Sunteți pe pagina 1din 11

Fiziologia bacterian 3. 1.

Constituia chimic a bacteriilor


3. 1. 1. Apa: procent, rol Apa reprezint peste 75-85% din greutatea umed a bacteriei. Exist ap liber (mediu de dispersie) i ap legat fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puin ap, n special ap legat. Bacteriile sunt fiine acvatice prin excelen. Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas. Au o membran lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n special la bacteriile acvatice i ar putea avea un rol n plutirea acestora. Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti faptul c apa reprezint un mediu de dispersie, este reactiv n reaciile metabolice, reprezint etapa final a unor reacii oxidative etc. Prin deshidratare (desicare) este posibil prezervarea culturilor bacteriene timp ndelungat. O metod des utilizat datorit eficienei sale este liofilizarea (criodesicarea). Studiile tiinifice au artat c, n general, germenii Gram-negativi rezist mai puin timp liofilizrii dect cei Gram-pozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subire de peptidoglican. (1) 3. 1. 2. Substanele minerale Substanele minerale reprezint 2-30% din greutatea uscat a bacteriei i variaz n funcie de specie, vrsta culturii, compoziia chimic a mediului. Unele elemente intr n compoziia diferitelor structuri (exemplu sulful intr n structura aminoacizilor, fosforul n structura fosfolipidelor etc). Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti urmtoarele: favorizeaz schimburile cu mediul, particip la reglarea presiunii osmotice, pot stimula creterea i funcia bacteriei (de exemplu fierul n cazul bacilului difteric, care condiioneaz i producerea de toxine), activeaz unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH -ului i a potenialului de oxidoreducere. Aa cum am menionat anterior, la nivel ribozomal se gsesc Mg++ i K+. 3. 1. 3. Glucidele n structura bacterian se pot gsi glucide simple cu rol n metabolismul intermediar glucidic, precum i glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urm au o serie de roluri, spre ex. particip la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc. Exist teste biochimice n care se urmrete utilizarea sau imposibilitatea utilizrii unui anumit zahar de ctre o bacterie. Aceste teste sunt utile pe ntru identificarea bacteriei respective (n special n cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testrile biochimice sunt de mare utilitate i n studiul fungilor (auxanogram, zimogram). 3. 1. 4. Proteinele Exist proteine simple (cu rol n metabolismul intermediar protidic) i proteine complexe, cum ar fi: mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din structuri de tip capsular), cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi), nucleoproteinele (ex. n acizii nucleici). Este de remarcat prezena n structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic, precum i a aminoacizilor n forma D (ceea ce reprezint o adaptare biochimic a bacteriilor fa de aciunea nociv a enzimelor proteolitice). 3. 1. 5. Lipidele Reprezint mai puin de 10% din greutatea uscat a bacteriilor i variaz cantitativ n funcie de specie, vrsta culturii (cresc n celulele mbtrnite, reprezentnd probabil un semn de degenerescen)

i compoziia mediului. La mycobacterii, sunt n cantitate mai mare (circa 20 -40%), n special la nivel parietal i determin o serie de proprieti specifice, inclusiv afinitatea tinctorial. Lipidele se pot gsi libere n vacuole, combinate sau fcnd parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membran, mezozomi). Dintre lipidele bacteriene putem aminti: acizii grai speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii), cerurile (acizi grai plus alcooli monovaleni superiori), care se gsesc n cantitate mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. n peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D pare a fi implicat n inducerea hipersensibilitii ntrziate (de tip IV). fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gram-negative, cu activitate toxic.

