Cromatografie

Separarea diferitelor substane dintr-un amestec constituie una dintre cele mai importante probleme ale chimiei analitice. Metoda cromatografic se bazeaz pe repetarea echilibrului de repartiie a componentelor unui amestec ntre o faz mobil i una staionar. Datorit diferenelor n repartiie are loc deplasarea, cu vitez diferit, a componentelor purtate de faza mobil de-a lungul fazei staionare. n funcie de natura fazelor se disting urmtoarele tipuri de cromatografie! "aza mobil "aza staionar Denumirea tipului de cromatografie #ichid #ichid #ichid-lichid %##& #ichid Solid #ichid-solid %#S& $az Solid $az-solid %$S& $az #ichid $az-lichid %$#& n general, metodele de separare cromatografice se mpart n dou categorii! n prima intr cele care se bazeaz pe interaciunea diferit a componenilor cu faza staionar %repartiie, adsorbie, schimb ionic i afinitate&, iar n a doua cele care se bazeaz pe mrimea diferit a componenilor %e'cluziunea steric&. Schema de principiu a unui cromatograf %## sau #S& este reprezentat mai (os. )l se compune din! surs de eluent, dispozitiv de introducere al probei, coloan i un detector la care se adaug urmtoarele ane'e! sursa de eluent, dispozitiv de msurare i reglare a debitului, dispozitiv de introducere a probei, instrument de nregistrare a semnalului furnizat de detector. Principiul cromatografiei este urmtorul! eluentul trece prin dispozitivul de introducere a probei, preia proba de analizat i o introduce n coloana cromatografic. *oloana cromatografic este sediul procesului de separare. Din cauza interaciunii moleculelor cu faza staionar, componentele din amestecul de analizat rm+n n urma eluentului, n funcie de diferenele care e'ist ntre constantele echilibrului de repartiie ntre cele dou faze.

Semnal

,imp

Cromatografie de lichide i picul cromatografic

*omponentele amestecului separat vor iei din coloan la timpuri diferite, dup care sunt introduse de eluent n detector. -cesta transform diferena unei proprieti fizice ntre component i eluent, ntr-un semnal electric, proporional cu concentraia componentului din eluent. nregistrarea grafic a semnalului detectorului n funcie de timp se numete cromatogram %fig. .&. ,impul t/ la care apare ma'imul unui pic, msurat din momentul introducerii probei se numete timp de reinere sau retenie i este o caracteristic calitativ a componentului respectiv. nlimea picului h sau aria lui, -, sunt caracteristici cantitative, proporionale cu cantitatea componentului din prob. Se noteaz cu tM %timp mort& timpul n care eluentul i componentele care nu interacioneaz cu faza staionar parcurg distana p+n la detector. -stfel putem e'prima viteza zonei componentului %v& i a eluentului %u& prin urmtoarele ecuaii! v 0 #1t /, u 0 #1tM, unde # este lungimea coloanei. Coeficientul de partiie K reprezint raportul dintre concentraia molar %cS& a substanei n faza staionar i concentraia substanei n faza mobil %c M&! 2 0 cS1cM. "raciunea din timpul de reinere n care o molecul se gsete n faza mobil se noteaz cu / i reprezint probabilitatea ca molecula s se gseasc n faza mobil, respectiv fraciunea din totalul moleculelor care se afl n faza mobil. 3 - / reprezint restul moleculelor care se gsesc n faza staionar. #a echilibru reiese c! 4M 3 3 u = = v= c m 4M / 4 = , / 0 4M + 24S 3 + 2 4S 3 + 5 , / 0 v1u 0 tM1t/, 3+ 2 S 3 / c S 4S 4M 4M unde 4M i 4S reprezint volumul fazei mobile, respectiv staionare iar 5 0 24S14M reprezint raportul dintre cantitatea total de substan aflat n faz staionar i cantitatea total de substan aflat n faza mobil i se numete factor de capacitate. 6entru o specie oarecare - aflat n amestec, factorul de capacitate 5- va fi! 2 4 t tM 5 7 2 7 t / % 7& t M 5- = - S = / = = , = 4M tM 5 - 2 - t / %-& t M "actorul de capacitate 5 este o funcie de parametri de solubilitate, n cazul cromatografiei de separaie lichid-lichid. 6ractic, n vederea obinerii unei rezoluii ma'ime pe unitatea de timp, trebuie ca valoarea lui 5 s fie cuprins ntre . i 8. "actorul de separare 9 pentru o anumit coloan de separare este un parametru utilizat pentru descrierea diferenelor ce apar ntre vitezele de migrare a componenilor. Se definete ca fiind raportul dintre factorii de capacitate 5- i 57, ai componentului 7 %care trece mai greu prin coloan& i - %componentul care se elueaz mai repede& aflai n amestec. :na dintre cele mai importante caracteristici ale unui sistem cromatografic este eficiena sau numrul de talere teoretice. *u c+t o coloan va avea mai multe talere pe unitatea de lungime cu at+t eficacitatea ei de separare va fi mai bun. ;umrul de talere ; poate fi definit din cromatograma unui singur pic astfel!
t/ ;0 t t/ t/ = 3> < = 8,8= < 31 .
. .

