UNIVERSITATEATA DE VEST"VASILE GOLDIS ARAD

BIOLOGIA MOLECULAR A MEDICAMENTULUI

Arad 2009

PREFA
Biologia molecular este implicat major n cercetrile privind noile strategii terapeutice. Astfel, dac se identific gena/proteina care se afl la originea unei maladii ereditare sau dobndite exist posibilitatea descoperirii unor noi piste pentru concepia unor medicamente destinate s reduc deficitele sau excesele de activitate a acestei gene/proteine. De exemplu,n cazul anomaliei unui anumit receptor (protein a suprafeei celulare destinat s transmit mesajul extern la structurile celulare interne) care determin o anumit maladie este posibil concepia i dezvoltarea unor molecule ,viitoare medicamente, capabile s acioneze specific asupra receptorului sau s suplineasc funcia deficitar a acestuia printr-o alt cale. Cercetrile efectuate asupra moleculelor terapeutice se bazeaz acum pe tehnici de modelare a moleculelor asistate pe calculator, pe sinteza unor analogi de sintez a acestor molecule i pe teste de selecie de nivel nalt ale acestor numeroi analogi. Ansamblul acestor tehnici va permite ,n timp record, o selecie a eficacitii terapeutice a unei anumite inte dintre numeroasele molecule candidate. n prima parte a crii pe baza studiului molecular, mai precis al semnalelor moleculare, sunt analizate diferite tehnologii de testare celular. i, cnd amintim de aceste tehnici ne referim nu doar la simpla detectare a unui singur produs celular ci la urmrirea unei mari varieti de procese metabolice avnd drept scop final caracterizarea fenotipic multidimensional a comportamentului celular. Cel de al doilea capitol familiarizeaz cititorul cu modelele genelor knock-out, o tehnic care ne permite s creem i s introducem un model de mecanism patologic ntr-un organism complex urmrind astfel s obinem un instrument analitic cu relevan crescut n biologia molecular a medicamentului. Urmtorul capitol prezint detaliile unei tehnici de analiz molecular axat pe aa-numitele "gene reporter". Descifrarea recent a genomului uman a oferit un nou sprijin ntregii arii de cercetare. Dintro dat un numr mare de inte moleculare puteau fi supuse analizei. Mai nti trebuie s rspundem la ntrebarea: ce realizeaz aceast molecul int la nivelul proceselor biochimice celulare i cum este ea controlat? Acestei ntrebri i propune s raspund capitolul 4, care se ocup de receptorii "orfani" cuplai cu proteina G (GPCR) i ncearc implicit s prezinte noi provocri i oportuniti n gsirea unor noi liganzi cu efecte biologice nc necunoscute. Cea de-a doua parte a acestei cri este dedicat n ntregime procesului de sintez a medicamentelor. Dou arii de interes major pot beneficia enorm n urma cercetrii procesului de sintez n cadrul biologiei moleculare i utilizrii n acest scop a tehnicilior corespunztoare: elucidarea sintezei stereoselective a compuilor naturali i analogilor lor i sintetizarea compuilor 2

farmacologici derivai din ADN sau proteine. Primul capitol al acestei pri secunde ofer o privire de ansamblu, cuprinztoare, despre utilizarea enzimelor n sinteza stereoselectiv, implicnd utilizarea tehnicilor de recombinare genetic. Domeniul fascinant al produilor farmacologici care interacioneaz cu acizii nucleici, structura i sinteza acestora, agonitii lor i mecanismele de aciune fac obiectul capitolului 6. Partea a treia prezint metodele analitice implicate n determinarea interaciuni medicamentint. n acest sens se discut utilizarea proteinelor n cromatografia de afinitate i enantioseparare a enantiomerilor (molecul parte a unui compus alctuit din dou molecule din care una este imaginea n oglind a celeilalte fr s fie identic cu ea). Utilizarea rezonanei magnetice nucleare (NMR) i a tehnicilor nrudite n studiul structurilor moleculare este un alt subiect din aceast parte a crii. Elementele de cinetic, metabolism,i toxicologie implicate n domeniile farmacogenomicii i toxicogenomicii constituie partea final a acestei cri. Acum tim c o maladie este rezultatul combinat a sute de proteine i n acest context este dificil s sperm c vom gsi un principiu unic activ capabail s vindece boala. ntr-adevr, din 100 de medicamente care depesc stadiul de testare pe om , numai trei ajung pe pia. Celelalte se vor dovedi a fi toxice sau ineficiente. Probabil c toate intele bune asupra crora un medicament poate s exercite un efect au fost deja gsite. Ceea ce presupune c pentru a produce noi medicamente trebuie s se revin la cele vechi, care vor fi altfel reutilizate. Ca i natura, cercettorii vor face cu ajutorul biologiei moleculare, noul din vechi.

Autorii

CUPRINS
CUVNT NAINTE .......................................................................................................................... 7 PARTEA I: CARACTERIZAREA MOLECULAR A INTERACIUNILOR MEDICAMENT-INT .................................................................................................................10 1. TESTELE CELULARE: UTILIZAREA I IMPACTUL LOR N DESCOPERIREA MEDICAMENTELOR ..................................................................................................................10 1.1. Introducere ..............................................................................................................................10 1.2. Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapide...........................................................16 1.3. Evaluarea expresiei genelor i proteinelor n cadrul unor sisteme de analiz de mare capacitate........................................................................................................................................27 1.4.Reaciile celulare spaio-temporale i analizele subpopulaiilor..............................................37 1.5. Analizele fenotipice ................................................................................................................49 2. IMPLICAREA GENELOR KNOCKOUT N NELEGEREA MECANISMELOR BOLII I DEZVOLTAREA UNOR NOI STRATEGII TERAPEUTICE .....................................................58 2.1. Introducere ..............................................................................................................................58 2.2. Gene knockout la oareci ........................................................................................................59 2.3. Expresia genelor esut specifice..............................................................................................70 2.4. oareci transgenici ..................................................................................................................77 2.5. Lezarea genelor int la Drosophila ........................................................................................79 2.6. Inactivarea genelor int la petele zebr ................................................................................81 2.7 . Deleia tulpinilor int de Caenorhabditis elegans .................................................................82 3. SISTEME DE TESTE BAZATE PE GENE REPORTER CARE INVESTIGHEZ RECEPTORII CUPLAI CU PROTEINA G IMPLICAI N DESCOPERIREA DE NOI MEDICAMENTE ..........................................................................................................................84 3.1. Receptorii i comunicarea celular .........................................................................................84 3.2. Afinitatea i activitatea liganzilor GPCR................................................................................90 3.3. Rolul factorilor de transcripie n expresia genelor.................................................................91 3.4. Genele reporter.......................................................................................................................94 3.5. Sisteme de teste bazate pe gene reporter pentru investigarea GPCRs ..................................102 4. DE LA GENOMUL UMAN LA NOILE MEDICAMENTE: POTENIALUL RECEPTORILOR ORFANI CUPLAI CU PROTEINELE G ..................................................109 4.1.Introducere .............................................................................................................................109 4.2. GPCRs i genomul uman ......................................................................................................111 4.3. Investigarea liganzilor...........................................................................................................116 4.4. Screeningul pentru liganzi oGPCR folosind teste funcionale.............................................124 4.5. Perspective ............................................................................................................................137 PARTEA A II-A: SINTEZA MEDICAMENTELOR PE BAZA ENZIMELOR I ACIZILOR NUCLEICI...................................................................................................................................... 140 5.SINTEZA STEREOSELECTIV A MEDICAMENTELOR CU AJUTORUL ENZIMELOR RECOMBINANTE......................................................................................................................140 5.1. Sinteza stereoselectiv nainte de apariia ingineriei genetice ..............................................140 5.2. Metode clasice de mbuntire a tulpinilor pentru sinteza stereoselectiv ..........................144 5.3. Ingineria genetic i apariia enzimelor recombinante pentru sinteza stereoselectiv..........146 5.4. Antibioticele -lactamice ......................................................................................................149 5.5. Antibioticele poliketide.........................................................................................................157 5.6. Vitaminele.............................................................................................................................160 5.7.Steroizii...................................................................................................................................167 5.8. Alte medicamente .................................................................................................................168 4

5.9. Concluzii ...............................................................................................................................172 6. MEDICAMENTE PE BAZ DE ACIZI NUCLEICI.............................................................173 6.1. Introducere ............................................................................................................................173 6.2. Sinteza chimic a oligonucleotidelor ....................................................................................174 6.3. Modificri chimice ale oligonucleotidelor............................................................................176 6.4. Mecanismul de aciune..........................................................................................................186 6.5. Identificarea poziionrii situsurilor accesibile ribozimelor la nivelul ARN int ................198 6.6. Distribuirea exogen a ribozimelor.......................................................................................199 6.7. Aplicaiile oligonucleotidelor n inhibarea expresiei genelor ...............................................202 6.8. Concluzii ...............................................................................................................................203 PARTEA III: METODE ANALITICE IMPLICATE N PRODUCEREA I UTILIZAREA MEDICAMENTELOR..................................................................................................................204 7. TENDINE RECENTE N ENANTIOSEPARAREA MEDICAMENTELOR CHIRALE..204 7.1. Introducere ............................................................................................................................204 7.2. Situaia actual a dezvoltrii i utilizrii medicamentelor chirale ........................................208 7.3. Rolul tehnologiilor de separare n producerea, cercetarea i utilizarea medicamentelor chirale...........................................................................................................................................211 7.4. Prepararea medicamentelor enantiomeric pure.....................................................................212 7.5. Bioanaliza medicamentelor chirale.......................................................................................225 7.6. Perspective ............................................................................................................................238 8. CROMATOGRAFIA DE AFINITATE: APLICAII N BIOFARMACEUTIC ................239 8.1. Introducere ............................................................................................................................239 8.2. Principiile cromatografiei de afinitate...................................................................................240 8.3. Ligandul ................................................................................................................................243 8.4. Matricea de afinitate..............................................................................................................249 8.5. Principii de operare ...............................................................................................................254 8.6. Modele de cromatografie de afinitate ...................................................................................256 8.7. Aplicaiile interaciunilor de afinitate ...................................................................................265 9. IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR PE BAZA REZONANEI MAGNETICE NUCLEARE ................................................................................................................................281 9.1. Introducere ............................................................................................................................281 9.2. Relaia structur-activitate (SAR) prin RMN .......................................................................282 9.3. Monitorizarea moleculelor mici............................................................................................294 9.4. Concluzii ...............................................................................................................................308 10. MARCAREA PROTEINELOR CU IZOTOPII C13 I N15 PENTRU ANALIZA STRUCTURII I DINAMICII MACROMOLECULELOR BIOLOGICE ...............................310 10.1. Introducere ..........................................................................................................................310 10.2. Sisteme de expresie ale ncorporrii in vivo a izotopilor C13 i N15 n proteine..................312 10.3. Marcarea izotopic acelular ..............................................................................................328 11. UTILIZAREA FRAGMENTELOR DE ANTICORPI CA MEDIATORI AI CRISTALIZRII PROTEINELOR MEMBRANARE N VEDEREA DESCOPERII DE NOI MEDICAMENTE ........................................................................................................................344 11.1. Introducere ..........................................................................................................................344 11.2. Cristalizarea proteinelor membranare mediat prin fragmente de anticorp........................348 11.3. Concluzii .............................................................................................................................367 PARTEA IV: ELEMENTE DE CINETIC, METABOLISM I TOXICOLOGIE ALE MEDICAMENTELOR..................................................................................................................368 12. FARMACOGENETICA: EFECTUL VARIANTELOR GENETICE N DISPONIBILITATEA I RSPUNSUL MEDICAMENTELOR..............................................368 12.1. Consideraii generale...........................................................................................................368 5

12.2. Relaii ntre genotip i fenotip.............................................................................................369 12.3. Stabilirea relaiilor ntre genotip i fenotip .........................................................................371 12.4. Fenotiparea versus genotipare i predicia rspunsului individual la medicamente ...........374 12.5. Polimorfismul genetic al enzimelor de metabolizare a medicamentelor (DMEs) ..............376 12.6. Polimorfismul CYP2D6......................................................................................................381 12.7. Polimorfsmul genetic al transportorilor de medicamente ...................................................385 12.8. Gena de rezisten multipl la medicamente (MDR) marker versus polimorfismul funcional .....................................................................................................................................385 12.9. Polimorfismul genetic al intelor medicamentelor..............................................................387 12.10. Concluzii ...........................................................................................................................391 13. FARMACOGENOMICA BIODISPONIBILITII I ELIMINRII MEDICAMENTELOR ................................................................................................................393 13.1. Introducere ..........................................................................................................................393 13.2 Contribuia metabolismului la clearance-ul medicamentelor ..............................................394 13.3. Transportorii medicamentelor: Glicoproteina P (P-gp) ......................................................404 13.4. Concluzii .............................................................................................................................408 14. TOXICOGENOMICA: INTEGRAREA NOILOR METODE PROPRII BIOLOGIEI MOLECULARE N TOXICOLOGIE .........................................................................................409 14.1. Dezvoltarea toxicologiei .....................................................................................................409 14.2. Genomica funcional: noi tehnologii ale biologiei moleculare .........................................411 14.3. Integrarea tehnologiilor genomice funcionale n toxicologie ............................................423 14.4. Aplicaiile toxicogenomicii n studiul mecanismului hepatotoxicitii indus de bromobenzen................................................................................................................................428 14.5. Concluzii .............................................................................................................................430 15. IMPORTANA POLIMORFISMULUI GENETIC I A INTERACIUNILOR MEDICAMENTOASE N TRATAMENTUL DURERII........................................................431 15.1. Introducere ..........................................................................................................................431 15.2. Polimorfismul genetic:efectele asupra diferitelor analgezice .............................................434 15.3. P-gp:un alt exemplu al variabilitii genetice .....................................................................448 15.4. Fenotipaj i genotipaj: perspective......................................................................................450 15.5. Concluzii .............................................................................................................................453 BIBLIOGRAFIE............................................................................................................................ 454

CUVNT NAINTE
Progresul uria nregistrat de biologia molecular de-a lungul ultimelor decenii a condus la dezvoltarea a numeroase metode de cercetare inovatoare cu impact implicit asupra descoperirii i dezvoltrii de noi ageni farmacologici. Tehnicile moderne de identificare i validare a unor molecule inte pe de o parte i descoperirea i ulterior descrierea de noi medicamente i mecanisme de aciune pe de cealalt parte necesit un spectru extrem de larg de metode i tehnici care depete cu mult repertoriul metodologiilor clasice . Descrierea molecular detaliat a interaciunii medicament - molecul int este la fel de important i solicitant ca i cunoaterea interaciunii medicament ntregul sistem fiziologic. Acum ne sunt la ndemn conceptele i informaiile despre transportul medicamentelor, metabolismul i stabilitatea acestora. De asemenea, putem s prezicem i s determinm modalitatea de reacie a ntregului sistem la administrarea unui medicament, chiar dac se tie c acest medicament ar aciona doar la nivelul unei inte specifice. Metodele i conceptele moderne care fac obiectul farmacogenomicii i toxicogenomicii au demonstrat clar acest principiu. Lucrarea are patru pri: (1) Caracterizarea molecular a interaciunii medicament-int (2) Sinteza medicamentelor pe baza enzimelor i acizilor nucleici , (3) Metode analitice implicate implicate n producerea i utilizarea medicamentelor i n final, (4) Cinetic, metabolism, toxicologie i dezvoltarea agenilor farmacologici. Cel dinti capitol al primei pri prezint contextul biologic oferind o descriere la zi a testelor celulare care ne sunt la ndemn, aplicabilitatea i impactul lor asupra descoperirii agenilor farmacologici. Se analizeaz testele implicate n studiul proteinelor membranare, a rspunsurilor celulare rapide, testrile pentru cercetarea expresiei proteice i genice celulare , analiza spaio-temporal i a subpopulaiilor celulare i nu n ultimul rnd determinarea fenotipului. n capitolul doi al primei pri, se descriu elemente referitoare la oareci "knock-out" (oareci transgenici obinui prin recombinare omolog, cu modificri genetice care pot conduce la eliminarea funciei unei gene) i la tehnicile necesare generrii unor asemenea animale. Receptorii cuplai cu proteina G fac obiectul capitolelor trei i patru. n primul dintre ele accentul este pus pe caracterizarea receptorilor cuplai cu proteina G i aplicabilitatea genelor "reporter" ca sisteme de transcriere, n timp ce capitolul urmtor fcnd referire la etapa postgenomic ofer strategii de identificare a liganzilor pentru receptorii "orfani" cuplai cu proteina G. 7

Partea a-IIa a crii se ocup de diferite aspecte ale sintezei medicamentelor.Se ofer o combinaie clasic ntre elemente de sintez organic i biotehnologie realiznd tabloul sintezei stereoselective a medicamentelor cu ajutorul enzimelor recombinante. Prima parte a acestui capitol ne prezint o imagine de ansamblu asupra acestor elemente i ofer numeroase exemple evalund rezultatele unor asemenea strategii. n perspectiv vor fi utilizai ageni farmacologici care interacioneaz cu acizii nucleici . Atractivitatea lor ca i liganzi cu specificitate mare a intrat mereu n conflict cu numeroase probleme de farmacocinetic. Cu toate acestea, numeroase concepte cu privire la stabilizarea acestor molecule, potenialul fascinant de a interaciona cu ARN-ul (RNAi) au fcut ca primele medicamente aprobate s fie extrem de similare acestor molecule, spre exemplu manipulatorii semnalizrii celulare. Capitolul 6 discut mai multe aspecte, incluznd sinteza i aplicabilitatea unor asemenea tipuri de compui, incluznd tehnica interaciunii cu ARN (RNAi). Partea a-IIIa se ocup de aspecte analitice. Separarea enantiomerilor (enantiosepararea) medicamentelor chirale i cromatografia de afinitate sunt instrumente importante ale dezvoltrii medicamentelor i elementele lmuritoare asupra acestor aspecte sunt prezentate n capitolele 7 i 8. Metode analitice bazate pe tehnici de biologie molecular sunt incluse ntr-o serie de trei capitole. Dou dintre acestea se axeaz pe descrierea tehnicilor RMN care au cunoscut o dezvoltare deosebit n ultimele decenii. Aceast dezvoltare a condus ulterior la definirea tehnicii RMN ca un instrument de baz n determinarea att a structurilor macromoleculare dar i a detectrii i caracterizrii interaciunilor dintre ligand i molecula int. Capitolele 9 i 10 analizeaz aplicabilitatea tehnicii RMN n descoperirea agenilor farmacologici i descrie tehnici de marcare a proteinelor cu izotopi radioactivi de C13 i N15. Realizarea unor modele de structuri medicamentoase realiste are la baz cunotine exacte obinute prin cristalografie cu raze X. n ciuda, mbuntirilor evidente pe care le-a suferit metodologia n acest domeniu de cercetare, structurile receptorilor membranari, care reprezint de fapt intele cele mai importante ale medicamentelor, sunt nc neelucidate. Un pas uria ctre rezolvarea acestei enigme l-ar putea constitui utilizarea fragmentelor de anticorpi drept elemente de potenare ale cristalizrii. Detalii despre aceast nou i captivant tehnic sunt oferite cititorului n capitolul final al prii a-IIIa . Farmacogenomica i toxicogenomica sunt domenii noi cu un considerabil impact asupra viitoarei dezvoltri a agenilor farmacologici. Ultima parte a crii se ocup de aceste subiecte noi, care vor reui probabil cu timpul s genereze schimbri, renunndu-se la concepiile iniiale "aceeai doz este recomandat pentru toi pacienii care au aceeai boal". Direciile moderne se vor baza pe ideea "medicamentul adecvat, doza adecvat, persoana adecvat".

Pe de o parte, medicamentele vor aciona de manier mai intit i vor antrena mai puine efecte nedorite, iar eficacitatea lor va crete.Pe de alt parte, medicii vor fi n msur s decid plecnd de la profilul genetic al pacientului, dac un tratament are anse s reueasc i dac nu s opteze pentru un alt tratament. Riscurile personale ascunse n genele unui anumit pacient vor putea fi identificate de ctre medic i innd cont de specificitatea i individualitatea lor se va alege strategia pentru prevenie i tratament.Totalitatea medicamentelor cunoscute sunt dirijate asupra 400 de biomolecule diferite ale organismului nostru ,molecule cunoscute sub numele de inte terapeutice (drug targets) dintre care menionm:enzime,receptori,i alte biomolecule care sunt inhibate sau asupra crora acioneaz ntr-o manier sau alta. Datorit decriptajului genomului uman se vor descoperi ntre 3000 -10000 de biomolecule noi care vor fi utilzate ca situsuri de atac molecular. Terapia genic este o cale nou de cercetare ,care suscit un foarte mare interes. Ea i propune s vindece sau s atenueze efectul unei maladii reparnd o gen defect sau activnd sute de gene utile.Strategia introduce n celulele umane(cu excepia celulelor sexuale sau gamei) o gen corectoare sau terapeutic destinat s reduc defectele genei afectate, n cazul maladiilor genetice ,sau s acioneze ntr-un alt mod , de exemplu s ajute sistemul imunitar s elimine cancerul.n aceste cazuri se acioneaz asupra genomului pentru ca organismul s produc o protein de interes terapeutic , ceea ce presupune implicarea ADNului ca medicament. Dei sunt puine maladii care pot fi tratate pe baza terapiei genice aceast strategie ne d numeroase sperane, chiar dac ea nu poate fi utilizat curent avnd n vedere dificultile pe care trebuie s le depeasc.