3. 1. Constituia chimic a bacteriilor (b)


3. 1. 6. Pigmenii Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este dependent de condiiile de cultivare. Producerea de pigmeni poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. n cazul tulpinilo r de Pseudomonas aeruginosa sau n cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie s reinem nc de la nceput faptul c n cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ i nu vom clasifica drept patogen o tulpin de stafilococ n funcie de culoarea coloniei. Stafilococii sunt condiionat patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat n mod obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacieni. Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi: cromofore (pigmentul este legat n citoplasm); paracromofore (pigmentul este prezent n perete sau n stratul mucos, de exemplu la S. aureus sau la Staphylococcus epidermidis); cromopare (pigmentul este difuzibil n mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa). n afar de faptul c datorit producerii de pigmeni (albastru, galben-verde, maro etc. n cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb n cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se poate orienta n alegerea testelor de identificare ntr-un anumit context clinic i microbiologic. Putem aminti i faptul c pigmenii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecie fa de radiaiile UV (pigmeni carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborat de P. aeruginosa fa de B. anthracis) i rol enzimatic. 3. 1. 7. Enzimele n cazul bacteriilor se poate aprecia c metabolismul este foarte intens. Capacitatea de a elabora anumite enzime este determinat genetic (exist peste 2000 de determinani genetici diferii), precum i prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic n funcie de necesiti. Dup locul de aciune, enzimele bacteriene se pot mpri n: enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele; enzime ectocelulare (n membrana citoplasmatic, reglnd permeabilitatea selectiv), de exemplu permeazele; enzime intracelulare. n raport cu reacia catalizat, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreduct aze, liaze, izomeraze etc. Dup modul de apariie, enzimele pot fi: constitutive (exist totdeauna n celul, indiferent de natura mediului);

inductibile (sunt sintetizate de ctre bacterie numai ca rspuns la anumii compui aprui n mediu). Studierea comportamentului enzimatic este foarte util n taxonomie. Fiecare unitate taxonomic bacterian (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatic propriu; studierea acestuia poate avea o deosebit importan n identificarea bacteriilor. 3. 1. 8. Substane cu aciune antibiotic: plasmidul Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra altor bacterii receptive nrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli); unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B. licheniformis produce bacitracina, B. brevissintetizeaz gramicidina, iar B. polymyxa sintetizeaz polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48). 3. 1. 9. Vitaminele bacteriene Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretat de exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizat de E. coli, riboflavina sintetizat de B. subtilis, vitaminele B2 i B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B i K, care pot fi sintetizate sub influena florei bacteriene intestinale umane. 3. 1. 10. Factorii de cretere Factorii de cretere sunt metaboliii eseniali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza substanelor care se gsesc n mediul extern. Factorii de cretere trebuie neaprat inclui n mediul de cultur n cazul n care dorim s izolm microorganismul respectiv, numit microorganism pretenios (ex. factorii X i V trebuie inclui n mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae). Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptndu-se la viaa parazitar, devin dependente de o serie de astfel de factori de cretere (unele sunt att de dependente nct nu pot fi cultivate in vitro, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae).

3. 2. Metabolismul bacterian
3. 2. 1. Nutriia bacterian Nutriia bacterian reprezint suma proceselor metabolice care cond uc la producerea de materiale convertibile n energie i n diferite componente celulare. Nutrienii sunt substane ale cror soluii pot traversa membrana citoplasmatic pentru a fi antrenai n reaciile metabolice care asigur creterea i multiplicarea celular. n raport cu sursa de energie, bacteriile se mpart n: bacterii care folosesc energie luminoas i triesc la lumin ( photobacterii) i bacterii care i procur energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic i triesc la ntuneric (scotobacterii, chimiosintetizante). n raport cu sursele folosite ca material de sintez n ambele diviziuni se difereniaz: bacterii autotrofe, capabile s-i sintetizeze toi compuii organici din materie anorganic i bacterii heterotrofe, dependente de prezena unor compui organici. Nutriia principalelor bacterii studiate Majoritatea bacteriilor comensale, condiionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se di fereniaz n funcie de tipul respirator. Exist i bacteriile paratrofe, a cror energie trebuie oferit de gazd. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia i Chlamydia, care depind nutriional de o gazd vie). Creterea microbian necesit polimerizarea unor substane mai simple pentru a forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide i lipide. Aceste substane se obin fie din mediul de cultur, fie sunt sintetizate de ctre celulele n cretere (sunt necesare diferite coenzime i legturi macroergice de tipul celor din ATP). Substanele necesare i coenzimele implicate se pot obine dintr -un numr relativ redus de precursori metabolici.

