BOTANICA

Acta Cientfica Venezolana, 55: 7-12, 2004

PROPAGACION IN VITRO DE CAOBA (Swietenia macrophylla KING) A PARTIR DE YEMAS AXILARES

Melngel Tacoronte*, Mara Vielma*, Argenis Mora** y Carle Valecillos*

*Laboratorio de Cultivos Vegetales in vitro, Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias **Indefor-Facultad de Ciencias Forestales y Ambientales. Universidad de los Andes. Mrida, Zona Postal 5101. Venezuela *E-mail: tacoront@ula.ve

Recibido: 11/01/02; Revisado: 03/05/02; Aceptado: 20/04/04

RESUMEN: La caoba ( Swietenia macrophylla King) es una especie forestal muy cotizada por su madera, pero se encuentra amenazada por las deforestaciones indiscriminadas y por el ataque severo de un insecto, conocido como el barrenador de las meliceas Hypsipyla grandella Zell (Lepidoptera, Pyralidae) , adems presenta una baja capacidad de regeneracin. Para aumentar la poblacin de caoba, se plante la propagacin en masa por cultivo in vitro. En este sentido, fueron cultivados segmentos nodales en medio MS a la mitad de su fuerza inica, complementado con diferentes relaciones de cido naftalen actico (ANA) y 6- benciladenina (BA) establecidas por el diseo estadstico Compuesto Central Rotable (CCR), en un rango de 0-3 mg/L para ambas hormonas. Las condiciones de cultivo fueron 25 C, -2 -1 16 h de luz y 40-45 moles. m . s . La superficie de respuesta resultante muestra un ptimo de alargamiento de yemas laterales en una relacin 0,38 mg/L de ANA y 1,94 mg/L de BA. No hubo diferencias significativas en los vstagos de caoba cultivados en los diferentes medios de enraizamiento estudiados. La metodologa aplicada permiti obtener plntulas de caoba aclimatadas. Palabras clave: Swietenia macrophylla King, caoba, micropropagacin, BA (Benciladenina), ANA (cido Naftalenacetico), Compuesto Central Rotable, (CCR), segmentos nodales, optimizacin de respuesta.

IN VITRO PROPAGATION OF MAHOGANY TREE (Swietenia macrophylla KING) FROM AXILLARY BUDS
ABSTRACT: The mahogany tree (Swietenia macrophylla King) is a forest tree with a great commercial value mainly due to its wood quality. Unfortunately, this species is being threatened by the effect of intensive timber exploitation, its low capacity to regenerate, and the attack of the Meliaceae shoot borer (Hypsipylla grandella Zeller) (Lepidoptera Pyralidae). To increase population, large-scale propagation of mahogany by in vitro culture was developed. To obtain plantlets, nodal segments were cultured in a half-strength MS medium supplemented with different combinations of naphthaleneacetic acid (NAA) and 6-benzyladenine (BA), specified by the Central Compositional Rotable Statistical Design Method, within a range of 0-3 mg/L for both hormones. Favourable incubation -2 -1 o conditions were: 16 h light, and 40-45 mol. m . s at 25 C. The derived response surface showed an optimal axillary bud elongation on a medium containing 1.94 mg BA/L and 0.38 mg NAA/L. No significant differences were found neither applying Orellana Method nor modified Orellana method. Mahogany plantlets obtained were successfully acclimated. Key Words: Swietenia macrophylla King, mahogany, micropropagation, benzyladenine (BA), naphthaleneacetic acid (NAA) rotable cental composite (RCC), nodal segments.

INTRODUCCION La caoba (Swietenia macrophylla King), especie forestal, pertenece a la familia Meliaceae, de gran inters econmico, pero se encuentra en vas de extincin. En Venezuela su hbitat natural son los bosques de galera de los Llanos Occidentales. Plonczak8, reporta la caoba como especie muy escasa, afirma que esto se debe al mal manejo, deforestaciones continuas de los bosques tropicales y la baja regeneracin natural. Por otra parte, su establecimiento en plantaciones se ha visto interferido por el ataque del barrenador de las Meliaceae, la larva de la mariposa Hypsipyla grandella Zeller, que se alimenta de la yema apical y la destruye2 causando deformacin y bifurcacin del fuste lo cual disminuye la calidad y rentabilidad de la madera.