PARTEA I: CARACTERIZAREA MOLECULAR A INTERACIUNILOR MEDICAMENT-INT

CAPITOLUL 1 TESTELE CELULARE: UTILIZAREA I IMPACTUL LOR N DESCOPERIREA MEDICAMENTELOR 1.1. Introducere
1.1.1.Testele/experimentele celulare Experimentele bazate pe studiul celulelor permit studierea funciilor preparatelor farmaceutice sau a intelor bolilor n cadrul unui mediu complex i al contextului biologic de ansamblu. Aplicarea noilor tehnologii n biologia molecular, mpreun cu introducerea noilor metode de analiz a mutat cadrul experimentelor celulare de la nivelul fenotipic cum ar fi, proliferarea celular, moartea celular, respiraia i diferenierea funcional, ctre analizele celulare ale funciilor moleculelor semnal - specifice i ale componentelor metabolice. n momentul de fa, experimentele celulare presupun msurtori mecanice, asociate intelor specifice, care permit identificarea componenilor chimici cu funcie specific intei sau funcie modulatoare asociat. Se poate aadar afirma c analizele celulare vor juca un rol din ce n ce mai important n descoperirea medicamentelor, n special a componentelor pentru validarea i optimizarea intei, precum i n selecia modulatorilor cu molecule mici i n opimizarea modulrii. n contrast cu testele biochimice ale substanelor chimice pentru modularea activitii intelor moleculare, sistemele celulare pot oferi informaii adiionale cu privire la transportul, metabolismul i stabilitatea medicamentelor. Cel mai important aspect este acela c
10

intele farmacologice rmn n mediul lor natural atunci cnd este analizat modularea , astfel ca datele s aib o valoare predictiv nalt (Fig 1.1). Cu toate acestea, mai trebuie spus c, pentru a utiliza experimentele celulare, celulele trebuie scoase din mediul lor natural i crescute n culturi. Acest lucru va conduce inevitabil la alterri ale repertoriului genelor i ale expresiei proteice i deci ale fenotipului. Celulele utilizate n astfel de experimente trebuie deci s fie caracterizate din punctul de vedere al funciilor reelelor intracelulare, rspunsului la stimuli externi - cel puin pentru calea de semnalizare de interes - i comparate cu rspunsul i evenimentele ce au loc la nivelul esutului sau organului. n multe cazuri, acest lucru nu este nc pe deplin realizabil.

Fig. 1.1 Selecia intelor farmaceutice. Numrul mare al intelor farmaceutice poteniale necesit un proces eficient de selectare a acelor inte pentru modularea cilor i fenotipurilor relevante pentru anumite afeciuni. Experimentele celulare, care sunt strns legate cu intele de interes, permit calificarea modulatorilor cu molecul mic identificai n experimentele celulare sau biochimice de nalt capacitate, n conformitate cu funcionalitatea ntr-un mediu fiziologic relevant. Experimentele celulare care nu sunt strns legate cu inta vor indica efectele sistemice ale componenilor i pot fi interpretate ca i clasificare celular de siguran. Testele celulare pot fi utilizate pentru prioritizarea intelor i a componenilor.

1.1.2. Impactul asupra descoperii medicamentelor n timpul descoperii i dezvoltrii medicamentelor, multe elemente sunt pierdute datorit efectelor nedorite sau toxicitii i lipsei eficacitii dorite. O mare
11

parte din aceste efecte pot fi determinate de interaciunile potenialelor medicamente cu alte inte dect cele considerate iniial ca modulatoare ale unei afeciuni. Sistemele de teste celulare au potenialul de a elucida multitudinea interaciunilor medicamentoase i deci de a contribui la o mai bun nelegere a aciunii i selectrii medicamentelor. Celula, prin structura i funciile sale, este organizat n cascade metabolice i de transducie a semnalului. Majoritatea acestor cascade sunt complexe i non-lineare [Stephaopoulos, Kelleher, 2001]. n plus, diferitele cascade comunic unele cu altele, formnd circuite i domenii intracelulare. Majoritatea bolilor nu pot fi explicate prin afectarea unei singure etape a unei ci, de semnalizare, ci prin multiple alterri care afecteaz reelele ntr-o manier complex [Hanahan, Weinberg 2000, Somogyi, Greller 2001]. Similar, medicamentele, fie c interacioneaz specific cu o singur int sau cu mai multe molecule, vor perturba cascadele metabolice i de semnalizare, ntr-un mod complex. n plus, din moment ce multe tipuri de celule utilizeaz aceleai molecule pentru semnalizare n contexte diferite, multe tipuri celulare pot fi afectate n grade diferite de acelai medicament. Introducerea recent a evalurii expresiei genice i proteice pe baza unor sisteme de analiz de mare capacitate, ca i a analizelor metaboliilor [Glassbrook i colab. 2000, Raamsdonk i colab. 2000] permit o mai bun nelegere a gradului i localizrii interferenelor. Experimentele celulare ofer astfel o soluie pentru studierea modulrii unei inte farmacologice n reeaua sa natural complex precum i a potenialelor efecte asupra altor reele. Bolile umane sunt caracterizate prin una sau mai multe alterri ale cilor metabolice i de semnalizare implicate major n meninerea homeostaziei celulare i diferenierea funcional. Testele celulare pot oferi o reprezentare a acestor alterri i devin astfel modele funcionale relevante pentru evaluarea aciunii medicamentelor. n zilele noastre, experimentele celulare ofer oportunitatea de a identifica punctele de interferen care conduc la alterri fenotipice sau modificri finale. Frecvent, multiple nivele de intervenie sunt necesare pentru a altera efectele unor reele biologice. Reguli similare se pot aplica pentru numrul de inte terapeutice care trebuie modulate, n special pentru maladii complexe. intele potrivite i combinaiile
12

medicamentoase pot fi selectate numai n cazul n care fiecare component individual al unei ci particulare poate fi studiat individual, acest lucru fiind posibil prin utilizarea sistemelor celulare. Combinaia componentelor care duc la efectul dorit poate fi identificat prin analiza mai multor parametri. Mai mult, aceste analize pot facilita aprecierea efectului componentelor individuale asupra mai multor ci. Aceasta permite o estimare a efectelor nedorite (profilul de siguran), dar poate conduce de asemenea la identificarea unor aplicaii n noile condiii. n acest fel testele realizeaz o selecie rapid a componentelor chimice cu variate profile. Ierarhic, citirea spaio-temporal va genera o bun cunoatere a mecanismelor de aciune a medicamentelor i va permite prezicerea efectelor sistemice (Fig 1.2). Dezvoltarea i aplicarea mijloacelor computerizate i a modelelor cilor intracelulare sunt o condiie obligatorie pentru sigurana evalurii i a interpretrii [Gifford, 2002, Karp, 2001]. nelegerea nivelelor sistemelor este posibil numai prin urmrirea rezultatelor experimentale la nivel celular sau sub-celular.

Fig. 1.2. Circuitul celular schematic i conceptul analizei sistemelor celulare. Celulele se conecteaz cu mediul nconjurator printr-o varietate de receptori, canale i transportori. Semnalizarea intracelular ,cile i reelele metabolice reacioneaz la stimulii intra- i extracelulari ntr-o manier dependent spaio-temporal. Diferitele tipuri de celule reacioneaz diferit la acelai stimul. Diferite tipuri de celule ale esuturilor normale i patologice sau celule manipulate genetic pot fi expuse la stimuli diferii n prezena i n absena medicamentelor i reaciile celulare pot fi 13

evaluate. Analizele multiparametrice identific compuii cu efecte asupra homeostaziei celulei care pot fi specifice intei, nelegate de int, reversibile sau ireversibile.

1.1.3. Clasificarea testelor celulare Testele celulare au avantajul c nu necesit purificarea intelor farmacologice. Totui, n multe cazuri, testele celulare necesit manipularea celular pentru a permite citirea specific a semnalului. Supraexprimarea receptorilor de suprafa celular sau a proteinelor intracelulare pot avea efecte substaniale asupra fiziologiei celulei i trebuie luate n considerare atunci cnd se utilizeaz aceste teste pentru descoperirea noilor medicamente. Reaciile precoce ale hormonilor, factorilor de cretere i neurotransmitorilor sunt deseori mediate prin intermediul mesagerilor secunzi sau influxului i efluxului rapid de ioni. Modificrile proteinelor posttranslaionale i translocaia proteinelor sunt urmtoarele etape care altereaz statusul fiziologic al unei celule. Asemenea modificri sunt capabile s conduc la modificri rapide ale cilor metabolice, precum i la alterri ale activitii genelor i expresiei proteice, ducnd n final la noi fenotipuri celulare, ce includ proliferarea i moartea celular. Testele celulare pot fi clasificate n funcie de evenimentele temporale care apar atunci cnd o celul este expus la alterri ale mediului extra- i intracelular (Tabelul 1.1). Rspunsurile rapide indicatoare de modificri ale concentraiilor ionilor sau mesagerilor secunzi conduc n final la modificari funcionale i fenotipice. Unele dintre evenimentele celulare pot fi refcute n aa numitele sisteme model, care pot fi mai uor de manevrat i manipulat genetic fa de celulele mamiferelor. Drojdiile s-au dovedit a fi organismele cel mai frecvent utizate n aceste sisteme, deoarece semnalele metabolice i interaciunile protein-protein sunt relevante pentru transducia semnalului, putnd fi traduse ntr-un rspuns al creterii uor msurabil [White, 1996, Ito i colab., 2001]. Cteva modificri ale dublului sistem hibrid al drojdiilor s-au dovedit utile n identificarea compuilor care interfer funcional cu mecanismele intracelulare specifice. Tucker i Fields (2001) au descris un sistem senzor pentru descoperirea medicamentelor bazat pe activarea conformaional, dup legarea medicamentului, sau a unei enzime implicate major n
14

proliferare. Cu toate acestea, comparativ cu celulele mamiferelor, drojdiile prezint unele diferene care includ prezena peretelui celular, lipsa genelor pentru complementul total al mamiferelor i alterri ale sistemelor metabolice.
Tabelul 1.1 Clasificarea tipurilor de reacii celulare funcionale Mesageri secunzi i canale nivelele Ca2+ canale ionice transportori nucleotide ciclice Dinamica proteinelor modificari posttranslaionale (fosforilarea) translocaiile proteice Expresia genic tehnologiile pe chip-uri tehnologia ADN ramificat senzori oligonucleotidici Expresia proteic tehnologia genelor reporter reacia ELISA array-uri ale proteinelor pe chip-uri Profilul metaboliilor profilul analitic cantitativ Rspunsurile metabolice i proliferarea celular, citotoxicitatea, fenotipice moartea celular/ apoptoza, acidifierea diferenierea celular

1.1.4.

Progrese

ale

mijloacelor

tehnologiilor

pentru

profilul

componentelor celulare Perfecionarea sistemelor analitice [Straub i colab., 2001] i a sistemelor de citire permite cercettorilor s obin aspecte clare ale alterrilor expresiilor genice i proteice [Celis i colab., 2000], precum i a metaboliilor [Glassbrook i colab., 2000, Nicholson i colab., 2002]. n afara situaiei n care este necesar o analiz pe scar larg, tehnologiile curente permit obinerea unor rezultate convenabile pentru profilul medicamentelor. Pentru studiile expresiei genice, experimentele care utilizeaz sonde fluorescente pot substitui sistemele bazate pe cipuri cel puin pentru unele cazuri bine selecionate [Broach, Thorner, 1996; Goetz i colab, 2000]. Actual sunt disponibile cteva sisteme de imagistic celular sau microscopie de mare capacitate i scanare laser, precum i dezvoltarea unor noi markeri fluoresceni i anticorpi specifici. Aceste combinaii permit studiul traficului proteinelor n celule. Studiile dinamicii i interaciunii proteinelor a fost facilitat de identificarea proteinelor florescente [Raamdonk i colab., 2000, Remington, 2002;
15

Schaufele, 2001] i a altor colorani fluoresceni [Mitchell, 2001], mpreun cu aplicaiile fluorescenei cu transfer de energie prin rezonan (fluorescence resonance energy transfer - FRET). Alte tehnologii, precum spectroscopia cuplat multipolar (multipole coupling spectroscopy - MCS) [Hefti, Kumar, 1999] i biochip-urile pentru monitorizarea celular multiparametric [Baumann, 1999] sunt pe cale de a fi utilizabile. Sistemul FLIPRTM (Cititorul de plci fluorometrice; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) utilizat pentru studiul rspunsurilor rapide ale mesagerilor secundari, precum eliberarea Ca2+, a fost recent mbuntit pentru a permite analiza canalelor ionice. Aplicaiile FLIPR sunt discutate n detaliu mai jos. n seciunile urmtoare, vom descrie n detaliu un set selectat de aplicaii. Discuiile sunt grupate, pe baza tabelului 1.1, n rspunsuri rapide sau sistemele mesagerilor secundari, alterri ale expresiei genice sau proteice, alterri metabolice, precum i efectele asupra fenotipului [Dingerman i colab.,2004].

1.2. Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapide

O varietate de proteine membranare au fost exprimate n diferite celule eucariote (linii celulare ale mamiferelor, celule ale insectelor, drojdii) cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant, pentru a studia receptorii de suprafa celular, canalele ionice sau proteinele de transport. 1.2.1 Receptorii Receptorii de suprafa celular mediaz semnalizarea celular de la suprafaa celular la citoplasm i/sau nucleu prin intermediul a dou procese majore, semnalizarea prin intermediul receptorilor legai la enzime sau a proteinelor de legare a GTP (proteinele G). Receptorii legai la enzime includ receptorii guanilat ciclazici, receptorii tirozin-kinazici, receptorii asociai tirozin kinazei, receptorii tirozin fosfatazici i receptorii serin/treonin kinazici [Schlessinger, 1993]. n toate cazurile, n urma activrii este iniiat o cascad de evenimente care afecteaz statusul receptorilor i concentraia uneia sau mai multor molecule mici de semnalizare
16

intracelulare. n cele ce urmeaz, vom discuta monitorizarea semnalelor mediate de proteinele G, care sunt activate de receptorii cuplai cu proteina G n urma legrii unui ligand specific. Consecutiv stimularii au loc modificari ale AMPc intracelular sau concentraiei Ca2+. Aceste dou molecule semnal specifice sunt implicate n procesele reglatoare ale sistemelor cardiovascular i nervos, mecanismelor imune, diferenierii i creterii celulare i metabolismului. Ambii mesageri acioneaz ca efectori alosterici pe proteine int specifice ale celulei, incluznd kinazele (protein kinaza A i C), lipazele (fosfolipaza C), proteinele de legare a Ca2+ (calmodulina) i canale ionice (receptori glutamat ionotropici). Concentraiile citoplasmatice ale mesagerilor secundari sunt reglate prin intermediul enzimelor membranei plasmatice n cazul cii AMPc enzima adenilat ciclaza produce direct AMPc, iar n cazul cii Ca2+ lipazele sunt stimulate s produc mesagerul solubil inozitol trifosfatul (IP3) care induce eliberarea Ca2+ din reticulul endoplasmic. n unele cazuri canalele ionice sunt activate prin interaciunea direct cu subunitile proteinei G [Cruce M, 2000]. n prezent au fost realizate diferite tehnologii pentru monitorizarea intracelular a mesagerilor secundari n celule. Detectarea Ca2+ este n general bazat pe indicatorii fluoresceni, care au proprietatea de a penetra cu uurin membranele celulare i a-i altera emisia fluorescent n urma legrii Ca2+. Pentru msurtorile unui rspuns rapid i tranzitor, reacia de legare a Ca2+ trebuie s fie reversibil, oferind date cinetice importante care permit diferenierea unui semnal tranzitor tipic datorat activrii specifice a receptorului de un semnal nespecific care afecteaz homeostazia Ca2+ i permeabilitatea membranar. n mod curent se utilizeaz numeroase sisteme, diferite, pentru a detecta AMPc n testele celulare. n cele mai multe cazuri celulele sunt lizate n urma expunerii la un ligand specific, iar cantitatea de AMPc este determinat printr-o imunoreacie competitiv (Perkinelmer Life Sciences, Boston, Ma; Molecular Devices; Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, Ca) sau printr-o reacie enzimatic competitiv de complementare (Discoverx, Fremont, Ca). Tipic, receptorii cuplai cu proteina G sunt supraexprimai n liniile celulelor eucariote pentru a monitoriza concentraia mesagerilor secundari n urma stimulrii
17

cu un ligand specific [Sullivan i colab., 1999]. n multe cazuri, co-exprimarea unei subuniti corespunztoare sau a proteinelor G himerice este necesar pentru a obine un semnal suficient pentru detecie [Milligan, Rees, 1999]. 1.2.1.1 Tehnologia FLIPR pentru detecia eliberrii Ca2+ intracelular Sistemul FLIPR permite citiri repetate pentru sistemele de analiz de mare capacitate n reaciile celulare. Pe scurt, celulele sunt ncrcate cu un indicator fluorescent (ex. Fluo-4 AM pentru Ca2+) care arat un spectru de absorbie compatibil cu o excitaie la 488 nm de la o surs laser argon mergnd pn la o emisie maxim la 516 nm n prezena Ca2+. Emisia fluorescent este indus simultan n toate situsurile unei plci cu 96 sau 384 de situsuri, iar cinetica eliberrii Ca2+ intracelular, declanat de expunerea la un ligand specific, poate fi monitorizat la o rat de maxim 60 de ori pe minut. Sistemul FLIPR distinge rapid agonitii complei, agonitii pariali i antagonitii pentru a accelera screening-ul primar i secundar. Figura 1.3(a) ilustreaz un experiment tipic efectuat pe o linie de celular de mamifer transfectat cu un vector ce conine gena GPCR. Componentele pozitive reprezentate n figura 1.3(b) au fost verificate prin msurtori n duplicat, iar modulatorii cu molecul mic au fost ulterior testai pentru relaia doz-rspuns prin experimente EC50/IC50.

18

Antagonist

Fig 1.3. Determinarea Ca2+ intracelular prin sistemul FLIPR. Fig 1.3.(a) Curb a cineticii Ca2+ tipice, precum i parametrii utilizai pentru calcularea semnalului fluorescent maxim. n acest exemplu maximele au fost msurate nainte i dup adiia ligandului (Max 1 si Max 2) i au fost standardizate prin diviziune la minima masurat nainte de adugarea compusului (Min). Media controalelor pozitive a fost stabilit control 100%, iar media controalelor negative a fost stabilit control 0%. Pentru fiecare godeu, au fost calculate activitile relative n funcie de controale. Fig 1.3 (b) Diagram a fluxului pentru un experiment tipic. Celulele modificate genetic care au inta GPCR supraexprimat au fost adugate n plci cu 384 de godeuri peste noapte. Celulele au fost splate cu soluie tampon nainte de adaugarea soluiei tampon ce coninea colorantul Fluo-4 AM, urmat de o incubare de 45 de minute. Dup o etap adiional de splare, plcile au fost transferate n aparatul FLIPR i au fost adugai compuii chimici, urmai de adiia ligandului. Emisia fluorescenei a fost monitorizat ncepnd de la un moment anterior adiiei compusului i continuat pn cnd s-a observat o descompunere substanial a semnalului. n graficele mrite sunt prezentate exemple de agonist i antagonist. 19

1.2.1.2. Tehnica reaciilor competitive n detecia AMPc intracelular Cele mai multe experimente utilizate pentru detecia AMPc intracelular sunt bazate pe anticorpi monoclonali care recunosc specific AMPc. Clasic, lizatele celulare sunt amestecate cu AMPc biotinilat exogen pentru a forma un heterotrimer cu un anticorp specific i streptavidina. Formarea acestui complex este n competiie cu AMPc endogen nebiotinilat. Streptavidina i anticorpii se pot lega covalent la un fluorofor donor i acceptor (criptat de europiu i aloficocianina), formnd o pereche FRET interactiv dup formarea complexului. Un semnal sczut este observat atunci cnd este crescut producia de AMPc intracelular, datorit competiiei pentru legarea la anticorpul specific. Tehnologia AlphaScreenTM (PerkinElmer Life Sciences) este o tehnologie alternativ care permite detecia cantitativ a unei game variate de componente celulare, inclusiv AMPc. AlphaScreen are la baz utilizarea unor particule donor i acceptor care sunt acoperite cu un strat de hidrogel care ofer grupri funcionale pentru bioconjugare. Cnd particulele sunt aduse una lng alta, este iniiat o cascad de reacii chimice pentru a produce un semnal nalt amplificat. nainte de excitarea laser, un fotosensibilizator din particula donoare convertete oxigenul ambiental la starea excitat de singlet. Moleculele de oxigen n starea de singlet difuzeaz pentru a reaciona cu chemiluminiscentul de la nivelul particulei acceptoare, ceea ce activeaz fluoroforii coninui n aceeai particul. AlphaScreen a fost utilizat n testele funcionale ale GPCR pentru detecia produciei endogene de AMPc. n toate sistemele menionate mai sus, celulele sunt supuse lizei nainte de realizarea msurtorilor, adugnd nu numai un pas suplimentar procedurii, dar, mai important, fcnd imposibile msurtorile cinetice deoarece datele pot fi obinute numai la final. n plus, au fost dezvoltate metode FRET care au la baz studiul celulei ca ntreg pentru studiul dinamicii temporale i spaiale a nucleotidelor ciclice (vezi 1.4.4).