Dac o celul bacterian primete substanele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar secvena aranjrii componentelor n aceste macromolecule este determinat fie dup un model ADN -ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidrai i lipide. Dup ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansambleaz, formnd structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor i activitatea cilor metabolice sunt foarte bine reglate (exist o permanent balan a biosintezei). Microorganismele reprezint un grup de celule vii care utilizeaz o mare diversitate de ci metabolice; de exemplu, mai multe ci diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singur cale metabolic pentru benzoat poate fi reglat de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru cile metabolice este acela al organizrii unui numr relativ mic de tipuri de reacii biochimice, ntr-o ordine specific. Multe dintre cile biosintetice se pot deduce avnd n vedere structura chimic de la care se pornete, produsul final i eventual unul sau doi metabolii intermediari. Principiul determinant al reglrii metabolismului este acela c enzimele par a fi chemate n joc numai cnd activitatea lor este necesar. Activitatea unei enzime poate fi modificat variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acioneaz. n unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuat prin cuplarea unor efectori specifici (metabolii care moduleaz activitatea enzimatic). De multe ori, activitatea unei enzime care catalizeaz o etap metabolic iniial este (poate fi) inhibat de produsul final al cii respective. O astfel de inhibiie nu poate depinde de competiia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiia depinde de faptul c enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzim are att un situs catalitic de legare cu substratul, ct i unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul su duce la o modificare conformaional a enzimei, astfel nct afinitatea situsului catalitic scade (inhibiie allosteric) sau crete (activare allosteric). Cnd o bacterie peritriche se mic, flagelii se asociaz i se mic mpreun, rezultnd o deplasare liniar. La diferite intervale de timp, bacteria i schimb direcia (flagelii se dau peste cap). Acest comportament face posibil chemotaxia: o celul care se ndeprteaz de sursa atractantului chimic i schimb sensul de micare mult mai frecvent n comparaie cu una care se apropie de atractant i ca o nsumare, bacteria se va deplasa nspre atractant. Spre exemplu, prezena unui zahar sau a unui aminoacid este sesizat de receptori specifici localizai pe membrana celular (de multe ori acelai receptor particip i la transportul membranar al acelei substane). Celula bacterian este prea mic pentru a fi capabil s detecteze existena unui gradient chimic (n spaiu), dar s -a demonstrat experimental c detecteaz gradienii n timp (de exemplu, concentraia unei substane scade n timp ce bacteria se ndeprteaz de surs i crete n timp ce aceasta se apropie de surs). Anumii compui acioneaz ca respingtori (R), iar alii ca atractani (A). Un mecanism care ar explica rspunsul celulei fa de A/R ar implica metilarea i respectiv demetilarea unei proteine specifice din membran, care depinde de GMPc. Atractanii produc o inhibiie tranzitorie a demetilrii acestei proteine. Respingtorii stimuleaz demetilarea. Mecanismul prin care o modificare n comportamentul celular se produce ca rspuns la o modificare de mediu poart numele de transducie senzorial. Aceasta pare s fie responsabil de: chemotaxie; aerotaxie (deplasarea ctre concentraia optim de O2); fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe ctre lumin); deplasarea spre acceptorul de electroni etc. 3. 2. 2. Respiraia bacterian Respiraia reprezint suma reaciilor biochimice aerobe sau anaerobe productoare de energie. Mecanismul de baz este reprezentat de oxido-reducerea biologic (pierderea ionilor de hidrogen sau a electronilor) de ctre o substan chimic (donor) i transportul lor pe molecula unei alte substane

