Electroforeza

Definitie:Metoda de separare prin migrarea particulelor incarcate electric in camp electric. Particule:macromoleculare-proteine, acizi nucleici monomeri-aminoacizi, nucleotide Tehnica separarii proteinelor Metoda analitica ce permite: -vizualizarea i separarea n acelai timp, permind estimarea
rapid a numrului de proteine dintr-un amestec sau gradul de puritate al unui preparat proteic specific. - determinarea proprietilor fundamentale ale proteinelor cum ar fi punctul izoelectric (p ! sau greutatea molecular. pI "punctul izoelectric este p#-ul la care ncrcarea net total a unei molecule amfotere devine zero si mo$ilitatea este nula. Principiu fizic Migrarea electroforetic a unei molecule incarcate electric n orice tip de mediu are loc n direcia electrodului cu ncrcare electric de sens opus ncrcrii nete a moleculei. %stfel, cationii vor migra spre catod (-!, iar anionii spre anod (&!. Migrarea proteinelor este posi$ila caracterului lor amfoter:-grupare $azica '#( -grupare acida )**# +isocierea uneia din aceste grupari are drept consecinta incarcarea pozitiva sau negativa a particulei. Prin urmare la un mediu cu p# acid proteinele vor fi incarcate pozitiv si vor migra spre catod, iar la p# $azic proteinele vor avea incarcare negativa si vor migra spre anod. Mediul de migrare tre$uie s fie tamponat la un p# care determin o direcie i o rat de migrare specifice. p# -indepartat de p determina cresterea incarcarii nete a particulei ,rezultand o mo$ilitate crescuta. -apropiat de p determina reducerea incarcarii particulei, scaderea mo$ilitatii si o $una rezolutie de separare.

,ata de migrare depinde de -incarcarea neta, forma si marimea moleculelor -concentratia ionilor, vascozitatea si temperatura mediului -intensitatea campului electric

-lectroforeza se desfoar fie pe .rtie de filtru sau pe geluri. /elurile pot fi de agaroz sau poliacrilamid.

Electroforeza pe gel de poliacrilamid /elul de poliacrilamid acioneaz ca o sit molecular, ncetinind micarea proteinelor proporional cu raportul mas molecular 0 ncrcare electric. Pentru migrarea proteinelor n gel este nevoie de e1tragerea lor din conte1t. Pentru e1tracie se utilizeaza un detergent, numit 2+2 (sodium-dodecil-sulfat!. Proteinele in amestec cu acest detergent , la caldura, se denatureaza. %cest proces determina o alungire si o incarcare negativa proportionala cu masa moleculara a proteinelor. %stfel, electroforeza n prezena 2+2 separa proteinele dupa masa molecular, cele mai 3usoare4 migrand mai rapid spre anod. +up electroforez, vizualizarea proteinelor se face prin adugarea unui colorant (cel mai folosit al$astru )oomassie! care se leag la proteine, fr a colora gelul. nstalatiile de electroforeza pe gel poliacrilamidic sunt de ( tipuri:-in placi cu tu$uri de sticla suspendate intre rezervoarele tampon cu gelul. -in coloane cu gelul introdus in tu$uri de sticla si iluminat cu o sursa ultraviolet pentru polimerizare. %vanta5e:- monitorizarea progresiei unui proces de purificare proteic cum ar fi fracionarea celular -identificarea unor proteine cu greutate molecular necunoscut prin compararea poziiilor $enzilor de migrare cu geluri standard

Focusarea izoelectrica

are loc ntr-un gradient de p# format de tampoane speciale amfoteri molecule amfoteri, cum ar fi proteine, enzime si peptide.

Moleculele migreaza la p# ec.ivalent punctului sau izoelectric (p#6p ! unde au un numar egal de sarcini pozitive si negative.Prin urmare, atingerea p determina oprirea particulei..

Imunoelectroforeza migrare n cmp electric com$inat cu o reacie imun antigen-anticorp (%g-%c!. reacie de precipitare antigen-anticorp n gel de agaroza

reacie calitativ i are o durat de lucru mare : (7-8( de ore