20

1.2.1.3. Tehnologia Complementrii Fragmentelor Enzimatice (EFC) EFC are la baz organisme modificate genetic ce conin dou fragmente legate de o reacie enzimatic, de exemplu acceptorul enzimei (EA) i donorul enzimei (ED). Fragmentele separate sunt inactive i numai formarea spontan de heterodimeri duce la forma enzimatic activ [Zabin, 1982]. Tehnologia HitHunterTM (DiscoveRx) este bazat pe o variant modificat a enzimei -galactozidaza care formeaz perechea EA/ED. Aceast tehnologie a fost adaptat pentru utilizarea n multe reacii n care sunt implicate: kinaza, receptorul progesteronic, receptorul estrogenic i AMPc. n acest capitol vom discuta numai despre aplicaia specific pentru detecia intracelular a AMPc. Pe scurt, este utilizat un conjugat peptidic ED-AMPc din care AMPc este recunoscut de un anticorp specific. n absena anticorpului specific, fragmentul ED este capabil s complementeze EA pentru a forma un complex activ. n aceast reacie, anticorpul AMPc este titrat pentru inhibiia complet a formrii enzimei. Expunerea lizatului celular la o anumit cantitate de anticorp permite formarea complexului anticorp-AMPc, reducnd astfel cantitatea liber de anticorp. Ca urmare, adugarea de conjugat ED n urmatoarea etap a reaciei va conduce la scderea formrii complexului anticorp-ED, promovnd astfel complementarea enzimei active. ED-conjugat liber din reacie este proporional cu concentraia AMPc intracelular, acelai principiu putnd fi aplicat pentru msurarea activitii galactozidazei. 1.2.2. Proteine de transport membranar O mare varietate de substane sunt transportate n interiorul organismelor complexe, n unele cazuri prin intermediul transportului pasiv, prin difuziune facilitat datorat gradientului de concentraie sczut, sau prin intermediul cilor paracelulare sau transcelulare. Absorbia i distribuia multor constitueni alimentari precum ionii, monozaharidele, aminoacizii i nucleotidele sunt mediate/facilitate de proteine specifice de transport membranar, care formeaz canale prin membranele celulare. Mecanisme similare sunt necesare pentru ndeprtarea activ a xenobioticelor, produilor de metabolism din esuturi. Aceste proteine specifice de
21

transport carrier sunt divizate n dou clase, transportori uniport (sisteme uniport), respectiv transportori cuplai (sisteme de transport cuplat), primii transportnd un singur tip de molecul de pe o fa pe alta a membranei, iar transportorii cuplai transfer o molecul n funcie de transportul simultan sau secvenial al celei de-a doua [Ardelean, Tripa, 2001]. Sistemele de transport cuplat sunt la rndul lor divizate n transportori simport, care transport simultan moleculele n aceeai direcie i transportori antiport, care transport moleculele n direcii opuse. Unii transportori specifici acioneaz ntr-o manier pasiv, transfernd moleculele n funcie de gradientul de concentraie; acesta este cazul multor nutrieni precum glucoza, gsit n concentraii mari n spaiul extracelular. O situaie similar este reprezentat de canalele ionice cu poart comandat de ligand sau de voltaj din sistemul nervos, care elibereaz ionii dup stimularea de ctre neurotransmitori, respectiv depolarizarea membranar. n schimb, transportorii activi sunt dependeni de hidroliza ATP-ului i ei transfer moleculele mpotriva gradientului de concentraie. Cel mai bine cunoscut i variat grup de proteine de transport activ l constituie super-familia de transportori ABC (caset legat la ATP) [Dean i colab., 2001]. Au fost descrise peste 50 de transportori ABC, substraturile transportate fiind foarte variate: aminoacizi, monozaharide, ioni anorganici, polizaharide, peptide i chiar proteine mari. Unul dintre cei mai studiai transportori ABC, proteina de rezisten la mai multe medicamente - MDR1 (multi-drug resistance) [Brinkmann, Eichelbaum, 2001], a fost n centrul ateniei multor eforturi de descoperire a medicamentelor n ultimii ani deoarece supraexpresia acestei proteine n celulele canceroase umane poate determina rezistena simultan a acestor celule la o varietate de chimioterapice din clase diferite. Alte procese importante n care se implic transportorii ABC includ rezistena la clorochin n malarie, prezentarea peptidelor antigenice celulelor imune n maladia genetic fibroza chistic [Hwang i colab., 2001].

22

1.2.2.1. Canalele ionice Majoritatea celulelor menin un potenial electric de o parte i de alta a membranei,care este cel mai bine studiat la nivelul neuronilor i celulelor musculare al cror potenial atinge o valoare nalt de aproximativ -70mV. Potenialul membranar este meninut de pompa de sodiu i potasiu (Na+, K+ - ATPaza) care funcioneaz ca o pomp antiport de transport activ ce scoate din celula 3 ioni de Na+ i introduce 2 ioni de K+ pentru fiecare molecula de ATP hidrolizat, crend astfel o ncrctur negativ n interiorul celulei [Ardelean, Tripa, 2001]. Proteinele canal formeaz pori hidrofili care traverseaz bistratul lipidic, permind anumitor ioni s treac de pe o parte pe cealalt a membranei datorit gradientului de concentraie. O caracteristic a canalelor ionice este prezena unui mecanism cu poart care controleaz micarea ionilor. n acest capitol vom insista asupra canalelor ionice exprimate n neuroni i celulele musculare, care au astfel un rol important n semnalizarea neuronal i contracia muscular. Schimbrile potenialului membranar pot fi induse ntr-o manier limitat spaial, prin intermediul canalelor de Na+ cu poart comandate de ligand n acest caz neurotransmitorul. Deschiderea ulterioar a canalelor de Na+ comandate de voltaj induce autopropagarea depolarizrii de-a lungul membranei celulare (potenialul de aciune), inducnd n final deschiderea canalelor de Ca2+ cu poart comandate de voltaj de la nivelul sinapsei. Influxul de Ca2+ induce eliberarea neurotransmitorilor n fanta sinaptic, propagnd semnalul n celula post-sinaptic. Funcionarea deficitar a canalelor ionice st la baza multor afeciuni incluznd afeciuni musculare i cardiace, epilepsia, migrena, depresia i ataxia. Deschiderea canalelor ionice este n cele mai multe cazuri monitorizat prin msurarea modificrilor potenialului membranar. Standardul de aur utilizat n acest scop este tehnologia patch clamp, care ofer o sensibilitate foarte nalt, rezoluie temporal bun, precum i msurarea conductanei unui singur canal la un voltaj precis. Aceast tehnologie ofer cele mai bune informaii pentru evaluarea funcional a canalelor ionice; dezavantajele majore ale acestei tehnici includ participarea operatorilor experimentai, experimente laborioase i rezultate puine. n
23

prezent, diferite companii sunt implicate n dezvoltarea noilor echipamente pentru automatizarea procedurilor patch-clamp. Unul dintre cele mai avansate echipamente este staia IonWorksTM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) care utilizeaz tehnicile de fluidic integrat pentru poziionarea automat a unei singure celule n godeurile unui suport special. nregistrri ale unui singur canal ionic au fost obinute la o rat de pn la 2000 de reacii pe zi. Rezultate mai bune sunt obinute prin utilizarea coloranilor solvatocromatici pentru care celulele sunt permeabile, precum DiBAC (Molecular Probes, Eugene, OR) sau prin utilizarea colorantului recent descoperit FMP (Molecular Devices). Asocierea cu sistemul FLIPR permite monitorizarea funciei canalelor ionice prin sisteme de analiz de mare capacitate, depind numrul de 30000 de compui analizai pe zi. Detalii cu privire la alte tehnologii de analiz a canalelor ionice au fost descrise de Xu i colab., ( 2001). Tehnologia FLIPR i analiza canalelor ionice. Pentru identificarea compuilor care moduleaz activitatea canalelor ionice este imperativ disponibilitatea evalurilor rapide i economice ale activitilor biologice prin analize de mare capacitate. Una din metodele bazate pe fluorescen care testeaz modificrile potenialului membranar utilizeaz o sond fluorescent poteniometrica acid bis-(1,3-dibutilbarbituric) trimetin oxonol [DiBAC4(3)], care separ compartimentele intracelulare i extracelulare n funcie de potenialul electric de o parte i de alta a membranei. n urma depolarizrii celulei, colorantul ptrunde n celul, iar legarea la situsurile hidrofobe intracelulare se traduce ntr-o cretere a intensitii semnalului fluorescent. Invers, hiperpolarizarea membranei declaneaz eliminarea colorantului din celul i scderea fluorescenei deoarece cuantumul produciei DiBAC4(3) este sczut n mediu apos. Deoarece separarea DiBAC4(3) este un proces lent, aceasta tehnologie nu este aplicabil pentru evaluarea canalelor cu o cinetic rapid la nivelul porii sau cu desensibilizare rapid. mbuntiri substaniale au fost obtinue odat cu descoperirea colorantului FMP [Baxter i colab., 2002] care are o cinetic de separare mai rapid. Figura 1.4 prezint un experiment tipic condus cu miotuburi difereniate (linia celular C2C12).
24

Fig 1.4 Activitatea canalelor ionice n miotuburi difereniate. Linia celular de celule musculare murine C2C12 a fost utilizat pentru validarea colorantului FMP. Celulele C2C12 au fost adugate n plci i difereniate n miotuburi prin expunerea la ser de cal. Celulele C2C12 difereniate exprim nAchR, iar depolarizarea celulelor poate fi indus cu un agonist specific pentru receptor, precum carbacol. Exemple de agonist i antagonist sunt reprezentate n graficele mrite.

Biblioteca LOPAC (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) a compuilor farmacologici activi a fost supus screening-ului pentru identificarea compuilor care exercit efecte agoniste sau antagoniste asupra receptorului nicotinic al acetilcolinei (nAChR). Pe scurt, celulele au fost splate cu o soluie tampon i ncrcate cu colorant FMP timp de 30 de minute la temperatura camerei. 644 de compui din libraria LOPAC au fost adaugai n FLIPR, urmai de stimularea cu carbacol.
25

n contrast cu semnalizarea tipic prin intermediul Ca2+, depolarizarea membranar nu prezint o cinetic tranzitorie. Evaluarea datelor i identificarea modulatorilor poate fi efectuat dup modelul descris n figura 1.3. Identificarea agonitilor i antagonitilor este posibil ntr-un singur experiment. Compuii pozitivi au fost supui determinrii EC50/IC50 i, n cazul agonitilor, antagonistul specific al AChR - pancuronium a fost utilizat pentru a evidenia reversul semnalului carbacol (vezi Fig. 1.4). Iniial, 21 de compui au fost identificai ca agoniti, iar 12 compui au avut specificitate pentru AChR. Tehnologia VIPRTM (Voltage Ion Probe Reader) i analiza canalelor ionice Tehnologia VIPR (electrod folosit la msurtori de potenial ntre mediul intern i extern al unei celule) (Aurora Bioscience, San Diego, CA) este bazat pe FRET i utilizeaz dou molecule fluorescente. Prima molecul, oxonol este un ion hidrofob, nalt fluorescent, ncrcat negativ, care poate fi rapid redistribuit ntre dou situsuri de legatur pe cele dou fee ale membranei plasmatice ca rspuns la modificrile potenialului membranar. Cea de-a doua molecul fluorescent, lipidul coumarina se leag specific pe o fa a membranei plasmatice i funcioneaz c un donor FRET pentru molecula acceptoare de oxonol sensibil la voltaj. Cnd molecula de oxonol ajunge la nivelul situsului intracelular al membranei plasmatice n urma depolarizrii, FRET este sczut, ceea ce se traduce n creterea fluorescenei donorului i descreterea emisiei oxonolului. Aceast tehnologie permite dezvoltatea cercetrilor n domeniul biologiei canalelor ionice. Tehnologia VIPR poate furniza cadre de citire subsecvene real-time n urma reaciilor efectuate n microplci. 1.2.2.2. Proteinele MDR MDR (proteina rezistent la medicamente) este n principal legat de supraexpresia proteinelor superfamiliei de transportori ABC. Cel mai studiat membru al acestei superfamilii este produsul genei MDR1 (glicoproteina P) care este exprimat n intestin, rinichi, ficat, bariera hemato-encefalic i n multe celule tumorale. n ultimul caz, supraexpresia genei MDR1 este unul din factorii principali ai rezistenei celulelor la chimioterapia cancerului. Aceast rezisten este rezultatul
26

pomprii medicamentelor anticanceroase n exteriorul celulelor, rezultnd scderea nivelelor intracelulare ale acestora. Moleculele mici, capabile s reversibilizeze efluxul pot restaura sensibilitatea la medicamente a celulelor tumorale rezistente. Cele mai utilizate metode pentru identificarea inhibitorilor pompei MDR sunt bazate pe substraturile fluorescente ale glicoproteinei P, precum Hoechst 33342, rodamina 123 i rodamina 6G. Celulele sunt ncrcate cu substratul, iar colorantul extracelular este ndeprtat prin splarea cu detergeni anterior lizei [Sarver i colab., 2002]. Msurtorile emisiei fluorescenei ofer rezultate cantitative, proporionale cu acumularea intracelular a substratului. Expunerea celulelor la inhibitorii pompei MDR va reduce efluxul substratului i deci va determina nregistrarea unui semnal fluorescent crescut. Aceste reacii nu sunt omogene i implic etape de splare dup ncrcarea celulelor cu colorantul corespunzator. Un nou substrat pentru pompa MDR a fost dezvoltat recent pentru realizarea unor reacii omogene ntr-un sistem FLIPR. Tehnica FLIPR pentru Multirezistena la Medicamente (FLIPR Multidrug Resistance Assay) (Molecular Devices) este o aplicaie omogen care necesit numai 15 minute de incubare la temperatura camerei cu un colorant proprietar, care este transportat de ctre produsul genei MDR1 i el i modific proprietile fluorescente numai n urma aciunii enzimelor intracelulare asupra sa. Aceasta permite performana reaciilor cinetice asupra celulelor vii pentru screening-ul inhibitorilor pompei MDR. Eliminarea etapelor de splare i controlul temperaturii a determinat automatizarea reaciei [Sarver i colab., 2002].

1.3. Evaluarea expresiei genelor i proteinelor n cadrul unor sisteme de analiz de mare capacitate
Profilul expresiei genelor i proteinelor poate fi aplicat n descoperirea medicamentelor cu cel puin dou scopuri diferite. Prima aplicaie este pentru descoperirea noilor medicamente poteniale. n acest caz, inta de interes o constituie fie o component a sistemului de expresie, fie monitorizarea expresiei ca indicator pentru inta din amonte ce reflect rspunsul celular cuplat [Broach, Thorner, 1996].
27

Pentru a face un screening de mare capacitate (HTS) posibil, secvenele promotoare de interes, care sunt cuplate cu evenimentele celulare din amonte, sunt legate la aa-numitele gene reporter, care servesc ca indicatori pentru activarea transcripiei i translaiei. Cea de-a doua aplicaie este utilizarea profilului expresiei pentru a obine informaii asupra specificitii la nivel celular a unui medicament candidat sau pentru identificarea unor markeri surogat pentru aciunea medicamentelor. n acest caz, ar trebui investigat expresia genic sau proteic a ct mai multor gene sau proteine ca rspuns la un potenial medicament candidat. Modelele de expresie pot fi utilizate ca un indicator pentru numrul interaciunilor dintr-o celul. Asemenea date pot fi relevante pentru nelegerea impactului modulrii unei singure inte terapeutice asupra ntregului sistem celular. Chip-uri de expresie genic au fost introduse recent pentru msurarea simultan a sute de gene exprimate la nivelul ARNm [Epstein, Butow, 2000]. Utilitatea acestei abordri, a fost recent validat la drojdii; n acest caz profilurile expresiilor au identificat ci ale unor mutaii necaracterizate anterior sau au identificat noi poteniale inte terapeutice. Similar, au fost introduse chip-uri pentru caracterizarea expresiei proteice pentru a captura o fraciune particular a proteinelor i a permite analiza cu o cantitate rezonabil de prob [Weinberger i colab, 2002]. n plus, tehnicile de proteomic au fost introduse de Celis i colab., (2000). Analiza a mii de probe devine o condiie obligatorie dac profilurile de expresie sunt utilizate n identificarea unui modulator. Selecia modulatorilor cu molecule mici i optimizarea modulrii vor necesita analize de mare capacitate care s fie la nivelul a sute sau mii de componente. Ambele pot fi obinute prin focalizarea asupra unor gene indicatoare selectate sau a produilor lor, indicatori mai degrab ai intei de interes dect ai profilului complet al expresiei. n seciunea urmtoare ne vom axa pe exemple care pot fi aplicate n descoperirea iniial a medicamentelor. Chip-urile pentru expresia genic [Epstein, Butow, 2000; Weinberger i colab, 2002] i tehnologiile de proteomic sunt subiectul multor recenzii recente.
28

1.3.1. Analiza genelor reporter pentru identificarea modulrii compuilor biologici activi Factorii de transcripie pot fi clasificai att n funcie de natura structural, ct i n funcie de modul n care rspund pentru modularea transduciei semnalului. O astfel de clasificare, esenial pentru tehnologiile ce implic genele reporter, aparine lui Brivanlou i Darnell (2002). Conform acestei clasificri, factorii de transcripie pot fi grupai n dou mari clase aceia care sunt activai constituional i cei a cror activitate este reglat ntr-o manier spaio-temporal, cantitativ i calitativ. Din clasa factorilor de transcripie reglai face parte clasa factorilor de transcripie dependeni de semnal, care sunt activai n urma unui semnal intracelular sau extracelular. Genele reglate prin intermediul acestor factori de transcripie dependeni de semnal sunt atractive ca gene reporter deoarece cupleaz cile de semnalizare cu rspunsul transcripional. Semnalele extracelulare, n urma interaciunii cu moleculele receptoare corespunztoare de pe suprafaa celulei, iniiaz o cascad de evenimente intracelulare care conduc la alterri ale expresiei unui set de gene. Una sau cteva dintre aceste gene pot fi utilizate ca indicatori pentru modularea intelor n cadrul unor ci de semnalizare specifice. Activarea unei anumite gene poate fi uor identificat prin ataarea la gena de interes a unei aa-numite gene reporter. Pentru acest scop, trebuie create plasmide care conin promotorul sau regiunea reglatoare a genei de interes lng gena reporter. Aceste plasmide sunt apoi introduse ntr-o linie celular care exprim calea de interes ce conine intele farmacologice i cupleaz indicatorul reporter cu calea particular de interes. Un numr de gene au fost descrise ca fiind gene reporter [Broach, Thorner, 1996]. Expresia poate fi monitorizat prin intermediul fluorescenei, de exemplu prin utilizarea unei proteine fluorescente verzi (GFP) ca reporter sau prin detecia cu anticorpi marcai fluorescent. Alternativ, este utilizat activitatea enzimatic a reporterului, aa cum se ntmpl n cazul luciferazei care convertete substratul ntr-un produs luminescent, sau reporterul este detectat cu ajutorul fluorescenei, luminescenei sau reaciilor colorate ale produilor secundari.