numit acceptor (prima se oxideaz, a doua se reduce: AH2 + B <=> A + BH2). n funcie de natura acceptorului final, respiraia poate fi: aerob sau anaerob. Respiraia aerob (oxibiotic) n respiraia aerob, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraia aerob necesit existena membranei celulare. Electronii sunt pasai de la un reductor la un oxidant prin membran cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reductor frecvent utilizat este NADPH ul. Enzimele catenei respiratorii sunt: - nicotinice (cu coenzima NAD i NADP); - flavinice (cu gruparea proteic FMN sau FAD); - ferice (grupul prostetic conine Fe sub form de derivai ai protohemului, spre exemplu citocromi, citocromoxidaz, peroxidaz etc).

NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid).
Pentru sinteza ATP-ului se utilizeaz fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator) cuplat cu partea terminal a lanului respirator. Respiraia anaerob (anoxibiotic) n respiraia anaerob acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substan anorganic diferit de oxigen sau de orice substan organic (fermentaia); fosforilarea se face la nivelul substratului. Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezult prin fermentaia zaharidelor i reprezint un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere taxonomic i biochimic. Etapele fermentaiei sunt mai reduse, ctigul energetic fii nd mai mic. De exemplu n cazul genului Clostridium, prin fermentaie acetic se obine 1 mol ATP, iar prin fermentaie butiric se obin 0,5 moli ATP. Fermentaia butiric a fost descoperit de Louis Pasteur n anul 1861 (produs de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul biologic al fermentaiei este reprezentat de producerea energiei i nu de obinerea unor produi finali. Sinteza ATP-ului Sinteza ATP-ului se realizeaz prin cuplarea reaciilor de oxidoreducere cu reaciile de fosforilare. n respiraia aerob se utilizeaz mai ales fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator) cuplat cu partea terminal a lanului respirator. n respiraia anaerob fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii i acceptorii fiind metabolii anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaia). Energetica respiraiei bacteriene Prin fosforilarea oxidativ se pot obine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoz. Prin fosforilarea substratului se pot obine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoz. Energia este folosit apoi n procese metabolice de asimilaie. Tipul respirator n raport cu utilizarea proceselor pentru obinerea energiei i de relaia cu oxigenul din mediu, bacteriile se pot grupa n 4 tipuri respiratorii principale (vezi i Tabelul nr. 1): - strict aerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvolt numai n prezena unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic. Aceste bacterii posed catalaz, peroxidaz, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula bacterian; vezi Figura nr. 1) i utilizeaz numai procese de respiraie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta n medii lipsite de oxigen, dac n mediu sunt prezeni nitratul s au nitritul; - strict anaerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai n absena O2. Nu pot supravieui n prezena O2, care nefiind redus are o aciune bactericid. Nu au catalaz, peroxidaz (care acioneaz

asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obinerea energiei numai procese de fermentaie. Pentru cultivarea lor este necesar utilizarea unui mediu cu potenial redox foarte sczut. - aerob facultativ anaerob, atunci cnd bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvolt mai bine n mediile cu oxigen, prin procese de respiraie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, n funcie de potenialul redox. Majoritatea au catalaz sau citocromoxidaz, dar nu au peroxidaze flavoproteice. n acest tip se ncadreaz majoritatea bacteriilor studiate. - anaerob microaerofil, atunci cnd bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolereaz mici cantiti de O2.

