pro-
El dominio ER-luminal
se une con la protena
no plegada
El dominio nuclear/
citoslico escinde el
HAd RNAm
Traduccin
Ligasa
'
'
de RNAt
|(
Degradacin Traduccin
HAC1
UPRE
FIGURA 26.31 La respuesta de La protena no plegada se pro-
duce por activacin de un corte y empalme especial del RNAm
HAC1 para producir un factor de transcripcin que reconoce
al UPRE.
26.17 La respuesta de la protena no plegada tiene relacin con el corte y empalme del RNAt
Los extremos 3' de Los
productos de transcripcin
pol I y pol III se generan
por terminacin
Conceptos principales
.
La polimerasa I de RNA termina la transcripcin con
una secuencia Analizadora de 18 bases.
.
La polimerasa III de RNA termina la transcripcin en la
secuencia poli (U)4 de una secuencia rica en G-C.
Los extremos 3' del RNA pueden generarse en dos
formas. Algunas polimerasas de RNA terminan la
transcripcin en una secuencia definida (termi-
ri'i,i'ii'i'i,:iiiifH'iir-MH;iiii,ri,i,HiMiJ
Promotor Terminador
5
'
FIGURA 26 Cuando se genera un extremo 3' por termina-
cin, la polimerasa de RNA y el RNA se liberan en una secuencia
definida (de terminacin) en el DNA.
Se puede generar un extremo 3' por escisin
FIGURA 26.: Cuando se genera un extremo 3' por escisin,
la
polimerasa de RNA contina la transcripcin, mientras una endo-
nucleasa hace un corte en una secuencia definida en el RNA.
nadora) en el DNA, como se muestra en la
26.32
, en tanto que otras polimerasas de RNA r
muestran una terminacin definida, sino que cor-
tinan ms all del sitio que corresponde al extren:
3'
generado por la escisin del RNA por una ene
nucleasa, como se muestra en la GURA 26.33.
La informacin acerca de la reaccin de termi-
nacin para las polimerasas de RNA eucariticas e
menos detallada que el conocimiento que se tier_:
de la iniciacin. Las polimerasas I y III de RNA r.r
nen sucesos de terminacin bien definidos (cor
la polimerasa de RNA bacteriana), pero no se ;
aclarado si la polimerasa II de RNA suele termir.
-
de esa forma.
Para la polimerasa I de RNA, el producto tl
co de transcripcin es un gran precursor que ce r
tiene las secuencias del RNAr mayor. El precurs
est sujeto a un procesamiento extenso, con u"
terminacin en un sitio definido >I00 bp en flu
descendente respecto del extremo 3' maduro, gen -:
rado por corte y empalme. La terminacin implica
el reconocimiento de una secuencia terminadora :
18 bases por un factor auxiliar.
Con la polimerasa III de RNA, la transcripc: _
-
invitro genera molculas con los mismos extrer:.
5
'
y 3' que los sintetizados in vivo. La reaccin ; -
terminacin simula la terminacin intrnseca r
la polimerasa de RNA bacteriana (vase la secc
11.21, Hay dos tipos de terminadores en E. coli). 1;
terminacin suele ocurrir en el segundo U de un;
serie de cuatro bases U, pero hay heterogeneidec
de modo que algunas molculas terminan en tf
o hasta cuatro bases U. La misma heterogeneic:
se observa en molculas sintetizadas in vivo, de rn:
era que parece una caracterstica de buena fe de
reaccin de terminacin.
Como los terminadores procariticos, la Se-
de U est incrustada en una regin rica en G-C
aunque hay secuencias simtricas cada 180, no ?: -
necesarias para la terminacin, pues las mutacin
que eliminan la simetra no evitan la conclus: "
normal de la sntesis de RNA; tampoco hay secuen-
cias necesarias ms all de la serie U porque todss
las secuencias vitales pueden ser sustituidas, ; -
ningn efecto en la terminacin.
La serie U misma no es suficiente para la r;
minacin porque hay regiones de cuatro molcn
"
:
U sucesivas en las unidades de transcripcin ledas
por la polimerasa III de RNA (si bien no hay se- =
U
5
internas, lo cual coincide con una mayor efics r
en la terminacin cuando el terminador es U
5,
nii
que una secuencia U4). As pues, la caracterstica
clave de la terminacin debe ser el reconocimien
de una secuencia U
4
en un contexto rico en pa n
de bases G-C.
694
CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
Cmo ocurre la reaccin de terminacin? No
r puede confiar en la debilidad de la regin del
ubrido RNA-DNA rU-dA que yace en el extremo
el transcrito, pues a menudo slo se transcriben
las primeras dos molculas de U. Tal vez la regin
rica en G-C participe en el enlentecimiento de la
enzima
, pero no parece que una contraparte de
a horquilla est involucrada en la terminacin en
as procariotas. Se mantiene el enigma en cuanto a
la forma en que la enzima puede responder de ma-
nera tan especfica a una seal tan breve. A diferen-
a de la reaccin de iniciacin, que la polimerasa
HI de RNA no puede realizar sola, la terminacin
carece ser una funcin de la enzima misma.
Los extremos 3' deL RNAm
se generan por escisin
y poLiadeniLacin
Conceptos principales
La secuencia AAUAAA es una seal para La escisin,
que genera un extremo 3
'
del RNAm poliadenilado.
.
La reaccin requiere de un complejo protenico que
contiene un factor de especificidad, una endonucleasa
y una polimerasa poli(A).
.
El factor de especificidad y La endonucleasa escinden el
RNA en flujo descendente respecto de AAUAAA.
.
EL factor de especificidad y la polimerasa poli(A)
agregan continuamente ~200 molculas de A al
extremo 3
'
.
los extremos 3' del RNAm son generados por es-
;
isin, seguida de poliadenilacin. La adicin de
poli(A) al RNA nuclear puede evitarse mediante el
anlogo desoxiadenosina, que tambin se conoce
como cordicepina, que si bien no detiene la trans-
cripcin del RNA nuclear, al agregarla se impide la
aparicin de RNAm en el citoplasma,
con lo cual se
demuestra que la poliadenilacin es necesaria para la
maduracin del RNAm a partir del RNA nuclear,
La generacin del extremo 3' se ilustra en la
FIGURA 26.34. La polimerasa de RNA transcribe ms
n del sitio correspondiente al extremo 3',
de modo
que las secuencias de RNA se reconocen como dianas
ara un corte endonucleoltico seguido de poliade-
nilacin; un solo complejo de procesamiento realiza
el corte y la poliadenilacin; esta ltima estabiliza el
3NAm contra la fragmentacin desde el extremo 3';
el extremo 5
'
ya est estabilizado por el capuchn. La
polimerasa de RNA contina la transcripcin despus
le la escisin, pero el extremo 5' que se genera est
desprotegido.
El suceso de escisin proporciona un desencade-
nante indirecto de la terminacin por la polimerasa
II de RNA. Una exonucleasa se une con el extremo
5' d
el RNA, que sigue siendo transcrito despus de
la escisin y fragmenta al RNA en forma ms rpi-
da que su sntesis; se aparea con la polimerasa de
RNA para despus interactuar con protenas auxi-
liares unidas al dominio carboxilo terminal de la po-
limerasa, interaccin que desencadena la liberacin
de la polimerasa de RNA del DNA y lleva a su fin
la transcripcin. El modelo global es similar al de la
participacin de Rho en la terminacin de la trans-
cripcin por la polimerasa de RNA bacteriana (vase
la seccin 11.22, Cmo fundona el factor Rho?), lo
que explica porqu los sitios de terminacin para la
polimerasa n de RNA no estn bien definidos, sino
que pueden ocurrir en varias localizaciones de una
prolongada regin de flujo descendente respecto del
sitio correspondiente al extremo 3
'
del RNA.
Una caracterstica comn del RNAm en euca-
riotas superiores (no as en las levaduras) es una
secuencia altamente conservada, AAUAAA, en la
regin de 11 a 30 nucletidos en flujo ascendente
respecto del sitio de adicin de poli (A). La delecin
o mutacin del hexmero AAUAAA impide la gene-
racin de un extremo 3
'
poliadenilado, pues la seal
es necesaria para la escisin y la poliadenilacin.
El desarrollo de un sistema en el cual la poliade-
nilacin ocurre in vitro, abri las puertas al anlisis
de las reacciones. La formacin y las funciones del
complejo que realiza el procesamiento 3
'
se ilustran
en la . I6URA 26.3S. La generacin de la estructura 3
'
terminal apropiada requiere de una endonucleasa
constituida por los componentes CF1 y CFII para
escindir el RNA, una polimerasa poli(A) (PAP)
El extremo 3' del RNAm se genera por escisin
Elongacin
Capuchn 5'
V
Escisin
i
*
Endonucleasa
El RNAm se estabiliza por poliadenilacin
Exonucleasa
Degradacin
Poliadenilacin
Capuchn S'/V/V AAUAAa/X/X
FIGURA 26 La secuencia AAUAAA es necesaria para que la
escisin genere un extremo 3
'
para la poliadenilacin.
26.19 Los extremos 3' del RNAm se generan por escisin y poliadenilacin 695
Hay un solo complejo de procesamiento 3' terminal
FIGURA 26.35 EL complejo de procesamiento 3' consiste de
varias actividades; el CPSF y el CstF constan cada uno de varias
subunidades; Los otros componentes son monomricos. La masa
total es de >900 kD.
para sintetizar la cola poli(A) y un componente
de especificidad (CPSF) que reconoce la secuencia
AAUAAA y dirige las otras actividades. Un factor de
estimulacin, CstF, se une a una secuencia rica en
G
-U en flujo descendente respecto del sitio mismo
de escisin.
El factor de especificidad contiene cuatro sub-
unidades que juntas se unen especficamente al
RNA que contiene la secuencia AAUAAA. Las sub-
unidades individuales son protenas con segmentos
de unin al RNA comunes, pero que por s mismas
se unen de manera inespecfica al RNA. Las inter-
acciones protena-protena entre subunidades tal
vez sean necesarias para generar el sitio de unin
especfico a AAUAAA. El CPSF se une fuertemente
a esta ltima slo cuando tambin est presente el
CstF para unirse al sitio rico en G-U.
Para las reacciones de escisin y poliadenila-
cin se necesita el factor de especificidad, que se
encuentra como complejo con la endonucleasi
polimerasa poli(A), complejo que suele realW
escisin seguida de poliadenilacin en una :
estrechamente acoplada.
Los dos componentes CFI y CFII (factorc
escisin I y II), aunados al factor de especlfic
son necesarios y suficientes para la escisin ?i
nucleoltica.
La polimerasa poli(A) tiene una actividad ;
ltica inespecfica. Cuando se combina con lo? c
componentes, la reaccin sinttica se hace er
fica del RNA que contiene la secuencia AAU.A
La reaccin de poliadenilacin pasa por dos eM
primero se agrega una secuencia ms bien c
oligo(A) (-10 molculas), al extremo 3', rea;
absolutamente dependiente de la secuencia AA
AA, que realiza la polimerasa poli(A) dirigida r
factor de especificidad. En la segunda fase,
U
oligo(A) se alarga hasta un total de -200 mol;
Dicha reaccin requiere de otro factor estimu!
que reconoce la cola oligo(A) y dirige a la pijK
rasa poli (A) especficamente a que extienda c-
tremo 3' de una secuencia poli(A).'
La polimerasa poli(A) agrega por s misma
lculas de A individuales a la posicin 3'. Su ::
intrnseca de accin es distributiva, se disocia
pus de que se ha agregado cada nucletido, ?i
en presencia de CPSF y PABP (protena de m
poli(A)) acta de manera progresiva para ext&
una cadena poli(A) individual. La PABP es uns
tena de 33 kb que se une de manera estequiom
ca al segmento poli(A), cuya longitud es contn
por la PABP, que de alguna manera limita la 3?
de la polimerasa poli(A) a -200 adiciones de r
culas de A. El lmite podra representar la acy
lacin de una masa crtica de PABP en la csK
poli(A). La PABP se une con un factor de inic-
ia traduccin, eIF4G, generando as una asa ct
da en la cual un complejo protenico contiena
extremos 5
'
y 3' del RNAm (vase la Fig. 8.2
la seccin 8.9, Las eucariotas usan un comple':
muchos factores de iniciacin).
La poliadenilacin determina de manera im
tante la funcin del RNAm, pues puede afectar 1
la estabilidad como el inicio de la traduccin {V
la seccin 7.10, El extremo 3' est poliadenik-
Durante el desarrollo embrionario de algunos o
nismos, la poli(A) controla la transduccin, de rfi
que los RNAm previos pueden estar poliadenil
(para estimular la traduccin) o desadenilados i
terminarla). Durante el desarrollo embrionario
gnero Xenopus, la poliadenilacin del RNAm
citoplasma depende de un elemento especfic
actuacin en configuracin cis (el CPE) en la col
otra frecuencia rica en AU, UUUUUAU.
5
'
3' CPSF
AAUAAA
PAP
El factor de escisin genera un extremo 3'
AAUAAA
'
C
La polimerasa poli(A) (PAP) agrega molculas de A
f PAP
AAUAAA \ AAAAAAAA-3'
..; CstF (
La protena de unin poli(A) (PBP) se une a poli(A)
PBP
AAUAAA AAAAAAAAAAAAAA-3'
*
CstF
El complejo se disocia despus de agregar -200
molculas de A
PBP
AAUAAA .. , AAAAAAAAAAAAAA-3'
CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
En los embriones del gnero Xenopus, cuando
menos dos tipos de secuencias de actuacin en con-
r
.guracin cis que se encuentran en la cola 3
'
pue-
den desencadenar la desadenilacin. Por una parte,
I EDEN (elemento de desadenilacin embrionaria)
rs una secuencia de 17 nucletidos, en tanto que
os elementos ARE son ricos en AU y suelen con-
:
ener repeticiones seriadas de AUUUA. Hay una
ribonucleasa poli(A) (PARN) especfica que podra
participar en la fragmentacin. Obviamente, la des-
adenilacin no siempre es desencadenada por los
elementos especficos; en ciertas situaciones (inclui-
la la fragmentacin normal del RNAm conforme
envejece), la poli(A) se fragmenta, a menos que sea
especficamente estabilizada.
El RNAsn U7 es complementario del RNAm H3
Horquilla-
u
UU
u
UA
-
CG
UA
CG
RNAm H3
Consenso
5
'
... aacgg ccaccacacccccaagamgauucucguuaaa
CAACCGUGA uCUGGGAAGAUCU
G CUlJUCU A
GC
CG
IB
GC
GC
CG

U A
G A
RNAsn U7
FIGURA 26.36 La generacin del extremo 3' del RNAm de la
histona H3 depende de una horquilla conservada y una secuen-
cia que aparea sus bases con el RNAsn U7.
La escisin del extremo 3'
deL RNAm de histona puede
requerir un RNA pequeo
Conceptos principales
.
Los RNAm de histonas no estn poliadenilados; sus
extremos 3
'
se generan por una reaccin de escisin
que depende de la estructura del RNAm.
.
La reaccin de escisin exige la unin de SLBP a una
estructura de tallo-asa y que se aparee el RNAsn U7
con una regin adyacente monocatenaria.
Algunos RNAm no estn poliadenilados, de modo
que la formacin de sus extremos 3
'
es diferente de
B reaccin coordinada de escisin/poliadenilacin.
los miembros ms notables de esta clase de RNAm
son los que codifican para las histonas que se sinteti-
zan durante la replicacin del DNA, la formacin de
cuyos extremos 3' depende de la estructura secun-
daria. La estructura del extremo 3' es de tallo-lazo
muy conservada, con un tallo de 6 bp y un asa de
cuatro nucletidos. La escisin ocurre a una dis-
tancia de cuatro a cinco bases en flujo descendente
respecto del tallo-lazo. Para la reaccin de escisin,
se requieren dos factores, que la protena de unin
al tallo-asa (SLBP) reconozca la estructura y que
el RNAsn U7 se aparee con una secuencia rica en
purinas (el elemento de flujo descendente histona
o HDE) localizada -10 nucletidos en flujo deseen-
lente respecto del sito de escisin.
Las mutaciones que no permiten la formacin
del tallo doble en la estructura tallo-lazo impiden
la formacin del extremo del RNA. Las mutacio-
nes secundarias que restablecen la estructura doble
-
aunque no necesariamente la secuencia original)
fe comportan como revertores, fenmento que su-
giere que la formacin de la estructura secundaria es ms
importante que la secuencia exacta. La SLBP se une con
tallo-asa y despus interacta con el RNAsn U7 para
promover su interaccin con el sitio de unin del
flujo descendente de RNPsn U7, que es una RNPsn
menor constituida por 63 nucletidos del RNAsn U7
y un conjunto de varias protenas (incluidas las Sm;
vase la seccin 26.5, Se requieren RNAsn para el
corte y empalme).
La reaccin entre el RNAm de la histona H3 y
el RNAsn U7 se incluye en la FIGURA 26.36. La hor-
quilla en flujo ascendente y el HDE que se aparea
con el RNAsn U7 se han conservado en el RNAm
de la histona H3 de varias especies. El RNAsn U7
tiene secuencias hacia su extremo 5' que se apa-
rean con las de consenso del RNAsn de histonas.
El procesamiento 3' es inhibido por mutaciones en
HDE que reducen su capacidad de apareamiento
con el RNAsn U7. Las mutaciones compensatorias
en este ltimo que restablecen la complementa-
riedad, tambin restablecen el procesamiento 3';
esto sugiere que el RNAsn U7 acta por aparea-
miento de bases con el RNAm de histonas. La se-
cuencia de HDE vara entre los diversos RNAm de
histonas, de modo que la unin de RNAsn no es por
s misma necesariamente estable, sino que requiere
tambin de la interaccin con SLBP.
La escisin para generar un extremo 3' ocurre
a una distancia fija respecto del sitio reconocido por
el RNAsn U7, lo cual sugiere que el RNAsn participa
en la definicin del sitio de escisin. Sin embargo,
los factores realmente encargados de la escisin no
han sido identificados an.
2 La produccin de RNAr
requiere de sucesos de escisin
Concepto principal
.
El RNAr grande y el pequeo se liberan por escisin a
partir de un RNA precursor comn.
25.21 La produccin de RNAr requiere de sucesos de escisin
697
Los RNAr se escinden a partir de un precursor comn
5
'
18S 5.8S 28S
I
18S
-
5.
8S
28S
Endonucleasa
3-5
'
exonucleasa
5-3
'
exonucleasa
A partir de un producto primario de transcrip-
cin se generan RNAr eucanticos maduros por sucesos de
escisin y recorte.
Los RNAt se escinden de productos de transcripcin
de operones de RNAr
DNA
RNAt
P1P216S RNAr 23S RNAr
RNAt
5S RNAt t1 t2
30S RNA
I
I
Productos g
16S RNAr RNAt 23S RNAr 5S RNA RNAt
FIGURA 26.38 Los operones rrn de E. coli contienen genes para RNAr
y RNAt. La Longitud exacta de Los productos de transcripcin depende
de qu promotores (P) y terminadores (t) se usen. Cada RNA producido
debe Liberarse del transcrito mediante cortes a ambos Lados.
Los principales RNAr se sintetizan como parte d;
producto nico de transcripcin primaria preces:
para generar los productos maduros. El prec :
contiene las secuencias de los RNAr de 18S, 5 :
28S. En eucariotas superiores, el precursor se nct
bra de acuerdo con su velocidad de sedimenta
como RNA 45S; en eucariotas inferiores es r
pequeo (35S en levaduras).
Los RNAr maduros se liberan del precursor
una combinacin de sucesos de escisin y reaed
nes de recorte. En la se muestra U
general de las levaduras. Puede haber variacin
el orden de los sucesos, pero bsicamente partic:
reacciones similares en todas las eucariotas. La -
yor parte de los extremos 5
'
se genera directamea
por un suceso de escisin, en tanto que casi t ;
los extremos 3' se generan por escisin segui:.;
una reaccin de recorte 3
'
5
'
.
Muchas ribonucleasas han sido implicadas.
procesamiento de RNAr, incluido el exosoma
es un ensamblaje de varias exonucleasas que
bin participa en la fragmentacin del RNAm (v
la seccin 7.13, La fragmentacin del RNAm itdj
mltiples actividades). Las mutaciones en enz:
individuales no impiden el procesamiento, lo .
sugiere que sus actividades son redundantes y :
se pueden usar diferentes combinaciones de ese ;
nes para generar las molculas maduras.
Siempre hay varias copias de la unidad de tr;
cripcin para RNAr, las cuales se organizan coi
repeticiones seriadas (vase la seccin 6.9, Los
nes repetidos para RNAr mantienen una secue:;
constante.)
El RNA 5S se transcribe a partir de genes sej 5
dos por la polimerasa m de RNA. En general, did
genes se agrupan, pero estn separados de los RN
principales. (En el caso de las levaduras, un gen
se vincula con una unidad de transcripcin me
pero se transcribe de manera independiente.)
En la organizacin de los precursores en las i
terias hay diferencia; la secuencia correspondic
al RNAr de 5.8S forma el extremo 5
'
del RNAr g:
de (23S, esto es, no hay procesamiento entre e
secuencias). En la se muestra qur
precursor tambin contiene el RNAr de 5S en u
o dos RNAt. En E. coli, los siete operones rm es
dispersos en el genoma; cuatro loci rrn contienen
gen de RNAt entre las secuencias de RNAr de 1
y 23S, y los otros loci rrn contienen dos genes
RNAt en esa regin. Puede, o no, haber genes a
dnales de RNAt entre la secuencia 5S y el extrei
3
'
. As, las reacciones de procesamiento requerir
para liberar los productos dependen del conten
del locus rrn en particular.
En el procesamiento de RNAr en procariota
eucariotas, las protenas ribosmicas, y posiblemt
698
CAPTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA
te otras, se unen al precursor, de manera que en el
sustrato para el procesamiento no est el RNA libre,
ms bien un complejo ribonucleoprotenico.
Se requieren RNA pequeos
para eL procesamiento
deL RNAr
Conceptos principales
.
Se requiere el grupo C/D de los RNAsno para modificar
La posicin 2' de la ribosa con un grupo metilo.
.
Para modificar la posicin 2' de La ribosa con un grupo
metilo se requiere del grupo C/D de RNAsno.
.
Para convertir La uridina en seudouridina se necesita el
grupo H/ACA de RNAsno.
.
Para generar una estructura usual, sustrato de La
modificacin, en todos Los casos. La base del RNAsno se
aparea con una secuencia de RNAr que contiene La base
diana,
El procesamiento y modificacin del RNAr requie-
re de una clase pequea de RNA llamada RNAsno
(RNA nucleolares pequeos), de los cuales hay 71 en
el genoma de las levaduras (S. cerevisiae), los cuales
se vinculan con la protena fibrilarina, componente
abundante del nuclolo (regin del ncleo donde se
transcriben los genes de RNAr). Para escindir al pre-
cursor de RNAr se requiere de algunos RNAsno; un
ejemplo es el U3, necesario para el primer suceso de
corte en levaduras y organismos del gnero Xenopus.
No se sabe qu participacin tiene en la escisin,
pero podra requerirse para el apareamiento con la
secuencia de RNAr y formar una estructura secun-
daria reconocida por una endonucleasa.
Para las modificaciones que se hacen en las ba-
ses del RNAr, se requieren dos grupos de RNAsno,
cuyos miembros se identifican por secuencias con-
servadas muy cortas y caractersticas comunes en
las estructuras secundarias.
El grupo C/D del RNAsno permite aadir un
grupo metilo a la posicin 2
'
de la ribosa. Hay >100
grupos 2
/
-0-metilo en localizaciones conservadas
en RNAr de vertebrados. Ese grupo toma su nom-
bre de dos secuencias cortas conservadas llamadas
cajas C y D. Cada RNAsno contiene una secuencia
cerca de la caja D, complementaria de una regin
del RNAr de 18S o 28S metilada. La prdida de un
RNAsno impide la metilacin en la regin del RNAr
de la que es complementario.
En la ' IGURA 26.39 se sugiere que el RNAsno
aparea sus bases con el RNAr para crear una regin
doble que se reconoce como sustrato para la metila-
cin, la cual ocurre en la regin de complementarie-
dad, en una posicin fija a cinco bases de distancia
El RNAsno se aparea con dianas
de metilacin
Caja C
RUGAUGA
RNAsno
Caja D
NNNNNN CUGA
Apareamiento
de bases
l
RUGAUGA NNNNNN CUGA
NNNNNN
RNAr
I Metilacin
5 bases de la caja D
RUGAUGA NNNNNN CUGA
NNNNNN

NNNNNN
RNAr metilado
Un RNAsno aparea sus bases con una regin
del RNAr que se va a metilar.
seudouridina se sintetiza a partir de uridina
O
II
Q
HNs
"
4 CH
I II
o
*
C CH
I
Uridina
O
Sintetasa de
seudouridina
HNs 1NH
0.
C15/CH
I
Seudouridina (\|/)
FIGURA 26. 0 La uridina se convierte en seudouridina por
sustitucin del enlace Nl-azcar con el enlace C5-azcar y
rotacin de la base respecto del azcar.
del lado 5' de la caja D. Es posible que cada suceso
de metilacin sea especificado por un RNAsno dife-
rente, de los cuales se han caracterizado -40, has-
ta ahora. No se han caracterizado las metilasas, de
modo que es posible que el RNAsno mismo provea
parte de la actividad de metilasa.
Otro grupo de RNAsno participa en la sntesis
de la seudouridina. En el RNAr de las levaduras hay
43 molculas \j/ y ~ 100 en el de los vertebrados. La
sntesis de la seudouridina implica la reaccin que
se muestra en la GURA 26.40, en la cual se rompe
26.22 Se requieren RNA pequeos para el procesamiento del RNAr
699
Los RNAsno tienen segmentos conservados
RNAr 5'
ANANNA ACANNN
RNAsno 5' Caja H Caja ACA
Los RNAsno H/ACA tienen dos secuencias cor-
tas conservadas y dos estructuras en horquilla, cada una con
regiones complementarias del RNAr en el tallo. La seudouridina
se forma por conversin de una uridina impar en la regin
complementaria del RNAr.
el enlace NI del cido uridlico a la ribosa, la base
gira y C5 se rene con el azcar.
La formacin de seudouridina en el RNAr ne-
cesita al grupo H/ACA de -20 RNAsno, los cuales
se nombran por la presencia de un triplete de ACA
a tres nucletidos de distancia del extremo 3
'
y una
secuencia parcialmente conservada (la caja H) que
yace entre dos estructuras de tallo-asa-horquilla.
Cada uno de esos RNAsno tiene una secuencia com-
plementaria del RNAr en el tallo de cada horquilla.
En la FIGURA se muestra la estructura que se
producira por apareamiento con el RNAr. En cada
regin de apareamiento hay dos bases no apareadas,
una de cuales es una uridina que se convierte en
seudouridina.
Los RNAsno H/ACA se vinculan con una pro-
tena nucleolar llamada Garlp necesaria para la for-
macin de la seudouridina, pero se desconoce su
funcin. Las sintetasas de seudouridina conocidas
son protenas que actan sin un cofactor RNA. No
se han identificado las sintetasas que podran par-
ticipar en la sntesis de seudouridina mediada por
RNAsno.
La participacin de RNAsn U7 en la generacin
del extremo 3' y de RNAsno en el procesamiento y
modificacin del RNAr es compatible con el punto de
vista expresado en el Captulo 27, RNA cataltico,
de que muchos de los sucesos de procesamiento del
RNA, si no es que todos, dependen de interacciones
RNA-RNA. Como en las reacciones de escisin
RNAsn tal vez acta en forma de una ribonuclet
_
r:
tena espeafica que contiene protenas y RNA. E> r
cuente que el RNA de la partcula aparee sus base?:
una secuencia corta en el RNA sustrato (aunque r.
nico mecanismo de accin).
Q2 Resumen
Por el corte y empalme se eliminan intrones \
unen exones en la secuencia madura del RNA. H
cuando menos cuatro tipos de reaccin, segur.
observa por sus requerimientos in vitro y los ; [
ductos intermedios que generan. Los sistema-
cluyen intrones nucleares eucariticos, introiic: :
los grupos I y II e intrones de RNAt. Cada reacc:
implica un cambio de organizacin en una mole ;
individual de RNA y, por tanto, es un suceso que
ocurre en configuracin cis.
El corte y empalme del pre-RNAm sigue '
preferidas, pero no obligatorias. Slo se rce;::.
secuencias de consenso muy cortas, el resto t\
trn parece carecer de importancia. Todos los si:
de escisin 5' son tal vez equivalentes, igual queh
3
'
.
Las secuencias necesarias se derivan de la r:
r
GU-AG, que describe los extremos del intrn. Z
intrones de mamfero tambin se requiere el sif . ;
ramificacin UACUAAC de las levaduras o una -
cuencia de consenso menos conservada. La reac r:
con el sitio de corte y empalme 5
'
implica la for;
cin de un lazo que une el extremo GU del intr
travs de un enlace 5'-2' con la A de la posicin : -
el sitio de ramificacin. El extremo 3
'
-
OH del e:_
ataca entonces el sitio de corte y empalme 3 :
manera que los exones se ligan y el intrn se lit -
como lazo. Ambas reacciones son transesterifica.
nes que conservan los enlaces. En varias etapas
la reaccin se requiere de hidrlisis de ATP, p
blemente para producir cambios conformacin
en el RNA, los componentes protenicos, o am
'
r
La formacin de lazos se encarga de la seleccin .
sitio de corte y empalme 3
'
, en tanto que fact :
protenicos producen patrones alternos de conr
empalme que estimulan el uso de un nuevo sit;
bloquean el de un sitio predeterminado.
El corte y empalme del pre-RNAm implica
formacin de un empalmosoma, partcula grar -
que ensambla secuencias de consenso en una c
formacin reactiva. El empalmosoma se forma n;
a menudo por un proceso de definicin de intror: e
el cual implica el reconocimiento del sitio de cor-.;
empalme 5
'
, el de ramificacin y el de corte y e-
palme 3
'
. Una va alterna implica la definicin
exn, que incluye el reconocimiento inicial de ;
sitios 5
'
de corte y empalme del intrn sustrato y (
700 CAPTULO 26 Corte
, empalme y procesamiento del RNA
siguiente intrn. Su formacin pasa por una serie de
etapas, del complejo E (de asignacin), que contiene
RNPsn Ul y factores de corte y empalme, a los com-
plejos A y B como componentes adicionales.
El empalmosoma contiene las RNPsn Ul, U2,
U4/U6 y U5, as como algunos factores de corte y
empalme adicionales. Las RNPsn Ul, U2 y U5 con-
tienen cada uno un RNAsn nico y varias protenas:
la RNPsn U4/U6 contiene dos RNAsn y varias pro-
tenas, algunas son comunes a todas las partculas
de RNPsn, que reconocen secuencias de consenso.
El RNAsn Ul aparea sus bases con el sitio de corte
y empalme 5
'
,
la RNAsn U2 con la secuencia de ra-
mificacin y el RNPsn U5 acta como sitio de corte
y empalme 5
'
.
Cuando U4 libera a U6, el RNAsn
U6 aparea sus bases con U2, lo cual puede dar lu-
gar al centro cataltico para el corte y empalme. Un
conjunto alternativo de RNPsn proporciona funcio-
nes anlogas para corte y empalme de la subclase
de intrones dependiente de U12. Las molculas de
RNAsn pueden tener funciones cuasi catalticas en
el corte y empalme, otras de procesamiento.
En el nuclolo, dos grupos de RNAsno se en-
cargan del apareamiento con el RNAr en sitios mo-
dificados; los RNAsno del grupo CID indican sitios
diana para la metilacin y los del grupo ACA iden-
tifican sitios en que la uridina se convierte en seu-
douridina.
El corte y empalme suelen ser intramoleculares,
pero en tripanosomas y nematodos ocurre en confi-
guracin trans (corte y empalme intermoleculares).
Este proceso implica una reaccin entre un RNA
SL pequeo y el pre-RNAm. El RNA SL simula un
RNAsn Ul y puede combinar la fundn de propor-
cionar el exn con las funciones de Ul. En los gu-
sanos hay dos tipos de RNA SL, uno se utiliza para
;
orte y empalme del extremo 5
'
de un RNAm y el
fco, para corte y empalme en un sitio interno.
Los intrones del grupo II comparten con los in-
Irones nucleares el uso de un lazo como intermedio,
pero pueden realizar la reaccin como propiedad
autocatalizada del RNA. Dichos intrones siguen la
:
egla GT-AG pero forman una estructura secundaria
raracterstica que mantiene los sitios reactivos de
corte y empalme en la aposicin apropiada.
El corte y empalme del RNAt de las levaduras
.mplica reacciones de endonucleasa y ligasa separa-
bas. La endonucleasa reconoce la estructura secun-
:
aria (o terciaria) del precursor y fragmenta ambos
extremos del intrn; las dos mitades de RNAt libe-
radas por prdida de un intrn, se pueden ligar en
?uesencia de ATP.
La capacidad de terminacin de la polimerasa
de RNA no ha sido caracterizada an, y los extre-
mos 3
'
de sus productos de transcripcin se gene-
ran por escisin. La secuencia AAUAAA localizada
de 11 a 30 bases en flujo ascendente respecto del
sitio de escisin proporciona la seal para la esci-
sin y la poliadenilacin. Una endonucleasa y la
polimerasa poli(A) se vinculan en un complejo con
otros factores que confieren especificidad para la
seal AAUAAA. La transcripcin termina cuando
una exonucleasa que se une con el extremo 5
'
de
la cadena de RNA naciente creada por la escisin,
se empareja con la polimerasa de RNA.
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27
RNA cataltico
ESQUEMA DEL CAPTULO
Introduccin
BB Los intrones deL grupo I realizan autocorte y
empalme por transesterificacin
.
Los nicos factores necesarios para el autocorte y empalme
de los intrones del grupo I m vitro son n catin monova-
lente, un catin bivalente y un nucletido de guanina.
El corte y empalme ocurren por dos transesterificaciones,
sin necesidad de ingreso de energa.
.
El extremo 3'-0H del cofactor de guanina ataca al extremo
5
'
del intrn en la primera transesterificacin.
.
El extremo 3-OH generado al final del primer exn ataca
la unin entre el intrn y el segundo exn en la segunda
transesterificacin.
.
El intrn es liberado como molcula lineal que se convierte
en circular cuando su extremo 3
'
-0H ataca un enlace en
una de las dos posiciones internas.
.
El enlace interno G414-A16 del intrn puede tambin ser
atacado por otros nucletidos en una reaccin de corte y
empalme en configuracin trans.
Los intrones del grupo I forman una estructura
secundaria caracterstica
.
Los intrones del grupo I forman una estructura secundaria
con nueve regiones dobles.
.
Las porciones medulares de las regiones P3, P4, P6 y P7
tienen actividad cataltica.
.
Las regiones P4 y P7 se forman por apareamiento entre
secuencias de consenso conservadas.
.
Una secuencia adyacente a P7 aparea sus bases con la
secuencia que contiene la G reactiva.
Las ribozimas tienen varias actividades catalticas
Cambiando el sitio de unin del sustrato de un intrn
del grupo I es posible introducir secuencias alternas que
interactan con la G reactiva.
.
Las reacciones siguen la cintica enzimtica usual de baja
velocidad catalitica.
.
Las reacciones que utilizan enlaces 2'-0H podran haber
sido la base de la evolucin de las actividades catalticas
originales del RNA.
BEI Algunos intrones del grupo I codifican
endonucleasas que fomentan la movilidad
Los intrones mviles pueden insertarse en nuevos sitios.
.
Los intrones mviles del grupo I codifican una endonudea-
sa que produce rotura de la doble cadena en un sitio diana.
.
El intrn se transpone al sitio de la rotura de la doble
cadena por un mecanismo de replicacin mediado por DNA.
mtmm Los intrones del grupo II pueden codificar
protenas multifuncionales
Los intrones del grupo 11 pueden ser sujetos de autocorte y
empalme in vitro, pero suelen ser auxiliados por actividades
protenicas codificadas en el intrn.
706
.
Un solo marco de codificacin especifica a una protena
con actividad de transcriptasa inversa y madurasa, un
segmento de unin de DNA y una endonucleasa de DNA.
.
La transcriptasa inversa genera una copia de DNA a
partir de la secuencia del RNA, que se transpone por ur
mecanismo similar al del retroposn.
.
La endonucleasa escinde el DNA diana para permitir la
insercin del transposn en un nuevo sitio.
Algunos intrones de autocorte y empalme
requieren de madurasas
.
Los intrones de autocorte y empalme pueden necesitar
actividades de madurasa codificadas en su interior para
ayudar al plegamiento en la estructura cataltica activa.
La actividad cataltica de la ribonucleasa P se
debe al RNA
La ribonucleasa P es una ribonucleoprotena en la cual e
RNA tiene actividad cataltica.
Los virioides tienen actividad cataltica
.
Virioides y virusoides forman una estructura en cabeza
martillo con actividad de autoescisin.
.
Se pueden generar estructuras similares para el
apareamiento de una cadena de sustrato fragmentada pe
una cadena de enzimas.
. Cuando una cadena enzimtica se introduce en una cluj
puede aparearse con una cadena sustrato diana, que
despus es escindida.
ww La edicin de RNA ocurre en bases individuales
.
Los receptores de apolipoprotena B y glutamato prese-:;
desaminaciones especficas de sitio catalizadas por
desaminasas de citidina y adenosina, que cambian la
secuencia de codificacin.
f-mii La
edicin del RNA puede dirigirse
por RNA guas
.
La intensa edicin de RNA en mitocondrias de tripanosc-
se debe a inserciones o deleciones de uridina.
.
El sustrato de RNA aparea sus bases con un RNA gua e-
ambos lados de la regin por editar.
.
El RNA gua proporciona el molde para la adicin (o, cc-
menos frecuencia, la delecin) de uridinas.
.
La edicin es catalizada por un complejo de endonuclea;;
actividad de transferasa de uridilo terminal y ligasa de F
nn El corte y empalme de protenas son
autocatalticos
.
Una intena tiene La capacidad de catalizar su propia
eliminacin de una protena, de manera que las extens;
los flancos se conecten.
.
Corte y empalme de las protenas se catalizan por la inte
. Casi todas las intenas tienen dos actividades
independientes, corte y empalme de protenas y una
endonucleasa que vuelve a casa.
wim Resumen
23 Introduccin
la idea de que slo las protenas tienen actividad
inzimtica estaba profundamente arraigada en la
rioqumica (incluso los devotos de la funcin pro-
cnica llegaron a pensar que slo ellas tenan la
versatilidad para constituir el material gentico!),
Boa de las razones de la identificacin de enzimas
v protenas proviene del punto de vista de que slo
js protenas con sus variadas estructuras tridimen-
fionales y grupos laterales tienen la flexibilidad para
.vear los sitios activos que catalizan las reacciones
bioqumicas. Sin embargo, la caracterizacin de sis-
:
emas implicados en el procesamiento del RNA ha
mostrado que ese punto de vista es una simplifica-
n exagerada.
Hoy se sabe que el RNA tiene varios tipos de
raccioncs catalticas. El trmino ribozima es ya
ie uso general para describir un RNA con actividad
zataltica y es posible caracterizar la actividad en-
pmtica en la misma forma que una enzima ms
convencional. Algunas de las actividades catalticas
iel RNA se dirigen contra sustratos separados, en
:
anto que otras son intramoleculares (lo cual limita
.3. accin cataltica a un solo ciclo).
Los intrones del grupo I y del II poseen la ca-
racidad de segmentarse a s mismos fuera del pre-
jtNAm que los contiene. La intervencin de los in-
trones del grupo I ha permitido generar molculas
ie RNA con otras actividades catalticas relaciona-
-
as con la original.
La enzima ribonucleasa P es una ribonucleopro-
-rna que contiene una sola molcula de RNA unida
:
una protena. El RNA posee la capacidad de ca-
alizar la escisin en un sustrato RNAt, en tanto el
componente protenico tal vez participe de manera
indirecta para mantener la estructura del RNA ca-
bitico.
El tema comn de esas reacciones es que, in
itro, el RNA puede presentar una reaccin intra-
molecular o intermolecular que implica escisin o
unin de enlaces fosfodister. Aunque la especifici-
dad de la reaccin y la actividad cataltica bsica son
Droporcionadas por el RNA, las protenas relaciona-
das con ste pueden ser necesarias para la reaccin
eficaz in vivo.
El corte y empalme del RNA no constituyen el
nico medio por el que pueden introducirse cam-
;:
os en su contenido informacional; en el proceso de
edicin del RNA se introducen cambios en bases
ndividuales o se agregan bases en posiciones espe-
rficas de un RNAm; dicha insercin de bases (muy
a menudo molculas de uridina) ocurre en varios
genes de las mitocondrias de ciertas eucariotas in-
feriores; a semejanza del corte y empalme, implica
la rotura y reunin de enlaces entre nucletidos,
pero tambin requiere de un molde para codificar
la informacin de la nueva secuencia.
rm Los intrones deL grupo I
realizan autocorte y empalme
por transesterificacin
Conceptos principales
.
Los nicos factores necesarios para el autocorte y
empalme de los intrones del grupo I in vitro son
un catin monovalente, un catin bivalente y un
nucletido de guanina.
.
EL corte y empalme ocurren por dos
transesterificaciones, sin necesidad de ingreso de
energa.
.
El extremo 3-OH del cofactor de guanina ataca al
extremo 5
'
del intrn en la primera transesterificacin.
.
El extremo 3'-0H generado al final del primer exn
ataca la unin entre el intrn y el segundo exn en la
segunda transesterificacin.
.
El intrn es liberado como molcula lineal que se
convierte en circular cuando su extremo 3
'
-
OH ataca
un enlace en una de las dos posiciones internas.
.
El enlace interno G414-A16 del intrn puede tambin
ser atacado por otros nucletidos en una reaccin de
corte y empalme en configuracin trans.
Los intrones del grupo I se encuentran en diversas
localizaciones, adems de presentarse en genes que
codifican el RNAr en los ncleos de los eucario-
tas inferiores Tetrahymena thermophila (un ciliado)
y Physarum polycephalum (un moho de lama). Son
comunes en los genes de mitocondrias micticas,
estn presentes en tres genes del fago T4 y tambin
se encuentran en bacterias. Los intrones del grupo
I tienen una capacidad intrnseca de autocorte y
empalme (propiedad que tambin poseen los in-
trones del grupo II analizados en la seccin 26.11,
Los intrones del grupo 11 presentan autocorte y em-
palme a travs de la formacin de lazos).
El autocorte y empalme como propiedad de los
productos de transcripcin de los genes de RNAr
se descubri en T. thermophila. Los genes de los dos
principales RNAr siguen la organizacin usual, en
la cual ambos se expresan como parte de una uni-
dad de transcripcin comn. El producto es un RNA
precursor 35S con la secuencia del RNAr pequeo
en la parte 5
'
y la del ms grande (26S) hacia el
extremo 3
'
.
En algunas cepas de T. thermophila la secuencia
que codifica el RNAr de 26S se interrumpe por un
intrn corto nico. Cuando el RNA precursor de
35S se incuba in vitro, el corte y empalme ocurre
27.2 Los intrones del grupo I realizan autocorte y empalme por transesterificacin
707
El corte y empalme elimina un intrn
Exn 1 Intrn Exn 2
Transcripcin
Corte y
empalme
Electroforesis en gel
RNA de 35S-m
Formacin
de un ciclo
l
O
Intrn circular
Intrn lineal
En el gnero Tetrahymena, el corte y empalme
del precursor del RNAr de 35S puede seguirse por electroforesis
en gel. La eliminacin del intrn se revela por la aparicin de
una banda pequea de movimiento rpido, y al tornarse circu-
lar, se desplaza ms lentamente en la electroforesis, como se
observa por una banda ms alta.
como reaccin autnoma. El intrn es escindido del
precursor y se acumula como fragmento lineal de
400 bases, que posteriormente se convierte en un
RNA circular. En la jURA 27. se resumen esos
sucesos.
La reaccin requiere slo de un catin monovalente,
un catin bivalente y un cofactor nucleotdico de guanina.
No se puede sustituir ninguna base con G, pero no es
necesario un trifosfato, pueden utilizarse todos, GTP,
GDP, GMP y la guanosina misma, de manera que no
hay un requerimiento neto de energa. El nucletido
de guanina debe tener un grupo 3'-OH.
La trayectoria del nucletido de guanina Puede
seguirse con una marca radioactiva. La radioactivi-
dad empieza por penetrar el fragmento lineal escin-
dido del intrn y la molcula de G se conecta con
el extremo 5
'
del intrn por un enlace fosfodister
normal.
En la 16URA se muestra que ocurren tres
reacciones de transferencia. En la primera, el nu-
cletido de guanina se comporta como cofactor
que proporciona el grupo libre 3
'
-
OH, que ataca el
extremo 5
'
del intrn. Esta reaccin crea el enlace
G
-intrn y genera un grupo 3
'
-
OH en el extremo
del exn. La segunda transferencia implica una re-
accin qumica similar, donde ese 3
'
-OH ataca des-
pus al segundo exn. Los dos productos de trans-
ferencia se conectan, no se han observado exones
libres, de manera que su unin puede ocurrir como
parte de la misma reaccin que libera el intrn. El
intrn se libera como molcula lineal, pero en
tercera reaccin de transferencia se convierte
circular.
Cada etapa de la reaccin de autocorte y emr;
me ocurre por una transesterificacin, en la cua. _
ster fosfato se convierte directamente en otro,
hidrlisis intermedia. Los enlaces se intercam:::
de manera directa y se conserva la energa, o s<a
que la reaccin no requiere de entrada de ene:.
ni hidrlisis de ATP o GTP. Si ninguna de las re i
dones consecutivas de transesterificacin imph
un cambio neto de energa, por qu la reacc
de corte y empalme avanza hasta terminarse v
se equilibra entre el producto con corte y empal:
y el precursor, que no ha sufrido esos cambios? 1
concentracin de GTP es alta en relacin con h :
RNA y, por tanto, hace avanzar la reaccin; un car-
bio en la estructura secundaria del RNA impide
reaccin inversa.
El sistema in vitro no incluye protenas, de n:.:
ra que la capacidad de corte y empalme es intrnseca
RNA. Este ltimo forma una estructura secundan'
terciaria especfica en la cual los grupos impon;
te se yuxtaponen, de manera que el nucletidc :
guanina puede unirse en el sitio especfico y des-
pus ocurren las reacciones de rotura de enlace
reunin que se muestran en la Figura 27.2. A_
que es una propiedad del RNA mismo, la reacc:
es asistida in vivo por protenas, que estabiliza::
estructura del RNA.
La capacidad de participar en esas reacciona
de transferencia reside en la secuencia del inr: -
que sigue siendo reactivo despus de ser escindid
como molcula lineal. En la FIGURA 2: seresur:
sus actividades.
El intrn puede hacerse circular cuando la G
terminal ataca alguna de las dos posiciones cercaras
al extremo 5
'
; el enlace interno se rompe y entt ri-
ces el nuevo extremo 5
'
se transfiere al extre"
3
'
-
OH del intrn. La formacin primaria de un :
suele involucrar una reaccin entre la G414 tenx;::
y la A
16
, que es la reaccin ms frecuente (apar.
como tercera transferencia en la Figura 27.2). f -
menos frecuencia, la G414 reacciona con U
20
;
c::
reaccin genera un intrn circular y un fragme:
lineal que representa a la regin 5' original (de |
bases de longitud para atacar A16 y de 19 para ataot
U20). El fragmento 5' liberado contiene el nucletido
original de guanina agregado.
Cualquiera de los ciclos puede regenerar :
molcula lineal in vitro mediante hidrlisis es:.
fica del enlace (G414-A'6 o G414-U20) que lo h:
cerrado, fenmeno que se conoce como forma;
inversa de un ciclo. La molcula lineal generade :
reversin de \a formacin primaria de un ciclo en A
CAPTULO 27 RNA cataltico
. =ntiene activa y puede dar lugar a una formacin
rrundaria de ciclo por ataque de U
20
.
El producto final de las reacciones espontneas
steriores a liberacin del intrn es el RNA L-19,
fcula lineal generada por reversin de la forma
rcular ms corta. Dicha molcula tiene una activi-
:
id enzimtica que le permite catalizar la extensin
r ribonucletidos cortos (no se muestran en la fi-
:a, pero vase la Fig. 27.8).
La reactividad del intrn liberado va ms all
r revertir la reaccin de formacin de un ciclo; la
::
cin del oligonudetido UUU reabre el ciclo pri-
:
ario por reaccin con el enlace G
414
-A16. El UUU
pie simula el extremo 3
'
del 15-mer liberado por
i iormacin primaria de un ciclo) se convierte en
- extremo 5' de la molcula lineal formada. Esta es
r.a reaccin intermolecular y, por tanto, demues-
ca la capacidad de conectar dos molculas de RNA
-gerentes.
Esta serie de reacciones muestra vividamente
. ;.e la actividad autocataltica refleja la capacidad
generalizada de la molcula de RNA de formar un
mtro activo que pueda unirse a cofactores de gua-
::
na, reconocer oligonucletidos y conjuntar grupos
ractivos en una conformacin que permita romper
y volver a unir los enlaces. Otros intrones del grupo I
.
-1 han sido investigados con tamo detalle como el del
g nero Tetrahymena, pero en general, sus propiedades
son similares.
La reaccin de autocorte y empalme constitu-
ye una propiedad intrnseca del RNA in vitro, pero
hasta qu punto participan las protenas in vivo?
Ijs sistemas mitocondriales proporcionan ciertos
ndicios de la participacin de las protenas, en los
.Males, el corte y empalme de los intrones del grupo I
:
equieren de los productos que actan en configu-
Bcin trans de otros genes. El gen mutado cytl & de
Teurospom crasa constituye un ejemplo notable de
:
efectos en el corte y empalme de varios intrones
"
titocondriales del grupo I. El producto de ese gen
parece ser la sintetasa de tirosil-RNAt mitocondrial!,
o cual se explica por el hecho de que el intrn pue-

e adoptar una estructura terciaria similar a la del

RNAt estabilizada por la sintetasa y que fomenta la
:;accin cataltica.
Esta relacin entre la sintetasa y el corte y em-
p
alme es compatible con la idea de que este ltimo se
rigin como una reaccin mediada por RNA, poste-
riormente auxiliada por protenas de unin de RNA
;ue originalmente teman otras funciones. La capaci-
dad de autocorte y empalme in vitro puede ser la inte-
raccin bioqumica bsica. La estructura del RNA crea
el sitio activo, pero slo puede funcionar eficazmente
:
n vivo cuando lo asiste un complejo proteinico.
El autocorte y empalme ocurren por transesterlficaciones sucesivas
r
,
ExnA
p
_3) p ExonB y
\
Primera transferencia
El extremo 3'-OH de G ataca
al 5
'
dei intrn
pG-OH
v
pNpNpNpNpNpNpXpXpXpXpXpX
pNpNpNpNpNpN-OH
+
pGpXpXpXpXpXpX
+
OH
*

Segunda transferencia
El extremo 3'-OH del exn A
ataca al 5' del B
O
G-P=i> C-OH
o
Tercera transferencia
El extremo 3'-OH del intrn
ataca el enlace a 15 bases
del extremo 5'
FIGURA 27.2 El autocorte y empalme se debe a reacciones de trans-
esterificacin en las cuales hay un intercambio directo de enlaces.
Los enlaces generados en cada etapa se indican mediante recuadros
sombreados.
Los intrones del grupo I
forman una estructura
secundaria caracterstica
Conceptos principales
Los intrones del grupo I forman una estructura
secundaria con nueve regiones dobles.
Las porciones medulares de las regiones P3, P4, P6 y
P7 tienen actividad cataltica.
Las regiones P4 y P7 se forman por apareamiento entre
secuencias de consenso conservadas.
Una secuencia adyacente a P7 aparea sus bases con la
secuencia que contiene la G reactiva.
Todos los intrones del grupo I pueden organizarse
en una estructura secundaria caracterstica de nue-
ve hlices (P1-P9). En la FIGURA 27.4 se muestra un
modelo de la estructura secundaria del intrn del
gnero Tetrahymena. Dos de las regiones de bases
apareadas se generan por apareamiento entre los
elementos de secuencias conservados que son co-
munes a los intrones del grupo I. La P4 se estructura
27.3 Los intrones del grupo I forman una estructura secundaria caracterstica
709
El intrn escindido tiene actividades catalticas
El extremo 3-OH de G414 ataca a pA16 o pU2o
5'G..
UUUpA16CCUpU20UG 5'G
..UUUpA16CCUpU20UG
t I /
414GOH 414GOH
Formacin de un ciclo
H20|
pA15CCUpU20UG
Inversin de la formacin de un ciclo
|
H20
pU
20UG:
Prcuctos
del cambio a
414
,
GOH
estructura lineal
RNAL-15 RNA L-19
Reaccin en configuracin trans
Q414pA16CCUpU20UG
UUUpA16CCUpU20UG.
UUU
El intrn escindido puede formar crculos mediante
uno de los dos sitios internos para la reaccin con el extremo 5
'
y
reabrirlos por reaccin con agua u oligonucletidos.
a partir de las secuencias P y Q, y la P7, de Ry S. La
secuencia de otras regiones de bases apareadas vara
en funcin de los intrones individuales. El anlisis
de mutaciones identifica un "ncleo" de intrn que
contiene P3, P4, P6 y P7 que constituye la regin
mnima susceptible de llevar a cabo una reaccin
cataltica. La longitud de los intrones del grupo I
vara ampliamente, de modo que las secuencias de
consenso se localizan a distancia considerable res-
pecto de las uniones de corte y empalme reales.
Algunas de las reacciones de apareamiento se re-
lacionan directamente con el cambio de las uniones
de corte y empalme a una conformacin que soporte
la reaccin enzimtica. La Pl incluye el extremo 3'
del exn izquierdo. La secuencia del intrn que se
aparea con el exn se denomina IGS, o secuencia
gua interna (nombre que refleja el hecho de que
originalmente se pensaba que la regin 3' inmediata
upo I se conserva
Exn 1
""
G
-OH
p
5' CUCUCU Pimera 5
'
UGGGGG 3'
3'GGGAGG transferencia 3'ACGCGC 5'
IGS Q
P6
Exn 1
S'UAGUCS'
3
'
AUGAG 5'
R
Exn 2
Se forma
2 bp en el
extremo 3
'
del intrn
Los intrones del grupo I tienen una estruct:-; :
cundaria comn formada por nueve regiones de pares de bf
Las secuencias de las regiones P4 y P7 se conservan, de _:-
que identifican a cada uno de los elementos de secuencia :
R y S. Entre el extremo del exn izquierdo y la IGS del r:
se crea Pl por apareamiento; la regin intermedia entre :~
P9 se aparea con el extremo 3' del intrn.
a la secuencia IGS, mostrada en la figura, se apaai
ba con la unin de corte y empalme 3', unienci
los dos enlaces. La interaccin es posible, pero "
parece indispensable). Una secuencia muy con;
ocasiones de apenas dos bases, entre P7 y P9, af; ':
sus bases con la secuencia inmediatamente antfi
a la G reactiva (posicin 414 en el gnero Ter '
mena) del extremo 3
'
del intrn.
Las propiedades de las mutaciones que ac'-
en configuracin cis y que impiden el corte y efiapa
me de intrones del grupo I, destacan la impors c:
del apareamiento de las bases para crear la esta-
tura central necesaria del RNA. Dichas mutacin-
han sido aisladas en los intrones mitocondriJfs
travs de mulantes que no pueden eliminar u
trn in vivo, y se han aislado para el intrn del p
ero Tetrahymena por transferencia de la rea-tp
de corte y empalme a un ambiente bacteriar- I
estructura que se muestra en la FIGURA 27.5 pejB*
seguir la reaccin de corte y empalme en E. a
intrn de autocorte y empalme se localiza en
to que interrumpe el dcimo codn de la secufao
de codificacin de la galactosidasa |3, de med:' | -
la protena puede ser traducida con xito a par -
un RNA slo despus de eliminado el intrn.
La sntesis de la galactosidasa (3 en este
ma indica que el corte y empalme puede dar=
condiciones bastante distantes de las prevaled'si
en el gnero Tetrahymena o incluso in vitro, tes
710 CAPTULO 27 RNA cataltico
El intrn de! gnero Tetrahymena puede
corlarse y empalmarse en E. coli
El intrn se inserta en el codn 10
Promotor
Codn Codones de Codones de
AUG galactosidasa 6 Intrn galactosidasa B
1 L
nnr
I I I I I
1
L Transcripcin
Corte y empalme
Traduccin
Galactosidasa p
Pacas azules
generadas por tincin
de galactosidasa p
3 jo
La colocacin del intrn de Tetrahymena en la
encia de la galactosidasa p da lugar a un anlisis para
Hutocorte y empalme en la Escherchia coli. La sintesis de
ctosidasa P se analiza por la adicin de un compuesto que
:
3rna azul por accin de la enzima. La secuencia es Llevada
:
3bo por un bacterifago, de manera que las placas azules
ie contienen bacterias infectadas) indican que el corte y
alme fue exitoso.
o que podra interpretarse en el sentido de que
autocorte y empalme puede ocurrir, en la clula
bacteriana. Otra posibilidad es que haya protenas
tccterianas que ayuden a la reaccin.
Aplicando este anlisis se pueden producir mu-
taciones en el intrn para ver si impiden la reaccin.
las mutaciones de las secuencias de consenso del
jrupo I que alteran el apareamiento de sus bases de-
enen el corte y empalme, pero pueden revertirse
-
.ediante cambios compensatorios que restablezcan
cho apareamiento.
Las mutaciones de las secuencias de consenso
correspondientes en los intrones mitocondriales del
;
rupo I producen efectos similares. La mutacin de
-na secuencia de consenso puede ser revertida por
-
:
de una secuencia de consenso complementaria
a modo de restablecer el apareamiento; por ejem-
plo, las mutaciones de la secuencia de consenso R
pueden compensarse mediante mutaciones de la
tenencia de consenso S.
Juntos, esos resultados sugieren que la reaccin
de corte y empalme del grupo I depende de la for-
jacin de una estructura secundaria entre pares
de secuencias de consenso en el intrn. El princi-
pio establecido en esta obra es que las funciones de
las secuencias distantes del sitio del corte y empalme son
'
.
.cesarlas para formar el sitio activo que hace posible el
ititocortey empalme.
La catlisis del RNA utiliza dos sitios
El RNA cataltico tiene un sitio de unin de guanosina
y uno de unin de sustrato
3
'
414
Sitio de unin de
guanosina
5
'
CUCUCU UUUACCU
Sitio de unin de -
sustrato
GGGAGG
incluye A y U2"
La primera transferencia de G-OH ocupa el sitio de unin
de G; el exn 5' ocupa el sitio de unin de sustrato
Q 14 414
G-OH
5
'
5
'
5ggg
La segunda transferencia de G414 ocurre en el sitio de
unin de G; el exn 5
'
est en el sitio de unin del sustrato
3
'
5' CUCUCU
GGGAGG GGGAGG
+
5
'
CUCUCU 3
'
La tercera transferencia de G414 ocurre en el sitio de unin
de G; el extremo 5' del intrn est en el sitio de unin del
sustrato
G -s, G
GGGAGG
G UUUACCU
AGCU
"
iAGG
FIGURA 21. La escisin del intrn del grupo I del RNAr del
gnero Tetrahymena ocurre por reacciones sucesivas entre los
ocupantes del sitio de unin de guanosina y el de unin de
sustrato. El exn izquierdo es rosado, y el derecho, prpura.
Las ribozmas tienen varias
actividades catalticas
Conceptos principales
Cambiando el sitio de unin del sustrato de un intrn
del grupo I es posible introducir secuencias alternas
que interactan con la G reactiva.
Las reacciones siguen la cintica enzimtica usual de
baja velocidad cataltica.
Las reacciones que utilizan enlaces 2'-0H podran
haber sido la base de la evolucin de las actividades
catalticas originales del RNA.
27.4 Las ribozmas tienen varias actividades catalticas 711
La estructura cambia en la unin del ststrato
Contactos encontrados antes de la unin del sustrato
Un G-OH reactivo cataliza transferencias sucesr. =
IGS
Contactos encontrados despus de la unin del sustrato
'
/)/ P9
FIGURA 27.7 La posicin de la IGS de la estructura terciaria
cambia cuando se forma Pl por la unin del sustrato.
La actividad cataltica de los intrones del grupo I fue
descubierta por su capacidad de autocorte y empal-
me, pero stos pueden presentar otras reacciones
catalticas in vitro; todas estas reacciones se basan en
transesterificaciones y se analizan de acuerdo con su
relacin con la reaccin de corte y empalme en s.
La actividad cataltica de un intrn del grupo
I es conferida por su capacidad de generar una es-
tructura secundaria y una terciaria en particular,
las cuales dan lugar a sitios activos equivalentes a
los sitios activos de una enzima convencional (pro-
teincea). En la FIGURA 27.6 se ilustra la reaccin de
corte y empalme de conformidad con dichos sitios
(es la misma serie de reacciones mostrada antes, en
la Fig. 27.2).
El sitio de unin del sustrato se forma a partir
de la hlice Pl, en la cual, el extremo 3' del primer
intrn aparea sus bases con la IGS en una reaccin
intermolecular. Las secuencias de P7 forman un si-
tio de enlace de guanosina que podra ser ocupado
por un nucletido de guanosina libre o por la mo-
lcula de G en la posicin 414. En la primera reac-
cin de transferencia es utilizado por el nucletido
de guanosina libre, pero posteriormente lo ocupa
G414. Mediante la segunda transferencia se liberan
los exones unidos, en tanto que la tercera crea el
intrn circular.
La unin con el sustrato implica un cambio
de conformacin; antes, el extremo 5' de IGS est
cerca de P2 y P8, y despus, cuando se forma la
hlice Pl, se acerca a bases conservadas que yacen
3' G
-OH
1
5'
pCCCCC-OH 3
'
GGGAGG- 5
3' G-OH
5' pCC
ibc-OH 3'
GGGAGG- -'-5
HO-CCCCi
C5 se aparea oc-
al sitio IGS cerc=
del extremo 5' z-.
RNA
G-OH ataca el
enlace CpC
J
3
'
C-OH
GQGAGG=
3
'
G
|
C-OH
5'
pCCCCC-OH 3
'
GGGAGG
HO-CCCCCCp
Transferencia ds
C a 3'-G; liberac :-
de C4
Se une otro C5; l|
reaccin de
transferencia se
invierte
3
'
G-OH
GGGAGG 5
Se libera C6 con
generacin de
RNA L-19
FIGURA 27.8 El RNA lineal L-19 puede unirse a C en elsitiw
unin de sustrato; el extremo G-OH 3
'
reactivo est locc. ri
en el sitio de unin G y cataliza reacciones de transferenr; :
convierten dos oligonucletidos C
;
en un C
,
, y un C6.
entre P4 y P5, reaccin representada en la
27.7 por contactos que se detectan en la estrurwa
secundaria. En la estructura terciaria, los dos 3 .
contactados alternativamente por Pl tienen 37 *
entre s, lo cual implica un movimiento suslanoi
en la posicin de Pl.
El RNA L-19 se genera por la apertura dr'
trn circular (mostrado en la ltima etapa dt
reestructuraciones intramoleculares incluidas - i
Fig. 27.3); an conserva capacidades enzims--
que simulan las implicadas en la reaccin oi.U
'
.
"
-
de corte y empalme. La funcin de la ribozimo ' --
de ser analizada en cuanto a su capacidad de uib
con una secuencia intramolecular complemer.:;. "-
de IGS en el sitio de unin de sustrato, en tani
enlaza con el G414 terminal o un nucletido G ]
en el sitio de unin de G.
En la F se ilustra el mecanismo
el cual el oligonucletido C
5
se extiende hasl
712 CAPTULO 27 RNA cataltico
La catlisis utiliza transesterificaciones
Endorribonucleasa especfica de secuencia
3
'
G-OH

5
'
=GU(
f
u=3'
_
5' =CUGU-OH
GGGAGG 5'
+
V ' J
V- ii. 5'G =3
'
Ligasa de RNA
3
'
Gp

5
'
==.Y-OH -
* 5'=Y 3'
XXXXXX 5'
i
Fosfatasa
f -]
G-OH

5' UCU
p 3
'
-5'UCU
-
OH 3'
GGGAGG 5'
i
-/
Las reacciones catalticas de la ribozima impli-
can transesterificaciones entre un grupo del sitio de unin del
--Strato y otro del sitio de unin de G.
-
ar una cadena C
,
al adosarse al sitio de unin del
rstrate, en tanto G414 ocupa el sitio de unin de G.
:
>r reacciones de transesterificacin, se transfieren
-
"
C de C
5
a la G 3' terminal, y despus, de regre-
a una nueva molcula de C
5
.
Las reacciones de
ansferencia adicionales llevan a la acumulacin
de oligonucletidos de citosina ms prolongados,
zaccin que constituye una catlisis real, pues el
;
NA L-19 se mantiene sin cambios y est disponible
-
ara catalizar a varios sitios. La ribozima se compor-
a como transferasa de nucletidos.
En la FIGURA 27.9 se definen otras reacciones
enzimticas. La ribozima puede comportarse como
endorribonucleasa especfica de secuencia aprove-
chando la capacidad de IGS para unir secuencias
complementarias. En este ejemplo une un sustrato
xterno que contiene la secuencia CUCU y no la
rcuencia anloga contenida generalmente en el
- .tremo del exn izquierdo. En el sitio de unin G
By un nucletido que contiene guanina y que ata-
i a la secuencia CUCU precisamente de la misma
forma que el exn suele ser atacado en la primera
raccin de transferencia, de modo que escinde la
ecuencia diana en una molcula 5', y que simu-
:
el exn izquierdo, y una molcula 3' que porta
La catlisis del RNA es enzimtica
Enzima Sustrato
(mM)
Recambio
(/minuto)
Virusoide de 19 RNA de 24 0.0006 0.5
bases bases
Intrn L-19 cccccc 0.04 1.7
RNA de ribonucleasa P
pre-RNAt
0.00003 0.4
Ribonucleasa P
pre-RNAt
0.00003 29
completa
Ribonucleasa T1
GpA
0.05 5 700
Galactosldasa p
lactosa 4.0 12 500
FIGURA 27.10 Las reacciones catalizadas por RNA tienen
las mismas caractersticas que las catalizadas por proteinas,
aunque su velocidad es menor. La K
M
seala la concentracin
de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad
mxima, que es una medida inversa de la afinidad de la enzima
por el sustrato. El nmero de recambio aporta la cifra de mo-
lculas de sustrato transformadas por un solo sitio cataltico
en la unidad de tiempo.
una G terminal. La especificidad de la ribozima pue-
de modificarse por mutacin del elemento IGS, de
manera que reconozca secuencias complementarias
de la nueva secuencia de la regin IGS.
La modificacin de IGS puede usarse para cam-
biar la especificidad del sitio de unin de sustrato
y permitir que otras dianas de RNA ingresen, de
modo de generar una actividad de ligasa. Un RNA
que termina en un 3
'
-
OH se une al sitio sustrato y
otro, terminado en la molcula 5
'
-
G
, se acopla al
sitio de unin G. Un ataque por el hidroxilo en el
enlace fosfato conecta las dos molculas de RNA con
prdida de una molcula de G.