29

Tehnologia ce implic utilizarea genelor reporter a fost utilizat pe scar larg pentru a realiza HTS pentru o varietate de inte de interes n descoperirea medicamentelor. Pentru multe inte, precum receptorii transmembranari pentru care alte metode de screening erau dificil de realizat, tehnologia genelor reporter a devenit metoda cea mai bun pentru identificarea modulrii compuilor biologici/ farmacocinetici activi (lead finding). Exemplele selectate includ utilizarea reaciilor ce implic genele reporter n identificarea agonitilor i antagonitilor pentru o mare varietate de GPCR [Goetz i colab., 2000] transfectai ntr-o linie de celule ovariene de hamster (CHO) cu un construct al reporterului luciferazei 6xCRE. Aceast linie celular a servit ca un indicator pentru GPCR, precum receptorul pentru melanocortina-1 care n urma stimulrii moduleaz nivelele de AMPc n celul. Aceasta reacie poate fi realizat ntr-o plac cu 384 godeuri, oferind astfel economii substaniale de timp, cost i realizare a culturilor celulare. n aceeai linie celular a fost stabilit un sistem HTS pentru receptorul metabotropic al glutamatului mGluR7. Receptorul mGluR7 este cuplat negativ cu adenilat/adenilil ciclaza i stimularea sa duce la scderea nivelelor de AMPc. Celulele CHO au fost transfectate stabil cu ADNc pentru mGluR7 de la obolan i o gen reporter care rspunde la AMPc. Aplicabilitatea pentru HTS a fost demonstrat ntr-o linie n care nivelele de AMPc induse de forskolina (un activator al adenilat ciclazei) au fost reduse semnificativ de ctre agonitii receptorilor. Xing i colab. (2000) au descris o metod direct pentru investigarea receptorilor cuplai negativ cu adenilat ciclaza. Linia celular CHO transfectat stabil a coninut trei plasmide distincte: (i) o proteina himeric Gq/i care redirecioneaz semnalul Gi negativ ntr-un semnal Gq pozitiv; (ii) un GPCR cuplat cu Gi, n acest caz receptorul -opioid sau receptorul pentru 5-hidroxitriptamina i, (iii) reporterul 3xNFAT -lactamazei. Astfel, activarea GPCR cuplat cu Gi s-a translatat ntr-o activare NFAT prin intermediul cii de semnalizare mediata de Gq, permind monitorizarea expresiei -lactamazei ntr-un format HTS. O mare varietate de linii celulare diferite au fost utilizate pentru a stabili reaciile genelor reporter. Celule din rinichiul embrionar uman (HEK) 293-EBNA crescute n culturi celulare n suspensie au fost utilizate pentru expresia receptorilor
30

prostanoizi cuplai cu un reporter CRE-SEAP (fosfataza alcalin secretat de placenta uman). Celulele ECV304, o linie celular transformat spontan, derivat din celule endoteliale ale venei ombilicale umane, au fost transfectate cu un reporter ICAM-1 pentru screening-ul componenilor care inhib expresia ICAM-1 n urma stimulrii cu interleukina IL-1b. Linia celular provenit din celule de cancer mamar uman MDAMB-453 a fost utilizat ca gazd a transfeciei pentru a stabili reporterii stabili sub controlul promotorului virusului tumorii mamare la oarece (MMTV) pentru a studia agonitii receptorilor androgeni i glucocorticoizi. Celulele MDA-MB exprim att receptorii glucocorticoizi ct i receptorii androgeni, servind astfel ca o celul gazd ideal pentru reporterii construii. Ca un exemplu practic, datele obinute cu ajutorul reaciilor care implic genele reporter n condiiile HTS, sunt prezentate n figura 1.5 i tabelul 1.2. Celulele transfectate stabil cu gena reporter a luciferazei au fost aplicate ntr-o plac cu 384 de godeuri i dozate cu diluii seriate ale unui compus care activeaz promotorul genei reporter. Dup o incubare de 24 de ore, celulele au fost splate, lizate i a fost adugat substratul luciferazei (LucLite2; PerkinElmer Life Sciences). Cantitatea exprimat de proteina luciferaz s-a corelat direct cu cantitatea de substrat metabolizat ntr-un compus luminiscent, care a fost detectat cu ajutorul unui cititor de plci luminometric (TopCount2 NXT; PerkinElmer Life Sciences). Datele prezentate au oferit informaii asupra concentraiei minime a compusului de referin pozitiv necesar ca standard pe fiecare plac pentru HTS a 100000 de compui. Pentru a obine rezultate de calitate pentru fiecare plac individual n timpul HTS, este calculat un criteriu numit factor Z (diferena dintre mediile semnalului de fond i godeurile de control pozitiv) i deviaia standard (SD) a godeurilor de control pentru fiecare plac. Din moment ce factorul Z ia n considerare att intensitatea semnalului, ct i variaia intrinsec, el ofer o msur a stabilitii unei reacii. Screening-ul este considerat posibil dac 0<Z<1; cu toate acestea, n practic, valoarea minim a factorului Z este deseori mai mare. O concentraie de cel puin 3mM a agonistului n controlul pozitiv poate fi necesar pentru a obine o valoare a Z>0.5. Astfel, n acest experiment concentraia controlului pozitiv a fost de 10mM.
31

Tabelul 1.2 Activarea genei reporter a luciferazei i performana reaciei Concentraia (M) 0 0,1 0,3 1 3 10 30 Media a 8 godeuri 6364 6347 9028 12006 20436 31292 38343 SD 641 314 458 509 1476 1181 2027 Factorul Z n.d. -0,238 0,389 0,549 0,781 0,750

Fig 1.5 Inducia dependent de doz a genei reporter a luciferazei de ctre o substan inductoare utilizat ca i control agonist n HTS. Fiecare valoare reprezint media a 8 determinri separate, barele de eroare indic 1 SD. Media determinrilor luminometrice msurate cu TopCount NXT (PerkinElmer Life Science) este reprezentat mpotriva concentraiei substanei inductoare (mM). Valorile obinute n absena compusului se refer la expresia bazal a genei reporter a luciferazei i constituie fundamentul reaciei.

Analizele genelor reporter pot fi nalt informative dac produsul genei de interes i calea de inducie sunt bine caracterizate. Este necesar s se in cont de faptul c o gen reporter poate fi modulat de orice tip de stimul care infueneaz oricare dintre etapele cascadei de transducie a semnalului cuplat. Astfel, efectele expresiei asupra genelor reporter observate ca rspuns la compuii testai trebuie ntotdeauna estimai prin reacii care se adreseaz unor etape specifice ale cii, pentru a exclude mecanisme asociate indirect cu inta de interes.

32

Dei n general expresia genelor reporter nu influeneaz homeostazia celulei, un anumit component artificial este introdus n sistem. n primul rnd, este necesar sa se stabileasc n ce msur calea de transducie a semnalului ce conduce la activarea unui anumit promotor este prezent i funcional activ n celulele de interes. Introducerea unei gene reporter n celule poate s perturbe caracteristicile transcripionale normale, datorit eliminrii unor factori transcripionali sau prin efectele de poziie datorate integrrii plasmidului n timpul generrii clonelor celulare stabilizate. De aceea, trebuie s existe grij n alegerea promotorului i a liniei celulare n care se realizeaz analiza genei reporter. Limitrile pot s apar n legatur cu liniile celulare utilizate, metodele de transfecie i eficiena expresiei genei reporter. Nu n ultimul rnd, dei generarea liniilor celulare bine caracterizate din punct de vedere al genelor reporter este consumatoare de timp, ele constituie un sistem foarte eficient pentru programele HTS. 1.3.2. Teste de detecie genic pentru optimizarea modulrii compuilor activi farmacocinetici Utilizarea array-urilor de expresie genic pentru monitorizarea simultan a expresiei a sute sau mii de gene a fost menionat anterior. Array-urile de expresie sunt metode utile nu numai pentru caracterizarea fenotipurilor de expresie ale celulelor i esuturilor n vederea clasificrii, dar ele permit i monitorizarea impactului mutaiilor sau medicamentelor asupra fenotipului celular. Array-urile sunt utilizate pe scar larg n studiile toxico- i farmacogenomice. n plus, datele obinute au fost utilizate pentru crearea unor modele predictive n scop diagnostic. Utilizarea array-urilor de expresie necesit producerea unor probe adecvate pentru hibridizare, care pot fi foarte dificil de obinut. Mai mult, analiza seturilor de date obinute necesit soft-uri sofisticate, precum i cunotine cu privire la semnificaia i relevana multiplicitii de rspunsuri observate. n unele cazuri, numai o fracie particular a genelor msurate ofer informaii referitoare la inta cercetat. Thomas i colab. (2001) au analizat expresia a 1200 de transcripturi din ficat utiliznd array ADNc, dup administrarea la oareci a 24 de tratamente diferite
33

divizate n cinci categorii. Un set de 12 transcripturi a fost identificat i considerat de importan diagnostic pentru clasificarea tratamentului n clase de toxicitate. Interesant, adugarea altor transcripturi a condus la un declin al acurateei predictive a individualitaii unui profil terapeutic specific. ntr-un studiu similar, Bartosiewicz i colab. (2001) au utilizat un set de 260 de gene implicate n faza I i II a metabolismului medicamentelor pentru a testa efectele a 10 substane toxice asupra profilurilor de expresie n diferite esuturi la momente diferite ale expunerii oarecilor. Diferite grupuri de clase chimice pot fi corelate cu profiluri de expresie diferite ale unui numr relativ sczut de transcripturi. Studii similare ale profilurilor expresiei evaluate pe celulele HepG2 i pe ficat de obolan tratat au aratat c numai cu un set de gene nalt selectate pot fi identificate clase diferite de substane chimice prin intermediul modulrii expresiei setului de gene selectate. n zilele noastre, cea mai bun metod pentru evaluarea profilului expresiei genice in vivo const n utilizarea oligonucleotidelor sau microarray-urilor ADNc sau a chip-urilor de gene. Cu toate acestea, datorit costurilor crescute i a efortului depus pentru prepararea probelor (care n general exclude o metoda de nalt capacitate) studiile au fost efectuate n special n faza tardiv a procesului de descoperire a medicamentelor. De aceea, una sau mai multe componente sunt analizate pentru modelele de expresie ale multor gene. Pentru a reduce uzura n faza tardiv a medicamentelor potenial candidate datorit efectelor adverse neobservate, sunt necesare sistemele de profil al expresiei justificabile pentru HTS. A fost descris o abordare care utilizeaz analiza genelor reporter. Albano i colab. (2001) au selecionat un set de promotori care rspund la stres din genele Escherichia coli pentru a genera construcii ale genei reporter GFP ca o unealt pentru screening-ul mecanicistic al medicamentelor antitumorale ntr-o plac cu 96 de godeuri. Zhu i Fahl (2000) au generat clone celulare stabile HepG2 care exprima GFP sub controlul elementului de rspuns electrofil (EpRE), care permite HTS pentru inducia enzimelor fazei a II-a a metabolismului medicamentelor. Un alt avantaj al construciilor genelor reporter GFP este faptul c expresia poate fi detectat n celule vii, permind monitorizarea facil n dinamic, precum i reversibilitatea induciei.
34

Utilizarea genelor reporter din liniile celulare pentru profilurile expresiei a fost mai profund documentat de Farr i Todd (1998), care au stabilit un model de linii celulare ce conin gena reporter pentru N-acetiltransferaza cloramfenicolului (CAT) sub controlul promotorilor indicatori pentru rspunsurile la stresurile celulare. Inducia unor construcii de reporteri de ctre compuii chimici poate oferi indicaii cu privire la aciunea compuilor la nivel subcelular. Astfel, construciile promotorgen reporter exprimate n linii celulare bine caracterizate pot oferi sisteme utile pentru profilul compuilor innd seama de activarea cilor de transducie a semnalului recunoscut care se asociaz cu anumite fenotipuri. Sistemul de analiz va detecta compui care moduleaz direct expresia genei reporter i pe aceia care interfer cu expresia provocat prin stimuli externi cum ar fi factorii de cretere i citokinele. Cnd un tablou de analize ale genelor reporter este utilizat pentru profilul compuilor, modele de expresie similar pot demonstra mecanisme comparabile de aciune ale compuilor testai n celule intacte. Modificri ale modelelor expresiilor ca rspuns la ci de semnalizare specifice i n linii celulare diferite pot aduce informaii cu privire la specificitatea compuilor testai. Aceste sisteme pot fi uor adaptate pentru HTS i pentru analiza n dinamic i a dependenei de doz a induciei. n consecin, crearea profilului modulatorilor identificai sau a seturilor de compui rezultai din optimizarea modulrii compuilor activi farmacocinetici poate permite organizarea compuilor n grupe cu rspunsuri farmacologice similare. De exemplu, activarea genelor reporter cuplate la elementul p53-responsiv (p53RE) va arta c acel compus testat conduce la lezri ale ADN; activarea reporterilor sub controlul elementului de rspuns la xenobiotice (XRE) va conduce la inducia transcripionala a enzimelor ce catalizeaz metabolismul medicamentelor, precum citocromul P450 i altele. Astfel, realizarea profilului genelor reporter in vitro cu un set de gene bine definite i validate poate contribui nu numai la clasificarea compuilor, dar i la identificarea unor posibile efecte adverse ale compuilor testai. Recent, cu ajutorul unor tehnici mai sensibile de monitorizare a expresiei genice, a fost raportat un nou set de analize. n timp ce analizele genelor reporter au fost coroborate cu ideea vizualizrii unui eveniment particular al expresiei genice prin
35

cuplarea cu o protein care poate fi monitorizat cu uurin, tehnicile noi monitorizeaz direct expresia genic prin cuantificarea nivelelor de ARNm pentru pn la cteva mii de gene simultan. Mai mult, aceste tehnici nu necesit introducerea anterioar a unui sistem de detecie ceea ce permite alegerea n funcie de tipul de celul sau esut derivate din organe. Tabelul 1.3 ofer o privire de ansamblu asupra unor tehnici dezvoltate pentru aplicaiile HTS care sunt disponibile n momentul actual.
Tabelul 1.3 . Tehnici pentru identificarea expresiei genelor Tehnologia SAGE Metodologia transcriptul capturat prin amprenta SAGE, identificarea i cuantificarea prin secvenierea concatemerelor seriate GeneCalling amprentarea prin endonucleaze de (profilarea restricie a ADNc, confirmare prin PCR transcriptului) competitiv TOGA PCR bazat pe ADNc, identificarea ARNm cu capt 3poli(A) prin secveniere Microarray/ hibridizarea ARN total la sonde ale oligoarray ADN genelor aranjate pe chip-uri de silicon sau lame de sticl RT-PCR Cantitativ eliberarea mediat prin PCR a unor sonde (TaqmanTM) fluorogenice specifice genelor; limita de detecie este invers proporional cu concentraia ADN ramificat detecia direct a ARNm prin hibridizarea (branched DNA) cu un linker specific genei i amplificarea (QuantigeneTM) sondei TM HPSA detecia direct a ARNm prin hibridizarea cu captur specific genei i amplificarea sondei Gene int HTcompatibil 96 de reacii 256 de reacii HTcompatibil puine sonde Probe puine puine puine puine format cu 96 de godeuri format 96 godeuri format 96 godeuri cu de cu de

1 sond 2 sonde

n funcie de aplicabilitatea pentru HTS a acestor noi tehnologii, pot fi difereniate dou mari clase. Dintre metode menionm analiza seriat a expresiei genice (SAGE), GeneCalling (realizarea profilului expresiei prin amprentarea cu endonucleaze de restricie) i analiza expresiei genice totale (TOGA), unde prepararea probei iniiale este foarte dificil, dar detecia poate fi realizat n paralel pentru mai multe gene diferite. Aceste tehnici sunt denumite colectiv sisteme deschise deoarece nu este necesar nicio informaie despre secven i virtual toate
36

genele induse de un compus particular pot fi detectate. Sistemele deschise pun sub semnul ntrebrii tehnologia ADN microarray, oferind o alternativ la costurile nalte i la necesarul nalt al materialului iniial asociate cu aceste tehnici. n practic, ele se vor dovedi utile dac trebuie analizate doar cteva probe pentru detecia produilor mai multor gene diferite. Reacia de polimerizare n lan cantitativ (RT-PCR), tehnologia ADN ramificat (branched DNA) promovat de Bayer (Emeryville, CA) i amplificarea de nalt performan a semnalului (high-performance signal amplification - HPSATM) promovat de Chromagen (San Diego, CA) pot detecta moleculele de ARNm. Acestea sunt denumite sisteme nchise deoarece pot fi aplicate numai genelor cu secven cunoscut. Totui, aceste metode pot fi utilizate pentru HTS deoarece reaciile pot fi realizate n plci, permind procesarea simultan a mai multor probe. Mai mult, au avantajul de a fi mai flexibile i pot fi realizate pe orice surs i detecia noilor gene necesit doar design-ul i sinteza unor sonde specifice genelor. Aceste noi tehnologii promit o cretere a sensibilitii, cu rezultate necompromise de efectele secundare datorate genelor reporter, dar nc nu sunt att de larg utilizate ca sistemele genelor reporter.

1.4.Reaciile celulare spaio-temporale i analizele subpopulaiilor

Reaciile celulare care se adreseaz nivelelor expresiei proteinelor, distribuiei spaiale i temporale ale proteinelor n interiorul celulei i dinamicii semnalizrii intracelulare sunt utilizate curent pentru o mai bun nelegere a funciilor intelor farmaeutice n celule. Exista un numr n cretere de reactivi pentru marcare i de sonde fluorescente, incluznd anticorpii specifici intei, enzimele complementare, coloranii (Alexa Fluor dye series; Molecular Probes), reactivii de afinitate i proteinele fluorescente codificate genetic. Sistemele care permit analize de mare capacitate ale celulelor includ tehnici bazate pe citometria n flux, precum sistemul farmacologic de mare capacitate recent descris [Edwards i colab., 2001]. Acest sistem permite caracterizarea multifactorial

37

a celulelor, dar nu permite cuantificarea rearanjamentelor spaiale din interiorul celulei. Tehnologiile de imagistic microscopic recent dezvoltate au aplicaii variate. Ele permit analiza unor funcii celulare variate incluznd motilitatea celular, morfologia celular, motilitatea proteinelor n interiorul celulelor, localizarea proteinelor, mesagerii secunzi intracelulari i msurtorile captului cascadelor de semnalizare. Dezvoltarea unui sistem de imagistic automat a fcut posibil screeningul compuilor ntr-un format bogat n informaii. Avantajul major al imagisticii automate i al tehnicilor de scanare l constituie creterea considerabil a sistemelor de analiz de mare capacitate cuantificate simultan. Sistemul ArrayScan II a fost introdus n 1999 de ctre Cellomics [Brunet i colab. 1999] i a fost unul dintre primele instrumente de imagistic automate pentru screeningul bogat n informaii de pe pia. Pentru moment, alte instrumente, software-uri i hardware-uri au fost dezvoltate de cteva companii incluznd Acumen-Biosciences (www.acusite.co.uk), Amersham Bioscience (www.amersham. com), Applied Biosystems (www.appliedbiosystems.com), Q3DM (www.q3dm.com), CompuCyte (www.compucyte.com), Kinetics Imaging (www.kinetikimaging.com), Universal Imaging (www.imagel.com), Axon Instruments (www.axon.com) i Evotec OAI (www.evotecoai.com). Progresul rapid n dezvoltarea sistemelor analitice pentru analizele subcelulare n combinaie cu reactivii de marcare pentru identificarea specific a moleculelor de interes va permite analiza semnalizrii specifice i a etapelor metabolice prin sisteme de analiz de mare capacitate. 1.4.1. Anticorpii specifici etapei de fosforilare De un interes deosebit pentru imagistica automat sunt reactivii dependeni de o activitate, precum anticorpii fosfospecifici care permit analiza selectiv a cilor de semnalizare din celule. Fosforilarea i defosforilarea proteinelor de ctre fosfataze i
38

comparativ cu microscopia manual. n cazul

microscopiei cu fluorescen, multiple sonde fluorescente pot fi detectate i

kinaze sunt procese componente ale reelei complexe de semnalizare a proceselor dinamice fin reglate. Fosforilarea proteinelor se traduce frecvent n redistribuia subcelular a moleculelor semnalizatoare cheie, care este important pentru activitatea lor biologic. Distribuia spaial a dou proteine cheie n semnalizare n urma fosforilarii, kinaza extracelular reglat de semnal (Erk) i MAP kinaza p38, a fost analizat cu anticorpi fosfotirozin-specifici care recunosc numai forma fosforilat a proteinei [Vogt i colab., 2001]. Expunerea celulelor la un inhibitor al fosfatazei Cdc25 s-a tradus ntr-o acumulare nuclear dependent de concentraie a fosfo-Erk i fosfo-p38, dar nu i a factorului nuclear B (NF-B). Aceste experimente au aratat c inhibiia Cdc25 a crescut fosforilarea Erk i acumularea sa n nucleu, indicnd c statusul de fosforilare al Erk este reglat de ctre fosfataza Cdc25. Un anticorp fosfo-histonic H3 care intete situsul de fosforilare Ser10 al histonei H3 i anticorpul fosfo-histonic H1 au fost utilizai pentru a detecta fosforilarea mitogen i oncogen-stimulat n regiunile nucleozomale mici care sunt sensibile la hiperacetilare [Chadee i colab., 1999]. Statusurile kinazei active au fost analizate cu un set de anticorpi monoclonali anti-kinazici fosfospecifici. Specificitatea anticorpilor pentru kinaza specific a fost verificat prin analiza Western blot i cu inhibitori specifici pentru kinazele din amonte. Utiliznd citometria n flux multiparametric, Perez i Nolan (2002) au putut identifica subseturi de limfocite cu ajutorul a patru kinaze intracelulare active. Aceast tehnic permite pentru prima data investigarea simultan a diferitelor kinaze active ntr-o singur celul. n timp ce aceast tehnologie poate fi cel mai bine aplicat celulelor n suspensie, microscopia de nalt capacitate este tehnica cea mai adecvat pentru celulele aderente. n plus, aplicaiile microscopiei permit analiza distribuiei spaiale intracelulare care nu este posibil prin citometria n flux. Celulele n mitoz sunt caracterizate prin creterea nucleolinei fosforilate, o protein nuclear fosforilat n celulele care intra n mitoz. Utiliznd un anticorp monoclonal care recunoate specific nucleolina fosforilat, Mayer i colab. (1999) au dezvoltat o analiza de mare capacitate whole-cell immunoblot.