unde! t/ este timpul de retenie, t este dispersia aceleiai benzi n uniti de timp, iar < este valoarea segmentului pe abscis rezultat din intersecia celor dou tangente prin punctele de infle'iune ale picului. ; este un numr adimensional. -ceeai valoare a lui ; . poate fi obinut din volumul de retenie 4/ i dispersia 4 e'primat n uniti de volum. ;umrul de talere ; este o msur a eficienei ntregului suport al coloanei. ? alt msur a eficienei coloanei, folosit curent n cromatografie este dat de nlimea unui taler @ %nlimea echivalent a unui taler teoretic&! . . .t / % 7& . t / % - & #< . 4/ # # . = @ = = ;0 , , @ 0 , / 0 . 3> t / <- + <7 ; # 4
.

unde # este lungimea coloanei cu umplutur. 6entru caracterizarea separabilitii a doi componeni s-a introdus noiunea de rezoluie, notat /S. n e'presia rezoluiei s-a cutat s se lege mrimile care caracterizeaz proprietile termodinamice ale fazelor i componenilor precum i mrimile care caracterizeaz dinamica proceselor din coloan. /ezoluia este o noiune mai cuprinztoare, conin+nd i mrimile care caracterizeaz eficacitatea coloanei precum i selectivitatea ei. 6entru simularea unei cromatografii de lichide se va folosi produsul softAare Chemland produs de o echip format din programatori, designeri i animatori de la :niversitatea Massachusetts din -rmhest, :.S.-. %http!11soulcatcher.chem.umass.edu&. 6e l+ng programul de simulare propriu zis, pachetul softAare conine i un tutorial bine documentat i ilustrat cu desene i animaii. Simularea unor e'perimente reale de laborator, care se bazeaz pe probe, faze mobile i faze staionare reale, poate fi utilizat pe l+ng calitatea de material de nvare, formare priceperi i deprinderi i ca i o baz de date cu informaii reale despre cromatografia de lichide care poate fi utilizat oric+nd ca preambul la e'periment. 6e ntreg parcursul pachetului softAare, se pot observa cuvinte rezervate colorate n verde deschis. -ps+nd aceste cuvinte, se vor afia definiii sau informaii adiionale despre subiectul n discuie. -cestea se nchid apoi prin simpla apsare asupra lor. -cion+nd asupra te'tului albastru se va produce o legtur ctre informaii adiionale, animaii i simulri. ,e'tul albastru se transform n rou dup acionare. 6entru ntoarcerea la te'tul original, se acioneaz asupra te'ului colorat n rou. Algoritmul de lucru 3. Se utilizeaz programul pentru formarea deprinderilor de simulare astfel! 3.3. Se lanseaz programul n e'ecuie % Start/Programs/LC&B 3... Se intr n meniul aplicaiei %clic5 pe fereastra *hemland&B 3.C. Se intr n seciunea 2 %se apas tasta mouse-ului cu cursorul pus pe butonul din dreapta (os al ferestrei), unde apare o descriere general a cromatografiei i este simulat o coloan de separare n care se introduce un amestec format din doi componeni - i 7 n diferite concentraii molareB 3.=. Se ruleaz programul de simulare, in(ect+nd amestecul lichid n coloan % click pe butonul Elute i se obine n final, rspunsul 0 f%timp& sub form de picuri, separ+nd cei doi compui e'isteni n amestecB se obine o cromatogramB modific+nd concentraia componenilor - i 7 se obine o alt cromatogram. 3.8. Se acceseaz seciunea ! %butonul din dreapta (os al ferestrei) unde se va simula un e'periment al cror rezultate se noteaz pas cu pas n caietB 3.>. Se selecteaz categoria de compui %componeni ai acizilor nucleici, aminoacizi sau tDrosine i tDronine&B 3.E. Se selecteaz doi componeni aflai n amestec %de e'emplu, din categoria aminoacizilor se selecteaz lizina i glicina&B 3.F. Se selecteaz apoi faza mobil %mobile phase&, tipul coloanei %column t"pe&, debitul %flo# rate&, temperatura de lucru i tipul de detecie %detection&B este necesar de precizat c nu toate opiunile apar la fiecare amestec n parteB 3.G. Se ruleaz modulul de simulare %click pe butonul Elute&B 3.3H. Modific+nd parametrii mai nainte enumerai, pentru acelai amestec ales, se observ c cromatograma se modific odat cu schimbrile fcuteB 3.33. Se noteaz concluziile referitoare la modelul ales %valorile lui 2 i 9&B 3.3.. Se ruleaz modulul de simulare pentru alt categorie de compui % compound categories&, repet+nd paii 3.G-3.33B 3.3C. n final se compar datele e'perimentale obinute aleg+nd valorile optime pentru dimensiunile coloanei, tipul de coloan %column t"pe&, faza mobil %mobile phase&, debitul %flo# rate&, temperatura folosit, detecie %detection&, astfel nc+t s rezulte un factor de separare 9 cel mai bun.