Urge, por lo tanto, plantear estrategias para conservar la especie. Una posibilidad es la propagacin in vitro y la seleccin de somaclones con caractersticas superiores. La FAO3 tiene una red que coordina todos los estudios que se realizan en el rea de distribucin natural de la caoba, la considera una de la especie prioritaria para establecimiento de plantaciones comerciales de madera Sin embargo, mientras no se garanticen individuos con caractersticas superiores (ej. resistencia a plagas y enfermedades) y se recurra a un mtodo de propagacin clonal masivo, ser imposible lograr plantaciones verdaderamente rentables. La propagacin in vitro de caoba tiene pocos antecedentes, debido posiblemente a lo recalcitrante de la especie. Lee y Rao4 obtuvieron vstagos adventicios a partir de callos friables originados de segmentos nodales

8 de plantas de diferentes edades, cultivados en un medio modificado de Murashige y Skoog6 complementado con benciladenina (BA) a concentraciones de 0,002 g/L y 0,005 g/L. Albarrn1 encontr que los explantes de mayor potencial para lograr vstagos eran tambin los segmentos nodales de 0,5 cm, obtenidos de plantas germinadas in vitro y cultivados en un medio MS modificado con diferentes relaciones de la auxina (cido indol actico -AIA) y la citoquinina ( benciladenina BA). A travs de esta investigacin se logr estandarizar una metodologa que ha permitido el desarrollo de yemas axilares, aislando segmentos nodales de 1 a 1,5 cm de longitud. Los mismos fueron sometidos a diferentes tratamientos fitohormonales (ANA/BA), determinados por el diseo estadstico Compuesto Central Rotable (CCR), el cual, tambin aporta una metodologa de anlisis y optimiza respuestas de variables dependientes (propagacin de vstagos), influenciadas por variables independientes continuas (tratamientos)5. Finalmente los vstagos propagados en estos ensayos fueron enraizados, obtenindose as plantas de caoba aclimatadas. MATERIALES Y METODOS

Tacoronte, Vielma, Mora y Valecillos 11,5 cm de largo, tomados entre el tercer nudo y el nudo cercano a los cotiledones. Los mismos fueron cultivados en tubos de ensayo de 50 ml Sigma, llenados con 12 ml/tubo de medio MS modificado, a la mitad de la fuerza ionica (MS/2) y complementado con los diversos tratamientos (Tabla I), incluyendo el control, sin reguladores de crecimiento. Se hicieron cuatro repeticiones de cada tratamiento, para establecer un lmite de confiabilidad de 95% en las respuestas obtenidas. El total de las unidades experimentales fueron ochenta, cuatro repeticiones por tratamiento y veinte explantes por cada repeticin. Los cultivos fueron incubados a 25C y 16h de luz con intensidad de 4045 moles/m2.s Enraizamiento Se ensayaron tres mtodos de enraizamiento: a) Orellana7 b) modificacin del mtodo de Orellana7 y c) uso de un producto comercial, polvo enraizador Hormonex. A continuacin se describe cada metodologa: a) Orellana7 el mtodo se realiza en tres etapas: 1) Induccin, 2) expresin y 3) desarrollo de races. La induccin se establece en un medio lquido con las sales MS/2, vitaminas de Morel al 40%, 0,0898 g/L de cido indolbutrico (AIB), 0,0229 g/L de cido naftaln actico (ANA), 0,0049 g/L de kinetina, sacarosa 15 g/L y pH 5.6. Los vstagos fueron incubados en oscuridad total, por 16 horas. Los explantes fueron subcultivados en una solucin en agua destilada conteniendo, AIB 0,0049 g/L y ANA 0,0049 g/L, pH 5,7 e igualmente en oscuridad total por 72 h. Para la expresin de races, el medio de cultivo fue MS/2, suplementado con tiamina 0,0099 g/L, AIB 0,00059 g/L, ANA 0,0025 g/L, sacarosa 40 g/L, gelrite 2 g/L y pH de 5,7. Despus de 10 das, los vstagos fueron cultivados en el medio descrito por Pierrin y col9. con sacarosa 80 g/l, agar 9 g/L y pH 5,8; por 10 das y un fotoperodo de 16h luz. El desarrollo de races se logr en un medio WPM/2, sacarosa 20 g/L carbn activado 5 g/L, agar 8 g//L y pH a 5,7. Los explantes fueron expuestos durante 30 das en fotoperodo de 16h de luz. b) Consisti, este segundo mtodo, Orellana modificado (1997). Fueron inducidas las races sumergiendo la base del vstago en medio lquido MS/2, complementado con 0,0904 g/L de AIB, 0,02346 g/L de ANA, 0,0057 g/L de kinetina, sacarosa 20 g/L y pH 5,6. A las 48 horas los explantes fueron subcultivados en una solucin de agua destilada conteniendo AIB 0,005 g/L, ANA 0,005 g/L, a un pH 5,7. Los explantes fueron incubados por 72 h con un fotoperodo de 16 h de luz, para ambos tratamientos. La formacin de races se hizo en medio MS/2, suplementado con tiamina 0,0099 g/L, AIB 0,0005 g/L, ANA 0,0003 g/L, sacarosa 40 g/L, gelrite 2 g/L y pH 5,7. Despus de 10 das, se estableci el desarrollo de races cultivando los explantes en un medio MS/2, sacarosa 20 g/L, carbn activado 5 g/L, agar 8g/L y el pH 5,7 por 20 a 30 das.