39

Componentele care opresc celulele n mitoz prin noile metode de aciune au putut fi identificate dup sortarea componentelor cu o a doua reacie. Alte modificri ale proteinelor precum acetilarea pot fi de asemenea detectate cu anticorpi specifici. Organizarea cromatinei active transcripional i activitatea acetiltransferazei i deacetilazei histonelor nucleare au fost investigate prin utilizarea unui anticorp specific acetil-histonei H3. Componentele care afecteaz modificrile stimulate de ligand n structura cromatinei pot fi cel mai bine scanate cu aceti anticorpi prin tehnici de imagistic automate. 1.4.2. Anticorpi specifici intelor proteice Multe proteine joac roluri importante att n citoplasm ct i n nucleu. Deci, ele necesit traficul dintr-un compartiment n altul pentru a-i ndeplini funciile. Exemple tipice sunt factorii de transcripie citoplasmatici lateni sau factorii de transport nucleari. Au fost descrise reacii pentru factorii de transport nuclear care utilizeaz formarea heterocarionului n asociere cu proteine fluorescente. Traficul factorilor de transcripie citoplasmatici lateni n urma activrii ctre nucleu poate fi monitorizat i cuantificat prin imagistica fluorescent automat. Translocaia n nucleu a NF-B indus de IL-1 i de factorul de necroz tumoral a fost cuantificat cu ajutorul aplicaiilor tehnnologiei Cellomics ArrayScan II [Ding i colab, 1998]. Celulele nestimulate conin NF-B inactiv distribuit n interiorul citoplasmei care poate fi detectat cu anticorpi specifici pentru NF-B legai la anticorpi secundari marcai fluorescent. n celulele stimulate cu IL-1, cea mai mare parte a NF-B este activat i este transportat n nucleu ntr-o manier dependent de moment i de doz (fig. 1.6 i 1.7). n urma stimulrii de ctre IL-1, celulele HeLa au fost analizate cu ajutorul sistemului ArrayScan II utiliznd un software specific care permite analiza cantitativ a fluorescenei n nucleu i n citoplasma adiacent. Celulele sunt identificate ca obiecte de ctre software prin colorarea nuclear cu Hoechst 33324 sau DAPI i sunt acoperite pentru msuratori ale fluorescenei nucleare i citoplasmatice (fig 1.8)
40

Fig 1.6 Translocaia nuclear a NF-B n dinamic. Celulele HeLa au fost stimulate cu 1 ng/ml de IL-1a la 37oC. Sunt reprezentate valorile medii a 100 de celule msurate n fiecare godeu n dou experimente separate (Exp 1 si Exp 2). Nuc-CytoInten = intensitatea fluorescenei nucleare minus intensitatea fluorescenei citoplasmatice.

Fig 1.7 Relaia doz-rspuns a translocaiei nucleare a NF-B indus de IL-1a. Celulele HeLa au fost stimulate cu concentraiile indicate de IL-1a pentru 30 de minute la 37oC. Sunt reprezentate valorile medii a 100 celule msurate per godeu n dou experimente separate (Exp 1 si Exp 2). Nuc-CytoInten = intensitatea fluorescenei nucleare minus intensitatea fluorescenei citoplasmatice

41

Fig. 1.8 Translocaia NF-B indus de IL-1a n celulele HeLa. Celulele au fost marcate cu anticorp de iepure antip65 pentru NF-B i anticorp de capr anti-anticorpul de iepure Alexa Fluor 488. ADN-ul nuclear a fost marcat cu Hoechst 33342. NF-B este cuantificat prin msurarea intensitii fluorescenei verzi; nucleii apar albatrii. Celulele nestimulate (stnga) prezint fluorescena verde mai ales n citoplasm, pe cnd celulele stimulate cu IL-1a 2ng/ml 30 de minute la 37oC (dreapta) prezint translocaia NF-B n nucleu.

1.4.3. Fuziunile Proteina-GFP Tehnologiile prin ataare au fost frecvent utilizate pentru monitorizarea traficului sau transportului moleculelor prin membran n celule i n interiorul celulelor. Liganzii extracelulari pot fi conjugai cu biotina i apoi vizualizai cu streptavidina conjugat la o enzim. Un experiment HTS a fost descris pentru internalizarea factorului de cretere epidermal (EGF) [De Wit i colab., 2000]. Proteinele fluorescente contribuie semnificativ la nelegerea dinamicii proteinelor n interiorul celulelor. Ele reprezint instrumente importante i adaosuri ideale pentru evaluarea n timp real, a evenimentelor moleculare n celulele vii, sub forma de proteine reporter sau proteine de fuziune. Cea mai utilizat este proteina fluorescent verde(GFP), izolat iniial i clonat din petele cartilaginos Aequorea victoria. Un mare numr de variante GFP au fost realizate cu spectre de excitaie i emisie diferite, incluznd proteina
42

fluorescent albastr intensificat (eBFP), proteina fluorescent galben intensificat (eYFP) i proteina fluorescent azurie intensificat (eCFP). Natura structurilor acestor proteine evalueaz aceste proteine ca extrem de stabile i rezistente la degradare de ctre majoritatea proteazelor. Acest nalt nivel de stabilitate nu reprezint n mod necesar un avantaj pentru aplicaiile celulare. Dac se dorete monitorizarea modificrilor expresiei genice prin reaciile reporterilor transcripiei, este de preferat un reporter cu un timp de njumtire redus. n consecin, au fost create forme cu timp de njumtire redus ale eGFP pentru a putea fi utilizate ca proteine reporter ale transcripiei i ele sunt denumite proteine eGFP destabilizate. n acelai timp, au fost clonate alte proteine fluorescente din nevertebratele marine,cum ar fi proteinele fluorescente din recifurile de corali. Combinaia variantelor spectrale distincte ale proteinelor fluorescente permite o mare varietate de aplicaii, precum analiza simultan a cascadelor expresiei mai multor gene sau translocaia diferitelor proteine. Msurarea co-internalizarii -arestinei legat de GPCR poate fi utilizat pentru monitorizarea activrii i reciclrii receptorului. Barak i colab. (1997) au demonstrat cu ajutorul microscopiei confocale, translocaia proteinelor de fuziune -arestina-2GFP din citoplasma la GPCR ancorai la membran. Acest lucru a fost demonstrat pentru mai mult de 15 GPCR activai de ligand n celulele HEK-293. n absena activrii receptorului, -arestinele sunt distribuite n citosol i sunt absente n nucleu. Dupa adugarea ligandului la celule, proteinele de fuziune -arestina-2-GFP sunt translocate prin membrana plasmatic i mai departe prin veziculele de endocitoz. Acumularea proteinelor GFP-ataate poate fi cuantificat cu ajutorul tehnicilor imagistice fluorescente. Cu ajutorul proteinei de fuziune -arestina-2-GFP, se realizeaz cointernalizarea arestinei cu receptorul 1 al TRH (thyrotropin-releasing hormone) ca rspuns la agonist, reacia fiind monitorizat i fotografiat. NORAK Biosciences (Research Triangle Park, NC; www.norakbio.com) exploreaz micarea complexului arestina-GFP sub denumirea de tehnologia TransfluorTM ca o platforma HTS

43

aplicabil pe scar larg, stabil, care permite identificarea modulrii compuilor semnalizrii prin GPCR. Internalizarea receptorului i traficul su au fost explorate prin utilizarea liganzilor marcai fluorescent, ca de exemplu ligandul pentru receptorul transferinei [Ghosh i colab., 2000]. Screening-ul a fost condus cu un sistem ArrayScan II, iar internalizarea i reciclarea receptorului transferinei cu ligandul legat a putut fi monitorizat i cuantificat. Activarea i internalizarea GPCR a fost monitorizat cu ajutorul proteinelor de fuziune fluorescente GPCR-GFP. Conway i colab. (1999) au utilizat sistemul de screening ArrayScan pentru a monitoriza internalizarea receptorului pentru hormonul paratiroid i receptorului 2-adrenergic dup stimularea de ctre liganzii specifici. Alte exemple n care a fost utilizat fuziunea cu proteine fluorescente pentru a cuantifica traficul proteinelor includ translocaia nuclear a calmodulinei sau reglatorul transcripional legat de membrana dup hidroliza fosfoinozitidului. n alte aplicaii, domeniile de translocaie precum domeniul C2 sensibil la Ca2+ al protein kinazei C a fost fuzionat cu YFP i exprimat n celule leucemice de obolan. Tehnologia evanescent wave single-cell array (radiaii cu scdere exponenial a intensitii n funcie de distan) a fost aplicat ca o tehnologie imagistic pentru a monitoriza traficul proteic dupa adiia factorului activator plachetar. Analiza simultan a populaiilor celulare mixte poate fi efectuat prin transfecia fiecrei linii celulare cu o singur protein de fuziune fluorescent. Vectorii BFP i YFP au fost utilizai pentru transfecia stabil a dou linii diferite de cancer colonic, linia parental cu gena K-ras mutant i o variant unde gena mutant a fost deletat. Pentru a realiza screening-ul compuilor care omoar selectiv numai varianta tumorigenic cu gena mutant, ambele populaii au fost amestecate i testate simultan pentru supravieuirea celular utiliznd msurtori ale intensitii fluorescenei. Au putut fi identificai compui care afecteaz preferenial celulele cu alela ras mutant.

44

1.4.4. Fluorescen cu transfer de energie prin rezonan (FRET) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) a devenit o metod utilizat frecvent pentru studiul dinamicii proteinelor n celule. FRET este bazat pe transferul energiei absorbite de o molecul fluorescent la o alt molecul, determinnd excitarea celei de-a dou molecule. Pentru a realiza FRET, cele dou molecule fluorescente cu spectre diferite de excitaie/emisie trebuie sa fie ntr-o strns proximitate. Cea mai general strategie pentru crearea unor astfel de indicatori este interpunerea domeniului de interes sensibil conformaional ntre dou mutante GFP. n cazul legrii ligandului sau al modificrii domeniului, cele dou jumti fluorescente se gsesc n strns proximitate, ceea ce permite realizarea FRET. ntr-un studiu de pionierat, Mahajan i colab. (1998) au utilizat construcii plasmidice care au exprimat proteinele de fuziune GFP-Bax i BFP-Bcl-2. Bax i Bcl-2 sunt doi modulatori cheie ai apoptozei, dar interaciunea lor direct nu fusese niciodat demonstrat la nivel celular. Pe baza FRET s-a evideniat interaciunea direct a celor dou proteine la nivelul mitocondriei . FRET a fost de asemenea aplicat pentru a determina activitile kinazei n celule vii. Pentru acest scop, au fost creai reporteri constnd din fuziunea CFP, un domeniu de legare a fosfo-aminoacizilor, un substrat de consens pentru kinaza de interes i YFP. n celulele transfectate cu reporteri i stimulate pentru activitatea particular a kinazei, proteina de fuziune dup fosforilare a suferit modificri conformaionale i a permis realizarea FRET ntre YFP i CFP. Modificarea raportului ntre emisia galben i azurie a putut fi cuantificat i determinat temporal i spaial. Aceasta tehnologie a fost aplicat cu succes pentru protein kinaza A i cele trei tirozin kinaze Abl, Scr i receptorul EGF. ntr-o abordare similar, Honda i colab. (2001) au utilizat un indicator fluorescent codificat genetic pentru a investiga dinamica GMPc n celule individuale. Indicatorul GMPc a fost construit din mutani cu deleii ai protein kinazei GMPc dependente ntre mutanii galben i azuriu ai GFP. Legarea GMPc la indicatorul proteinei de fuziune a alterat FRET dar i raportul ntre emisia galben i azurie, care a fost selectiv peste AMPc. Prin utilizarea acestei metode, dinamica temporal i
45

spaial a nivelelor de GMPc intracelular n fibroblastele plmnului fetal de obolan i n neuronii Purkinje a fost monitorizat n urma adugrii diferiilor stimuli.De asemenea au fost studiai senzori similari pentru AMPc . Senzorii bazai pe FRET au fost de asemenea utilizati pentru a demonstra comportamentul spaio-temporal al proteinelor de legare a GTB n urma stimulrii celulare cu factori de cretere. A fost creat o protein de fuziune ce cuprinde H-Ras, domeniul de legare al Ras la Raf i a fost flancat de o pereche de mutani galben i azuriu ai GFP. H-Ras a fost nlocuit n cea de-a doua construcie cu proteina analoag Rap1. Activarea cii Ras/Rap de ctre factorii de cretere a indus FRET. Localizarea spaio-temporal a proteinei de fuziune a indicat c stimularea de ctre EGF a celulelor COS-1 a activat Ras la nivelul membranei plasmatice, iar Rap la nivelul regiunii perinucleare. n plus, acest studiu a demonstrat c factorii de cretere activeaz numai o subpopulaie a Ras i Rap i numai la nivelul unor arii restrnse din celul. Aceast tehnologie n combinaie cu imagistica celular va crete sensibilitatea i va facilita abordrile HTS celulare pentru evenimente specifice ale semnalizrii celulare. 1.4.5. Activarea GPCR prin biolominiscena cu transfer de energie prin rezonan (BRET) BRET (Bioluminiscence Resonance Energy Transfer) este un fenomen care apare n mod natural. Petele cartilaginos A. victoria sau Renilla reniformes produc fluorescena verde prin BRET. n cazul anterior al emisiei de lumin albastr, aequorina se asociaz cu GFP, n timp ce n ultimul caz, energia generat n urma degradrii coelanterazinei de ctre luciferaz este transferat ctre GFP. Acest transfer apare numai n cazul n care luciferaza i GFP formeaz un heterodimer. BRET a fost utilizat pentru a demonstra interaciunea proteinelor ceasului circadian de la cianobacteriile exprimate n E. coli. Mai recent, BRET a fost aplicat pentru studiul activarii GPCR de cteva grupuri de cercetatori [Angers i colab., 2000]. Pentru a demonstra dimerizarea receptorului 2-adrenergic (2-AR), construciile 2AR-Renilla luciferaza i 2AR-GFP supus efectului Doppler (redshift) (YFP) au
46

fost co-exprimate n celulele HEK-293. Apariia BRET a fost un indicator al dimerizrii receptorului. n acelai studiu, -arestina, cunoscut a se asocia cu domeniul intracelular al receptorilor cuplai cu proteina G activai, a fost exprimat ca o construcie arestina-YFP mpreun cu luciferaza- 2AR-Renilla. A fost prezent BRET ntre dou proteine, dar a fost n totalitate dependent dup activarea receptorului, indicnd asocierea arestinei cu domeniul intracelular al 2AR n starea activ a receptorului. Aceasta reacie a fost dezvoltat ca o tehnologie pentru HTS de ctre PerkinElmer Life Sciences. 1.4.6. Teste de detecie prin complementaritate a fragmentelor proteice (Protein Fragment Complementation Assays - PCA) Metodele descrise anterior pentru studiul interaciunilor protein-protein sunt asociate cu unele neajunsuri. Dublul sistem al drojdiilor este bazat pe transcripie, care necesit disponibilitatea proteinelor n nucleu. n FRET, proteinele fluorescente trebuie s fie exprimate n celule la nivele relativ nalte i interaciunea trebuie sa aib loc ntr-un asemenea mod nct proteinele s fie n strns proximitate pentru a permite transferul energiei. Complementarea enzimelor i utilizarea PCA n studiul interaciunilor protein-protein a fost dezvoltat pentru -galactozidaza la E. coli, dihidrofolat reductaza (DHFR) i mai recent pentru -lactamaza. n cazul -galactozidazei, doi mutani cu deleii, complementari sunt fuzionai cu dou proteine pentru a proba interaciunea. Numai n cazul n care cele dou proteine interacioneaz ele sunt cele dou pri ale galactozidazei forate s se completeze una pe cealalt i s exercite activitate enzimatic. Sistemul a fost dezvoltat pentru demonstrarea interaciunii FRAP i FKBP12 n prezena rapamicinei. Mai recent, complementarea -galactozidazei a fost utilizat pentru a crea sisteme HTS pentru screening-ul antagonitilor dimerizrii EGF-R mediat de ctre EGF. Pentru acest scop, mutanii cu deleii complementari ai -galactozidazei au fost fuzionai cu domeniile intracelulare ale EGF-R i cotransfectate n mioblaste de oarece C2C12. Activitatea enzimei a fost reconstruit n urma adugrii EGF la
47

celulele din cultur. Cu ajutorul acestei reacii, adaptat la un format cu 384 de godeuri, modulatorii cu molecule mici primar identificai n reacia EGF-R au fost supui screening-ului pentru specificitate cu doi mutani cu deleii complementari ai -galactozidazei fuzionai cu 2-adrenoreceptorul i -arestina uman. Prin utilizarea reactivilor chemiluminisceni i a galactozidazei fluorescente, aceast tehnic permite msurarea interaciunilor protein-protein n celulele vii pentru aplicaii HTS. Reasamblarea DHFR activ din fragmente create raional a fost realizat de ctre Pelletier i colab. (1998) ntr-un sistem procariot. DHFR a E. coli este inhibat selectiv de ctre antifolatul trimetoprim. DHFR murin poate salva celulele E. coli. Fragmentele complementare ale DHFR murin fuzionate cu proteine homo- sau heterodimerizate au fost utilizate pentru a transforma E. coli crescute ntr-un mediu cu trimetoprim. Supravieuirea a fost considerat ca o msur pentru interaciunile proteice i complementarea enzimei. n alt studiu, partenerii proteici fuzionai pentru complementarea fragmentelor DHFR murin au fost introdui n celule de mamifere DHFR-negative crescute n absena nucleotidelor. Celulele n care proteinele se asociaz i DHFR poate complementa sunt capabile s supravieuiasc n aceste condiii. Ca o alternativ, interaciunea proteic i complementarea DHFR pot fi monitorizate prin adugarea de metotrexat conjugat cu fluorescein. Metotrexatul se leag la DHFR numai n condiiile co-exprimrii i reasamblrii fragmentelor complementare. Semnalele fluorescente pot fi monitorizate prin microscopie fluorescent FACS sau prin metode spectroscopice utilizate n HTS. Complexul FKBP-rapamicina-FRAP i activarea receptorului pentru eritropoietin au fost utilizate ca sisteme model [Remy, Michnick, 1999]. Mai recent, reacia PCA-DHFR a fost utilizat pentru a analiza totalitatea reelelor biochimice n celule vii. Celulele ce exprim perechi de proteine asociate au fost selectate i metotrexatul conjugat cu fluoresceina, care se leag la DHFR reconstituit a fost aplicat pentru a localiza partenerii proteici interacionai i pentru a studia inhibitorii care previn interaciunea. Aceeai metod a fost utilizat cu succes pentru protoplastele plantelor care exprim fragmente complementare ale DHFR fuzionate cu proteinele interacionate.
48

Legarea metotrexatului conjugat cu fluoresceina ca o msur a interaciunii protein-protein a fost monitorizat prin microscopie fluorescent [Subramaniam i colab., 2001].

1.5. Analizele fenotipice

1.5.1 Proliferarea/Respiraia/Toxicitatea Multe reacii pentru citotoxicitate i proliferare se bazeaz pe msurarea radioactivitii i msurarea ncorporrii nucleotidelor marcate radioactiv precum [H3] timidina n ADN-ul celular. Dei foarte sensibil, reacia ce utilizeaz [H3] timidina este relativ costisitoare i consumatoare de timp i presupune manipularea i nlturarea deeurilor radioactive. Alte reacii de citotoxicitate, precum MTT [3-(4,5dimetiltiazol-2yl)-2,5difeniltetrazolium bromide], Alamar Blue, lactat dehidrogenaza i coninutul de ATP, necesit adiia unor reactivi specifici pentru generarea semnalului. Dintre aceste tehnici, cea mai utilizat este MTT. Aceast sare de tetrazoliun este redus n interiorul mitocondriilor celulelor pentru a forma un precipitat colorat formazan. Utilitatea MTT este limitat de faptul c poate fi susceptibil la interferena cu medicamentele, fie prin reacia cu gruprile reductoare ale medicamentelor, fie prin difuzarea absorbanei ce rezult din precipitarea n spectrul vizibil a luminii absorbite de medicamente. Msurarea viabilitii celulare prin reacia MTT se bazeaz pe reacia sa cu succinat dehidrogenaza mitocondrial, care poate ea nsi s perturbe celulele. Mai mult, testul n sine nu este reversibil i, datorit faptului c se realizeaz o citire la finalul reaciei, citirea pentru fiecare moment necesit o reacie separat. Trebuie notat faptul c reaciile de toxicitate i proliferare sunt utilizate att separat i independent una fa de cealalt, ct i n combinaie. Combinaia ambelor reacii permite o investigare detaliat a efectelor compuilor asupra unei linii celulare particulare. Reaciile omogene i reversibile sunt n mod considerabil necesare. Sistemul Oxygen Biosensor System (OBSTM; BD Biosciences, Bedford, MA) poate fi privit c un prototip reprezentativ. n acest sistem nu este necesar adugarea niciunui reactiv pentru generarea semnalului.
49

OBS este o reacie realizat ntr-o microplac care permite monitorizarea cinetic a oxigenului dizolvat. Colorantul sensibil la oxigen este nvelit cu o matrice de silicon care este permanent ataat de baza fiecarui godeu al microplcii. Matricea permeabil pentru gaze permite oxigenului din vecintatea colorantului s fie n echilibru cu oxigenul din mediul lichid. Oxigenul atenueaz capacitatea colorantului de a emite fluorescena ntr-o manier predictibil, dependent de concentraie. Prin urmare, pe msur ce oxigenul este depletat din godeu (celulele consum oxigenul din mediul nconjurator pe msur ce cresc), concentraia oxigenului n matrice descrete i fluorescena crete. Nivelul fluorescenei se coreleaz direct cu consumul de oxigen din godeu. Consumul de oxigen este n legatur direct cu numrul sau viabilitatea relativ a celulelor din fiecare godeu. Orice reacie care poate fi legat de consumul sau generarea de oxigen poate fi potenial msurat de ctre acest sistem (Fig. 1.9). Semnalul este dinamic i este citit n timp real. Probele pot fi citite orict de frecvent i de cte ori se dorete. Semnalul este complet reversibil i va crete pe msur ce celulele prolifereaz i va descrete pe msur ce celulele mor, oferind o imagine complet a cineticii proliferrii i toxicitii.