.. 6entru separarea unor componeni necunoscui dintr-un amestec se acceseaz seciunea $ a programului %butonul din dreapta (os al ferestrei& i se procedeaz astfel! ..3. Se alege un compus din lista de compui cunoscuiB .... Se selecteaz faza mobil %mobile phase& %de e'emplu! apa& i condiiile e'perimentale! tipul de coloan %Sephade' >.8, medium particule size, # 0 C8cm, D 0 ..8cm&, debitul %.8m#1h - floA-rate&, temperatura %room temperature&, detecie %:.4. absorption detection&B ..C. Se ruleaz modulul de simulare %clic5 pe butonul )lute& i se noteaz rspunsul n timp al fiecrei substane cunoscute, pentru ca ulterior, aceste valori s poat fi comparate cu rspunsurile substanelor aflate n amestecurile necunoscute i pentru a identifica componenii respectiviB ..=. Se modific faza mobil i se noteaz rezultatele simulrilor acu aceastaB ..8. n continuare, se alege de la amestecul 3 din lista de compui necunoscui aflai n amestec % 3 I G&B ..>. Se alege faza mobil %e'! apa& i condiiile e'perimentale de lucruB ..E. Se ruleaz programul de simulare %click pe butonul Elute&B ..F. Se identific componenii din amestecul 3, conform cromatogramei obinute i listei de rspunsuri n funcie de timp a componenilor cunoscui, list care a fost alctuit anteriorB ..G. Se repet succesiunea de pai ..3-..F pentru celelalte F amestecuri necunoscute, iar datele obinute se trec ntr-un tabel.
Rezultate cromatografice (exemplu de simulare)

Substane cunoscute "aza mobil @idrochinon @.? "enol @.? o-;itrofenol @.? *atechol @.? o-*lorofenol @.? -cid clorogenic @.? $uaiacol @.? -cid vanilic @.? -mestec "aza mobil /spuns 3 @.? .=.. J .>.= min. . @.? ...3 J .=.3 min. C @.? .3.E J .>.> min. = 8 > E F G @.? @.? @.? @.? @.? @.? ...3 J .=.8 min. .C min. .3.E J .C.. min. .C.G min. ...3 J .C.E min. .3.E J ...E min.

/spuns ...3 min. .C.E min. ...G min. .=.3 min. .>.> min. .C.C min. .=.8 min. .3.E min.

Rezultate cromatografice pentru cromatografia de amestecuri

2 Substane identificate . ........ 3 @idrochinonJ*atechol C. -. vanilicJo-*lorofenol . .. @idrochinonJ$uaiacol . 3. ........ = 3. -. vanilicJ...... > . ......... 3 @idrochinonJ"enol 3. -. vanilic J ...... =

Interpretarea rezultatelor 3. Datele obinute se trec n tabele similare cu cele prezentate mai sus. Se urmrete corectitudinea nregistrrilor n tabel cu a(utorul schematizrii din tabelul urmtor!

Recapitularea noiunilor de cromatografie

;ume ,imp de migrare a speciilor nereinute, faza mobil ,imp de retenie a speciilor - i 7 -(ustarea timpului de retenie #rgimea picurilor #ungimea coloanei Debit 4olumul fazei staionare *oncentraia n faz mobil, respectiv n faz staionar

Simbol tM t/%-& i t/%7& t/%-&K , t/%7&K <-, <7 # " 4S cM, cS

Sursa cromatogram cromatogram t/%-&K 0 t/%-& - tM t/%7&K 0 t/%7& - tM cromatogram msurare direct msurare direct pregtirea coloanei pregtirea analizei

ntrebri 3. *um se obine o cromatogramL .. *um se realizeaz cromatografia lichid-lichid i care este aparatura necesar pentru separarea cromatografic a unui amestec de substaneL C. *e este rezoluiaL =. *e se nelege prin factor de separareL 8. )numerai cele mai importani pai care trebuie parcuri spre a obine o cromatogram.