3. 3. Ci metabolice
Metabolismul glucidic Polizaharidele utilizabile de ctre bacterii nu pot ptrunde ca atare n celul. Ele sunt degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindeaz unitile monozaharidice din extremitile lanurilor polizaharidice) i endohidrolaze (care hidrolizeaz unitile interne). Polizaharidele existente n celul ca materiale de rezerv au o degradare diferit, prin fosforoliz, rezultnd hexozo-monofosfai. Principalele ci metabolice (de catabolism) sunt: a). calea hexozo-difosfailor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care n final pentru 1 mol de glucoz se obin 1 mol de acid piruvic i 2 moli ATP; b). calea pentozo-monofosfailor; c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas). Metabolismul lipidic Multe bacterii degradeaz trigliceridele prin lipaze exocelulare n glicerol i acizi grai liberi. Activitatea lipazic poate fi cercetat pe medii care conin glicerol -tributirat. Pentru degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posed enzime specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C confer bacteriilor proprietatea de hemoliz. Acizii grai sunt degradai preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii grai reprezint surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic genereaz 129 moli de ATP). Bacteriile saprofite au proprieti lipolitice intense, participnd la biodegradarea grsimilor i uleiurilor (mai ales n mediul marin). Metabolismul proteic n lumea bacterian mai rspndii sunt D-aminoacizii. Acetia pot forma diferite polipeptide cu activitate antibiotic (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu capsula bacilului anthraxului. Particip de asemenea i la formarea peretelui celular (de exemplu D-Ala). Cile de degradare sunt reprezentate mai ales de: a). transaminarea i dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au ci proprii de catabolism, utile n identificare); b). decarboxilarea aminoacizilor.

3. 4. Ci biosintetice particulare
3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat e tc. se realizeaz utiliznd inclusiv structuri chimice care n lumea vie sunt utilizate numai de ctre bacterii, de exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic. 3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului Sinteza peptidoglicanului se desfoar pe parcursul mai multor etape (vezi Figura nr. 3). ncepe prin sinteza n citoplasm a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Aceast structur se ataeaz de bactoprenol (un lipid din membrana celular), dup care urmeaz un lan de reacii biochimice. Legarea ncruciat final se realizeaz printr-o reacie de transpeptidare n care terminaiile amino libere ale pentaglicinei nlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul nvecinat. Reacia este catalizat de

transpeptidaze, un set de enzime numite i PBPs (penicillin binding proteins) care au att activitate de transpeptidaze i carboxipeptidaze, dar controleaz i gradul de legare a peptidoglicanului (aspect foarte important n diviziunea celular). La nivelul lor se pot lega penicilinele i alte medicamente betalactamice (Figura nr. 4). Aceast cale de biosintez are o importan particular n medicin, oferind i baza aciunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracin, vancomicin, cicloserin etc). Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele nu sunt izotone cu fluidele organismului. n interiorul lor presiunea osmotic este foarte mare i viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care inhib o etap n biosinteza peptidoglicanului la o bacterie n cretere va putea produce liza bacterian (efect bactericid). 3. 4. 3. Sinteza LPZ Sinteza este asemntoare cu cea a peptidoglicanului; n ambele situaii, o serie de subuniti se asambleaz pe un lipid transportor la nivelul membranei i apoi sunt transferate n fabrica polimerului n cretere pentru realizarea peretelui celular. Toate componentele LPZ sunt sintetizate i ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice. 3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare Capsula se sintetizeaz enzimatic din subuniti activate. n sinteza capsulei extracelulare (poate avea structur polizaharidic sau peptidic) nu sunt implicate lipide transportoare de provenien membranar. Prezena capsulei este adesea determinat de condiiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroz i acest lucru se va realiza doar dac exist sucroz n mediu. 3. 4. 5. Sinteza substanelor de rezerv Cnd nutrienii sunt n exces, bacteria poate converti o parte din ei n granule de rezerv (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutin, care difer de la o bacterie la alta.