Fig 1.9 Consumul de oxigen de ctre celulele HeLa n urma expunerii la trinitrat de sodiu. Celulele (1x105), au fost adugate n godeuri separate ale unei plci cu biosenzori pentru oxigen i tratate cu trinitrat de sodiu n concentraiile indicate. Celulele au fost cultivate i fluorescena a fost msurat la momentele indicate. Concentraiile micromolare mici ale trinitratului nu au influenat creterea celulelor HeLa. n schimb, concentraiile micromolare ale trinitratului de Na sunt toxice i fluorescena relativ este meninut la un nivel constant. Descreterea consumului de oxigen la 126 de ore dup adugarea medicamentului indic faptul c celulele au confluat i au ncetat s prolifereze. 50

1.5.2. Apoptoza Apoptoza, sau moartea celular programat, este unul dintre cele mai complexe procese celulare. Evenimentele timpurii i tardive care apar n celulele supuse apoptozei cuprind activarea diferitelor caspaze, modificri ale citoscheletului, modificri ale potenialului membranei mitocondriale i a masei mitocondriale, condensarea sau fragmentarea nuclear, micarea de flip a fosfatidilserinei pe faa extern a membranei celulare i dezorganizarea membranei plasmatice. Modificri ale morfologiei nucleare, reorganizarea actinei i a potenialului i coninutului mitocondriei pot fi detectate i cuantificate prin analiza multiparametric a apoptozei [Woo i colab., 1999]. Mrirea sau ngustarea ariei nucleare i distribuia cromatinei n interiorul nucleului este analizat prin colorarea celulelor cu un colorant ADN fluorescent, precum DAPI sau Hoechst 33342. Gruparea filamentelor intracelulare de actin F i mrirea coninutului n actin a celulelor apoptotice sunt detectate cu ajutorul faloidinei fluorescente. Aceast falotoxin, izolat din ciuperca Amanita phalloides, se leag foarte nalt specific la actina F i poate fi marcat cu un colorant fluorescent. Cu toate acestea, creterea coninutului de actina F nu este observat n toate cazurile n celulele apoptotice, depinznd de tipul de celul sau de inducator. Colorantul cationic specific mitocondriilor, MitotrackerR Red, care se acumuleaz n mitocondriile active, este utilizat pentru a estima potenialul membranar i coninutul mitocondrial [Camilleri-Broet i colab., 1998]. n ambele cazuri, cantitatea de colorant de la nivelul mitocondriei este o masur a nivelului apoptozei. n cazul aplicaiei multiparametrice a apoptozei, algoritmul ArrayScan II nu numai c cuantific marcajul, dar ia n considerare distribuia colorantului fluorescent n compartimentele celulare i calculeaz fragmentarea nuclear i creterea coninutului mitocondial. Acest algoritm a fost aplicat cu succes n detecia apoptozei induse de anumii compui i poate fi utilizat pentru HTS.

51

1.5.3. Diferenierea Celulele stem umane de diferite tipuri au capacitatea de a se diferenia ntr-un numr de tipuri de celule mature.Asemenea celule stem fiind n mod curent utilizate n transplantul de mduv osoas i n cercetarea medicamentelor. Noi medicamente, precum factorul stimulator al coloniilor de granulocite i eritropoietina au fost create pentru a aciona direct asupra acestor celule, fiind eseniale pentru succesul transplantului de maduv osoas. Expansiunea progenitorilor din maduva osoas este extrem de sensibil la o varietate de chimioterapice i ali agenti toxici. n unele cazuri, efectele adverse toxice ale medicamentelor sunt specifice pentru liniile hematopoietice. n trecut, utilizarea progenitorilor hematopoietici pentru descoperirea medicamentelor pe baza analizelor de mare capacitate i screening-ul toxicologic era limitat de disponibilitatea esutului. innd seama de disponibilitatea actual a progenitorilor hematopoietici umani de nalt calitate, impasul curent l constituie utilizarea acestor celule n reaciile fenotipurilor lor de difereniere. Cea mai utilizat reacie in vitro pentru a determina rspunsul diferenierii celulelor progenitoare hematopoietice este reacia coloniei [Eaves, 1995]. Aceast reacie utilizeaz populaii progenitoare selectate din mduva osoas uman, cordonul ombilical sau sngele periferic mobilizat n reacii clonogenice ntr-un mediu semisolid. Dup o perioad de 14 zile apar colonii ale diferitelor tipuri de celule sanguine difereniate care sunt numrate manual. Diferite tipuri de colonii sunt identificate datorit morfologiei lor (mieloide sau eritroide) sau prin tehnici de colorare citochimic (megacariocite). Dei parametrii acestei reacii au fost optimizai pentru a obine date cantitative, rezultatele extrem de reduse i natura subiectiv a acestei reacii determin anumite probleme atunci cnd reacia este utilizat pentru screening-ul bibliotecii de compui chimici, descoperirea iniiala a medicamentelor i screening-ul toxicitii prin analize de mare capacitate. Rspunsuri difereniate pot fi obinute i prin transfecia unei celule int cu o gen pentru un receptor legat de expresia unui marker specific de difereniere.

52

Aceasta necesit transfecia unei celule ce conine cascade de transducie a semnalului caracteristice progenitorilor hematopoietici intaci. O alt abordare a fost descris de Warren i colab. (1995). Autorii au descris o imunoreacie celular n care celulele sunt transferate ntr-o plac de reacie tratat cu fixator, i fixate anterior incubrii cu anticorpii primari i secundari. Dei aceast reacie a fost utilizat cu succes, transferul celulelor din placa de cultur n placa de reacie este consumator de timp i nu este justificabil pentru HTS. Recent, aceast reacie a fost revizuit i mbuntit de ctre Greenwalt i colab. (2001) pentru a reduce numrul de manipulri necesare. La finalul perioadei de cultur, supernatantul culturii celulare este ndeprtat prin filtrare prin vacuum i este adugat un anticorp specific. Pentru a obine sensibilitatea dorit, anticorpii monoclonali au fost conjugai cu un chelat de europium DELFIA. Pe lng sensibilitate, emisia relativ lung a chelatului de europium DELFIA a permis utilizarea TRF (time-resolved fluorescence) pentru a preveni fluorescena fundalului endogen care este deseori o problem semnificativ n analizele biologice. ndeprtarea supernatantului culturii, a anticorpilor nelegai i etape ulterioare de splare sunt realizate ntr-o plac cu filtru cu 96 de godeuri. Deoarece este prezent numai o contaminare redus de la un ciclu de splare la altul, ndeprtarea anticorpului nelegat este foarte eficient. Sunt posibile splari repetate fr pierderea celulelor. Pentru detecia semnalului, a fost adugat o soluie de intensificare i fluorescena europiului (excitare la 340 nm i emisie la 615 nm) i a fost msurat cu ajutorul unui spectrofluorometru dup o perioad de 400 s dup ntrzierea iniial de 400 s. 1.5.4. Monitorizarea metabolismului celular Determinarea direct a metaboliilor la nivel celular sau in vivo ofer un sistem sensibil pentru evaluarea aciunii medicamentului deoarece metaboliii reprezint produii finali ai proceselor reglatoare celulare. n plus, metaboliii celulari sunt n general mult mai puin abundeni dect proteinele. n mediul celular, transducia semnalului, iniierea expresiei genice, sinteza proteinelor i rspunsurile metabolice la stres trebuie s fie secveniale. n ultimii ani s-au dezvoltat domeniile
53

metabolomicii, care investigheaz reglarea metabolic i fluxurile celulelor individuale sau tipurilor de celule, i metabonomicii, care determin profilurile biochimice sistemice i reglarea funciei n organismul ca ntreg prin analiza fluidelor biologice i a esuturilor [Nicholson i colab., 2002]. Studiul efectelor adverse ale medicamentelor asupra celulelor sau a ntregului organism prin metabonomic se bazeaz pe msurtori multiparametrice ale alterrilor metabolice n timp, ca rspuns la un factor de stres. Probele sunt cartografiate n funcie de compoziia lor biochimic [Nicholson i colab., 1999]. Metaboliii s-au dovedit extrem de utili n caracterizarea fenotipurilor mutante, aa cum s-a aratat recent la plante [Fiehn, 2002] i n caracterizarea aa-numitor mutaii silenioase la drojdii [Raamsdonk i colab., 2000]. Multe gene sunt silenioase, ceea ce nseamn c dac sufer o mutaie, ele nu conduc la modificri fenotipice uor observabile, precum alterri ale ratei de cretere. Rata de cretere poate s nu fie modificat deoarece concentraiile diferiilor metabolii intracelulari sunt adaptate ntr-un mod care compenseaz efectul mutaiei. Corespunztor, analize metabolomice pot releva un fenotip al metaboliilor anterior considerat ca silenios. n plus, cuantificarea modificrilor relative ale concentraiei metaboliilor cauzat de o mutaie face posibil identificarea unui situs de aciune al produsului genic alterat, dup cum a demonstrat Raamsdonk i colab. (2000). Prin utilizarea aplicaiilor rezonanei magnetice nucleare sau spectrometriei de mas (MS)/cromatografia lichid/MS, este posibil analiza de mare capacitate. Aceasta va permite utilizarea analizelor metabolomice i metabonomice n descoperirea medicamentelor ca o estimare sensibil a aciunii medicamentelor [Nicholson i colab., 2002]. O abordare nou, care permite analiza statusului metabolic n celule intacte, este analiza funcional a celulelor vii n medii controlate fiziologic pe perioade mari de timp (biochip-uri). Eforturile sunt direcionate ctre dezvoltarea, adaptarea i integrarea senzorilor microelectronici n biochip-uri miniaturizate pentru monitorizarea celular multiparametric (Cell Monitoring System). Unele dintre citirile posibile ale activitilor celulare corespunzatoare sunt sumarizate n tabelul 1.4.
54

Monitorizarea schimburilor oxigenului celular poate fi utilizat pentru evaluarea activitii mitocondriale. Mitocondria, pe lng faptul c furnizeaz energie celulei, se presupune c este implicat i n mbtrnirea celular accelerat datorat speciilor reactive de oxigen (ROS), n apoptoz i mecanismele toxice ale multor medicamente. Monitorizarea activitii mitocondriale prin colorani lipofilici precum rodamina 123 prezint riscul unor poteniale artefacte i deci, tehnicile non-toxice i neinvazive sunt n mod particular valoroase. OBS a fost descris mai sus ca una dintre primele tehnici neinvazive pentru monitorizarea consumului de oxigen. O limitare a OBS este determinat de necesitatea unui numr mare de celule. Sistemul necesit cel puin 50000 de celule n fiecare godeu pentru a produce rezultate viabile (un numr mai mic de celule nu consum suficient oxigen pentru a compensa difuzia oxigenului din mediul exterior la biosenzor). Comparativ, tehnologiile bazate pe microsenzori permit, n condiii ideale, nregistrarea semnalelor de la o singur celul. nregistrarea pH-ului bazat pe microsenzori este predominant utilizat pentru determinarea ratelor de acidifiere extracelulare. Cteva ci metabolice contribuie la acidifierea celular i, astfel, pot fi privite ca un indicator global al activitii metabolice. n acest sens, modificrile rapide (minute) tind s reflecte evenimentele activrii celulare (semnalizarea mediat de receptor), pe cnd modificarile lente (ore) sunt de obicei atribuite creterii sau morii celulare. Monitorizarea adeziunii celulare (metastazele tumorale) sau a creterii spre exterior (neurite) poate fi obinut prin creterea celulelor plasate direct pe perechi de electrozi interdigitai. Semnalul impedanei celulare rezult din izolarea prin membranele celulare. Dac celulele sunt plasate pe electrozi, ele blocheaz fluxul curentului ntr-un mod pasiv i astfel impedana crete. Astfel, impedana unui sistem ofer o privire asupra comportamentului de adeziune al celulelor. Aceast metodologie se bazeaz pe achiziia datelor utiliznd dispozitive multiparametrice cu microsenzori. Un sistem de fluide pentru suplimentarea mediului de cultur/soluiei de medicamente i pentru realizarea msurtorilor metabolice este conectat la chip. De asemenea este necesar meninerea precis a condiiilor
55

micromediului in vitro. Parametrii celulari rspunztori de citirea chip-urilor cu senzori sunt activitatea metabolic (ratele acidificrii extracelulare i respiraiei celulare), proprietile morfologice i unele fluxuri ionice. Chip-urile cu senzor la scar mic necesit cantiti foarte mici ale probei celulare. Au fost dezvoltate metode care permit testarea unui numr mare de compui, iar formatul n plci cu 96 de godeuri ar putea deveni disponibil n curnd.
Tabelul 1.4. Citirile pentru sistemele multiparametrice de monitorizare a activitii celulare Citirea Activitatea celular corespunzatoare Modificri ale nivelului de oxigen activitate mitocondrial (metabolism energetic, mbtrnire celular, apoptoz) indicator global pentru activitatea metabolic; Acidifierea mediului modificri rapide: activri celulare; modificri lente: cretere sau moarte celular adeziune celular: ataarea la matrix, metastaze Modificari ale impedanei tumorale; excrescene celulare: diferenierea neuritelor influx sau eflux de Ca2+, Na+, K+ Fluxul ionic preluarea glucozei, excreia lactatului Metabolii inducia expresiei genei reporter cuplat cu Emisia de lumin generarea de bioluminiscen

1.5.5. Alte reacii fenotipice Datorit unor limitri ale tehnologiilor existente actual, se nregistreaz o cretere a necesitilor pentru observaii n timp real, fr compui marcani ai proteinelor i celulelor n condiii naturale (neperturbate). Un dezavantaj major al tehnologiilor actuale este necesitatea marcrii i supraexpresiei proteinei de interes. Datorit supraexpresiei i modificrii, activitatea biochimic a proteinei i localizarea sa pot s nu reflecte condiiile naturale (neperturbate) i de aceea rezultatele trebuie interpretate cu precauie. O tehnologie care se adreseaz acestei probleme utilizeaz unde de radiofrecven [Hefti, Kumar, 1999] pentru a proba statusul fiziologic al unei proteine n contextul celulei c ntreg. MCS utilizeaz microunde, care corespund frecvenei naturale a dinamicii proteice, permind msurarea proprietilor electrodinamice ale proteinelor i celulelor. MCS nu permite utilizarea niciunor
56

adaosuri sau markeri i poate fi realizat n orice mediu, de la soluii apoase simple la mixturi foarte complexe (celule), permind o abordare direct pentru determinarea modificrilor n fenotipul celular (difereniere). Proteinele izolate n soluii tampon fiziologice expuse la o serie de frecvene ale microundelor, demonstreaz dou proprieti: rspunsul spectral (semntura proteinelor) i profilul biofizic. Prima proprietate determin un rspuns natural al fiecarei proteine ntr-un interval de frecvene. Profilul biofizic descrie modul n care o protein interacioneaz cu mediul volumul molecular, complexarea cu apa, interaciunea cu ali compui/proteine precum i modul n care se compar cu alte proteine aparinnd unor clase similare. Prin scanarea unui interval de frecvene i evaluarea diferitelor medii (condiiile de tamponare, prezena cofactorilor), aceast analiz definete o semntur multidimensional pentru fiecare protein chiar i n medii complexe (celulare). Aceasta ar putea permite dezvoltarea unor reacii cellbased prin care profilul biofizic al proteinelor int s poat fi analizat ntr-un mediu care mimeaz situaia din esuturile primare afectate de boal.

57

CAPITOLUL 2 IMPLICAREA GENELOR KNOCKOUT N NELEGEREA MECANISMELOR BOLII I DEZVOLTAREA UNOR NOI STRATEGII TERAPEUTICE 2.1. Introducere
Lezarea genelor int la oareci reprezint a nou tehnologie care revoluioneaz cercetarea biomedical, constituind un puternic instrument pentru producerea modelelor animale pentru studiul dezvoltrii umane i a bolilor ereditare. Chiar dac proiectul genomului uman a ajutat la stabilirea celor aproximativ 35000 de gene candidate, doar o mic parte din aceste gene au fost caracterizate precis pentru funcia lor in vivo. Genele int au un mare impact n ncercrile de a elucida rolul funcional al acestor gene. Beneficiul major al acestei tehnologii este acela de a permite analiza funciei proteinei produs de o anumit gen in vivo. Astfel funcia genei poate fi determinat n toate tipurile de celule normale, lund n considerare i interaciunile complexe ntre molecule sau celule. Este astfel posibil determinarea produsului genei n condiii de repaus al corpului, dar i n diferite situaii patologice i fiziologice. Multe modele de gene knockout la oareci simuleaz fenotipul bolilor umane. Modelele de oareci modificate genetic reprezint oportuniti unice pentru dezvoltarea i testarea diferitelor strategii terapeutice nainte ca acestea s fie introduse n clinic. n viitor, ingineria genetic pe modele animale va fi indispensabil pentru realizarea unor descoperiri importante n ceea ce privete mecanismele moleculare care stau la baza semnalizrii celulare, dezvoltrii, dar i a patogenezei, diagnosticului, prevenirii i tratamentul bolilor.
58

2.2. Gene knockout la oareci

Modelele animale sunt deosebit importante pentru cercetarea biomedical deoarece ajut la ntelegerea patogenezei bolilor i permit dezvoltarea de strategii terapeutice care s permit studiul eficacitii noilor tratamente cu consecine asupra costului i timpului alocat trialurilor clinice [Malakoff, 2000; Smithies, 1993]. n unele cazuri, lipsa de modele animale a mpiedicat progresul n direcia dezvoltrii de terapii eficiente pentru bolile genetice. oarecii de laborator au devenit rapid cele mai utilizate mamifere n biomedicin datorit dimensiunilor reduse, ciclului de reproducere scurt, informaiei lor genetice cunoscute i mai ales datorit posibilitii de a induce modificri genetice precise n celulele stem embrionare i de a le transfera la linii de oareci. Prin urmare manipularea genetic a oarecilor este actualmente larg rspndit, oarecii fiind utilizai ca modele animale ce ne ajut s nelegem dezvoltarea, prevenirea i tratamentul bolilor. Multe alte specii ca Drosophila [Gloor, 2001], viermele nematod Caenorhabditis elegans [Jorgensen, Mango, 2002] i petele zebr [Udvadia, Linney, 2003] au fost utilizai n experimente de mutagenez pentru studiul proceselor de dezvoltare i transducie a semnalelor. Dintre mamifere oarecii s-au dovedit a fi cele mai bune modele animale, deoarece ei sunt capabili s mimeze fenotipic bolile i afeciunile umane. Motivul pentru generarea de gene knockout la oareci purttori de gene inactivate sau mutante, este de cele mai multe ori bazat pe supoziii sau necunoaterea funciilor proteinei codificate de gena candidat, modelului ei de expresie, studiilor farmacologice sau a locilor cromozomiali implicai, n cohortele de pacieni din cadrul studiului. n urma publicrii schiei genomului uman, muli cercettori au adoptat strategii pe oareci knockout pentru a contura, in vivo, funciile genelor de interes i implicarea lor fiziopatologic n producerea bolilor. Procesul de dezvoltare a oarecilor knockout cu o gen modificat ncepe de la ADN-ul genei. Dac secvena de nucleotide a genei sau un fragment mare din gen este necunoscut, nu se poate realiza designul vectorilor int. ADN-ul celor mai muli oareci poate fi obinut din bazele de date ce conin bioinformaii despre ADNul din genomul oarecilor, proiect care a fost
59

completat cu succes n 2002 [Blake JA i colab., 2003]. Informaiile despre ADN-ul genelor permit construirea de vectori int care ofer posibilitatea de manipulare a genomului celulelor stem embrionare i de inducie a unor alterri n gena de interes. 2.2.1. Celulele stem embrionare n anii 60 dup ce primele experimente de deleie genic au fost efectuate n celulele stem embrionare (ES) ale murinelor [Thomas i colab., 1987], s-a obinut un numr remarcabil de oareci knockout. O condiie obligatorie pentru realizarea acestui obiectiv a fost posibilitatea de obinere a murinelor. Celulele embrionare au caracteristici ce le face uor de cultivat. Celulele ES sunt linii de culturi celulare, colectate iniial din masa celular intern a blastocitilor la 3,5 zile postcoitus la stadiul blastul de dezvoltare (fig. 2.1.).

Figura 2.1. Diagrama izolrii i multiplicrii celulelor stem embrionare 60

Deoarece aceste celule provin din stadii timpurii ale dezvoltrii ele sunt celule pluripotente. Toate genele lor pot fi activate i toi produii lor genici pot fi sintetizai. De asemenea ES pot fi subcultivate cu o eficien rezonabil, permind ca un numr crescut de celule s fie folosite n procese ca transfecia i recombinarea secvenelor omooage. n plus, celulele ES ale oarecilor pot fi meninute ntr-un stadiu nedifereniat, n monostraturi de tip fibroblastic i cnd mediul de cultur este mbogit cu factor inhibitor leucemic. n ciuda acestui tratament, celulele ES pstreaz capacitatea lor de a contribui la toate tipurile de esuturi i toate liniile celulare cnd sunt reintroduse ntr-un blastocist gazd [Nagy, i colab., 1993]. 2.2.2. Vectori int Pentru a stabili modelul de oarece knockout, este realizat o construcie de ADN, numit vector int ce conine forma mutant a genei de interes (fig. 2.2). Iniial, primii vectori int utilizai pentru a leza funcia genei int prin deleia de secvene specifice i nlocuirea lor cu ADN heterolog, erau o gen de selecie pentru medicamente sau o gen marker pentru analiza expresiei genei int [Zhang i colab., 1994].Cum este artat n figura 2.2 vectorul int cuprinde trei elemente principale ordonate specific: i) o regiune 5' omoloag genei int, ii) o gen marker de rezisten la medicamente pentru selecia pozitiv a celulelor care integreaz vectorul int, iii) o regiune 3' omoloag genei int. Secvenele ADN de la nivelul regiunilor 3' i 5' din vectorul int reprezint substratul pentru crossing-overul reciproc sau pentru mecanismul de conversie genic care trasfer caseta marker de selecie n locusul endogen. Secvenele omoloage provin din fragmente genomice clonate ale genei int i delimiteaz sevenele genei int, care sunt nlocuite de caseta marker de selecie pentru a genera locusul mutant. Pentru a deveni int ADNul genomic izogenic trebuie utilizat mpreun cu cel al celulelor ES n vederea construirii intelor. Specificitatea i lungimea secvenei ADN care delimiteaz regiunea int poate fi maximalizat pentru o recombinare omoloag eficient, ce presupune de exemplu nlturarea secvenelor
61

repetitive. Cnd construcia a fost complet, vectorul este liniarizat la sfritul regiunilor omoloage 5' sau 3', astfel nct capetele ADN-ului s poat servi ca substrat pentru iniierea recombinrii omoloage cu locusul int.