Material vegetal Los segmentos nodales de caoba con un solo nudo, se extrajeron de plntulas de 4 semanas obtenidas por germinacin in vitro (Fig. 1). Las semillas germinadas fueron obtenidas de frutos recolectados en la Ciudad de Caracas- Distrito Federal. Los rboles de caoba (Swietenia macrophylla King) seleccionados presentaban fuste recto, altura promedio de 5-6 m vigorosos y abundantes frutos grandes, con apariencia de no haber sido atacados por plagas. La recoleccin de frutos se realiz entre los meses noviembre y diciembre. Medios de cultivo El medio Murashige y Skoog6 a la mitad de su fuerza inica (MS/2) fue utilizado tanto para la germinacin como para el cultivo de los explantes, modificando la concentracin de NH4NO3 de 1,65 g/L a 2 g/L, sacarosa de 30 g/L a 20 g/L y el agar a 7 g/l, pH 5,7 5,8. Particularmente para el cultivo de los explantes, el medio fue complementado con ANA y BA, en concentraciones de 0 a 0,003 g/L, segn lo determinado por el diseo CCR (Tabla I). Micropropagacin A partir de plntulas de caoba germinadas in vitro fueron aislados segmentos uninodales (Fig. 2), con

Propagacin in vitro de caoba c) Tratamiento con Hormonex: la base de los explantes fue sumergida en agua destilada estril, para adherir el polvo enraizador Benomil, el cual contiene AIB (1,0%) e ingredientes inertes (98,9%). Se aplic una prueba Z, para comparar proporciones entre los tratamientos. Para p 0.05 y n = 60 explantes para cada tratamiento.

9 02,56 mg/L de BA. Analizando en conjunto los resultados; los mejores tratamientos fueron el 2, 7 y 10, donde se pudo observar que la emergencia de yemas fue del 100 % para los tratamientos 7 y 10, y 95 % para el tratamiento 2. Sin embargo, no todas estas yemas produjeron vstagos. En el tratamiento 7 se alcanz aproximadamente una produccin de vstagos de un 96%. El tratamiento 2 en 73,3% y tratamiento 10 en un 72,72%. Tomando en cuenta el desarrollo de estos vstagos es en el tratamiento 2 donde se obtuvo la mayor estimulacin del crecimiento longitudinal hasta alcanzar vstagos de 2,5 cm promedio, de coloracin plidos y con hojas enrolladas en su mayora. Por otro lado, en el tratamiento 10 se presentaron vstagos de una longitud de 1,3 cm (promedio) pero vigorosos, fololos bien desarrollados, extendidos y de color verde intenso. (Fig 6a y 6b). Entre los tratamientos 10 y 7, hubo diferencia significativa en las respuestas (Fig 7a y 7b). El tratamiento 7 produjo un nmero de vstagos vigorosos que presentaron una menor longitud promedio (0,5 cm).

RESULTADOS Y DISCUSION

Efecto de las relaciones ANA/BA en las yemas laterales Los tratamientos aplicados a segmentos uninodales (Tabla I), presentaron tres tipos de respuestas: estimulante, intermedia e inhibitoria, reflejadas en la emergencia o no de la yema (Fig.3). Dichas yemas tuvieron posteriormente dos tipos de respuestas: alargamiento hasta obtener vstagos (Fig.4) o el poco desarrollo, obtenindose estructuras de morfologa arrosetadas (Fig.5).

Figuras 1 4. 1- Plantas vigorosas de caoba (Switenia macrophylla King, obtenidas por germinacin de semillas asptica. 2- Segmentos nodales de un nudo obtenidas a partir de vitro-plntulas. 3- Explante de segmento nodal, con respuesta de brote de la yema axilar. 4- Desarrollo del vstago a partir de yema axilar, en segmento nodal de un nudo.