La reaccin de fosfatasa no tiene relacin di-
recta con las reacciones de transferencia de corte y
empalme. Una secuencia oligonucleotdica comple-
mentaria de IGS, terminada en un 3
'
fosfato, puede
ser atacada por G4
14
, que se adjudica el fosfato; a
continuacin se libera un oligonucletido con un
extremo 3
'
-
OH. El fosfato puede entonces trans-
ferirse a un oligonucletido que termina en 3'-OH
(revirtiendo eficazmente la reaccin) o, de hecho, a
agua (con liberacin de fosfato inorgnico y conclu-
sin de una reaccin autntica de fosfatasa).
Las reacciones catalizadas por el RNA pueden
ser descritas en la misma forma que las reacciones
enzimticas usuales segn la cintica de Michaelis-
Menten. En la FIGURA 27.10 se analizan las reaccio-
nes catalizadas por el RNA. Los valores de K
M
para
dichas reacciones son bajos, de modo que implican
que el RNA se una con su sustrato con alta especifi-
cidad. El nmero de recambio es bajo, lo cual refleja
baja velocidad cataltica. De hecho, las molculas de
RNA se comportan en la misma forma general de-
finida para las enzimas, aunque son relativamente
27A Las ribozimas tienen varias actividades catalticas 713
El GIcNeP es un ligando para un cambio de azcar que desactiva un RNAm
U a Regin
La unin de glucosamina
6 fosfato provoca e
autocorte y empalme
del RNA
5'?G
GUCU...N55.,.AUA
C G medular de
-j la ribozima ilAAG
CGCCCG GACGAGG \fi Ccq
GC
GC
GG
U A
Codn
de inicio
'
ACAUGAUCUU...N85...AUG....3'
El rojo indica las base; en que
la mutacin disminuye la actividad
A
G
U
G
U
G
GG
A
C
U
A
A
G
En la regin 5' no traducida del RNAm hay una ribozima que codifica la
enzima productora de la glucosamina-5-fosfato. Cuando Glc-5-P se une a la ribozima,
escinde el extremo 5
'
del RNAm, lo desactiva, e impide que siga produciendo la enzima.
lentas respecto de los catalizadores protenicos (en
los cuales las cifras de recambio normales van de
103 a 106).
Con el descubrimiento de que las ribozimas
pueden ser reguladas por ligandos, se ha logrado
ampliar de manera importante sus actividades (va-
se la seccin 13.7, Las molculas de RNA pequeas
pueden regular la traduccin). En la -jURA
se resume la regulacin de un ribointerruptor. El
metabolito pequeo GlcNP se une a una ribozima
y la activa para escindir el RNA en una reaccin
intramolecular con el n de regular la produccin
de GlcNP; la ribozima se localiza en la regin 5'
no traducida del RNAm, que codifica la enzima in-
volucrada en la produccin de GlcNP, y la escisin
impide la traduccin.
Cmo proporciona el RNA un centro catalti-
co? Esta capacidad parece razonable si se piensa en
un centro activo en cuya superficie se expone una
serie de grupos activos en una relacin fija. En
una protena, los grupos activos son proporciona-
dos por las cadenas laterales de los aminocidos,
notablemente variadas, que incluyen grupos i-
nicos positivos y negativos, as como hidrfobos.
En un RNA, las molculas disponibles estn ms
restringidas, constituidas sobre todo por los grupos
expuestos de las bases nitrogenadas. La conforma-
cin secundaria/terciaria de la molcula, que pro-
porciona una superficie de grupos activos ca; ;
de mantener un ambiente en el que se rompe- :
laces que se forman en otra molcula, da lugar
conservacin de regiones cortas en una estruc
especfica. Parece inevitable que la interaccin er
el RNA cataltico y el sustrato de RNA dependa ;
del apareamiento de bases para crear el ambiefll
Los cationes divalentes (por lo general Mg2+), si
importantes en la estructura, y suelen estar pr-c::
tes en el sitio activo, donde coordinan las posic .
de los diversos grupos; participan de manera dir:.
en la actividad endonucleoltica de la ribozima
virusoides (vase seccin 27.9, Los virioides tier.
actividad cataltica).
Las implicaciones evolutivas de esos descu:
mientos son intrigantes. La capacidad de fragme
tacin del aparato gentico, en el cual hay RN>.
todos los componentes, pero las protenas xea/-
reacciones catalticas, siempre ha sido un enig-
Parece poco probable que los primersimos sislerr
de replicacin tuvieran tanto cidos nucleicos cob
protenas.
Supngase, entonces, que los primeros sisterr
contenan slo un cido nucleico con replica:
propia y actividades catalticas primitivas, jur
mente las necesarias para formar y romper enlai!
fosfodister. Si se supone que la participacin de
enlaces 2-OH en las reacciones de escisin actv;
714 .; -r. 27 RNA cataltico
proviene de esas actividades catalticas primitivas,
>e podra argumentar que el cido nucleico original
era RNA, porque el DNA carece del grupo 2
'
-
OH
R por tanto, no podra dar lugar a tales reaccio-
:.es. Las protenas podran haberse agregado por
u capacidad para estabilizar la estructura del RNA.
La mayor versatilidad de las protenas, que pudo
r
.aberles permitido presentar reacciones catalticas,
;
ondujo en un momento dado al complejo aparato
de la expresin gnica moderna.
Rld Algunos intrones del grupo I
codifican endonucleasas
que fomentan La movilidad
Conceptos principales
Los intrones mviles pueden insertarse en nuevos
sitios.
Los intrones mviles del grupo I codifican una
endonucleasa que produce rotura de la doble cadena en
un sitio diana.
El intrn se transpone al sitio de la rotura de la doble
cadena por un mecanismo de replicacin mediado por
DNA.
Ziertos intrones de los grupos I y n contienen mar-
:
os de lectura abiertos que se traducen en protenas.
La expresin de las protenas permite al intrn ser
nvil (ya sea en su forma original de DNA o como
;
opia DNA del RNA), e insertarse en un nuevo sitio
enmico. Los intrones de los grupos I y II estn
"
luy dispersos, se encuentran tanto en procariotas
;
3mo en eucariotas. Los del grupo I migran por me-
ranismos mediados por DNA, en tanto que los del
feupo n hacen lo propio por mecanismos mediados
por el RNA.
La movilidad del intrn fue detectada por pri-
mera vez por cruces, en los cuales los alelos del gen
suportante difieren en cuanto a su posicin en el
ntrn. Los polimorfismos de la presencia o ausencia
e intrones son comunes en mitocondrias micti-
:
as, lo cual es compatible con el punto de vista de
;
"
je esos intrones se originaron por insercin en el
jen. Un anlisis de recombinacin en cruces que
aplican un gran gen de RNAr de la mitocondria
K levadura arroja un poco de luz en el proceso
mplicado.
Este gen tiene un intrn del grupo I con una se-
cuencia de codificacin, el cual est presente en algu-
nas cepas de levaduras (llamadas co+), pero ausente
en otras (ar). Las cruzas genticas entre organismos
&)" y co" son polares, su progenie suele ser co+.
Si se piensa en la cepa (+ como donadora y la
.
r como receptora, se llega a la idea de que en las
Un intrn codifica una endonucleasa que inicia su transferencia
Exn Intrn Exn
1
La endonucleasaf-
"
.
Sitio diana
RNA
escinde el sitio diana
El intrn se replica y
despus se inserta
Hi
7.
12 Un intrn codifica una endonucleasa que provoca una
rotura de doble cadena en el DNA. La secuencia del intrn se duplica
y despus se inserta en el sitio de rotura.
cruzas co+ con ar se genera una nueva copia del in-
trn en el genoma or, de modo que la progenie es
totalmente co+.
Para abolir la polaridad pueden ocurrir mutacio-
nes en cualquier progenitor, y los mutantes mues-
tran segregacin normal con, un nmero equivalen-
te co+ y co- en la progenie. Estas mutaciones indican
la naturaleza del proceso. Las mutaciones en la cepa
ar ocurren cerca del sitio en que se insertara el in-
trn, en tanto que las de la cepa co+, yacen en el
marco de lectura del intrn e impiden la produccin
de la protena. Esto sugiere el modelo de la FIGURA
7.12, donde la protena codificada por el intrn en
una cepa co+ reconoce el sitio donde debera inser-
tarse el intrn en una cepa or, y hace que se herede
de manera preferendal.
Cmo acta la protena? El producto del intrn
co es una endonucleasa que reconoce al gen or como
diana para una rotura de doble cadena. La endonu-
cleasa reconoce una secuencia diana de 18 bp que
contiene el sitio en que se inserta el intrn, de modo
que sta se escinde en cada cadena del DNA, a una
distancia de dos bases del extremo 3' del sitio de
insercin. As, los sitios de escisin estn separados
por 4 bp y generan cadenas nicas que sobresalen.
Este tipo de escisin se relaciona con la caracte-
rstica de los transposones cuando migran a nuevos
sitios (vase Cap. 21, Transposones). La rotura de
la doble cadena probablemente inicie un proceso
de conversin gnica, en la cual la secuencia del
gen oT se copia para sustituir a la del gen co-. La
reaccin implica transposicin por un mecanismo
de duplicacin, y tiene lugar slo en el mbito del
27.5 Algunos intrones del grupo I codifican endonucleasas que fomentan la movilidad
715
DNA. La insercin del intrn interrumpe la secuen-
cia reconocida por la endonucleasa, de modo que se
garantiza la estabilidad.
Muchos intrones del grupo I codifican endonu-
cleasas que les confieren movilidad. Hay varias fa-
milias de endonucleasas cuya caracterstica comn
es la secuencia de aminocidos LAGLIDADG, cerca
del sitio activo. Los intrones similares suelen portar
endonucleasas bastante diferentes en cuanto a los
detalles de la insercin; por ejemplo, la endonuclea-
sa codificada por el intrn tb del fago T4 escinde un
sitio diana situado a 24 bp en flujo ascendente res-
pecto del sitio en que se inserta el intrn mismo. La
disociacin entre las secuencias del intrn y la en-
donucleasa destaca por el hecho de que las mismas
secuencias de endonucleasas se encuentran en las
intenas (secuencias que codifican para protenas de
autocorte y empalme; vase la seccin 27.12, El cor-
te y empalme de las protenas es autocataltico).
La variacin en las endonucleasas significa que
no hay homologa entre las secuencias de los sitios
diana, que son de los ms largos y, por tanto, de
los ms especficos que se conocen para cualquier
La transcriptasa invc copia el intrn en un nuevo sitio
Exn Intrn Exn Sitio diana
Endonucleasa/
transcriptasa inversa
:
RNA
La rotura de la doble
cadena proporciona
un extremo de cebacln
13'
DNAo sintetizado
El intrn del RNA es el molde
El DNA sustituye al RNA -t"*"
El intrn se recombina
FIGURA 27.13 La transcriptasa inversa codificada por un intrn
permite insertar una copia del RNA como sitio diana generado por
una rotura dicatenaria.
endonucleasa (con un rango de 14 a 40 bp). L
pecificidad garantiza que el intrn se perpete l
por insercin en un sitio diana nico, y no en <
punto del genoma, lo que se llama alojamie
del intrn.
Los intrones que portan secuencias que l
difican endonucleasas se encuentran en divc
bacterias y eucariotas inferiores. Estos resulta
refuerzan el punto de vista de que los intrones
portan secuencias de codificacin surgieron i
elementos independientes.
Los intrones deL grupo II
pueden codificar protenas
muLtifuncionaLes
Conceptos principales
.
Los intrones del grupo II pueden ser sujetos de
autocorte y empalme in vitro, pero suelen ser
auxiliados por actividades protenicas codificadas e-
intrn.
.
Un slo marco de codificacin especifica a una
proteina con actividad de transcriptasa inversa y
madurasa, un segmento de unin de DNA y una
endonucleasa de DNA.
.
La transcriptasa inversa genera una copia de DNA-a
partir de la secuencia del RNA, que se transpone pc
mecanismo similar al del retroposn.
.
La endonucleasa escinde el DNA diana para permir'-
insercin del transposn en un nuevo sitio.
Los intrones mviles del grupo II mejor carao
zados codifican una sola protena en una regi."
intrn ms all de su centro cataltico. La prc:
tpica contiene actividad de transcriptasa fl
terminal N, que es un dominio central vincu:
con actividad auxiliar de plegamiento del ini
en su estructura activa (se llama madurasa: 1
se la seccin 27.7, Algunos intrones de auto:
y empalme requieren de madurasas), un do:r.
de unin al DNA y un dominio de endonucli
terminal C.
La endonucleasa inicia la reaccin de tran
sicin y tiene la misma participacin en el re:
a casa que su contraparte en un intrn del gru;
La transcriptasa inversa genera una copia de Di
partir del intrn insertado en el sitio de alojamit
La endonucleasa tambin escinde sitios diana I
cidos al sitio de alojamiento, pero no idnticos.
mucho menos frecuencia, lo cual lleva a la inse:
del intrn en nuevas localizaciones.
En la ftGUR/ 27.13 se ilustra la reaccin de tr
posicin de un intrn del grupo II tpico. La t.
nucleasa efecta una rotura de la doble cade::
716 CAPTULO 27 RNA cataltico
el sitio diana; para su actividad, requiere tanto del
iominio de la protena como del RNA del intrn.
z\ dominio de la protena escinde la cadena no co-
ficadora del DNA, y el intrn del RNA en realidad
rscinde la cadena en sentido normal; mediante esta
reaccin
,
el intrn se inserta directamente en un
Rio diana del DNA.
El intrn del RNA proporciona un molde para la
antesis de DNAc. Casi todos los intrones del grupo n
:
enen actividad de transcriptasa inversa especfica de
ntrn, la cual genera una copia del intrn del DNA
I resulta en la insercin del intrn en un sitio diana,
pomo DNA de doble cadena. El mecanismo simula
la transposicin de retrovirus, en la cual el RNA es
un intermediario obligatorio (vase la seccin 22.2,
El ciclo vital de los retrovirus implica sucesos simi-
ares a la transposicin). El tipo de retrotransposi-
n implicado en este caso simula el de un grupo
de retroposones que carecen de LTR y generan el
r.xtremo 3
'
-
OH, necesario para la cebacin, haciendo
ma hendidura en la diana (vase la Fig. 22.20 de la
seccin 22.12, Las UNES utilizan una endonucleasa
para generar un extremo de cebacin).
Algunos intrones de autocorte
y empalme requieren
de madurasas
Concepto principal
.
Los intrones de autocorte y empalme pueden necesitar
actividades de madurasa codificadas en su interior
para ayudar al plegamiento en la estructura cataltica
activa.
Aunque los intrones de los grupos I y II tienen la
opacidad de autocorte y empalme in vitro, en con-
diciones fisiolgicas suelen necesitar la ayuda de
protenas. Ambos tipos de intrn pueden codificar
;;
tividades de madurasa, las cuales se requieren
para ayudar a la reaccin de corte y empalme.
La actividad de madurasa es parte del marco
de lectura abierto nico, codificado por el intrn.
Bn el ejemplo de los intrones que codifican endo-
nucleasas de alojamiento, el producto protenico
nico tiene actividad tanto de endonucleasa como
de madurasa. El anlisis de las mutaciones muestra
que ambas actividades son independientes.
El anlisis estructural muestra que las activida-
des de endonucleasa y madurasa son proporciona-
das por diferentes sitios activos de la protena, cada
no codificado por un dominio independiente. El
rio de endonucleasa se une con el DNA, a dife-
rencia del de madurasa, que hace lo propio con el
.trri del RNA. En la se muestra la es-
tructura de una de esas protenas unida al DNA. Un
rasgo caracterstico de la endonucleasa es la presen-
cia de hlices a paralelas que contienen secuencias
LAGLIDADG, marcas de referencia que conducen
a los dos aminocidos catalticos. La actividad de
madurasa est localizada a cierta distancia, en la
superficie de la protena.
Los intrones que codifican madurasas tal vez
no sean susceptibles de autocorte y empalme eficaz
sin actividad protenica. De hecho, la madurasa es
un factor de corte y empalme especficamente ne-
cesario para el de la secuencia que la codifica, dado
que facilita el plegamiento del centro cataltico con
el fin de formar un sitio activo.
La coexistencia de actividades de endonuclea-
sa y madurasa en la misma protena sugiere una
va para la evolucin del intrn. En la FIGURA 27.15
se sugiere que el intrn se origin en un elemen-
to independiente de autocorte y empalme, al cual
la insercin de una secuencia de codificacin de
una endonucleasa le dio movilidad. No obstante,
dicha insercin podra haber alterado la capacidad de
la secuencia del RNA para plegarse en la estructura
activa, lo que presionara para que ciertas protenas
ayudaran a restablecer la actividad de plegamiento.
La incorporacin de una secuencia de ese tipo en el
intrn mantendra su independencia. Algunos in-
trones del grupo II que no codifican actividades de
madurasa pueden tener protenas comparables, co-
dificadas por secuencias del genoma del hospedador,
lo cual sugiere una posible va para la evolucin de
factores de corte y empalme generales. El factor po-
dra haberse originado como madurasa que facilitara
especficamente el corte y empalme de un intrn
en particular. La secuencia de codificacin se aisl
Los sitios activos de endonucleasa
y madurasa son diferentes
Sitio activo Sitios acl . es Hlices de
de aminocidos de la madurasa endonucleasas
Un intrn de alojamiento codifica a una endo-
nucleasa de la familia LAGLIDADG que tambin tiene actividad
de madurasa. Las secuencias LAGLIDADG son parte de las dos
hlices a que terminan en los aminocidos catalticos, cerca
del DNA dicatenario. El sitio activo de la madurasa se identifica
mediante una molcula de arginina en otra parte de la super-
ficie de la protena.
27.7 Algunos intrones de autocorte y empalme requieren de madurasas
717
Los intrones de autocorte y empalme pueden
adquirir secuencias de codificacin
I
Intron
El gen de endonucleasc
se inserta en el intrn
Endonucleasa
El intrn
transporta
la endonucleasa
I
El gen de madurasa
se Inserta en el intrn 1
El intrn porta
la endonucleasa
y la madurasa
FIGURA 27.15 El intrn se origin como una secuencia de co-
dificacin independiente para un RNA de autocorte y empalme.
La insercin de la secuencia de endonucleasa cre un intrn
mvil de alojamiento. La insercin de la secuencia de madurasa
increment entonces la capacidad de las secuencias del intrn
para plegarse en la estructura activa para corte y empalme.
del intrn en el genoma del hospedador y entonces
evolucion para actuar en una gama de sustratos
ms amplia que la secuencia del intrn original. El
gen cataltico del intrn podra haber evolucionado
hacia un RNAsn.
La actividad cataltica de La
ribonucLeasa P se debe al RNA
Concepto principal
La ribonucleasa P es una ribonucleoprotena en la cual
el RNA tiene actividad cataltica.
Una de las primeras demostraciones de las capa-
cidades del RNA provino de la diseccin de la ri-
bonucleasa P, endonucleasa de procesamiento del
RNAt de E. coli, que puede ser disociada en sus dos
componentes, el RNA de 375 bases y el polipptido
de 20 kD. En las condiciones originalmente utiliza-
das para caracterizar la actividad de las enzirr i
vitro, ambos componentes fueron necesarios pm
escindir el sustrato RNAt.
Sin embargo, un cambio en las condiciones ii
nicas (aumento de la concentracin de Mg2+) bac
que el componente protenico sea superfluo, pai
el RNA slo puede catalizar la reaccin! Analizando a
resultados como si el RNA fuese una enzima, cad
"
enzima
"
cataliza la escisin de mltiples sustraa
y si bien la actividad cataltica reside en el RN
componente protenico aumenta mucho la veloc
dad de la reaccin, como se observa en el increma
to del nmero de recambio (vase la Fig. 27. IM
Las mutaciones del gen del RNA o de la prcuo
na suelen desactivar a la ribonucleasa P in vivo
modo que se ha llegado a saber que ambos coaf
nentes son necesarios para la actividad natur?;
la enzima. La hiptesis original fue que la proie
na proporcionaba la actividad cataltica, en tan
el RNA tena alguna participacin accesoria. |
ejemplo, facilitar el plegamiento del sustrato (da
algunas secuencias cortas complementarias de f
regiones expuestas del RNAt), pero esas funcicm
se revierten!
Los virioides tienen actividad
cataltica
Conceptos principales
Virioides y virusoides forman una estructura en cal)ez*
de martillo con actividad de autoescisin.
Se pueden generar estructuras similares para el
apareamiento de una cadena de sustrato fragmentada
por una cadena de enzimas.
Cuando una cadena enzimtica se introduce en una
clula, puede aparearse con una cadena sustrato di .
que despus es escindida.
Otro ejemplo de la capacidad del RNA para acto
como endonucleasa proviene de RNA (-350 base
de plantas pequeas que presentan una reacot
de escisin propia. No obstante, como en el casa
del intrn del grupo I del gnero Tetrahymena. rre-
diante ingeniera es posible obtener estructura? qac
incidan en sustratos externos.
Estos RNA de plantas pequeas forman paar
de dos grupos generales, virioides y virusoides;. Los
virioides son molculas de RNA infecciosas qr
actan de manera independiente, sin ser encaps-
lados por alguna cubierta protenica, a diferenci
de los virusoides, similares en cuanto a organia-
cin, pero son encapsulados por virus de plantas
empacados con un genoma vrico. Los virusokk
no pueden replicarse de manera independiente. -
718 CAPTULO 27 RNA cataltico
quieren de la asistencia del virus; en ocasiones se les
denomina RNA satlite.
Virioides y virusoides se replican a travs de
crculos giratorios (vase la Fig. 16.6). La cadena de
RNA empaquetado en el virus se denomina cadena
positiva, y la complementaria, generada durante la
replicacin del RNA, se llama cadena negativa. Se
encuentran multmeros tanto de cadenas positivas
como de negativas. Ambos tipos de monmero se
generan por escisin de la cola de un crculo gira-
lorio; los monmeros circulares de cadena positiva
se generan por ligadura de los extremos del mon-
mero lineal.
Ambas cadenas de virioides y virusoides, po-
sitiva y negativa, presentan autocorte y empalme
:
n vitro, reaccin fomentada por cationes metlicos
divalentes
, que genera extremos 5'-OH y 2-3' fos-
odister cclico. Algunos de los RNA se escinden
p vitro en condiciones fisiolgicas, otros hacen lo
propio slo despus de un ciclo de calentamiento
I enfriamiento, lo cual sugiere que el RNA aislado
tiene una conformacin inapropiada, pero puede
generar una conformacin activa cuando se desna-
turaliza y renaturaliza.
Los virioides y los virusoides que presentan es-
cisin propia,
forman una estructura secundaria "en
martilllo" en el sitio de escisin, como se muestra
en la parte superior de la FIGURA 27.16. La secuencia
ie dicha estructura es suficiente para la escisin.
Cuando las secuencias circundantes presentan de-
.ecin, se obvia la necesidad de un ciclo de calenta-
miento-enfriamiento y el RNA pequeo se corta y
empalma espontneamente a s mismo, fenmeno
que sugiere que las secuencias ms all del martillo
uelen interferir con su formacin.
El sitio activo es una secuencia de slo 58 nu-
detidos. La cabeza del martillo contiene tres regio-
nes de tallo-asa, cuya posicin y tamao son cens-
antes, y 13 nucletidos conservados, casi todos en
regiones que se conectan con el centro de la estruc-
tura. Las bases y los tallos dobles conservados gene-
ran un RNA con capacidad intrnseca de escisin.
Tambin puede generarse un martillo activo
por apareamiento de un RNA que representar un
.
ado de la estructura y otro que representar al otro.
En la parte inferior de la Figura 27.16 se muestra un
feemplo de un martillo generado por hibridacin de
una molcula de 19 bases con una de 24. El hbrido
nula la estructura del martillo, con omisin de las
asas I y III. Cuando se agrega el RNA de 19 bases
H RNA de 24, se produce la escisin en la posicin
apropiada del martillo.
Se puede considerar que la cadena superior (24
rases) de ese hbrido incluye el "sustrato", y la in-
erior (19 bases),
la "enzima". Cuando se mezcla el
BSfA de 19 bases con un excedente del RNA de 24,
Las cabezas de martillo llevan a cabo
Las cabezas de martillo de consenso tienen
tres asas de tallo y bases conservadas
Tallo 3
3
'
5'
i/
Escisin
G N CG
CNGA
N N N N N
-N N N N N
Tallo 2
A
Tallo 1
Sitio cataltico
Por interaccin entre dos molculas de RNA
complementarias se pueden crear cabezas de martillo
Cadena sustrato
CCG
A
O
.
A
r-
~
Escisin
PPPGC.GCCG
HOCGCGG
U C G A G C'oh
AGCUCGGppp
Cadena enzimtica
UAG
. 7 L
os sitios de autocorte y empalme de virioides
y virusoides tienen una secuencia de consenso y forman una
estructura secundaria en cabeza de martillo, La cual tambin
puede generarse por apareamiento entre una cadena de sustrato
y una de
"
enzima
"
.
se escinden copias mltiples de este ltimo, lo cual
sugiere que hay un ciclo de apareamiento de 19
y 24 bases, escisin, disociacin de los fragmentos
eliminados del RNA de 19 bases y apareamiento de
este ltimo con el nuevo sustrato de 24 bases. El
RNA de 19 bases es, por tanto, una ribozima con
actividad de endonucleasa. Los parmetros de la
reaccin son similares a los de otras catalizadas por
el RNA (vase Fig. la 27.10).
La estructura cristalina de una cabeza de mar-
tillo muestra que forma una estructura en V com-
pacta, donde a su vez yace el centro cataltico, segn
se ilustra esquemticamente en la '. La
participacin de un ion Mg2+ localizado en el sitio
cataltico es crucial en la reaccin; lo ubica la citidi-
na diana y la citidina de la base del tallo I; tambin
puede estar conectado con la uridina adyacente.
Extrae un protn del extremo 2'-OH de la citidina
diana y despus ataca directamente el lbil enlace
fosfodister. Las mutaciones en la secuencia de ca-
beza de martillo que afectan el estado de transicin
de la reaccin de escisin ocurren tanto en el sitio
activo como en otras localizaciones
, lo cual sugiere
que puede haber cambios estructurales sustanciales
antes de la escisin.
Es posible disear combinaciones enzima-sus-
trato que formen estructuras en cabeza de martillo,
?7.9 Los virioides tienen actividad cataltica 719
El Mg++ inicia la catlisis
5' 3
'
G C
G S 3'
Tallo 2 C G c 5'
C G A G
G A CU
A U rA
C
G
G Tal101
A C U
Tallos U A
G A
U A
C
A Mg
C
G

Sitio cataltico
FIGURA 27. Una ribozima en cabeza de martillo da lugar
a una estructura terciaria con forma de V, en la cual, el tallo
2 se inserta sobre el 3; entre los tallos 2, 3 y 1 yace el centro
cataltico que contiene un ion magnesio que inicia la reaccin
hidroltica.
que se hayan sido usadas para demostrar que la in-
troduccin de las molculas apropiadas de RNA en
una clula permite que la reaccin enzimtica ocu-
rra in vivo. Una ribozima diseada en esa forma, pro-
porciona esencialmente una actividad similar a la de
restriccin, altamente especfica, dirigida contra un
RNA diana. Al poner la ribozima bajo el control de
un promotor regulado, se puede usar en la misma
forma que las cadenas no codificantes (por ejem-
plo), especficamente para eliminar la expresin de
un gen diana en circunstancias definidas.
rryr La edicin de RMA. ocurre
en bases individua Les
Concepto principal
.
Los receptores de apolipoproteina B y glutamato
presentan desaminaciones especficas de sitio
catalizadas por desaminasas de citidina y adenosina,
que cambian La secuencia de codificacin.
Un axioma primordial de la biologa molecular es
que la secuencia de un RNAm slo puede represen-
tar lo que est codificado en el DNA. El dogma cen-
tral contemplaba una relacin lineal en la cual una
secuencia continua de DNA se transcriba en una de
RNAm, que a su vez, se traduca directamente en
una protena. La presencia de genes interrumpidos
y la eliminacin de intrones por corte y empalme
del RNA introduce un paso adicional en el proceso
de expresin gnica, las secuencias de codificacin
(exones) del DNA deben ser reconectadas en
RNA, proceso que sigue siendo de transferencia i
informacin, en el cual la secuencia de codificac.
real del DNA se mantiene sin cambios.
Los cambios en la informacin codificada p ;
DNA ocurren en circunstancias excepcionales. .
bre todo en la generacin de nuevas secuencias :
codifican inmunoglobulinas en mamferos y n
Dichos cambios tienen lugar especficamente e:
clulas somticas (linfocitos B), donde se sintet
las inmunoglobulinas (vase Cap. 23, Diversida:
munitaria). Durante el proceso de reconstruc:
de un gen de inmunoglobulina, en el DNA de
individuo se genera nueva informacin, y la infa
macin codificada en el DNA es cambiada por m
mutacin somtica. La informacin del DNA si
siendo transcrita fielmente en el RNA.
La edicin del RNA es un proceso en que
formacin cambia en el mbito del RNAm; es reveLi.
por circunstancias en que la secuencia de codefc
cin de un RNA difiere de la del DNA a parti; i
cual fue transcrito. La edicin del RNA ocurre
dos circunstancias diferentes, cada una por difecs
tes causas. En clulas de mamfero se dan cas(<
sustitucin de una base individual del RNAm :
produce un cambio en la secuencia de la prote
codificada. En las mitocondrias de tripanosu-;
los cambios son ms extensos en los productes
transcripcin de varios genes, en cuyo caso se ; i
gan o eliminan bases sistemticamente.
La edicin convierte a CAA en UAA en el RNAm
El gen de apolipoproteina B tiene 29 exones
r'tllH-l!'
.
til I 111 "t HMTHi
CAA El codn 2153 codifica la glutamina
CAA
Edicin
UAA
El RNAm escindido y El RNAm intestinal
empalmado en el hgado '
iene un codn UAA
codifica para una protena que term
ina la sntesis
de 4563 aminocidos en el aminocido 2153
i
FIGURA 27.18 La secuencia del gen de la apo-B es la - :-
en el intestino y el hgado, pero la del RNAm se modifsg
un cambio de base que crea un codn de terminacin -.-
intestino.
720 CAPTULO 27 RNA cataltico
En la FIGURA 27.15 se resumen las secuencias del
gen de la apolipoprotena B y el RNAm en el intes-
tino y el hgado de los mamferos. El genoma tiene
m solo gen (interrumpido), cuya secuencia es idn-
tica en todos los tejidos, con una regin de codifica-
-ion de 4 563 codones. Este gen se transcribe en un
RNAm
, el cual se traduce en una protena de 518 kD,
que representa la secuencia completa de codificacin
en el hgado.
Una forma ms corta de la protena de -250 kD
-
;
e sintetiza en el intestino, la cual consta de la mitad
terminal N de la protena completa y se traduce a
partir de un RNAm cuya secuencia es idntica a la
heptica, excepcin hecha de un cambio de C por U
rn el codn 2 153. Dicha sustitucin pasa el codn
IAA para glutamina hacia el codn ocre UAA para
'
erminacin.
A qu se debe esta sustitucin? No hay un gen
I exn alterno en el genoma para codificar la nueva
secuencia, y no se ha descubierto ningn cambio en
el patrn de corte y empalme. La conclusin obli-
gada es que ha habido un cambio directamente en
a secuencia del transcrito.
Otro ejemplo son los receptores de glutamato del
:
erebro de rata. La edicin en una posicin cambia
Un codn de glutamina del DNA por un codn de ar-
Kna del RNA, cambio que afecta la conductividad
iel conducto y, por tanto, tiene un efecto importante
en el control del flujo inico a travs del neurotrans-
misor. En otra posicin del receptor, un codn de
irginina se convierte en un codn de lisina.
El suceso de edicin en la apo-B hace que C
2153
E cambie por U; ambos cambios en el receptor de
lutamato son de A a I (inosina). Estos sucesos son
ukaminaciones en las cuales se elimina el grupo ami-
no del anillo nucleotdico, sucesos catalizados por
inzimas llamadas desaminasas de citidina y adeno-
-
;
ina, respectivamente. Este tipo de edicin parece
:
ener lugar principalmente en el sistema nervioso.
Hay 16 dianas (potenciales) para la desaminasa de
citosina en Drosophila melanogaster, y todas corres-
fonden a genes implicados en la neurotransmisin.
En muchos casos el suceso de edicin cambia un
aminocido de una posicin funcionalmente impor-
tante de la protena.
Qu controla la especificidad de una reaccin
le edicin? Las enzimas que llevan a cabo la des-
aminacin como tal
, a menudo son muy especficas;
j'or ejemplo, la desaminasa de adenosina mejor ca-
racterizada acta en cualquier molcula A, en una
:
egin dicatenaria del RNA. Las enzimas de edicin
se relacionan con las desaminasas generales, pero
presentan otras regiones o subunidades adiciona-
Bs que controlan su especificidad. En el caso de
!a edicin de apo-B, la subunidad cataltica de un
complejo de edicin se relaciona con la desaminasa
La enzima de edicin es una desaminasa
Adenosina
NHg
t II GH
"
NT
Inosina
O
l
I II
HC*
N
-
-
C
CH
Exn
Intron
\ La edicin del RNAm se produce cuando una
desaminasa acta sobre una adem'na en una regin dicatenaria
de RNA apareada de manera imperfecta.
de citidina bacteriana, pero presenta una regin de
unin al RNA adicional que ayuda a reconocer el
sitio diana especifico para la edicin. Una enzima
especial, la desaminasa de adenosina, reconoce los
sitios diana del receptor de glutamato del RNA y
se presentan sucesos similares en un receptor de
serotonina del RNA.
El complejo puede reconocer una regin parti-
cular de la estructura secundaria de manera anlo-
ga a las enzimas de modificacin del RNAt, o bien
reconocer directamente una secuencia nucleotdica.
El perfeccionamiento de un sistema in vitro para el
suceso de edicin de apo-B sugiere que una secuen-
cia relativamente pequea (~ 26 bases) que rodea
al sitio de edicin constituye una diana suficiente.
En la FIGURA 27.19 se muestra que en el caso del
RNA de GluR-B, se forma una regin de pares de
bases necesaria para el reconocimiento de la diana
entre la regin editada en el exn y una secuencia
complementaria del intrn de flujo descendente. Se
necesita un patrn de apareamiento errneo dentro
de la regin doble para el reconocimiento especfi-
co. As, diferentes sistemas de edicin pueden tener
diferentes requisitos de especificidad de secuencias
en sus sustratos.
La edicin del RNA puede
dirigirse por RNA gulas
Conceptos principales
La intensa edicin de RNA en mitocondrias de tripano-
somas se debe a inserciones o deleciones de uridina.
El sustrato de RNA aparea sus bases con un RNA gua
en ambos Lados de la regin por editar.
El RNA gua proporciona el molde para la adicin
(o, con menos frecuencia, la delecin) de uridinas.
La edicin es catalizada por un complejo de
endonucleasa, actividad de transferasa de uridilo
terminal y ligasa de RNA.
27.11 La edicin del RNA puede dirigirse por RNA guas
721
Otro tipo de edicin se revela por cambios secuen-
ciales notables en los productos de varios genes de
mitocondrias de los tripanosomas. En el primer caso
por descubrir, la secuencia de la subunidad II de
la protena oxidasa de citocromo experimenta un
cambio de marco respecto de la secuencia del gen
coxil. Las secuencias del gen y la protena, incluidas
en la FIGURA 27.20, se conservan en varias especies de
tripanosomas. Cmo acta ese gen?
El RNAm de coxil tiene un inserto de cuatro
nucletidos adicionales (todos uridinas) en torno
al sitio de cambio del marco de lectura; con la es-
cisin se restablece el marco de lectura apropiado,
se inserta un aminocido adicional y cambian los
aminocidos a uno y otro lado. Con esa secuencia
no es posible descubrir un segundo gen, y debe con-
cluirse que las bases adicionales se insertan durante
o despus de la transcripcin. En los genes de SV5
y los paramixovirus causantes del sarampin se en-
cuentra una discrepancia similar entre el RNAm y
las secuencias genmicas, en cuyo caso implica la
adicin de molculas de G en el RNAm.
En otros genes, la edicin de secuencias de
RNA es similar, e incluye deleciones, as como
adiciones de uridina. El caso extraordinario del
gen coxIII del Trypanosoma brucei se resume en la
FIGURA 27.21.
Ms de la mitad de las molculas del RNAm consta
de uridinas no codificadas por el gen. La comparacin
entre el DNA genmico y el RNAm muestra qut
hay segmento mayor de siete nucletidos repres
tado en el RNAm que no haya sido modificado,
insertan series de uridinas de hasta siete bases.
dnde proviene la informacin para la inserc
especfica de uridina? Un RNA gua contiene \
secuencia complementaria de la del RNAm con
tamente editado. En la Fl JRA 27.22 se observa
modelo de su accin en el gen del citocromo B
especies de Leishmania.
La secuencia de la parte alta de la figura m,
tra el transcripto original, o RNA preeditado.
espacios indican el sitio de insercin de las b|
en el proceso de edicin, que para crear la secu
cia vlida cte" RNAm en esa regin, deben ser I
uridinas.
El RNA gua es complementario del RNA
lo largo de una distancia significativa que incl
la regin editada y la rodea. Por lo general, la I
plementariedad es ms extensa en el lado 3
'
d
regin editada y bastante corta en el lado 5
'
.
El a
reamiento entre el RNA gua y el preeditado i
espacios donde las molculas de A del RNA gua
apareadas, no encuentran complemento en el I
preeditado; el RNA gua proporciona un molde
permite a las molculas altantes de U insertara
dichas posiciones. Cuando concluye la reaccin
RNA gua se separa del RNAm, que queda disp<
ble para la traduccin.
Las inserciones de uridina crean un cambio de marco de lectura en el RNAm
ISSLGIKVE N LVGVM Codificado en la
AUA UCA AGU UUA GGU ADA AAA GUA GAG A AC CUq GUA GGU GUA AU secuencia de DNA
del genoma
Cambio de marco de lectura
AUA UCA AGU UUA GGU AUA AAA GUA GAU UGU AUA CCU GGU AGG UGU AAU Secuencia del RNA
I SSLG I KVDC I PG RCN Secuencia de la
protena
FIGURA 27.20 El RNAm para el gen coxil de los tripanosomas tiene un cambio de marco respecto
del DNA; el marco de lectura correcto se crea por la insercin de cuatro uridinas.
El RNAm de CoxIII es ampliamente editado, tanto por insercin como por delecin de uridina
UAUAUGUUUUGUGUUUAUUAVG JGA-UAGG G - A1 ' jUA ' -GA ;A. - UAAUUUQUUGAU
AAUACAUUUUAUUUGUUUGUUAAUUUUUUUGUUUUGUGUUUUGGUUAGGUUUUUUUGUUGUUGUUGUUUUGUAUUA
u
FIGURA 27.21 Parte de la secuencia coxIII del RNAm de 7". brucei muestra muchas uridinas no codificadas en el
DNA (rojas) o eliminadas del RNA (marcadas con T).
722 CAPTULO 27 RNA cataltico
El RNAm gua se aparea con el RNA preeditado para proporcionar un molde de edicin
Genoma AAAGCGGAGAGAAAAGAAA A G G C TTTAACTTCAGGTTGTTTATTACGAGTATATGG
Transcripcin
RNA preeditado AAAGCGGAGAGAAAAGAAA A G G C UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
Apareamiento con el RNA gua
i
i
RNA preeditado AAAGCGGAGAGAAAAGAAA A G G C UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
III lili llllllllll
RNA gua AUAUUCAAUAAUAAAUUUMHrtUAUrtAUrtGrtftrtAUUGArtGUUCAGUAUACACUAUAAUAAUAAU
i
Insercin de uridhas
RNAm AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUC'JUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
llllllfllllllllllllliltll
RNA gua AUAUUCAAUAAUAAAUUUUAAAUAUAAUA&AAAaUUGAAGUUCAGUAUACACUAUAAUAAUAAU
RNAm
Liberacin de RNAm
AAAGCGGAGAGAAAAGAAA! A G G Ci UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG
FIGURA 27.22 El RNA preeditado aparea sus bases con un RNA gua a ambos lados de la regin por editar.
El RNA gua proporciona un molde para la insercin de uridinas. El RNAm producido por las inserciones es
complementario del RNA gua.
La especificacin de la secuencia final editada
luede ser bastante compleja. En este ejemplo se evi-
a una porcin larga del producto de transcripcin
m insercin de un total de 39 molculas de U,
le parece necesitar dos RNA guas que actan en
Eos adyacentes; el primero se aparea en el sitio
r y la secuencia editada se convierte entonces en
m sustrato para edicin adicional por el siguiente
NA gua.
Los RNA guas se codifican como unidades de
ianscripcin independientes. En la f]
muestra un mapa de la regin importante del
INA mitocondrial del gnero Leishmania que in-
-uye el
"
gen
"
del citocromo b que codifica la se-
uencia preeditada y dos regiones que especifican
NA guas. Los genes para las principales regiones
e codificacin y otros RNA y sus RNA guas estn
atercalados.
i En principio, una mutacin en el "gen" o uno
e sus RNA guas podra cambiar la secuencia pri-
maria del RNAm y, por tanto,
tambin la secuen-
ia primaria de la protena. Por criterios genticos,
ada una de esas unidades podra considerarse como
mstitutiva de parte del "gen
"
.
Las unidades se ex-
iresan de manera independiente, de modo que de-
icran complementarse en configuracin trans.
Si
lubiera mutaciones, se necesitaran tres grupos de
Los genes para RNAm preeditados estn intercalados
MURF3(5')Cy RNA guias MURF2-1 Coll-FS MURFII-2 CyB-1
MURF3(FS)
Genes 12S 98 MURF3ColllC IMURF4MURF1ND1CollMURF2Col ND4 ND5
FIGURA 27.23 El genoma de especies de Leishmania contiene genes
que codifican RNA preeditados intercalados con unidades que codificar
los RNA guas necesarios para generar las secuencias RNAm correctas.
Algunos genes tienen varios RNA guas. El CyB es el gen para el cito-
cromo b preeditado, y CyB-1 y CyB-2 son genes para los RNA guas
implicados en su edicin.
complementacin para codificar la secuencia prima-
ria de una sola protena.
La caracterizacin de intermediarios editados
en parte sugiere que la reaccin procede a lo largo
del RNA preeditado en direccin 3'-5'. El RNA gua
determina la especificidad de las inserciones de uri-
dina por su apareamiento con RNA preeditado.
La edicin de uridinas es catalizada por un
complemento enzimtico de 20S que contiene una
endonucleasa, una transferasa de uridilo nuclear
27.11 La edicin del RNA puede dirigirse por RNA guas
723
La edicin se produce por escisin y ligadura
5
'
=3'
Endonucleasa
5
'
===== =3'
Transferasa de
I uridilo terminal/
TTUTasa)
5
'
U =3'
Ligasa de RNA
5' U=- -S'
FIGURA 27 ; La adicin o delecin de molculas de U se
debe a escisin del RNA, eliminacin o adicin de U, y ligadura
de los extremos. Las reacciones son catalizadas por un complejo
de enzimas dirigido por un RNA gua.
(TUTasa) y una ligasa de RNA, como se ilustra en
la se une al RNA gua y lo utiliza
para aparearse con el RNAm preeditado. El sus-
trato RNA es escindido en un sitio que (supuesta-
mente) se identifica por ausencia de apareamiento
con el RNA gua, se inserta o elimina una uridina
para el apareamiento de bases con el RNA gua, y
despus, se liga el sustrato RNA. El trifosfato de
uracilo (UTP) constituye la fuente del fragmento
uridilo que se agrega por actividad de la TUTasa;
no se sabe si esa actividad o la de una exonucleasa
independiente se encarga de la delecin. (En algn
momento se pens que el segmento de molculas
de U en el extremo del RNA gua podra proporcio-
nar la fuente de U aadido o un vertedero para los
eliminados, pero la transferencia de molculas de
U al RNA gua parece ser una reaccin aberrante
que no se encarga de la edicin.)
ETEE i corte y empalme de
protenas son autocatalltiCOs
Conceptos principales
.
Una intena tiene la capacidad de catalizar su propia
eliminacin de una protena, de manera que las
extenas de los flancos se conecten.
.
Corte y empalme de protenas se catalizan por la
intena.
.
Casi todas las intenas tienen dos actividades
independientes, corte y empalme de protenas y una
endonucleasa que vuelve a casa.
El corte y empalme de las protenas
escinde una intena
Extena Intena Extena
PNA
1
Protema
Protena
1 intena
'
escindida
<3
FIGURA 27.25 En el corte y empalme de protenas,
las e--;
as se conectan por eliminacin de la intena de la proter-;
El corte y empalme de protenas tienen el mi?
efecto que el correspondiente del RNA, una secuec-
cia representada en el gen no est representada ee
la protena, cuyas partes se nombran por anak _
con el corte y empalme del RNA: las extenas i
las secuencias representadas en la protena madw;
y las intenas, las secuencias que se eliminan. E
mecanismo de eliminacin de la intena es comr r
tamente diferente del de corte y empalme del R' -
En la FIGURA 27.25 se muestra que el gen se trac
en un precursor protenico que contiene la inter :
de modo que sta ser posteriormente escindid;
la protena. Se conocen casi 100 ejemplos de o
y empalme de protenas, difundidos en todas
"
i
clases de organismos. El gen tpico cuyo produ:
presenta corte y empalme de protenas tiene
sola intena.
La primera intena se descubri en un gen "
caico de polimerasa de DNA en forma de una ; :
cuencia intercalada en el gen que no cumple cor :
reglas de los intrones. Se demostr entonces qu i
protena purificada puede cortar su secuencia hada
fuera, en una reaccin autocataltica que no requie-
re de ingreso de energa y que ocurre a travs de
una serie de reestructuraciones de enlaces, co~
se muestra en la "I6URA 27.26. La reaccin es un
funcin de la intena, si bien su eficacia podra de-
pender de las extenas.
La primera reaccin es un ataque por un -C l-
o una cadena lateral -SH del primer aminocidi
la intena en el enlace peptdico que la conecta c. -
la primera extena, con lo cual la extena se trar. -
fiere del grupo amino terminal de la intena a una
724 CAPTULO 27 RNA cataltico
conexin N-0 o N-S acilo. Despus, ese enlace es
atacado por la cadena lateral -OH o -SH del primer
aminocido de la segunda extena,
el resultado ser
a transferencia de la extena I a la cadena lateral del
aminocido terminal de la extena II. Por ltimo
,
la
asparagina terminal C de la intena forma un ciclo y
B NH terminal de la extena II ataca el enlace acilo
para sustituirlo con un enlace peptdico convencio-
nal. Cada una de esas reacciones puede ocurrir de
manera espontnea a velocidades muy bajas, pero
su aparicin en forma coordinada, suficientemente
rpida como para lograr el corte y empalme de la
protena, requiere de catlisis por la intena.
Las intenas tienen rasgos caractersticos. Se en-
cuentran como inserciones en el marco de lectura
K las secuencias de codificacin, y se reconocen
;
omo tales por la presencia de genes homlogos
que carecen de la insercin. Tienen una serina o
dstena terminal N (para proporcionar la cadena
lateral -XH) y una asparagina terminal C. La intena
tpica porta una secuencia de ~150 aminocidos en
el extremo terminal N y casi 50 en el terminal C,
los cuales participan en la catalizacin de la reaccin
de corte y empalme de protenas. La secuencia del
centro de la intena puede tener otras funciones.
Una caracterstica extraordinaria de muchas
intenas es su actividad de endonucleasa de aloja-
miento, la cual escinde un DNA diana para crear un
sitio donde pueda insertarse la secuencia de codi-
cacin de la intena del DNA (vase la Fig. 27.12
E la seccin 27.5, Algunos intrones del grupo I co-
fican endonucleasas que fomentan la movilidad).
Las actividades de corte y empalme de las protenas
I de la endonucleasa de alojamiento de una intena
m independientes.
En realidad se desconoce la conexin entre esas
ios actividades en una intena, pero se han sugeri-
do dos tipos de modelo. Uno supone que original-
raente haba cierta conexin entre las actividades,
pero desde entonces se tornaron independientes y
Bgunas intenas han perdido la capacidad de en-
doiaucleasa de alojamiento. En el otro,
las intenas
meden haberse originado como unidades de corte
y empalme de protenas, que en su mayor parte
ieron invadidas despus por endonucleasas de alo-
jamiento (se desconoce la razn), lo cual es com-
atible con el hecho de que las endonucleasas de
aJojamiento parecen haber invadido tambin otros
:
ipos de unidades, incluidos,
sobre todo, los intrones
Kl grupo I.
25E Resumen
11 autocorte y empalme constituye una propiedad
de dos grupos de intrones muy difundidos entre las
El corte y empalme de protenas utiliza transesterificaciones
X = SoO
L
ev"
1m l i-J
O
il
C-NH
2
PH2 HHCH.
| Externa 1 VcV,:/ lnteina X c xtena 2
O
R
| Extena 1 fH C-X

-- c HExtefna2J
2HNC Intena | h o H
j
H
H
I
X
l
CH*
CH2
H -
A
CH2 NH
XO-jO
o=o
i
H
-v
C
'
,
C/lexteina2
o
/ . i i-i un,/
2HN
-
Externa 1/C 7 [ |ntena ]X nJ> Extena 2
o
HX
H CH,
O
FIGURA 27.26 Los enlaces se reestructuran mediante una serie de trans-
esterificaciones que involucran a los grupos -OH de serina o treonina,
o
al grupo -SH de la dstena, hasta que las extenas se conectan mediante
un enlace peptdico y la intena con un extremo C-circular es liberada.
eucariotas inferiores, los sistemas procariticos y
las mitocondrias. La informacin necesaria para la
reaccin reside en la secuencia del intrn (aunque
en realidad, protenas in vivo facilitan la reaccin).
Para los intrones de los grupos I y II,
la reaccin
requiere de la formacin de una estructura secun-
daria/terciaria especfica que implica secuencias de
consenso cortas. El RNA del intrn del grupo I crea
una estructura en que la secuencia del sustrato es
mantenida por la regin IGS del intrn,
en tanto
que otras secuencias conservadas generan un si-
tio de unin del nucletido guanina, todo ello, por
transesterificacin, que implica una molcula de
guanosina como cofactor. No se requiere ingreso de
energa. La guanosina rompe el enlace en la unin
5'
exn-intrn y se enlaza con el intrn; el hidroxilo
del extremo libre del exn ataca entonces la unin
3'
exn-intrn. El intrn se torna cclico y pierde
la guanosina y las 15 bases terminales. Una serie
27.13 Resumen 725
de reacciones relacionadas puede catalizarse a tra-
vs de ataques por el fragmento terminal G-OH del
intrn en enlaces fosfodister internos. Proporcio-
nando sustratos apropiados ha sido posible obtener
ribozimas por ingeniera, las cuales realizan diversas
reacciones catalticas, incluidas actividades de trans-
ferasa de nucleotidilos.
Algunos intrones mitocondriales de los grupos I
y II tienen marcos de lectura abiertos. Las protenas
codificadas por los intrones del grupo I son endo-
nucleasas, que producen escisiones dlcatenarias en
sitios diana del DNA; la escisin Inicia un proceso
de conversin del gen, en el cual, la secuencia del
intrn mismo se copia en el sitio diana. Las prote-
nas codificadas por intrones del grupo II incluyen
una actividad de endonucleasa que inicia el proce-
so de transposicin y una de transcriptasa inversa
que permite obtener una copia del intrn mismo
en el sitio diana. Dichos intrones posiblemente se
originaron por procesos de insercin. Las protenas
codificadas por ambos grupos de intrones pueden
incluir actividades de madurasa, que facilitan el
corte y empalme del intrn por estabilizacin de la
formacin de la estructura secundaria/terciaria en
sitio activo.
El componente RNA de la ribonucleoprotena
ribonucleasa P lleva a cabo reacciones catalticas.
Los RNA virusoides son susceptibles de autocorte
y empalme en una estructura
"
en cabeza de marti-
llo", estructura que puede formarse entre un RNA
sustrato y un RNA rbozima, lo cual permite dirigir
la escisin en secuencias muy especficas. Dichas re-
acciones sustentan el punto de vista de que el RNA
puede formar sitios activos especficos con actividad
cataltica.
La edicin del RNA cambia la secuencia de un
RNA durante su transcripcin o despus de sta, que
son cambios necesarios para crear una secuencia de
codificacin significativa. En sistemas de mamfe-
ros se presentan sustituciones de bases individuales
que asumen la forma de desaminaciones, donde C
se convierte en U, o A en I. Una subunidad cata-
ltica relacionada con la desaminasa de citidina o
adenosina acta como parte de un complejo ms
grande con especificidad para una secuencia diana
en particular.
Las adiciones y deledones (casi siempre de uri-
dina) se presentan en las mitocondxias de tripanoso-
mas y en paramixovirus. Las reacciones extensas de
edicin ocurren en los tripanosomas, en los cuales,
hasta la mitad de las bases de un RNAm provienen
de la edicin. En la reaccin de edicin se usa un
molde constituido por un RNA gua complementa-
rio de la secuencia del RNAm. La reaccin es cata-
lizada por un complejo enzimtico que incluye una
endonucleasa, una transferasa de uridina terwm
y una ligasa de RNA, que utilizan nucletidos
'
,::
"
como fuente de adicin o liberan nucletidos esa
didos despus de la delecin.
El corte y empalme de protenas constituvi ..
reaccin cataltica derivada de reacciones de =
ferencia de enlaces que no requiere de ingrc;
energa. La entena cataliza su autocorte y empine
fuera de las externas de los flancos. Muchas intr-ra
tienen una actividad de endonucleasa de aloja"'
to independiente de la actividad de cortey emr;-- -
de las protenas.
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-
-
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CAPTULO 27 RNA cataltico
Cromosomas
ESQUEMA DEL CAPITULO
Introduccin
Los genomas vricos estn empaquetados en sus
cubiertas fEMSM
.
La longitud del DNA que se puede incorporar a un virus
depende de la estructura de su casco.
.
El cido nucleico del casco est muy condensado.
.
Los virus de RNA filamentosos condensan el genoma de
RNA conforme ensamblan el casco a su alrededor.
.
Los virus de DNA esfrico insertan el DNA en una cubierta
protenica preensamblada. fJHKSt
EL genoma bacteriano es un nucleoide
.
El nucleoide bacteriano es ~80% DNA en cuanto a masa, y
puede ser desplegado por agentes que actan en el RNA o
las proteinas.
.
Las proteinas que condensan el DNA no han sido
identificadas.
El genoma bacteriano est superenrollado
.
El nucleoide tiene -100 dominios independientes
superenrollados negativamente.
.
La densidad promedio del superenrollamiento es ~1
superhlice/100 bp.
El DNA eucaritico tiene asas y dominios unidos a
un bastidor
.
El DNA de la cromatina de interfase est superenrollada en
forma negativa en dominios independientes de ~85 kb.
.
Los cromosomas en metafase tienen un bastidor de
protenas al que se unen las asas del DNA.
Secuencias especificas unen el DNA a una matriz
de interfase
.
El DNA est unido a la matriz nuclear en secuencias
especificas llamadas MAR o SAR,
.
Las MAR son ricas en A-T, pero no tienen una secuencia de
consenso especifica.
La cromatina se divide en eucromatina y
heterocromatina
. Los cromosomas individuales se observan slo durante la
mitosis.
.
En la interfase, la masa general de la cromatina est en
forma de eucromatina, con empaquetamiento menos
compacto que los cromosomas en mitosis.
.
Las regiones de heterocromatinas se mantienen densamente
empaquetadas durante la interfase.
Los cromosomas tienen patrones de banda
.
Ciertas tcnicas de tincin hacen que los cromosomas
parezcan una serie de estrias llamadas bandas G.
.
Las bandas tienen un menor contenido de G-C que los
espacios intermedios (interbandas).
*
Los genes se concentran en las interbandas, ricas en G-C.
Los cromosomas en escobilln se extienden
.
Los sitios de expresin gnica de los cromosomas en esco-
billn muestran asas que se extienden a partir de su eje.
Los cromosomas politnicos forman bandas
Los cromosomas politnicos de los dpteros tienen una
serie de bandas que se pueden usar como mapa citolgico.
Los cromosomas politnicos se expanden en sitios
de expresin gnica
.
Las bandas son sitios de expresin gnica en
cromosomas politnicos que se expanden para dar lugar a
"
abultamientos
"
.
El cromosoma eucaritico es un dispositivo de
segregacin
. Un cromosoma de eucariota se mantiene en el huso
mittico por unin de microtbulos al cinetcoro, que se
forma en su regin centromrica.
.
Los centrmeros a menudo tienen heterocromatina rica en
secuencias de DNA satlite.
Los centrmeros pueden contener DNA repetitivo
.
Los centrmeros de los cromosomas de eucariotas
superiores contienen grandes cantidades de DNA repetitivo.
.
Se desconoce la funcin del DNA repetitivo.
Las secuencias de DNA de los centrmeros de
S
.
cerevisiae son cortas
.
En S. cerevisiae, los elementos CEN se identifican por la
capacidad de permitir que un plsmido se segregue de
manera precisa en la mitosis.
.
Los elementos CEN consisten en las secuencias cortas
conservadas CDE-I y CDE-III, las cuales flanquean una
regin CDE-III rica en A-T.
El centrmero se une a un complejo protenico
.
En CDE-II se forma un complejo protenico especializado
alterno a la estructura usual de la cromatina,
.
El complejo protenico CBF3 que se une a CDE-III es
indispensable para la funcin del centrmero.
.
Las protenas que conectan esos dos complejos podran
proporcionar la conexin para los microtbulos.
Los telmeros tienen secuencias de repeticin
simples
.
Para la estabilidad del extremo cromosmico, se requiere el
telmero.
Contina en la siguiente pgina
729
.
Un telmero es una repeticin sencilla en la que una
cadena rica en C + A tiene la secuencia (
(A/r) .
w:M Los teLmeros sellan los extremos de los
cromosomas
.
La protena TRF2 cataliza una reaccin en que la
unidad repetida 3
'
de la cadena rica en G + T forma un
asa por desplazamiento de su homologa en una regin
de flujo ascendente respecto del telmero.
ewim Los teLmeros son sintetizados por
una enzima ribonudeoprotenica
.
La telomerasa hace uso del 3'-OH de la cadena
telomrica G + T para cebar la sntesis de repeticiones
seriadas de tipo TTGGGG.
.
El componente RNA de la telomerasa tiene una
secuencia que se aparea con repeticiones ricas en
C +A.
.
Una de las subunidades proteinicas es una
transcriptasa inversa que utiliza al RNA como molce
para la sntesis de la secuencia rica en G + T.
EfrWM Los telmeros son indispensables para la
supervivencia
waKHi Resumen
gnn Introduccin
En la organizacin de todo material gentico celular
es evidente un principio general, se trata de una
masa compacta confinada en un volumen limitado,
y sus diversas actividades, como replicacin y trans-
cripcin, deben tener lugar en ese espacio. Por otra
parte, la organizacin del material debe ajustarse a
transiciones entre un estado de inactividad y otro
de actividad.
El estado condensado del cido nucleico resul-
ta de su unin con protenas bsicas, cuyas cargas
positivas neutralizan las cargas negativas del cido
nucleico. La estructura del complejo nucleoprote-
nico depende de las interacciones de las protenas
con el DNA (o RNA).
El empaquetado del DNA, en fagos, virus,
clu-
las bacterianas y ncleos de eucariotas, resulta en
un problema comn. La longitud del DNA (o en
el caso de algunos virus, el RNA) como molcula
extendida rebasara con mucho las dimensiones del
compartimiento que la contiene, de modo que ten-
dra que comprimirse exageradamente para caber
en el espacio disponible. Este fenmeno contrasta ::
la imagen tpica del DNA de una doble hlice extend!:
pero su deformacin estructural al plegarse en unafov
ms compacta es la regla, ms que la excepcin.
La magnitud de la discrepancia entre la lor.;.-
tud del cido nucleico y el tamao de su compar-
timiento resulta evidente a partir de los ejemplos
resumidos en la IGURA 28.1. Para bacterifagos
virus de eucariotas, el genoma de cido nucleic
ya sea DNA o RNA monocatenario o dicatenaricj
efectivamente llena el receptculo (que puede s-.:
cilindrico o esfrico).
En compartimientos de bacterias o clulas eu-
cariticas es difcil calcular con exactitud la discri-
pancia, pues el DNA est contenido en una zonz
compacta que ocupa slo parcialmente el compar.-
miento; el material gentico asume la forma de nu-
cleoide en las bacterias y de masa de cromatina c "
ncleos eucariticos de interfase (entre divisiones
La densidad del DNA en esos compartimient ;
es alta, de -10 mg/ml, en una bacteria, de -100 m
mi en un ncleo eucaritico, y en la cabeza del fag
T4, de >500 mg/ml. Tal concentracin en solucii'r
El DNA est muy compactado en todos los tipos de genomas
Compartimiento
Forma Dimensiones
Tipo de cido nucleico Longitud
TMV filamento 0.008 x 0.3 um Un RNA monocatenario 2
,
um = 2.64 kb
Fago fd
filamento 0.006 x 0.85 um
Un DNA monocatenario
2 um = 6.0 kb
Adenovirus icosaedro 0.07 um de dimetro Un DNA dicatenario 11
.
um = 35.0 kb
Fago T4
icosaedro 0.065 x0.10
,
um Un DNA dicatenario 55
,
um = 170.0 kb
col cilindro 1.7 x 0.65
,
um Un DNA dicatenario 1.3 mm = 4.2x103 kb
Mitocondria esferoide
3.0 x 0.5 |im
-10 DNA dicatenarios
50 |im = 16.0 kb
(humana)
en oblea idnticos
Ncleo esferoide 6 um de dimetro 46 cromosomas 1.8m = 6x106kb
(humano)
de DNA dicatenario
FIGURA 28.- La longitud del cido nucleico es mucho mayor que las dimensiones del compartimiento
circundante.
730 CAPTULO 28 Cromosomas
sera equivalente a un gel de gran viscosidad. Se
desconocen las implicaciones fisiolgicas, como su
efecto en la capacidad de las protenas para hallar
sus sitios de unin en el DNA.
El empaquetamiento de la cromatina es flexi-
ble y cambia durante el ciclo celular eucaritico.
En el momento de la divisin (mitosis o meiosis),
el material gentico se empaqueta todava ms den-
samente, de modo que los cromosomas son iden-
tificables,
La compresin global del DNA suele describirse
mediante la razn de empaque, que corresponde
a la longitud del DNA dividida entre la longitud de
la unidad que la contiene. Por ejemplo, el cromo-
soma humano ms pequeo contiene -4.6 x 107 bp
de DNA (-10 veces el tamao del genoma de la
bacteria E. coli), lo cual equivale a 14 000 mieras
(
= 1.4 cm de DNA extendido). En el momento de la
mayor condensacin de la mitosis, el cromosoma tiene
-
2 p de longitud, as que la razn de empaque del
DNA en el cromosoma puede llegar hasta 7 000.
Las razones de empaque de las estructuras glo-
bales ms amorfas del nucleoide bacteriano o la cro-
matina eucaritica no pueden ser tan exactas, pero
el resultado puntual usual suele ser que los cromo-
somas en mitosis tengan un empaquetado cinco o
diez veces ms denso que la cromatina de interfa-
se, lo cual indica una razn de empaque tpico de
1000 a 2 000.
Una cuestin importante an sin respuesta se
refiere a la especificidad del empaquetado. El DNA
se pliega en un patrn particular o es diferente para
cada copia del genoma? Cmo cambia el patrn
del empaque cuando se replica o transcribe un seg-
mento del DNA?
Los genomas vricos estn
empaquetados en sus cubiertas
Conceptos principales
.
La longitud del DNA que se puede incorporar a un virus
depende de la estructura de su casco.
.
El cido nucleico del casco est muy condensado.
.
Los virus de RNA filamentosos condensan el genoma de
RNA conforme ensamblan el casco a su alrededor.
.
Los virus de DNA esfrico insertan el DNA en una
cubierta protenica preensamblada.
Desde la perspectiva del empaquetado de cada se-
cuencia, hay una diferencia importante entre un
genoma celular y un virus. El tamao del genoma
celular es esencialmente indefinido, pues el nmero
y localizacin de las secuencias individuales puede
cambiar por duplicacin, delecin y reestructura-
cin, o sea que se requiere de un mtodo genera-
lizado de empaquetamiento del DNA insensible al
contenido o la distribucin total de la secuencia. Por
el contrario, dos instrucciones definen las necesida-
des de un virus. La cantidad de cido nucleico por
empaquetar depende del tamao del genoma y debe
adaptarse a una de cubierta ensamblada por una o
varias protenas codificadas por los genes vricos.
El aspecto superficial de una partcula vrica
es falazmente simple; el genoma de cido nucleico
est contenido en una cpside, o estructura sim-
trica, o casi simtrica, ensamblada a partir de una
o unas cuantas protenas. A la cpside se unen (o
se incorporan a ella) otras estructuras, las cuales se
ensamblan a partir de protenas diferentes y que
son necesarias para la infeccin de la clula hos-
pedadora.
La estructura de la partcula vrica es muy com-
pacta, ya que rara vez el volumen interno de la cp-
side es mucho mayor que el del cido nucleico que
contendr; la diferencia suele ser menor del doble
y a menudo, el volumen interno es apenas mayor
que el del cido nucleico.
En su forma ms extrema, la restriccin de que
la cpside se ensamble con protenas codificadas por
el virus, indica que toda la cubierta se construye a
partir de un solo tipo de subunidad. Las reglas de
ensamblaje de subunidades idnticas en estructuras
cerradas restringe la cpside a uno o dos tipos. En el
primer caso, las subunidades de protena se apilan
secuencialmente en forma helicoidal para constituir
una estructura filamentosa o cilindrica, mientras que
en el segundo, forman una cubierta seudoesfrica,
una estructura similar a un poliedro con simetra
icosadrica. Algunas cpsides vricas se ensamblan
a partir de ms de un tipo de subunidad protenica,
y si bien esto ampla los tipos exactos de estructuras
que se pueden formar, las cpsides vricas an se
apegan a las clases generales de filamentos cuasi-
cristalinos o icosaedros.
Hay dos tipos de soluciones al problema de
cmo construir una cpside que contenga un cido
nucleico:
.
La cubierta protenica se puede ensamblar
en torno al cido nucleico, de modo de con-
densar el DNA o el RNA por interacciones
protena-cido nucleico durante el proceso
de ensamblaje.
.
La cpside se puede construir a partir de
esos componentes en forma de cascarn va-
co, en el cual se insertar el cido nucleico,
que se condensa conforme entra.
En los virus de RNA monocatenario, la cpside
se ensambla en torno al genoma segn el principio
de que la posicin del RNA dentro de la cpside es de-
28.2 Los genomas vricos estn empaquetados en sus cubiertas
731
El casco se condensa en torno al RNA de TMV
El RNA se enrolla en una hlice
El DNA lambda se inserta en la cabeza
FIGURA 28.2 Mediante apilado de subunidades protenicas en
el virin se crea una va helicoidal para el RNA del TMV.
terminada directamente por su unin con las protenas
de la cubierta. El ejemplo mejor caracterizado es el
de TMV (virus del mosaico del tabaco), en el cual,
el ensamblaje se inicia con una horquilla doble
que yace en la secuencia del RNA. A partir de ese
centro de nucleacin, procede de manera bidi-
reccional en el RNA hasta llegar a los extremos. La
unidad de la cpside es un disco de dos capas, cada
una de las cuales contiene 17 subunidades prote-
nicas idnticas. El disco es una estructura circular
que, al interactuar con el RNA, forma una hlice.