Figura 2.2. Secvena de nlocuire a vectorului pentru selecia pozitiv-negativ n celulele ES. Vectorul conine caseta de expresie a genei de rezisten Neo i gena HSV Tk. Dup recombinarea omoloag caseta de selecie pozitiv la medicament este ncorporat n locusul int i caseta de selecie negativ este nlturat. Alela (-) indic alela mutant dup recombinarea omoloag. R indic situsurile enzimei de restricie utilizate pentru excizia ADN nainte de detecia recombinrii omoloage prin tehnica Southern blot cu ajutorul unei sonde specifice derivat din afara regiunii int.

62

Dup transfecia vectorului int liniarizat n celule ES, se face o selecie a medicamentelor, pentru a mbogi aceste celule ES, care s-au integrat n vectorul int i se exprim ca gene sensibile la medicament. Caseta de exprimare a genei marker include toate secvenele, de reglare necesare pentru transcriere. Cei mai frecvent utilizai markeri de selecie au fost gena neomicin fosfotransferaza (Neo), care confer rezisten la analogul de neomicin G418. Metoda utilizat pe scar larg pentru a mbogi clonele de celule ES pentru recombinare omoloag este o strategie a genelor int care implic un vector conceput pentru a fi utilizat ntr-o dubl selecie de droguri, protocol cunoscut ca selecie pozitiv-negativ (fig. 2.2). n afar de selecia pozitiv a markerului Neo poziionat ntre regiunile 5 i 3 omoloage ale genei int, este inclus o gen caset suplimentar de selecie negativ amplasat la captul regiunilor omoloage. Gena de selecie negativ cel mai frecvent folosit este gena caseta de expresie a virusului herpes simplex timidin kinaza (Tk), care confer sensibilitate la guanozin analog al ganciclovirului. Produsul genei Tk fosforileaz ganciclovirul, i i permite acestuia s fie ncorporat n ADN-ul replicat acionnd ca un inhibitor de sintez al ADN-ului (fig. 2.3). ntr-un experiment tipic de gene-int, vectorul de selecie pozitiv/negativ va fi aleatoriu integrat de ctre capetele liniare n genomul multor celule, care pstreaz ambele casete de selecie Neo i Tk i confer rezisten la neomicin i sensibilitate pentru ganciclovir. Totui, n cazul n care n celule ES a aprut recombinarea omoloag ntre vectorul int i gena omoloag, caseta Neo-CAS va fi integrat n locusul int n timp ce caseta Tk se pierde i aceste celule vor supravieui fiind pozitive, dar i sensibile la ganciclovir . Prin folosirea schemei de selecie pozitiv/negativ, numrul absolut al coloniilor de celule ES care supravieuiesc seleciei duble de medicamente este de aproximativ 10 ori mai mic dect numrul de colonii care supravieuiesc doar seleciei pozitive. Reducerea numrului de colonii fiind un screening pentru evenimentele genei int. Empiric, nu toate clonele de ES care supravieuiesc seleciei pozitiv/ negativ sunt recunoscute ca prezentnd recombinri omoloage ce vor fi evideniate prin
63

tehnica Southern blot care utilizeaz sonde specifice pentru locusul int n celulele ES (fig. 2.2), motiv pentru care acestea, ar putea conine gena marker de selecie negativ care dobndete mutaii de inactivare, nainte de integrarea aleatorie a vectorului int n genomul celulei ES.

Figura 2.3. Mecanismul toxicitii celulare a ganciclovirului utilizat pentru selecia negativ n screening-ul celulelor stem embrionare cu recombinare omoloag.

2.2.3. Selectarea celulelor stem embrionare recombinate Vectorul int liniar este introdus n celulele stem embrionare prin amestecare cu prealabil cu aceste celule ntr-o cuvet de electropermebilizare, anterior construirii unui cmp electric. Cmpul electric deschide porii membranei celulelor ES, permind intrarea vectorului int. Cnd curentul electric este ntrerupt , membrana celulelor ES revine la situaia normal.
64

Secvena ADN construit difuzeaz prin citoplasm i intr n nucleu. Toate celulele ES care au suferit electropermeabilizare sunt crescute n culturi celulare care conin soluie de antibiotic. Dup transfecie, recombinarea omoloag dintre vectorul int i locusul endogen din celulele ES este rar, iar prezena de gene marker pentru selectarea medicamentelor permite mbuntirea recuperrii celulelor ES recombinate. Coloniile de celule ES crescute vizibil i dezvoltate n prezena unor compui de selecie sunt recoltate ca i candidate probabile ce pot s conin gene mutante n genomul lor. Celulele ES care au suferit recombinari omoloage vor fi genetic heterozigote, la nivelul locilor cromozomiali vizai. Astfel, n planificarea oricrui experiment cu gene int, este important s avem o strategie de genotipare, strategie care va face uor discriminri ntre tipul slbatic (wild type) i locii mutani din celulele cu evenimente de recombinare omoloag. La selectarea regiunilor omoloage din gena int pentru clonare n vectorul int, este important de a se anticipa utilizarea analizei Southern blot (sau analiza PCR), considernd disponibile situsurile enzimei de restricie pentru a genera fragmente de diagnostic. Succesul acestor analize este dependent de selecia sondelor ADN din afara regiunilor de recombinare i de alegerea situsurilor de restricie care vor conduce la identificarea fragmentelor de restricie care sunt unice pentru alelele mutante i respectiv alelele de tip slbatic (fig. 2.2). 2.2.4. Injectarea celulelor ES recombinate n blastociti i transferul blastocistului la primitori pseudonsrcinai Coloniile de celule ES ce prezint recombinrile omoloage presupuse sunt individualizate prin tripsinizare i colectate cu un ac fin, subire care este conectat la un micromanipulator. Blastocitii destinai microinjectrii cu celule ES sunt prelevai de la femele donatoare. Cu un ac ascuit se penetreaz brusc i precis blastocistul i se elibereaz 15-25 celule ES, prin presiune pozitiv. Embrionii injectai trebuie implantai la femele. Succesul de transfer al embrionilor depinde de calitatea mediului gazdei materne. mperecherea cu oareci masculi este necesar pentru
65

modificrile hormonale necesare stabilirii sarcinii. Femelele nu pot purta embrionii lor adevrai i sunt puse s se mperecheze cu oareci vasectomizai. Femelele de oareci au ovulaie spontan i pot fi fals nsrcinate prin mperecherea cu masculi vasectomizai n timpul estrului, ele vor afia profilul hormonal al unei femele gravide normal.

Figura 2.4. Figura de sus. Clone celulare multiple de celule stem embrionare ce cresc formnd monostraturi de fibroblati. Fibroblatii provin de la embrioni de oareci transgenici purttori ai casetei de selecie Neo, conferind rezisten la geneticin pentru selecia pozitiv. Fibroblatii sunt iradiai pentru a preveni proliferarea lor ulterioar, dup pregtirea acestora din embrioni, Figura de jos. Injectarea celulelor ES n blastocist. Celule ES individualizate sunt ncrcate ntr-o pipet de injectare. (1), vrful ascuit al pipetei ptrunde n cavitatea blastocistului (2) cu grij i ncet se mpinge vrful de injecie al pipetei n embrion fr ruperea sau neparea peretelui opus(3), celulele ES sunt expulzate prin presiune pozitiv, (4), acul este retras din embrion (5), i blastocitii injectai sunt colectai pentru transferul la femele recipient( surogat) (6). 66

2.2.5. Himera i puii F1 i F2 Succesul microinjectrii celulelor stem embrionare n blastocist duce la formarea unui embrion care conine celule din blastocistul iniial i n plus celulele embrionare implantate n blastocist. Celulele de origini diferite cresc mpreun pentru a forma un nou embrion. oarecele hibrid rezultat are esuturile i organele formate dintr-un amestec de celule derivate din celulele de origine (de obicei cu provenien din oareci C57/BL6 cu blana neagr) i celule ES (de obicei cu provenien din oareci SV129 cu blana galben/maronie). Hibridul este denumit himer pentru c acesta conine celule din dou surse independente. Blana hibrizilor himerici este un amestec de galben-maroniu i negru. Dac nici o celul ES nu este ncorporat n stadiul de blastocist, puii vor avea blana neagr. Aspectul blnii este un marker precoce util pentru succesul unei mutaii. oarecii himer sunt identificai odat ce culoarea blnii devine detectabil. Cnd ncorporarea celulelor mutante este numai la nivelul celulelor somatice, care se dezvolt n esuturi nonreproductive, himerele vor exprima mutaia, dar puii lor nu. Cnd ncorporarea are loc n celule care se dezvolt din celulele germinale mutaia int este transmis la generaia urmtoarea de pui de himer (fig.2.5). Pentru a detecta trasmiterea pe linie germinal se realizeaz ncruciarea ntre himer i oareci de tip slbatic. Himera este ncruciat cu rase de oareci normali, ca C57/BL6. Puii F1, rezultat al ncrucirii, sunt analizai pentru exprimarea mutaiei (fig. 2.5). Un pui de oarece F1 care primete gena mutant de la progenitorul himeric este heterozigot pentru gena mutant. Tehnica Southern blot i tehnica PCR cu sonde specifice se efectueaz pe ADN-ul genomic dintr-un mic eantion de esut de la coada puiului de oarece, n scopul identificarii heterozigoilor pozitivi. Fiecare heterozigot pozitiv este un potenial fondator pentru o linie de oareci mutani. Puii heterozigoi F1 identificai sunt mperecheai unul cu cellalt pentru a produce o generaie F2. Teoretic, populaia F2 va urma principiile de segregare mendelian, rezultatul fiind 25% homozigoi mutani, 25% homozigoi control tipul slbatic i 50% heterozigoi mutani. n cazul n care deleia genei este letal, homozigoii mutani nu vor supravieui.
67

n cele din urm, lipsa produsului genei la homozigoii mutani este evideniat prin anticorpi specifici prin tehnica Western blot folosind esut unde proteina este, de obicei, exprimat.

Figura 2.5. mperecherea oarecilor himer, cu oareci de tip slbatic( wild type) pentru obinerea de heterozigoi mutani. Clonele de celule stem embrionare puttoare a unei alele de tip slbatic i unei alele mutante (+/-) sunt injectate n blastociti.Se observ analiza Southern blot caracteristic pentru clonele de celule ES. Blastocitii injectai sunt transferai la femele recipient care vor da natere la himere. De obicei celulele ES purttoare de mutaii dominante care determin culoarea maroniu-glbuie a blnii (rasa SV129), sunt injectate la blastociti de la oareci de ras neagr (rasa C57B16). Prin urmare, gradul de hibridizare poate fi uor recunoscut prin contribuia culorii maroniu/glbuie la culoarea blnii. Himerele sunt apoi, mperecheate cu oareci C57B16 de culoare neagr. n cazul transmiterii mutaiei pe linie germinal, oarecii heterozigoi F1 (+/-) vor fi cu blana maroniu-glbuie.Ca urmare a mperecherii oarecilor heterozigoi ntre ei, un sfert din oareci vor fi homozigoi F2, dac viabilitatea nu este compromis de mutaii. 68

Se genereaz apoi o linie de oareci cu gena mutant. oarecii homozigoi cu mutaie nul au deficiente ambele alele, iar heterozigoii au deficient doar una din cele dou alele ale genei. Genotipul este -/- pentru mutaie nul, +/-pentru heterozigoi i +/+ pentru alela de tip slbatic obinuit, de control (wild-type). Fenotipul reprezint setul de caracteristici determinate de mutaie i se refer la caracteristici biochimice, anatomice, fiziologice i comportamentale. Caracteristicile oarecilor mutani sunt identificate, n comparaie cu oarecii de control normali, iar cele relevante pentru bolile umane sunt cuantificate. Aceste caracteristici specifice bolii sunt apoi folosite ca variabile de test pentru evaluarea eficienei tratamentelor. Tratamente general acceptate sunt administrate la oarecii mutani. Un tratament care previne sau nltur caracteristicele bolii la oarecii mutani este folosit pentru mai multe teste suplimentare ca un tratament potenial terapeutic pentru boli genetice umane.

Figura 2.6. Diagrama fluxului pentru genele knockout 69

2.3. Expresia genelor esut specifice

Tehnologia convenional de gene knockout este limitat de moartea embrionar sau postnatal imediat ntruct rolul unor astfel de gene nu poate fi investigat. n plus, rolul unei anumite gene n esuturile adulte poate fi mascat la orice oareci knockout, generai prin anomalii sau compensri de dezvoltare, sub forma intensificrii sau atenurii expresiei altor gene. Implementarea de situsuri specifice de recombinare, cum ar fi sistemul bacteriofag P1 LoxP / CRE, permit dezvoltarea unui knockout condiionat de absena unei anumite gene numai ntr-un esut specific sau dup un stadiu de dezvoltare specific [Gu i colab., 1993]. Enzima CRE este izolat de la bacteriofagul P1 i acioneaz ca un situs specific de recombinare. Secvena recombinat de ctre CRE, denumit LoxP, const din dou scurte repetiii de ADN (situsul de recunoatere CRE ) i o secven intermediar, ntre cele dou. Dou secvene LoxP cu aceeai orientare vor conduce la excizia ADN-ului cuprins ntre cele 2 secvene de ctre CRE lsnd intact un situs LoxP (fig. 2.7). n contrast, n cazul n care dou situsuri LoxP sunt orientate opus, CRE va inversa acest segment intermediar de ADN. Construciile int pentru inseria situsurilor LoxP n ADN-ul genomic sunt similare cu cele utilizate pentru realizarea de gene knockout convenional n celule ES (fig. 2.2). n plus fa de aceste aspecte, design-ul construciei de gene knockout condiionat necesit un numr important de considerente suplimentare: knockoutul convenional este, de obicei, conceput astfel nct caseta Neo lezeaz transcrierea genei endogene. n knockout-ul condiionat, gena endogen trebuie s funcioneze n mod normal, pn la recombinarea de ctre CRE recombinaza i, astfel, orice modificri trebuie s fie n afara regiunilor de codificare, adic introni, i nu trebuie s interfereze cu regiunile de reglare (fig. 2.7). Situsul LoxP trebuie s fie introdus ntr-un mod n care splicing-ul, va avea ca rezultat excizia unei cantiti suficiente de ADN pentru ca gena s fie inactivat. Acest lucru poate fi deosebit de dificil pentru genele cu introni de dimensiuni mari, n cazul n care numai cantiti mici de secvene codificatoare pot fi nlturate.

70

Figura 2.7. Knockout condiional utiliznd LoxP/ CRE. Locusul de tip slbatic i construcia int condiional prezint trei situsuri LoxP ce flancheaz caseta marker de selecie a tandemului Neo/Tk i exonul care va fi deletat. O prima int este recombinarea dintre aceast construcie i locusul ales. O clon recombinat pozitiv este aleas pentru a doua faz , ce cuprinde trasfecia cu vectorul ADNc - recombinaza CRE . Dup expunerea la CRE sunt posibile 3 evenimente recombinatorii. Populaia celular A prezint excizia complet i poate fi utilizat pentru injectarea blastocitilor pentru a genera knockout total la oareci. Populaia de celule B este forma n care caseta de selecie a fost eliminat, dar gena nu este nc deletat. Aceste celule ES sunt preluate pentru a stabili knockoutul condiional, unde exonul flancat este deletat mai trziu, adic dup ncruciarea animalelor rezultate cu oareci transgenici ce exprim recombinaza CRE sub un promotor esut specific. Secvena palindromic parial de nucleotide a situsurilor LoxP este prezentat n partea inferioar. 71

Astfel, situsurile LoxP trebuie s fie poziionate pentru a nltura exonii care codific un important domeniu funcional i ca rezultat ar avea loc schimbarea cadrului de citire. Genele de rezisten incluse pentru selecia clonelor int conin de obicei mai multe kilobaze de ADN strin, care are potenialul de a influena expresia genei int nainte de recombinare. Pentru a minimaliza aceast potenial influen asupra expresiei genei, este posibil s se nlture gena de rezisten din clonele celulelor ES int in vitro, nainte de microinjectarea blastocitilor. Pentru a elimina genele de rezisten, un situs suplimentar LoxP trebuie s fie inclus pentru a flanca gena de rezisten (fig. 2.7). ADN-ul genomic modificat ar include, astfel, trei situsuri LoxP, dou poziionate pe flancuri, nsoind gena de rezisten, precum i cel de-al treilea situs situat pentru producerea deleiei dorite, atunci cnd apar recombinari. Transfecia clonelor celulare int de celule ES cu un vector care conine ADNc al recombinazei CRE produce celule ES cu trei configuraii genomice alternative n plus fa de clonele non-recombinate (fig. 2.7). Pentru a limita numrul evenimentelor de recombinare i pentru a facilita selecia dorit de clone, o selecie negativ poate fi realizat prin adugarea ganciclovirului n celule ES. Aceast strategie necesit utilizarea unei casete marker de selecie care conine att gena Tk ct i gena Neo de rezisten pentru selecie. Adaosul de ganciclovir n culturile celulare de ES va permite creterea clonelor cu : i) exonul de interes flancat de dou situsuri LoxP, i anume exonul delimitat pentru knockout-ul condiionat i ii) clonele de celule ES cu un singur situs LoxP, gata de utilizare pentru stabilirea knockout-ului general. Astfel, folosind trei site-uri LoxP i caseta marker de selecie Neo/Tk introduse n genomul celulei ES se produc ambele tipuri de clone clasice pentru: knockout-ul general i knockout-ul condiionat. Selecia clonelor n care gena de rezistena a fost deletat i ADN-ul genomic, cu modificri adecvate, a fost lsat intact, poate fi realizat prin screening folosind tehnica Southern blot. Cnd injectarea blastocitilor i transmiterea pe linie germinal a celulelor ES cu knockout condiionat este realizat i oareci cu exonul flancat au fost obinui, recombinaza CRE este exprimat n esutul sau tipul celular de interes (fig. 2.8). Recombinaza nltur specific exonul fundamental din alela
72

modificat i creeaz o excizie CRE knockout dependent. Pentru a realiza acest lucru, o linie CRE transgenic care exprim recombinaza sub un promotor celular sau esut specific este ncruciat cu oareci knockout condiionat cu exonul flancat. Numai n celulele unde recombinaza CRE este exprimat, are loc excizia exonului, rezultnd o deleie a genei esut specific. ntre timp, linii de oareci CRE transgenici sunt disponibili, fiecare exprimnd recombinaza cu specific diferit. Astfel, sistemul de recombinare LoxP/CRE este un instrument puternic pentru deleia condiionat i specific celular a genelor. Introducerea acestui sistem la oarecii transgenici faciliteaz studiile cu privire la pierderea funciei genelor ntr-un anumit tip de celule. Prin inseria situsurilor Lox pe calea recombinarii omoloage n gena de interes i expresia recombinazei CRE int pentru un anumit tip de celule folosind un promotor esut specific, va fi posibil introducerea deleiilor predeterminate mamiferelor. 2.3.1. Recombinaza CRE ligand activatoare n ultimii ani, au fost dezvoltate tehnologii, care permit noi abordri n scopul de a controla temporal i esut specific mutaia dorit pentru expresia genelor inductibile la oareci transgenici i care pot fi combinate cu mai multe gene int convenionale. De exemplu, o metod pentru genele int condiionate este bazat pe supraexpimarea recombinazei CRE care ar putea permite inactivarea genei int flancat, esut-specific, n orice moment din timpul dezvoltrii i la oarecele adult (fig. 2.8., figura de jos). Fuziunea domeniului de legare la ligand (LBD) al receptorilor de estrogen cu recombinaza CRE genereaz o recombinaz himeric a crei activitate este dependent de prezena receptorilor de estrogen sau de tamoxifen modulator al receptorilor de estrogen [Metzger , 2001]. Pentru a obine gene int condiionate la oareci, n cazul n care estradiolul endogen este prezent, s-a indus fuziunea recombinazei CRE cu LBD mutant al receptorilor de estrogen uman. LBD mutant al receptorilor de estrogen nu este legat de estradiol, ntruct acesta se leag de ligandul sintetic pentru tamoxifen.
73

n genomul

S-au produs linii de oareci transgenici ce exprim recombinaza CRE fuzionat cu LBD mutant al receptorului de estrogen sub controlul unor promotori diferii esut specific (P) (fig. 2.8, figura de jos).