3. 5. Cultivarea bacteriilor
3. 5. 1. Definiii utile Populaia reprezint o multitudine de indivizi ai unei specii care convieuiesc ntr-un anumit biotop. Clona este populaia care rezult dintr-o singur celul prin nmulire vegetativ (diviziune binar). Tulpina reprezint populaia microbian alctuit din descendenii unei singure izolri n cultur pur. Temperatura de dezvoltare n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: - mezofile, cu temperatura optim de 30-37C; - psichrofile, cu temperatura optim n jur de 20C (unele acceptnd temperaturi apropiate de 0C; Listeria spp. poate supravieui sau se poate chiar i multiplica la temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numrul mare de acizi grai nesaturai coninui de membrana plasmatic. Gradul de nesaturare al unui acid gras se coreleaz cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziie termic (temperatura la care se topete sau se solidific lipidul). Acizii grai nesaturai rmn n faz lichid la temperaturi joase, dar sunt denaturai la temperaturi moderate. Fie c acizii grai din membran se afl n faz lichid sau solid, ei afecteaz fluiditatea membranei, care afecteaz n mod direct capacitatea de a funciona. - termofile, cu temperatura optim de 50-60C (unele putnd s se multiplice i la temperaturi apropiate de 95C, ca de ex. Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate s reziste la temperaturi de peste 60C printr-o varietate de modaliti. Acizii grai din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grai saturai, permind membranelor s rmn stabile i funcionale la temperaturi ridicate. - extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optim de 80C sau mai mare i o temperatur de dezvoltare maxim de 115C. (2) Nu sunt patogene. Bacteriile studiate de microbiologia medical sunt n marea lor majoritate mezofile. 3. 5. 2. Noiuni de cretere i multiplicare bacterian

Creterea oricrui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creterea volumului celular raportat la creterea suprafeei este mai mare, n cursul creterii se ajunge la un punct critic. Multiplicarea celular este o consecin a creterii. Se restabilete raportul optim dintre volumul i suprafaa celulei. Multiplicarea majoritii bacteriilor se face prin diviziune simpl (binar). Sporii nu reprezint forme de multiplicare (aa cum se ntmpl n cazul fungilor sau paraziilor). 3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient s obinem mai nti respectivul microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i putem studia diferitele caractere n vederea identificrii. Metodele de cultivare a bacteriilor urmresc mai multe obiective: obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaiile propuse, prevenirea contaminrii produsului cercetat cu un microorganism strin i izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi monomicrobiene denumite culturi pure. Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrei bacterii. Termenul nsmnare definete operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr -un mediu de cultur artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien folosim termenul inoculare. Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea bacteriilor pe medii de cultur. Mediile solide sau lichide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene se numesc medii de cultur. Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de cultur bacterian. Mediile de cultur Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii i pe medii artificiale. Exist anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate dect pe gazde vii, aa cum se ntmpl n cazul virusurilor, respectiv: animale de laborator, ou de gin embrionate sau culturi de celule. Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe medii artificiale. Mediile de cultur artificiale trebuie s fie nutritive (s conin factorii de cretere necesari), s fie sterile, s aib un anumit pH (de obicei ntre 7,2-7,6), s aib o anumit presiune osmotic, s aib umiditatea favorabil multiplicrii germenilor etc. Factorii de cretere reprezint substane eseniale pe care microorganismele nu sunt capabile s le sintetizeze din nutrienii de care pot s dispun. Ei sunt necesari n cantitai mici. ndeplinesc anumite roluri n biosintez. Factorii de cretere pot fi grupai n: 1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN i ARN); 2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor; 3. Vitamine: necesare n calitate de coenzime i grupri funcionale pentru enzime. Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesit factori de cretere. Aceste bacterii pot sintetiza purinele eseniale, pirimidinele, aminoacizii i vitaminele pornind de la o surs de carbon. Alte bacterii necesit purine, pirimidine, vitamine i anumii aminoacizi pentru a crete. Aceti compui trebuie adugai n prealabil n mediile de cultur. Factorii de cretere nu sunt metabolizai direct ci sunt asimilai de ctre bacterii pentru a-i ndeplini rolul n metabolism. Tulpinile mutante care necesit anumii factori de cretere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numite auxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesit triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan i va fi desemnat E. coli trp- (2). Clasificarea mediilor de cultur artificiale Aceste medii se pot clasifica dup starea de agregare, dup natura ingredientelor, dup complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), dup scopul urmrit (de transport, de izolare,