En el centro de nucleacin, la horquilla de RNA se
inserta en el orificio central del disco y ste cambia
de conformacin, a una estructura helicoidal que
rodea al RNA. Se agregan discos adicionales, cada
uno de los cuales lleva una nueva cadena de RNA
hada su orificio central. El RNA se enrolla de forma
helicoidal dentro de la cubierta de protena como se
ilustra en la FIGURA 28.2
Las cpsides esfricas de los virus de DNA se
ensamblan de forma diferente, siendo el ejemplo ca-
racterstico los fagos lambda y T4, en cuyo caso, una
cubierta vaca se ensambla a partir de un pequeo
conjunto de protenas. A continuacin, elgenoma doble
se inserta en la cabeza, proceso que se acompaa de
un cambio estructural en la cpside.
En la "IGURA se resume el ensamblaje del
virus lambda, el cual empieza con un pequeo cas-
co que contiene una protena
"
medular
"
y que se
transforma en un casco vaco de forma caractersti-
ca. En ese punto se inicia el empaquetado del DNA,
el casco aumenta de tamao, aunque conserva la
misma forma, hasta que toda la cabeza se sella por
la adicin de la cola.
La procabeza I tiene un
centro de protena
O
La procabeza II est vaca
Se inicia el empaquetamiento
del DNA
El casco se expande
conforme aumejita el DNA Partcula de fago madura
Procabeza I
El casco alcanza su tamao
completo
Se une la cola
A
i
FIGURA 28.2 La maduracin del fago lambda pasa por viriss
etapas. La cabeza vaca cambia de forma y se expande cua-;:
se llena de DNA. Las micrografas electrnicas muestran .;
partculas al inicio y al trmino de la va de maduracin. Fc:;-
grafa superior reproducida de Cue, D. y Feiss, M. 1993, P-::
Nati Acad. Se/. USA, 90:9290-9294. Copyright 1993, NatiunaL
Academy of Sciences U.S.A. Imagen cortesa de Michael
Feiss, University of lowa. La imagen inferior es cortesa :-
Robert Duda, University of Pittsburgh.
Un DNA dicatenario que cubre distancias coreas
es un cilindro bastante rgido que de todas forniai
debe comprimirse en una estructura compacta ps:;
ajustarse al interior de la cpside. Sera bueno saber
si el empaquetado implica un enrollado ligero fe
DNA dentro de la cabeza o si necesita flexionatse
abruptamente.
La insercin del DNA en una cabeza de ag
implica dos tipos de reaccin, translocacin y con-
densacin, ambas desfavorables desde el punto -:.
vista energtico.
La translocacin es un proceso activo en el que
el DNA es llevado al interior de la cabeza por -
mecanismo dependiente de ATP; el mecanismo u: -
fizado es comn para muchos virus que se replican
mediante enrollamiento circular para generar larg;,
colas que contienen multmeros del genoma vi
'
r;-
732 CAPTULO 28 Cromosomas
co. El ejemplo mejor caracterizado es el del fago
lambda, cuyo genoma es empaquetado en la cpsi-
de vaca por la enzima terminasa, proceso que se
resume en la iGURA 28.4.
La terminasa fue detectada por primera vez
merced a su participacin en la generacin de ex-
tremos del fago lineal de DNA por escisin en si-
tios eos (nombre que refleja el hecho de que genera
extremos cohesivos con colas complementarias de
una sola cadena). El genoma del fago codifica dos
subunidades que constituyen la terminasa, una de
las cuales se une a un sitio eos, punto en que se une
a la otra subunidad, la cual corta el DNA. La ter-
minasa se ensambla en un heterooligmero dentro
de un complejo que tambin incluye IHF (factor
de integracin del hospedador, dmero codificado
por el genoma bacteriano). Despus se une a una
cpside vaca y aprovecha la hidrlisis de ATP para
impulsar la translocacin a lo largo del DNA, hasta
llevarlo al interior de la cpside vaca.
Otro mtodo de empaquetado utiliza un com-
ponente estructural del fago. En el fago (p29 del
Bacillus subtilis, el motor que inserta el DNA en la
cabeza es la estructura que la conecta con la cola y
que acta como motor rotatorio, cuya accin efec-
ta la translocacin lineal del DNA al interior de
la cabeza del fago. El mismo motor se usa para ex-
pulsar el DNA y la cabeza del fago cuando infecta
a una bacteria.
Se sabe poco del mecanismo de condensacin en
una cpside vaca, excepto que sta contiene
"
prote-
nas internas
"
, as como DNA. Una posibilidad es que
proporcione algn tipo de
"
bastidor" donde se con-
densa el DNA (sera la contraparte del uso de prote-
nas en la cubierta de los virus vegetales de RNA).
Qu tan especfico es el empaquetado? No pue-
de depender de ciertas secuencias porque deleciones,
inserciones y sustituciones no pueden interferir con
el proceso de ensamblaje. La relacin entre el DNA
y el casco ha sido directamente investigada para de-
terminar cules de sus regiones pueden enlazarse
en forma cruzada con las protenas de la cpside.
La sorprendente respuesta es que todas las regiones
del DNA son casi igualtemente susceptibles, es decir,
que cuando se inserta en la cabeza, sigue una regla
general para la condensacin, pero el patrn no es
determinado por secuencias especficas.
Estos diferentes mecanismos de ensamblaje de
virus llegan todos al mismo fin: el empaquetado
de una molcula unicatenaria de DNA o RNA den-
tro de la cpside. No obstante, algunos virus tienen
genomas que constan de muchas molculas de cido
nucleico. Por ejemplo, los reovirus contienen diez
segmentos de RNA dicatenario que deben empacarse
en la cpside, para lo cual pueden ser necesarias
secuencias de seguimiento especficas en los seg-
La terminasa corta el DNA y lo empaca en la cpside
Un circulo rodante genera multmeros lambda
La terminasa se une al sitio eos en el DNA
Q
Se escinde el DNA
La terminasa recluta la cpside
La terminasa transloca al DNA en el interior de
la cpside
\
La protena terminasa se une a sitios especficos
en un multmero de genomas vricos generales por repLicacin
de un crculo rodante. Corta el DNA y se une a una cpside vrica
vaca, para despus utilizar la energa de la hidrlisis de ATP
con el fin de insertar el DNA en la cpside.
mentos de modo de garantizar que el proceso de en-
samblaje elija una copia de cada molcula diferente
para formar un conjunto completo de informacin
gentica. En el caso ms sencillo del fago (p6, que
empaqueta tres diferentes segmentos de RNA de
doble cadena en una cpside, los segmentos deben
unirse en un orden especfico; como cada uno es
incorporado a una cpside, desencadena un cambio
en su conformacin que crea sitios de unin para el
siguiente segmento.
Algunos virus vegetales tienen mltiples divi-
siones, sus genomas estn formados por segmentos,
cada uno de los cuales se empaqueta en una cpside
diferente. Un ejemplo es el virus del mosaico de la
alfalfa (AMV), que tiene cuatro RNA unicatenarios
diferentes, cada uno empacado de manera inde-
pendiente en una cubierta constituida por la misma
subunidad protenica. Una infeccin exitosa depen-
de del ingreso de un RNA de cada tipo a la clula.
Los cuatro componentes del AMV constan de
partculas de diferentes tamaos, o sea que la misma
protena de la cpside puede empacar cada RNA
en su propia partcula caracterstica, fenmeno que
28.2 Los genomas vricos estn empaquetados en sus cubiertas
733
difiere del empaquetado de un segmento nico de
cido nucleico en una cpside de forma fijas,
La va de ensamblaje de los virus cuyas cpsides
tienen slo una forma autntica puede ser desviada
por mutaciones que dan lugar a la formacin de
partculas monstruosas aberrantes, en las cuales,
la cabeza es mayor de lo usual. Esas mutaciones
muestran que una protena de la cpside, tiene ca-
pacidades intrnsecas para ensamblarse en un tipo
particular de estructura, pero el tamao y la forma
exactos pueden variar. Algunas de esas mutaciones
ocurren en genes que codifican factores de en-
samblaje necesarios para la formacin de la cabeza,
pero que no son parte del casco. Tales protenas
auxiliares limitan las opciones de la protena de la
cpside, de manera que se ensambla slo a lo largo
de la va deseada. En el ensamblaje de la cromatina
celular se emplean protenas comparables (vase
Cap. 29, Nucleosomas),
EflEI EL genoma bacteriano
es un nucleoide
Conceptos principales
.
El nucleoide bacteriano es -80% DNA en cuanto a
masa, y puede ser desplegado por agentes que actan
en el RNA o las protenas.
.
Las protenas que condensan el DNA.no han sido
identificadas.
Si bien las bacterias no muestran estructuras con
las caractersticas morfolgicas definidas de los cro-
mosomas eucariticos, de todas formas los genomas
estn organizados en cuerpos definidos. El matei
gentico se ve como un conjunto bastante co
pacto (o una serie de conjuntos), que ocupa cas:
33% del volumen de las clula. En la Fl
muestra el corte delgado de una bacteria en el c
es evidente dicho nucleoide.
Cuando se lisa E. coli, se liberan fibras en fon
de asas unidas a la envoltura rota de la clula. Ce
puede observarse en la Fl , el DNA de es-
asas no muestra una forma extendida dicatena:
sino compacta, por su vnculo con protenas. I
De . coli se han aislado varias protenas
unin con el DNA que superficialmente se seme;
a las protenas de cromosomas eucariticos. C
criterios deberan aplicarse para decidir si una p
tena que se une al DNA tiene participacin estr
tural en los nucleoides? Debera haber cantidat
suficientes como para que se una a todo el genon
y las mutaciones de su gen deberan modificar
alguna forma la estructura o las funciones vincu
das con la supervivencia del genoma (por ejemp
segregacin a clulas hijas). Ninguna de las posib
protenas cumple an las condiciones genticas.
La protena HU es un dmero que tal vez c
densa el DNA al envolverlo en una estructura si-
lar a una burbuja y que tiene relacin con IHF, c
presenta actividad estructural para la formacin
un complejo protenico en reacciones especializae
de recombinacin. Las mutaciones nulas en cu
quiera de los genes que codifican las subunidades
HU (hupA y -B) tienen poco efecto, pero la prd:
de ambas funciones da lugar a un fenotipo sens
al fro y cierta prdida de la estructura helicoidal
el DNA. Esos resultados dan lugar a la posibilid
El DNA bacteriano es un nucleoide compacto
El DNA bacteriano es una hebra
enrollada tensamente
5 Un corte delgado muestra el nucleoide bacte-
riano como masa compacta en el centro de la clula. Imagen
cortesa de Molecular and Cell Biology Instructional Laboratory
Program, University of California, Berkeley.
6 El nucleoide se vierte fuera de una f. coli lis
en forma de asas de una fibra. Fotografa G. Murti/Ph
Researchers, Inc.
734 CAPTULO 28 Cromosomas
de que intervenga de forma general en la conden-
sacin del nucleoide.
La protena Hl (tambin conocida como H-NS)
se une al DNA interactuando preferentemente con
secuencias plegadas. Las mutaciones en su gen han
resultado en diversas formas (osmZ, bglY, pilG), cada
una identificada como regulador aparente de un sis-
tema diferente. Dichos resultados tal vez reflejen el
efecto que Hl produce en la topologa local del DNA
que incide en la expresin gnica dependiente de
un promotor en particular.
Sera de esperar que la ausencia de una protena
necesaria para la estructura del nucleoide tuviera
graves efectos a la viabilidad, por qu entonces los
efectos en las deleciones de los genes para las pro-
tenas HU y Hl son relativamente restringidos? Una
explicacin es que dichas protenas son redundantes,
y una sola puede sustituir a las otras, de manera que
se necesitaran deleciones en todas ellas para modifi-
car notoriamente la estructura del nucleoide. Otra
posibilidad es que an no se han identificado las
protenas encargadas de las principales caractersti-
cas de la integridad del nucleoide, el cual se puede
aislar directamente en forma de complejo de sedi-
mentacin muy rpida constituido por -80% DNA
por masa. (Los complejos anlogos en eucariotas
tienen -50% DNA por masa; vase la seccin 28.4,
El genoma bacteriano est superenrollado); puede
ser desplegado por tratamiento con reactivos que
actan sobre el RNA o las protenas, cuya posible
participacin en la estabilizacin de esta estructura
es evidente; el papel del RNA ha sido bastante re-
fractario al anlisis.
fl EL genoma bacteriano
est superenrollado
Conceptos principales
.
El nucleoide tiene -100 dominios independientes
superenrollados negativamente.
.
La densidad promedio del superenrollamiento es
~
1 superhlice/100 bp.
El DNA del nucleoide bacteriano aislado in vitro se
comporta como una estructura doble cerrada, a juz-
gar por su respuesta al bromuro de etidio. Esa peque-
a molcula se intercala entre pares de bases para
generar giros superhelicoidales positivos en molcu-
las de DNA circular "cerradas", esto es, en molculas
donde ambas cadenas tienen integridad covalente.
(En las molculas circulares "abiertas" que incluyen
una hendidura en una cadena o en molculas linea-
les, el DNA puede rotar libremente en respuesta a la
intercalacin, aliviando as la tensin.)
En un DNA cerrado natural cuyo superenro-
llamiento es negativo, el intercalado de bromuro de
etidio elimina primero las superhlices negativas y
despus introduce superhlices positivas. La canti-
dad de bromuro de etidio necesaria para llegar a un
superenrollamiento de cero es un parmetro de la
densidad original de las superhlices negativas.
El nucleoide compacto presenta algunas hen-
diduras durante su aislamiento, las cuales tambin
pueden generarse por tratamientos limitados con
desoxirribonucleasa, con lo cual, sin embargo, el
bromuro de etidio no pierde su capacidad de in-
troducir superhlices positivas. Esta capacidad del
genoma de conservar su respuesta al bromuro de
etidio ante las hendiduras significa que debe tener
muchos dominios cromosmicos independientes,
y que en cada dominio, el superenrollamiento no resulta
afectado por lo que sucede en los otros.
Esta autonoma sugiere que la estructura del
cromosoma bacteriano tiene la organizacin general
que se muestra esquemticamente en la
Cada dominio consta de un asa de DNA cuyos extre-
mos se aseguran de alguna forma (desconocida) que
no permite que se propaguen los sucesos rotativos
de un dominio a otro.
En los primeros informes se sugera que los do-
minios constan de -40 kb de DNA, pero en anlisis
ms recientes se sugiere que pueden ser ms pe-
queos, de -10 kb cada uno, o -400 dominios en
el genoma de E. coli. Los extremos de los dominios
parecen distribuidos de manera aleatoria, y no loca-
lizados en sitios predeterminados del cromosoma.
El DNA bacteriano tiene dominios con
enrollado independiente
El asa promedio
contiene -10-40 kb
de DNA
1
Las asas se anclan
en la base mediante
un mecanismo
desconocido
El asa consta de DNA
dicatenario
condensado por
protenas bsicas
El genoma bacteriano consta de un gran nmero
de asas de DNA dicatenario (en forma de fibra); cada una de las
cadenas se ancla en la base para formar un dominio estructural
independiente.
-
El genoma bacteriano est superenrollado 73>
La unin de protenas restringe
las superhlices
DNA ,
dicatenario
(ni No comprimida,
u ffl) la va est
I superenrollada en
> yy el espacio y crea
tensin
La va comprimida est
superenrollada en torno
a las protenas, pero no
crea tensin
IGURA 28.8 Una superhlice sin restriccin en la va del
DNA crea tensin, pero sta no se transmite a lo largo del DNA
cuando una superhlice se restringe por unin con protenas.
La existencia de dominios independientes po-
dra permitir que se mantuvieran diferentes grados
de superenroUamiento en regiones diferentes del
genoma, que tal vez sea importante al considerar
las diferentes susceptibilidades de ciertos promoto-
res bacterianos ante el superenroUamiento (vase
seccin 11.15, El superenroUamiento es una carac-
terstica importante de la transcripcin).
Como se muestra en la FIGURA 28.8, en el ge-
noma, el superenroUamiento puede, en principio,
asumir una de dos formas:
.
Si un DNA superenrollado est libre, su va
no tiene restricciones y las superhlices ne-
gativas generan un estado de tensin por
torsin que se trasmite libremente a lo lar-
go del DNA en un dominio, tensin que se
alivia por el desenrollamiento de la doble
hlice, como se describe en la seccin 19.12,
El superenroUamiento afecta la estructura
del DNA. El DNA se encuentra en equilibrio
dinmico entre el estado de tensin y el de
desenrollado.
.
El superenroUamiento puede constreirse si
las protenas se unen al DNA para mante-
nerlo en una configuracin tridimensional
particular, en cuyo caso, las superhUces es-
tarn representadas por la va que sigue el
DNA en su vnculo fijo con las protenas. La
energa de la interaccin entre las protenas
y el DNA superenrollado estabiliza el cido
nucleico, de manera que no se transmita
tensin por la molcula,
7 vivo las superhlices del DNA de E. coli estn
comprimidas o la doble hlice est sujeta a la tensin
por torsin caracterstica del DNA libre? Las medi-
ciones del superenroUamiento in vitro se enfrentan
al problema de que las protenas que comprimen
podran haberse perdido durante el aislamiento. En
varios enfoques se sugiere que, in vivo, el DNA est
sometido a estrs por torsin.
Uno de los enfoques es determinar el efectc
de las hendiduras en el DNA. Las superhlices a
comprimidas se liberan por medio de hendidura?
en tanto que las comprimidas no resultan afecta
das. Las hendiduras liberan -50% del superenro
Uamiento general, lo cual sugiere que casi la mit*
del superenroUamiento se transmite como tensin
a lo largo del DNA, y la otra mitad es absorbida pe
la unin con protenas.
En otro enfoque se utiliza el psoraleno, reactive
de enlace cruzado, que se une ms fcilmente 9
DNA cuando se encuentra bajo tensin por torsin
La reaccin del psoraleno con el DNA de E. coli I
vivo corresponde a una densidad promedio de un
giro superhelicoidal negativo/200 bp (a = -0.051.
Tambin es posible analizar la capacidad de la
clulas de formar estructuras alternas de DNA, po
ejemplo, para generar estructuras cruciformes i
secuencias palindrmicas. A partir del cambio de!
nmero de enlaces que se requiere para llevar '
cabo tales reacciones, es posible calcular la densi
dad del superenroUamiento original, abordaje qui
sugiere una densidad promedio de a = -0.025 o ti
giro superhelicoidal negativo/100 pares de bases.
Por tanto, las superhlices crean tensin por te i
sin in vivo; podra haber variaciones acerca de in
nivel promedio, y es difcil medir la variedad precis.
de densidades. No obstante, es obvio que el nivel bas
ta para ejercer efectos significativos en la estructur.
del DNA, por ejemplo, para ayudar a su disolucin en
regiones especficas, como orgenes o promotores.
Muchas de las caractersticas importantes de L
estructura del nucleoide compacto an no han sij
establecidas. Con qu especificidad se construyei
los dominios? Yacen las mismas secuencias sien:
pre en las mismas localizaciones relativas o puede:
variar los contenidos de dominios en particular
Se mantiene la integridad del dominio? El anlis:
bioqumico por s mismo no puede responder po
completo a esas preguntas, pero es posible disea
tcnicas selectivas adecuadas, y las propiedades d
los mutantes estructurales deberan llevar a un an
lisis molecular de la construccin del nucleoide.
3 EL DNA eucaritico tiene asas y
dominios unidos a un bastidor
Conceptos principales
El DNA de la cromatina de interfase est superenrollado en
forma negativa en dominios independientes de ~85 kb.
.
Los cromosomas en metafase tienen un bastidor de
protenas al que se unen las asas del DNA.
736 CAPTULO 28 Cromosomas
La cromatina de interfase es una masa enmaraada
de DNA que ocupa gran parte del volumen nuclear,
a diferencia de la otra estructura tan organizada y
reproducible de los cromosomas mitticos. Qu
controla la distribucin de la cromatina de interfa-
se en el ncleo?
El aislamiento del genoma como cuerpo com-
pacto nico proporciona ciertas pruebas indirectas
de su naturaleza. Aplicando la misma tcnica perfec-
cionada para el aislamiento del nucleoide bacteriano
(vase la seccin 28.4, El genoma bacteriano est
superenrollado), es posible Usar los ncleos sobre un
gradiente de sacarosa, de modo de liberar el genoma
de forma que pueda conectarse por centrifugacin.
Despus de aislarlo de Drosophila melanogaster, es po-
sible visualizarlo como una fibra de pliegues com-
pactos (de 10 nm de dimetro) constituida de DNA
unida a protenas.
El superenrollamiento medido por su respuesta
al bromuro de etidio corresponde casi a una super-
hlice negativa/200 bp. Esas superhlices pueden
eliminarse mediante hendiduras de desoxirribonu-
cleasa, si bien el DNA conserva la forma de la fibra
de 10 nm, lo cual sugiere que el superenrollamiento
se debe a la disposicin de la fibra en el espacio, y
que representa la torsin presente.
La relajacin completa de las superhlices impli-
ca una hendidura/85 kb, de modo de identificar la
longitud promedio del DNA "cerrado". Dicha regin
podra constituir un asa o dominio de caractersticas
similares a los identificados en el genoma bacteria-
no. Las asas se observan directamente cuando la
mayor parte de las protenas es extrada de los cro-
mosomas mitticos. El complejo resultante consta
de DNA vinculado con -8% del contenido de pro-
tena original. Como se observa en la FIGURA 2c , los
cromosomas sin protenas adoptan la forma de un
bastidor central rodeado de un halo de DNA.
El bastidor en metafase consta de una red densa
de fibras, del cual emana DNA, aparentemente en
forma de asas de 10 a 30 pm (30 a 90 kb) de longitud
promedio. El DNA puede ser digerido sin afectar la
integridad del bastidor, que consta de un conjunto
de protenas especficas, lo cual sugiere una forma
de organizacin en la cual asas de DNA de -60 kb
se anclan en un bastidor proteinceo central.
El aspecto del bastidor simula un par de crom-
tides hermanas mitticas, el cual suele tener una
conexin muy estrecha (aunque en ocasiones las
hermanas estn separadas) y estar unido slo por
unas cuantas fibras. Podra ser sta la estructura
encargada de mantener la forma de los cromosomas
durante la mitosis? Podra generarse por unin de
los componentes protenicos que suelen asegurar las
bases de las asas en la cromatina de interfase?
Las asas de DNA se unen a un
bastidor de protena
-
v
FIGURA 28.9 Los cromosomas sin histonas constan de un bas-
tidor protenico al que se anclan las asas de DNA. Reproducida
de Ce//, vol. 12, Paulson, J. R., y Laemmli, U.K., The structure
ofhistone , pp. 817-828. Copyright 1977, con autorizacin
de Elsevier. Imagen cortesa de ULrich K. Laemmli, University
of Geneva, Switzerland.
Secuencias especficas unen el
DNA a una matriz de interfase
Conceptos principales
.
El DNA est unido a la matriz nuclear en secuencias
especficas llamadas MAR o SAR.
.
Las MAR son ricas'en A-T, pero no tienen una secuencia
de consenso especfica.
Se une el DNA al bastidor mediante secuencias es-
pecficas? Los sitios de DNA unidos a estructuras pro-
teinceas en ncleos de interfase se llaman MARS
(regiones de unin con la matriz), o bien SAR
(regiones de unin con el bastidor). Se desconoce
la naturaleza de la estructura celular en interfase a
la que se conectan. La cromatina a menudo parece
unida a una matriz y se ha sugerido mucho que esa
unin es necesaria para la transcripcin o replicacin.
Cuando los ncleos carecen de protenas, el DNA
se expulsa como asas desde una estructura protei-
ncea residual, pero los intentos por relacionar las
protenas que se encuentran en esa preparacin con
elementos estructurales de clulas ntegras no han
tenido xito.
Regiones especficas del DNA estn relaciona-
das con esa matriz?
28.6 Secuencias especficas unen el DNA a una matriz de interfase
737
El DNA se une a la matriz de protena
Se prepara el ncleo
Extraccin
1 de histonas
Escisin con
nucleasas de
restriccin
i
Extraccin y
anlisis de DNA
Fragmentacin de
todo el DNA con
desoxirribonucleasa
MAR
Matriz
i
Adicin
de DNA
MAR
Las regiones vinculadas con la matriz se pue-
den identificar por caracterizacin del DNA retenido por la
matriz aislada in vivo o por identificacin de ios fragmentos
que pueden unirse a la matriz de ia que se ha eliminado todo
el DNA.
Los abordajes in vivo e in vitro se resumen en la
FIGURA 28.10
. Ambos se inician por aislamiento de
la matriz como preparado nuclear crudo que con-
tiene protenas nucleares y cromatina, de modo que
entonces se pueden usar diferentes tratamientos
para caracterizar el DNA de la matriz o identificar
el que puede unirse a ella.
Para analizar el MAR existente, es posible des-
condensar las asas cromosmicas por extraccin de
las protenas, y al eliminar aqullas mediante un
tratamiento con nucleasas de restriccin, quedan
slo secuencias MAR in vivo (supuestas) unidas a
la matriz.
El abordaje complementario consiste en elimi-
nar todo el DNA de la matriz por tratamiento con
una desoxirribonucleasa, momento en que se puede
estudiar la capacidad de los fragmentos aislados del
DNA para unirse a la matriz in vitro.
Las mismas secuencias deberan vincularse con
la matriz in vivo o in vitro. Una vez que se ha iden-
tificado un MAR potencial, se puede determinar el
tamao de la regin mnima necesaria para el vin-
culo in vitro mediante deleciones, lo cual permitir
identificar protenas que se unen a las secuencias
MAR.
Una caracterstica sorprendente es la falta de
conservacin de secuencia en fragmentos MAR:
suelen ser -70% ricas en A-T, pero carecen de se-
cuencias de consenso desde otros puntos de vis-
ta. Sin embargo, otras secuencias interesantes se
encuentran a menudo en la cadena de DNA que
contiene la MAR. Los sitios de accin en configu-
racin cis que regulan la transcripcin son frecuen-
tes, y suele haber un sitio de reconocimiento de 9
topoisomerasa II en MAR. Por ello es posible que
esta ltima desempee ms de una funcin, pues
proporciona un sitio de unin con la matriz y con-
tiene otro donde se efectan cambios topolgicos
del DNA.
Cul es la relacin entre el bastidor de cromo-
somas de las clulas en divisin y la matriz de las c-
lulas de interfase? Las mismas secuencias de DNA
estn unidas a ambas estructuras? En varios casos.
los mismos fragmentos de DNA que se encuentran
en la matriz nuclear in vivo pueden recuperarse de!
bastidor en metafase, y los fragmentos que contie-
nen secuencias MAR pueden unirse a un bastido:
en metafase, de manera que parece probable que
el DNA contenga un solo tipo de sitio de unin. En
clulas de interfase, el sitio de unin se conecta con
la matriz nuclear, en tanto que en clulas mitticas
hace lo propio con el bastidor del cromosoma.
La matriz nuclear y el bastidor cromosmlcc
constan de diferentes protenas, si bien hay algunos
componentes comunes. La topoisomerasa II es un.
destacado componente del bastidor cromosmico y
constituyente de la matriz nuclear, lo cual sugiera
que el control de la topologa es importante en am-
bos casos.
La cromatina se divide en
eucromatina y heterocroitiatlna
Conceptos principales
Los cromosomas individuales se observan slo durante
la mitosis.
En la interfase, la masa general de la cromatina est en
forma de eucromatina, con empaquetamiento menos
compacto que los cromosomas en mitosis.
Las regiones de heterocromatinas se mantienen
densamente empaquetadas durante la interfase.
Cada cromosoma tiene un solo DNA dicatenark'
muy largo, lo cual explica porqu la replicacin cto-
mosmica es semiconservadora, como la molcula
de DNA individual. (Esto no necesariamente sera
el caso si un cromosoma porta muchas molcula?
independientes de DNA.) El DNA dicatenario nicc
se pliega en una fibra que recorre continuamente e:
738 CAPITULO 28 Cromosomas
Mm
- Centrmero-**-
FIGURA 28.11 Las cromtides hermanas de un par mittico
constan cada una de una fibra (-30 nm de dimetro plegada
compactamente dentro del cromosoma). Imagen cortesa de
Daniel L. Hartl, Harvard University.
cromosoma, de modo que en lo que se refiere a la croma-
tina de interfase y la estructura del cromosoma mittico, se
tiene que explicar el empaquetado de una sola molcula de
DNA extremadamente larga en una forma en que pueda
transcribirse y replicarse, as como adoptar cclicamente la
forma ms y menos comprimida.
Los cromosomas eucariticos individuales en-
tran a escena brevemente durante el acto de la divi-
sin celular, slo entonces pueden verse como uni-
dades compactas. La FIG es una micrografa
electrnica de un par de cromtides hermanas cap-
tadas en metafase. (Las cromtides hermanas son
cromosomas producidos por el suceso de replicacin
previo, an unidos en esa etapa de la mitosis.) Cada
una consta de una fibra de -30 nm de dimetro y
tiene aspecto nudoso. El DNA est de cinco a diez
veces ms condensado en los cromosomas que en
la cromatina de interfase.
Sin embargo, durante la mayor parte del ciclo
vital de la clula eucaritica, su material gentico
ocupa una zona del ncleo donde no se pueden dis-
tinguir cromosomas individuales. La estructura de la
cromatina de interfase no cambia visiblemente entre
divisiones, no hay una rotura evidente durante el
periodo de replicacin, cuando la cantidad se duplica.
La cromatina es brilar, si bien es difcil discernir en
detalle su configuracin general en el espacio, pero
es similar, o idntica, a la de los cromosomas mit-
ticos.
Como puede observarse en el corte nuclear de
la Fl 28.12, la cromatina se divide en dos tipos
de material:
La heterocromatina forma cmulos localizados
nlsMagiiaffimiigi
i
msSm>
2 Un corte delgado a travs de un ncleo teido
con el colorante de Feulgen muestra la heterocromatina como
regiones compactas agrupadas cerca del nuclolo y la membra-
na nuclear. Imagen cortesa de Edmund Puvion, Centre National
de la Recherche Scientifique,
.
En casi todas las regiones, las fibras estn
menos densamente empacadas que en los
cromosomas mitticos, material denomina-
do eucromatina, que parece relativamente
disperso en el ncleo y que ocupa la mayor
parte de ste en la Figura 28.12.
.
Algunas regiones de la cromatina estn
muy densamente empaquetadas con fibras,
lo cual les confiere un estado comparable al
de los cromosomas durante la mitosis, ma-
terial denominado heterocromatina, que
por lo general est en los centrmeros, pero
tambin en otras localizaciones. Experimen-
ta el ciclo celular con relativamente pocos
cambios en cuando a condensacin. En la Fi-
gura 28.12 forma una serie de cmulos bien
definidos, pero a menudo las diversas regio-
nes de heterocromatina se acumulan en un
cromocertro, densamente teido. (Esta
descripcin se aplica a regiones que siem-
pre son heterocromticas y constituyen la
denominada heterocromatina constitutiva;
adems, hay otro tipo de heterocromatina,
la heterocromatina facultativa, en la cual
,
algunas regiones de la eucromatina se con-
vierten a un estado heterocromtico.)
Las mismas fibras transcurren de manera con-
tinua entre eucromatina y heterocromatina,
lo cual
implica que esos estados representan diferentes gra-
dos de condensacin del material gentico; de la
misma forma, las regiones eucromticas se encuen-
tran en diferentes estados de condensacin durante
la interfase y la mitosis. As, el material gentico se
organiza de modo que permita mantener estados
alternativos en la cromatina y cambios cclicos en el
empaquetado de la eucromatina entre la interfase y
la divisin. En el Captulo 30, Control de la estruc-
tura de la cromatina, se describe la base molecular
de esos estados.
28.7 La cromatina se divide en eucromatina y heterocromatina
739
La condicin estructural del material gentico
se correlaciona con su actividad. Las caractersticas
comunes de la heterocromatina constitutiva son:
.
Est permanentemente condensada.
.
A menudo consta de mltiples repeticiones
de unas cuantas secuencias de DNA que no
se transcriben.
.
La densidad de los genes en esa regin ha
disminuido mucho respecto de la eucroma-
tina, y los genes se traslocan a ella o cerca
de ella, a menudo desactivados.
.
Se replica tardamente en la fase S y su re-
combinacin gentica es menos frecuente,
lo cual tal vez resulte de su estado conden-
sado.
Hay algunos marcadores moleculares de los cam-
bios de propiedades del DNA y sus componentes pro-
tenicos (vase la seccin 31.3, La heterocromatina
depende de interacciones con histonas), entre otros,
acetilacin reducida de protenas histonas, aumento
de la metilacin de una protena histona e hiperme-
tilacin de bases citidna en el DNA, cambios mole-
culares que dan lugar a la condensacin del material,
de lo que depende su inactividad.
Aunque los genes activos estn contenidos en
la eucromatina, slo una pequea parte de sus se-
cuencias se transcribe en cualquier momento, de
modo que la localizacin en la eucromatina es nece-
saria para la expresin gentica, pero insuficiente.
gffl Los cromosomas tienen
patrones de banda
Conceptos principales
.
Ciertas tcnicas de tincin hacen que los cromosomas
parezcan una serie de estras llamadas bandas G.
.
Las bandas tienen un menor contenido de G-C que los
espacios intermedios (interbandas),
.
Los genes se concentran en las interbandas, ricas en G-C.
Como resultado del estado difuso de la cromatina,
no se puede determinar directamente la especifi-
cidad de su organizacin, pero s investigar si la
estructura del cromosoma (mittica) es ordenada.
Siempre yacen secuencias particulares en sitios
particulares o el plegamiento de la fibra de la es-
tructura global es algo ms aleatorio?
En el mbito del cromosoma, cada miembro
del conjunto tiene una ultraestructura diferente y
reproducible. Cuando son sometidos a ciertos trata-
mientos y despus se tien con el colorante qumico
Giemsa, los cromosomas generan una serie de ban-
das G. En la se presenta un ejemplo de
los cromosomas humanos.
Hasta que no se perfeccion esta tcnica, los
cromosomas slo se distinguan por sus dimensio-
nes generales y la localizacin relativa de su centr-
mero, pero las bandas G permiten identificar a cada
cromosoma por su patrn de bandas caracterstico.
que permite identificar la translocacin de un cro-
mosoma a otro por comparacin con el conjunte
diploide original. En la FIGURA 28.14 se muestra un
esquema de las bandas del cromosoma X humano:
estas bandas son estructuras grandes, cada una de
~
107bp de DNA, posiblemente con muchos cientos
de genes.
La tcnica de bandas es de una utilidad prc-
tica enorme, pero el mecanismo sigue siendo xm
misterio. Todos lo que se sabe es que el colorante
tie los cromosomas no tratados de manera ms I
menos uniforme. Por tanto, la generacin de bandas
depende de una diversidad de tratamientos que mo-
difica la respuesta del cromosoma (supuestamente
por extraccin del componente que se une al co-
lorante desde las regiones sin bandas). Se pueder.
generar bandas similares mediante tratamientos
variados.
La nica caracterstica conocida que distingue
a las bandas de las interbandas es que las primeras
tienen un menor contenido de G-C, que es un re-
sultado peculiar. Si hay -10 bandas en un cromo-
soma grande, con un contenido total de -100 Mr
el cromosoma se divide en regiones de -5 Mb (9
longitud que alternan con las del contenido baje
(bandas) y elevado (interbandas) de G-C. Los genes
(identificados por hibridacin con RNAm) tienen la
tendencia a localizarse en las regiones interbandas
Todo cromosoma tiene un patrn distintivo de bandas G
12 3
*
4 5
ilii-rsifit
6 7 8 9
D
-
i'i-Vi-'l~ E
10 11
-
11 7 f
16 17 18
X Y
8.13 Las bandas G generan una serie lateral caraets-
rstica de bandas en cada miembro del conjunto cromosmic:
Imagen cortesa de Lisa Shaffer, Washington State Universv.-
Spokane.
CAPTULO 28 Cromosomas
El cromosoma X tiene muchas bandas G
Banda
022.3
p22.2
p22.1
El DNA de mamfero tiene -40% de G-C
I
I
p21
p11.4
pll.3
p11.2
Centrmero
q12
q13
q21
q22
q23
q24
q25
q26
q27
q28
FIGURA 28.14 El cromosoma X humano puede dividirse en
regiones distintas segn su patrn de bandas. EL brazo corto es
p, y el largo, q; cada brazo se divide en regiones ms pequeas,
subdivididas. En este mapa se observa una estructura de baja
resolucin; a mayor resolucin, algunas bandas se subdividen
adicionalmente en bandas ms pequeas e interbandas (p. ej.,
p21 se divide en p21.1, p21.2 y p21.3).
fenmeno que respalda a una organizacin depen-
diente de secuencias largas.
La secuencia del genoma humano confirma la
observacin bsica. En la FIGURA 28.15 se muestran
claras uctuaciones del contenido de G-C cuando
el genoma se divide en ramas pequeas (segmentos
o tramos de DNA). El promedio de 41% de G-C es
comn en los genomas de mamferos, pero hay re-
giones con apenas 30% o hasta con 65%. Cuando se
revisan tramos ms largos, hay menos variaciones.
La longitud promedio de las regiones que contienen
>43% de G-C es de 200 a 250 kb, lo cual aclara que
la estructura de bandas o interbandas no representa
segmentos homogneos que alternen en cuanto a
contenido de G-C, si bien las bandas contienen una
mayor cantidad de segmentos con contenido bajo
de G-C. Los genes se concentran en regiones con
un contenido ms alto de G-C. Todava se descono-
ce cmo afecta el contenido de G-C a la estructura
cromosmica.
gffl Los cromosomas en escobiLLn
se extienden
Concepto principal
.
Los sitios de expresin gnica de los cromosomas en
escobilln muestran asas que se extienden a partir de
su eje.
30 40 50 60%
Contenido de G-C
FIGURA 28.15 En distancias cortas hay grandes fluctuaciones
en cuanto a contenido de G-C. Cada barra muestra el porcen-
taje de fragmentos de 20 kb con el contenido determinado
de G-C.
Sera extremadamente til localizar la expresin g-
nica en su estado natural para observar qu cambios
estructurales se relacionan con la transcripcin. La
compresin del DNA en la cromatina, aunada a la
dificultad de identificar genes particulares en su in-
terior, hace imposible visualizar la transcripcin de
los genes activos individuales.
La expresin gnica se observa directamente
en ciertas circunstancias desusadas, en las cuales,
los cromosomas se encuentran muy extendidos, de
modo que se facilita distinguir loci individuales (o
grupos). La diferenciacin lateral de la estructura
es evidente en muchos cromosomas cuando apenas
llegan para la meiosis, etapa en la que simulan una
serie de cuentas ensartadas en un hilo; las cuentas
son grnulos intensamente teidos que apropia-
damente se nombran crommeros. Sin embargo,
en general hay poca expresin gnica durante la
meiosis, y no es prctico utilizar ese material para
identificar las actividades de cada uno de los genes.
Una circunstancia excepcional que permite estudiar
el material es la constituida por los cromosomas
en escobilln, mejor caracterizados en ciertos an-
fibios,
Los cromosomas en escobilln se forman du-
rante una meiosis inusualmente larga que puede
durar incluso varios meses! Durante ese periodo,
los cromosomas se mantienen en una forma no dis-
tendida, visible con el microscopio de luz; en un
momento posterior de la meiosis, recuperarn su
tamao compacto normal.
As, el estado de extensin brinda esencialmen-
te una versin no plegada del estado normal del
cromosoma.
Los cromosomas en escobilln son bivalentes
meiticos, cada uno constituido por dos pares de
cromtides hermanas. En la FIGURA 28.16 se muestra
un ejemplo en que dichos pares casi se han separa-
28.9 Los cromosomas en escobilln se extienden 741
Las asas protruyen del eje del cromosoma
100 Lim
8.16 Un cromosoma en escobilln es un divalente
meitico en el que dos pares de cromtides hermanas se man-
tienen juntas en el quiasma (indicado con flechas). Imagen
cortesa de Joseph G. Gall, Carnegie Institution.
que sugiere que representan material cromosroc
expulsado de esa organizacin ms compacta c%
crommero.
Las asas estn rodeadas por una matriz de I *
bonucleoprotenas que contienen cadenas recic
formadas de RNA, y a menudo es posible defin.
-
:
una unidad de transcripcin por el aumento en .;
longitud de la RNP que se mueve en torno al a-:
vase el ejemplo de la nGURA 28.17.
Por tanto, el asa es un segmento expulsado
DNA en proceso de transcripcin activa. En cien
casos se han identificado las asas que corresponder.
a genes en particular; la estructura del gen transen":
y la naturaleza de su producto pueden analizarv-;
in situ.
Los cromosomas poLitm'cos
forman bandas
Concepto principal
Los cromosomas politnicos de los dpteros tienen
una serie de bandas que se pueden usar como mapa
citolgico.
Un asa del cromosoma en escobilln es rodeada
por una matriz de ribonucleoprotena. Reproducida de Gall, J G.
et al. Mol. Biol. Ce//. Diciembre 1999, 10:4385-4402. Imagen
cortesa de Joseph G. Gall, Carnegie Institution.
do, de manera que se mantienen juntos slo por los
quiasmas. Cada par de cromtides hermanas forma
una serie de crommeros elipsoidales, de -1 a 2 iim
de dimetro, conectados por una cadena muy fina
que contiene dos cadenas hermanas dobles de DNA
y transcurre en forma continua por el cromosoma,
a travs de los crommeros.
La longitud de los cromosomas en escobilln en
la lagartija acutica Notophthalmus viridescens va de
400 a 800 pm, frente a la variacin de 15 a 20 pm
que se observa ms tarde en la meiosis, de modo
que su empaquetamiento es -30 veces menos es-
trecho. La longitud total del conjunto total de cro-
mosoma en escobilln es de 5 a 6 mm y se organiza
en -5 000 crommeros.
Los cromosomas en escobilln toman su nom-
bre de las asas laterales que abandonan los crom-
meros en ciertas posiciones (simulan un escobilln,
que es un objeto extinto). Las asas se extienden
por pares, una a partir de cada cromtide hermana.
Las asas forman un continuo con la cadena axil, lo
Los cromosomas de los ncleos de interfase de algu -
nos tejidos de la larva de mosca dptera son muchc
mayores respecto de su estado normal, tanto en di-
metro como en longitud. En la FIGURA 28.18 se mues-
tra un ejemplo de un conjunto cromosmico de :
glndula salival de D. melanogaster, cuyos miembros
se denominan cromosomas politnicos.
Cada miembro del conjunto politnico constad-
una serie visible de bandas (ms apropiadamerue
llamadas crommeros, aunque es un trmino po
usado) que van de -0.5 pm de ancho la ms grantc
a -0.05 pm la ms pequea (sta es distinguible
slo por microscopa electrnica) y que contiener
la mayor parte de la masa del DNA; se tien inten-
samente con los reactivos apropiados. Las regioncs
intermedias son menos susceptibles a la tincin y k
denominan interbandas. El conjunto de D. mela-
nogaster tiene -5 000 bandas.
Los centrmeros de los cuatro cromosomas de
D
. melanogaster se suman para formar un cromocer-
tro constituido sobre todo por heterocromatina (er
el macho incluye el cromosoma Y completo). A es;
respecto, -75% del conjunto de DNA haploide se
organiza en bandas e interbandas alternadas, cot
una longitud de -2 000 pm. Extendido, el DNA lle-
gara a los -40 000 pm, de manera que la razn fc
empaquetado sera de -20, con lo que se demues-
tra vividamente la extensin del material gentic
respecto de los estados normales de la cromatina de
interfase o cromosomas mitticos.
742 CAPTULO 28 Cromosomas
Los cromosomas politnicos tienen
has bandas
mmmm
FIGURA 28.18 Los cromosomas politnicos de D. melanogaster
forman una serie alternante de bandas e interbandas. Imagen
cortesa de Jos Bonner, Indiana University.
Qu estructura tienen esos cromosomas gigan-
tes? Cada uno es producido por replicaciones suce-
sivas de un par diploide en sinapsis, pero las rplicas
no se separan, se mantienen unidas en estado exten-
dido. Al inicio del proceso, el contenido de DNA de
cada par de sinapsis es de 2C (donde C representa el
contenido de DNA del cromosoma individual), que
entonces se duplica hasta nueve veces, para llegar a
un mximo de 1024C. El nmero de duplicaciones
es diferente en los diversos tejidos de las larvas de
D
. melanogaster.
Cada cromosoma se ve como un gran nmero
de fibras paralelas longitudinales, muy condensadas
en las bandas y menos en las interbandas. Es posible
que cada bra represente un solo cromosoma ha-
ploide (C), lo cual da lugar al nombre de politni-
co, el grado de politenia corresponde al nmero de
cromosomas haploides contenidos en el cromosoma
gigante.
El patrn de bandas es caracterstico de cada
cepa de especies de Drosophila. El nmero constante
y la disposicin lineal de las bandas se observ por
primera vez en el decenio de 1930, cuando se detec-
t que forman un mapa citolgico de los cromosomas.
Las reestructuraciones, como deleciones, inversio-
nes y duplicaciones, resultan en modificaciones en
el orden de las bandas.
El arreglo lineal de las bandas es equiparable
al correspondiente de los genes, de modo que las
reestructuraciones genticas, segn se observa en
un mapa de enlace, pueden correlacionarse con las
estructurales de los mapas citolgicos. En ltima
instancia
, se puede localizar una mutacin deter-
minada en una banda en particular. El nmero total
de genes de D. melanogaster supera al nmero de
oandas, de manera que probablemente hay genes
mltiples en casi todas las bandas.
La posicin de genes especficos en el mapa
citolgico suele determinarse directamente por la
Las bandas se identifican mediante hibridacin m s/tu
Clulas diana
Congelacin en hielo seco aplastadas
Lavado con etanol en la laminilla
Inmersin en solucin de agar
Desnaturalizacin del DNA
Adicin de sonda radioactiva
Lavado de la sonda sin reaccin
Autorradiografa
i
Clula diana
Las zonas negras corresponden
a granos de plata e identifican
los sitios en que hubo hibridacin
de la sonda
5 Mediante hibridacin in situ es posible identifi-
car bandas individuales que contienen genes particulares.
tcnica de hibridacin in situ, cuyo protocolo se re-
sume en la FIGURA 19, Una sonda radioactiva que
representa a un gen (con mucha frecuencia un clon
de DNAc marcado, derivado del RNAm) da lugar a
la hibridacin con el DNA desnaturalizado de los
cromosomas politnicos in situ. Mediante autorra-
diografa se identifican las posiciones de los genes
correspondientes por la superposicin de granos en
una o varias bandas especficas; vanse los ejem-
plos de la jURA 28.20. Recientemente las sondas
fluorescentes han sustituido a las radioactivas, que
facilitan la determinacin directa de la banda en la
que yace una secuencia en particular.
2 Los cromosomas politnicos
se expanden en sitios
de expresin gnica
Concepto principal
.
Las bandas son sitios de expresin gnica en
cromosomas politnicos que se expanden para dar lugar
a
"
abultamientos
"
.
Una de las caractersticas intrigantes de los cromo-
somas politnicos es que los sitios reactivos son vi-
sibles. Algunas de las bandas pasan transitoriamente
por un estado de expansin en el cual simulan un
abultamiento en el cromosoma, cuando material
28.11 Los cromosomas politnicos se expanden en sitios de expresin gnica 743
Una banda se identifica por hibridacin in situ
I
Vista amplificada de las bandas 87A y 87C en
que se observa La hibridacin in situ con DNA marcado, extrado
de clulas con choque trmico. Imagen cortesa de Jos Bon-
ner, Indiana University.
cromosmico es expulsado desde el eje. En la FIGU-
RA 28.21 se observan abultamientos muy grandes
(llamados anillos de Balbiani).
Cul es la naturaleza del abultamiento? Consta
de una regin en que las fibras cromosmicas se des-
enrollan respecto de su estado usual de empaqueta-
miento en las bandas, aunque mantienen su conti-
nuidad con el eje cromosmico. Los abultamientos
suelen emanar de bandas nicas, si bien, cuando son
muy grandes, como los anillos de Balbiani, el au-
mento de volumen puede ser de tal magnitud, que
oculta la disposicin de las bandas subyacentes.
El patrn de abultamientos se relaciona con la
expresin gnica. Durante el desarrollo de las larvas,
los abultamientos aparecen y remiten con un patrn
definido, especfico de tejido, de manera que, en un
momento dado, se observa un patrn caracterstico
en cada tejido. Los abultamientos son inducidos por
la hormona ecdisoma, que controla el desarrollo en
el gnero Drosophila e induce algunos directamente,
mientras que otros, son inducidos de manera indi-
recta por los productos de los primeros.
Los abultamientos son sitios en que se est sinteti-
zando RNA. El concepto aceptado ha sido que la ex-
pansin de la banda es consecuencia de la necesidad
de relajacin de la estructura para sintetizar RNA.
Por tanto, es posible considerar a los abulta-
mientos como consecuencia de la transcripcin, un
gen activo nico puede generar un abultamiento,
Un abultamiento expulsa material de una banda
Sitio del abultamiento
m
Bandas
.
cromosmicas
FIGURA 28.21 El cromosoma IV del insecto C. tmtans tiene
tres anillos Balbiani en la glndula salival. Reproducido de Ce..
vol. 4, Daneholt, B., et al., Transcription in polytene chromos:-
mes..., pp. 1-9. Copyright 1975, con autorizacin de ElseviV
Imagen cortesa de Bertil Daneholt, Medical Nobel Institute.
Los sitios de abultamiento difieren de las banda;
normales en la acumulacin de protenas adicic-
nales, por ejemplo, la polimerasa II de RNA y otra-
vinculadas con la transcripcin.
Las caractersticas de los cromosomas en escobi-
lln y politnicos sugieren una conclusin genera!
Para ser transcrito, el material gentico se dispersa
respecto de su estado usual de empaquetado dnse-
la duda es si esa dispersin en el mbito macroscr -
pico del cromosoma emula los sucesos que ocurrer.
en el mbito molecular de la masa de eucromatin
de interfase ordinaria.
Las bandas de un cromosoma politnico tienen
un significado funcional? Es decir, corresponde a
cada banda a un tipo de unidad gentica? Se podr;
pensar que la respuesta es inmediatamente evidente
a partir de la secuencia del genoma de la mosca.
porque mediante el mapeo de interbandas con la
secuencia sera posible determinar si en alguna a
tipo de identidad es fijo, pero hasta ahora no se h;
encontrado un patrn que apunte a un significad'
funcional de las bandas.
gjg EL cromosoma eucaritico es
un dispositivo de segregacin
Conceptos principales
.
Un cromosoma de eucariota se mantiene en el huso
mittico por unin de microtbulos al cinetcoro, que
se forma en su regin centromrica.
.
Los centrmeros a menudo tienen heterocromatina rica
en secuencias de DNA satlite.
744 CAPTULO 28 Cromosomas
Los microtubulos separan los centrmeros en la mitosis
Metafase Anafase Telofase
-Cohesinas
Microtubulos
"
Centrmero
FIGURA 28.22 Los cromosomas sufren traccin hacia Los poLos a travs de microtbuLos que
se unen a los centrmeros. Las cromtides hermanas se mantienen juntas hasta La anafase,
mediante protenas (cohesinas). EL centrmero se muestra aqu a la mitad del cromosoma
(metacntrico), pero puede localizarse en cualquier sitio, a todo lo largo, incluso cerca del
extremo (acrocntrico) y en el extremo (telocntrico).
Durante la mitosis, las cromtides hermanas se diri-
gen a polos opuestos de la clula, movimiento que
depende de la unin de los cromosomas a los micro-
tubulos, conectados a los polos en el otro extremo.
(Los microtbulos constituyen un sistema filamen-
toso celular que se reorganiza durante la mitosis,
de manera que conecte los cromosomas con los
polos de la clula.) Los sitios de las dos regiones en
que se organizan los extremos de los microtbulos,
cerca de los centriolos, en polos y cromosomas, se
llaman MTOC (centros de organizacin de micro-
tbulos).
En la FIGURA 28.22 se ilustra la separacin de las
cromtides hermanas conforme avanza la mitosis de
metafase a telofase. La regin del cromosoma en-
cargada de su segregacin en la mitosis y la meiosis
se llama centrmero. La regin centromrica de
cada cromtide hermana est sujeta a traccin por
los microtbulos hacia el polo opuesto, y para opo-
nerse a esa fuerza motriz, las protenas
"
goma
"
,
lla-
madas cohesinas, mantienen juntas alas cromtides
hermanas. Inicialmente, las cromtides hermanas
se separan en sus centrmeros y despus se suel-
tan completamente una de otra durante la anafase,
cuando las cohesinas se fragmentan. El centrme-
ro es sometido a traccin hacia el polo durante la
mitosis y el cromosoma adherido a l es "arrastra-
do", de modo que ste constituye el dispositivo de
unin de gran nmero de genes con el aparato para
la divisin. Dicho aparato contiene el sitio en que
las cromtides hermanas se mantienen juntas antes
de la separacin de cromosomas individuales, que
en la fotografa de la Figura 28.11 se muestra como
una regin comprimida que conecta los cuatro bra-
zos del cromosoma; las cromtides hermanas se en-
cuentran en la etapa de metafase de la mitosis.
El centrmero es indispensable para la segre-
gacin, segn se observa por el comportamiento de
los cromosomas que se han roto. Una sola rotura
genera un sitio que retiene el centrmero y un frag-
mento acntrico, que carece de l. Este ltimo
no se une con el huso mittico y,
como resultado,
no puede incluirse en ninguno de los ncleos de
clulas hijas.
(Cuando el movimiento cromosmico depen-
de de centrmeros bien definidos, slo puede haber
un centrmero por cromosoma, pero si las trans-
locaciones generan cromosomas con ms de un
centrmero, en la mitosis se forman estructuras
aberrantes debido a que los dos centrmeros de la
misma cromtide hermana han sido arrastrados ha-
cia diferentes polos, rompiendo as el cromosoma.
No obstante, en algunas especies los centrmeros
son
"
difusos", y la situacin, diferente. En el mbito
molecular slo se han analizado centrmeros bien
definidos.)
Las regiones que flanquean al centrmero sue-
len ser ricas en secuencias DNA satlite y presentan
una cantidad considerable de heterocromatina, pero
todo el cromosoma est condensado
, de manera que
la heterocromatina centromrica no es de inmediato
evidente en los cromosomas mitticos
, pero puede
observarse mediante una tcnica que genera ban-
das C. En el ejemplo de la FIGURA 28.23,
todos los
centrmeros se muestran como regiones de tincin
intensa. Aunque esto es comn,
la heterocromatina
no es identificable en torno a todos los centrmeros
conocidos, lo cual sugiere que probablemente es in-
dispensable para el mecanismo de divisin.
La regin del cromosoma en que se forma el
centrmero se define por secuencias de DNA (si
bien se han definido en muy pocos casos). El DNA
centromrico se une a protenas especficas encar-
gadas de establecer la estructura que une el cro-
mosoma con los microtbulos, estructura llamada
cinetcoro, que es un objeto fibroso de tincin
intensa con dimetro o longitud de -400 nm. El
cinetcoro proporciona el MTOC de un cromosoma.
28.12 El cromosoma eucaritico es un dispositivo de segregacin
745
Las bandas C identifican a los cent
a
-
'
M-
. '
12 3 i 5
C.
.
.
.
_
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15
19 20 21 22
16 17 18
x y
Las bandas C generan una tincin intensa en
los centrmeros de todos los cromosomas. Imagen cortesa de
Lisa Shaffer, Washington State University-Spokane.
DNA centromrico Microtbulo
. Protnas de unin
con el microtbulo
Protenas de unin
con el centrmero
El centrmero se identifica por una secuencia
de DNA que se une a protenas especficas. Dichas protenas no
se unen a los microtbulos, sino que establecen el sitio en que
las protenas de unin de microtbulos, a su vez, se unen.
La FIGURA muestra la jerarqua de organizacin
que conecta el DNA centromrico con los microt-
bulos. Las protenas unidas al DNA centromrico
se adhieren a otras que, a su vez, se unen con los
microtbulos (vase la seccin 28.15, El centrmero
se une a un complejo protenico).
Los centrmeros pueden
contener DNA repetitivo
Conceptos principales
Los centrmeros de los cromosomas de eucariotas
superiores contienen grandes cantidades de DNA
repetitivo.
Se desconoce la funcin del DNA repetitivo.
Para que el centrmero funcione, el DNA debe i
bastante largo. (Los elementos cortos bien definid
de Saccharomyces cerevisiae pueden ser una excep
cin a la regla general.) Los casos en que es posi
ble comparar secuencias especficas del DNA a
la regin centromrica, suelen incluir secuenci.
repetitivas.
Hasta ahora, S. cerevisiae es el nico caso en qu;
el DNA centromrico puede identificarse por su CE
pacidad de conferir estabilidad en plsmidos. S:
embargo, con la levadura Schizosaccharomyces pom
'
v
de slo tres cromosomas, se ha utilizado un enfoqu
relacionado, y la regin en que se encuentra a
centrmero se identific por delecin de la mayo
parte de la secuencia de cada cromosoma para ere
un minicromosoma estable. Mediante ese aborda :
se localiza a los centrmeros en regiones de 40 a 1:
kb, que consisten en DNA parcial o completamen'
repetitivo. No se sabe bien a bien qu tanto de ca i
una de esas regiones ms bien largas se necesi"
para la segregacin de cromosomas en la mitosis
la meiosis.
Los intentos para localizar funciones centrme
ricas en cromosomas del gnero Drosophila sugiere
que se dispersan en una gran regin constituida p
200 a 600 kb. El gran tamao de ese tipo de cB
trmero sugiere que es posible que contenga
ras funciones especializadas, incluidas secuenci:
necesarias para el ensamblaje del cinetcoro v
apareamiento de cromtides hermanas.
En el gnero Arahidopsis, el tamao del ce:
trmero es comparable; cada uno de los cinco cr
mosomas tiene una regin centromrica en la c:
prcticamente se ha suprimido la recombinad<
'
-
que ocupa >500 kb. Obviamente incluye al cent:
mero, pero no se cuenta con informacin direc
respecto de cunto se necesita de l. En esas regk
nes hay genes expresados, lo cual hace dudar re
pecto de si toda la regin es parte del centrmep
En el centro de la misma se encuentra una serie :
180 bp repetidos, el tipo de estructura que suele re
lacionarse con los centrmeros. Es muy pronto pai
decir cmo se relacionan dichas estructuras cor.
funcin del centrmero.
En los primates, el segmento primario que ::
cluye la heterocromatina de los centrmeros es
DNA a satlite, que consta de arreglos seriados d
unidades de repeticin de 170 bp. Hay variar.:-
significativas entre las repeticiones, si bien las :
cualquier centrmero tienden a relacionarse me;
entre s que con miembros de la familia de otr
localizaciones. No hay duda de que las secuenci..
necesarias para la funcin del centrmero reside
en bloques de DNA satlite a, pero no se sabe
esas mismas secuencias satlite a llevan a cabe
funcin o llevan incrustadas otras secuencias.
746 CAPTULO 28 Cromosomas
El centrmero de S. cerevisiae tienen secuencias cortas conservadas y una cadena A-T larga
TCACATGATGATATTTGATTTTATTATAI I I I IAAAAAAAGTAAAAAATAAAAAGTAGTTTAI I I I IAAAAAATAAAATTTAAAATATTTCACAAAATGATTTCCGAA
AGTGTACTACTATAAAGTAAAATAATATAAAAAI I I I I I! CAI I I I i IAI I I I I CATCAAATAAAAA I I I I I IATTTTAAATTTTATAAAGTGTTTTAGTAAAGGCTT
CDE-I CDE-II 80-90 bp, >90% A + T CDE-lll
FIGURA 28.25 Por las homologas de secuencia entre elementos CEN de levaduras es posible identificar tres
regiones conservadas.
Las secuencias de DNA
de Los centrmeros
de S. cerevisiae son cortas
Conceptos principales
.
En S. cerevisiae, los elementos CEN se identifican por la
capacidad de permitir que un plsmido se segregue de
manera precisa en la mitosis.
. Los elementos CEN consisten en las secuencias cortas
conservadas CDE-I y CDE-III, las cuales flanquean una
regin CDE-III rica en A-T.
Si una secuencia centromrica del DNA se encarga
de la segregacin, cualquier molcula que porte esa
secuencia debera trasladarse apropiadamente en la
divisin celular, en tanto que cualquiera que care-
ciera de ella, debera fracasar en la segregacin. Este
pronstico se ha usado para aislar el DNA centro-
mrico en la levadura S. cerevisiae. Los cromosomas
de las levaduras no muestran cinetcoros visibles
comparables con los de eucariotas superiores, pero
de todas formas se dividen en la mitosis y se segre-
gan en la meiosis por los mismos mecanismos.
La ingeniera gentica ha permitido producir
plsmidos de levaduras que se replican como las
secuencias cromosmicas (vase la seccin 15.8,
Los orgenes de la replicacin pueden aislarse en
las levaduras), pero son inestables en la mitosis y la
meiosis y desaparecen de gran parte de las clulas
porque se segregan de manera errtica. Los frag-
mentos de DNA cromosmico que contienen cen-
trmeros se han aislado por su capacidad de conferir
estabilidad mittica a esos plsmidos.
Un fragmento de regiones de DNA centromrico
(CEN) se identifica como la secuencia mnima sus-
ceptible de conferir estabilidad a tal plsmido. Otra
forma de caracterizar la funcin de esas secuencias
es modificarlas in vitro y despus reintroducirlas en
la clula de la levadura, donde, en el cromosoma,
sustituyen al centrmero correspondiente, lo cual
permite que las secuencias necesarias para la fun-
cin del CEN se definan directamente en el contexto
del cromosoma.
Un fragmento del CNE derivado de un cromoso-
ma puede sustituir al centrmero de otro cromosoma
sin consecuencias aparentes, lo cual sugiere que los
centrmeros son intercambiables, se utilizan sencilla-
mente para unir el cromosoma al huso y no se relacionan
con la distincin entre un cromosoma y otro.
Las secuencias requeridas para la fundn cen-
tromrica entran en una banda de -120 bp; la re-
gin centromrica est empaquetada en una es-
tructura resistente a la nucleasa y se une a un solo
microtbulo, de modo que la regin centromrica
de S. cerevisiae se puede aprovechar para identificar
a las protenas que se unen al DNA del centrmero
y a las que conectan al cromosoma con el huso.
Como se resume en la FI 25, en la regin
CEN se pueden distinguir tres tipos de elementos
de secuencia:
.
El elemento dependiente del ciclo celular
(CED)-I es una secuencia de 9 bp que se
conserva con variaciones menores en el l-
mite izquierdo de todos los centrmeros.
.
El CDE-II corresponde a una secuencia
>90% rica en A-T, de 80 a 90 bp, que se
encuentra en todos los centrmeros, cuya
funcin podra depender de su longitud,
ms que de la exactitud de la secuencia. Su
constitucin recuerda algunos DNA repe-
tidos, cortos y seriados (satlites) (vase la
seccin 6.12, Los satlites de los artrpodos
tienen repeticiones idnticas muy cortas) en
los que la composicin de las bases podra
causar algunas distorsiones caractersticas
de la estructura doble helicoidal del DNA.
.
El CDE-EH es una secuencia de II bp muy
conservada en el lmite derecho de todos los
centrmeros. Las secuencias a uno y otro
lado del elemento estn menos conservadas,
y probablemente tambin sean necesarias
para la funcin del centrmero. (El CDE-III
podra tener ms de 11 bp si resulta que las
secuencias de los flancos son esenciales.)
Las mutaciones en CDE-I o CDE-II reducen,
pero no desactivan, la funcin del centrmero, a
diferencia de las mutaciones puntuales del CCG
central de CDE-III que desactivan por completo al
centrmero.
28.14 Las secuencias de DNA de los centrmeros de S. cerevisiae son cortas 747
EL centrmero se une
a un complejo protenico
Conceptos principales
En CDE-II se forma un complejo protenico
especializado alterno a la estructura usual de la
cromatina.
El complejo protenico CBF3 que se une a CDE-III es
indispensable para la funcin del centrmero.
Las protenas que conectan esos dos complejos podran
proporcionar la conexin para los microtbulos.
Es posible identificar las protenas necesarias para
la funcin de secuencias CNE? Hay varios genes en
que las mutaciones afectan la segregacin cromos-
mica y cuyas protenas se localizan en los centrme-
ros. La contribucin de dichas protenas a la estruc-
tura centromrica se resume en la FIGURA 28.26.
Una estructura especializada de cromatina se
sintetiza en la regin CDE-II por su unin con una
protena llamada Cse4 que simula una de las histo-
nas que constituyen las subunidades bsicas de la
cromatina (vase la seccin 31.3, La heterocroma-
tina depende de las interacciones con las histonas).
Una protena llamada Mif2 puede tambin ser parte
de ese complejo, o cuando menos, conectarse con
l. Las Cse4 y Mif2 tienen contrapartes localizadas
en centrmeros eucariticos superiores, CENP-A y
CENP-C, lo cual sugiere que esa interaccin puede
ser un aspecto universal de la estructura del cen-
trmero. La interaccin bsica consiste en el plega-
miento del DNA en la regin CDE-II en torno a un
agregado protenico; la reaccin probablemente se
facilita con la aparicin de un plegamiento intrn-
seco en la secuencia CDE-II.
El CDE-I se une por medio del homodmero
CBFI, interaccin no esencial para el funcionamien-
to del centrmero, pero si no ocurre, disminuye la
s se unen con los
CDE de levaduras
CDE-II Cse4
CDE-I CBF1 Microtbulos
Mcm21
Okp1
CBF3
CDE-III
FIGURA 28.26 El DNA en CDE-II se enrolla en torno a un
agregado protenico que incluye Cse4p. El CDE-III est unido
a CBF3, y el CDE-I, a CBFI. Esas protenas se conectan a travs
del grupo de Ctfl9, Mcm21 y Okpl.
fidelidad de la segregacin cromosmica ~10x. Lr
complejo de 240 kD de cuatro protenas llamad.;
CBF3 se une a CDEIIL interaccin, sta s, indispen
sable para la funcin del centrmero.
Las protenas unidas en CDE-I y CDE-III estn
conectadas entre s y tambin con la estructura pro
tenica enlazada en CDE-II por otro grupo de prote
as (Ctfl9, Mcm21, Okpl). La conexin con el m;
crotbulo suele ser Llevada a cabo por ese complejo
El modelo general sugiere que una estructur.
protenica que simula el bloque de estructura or
mal de la cromatina (nucleosoma) localiza al com
piejo que se encuentra en el centrmero. El pleg
miento del DNA en dicha estructura permite a L
protenas unirse con los elementos de los flanee
para formar parte de un solo complejo. Algunos de
los componentes de ste (tal vez no los que se unet
directamente con el DNA) vinculan el centrmer
con el microtbulo. La estructura de los cinetQV
ros probablemente siga un patrn similar y utilic;
compuestos relacionados en una amplia varieds,.
de organismos.
g ffi Los teLmeros tienen
secuencias de repeticin
simples
Conceptos principales
. Para la estabilidad del extremo cromosmico, se
requiere el telmero.
.
