Sunteți pe pagina 1din 18

Dezvoltarea limfocitelor Tn cultura timusului la foeteii de oarece

Masterand Dan ovan An VI Biotehnologii

Autori articol:

Toomo Ueno; Cunlan Liu; Takessi Nitta i Kosshuki Takahama

Referat biotehnologia culturilor de celule aimale

Limfocitele T sunt singurele linii ale celulelor hematopoietice, care pentru a deveni imunocompetente, inafar de dezvoltarea n mduva osoas sau ficat, au nevoie i de o migrare a celulelor precursoare n mediul gladei Timus. Cultura timal la foetui, reprezint sistemul unic care permite dezvoltarea in vitro a limfocitelorT intratimale, fetale, reflectnd dezvoltarea lor n timpul ontogeniei i timpul de difereniere.

Adugarea diferiilor reageni: substane chimice, anticorpi, virusuripermite examinarea efectului acestora asupra dezvoltrii celulelorT

Analiza dezvoltrii limfocitelor T in cultura de organe de timus (FTOC) a fost iniat i desvrit de grupul de cercettori condui de Owen i Mendel

Protocolul metodei prevede


Separarea foetuilor de femelele gestante

Pregtirea mediului de cultur


Separarea i cultura de organ a lobilor timali din foetus Separarea suspensiei unicelulare din timusul de cultur Diverse tehnici opionale de dzvoltare a limfocitelor Tn cultura timusului

Separarea i cultura de organ a lobilor timusului la foetus


Pregtirea unui microscop de disecie n apropierea culturii Pregtirea unui vas cu aproximativ 5ml mediu de cultur Sterilizarea instrumentarului de disecie Recoltarea lobilor timali sub microscop Imersia lobilor timali n vasul de cultur pe membrana de filtru policarbonat Verificarea aezrii lobilor timali ntre membrana i aer (evitarea necrii lobilor timali n cultur) Adugarea de 1-2 ml mediu de cultur proaspt (evitarea evaporrii) Incubarea la 37C i 5% CO2

Separarea lobilor timusului la fetuii de oareci

Extragerea suspensiei unicelulare din cultura de timus


Pregtirea unui vas cu 100 l soluie tampon Transferul i numrarea lobilor Disocierea lobilor i eliberarea timocitelor Transferul suspensiei celulare in tuburi de plastic Folosirea suspensiilor celulare pentru examinarea dezvoltrii timocitelor Examinarea prin imunofluorescen sau analiza citometriei n flux

Prepararea mediului de cultur


1. Burete de colagen este tiat in buci de 1-2 cm cu ajutor foarfeci i forceps.

2. Plasarea a cte o bucat de burete in de 24 vase de cultur


3. Pipetarea n vase a 1 ml mediu de cultur RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser foetus de viel, sruri, factori de cretere 4. ntoarcerea buretelui cu forcepsul inct s fie cu partea moale sus 5. Tapetarea cu o bucat de membran cu filtru policarbo nat pe fiecare burete, cu ambele pari ale membranei imbibate 6. Indeprtarea a 0,5 ml mediu de cultur din fiecare vas cu o pipet 1 ml. Volumul final al culturii este de 0,5 ml/ vas.

Diferenierea limfocitelor T n FTOC

CD4

Vizualizarea n timp comprimat a migraiei celulare timale folosind FTOC (cultura timusului foetal-transparent)

Avantajele culturii timusului (FTOC)


Reproductibilitatea i convenabilitatea culturilor in vitro

Dezavantajele culturii timusului (FTOC)


Limitarea numrului de celule

Necroza celulelor din centrul lobului timusului, care nu se mai observ

Cultura timusului fetal prin submersia n oxigen concentrat


Este util pentru reconstrucia cu un numr limitat de celule progenitoare Lobii timusului pot fi cultivai n continuu la fundul vaselor de cultur rotunde sau form de V Prezena celulelor progenitoare este asigurat n mod eficient in timpul culturii datorit gravitaiei Celule T se dezvolt mai rapid n aceste condiiicu oxigen concentrat- dect in vivo sau condiii standard

Refacerea lobilor timali tratai cu deoxiguanosine


Tehnica reconstituirii prin hanging drop Este util pentru testarea potentialului de dezvoltare a celulelor precursoare T la lobii timusului

Pentru reconstituire pot fi folosite celule precursoare T dintr-un fond genetic dat i/sau cu o modificare genetic anterioar

Reagregarea culturii timusului (RTOC)


Ofer un model n care interaciunile celulare necesare pentru dezvoltarea limfocitelor T pot fi studiate n condiii controlate in vitro Celulele precursoare T endogene din lobii timusului pot fi reduse ca urmare a tratamentului cu deoxiguanosin Celule stromale supravieuitoare sunt disociate enzimatic pentru a genera supensii unicelulare Mixtura generat de centrifugare este un amestec de timocite i celule stromale, care recreeaz o structur asemntoare structurii celulare a lobului timusului

Diagrama schematic a culturii timusului reagregat

Transferul retroviral de gene la timocitele n dezvoltare, n cultura de organ a timusului


Este o metod rapid i ieftin de a explora funciile genetice n timpul dezvoltrii celulelor T

Timocitele mature pot fi infectate rapid i eficient prin metoda spin fection
Celulele transferate sunt rapid detectate prin citome tria n flux prin proteina verde fluorescent Un retrovirus poate fi produs prin contaminarea celulelor cu o plasmid retroviral-celule packaging Plat-E (celule ambalaj)

Reconstituirea in vitro a timusului cu timocite infectate retroviral