de identificare etc.), dup coninutul n ap, etc. Exist medii de cultur simple (agar, ap peptonat, bulion simplu etc) i medii de cultur mai complexe (agar-snge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2) Medii speciale Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura nr. 5). Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv inhib dezvoltarea altor bacterii dect cea a crei izolare se urmrete. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi izolat este rezistent) (Figura nr. 6) Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii patogene, inhibnd dezvoltarea florei de asociaie dintr-un produs patologic. Funcioneaz concomitent ca mediu selectiv i ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de mbogire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi). Mediul diferenial conine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu metabolizat, determinnd modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care difereniaz bacteriile lactoz -pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoz-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree). (Figurile nr. 7-10). Colonia izolat Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian. Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a unei poriuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizeaz ansa; se verific temperatura, prin atingerea mediului ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa steril se traseaz a doua latur a poligonului; se resterizeaz ansa i se repet procedeul descris pn la realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur. n acest mod, pe ultimele laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar multiplicrii bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1) Incubarea const n meninerea mediilor de cultur nsmnate, n condiiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvolt i duc la apariia unei culturi n circa 18 24 de ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare (asigurat n termostat) pentru c timpul de generaie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaie de 12-27 ore i n acest caz cultura devine pozitiv n 2-8 sptmni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz (ex. n medii la care s-au adugat ingrediente cu activitate reductoare sau n anaerostat); dorim s subliniem c dac transportul nu se face n condiii de anaerobioz, nu vom mai obine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate (Figura nr. 11). Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi Culturile bacteriene sunt discontinue cnd se realizeaz n volum limitat de mediu, care nu este rennoit i continue atunci cnd mediul de cultur este continuu rennoit. O populaie bacterian poate fi meninut indefinit n faza de multiplicare exponenial dac se adaug continuu mediu de cultur proaspt, cu omogenizare prin curent de aer steril i evacuare a unei cantiti corespunztoare de cultur (de exemplu n dispozitivul numit chemostat sau turbidostat). Chemostatul utilizeaz un mediu de cultur n care unul dintre nutrieni, aflat n concentraie mai redus dect ceilali, funcioneaz ca factor limitant al creterii. Mediul de cultur proaspt este admis n vasul de cultur n ritmul n care este consumat factorul limitant, iar cultura este evacuat cu acelai ritm. Cultura este meninut astfel la o valoare constant i submaximal ratei de cretere, reglat prin factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obinerea de tulpini mutante pentru c dup ce rata de multiplicare a fost determinat ansa de selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12). n laboratorul de microbiologie clinic, de regul se utilizeaz culturile discontinue.