Un telmero consiste en una repeticin sencilla en la
que una cadena rica en C + A tiene la secuencia C A/
Otra caracterstica esencial de todos los cromosonaf
es el telmero, que
"
sella
"
su extremo. Se sabe qu*
debe ser una estructura especial porque los extr.e
mos cromosmicos generados por rotura son
"
pega
josos" y tienden a reaccionar con otros cromosoms'i
en tanto los extremos naturales son estables.
Para identificar una secuencia telomrica
pueden aplicar dos criterios:
.
Debe yacer en el extremo de un cromos;
ma (o cuando menos en el extremo de -uu
molcula de DNA lineal autntica).
.
Debe conferir estabilidad a una molcC
lineal.
El problema de encontrar un sistema que ofrez
ca un anlisis de la fundn ha llevado nuevamen:;
al mbito molecular utilizando levaduras. Todos h
plsmidos que sobreviven en las levaduras (porq
poseen elementos ARS y CEN) son molculas d
DNA circulares, los lineales son inestables (porq.u
se han degradado). Una secuencia telomrica m
748 CAPTULO 28 Cromosomas
tntica de DNA podra conferir estabilidad a un pls-
mido lineal? Es posible identificar los fragmentos de
DNA de levaduras que demostradamente se locali-
zan en los extremos cromosmicos mediante dicho
anlisis, adems de que una regin del extremo de
una molcula conocida de DNA lineal natural, el
DNAr extracromosmico del gnero Tetrahymena,
puede tornar estable un plsmido lineal de leva-
dura.
Las secuencias telomricas se han caracteriza-
do a partir de una amplia variedad de eucariotas
inferiores y superiores. El mismo tipo de secuencia
se encuentra en plantas y seres humanos, de modo
que la construccin del telmero parece seguir un
principio casi universal, consta de una larga serie
de secuencias repetidas, seriadas y cortas; depen-
diendo del organismo, pueden ser de 100 a 1 000
repeticiones.
Todas las secuencias telomricas se pueden ex-
presar con la frmula general CJA IT)m donde n>\ y
m
, de la 4. En la iGURA 28, se muestra un ejem-
plo genrico. Una propiedad inusual de la secuencia
telomrica es la extensin de la cadena rica en G-T,
para la cual, de 14 a 16 bases suelen constituir una
sola cadena. La cola G se genera, quiz, debido
a una fragmentacin limitada especfica de la cade-
na rica en C-A.
Algunos indicios respecto de la forma de actuar
de un telmero dependen de algunas ciertas propie-
dades inusuales de los extremos de las molculas de
.
DNA lineales. En una poblacin de tripanosomas,
vara la longitud de los extremos. Cuando se hace
seguimiento a una clula clon, el telmero crece
de siete a 10 bp (una a dos repeticiones) por ge-
neracin. Todava ms revelador es el destino de
los telmeros ciliados introducidos en las levaduras.
Despus de la replicacin en stas, se agregan repe-
ticiones telomricas de levaduras en los extremos de las
repeticiones de especies de Tetrahymena.
La adicin de repeticiones telomricas en el ex-
tremo del cromosoma en cada ciclo de replicacin
podra resolver el problema de la replicacin de las
molculas de DNA lineal descrito en la seccin 16.2,
Los extremos del DNA lineal son un problema para
la replicacin. La adicin de repeticiones por snte-
sis nueva contravendra la prdida de repeticiones
resultante de la falta de replicacin hasta el extremo
del cromosoma. La extensin y el acortamiento es-
taran en equilibrio dinmico.
Si los telmeros se prolongan (y acortan) conti-
nuamente, su secuencia exacta puede no ser de im-
portancia. Todo lo que se requiere es que el extremo
sea reconocido como un sustrato adecuado para la
adicin, lo cual explica cmo funciona el telmero
ciliado en las levaduras.
La fragmentacin de la cadena C-A genera la cola G
CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAA
GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT
1
CCCCAAGCCGAACCCCAA 5'
GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT3'
FIGURA Un telmero comn tiene una estructura de
repeticin simple en la que una cadena rica en G-T va ms
all de la cadena rica en C-A. La cola G es generada por una
fragmentacin limitada de la cadena rica en C-A.
Repeticiones del telmero
a partir de c
liyiiiMiiiaHi
AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
La estructura cristalina de una secuencia cor-
ta de repeticin del telmero humano forma tres cuartetos G
apilados; el superior contiene la primera G de cada unidad de
repeticin y se apila sobre cuartetos que contienen La segunda G
(G3, G9, G15,- G21) y la tercera G (G4, G10, G16, G22).
Los telmeros sellan Los
extremos de Los cromosomas
Concepto principal
La protena TRF2 cataliza una reaccin en que la
unidad repetida 3
'
de la cadena rica en G + T forma un
asa por desplazamiento de su homologa en una regin
de flujo ascendente respecto del telmero.
Los fragmentos telomricos aislados no se com-
portan como si tuvieran DNA monocatenario, ms
bien muestran movilidad electrofortica aberrante
y otras propiedades,
Las bases de guanina tienen una capacidad in-
usual para relacionarse entre s. La cola monocate-
naria rica en G del telmero puede formar
"
cuar-
tetos" de molculas de G, cada uno de los cuales
contiene cuatro guaninas que forman enlaces de
hidrgeno para formar una estructura plana. Cada
28.17 Los telmeros sellan los extremos de los cromosomas 749
Un asa sella el extremo del cromosoma
Cromosoma
J
Fin del asa
En el extremo del DNA cromosmico se forma
un asa. Imagen cortesa de Jack Griffith, University of North
Carolina at Chapel HUI.
il'li' MMiii-lilHi'liiif-l'li f-W
TT
ASG
TTAGGG TTGGG
TRF2
i
Extremo 5'
Extremo 3'
28.30 El extremo 3' del telmero de una sola cade-
na (TTAGGG)
ii
desplaza a las repeticiones homologas del DNA
dicatenario para formar el asa. La reaccin es catalizada por
TRF2.
propiedades desusadas de la secuencia rica en G
vitro, no demuestra, por supuesto, si el cuarteto j
forma in vivo.
Qu caractersticas del telmero se encarga
de la estabilidad del extremo cromosmico? En
se observa que en el telmero se forra
un asa de DNA. La ausencia de cualquier extreir.
libre podra ser la caracterstica clave para la estbil
zacin del extremo del cromosoma. La longitud pr
medio del asa es de 5 a 10 kb en clulas animalef
En la se muestra que el asa se fe
ma cuando el extremo 3
'
del telmero de una so
cadena (TTAGGG)
n
desplaza a la misma secuenc
en una regin del telmero de flujo ascenden:
Esto convierte a la regin doble en una estrucur
del tipo del asa D, en la cual, una serie de repetido
nes de TTAGGG se desplaza para formar una regi
de una sola cadena y la cola del telmero se apajes
con la cadena homloga.
La reaccin es catalizada por la protena
unin del telmero TRF2, que con otras protena
crea un complejo que estabiliza los extremos at
mosmicos. Su importancia en la proteccin de 1c
extremos depende de que la delecin de TRF2
lu ar a reestructuraciones cromosmicas.
Los telomeros son
sintetizados por una enzima
ribonudeoproteinica
Conceptos principale
.
La telomerasa hace uso del 3'-0H de la cadena
telomrica G + T para cebar la sntesis de repeticiones
seriadas de tipo TTGGGG.
.
El componente RNA de la telomerasa tiene una
secuencia que se aparea con repeticiones ricas en
C +A.
Una de las subunidades protenicas es una transcriptas;
inversa que utiliza al RNA como molde para La sntesis
de la secuencia rica en G + T.
guanina proviene de la posicin correspondiente de
una unin de repeticin sucesiva TTAGGG. En la
se muestra una organizacin basada
en una estructura cristalina reciente. El cuarteto
ilustrado representa un vnculo entre las primeras
guaninas de cada unidad de repeticin y se apila
sobre otro cuarteto que tiene la misma organiza-
cin, pero se forma a partir de la segunda guanina
de cada unidad de repeticin. Una serie de cuarte-
tos como ste podra apilarse en forma helicoidal,
y si bien la formacin de esa estructura da fe de las
El telmero tiene dos funciones:
.
La primera es proteger el extremo cronu
smico; cualquier otro extremo del DN*
por ejemplo, el generado por una rotu
dicatenaria, se convierte en blanco de 1
sistemas de reparacin. Las clulas tiene qi
ser capaces de distinguir al telmero.
.
La segunda es permitir que el telmero
extienda, de lo contrario, se har ms cp|
con cada ciclo de replicacin (porque la n
plicacin no puede iniciarse en el extrern
mismo).
750 CAPTULO 28 Cromosomas
Las protenas que se unen al telmero constitu-
yen la solucin para ambos problemas. En las leva-
duras, diferentes conjuntos de protenas resuelven
cada problema, pero ambos se unen con el telmero
mediante la misma protena, Cdcl3:
.
La protena Stnl protege contra la fragmen-
tacin (especficamente contra cualquier
extensin de la fragmentacin de la cadena
C
-A que genera la cola G
.
.
Una enzima telomerasa extiende la cadena
rica en C-A. Esta actividad depende de dos
protenas con actividades auxiliares, como
el control de la longitud de extensin.
La telomerasa utiliza el extremo 3'-OH de la
cadena telomrica G + T como cebador de la snte-
sis de repeticiones seriadas TTGGGG, actividad que
slo necesita GTPd y TTPd. La telomerasa es una
gran ribonucleoprotena que consta de un molde
de RNA (codificado por TLC1) y una protena con
actividad cataltica (EST2). El componente de RNA
corto (159 bases de longitud en el gnero Tetrahy-
mena y 192 en el Euplotes) incluye una secuencia de
15 a 22 bases, la cual es idntica a dos repeticiones
de la secuencia de repeticin rica en C. Este RNA
proporciona el molde para la sntesis de la secuencia
de repeticin rica en G. El componente protenico
de la telomerasa es una subunidad cataltica que
slo puede actuar en el molde de RNA provisto por
el componente de cido nucleico.
En la FIGURA 28.31 se muestra la accin de la
telomerasa, enzima que avanza de manera discon-
tinua; el molde de RNA es ubicado en el cebador
de DNA, se agregan varios nucletidos al cebador y
despus, la enzima se transloca para volver a em-
pezar. La telomerasa es un ejemplo especializado
de una transcriptasa inversa, enzima que sintetiza
la secuencia de DNA en un molde de RNA (vase la
seccin 22.4, El DNA vrico es generado por trans-
cripcin inversa). No se sabe cmo se ensambla la
cadena complementaria del telmero (rica en C-A),
pero se especula que podra sintetizarse mediante el
extremo 3
'
-
OH de una horquilla terminal G-T como
cebador de la sntesis de DNA.
La telomerasa sintetiza las repeticiones indivi-
duales que se agregan a los extremos cromosmicos,
pero, en s, no controla el nmero de repeticiones.
Otras protenas participan en la determinacin de
la longitud del telmero y pueden ser identificadas
por los mutantes ESTl y EST3 de levaduras, en los
cuales, la longitud del telmero ha sido modificada.
Estas protenas pueden unir telomerasas, e influyen
en la longitud del telmero controlando el acceso
de la telomerasa a su sustrato. Se han encontrado
protenas que se unen a los telmeros en clulas de
mamferos, pero poco se sabe sobre su funcin.
Unin: el molde de RNA se aparea con el cebador de DNA
cebador de DNA
1
TTGGGGTTGGGGTTG
3' AACCCGAACCCCAACCCCAAC
3
'
5
'
/ 5'
molde de RNA
Polimerizacin: El molde de RNA dirige la adicin
de nucletidos al extremo 3' del DNA
3
'
rdGTP
5'
...TTGGGGTTGGGGTTGQ '
3' ...AACCCGAACCCCAACCCCAAC
3' 5'
La polimerizacin .
contina hasta el final Jf
de la regin molde
5' ...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTQ
3'
...AACCCCAACCCCAACCCCAACAAC
3
'
5'
Translocacn: la enzima se traslada al extremo 3' del molde
.
'
3'.
5' ...TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG
3' ...AACCCC 5' AACCCCAACCCCAAC
I 31 | 5
FIGURA 28.31 La telomerasa se ubica a s misma por aparea-
miento de bases entre el molde de DNA y el cebador de DNA
unicatenario, que sobresale; agrega bases G y I al cebador, una
a la vez, segn el molde. El ciclo se inicia nuevamente cuando
se ha agregado una unidad de repeticin.
Cada organismo presenta un rango caracte-
rstico de longitudes telomricas; son largos en los
mamferos (en general, de 5 a 15 kb en el ser hu-
mano) y cortos en las levaduras (unos -300 bp en
S. cerevisiae). El mecanismo de control bsico es que
la probabilidad de que un telmero sea un sustrato
de la telomerasa aumenta conforme se abrevia su
longitud; no se sabe si esto es un efecto continuo o
s depende de que la longitud se reduzca respecto
de alguna cifra crtica. Cuando la telomerasa acta
en un telmero, puede agregar varias unidades de
repeticin. La forma intrnseca de accin de la en-
zima es disociar, despus de agregar una repeticin;
la adicin de varias unidades de repeticin depende
de otras protenas que hacen que la telomerasa lleve
a cabo ms de un ciclo de extensin. El nmero de
repeticiones agregadas no influye en la longitud del
telmero mismo, ms bien es controlado con prote-
nas auxiliares que se vinculan con la telomerasa.
Las caractersticas mnimas requeridas para que
exista como cromosoma son:
28.18 Los telmeros son sintetizados por una enzima ribonucleoprotenica
751
.
Telmeros para asegurar la supervivencia.
.
Un centrmero para mantener la segregacin,

. Un origen para iniciar la replicacin.

Todos esos elementos se han conjuntado para
estructurar un cromosoma artificial de levaduras
(YAC), mtodo que permite perpetuar secuencias
ajenas, de ah que el cromosoma sinttico sea es-
table slo si tiene ms de 20 a 50 kb de longitud.
Se desconoce el fundamento de dicho efecto, pero
la capacidad de construir un cromosoma sinttico
permite investigar la naturaleza del dispositivo de
segregacin en un ambiente controlado.
Los teLmeros
son indispensables
para La supervivencia
En todas las clulas en proceso de divisin se observa
actividad de telomerasa, la cual suele interrumpirse
en aqullas con diferenciacin terminal que no se
dividen. En la FIGURA 28.32 se muestra que si la te-
lomerasa presenta mutacin en una clula en esas
condiciones, los telmeros se acortan gradualmente
en cada mitosis. Un ejemplo de los efectos de tal mu-
tacin en las levaduras se ilustra en la FIGURA 28.33,
en la cual, el telmero se acorta de 400 a 0 bp en
-
120 generaciones.
La prdida de telmeros produce efectos no-
civos. Cuando la longitud del telmero llega a 0,
a las clulas se les dificulta dividirse con xito. Los
intentos de divisin por lo general causan roturas
y translocaciones de cromosomas, proceso que re-
sulta en una mayor tasa de mutaciones, que en las
El acortamiento dol telmero conduce al desastre
Tel lero Telmero
La mutacin en la telomerasa hace que los
telmeros se acorten en cada divisin celular. En un momento
dado, la prdida del telmero da lugar a rotura y reestructura-
cin de los cromosomas.
Los telmeros se acortan de 400 a 0 bp en mulantes triJ
trt1 de tipo silvestre frf7-deficiente
600
500
400
300
200
100
Divisiones 40 80 120 40 80 120
La longitud del telmero se mantiene en ~35I
bp en la levadura de tipo silvestre, pero por una mutacin en
el gen trtl, que codifica el componente de RNA de la telome-
rasa, rpidamente acorta sus telmeros a una longitud de 0.
Reproducida con autorizacin de Nakamura, T. M., et al. 199
Science. 277:955-959. 1997 AAAS. Imagen cortesa de Tho-
mas R. Cech and Toru Nakamura, University of Colorado.
levaduras se vincula con prdida de la viabilidad y
ocupacin del cultivo predominantemente por clu-
las senescentes (alargadas, que no se dividen y que.
en ltima instancia, mueren).
Algunas clulas brotan del cultivo senescente
porque han adquirido la capacidad de extender sus
telmeros por una alternativa a la actividad de la
telomerasa. Las supervivientes entran en dos gru-
pos, en uno de los cuales, los cromosomas se han
tornado circulares, carecen de telmeros y, como
resultado, son independientes de la telomerasa. E
'
otro grupo utiliza un entrecruzamiento inequitativo
para extender sus telmeros (
:
,
3URA 28.34). El te-
lmero es una estructura de repeticin, de manera
que es posible que dos de ellos se alineen de ma-
nera errnea cuando los cromosomas se aparean.
La recombinacin entre regiones desiguales genera
un entrecruzamiento inequitativo, como se muestra
antes en la Figura 6.1, en cuyo caso, la longitud de
un cromosoma recombinante aumenta, mientras
que la del otro disminuye.
Las clulas suelen suprimir el entrecruzamiento
inequitativo por sus consecuencias potencialmente
nocivas mediante dos sistemas, uno de ellos, propor-
cionado por las protenas de unin con telmeros.
En las levaduras, la frecuencia de recombinacin
entre telmeros aumenta por delecin del gen tazl.
que codifica una protena reguladora de la actividad
752 CAPTULO 28 Cromosomas
de telomerasa. El segundo es un sistema general que
repara el apareamiento errneo. Adems de corregir
pares de bases apareadas errneamente que podran
surgir en el DNA, este sistema suprime la recom-
binacin entre regiones errneamente apareadas,
como se muestra en la Figura 28.34, incluidos los
telmeros. En caso de mutacin, un mayor porcen-
taje de las levaduras con deficiencias de telomerasa
sobrevive a la prdida de los telmeros porque la
recombinacin entre ellos genera algunos cromo-
somas con telmeros ms largos,
Cuando se cultivan clulas eucariticas, suelen
dividirse un nmero fijo de generaciones y despus,
entran en senescencia, tal vez por una declinacin
de la longitud del telmero por la falta de expre-
sin de la telomerasa. La clula entra en una crisis
que algunas superan, pero por lo general estas l-
timas presentan reestructuraciones cromosmicas
resultado de la falta de proteccin de los extremos
cromosmicos. Dichas reestructuraciones pueden
dar lugar a mutaciones que contribuyen a! estado
tumorignico. La ausencia de expresin de la telo-
merasa en esas circunstancias se debe a una falta
de expresin del gen, y la reactivacin de la enzima
es uno de los mecanismos por lo que dichas clulas
pueden sobrevivir de manera continua en cultivo
(que obviamente no era una opcin en los experi-
mentos con levaduras en los cuales haba antece-
dentes de delecin del gen).
HHff Resumen
El material gentico de todos los organismos y vi-
rus adopta la forma de nucleoprotenas estrecha-
mente empaquetadas. Algunos genomas vricos
se insertan en viriones preformados, en tanto que
otros ensamblan una cubierta protenica en torno
al cido nucleico. El genoma bacteriano forma un
denso nucleoide de -20% de protena por masa,
pero se desconocen los detalles de la interaccin de
las protenas con el DNA. El DNA est organizado
en -100 dominios que mantienen un superenrolla-
miento independiente, con una densidad de super-
hlices no restringidas correspondiente a -1/100 a
200 bp. En eucariotas, la cromatina de interfase y
los cromosomas de metafase parecen organizados
en grandes asas, cada una de las cuales puede ser un
dominio superenrollado de manera independiente.
Las bases de las asas se conectan a un bastidor de
metafase o a la matriz nuclear mediante sitios es-
pecficos del DNA.
Las secuencias con transcripcin activa residen
en la eucromatina, que constituye la mayor parte
de la cromatina de interfase. Las regiones de he-
Los telmeros pueden extenderse por recombnacin||
Los sistemas de reparacin del
apareamiento errneo suprimen el
entrecruzamiento entre telmetros
Se produce entrecruzamiento cuando
no se repara el apareamiento errneo
i
FIGURA 28.34 El entrecruzamiento en las regiones telom-
ricas suele ser suprimido por los sistemas de reparacin de
apareamiento errneo, pero puede ocurrir cuando se presenta
una mutacin. El suceso de entrecruzamiento inequitativo ex-
tiende el telmero de uno de los productos, permitiendo que el
cromosoma sobreviva en ausencia de la telomerasa.
terocromatina estn empaquetadas -5 a lOx, ms
compactadas, y son inertes en cuanto a la transcrip-
cin. Toda la cromatina se empaqueta densamente
durante la divisin celular, cuando es posible dis-
tinguir cada uno de los cromosomas. La produccin
de bandas G mediante tratamiento con el colorante
Giemsa es indicio de la existencia en los cromoso-
mas de una infraestructura reproducible. Las bandas
son regiones muy grandes (-107 bp) que pueden
utilizarse para localizar translocaciones cromosmi-
cas u otros cambios considerables en la estructura.
Los cromosomas en escobilln de los anfibios
y los politnicos de los insectos tienen estructuras
inusualmente amplias, con razones de empaque-
tamiento <100. Los cromosomas politnicos de D.
melanogaster se dividen en casi 5 000 bandas, cuyo
tamao vara en magnitud con un promedio de -25
kb. Tambin se observan regiones con actividad
transcripcional en estructuras an ms desplegadas
(con "abultamientos") donde se expulsa material
del eje del cromosoma, proceso que podra simular
los cambios que ocurren en menor escala cuando se
transcribe una secuencia en la eucromatina.
La regin centromrica contiene el cinetcoro,
encargado de unir el cromosoma con el huso mi-
ttico. El centrmero suele estar rodeado de hete-
rocromatina. Las secuencias centromricas se han
identificado slo en la levadura S. cerevisiae, donde
constan de elementos conservados cortos, CDE-I y
CDE-III, que se unen a CBFI y al complejo CBF3,
respectivamente, as como una regin larga, rica en
A-T
, llamada CDE-II, que se une a Cse4 para formar
una estructura especializada en la cromatina. Otro
grupo de protenas que se une a ese ensamblaje pro-
porciona la conexin con los microtbulos.
28.20 Resumen 753
Los telmeros proporcionan estabilidad a los
extremos de los cromosomas, y casi todos los cono-
cidos constan de mltiples repeticiones, en las cua-
les una cadena tiene la secuencia general CJA/T) ,
donde n>\ y m = 1 a 4. La otra cadena G
j
(T/A)j)/
tiene un extremo nico que sobresale y aporta un
molde para la adicin de bases individuales en un
orden definido. La enzima telomerasa es una ribo-
nucleoprotena cuyo componente RNA proporciona
el molde para la sntesis para la cadena rica en G,
con lo cual se resuelve el problema de la imposibi-
lidad de replicacion en el extremo de una cadena
doble. El telmero estabiliza el extremo del cromo-
soma porque la cadena nica colgante G
ii
(T/A)mdes-
plaza del telmero a su homloga en unidades de
repeticin previas hasta formar un asa, de manera
que no haya extremos libres,
Referencias
Los genomas vricos estn empaquetados en sus
cubiertas
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756 CAPTULO 28 Cromosomas
Nucleosomas
ESQUEMA DEL CAPTULO
y
WEW Introduccin
RCT EL nucleosoma es la subunidad de la cromatina
. La nudeasa de micrococos libera los nucleosomas de la
cromatina como partculas de 11S.
.
Un nucleosoma contiene ~200 bp de DNA y dos copias de
cada histona medular (H2A, H2B, H3 y H4).
.
El DNA envuelve la superficie externa del octmero de
protenas.
wnitm El DNA est enrollado en la estructura de los
nucleosomas
.
>95% del DNA se recupera en nucleosomas o multmeros
cuando la nudeasa de micrococos escinde el DNA de la
cromatina.
.
La longitud del DNA por nucleosoma vara de tejido a tejido
en un rango de 154 a 260 bp.
Wiswm Los nucleosomas tienen una estructura comn
.
El DNA de los nucleosomas se divide en DNA medular y DNA
de enlace, dependiendo de su susceptibilidad a la nudeasa de
micrococos.
.
El DNA medular tiene una longitud de 145 bp y se
encuentra en las partculas centrales producidas por
digestin prolongada con la nudeasa de micrococos.
.
El DNA de enlace es la regin de 8 a 114 bp susceptible de
escisin temprana por la enzima.
.
Los cambios en la longitud del DNA de enlace explican las
variaciones de la longitud total del DNA nucleosmico,
La Hl se vincula con el DNA de enlace y podra encontrarse
en el punto en que el DNA entra y sale del nucleosoma.
libM La estructura del DNA vara en La superficie del
nucleosoma
. El DNA le da 1.65 vueltas al octmero de histonas.
.
La estructura del DNA se modifica de manera que tiene
un nmero mayor de pares de bases por giro en la parte
media, pero menor en los extremos.
KCirii La periodicidad del DNA cambia en el nucLeosoma
.
Con el cambio en bp por giro se absorben ~0.5 giros
negativos del DNA, de 10.5 en solucin a un promedio de
10.2 en la superficie del nucleosoma, lo cual explica la
paradoja del nmero de enlaces.
%3k Organizacin del octmero de histonas
.
El meollo del octmero de histonas est constituido por un
tetrmero, H3
2
-H4
2
vinculado con dos dmeros H2A-H2B.
.
Cada histona presenta interdigitacin intensa con su
contraparte.
.
Todas las histonas medulares tienen el segmento
estructural de pliegue. Las colas terminales N salen del
nucleosoma.
IsbU La va de Los nucleosomas en La fibra de
cromatina
Las fibras de cromatina de 10 nm se despliegan a partir de
fibras de 30 nm y constan de una cadena de nucleosomas.
Las fibras de 30 nm tienen seis nucleosomas por giro
organizados en un solenoide.
.
La histona Hl es necesaria para la formacin de la fibra de
30 nm.
smm La replicacin de La cromatina requiere del
ensamblaje de los nucleosomas
. Los octmeros de las histonas no se conservan durante
la replicacin, a diferencia de los dmeros H2A-H2B y los
tetrmeros H3
2
-H4
2
.
.-
Hay diferentes vas para el ensamblaje de los nucleosomas
durante la replicacin e independientemente de sta.
.
Para eliminar al ensamblaje de los nucleosomas, se
requieren protenas accesorias.
.
El CAF-1 es una protena de ensamblaje que se vincula
con la subunidad PCNA del replicosoma; es necesaria
para el depsito de los tetrmeros H32-H42 despus de la
replicacin.
.
Para el ensamblaje independiente de la replicacin se
puede usar una protena de ensamblaje diferente y una
variable de la histona H3.
jil'MM Los nucleosomas yacen en posiciones
especficas?
.
Los nucleosomas pueden formarse en posiciones especficas
como resultado de la estructura local del DNA o de las
protenas que interactan con secuencias especficas.
.
La causa ms frecuente de la posicin del nucleosoma es el
lmite impuesto por las protenas que se unen al DNA.
.
El posicionamiento influye en qu regiones del DNA quedan
en el enlace y qu cara del DNA se expone a la superficie
del nucleosoma.
fcfcmi Los genes transcritos se organizan en
nucleosomas?
. Los nucleosomas se encuentran a la misma frecuencia
cuando los genes transcritos o no transcritos son digeridos
con nudeasa de micrococos.
.
Algunos genes intensamente transcritos parecen casos
excepcionales desprovistos de nucleosomas.
M-
'
Hl Los octmeros de histonas son desplazados
por la transcripcin
.
En un sistema modelo, la polimerasa de RNA desplaza a los
octmeros de histonas durante la transcripcin, pero stos
Contina en la siguiente pgina
757
se unen nuevamente con el DNA tan pronto como ha
pasado la polimerasa.
.
Los nucleosomas se reorganizan cuando la
transcripcin pasa a travs de un gen.
M3iM EL desplazamiento del nudeosoma y su
reensamblado requieren factores especiales
.
Se necesitan factores auxiliares para que la
polimerasa de RNA desplace a los octmeros durante
la transcripcin y para que despus, las histonas se
reensamblen en nucleosomas.
mma Los aislantes impiden la accin de los
potenciadores y de la heterocromatina
.
Los aislantes pueden impedir el paso de cualquier
efecto activador o inactivador desde los potenciadores,
silenciadores y LCR.
.
Los aislantes suelen constituir barreras para evitar que
la heterocromatina se expanda.
ECllia Los aislantes pueden definir un dominio
.
Los aislantes son estructuras especializadas de la
cromatina con sitios hipersensibles. Dos aislantes
pueden proteger de todo efecto externo la regin que
los separa.
mmn Los aislantes pueden actuar en una direccin
Algunos aislantes tiene direccionalidad, de modo
que pueden detener el paso de los efectos en una
direccin, pero no en la otra.
w-
'
HM Los aislantes pueden variar en potencia
.
Los aislantes difieren en cuanto a eficacia para ir.-ir
el paso de una seal de activacin.
taaiia Los sitios hipersensibles a la
desoxirribonucleasa reflejan cambios en ta
estructura de la cromatina
.
En los promotores de los genes expresados hay sir:i<
hipersensibles.
.
Estos sitios son generados por la unin de factor*;
de transcripcin que desplazan a los octmeros m
histonas.
vumvi Los dominios definen regiones que contien*-"
genes activos
.
Un dominio que contiene un gen transcrito se de"--;
por su mayor sensibilidad a la fragmentacin por .:
desoxirribonucleasa I.
UWM Una LCR puede controlar a un dominio
. Una LCR se localiza en el extremo 5' del dominio
,
consta de varios sitios hipersensibles.
ta-'iMi Qu constituye un dominio regulador?
.
Un dominio puede tener aislante, LCR y sitio de l.- ;---
a la matriz, as como unidades de transcripcin.
EMEEl Resumen
Introduccin
La cromatina tiene una organizacin compacta en
que casi todas las secuencias del DNA son estruc-
turalmente inaccesibles y estn inactivas desde el
punto de vista funcional. En esta masa se encuen-
tra la parte ms pequea de las secuencias activas.
Cul es la estructura general de la cromatina y cul
la diferencia entre secuencias activas e inactivas? La
elevada proporcin general del empaquetado del
material gentico sugiere de inmediato que el DNA
no puede empacarse directamente en la estructura
general de la cromatina, debe haber jerarquas de
organizacin.
El diseo de la subunidadfundamental de la croma-
tina es el mismo en todas las eucariotas; el nucleosoma
consta de -200 bp de DNA organizados en un oct-
mero de protenas bsicas, pequeas, cuya estructu-
ra simula cuentas. Los componentes protenicos son
las hlstonas, que forman una porcin medular, y
el DNA se encuentra en la superficie de la partcula.
Los nucleosomas son un componente invariable de
la eucromatina y la heterocromatina en el ncleo
de interfase, as como de los cromosomas mitticos.
El nucleosoma constituye el primer nivel de orga-
nizacin, con una razn de ~6 de empaque. Sus
componentes y estructuras estn bien definidos.
El segundo nivel de organizacin es el enrollado
de la serie de nucleosomas en una disposicin heli-
coidal para constituir la bra de -30 nm de dime-
tro de la cromatina de interfase y los cromosoni*
mitticos (vase Fig. 28.11). En la cromatina, U -ri-
zn de empaque del DNA es de -40. La estruc.-.
de esa fibra requiere de protenas adicionales, f i-
no ha sido bien definida.
La proporcin final del empaquetado depeodt
del tercer nivel de organizacin, el empaqueti:
de la propia fibra de 30 nm, lo cual resulta etj un
razn general de empaquetado de -1 000 en la
cromatina, intercambiable cclicamente con el j-
los cromosomas mitticos, que alcanza una rizB
general de -10 000. En general, la heterocromstiaj
tiene una razn de empaque de -10 000, tamo ex
la interfase como durante la mitosis.
Para caracterizar los sucesos involucrados en -
empaque, la replicacin y la transcripcin cccos
se necesita dilucidar estos niveles de organizad
Se supone que el vnculo con protenas adicior.r
o la modificacin de las protenas cromosn;;.::
existentes se relacionan con el cambio de la estnjc-
tura de la cromatina, pero no se conocen las daas
especficas para el control del empaquetado dck:;
Tanto replicacin como transcripcin implicao
desenrollado del DNA y, por tanto, deben inc.
un despliegue de la estructura que permita a la
enzimas importantes actuar sobre l, lo cual posi-
blemente implicara cambios en todos los nhvt-
de organizacin.
Cuando se replica la cromatina, los nuclecs -
mas deben replicarse en ambas molculas hija :
758 CAPTULO 29 Nucleosomas
:
ue adems de preguntarse cmo se ensambla el
nucleosoma mismo, se debe inquirir qu pasa con
as otras protenas de la cromatina. La replicacin
:
)mpe su estructura, indicio de que representa un
roblema para las regiones de mantenimiento de
estructura especfica y ofrece la oportunidad de mo-
lificarla.
La masa de cromatina contiene hasta el doble de
"
rotenas que el DNA, y casi la mitad de esa masa pro-
.enica se encuentra en los nucleosomas; la masa del
RNA representa <10% respecto de la masa de aqul,
mientras que gran parte de ste consta de produc-
ios de transcripcin recientes, an vinculados con el
nolde del DNA.
Las no histonas incluyen todas las protenas
E la cromatina, excepcin hecha de las histonas,
tran ms entre tejidos y especies, y constituyen
un porcentaje menor de masa que las histonas. Por
otra parte, tambin incluyen un nmero mucho
mayor de protenas, de manera que cualquiera de
istas est presente en cantidades ms pequeas que
las de cualquier histona.
Las funciones de las protenas no histonas in-
cluyen el control de la expresin gnica y de las
estructuras de orden superior, de modo que la poli-
merasa de RNA puede considerarse como una histo-
na prominente. Las protenas del HMG (grupo de alta
movilidad) constituyen una subclase bien definida
ie no histonas (cuando menos algunas son facto-
res de transcripcin). Un problema importante res-
pecto de otras no histonas, es que tienden a contami-
narse con otras protenas nucleares, y hasta ahora ha
sido difcil obtener las protenas no histonas respon-
sables de las estructuras de orden superior.
m
v
.V
La cromatina que se derrama de los ncleos li-
sados consta de una serie de partculas muy compactas. La
barra mide 10 nm. Reproducida de Ce//, vol. 4 Oudet. P., et al.
,
Electrn microscopic... pp. 281-300. Copyright 1975,
con auto-
rizacin de Elsevier. Imagen cortesa de Pierre Chambn.
Los nucleosomas son como cuentas de 10
V
EL nucleosoma es La subunidad
de La cromatina
Conceptos principales
.
La nucleasa de micrococos Libera los nucleosomas de La
cromatina como partculas de 11S.
.
Un nucleosoma contiene ~200 bp de DNA y dos copias
de cada histona medular (H2A, H2B, H3 y H4).
.
El DNA envuelve la superficie externa del octmero de
protenas.
Cuando se suspenden en una solucin de poca po-
:
encia inica, los ncleos de interfase se hinchan y
ompen para liberar fibras de cromatina. En la FIGURA
se muestra un ncleo lisado con fibras dirigidas
a! exterior. En algunas regiones, las fibras constan
de material muy compacto, pero en las que se han
extendido
, se observa que estn constituidas de par-
n
'
culas bien definidas
., los nucleosomas. En regiones
-
La digestin de la cromatina con nucleasa de mi-
crococos libera nucleosomas individuales. La barra mide 100 nm.
Reproducida de Ce//, vol. 4 Oudet. P., et al.
.
Electrn microsco-
pic... pp. 281-300. Copyright 1975, con autorizacin de Elsevier.
Imagen cortesa de Pierre Chambn.
especialmente extendidas, los nucleosomas estn co-
nectados por una cadena fina que corresponde a una
cadena doble de DNA libre. Una cadena doble continua
de DNA transcurre por la serie de partculas.
Si se trata la cromatina con la endonucleasa co-
nocida como nucleasa de micrococos
, que corta
la cadena de DNA en la unin entre nucleosomas, se
pueden obtener nucleosomas individuales; primero
libera grupos de partculas y despus nucleosomas
independientes, que en la GURA 29.2 se ven como
partculas compactas que se sedimentan a -11 S.
El nucleosoma contiene -200 bp de DNA vinculadas
con un octmero de histonas que consta de dos copias de
cada una de las histonas medulares conocidas como
29.2 El nucleosoma es la subunidad de la cromatina 759
Un nucleosoma tiene un DNA de 200 bp
e histonas medulares
re.
H2Ax2 = 28kD
-
y y A yy
~ QO H2B X 2 = 28 kD
:
H3x2 =30kD
/\/\/\/\/\>\/
'
H4x2 =22kD
200 bp de DNA = 130 kD Protena total = 108 kD
Longitud = 67 nm
I
c
6 nm
-
H1 =24 kD
i .
11 nm
FIGURA 29.3 EL nucleosoma consta de masas casi equivalen-
tes de DNA e histonas (incluida Hl). La masa pronosticada del
nucleosoma es de 242 kD.
El nucleosoma tiene dos giros de DNA
El DNA "sale"
El DNA "entra"
FIGURA 29A EL nucleosoma puede ser un cilindro con el DNA
organizado en dos giros en torno a su superficie.
H2A, H2B, H3 y H4, cuyo vnculo se ilustra esque-
mticamente en la FIGURA 29.3. Con este modelo se
explica la estequiometra de las histonas medulares
de la cromatina: H2A, H2B, H3 y H4 estn presentes
en cantidades equimolares, con dos molculas de
cada una por cada -200 bp de DNA.
Las histonas H3 y H4 son de las protenas ms
conservadas que se conocen, lo cual sugiere que sus
fundones son idnticas en todas las eucariotas. Los
tipos H2A y H2B pueden reconocerse en todas las
eucariotas, pero muestran variaciones de secuencia
apreciables, especficas de cada especie,
La histona Hl es un conjunto de protenas es-
trechamente relacionadas con variantes apreciables
entre tejidos y especies, y su participacin es diferen-
te de la de las histonas medulares; por otra parte, la
cantidad equivale a la mitad de la cantidad de una
histona medular, adems de que se puede extraer
ms fcilmente de la cromatina (en general con una
solucin salina diluida [0.5 M]).La Hl se puede elimi-
nar sin afectarla estructura del nucleosoma, lo cual sugiere
que su localizacin en la partcula es externa.
EL nucleosoma es un cilindro plano
Eje de simetra
Protena = 3.12 nm:
Radio de giro
1
~Octrnero: de histonas
DNA = 5.2 nn>
Dos giros de DNA, cada uno de 2 nm
de dimetro, ocupan la mayor parte
de la altura (6 nm)
FIGURA 29.5 Los dos giros del DNA del nucleosoma :
muy juntos.
Los giros del DNA estn cerca uno de otro
i
B
Los sitios de 80 bp de separacin en el DNA
lineal se encuentran cerca del nucleosoma
Las secuencias de DNA que yacen en dife-;
giros, rodeando al nucleosoma, pueden quedar muy juntas
La forma del nucleosoma corresponde a ur.
co o cilindro plano de 11 nm de dimetro y I
altura. La longitud del DNA es de -34 nm, c;
doble de la circunferencia de la partcula y sigue i
va simtrica que rodea al octmero. En la
se muestra un esquema de la va del DNA i
asa helicoidal que da dos giros en torno al oa;-
cilndrico. Ntese que el DNA
"
entra
"
y "saic
nucleosoma en puntos cercanos. La histona 9
vez se localice en esa regin (vase la seccin :
Los nucleosomas tienen una estructura comn
Si se analiza este modelo en funcin de un
transversal del nucleosoma, se observar, cor:
la FI , que las dos circunferencias de. E
yacen cerca una de la otra. La altura del cilindl
de 6 nm, de los cuales, 4 son ocupados por dos g
del DNA (cada uno de 2 nm de dimetro).
El patrn de dos giros posiblemente tenga
secuencias funcionales. Un giro en torno al tu
soma requiere de -80 bp de DNA, por lo cu i
puntos separados por 80 bp en la doble hlice
en realidad pueden estar cerca de la super::: .
nucleosoma, como se ilustra en la FIGURA 2!
CAPTULO 29 Nucleosomas
La unidad de longitud del
DNA es de 200 bp
Longitud
La nucLeasa de micrococos digiere La cromatina
Mi los ncleos y produce una serie multimrica de bandas de
TMA que pueden ser separadas mediante electroforesis en gel.
-Tiagen cortesa de Markus Noli, Universitt Zrich.
EL DNA est enroLLado
en La estructura
de Los nucLeosomas
Conceptos principales
.
>95% del DNA se recupera en nucleosomas o
multmeros cuando la nucleasa de micrococos escinde
el DNA de la cromatina.
.
La longitud del DNA por nudeosoma vara de tejido a
tejido en un rango de 154 a 260 bp.
luando se digiere la cromatina con la enzima
r.ucleasa de micrococos, el DNA es escindido en
Biltiplos integrales de una unidad de longitud. El
::
accionamiento por electroforesis en gel revela la
"
escalera
"
que se representa en la FIGURA 29.7. Tales
escaleras tienen -10 escalones y la unidad de longi-
:
ud determinada por los incrementos entre pelda-
;
.os sucesivos, es de -200 bp.
En la IGURA 29.8 se muestra que la escalera es
enerada por grupos de nucleosomas, que cuando
i fraccionan sobre un gradiente de sacarosa, arro-
m una serie de picos bien definidos que correspon-
:
en a monmeros, dmeros, trmeros y as sucesi-
vamente. Cuando se extrae DNA de las fracciones y
se somete a electroforesis, cada fraccin resulta en
una banda de DNA cuyo tamao corresponde a un
reldao de la escalera de la nucleasa de microco-
cos. El nudeosoma monomrico contiene DNA de
nna unidad de longitud, el dmero de nucleosomas
La escalera de DNA corresponde a multmeros
Porcin Sedimentacin Porcin
superior
'
inferior
Monmeros
Dmeros
Trmeros
Extraccin de DNA y electroforesis
Control de
la digestin
Q
15
T3
1 000
FIGURA 29. Cada multmero de nucleosomas contiene el
nmero apropiado de unidades de longitud de DNA. En la fo-
tografa, las bandas artificiales simulan una escalera de DNA.
La imagen se estructur utilizando fragmentos de PCR cuyo
tamao corresponde al de las bandas reales. Imagen cortesa
de Jan Kieleczawa, Wyeth Reserch.
contiene el doble de la unidad de longitud de DNA,
y as sucesivamente.
Cada peldao en la escalera representa al DNA
derivado de un nmero definido de nucleosomas,
de modo que se considera que la escalera de 200 bp de
cualquier cromatina indica que el DNA est organizado
en nucleosomas. La escalera microccica se genera
cuando la enzima torna soluble en cido (degradado
hasta pequeos fragmentos) a slo -2% del DNA
del ncleo. As, un pequeo porcentaje del DNA atacado
especficamente, quiz represente regiones especialmente
susceptibles.
29.3 El DNA est enrollado en la estructura de los nucleosomas 761
Cuando la cromatina se escurre del ncleo, a
menudo se observa una serie de nucleosomas co-
nectados por una cadena de DNA libre (cuentas
ensartadas en un hilo), no obstante, la necesidad
de compactacin del DNA in vivo sugiere que pro-
bablemente haya poco DNA libre (si acaso).
Este punto de vista es confirmado por el hecho
de que puede recuperarse >95% del DNA de la cromati-
na enforma de escalera de 200 bp. As pues, casi todo el
DNA debe estar organizado en nucleosomas. Es muy
probable que en su estado natural, los nucleosomas
estn empaquetados estrechamente, con paso direc-
to del DNA de uno al siguiente. Quiz la generacin
de DNA libre se deba a la prdida de algunos oct-
meros de listonas durante su aislamiento.
La longitud del DNA del nucleosoma vara,
en cierta forma, de la cifra "usual
"
de 200 bp. La
cromatina de cualquier tipo celular tiene un valor
promedio caracterstico (5 bp). Normalmente,
el promedio es de entre 180 y 200, pero hay ex-
tremos, apenas 154 bp (en un hongo) o hasta 260
bp (en espermatozoides del erizo de mar). El valor
promedio puede ser diferente en cada tejido del
organismo adulto, y tal vez haya diferencias entre
diferentes partes del genoma en un solo tipo de c-
lula. Las variaciones del genoma promedio incluyen
secuencias repetidas seriadas, como los grupos de
genes de RNA de 5S.
EEQ Los nucleosomas tienen
una estructura comn
Conceptos principales
EL DNA de los nucleosomas se divide en DNA medular y
DNA de enlace, dependiendo de su susceptibilidad a la
nucleasa de micrococos.
El DNA medular tiene una longitud de 146 bp y se
encuentra en las partculas centrales producidas por
digestin prolongada con la nucleasa de micrococos.
EL DNA de enlace es la regin de 8 a 114 bp susceptible
de escisin temprana por la enzima.
Los cambios en la longitud del DNA de enlace
explican las variaciones de La Longitud total del DNA
nudeosmico.
La Hl se vincula con el DNA de enlace y podra
encontrarse en el punto en que el DNA entra y sale del
nucleosoma.
Una estructura comn subraya la cantidad variable
de DNA contenida en los nucleosomas de diferen-
tes fuentes. El vnculo del DNA con el octmero
de histonas forma una partcula medular que con-
tiene 146 bp de DNA, independientemente de la
longitud del DNA del nucleosoma. La diferencia de
El centro del nucleosoma tiene 46 bp
Pares
de
bases
180
160
u
140
Tiempo de digestin
La nucleasa de micrococos disminuye la le
de Los monmeros de nucleosomas en pasos bien de
Imagen cortesa de Roger Kornberg, Stanford Universit.
of Medicine.
longitud total del DNA por nucleosoma se supe
ne a esta estructura medular bsica.
La partcula medular es definida por los ei
de la nucleasa de micrococos en el nucleosoma
nomrico. La reaccin inicial de la enzima es I
entre nucleosomas, pero si se le permite con::
despus de que se han generado monmerw
giere algo del DNA del nucleosoma individua,
una reaccin en que el DNA es
"
recortado
"
i
extremos del nucleosoma.
La longitud del DNA disminuye en etapas
definidas, como se muestra en la '.9. E
ncleos del hgado de rata, los nucleosomas n*
mricos tienen inicialmente 205 bp de DNA
despus del primer paso, en algunos monme:
longitud del DNA ha disminuido a -165 bp.
acaban por disminuir a la longitud del DNA
partcula medular, 146 bp. (El centro es razor.
mente estable, pero la digestin continua gene:
"
producto limtrofe de digestin
"
,
en el cual, loa
mentos ms largos del DNA central son de 14':
los ms pequeos, apenas 20 bp.)
Este anlisis sugiere que el DNA de los nr-
somas puede dividirse en dos regiones:
.
DNA medular, con una longitud invar
de 140 bp, y relativamente resistenk
digestin por nucleasas.
.
DNA de enlace, que constituye el xtS
la unidad de repeticin. Su longitud
de apenas 8 bp a tantos como 114 9
nucleosoma.
762 CAPTULO 29 Nucleosomas
El tamao bien definido de la banda de DNA
generada por la escisin inicial con la nucleasa de
micrococos sugiere que la regin inmediatamente
Bisponible para la enzima est restringida y repre-
senta slo parte de cada DNA de enlace. (Si la tota-
lidad de ste fuese susceptible, la banda fluctuara
entre 146 y >200 bp.) Sin embargo, una vez que se
ha hecho un corte en el DNA de enlace, el resto de
la regin se torna susceptible y puede eliminarse re-
lativamente rpido por accin enzimtica adicional.
En la FIGURA 29.10 se representa la conexin entre
los nucleosomas.
Las partculas medulares tienen propiedades
parecidas a las de los nucleosomas mismos, si bien,
son ms pequeas. Su forma y tamao son simila-
res a los de los nucleosomas, lo cual sugiere que la
geometra esencial de la partcula depende de las
Interacciones entre el DNA y el octmero de prote-
nas. Las partculas medulares se obtienen ms fcil-
mente como grupo homogneo, de modo que para
estudios estructurales, a menudo se prefieren a los
preparados de nucleosomas (que tienden a variar,
pues es difcil obtener una preparacin en que no
haya habido un recorte terminal del DNA).
Cules son las caractersticas fsicas de la regin
medular y la de enlace? Estos trminos se introdujeron
como definiciones operativas para describir las regiones
en cuanto a su susceptibilidad relativa al tratamiento con
nucleasas, pero dicha descripcin no tiene implica-
ciones acerca de su estructura real, de ah que la
mayor parte del DNA medular se encorva sobre el
nucleosoma, en tanto que las regiones terminales de
la porcin medular y la de enlace estn ms exten-
didas (vase la seccin 29.5, La estructura del DNA
vara en la superficie del nucleosoma).
La existencia del DNA de enlace depende de
factores diferentes a las cuatro histonas medulares.
Los experimentos de reconstitucin in vitro mues-
tran que estas ltimas tienen una capacidad intrn-
seca para organizar el DNA en partculas medulares,
pero no forman nucleosomas con la unidad de lon-
gitud apropiada. El grado de superenrollamiento del
DNA es un factor importante. La histona Hl y las
protenas no histonas, o ambas, influyen en la lon-
gitud del DNA de enlace vinculado con el octmero
de histonas -en una serie natural de nucleosomas.
Las "protenas de ensamblaje" que no forman parte
de la estructura del nucleosoma, participan in vivo
en la estructuracin de los nucleosomas a partir de
histonas y DNA (vase la seccin 29.9, La replica-
cin de la cromatina implica el ensamblaje de los
nucleosomas).
Dnde est la histona Hl? Se perdi durante
la fragmentacin de nucleosomas monomricos, y
si bien se puede retener en monmeros que an
tienen 165 de bp de DNA, siempre se pierde con la
La nucleasa de micrococos recorta los nucleosomas
en partculas medulares
g-.
200 bp -* 165 bp - 146 bp
Mononucleosomas Nucleosomas Partculas
recortados medulares
FIGUR1 La nucleasa de micrococos corta inicialmente entre
los nucleosomas. Los mononucleosomas suelen tener ~200 bp de
DNA. Los cortes terminales disminuyen la longitud del DNA primero a
~
165 bp y posteriormente generan partculas medulares de 146 bp.
reduccin final a la partcula medular de 146 bp, lo
cual sugiere que la Hl podra localizarse en la regin
del DNA de enlace, adyacente al DNA medular.
Si la Hl est localizada en el DNA de enlace,
podra "sellarlo
"
dentro del nucleosoma por unin
con el punto en que el cido nucleico entra y sale
(vase la Fig. 29.4). La idea de que Hl yace en la re-
gin de unin de nucleosomas adyacentes es com-
patible con los antiguos resultados de que es la que
ms fcilmente se elimina de la cromatina, y que la
cromatina, sin Hl, es ms fcilmente "solubilizada".
Adems, es ms fcil obtener una fibra estirada a
manera de cuentas ensartadas en un hilo cuando
se ha eliminado la Hl.
ES La estructura del DNA vara
en La superficie del nucleosoma
Conceptos principales
.
El DNA le da 1.55 vueltas al octmero de histonas.
.
La estructura del DNA se modifica de manera que tiene
un nmero mayor de pares de bases por giro en la
parte media, pero menor en los extremos.
La exposicin del DNA en la superficie del nucleo-
soma explica porqu es accesible a la escisin por
ciertas nucleasas. La reaccin con las nucleasas que
atacan a cadenas nicas ha sido especialmente in-
formativa. Las enzimas desoxirribonucleasas I y II
hacen hendiduras de una sola cadena en el DNA;
fragmentan un enlace en una cadena, pero la otra
se mantiene intacta en ese punto, de modo que los
efectos no son visible en el DNA de doble cadena.
Sin embargo, con la desnaturalizacin se liberan
fragmentos cortos y no cadenas nicas de longitud
total. Si el DNA ha sido marcado en sus extremos
,
se pueden identificar los fragmentos terminales
por autorradiografa, segn se resume en la IGURA
29.11. Cuando el DNA est libre en solucin
, pre-
29.5 La estructura del DNA vara en la superficie del nucleosoma
763
El marcado radioactivo terminal identifica fragmentos terminales de
Hendidura Hendidura
Electroforesis
Marca 5'
Desnaturalizacin
/larca 5'
Fragmento marcado
Fragmento maroado-
1 Cuando se desnaturaliza el DNA para dar cadenas nicas,
se revelan hendiduras
en el DNA de doble cadena por la presencia de fragmentos. Si el DNA se marca (digamos en los
extremos 5
'
, slo los fragmentos 5' sern visibles mediante autorradiografa). El tamao del frag-
mento identifica la distancia de la hendidura al extremo marcado.
La desoxirribonucleasa I corta cada 10 bp
S12
S11
S10
S9
S8
S7
S6
S5
S4
S3
29.1 Los sitios para las hendiduras yacen a interva-
los regulares a lo largo del DNA medular, como se observa en el
producto de digestin de ncleos por la desoxirribonucleasa I.
Imagen cortesa de Leonard C. Lutter, Henry Ford Hospital, De-
troit, MI.
senta hendiduras (relativamente aleatorias). El DNA
de los nucleosomas tambin puede ser modificado
por las enzimas que le hacen hendiduras, pero slo
a intervalos regulares. Cuando los puntos de corte se
determinan mediante DNA con marca radioactiva
en los extremos, y despus el DNA se desnaturaliza
y somete a electroforesis, se obtiene una escalera del
tipo que se muestra en la FIGURA 29.12.
El intervalo entre peldaos sucesivos de la es-
calera es de 0 a 11 bases, y la escalera abarca tod;
la distancia del DNA medular. Los sitios de escisin
se numeran de SI a SI3 (SI est a -10 bases de!
extremo 5
'
marcado, S2, a -20 bases, y as sucesi-
vamente); las posiciones respecto de la hlice de
'
DNA se ilustran en la FIGURA 29.13.
No todos los sitios se cortan con igual frecuencia.
en algunos casos el corte es bastante eficaz, mientras
que en otros, es apenas perceptible. Las enzimas
desoxirribonucleasas I y II generan la misma esca-
lera, si bien con algunas diferencias en cuanto a I
intensidad de las bandas, lo cual demuestra que 9
patrn de corte representa una serie nica de dianas
en el DNA, determinada por su organizacin, con
slo una ligera preferencia por sitios particulares im-
puesta por cada enzima. El mismo patrn de corte se
obtiene por escisin con un radical hidroxilo, lo cm.
apunta a que el patrn refleja la estructura del DNA
mismo, ms que preferencia de secuencias.
La sensibilidad del DNA nucleosmico a las nu-
cleasas es anloga a un experimento de rastreo, as:
que la falta de reaccin en sitios diana especficos es
atribuible a la estructura del nucleosoma, en el cua
"
.
ciertas posiciones del DNA se hacen inaccesibles.
Hay dos cadenas de DNA en la partcula medu-
lar, de modo que en un experimento de marcado de
extremos se incluyen los dos 5
'
(o 3'), uno en cad
cadena. As, el patrn de corte incluye fragmentos
derivados de varias cadenas, lo cual se ilustra en
la Figura 29.11, en que cada fragmento etiquetada
proviene de una cadena diferente. El corolario es
que en un experimento, cada banda marcada pue-
de representar de hecho dos fragmentos generados
por corte a la misma distancia de cualquiera de los
extremos marcados.
764 CAPTULO 29 Nucleosomas
Cmo, entonces, deberan interpretarse las
preferencias definidas en sitios especficos? Un pun-
to de vista es que la va del DNA en la partcula es
simtrica (casi un eje horizontal a travs del nu-
cleosoma, como se ilustra en la Figura 29.4); por
ejemplo, si la desoxirribonucleasa I no generara un
.
fragmento de 80 bases, ello significara que la po-
sicin a 80 bases de distancia respecto del extremo
5' d
e cualquiera de las cadenas no es susceptible a la
enzima. El segundo esquema de liberacin utilizado
en la Figura 29.13 refleja ese punto de vista e iden-
tifica a S7 como sitio 0, o centro de simetra.
Cuando el DNA se inmoviliza sobre una super-
ficie plana, los cortes resultan en sitios con separa-
cin regular. La FIGURA sugiere que dicho fe-
nmeno refleja la recurrencia del sitio expuesto con
la periodicidad helicoidal de la forma B del DNA. La
periodicidad del corte (espaciado entre puntos de
escisin) coincide con la periodicidad estructural,
de hecho es reflejo de ella (el nmero de pares de
bases por giro de la doble hlice), es decir, la distan-
cia entre sitios corresponde al nmero de pares de
bases por giro. Las mediciones de ese tipo sugieren
que un valor promedio para el DNA helicoidal de
tipo B doble es de 10.5 bp/giro.
Cul es la naturaleza de los sitios diana del nu-
cleosoma? En la FIGURA se muestra que cada
sitio tiene de tres a cuatro posiciones en que ocurre
el corte, esto es, el sitio de corte se define 2 bp,
por lo cual representa una cadena corta de enlaces,
en ambas cadenas, que est expuesta a la accin de
la nucleasa en tres a cuatro pares de bases. Las in-
tensidades relativas indican que se prefieren ciertos
sitios a otros.
A partir de ese patrn, se puede calcular el pun-
to "promedio" que se corta. En los extremos del
DNA, los pares de sitios de SI a S4 o de SI0 a SI3,
distan entre s 10.0 bases cada uno, mientras que en
el centro de la partcula, la separacin de los sitios
entre S4 y S10 es de 10.7 bases (este anlisis trata
con posiciones promedio, de manera que los sitios
no necesariamente estn separados por un nmero
entero de bases).
La variacin en la periodicidad del corte en el
DNA medular (10.0 en los extremos, 10.7 a la mi-
tad) significa que su periodicidad estructural difiere.
El DNA tiene ms bp/giro que la cifra correspon-
diente en solucin en la parte media, pero menos
bp/giro en los extremos. La periodicidad promedio
sobre el nucleosoma es de slo 10.17 bp/giro, sig-
nificativamente menor que la de 10.5 bp/giro del
DNA en solucin.
La estructura cristalina de la partcula medular
sugiere que el DNA se organiza en una superhlice
plana de 1.65 giros en torno al octmero de histo-
nas. El grado de inclinacin de la superhlice vara,
El DNA nucleosmico tiene dos giros
Vista lateral Vista superior
S4S5 -2
-6
-
3
36
-
o + 1
1
+4
vi?
TU
S .
3
+2
+2 -
3
Dos esquemas de numeracin dividen el DNA de
la partcula medular en segmentos de 10 bp. Los sitios pueden
numerarse de Si a S13 a partir de un extremo, o tomando S7
para identificar la coordenada 0 de la simetra doble, que puede
numerarse de -7 a +7.
desoxirribonucleasa I
Sitios expuestos a la desoxirribonucleasa
Las posiciones ms expuestas del DNA se pre-
sentan con una periodicidad que refleja la estructura de la
doble hlice. (Para mayor claridad se muestran los sitios de
slo una cadena.)
en enlaces agrupados
P
S13
S12
S10
S9
S7
S5
S4
El anlisis de alta resolucin muestra que cada
sitio de la desoxirribonucleasa I consta de varios enlaces fos-
fodister adyacentes, susceptibles, segn se observa en este
ejemplo de sitios S4 y S5 analizados en partculas medulares
con marca en los extremos. Imagen cortesa de Leonard C.
Lutter, Henry Ford Hospital, Detroit, MI.
29.5 La estructura del DNA vara en la superficie del nucleosoma 765
y en la parte media es discontinuo. Las regiones de
gran curvatura se disponen de manera simtrica en
las posiciones 1 y 4, que corresponden a S6 y S8,
S3 y Sil respectivamente, y son los sitios menos
sensibles a la desoxirribonucleasa I.
Una estructura de alta resolucin del centro del
nucleosoma muestra en detalle cmo se distorsiona
la estructura del DNA. Gran parte del superenrolla-
do ocurre en los 129 bp centrales, que hacen 1.59
giros superhelicoidales izquierdos con un dimetro
de 80 (slo cuatro veces el dimetro de la cadena
dicatenaria del DNA). Las secuencias terminales de
cualquier extremo hacen slo una pequea contri-
bucin a la curvatura general,
Estos 129 bp centrales se encuentran en forma
de DNA-B, pero con una curvatura sustancial, nece-
saria para formar la superhlice. El surco mayor se
dobla suavemente, pero el menor tiene ensortijados
abruptos, cambios de conformacin que explican
porqu la parte central del DNA del nucleosoma no
suele ser diana para la unin de protenas regula-
doras, que suelen unirse a las partes terminales del
DNA central o a las secuencias de enlace,
Rin La periodicidad del DNA
cambia en el nucleosoma
Concepto principa
.
Con el cambio en bp por giro se absorben ~0.6 giros
negativos del DNA, de 10.5 en solucin a un promedio
de 10.2 en la superficie del nucleosoma, lo cual explica
la paradoja del nmero de enlaces.
La comprensin de la estructura del DNA nucleos-
mico tiene lugar cuando se comparan los pronsticos
para el superenrollado de la va que sigue el DNA
con las mediciones reales del superenrollado del
DNA nucleosmico. Gran parte de los trabajos sobre
la estructura de los conjuntos de nucleosomas se ha
hecho en el virus SV40, cuyo DNA es una molcula
circular de 5 200 bp con una longitud de contorno
de ~1 500 nm. Tanto en el virin como en el ncleo
infectado se empaqueta una serie de nucleosomas,
que juntos se denominan minicromosoma,
Como se aisla normalmente, la longitud del
contorno del minicromosoma es de -210 nm, que
corresponde a una razn de empaquetado de ~7
(esencialmente la misma que la de ~6 del nucleo-
soma mismo). Los cambios en la concentracin de
sales pueden convertirlo en un Mo de cuentas flexi-
ble, con una proporcin mucho menor de empa-
quetado general, lo cual subraya el punto de que,
in vitro, las tiras de nucleosomas pueden asumir ms
de una forma, dependiendo de las condiciones.
El grado de superenrollamiento de los nuc.
somas individuales del minicromosoma se p\w
medir como se ilustra en la . En priiD
trmino, las superhlices libres del minicromosr r
mismo estn relajadas, de manera que los ncleos
mas forman una cuerda circular con una densic
superhelicoidal de 0. A continuacin se extraer I
octmeros de histonas, con lo cual se libera al DB
para que siga una va libre. Las superhlices
estaban comprimidas en el minicromosoma apa
cern en el DNA desproteinado como -1 giro, J
se puede medir el nmero total de superhlice?
el DNA de SV40.
La cifra observada se aproxima al nmerc
nucleosomas; el resultado ser inverso cuan
los nucleosomas se ensamblan in vitro en un L
.
de SV40 superenrollado, pues la formacin de c;
nucleosoma elimina ~1 superhlice negativa.
As pues, el DNA sigue una va en la superfi
del nucleosoma que genera ~1 giro de superh".
negativo cuando se elimina la protena de res::
cin, si bien la va que sigue el DNA correspcr
a -1.67 giros de superhlice (vase la Fig. 29 -
discrepancia que a veces se denomina paradoja ;
nmero de enlace.
La discrepancia se explica por la diferencia er
-
las 10.17 bp/giro promedio del DNA nucleosir
Los cromosomas do SV40 estn superemollados
Minicromosoma superenrollado
OCO
I Tratamiento con
\f topoisomerasa
Minicromosoma
relajado
Eliminacin de protenas
DNA superenrollado
Las superhlices del. minicromosoma de SV-i
pueden relajar para generar una estructura circular cuya ptf
de histonas genera entonces superhlices en el DNA libre.
CAPlTlQ 29 Nucleosomas
i las 10.5 bp/giro del DNA libre. En un nucleoso-
;
na de 200 bp se tienen 200/10.17 = 19.67 giros.
Cuando el DNA se libere del nucleosoma, tendr
200/10.5 = 19.0 giros. La va del DNA en que el
enrollado es menos compacto, sobre el nucleosoma,
absorbe -0.67 giros, lo cual explica la discrepancia
entre la va fsica de -1.67 y la medicin de -1.0
giros superhelicoidales. De hecho, algo de la tensin
por torsin en el DNA de los nucleosomas depende
del aumento del nmero de bp/giro; slo queda el
resto para medirse como superhlice.
EO Organizacin del octmero
de histonas
Conceptos principales
.
El meollo del octmero de histonas est constituido por
un tetrmero, H3
2
-H4
2
vinculado con dos dmeros
H2A-H2B.
.
Cada histona presenta interdigitacin intensa con su
contraparte.
.
Todas las histonas medulares tienen el segmento
estructural de pliegue. Las colas terminales N salen del
nucleosoma.
Hasta ahora se ha analizado la estructura del nu-
cleosoma desde la perspectiva de su organizacin en
el DNA de la superficie, pero desde la perspectiva de
las protenas, se necesita saber cmo interactan las
histonas entre s y con el DNA. Reaccionan apro-
piadamente slo en presencia de DNA o poseen una
capacidad independiente para formar octmeros?
La mayor parte de las pruebas acerca de las interac-
ciones histona-histona provienen de su capacidad
para formar complejos estables y de experimentos
de enlace cruzado con el nucleosoma.
Las histonas medulares forman dos tipos de
complejos; H3 y H4 forman un tetrmero (H3
2
-H4
2
),
H2A y H2B forman varios complejos, en particular
un dmero (H2A-H2B).
Se puede obtener octmeros de histonas nte-
gros por extraccin de la cromatina o (ms difcil-
mente), al permitir que las histonas se vinculen in
vitro
,
en condiciones de concentracin alta de sales
y protenas. El octmero suele disociarse para ge-
nerar un hexmero de histonas que ha perdido un
dmero H2A-H2B, en tanto que el otro se pierde
separadamente en ese punto, con lo que queda un
tetrmero H3
2
-H4
2,
fenmeno que apunta a una
forma de organizacin en que el nucleosoma tiene
un
"
meollo
"
central constituido por el tetrmero
H3
2
-H4
2
; in vitro, este tetrmero puede organizar al
DNA en partculas que muestran algunas de las pro-
piedades de la partcula medular.
El nucleosoma tiene pares de histonas
H4
H3
H2B
H2A
H3
H4
En un modelo simtrico del nucleosoma, el
tetrmero H3
2
-H4
2
constituye el centro de La estructura. En
la parte superior se observa un dmero H2A-H2B; el otro est
debajo.
Los estudios mediante enlaces cruzados amplan
esas relaciones para mostrar qu pares de histonas
estn cerca uno del otro en el nucleosoma. (Un pro-
blema con dicha informacin suele ser que slo un
pequeo porcentaje de las protenas tiene enlaces
cruzados, de modo que es necesario ser cauto al
decidir si los resultados tipifican a las principales in-
teracciones.) A partir de esos datos, se ha construido
un modelo de la organizacin del nucleosoma,
es-
quematizado en la PIGU
Mediante estudios estructurales se ha mostra-
do que la forma global del octmero de histonas es
similar a la de la partcula medular, lo cual sugiere
que las interacciones histona-histona establecen la
estructura general. Las posiciones de cada una de
ellas han sido asignadas a regiones de estructura
octamrica con base en su comportamiento al nter-
actuar y en respuesta a enlaces cruzados,
La estructura cristalina (con una resolucin de
3.1 ) sugiere el modelo que se muestra en la
para el octmero de histonas. El rastreo de
las vas de las columnas polipeptdicas individuales
de la estructura cristalina sugiere que las histonas
no slo se organizan como protenas globulares in-
dividuales, sino que cada una se interdigita con su
contraparte, H3 con H4 y H2A con H2B. As,
en el
modelo se distingue el tetrmero H3
2
-H4
2
(blanco)
de los dmeros H2A-H2B (azules), pero no se mues-
tran las histonas aisladamente.