Figuras 5 7. 5- Yema arrosetada, el crecimiento del vstago no es alargado y un conjunto de hojas poco desarrolladas que se concentran en el pice. 6a- Vstago con caractersticas morfolgicas tpicas del tratamiento 2, de una longitud promedio de 2,6 cm plido, hojas enrolladas. 6b- Vstago de caractersticas morfolgicas tpicas del tratamiento control de aproximadamente una longitud de 1,3 cm. vigoroso y con hojas extendidas de verdor intenso. 7a- Vstagos del tratamiento 7. Se caracterizan por una longitud promedio de 0,7cm, vigor y presencia de hojas extendidas con verde intenso. 7b- Vstagos resultantes del tratamiento control, con mejores caractersticas que favorecen al enraizamiento.

Respuesta estimulante El mayor nmero de vstagos se obtuvo dentro de un rango de concentracin 0 0,44 mg/L para ANA y entre La mejor induccin y formacin de brotes se obtuvo en aquellos medios sin auxina o con bajas concentraciones de las mismas.

10 Respuesta intermedia A iguales concentraciones de las fitohormonas utilizadas, el porcentaje de respuesta fue menor, en comparacin con los resultados antes descritos. As, en el tratamiento 1 se alcanz un 69,38 % en formacin de vstagos, seguido por un 66,66 % para el tratamiento 5 y luego un 33,33 % para el tratamiento 4. Las caractersticas morfolgicas de cuyos vstagos son de poco vigor y de poco desarrollo foliar, tomando muchos de ellos, la apariencia de yemas arrosetadas (Fig. 5) condicin que limita el estmulo para un desarrollo radical. Respuesta inhibitoria Cuando la concentracin de la auxina es mayor que la citoquinina, hay tendencia a obtener pocos vstagos, de stos presentaban poco vigor tratamientos 3, 6 y 9. El tratamiento 6 alcanza los valores ms bajos 8,57%; aumenta el tratamiento 9 con 25% y el 27,27% para el tratamiento 3. Finalmente la relacin auxina/citoquinina conveniente es la que responda en igual cantidad de vstagos del tratamiento 7, igual calidad del tratamiento 10 y respuestas tempranas como el tratamiento 2. Vstagos vigorosos, hojas de color verde intenso, y longitudes mayores de 1cm. son las caractersticas apropiadas para garantizar el enraizamiento y obtener plantas completas con una mayor posibilidad de aclimatacin y capacidad de sobrevivencia. Indudablemente que las distintas respuestas estn sujetas a las concentraciones de auxina /citoquinina implementada y son los vstagos resultantes del tratamiento 10 los que garantizan plantas completas y con mayor facilidad al proceso de adaptacin al ambiente. La Tabla I resume las distintas respuestas de los explantes de segmentos uninodales a diferentes concentraciones de ANA/BA (auxina/citoquinina) conformando en total diez tratamientos, presentndose tres tipos de respuestas: brote, yemas arrosetadas, vstagos o lo que es lo mismo alargamiento de yema, todo expresado en porcentaje. Anlisis estadstico Las respuestas de brote y vstago de cada explante fueron ajustadas a un modelo polinmico. Se determin la varianza y el coeficiente de determinacin (R2), el cual indica en que medida la relacin auxina/citoquinina interviene en las respuestas. Las ecuaciones polinmicas (Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X12 + B4X22 + B5X1X2 + E) fueron graficadas (Figs. 8 y 9) para obtener una superficie de respuesta, mostrndose el efecto poco estimulante de ANA para la obtencin de vstagos, mientras que el aumento de concentracin BA, da resultados favorables.

Tacoronte, Vielma, Mora y Valecillos

Figura 8. Superficie de respuesta de brotes para segmentos nodales de un nudo.

Figura 9. Superficie de respuesta de vstagos para segmentos nodales de un nudo.

Lo anterior queda confirmado con los resultados del tratamiento 7 (Tabla I), donde no acta ANA y BA es de 1,5 mg/L, se logra la mayor cantidad de vstagos. Pero, se hace hincapi que el anlisis estadstico slo incluye la cantidad y no la calidad de la respuesta, aspecto de mucha importancia en esta investigacin. En este sentido, se recomienda experimentar con bajas concentraciones de ANA, en busca de aumentar la cantidad de vstagos vigorosos y de longitudes apropiadas, evitando una supuesta descompensacin hormonal endgena reflejada en aspectos morfolgicos. El rango ptimo de auxina/citoquinina, sealado por el diseo estadstico, est comprendido entre 0 y 1,94 mg/L. Para respuestas de brote, R2 = 0,513 indica que la relacin auxina/citoquinina interviene en un 51,3 % en el brote de yema axilar.