Timpul de generaie Populaia care rezult prin diviziunea unei bacterii crete n progresie geometric cu raia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaiei se numete timp de dublare sau timp de generaie. Timpul de generaie n faza exponenial i n condiii optime de cultivare este determinat ge netic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca i pentru majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosistimpul de generaie poate avea o valoare ntre 12-27 ore. Fazele dezvoltrii unei culturi bacteriene Teoretic, dinamica unei populaii bacteriene ar trebui s evolueze exponenial. Dinamica real a populaiei bacteriene n cultur discontinu are ns o evoluie caracterizat printr -o curb la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmic; faza staionar i faza de declin (Figura nr. 13). Faza de lag Numrul bacteriilor nsmnate rmne staionar sau scade; germenii se adapteaz la condiiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, i consum pn la dispariie incluziile, cresc mult n dimensiuni, sintetizeaz enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag dureaz aproximativ 2 ore. Aceast faz este aparent dependent de o varietate de factori incluznd dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-i reveni din ocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor eseniale sau a factorilor de diviziune i timpul necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent n mediu. (2) Faza de multiplicare logaritmic (exponenial) Celulele bacteriene prezint caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt ns ceva mai mari), citoplasma este intens bazofil i omogen, lipsit de incluzii. Bacteriile sunt foar te sensibile la antibiotice. Aceast faz este adecvat pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor n vederea preparrii de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenial dureaz aproximativ 2 -3 ore. Faza staionar Multiplicarea este realizat n progresie aritmetic, dar pentru c numrul bacteriilor care sunt distruse este aproximativ egal cu numrul bacteriilor nou aprute rata de cretere devine nul. Germenii au morfologia caracteristic speciei; n aceast faz realizm identificarea germen ilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene ncepe formarea sporilor. Faza staionar dureaz aproximativ 2-3 zile. Faza de declin Substratul nutritiv srcete, apar metabolii toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc i enzime autolitice, rezervele de hran din incluzii (ex. acidul poli--hidroxi butiric sau glicogenul) se consum, pentru un timp sursa de energie rmne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. n acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare i se exprim o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durat limitat de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogenez devine foarte intens. Aspectul culturilor pe medii solide Condiiile de cultivare i aspectul culturii sunt caractere cheie n identificarea bacteriilor. Aspectul coloniilor variaz ntre diferitele bacterii, fr a permite diferenieri definitive de specie (dar au utilitate n contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene i n contextul general al diagnosticului de laborator, care la rndul su trebuie s aib loc ntr-un context n care punem n balan i alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea ntre medicii de diferite specialiti este esenial). Se examineaz: dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm i mici, sub 1 mm), conturul (circular, lobat, zimat), relieful (plat, bombat, acuminat, papilat), suprafaa (lucioas, granular, rugoas), culoarea (pigmentate, nepigmentate), opacitatea (transparente, opace),

consistena, aderena la mediu, prezena sau absena hemolizei (pe medii de tipul geloz -snge). (Figura nr. 14) Colonia S (smooth) are suprafa bombat i neted, margini circulare i adesea aspect strlucitor. Germenii pstreaz structura antigenic i nu aglutineaz spontan cu soluie salin fiziologic. Germenii capsulai i pstreaz capsula. Virulena este conservat. Majoritatea bacteriilor studiate formeaz colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc). (Figura nr. 15) Colonia R (rough) este plat, suprafaa ei prezint rugoziti, marginile sunt crenelate. Structura antigenic nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula. Virulena nu este conservat (excepii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae). O bacterie care n mod caracteristic duce la apariia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), n cazul n care test ele de identificare prin reacii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lam, folosind anticorpi cunoscui) nu se efectueaz la timpul potrivit ci mai trziu, prin nbtrnire va suferi anumite modificri, coloniile vor deveni de tip R iar identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibil. (Figura nr. 16) Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, mucoas. Este dat de exemplu de bacteriile care prezint capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17) Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi i de tip S i de tip M. n cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obinuite nu vom putea obine colonii izolate (a fost descris fenomenul de invazie). (Figura nr. 18) Cultura se ntinde pe toat suprafaa plcii n strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea n mediu de acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc. Aspectul culturilor pe medii lichide Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de lichid, tulburndu-l. Bacteriile strict aerobe se dezvolt preponderent la suprafaa mediului. Ca un aspect particular, n apa peptonat Vibrio cholerae se poate dezvolta i formeaz un vl la suprafaa mediului. n acest caz , pHul mediului este 9-9,5. Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbur omogen mediul (majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19) Variantele R realizeaz o tulburare mai puin omogen. Pot lsa mediul limpede, formnd flocoane care se depun sau un strat (vl) la suprafaa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos). (Figura nr. 20) Alte informaii privind mediile de cultur, diferitele tehnici de cultivare, examinarea culturilor bacteriene i diferitele tehnici de identificare fenotipice utile n diagnosticul microbiologic sunt prezentate n anexa nr. 2.