En la parte superior se representa la misma
perspectiva esquemtica de la Figura 29.17. El te-
trmero H3
2
-H4
2
contribuye al dimetro del oct-
mero y asume la forma de una herradura. Los pares
H2A-H2B se acoplan como dos dmeros, pero en
esa imagen slo se observar uno. La vista lateral
representa la misma perspectiva de la Figura 29.4,
en la cual se distingue la participacin del tetrme-
'
Organizacin del octmero de histonas
El DNA gira dos veces en tomo al octmero de histonas
Modelo tridimensional de la estructura cris-
talina del octmero de histonas, con el tetrmero H3
2
-H4
2
en
blanco y los dimeros H2A-H2B en azul. Slo uno de los dmeros
HsA-H2B es visible en la imagen superior, el otro est escon-
dido debajo. La va potencial del DNA se muestra en la parte
superior como un tubo estrecho (de una cuarta parte del di-
metro del DNA); en la vista lateral son las lneas paralelas de un
haz de 20 de ancho. Imagen cortesa de E. N. Moudrianakis,
Johns Hopkins University.
ro H3
2
-H4
2
y de los dmeros H2A-H2B separados.
La protena forma un tipo de carrete, con una va
superhelicoidal que podra corresponder al sitio de
unin del DNA, enrollado casi 2 giros completos
en un nucleosoma. El modelo muestra una doble
simetra en torno a un eje que correra en forma
perpendicular en la vista lateral.
En la FIGURA se resume una vista ms de-
tallada de las posiciones de las histonas (con base
en una estructura cristalina a 2.8 ). La imagen
superior muestra la posicin de una histona de cada
tipo respecto de un giro en torno a un nucleosoma
(numeradas de 0 a +7). Las cuatro histonas me-
dulares muestran un tipo similar de estructura, en
que 3 a hlices se conectan con dos asas, a lo que
se le llama pliegue de histonas. Las regiones in-
teractan para formar heterodmeros con forma de
lnula; cada uno se une a 2.5 giros de la hlice doble
El nucleosoma tiene simetra doble
Los pares de histonas forman una "mitad de
nucleosoma"
+7 - 0
H2
V
H3
y
'
H4 i
+
+6
H2A
+5 >
H2B
<
A-4
La superposicin de los pares de histonas
muestra organizacin simtrica
5?
\ \ \
H2A H2B H3 H4
Las posiciones de las histonas en una rrs
desde arriba muestran los pares H3-H4 y H2A-H2B en una mitac
de nucleosoma; en la imagen inferior se percibe la organizar:
simtrica por la superposicin de ambas mitades.
de DNA (H2A-H2B se une a +3.5 - +6; H3-H4 .;
une a +0.5 - +3 en la circunferencia que se ilustra
La unin ocurre en gran parte de la columna
enlaces fosfodister (compatible con la necesioa.
de compactar cualquier DNA, independientemente :
su secuencia). El tetrmero H3
2
-H4
2
se forma r -
interacciones entre las dos subunidades H3, cor.:.
puede observarse en la parte inferior de la figur;
Cada una de las histonas medulares tiene ._:
cuerpo globular que contribuye a la masa proten:;:
centra! del nucleosoma, adems de una cola ter:~ .
nal N flexible con sitios para modificacin, que r.: -
den ser importantes para la funcin de la cromatina.
La posicin de las colas, que contribuyen con cas .
768 CAPTULO 29 Nucleosomas
Las estructuras de las colas de histonas
no han sido definidas
La cromatna es una cadena de nucleosom
H4
H3
H2B
H2A
H3
N
FIGURA 29.20 Los cuerpos globulares de las histonas se lo-
calizan en el octmero de la partcula medular. No obstante, se
desconoce la localizacin de las colas terminales N, que portan
los sitios para modificacin, que podran ser ms flexibles.
Las colas de histonas emergen
entre giros del DNA
1
FIGI Las colas terminales N de las histonas estn
desordenadas y salen del nucleosoma entre giros del DNA.
25% de la masa protenica, no est tan bien defini-
da, como se indica en la 20. No obstante,
Las colas de H3 y H2B se pueden observar pasando
entre giros de la superhlice de DNA y extendin-
dose fuera del nucleosoma, como se muestra en la
.
Cuando las colas de histonas se entre-
cruzan con el DNA por irradiacin UV, se obtienen
ms productos con nucleosomas que con partculas
medulares, lo cual podra significar que las colas en-
tran en contacto con el DNA de enlace. La cola de
H4 parece hacer contacto con un dmero H2A-H2B
de un nucleosoma adyacente, que podra ser una
caracterstica importante en la estructura global.
La fibra de 10 nm est parcialmente desen-
rollada; se observa que est constituida por una cadena de
nucleosomas. Imagen cortesa de Barbara Hamkalo, University
of California, Irvine.
La va de Los nucleosomas
en la fibra de cromatina
Conceptos principales
Las fibras de cromatina de 10 nm se despliegan a
partir de fibras de 30 nm y constan de una cadena de
nucleosomas.
Las fibras de 30 nm tienen seis nucleosomas por giro
organizados en un solenoide,
La histona Hl es necesaria para la formacin de la fibra
de 30 nm.
Cuando se revisa la cromatina bajo el microscopio
electrnico, se observan dos tipos de fibras, de 10 y
30 nm, descritas por su dimetro aproximado (que
en la fibra de 30 nm en realidad flucta entre -2 5
y 30 nm).
La fibra de LO nm es esencialmente una cuer-
da continua de nucleosomas que, de hecho, en oca-
siones transcurre de forma continua por una regin
ms distendida en que se observan los nucleoso-
mas como un hilo de cuentas, segn se indica en el
ejemplo de la FIGURA !2. La estructura fibrilar de
10 nm se obtiene en condiciones de escasa fortaleza
inica y no requiere de la presencia de la histona
Hl, lo cual significa que, estrictamente, es una fun-
cin de los nucleosomas mismos, que en esencia
puede ser observada como una serie continua de
nucleosomas, como se muestra en la jURA
No se sabe si tal estructura existe in vivo o es simple-
mente una consecuencia de su despliegue durante
la extraccin in vitro.
Cuando se visualiza la cromatina en condicio-
nes de mayor fortaleza inica, se obtiene la fibra de
29.8 La va de los nucleosomas en la fibra de cromatina 759
La fibra de 10 nm est formada por nucleosomas
La fibra de 30 nm es un doble solenoide
nucleosomas.
La fibra de 10 nm es una cadena continua de
La fibra de 30 nm es un asa enrollada
La estructura de la fibra de 30 nm est enrolla-
da. Imagen cortesa de Barbara Hamkalo, University California,
Irvine.
:50 nm. como en la
,
en la cual se mues-
tra que la fibra tiene una estructura enrollada sub-
yacente; presenta ~6 nucleosomas por giro, es decir,
una razn de empaquetado de 40 (esto es, en cada
)jm del eje de la bra estn contenidos 40 ]im de
DNA); en este caso s se requiere la presencia de Hl.
Esta bra es el constituyente fundamental de la cro-
matina de interfase y los cromosomas en mitosis.
La disposicin ms probable para el empaqueta-
do de los nucleosomas en la fibra es la de un solenoi-
de, en el que los nucleosomas giran con una trayec-
toria helicoidal y se enrollan en torno a una cavidad
1
h
La fibra de 30 nm es un listn helicoidal cons-
tituido por dos hileras paralelas de nucleosomas enrollados e*
un solenoide.
central. Las dos formas principales de un solenoide
son un solo inicio, que forma un arreglo lineal nico,
y dos inicios, en que efectivamente hay una doble
hilera de nucleosomas. La muestra un
modelo de dos inicios, sugerido por datos recientes
de enlaces cruzados mediante los cuales se identifict'
una doble pila de nucleosomas en la fibra de 30 nm;
esto es sustentado por la estructura cristalina de un
complejo tetranucleosmico.
Las fibras de 30 y 10 nm pueden convertirse de
manera reversible merced a cambios en la fortaleza
inica, lo cual sugiere que la disposicin lineal de
los nucleosomas de la fibra de 10 nm desaparece
al enrollarse dentro de la estructura de 30 nm en
condiciones de mayor fortaleza inica y en presen-
cia de Hl.
Si bien la presencia de esta ltima es necesaria
para la formacin de la fibra de 30 nm, la infor-
macin acerca de su localizacin es controvertida.
La relativa facilidad con que se extrae la cromatina
parece apuntar en el sentido de que se encuentra en
la parte externa del eje de la fibra superhelicoida!.
No obstante, mediante datos de difraccin y por el
hecho de que es ms difcil encontrarla en fibras
de 30 nm que en las de 10 nm que la retienen, se
argumenta respecto de una localizacin interna.
Cmo se pasa de la fibra de 30 nm a las estruc-
turas especficas que se muestran en los cromoso-
mas mitticos? Hay alguna especificidad adiciona!
en la disposicin de la cromatina de interfase? Tie-
nen las regiones particulares de fibras de 30 nm un?.
relacin fija entre s o su disposicin es aleatoria?
77.0 CAPTULO 29 Nucleosomas
La replicacin de La cromatina
requiere del ensamblaje
de los nucleosomas
CDnceptos principales
Los octmeros de [as histonas no se conservan durante
la replicacin, a diferencia de los dimeros H2A-H2B y
los tetrmeros H3
2
-H4
2
.
Hay diferentes vas para el ensamblaje de
los nucleosomas durante la replicacin e
independientemente de sta.
Para eliminar al ensamblaje de los nucleosomas, se
requieren protenas accesorias.
El CAF-1 es una protena de ensamblaje que se vincula
con la subunidad PCNA del replicosoma; es necesaria
para el depsito de los tetrmeros H32-H42 despus de
la replicacin.
Para el ensamblaje independiente de la replicacin se
puede usar una protena de ensamblaje diferente y una
variable de la histona H3.
En la replicacin del DNA se separan sus cadenas y,
por tanto, debe alterarse inevitablemente la estruc-
tura del nucleosoma. La transitoriedad del suceso de
replicacin constituye un problema importante para
el anlisis de una estructura en particular durante
dicho proceso. La estructura del triplete de replica-
cin es caracterstica; es ms resistente a la nucleasa
He micrococos y es digerida en bandas que difieren
de tamao respecto del DNA del nucleosoma. La re-
gin que muestra esa estructura alterada se confina
b la vecindad inmediata del triplete de replicacin,
lo cual sugiere la participacin de un gran comple-
jo protenico, pero los nucleosomas se vuelven a
formar ms o menos inmediatamente detrs de l,
conforme se traslada.
La replicacin de la cromatina no implica nin-
gn periodo prolongado durante el cual el DNA ca-
rezca de histonas, una vez que se ha replicado, los
iucleosomas se regeneran rpidamente en ambos
productos de la replicacin. Este punto se ilustra
mediante la micrografa electrnica de la F
29.26, que muestra una cadena de DNA con replica-
cin reciente, ya empaquetada en los nucleosomas
de ambos segmentos de las cadenas dobles hijas.
As pues, tanto el anlisis bioqumico como la
visualizacin del triplete de replicacin sugieren que
la alteracin de la estructura del nucleosoma se limi-
ta a una regin corta, inmediata al triplete, el cual,
al avanzar, desintegra los nucleosomas, pero stos
Be forman otra vez rpidamente en las cadenas do-
fcles hijas, conforme el triplete avanza. De hecho, el
[
ensamblaje de los nucleosomas tiene enlace directo
pon el replisoma, que est replicando el DNA.
Los nucleosomas vuelven a formar
despus de la repl
No replicado
Replicado
No replicado
I
i El DNA replicado se incorpora de inmediato a
los nucleosomas. Imagen cortesa de Steven L. McKnight, UT
Southwestern Medical Center at Dallas.
Cmo se relacionan las histonas con el DNA
para generar nucleosomas? Las histonas forman
previamente un octmero de protenas alrededor del
cual el DNA forma despus una cubierta, o se en-
sambla el octmero de histonas sobre el DNA a partir
de histonas libres? La Fl !7 muestra que para
el ensamblaje de los nucleosomas se pueden usar
dos vas in vitro, dependiendo de las condiciones.
En una de ellas, un octmero preformado se une al
DNA, y en la otra, primero se une un tetrmero de
H3
2
-H4
2
y despus se unen dos dimeros H2A-H2B.
Ambas vas tienen relacin con reacciones in vivo.
La primera refleja la capacidad de la cromatina de
remodelarse por movimientos de los octmeros de
histonas a lo largo del DNA (vase la seccin 30.3,
El remodelado de la cromatina es un proceso ac-
tivo). La segunda representa la va utilizada en la
replicacin.
Las protenas accesorias ayudan a las histonas
en su vinculacin con el DNA. Los candidatos para
esa funcin se pueden identificar mediante extrac-
tos que ensamblan histonas y DNA exgeno en los
nucleosomas. Las protenas accesorias pueden ac-
tuar como "chaperones moleculares", que se unen
a las histonas para liberar controladamente histo-
nas o complejos de histonas (H3
2
-H4
2
o H2A-H2B)
hacia el DNA; esto podra ser necesario porque las
histonas, como protenas bsicas, tienen una ele-
vada afinidad general por el DNA. Las interacciones
mencionadas permiten a las histonas formar nucleosomas
sin ser atrapadas en otros intermediarios cinticos (esto es,
otros complejos que resultan de la unin homognea de
las histonas al DNA).
Los intentos de producir nucleosomas in vitro
empiezan con el anlisis de un proceso de ensam-
blaje entre el DNA libre y las histonas, si bien in vivo,
los nucleosomas se forman slo cuando el DNA se
29,9 La replicacin de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas 771
Los octmeros de histonas
pretor
El octmero se El octmero
ensambla sobre el DNA preformado se une
H4 H3
Meollo H3-H4
m
,
H4
H3
H2B H2A
H4
H3
H2A-H2B (debajo)
H2A-H2B
'
arriba)
In vitro, el DNA puede interactuar directamen-
te en un octmero de histona ntegro (en enlace cruzado), o
bien ensamblarse con el tetrmero H3
2
-H4
2,
despus de lo cual
se agregan dos dmeros H2A-H2B.
replica. Se ha perfeccionado un sistema que simula
ese requisito con extractos de clulas humanas que
replican el DNA de SV40 y ensamblan los productos
en la cromatina. La reaccin de ensamblaje ocurre
preferentemente en el DNA en proceso de replica-
cin, para lo cual se requiere un factor auxiliar, el
factor de ensamblaje de la cromatina (CAF)-l, que
consta de >5 subunidades con una masa total de
238 kD. El antgeno nuclear de clulas en prolife-
racin (PCNA), factor de progreso de la polimerasa
de DNA, recluta al CAF-1 para el triplete de replica-
cin; con esto se logra el enlace entre la replicacin
y el ensamblaje de nucleosomas, de modo de ase-
gurar que los nucleosomas se ensamblen tan pronto
como el DNA se haya replicado.
El CAF-1 acta de manera estequiomtrica y
por unin con H3 y H4 recin sintetizadas, lo cual
sugiere que se forman nuevos nucleosomas, pri-
mero por ensamblaje del tetrmero H3
2
-H4
2
y por
la adicin posterior de los dmeros H2A-H2B. Los
nucleosomas que se forman in vitro tienen una lon-
gitud de repeticin de 200 bp, pero carecen de his-
Se conservan los octmeros de histonas?
La conservacin del octmero pronostica
que los nucleosomas contienen exclusivamente
histonas antiguas o nuevas
Octmero nuevo
Octmero antiguo
conservado
Enlaces cruzados de histonas, extraccin
de octmeros y anlisis de la densidad
Octmero
antiguo
Octmero
nuevo
Pesado
Ligero
J Si se conservaran los octmeros de histc
los octmeros antiguos y nuevos tendran bandas de difere"
densidades al ocurrir la replicacin de los octmeros pes=:
en los aminocidos ligeros.
tonas Hl, lo cual sugiere que sin Hl se puede logr
el espaciamiento apropiado.
Cuando se replica la cromatina, se replica un
cadena de DNAya vinculada con nucleosomas, lo cual
da origen a dos cadenas hijas dobles. Qu pasa coi
los nucleosomas preexistentes en ese punto? L
octmeros se disocian de histonas en histonas B
bres para ser utilizadas de nuevo, o se manden
ensamblados? La integridad del octmero se puede
estudiar por los enlaces cruzados de las histonas. E
las siguientes dos figuras se comparan los posibles
resultados de un experimento en que se cultiva
clulas en presencia de aminocidos pesados pan
identificar las histonas antes de la replicacin; des-
pus se permite que ocurra la replicacin en prsam-
ela de aminocidos ligeros. En ese punto, los c
meros de histona presentan enlaces cruzados y -
centrifugan en un gradiente de densidad. La FM
-
8 muestra que si se han conservado los octme-
ros originales, se encontrarn en una posicin d
alta densidad, de modo que los nuevos ocupara
la posicin de baja densidad. Pero esto no llega J
ocurrir. En la posicin de alta densidad se encuenoa
poco material, lo cual sugiere que los octmeros d
772 CAPTULO 29 Nucleosomas
Los octmeros de hstonas vuelven a ensamblarse
Historias antiguas
Histonas recin
sintetizadas
Desensamblado y reensamblado pronostican que
los nucleosomas contienen tanto histonas antiguas
como nuevas, ya sea preensambladas de manera
sistemtica o aleatoriamente
Disposicin aleatoria H3 y H4 antiguas,
H2A y H2B nuevas
Enlaces cruzados de histonas, extraccin de
octmeros y anlisis de la densidad
ctmeros reensamblados
Pesado
Ligero
FIGURA 29. Cuando Los octmeros pesados se replican con
aminocidos ligeros, los nuevos octmeros presentan bandas
difusas entre densidades pesadas y ligeras, lo cual sugiere que
ha habido desensamblado y reensamblado.
histonas no se conservan. Los octmeros tienen una
densidad intermedia, y en la FIGURA 29.29 se mues-
tra lo que sera el resultado esperado si se hubieran
liberado las histonas antiguas y despus reensam-
blado con histonas recin sintetizadas.
El patrn de desensamblado y reensamblado
ha sido difcil de caracterizar en detalle, pero en
la FIGURA se muestra un modelo funcional.
El triplete de replicacin desplaza a los octmeros
de histonas, que despus se disocian en tetrme-
ros H3
2
-H4
2
y dmeros H2A-H2B. Esos tetrmeros
y dmeros
"
antiguos
"
entran a un fondo de reserva
que tambin incluye
"
nuevos
"
tetrmeros y dmeros
que se ensamblan a partir de histonas de recien-
Los octmeros de hstonas se desensamblan
se vuelven a formar detrs del triplete
1. El triplete de
replicacin avanza
hacia el nucieosoma
Siguiente
nucieosoma
Triplete de
replicacin
El tetrmero de
histonas es
desplazado y
se desensambla
las histonas recin
sintetizadas se
ensamblan
Tetrmeros
H3-H4
Dmeros LjLJ
H2A-H2B
re

Sntesis durante
la fase S
3,
Los tetrmeros H3-H4 se unen
a cadenas dobles hijas
CAF
s
4. Los dmeros H2A-H2B
se unen
El paso del triplete de replicacin desplaza los oct-
meros de histonas del DNA, que se desensamblan en tetrmeros H3-
H4 y dmeros H2A-H2B. Las histonas recin sintetizadas se ensamblan
en tetrmeros H3-H4 y dmeros H2A-H2B. Los tetrmeros y dmeros
antiguos y nuevos se ensamblan de manera aleatoria con ayuda de
CAF-1 en nuevos nucleosomas, inmediatamente detrs del triplete
de replicacin.
te sntesis. Los nucleosomas se ensamblan a -600
bp detrs del triplete de replicacin, proceso que
se inicia cuando los tetrmeros H3
2
-H4
2
se unen a
cada una de las cadenas dobles hijas, ayudados por
CAF-1. Dos dmeros H2A-H2B se unen entonces a
cada tetrmero H3
2
-H4
2
para completar el octmero
de histonas. El ensamblaje de tetrmeros y dmeros
es aleatorio respecto de subunidades
"
antiguas
"
y
"
nuevas
"
, lo cual explica los resultados de la Figura
29.29. El tetrmero H3
2
-H4
2
"
antiguo
"
podra ser
un vnculo transitorio con una cadena simple de
DNA durante la replicacin; de hecho, tal vez ten-
dra ms probabilidades de mantenerse dentro de
la cadena lder para su reutilizacin. Es posible que
los nucleosomas se escindan y vuelvan a ensamblar
de forma similar durante la transcripcin (vase la
29.9 La repLicacin de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas
773
seccin 29.11, Los genes transcritos se organizan
en nucleosomas?).
Durante la fase S (periodo de replicacion del
DNA) en un ciclo celular eucaritico, la replicacion
de la cromatina implica la sntesis de suficientes pro-
tenas histonas como para empaquetar todo el geno-
ma, bsicamente debe sintetizarse la misma cantidad
de histonas que las ya contenidas en los nucleoso-
mas. La sntesis de RNAm de histonas es controlada
como parte del ciclo celular y aumenta enormemente
en la fase S. La va para el ensamblaje de la croma-
tina a partir de esa mezcla equivalente de histonas
antiguas y nuevas durante la fase S se le denomina
va de replicacion acoplada (RC).
En otra va, llamada va independiente de las
replicaciones (RI), se ensamblan nucleosomas du-
rante otras fases del ciclo celular, cuando no se est
sintetizando DNA. Esto resultara necesario como
resultado de daos en el DNA o porque los nu-
cleosomas se desplazan durante la transcripcin. El
proceso de ensamblaje debe tener necesariamente
algunas diferencias respecto de la va acoplada a la
replicacin porque no puede vincularse con el apa-
rato respectivo. Una de las caractersticas ms inte-
resantes de la va independiente de la replicacin
es que utiliza variantes de algunas de las histonas
diferentes de las utilizadas durante la replicacin.
La variante de histona H3.3 difiere de la his-
tona H3 altamente conservada en cuatro amino-
cidos; la primera sustituye lentamente a la H3 en
clulas en proceso de diferenciacin que no tienen
ciclos de replicacin. Esto sucede como resultado
del ensamblaje de nuevos octmeros de histonas
para sustituir a los que han sido desplazados con
el DNA por cualquier motivo. El mecanismo que
se utiliza para asegurar el uso de H3.3 en la va
independiente de la replicacin es diferente en dos
casos investigados,
En los protozoarios del gnero Tetrahymena el uso
de histonas depende exclusivamente de su disponi-
bilidad. La histona H3 se sintetiza slo durante el ci-
clo celular, en tanto que la variante de reposicin se
sintetiza slo en clulas sin replicacin. En el gnero
Drosophila, sin embargo, hay una va activa que ase-
gura la utizacin de H3.3 por la va independiente
de la replicacin. Nuevos nucleosomas que contienen
H3.3 se ensamblan en los sitios de transcripcin, su-
puestamente sustituyendo a nucleosomas desplazados
por la polimerasa de RNA. El proceso de ensamblaje
discrimina entre H3 y H3.3 con base en sus secuen-
cias, excluyendo espeaficamente la utilizacin de H3.
Por el contrario, el ensamblaje acoplado a la replica-
cin hace uso de ambos tipos de H (aunque H3.3 est
disponible en concentraciones mucho menores que
H3, y, por tanto, entra slo a un pequeo porcentaje
de los nucleosomas).
Probablemente el CAF1 no participa en e! .
samblaje independiente de la replicacin. (Tamh
hay organismos como las levaduras y los del gner
Arabidopsis, para los cuales el gen no es indisper::
ble, lo cual implica el uso de procesos alternativo
en el ensamblaje acoplado a la replicacin.) 0
protena que puede participar en el ensamblaje
dependiente de la replicacin se denomina HI? -
cuyo agotamiento en sistemas in vitro para e! 7-
samblaje de nucleosomas inhibe la formacin
nucleosomas en el DNA no replicado, pero nP a
el que est en proceso de replicacin, lo cual indi
que, de hecho, las vas utilizan diferentes meci-
mos de ensamblaje. La H1RA acta como chaper1
para facilitar la incorporacin de histonas en I
nucleosomas, va que supuestamente se encar:;
en general, del ensamblaje independiente de la 11
plicacin; por ejemplo, es necesaria para la deseos-
densacin del ncleo del espermatozoide, cuan;
las protaminas son sustituidas por las histonas r ;
generar cromatina competente en la replicac.
despus de la fecundacin.
El ensamblaje de los nucleosomas que cor: t
nen una alternativa de H3 tambin ocurre en
centrmeros (vase la seccin 31.3, La heteroc:
matina depende de las interacciones con histonas
El DNA centromrico se replica tempraname;-
durante la fase de replicacin del ciclo celular
diferencia de las secuencias heterocromticas tir
cndanles, que se replican despus; vase la se:
cin 15.7, Cada cromosoma eucaritico contier;
muchos replicones). Se inhibe la incorporacin d
H en los centrmeros y en su lugar, en las clllh
eucariotas superiores, se incorpora una prote;-
llamada CENP-A (en el gnero Drosophila se Uam
Cid y en las levaduras Cse4). Esto ocurre en la v
de ensamblaje independiente de la replicacin i
parecer porque la va acoplada a la replicacin a
inhibe durante un lapso breve, mientras se repHc
el DNA centromrico.
gjg L05 nucleo.soma.s yacen
en posiciones especficas?
Conceptos principales
.
Los nucleosomas pueden formarse en posiciones
especficas como resultado de la estructura local del
DNA o de las protenas que interactan con secuencias
especficas.
.
La causa ms frecuente de la posicin del nucleosoma
es el lmite impuesto por las protenas que se unen al
DNA.
.
El posidonamiento influye en qu regiones del DNA
quedan en el enlace y qu cara del DNA se expone a la
superficie del nucleosoma.
774 CAPTULO 29 Nucleosomas
Se sabe que los nucleosomas pueden reconstituir-
se in vitro, independientemente de la secuencia del
DNA, pero esto no significa que su formacin in
vivo sea as. Yace siempre una secuencia de DNA
en particular en cierta posicin in vivo respecto de la
topografa del nucleosoma, o estn los nucleosomas
dispuestos en forma aleatoria en el DNA, de mane-
ra que una secuencia especfica pueda presentarse
en cualquier localizacin, por ejemplo, en la regin
medular en una copia del genoma y en la regin de
enlace en otra?
Para responder a esta interrogante es necesario
usar una frecuencia definida de DNA, ms precisa-
mente, se tiene que determinar la posicin de un
punto definido del DNA respecto del nucleosoma.
En la se ilustra el principio de un pro-
cedimiento para lograrlo.
Supngase que la secuencia de DNA se organiza
en nucleosomas slo con cierta configuracin, de
manera que cada sitio del DNA siempre se localice
en una posicin particular del nucleosoma. Ese tipo
de organizacin se llama posicionamiento del
nucleosoma (o, a veces, fases del nucleosoma). En
una serie de nucleosomas en posicin, las regiones
del DNA de enlace constituyen sitios nicos.
Considrese la secuencia nada ms para un nu-
cleosoma. La escisin con nucleasa de micrococos
genera un fragmento monomrico que constituye
una secuencia especfica. Si el DNA se aisla y escin-
de con una enzima de restriccin que tiene slo
un sitio diana en ese fragmento, podra cortarse en un
punto nico, lo cual resultara en dos fragmentos,
cada uno de tamao nico.
Los productos de la doble digestin, por enzi-
mas de restriccin y microccica, se separan por
electroforesis en gel. Para identificar el fragmento
correspondiente en el producto de la doble diges-
tin, se usa una sonda que representa la secuencia
de un lado del sitio de restriccin, tcnica llamada
de marcado terminal indirecto.
Revirtiendo el argumento, la identificacin de
una sola banda demuestra que la posicin del sitio
de restriccin tiene definicin exclusiva respecto del
extremo del DNA del nucleosoma (segn se define
por el corte de la nucleasa microccica). As, el nu-
cleosoma tiene una secuencia de DNA nica.
Qu pasa si los nucleosomas no yacen en una
sola posicin? Ahora, los DNA de enlace constan de
diferentes secuencias en cada copia del genoma, de
modo que el sitio de restriccin yace en una po-
sicin diferente cada vez; de hecho, se encuentra
en todas las localizaciones posibles respecto de los
extremos del DNA nucleosmico monomrico. La
2 muestra que la doble escisin genera
entonces una amplia extensin, del fragmento ms
Fragmentos bien definidos identifican el posicionamiento
El posicionamiento ubica la secuencia diana (roja) en
una ubicacin exclusiva

i
VL \k
La nucleasa de micrococos libera monmeros
lili
wwv. iL
i
La enzima de restriccin corta en la secuencia diana
El fragmento tiene un corte de restriccin en un extremo,
un corte microccico en el otro extremo; la electroforesis
resulta en una banda nica
El posicionamiento del nucleosoma coloca si-
tios de restriccin en ubicaciones nicas respecto de los sitios
de enlace escindidos por la nucleasa de micrococos.
pequeo detectable (casi 20 bases) a la longitud del
DNA monomrico.
Al describir esos experimentos se ha tratado a
la nucleasa de micrococos como una enzima que
escinde el DNA en las regiones de enlace expues-
tas sin ningn tipo de especificidad de secuencia.
En realidad, la enzima tiene la misma especificidad
de secuencia, no obstante que se desva hacia la
seleccin de secuencias ricas en A-T. Por tanto, no
es posible suponer que la existencia de una banda
especfica en la tcnica de marcado indirecto del
extremo represente la distancia a partir de un corte
29.10 Los nucleosomas yacen en posiciones especficas?
775
Ningn posicionamiento genera una banda ancha
II
tL U,
,
\l, ii; vvl
i
i
-.
En ausencia deL posicionamiento de un nu-
cleosoma, en todas las Localizaciones posibles de diferentes
copias del genoma yace un sitio de restriccin. Se producen
fragmentos de todos los tamaos posibles cuando una enzima
de restriccin corta en un sitio diana (rojo) y la nucleasa de
micrococos corta en las uniones entre nucleosomas (verde).
por la enzima de restriccin a la regin de enlace.
Ms bien podra representar la distancia del corte
por la enzima de restriccin a un sitio de escisin
preferido por la nucleasa de micrococosl
Esta posibilidad se controla mediante el trata-
miento del DNA desnudo exactamente en la misma
forma que la cromatina. Si hay sitios preferidos por
la nucleasa de micrococos en la regin especfica, ha-
br bandas especficas, patrn que entonces se com-
parara con el generado a partir de la cromatina.
Una diferencia entre el patrn de bandas del
DNA de control y el de la cromatina proporciona
pruebas del posicionamiento de los nucleosomas.
Algunas bandas presentes en el producto de diges-
tin del DNA de control pueden desaparecer del
correspondiente del nucleosoma, lo cual indica que
no se dispone de posiciones para escisin preferen-
cia!. Por otra parte, pueden aparecer nuevas bandas
en el producto de digestin de los nucleosomas,
cuando por la organizacin de stos, se hacen acce-
sibles de manera preferencial nuevos sitios.
El posicionamiento de los nucleosomas podra
lograrse por cualquiera de dos formas:
.
Intrnseca; cada nucleosoma se deposita es-
pecficamente en una secuencia particular
del DNA. Esto modifica el punto de vista
del nucleosoma como unidad susceptiKr .
formarse entre cualquier secuencia dei E
y un octmero de histona.
.
Extrnseca: el primer nucleosoma de -z.
regin se ensambla preferentemente er .
-
sitio particular. Un punto de inicio preferen-
cial para el posicionamiento del nucleosoM
es resultado de la presencia de una rt;. t
de la que se excluyen los nucleosoma5 L
regin excluida proporciona un lmite : .
restringe las posiciones disponibles pa:; -
nucleosoma adyacente, de modo que .
tonces se ensamblara secuencialmente _ -
serie de nucleosomas con una longitu:. _
repeticin definida.
Ahora queda claro que el depsito de octmen ; ;
histonas en el DNA no es aleatorio respecto _7
secuencia. El patrn es intrnseco en algunos casos
en los cuales depende de caractersticas estrucr.. ::
les del DNA, y es extrnseco en casos en que procc-
de las interacciones de otras protenas con e( r. -
las histonas, o ambos.
Ciertas caractersticas estructurales del I.
afectan la ubicacin de los octmeros de hist.
dadas las tendencias intrnsecas de aqul para pir
garse en una direccin ms que en otra; as, [
giones ricas en A-T se localizan de manera C - -
surco menor vea hacia el octmero, en tanto c, -
regiones ricas en G-C se disponen de manerj :
el surco menor seale hacia fuera. Los segm oii
largos de dA-dT (>8 bp) evitan el posicionaiuCTa
en el giro superhelicoidal central del meollo. .-
no es posible sumar todos los efectos estructurir
importantes y as pronosticar completamen-te U 1:-
calizacin de la secuencia especfica del DNA respec-
to del nucleosoma. Las secuencias que hacen q,-
DNA adopte estructuras ms extremas pueden c.r;::
efectos, como la exclusin de nucleosomas, j -
forma que podran incidir en los lmites.
Es frecuente que los nucleosomas se posic
cerca de los lmites. Si hay alguna variante er.
construccin de los nucleosomas, por ejemp!
la longitud del DNA de enlace vara unos 10 ':
especificidad de la localizacin se reducira, ale;;
dose del primer nucleosoma definido en el \c:.
En ese caso podra esperarse que el posidonantetSB
se mantuviera rigurosamente slo con una re!;" .
cercana al lmite.
La localizacin del DNA en los ncleos
puede describirse de dos formas. En la FIGURA 2!
se muestra que el posicionamiento traduccior
describe la posicin del DNA respecto de los itas
del nucleosoma. En particular, determina qtt ix
cuencias se encuentran en las regiones de e:; .j
Un cambio de 10 bp en el DNA lleva el siguieute
a una regin de enlace. As, en el posicionatuaM
776 CAPTULO 29 Nucleosomas
Las fases controlan la exposicin
del ONA de enlace
Giros 3-4 en la regin de enlace
123456789 101112
Giros 2-3 en la regin de enlace
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
El posicionamiento traduccional describe La
:
osicin Lineal del DNA respecto del octmero de histonas.
El desplazamiento del DNA por cambios de 10 bp cambia las
secuencias de las regiones de enlace ms expuestas, pero no
altera la cara del DNA protegida por la superficie de las histonas
ni la que est expuesta al exterior. El DNA ya est enrollado
sobre los nucleosomas; para mayor comodidad se muestra en
forma lineal.
ll'i-H-- ll-lHiiilliHiIfl ll'l -l'l l-l-NI'k'M
Las fases 1 y 5 estn fuera
4?
Nucleasas
Factores
V
Superficie del /
octmero
1
2
3
Nucleasas
Las bases 1 -5 estn
dentro
Factores
7
FIGURA 29.34 El posicionamiento rotativo describe la ex-
posicin del DNA en la superficie del nucleosoma. Cualquier
-
lovimiento que se aleje de la repeticin helicoidal (~10.2 bp/
giro) desplaza al DNA respecto de la superficie de la histona.
-os nucletidos del interior estn ms protegidos contra las
T.ucleasas que los del exterior.
:-
raduccional se determina qu regiones son ms ac-
cesibles (cuando menos, a juzgar por la sensibilidad
I la nucleasa de micrococos).
El DNA yace en el exterior del octmero de his-
tonas, de modo que uno de los lados de cualquier
secuencia especfica es ocultado por las histonas, en
tanto que el otro es accesible. Dependiendo de su po-
sicionamiento respecto del nucleosoma, un sitio en el
DNA que debe reconocer a una protena reguladora
podra ser inaccesible, o estar disponible; por tanto,
la posicin exacta del octmero de histonas en rela-
cin con la secuencia del DNA puede ser importante.
En la ... se muestra el efecto del posicio-
namiento rotativo de la doble hlice en cuanto a
la superficie del octmero. Si se mueve el DNA un
nmero parcial de giros (imagnese el DNA rotando
respecto de la superficie de la protena), habr un
cambio en la exposicin de secuencias al exterior.
El posicionamiento traduccional y rotativo pue-
de ser importante para controlar el acceso al DNA.
Los casos de posicionamiento mejor caracterizados
involucran la limitacin especfica de los nucleo-
somas en los promotores. El posicionamiento tra-
duccional, la exclusin de los nucleosomas de una
secuencia en particular, o ambos procesos, pueden
ser necesarios para permitir que se forme un com-
plejo de transcripcin. Algunos factores reguladores
pueden unirse con el DNA slo si se excluye un nu-
cleosoma para dejar acceso libre al DNA, y ello crea
un lmite para el posicionamiento traduccional. En
otros casos, los factores reguladores pueden volver a
unirse con el DNA en la superficie del nucleosoma,
pero el posicionamiento rotativo es importante para
garantizar que se exponga la cara del DNA con los
puntos de contacto apropiados.
En la seccin 30.4, La organizacin de los nucleo-
somas puede cambiarse en el promotor, se analiza la
conexin entre organizacin de nucleosomas y trans-
cripcin, pero por ahora ntese que los promotores
(y algunas otras estructuras), a menudo tienen regio-
nes cortas que excluyen a los nucleosomas. Dichas
regiones por lo general forman un lmite, cerca del
cual se restringen las posiciones de los nucleosomas.
Mediante un rastreo de una regin extensa del ge-
noma de Saccharomyces cerevisiae (con mapeo de 2 278
nucleosomas en ms de 482 kb de DNA) se demostr
que, de hecho, el 60% de los nucleosomas tiene una
posicin especfica como resultado de efectos limtro-
fes, casi siempre por los promotores.
BQ Los genes transcritos se
organizan sn nudeosornas
"
!
Conceptos principales
. Los nucleosomas se encuentran a la misma frecuencia
cuando los genes transcritos o no transcritos son
digeridos con nucleasa de micrococos.
.
Algunos genes intensamente transcritos parecen casos
excepcionales desprovistos de nucleosomas.
29.11 Los genes transcritos se organizan en nucleosomas?
777
Las unidades de transcripcin
Matriz de ~~
transcripcin
Espaciador -
en cuecas ,
Las unidades de transcripcin del DNAr de
genes nudeolares aislados alternan con segmentos de DNA no
transcritos. Reproducida de Miller 0. L. y Beatty, B. R. 1969.
Science. 164; 955-957. Imagen cortesa de Oscar Miller.
SE3
Un minicromosoma de SV40 puede ser trans-
crito. Reproducida de J. Mol. Bio. Vol. 131, Gariglio, P. et al.,
The tmplate of the isolated... p. 131. Copyright 1979, con
autorizacin de Elsevier. Imagen cortesa de Fierre Chambn.
Los intentos por observar a los genes durante la trans-
cripcin han dado resultados controvertidos. Las si-
guientes dos figuras ejemplifican cada extremo.
La cromatina con transcripcin intensa se ve
bastante extendida (demasiado como para ser cu-
bierta por nucleosomas). En los genes con trans-
cripcin intensa que codifican RNAr, ilustrados en
la , el empaquetamiento extremo de
las polimerasas de RNA dificulta la observacin del
DNA, y no es posible medir directamente las longi-
tudes de los productos de transcripcin del RNAr,
dado que el RNA es compactado por protenas, pero
se sabe (por la secuencia del RNAr) qu tan largo
debe ser el producto de transcripcin. La longitud
del segmento de DNA transcrito que se mide po:
longitud del eje del "rbol de navidad" es de ~8"
de la longitud del RNAr, lo cual significa que el DN
est casi totalmente extendido.
Por otra parte, los complejos de transcripcin
los minicromosomas de SV40 se pueden extraer
clulas infectadas; contienen el complemento usi
de histonas y presentan una estructura tipo cu
tas ensartadas. Se puede observar que las caden
de RNA se extienden a partir del minicromosore
como en el ejemplo de la , lo cual apu
ta a la transcripcin puede continuar mientra;
DNA de SV40 se organiza en nucleosomas. Obvi
mente, el minicromosoma SV40 se transcribe c
menor intensidad que los genes de RNAr.
La transcripcin implica el desenrollamier.
del DNA, y puede implicar el despliegue de la fL
en regiones restringidas de la cromatina. Un pu"
de vista simplista sugiere que se necesitar cit"
"
espacio
"
para el proceso. Las caractersticas de _
cromosomas politnicos y en escobilln descritas
el Captulo 28, Cromosomas, dan indicios de qu ;
expresin gnica se relaciona con una organizac
estructural ms expansiva.
Al reflexionar acerca de la transcripcin,
deben tener en mente el tamao relativo de la ;
limerasa de RNA y del nucleosoma. Las enzirr.
eucariticas son protenas grandes con mlti] .
subunidades, por lo general >500 kD que se o :
pararn con los -40 kD del nucleosoma. E::
se ilustra el enfoque de la polimerasa
DNA respecto del DNA de los nucleosomas. nc
so sin un conocimiento profundo de la interacc:
es evidente que implica abordar dos organis:_:
comparables.
Considrense los dos giros del DNA en torno
nucleosoma. Tendra suficiente acceso la poli-
rasa del RNA al DNA si el cido nucleico se co::
nara a esa va? Durante la transcripcin, confor:
la polimerasa de RNA se mueve sobre el molde
une estrechamente con una regin de -50 bp qi
incluye un segmento local, no enrollado, de -12 :
La necesidad de desenrollar el DNA hace par.;
poco probable que el segmento involucrado er,
reaccin de la polimerasa de RNA podra manter..
se en la superficie del octmero de histonas.
Por tanto, parece inevitable que la transcrip;
implique un cambio estructural, de modo que
primera pregunta acerca de la estructura de un _
activo ser si el DNA en proceso de transcrip;
se mantiene organizado en nucleosomas. Si se de
plazan los octmeros de histonas se mantiene:;
alguna manera aunados al DNA transcrito?
Un abordaje experimental es el de digerir la u
matina con nucleasa de micrococos y, despus, l:_
zar una sonda de alguno o algunos genes especnv;
778 CAPTULO 29 Nucleosomas
'
La polimerasa de RNA es comparable en ta-
mao al nucleosoma, y podra tener dificultades para seguir
al DNA en torno al octmero de (listonas. Imagen superior,
cortesa de E. N. Moudrianakis, Johns Hopkins Universty. Ima-
gen inferior, cortesa de Roger Kornberg, Stanford University
School of Medicine.
para determinar si los fragmentos correspondientes
estn presentes en la escalera usual de 200 bp a la
concentracin esperada. Las conclusiones de esos
experimentos son limitadas pero importantes. Los
genes que estn en proceso de transcripcin contienen nu-
cleosomas con la misma frecuencia que las secuencias no
transcritas. Por tanto, los genes no necesariamente
adoptan una forma alternativa de organizacin para
ser transcritos. No obstante, tal vez el gen transcrito pro-
medio tenga slo una polimerasa de RNA en un momento
dado, por lo cual no revela qu est pasando en los sitios
realmente afectados por la enzima. Quiz conservan
sus nucleosomas; es ms probable que los ncleo-
somas se desplacen de manera temporal, conforme
la polimerasa de RNA pasa a travs de ellos, pero se
forman de nuevo inmediatamente despus.
CTH Los octmeros de histonas
son despLazados
por La transcripcin
Conceptos principales
En un sistema modelo, la polimerasa de RNA desplaza
a los octmeros de histonas durante la transcripcin,
pero stos se unen nuevamente con el DNA tan pronto
como ha pasado La polimerasa.
Los nucleosomas se reorganizan cuando la transcripcin
pasa a travs de un gen.
La transcripcin desplaza a un
Promotor Terminador
Nucleosoma ensamblado en una localizacin
especfica
I
La polimerasa de RNA se une al promotor
La polimerasa de RNA transcribe hasta el
terminador
S k
El nucleosoma se encuentra en una nueva posicin
I Un protocolo para estudiar el efecto de la
transcripcin en Los nucleosomas muestra que el octmero de
histonas es desplazado del DNA y se vuelve a unir en una
nueva posicin.
Los experimentos para comprobar si una polimerasa
de RNA puede transcribir directamente a travs de
un nucleosoma sugieren que el octmero de histo-
nas es desplazado por el hecho de la transcripcin.
En la R Ifl se muestra lo que sucede cuando
la polimerasa de RNA del fago T7 transcribe un frag-
mento corto de DNA que contiene un solo ncleo
octamrico in vitro, el cual se mantiene vinculado
con el DNA pero en una localizacin diferente; es
muy probable que se vuelva a unir con la misma
molcula de DNA de la que fue desplazado.
En la Fl 9 se muestra un modelo para
el avance de la polimerasa. El DNA se desplaza
conforme la polimerasa entra al nucleosoma, pero
la enzima llega a un punto en que el DNA hace
retroceder sus asas y se vuelve a unir,
formando
una regin cerrada. Conforme la polimerasa avan-
za ms, crea superhlices positivas desenrollando el
DNA; el efecto puede ser muy notorio, pues el asa
cerrada es de slo -80 bp, de manera que cada par
de bases a travs del cual avanza la polimerasa hace
una adicin significativa al superenrollamiento. De
hecho, la polimerasa avanza fcilmente los primeros
30 bp hada el nucleosoma, pero despus lo hace en
forma ms lenta, como si su avance fuera cada vez
ms difcil. Cada 10 bp hay pausas, lo cual sugiere
que la estructura del asa impone pausas relaciona-
das con la rotacin en cada giro del DNA. Cuando
la polimerasa Uega el punto medio del nucleosoma
(las bases por aadir a continuacin se encuentran
sobre todo en el eje de la simetra doble), se reanuda
29.12 Los octmeros de histonas son desplazados por la transcripcin
779
I octmero desplazado nunca deja el DNA
La polmerasa de RNA avanza
La expresin cambia la organizacin del nucleosoma
El DNA es desplazado del octmero y forma un
asa cerrada
La torsin delante de la polimerasa de RNA desplaza
al octmero que se renserta detrs de la polimerasa
La polimerasa de RNA desplaza al DNA del
octmero de histonas conforme avanza. El DNA se enrolla nue-
vamente y se une (a la polimerasa o al octmero), para formar
un asa cerrada. Conforme la polimerasa avanza, genera un so-
breenrollado positivo adelante, desplazando al octmero que
mantiene contacto con el DNA, la polimerasa o ambos, y se
inserta detrs de la polimerasa de RNA.
o
c
Q)
Reprimido Expresado
2
a>
a
u
LU
Reprimido
FIGURA 29.40 Las secuencias gnicas URA3 se fusionan CP"
un promotor GAL1 regulado y una secuencia de DNA ribosnlit-:
El URA3 tiene nucleosomas posicionados en forma transicin
antes de la transcripcin. Cuando se induce la transcripc
'
:
.
controlada por un promotor inducible, las posiciones de los
nucleosomas son aleatorias. Cuando se reprime la transcripc1>n-
Los nucleosomas recuperan su posicin especfica. ReprodUciil
de Suter, B., et al. 1997, EMBO 3. 16: 2150-2160. Copyright
s Oxford University Press. Imagen cortesa de Fritz Thoms:
ETH Zurich.
el movimiento y la polimerasa avanza rpidamente,
lo cual sugiere que el punto medio del nucleosoma
marca el sitio en que el octmero es desplazado (tal
vez porque el superenrollado positivo ha llegado a
un nivel crtico en el cual se expulsa al octmero del
DNA). De esta forma se libera la tensin delante de
la polimerasa y se permite que avance. El octmero
se une despus al DNA, detrs de la polimerasa, y
ya no constituye un obstculo para su avance. Es
posible que el octmero cambie de posicin, incluso
sin haber perdido contacto con el DNA.
El octmero se libera como unidad ntegra? El
entrecruzamiento de las protenas del octmero no
crea un obstculo para la transcripcin, la cual pue-
de continuar incluso si los enlaces cruzados son lo
suficientemente extensos como para asegurar que
se hayan enlazado las regiones centrales de las his-
tonas medulares, de ah que la transcripcin no im-
plique disociacin del octmero en las histonas que
lo componen, y no es probable que necesite un ma-
yor despliegue de la estructura central. La adicin
de la histona Hl a ese sistema, sin embargo, causa
una rpida declinacin en la transcripcin, lo cual
sugiere dos conclusiones. El octmero de histona
(ya sea que se conserve o se desplace) acta corno
unidad ntegra, y puede ser necesario eliminar la H
'
de la cromatina activa o modificar de alguna foffla
sus interacciones.
Por tanto, una polimerasa de RNA pequei:
puede desplazar a un solo nucleosoma, que vueK?
a formarse detrs de ella durante la transcripcin. Por
supuesto, la situacin es ms compleja en un ncle1:
eucaritico. La polimerasa de RNA es mucho mayor v
el obstculo al avance es una cadena de nucleosomas
conectados, y para superarlo se necesita que factSfll
adicionaies acten en la cromatina (ver Captulo 30
Control de la estructura de la cromatina).
La organizacin de los nucleosomas puede ser
modificada por la transcripcin. En la 29.0 s?
observa lo que le sucede al gen URA3 de las levadu-
ras cuando se transcribe estando controlado por t
"
promotor inducible. El posicionamiento se analiza
con la nucleasa de micrococos para revisar los sitios
de escisin respecto de un sitio de restriccin en f
extremo 5
'
del gen. Inicialrnente, el gen muestra U
patrn de nucleosomas organizadas desde el prorri<v-
780 CAPTULO 29 Nucleosomas
tor a una distancia significativa a travs del gen; el
posicionamiento se pierde en las regiones 3
'
. Cuan-
do el gen se expresa, un extendido general sustituye
al patrn de posicionamiento de los nucleosomas,
lo cual indica la concentracin de nucleosomas en
la misma, pero ya no estn organizados en fase, lo
cual, a su vez, sugiere que la transcripcin destruye
el posicionamiento nucleosmico. Cuando se res-
tablece la represin, el posicionamiento aparece en
un lapso de 10 minutos (aunque no completo). El
resultado lleva al interesante punto de que se pue-
den ajustar las posiciones de los nucleosomas sin
replicacin.
En el modelo de unificacin se supone que la
polimerasa de RNA desplaza a los octmeros de his-
tonas conforme avanza. Si el DNA que viene de-
trs de la polimerasa est disponible, el octmero
se vuelve a unir ah. (Es posible, o tal vez probable,
que el octmero nunca pierda totalmente el contac-
to con el DNA, pero sigue siendo un enigma cmo
un octmero podra mantener el contacto con el
DNA sin desplegarse o perder componentes, cuando
un objeto incluso de mayor tamao que l avanza
a travs del DNA. Tal vez el octmero sea
"
envia-
do atrs" haciendo contacto con la polimerasa de
RNA.) Si el DNA no est disponible tal vez porque
otra polimerasa contina inmediatamente despus
de la primera, el octmero podra desplazarse per-
manentemente y el DNA mantenerse extendido.
PTO El desplazanrento dei
nudeosoma y su reensamblado
requieren factores especiales
Concepto principal
Se necesitan factores auxiliares para que la
polimerasa de RNA desplace a los octmeros durante
la transcripcin y para que despus, las histonas se
reensamblen en nucleosomas.
El desplazamiento de los nucleosomas respecto del
DNA es clave para todas las etapas de la transcrip-
cin. El inicio del proceso es lo que se ha caracteri-
zado mejor. Los promotores activos estn marcados
por sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa
porque los octmeros de histonas se han desplazado
del DNA (vase la seccin 29.18, Los sitios hiper-
sensibles de la desoxirribonucleasa reflejan cambios
en la estructura de la cromatina). La eliminacin de
los octmeros requiere de complejos de remodelado
reclutados por factores de transcripcin que utilicen
la energa generada por la hidrlisis de ATP para
modificar la estructura de la cromatina (vase la
seccin 30.4, La organizacin de los nucleosomas
puede cambiar en el promotor). Esto significa que
la polimerasa de RNA inicia la sntesis de sta en
una cadena corta de DNA no obstaculizada por los
nucleosomas. Para que siga avanzando durante la
elongacin, deben desplazarse los octmeros de his-
tonas delante de ella, pero para evitar que el DNA
quede desnudo tras los octmeros, deben formarse
nuevamente despus de la transcripcin.
La transcripcin in vitro por la polimerasa 11
de RNA se necesita la llamada protena facilitado-
ra de la transcripcin de la cromatina (FACI), que
se comporta como factor de elongacin durante la
transcripcin. (No es parte de la polimerasa de RNA,
pero se vincula con ella especficamente durante la
fase de elongacin de la transcripcin.) La FACT
consta de dos subunidades bien conservadas en to-
das las eucariotas y se vincula con la cromatina de
los genes activos.
Cuando se agrega FACT a nucleosomas aislados,
conduce a la prdida de los dmeros H2A-H2B, razn
de que durante la transcripcin in vitro,
los nucleo-
somas se conviertan en "hexasomas
"
. Esto sugiere
que la FACT es parte de un mecanismo para el des-
plazamiento de octmeros durante la transcripcin,
aparte de que podra participar en el reensamblado
de los nucleosomas despus de la transcripcin, ya
que ayuda a la formacin de nucleosomas a partir
de histonas medulares. Esto sugiere el modelo de la
29.4
,
en la cual, la FACT saca de un ncleo-
soma el complejo H2A-H2B frente a la polimerasa
de RNA y facilita su insercin en un nucleosoma
que se est reensamblando detrs de la enzima. Se-
guramente se necesitan otros factores para llevar a
cabo el proceso. Dicha protena faciitadora tambin
es necesaria para otras reacciones en que los nucleo-
somas pueden desplazarse, incluidas replicacin y
reparacin del DNA.
Para mantener la integridad de la cromatina en
regiones en proceso de transcripcin, se requiere de
otros factores, tal vez porque tambin participan en
el desensamblado y reensamblado de los nucleo-
somas, pero no hay todava informacin detallada
acerca de sus funciones.
RITO Los aislantes impiden
la accin de los potenciadores
y la heterocromatina
Conceptos principales
Los aislantes pueden impedir el paso de cualquier
efecto activador o desactivador desde los
potenciadores, silenciadores y LCR.
Los aislantes suelen constituir barreras para evitar la
dispersin de la heterocromatina.
29.14 Los aislantes impiden la accin de los potenciadores y la heterocromatina
7.81
i Los factores desensamblan y reensamblan los n
Transcripcin
M
M JUI
H2B H2A FACT libera el dmero
H2A-H2B
H2BH2A H3-H
jjj/
Otros factores liberan
H3-H4
La polimerasa de
RNA se mueve a
lo largo del DNA
H2BH2A
H3-H4
O
El nucleosoma
se reensambla
, Los octmeros de histonas se desensamblan
antes de la transcripcin en proceso para eliminar nucleoso-
mas y se forman nuevamente despus de la transcripcin. La
liberacin de dmeros H2A-H2B probablemente inicie el proceso
de desensamblado.
Los elementos que evitan el paso de los efectos ac-
tivadores o desactivadores se llaman aislantes, y
tienen una de dos propiedades clave, o ambas:
.
Cuando un aislante se coloca entre un pro-
motor y un potenciador, impide que el poten-
dador active al promotor. El efecto del bloqueo
se muestra en la FI , lo cual podra
explicar cmo la accin de un potenciador
se limita a un promotor en particular.
Un aislante puede bloquear a un potenciador
Un potenciador activa a un promotor
Potenciador Promotor
Transcripcin
Un aislante bloquea la accin del potenciador
Potenciador Aislante Promotor
No hay transcripcir
! Un potenciador activa a un promotor en :
alrededores, pero un aislante localizado entre ambos pii
impedrselo.
Un aislante activo es una barrera para la heterocromatina
Aislante Promotor
Centro de propagacin1 Transcripcin
\ La heterocromatina puede dispersarse a par
de un centro y despus bloquear a cualquier promotor que :
bra. Un aislante puede ser una barrera para la propagacin c-.
heterocromatina, que permite al promotor mantenerse acr-
.
Cuando un aislante se coloca entre un
activo y la heterocromatina constituye
barrera que protege al gen contra el efeci: i
desactivacin que se propaga desde la hetercr
matina. (La heterocromatina es una regir
de la cromatina inactiva, resultado de su t
tructura de orden superior; vase la secc:; :
31.2, La heterocromatina se propaga a p-
de un suceso de nucleacin.) El efecto :
barrera se muestra en la F] 43.
Algunos aislantes poseen ambas propiedac-
y otros slo una, o bien, funciones de bloqueo
barrera pueden estn separadas. Aunque ambas a :
tividades posiblemente sean mediadas por camb-
en la estructura de la cromatina, tal vez implique
efectos diferentes; en cualquier caso, el aislante de-
fine el lmite para los efectos a largo plazo.
Cul es el objetivo de un aislante? Una fun-
cin importante podra ser contrarrestar las accior. r
indiscriminadas de los potenciadores sobre los p: : -
782 CAPTULO 29 Nucleosomas
motores. Casi todos los potenciadores actan cerca
de algn promotor, y un aislante puede restringirlo
impidiendo que los efectos rebasen cierto punto,
de modo que slo pueda actuar en un promotor
especfico. Asimismo, cuando un gen est cerca de
la heterocromatina, un aislante puede impedir que
sea desactivado inadvertidamente por la dispersin
de la heterocromatina. Los aislantes, por tanto, ac-
tan como elementos que hacen ms precisa la re-
gulacin gnica.
gfP Los aislantes pueden definir
un dominio
Concepto principal
.
Los aislantes son estructuras especializadas de la
cromatina con sitios hipersensibles. Dos aislantes
pueden proteger de todo efecto externo la regin que
los separa.
Los aislantes se descubrieron durante el anlisis
de la regin del genoma de Drosophila melanogaster
que se resume en la FIGURA 29.4- . Dos genes para la
protena Hsp70 (protena de choque trmico) yacen
en una regin de 18 kb que constituye la banda
87A7, en cuyos extremos se encuentran las estruc-
turas especiales scs y scs' (estructuras especializadas
de cromatina). Ambas constan de una regin muy
resistente a la fragmentacin por desoxirribonuclea-
sa I y a uno y otro lado hay sitios hipersensibles
espaciados casi cada 100 bp. El patrn de escisin de
dichos sitios se altera cuando los genes son activados
por un choque trmico.
Los elementos scs aislan a los genes hsp70 de los
efectos de las regiones circundantes. Si se toman
unidades scs y se colocan a cada lado de un gen blan-
co, ste funcionar en cualquier punto del genoma
en que se coloque, incluso en sitios en que, por con-
texto, normalmente sera reprimido, por ejemplo,
en regiones heterocromticas.
Las unidades scs y scs' no parecen participar ni
positiva ni negativamente en el control de la expre-
sin gnica, sino que apenas restringen los efectos
del paso de una regin a la siguiente.
No obstante, si regiones adyacentes ejercen
efectos represivos, estos elementos scs podran ser
necesarios para bloquear la dispersin de tales efec-
tos y, por tanto, tal vez seran esenciales para la
expresin gnica. En ese caso, la delecin de tales
elementos podra eliminar la expresin de los genes
adyacentes.
Los elementos scs- y scs' tienen diferentes estruc-
turas y no parecen apoyarse en la misma base para
su actividad aislante. La secuencia clave de estos
elementos scs es una tira de 24 bp que se une al
producto del gen zw5. La propiedad aislante de scs
'
reside en una serie de repeticiones CGATA, que se
unen a un grupo de protenas relacionadas llama-
do BEAF-32. La protena muestra una localizacin
n a los
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28kb
87A6 87A7
scs hspJO hspYO scs
'
350 bp 200 bp
resistente resistente
8748
sersbe sensible
W 4U
sensible sensible
Estructuras especializadas de cromatina, que
incluyen sitios de hipersensibilidad, marcan los extremos de un
dominio del genoma de D. melanogaster y aislan a los genes
intermedios de los efectos de las secuencias circundantes.
Una proteina de unin con el aislante se localiza parcialmente en nterbandas
ni i
*
******u*m i***
Interbanda que no se tie Interbanda que no se tie
Rojo = DNA = bandas Verde = BEAF en una interbanda Amarillo = BEAF + DNA
FIGURA 29.45 Una protena que se une al aislante scs' se localiza en nterbandas de cromosomas
politnicos del gnero Drosophila. La tincin roja identifica el DNA (las bandas) en ambas muestras,
superior e inferior; la tincin verde identifica a BEAF32 (a menudo en nterbandas) en la mues-
tra superior. La coincidencia de las dos marcas se seala con amarillo (es decir, BEAF32 est en
una banda). Reproducida de Ce//, vol. 81, Zhao, K., Hart, C. M., y Laemmli, U. K., Visualization of
chromosomal... pp. 879-889. Copyright 1995, con autorizacin de Elsevier. Imagen cortesa de Ulrich
K
. Laemmli, University of Geneva, Switzerland.
29.15 Los aislantes pueden definir un dominio
; Los potenciadores actan en tejidos especficos
Posiciones de potenciadores para tejidos especficos
ala cuerpo cerdas garras
hoja cutcula tarsales
i i ~ <SJ
Exn 1 Exn 2
M. Insercin del aislante y patrn de expresin
-
A T + +
- A + +
+ +
+ +
+ + + + A
definida en el ncleo, pero los datos ms notorios
provienen de su localizacin en cromosomas polit-
nicos. En la FIGURA 29.45 se muestra que el anticuer-
po contra BEAF-32 tie -50% de las interbandas
de los cromosomas politnicos, lo cual sugiere que
hay muchos aislantes en el genoma, y que BEAF-
32 es una parte comn del aparato aislante. Esto
implicara que la banda es una unidad funcional y
que las interbandas a menudo tienen aislantes que
impiden la propagacin de puntos de activacin o
desactivacin.
Otro ejemplo de un aislante que define a un
dominio es la LCR de la P-globina de pollo (grupo
de sitios hipersensibles que controlan la expresin
de todos los genes de la p-globina; vase la seccin
29.20, Una LCR puede controlar a un dominio). El
sitio hipersensible ms alejado hacia la izquierda de
la LCR de la p-globina de pollo (HS4) es un aislante
que marca el extremo 5
'
del dominio funcional y
restringe la actividad de la LCR a los genes de glo-
bina del dominio.
Un gen rodeado de aislantes suele estar protegi-
do contra la propagacin de efectos de desactivacin
desde las regiones circundantes. La prueba consiste
en insertar DNA por transfeccin en un genoma en
localizaciones aleatorias. La expresin de un gen
de la secuencia insertada a menudo es errtica
, y si
bien en algunos casos se expresa apropiadamente,
en otros se extingue. No obstante,
cuando los ais-
lantes con funcin de barrera se colocan a ambos
lados del gen, en el DNA insertado, por lo general
su expresin es uniforme en todos los casos.
fffB Los aisLantes pueden actuar
en una direccin
Concepto principal
*
Algunos aislantes tiene direccionalidad, de modo
que pueden detener el paso de los efectos en una
direccin, pero no en la otra.
Los aislantes pueden tener propiedades direcciona-
les. Las inserciones del transposn gypsy en el locus
yellow (y) de D. melanogaster provocan la prdida
de la funcin del gen en algunos tejidos,
no as en
otros. El motivo es que el locus y es regulado por
cuatro potenciadores, como se muestra en la IGURA
.
Donde quiera que se inserte gypsy, bloquea
la expresin de todos los potenciadores que separa
del promotor, pero no de aqullos ubicados del otro
lado. La secuencia encargada de ese efecto es un
aislante que yace en un extremo del transposn,
el
cual acta independientemente de la orientacin
de su insercin.
FIGURA 29.46 El aislante del transposn gypsy bloquea ti
accin de un potenciador cuando se coloca entre potencia::-
y promotor.
Algunos de los potenciadores se encuentran
en flujo ascendente respecto del promotor y otros es
flujo descendente, de manera que el efecto no pue=
de depender de la posicin respecto del promof -
tampoco es necesario que haya transcripcin a tr<}=
vs del aislante. Esto es difcil de explicar en funcin
de modelos de asa para la interaccin potenciadla-
promotor, la cual pronostica esencialmente la o
pertinencia del DNA interpuesto. El modelo obvio
que viene a la mente es un mecanismo de rastree-
en que alguno de los componentes debe moverse er
forma unidireccional, del potenciador al promotor.
pero es difcil hacer coincidir ese punto de vista ton
las caracterizaciones previas de la independencia Ct
los potenciadores respecto de tales efectos.
Las protenas que actan sobre el aislante bs-
sido identificadas por la existencia de otros dos lod
que afectan la funcin del aislante en forma traK;
Las mutaciones en su(Hw) suprimen el aislamient -
de modo que y se expresa en todos los tejidos a pesf-i
del aislante, lo cual sugiere que codifica una protfl
na que reconoce al aislante y que es necesaria pax
su accin. El su(Hw) tiene un segmento de DNA cc"
dedo de zinc; el mapeo de los cromosomas politinl
eos muestra que est unido a gran nmero de siteS
El aislante contiene doce copias de una secuenc:;
de 26 bp que se une a Su(Hw). Las manipulaciones
muestran que la potencia del aislante depende t
nmero de copias de la secuencia de unin.
El segundo locus es mod{mdg4), en el cual )as
mutaciones producen el efecto contrario, cor+"P
en la prdida de direccionalidad. Tales mutad-P--
nes aumentan la eficacia del aislante por extensic>n
de sus efectos, de manera que impida la utilizacin 'f
los potenciadores a ambos lados. El su(Hw) es epm
ttico respecto de mod{mdg4), es decir, que en un;
doble mutante se observa slo el efecto de su(Hv-'
784 CAPTULO 29 Nucleosomas
Los aislantes actan a travs de la
estructura de la cromatina?
Asas de DNA
Mod{mdg4)
Periferia nuclear
FIGURA 29.47 En La periferia del ncleo se encuentran com-
plejos Su(Hw)/mod(nidg4) que pueden organizar el DNA en
asas que limitan las interacciones potenciador-promotor.
lo cual implica que mod(mdg4) acte a travs
de su(Hw). La participacin bsica de la protena de
tipo silvestre del locus mod{mdg4) es, por tanto, im-
poner direccionalidad a la capacidad de su(Hw) de
aislar promotores dentro de esos lmites.
Por tanto, la unin de su(Hw) con el DNA, se-
guida de la unin de mod(mdg4) con su{Hw), da
lugar a un bloqueo unidireccional de la activacin
de un promotor, lo cual sugiere que el aislante
unido por su(Hw) puede extender la inactividad
en ambas direcciones, pero modmdg detiene
el efecto de dispersin en una direccin. Tal vez
haya una direccionalidad intrnseca en la croma-
tina que finalmente resulte en la incorporacin de
su(Hw), modmdg o algn otro componente, en
una orientacin, supuestamente en virtud de la
interaccin con algn componente de la cromati-
na que, en s, tenga orientacin preferencial. Sera
necesario revertir cualquier direccionalidad de esas
caractersticas en el promotor.
Es posible que los aislantes acten haciendo
cambios en la estructura de la cromatina. Un mo-
delo proviene de la observacin de que los sitios de
unin de Su(Hw) y modmdg estn presentes en
>500 localizaciones de un genoma del gnero Dro-
sophila. Sin embargo, la visualizacin de los sitios en
que las protenas se unen al ncleo muestra que se
localizan a -25 sitios definidos en torno a la periferia
del ncleo, lo cual sugiere el modelo de la FIGURA
29.47
, en el cual, las protenas Su(Hw) unidas en
'
diferentes sitios del DNA se conjuntan por enlace
fcon mod(radg4). El complejo Su(Hw)/mod(mdg4
y
)
se localiza en la periferia nuclear. El DNA unido a l
[se organiza en asas, de las cuales podra haber -20
[
en un complejo promedio. Las interacciones poten-
fciador-promotor deben ocurrir slo dentro de un asa
y no pueden propagarse entre ellas.
Los aislantes controlan el desarrollo
Fab-7
Control lab-5 iab-6 iab-7 Abd-E
transcripcional
I 1 i
A5 A6 A7
A5A6A7
Delecin de Fab-7
Control iab-5 iab-6 iab-7 Abd-i
transcripcional
I ! 1
A5 A7 A7
A5A6A7
A6 simula A7
FIGURA 29.48 El Fab-7 es un elemento limtrofe necesario para
la independencia de los elementos reguladores iab-6 e iab-7.