Propagacin in vitro de caoba Para vstago R2=0,821 indica que la relacin auxina/citoquinina est involucrada en un 82,1% en el alargamiento de la yema axilar. Enraizamiento de vstagos propagados Los resultados de los tres tratamientos de enraizamiento se muestran en la Tabla II. El primer tratamiento es el de mayor estimulo de rizognesis (57%); sin embargo, el porcentaje obtenido vara muy poco con el segundo tratamiento (55%), adems estadsticamente se evidencia que los datos estudiados no proporcionan diferencias significativas de enraizamiento, para un p 0.05. En lo referente al tratamiento 3 por no inducir races en ninguno de los explantes, fue descartado sin ninguna objecin.

11 Para la propagacin de caoba in vitro, los resultados de esta investigacin permiten concluir que para el desarrollo y alargamiento de las yemas axilares, es necesaria una relacin ptima de ANA/BA en el rango de 0 a 1,94 mg/l de cada hormona. Las concentraciones bajas de ANA, favorecen la obtencin de vstagos. El enraizamiento de estos vstagos es posible aplicando el mtodo de Orellana modificado o no; sin embargo se recomienda el modificado, por ser ms rpido. Estas condiciones permitirn obtener plantas de caoba completas y vigorosas. AGRADECIMIENTOS Al CDCHT-ULA por el financiamiento de este trabajo a travs del Proyecto CVI-PIC-02-98. Al Sr. Scrates Prez por su colaboracin en el trabajo fotogrfico

Tabla I: Porcentaje de brotes, yemas arrosetadas y vstagos obtenidos a partir de segmentos nodales de un solo nudo de S. macrophylla cultivados en tratamientos con diferentes concentraciones de ANA/BA.

N de tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Relacin ANA/BA mg/L 0,44/0,44 0,44/2,56 2,56/0,44 2,56/2,56 1,5/1,5 3/1,5 0/1,5 1,5/3 1,5/0 0/0

Brotes % 97,95 95,5 72,7 92,3 88,88 34,28 100 78,78 75 100

Yemas Arrost. % 24,48 16,30 27,27 28,20 10,00 14,29 0,00 27,27 25,00 6,06

Vstago % 69,38 73,30 27,27 33,33 66,66 8,57 95,83 30,30 25,00 72,72

Tabla II: Porcentaje de enraizamiento de vstagos en diferentes tratamientos. *

Tratamientos A B C

Enraizamiento (%) 57 55 0

* Poblacin = n = 60 vstagos por tratamiento

12 REFERENCIAS

Tacoronte, Vielma, Mora y Valecillos

1.

Albarrn, J. G. Estudios de condiciones ptimas para la regeneracin in vitro de Swietenia macrophylla King (caoba).Trabajo Especial de Grado. Universidad de los Andes. Mrida, Venezuela, 1990. Dourojeanni, R. M. El barreno de los brotes (Hypsipyla grandella Zeller) en cedro y caoba. Agronoma 30: 35-43, 1963. FAO. Informe: Cuadro de Expertos de la FAO en recursos genticos forestales. Novena Reunin. FO:FRG/9/ Rep. Roma, 1997, p. 58. Lee, S.K. and Rao, A. N. Plantlet production of Swietenia macrophyla King. Through tissue culture. Gard. Bull.(Singapore) 41:11-18, 1998. Montgomery, D. C. Diseo y Anlisis de Experimentos. Edicin. John Wiley and Sons. 1991, pp. 467-509.

6.

Murashige, T. and Skoog, F. A revised medium for rapid growh and bioassay with tobacco. Tissue Culture. Physiol Plant. 15: 473, 1962. Orellana, N. A. Desarrollo de un sistema de cultivo in vitro para los explantes nodales de caoba (Swietenia macrophylla King.). Tesis MSc. Centro Agronmico Tropical de investigacin y enseanza (CATIE). Turrialba, Costa Rica, 1997. Plozchak, M. Estructura y dinmica de desarrollo de bosques naturales manejados bajo la modalidad de concesiones en los llanos Occidentales de Venezuela. IFLA. Mrida, Venezuela, 1993, p.139. Pierrin, Y., Lardet, L., Enjalic, F. and Carron, M.P. Rajeunissement de clones matures dHevea brasiliensis (Mll,Arg.) par microgreffage in vitro. Can. J. Plant. Sci. 74:623 630, 1994.

7. 2.

3.

8.

4.

9.

5.