Los aislantes pueden variar
en potencia
Concepto principal
Los aislantes difieren en cuanto a eficacia para impedir
el paso de una seal de activacin.
En ocasiones, los elementos con diferentes propieda-
des de accin en configuracin cis se combinan para
generar regiones con efectos reguladores comple-
jos. La regin Fab-7 es definida por deleciones en el
locus bithorax del gnero Drosophila, que contiene
una serie de elementos reguladores en configura-
cin cis que controlan las actividades de tres unida-
des de transcripcin. La parte importante del locus se
ilustra en la FIGURA 48. Los elementos reguladores
iab-6 e /fli-7 controlan la expresin del gen adyacen-
te Abd-B en regiones sucesivas del embrin (segmen-
tos A6 y A7). Una delecin de Fab-7 hace que A6 se
desarrolle como A7 y no en la forma acostumbrada;
este efecto dominante sugiere que ab-7 ha tomado
el control sobre iab-6, lo cual se puede interpretar
en funcin de las molculas por el supuesto de que
Fr-7 proporciona un lmite que impide que iab-7
acte cuando iab-6 suele estar activo.
Como otros elementos limtrofes (aislantes),
el Fab-7 contiene una estructura distintiva de cro-
29.17 Los aislantes pueden variar en potencia
785
matina marcada por una serie de sitios hipersensi-
bles. En cuanto a su capacidad para proporcionar
un lmite, la regin puede dividirse en dos tipos
de elementos por deleciones ms pequeas y por
anlisis de fragmentos. Una secuencia de -3.3 kb
se conduce como aislante cuando se coloca dentro
de otras estructuras, una secuencia de -0.8 kb se
conduce como represor que acta sobre iab-7. La
presencia de esos dos elementos explica la compleja
conducta gentica de Pab-7 (que no ha sido descrito
con detalle).
Los efectos de sustituir otros aislantes con Pab-7
permiten profundizar en la accin del elemento lmite.
El efecto de Fab-7 no es ms que evitar interacciones
entre iab-6 e iab-7. No obstante
,
cuando se cambia
Fab-7-por un aislante diferente [de hecho,
un sitio de
unin para la protena Su(Hw)], se observa un efecto
ms fuerte: iab-5 toma el control de iab-7. Cuando se
usa un elemento scs, el efecto se extiende hasta iab-
4
, lo cual sugiere un esquema en que los elementos
ms fuertes pueden bloquear la accin de secuencias
reguladoras que yacen ms lejos.
Esta conclusin introduce una dificultad para
explicar la accin de los elementos lmite, los cuales
no pueden actuar en esa forma simplemente im-
pidiendo la transmisin de los efectos ms all del
lmite, lo cual apunta en contra de modelos basados
en el simple rastreo o en la inhibicin de la pro-
pagacin lineal de efectos estructurales, adems de
sugerir que puede haber algn tipo de efecto com-
petitivo en que la fortaleza del elemento determine
qu tan lejos puede llegar su efecto.
La situacin se complica an ms por la exis-
tencia de elementos antiaislante que permiten a
un potenciador superar los efectos del bloqueo de un
aislante, lo cual nuevamente sugiere que aquellos
efectos son mediados por algn tipo de control sobre
la estructura local de la cromatina.
los sitios hper&ensibles
a la desoxnibonudeasa
reflejan cambios en La
estructura de La cromatina
Conceptos principales
En los promotores de los genes expresados hay sitios
hipersensibies.
Estos sitios son generados por La unin de factores
de transcripcin que desplazan a los octmeros de
histonas.
Adems de los cambios generales que ocurren en
regiones activas, o potencialmente activas, se pre-
sentan modificaciones estructurales en sitios espe-
cficos vinculados con el inicio de la transcripcin
o con ciertas caractersticas estructurales del DNA.
Esos cambios se detectaron por primera vez mer-
ced a los efectos de la digestin con concentraciones
muy bajas de la enzima desoxirribonucleasa I.
Cuando digiere a la cromatina, como prime:
efecto introduce roturas en sitios hipersensible
especficos de la cadena doble. La susceptibilidad
a la desoxirribonucleasa I refleja la disponibilid?.
del DNA en la cromatina, por lo cual se toman est r
sitios como representativos de regiones cromtica
en que el DNA est particularmente expuesto por-
que no se encuentra organizado en la estructure
usual de nucleosomas. Un sitio hipersensible tipie
es 100 veces ms sensible al ataque de las enzima?
que la mayor parte de la cromatina. Esos sitios tam-
bin son hipersensibles a otras nucleasas y agente
qumicos.
Los sitios hipersensibles se crean debido a la es-
tructura de la cromatina (especfica de tejido). Si
localizacin puede determinarse por la tcnica Cs
marcado terminal indirecto, presentada antes en d
contexto del posicionamiento de los nucleosoma?-
Esa aplicacin de la tcnica se recapitula en la
En este caso se utiliza la escisin p;-
desoxirribonucleasa I en el sitio hipersensible par;
generar un extremo del fragmento y su distancia S|
mide desde el otro extremo, generado por la esci-
sin con una enzima de restriccin.
Muchos de los sitios hipersensibles tienen rela-
cin con la expresin gnica. Todo gen activo e:\-.
un sitio, o ms de uno, en la regin del promotc> -
Casi todos los sitios hipersensibles se encuentran slo :
la cromatina de las clulas en que est expresndose :
gen vinculado, no cuando el gen est inactivo. I;_
sitios hipersensibles 5
'
aparecen antes de que se ir:-
ci la transcripcin, y para la expresin gnica se
requieren las secuencias de DNA contenidas en !;
sitios hipersensibles, como se observa por anJi
de mutaciones.
Una regin sensible a nucleasas, particularmen-
te bien caracterizada, yace en el minicromosor:;
SV40. Un segmento corto cercano al origen de 'a
replicacin, apenas en flujo ascendente respecto cV
promotor de la unidad de transcripcin tarda, !
escindido preferencialmente por la desoxirriboc.; -
cleasa I, la nucleasa de micrococos y otras nucleasas
(incluidas las enzimas de restriccin).
El estado del minicromosoma SV40 puede
servarse al microscopio electrnico. Hasta en 2C
de las muestras se observa un "espacio" en la or;;-
nizacin del nucleosoma, el cual es evidente er_ i
50; Ese espacio es una regin de -20
de longitud (casi 350 bp), con nucleosomas a un;
otro lado. El espacio visible corresponde a la reg:: -
786 CAPTULO 29 Nucleosomas
Brecha
Nucleosomas
Los sitios hipersensibles pueden mapearse
Sitio de restriccin Sitio hipersensible
Escisin con
desoxirribonucleasa I
Extraccin del DNA
Escisin con enzima
de restriccin
1
Electroforesis y mancha
con sonda para una
regin adyacente al sitio
de restriccin
La banda consta de un
fragmento cortado en
un extremo por la
desoxirribonucleasa 1
y en el otro por una
enzima de restriccin
FIGURA 29.49 El marcado terminal indirecto permite medir la
distancia entre un sitio hipersensible y la desoxirribonucleasa
desde un sitio de corte por restriccin. La existencia de un sitio
de corte en particular para la desoxirribonucleasa I genera un
fragmento bien definido, cuyo tamao identifica la distancia
del sitio hipersensible a la desoxirribonucleasa I, desde el sitio
de restriccin.
El minicromosoma de SV40 tiene una brecha de
nucleosoma. Imagen cortesa de Moshe Yaniv, Pasteur Institute.
-
300
Sitios de escisin
i i I
-
Protegido
Sitios de escisin Punto de inicio
i \ \
Sitios de escisin
* I M
-
270 -70
-
50 Regin tarda de SV40
Punto de inicio
Gen de p-globina
-
300 -200 -100 0 100
Posicin respecto del punto de inicio
FIGURA 29.51 El segmento de SV40 incluye sitios hipersensibles,
regiones sensibles y una regin protegida del DNA. El sitio hipersensi-
ble de un gen de la p-globina de pollo incluye una regin susceptible
a varias nucleasas.
sensible a nucleasas, lo cual muestra directamente
que la mayor sensibilidad a las nucleasas se relacio-
na con la exclusin de nucleosomas.
Un sitio hipersensible a las nucleasas no nece-
sariamente lo es de manera uniforme. En la IGURA
29.51 se muestran dos mapas que ilustran este fen-
meno. Dentro del espacio de -300 bp del SV40 hay
dos sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa I
y una regin
"
protegida
"
; esta ltima posiblemente
refleje la relacin de las protenas (no histonas) con
el DNA. El espado se relaciona con elementos de la
secuencia del DNA necesarios para la funcin del
promotor.
El sitio de hipersensibilidad del promotor de la
p-globina es digerido preferentemente por varias
enzimas, entre otras, desoxirribonucleasas I y 11 y
nucleasa de micrococos. Las enzimas tienen sitios
preferidos de escisin que yacen en puntos ligera-
mente diferentes de la misma regin general. As,
a una regin que va de -70 a -270 de preferencia
acceden las nucleasas cuando el gen es susceptible
de transcripcin.
Cul es la estructura del sitio hipersensible?
Su accesibilidad preferencial a las nucleasas indica
que no est protegido por octmeros de histona,
pero eso no necesariamente implica que est libre
de protenas. Una regin de DNA libre puede ser
vulnerable al dao y, en todo caso, cmo podra
excluir a los nucleosomas? Se supone que el sitio
hipersensible es resultado de la unin de protenas
reguladoras especficas que excluyen a los nucleo-
somas. De hecho, la unin de tales protenas tal vez
constituya la base para la existencia de la regin
protegida dentro del sitio hipersensible.
29.18 Los sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa reflejan cambios en la estructura de la cromatina
787
Es posible que las protenas que generan sitios
hipersensibles sean factores reguladores de varios
tipos, pues dichos sitios se relacionan con los pro-
motores, otro tipo de elementos que regulan la
transcripcin, los orgenes de la replicacin, los cen-
trmeros y los sitios con otro significado estructural.
En algunos casos se vinculan con una organizacin
ms amplia de la estructura de la cromatina. Un
sitio hipersensible puede constituir un lmite para
una serie de nucleosomas en posicin. Los sitios hi-
persensibles vinculados con la transcripcin pueden
ser generados por factores de transcripcin cuando
se unen al promotor como parte del proceso que
los hace accesible a la polimerasa de RNA (vase la
seccin 30.4, La organizacin del nucleosoma puede
cambiarse en el promotor).
La estabilidad de los sitios hipersensibles se re-
vela por las propiedades de los fibroblastos de po-
llo transformados con virus de tumor sensibles a la
temperatura. En esos experimentos se aprovecha
una propiedad inusual, pues aunque los fibroblastos
no pertenecen a la lnea eritroide, la transformacin
de las clulas a temperatura normal lleva a la activa-
cin de los genes de globina, que as activados, son
sitios hipersensibles. Si la transformacin se hace a
una temperatun. mayor (no permitida), los genes
de globina no se activan, y los sitios hipersensibles
no aparecen. Cuando los genes de globina se han
activado por transformacin a baja temperatura,
pueden desactivarse por elevacin de sta, aunque
se mantienen cuando menos durante las siguientes
20 replicaciones celulares.
Este resultado demuestra que la adquisicin de
un sitio hipersensible es slo una de las caractersti-
cas necesarias para iniciar la transcripcin, e implica
que los sucesos involucrados en el establecimiento
de un sitio hipersensible sean diferentes de los en-
cargados de perpetuarlo. Una vez que se ha estable-
cido el sitio, se perpeta por replicacin si no se pre-
sentan las condiciones necesarias para la induccin.
Podra ser necesaria alguna intervencin especfica
para suprimir un sitio hipersensible?
Los dominios definen regiones
que contienen genes activos
Concepto principal
Un dominio que contiene un gen transcrito se define
por su mayor sensibilidad a la fragmentacin por la
desoxirribonucleasa I.
La estructura de una regin del genoma que con-
tiene un gen activo, puede estar alterada. El cambio
de estructura precede a la ruptura de la estructura
del nucleosoma y es diferente de sta, que poc" ;
ser secundaria al verdadero paso de la polimera-
sa de RNA. Un ndice del cambio de la cromatir
.
transcrita depende de esa mayor susceptibilidad i ;
fragmentacin por desoxirribonucleasa I, que dez: _
a un dominio cromosmico, regin de estrucu; :
alterada que incluye cuando menos una unidad ;:
transcripcin activa y que llega a extenderse m
(Ntese que el uso del trmino "dominio" no irnpl
ca necesariamente una conexin con los dominios
estructurales identificados por las asas de cromatni
o los cromosomas.)
Cuando la cromatina es digerida con desoxim-
bonucleasa I, podra degradarse a un material s ;
ble en cido (fragmentos muy pequeos de DN7
y la reaccin general avanzara en funcin del pe
centaje de DNA modificado de esa forma. Cir-
slo el 10% del DNA total se ha vuelto soluble en :::
se pierde ms del 50% del DNA de un gen activo, lo :: -
sugiere que los genes activos se fragmentan de mam
preferencial.
El destino de los genes individuales se ras'
con una sonda especfica por cuantificacin de I
cantidad de DNA que sobrevive para la reacci r
protocolo incluido en la . El princ;
es que la prdida de una banda en particular ir.
ca que la regin correspondiente del DNA ha :
fragmentada por la enzima.
En la se muestra lo que sucede ; -
los genes de la p-globina y con un gen de ov i
bmina en la cromatina extrada de los eritrodi
de pollo (los genes de globina se expresan y el gei: ;
ovoalbmina est inactivo). Los fragmentos de r. -
triccin que representan genes de p-globina se pier-
den rpidamente, en tanto los que representa i
gen de ovoalbmina muestran poca fragmenta..
(de hecho, el gen de ovoalbmina, es digerido i _
misma velocidad que la mayor parte del DNAt.
Por tanto, la mayor parte de la cromato; :
relativamente resistente a la desoxirribonucic:
I y contiene genes no expresados (as como c.:;
secuencias). Un gen se torna relativamente suscef.::
a la enzima de manera especfica en el tejido en que
expresa.
Es la susceptibilidad preferencial una caraae-
rstica slo de los genes de expresin ms bien ae.
como el de la globina, o de todos los genes aci:
Los experimentos mediante sondas que repte
tan a todo el grupo de RNAm celulares sugie
que todos los genes activos, ya sea que codificj;-
RNAm abundantes o raros, son preferiblen::;:
susceptibles a la desoxirribonucleasa I (aunque r :
variaciones en el grado de susceptibilidad). Lo-; .-;:
nes que rara vez se expresan posiblemente te_
muy pocas molculas de polimerasa de RNA c
CAPTULO 29 Nucleosomas
,Los genes expresados se digieren de manera preterencial?
Digestin de la cromatina con desoxirribonucleasa I
lili
Extraccin y escisin del DNA con la enzima de restriccin
I
Electroforesis de los fragmentos y desnaturalizacin del
DNA; sonda para genes expresados y no expresados
Sonda 1
Sonda 2
Comparacin de intensidades de bandas en
preparados en que la cromatina fue digerida con
concentraciones crecientes de desoxirribonucleasa
Desoxirribonucleasa
La sonda 1 de DNA se digiere
de manera preferencial
Desoxirribonucleasa
La sonda 2 de DNA no se
digiere de manera preferencial
.
La desoxirribonucleasa I se puede medir me-
diante una sonda especfica, por determinacin de La tasa de
desaparicin del material con hibridacin.
realmente se involucren en la transcripcin en un
momento dado; ello implica que la sensibilidad a
la desoxirribonucleasa I no proviene del acto de la
transcripcin, ms bien es una caracterstica de los
genes que pueden ser transcritos.
Cul es la extensin de la regin preferente-
mente sensible? Esto puede determinarse mediante
una serie de sondas que representan las regiones de
los flancos, as como la unidad de transcripcin mis-
ma. La regin sensible siempre abarca toda la regin
transcrita; una regin adicional de varios kb a cada
lado mostrara un nivel intermedio de sensibilidad
(tal vez como resultado de efectos de dispersin).
El concepto crtico implcito en la descripcin
del dominio es que la regin de alta sensibilidad a
Los genes expresados se digieren de manera preferencial
-
p-globina embrionaria:
digerida a 1.0 pg/ml
-
p-globina del adulto:
digerida a 0.5 pg/ml
Ovoalbmina de control
0 .01 .05 .10 .50 1.0 1.5 pg/ml
Desoxirribonucleasa
FIGURA 29.53 En clulas eritrcides del adulto
, el gen de La
|3-globina del adulto es muy sensible a la digestin por
desoxirribonucleasa I, en tanto que el gen de la P-globina
embrionaria es parcialmente sensible (quiz por efectos de
dispersin), no as la ovoalbmina. Imgenes cortesa
de Harold Weintraub, Fred Hutchinson Cncer Research Cen-
ter. Con autorizacin de Mark T. Groudine.
la desoxirribonucleasa I cubre una distancia consi-
derable. A menudo se piensa en la regulacin como
dependiente de sucesos que ocurren en un sitio de-
finido del DNA, por ejemplo, de la capacidad de ini-
ciar la transcripcin en el promotor, pero incluso si
esto fuera vlido, tal regulacin debera determinar
un cambio de mayor envergadura en la estructura,
o bien ir acompaada de l. Esta es una diferencia
entre eucariotas y procariotas.
Una LCR puede controlar
a un dominio
Concepto principal
.
Una LCR se localiza en el extremo 5' del dominio y
consta de varios sitios hipersensibles.
Todo gen es controlado por su promotor, y algunos
genes tambin responden a los potenciadores (que
contienen elementos de control similares
, pero ms
alejados), segn se describi en el Captulo 24,
Pro-
motores y potenciadores, pero esos controles locales
no son suficientes para todos los genes. En algunos
casos, un gen yace en un dominio de varios genes,
todos bajo la influencia de elementos reguladores
que actan en el dominio completo. Esos elementos
29,20 Una LCR puede controlar a un dominio
789
Sitios hipersensibles 5' Sitio hipersensible 3'
fifi < GA 5.t \
HS4 HS1 Genes de globina
kb 20 40 60 80
FIGURA 29.54 Un dominio de globina es marcado por sus
sitios hipersensibles en ambos extremos. El conjunto de sitios
del lado 5' constituye a la LCR y es indispensable para la fun-
cin de todos los genes del grupo.
se identificaron por la incapacidad de una regin
de DNA, que incluye un gen y todos sus elementos
reguladores conocidos, para expresarse apropiada-
mente cuando son introducidos a un animal a ma-
nera de transgn.
El ejemplo mejor caracterizado de un grupo de
genes regulados es el de los genes de la p-globina
de mamfero. Recurdese de la Figura 6.3, que los
genes de a y P-globina en mamferos se encuentran
como grupos de genes relacionados que se expre-
san en diferentes momentos durante el desarrollo
embrionario y el adulto. Esos genes estn provistos
de un gran nmero de elementos reguladores ana-
lizados en detalle. En el caso del gen de la p-globina
humana del adulto, las secuencias reguladoras se
encuentran en los extremos 5
'
y 3' del gen, e inclu-
yen elementos positivos y negativos en la regin
del promotor, as como elementos positivos adicio-
nales en el gen y en flujo descendente respecto del
mismo.
Sin embargo, un gen de la p-globina humana
que contenga todas esas regiones de control, nunca
se expresar en un ratn transgnlco en un orden
de magnitud del mbito de tipo silvestre, pues se
requiere de alguna secuencia reveladora adicional.
Las reservas que proporcionan una funcin regu-
ladora adicional son identificadas por los sitios hi-
persensibles a la desoxirribonucleasa I que se en-
cuentran en los extremos del conjunto. El mapa
de la FIGURA 29.54 muestra que los 20 kb en flujo
ascendente respecto del gen psilon contienen un
grupo de cinco sitios, y que hay un sitio a 30 kb en
flujo descendente del gen p. Con la transfecdn de
varias estructuras en clulas de la eritroleucemia del
ratn, se muestra que las secuencias entre los sitios
hipersensibles individuales de la regin 5' se pueden
eliminar sin mucho efecto, pero que la eliminacin
de cualquiera de los sitios reduce el nivel general
de expresin.
Los sitios 5' son los principales reguladores, y
el grupo de sitios hipersensibles se llama regin de
control del locus (LCR); no se sabe si el sitio 3
'
tiene alguna funcin. La LCR es absolutamente
cesara para la expresin de cada uno de los ge
de globina del grupo, aparte de que cada ge:
regulado adicionalmente por sus propios contr
especficos, algunos de los cuales son autnon
La expresin de los genes e y y en conjuncin
LCR parece intrnseca a esos loci, en tanto que o
controles parecen depender de la posicin en el L
po, lo cual sugiere que el orden gnico en un gr
es importante para la regulacin.
Toda la regin que contiene los genes de glo
"
:
y que se extiende an ms, constituye un domi
cromosmico, que muestra mayor sensibilidad
digestin por la desoxirribonucleasa I (vase la
29.52). La delecin de la LCR 5' restablece la re
tencia normal a la desoxirribonucleasa en toe
regin. Dos modelos de funcionamiento de una I
proponen que su participacin es necesaria para
tivar al promotor, o bien, se necesita para aume:
su velocidad de transcripcin. La naturaleza ex,
de las interacciones entre la LCR y los promc
individuales no es todava muy clara.
Este modelo es aplicable a otros grupos de
nes? El locus de globina a tiene una organiza
similar de genes que se expresan en diferentes e
mentes, con un conjunto de sitios hipersensf
en un extremo del grupo y mayor sensibilida
la desoxirribonucleasa I en toda la regin. S:
conoce un pequeo nmero de casos en que
LCR controla a un grupo de genes.
Uno de esos casos implica que una LCR conu
genes en ms de un cromosoma. La TH2LCR reg
coordinadamente a un grupo de genes disperse
120 kb del cromosoma 11 por interaccin con
promotores; tambin interacta con el promotor
gen de BFNy en el cromosoma 10. Los dos tipo
interaccin constituyen alternativas que comp:
den dos destinos celulares diferentes, esto es, er
grupo de clulas la LCR causa expresin de los m
en el cromosoma 11, mientras que en el otro, I
que se exprese el gen del cromosoma 10.
rtm Qu constituye un dominio
regulador?
Concepto principal
.
Un dominio puede tener aislante, LCR y sitio de unic
a la matriz, as como unidades de transcripcin.
Si se conjuntan los diversos tipos de estructuras
contrados en diferentes sistemas, se puede per
acerca de la posible naturaleza de un dominio
mosmico. La caracterstica bsica de un domi
regulador es que los elementos reguladores pue
790 CAPTULO 29 Nucleosomas
actuar slo en unidades de transcripcin del mismo
dominio, el cual podra contener ms de una unidad
de transcripcin, un potenciador, o ambos.
En la IGURA 29.55 se resumen las estructuras
que podran participar en la definicin de un do-
minio.
Un aislante detiene el paso de los efectos acti-
vadores o represores. En su forma ms simple, un
aislante bloquea cualquier tipo de efecto de paso,
pero puede haber relaciones ms complejas en que
el aislante bloquee slo un tipo de efecto, acte de
manera direccional, o ambos. Se supone que la ac-
cin de los aislantes afecta la estructura de la cro-
matina de orden superior, pero no se conocen los
detalles ni la variedad de tales efectos.
Un sitio de unin a la matriz (MAR) pue-
de encargarse de unir la cromatina con un sitio de
la periferia del ncleo (vase la seccin 28.6, Se-
cuencias especficas unen el DNA a una matriz de
interfase). Dichas secuencias posiblemente se encar-
gan de crear dominios fsicos del DNA que adoptan
la forma de asas que salen de los sitios de unin,
de manera muy parecida a un modelo de accin de
aislante. De hecho, algunos elementos de MAR se
comportan como aislantes en experimentos in vitro,
pero parece que su capacidad de unir el DNA con la
matriz se puede separar de su funcin de aislante,
de manera que no es una simple accin de causa y
efecto. No sera sorprendente que el aislante y los
elementos de un MAR se vincularan para mantener
una relacin entre efectos reguladores y estructura
fsica.
Una LCR acta a distancia y cualquiera de los
genes puede necesitarla en un dominio por expresar
(vase la seccin 29.20, Una LCR puede controlar
un dominio). Cuando un dominio tiene una LCR,
su funcin es esencial para todos los genes del mis-
mo, pero las LCR no parecen ser comunes. Para su
funcionamiento podran necesitarse varios tipos de
estructuras en configuracin de accin cis. Como se
defini originalmente, la propiedad de la LCR yace
en el sitio hipersensible similar a un potenciador,
necesaria para la actividad completa de los promo-
tores del dominio.
La organizacin de dominios puede llegar a
explicar el gran tamao del genoma. Para que tal
estructura funcionara, se requerira cierta cantidad
de espado, por ejemplo, para permitir que la croma-
tina se descondensara y se hiciera accesible. Aunque
las secuencias exactas de gran parte de la unidad
podran no tener importancia, tal vez entrara en
accin la seleccin en cuanto a cantidad global de
DNA en su interior, o cuando menos para evitar
que diversas unidades de transcripcin estuvieran
demasiado cerca.
La expresin es controlada por varios tipos de elementos
Aislante MAR LCR Potenciador
Unidades de transcripcin
FIGUR Los dominios pueden poseer tres tipos de sitios:
aislantes para evitar los efectos de la dispersin entre dominios;
MAR para unir el dominio con la matriz nuclear, y LCR, los cuales son
necesarios para el inicio de la transcripcin. Un potenciador puede
actuar en ms de un promotor dentro del dominio.
tTWT\ Resumen
Toda la cromatina eucaritica consta de nucleoso-
mas. Un nucleosoma contiene una longitud carac-
terstica de DNA, por lo general -200 bp, que se
ubican en torno a un octmero que contiene dos
copias de cada una de las histonas H2A, H2B, H3
y H4. Una protena Hl aislada se vincula con cada
nucleosoma. Virtualmente todo el DNA genmico
se organiza en nucleosomas. El tratamiento con
nucleasa de micrococos muestra que el DNA em-
paquetado en los nucleosomas puede dividirse en
dos regiones desde el punto operativo. La nucleasa
digiere rpidamente la regin de enlace, si bien la
regin medular de 146 bp es resistente a esa diges-
tin. Las histonas H3 y H4 son las ms conservadas
y un tetrmero H32-H42 contribuye al dimetro de
la partcula. Las histonas H2A y H2B se organizan
como dos dmeros H2A-H2B. Los octmeros se en-
samblan por adicin sucesiva de dos dmeros H2A-
H2B al ncleo H3
2
-H4
2
.
La va del DNA que rodea al octmero de his-
tonas crea -1.65 superhlices. El DNA "entra" y
"
sale
"
del nucleosoma en la misma zona, y podra
ser sellado por una histona Hl. La eliminacin de
las histonas medulares libera -1.0 superhlices.
La diferencia puede explicarse en gran parte por
un cambio en la pendiente helicoidal del DNA, de un
promedio de 10.2 bp/giro, en forma de nucleoso-
ma, a 10,5 bp/giro, cuando est libre en solucin.
Hay variaciones en la estructura del DNA de una
periodicidad de 10.0 bp/giro en los extremos del
nucleosoma a 10.7 bp/giro en su parte central, as
como enroscamientos en la va del DNA sobre el
nucleosoma.
Los nucleosomas estn organizados en una fibra
de 30 nm de dimetro, con seis por giro, y una razn
de empaquetamiento de 40. La eliminacin de Hl
permite a esta fibra desplegarse en una de 10 nm
que consta de una cadena lineal de nucleosomas. La
fibra de 30 nm probablemente conste de la fibra de
10 nm enrollada en un solenoide con dos inicios.
29.22 Resumen 791
La fibra de 30 nm es el constituyente bsico de la
eucromatina y la heterocromatina; las protenas no
histonas se encargan de la organizacin adicional
de la fibra en la cromatina o la ultraestructura del
cromosoma.
Hay dos vas para el ensamblaje de los nucleoso-
mas. En la va acoplada a la replicacin, la subunidad
de avance de PCNA del replisoma recluta a CAP-1,
que es un factor de ensamblaje del nucleosoma, el
cual facilita el depsito de tetrmeros H3
2
-H4
2
en las
cadenas hijas dobles resultantes de la replicacin.
Los tetrmeros pueden producirse por rotura de los
nucleosomas existentes por el triplete de replicacin
o como resultado del ensamblado de histonas recin
sintetizadas. Fuentes similares proporcionan los d-
meros H2A-H2B, que despus se ensamblan con el
tetrmero H3
2
-H4
2
para completar el nucleosoma.
Dicho tetrmero y los dmeros H2A-H2B se ensam-
blan en forma aleatoria, de modo que los nuevos
nucleosomas pueden incluir tanto las histonas pre-
vias como las de reciente sntesis.
La polimerasa de RNA desplaza a los octmeros
de histonas durante la transcripcin. Los nucleoso-
mas vuelven a formarse sobre el DNA despus de
que ha pasado la polimerasa, a menos que la trans-
cripcin sea muy intensiva (como en el DNAr), en
cuyo caso, pueden desplazarse por completo. La va
independiente de la replicacin para el ensamblaje
del nucleosoma se encarga de sustituir los octme-
ros de histonas desplazados por la transcripcin.
Utiliza la variante de histona H3.3 y no H3. Para el
ensamblaje de nucleosomas en secuencias de DNA
centromricas despus de la replicacin, se usa una
va similar, con otra alternativa de H3. Un aislante
bloquea la transmisin de efectos de activacin y
desactivacin en la cromatina. Un aislante localiza-
do entre un potenciador y un promotor impide que
el primero active al segundo. Dos aislantes definen
la regin intermedia como un dominio regulador;
las interacciones regulatorias dentro del dominio
se limitan a l, de modo que queda aislado de los
efectos externos. La mayor parte de los aislantes
bloquea el paso de los efectos reguladores, en cual-
quier sentido, pero algunos son direccionales. Los
aislantes suelen bloquear tanto los efectos activado-
res (interacciones potenciador-promotor) como los
desactivadores (mediados por dispersin de la hete-
rocromatina), pero algunos se limitan a uno u otro.
Se cree que los aislantes actan por modificacin de
la estructura de la cromatina de orden mayor, pero
se desconocen los detalles.
La actividad gnica se vincula con dos tipos de
cambios de sensibilidad a las nucleasas. La croma-
tina susceptible de transcribirse tiene generalmente
mayor sensibilidad a la desoxirribonucleasa I, lo cual
refleja un cambio en la estructura en una regin
amplia, que puede definirse como dominio, y : _
contiene genes activos o potencialmente activos. 1
sitios hipersensibles del DNA ocurren en localiza-
ciones bien definidas y se identifican por una s-r
sibilidad mucho mayor a la desoxirribonucleaj; I
Un sitio hipersensible consta de una secuencia c
-
200 bp a partir de la cual se excluyen los nucle >
somas, por la presencia de otras protenas, ade. :;
de que forma un lmite que puede hacer que _
nucleosomas adyacentes tengan restriccione; C
cuanto a posicin. El posicionamiento de los nuc>
somas puede ser importante para controlar el acceso
de protenas reguladoras al DNA.
Hay sitios hipersensibles en varios tipos de
guiadores; los que regulan la transcripcin indU]
promotores, potenciadores y LCR, a diferencis :
otros, que incluyen orgenes para la replicacirr
centrmeros. Un promotor o potenciador acta
bre un solo gen, pero una LCR contiene un gr:-
de sitios hipersensibles y puede regular un domir
que contenga varios genes.
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Referencias 795
Control de la estructura
de la cromatina
ESQUEMA DEL CAPTULO
mu
Introduccin
La cromatina puede tener estados alternativos
.
La estructura de la cromatina es estable y no puede
modificarse con la alteracin del equilibrio de los factores
de transcripcin y las histonas.
EL remodelado de la cromatina es un proceso
activo
.
Hay varios complejos de remodelado de la cromatina que
utilizan la energa provista por la hidrlisis del ATP.
.
Los complejos SWI/SNF, RSC y NURF son muy grandes todos
y comparten algunas subunidades relacionadas.
.
Un modelo de remodelado no tiene en s especificidad para
algn sitio diana particular, sino que debe ser reclutado por
un componente del aparato de transcripcin.
La organizacin de los nucleosomas puede
cambiar en el promotor
.
Los activadores especficos de secuencia reclutan complejos
de remodelado a los promotores.
.
El factor puede liberarse una vez que se ha unido el
complejo de remodelado.
.
El promotor MMTV requiere un cambio del posicionamiento
rotativo de un nucleosoma que permita que un activador se
una al DNA sobre el nucleosoma.
La modificacin de las histonas es un episodio
clave
.
Las histonas se modifican por metilacin, acetilacin y
fosforilacin
Ocurre acetilacin de histonas en dos
circunstancias
.
Ocurre acetilacin de histonas de manera transitoria
durante la replicacin.
.
La acetilacin de histonas se vincula con la activacin de
[a impresin gnica.
Las acetilasas se relacionan con activadores
.
La cromatina desacetilada puede tener una estructura ms
condensada.
.
Los activadores de la transcripcin se relacionan con
actividades de acetilasa de histonas en grandes complejos.
.
Las acetilasas de histonas varan en su especificidad diana.
.
La acetilacin podra afectar la transcripcin en una forma
cuantitativa o cualitativa.
-
fclilM
Las desacetilasas se relacionan con los represores
.
La desacetilacin se vincula con la represin de la
actividad gnica.
.
Hay desacetilasas presentes en complejos con actividad
represora.
Las metilaciones de histonas y de DNA estn
relacionadas
.
La metilacin de DNA y de histonas es una caracterstica de
la cromatina inactiva.
.
Los dos tipos de episodios de metilacin pueden estar
relacionados.
Los estados de la cromatina se interconvierten
por modificacin
.
La acetilacin de histonas se relaciona con la actividad
gnica.
.
La metilacin de DNA y de histonas se relaciona con la
heterocromatina.
La activacin del promotor comprende una serie
ordenada de episodios
.
El complejo de remodelado puede reclutar al complejo de
acetilacin.
.
La acetilacin de histonas puede ser el suceso que
mantenga al complejo en estado activado.
La fosforilacin de las histonas afecta la
estructura de la cromatina
.
Al menos dos histonas son dianas de la fosforilacin, tal
vez con efectos contrarios.
Se encuentran algunos segmentos comunes en las
protenas que modifican la cromatina
.
El dominio cromo se encuentra en varias protenas de la
cromatina que tienen efectos de activacin o represin
sobre la expresin de los genes.
.
El dominio SET es parte del sitio cataltico de las
transferasas de metilos de protenas.
.
El dominio bromo se encuentra en una variedad de
protenas que interactan con la cromatina y sirve para
reconocer sitios acetilados en las histonas.
Resumen
796
fW Introduccin
Cuando se aborda la transcripcin en trminos de
interacciones del DNA, factores de transcripcin in-
dividuales y polimerasas de RNA, se llega a la des-
cripcin precisa de los sucesos que tienen lugar in
vitro, pero carece de una caracterstica importante
de la transcripcin in vivo. El genoma celular est
organizado en nucleosomas, pero en general se im-
pide la iniciacin de la transcripcin si la regin del
promotor est empacada dentro de los nucleosomas.
En este sentido, las histonas actan como represores
generalizados de transcripcin (una idea bastante
antigua), si bien se ve en este captulo que tambin
participan en interacciones ms especficas. La acti-
vacin de un gen requiere cambios en el estado de
la cromatina: el tema esencial es cmo tienen acceso
al DNA promotor los factores de transcripcin.
La estructura local de la cromatina es parte in-
tegral del control de la expresin gnica. Los genes
pueden estar presentes en una de dos condiciones
estructurales. Se han encontrado genes en estado
"
activo
"
slo en las clulas donde se expresan. El
cambio de estructura antecede al acto de la trans-
cripcin e indica que el gen es
"
transcribible". Esto
hace pensar que la adquisicin de una estructura
"
activa
"
debe de ser el primer paso en la expresin
gnica. Los genes activos se encuentran en dominios
de la eucromatina con susceptibilidad preferencial a
las nucleasas (vase la seccin 29.19, Los dominios
definen regiones que contienen genes activos). Se
crean sitios hipersensibles en los promotores antes
de que se active un gen (vase la seccin 29.18, Los
sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa cam-
bian la estructura de la cromatina).
En fecha ms reciente se ha visto que hay una
conexin cercana y continua entre la iniciacin de
la transcripcin y la estructura de la cromatina. Al-
gunos activadores de la transcripcin gnica modifi-
can de manera directa las histonas; en particular, la
acetilacin de histonas se relaciona con la activacin
gnica. Por el contrario, algunos represores de la
transcripcin actan por desacetilacin de histonas.
De este modo, un cambio reversible en la estructura
de las histonas en la vecindad del promotor parti-
cipa en el control de la expresin gnica, lo que tal
vez sea parte del mecanismo por el que un gen se
mantiene en estado activo o inactivo.
Los mecanismos por los que se mantienen re-
giones locales de cromatina en estado inactivo (si-
lente) tienen relacin con el medio por el que se
reprime cada promotor. Las protenas involucradas
en la formacin de la heterocromatina actan en la
cromatina a travs de las histonas, y las modifica-
ciones de las histonas pueden ser una caracterstica
importante de la interaccin. Una vez establecidos,
dichos cambios en la cromatina pueden persistir a
travs de las divisiones celulares y crear un estado
epigentico donde las propiedades de un gen son
determinadas por la estructura autoperpetuante de
la cromatina. El nombre epigentica refleja el hecho
de que un gen pudiese tener una circunstancia he-
redada (puede ser activa o inactiva) que no depende
de su secuencia. Sin embargo, se pueden conocer
mejor las propiedades epigenticas por las estructu-
ras autoperpetuantes denominadas priones (agen-
tes infecciosos proteinceos).
Eg La cromatina puede tener
estados alternativos
Concepto principal
.
La estructura de
, la cromatina es estable y no puede
modificarse con la alteracin del equilibrio de los
factores de transcripcin e histonas.
Se han propuesto dos tipos de modelos para explicar
cmo cambia el estado de expresin del DNA: en
equilibrio o en cambio discontinuo.
En la IGURA se muestra el modelo en equi-
librio. Aqu el nico factor pertinente es la concen-
tracin de la protena represora o activadora, que
produce un equilibrio entre las formas libre y unida
al DNA. Cuando la concentracin de la protena es
suficientemente alta, ocupa su sitio de unin al DNA
El modelo en equilibrio depende de la concentracin de protenas
El sitio diana est
libre cuando la
concentracin de
protenas es baja
c 100%
:2
1 50%.
3
o
0
. n
La concentracin alta
_de protenas propicia
la unin al DNA diana
V<V, \,.\.*XC\.'. \.
<\/\.<\.<\/\.<'
Concentracin de protenas
En un modelo en equilibrio el estado de un sitio de unin en el DNA depende
de la concentracin de la protena que se le une.
30.2 La cromatina puede tener estados alternativos
797
y altera el estado de expresin del ddo. (Es posible
que la unin reprima o active cualquier secuencia
diana particular.) Este tipo de modelo explica la re-
gulacin de la transcripcin en clulas bacterianas,
donde la expresin gnica depende de manera ex-
clusiva de las acciones de cada una de las protenas
represoras y activadores (vase el Captulo 12, El
opern). Puede predecirse si se transcribe un gen
bacteriano a partir de la suma de concentraciones
de varios factores que activan o reprimen al gen in-
dividual. Los cambios de estas concentraciones en
cualquier momento modificarn el estado de expresin
de manera acorde. En la mayor parte de los casos, la
unin a protenas es colaboradora, de modo que una
vez que la concentracin alcanza un nivel lo sufi-
cientemente alto, hay un rpido vnculo con el DNA
que origina un cambio en la expresin del gen.
Ocurre una situacin diferente con la cromati-
na eucaritica. Los primeros experimentos in vitro
mostraron que se puede establecer un estado activo
o inactivo, pero esto no se afecta por la adicin pos-
terior de otros componentes. El factor de transcrip-
cin TF
ra
A
, indispensable para que la polimerasa de
RNAIII transcriba los genes del RNAm 5S, no puede
activar sus genes diana in vitro si estn combinados
con histonas. Sin embargo, si el factor est presente
ante DNA libre, forma un complejo de transcrip-
cin, y despus, la adicin de histonas no impide
que el gen se mantenga activo. Una vez que el faaor
La polimerasa de RNA y los
factores no pueden tener
acceso al DNA
1
J J J
JJJ
! I
Los octmeros de
histonas no pueden
tener acceso al DNA
1] I] 1) jjfl
Si los nucleosomas se forman en un promotor, Los
factores de transcripcin (y la polimerasa de RNA) no pueden
unirse. Si Los factores de transcripcin (y la polimerasa de RNA)
se unen al promotor para establecer un complejo estable de
inicio, se excluyen las histonas.
se ha unido, permanece en el sitio; esto permite que
_
una sucesin de molculas de la polimerasa de RNA"
inicie la transcripcin. El que el factor o las histonas
lleguen al sitio de control en primer trmino puede
ser el punto determinante.
En la se muestran los dos tipos de
circunstancia que pueden encontrarse en un pro-
motor eucaritico. En el estado inactivo, hay nu-
cleosomas que impiden que se unan los factores
bsales y la polimerasa de RNA. En el estado activo,
el aparato basal ocupa el promotor, al que los oct-
meros de histonas no pueden unirse. Ambos tipos
de estado son estables.
Se observa una situacin similar con el complejo
TF
n
D en los promotores de la polimerasa II de RNA.
Un plsmido que contiene un promotor de adenovi-
rus se puede transcribir in vitro por la actividad de la
polimerasa n de RNA en una reaccin que requie-
re TF
n
D y otros factores de transcripcin. El molde
puede ensamblarse en nucleosomas si se adicionatl
histonas. Si se agregan las histonas antes del TF
no puede iniciarse la transcripcin. No obstante, si
el TF
n
D se agrega primero, el molde puede aun ser
transcrito en esa forma de cromatina. Por lo tanto,
el TF
n
D puede reconocer el DNA libre pero no pue-
de hacer lo mismo con el DNA de los nucleosomas
o actuar sobre l. Slo el TF
n
D debe agregarse antes
de las histonas; los otros factores de transcripcin y
la polimerasa de RNA se pueden agregar despus, 1<
que permite suponer que la unin del TFnD al pro-
motor crea una estructura a la que se pueden unir
"
otros componentes del aparato de transcripcin.
Es importante sealar que en estos sistemas in
vitro se utilizan cantidades desproporcionadas de
componentes, que pueden crear situaciones no na-
turales. Por lo tanto, la mayor importancia de estos
resultados no es que demuestren el mecanismo uti-
lizado in vivo, sino que establecen el principio de que
losfactores de transcripcin o nucleosomas pueden formar
estructuras estables que no pueden cambiarse tan slo con
la modificacin del equilibrio con los componentes libres.
gfl EL remodeLado de La cromatina
es un proceso activo
Conceptos principales
.
Hay varios complejos de remodelado de cromatina que
utilizan energa provista por la hidrlisis del ATP.
.
Los complejos SWI/SNF, RSC y NURF son todos muy
grandes y comparten subunidades relacionadas.
.
Un complejo de remodelado no tiene en s
especificidad para algn sitio diana particular, sino que
debe ser reclutado por un componente del aparato de
transcripcin.
798 CAPTULO 30 Control de la estructura de la cromatina
El proceso general de induccin de cambios en la
estructura de la cromatina se denomina remodela-
do de cromatina, que consta de mecanismos para
remplazar histonas y depende del aporte de ener-
ga. Muchos contactos protena-protena y prote-
na-DNA necesitan modificarse para que se liberen
histonas de la cromatina. No hay traslados sin costo;
debe proveerse energa para alterar estos contactos.
En la -IGURA 30.3 se ilustra el principio de un modelo
dinmico, por un factor que hidroliza el ATP. Cuando
el octmero de histonas se libera del DNA, se pue-
den unir otras protenas (en este caso, factores de
transcripcin y polimerasa de RNA).
En la FIGURA 30.4 se resumen los tipos de cam-
bios de remodelado de la cromatina que pueden
describirse in vitro:
.
Los octmeros de histonas pueden despla-
zarse por el DNA y cambiar la relacin entre
el cido nucleico y las protenas, lo que mo-
difica la posicin de una secuencia particu-
lar sobre la superficie del nucleosoma.
.
El espaciamiento entre octmeros de histo-
nas puede cambiar, de nuevo con el resul-
tado de que se alteran las posiciones de cada
secuencia con relacin a la protena.
.
El cambio ms extenso es cuando un octme -
ro puede desplazarse por completo del DNA
para generar una brecha sin nucleosomas.
El uso ms comn del remodelado de la croma-
tina es cambiar la organizacin de los nucleosomas
en el promotor de un gen que se va a transcribir.
Esto se requiere para permitir que el aparato de
transcripcin tenga acceso al promotor. Sin embar-
go, tambin se necesita remodelado para permitir
otras manipulaciones de la cromatina, incluidas las
reacciones de reparacin del DNA daado.
El remodelado adopta ms a menudo la forma
de desplazamiento de uno o ms octmeros de his-
tonas. Esto puede detectarse por un cambio en la
escalera de la nucleasa de micrococos, donde se ha
perdido la proteccin contra la escisin. A menudo,
esto da origen a la creacin de un sitio que es hi-
persensible a la escisin por la desoxirribonucleasa
I (vase la seccin 29.18, Los sitios hipersensibles a
la desoxirribonucleasa cambian la estructura de la
cromatina). A veces hay cambios menos notorios,
por ejemplo, que incluyen una modificacin en la
posicin rotativa de un solo nucleosoma; esto puede
detectarse por la prdida de la escalera de 10 bases
de la desoxirribonucleasa I. As, los cambios en la
estructura de la cromatina pueden ir desde alterar la
posicin de los nucleosomas hasta retirarlos.
El remodelado de cromatina lo realizan grandes
complejos que aprovechan la hidrlisis de ATP para
proveer la energa. El meollo del complejo de remo-
delado es su subunidad de fosfatasa del trifosfato
de adenosina. Los complejos de remodelado suelen
clasificarse de acuerdo con el tipo de subunidad de
fosfatasa del trifosfato de adenosina; aquellos con
subunidades de fosfatasa del trifosfato de adenosi-
na relacionadas se consideran pertenecientes a la
misma familia (por lo general algunas otras sub-
unidades son tambin comunes). En la
se conservan los nombres. Los dos tipos principales
fo del nucleosoma
es un proceso activo
Complejo de remodelado-
Se desplaza el octmero
ADP+P
Se unen los factores
y la polimerasa de RNA
El modelo dinmico para la transcripcin de La
cromatina depende de factores que pueden aprovechar la ener-
ga provista por la hidrlisis del ATP para desplazar nucleoso-
mas de secuencias especficas del DNA.
El remodelado cambia la organizacin del nucleosoma
Los nucleosomas
se deslizan
Se ajusta el
espaciado
El nucleosoma
se desplaza
V t
Las secuencia El espaciamiento Brecha de
cambia de posicin se hace uniforme DNA libre
Los complejos de remodelado pueden hacer
que los nucleosomas se deslicen por el DNA, pueden desplazar
a los nucleosomas del DNA o reorganizar el espaciado entre
los nucleosomas.
.30.3 El remodelado de la cromatina es un proceso activo
799
Hay varios tipos de complejos de remodelado
Tipo de complejo SWI/SNF
ISWI Otras
Levaduras SWI/SNF
RSC
ISW1
ISW2
Complejo INO80
SWRI
Moscas dSWI/SNF
(brahma)
NURF
CHRAC
ACF
Seres humanos hSWI/SNF RSF
hACF/WCFR
hCHRAC
WICH
NuRD
Complejo INO80
SRCAP
Rana WICH
CHRAC
ACF
Mi-2
Los complejos de remodelado pueden clasificarse por sus
subunidades de fosfatase del trifosfato de adenosina.
de complejos son SWI/SNF e ISWI (las siglas ISWI
se refieren a SWI de imitacin).
Las levaduras tienen dos complejos SWI/SNF y
tres complejos ISWI. Se encuentran tambin com-
plejos de ambos tipos en la mosca y el ser humano.
Cada tipo de complejo puede emprender una varie-
dad diferente de actividades de remodelado.
El primer complejo de remodelado identifica-
do fue SWI/SNF, nombre que refleja el hecho de
que muchas de sus subunidades son codificadas
por genes identificados en un principio mediante
mutaciones SWI o SNP en Saccharomyces cerevisiae.
Las mutaciones de estos loci son pleiotrpicas y la
variacin de defectos es similar a la que muestran
los mutantes que perdieron la cola del dominio car-
boxilo terminal (CID) de la polimerasa de RNA II.
Estas mutaciones tambin muestran interacciones
genticas con las mutaciones de genes que codifi-
can los componentes de la cromatina, en particular
SINl, que codifica una protena no histona, y S1N2,
que codifica la histona H3. Se requieren los genes
SWZy SiVFpara la expresin de una variedad de loci
individuales (se afectan -120, 0 2%, de los genes de
S
. cerevisiae). La expresin de estos loci puede reque-
rir que el complejo SWI/SNF remodele la cromatina
en sus promotores.
El complejo SWI/SNF acta en forma cataltica
in vitro y hay slo ~ 150 complejos por clula de leva-
dura. Los genes que codifican las subunidades SWI/
SNF no son esenciales, lo que indica que la levadura
debe de tener tambin otras formas de remodelado
de la cromatina. El complejo RSC (que remodela
la estructura de la cromatina) es ms abundante y
tambin indispensable. Acta en -700 loci diana.
Los complejos SWI/SNF pueden remodelar la
cromatina in vitro sin prdida global de histonas, o
pueden desplazar a los octmeros de histona. Am-
bos tipos de reaccin tal vez pasen por el mismo
proceso intermedio donde se altera la estructura
de un nucleosoma diana, lo que lleva a la recons-
titucin de un nucleosoma (remodelado) sobre el
DNA original, o al desplazamiento del octmero
de histonas hacia una molcula diferente de DNA.
El complejo SWI/SNF altera la sensibilidad de los
nucleosomas a la desoxirribonucleasa I en el sitio
diana e induce cambios en los contactos protena-
DNA que persisten despus que se ha liberado de los
nucleosomas. La subunidad Swi2 es la fosfatasa del
trifosfato de adenosina, que aporta la energa para
el remodelado por SWI/SNF.
Hay muchos contactos entre el DNA y un oct-
mero de histonas; 14 identificados en la estructura
cristalina. Todos estos contactos deben romperse
para que pueda liberarse un octmero o moverse a
una nueva posicin. Cmo se logra esto? Se pue-
den descartar algunos mecanismos obvios, porque
se sabe que no se genera DNA de cadena nica du-
rante el remodelado (y no hay actividades de helica-
sa vinculadas con los complejos). La creencia actual
es que los complejos de remodelado en las clases
SWI e ISWI aprovechan la hidrlisis del ATP para
hacer girar el DNA en la superficie del nucleosoma.
Las pruebas indirectas permiten suponer que esto
crea una fuerza mecnica que permite a una pe-
quea regin del DNA liberarse de la superficie y
despus volver a ubicarse.
Una reaccin importante catalizada por com-
plejos de remodelado incluye el deslizamiento de
los nucleosomas. Se observ por primera vez que
la familia ISWI afecta el posicionamiento de los
nucleosomas sin desplazar a los octmeros. Esto se
logra por una reaccin de deslizamiento donde el
octmero se mueve a lo largo del DNA. El desliza-
miento se impide si se retira la cola N terminal de
la histona H4, pero no se sabe con exactitud cmo
acta dicha estructura a ese respecto. Los comple-
jos SWI/SNF tienen la misma capacidad; se impide
la reaccin con la introduccin de una barrera en
el DNA, lo que hace pensar que hay una reaccin
de deslizamiento, donde el octmero de histonas se
traslada ms o menos en forma continua por el DNA
sin perder contacto en ningn momento.
Un enigma acerca de la accin del complejo
SWI/SNF es su tamao completo. Tiene 11 subuni-
dades con un peso molecular combinado de -2 x IG6.
Esto hace muy pequea a la polimerasa de RNA y
el nucleosoma, lo que dificulta comprender cmo
todos estos componentes pudiesen interactuar con
el DNA detenido en la superficie del cromosoma.
Sin embargo, se puede encontrar un complejo de
transcripcin con actividad completa, llamado ho-
loenzima polimerasa II de RNA, que contiene la
800 CAPTULO 30 Control de la estructura de la cromatina
polimerasa de RNA misma, todos los factores TFjj
excepto TBP y T A, y el complejo SW1/SNF, que se
vincula con la cola CTD de la polimerasa. De hecho,
casi todo el complejo SWI/SNF puede estar presente
en los preparados holoenzimticos, lo que sugiere
que el remodelado de la cromatina y el reconoci-
miento de los promotores tienen lugar en forma
coordinada por un solo complejo.
|23 La organizacin
de Los nucleosomas puede
cambiar en el promotor
Conceptos principales
Los activadores especficos de secuencia reclutan
complejos de remodelado a los promotores.
EL factor puede Liberarse una vez que se ha unido eL
compLejo de remodelado.
EL promotor MMTV requiere un cambio deL posiciona-
miento rotativo de un nudeosoma que permita que un
activador se una aL ONA sobre eL nudeosoma.
Cmo se dirigen los complejos de remodelado a
sitios especficos de la cromatina? No contienen en
s subunidades que se unan a secuencias especficas
de DNA, lo que hace pensar en el modelo que se
muestra en la FIGURA 30 , donde son reclutados por
activadores o (a veces) por represores.
La interaccin entre los factores de transcripcin
y los complejos de remodelado da indicios clave de
su forma de accin. El factor de transcripcin Swi5
activa el locus HO en levaduras (ntese que Swi5
no es miembro del complejo SWI/SNF). El Swi5
entra a los ncleos cerca del final de la mitosis y se
une al promotor HO. Despus recluta SWI/SNF al
promotor. A continuacin, se libera Swi5, que deja
a SWI/SNF en el promotor, lo que significa que un
factor de transcripcin puede activar un promotor
por un mecanismo de
"
batear y correr", donde su
funcin se cumple una vez que se ha unido el com-
plejo de remodelado.
Se descubri la participacin de los complejos
de remodelado en la activacin gnica porque di-
chos complejos son indispensables para que ciertos
factores de transcripcin puedan activar sus genes
diana. Uno de los primeros ejemplos fue el factor
GAGA, que activa al promotor de hsp70 de Drosophila
in vitro. La unin de GAGA a cuatro sitios ricos en
(CT)h en el promotor altera los nucleosomas, crea
una regin hipersensible y hace que los nucleoso-
mas adyacentes se reacomoden de manera que ocu-
pen posiciones preferentes ms que aleatorias. La
escisin es un proceso que depende de la energa y
que requiere el complejo de remodelado NURF. La
Los complejos de remodelado se unen
a travs de activai
1. El factor especfico de secuencia se une al DNA
2. El complejo de remodelado se une al sitio
a travs de un factor s-s-x
Complejo de remodelado
JJJJ
3. El complejo de remodelado desplaza al octamero
6 Un complejo de remodelado se une a la croma-
tina gracias a un activador (o un represor).
organizacin de los nucleosomas se modifica para
crear un lmite que determine las posiciones de los
nucleosomas cercanos. Durante este proceso, GAGA
se une a su sitio diana y al DNA; su presencia fija el
estado remodelado.
El sistema PEO fue uno de los primeros en los
que se demostr que hay un cambio en la orga-
nizacin de los nucleosomas durante la activacin
gnica. En el promotor PH05 el regulador de bHLH,
PH04, responde a la privacin de fosfatos con la
induccin de la rotura de cuatro nucleosomas en
una posicin precisa. Ese episodio es independien-
te de la transcripcin (se presenta en un mutante
TATA") y de la replicacin. Hay dos sitios de unin
para PH04 en el promotor. Uno se localiza entre
los nucleosomas, que se puede unir por el domi-
nio de unin a DNA aislado PH04, y el otro yace
dentro del nudeosoma y no puede reconocerse. La
rotura del nudeosoma para permitir la unin del
DNA en el segundo sitio es indispensable para la
activacin gnica. Dicha accin requiere la presen-
cia del dominio de activacin de la transcripcin.
30.4 La organizacin de Los nucleosomas puede cambiar en eL promotor
801
La secuencia del activador de VP16 puede susti-
tuir a la correspondiente PH04 en la escisin del
nucleosoma. Esto hace pensar que la rotura tiene
lugar gracias a interacciones protena-protena que
involucran a la misma regin que hace contactos
protena-protena para activar la transcripcin. En
este caso, no se sabe qu complejo de remodelado
participa en la ejecucin de los efectos.
Una bsqueda de posiciones de nucleosomas
del genoma de levadura mostr que la mayor parte
de los sitios donde se unen factores de transcripcin
estn libres en el nucleosoma. Los promotores de la
polimerasa II de RNA por lo general tienen una re-
gin sin nucleosomas -200 bp en sentido ascenden-
te respecto del punto de inicio, que es flanqueado
por los nucleosomas ubicados a cada lado.
Sin embargo, no siempre tienen que excluirse
los nucleosomas para permitir la iniciacin de la
transcripcin. Algunos activadores pueden unirse al
DNA en la superficie de un nucleosoma. Los nucleo-
somas parecen ubicados de manera precisa en algu-
nos elementos de respuesta de hormonas esteroides,
de manera que se puedan unir a los receptores. La
unin a receptores tal vez altere la interaccin del
DNA con las histonas y pudiese incluso llevar a la
exposicin de nuevos sitios de unin. Podra requer-
irse el posicionamiento exacto de los nucleosomas,
ya sea porque el nucleosoma
"
presenta
"
el DNA en
una fase de rotacin particular, o porque hay inter-
acciones protena-protena entre los activadores y las
Se requiere el nucleosoma para la unin de NF1
NF1
Receptor Receptor
de hormona de hormona
Receptor
de hormona
v. - NF1
Receptor
de hormona' Octmero
OTF-1
HS en el eje-
de histonas /
W. , OTF-1
Receptor v
de hormona
El receptor hormonal y NF1 no pueden unirse
de manera simultnea al promotor MMTV en forma de DNA
lineal, pero pueden hacerlo cuando el DNA se presenta sobre
La superficie del nucleosoma.
histonas u otros componentes de la cromatina. De
algn modo, se ha dejado de ver a la cromatina slo
como una estructura represiva y ahora se analizan
cules interacciones entre activadores y cromatina
pueden necesitarse para la activacin.
El promotor MMTV representa un ejemplo de la
necesidad de una organizacin nucleosmica espe-
cfica. Contiene un conjunto de seis sitios palindr-
micos en parte, cada uno unido a un dmero del re-
ceptor de la hormona (HR), que constituye el HRE.
Tambin tienen un sitio de unin aislado para el
factor NF1, y dos sitios cercanos para el factor OTP.i
HR y NEI no pueden unirse de manera simultnea;
a otros sitios en el DNA libre. La FIGURA 30.7 mus-'
tra cmo la estructura del nucleosoma controla la-;
unin de los factores.
El HR protege sus sitios de unin en el promo-]
tor cuando se agrega hormona, pero no afecta
los sitios sensibles a la nucleasa de micrococos, que;
marcan ambos lados del nucleosoma. Esto permite!
suponer que HR se une al DNA sobre la superficie
'
del nucleosoma; sin embargo, el posicionamiento
rotativo del DNA en el nucleosoma antes de la adi-
cin de la hormona permite el acceso a slo dos de
cuatro sitios. La unin a los otros dos sitios requiere
un cambio en la posicin de rotacin sobre el nu-
cleosoma, que puede detectarse por la aparicin de
un sitio sensible en el eje de simetra par (que est
en el centro de los sitios de unin que constituyen
el HRE). Se puede buscar NFI en el nucleosoma des-
pus de la induccin hormonal, de modo que dichos.
cambios estructurales tal vez sean necesarios para
permitir la unin de NFI, quizs porque exponen al
DNA y eliminan el impedimento estrico por el que
el HR bloquea la unin de NFI al DNA libre.
La modificacin de Las
histonas es un episodio clave
Concepto principal
.
Las histonas se modifican por metilacin, acetilacin y
fosforilacin.
El que un gen se exprese depende de la estructura
local de la cromatina (en el promotor) y en el do-
minio circundante. La estructura de la cromatina
puede regularse de manera correspondiente gracias
a episodios de activacin individuales o cambios que
afectan una regin cromosmica amplia. Los suce-
sos ms localizados implican a un gen diana indivi-
dual donde se presentan cambios en la estructura
de los nucleosomas y su organizacin en la vecindad
inmediata del promotor. Cambios ms generales
pueden afectar regiones tan grandes como todo un
cromosoma.
802 CAPTULO 30 Control de la estructura de la cromatina
Los cambios que afectan a regiones grandes
controlan la posibilidad de expresarse de un gen.
El trmino silenciamiento se utiliza para referir-
se a la represin de la actividad de un gen en una
regin cromosmica local. La denominacin he-
terocromatina se usa para describir regiones de
los cromosomas que son lo bastante grandes como
para observarse con una estructura fsicamente ms
compacta al microscopio. La base de ambos tipos de
cambio es la misma: protenas adicionales se unen a
la cromatina e impiden de manera directa o indirec-
ta la activacin de los promotores en la regin por
factores de transcripcin o la polimerasa de RNA.
Los cambios en cada promotor controlan que la
transcripcin se inicie en un gen particular y pue-
den ser de activacin o represin.
Todos estos episodios dependen de interaccio-
nes con histonas. Los cambios en la estructura de
la cromatina se inician cuando se modifican las co-
las terminales Nes de las histonas, en especial H3
y H4. Las colas de las histonas constan de 15-30
aminocidos en el extremo N de las cuatro histonas
centrales y el extremo C de H2A. Las colas de H2B
y H3 pasan entre los giros del DNA (vase la Figura
29.21 en la seccin 29.7, Organizacin del octmero
de histonas). La FIGURA 30.8 muestra que se pueden
modificar en varios sitos por metilacin, acetilacin
o fosforilacin. Otras modificaciones, como una mo-
noubicuitinacin o dimetilacin tambin ocurren,
pero no estn bien descritos,
La acetilacin y metilacin tienen lugar en el
grupo amino libre (e) de la lisina. Como se observa
en la FIGURA 30.9 la acetilacin retira la carga positi-
va que reside en la forma NH
*
del grupo. Tambin
ocurre metilacin en la arginina. La fosforilacin se
presenta en el grupo hidroxilo de la serina y tambin
en la treonina, lo que introduce una carga negativa
en forma de un grupo fosfato. La lisina puede ser
mono, di o trimetilada (todas las formas con carga
positiva) y la arginina puede ser mono o dimetilada
(en forma simtrica o asimtrica).
Estas modificaciones son transitorias. Pueden
cambiar la carga de la molcula de la protena y, en
consecuencia, estn en posibilidades de modificar
las propiedades funcionales de los octmeros. Las
modificaciones de las histonas se vinculan con los
cambios estructurales que se presentan en la croma-
tina durante la replicacin y transcripcin. Pueden
requerirse fosforilaciones en posiciones especficas y
en diferentes histonas para procesos particulares, por
ejemplo, la posicin Ser
10 de H3 se fosforila cuando
los cromosomas se condensan durante la mitosis,
En clulas en cultivo sincronizadas, tanto las
histonas medulares preexistentes como las recin
sintetizadas parecen ser acetiladas y metiladas du-
rante la fase S (cuando se replica el DNA y tambin
se sintetizan las histonas). Durante el ciclo celular,
los grupos modificantes se retiran despus.
La coincidencia de modificacin y replicacin
hace suponer que la acetilacin (y metilacin) po-
dran vincularse con el ensamblaje del nucleosoma.
Una especulacin ha sido que la disminucin de
las cargas positivas en las histonas podra aminorar
su afinidad por el DNA, lo que permite controlar
mejor la reaccin. La idea ha perdido sustento des-
pus de que se observ que los nucleosomas pue-
den reconstituirse, al menos in vitro, con histonas
no modificadas. La acetilacin de histonas es in-
dispensable para el ensamblaje de nucleosomas en
las levaduras y tal vez se requiera para algunas de
Las colas de las histonas tienen muchos sitios de modificacin
Sitios de modificacin en H3
[Me| |Me|ep
Ala rgTreD Lis Gln freoAla Arg Lis SerTreo,)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Sitios de modificacin en H4
.
Ser Glu Arg Glu 'Lis.
Gi Glu lis Glu UeuGlu Ife Glu G\u
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
FIGURA 30.8 Las colas terminales Nes de las histonas H3 y
H4 pueden acetilarse, metilarse o fosforilarse en varias posi-
ciones.
Lisina y serina son dianas para la modificacin
Lisina Serina
o
A
CH2
OH
C
CH2
CH2
CH2
CH2
NH
H O R h
A
c
HA
n cA
h
i H
CH2
CH2
CH2
CH2
1 I 1 +
Metilacin CH3 H
11
O
CH2
O
-
o
-P
-o
-
o
Fosforiiacin
Acetiiacin
CH3-C
FIGURA 30.9 La acetilacin de la lisina o la fosforilacin de la
serina reducen la carga positiva global de una protena.
30.5 La modificacin de las histonas es un episodio clave
803
las interacciones protena-protena que tienen lugar
durante etapas ms avanzadas de la reaccin (vase
la seccin 30.6, Ocurre acetilacin de histonas en
dos circunstancias).
Ocurre un ciclo de fosforilacin y desfosfori-
lacin en Hl, pero su sincronizacin es diferente
del ciclo de modificacin de las otras histonas. En
clulas de mamfero en cultivo se introducen uno
o dos grupos fosfato durante la fase S. No obstante,
el principal episodio de la fosforilacin es la adicin
posterior de ms grupos en la mitosis, lo que lleva
al nmero total de hasta seis. Todos los grupos fos-
fato se retiran al final del proceso de divisin. La
fosforilacin de Hl es catalizada por una cinasa de
fase M, que provee el desencadenamiento indispen-
sable para la mitosis. De hecho, esta enzima ahora
se estudia a menudo en trminos de su actividad de
Las modificaciones de las histonas
regulan la actividad genica
Colas terminales Nes
H3 H4 H3 H4
1
Cromatina activa Cromatina inactiva
I ,
La acetilacin de H3 y H4 se vincula con la
cromatina activa, en tanto la metilacin se relaciona con
la cromatina inactiva.
nodlficacin de las histonas afecta la estructura
y el funcionamiento
de la cromatina
Historia Sitio Modificacin Funcin
H3 Lis-4 Metilacin Activacin
H3 Lis-9 Metilacin Condensacin de la cromatina
Lis-9 Metilacin
Se requiere para la metilacin
del DNA
Lis-9 Acetilacin Activacin
H3 Ser-10 Fosforilacin Activacin
H3 Lis-14 Acetilacin
Impide la metilacin en Lis-9
H3 Lis-79 Metilacin Silenciamiento telomrico
H4
Arg-3
Metilacin
H4 Lis-5 Acetilacin
Ensamblaje
H4 Lis-12 Acetilacin
Ensamblaje
H4 Lis-16 Acetilacin
Ensamblaje del nucleosoma
Lis-16 Acetilacin Activacin de X en la mosca
La mayor parte de los sitios modificados en las histonas
tiene un tipo nico especfico de modificacin, pero algunos sitios pue-
den tener ms de un tipo de modificacin. Cada una de las funciones se
puede vincular con algunas de las modificaciones.
cinasa de Hl. No se sabe mucho acerca de la o las
fosfatasas que retiran despus los grupos.
La sincronizacin de la fosforilacin principal
de Hl ha llevado a especular que participa en la
condensacin mittica. Sin embargo, en el gnero
Tetrahymena (de protozoarios) es posible la delecia
de todos los genes de Hl sin afectar de manera sig-
nificativa las propiedades globales de la cromatina.
Hay un efecto ms bien pequeo sobre la capacidad
de la cromatina de condensarse durante la mitosis.
Algunos genes se activan y otros se reprimen por
ese cambio, lo que sugiere que hay alteraciones de
la estructura local. Las mutaciones que eliminan
sitios de fosforilacin en Hl no tienen efecto, pero
aquellas que simulan los efectos de la fosforilacin
producen un fenotipo que se parece al de la dele-
cin. Esto permite suponer que el efecto de la fos-
forilacin de Hl es eliminar sus acciones sobre k
estructura de la cromatina local.
Afectan las modificaciones de las histonas de
manera directa la estructura del nucleosoma o si.
efecto sobre la cromatina es indirecto? No hay, de
hecho, muchas pruebas de alguna diferencia en las
propiedades de los nucleosomas conforme al estado
de modificacin de las histonas. Sin embargo, hasta
ahora se han descrito varios casos donde la modi-
ficacin de las histonas crea sitios de unin para
protenas no histonas, que cambian las propiedades
de la cromatina.
Los nucleosomas sujetos a modificacin pueden
ser muy diversos. La modificacin tal vez sea un
episodio local, por ejemplo, restringido a los nucleo-
somas en el promotor. Tambin puede ser un suceso
general que se extiende, por ejemplo, hasta todo un
cromosoma. La ;URA 0.10 muestra que hay una
correlacin general donde la acetilacin se vincula
con la cromatina activa, en tanto la metilacin se
relaciona con la cromatina inactiva. No obstante,
esto no es una regla simple y los sitios particulares
que se modifican (as como las combinaciones de
modificaciones especficas) pueden ser importantes,
de manera que hay, sin duda, excepciones donde
(por ejemplo) las histonas metiladas en cierta po-
sicin se encuentran en la cromatina activa. Las
mutaciones en uno de los complejos de acetilasas
de histonas de levaduras tienen el efecto contrario
al habitual (impiden el silenciamiento de algunos
genes); esto resalta la falta de un efecto uniforme
de la acetilacin.
La especificidad de las modificaciones la indica
el hecho de que muchas de los enzimas modificantes
tienen sitios diana individuales en histonas espec-i
ficas. En la se resumen los efectos de
algunas de las modificaciones. La mayor parte de los
sitios modificados est sujeta a un solo tipo de cam-
bio. En algunos casos, la modificacin de un sitio
804 CAPITULO 30 Control de la estructura de La cromatina
puede activar o inhibir la modificacin en otro. La
idea de que se pueden usar las combinaciones de
seales para definir los tipos de cromatina a veces se
ha llamado cdigo de histonas.
Ocurre acetiLacin de histonas
en dos circunstancias
Conceptos principales
.
Ocurre acetiladn transitoria de histonas durante la
reph
'
cacin.
.
La acetiLacin de histonas se vincula con la activacin
de la expresin gnica.
puede ser parte del sistema que establece los patrones
de acetiladn de histonas despus de la replicacin.
Fuera de la fase S, la acetilacin de histonas en
la cromatina en general tiene correlacin con el es-
tado de expresin gnica. La correlacin se observ
por primera vez porque la acetilacin de histonas
aumenta en un dominio que contiene genes activos
y la cromatina acetilada es ms sensible a la desoxi-
ribonucleasa I y (tal vez) a la nucleasa de micro-
cocos. La muestra que esto implica la
acetilacin de colas de histonas en los nucleosomas,
Ahora se sabe que esto ocurre en gran parte por la
acetilacin de nucleosomas en la vecindad del pro-
motor cuando se activa un gen.
Los nucleosomas se forman a partir
de histonas aceliladas
Todas las histonas centrales pueden acetilarse. Las
principales dianas para la acetilacin son las Usinas
en las colas terminales Nes de las histonas H3 y H4.
La acetilacin tiene lugar en dos circunstancias di-
ferentes:
.
Durante la replicacin del DNA y
.
Cuando se activan los genes.
Cuando se replican los cromosomas, lo que ocu-
rre durante la fase S del ciclo celular, las histonas
se acetilan de manera transitoria. La FIGURA
muestra que esa acetilacin ocurre antes de que las
histonas se incorporen a los nucleosomas. Se sabe
que las histonas H3 y H4 se acetilan en la etapa
en que se vinculan entre s en el tetrmero H3
2
-H4
2
.
El tetrmero se incorpora entonces a los nucleosomas.
Bastante poco despus, se retiran los grupos acetilo.
La importancia de la acetilacin queda de mani-
fiesto por el hecho de que impedirla en las histonas
H3 y H4 durante la replicacin causa prdida de via-
bilidad en las levaduras. Las dos histonas son abun-
dantes como sustratos, porque la levadura puede
mantenerse perfectamente bien en tanto pueda ace-
tilar cualquiera de esas histonas durante la fase S.
Hay dos posibles funciones de la acetilacin: podra
necesitarse para que las histonas sean reconocidas
por factores que las incorporan a los nucleosomas, o
podra requerirse para el ensamblaje, la estructura,
o ambos, del nuevo nucleosoma.
Los factores que se sabe intervienen en el en-
samblaje de la cromatina no distinguen entre his-
tonas acetiladas y no acetiladas, lo que hace pensar
que es ms probable que se requiera la modificacin
para interacciones posteriores. Se ha credo duran-
te mucho tiempo que tal vez se requiera acetilacin
para ayudar a controlar las interacciones protena-
protena que tienen lugar a medida que las histonas
se incorporan a los nucleosomas. Una prueba de tal
participacin es que el complejo de acetilasa de his-
tonas SAS en las levaduras se une al complejo de
ensamblaje de la cromatina en la horquilla de repli-
cacin, donde acetila a la l6Lis de la histona 4. Esto
y\ '\\
JJ
Se retiran los grupos acetilo
'
JJ
JJ
La acetilacin durante la replicacin ocurre en
las histonas antes de que se incorporen a los nucleosomas.
Las histonas de los nucleosomas estn acetiladas
Gen inactivo
0 "AY
J1J
JJ
WJ
JJ
Gen activo
'
JJ
JJ
JJ
La acetilacin relacionada con la activacin
gnica ocurre por modificacin directa de las histonas en los
nucleosomas.
30.6 Ocurre acetilacin de histonas en dos circunstancias 805
Adems de los sucesos en cada promotor, ocu-
rren cambios a gran escala en la acetilacion de los
cromosomas sexuales. Esto es parte del mecanis-
mo por el que las actividades en el cromosoma X
se alteran para compensar la presencia de dos cro-
mosomas X en una especie, pero slo uno (adems
del cromosoma Y) en otras (vase la seccin 31.5,
Los cromosomas X presentan cambios globales). El
cromosoma X inactivo en mamferos hembra tiene
una H4 subacetilada. El cromosoma X superactivo
en machos del gnero Drosophila presenta mayor
acetilacin de H4, lo que sugiere que la presencia
del grupo acetilo puede ser un prerrequisito para
una estructura activa menos condensada. En el
macho del gnero Drosophila, el cromosoma X est
acetilado de manera especfica en la
16Lis de la his-
tona H4. La acetiltransferasa de las histonas (HAT)
encargada es una enzima que se recluta al cromoso-
ma como parte de un gran complejo protenico. Este
complejo de
"
compensacin de dosis
"
se encarga de
introducir cambios generales en el cromosoma X
que le permiten una mayor expresin. El aumento
de la acetilacin es slo una de sus actividades.
f?!*! Las acetiLasas se reLacionan
con activadores
Conceptos principales
La cromatina desacetilada puede tener una estructura
ms condensada.
Los activadores de la transcripcin se relacionan
con-actividades de acetilasa de histonas en grandes
complejos.
Las acetilasas de histonas varan en su especificidad
diana.
La acetilacin podra afectar la transcripcin en una
forma cuantitativa o cualitativa,
La acetilacin es reversible. Cada direccin de la
reaccin es catalizada por un tipo especfico de en-
zima. Las enzimas que pueden acetilar histonas se
llaman acetiltransferasas de histonas o HAT; los
grupos acetilo son retirados por las desacetilasas
de histonas o HDAC. Hay dos grupos de enzimas
HAT: aquellas en el grupo A actan sobre las histo-
nas de la cromatina y participan en l control de la
transcripcin. Las del grupo B actan sobre histonas
de reciente sntesis en el citosol y participan en el
ensamblado de los nucleosomas.
Dos inhibidores han permitido analizar la aceti-
lacin. La tricostatina y el cido butrico inhiben las
desacetilasas de histonas y hacen que se acumulen
nucleosomas acetilados. El uso de estos inhibidores
ha servido de sustento a la opinin generalizada
de que la acetilacin se vincula con la expresin
gnica; de hecho, la capacidad del cido butrico de
causar cambios en la cromatina semejantes a los
observados en la activacin de genes constituye uno
de los primeros indicios de la conexin entre aceti-l
lacin y actividad gnica,
El gran adelanto logrado al analizar la funcin
de la acetilacin de histonas fue la descripcin de las
enzimas acetilantes y desacetilantes y su vnculo con
otras protenas que intervienen en episodios espe-
cficos de activacin y represin. Un cambio bsicol
en la manera de ver la acetilacin de histonas lo
propici el descubrimiento de que las HAT no son
necesariamente enzimas dedicadas vinculadas con la
cromatina; ms bien resulta que los activadores de
la transcripcin conocidos tienen actividad de HATJ
Se estableci la conexin cuando se identifica
la subunidad cataltica de un grupo A de HAT como
homloga de la protena reguladora Gcn5 en leva-
duras. Despus se demostr que la Gcn5 misma tie-
ne actividad de HAT (con las histonas H3 y H4 como
sustratos). La Gcn5 es parte de un complejo adaptaJ
dor necesario para la interaccin entre 300 potencia-j
dores y sus promotores diana. Su actividad de HAT
se requiere para la activacin del gen diana.
Esto permite cambiar la imagen de la accin de
los coactivadores, como se muestra en la FIGURA 30.14,
donde la polimerasa de RNA se une a un sitio hiperJ
sensible y los coactivadores son histonas acetilantesj
en los nucleosomas de la vecindad. Se sabe hoy de
muchos ejemplos de interacciones de este tipo.
El Gcn5 conduce a uno de los complejos de
acetilasas ms importantes. En las levaduras, Gcn5
es parte del complejo de acetiltransferasa Spt-Ada-
Gcn5 (SAGA) de 1.8 MDa que contiene varias pro-
Algunos coactivadores son acetilasas
Activadores
Coactivadores
Aparato basai
PCAF
CPB/p300
Polimerasa de RNA
Colas de histonas
Los coactivadores pueden tener actividades de
HAT que aceti [a n las colas de las histonas nucleosmicas.
806 CAPTULO 30 Control de la estructura de la cromatina
tenas que participan en la transcripcin. Entre estas
protenas se encuentran varios TAFn. Adems, la
subunidad TAF
n
145 de TF
U
D es una acetilasa. (La
TAF
n
145 de levaduras es homloga de la TAF
n
250
de los mamferos; ambas conocidas como TAF1.)
Hay algunas funciones que coinciden entre TAF
jj
D
y SAGA, la ms notoria es que las levaduras pue-
den mantenerse conTAF
n
145 o Gcn5, pero se daa
por la delecin de ambos. Esto permite suponer que
una actividad de acetilasa es indispensable para la
expresin gnica, pero puede proporcionarla TF
jj
D
o SAGA. Como podra esperarse por el tamao del
complejo de SATA, la acetilacin es slo una de sus
funciones, si bien sus dems acciones en la activa-
cin gnica no estn tan bien descritas.
Uno de los primeros activadores generales en
caracterizarse como HAT fue la protena de unin
dep300/CREB (CBP). (En la actualidad, p300 y CBP
son protenas diferentes, pero tienen una relacin
tan cercana que a menudo se consideran como un
solo tipo de actividad). La p300/CBP es un coactiva-
dor que enlaza a un activador con el aparato basal
(vase la Figura 25.7). La pBOO/CBP interacta con
varios activadores, como los receptores hormonales,
AP-1 (c-Jun y c-Fos) y MyoD. La interaccin es in-
hibida por las protenas reguladoras vricas El A de
adenovirus y el antgeno T de SV40, que se unen
a pBOO/CBP para impedir la interaccin con facto-
res de transcripcin; esto explica cmo estas pro-
tenas vricas inhiben la transcripcin celular. (Esta
iniciacin es importante para la capacidad de las
protenas vricas de contribuir al estado tumorig-
nico). La p300/CBP acetila las colas terminales Nes
de H4 en los nucleosomas. Otro coactivador, PCAF,
acetila de manera preferente la H3 en los nucleo-
somas. La p300/CBP y TCAF forman un complejo
que participa en la activacin de la transcripcin. En
algunos casos interviene otro HAT: el coactivador
ACTR, que acta con receptores de hormonas y es
en s un HAT que acta sobre H3 y H4 y tambin
recluta tanto p300/CBP como PCAF para formar un
complejo coactivador. Una explicacin de la presen-
cia de mltiples actividades de HAT en un complejo
de coactivacin es que cada HAT tiene especificidad
diferente y que se requieren mltiples episodios de
acetilacin diversos para la activacin.
Una caracterstica general de la acetilacin es
que un HAT del grupo A es parte de un gran com-
plejo. En la FIGURA 30.1E se muestra un modelo sim-
plificado de su comportamiento. Los complejos HAT
pueden dirigirse al DNA gracias a interacciones con
factores de unin al DNA. Esto determina la diana
del HAT. El complejo tambin contiene subunidades
detectoras que alteran la estructura de la cromatina
o actan de manera directa sobre la transcripcin.
Es posible que al menos algunos de los electores
requieran el episodio de acetilacin para actuar. La
desacetilacin, catalizada por una HDAC, puede ac-
tuar en forma similar,
Ocurre acetilacin tanto en la replicacin
(cuando es transitoria) como en la transcripcin
(cuando se mantiene mientras el gen est activo).
Desempea el mismo papel en cada caso? Una
posibilidad es que el efecto importante tenga lugar
sobre la estructura del nucleosoma. La acetilacin
puede ser indispensable para
"
hacer ms laxo" el
meollo del nucleosoma. En la replicacin tal vez se
requiera la acetilacin de histonas para permitirles
su incorporacin a nuevos meollos con ms facili-
dad. Es posible que en la transcripcin se necesite
un cambio similar para permitir una modificacin
relativa de la estructura, tal vez incluso permitir el
desplazamiento del meollo de la histona del DNA,
Otra posibilidad es que la acetilacin genere sitios
de unin para otras protenas que se requieren en
la transcripcin. En cualquier caso, la desacetilacin
revertira el efecto.
Es cuantitativo o cualitativo el efecto de la ace-
tilacin? Es posible que se requiera cierto nmero
de grupos acetilo para ejercer un efecto y en gran
medida carece de importancia la posicin exacta
donde ocurre. Una alternativa es que cada episodio
de acetilacin tenga efectos especficos. Podra inter-
pretarse que hay complejos que contienen mltiples
actividades de HAT en cualquier forma; si diferentes
enzimas tienen diversas especificidades, tal vez se
requieran mltiples actividades ya sea para acetilar
un nmero suficiente de posiciones diversas o por-
que se necesitan sucesos individuales para diferentes
efectos sobre la transcripcin. En la replicacin, pa-
rece (al menos con respecto a la histona H4) que la
acetilacin en cualquiera de las dos de tres posiciones
disponibles es adecuada, lo que favorece un mode-
lo cuantitativo en este caso. Donde la estructura de
la cromatina cambia para modificar la transcripcin, la
Los complejos de modificacin tienen varios componentes
La subunidad La desacetilasa Los efectores actan
diana se une acta sobre las sobre la cromatina o
al DNA colas de histonas el DNA
1 | liJ JJ JJJJ
FIGURA 30.15 Los compLejos que modifican La estructura o ac-
tividad de La cromatina tienen subunidades diana que determinan
sus sitios de accin. Las enzimas HAT o Las HDAC que acetiLan o
desacetiLan histonas y subunidades efectoras que tienen otras
acciones sobre La cromatina o eL DNA.
30.7 Las acetiiasas se reLacionan con activadores 807
acetilacin en posiciones especficas es importante
(vase la seccin 31.3, La heterocromatina depende
de las interacciones con histonas).
Las desacetiLasas se relacionan
con Los represores
Conceptos principales
.
La desacetilacin se vincula con la represin de la
actividad gnica.
.
Hay desacetilasas presentes en complejos con actividad
represora.
En las levaduras, las mutaciones en SIN3 y RPD3 ac-
tan como si estos loci reprimieran una diversidad
de genes. Las protenas forman un complejo con la
protena de unin a DNA Ume6, que se une al ele-
mento URS1. El complejo reprime la transcripcin
en los promotores que contienen URS1, como se
ilustra en la . La Rpd3 tiene actividad
de desacetilasa de histonas; no se sabe si la funcin
de Sin3 consiste slo en llevar Rpd3 al promotor o
si tiene alguna otra funcin en la represin.
Las clulas de mamferos tienen un sistema
similar para la represin. La familia bHLH de re-
guladores de la transcripcin incluye activadores
que actan como heterodmeros, entre los que se
encuentra MyoD (vase la seccin 25.15, Las pro-
tenas hlice-asa-hlice interactan por vnculo
combinatorio). Tambin comprende represores, en
particular el heterodmero Mad:Max, donde Mad
puede pertenecer a un grupo de protenas muy
relacionadas. El heterodmero Mad:Max (que se
une a sitios especficos del DNA) interacta con un
homlogo de Sin3 (llamado mSin3 en el ratn y
hSin3 en los seres humanos). El mSin3 forma par-
La desacetilacin reprime la transcripcin
Correpresor - ,
c:Z,r, Rpa3
Ume6
(unin a DNA)
O
(desaceliiasa)
JJ
JIJJ
Un complejo represor tiene tres componentes:
una subunidad de unin a DNA, un correpresor y una desace-
tilasa de histonas.
te de un complejo represivo que incluye protenas
de unin a histonas y las desacetilasas de histonas
HDAC1 y HDAC2. Se requiere la actividad de des-
acetilasa para la represin. La naturaleza modular
de este sistema la recalcan otros medios de empleo:
un correpresor (SRMT), que permite a los recepto-
res de hormonas retinoides reprimir ciertos genes
diana, que acta por unin a mSin3, que a su vez
lleva las actividades de HDAC al sitio. Otro medio
de llevar actividades de HDAC al sitio puede ser una
conexin con MeCP2, una protena que se une a d-
tosinas metiladas (vase la seccin 24.19, Los islotes
CpG son dianas reguladoras).
La falta de acetilacin de histonas tambin
es una caracterstica de la heterocromatina, lo que es
cierto en el caso de la heterocromatina constitutiva
(que, por lo general, incluye regiones de centr-
meros o telmeros) y la heterocromatina faculta-
tiva (regiones que son desactivadas en una clula
aunque estn activas en otra). Por lo general, las
colas terminales N de las histonas H3 y H4 no estn
acetiladas en las regiones heterocromticas.
PiH Las metiladones de histonas
y de DNA estn relacionadas
Conceptos principales
La metilacin de DNA y de histonas es una
caracterstica de la cromatina Inactiva.
Los dos tipos de episodios de metilacin pueden estar
relacionados.
La metilacin de histonas y de DNA se vincula cor-
la inactividad. Los sitios metilados en las histona?
comprenden dos Usinas en la cola de H3 y una ar-
ginina en la cola de H4.
La metilacin de la 9Lis de H3 es una caracter:
'
:
--
tica de las regiones condensadas de cromatina que
incluyen la heterocromatina como se observa en > _
mayor parte y tambin regiones ms pequeas, que
se sabe no tienen expresin. La enzima transieras;
de metilos de histonas que acta en esta lisina
llama SUV39H1. (Se ofrece el origen de este pecu-
liar nombre en la seccin 30.13, Algunos segmentos
comunes se encuentran en protenas que modificar
la cromatina.) Su sitio cataltico tiene una regirr
llamada dominio SET. Otras transferasas de metilo;
de histonas actan sobre la arginina. Adems, pue-
de ocurrir metilacin en la 79Lis de la regin central
globular de H3, que podra necesitarse para la for-
macin de heterocromatina en los telmeros.
Hasta fecha reciente se crea que la metiladcr
de histonas era irreversible. No obstante, ya se ide" -
tificaron desmetilasas de histonas, incluida una dc -
808 CAPTULO 30 Control de la estructura de la cromatina
metilasa especfica de lisina (LSD1) que acta sobre
K4 de la historia H3 y una enzima que desmetila la
arginina en las histonas H3 y H4. Aun no se sabe
como se regula la desmetilacin.
Gran parte de los sitios de metilacin en el DNA
son islotes CpG (vase la seccin 24.19, Los islotes
CpG son dianas reguladoras). Las secuencias CpG
en la heterocromatina por lo general estn meti-
ladas. Por el contrario, para que un gen se exprese
es indispensable que los islotes CpG localizados en
regiones promotoras sean desmetilados (vase la
seccin 24.18, La expresin gnica se vincula con
la desmetilacin).
La metilacin de DNA y de histonas est co-
nectada en un circuito de reforzamiento mutuo. La
metilacin de H3 es la seal que recluta la metilasa
del DNA hacia la cromatina. El orden de los epi-
sodios es que la 9Lis de H3 se desacetila para crear
un sustrato para la metilacin. La H3 se convierte
entonces al estado de Me9Lis o Me
2
9Lis
, que ofrece
un sitio de unin para la metilasa de DNA. Algunas
enzimas transferasas de metilos de histonas contie-
nen sitios posibles de unin para el par CpG meti-
lado, de manera que la metilacin del DNA refuer-
za el circuito con el fin de brindar una diana para
que la transferasa de metilos de histonas se una. El
punto importante es que un tipo de modificacin
puede desencadenar el otro. Estos sistemas estn
muy generalizados, como se observa por las pruebas
de estas conexiones en hongos, plantas y clulas
animales, y de la regulacin de la transcripcin en
los promotores usados por las polimerasas I y II de
RNA, as como el mantenimiento de la heterocro-
matina en un estado inerte.
El tipo contrario de episodios tiene lugar cuan-
do se compara la activacin de un promotor con la
generacin de heterocromatina. Las acciones de las
enzimas que modifican la cromatina aseguran que
los sucesos de activacin sean mutuamente exclu-
yentes con respecto a los de desactivacin. La me-
tilacin de 9Lis de H3 y la acetilacin de I4Lis de H3
son mutuamente antagonistas.
Las acetilasas y desacetilasas pueden desenca-
denar los episodios iniciadores. La desacetilacin
permite que ocurra la metilacin, lo que da lugar a
la formacin de un complejo heterocromtico (va-
se la seccin 31.3, La heterocromatina depende de
interacciones con las histonas). La acetilacin marca
una regin como activa (vase la seccin 30.11, La
activacin del promotor comprende una serie orde-
nada de episodios).
BEB La activacin del promotor
comprende una serie ordenada
de episodios
Conceptos principales
E[ complejo de remodelado puede reclutar al complejo
de acetilacin.
La acetilacin de histonas puede ser el suceso que
mantenga al complejo en estado activado.
Cmo se reclutan las acetilasas (o desacetilasas)
en sus dianas especficas? Como se ha observado
con los complejos de remodelado, es posible que
el proceso sea indirecto. Un activador (o represor)
Los estadas de la cromatina
se interconverten
por modificacin
Tres tipos de modificacin afectan la cromatina
Conceptos principales
.
La acetilacin de histonas se relaciona con la
activacin gnica.
.
La metilacin de DNA y de histonas se relaciona con la
heterocromatina.
En la FIGURA 0.17 se resumen los tres tipos de di-
ferencias observadas entre las cromatinas activa e
inactiva.
.
La cromatina activa se acetila en las colas de
las histonas H3 y H4.
.
La cromatina inactiva se metila en la 9Lys de
la histona H3.
. La cromatina inactiva se metila en las cito-
sinas de los pares CpG.
Estado inactivo
JJI
Estado activo
Acetilasa
de histonas
Desacetilasa
de histonas
esmetilasa
de histonas
Metilasa
de histonas
(Desmetiiasa
de DNA?)
Metiiasa
de DNA
JJ
La acetilacin de las histonas activa la croma-
tina, y la metilacin de DNA y las histonas la desactiva.
30.11 La activacin del promotor comprende una serie ordenada de episodios 809
especfico de secuencia puede interactuar con un
componente del complejo de la acetilasa (o desace-
tilasa) para reclutar un promotor.
Puede haber tambin interacciones directas en-
tre complejos de remodelado y complejos de mo-
dificacin de histonas. La unin por el complejo
de remodelado SWI/SNF puede llevar a su vez a la
unin por el complejo de acetilasa SAGA. Luego,
la acetilacin de histonas puede, de hecho, estabi-
lizar el vnculo con el complejo SWI/SNF, lo que
hace un reforzamiento mutuo de los cambios de los
componentes en el promotor.
Se pueden conectar todos los sucesos que tie-
nen lugar en el promotor a la serie resumida en la
. El episodio de iniciacin es la unin de
La activacin del promotor tiene muchos episodios
El factor de transcripcin se une a una secuencia especfica
El complejo de remodelado se une a travs de un factor
mi
El factor se libera
El remodelado cambia la organizacin del nucleosoma
El complejo de acetilasa se une por medio del complejo
de remodelado
Se modifican las histonas
0.18 La activacin del promotor comprende la unin
de un activador especfico de secuencia, el reclutamiento
y la accin de un complejo de remodelado, y el reclutamiento y
la accin de un complejo de acetilacin. El orden de los episo-
dios puede diferir, o tal vez se presenten de manera simultnea,
de acuerdo con el gen.
un componente especfico de secuencia (que puede
hallar su secuencia diana en el DNA en el contexto
de la cromatina), lo que recluta un complejo de re-
modelado. Los cambios ocurren en la estructura del
nucleosoma. Un complejo de acetilacin se une y la
acetilacin de las histonas diana provee una marca
covalente de que el sitio se ha activado.
Tambin ocurre modificacin del DNA en el
promotor. La metilacin de la citosina en pares CpG
se vincula con la inactividad gnica (vase la sec-
cin 24.18, La expresin gnica se relaciona con la
desmetilacin). La base para el reconocimiento del
DNA como diana de la metilacin no est muy bien
esclarecida (vase seccin 31.8, La metilacin del
DNA se encarga de la impresin).
Es claro que el remodelado de la cromatina en
el promotor requiere una diversidad de cambios que
afectan el nucleosoma, incluida la acetilacin, pero,
qu cambios se requieren dentro del gen para
que una polimerasa de RNA lo atraviese? Se sabe que
la polimerasa de RNA puede transcribir el DNA in
vitro a velocidades parecidas a la velocidad in vive
(-25 nucletidos por segundo),
slo con un molde
de DNA libre. Se han descrito varias protenas por
su capacidad para mejorar la velocidad con que la
polimerasa de RNA transcribe la cromatina in vivo.
La caracterstica comn es que actan sobre la cro-
matina. Un modelo actual de su accin es que se
asocian a la polimerasa de RNA y viajan con ella a
lo largo del molde, lo que modifica la estructura del
nucleosoma por su accin sobre las histonas. Entre
estos factores estn las acetilasas de histonas. Una
posibilidad, es que la primera polimerasa de RNA en
transcribir un gen sea la pionera de los factores de
acarreo de la polimerasa que cambien la estructura
de la unidad de transcripcin, para hacer ms fcil
la actuacin de las polimerasas posteriores.
La fosforiLacin de Las histonas
afecta La estructura
de La cromatina
Concepto principal
Al menos dos histonas son dianas para la fosforilacin,
tal vez con efectos contrarios.
Las histonas se fosforilan en dos circunstancias:
.
de manera repetida en el ciclo celular, y
.
en relacin con el remodelado de la croma-|
tina.
Se ha sabido durante mucho tiempo que la his-
tona Hl es fosfotilada durante la mitosis y en fecha
ms reciente se descubri que constituye un sustra-
810 CAPTULO 30 Control de la estructura de la cromatina
to muy bueno para la cinasa Cdc2/ que controla la
divisin celular. Ello llev a la especulacin de que
la fosforilacin tal vez se relacione con la conden-
sacin de la cromatina, pero hasta ahora no se ha
demostrado un efecto directo de este episodio de
fosforilacin y no se sabe si tiene participacin en
la divisin celular.
La prdida de una cinasa que fosforila la histo-
na H3 en la 10Ser tiene efectos devastadores sobre
la estructura de la cromatina. En la GURA 30 ,9 se
compara la estructura extendida usual del conjunto
de cromosomas politnicos de la Drosophila melano-
gaster (fotografa superior) con la estructura que se
observa en una mutante nuclear que no tiene cina-
sa JIL-I (fotografa inferior). La ausencia de JIL-I es
letal, pero los cromosomas pueden visualizarse en
las larvas antes de su muerte.
La causa de la prdida de la estructura es con
toda probabilidad la falta de fosforilacin de la his-
tona H3 (por supuesto, JIL-I puede tener tambin
otras dianas). Esto permite suponer que se requie-
re la fosforilacin de H3 para generar la estructura
cromosmica ms extendida de las regiones eucro-
mticas. La prueba que sustenta la idea de que JIL-I
acta de manera directa sobre la cromatina es que
se relaciona con el complejo de protenas que se une
al cromosoma X para aumentar su expresin gnica
en machos (vase la seccin 31.5, Los cromosomas
X sufren cambios globales).
Esto deja algunas impresiones contradictorias
respecto de la funcin de la fosforilacin de las his-
tonas. Si tiene importancia en el ciclo celular, es
posible que sea una seal para la condensacin. Su
efecto sobre el remodelado de la cromatina pare-
ce ser el contrario. Por supuesto, es posible que la
fosforilacin de diferentes histonas o incluso de di-
ferentes aminocidos en una de ellas, tenga efectos
contrarios sobre la estructura de la cromatina.
La prdida de JIL-1 causa condensacin
J
D.19 Las moscas que no tienen JIL-1 cinasa pre-
sentan cromosomas politnicos anormales que se condensan
en lugar de extenderse. Las fotografas son cortesa de Jorgen
Johansen y Kristen M. Johansen, lowa State University.
Se encuentran algunos
segmentos comunes
en Las protenas
que modifican La cromatina
Conceptos principales
El dominio cromo se encuentra en varias protenas
de la cromatina que tienen efectos de activacin o
represin sobre la expresin de los genes.
.
El dominio SET es parte del sitio cataltico de las
transferasas de metilos de protenas.
.
El dominio bromo se encuentra en una diversidad de
protenas que interactan con la cromatina y sirve para
reconocer sitios acetilados en las histonas.
Los conocimientos que se tienen sobre los meca-
nismos moleculares del control de la estructura de
la cromatina se inician con mutantes que influyen
en el efecto de la variegacin de la posicin. Se han
identificado casi 30 genes en el gnero Drosophila y
se denominan de manera sistemtica Su(var) aque-
llos cuyos productos actan suprimiendo la varia-
cin y E (var) aquellos cuyos productos la aumen-
tan. Recurdese que los genes se nombran por la
conducta de los loci mutantes. Las mutaciones de
Su (var) yacen en genes cuyos productos son ne-
cesarios para la formacin de la heterocromatina e
incluyen enzimas que actan sobre la cromatina,
como las desacetilasas de histonas, y las protenas
que se localizan en la heterocromatina. Las muta-
ciones E (var) yacen en genes cuyos productos son
indispensables para activar la expresin gnica e in-
30.13 Se encuentran algunos segmentos comunes en las protenas que modifican la cromatina
811
cluyen miembros del complejo SWI/SNP. Por estas
propiedades se infiere de inmediato que la modifica-
cin de la estructura de la cromatina es importante
para controlar la formacin de heterocromatina. La
universalidad de estos mecanismos la indica el he-
cho de que muchos de estos loci tienen homlogos
en levaduras que muestran propiedades anlogas.
Algunos de los homlogos en Schizosaccharomyces
pombe son clr (genes reguladores de loci crpticos)
donde las mutaciones afectan el silenciamiento.
Muchas de las protenas Su(var) y E(var) tienen
un segmento comn de 60 aminocidos llamado cro-
modominio o dominio cromo. El hecho de que este
dominio se encuentre en protenas de ambos grupos
permite suponer que representa un segmento que
participa en las interacciones protena-protena en
la cromatina.
Los cromodominios se encargan en gran par-
te de dirigir las protenas hacia la heterocromatina.
Actan por reconocimiento de Usinas metiladas en
colas de histonas (vase la seccin 31.3, La hetero-
cromatina depende de interacciones con las histonas
y la seccin 31.4, Polycomb y Trithorax son represo-
res y activadores antagonistas).
La Su(var) 3-9 tiene un cromodominio y tambin
un Su(var)3-9/ un dominio potenciador de gusto
Trithorax (SET), segmento que se encuentra en
varias protenas Su(var). Sus homlogos en mam-
feros se localizan en la heterocromatina del centr-
mero. Es la transferasa de metilos de histonas la que
La cola H3 presenta estados alternativos
la (n reois Glntreo,Ala rgs Sertre
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Cinasa
I
o
Ala rgTreis Glnfreo Ala Arg Lis Serfreo.GJU <3I lis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Acetilasa
Activa
Ala ArgTreo Lis G.nTreo Ala Arg .us SerTreoGlu Glu Lis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Desacetilacin
Desfosforilacin
Metilacin
inactiva
I
Ala Argirec Lis GlnTreoAa Arg Us SerTreoGlu Glu Lis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Las mltiples modificaciones en la cola H3
afectan la actividad de la cromatina.
acta sobre 9Lis de la histona H3 (vase la seccin
30.9, La metilacin de histonas y de DNA estn
relacionadas). El dominio SET es parte del sitio ac-
tivo y, de hecho, es marcador de la actividad de
metilasa.
El bromodominio o dominio bromo se encuen-
tra en una diversidad de protenas que interactan
con la cromatina, como las acetilasas de histonas.
La estructura cristalina muestra que tiene un sitio
de unin para la lisina acetilada. El bromodominio
mismo reconoce slo una secuencia muy corta de
cuatro aminocidos que incluye la lisina acetilada,
por lo que la especificidad para el reconocimiento
del sitio diana debe depender de interacciones que
abarquen ambas regiones. Adems de las acetilasas,
el bromodominio se encuentra en una variedad de
protenas que interactan con la cromatina, como
los componentes del aparato de transcripcin. Esto
indica que se utiliza para reconocer histonas aceti-
ladas, lo que significa que tal vez se encuentre en
protenas que participan en la activacin gnica.
Aunque hay una correlacin general donde la
cromatina activa se acetila, en tanto la inactiva es
metilada en las histonas, hay algunas excepciones
a la regla. La mejor definida es que la acetilacin de
12Lis de H4 se vincula con la heterocromatina.
Puede haber modificaciones mltiples en la'
misma cola de histona y una puede influir en otra/
'
La fosforilacin de una serina en una posicin pue-i
de ser necesaria para la acetilacin de una lisina edj
otra.
La FIGURA 30.20 muestra la situacin en la colaf
de H3, que puede existir en uno de dos estados. EL
estado inactivo tiene una 9Lis metilada. El estada
activo tiene una 9Lis acetilada y una 10Ser fosfatada.
Estos estados se pueden mantener sobre regiones
amplias de la cromatina. La fosforilacin de I0Ser
la metilacin de 9Lis son mutuamente inhibitorias,
lo que sugiere el orden de episodios que se muestra
en la figura. Esta situacin puede hacer que la cola
se mueva entre los estados activo e inactivo.
JJJJ Resumen
Los genes cuyas regiones de control se organizad
en los nucleosomas por lo general no se expresan.]
En ausencia de protenas reguladoras especficas,}
los promotores de otras regiones reguladoras se or-
ganizan por octmeros de histonas en un estado
en el que no pueden activarse. Esto puede expli-
car la necesidad de los nucleosomas de ubicarse
de manera precisa en la vecindad de un promotor, de
manera que los sitios reguladores indispensables
se expongan en forma apropiada. Algunos factores
de transcripcin tienen la capacidad de reconocer
812 CAPTULO 30 Control de la estructura de la cromatina
el DNA en la superficie del nucleosoma y puede
requerirse un posicionamiento particular del DNA
para la iniciacin de la transcripcin.
Las cromatinas activa e inactiva no estn en
equilibrio. Se requieren episodios sbitos de esci-
sin para convertir una en la otra. Los complejos
de remodelado de la cromatina tienen la capacidad
de desplazar octmeros de histonas por un mecanis-
mo que comprende la hidrlisis de ATP. Los com-
plejos de remodelado son grandes y se clasifican
de acuerdo con el tipo de subunidad de fosfatasa
del trifosfato de adenosina. Dos tipos frecuentes
son SWI/SNF e ISWI. Una forma caracterstica de
este remodelado de la cromatina es desplazar uno
o ms de los octmeros de histonas de secuencias
especficas del DNA, creando un lmite que da como
resultado el posicionamiento preciso o preferente
de los nucleosomas cercanos. El remodelado de la
cromatina puede tambin comprender cambios en
las posiciones de los nucleosomas, que a veces im-
plican el deslizamiento de los octmeros de histonas
por el DNA,
La acetilacin de histonas tiene lugar tanto en la
replicacin como en la transcripcin y en ocasiones
es necesaria para formar una estructura de croma-
tina menos compacta. Algunos coactivadores que
conectan factores de transcripcin con el aparato ba-
sal tienen actividad de acetilasas de histonas. Por el
contrario, los represores pueden vincularse con des-
acetilasas.
Las enzimas modificantes pueden ser especficas
de aminocidos particulares en histonas especficas.
Los sitios ms frecuentes de modificacin se locali-
zan en las colas terminales N de las histonas H3 y H4
que protruyen desde los nucleosomas entre los giros
del DNA. Los complejos de activacin (o represin)
suelen ser grandes y a menudo contienen varias ac-
tividades que emprenden diferentes modificaciones
de la cromatina. Algunos segmentos comunes que
se encuentran en las protenas que modifican la
cromatina son el cromodominio (que se encarga de
las interacciones protena-protena), el bromodomi-
nio (que se dirige a la Usina acetilada) y el dominio
SET (que es parte de los sitios activos de las transfe-
rasa de metilos de las histonas).
La modificacin de las colas de histonas cons-
tituye un desencadenante de la reorganizacin de
la cromatina. La acetilacin en general se vincula
con la activacin gnica. Las acetilasas de histonas
se encuentran en complejos de activacin, y las
desacetilasas de histonas en complejos de inactiva-
cin. La metilacin de las histonas se vincula con la
inactivacin gnica. Algunas de las modificaciones
de las histonas pueden ser exclusivas o sinrgicas
con otras.
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La cromatina puede tener estados alternativos
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Referencias 817
Los efectos epigenticos
son heredados
ESQUEMA DEL CAPTULO
ED Introduccin
.
Los efectos epigenticos pueden ser consecuencia de la
modificacin de un cido nucleico despus de que se ha
sintetizado o de la perpetuacin de estructuras protenicas.
BB La heterocromatina se propaga a partir de un
episodio de nucleacin
.
La heterocromatina es nucleada en una secuencia
especifica y la estructura inactiva se propaga por la fibra
de cromatina.
.
Los genes dentro de las regiones de heterocromatina estn
inactivos.
.
La longitud de la regin inactiva varia de una clula a otra;
como resultado, la desactivacin de genes en esta vecindad
causa un efecto de posicin abigarrado.
.
Ocurren efectos de dispersin similares en los telmeros
y los cartuchos silentes en el tipo de apareamiento de las
levaduras.
BSM La heterocromatina depende de interacciones con
Las histonas
.
La HPl es la proteina clave en la formacin de la
heterocromatina de mamfero y acta por unin a la
histona H3 metilada.
*
La Rapl inicia la formacin de la heterocromatina en
levaduras por unin a secuencias diana especficas en el
DNA.
.
Las dianas de Rapl incluyen repeticiones telomricas y
silenciadores en HML y HMR.
.
La Rapl recluta Sir3/Sir4 que nteractan con las colas
terminales N de H3 y H4.
BES PoLycomb y Trithorax son represores y activadores
antagonistas
.
Las proteinas del grupo Polycomb (Pc-G) perpetan un
estado de represin por medio de las divisiones celulares.
.
El PRE es una secuencia del DNA indispensable para la
accin de Pc-G.
.
La PRE constituye un centro de nucleacin a partir del cual
las proteinas Pc-G propagan una estructura inactiva.
.
No se ha encontrado una protena Pc-G individual que
pueda unirse a PRE.
.
El grupo de proteinas Trithorax antagoniza la accin de
Pc-G.
.EEI Los cromosomas X experimentan cambios globales
.
Uno de los dos cromosomas X se desactiva al azar en cada
clula durante la embriognesis de [os mamferos euterios.
En casos excepcionales donde hay ms de dos cromosomas
X
, todos, excepto uno, estn desactivados.
*
El Xic (centro de desactivacin de X) es una regin
de actuacin en configuracin cis en el cromosoma X,
necesaria y suficiente para asegurar que slo un cromse
X permanezca activo.
El Xic incluye al gen Xi'st que codifica un RNA que se
encuentra slo en cromosomas X inactivos.
*
Se desconoce el mecanismo encargado de prevenir que e.
RNA Xist se acumule en el cromosoma activo.
BO Las condensinas producen la condensacin de le
cromosomas
.
Las protenas SMC son fosfatasas del trifosfato de
adenosina que incluyen condensinas y cohesinas.
.
Un heterodimero de las proteinas SMC se vincula con o"
subunidades.
.
Las condensinas hacen que la cromatina de enrolle en
forma ms estrecha por la introduccin de superhlices
positivas al DNA.
'
Las condensinas se encargan de condensar los cromosor;
durante la mitosis.
.
Las condensinas especficas de cromosomas se encarga" i
condensar cromosomas X inactivos en C. elegans.
EB Una metilasa de mantenimiento perpeta La
metilacin del DNA
.
Casi todos los grupos metilo del DNA se encuentran en U
citosinas de ambas cadenas del par CpG.
.
La replicacin convierte un sitio por completo metiladc
uno hemimetilado.
Una metilasa de mantenimiento convierte los sitios
hemimetilados en metilados por completo.
EB La metilacin del DNA se encarga de la impresi
.
Los alelos materno y paterno pueden tener diferentes
patrones de metilacin en la fecundacin.
.
La metilacin suele vincularse con la desactivacin del
gen.
.
Cuando los genes tienen impresin diferencial, la
supervivencia de los embriones puede requerir que el ale,
funcional sea provisto por el progenitor con el alelo no
metilado.
.
La supervivencia de heterocigotos para genes impresos e;
diferente, de acuerdo con la direccin del cruce.
.
Los genes impresos se presentan en grupos y pueden
depender de un sitio de control local, donde ocurre met\
cin nueva, a menos que se evite de manera especfica.
BB Un solo centro puede controlar los genes con
impresin opuesta
*
Los genes impresos son controlados por la metilacin de
sitios de accin en configuracin os.
818
La metiladn pueden encargarse de desactivar o
activar un gen.
nmia Los efectos epigenticos pueden heredarse
.
Los efectos epigenticos pueden derivarse de una
modificacin de un cido nucleico despus de que se
ha sintetizado, o por la perpetuacin de estructuras
proteinicas.
Mmi Los priones de levaduras muestran herencia
desusada
.
La proteina Sup35 en su forma soluble de tipo silvestre
es un factor de terminacin de la traduccin.
.
Tambin puede existir en una forma alternativa de
agregados oligomricos, donde no es activa para la
sntesis de protenas.
.
La presencia de una forma oligomrica hace que la
protena recin sintetizada adquiera la estructura
inactiva.
. La conversin entre las dos formas recibe la influencia
de los chaperones.
.
La forma de tipo silvestre tiene el estado gentico
recesivo psr y la forma mutante tiene el estado
gentico dominante PSI\
nmn Los priones causan enfermedades en Los
mamferos
.
La protena que causa encefalopata espongiforme
ovina tiene dos formas de presentacin: la PrPc
no infecciosa de tipo silvestre, susceptible a las
proteasas, y la PrPSc que causa enfermedad y es
resistente a las proteasas.
.
La enfermedad neurolgica se puede transmitir a los
ratones mediante la inyeccin de la protena PrPSc
purificada.
.
El ratn receptor debe tener una copia del gen PrP que
codifica la protena de ratn.
.
La protena PrPSc puede autoperpetuarse y hacer que
la protena PrP, recin sintetizada, adopte la forma de
PrPSc en lugar de la forma PrPc.
Mltiples cepas de PrPSc pueden tener diferentes
conformaciones proteinicas.
EBB Resumen
Introduccin
Concepto principal
Los efectos epigenticos pueden ser consecuencia de
la modificacin de un cido nucleico despus de que
se ha sintetizado o de la perpetuacin de estructuras
proteinicas.
La herencia epigentica describe la posibilidad de
que diferentes estados, que pueden tener diferentes
consecuencias fenotpicas, se hereden sin ningn
cambio en la secuencia del DNA. Esto significa que
dos individuos con la misma secuencia de DNA en
el locus que controla el efecto pueden mostrar dife-
rentes fenotipos. La causa bsica de este fenmeno
es la existencia de una estructura autoperpetuante
en uno de los individuos, que no depende de la
secuencia de DNA. Varios tipos diferentes de es-
tructuras tienen la capacidad de presentar efectos
epigenticos:
.
Una modificacin covalente del DNA (me-
tiladn de una base).
.
Una estructura proteincea que se ensambla
con el DNA.
.
Un agregado protenico que controla la con-
formacin de las nuevas subunidades segn
se sintetizan.
En cada caso, el estado epigentico es resultado
de una diferencia en la fundn (por lo general in-
activacin) determinada por la estructura.
En el caso de la metiladn del DNA, una se-
cuencia metilada puede no transcribirse, en tanto
una no metilada se expresar. La FIGURA 31.1 mues-
tra cmo se hereda esta circunstancia. Un alelo tiene
una secuencia metilada en ambas cadenas del DNA,
en tanto el otro tiene una secuencia no metilada.
La replicacin del alelo metilado crea cadenas hijas
hemimetiladas que recuperan el estado metilado
gracias a la intervencin de una enzima metilasa,
Los sitios metilados se perpetan
cln de una metila
Alelo metilado
Me
m am
Alelo no metilada
GC
Replicacin
I
+
Me
Metllacin
ivie
Me
GC
GC
CG
GC
La replicacin de un sitio metilado produce
DNA hemimetilado, donde slo una cadena progenitora est
metilada. Una metilasa de perpetuacin reconoce los sitios
hemimetilados y aade un grupo metilo a la base en la cadena
hija, lo que restablece la situacin original donde el sitio est
metilado en ambas cadenas. Un sitio no metilado se mantiene
sin metilar despus de la replicacin.
Introduccin 819
constitutivamente activa. La replicacin no afecta
el estado del alelo no mediado. Si el estado de me-
tilacin afecta la transcripcin, los dos alelos difie-
ren en su estado de expresin gnica aunque sus
secuencias sean idnticas.
Las estructuras autoperpetuantes que se en-
samblan en el DNA suelen tener un efecto represor
al formar regiones heterocromticas que impiden
la expresin de genes en su interior. Su perpetua-
cin depende de la capacidad de las protenas en
una regin heterocromtica de mantenerse unidas
a esas regiones despus de la replicacin y luego
de reclutar ms subunidades protenicas para sos-
tener al complejo. Si cada una de las subunidades
se distribuye al azar en cada par de cadenas hijas
durante la replicacin, las dos seguirn marcadas
por la protena, aunque su densidad disminuya a
la mitad de la concentracin previa a la replicacin.
La FIGURA .2 muestra que la existencia de efectos
epigenticos obliga a pensar que una protena en-
cargada de tal circunstancia debe tener algn tipo
de capacidad de automoldeado o autoensamblado
capaz de restablecer el complejo original.
Puede ser el estado de modificacin de la pro-
tena ms que su presencia en s, el encargado de un
efecto epigentico. Por lo general, las colas de las his-
tonas H3 y H4 no estn acetiladas en la heterocroma-
tina constitutiva. Sin embargo, si la heterocromatina
del centrmero esta acetilada, los genes silenciados
tal vez se tornen activos. El efecto tal vez se perpete
durante la mitosis y meiosis, lo que permite suponer
que se ha creado un efecto epigentico al cambiar del
estado de acetiladn de las histonas.
Los agregados de protenas independientes que
causan efectos epigenticos (llamados priones), ac-
tan por secuestro de la protena en una forma en
la que no puede mostrar su funcin normal. Una
vez que se forma el agregado de protenas, obliga
a las nuevas subunidades de protena a unirse en
conformacin inactiva.
EH La heterocromatina se propaga
a partir de un episodio
de nudeacin
Conceptos principales
*
La heterocromatina es nucLeada en una secuencia
especfica y la estructura inactiva se propaga por la
fibra de cromatina.
.
Los genes dentro de las regiones de heterocromatina se
encuentran inactivos
La longitud de la regin inactiva vana de una clula a
otra; como resultado, la desactivacin de genes en esta
vecindad causa un efecto de posicin abigarrado.
.
Ocurren efectos de dispersin similares en los
telmeros y los cartuchos silentes en el tipo de
apareamiento de las levaduras.
Los complejos de autoensamblado
mantienen la heterocromatina
Heterocromatina Eucromatina
Replicacin
M M M M M M M M mj)
Autoensamblado
de protenas
\
FIGURA 31.2 La heterocromatina est formada por protenas
que se vinculan con histonas. La perpetuacin por medio de la
divisin requiere que la protena se relacione con cada par de
cadenas hijas y luego reclute nuevas subunidades para volver
a ensamblar los complejos represivos.
Un ncleo de interfase contiene eucromatina y he-
terocromatina. El estado de condensacin para la
heterocromatina es similar al de los cromosomas en
la mitosis. La heterocromatina es inerte. Permanece
condensada en la interfase, tiene represin trans-
cripcional, se replica de manera tarda en la fase f
y puede localizarse en la periferia del ncleo. La
heterocromatina centromrica consta, por lo gene-
ral, de DNA satlite; sin embargo, la formacin de
heterocromatina no se define en forma rigurosa por
la secuencia. Cuando se transfiere un gen, ya sea
por translocacin cromosmica o por transfeccin e
integracin, hacia una posicin cercana a la hetero-
cromatina, puede tomarse inactivo como resultado
de su nueva localizacin, lo que indica que se ha
convertido en heterocromtico.
Tal desactivacin es resultado de un efecto epi-
gentico (vase la seccin 31.10, Los efectos epige-
nticos pueden ser heredados). Puede diferir entre
clulas individuales en un animal y da como resul-
tado el fenmeno del efecto de posicin abiga-
rrado (PEV), donde clulas idnticas en trminos
genticos tienen diferentes fenotipos, lo que se ha
descrito bien en el gnero Drosophila. La FIGURA 31.3
muestra un ejemplo del efecto de posicin abigarra-
820 CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
do en el ojo de la mosca. Algunas regiones del ojo
carecen de color, en tanto otras son rojas debido a
que el gen blanco en alguna regin fue desactivado
por la heterocromatina cerana en unas clulas, pero
se mantuvo activo en otras.
La explicacin de este efecto se muestra en
la FIGURA 31.4. La desactivacin se expande desde la
heterocromatina hacia la regin adyacente una dis-
tancia variable. En algunas clulas llega bastante
lejos para desactivar un gen cercano, pero en otras
no lo hace. Esto ocurre en un cierto momento del
desarrollo embrionario, despus del cual todas las
clulas de la progenie heredan ese estado del gen.
Las clulas que provienen de un ancestro donde el
gen estaba inactivo forman parches que correspon-
den al fenotipo con prdida de funcin (en el caso
de blanco, ausencia de color).
Cuanto ms cerca est un gen de la heterocro-
matina, mayor probabilidad habr que sea inactivo.
Esto permite suponer que la formacin de la hete-
rocromatina puede ser un proceso de dos etapas:
ocurre un episodio de nucleacin en una secuencia
especfica y despus la estructura inactiva se propasa
por la fibra de cromatina. La distancia hasta la que
se extiende la estructura inactiva no est determi-
nada de manera precisa y pudiese ser aleatoria, con
la influencia de parmetros como las cantidades de
componentes de protenas limitantes. Un factor que
puede afectar el proceso de dispersin es la activa-
cin de los promotores en la regin; un promotor
activo puede inhibir la dispersin.
Los genes que estn ms cerca de la hetero-
cromatina tienen mayor probabilidad de ser desac-
tivados y, por tanto, sern inactivos en un mayor
porcentaje de clulas. En este modelo, es posible
que los lmites de una regin heterocromtica ter-
minen por el agotamiento del aporte de una de las
protenas que se requiere.
El efecto de silenciamiento telomrico en
levaduras es anlogo del efecto de posicin abiga-
rrado en el gnero Drosophila; los genes transloca-
dos a una ubicacin telomrica muestran la misma
clase de prdida variable de actividad. Esto se debe
a un efecto de dispersin que se propaga desde los
telmeros.
Una segunda forma de silenciamiento tiene lu-
gar en las levaduras. El tipo de apareamiento de
las levaduras lo determina la actividad de un solo
locus activo (MAT), pero el genoma contiene otras
dos copias de las secuencias de tipo de apareamiento
(HML y HMR), que permanecen inactivas. Los loci
HML y HMR comparten muchas propiedades con
la heterocromatina y podran considerarse regiones
constituyentes de la heterocromatina en miniatura
(vase la seccin 19.22, Los cartuchos silentes en
HML y HMR estn reprimidos).
Un ojo abigarrado tiene parches de diferentes colores
Prdida de color
en parches
FIGURA 31 Ocurre el efecto de posicin abigarrado en el
color del ojo cuando el gen blanco se integra cerca de la he-
terocromatina. Las clulas donde ese gen es inactivo producen
parches blancos en el ojo, en tanto las clulas donde es activo
producen parches rojos. La gravedad del efecto depende de la
cercana del gen integrado a la heterocromatina. Fotografa por
cortesa de Steven Henikoff, Fred Hutchinson Cncer Research
Center.
mi
Gen activo
Helerocromatma
i i
JU :' . -' JJ \
mmmmm
p
carecen
La extensin de la heterocromatina desactiva los genes.
La probabilidad de que un gen se desactive depende de la distancia que
lo separa de la regin de heterocromatina.
31.2. La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nucleacin 821
La heterocromatina
depende de interacciones
con las histonas
Conceptos principales
.
La HPl es La protena clave en la formacin de la
heterocromatina de mamfero y acta por unin a la
histona H3 metilada.
.
La Rapl inicia la formacin de la heterocromatina en
levaduras por unin a secuencias diana especficas en
el DNA.
.
Las dianas de Rapl incluyen repeticiones telomricas y
silenciadores en HML y HMR.
.
La Rapl recluta a SirS/Sirt, que interactan con las
colas terminales N de H3 y H4.
La desactivacin de la cromatina tiene lugar cuan-
do se agregan protenas a la fibra nucleosmica. La
desactivacin puede deberse a una diversidad de
efectos que incluyen la condensacin de la croma-
tina para hacerla inaccesible al aparato necesario
para la expresin gnica, la adicin de protenas que
bloquean de manera directa el acceso a los sitios re-
La metilacion de histonas ocasiona la unin de HPl
Metiltransferasa
Desacetilasa de histonas
de histonas SUV39H1 HPl
Cromatina activa
JJ JJ
Cromatina inactiva
FIGURA 31. La SUV39H1 es una metiltransferasa de histonas
que acta sobre la 9Lis de la histona H3. La HPl se une a la
histona metilada.
guiadores o protenas que inhiben en forma directa
la transcripcin.
Dos sistemas que se han descrito en trminos
moleculares son HPl en los mamferos y el comple-
jo SIR en las levaduras. Aunque no hay similitudes
detalladas entre las protenas comprendidas en cada
sistema, el mecanismo general de reaccin es simi-
lar: los puntos de contacto en la cromatina son colas
terminales N de histonas.
La HPl (protena 1 de la heterocromatina) es
una de las protenas Su(var) ms importantes, iden-
tificada en un principio como una protena que se
localiza en la heterocromatina mediante la tincin
de cromosomas politnicos con un anticuerpo diri-
gido contra la protena. Despus se demostr que
puede ser producto del gen Su(var)2-5. Su homloga
en la levadura Schizosaccharomyces pombe es codifica-
da por swi. La protena original identificada como
HPl hoy se denomina HPla debido a que desde
entonces se han encontrado dos protenas relacio-
nadas, HPlp y HPl y.
La HPl contiene un cromodominio cerca del
extremo N y otro relacionado con l, llamado do-
minio de sombra crmica, en el extremo C (vase
la Figura 31.6); la importancia del cromodominio
queda de manifiesto por el hecho de que es la loca-
lizacin de muchas de las mutaciones de HPl,
La mutacin de una desacetilasa que acta so-
bre Ac-14Lis de H3 impide la metilacin en 9Lis. La
H3 que est metilada en 'Lis se une a la protena
HPl gradas a un cromodominio. Esto sugiere el mo-
delo para iniciar la formacin de la heterocromatina
que se muestra en la
'
IGURA 31. . Primero
,
la des-
acetilasa acta para retirar la modificacin en
14Lis
y luego la metilasa SUV39H1 acta sobre la cola
de la histona H3 para crear la seal metilada a la
que se unir HPl. La FIGURA 31.6 ampla la reaccin
para mostrar que la interaccin tiene lugar entre el
cromodominio y la lisina metilada, que constituye
un desencadenante para la formacin de cromatina
El cromodominio de HPl se une a la Lis-9 metilada en la histona H3
HP1
Extremo N Cromodominio
Bisagra
Dominio sombra
Me
A a Arg.Treo s G(n Treo Aia'Arg lis Ser TreoGlu-Glu'Us.. H3
822
La metilacin de la histona H3 crea un sitio de unin para HPl.
CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
inactiva. La FIGURA 31.7 muestra que la regin inac-
tiva puede entonces extenderse por la capacidad de
otras molculas de HP1 de interactuar entre s.
Se puede suponer la existencia de una base co-
mn para el silendamiento en las levaduras porque
depende de un conjunto comn de or genticos. Las
mutaciones de cualquiera de un nmero de genes
causan activacin de HML y HMR y tambin alivian
la desactivacin de genes que se han integrado cerca
de la heterocromatina telomrica. Por lo tanto, los
productos de estos loci actan para mantener un es-
tado inactivo de ambos tipos de heterocromatina.
En la l IGURA 31.. se propone un modelo para las
acciones de estas protenas. Slo una de ellas es una
protena de unin a DNA especfica de secuencia. Se
trata de RAP1, que se une a las repeticiones C
, 3
A en
los telmeros, y tambin a los elementos del silen-
ciador de accin en configuracin cis que se requie-
ren para la represin de HML/HMR. Las protenas
Sir3 y Sir4 interactan con Rapl y tambin entre
s (pueden actuar como un heteromultmero). Las
Sir3/Sir4 interactan con las colas terminales N de
las histonas H3 y H4. (De hecho, la primera prueba
de la posibilidad de que las histonas tengan una fun-
cin directa en la formacin de la heterocromatina
provino del descubrimiento de que las mutaciones
suprimen el silendamiento en el mapeo de los genes
HML/HMR que codifican H3 y H4).
La Rapl tiene la participacin crucial de identifi-
car las secuendas del DNA donde se forma la hetero-
cromatina. Recluta Sir3/Sir4 e interacta de manera
directa con las histonas H3/H4. Una vez que Sir3/
Sir4 se han unido a las histonas H3/H4, el complejo
puede polimerizarse aun ms y dispersarse a lo largo
de la fibra de cromatina. Esto puede desactivar la
regin, ya sea porque la cobertura misma con Sir3/
Sir4 tiene un efecto inhibitorio, o porque la unin
a las histonas H3/H4 induce algn otro cambio en
la estructura. No se sabe qu limita la dispersin del
complejo. El extremo C de Sir3 tiene similitud con
las protenas de la lmina nuclear (constituyentes de
la matriz nuclear) y tal vez se encargue de apuntalar
la heterocromatina en la periferia nuclear.
Una serie similar de sucesos forma las regiones
silenciadas en HML y HMR (vase tambin la seccin
19.22, Los cartuchos silentes en HML y HMR estn
reprimidos). Tres factores especficos de secuencia
participan en el desencadenamiento de la formacin
del complejo: Rapl, Abfl (un factor de transcrip-
cin) ORC (el complejo de replicacin en el origen).
En este caso, Sirl se une a un factor especfico de
secuencia y recluta a Sir2, -3 y -4, para formar la
estructura represiva. La Sir2 es una desacetilasa de
histonas. La reaccin de desacetilacin es indispen-
sable para mantener la unin del complejo Sir a la
cromatina.
La HP1 puede propagar la heterocromatina
La HP1 se une a la H3 metilada
1
La HP1 se autoagrega I
-
JJ
La unin de HP1 a la histona H3 metilada forma
un desencadenante del silendamiento porque se agregan ms
molculas de HPl a la cadena del nucleosoma.
Un complejo se potmerlza a lo largo
de las colas de histonas
Colas terminales N de H3/H4
i
Rapl se une al DNA
,
.
VV,VT.T r.T,,T,
i
Slr3/Sir4 se une a H3/H4
Sr3/Sir4 se polimerlza
Sir3/Sir4 se une a la matriz
> r >
La formacin de la heterocromatina se inicia
cuando Rapl se une al DNA. Sir3/4 se une a Rapl y tambin a
las histonas H3/H4. El complejo se polimeriza a lo largo de la
cromatina y puede conectar telmeros a la matriz nuclear.
31.3 La heterocromatina depende de interacciones con las histonas
823
La formacin de la heterocromatina en la leva-
dura S. pombe depende de un complejo que contiene
varias molculas de RNAi (vase la seccin 13.10,
El
RNA de mterferencia tiene relacin con el silencia-
miento de los genes). Estas molculas de RNAi se
producen por la transcripcin de repeticiones cen-
tromricas para dar RNA que son fragmentados en
unidades ms pequeas. El complejo tambin con-
tiene protenas que son homlogas de las que inter-
vienen en la formacin de la heterocromatina en
otros organismos, como Argonaute, que contribuye
a dirigir los complejos de remodelado del complejo
de silenciamiento inducido de RNA (RISC) hacia la
cromatina. Los componentes RNAi se encargan de
localizar el complejo en el centrmero. A continua-
cin, el complejo facilita la dimetilacin de la histona
H3 por una metiltransferasa de histonas.
Cmo reprime un complejo de silenciamiento
la actividad de la cromatina? Es posible que con-
dense la cromatina de manera que las protenas
reguladoras no puedan encontrar sus dianas. Lo
ms sencillo sera suponer que la presencia de un
complejo silenciador es mutuamente incompatible
con la presencia de factores de transcripcin y po-
limerasa de RNA. La causa podra ser que los com-
plejos de silenciamiento impidan el remodelado (y
as, impidan de manera indirecta que los factores
se unan) o que oculten de forma directa los sitios
de unin a los factores de transcripcin en el DNA.
Sin embargo, la situacin tal vez no sea tan simple
puesto que se pueden encontrar factores de trans-
cripcin y polimerasa de RNA en promotores en la
cromatina silenciada. Es posible que esto signifique
que el complejo silenciador impide que los factores
acten, no que se unan. De hecho, puede haber
competencia entre activadores gnicos y los efectos
represores de la cromatina, de modo que la acti-
vacin de un promotor inhibe la dispersin de un
complejo silenciador.
Otra estructura especializada de la cromatina se
forma en el centrmero. Su naturaleza se deduce
por las propiedades de una mutacin en Saccharomy-
ces cerevisiae, cse4, que altera la estructura del cen-
trmero. La Cse4 es una protena relacionada con
la histona H3. Una protena centromrica de mam-
fero, la protena A del centrmero (CENP-A),
tiene
una secuencia relacionada. Las interacciones genti-
cas entre cse4 y CDE-II y entre cse4 de una mutacin
en el gen de la histona H4 permiten suponer que se
puede formar un octmero de histonas alrededor
de un meollo de Cse4-H4 y despus, los complejos
centromricos (factores de unin medular) CBF1 y
CBF3 pueden unirse para formar el centrmero.
Entonces, el centrmero puede vincularse con
la formacin de heterocromatina en la regin. En las
clulas humanas se requiere la protena especfica
del centrmero, CENP-B, para iniciar modificacio-
nes de la histona H3 (desacetilacin de
9Li
s y 14Lis,
seguida de la metilacin de 9Lis) que desencadenan
un vnculo con la protena Swi6 que conduce a la
formacin de heterocromatina en la regin.
Bfl PoLycomb y Trithorax
son represores y activadores
antagonistas
Conceptos principales
Las protenas del grupo Polycomb (Pc-G) perpetan un
estado de represin gracias a las divisiones celulares.
.
El PRE es una secuencia del DNA que se requiere para la
accin de Pc-G.
.
El PRE constituye un centro de nucleacin a partir
del cual las protenas Pc-G propagan una estructura
inactiva.
No se ha encontrado una protena Pc-G individual que
pueda unirse a PRE.
.
Las protenas del grupo Trithorax antagonizan las
acciones de Pc-G.
La heterocromatina ofrece un ejemplo de la repre-
sin especfica de la cromatina. Otro lo brinda la
gentica de los genes hometicos en el gnero Dro-
sophila, que condujo a la identificacin de un com-
plejo protenico que parece mantener ciertos genes
en un estado reprimido. Las mutantes Pe muestran
transformaciones de tipo celular que son equivalen-
tes a las mutaciones de ganancia de funcin en los
genes Antennapedia (Antp) o Ultrabithorax, debido a
que estos genes se expresan en tejidos donde por
lo general estn reprimidos. Esto implica a Pe en
la regulacin de la transcripcin. Es ms. Pe es el
prototipo de una clase de ~ 15 loci llamado grupo Pe
(Pc-G); las mutaciones en estos genes por lo general
tienen el mismo resultado de eliminar la represin
de los genes hometicos, lo que sugiere la posibili-
dad de que el grupo de protenas tenga alguna fun-
cin reguladora comn.
Las protenas Pe actan en grandes complejos.
El PRC1 (complejo represor Polycomb) contiene la
Pe misma, varias otras protenas Pc-G y cinco facto-
res generales de transcripcin. El complejo Esc-E(z)
contiene Ese, E(z), otras protenas Pc-G, una pro-
tena de unin a histonas y una desacetilasa de his-
tonas. La Pe misma tiene un cromodominio que se
une a la H3 metilada, y E(z) es una metiltransfera-
sa que acta sobre H3. Estas propiedades sustentan
de manera directa la conexin entre el remodelado de
la cromatina y la represin, insinuada en un princi-
pio por las propiedades de brahma, una contrapar-
te de SW12 en la mosca. El gen brahma codifica un
componente del complejo de remodelado SWI/SNF,
824 CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
y la prdida de la funcin de brahma suprime las
mutaciones en Polycomb.
En concordancia con la pleiotropa de las mu-
taciones de Pe, la Pe es una protena nuclear que
puede visualizarse en -80 sitios de cromosomas po-
litnicos, que incluyen el gen Antp. Otro miembro
del Pc-G, polihometico se visualiza como un conjunto
de bandas cromosmicas politnicas idnticas a las
que se une Pe. Las dos protenas se coinmunopreci-
pitan de manera simultnea en un complejo de -2.5
x 106 D que contiene de 10 a 15 polipptidos. An
no se establece la relacin entre estas protenas y
los productos de los -30 genes Pc-G. Una posibilidad
es que algunos de estos productos gnicos formen
un complejo represor general y despus algunas de
las otras protenas se vinculen para determinar su
especificidad.
Las protenas Pc-G no son represores conven-
cionales. No se encargan de determinar el patrn
inicial de expresin de los genes donde actan. En
ausencia de las protenas Pc-G estos genes en un ini-
cio estn reprimidos, como es lo habitual, pero ms
tarde en el desarrollo se pierde la represin sin que
el grupo Pc-G funcione. Esto permite suponer que
las protenas Pc-G de alguna forma reconocen el estado de
represin cuando se establece y despus actan para perpe-
tuarlo durante la divisin de las clulas hijas. La 1GURA
muestra un modelo donde las protenas Pc-G se
unen en conjuncin con un represor, pero las pro-
tenas Pc-G se mantienen unidas despus de que ya
no est disponible el represor, algo que es necesario
para mantener la represin, de manera que si las
protenas Pc-G estn ausentes, el gen se activa
Una regin de DNA que es suficiente para per-
mitir la respuesta a los genes Pc-G se llama PRE (ele-
mento de respuesta Polycomb). Se puede definir en
trminos de su funcionamiento por su propiedad de
mantener la represin en su vecindad durante el de-
sarrollo. El anlisis de un PRE consiste en insertarlo
cerca de un gen reportero controlado por un poten-
ciador que est reprimido en las primeras etapas del
desarrollo y despus determinar si el reportero se
expresa subsecuentemente en la descendencia. Un
PRE eficaz evitar tal reexpresin.
El PRE es una estructura compleja que mide
-
10 kb. Se han identificado dos protenas, Pho y
Phol, con actividad de unin al DNA en sitios den-
tro del PRE, pero puede haber otras. No obstante,
cuando un locus es reprimido por Pc-G, las prote-
nas Pc-G ocupan una longitud mucho mayor del
DNA que el PRE mismo. La Pe se encuentra local-
mente sobre unas cuantas kilobases del DNA que
rodea a una PRE.
Esto hace pensar que el PRE puede ofrecer un
centro de nucleacin a partir del cual se propague
un estado estructural dependiente de las protenas
El complejo Pc-G mantiene la represi
Represin -
establecida
Tipo silvestre
Las protenas Pc-G se unen
Mutante Pc-G
El represor se
pierde pero la
represin contina
El represor se
pierde y el gen
se activa
1
'
#1
FIGURA 31 Las protenas Pc-G no inician la represin, pero se
encargan de mantenerla.
Pc-G. Este modelo se sustenta en la observacin de
efectos relacionados con el efecto de posicin abi-
garrado (vase la Figura 31.4), esto es, un gen cerca
de un locus cuya represin es mantenida por Pc-G
puede desactivarse de manera hereditaria en algu-
nas clulas, pero no en otras. En una circunstancia
caracterstica, los experimentos de enlace cruzado
in vivo mostraron que la protena Pc-G se encuentra
sobre grandes regiones del complejo bithorax que
estn inactivas, pero se excluye la protena de las
regiones que contienen genes activos. La idea de
que eso podra deberse a interacciones colaborado-
ras con un complejo multimrico es respaldada por
la existencia de mutaciones en Pe que cambian su
distribucin nuclear y suprimen la posibilidad de
que otros miembros de Pc-G se localicen en el n-
cleo. La funcin de las protenas Pc-G en el mante-
nimiento de la represin, en contraposicin con su
establecimiento, debe significar que la formacin
del complejo en PRE tambin depende del estado
local de la expresin gnica.
Las propiedades de las protenas individuales
hacen pensar en un modelo de actuacin para la
unin de Pc-G a un PRE. En primer trmino, Pho
y Phol se unen a secuencias especficas dentro del
PRE. Se recluta Esc-E(z) a Pho/Phol; despus, se
utiliza su actividad de metiltransferasa para metilar
la 27Lis de la histona H3. Esto crea un sitio de unin
para PRC porque el cromodominio de Pe se une
a la lisina metilada. El complejo Polycomb induce
una estructura ms compacta en la cromatina; cada
complejo PRC1 ocasiona que unos tres nucleosomas
se hagan menos accesibles.
31.4 Polycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas
82
De hecho, el cromodominio se identific prime-
ro como regin de homologa entre Pe y la protena
HPl encontrada en la heterocromatina. La unin
del cromodominio de Pe a 27Lis en H3 es anloga
al uso de HPl de su cromodominio para unirse a
9Lis. El abigarramiento se debe a la dispersin de la
inactividad desde la heterocromatina constitutiva y,
en consecuencia, es posible que el cromodominio
sea usado por Pe y HPl en una forma similar para
inducir la formacin de estructuras heterocrom-
ticas o inactivas (vase la seccin 30.13, Algunos
segmentos comunes se encuentran en protenas que
modifican la cromatina). Este modelo indica que se
usan mecanismos similares para reprimir loci indi-
viduales o crear heterocromatina.
El grupo trithorax de protenas {trxG) tiene el
efecto contrario al de las protenas Pc-G; acta para
mantener los genes en estado activo. Puede haber
algunas semejanzas en las acciones de los dos grupos
de protenas: las mutaciones en algunos loci impi-
den el funcionamiento de Pc-G y trx, lo que permi-
te suponer que tal vez dependan de componentes
comunes. El factor GAGA que es codificado por el
gen similar a trithorax tiene sitios de unin en PRE.
De hecho, los sitios donde se unen las Pc-G al DNA
coinciden con los sitios donde se une el factor
GAGA.
Qu significa esto? Tal vez se requiera GAGA
para que los factores de activacin, incluidos los
miembros de trxG, se unan al DNA. Se necesita
tambin para que las protenas Pc-G se unan y ejer-
zan represin? Todava no se ha aclarado esto, pero
tal modelo exigira que, adems de GAGA, algo ms
determinara cul de los tipos alternativos de com-
plejo se ensambla despus al sitio.
CTE1 Los cromosomas X
experimentan cambios
globales
Conceptos principales
.
Uno de Los dos cromosomas X se desactiva al azar en
cada clula durante la embriognesis en mamferos
euterios.
.
En casos excepcionales donde hay ms de dos
cromosomas X, todos, excepto uno, estn desactivados.
.
ELX/c (centro de desactivacin de X) es una regin de
actuacin en configuracin os en el cromosoma X,
necesaria y suficiente para asegurar que slo un
cromosoma X permanezca activo.
.
El X/c incluye al gen X/s que codifica un RNA que se
encuentra slo en cromosomas X inactivos,
.
Se desconoce el mecanismo encargado de prevenir que
el RNA Xist se acumule en el cromosoma activo.
La compensacin de dosis cambia la expresin de X
Mamferos Moscas Gusanos
Desactiva
un X
femenino
Doble
expresinde
X masculino
La mitad de
la expresin
de dos X
femeninos
X
X
0
c
-
rr->
0 0
X
Y
0 0
FIGURA 31.10 Se usan medios diferentes de compensacin
de dosis para hacer equivalente la expresin del cromosoma X
en machos y hembras.
El sexo plantea un problema interesante para la re-
gulacin gnica debido a la variacin en el nmero
de cromosomas X. Si se expresaran los genes ligados
a X de manera equitativa en cada sexo, las hembras
tendran el doble de cada producto que los machos.
La importancia de evitar esta situacin la demuestra
la presencia de una compensacin de dosis, que
equilibra el grado de expresin de los genes ligados
a X en los dos sexos. Los mecanismos usados en
diferentes especies se resumen en la FIGURA 31.10.
.
En los mamferos, uno de los dos cromoso-
mas X femeninos se desactiva por completo.
El resultado es que las mujeres tienen slo
un cromosoma X activo, circunstancia que
es igual a la observada en los machos. El
cromosoma X activo de las hembras y el cro-
mosoma X nico de los machos se expresan
en el mismo grado,
.
En el gnero Drosophila, la expresin del
cromosoma X masculino nico se duplica
con relacin a la expresin de cada cromo-
soma X femenino.
.
En el Caenorhabditis elegans, la expresin de
cada cromosoma X femenino es de la mitad
con relacin a la expresin del cromosoma
X masculino nico.
La caraaerstica comn de todos estos mecanis-
mos de compensacin de dosis es que el cromosoma
entero es diana de la regulacin. Ocurre un cambio glo-
bal que afecta de manera cuantitativa a todos los
promotores en el cromosoma. Se sabe mucho acerca
de la desactivacin del cromosoma X en hembras
de mamferos, donde todo el cromosoma se torna
heterocromtico.
Las propiedades dobles de la heterocromatina
son su estado condensado y la inactividad vincula-
da. Se pueden dividir en dos tipos.
.
La heterocromatina constitutiva con-
tiene secuencias especficas sin funcin de
codificacin, que en general incluyen DNA
satlite y a menudo se encuentran en los
826
CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
Un cromosoma X se desactiva en forma aleatoria
Ambos cromosomas X son
activos en la clula precursora
Color de cubierta de tipo silvestre C
Color de cubierta de tipo mutado
/
Un cromosoma X
desactivado en cada
clula
alelo activo
alelo activo
\
Color
de la
cubierta
mutante
Expresin
del color de
cubierta
silvestre
centrmeros. Estas regiones son invariable-
mente heterocromticas por su naturaleza
intrnseca.
.
La heterocromatina facultativa adopta
la forma de cromosomas ntegros que son
inactivos en un linaje celular aunque se pue-
den expresar en otros. El ejemplo por exce-
lencia es el del cromosoma X de mamferos.
El cromosoma X inactivo se perpeta en un
estado heterocromtico, en tanto el cromo-
soma X activo es parte de la eucromatina.
Por tanto, participan secuencias de DNA idnti-
cas en ambos estados. Una vez que se ha esta-
blecido el estado de inactividad, lo heredan
las clulas descendientes. ste es un ejemplo
de herencia epigentica, porque no depende
de la secuencia del DNA.
La manera bsica de ver los cromosomas X de
la hembra del mamfero proviene de la hiptesis
del X nico planteada en 1961. Los ratones hem-
bra heterocigotos para las mutaciones en el color de
la piel ligadas al cromosoma X tienen un fenotipo
abigarrado, donde algunas reas son de tipo silves-
tre pero otras son producto de mutacin. La FIGURA
31.11 muestra que esto puede explicarse sise desactiva
uno de los dos cromosomas Xal azar en cada clula de una
pequea poblacin de precursores. Las clulas donde se
desactiva el cromosoma X portador del gen de tipo
silvestre dan origen a una progenie que expresa slo
el alelo mutante en el cromosoma activo. Las clulas
derivadas de un precursor donde se desactiv el otro
cromosoma tienen un gen silvestre de tipo activo. En
el caso del color de la piel, las clulas derivadas de
un precursor particular se mantienen juntas en un
parche del mismo color, que crea el patrn de abi-
garramiento visible. En otros casos, cada una de las
clulas en una poblacin expresar uno u otro de los
alelos ligados al cromosoma X; por ejemplo, en he-
terocigotos para el locus G6PD ligado a X, cualquier
eritrocito particular expresa slo una de las dos for-
mas allicas. (Ocurre desactivacin aleatoria de un
cromosoma X en mamferos euterios. En los marsu-
piales, la seleccin es dirigida: siempre el cromosoma
X heredado del padre es el que se desactiva.)
La desactivacin del cromosoma X en hembras
se rige por la regla n-1: no obstante, hay muchos
cromosomas X y todos, excepto uno, se desactivan.
En hembras normales hay, por supuesto, dos cro-
mosomas X, pero en casos excepcionales donde la
no disyuncin gener un genotipo 3X o mayor, slo
un cromosoma se mantiene activo, lo que hace pen-
sar en un modelo general donde un episodio espe-
cfico est limitado a un cromosoma X y lo protege
de un mecanismo de desactivacin que se aplica a
todos los dems.
Se produce abigarramiento ligado a X por la
desactivacin aleatoria de un cromosoma X en cada clula
precursora. Las clulas donde el alelo + se encuentra en el cro-
mosoma activo tienen un fenotipo silvestre; las clulas donde
el alelo - est en el cromosoma activo presentan el fenotipo
mutante.
Un solo locus en el cromosoma X es suficiente
para su desactivacin. Cuando ocurre una translo-
cacin entre el cromosoma X y un autosoma, ese
locus est presente en slo uno de los productos
recprocos y es el nico que puede desactivarse.
Cuando se comparan diferentes translocaciones es
posible ubicar este locus denominado Xic (centro de
desactivacin de X). Una regin clonada de 450 kb
contiene todas las propiedades elXic. Cuando esta
secuencia se inserta como transgn en un autoso-
ma, ste se ve sujeto a desactivacin (en un sistema
de cultivo celular).
El Xic es un locus que acta en configuracin cis
y contiene la informacin necesaria para contar los
cromosomas X y desactivar todas sus copias excepto
una. La desactivacin procede desde Xic por todo
el cromosoma X. Cuando Xic est presente en una
translocacin cromosoma X-autosoma, la desactiva-
cin se extiende a las regiones autosmicas (aunque
el efecto no siempre es completo).
El locus Xic contiene un gen llamado Xist que se
expresa slo en el cromosoma X inactivo. La con-
ducta de ese gen es en efecto la opuesta a la de todos
los dems loa en el cromosoma, que estn apagados.
La delecin de Z/sf impide que se desactive un cro-
mosoma X. Sin embargo, no interfiere con el me-
canismo de recuento (porque otros cromosomas X
31.5 Los cromosomas X experimentan cambios globales
Ambos cromosomas X expresan Xist: el RNA es inestable |
C
~~
) CUZ ZD
T T
El RNA se estabiliza y cubre a un cromosoma \
I
El X activo cesa la sntesis de Xist de RNA
X activo X inactivo
C n ) C n .>
1/
La desactivacin de X comprende la estabiliza-
cin del RNA de Xist, que cubre al cromosoma inactivo.
pueden desactivarse). De este modo, se pueden dis-
tinguir dos caractersticas de Xic. uno o varios ele-
mentos no identificados necesarios para el recuento
y un gen Xist requerido para la desactivacin.
En la se ilustra la funcin del RNA
y el gen Xist en la desactivacin del cromosoma X. El
gen Xist codifica un RNA que carece de un marco de
lectura abierto. El RNA Xist "cubre" al cromosoma
X a partir del cual fue sintetizado, lo que permite
suponer que tiene una actividad estructural. Antes
de la desactivacin de X, es sintetizado por ambos
cromosomas X femeninos. Despus de la desactiva-
cin, el RNA se encuentra slo en el cromosoma X
inactivo. La tasa de transcripcin se mantiene igual
antes y despus de la desactivacin, por lo que la
transicin depende de los episodios que tienen lugar
despus de la transcripcin.
Antes de la desactivacin de X, el RNA Xist de-
cae con una vida media de casi 2 h. La desactivacin
de X es mediada por la estabilizacin del RNA Xist
sobre el cromosoma X inactivo. El RNA Xist muestra
una distribucin puntiforme a lo largo del cromoso-
ma X, lo que permite suponer que el medio de es-
tabilizacin puede ser el vnculo con protenas que
forman estructuras particulares. No se sabe an si
otros factores pueden participar en esta reaccin y
cmo el RNA Xist se limita a la dispersin en con-
figuracin cis por el cromosoma. Las caractersticas
especiales del cromosoma X inactivo, que incluyen
una falta de acetilacin de una histona H4 y metila-
cin de las secuencias CpG (vase la seccin 24.19,
Los islotes CpG son dianas reguladoras), al parecer
surgen ms tarde como parte del mecanismo de des-
activacin.
La regla n-1 sugiere que la estabilizacin del
RNA Xist est "predeterminada" y que algn me-
canismo de bloqueo impide la estabilizacin en un
cromosoma X (que ser el X activo). Esto significa
que, si bien Xic es necesario y suficiente para des-
activar un cromosoma, los productos de otros loci
pueden ser necesarios para el establecimiento de un
cromosoma X activo.
El silenciamiento de la expresin de Xist es in-
dispensable para el X activo. La delecin del gen de
la metiltransferasa del DNA impide el silenciamien-
to de Xist, tal vez porque es necesaria la metilacin
en el promotor Xist para que cese la transcripcin.
gTfl Las condensinas producen
La condensacin
de Los cromosomas
Conceptos principales
.
Las protenas SMC son fosfatasas del trifosfato de
adenosina, que incluyen condensinas y cohesinas.
.
Un heterodmero de las protenas SMC se vincula con
otras subunidades.
.
Las condensinas hacen que la cromatina se enrolle en
forma ms estrecha por la introduccin de superhlices
positivas al DNA.
.
Las condensinas se encargan de condensar los
cromosomas en la mitosis.
.
Las condensinas especficas de cromosomas se
encargan de condensar cromosomas X inactivos en
C
. elegans.
Las estructuras de cromosomas enteros reciben la
influencia de las interacciones con protenas de
la familia de SMC (de mantenimiento estructu-
ral de cromosomas). Hay fosfatasas del trifosfato
de adenosina que entran en dos grupos funciona-
les. Las condensinas participan en el control de la
estructura global y se encargan de condensar cro-
mosomas compactos durante la mitosis. Las cohe-
sinas participan en las conexiones entre cromtides
hermanas que deben liberarse en la mitosis. Ambas
constan de dmeros formados por protenas SMC.
Las condensinas forman complejos que tienen un
meollo del heterodmero SMC2-SMC4 vinculado
con otras protenas (no SMC). Las cohesinas tie-
nen una organizacin similar basada en el meollo
heterodimrico de SMC1-SMC3.
En la FIGURA 31.13 se muestra que una prote-
na SMC tiene una estructura enrollada en el cen-
tro, que es interrumpida por una regin de bisagra
flexible. Tanto los extremos amino como carboxilo
tienen segmentos de unin a ATP y DNA. Se han
828
CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
Las protenas SMC tienen superhelices
Sitio de unin
de ATP y DNA
Extremo N
-
(atp)
Superhlice
Bisagra
Superhlice
-
p
Sitio de unin
de ATP y DNA
'
ATP i
Extremo C
FIGURA 31.13 Una protena SMP tiene un "mdulo Walker"
con un segmento de unin a ATP y uno de unin a DNA en sus
extremos, que se conectan por medio de superhelices enlazadas
por una regin de bisagra.
Condensina
ATP
ATP
6
"
Cohesina
FIGURA 31.14 Las dos mitades de una condensina se plie-
gan hacia atrs en un ngulo de 6. Las cohesinas tienen una
conformacin ms abierta, con un ngulo de 86 entre las dos
mitades.
Las cohesinas forman dimeros que podran tener enlace cruzado con el DNA
Las superhlices Las regiones terminales
Interactan se unen al DNA
TP ATP
ATI ATP ATP
ATP
i)
AT
AT
ATP
FIGURA 31.15 Las protenas SMC forman dimeros gracias a interac-
ciones antiparalelas entre las superhlices centrales. Ambas regiones
terminales de cada subunidad tienen segmentos de unin de ATP y DNA.
Las cohesinas pueden formar una estructura extendida que permite a
dos molculas diferentes de DNA enlazarse.
Las condenslnas podran compactar el DNA
TP
ATP
DNA
FIGURA 31.16 Las condensinas pueden formar una estructura
compacta si se doblan en la bisagra, lo que hace que el DNA
se torne compacto.
propuesto diferentes modelos para las acciones de
estas protenas, dependiendo de que se dimerizen
por interacciones intra o intermoleculares.
Los experimentos con homologas bacterianas
de las protenas SMC hacen pensar que se forma un
dmero por una interaccin antiparalela entre las
superhlices, de manera que el extremo N de una
subunidad se enlaza con el extremo C de la otra. Es
posible que la existencia de una regin de bisagra
flexible permita a cohesinas y condensinas depen-
der de un modo diferente de accin del dmero.
En la FIGURA 31.14 se muestra que las cohesinas tie-
nen una estructura en V con los brazos separados
en un ngulo de 86, en tanto las condensinas tie-
nen una flexin posterior ms aguda, con slo 6o
entre los brazos. Esto permite a las cohesinas man-
tener las cromtides hermanas juntas, en tanto las
condensinas, por otro lado, condensan un cromo-
soma individual. La FIGURA 31.15 muestra que una
cohesina puede adquirir la forma de un dmero ex-
tendido con enlace cruzado de dos molculas de
DNA. La FIGURA 31.16 muestra que una condensi-
na podra adoptar la forma de un dmero en V (en
esencia, flexionado en la bisagra), que hace traccin
sobre sitios distantes en la misma molcula de DNA
unindolos y condensndola.
Los experimentos hacen pensar en un modelo
alternativo donde las protenas de levaduras forman
dimeros por las interacciones intramoleculares. Esto
es, se forma un homodmero slo por la interaccin
entre dos subunidades idnticas. Los centros de dos
protenas diferentes (en este caso, SMC1 y SMC3)
pueden entonces interactuar en sus regiones cefli-
ca y de bisagra para formar una estructura circular
31.6 Las condensinas producen la condensacin de los cromosomas
829
La cohesina puede formar un anillo
alrededor del DNA
N
Bisagra
N
Las cohesinas pueden formar dmeros por me-
dio de conexiones intramoleculares y despus multimeros, que
se conectan en las cabezas y la bisagra. Es posible que tal es-
tructura mantenga dos molculas de DNA juntas al rodearlas.
Las condensinas se localizan a todo lo largo de
un cromosoma mittico. El DNA es rojo; las condensinas, amari-
llas. Fotografa por cortesa de Ana Losada y Tatsuya Hirano.
como la que se muestra en la . En lugar
de unirse de manera directa al DNA, una estructura
de ese tipo podra mantener juntas sus molculas
al rodearlas.
La visualizacin de los cromosomas mitticos
muestra que las condensinas se localizan a todo lo
largo del cromosoma, como puede observarse en
la FIGURA . (Por el contrario, las cohesinas se
encuentran en localizaciones bien definidas.) El
complejo condensina recibi ese nombre por su ca-
pacidad de hacer que la cromatina se condensase in
vitro. Tiene la capacidad de introducir superhlices
positivas en el DNA en una accin que aprovecha
la hidrlisis de ATP y depende de la presencia de la
topoisomerasa I. Esta capacidad es controlada por la
fosforilacin de las subunidades no SMC que tiene
lugar en la mitosis. No se sabe an de qu manera
se relaciona esto con otras modificaciones de la cro-
matina, por ejemplo, la fosforilacin de histonas. La
activacin del complejo de condensina de manera
especfica en la mitosis hace dudar de que tambin
participe en la formacin de la heterocromatina de
interfase.
Ocurren cambios globales en otros tipos de
compensacin de dosis. En el gnero Drosophila se
encuentra un complejo de protenas en los machos,
donde se localiza en el cromosoma X. En C. elegans,
un complejo protenico se vincula con ambos cro-
mosomas X en embriones XX, pero los componen-
tes protenicos se mantienen con distribucin difusa
en los ncleos de embriones XO. El complejo pro-
tenico contiene un meollo de SMC y es similar a
los complejos de condensina que se vinculan con
cromosomas mitticos en otras especies. Esto per-
mite suponer que tiene una funcin estructural que
hace que el cromosoma adquiera una forma ms
condensada, inactiva. Pueden necesitarse mltiples
sitios en el cromosoma X para que el complejo se
distribuya por completo. El complejo se une a esos
sitios y despus se dispersa por todo el cromosoma
para cubrirlo de manera ms amplia.
Los cambios que afectan a todos los genes en un
cromosoma, ya sea de manera negativa (mamferos
y C. elegans), o positiva (gnero Drosophila) son, por
tanto, una caracterstica comn de la compensacin
de dosis. No obstante, los componentes del aparato
de compensacin de dosis pueden variar, as como
los medios por los que se localizan en el cromosoma
y, por supuesto, ese mecanismo de accin es dife-
rente en cada caso.
mn Una metUasa
de mantenimiento perpeta
La metilacin del DNA
Conceptos principales
.
Casi todos los grupos metilo del DNA se encuentran en
las citosinas de ambas cadenas del par CpG.
"
La replicacin convierte un sitio por completo metilado
en uno hemimetilado.
-
Una metilasa de mantenimiento convierte los sitios
hemimetilados en metilados por completo.
Ocurre metilacin del DNA en sitios especficos.
En las bacterias se vincula con la identificacin del
sistema de metilacin de restriccin bacteriana uti-
lizado para la defensa de los fagos y tambin para
distinguir el DNA replicado del no replicado (vase
830
CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
La metilacin requiere mantenimiento
Me
C
Sitios hemimetilados
Sitios metilados por completo
CG
GC
Replicacin
metilados
GC GC
+
GC
Me
,
Metilacin
GC GC
| Replicacin
Me Sitio no metilado
Sitios hemimetilados
GC GC
Me Me
FIGURA 31.19 El estado de los sitios metilados podra per-
petuarse gracias a la accin de una enzima que reconoce slo
sitios hemimetilados como sustratos.
la seccin 20.7, Control de la direccin de la re-
paracin de apareamientos errneos). En las euca-
riotas, su principal funcin conocida tiene relacin
con el control de la transcripcin; la metilacin se
vincula con la desactivacin gnica (vase la sec-
cin 24.18, La expresin gnica se vincula con la
desmetilacin).
De 2 a 7% de las dtosinas del DNA de las clulas
animales estn metiladas (la cifra vara de acuerdo
con la especie). La mayor parte de los grupos metilo
se encuentra en
"
pares
"
CG y, de hecho, la mayor
parte de las secuencias CG est metilada. Por lo ge-
neral, los segmentos C de ambas cadenas de esta
secuencia palindrmica corta estn metilados, lo
que da lugar a la estructura.
Dicho sitio se describe como metilado por
completo. Considrense, no obstante, las conse-
Hay dos tipos de metilasas
CG
/\/\/\/\/\/\/\
GC
Metilasa nueva
Metilasa de
perpetuacin
Desmetilasa
El estado de metilacin es regulado por tres
tipos de enzimas. Se conocen metilasas nuevas y de perpetua-
cin, pero no se han identificado desmetilasas.
cuencias de la replicacin de este sitio. En la ' i
31.19 se muestra que cada par hijo tiene una cadena
metilada y una no metilada. Dicho sitio se denomi-
na hemimetilado.
La perpetuacin del sitio metilado depende de lo
que pase con el DNA hemimetilado. Si ocurre me-
tilacin de una cadena no metilada, se restablece la
condicin de metilacin completa del sitio. Sin em-
bargo, si la replicacin ocurre antes, se perpetuar
el estado hemimetilado en un par de cadenas hijas,
pero el sitio no estar metilado en el otro par de
cadenas hijas. En la FIGURA 31.20 se muestra que el
estado de metilacin del DNA es controlado por me-
tilasas, que agregan grupos metilo a la posicin 5 de
la citosina, y desmetilasas, que retiran los grupos
metilo (para describir estas enzimas de manera ms
formal se les denomina metiltransferasas).
Hay dos tipos de metilasa del DNA cuyas accio-
nes se distinguen por el estado de metilacin del
cido. Para modificar el DNA en una nueva posicin
se requiere la accin de una metilasa nueva, que
reconoce al DNA por virtud de una secuencia espe-
cfica y acta slo en el no metilado para agregar
un grupo metilo a una cadena. Hay dos metilasas
nuevas (Dnmt3a y Dnmt3B) en el ratn; tienen
diferentes sitios diana y ambas son indispensables
para el desarrollo.
Una metilasa de mantenimiento acta cons-
titutivamente slo en sitios hemimetilados, para conver-
Una metilasa de mantenimiento perpeta la metilacin del DNA
831
tirios en metilados completos. Su existencia indica
que cualquier sitio metilado se perpeta despus de
la replicacion. Hay una metilasa de mantenimiento
(Dnmtl) en el ratn y es indispensable: los embrio-
nes de ratn donde se ha alterado un gen no sobre-
viven despus de la embriognesis temprana.
La metilacion de mantenimiento es casi 100%
eficaz, lo que asegura que la situacin demostrada a
la izquierda de la Figura 31.19 prevalece in vivo. El
resultado es que s ocurre la metilacin nueva en un
alelo pero no en el otro, esa diferencia se perpetuar
a travs de las siguientes divisiones celulares, con lo
que se mantiene una diferencia entre los alelos que
no depende de sus secuencias.
La metilacin tiene varios tipos de dianas. Los
promotores gnicos son la diana mas frecuente.
Los promotores son metilados cuando el gen est
inactivo, pero no metilados cuando est activo. La
ausencia de Dnmtl en el ratn causa una desmetila-
cin amplia en los promotores y se asume que es letal
por la expresin gnica sin control. El DNA satlite
es otra diana. Las mutaciones en Dnmt3 impiden la
metilacin del DNA satlite, lo que causa inestabili-
dad en el centrmero dentro del mbito celular. Las
mutaciones en el gen humano correspondiente cau-
san una enfermedad llamada ICE (inmunodeficien-
cia/inestabilidad del centrmero, anomalas faciales).
La importancia de la metilacin se recalca en otra
enfermedad humana, el sndrome de Rhett, causado
por la mutacin del gen para la protena MeCP2 que
se une a secuencias CpG metiladas.
Las metilasas son enzimas convencionales que
actan sobre un DNA diana. Sin embargo, puede ha-
ber tambin un sistema de metilacin que utiliza una
secuencia corta de RNA para hacer diana en una se-
cuencia correspondiente de DNA para la metilacin
(vase la seccin 13.6, Se puede usar RNA no codi-
ficante para desactivar la expresin gnica). Nada se
sabe del mecanismo de operacin de este sistema.
Cmo se establecen y mantienen las regiones
desmetiladas? Si un sitio del DNA no se ha meti-
lado, es posible que una protena que reconoce la
secuencia no metilada la proteja contra la metila-
cin. Una vez que se ha metilado un sitio, hay dos
posibles formas de generar sitios desmetilados. Una
es bloquear la actuacin de la metilasa de mante-
nimiento sobre el sitio cuando ste se replica. Des-
pus de un segundo ciclo de replicacin uno de los
pares de cadenas hijas estar no metilado (como se
muestra en el lado derecho de la Figura 31.19). El
otro es desmetilar de manera activa el sitio, como
se muestra en la GURA 31. , ya sea por retiro di-
recto del grupo metilo de la citosina o por escisin
de la citosina o citidina metiladas del DNA para su
sustitucin por un sistema de reparacin. Se sabe
que puede ocurrir desmetilacin activa en el geno-
Tres tipos de reaccin podran desmetilar al ONA
5
'
Retiro del
grupo metilo
5
'
Retiro de la Retiro del
base 5-Me-C nucletido
5' 5'
i
3
'
FIGURA 31.: Es posible que el DNA se desmetile si se retira
el grupo metilo, la base o el nucletido. El retiro de la base
o el nucletido requerira su reposicin por un sistema de re-
paracin.
ma paterno poco despus de la fecundacin, pero
no se conoce el mecanismo usado. Una posibilidad
interesante es que participase la AID desaminasa de
histidina; puede desaminar fragmentos C-metilados
y crear un apareamiento errneo de bases que un
sistema de reparacin pudiese entonces corregir a
un par C-G estndar (no metilado).
tm La metilacin deL DNA
se encarga de La impresin
Concepto principal
Los alelos paternos y maternos pueden tener diferentes
patrones de metilacin en la fecundacin.
La metilacin suele vincularse con la desactivacin del
gen.
Cuando los genes tienen impresin diferencial, la
supervivencia de los embriones puede requerir que el
alelo funcional sea provisto por el progenitor con el
alelo no metilado.
La supervivencia de heterocigotos para genes impresos
es diferente, de acuerdo con la direccin del cruce.
Los genes impresos se presentan en grupos y pueden
depender de un sitio de control local, donde ocurre
metilacin nueva, a menos que se evite de manera
especfica.
CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
El patrn de metilacin de las clulas germinativas
se establece para cada sexo durante la gametogne-
sis mediante un proceso de dos etapas: primero el
patrn existente es borrado por una desmetilacin
de todo el genoma, y luego se impone el patrn
especfico de cada sexo.
Todas las diferencias de alelos se pierden cuando
las clulas germinales primordiales avanzan durante
el desarrollo del embrin; sin importar el sexo, los
patrones anteriores de metilacin se borran y un
gen caracterstico es entonces no metilado. En los
machos el patrn se presenta en dos etapas. La va de
metilacin caracterstica de los espermatozoides ma-
duros se establece en el espermatocito, pero se hacen
otros cambios en ese patrn despus de la fecunda-
cin. En las hembras, el patrn materno se impone
durante la oognesis cuando los oocitos maduran a
travs de la meiosis despus del nacimiento.
Como es de esperarse por la inactividad de los
genes en los gametos, su estado habitual es meti-
lado. Sin embargo, hay casos de diferencias entre
los dos sexos en los que un locus est no metilado
en un sexo. Una pregunta importante es, cmo
se determina la especificidad de metilacin en los
gametos masculino y femenino?
Ocurren cambios sistemticos en la embriogne-
sis temprana. Algunos sitios continuarn metilados,
en tanto otros sern de manera especfica no meti-
lados en las clulas donde se expresa un gen. Por el
patrn de cambios se puede inferir que cada uno de
los episodios de metilacin especfica de secuencia
tiene lugar durante el desarrollo somtico del orga-
nismo, a medida que se activan genes particulares.
El patrn especfico de los grupos metilo en
clulas germinativas se encarga del fenmeno de
la impresin, que describe una diferencia de con-
ducta entre los alelos heredados de cada padre. La
expresin de ciertos genes en embriones de ratn
depende del sexo del progenitor del que se hereda-
ron. Por ejemplo, el alelo que codifica IGL-II (factor
II de crecimiento similar a insulina) que se hereda
del padre se expresa, pero el heredado de la madre
no se expresa. El gen del IGF-II de los oocitos est
metilado pero el gen IGF-II de espermatozoides no
lo est, de manera que los dos alelos tienen con-
ducta diferente en el cigoto. ste es el patrn ms
frecuente, pero la dependencia del sexo se revierte
en algunos genes. De hecho, se muestra el patrn
contrario (expresin de la copia materna) para IGF-
IIR, el receptor de IGF-II.
Este modo de herencia especfico del sexo re-
quiere que se establezca el patrn de metilacin de
manera especfica durante cada gametognesis. El
destino de un locus hipottico en un ratn se ilus-
tra en la FIGURA 31.22. En el embrin temprano, el
alelo paterno no est metilado y s expresado, y
el alelo materno est metilado y es silente. Qu su-
cede cuando ese ratn forma sus gametos? Si es un
macho, el alelo aportado al espermatozoide deber
ser no metilado, sin importar si al principio lo estaba
o no. As, cuando un alelo materno se encuentra
en un espermatozoide, debe ser desmetilado. Si el
ratn es una hembra, el alelo con que contribuye
al oocito debe ser metilado; si en un principio era el
alelo paterno, debern agregarse grupos metilo.
La consecuencia de la impresin es que un em-
brin requiere un alelo paterno para este gen. As,
en el caso de una cruza heterocigota donde el alelo
de un progenitor tiene una mutacin de desacti-
vacin, el embrin sobrevivir si el alelo de tipo
silvestre proviene del padre, pero morir si proviene
de la madre. Este tipo de dependencia en la direc-
cionalidad de la cruza (al contrario de la gentica
mendeliana) es un ejemplo de herencia epigenti-
ca, donde algn factor diferente a las secuencias de
sus genes mismos influye en sus efectos (vase la
seccin 31.10, Los efectos epigenticos pueden he-
redarse). Si bien los alelos paterno y materno tienen
secuencias idnticas, muestran diferentes propieda-
des, dependiendo de qu progenitor los aport. Es-
tas propiedades se heredan a travs de la meiosis y
en las mitosis somticas posteriores.
FIGURA 31.22 El patrn caracterstico de La impresin es que
un locus metilado sea inactivo. Si se trata del alelo materno
,
slo el alelo paterno estar activo y ser esencial para la viabi-
lidad. El patrn de metilacin se reajusta cuando se forman los
gametos, de manera que todos los espermatozoides tienen un
tipo paterno y todos los oocitos tienen un tipo materno.
La metilacin se reajusta en cada generacin
Embrin
Grupos metilo
1
INACTIVO \/\/\ Alelo materno
Me
i
Alelo paterno
ACTIVC
Gametos de ia siguiente generacin
Las hembras aportan Los machos aportan
oocitos espermatozoides
o bien
/v
o bien
31.8 La metilacin del DNA se encarga de la impresin
833
Los genes impresos a veces se agrupan. Ms de
la mitad de los 17 genes impresos conocidos en el
ratn estn contenidos en dos regiones particulares,
cada una con genes de expresin materna y paterna.
Esto hace pensar en la posibilidad de que los meca-
nismos de impresin funcionen por largas distancias,
Se puede entender en parte esa posibilidad por las
deleciones en la poblacin humana que causan
las enfermedades de Prader-Willi y Angelman. Casi
todos los casos se deben a la misma delecin de 4
Mb, pero los sndromes son diferentes dependien-
do de qu progenitor contribuy con la delecin.
El motivo es que la regin con delecin contiene
al menos un gen impreso por el padre y al menos
uno impreso por la madre. Sin embargo, hay algu-
nos casos excepcionales con deleciones mucho ms
pequeas. Se puede causar el sndrome de Prader-
Willi por una delecin de 20 kb que silencia genes
distantes a ambos lados. El efecto bsico de la dele-
cin es impedir que un padre restablezca el modo
paterno a un cromosoma heredado por la madre. El
resultado es que los genes se mantienen en modo
materno, de manera que los alelos paternos, as
como los maternos, son silentes en la descendencia.
Se encuentra el efecto inverso en algunas pequeas
deleciones que causan el sndrome de Angelman.
La deduccin es que esa regin comprende algn
tipo de "centro de impresin" que acta a cierta
distanda para cambiar de un tipo de progenitor al
otro.
La metilacin tambin se encarga.de efectos
epigenticos que regulan la expresin de genes
de RNAr. El fenmeno de dominancia nucleo-
lar describe la transcripcin de slo un conjunto
de genes del RNAr de los progenitores, resultado de
la metilacin de citosinas en los promotores de los
genes heredados de un progenitor y no del otro,
Un solo centro puede controlar
Los genes con impresin
opuesta
Conceptos principales
.
Los genes impresos son controlados por la metilacin
de los sitios de accin en configuracin cis.
.
La metilacin puede encargarse de desactivar o activar
un gen.
La impresin est determinada por el estado de me-
tilacin del sitio de accin en configuracin cis cerca
de un gen diana o varios. Estos sitios reguladores se
conocen como dominios con metilacin diferencial
(DMD) o regiones de control de la impresin (ICR).
La metilacin del ICR controla a Igf2 y H19
\g2 ICR H19 Potenciador
Alelo paterno
ACTIVO Me INACTIVO
Alelo materno
INACTIVO ACTIVO
FIGURA 31.23 El ICR est metiiado en el alelo paterno, donde
Igf2 es activo y H19 es inactivo. El ICR no est metiiado en el
alelo materno, donde Igf2 es inactivo y H19 es activo.
El \gf2 es inactivo cuando la proteina se une a ICR
Alelo paterno
El potenciador activa a gf2
ACTIVO
Alelo materno
El CTCF se une al ICR sin metilacin
g12
INACTIVO
Se bloquea el potenciador
El ICR es un aislante que impide que un po-
tenciador active a Igf2. El aislante acta slo cuando une CTCF
al DNA no metiiado.
La delecin de esos sitios elimina la impresin y
los loci diana actan entonces igual en los genomas
materno y paterno.
La conducta de una regin que contiene dos
genes, Igf2 y H19, ilustra las formas en que la meti-
lacin puede controlar la actividad gnica. La FIGURA
muestra que estos dos genes reaccionan en
forma opuesta al estado de metilacin en el ICR lo-
calizado entre ellos. La ICR est metilada en el alelo
paterno. El H19 muestra la respuesta caracterstica
de desactivacin. Sin embargo, ntese que ellgfi se
expresa. La situacin inversa se encuentra en el ale-
lo materno, donde la ICR no est metilada. El HI9
se expresa entonces, pero el Igf2 est desactivado.
El control de Igf2 lo ejerce una funcin aislante
de la ICR. La FIGURA 31.24 muestra que cuando la
ICR no est metilada se une a la protena CTCF, lo
que crea una funcin de aislante que bloquea a un
potenciador y le impide la activacin del promotor
de Igf2. ste es un efecto muy poco comn, donde
834
CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
la metilacin activa de manera indirecta a un gen al
bloquear a un aislante. La regulacin de H19 mues-
tra la direccin ms habitual del control, donde la
metilacin crea un estado de impresin inactivo,
Esto podra reflejar un efecto directo de la metila-
cin sobre la actividad del promotor.
BW Los efectos epigenticos
pueden heredarse
Concepto principal
.
Los efectos epigenticos pueden derivarse de una
modificacin de un cido nucleico despus de que se
ha sintetizado, o por la perpetuacin de estructuras
protenicas.
La herencia epigentica describe la posibilidad
de diferentes estados, que pueden tener diversas
consecuencias fenotpicas, de heredarse sin ningn
cambio en la secuencia del DNA. Cmo puede ocu-
rrir esto? Los mecanismos epigenticos se dividen
en dos clases generales:
.
El DNA puede modificarse por la unin
covalente de una molcula que despus
es perpetuada. Dos alelos con la misma se-
cuencia pueden tener diferentes estados de
metilacin, que les confieren propiedades
diversas.
.
Puede establecerse un estado de protena de
autoperpetuacin que tal vez comprenda el
ensamblaje de un complejo protenico, la
modificacin de una o varias protenas es-
pecficas o el establecimiento de una confor-
macin protenica alternativa.
La metilacin establece la herencia epigentica,
en tanto la metilasa de mantenimiento acte de ma-
nera constitutiva para restablecer el estado metilado
despus de cada ciclo de replicacin, como se mues-
tra en la Figura 31.19. Se puede perpetuar un estado
de metilacin por medio de una serie indefinida de
mitosis somticas, lo que tal vez sea una situacin
"
predeterminada
"
. La metilacin tambin puede
perpetuarse a travs de la meiosis: por ejemplo, en
el hongo del gnero Ascobolus hay efectos epigen-
ticos que pueden transmitirse tanto por medio de
mitosis como de meiosis, por mantenimiento del
estado de metilacin. En las clulas de los mamfe-
ros se crean efectos epigenticos porque la reestruc-
turacin del estado de metilacin es diferente en la
meiosis de machos y hembras.
Las situaciones donde los efectos epigenticos
parecen mantenerse mediante estados protenicos se
conocen menos bien en trminos moleculares. El
efecto de posicin abigarrado muestra que la hete-
rocromatina constitutiva puede extenderse a una
distancia variable y despus se perpeta a travs de
las divisiones somticas. No hay metilacin del DNA
en el gnero Saccharomyces y una cantidad cada vez
menor en el gnero Drosophila y, como resultado,
es probable que la herencia de estados epigenticos
del efecto de posicin abigarrado o el silenciamiento
telomrico en estos organismos se deban a la perpe-
tuacin de estructuras protenicas.
En la se consideran dos posibilida-
des extremas para el destino de un complejo pro-
tenico en la replicacin.
.
Un complejo podra perpetuarse a s mismo
si se escinde en forma simtrica, de manera
que el complejo mitad se vincule con cada
cadena doble hija. Si los complejos mitad
tienen la capacidad de nuclear la formacin
de complejos totales, se restablecer el esta-
do original. Esto es bsicamente anlogo al
mantenimiento de la metilacin. El proble-
ma con este modelo es que no hay motivo
evidente por el que los complejos proteni-
cos acten de esa manera.
.
Un complejo podra mantenerse como uni-
dad y segregarse a una de las dos cadenas
hijas dobles. El problema con este modelo
es que requiere el ensamblaje de un nuevo
complejo en el otro par nuevo de cadenas
hijas y no es evidente por qu debera su-
ceder.
Cmo se perpetan los complejos protenicos?
Autoperpetuacin Segregacin
'
</. vA\ /\ v<\
ompleios mitad
.
Xa*
Complejos
Nuevas
Cmo se ensambia
subunidades
ei nuevo compieio?
/V
/A-
Qu sucede con los complejos protenicos en
la cromatina durante la replicacin?
31.10 Los efectos epigenticos pueden heredarse 835
El estado de acetilacion de histonas se hereda
Las colas de histonas se acetilan en la cromatina de los progenitores
i
1
1
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac
Los meollos acetilados se distribuyen
en forma aleatoria durante la replicacin
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac
Ac AcAc Ac Ac Ac
Qu se encarga de restablecer
el estado acetilado?
i
1
1
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac
Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac
FIGU1 Los meollos acetilados se conservan y distribuyen en
forma aleatoria en las fibras de cromatina hijas durante la replicacin.
Cada fibra hija tiene una mezcla de meollos antiguos (acetilados) y
nuevos (sin acetilar).
Considrese ahora la necesidad de perpetuar
una estructura heterocromtica constituida por
complejos protenicos. Supngase que una prote-
na se distribuye ms o menos de manera continua
en una banda de heterocromatina, como se mues-
tra en la Figura 31.4. Si se distribuyen subunida-
des individuales en forma aleatoria a cada cadena
doble hija en la replicacin, los dos constituyentes
continuarn marcados por la protena, aunque su
densidad disminuir a la mitad de su concentracin
antes de la replicacin. Si la protena tiene una pro-
piedad de autoensamblaje que hace que las nuevas
subunidades se asocien a ella, se restablecer la si-
tuacin original. En trminos bsicos, la existencia de
efectos epigenticos obliga a considerar que una protena
encargada de tal circunstancia debe tener algn tipo de
capacidad de automoldeado o autoensamblaje.
En algunos casos puede ser el estado de modi-
ficacin de la protena, ms que la presencia de la
protena en silo que se encarga de un efecto epige-
ntico. Hay una correlacin general entre la activi-
dad de la cromatina y el estado de metilacin de las
histonas, en particular H3 y H4, que ocurre en sus
colas terminales N. La activacin de la transcripcin
se vincula con la acetilacion en la vecindad del pro-
motor; y la represin de la transcripcin se vincula
con la desacetilacin (vase la seccin 30.7, Las ace-
tilasas se vinculan con los activadores). La correla-
cin ms notoria es que el cromosoma X inactivo
en clulas femeninas de mamfero est subacetilado
en la histona H4.
La inactividad de la heterocromatina constitu-
tiva puede requerir que las histonas no se acetilen.
Si una acetiltransferasa de histonas se apuntala en
una regin de heterocromatina telomrica en las
levaduras, los genes silenciados se tornan activos.
Cuando la levadura se expone a la tricostatina (un
inhibidor de la desacetilacin), la heterocromatina
centromrica se acetila y los genes silenciados en
regiones centromricas pueden tornarse activos. El
efecto puede persistir incluso despus de que se ha retirado
la tricostatina. De hecho, puede perpetuarse a travs
de mitosis y meiosis, lo que permite suponer que
se ha creado un efecto epigentico al cambiar el
estado de acetilacion de las histonas. Cmo podra
perpetuarse el estado de acetilacion? Supngase que
el tetrmero H3
2
-H4
2
se distribuye en forma alea-
toria a dos cadenas hijas. Esto crea la situacin que
se muestra en la FIGURA 31.26, donde cada par de
cadenas hijas contiene algunos octmeros de histo-
nas acetilados por completo en las colas H3 y H4, en
tanto otras estn por completo desacetiladas. Para
contribuir a un efecto epigentico, debera suponer-
se que la presencia de algunos octmeros de histo-
nas por completo acetilados ofrece una seal que
hace que los octmeros no acetilados se acetilen.
(La situacin real es tal vez ms complicada que
la mostrada en la figura, porque ocurren acetilacio-
nes transitorias durante la replicacin. Si tan slo
se revierten despus del depsito de histonas en los
nucleosomas, esto tal vez sea irrelevante. Otra po-
sibilidad es que se impida la desacetilacin usual en
lugar de, o adems de, inducir la acetilacion.)
55Jj Los priones de las levaduras
muestran herencia desusada
Conceptos principales
.
La protena Sup35 en su forma soluble de tipo
silvestre es un factor de terminacin de la traduccin.
.
Tambin puede existir en una forma alternativa de
agregados oligomricos, donde no es activa en la
sntesis de protenas.
*
La presencia de la forma oligomrica hace que la
protena recin sintetizada adquiera la estructura
inactiva.
.
La conversin entre las dos formas recibe la influencia
de los chaperones.
.
La forma de tipo silvestre tiene el estado gentico
recesivo psi' y la forma mutante tiene el estado
gentico dominante PSI*.
836 CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
El estado [psr] se debe a agregacin de protenas
Estado [psr]: ocurre la termlnaci
Sup35 [psr]
Terminacin
Estado [PS/+]: sin terminacin
Sup35 [ps/-] Sup35 [PS/+]
FIGURA 31.27 El estado de la protena Sup35 determina si
ocurre terminacin de la traduccin.
Uno de los casos ms claros de la dependencia de
la herencia epigentica del estado de la prolena lo
constituye la conducta de los priones, que se han
descrito en dos circunstancias: por efectos genti-
cos en levaduras y como agentes causales de en-
fermedades neurolgicas en mamferos, incluidos
los seres humanos. Un efecto epigentico notorio se
encuentra en las levaduras, donde se pueden here-
dar dos estados diferentes que se ubican en un solo
locus gentico, si bien la secuencia del gen es la misma
en ambos estados. Los dos estados diferentes son {psr]
y [PSr]. Ocurre un cambio de condicin con baja
frecuencia como resultado de la transicin espon-
tnea entre los estados.
El genotipo [psi] se ubica en el locus Sup35,
que codifica un factor de terminacin de la traduc-
cin. En la FIGURA 31.27 se resumen los efectos de la
protena Sup35 en las levaduras. En las clulas de
tipo silvestre, que se describen como [psr], el gen
est activo y la protena Sup35 termina la sntesis
de protenas. En las clulas de tipo mutante [PSI*]
el factor no funciona, lo que hace que la sntesis de
protenas no termine de manera apropiada. (Esto
se detect en un principio por los efectos letales de
la mayor eficacia de los supresores de codones ocre
en las cepas [PS/+].)
Las cepas [PSI*] tienen propiedades genticas
inusitadas. Cuando una cepa [psi'] se cruza con
ii-lili m
Estado [psr]: la protefna funciona de
manera normal
Sup35
\
J
Estado [PSI*\. todas las protenas entran
a un estado mutante
Sup35
/\.'\'\'-\.'-\.'\.'\
\
\
FIGURA 31.28 La protena Sup35 recin sintetizada cambia
al estado [PSI*] por La presencia de una protena preexistente
[PSL].
una [PSr], toda la progenie resulta [PSP]. ste es un
patrn de herencia que se esperara de un agente
extracromosmico, pero el rasgo [PSI*] no puede
localizarse en ninguno de esos cidos nucleicos.
El rasgo [PSP] es metaestable, lo que significa que
aunque es heredado por casi toda la progenie, se
pierde a un ritmo alto, compatible con la mutacin.
Se muestra una conducta similar tambin en el locus
URE2, que codifica una protena requerida para la
represin de ciertas enzimas catablicas mediadas
por el nitrgeno. Cuando una cepa de levadura se
convierte a un estado alternativo
, llamado [URE3],
la protena Ure2 ya no es funcional.
El estado [PSP] est determinado por la confor-
macin de la protena Sup35. En una clula psi'] de
tipo silvestre, la protena muestra su funcin nor-
mal. En una clula [PSP], no obstante, la prote-
na est presente en una conformacin alternativa,
donde ha perdido su funcin normal. Para explicar
el predominio unilateral de [PSI+] sobre [psr] en
cruzas genticas, se debe suponer que la presencia de
la protena en estado [PSI*] hace que todas las protenas
en la clula entren a ese estado. Esto requiere una inter-
accin entre la protena [PSP] y la protena recin
31.11 Los priones de las levaduras muestran herencia desusada 837
sintetizada, lo que tal vez refleja la generacin de un
estado oligomrico, donde la protena [PSI*] tiene
una funcin de nucleacin, como se ilustra en la
FIGURA 31.28.
Una caracterstica comn a las protenas Sup35
y Ure2 es que cada una consta de dos dominios que
actan de manera independiente. El dominio termi-
nal C es suciente para la actividad de la protena. El
dominio terminal N es suficiente para la formacin
de las estructuras que hacen inactiva a la protena.
De este modo, la levadura donde el dominio termi-
nal N de Sup35 tiene delecin no puede adquirir el
estado [PSI*] y la presencia de un dominio terminal
N [PSI*] es suficiente para mantener una protena
Sup35 en el estado de [PSI*]. La caracterstica crtica
del dominio terminal N es que es rico en glutamina
y asparagina.
La prdida de funcin en el estado [PSI*] se
debe al secuestro de la protena en un complejo oli-
gomrico. La protena Sup35 en las clulas [PSI*] se
agrupa en or bien definidos, en tanto la protena en
las clulas [psr] se difunde en el citosol. La protena
Sup35 de las clulas [PSI*] forma fibras amiloides in
vitro, que tienen un caracterstico contenido alto de
estructuras en hoja p.
Se sugiere la participacin de la conformacin
protenica (ms que su modificacin covalente) pol-
los efectos de los trastornos que afectan la estructu-
ra de las protenas. Los tratamientos de desnaturali-
zacin causan prdida del estado [PSI*]. En particu-
lar, el chapern Hspl04 participa en la herencia de
La protena [PSI+] puede
convertir levaduras
Protena [psr] Protena [PS/+]
Conversin in vitro
' (SS
Incorporacin al liposoma
J i
Fusin del liposoma con la levadura [psr]
La levadura se La levadura se
mantiene psr] torna [PSI*]
FIGURA 31.. La protena purificada puede convertir el esta-
do [psr] de Las Levaduras al [PSI*].
[PSI*]. Sus efectos son paradjicos. La delecin de
HSPI04 impide el mantenimiento del estado [PSI*] y
la sobreexpresin de Hspl04 tambin causa prdida
del estado [PSI*], lo que hace pensar que se requie-
re Hspl04 para algn cambio en la estructura de
Sup35 necesario para adquirir el estado [PSI*], que
debe ser transitorio.
Utilizando la capacidad de la Sup35 de formar
la estructura inactiva in vitro, es posible ofrecer una
prueba bioqumica de la participacin de la prote-
na. En la FIGURA 31.29 se ilustra un experimento
notorio, donde la protena se convirti a la forma
inactiva in vitro, se coloc dentro de liposomas (don-
de, en efecto, la protena es rodeada por una mem-
brana artificial) y despus se introdujo de manera
directa a las clulas por fusin de los liposomas con
[psi~] de levaduras. Las clulas de las levaduras se
convirtieron a [PSI*]. Ese experimento refuta todas
las objeciones que surgieron a la conclusin de que
la protena tiene la capacidad de conferir el estado
epigentico. Los experimentos donde se aparean c-
lulas o donde se toman extractos de una para tratar
a otra, siempre son susceptibles a la posibilidad de
que se haya transferido un cido nucleico. No obs-
tante, cuando la protena por s misma no convierte
clulas diana (aunque la protena convertida al es-
tado inactivo lo puede hacer), la nica diferencia es
el tratamiento de la protena, que debe, por tanto,
encargarse de la conversin.
La capacidad de la levadura de formar el es-
tado de prion [PSI*] depende de los antecedentes
genticos. La levadura debe ser [PIN*] para que se
forme el estado [PSI*]. El propio estado [PIN*] es
un estado epigentico. Puede crearse por la forma-
cin de priones a partir de cualquiera de diferentes
protenas. Esas protenas comparten la caracterstica
de Sup35 de tener dominios ricos en Gln/Asn. La
sobreexpresin de esos dominios en las levaduras
estimula la formacin del estado [PSI*], lo que su-
giere que hay un modelo comn para la formacin
del estado de prin, que involucra la agregacin
de los dominios Gln/Asn a la estructura amiloide de
autopropagacin.
Cmo influye la presencia de una protena
Gln/Asn sobre la formacin de priones por otra? Se
sabe que la formacin de los priones Sup35 es es-
pecfica de la protena Sup35, esto es, no ocurre por
agregacin cruzada de otras protenas. Esto permite
suponer que las clulas de levadura pueden conte-
ner protenas solubles que antagonizan la formacin
de priones. Estas protenas no son especficas de un
prin. Como resultado, la introduccin de cualquier
dominio protenico Gln/Asn que interacte con esas
protenas disminuir la concentracin. Esto permite
que otras protenas Gln/Asn se agreguen ms con
ms facilidad.
838
CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
Los priones causan
enfermedades
en Los mamferos
Conceptos principales
La protena que causa encefalopata espongiforme
ovina tiene dos formas de presentacin: la PrPc no
infecciosa de tipo silvestre susceptible a las proteasas,
y la PrP
Sc
que causa enfermedad y es resistente a las
proteasas.
La enfermedad neurolgica puede transmitirse a los
ratones mediante la inyeccin de la protena
PrPSc purificada.
El ratn receptor debe tener una copia del gen PrP que
codifica la protena murina.
La protena PrPSc puede autoperpetuarse al hacer que
la protena PrP, recin sintetizada, adopte la forma de
PrPSc en lugar de la forma PrPc.
Mltiples cepas de PrPSc pueden tener diferentes
conformaciones protenicas.
Se han encontrado enfermedades por priones en
ovejas, seres humanos, y en fecha ms reciente,
en vacas. El fenotipo bsico es una ataxia, trastor-
no neurodegenerativo que se manifiesta por una
imposibilidad de mantenerse erecto. El nombre
de esta enfermedad en ovejas, encefalopata es-
pongiforme ovina, refleja el fenotipo: el animal
se talla contra las paredes para mantenerse erecto.
La encefalomielitis ovina puede perpetuarse por la
inoculacin de ovejas con extractos hsticos de ani-
males infectados. La enfermedad kuru se encontr
en Nueva Guinea, donde pareci perpetuarse por el
canibalismo, en particular por la ingestin de cere-
bros. Las enfermedades en poblaciones occidentales
con un patrn de transmisin gentica incluyen el
sndrome de Gerstmann-Straussler y la enferme-
dad relacionada, de Creutzfeldt-Jakob (CJD), que
ocurre en forma espordica. En fecha ms reciente,
una enfermedad que simula CJD parece haber sido
transmitida por el consumo de carne de vacas que
sufre la enfermedad de
"
las vacas locas". Cuando
el tejido de ovejas infectadas por esta encefalitis se
inocula a ratones, aparece la enfermedad en un pe-
riodo que va de 75 a 150 das. El componente activo
es una protena resistente a las proteasas codificada
por un gen que normalmente se expresa en el cere-
bro. La forma de la protena en el cerebro normal,
llamada PrPces sensible a las proteasas. Su conver-
sin a la forma resistente, llamada PrPSc se vincula
con la aparicin de la enfermedad. La preparacin
infecciosa no tiene cidos nucleicos detectables, es
sensible a la irradiacin UV a longitudes de onda
que daan a las protenas y tiene una baja infecti-
vidad (una unidad infecciosa/105 protenas PrPSc),
que corresponde a una herencia epigentica donde
no hay cambio en la informacin gentica (porque
las clulas normales y enfermas tienen la misma
secuencia gnica PrP), pero la forma PrPSc de la pro-
tena es el agente infeccioso (mientras que PrPc es
inocua). La forma PrPSc tiene un alto contenido de
hojas p, que forman una estructura fibrilar amiloide
ausente en la forma PrPc.
La base para la diferencia entre las formas PrPSc
y PrPc parece radicar en un cambio de conforma-
cin, ms que en alguna alteracin covalente. Am-
bas protenas estn glucosiladas y unidas a la mem-
brana por un enlace GPI.
El anlisis de la infectividad en ratones permite
estudiar la dependencia de la secuencia protenica,
La FIGURA 31.30 muestra los resultados de algunos
experimentos determinantes. En circunstancias
normales, la protena PrPSc extrada de un ratn
infectado induce la enfermedad (y a la larga, la
muerte) cuando se inyecta a un ratn receptor. Si
el gen PrP es "puesto fuera de combate", el ratn
se hace resistente a la infeccin. Este experimento
demuestra dos cosas. Primero, la protena endgena
es necesaria para una infeccin, al parecer porque
provee la materia prima natural que se convier-
te en el agente infeccioso. Segundo, la causa de
la enfermedad no es el retiro de la forma PrPc de la
protena, porque un ratn sin PrPc sobrevive de
manera normal; la enfermedad es causada por una
La interactividad de PrP es restringida por la especie
Animales
donadores
RECEPTORES
m-PrP
Ratn infectado
m-PrP
Ratn fuera
de combate
Sin gen PrP
RESULTADOS
m-PrP
So
Se requiere el gen
PrP para lograr la
Infeccin
<3i -Qt -O -*
y.
Criceto infectado
de h-PrP
m-PrP
h.prp
Sc
h-PrP
El h-PrPSc no puede
infectar al ratn con m-PrP
El h-PrPSc puede Infectar
al ratn con h-PrP
FIGURA 31.30 Una protena Prp5' puede infectar slo a un animal que
tiene el mismo tipo de protena PrPc endgena.
31.12 Los priones causan enfermedades en los mamferos
839
ganancia de funcin en PrPSc. Si el gen PrP se altera
para impedir que ocurra el enlace GPI, los ratones
infectados por PrPScno padecen la enfermedad, lo
que hace pensar que la ganancia de funcin implica
una funcin de seal alterada para la que se requie-
re el enlace GPI.
La existencia de barreras de espede permite cons-
truir protenas hbridas para definir las caractersticas
requeridas para la infectividad. Las preparaciones ori-
ginales de la encefalopata espongiforme ovina fue-
ron perpetuadas en varios tipos de anmales, pero
no siempre se pueden transferir con facilidad. Por
ejemplo, los ratones son resistentes a la infeccin
por priones de criceto, lo que significa que PrPSc de
criceto no puede convertir la PrPc de ratn en PrPSc.
La situacin cambia, no obstante, si el gen de ratn
PrP es sustituido por un gen PrP de criceto (esto puede
hacerse mediante la introduccin de un gen PrP
de criceto al ratn con PrP puesto fuera de combate).
Un ratn con un gen PrP de criceto es sensible a la
infeccin por un PrPSc de criceto. Esto permite su-
poner que la conversin de la protena PrPc celular
al estado Se requiere que las protenas PrPSc y PrPc
tengan secuencias apareadas.
Hay diferentes "cepas de PrPSc" que se distin-
guen por periodos de incubacin caractersticos des-
pus de su inoculacin a ratones. Esto implica que la
protena no se restringe tan slo a estados alternati-
vos de PrPc y PrPSc, sino ms bien que puede haber
mltiples estados de Se. Estas diferencias deben de
depender de alguna propiedad de autopropagacin
de la protena ms que de su secuencia. Si la con-
formacin es la caracterstica que distingue a PrPSc
de PrPc, debe haber mltiples conformaciones, cada
una con una propiedad de automoldeado cuando
convierte PrPc.
La probabilidad de conversin de PrPc a PrPSc
se afecta por la secuencia de PrP. El sndrome de
Gerstmann-Straussler en seres humanos es causado
por un cambio de un solo aminocido en PrP, que se
hereda como rasgo dominante. Si se hace el mismo
cambio en el gen PrP del ratn, el animal presenta
la enfermedad. Esto sugiere que la protena mu-
tante tiene una mayor probabilidad de conversin
espontnea al estado Se. De manera similar, la se-
cuencia del gen PrP determina la susceptibilidad de
las ovejas a presentar la enfermedad en forma es-
pontnea; la combinacin de aminocidos en tres
posiciones (codones 136, 154 y 171) determina la
susceptibilidad.
El prin ofrece un caso extremo de herencia
epigentica, donde el agente infeccioso es una pro-
tena que puede adoptar mltiples conformaciones,
cada una con propiedad de automoldeado. Es po-
sible que esa propiedad participe en el estado de
segregacin de la protena.
25g Resumen
La formacin de la heterocromatina ocurre por
protenas que se unen a regiones cromosmicas es-
pecficas (como los telmeros) y que interactan
con las histonas. La formacin de una estructura
inactiva puede propagarse a lo largo de la hebra de
cromatina desde un centro de iniciacin. Ocurren
episodios similares en el silenciamiento de loci de
tipo de apareamiento inactivos en levaduras. Las
estructuras represivas que se requieren para man-
tener los estados inactivos de genes particulares son
formadas por el complejo de protena Pc-G en el g-
nero Drosopha. Comparten con la heterocromatina
la propiedad de propagarse a partir de un centro de
iniciacin.
La formacin de heterocromatina puede iniciar-
se en ciertos sitios y despus propagarse por una
distancia que no est determinada con precisin.
Cuando se ha establecido un estado heterocrom-
tico, se hereda a travs de divisiones celulares pos-
teriores, lo que da origen a un patrn de heren-
cia epigentica, donde dos secuencias idnticas de
DNA pueden vincularse con diferentes estructuras
protenicas y, por tanto, tener capacidades diversas
de expresin. Esto explica la aparicin del efecto de
posicin abigarrado en el gnero Drosopha.
La modificacin de las colas de histonas es un
desencadenante de la reorganizacin de la cromati-
na. La acetilacin se vincula en general con la acti-
vacin gnica. Se encuentran acetilasas de histonas
en complejos de activacin, en tanto las desacetilasas
de histonas se encuentran en complejos de desacti-
vacin. La metiladn de histonas se vincula con la
desactivadn gnica. Algunas modificaciones de his-
tonas pueden ser exclusivas o sinrgicas con otras.
La cromatina inactiva en telmeros de levadu-
ras y loci de tipo de apareamiento silente parecen
tener una causa comn, que comprende la interac-
cin de ciertas protenas con las colas terminales N
de las histonas H3 y H4. La formacin del complejo
inactivo puede iniciarse por la unin de una pro-
tena a una secuencia especfica del DNA; los otros
componentes pueden entonces polimerizarse en
forma colaboradora a lo largo del cromosoma.
La desactivacin de un cromosoma X en las
hembras de mamferos (euterias) ocurre en forma
aleatoria. El locus Xic es necesario y suficiente para
contar el nmero de cromosomas X. La regla n-1
asegura que se desactiven todos los cromosomas X,
excepto uno. Xic contiene el gen Xist que codifica
un RNA que se expresa slo en el cromosoma X
inactivo. La estabilizacin de Xist del RNA es el me-
canismo por el que se distingue el cromosoma X
inactivo.
840
CAPTULO 31 Los efectos epigenticos son heredados
La metilacin del DNA se hereda de manera
epigentica. La replicacin del DNA crea productos
hemimetilados y una metilasa de mantenimiento
restablece el estado de metilacin completo. Algu-
nos episodios de metilacin dependen del origen
parental. Espermatozoides y oocitos contienen pa-
trones diferentes y especficos de metilacin, con
el resultado de que los alelos maternos y paternos
se expresan de manera diferente en el embrin, lo
que causa la impresin donde un alelo no metila-
do heredado de un progenitor es esencial porque
es el nico alelo activo, el alelo heredado del otro
progenitor es silente. Los patrones de metilacin
se restablecen durante la formacin de gametos en
cada generacin.
Los priones son agentes infecciosos protein-
ceos que ocasionan la enfermedad de encefalopata
espongiforme ovina y padecimientos relacionados
en los seres humanos. El agente infeccioso es una
variante de una protena celular normal. La forma
prpsc tiene una conformacin alterada de automol-
deado: la forma normal, PrPc/ no adopta por lo ge-
neral esa conformacin, pero s lo hace en presencia
de PrPSc. Un efecto similar se encarga de la herencia
del elemento [PSJ] en las levaduras.
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