Figura. 2.8. Figura de sus. Strategie de reproducere pentru obinerea unor oareci cu knockout celular specific. oarecii care prezint alele nule , i n plus sunt purttori ai alelei unde gena sau exonul care vor fi deletai sunt flancai de dou situsuri LoxP ( exoni flancai) sunt fenotipic oareci heterozigoi. Cnd sunt mperecheai cu oareci transgenici care exprim recombinaza CRE (C) sub un promotor esut specific aceti oareci devin homozigoi mutani nuli n ceea ce privete acest esut. Figura de jos. Strategie de reproducere pentru obinerea de oareci cu knockout celular specific sub control temporal. Transgena-recombinaza CRE fuzionez cu ADNc domeniului de legare al ligandului receptorului de estrogen. Activarea recombinazei CRE este dependent de prezena tamoxifenului, care poate fi furnizat oarecilor n apa potabil. Adaosul de tamoxifen permite knockoutul genei sau exonului de interes oricnd n punctul dorit. 74

Un astfel de oarece transgenic poate fi mperecheat cu un oarece ce prezint un exon flancat n interiorul genei care ar trebui deletat. Puii lor exprim ambele modificri, exonul flancat i recombinaza CRE ligand dependent, i li se administreaz tamoxifen. Exonul flancat este ulterior eliminat din genomul acestor esuturi, n cazul n care proteina recombinazei CRE de fuziune este exprimat. Exprimarea celular specific a recombinazei CRE fuzionat la un receptor de estrogen LBD mutant, la oarecii transgenici, poate fi astfel utilizat pentru eficientizarea recombinrii CRE mediat de tamoxifen (tamoxifen dependent), la nivelul locilor ce conin situsuri LoxP pentru a genera mutaii somatice situs specifice ntr-o manier spaio-temporal controlat. 2.3.2. Expresia sistemului tetraciclin/ doxiciclin inductibil Capacitatea de a controla expresia genei, i n cele din urm, a genei, int, la oarecii transgenici prin simpla administrare de substane exogene ofer un nou nivel de de control asupra sistemului CRE / LoxP, pentru a induce mutaii genice la oareci. Sistemul ce rspunde la tetraciclin este compus dintr-o protein tetraciclin represoare (TetR), fuzionat la un domeniu activator de transcriere pentru virusul herpes, precum i o secven tetraciclin operator (tetO) legate de un mic promotor pentru controlul transcripiei unei gene ce intervine dup legarea TetR de tetO [Gossen , 2002]. Vectorii de exprimare TetR i promotorul minimal tetO ce dirijeaz transcripia genei n celulele de mamifere sunt disponibile n comer. Sistemul tetraciclin-responsiv poate fi folosit mpreun cu tehnologia CRE/LoxP pentru a permite controlul temporal al genei int la oareci, prin plasarea expresiei genei CRE sub controlul unui promotor minimal tetO. Pentru mai mult specificitate, un promotor esut specific poate fi folosit pentru a regla expresia genei TetR. Mai mult dect att, exist variaii Tet-off i Tet-on pentru controlul expresiei genei tet responsive, care depind de legarea de tetraciclin a TetR. n versiunea Tet-off a acestui sistem, proteina transactivatatoare TetR, tTA, se va lega la promotorul tetO minimal n prezena tetraciclinei pentru a represa expresia genei. Cnd administrarea de tetraciclin este oprit, tTA nu se mai leag de de
75

promotorul tetO minimal i transcrierea este indus de mai multe mii de ori n esuturile oarecilor transgenici. Dup cum este ilustrat (fig. 2.9), este necesar s se genereze dou linii de oareci care sunt homozigoi pentru gena tTA i heterozigoi pentru locii mutani ,,de tip sandwich", i homozigoi pentru transgena CRE i respectiv, heterozigoi pentru pentru locii mutani ,,de tip sandwich". Prin reproducerea celor dou linii de oareci, 25% dintre pui vor fi homozigoi pentru locusul mutant condiional i heterozigoi att pentru transgena tTA ct i CRE.

Fig. 2.9. intele genei Tet-off inducibile. Linie de oareci heterozigoi pentru un locus int mutant condiional cu situsurile LoxP flancnd gena de interes i linie de oareci homozigoi pentru transgena care exprim proteina tetraciclin represoare. De asemenea, linia de oareci este ncruciat cu alta care este heterozigot pentru transgena CRE responsiv la tetraciclin. ncruciarea acestor linii produce progenitori care sunt heterozigoi pentru ambele transgene, pentru a menine represia genei CRE i care vor transmite locusul mutant condiional i locusul de tip slbatic conform transmiterii mendeliene. Eliminarea doxicilinei are ca rezultat exprimarea genei CRE i crearea unui locus int mutant. Alela de tip slbatic a locusului int endogen nu este ilustrat. 76

Pentru a menine expresia genei CRE reprimat i pentru a preveni recombinarea LoxP-mediat de la nivelul locilor int n timpul embriogenezei puilor, doxiciclina poate fi administrat n apa potabil. La ndeprtarea doxiciclinei, expresia genei CRE este dezinhibat, i determin recombinarea LoxP mediat, perturbnd genele int. Ca dezavantaj al acestui sistem a fost raportat inconstana, adic pierderi ale expresiei genei CRE n starea represat. n versiunea Tet-On a acestui sistem, expresia genei CRE controlat de promotorul tetOminimal este mai degrab indus, dect represat, de administrarea doxiciclinelor (fig. 2.9). Astfel, rezult o form mutant a TetR, rtTA, care n mod normal represeaz promotorul minimal tetO. Dup adugarea de doxiciclin, rtTA este eliberat din tetO permind exprimarea genei CRE. De asemenea, acestui sistem, ca revers celui descris mai nainte, i lipsete o reprimare mic a promtorului tetO minimal.

2.4. oareci transgenici

Avnd n vedere c oarecii knockout au o gen cu deleie, oarecii transgenici pot avea o nou gen adugat sau o extracopie a unei gene existente, n scopul de a investiga supraexpresia genei. Tehnicile transgenice ncep cu dezvoltarea construciei genei de fuziune n care ADNul transgenic este dirijat de un promotor specific [Rossant, 1995]. ADN-ul transgenic construit este apoi microinjectat n pronucleii ovocitelor fecundate de oarece, care au fost recoltate dup tratamente hormonale, de la femele de oareci la care a fost stimulat ovulaia (fig. 2.10). Celula ou este suficient de mare pentru a fi vzut la microscop. Prin procese de recombinare aleatorii, gena de fuziune construit se integreaz n genom. n cazul n care transgena este integrat n genomul celulei nainte de prima diviziune, embrionii se dezvolt cu gene strine coninute n fiecare celul somatic i germinal. Oule microinjectate sunt transferate n oviductele femelei oarece fals nsrcinate, genetic normal. oarecele care se dezvolt din fiecare ou microinjectat este fondator de linie mutant. Probabil transgena se integreaz n locaii
77

cromozomiale diferite n genomul fiecarui oarece fondator, care genereaz linii mutante. Utiliznd promotori esut specifici, se ncearc definirea situsului de ncorporare. ADN-ul modificat se introduce ntr-o locaie cromozomial omoloag cu ADN-ul promotorului. Transgena se introduce numai ntr-un cromozom. Astfel, embrionul, se dezvolt ca heterozigot pentru transgen. Heterozigoii sunt apoi mperecheai unii cu alii pentru a genera homozigoi transgenici, heterozigoi, i de tip slbatic (wildtype), dup modelul transmiterii mendeliene. ADNul realizat conine adesea o gen reporter controlat, de aceleai promotor, astfel c prezena genei reporter n celule indic prezena celular a transgenei. Concentraiile de gen reporter, de transgen i produs genic se analizeaz cantitativ pentru a determina supraexprimarea genei n esutul de interes. Cartografierea anatomic a localizrii genei reporter, transgenei i produsului genei este realizat pentru a descrie distribuia anatomic a expresiei transgenei n perioada de dezvoltare a animalului.

Figura. 2.10. Diagrama producerii oarecilor transgenici 78

2.5. Lezarea genelor int la Drosophila

Completarea cartografierii secvenializrii genomului [Adams , i colab., 2000] ofer acces nelimitat la toate genele de Drosophila melanogaster. Cu toate acestea i aproape dup un secol de genetic pe Drosophila, exist mai multe gene pentru care mutaiile corespondente nu sunt nc disponibile. Mijloacele pentru a depi aceste impedimente au fost situsurile selectate de traspozonii mutageni i de interferen ARN-mediat. n timp ce transpozonii mutageni implic screeningul PCR complex, ARNi genereaz numai fenocopii specifice mutaiilor cu pierderea funciei i nu provoac ntotdeauna un fenotip cu adevrat nul. Ca urmare, s-au dezvoltat metode de inducie a unor gene int knockout. Genele int n Drosophila sunt realizate prin tehnici elegante, care profit de recombinarea omoloag endogen germinal la aceste insecte zburtoare [Rong , i colab., 2002]. Tehnica se aseamn cu cea de knockout int n celulele ES la oareci i poate viza o mutaie n orice locus din genomul Drosophilei. Aceast metod implic trei componente: i) o transgen, care exprim o recombinaz de oc termic situs specific inductibil, (recombinaza FLP din drojdia de bere), ii) o a doua transgen, care exprim o endonucleaz de oc termic inductibil situs specific (I-SceI), iii) un vector transgenic donator care poart situsurile de recunoatere pentru ambele enzime (dou situsuri FRT de 18 de perechi de baze i respectiv un situs I-SceI ), n plus fa de gena int de tip slbatic, i gena alb ca marker de selecie pozitiv (permite screeningul descendenilor pentru ochi albi). Primul pas este introducerea aleatorie, a endonucleazei I-SceI inductibil de oc termic situs specific i a recombinazei FLP folosind un element de sistem P. Elementul P- este un element genetic mobil ce codific o transponaz care permite elementului P- inserarea n ADN. Vectorul donator (fig. 2.11) este, de asemenea, introdus n mod aleatoriu n genom prin transformarea mediat de elementul P. Pentru recombinare, musculiele purttoare a ambelor transgene att a I-SceI inductibil de oc termic ct i a FLP sunt ncruciate cu musculie care poart gene care urmeaz s fie flancate intit de situsurile de recunoatere FRT. Prin oc termic, recombinaza FLP situs specific i endonucleaza (I-SceI) situs specific, excizeaz
79

apoi, in vivo, o molecul de ADN extracromozomial purttoare de rupturi dublu catenare recombinatorii n cadrul genei de interes. Prezena acestei rupturi dublu catenare (DSB) stimuleaz recombinarea omoloag ntre donorul excizat i locusul int omolog cromozomial (fig. 2.11). Cteva categorii de recombinare la nivelul locusului int incluznd substituiile alelice i inseria ADN-ului donor sunt observabile la gameii femelelor. n multe cazuri, produsul inseriei este o duplicaie n tandem parial a genei int, cu ambele copii cu defecte, deoarece fiecare are un fragment lips a genei (fig. 2.11). Avnd n vedere c evenimentele de recombinare apar germinal, progenitorii sunt obinui cu gena knockout int n afara fiecrei celule.

Figura 2.11. Gene int la Drosophila. Vectorul int transgenic conine gena int ntr-o form trunchiat cu un situs rar pentru endonucleaza I-SCE-I, mpreun cu gena alb, pentru a permite selecia ochilor albi la Drosophila. Construcia este flancat de dou situsuri FRT care sunt recunoscute de recombinaza FLP. Recombinaza FLP mediaz excizia, iar endonucleaza I-SceI mediaz tierea intelor ADN extracromozomiale din vectorii donori transgenici. ADN-ul int, este de ateptat s se recombine cu locusul genei endogene pentru a produce o duplicaie n tandem nefuncional. 80

2.6. Inactivarea genelor int la petele zebr

Recent genomul petelui zebra cu dimensiuni de 2 pn la 4 cm a fost complet secvenializat. Genomul haploid are 1,7x109 bp, comparativ cu genomul uman care are 3 x109 bp. Cartografierea comparativ arat conservarea extins a blocurilor de gene conservate, spaial localizate pe cromozomi (syntenies) ntre genomul petelui zebr i mamifere. Date directe despre funcia majoritii celor 30 000 de gene din genomul petelui zebr sunt facilitate de dezvoltarea rapid a tehnologiei pe baz de morfoline, care poate fi aplicat la acest model de organism. Morfolinele (fig. 2.12) sunt oligonucleotide antisens modificate, care sunt eficiente i specifice inhibitorilor translaionali cnd sunt injectate n oule fecundate ale petelui zebr [Heasman J., 2002]. Ele se leag i inactiveaz secvene de ARNm selectate. Oligonucleotidele sunt asamblate n patru subuniti, fiecare dintre ele coninnd una dintre cele patru baze azotate: adenina, citozina, guanina i timina legate n poziia 6 la inelul morfolinelor, ceea ce nucleazic. confer o nalt rezisten

Figura. 2.12 . Structura chimic a morfolino oligonucleotidelor. Segmentul morfolino nucleotidelor cuprinde 2 subuniti unite printr-o subunitate de linkage.

81

Morfolinele conin 21-25 de baze ntr-o ordine specific. Oligonucleotidele sunt concepute pentru a se lega la regiunea 5' netranslatat i includ aminoacidul de iniiere metionin specific ARNm. Ele acioneaz prin intermediul unui bloc steric al complexului de iniiere translaional, iar datorit secvenei specifice i afinitii mari, ele au randament fiabil i reproductibilitate fenotipic. Pentru inactivarea unei singure sau mai multor gene, morfolinele sunt injectate n glbenuul de ou aflat n etapa embrionar, de 1 la 4 celule. Embrionii se dezvolt n afara mamei i, prin urmare, nu sunt resorbii n cazul n care mor n timpul embriogenezei datorit morii cauzate de inactivarea genelor. Dup fertilizarea oulor, organismul cu toate organele sale se dezvolt n termen de 24 de ore (echivalentul a aproximativ 9 zile la oareci). Embrionii sunt, de asemenea, complet transpareni facilitnd observarea celulelor condamnate la moarte. Embrionii au fost analizai morfologic la 1-5 zile dup injectarea de morfoline, adic ntr-un stadiu de dezvoltare, cnd petele zebr deja noat liber. n contrast cu genele int de la oareci, care n mod normal necesit luni sau chiar ani pentru determinarea funciei genei, inactivarea genelor int pe baz de morfoline la petele zebr permite determinarea funciei genei la nivel de zile. Modelul animalul este, deosebit de potrivit pentru gene importante implicate n procese privind dezvoltarea vertebratelor, cum ar fi somitogeneza i organogeneza.

2.7 . Deleia tulpinilor int de Caenorhabditis elegans

Genomul acestui nematod a fost, de asemenea secvenializat i const din ase cromozomi ce au n total 97 Mb de perechi de baze (mrime haploid) i cuprinde 19 099 de gene. Nematodul adult, este format din exact 959 de celule somatice, ce includ 302 neuroni i 95 de celule musculare. Generaiile C. elegans au nevoie de un timp foarte scurt pentru a se dezvolta de la stadiul de ou fecundat pn la stadiul de adult matur. Trei zile de la fecundarea oului, viermele poate produce singur descendeni. Strategia de gene knock-out presupune deseori utilizarea sporadic de trimetilpsoralen, care este mutagen pentru un numr foarte mare de viermi [Jansen , 1997]. Expunerea la mutageni are ca rezultat mutaii aleatoare n celulele embrionare.
82

De exemplu, un spermatozoid ar putea fi un mutant pentru o gen specific. Fertilizarea ovului de acest spermatoizoid va avea ca rezultat indivizi heterozigoi. Pentru c este un vierme hermafrodit care realizeaz singur fertilizarea, se vor produce ovule i spermatozoizi, care poart aceast gen mutant; un sfert din urmtorii si descendeni vor fi homozigoi pentru alela mutant, rezultatul fiind un fenotip specific. Un astfel de animal poate fi investigat n termen de trei zile, dac fenotipul mutant este complet. Screeningul viermilor expui la un mutagen se face dup cum urmeaz: viermi sunt mprii n mai multe subculturi mici, permindu-le s aib descendeni. O poriune din fiecare subcultur este pstrat n via n congelator, i ADN genomic este luat de la restul de cultur. Prin urmare, acest ADN este sintetizat de fraii viermilor congelai i poart aceleai mutaii ca i viermii congelai. Cu o foarte mic frecven (aproximativ 1 din 200 000 genomuri mutagene) mutageneza va produce o deleie mic (100-1000 bp) la nivelul oricrei gene. Dac primerii PCR ce flancheaz zona genei de interes sunt folosii pentru a amplifica probe de ADN genomic, deleiile dintre primeri pot fi detectate, generndu-se ampliconi PCR de dimensiuni mai mici dect cei din ADN-ul genomic de tip slbatic amplificat. Astfel, ADN-ul, reprezentnd mai multe mii de genomuri cu mutaii poate fi supus screening-ului i ampliconii generai ce prezint deleii din aceste genomuri vor fi detectai. Dup ce un fragment de ADN care conine o anumit deleie este astfel evideniat, se pot identifica subculturile de viermi n care a avut loc deleia; viermii congelai din aceast subcultur pot fi decongelai, i animalele vii purttoare ale mutaiei, pot fi identificate. Indivizii mutanii care au fost detectai, pot fi recuperai i crescui n continuare pentru a studia funcia genei. La sritul anului 2002 aproximativ 10% din genele lui C. elegans au fost identificate prin mutaii . O treime din aceste gene au corespondent la mamifere, i nelegerea funciilor la C.elegans ne va ajuta s stabilim dac acestea funcioneaz la animale mai evoluate.

83

CAPITOLUL 3 SISTEME DE TESTE BAZATE PE GENE REPORTER CARE INVESTIGHEZ RECEPTORII CUPLAI CU PROTEINA G IMPLICAI N DESCOPERIREA DE NOI MEDICAMENTE 3.1. Receptorii i comunicarea celular
Organismele superioare, printre care, i omul, conin milioane de celule care au un rol important n reglarea funciilor fiziologice. n consecin, celulele au capacitatea de a comunica una cu cealalt i o disfuncie de comunicare celular poate conduce la diverse boli. n controlul funciei celulare, o influen considerabil o au moleculele de semnalizare extracelular i complementar acestora numeroase proteine receptor [Uings, 2000]. Fiecare celul rspunde la un anumit set de semnale care acioneaz n diverse combinaii pentru a regla comportamentul celulelor. Din cauza structurii unice tridimensionale a proteinei receptor, numai cteva molecule de semnalizare sunt capabile de a se lega de un anumit receptor. Prin urmare, fiecare celul acioneaz ntr-un mod caracteristic i programat. Cele mai multe molecule de semnalizare extracelular, cum ar fi adrenalina, serotonina, dopamina i neuropeptidul Y sunt hidrofile, i pot activa receptorii proteinelor numai la suprafaa celulelor int. n consecin, receptorii transmit semnalul prin conversia evenimentelor extracelulare n semnale intracelulare care modific comportamentul celulelor int. Exist trei mari familii de receptori de suprafa celular, care aparin la aceeai familie de proteine transmembranare: i) receptorii cuplai cu canale ionice, ii) receptorii de suprafa cu activitate enzimatic i iii) receptorii cuplai cu proteine G. Fiecare familie asigur o transducie specific a semnalelor extracelulare.

84

3.1.1. Receptorii cuplai cu canale ionice Una din clasele de receptori de suprafa celular sunt receptorii cuplai cu canale ionice, cunoscui, de asemenea, ca i canale ionice dependente de ligand (LGICs). Aceti receptori sunt diferii de receptorii cuplai cu proteine G (GPCRs) i sunt implicai n semnalizarea sinaptic rapid prin circulaia ionilor prin canalele cu poart controlate de neurotransmitori. De obicei, canale ionice cu poart dependente de ligand sunt nchise n stare de repaus, dar se deschid ca rspuns la agoniti. Dup activare, canalele implicate se desensibilizeaz spontan. Schimbrile de potenial membranar produse constituie un semnal care poate fi ulterior prelucrat de ctre celule receptoare. n prezent, se cunosc trei superfamilii de canale ionice cu poart dependente de ligand: superfamilia de receptori nicotinici, familia de receptori glutamatergici i de receptorii ATP. Superfamilia de receptori nicotinici este compus din mai multe familii de receptori, inclusiv receptorii nicotinici pentru acetilcolin, receptorii 5hidroxitriptamin (HT)3 pentru serotonin, receptori pentru acidul -aminobutiric GABAA i GABAc, i receptorii pentru glicin sensibili la stricnin [Chebib M, 2000]. Cei mai studiai i cel mai bine-nelei dintre aceti receptori sunt receptori GABA i cei pentru acetilcolin. Acetia se consider a fi compui pentamerici ai subunitilor de proteine i sunt caracterizai printr-un domeniu N-terminal extracelular mare. Cea de-a doua superfamilie de receptori, receptorii glutamatergici excitatori sunt abundeni n cele mai multe regiuni ale sistemului nervos central la mamifere. Din aceast superfamilie fac parte: receptorii pentru N metil-D-aspartat (NMDA), receptorii pentru acidul propionic -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol (AMPA) i receptorii kainat [Burnashev , 2000]. Receptorii nativi conin patru sau cinci subuniti care sunt asamblai ca homomeri, dublei sau triplete. Subtipul de receptori ATP P2x sunt membrii ai celei de a treia superfamilii, i au o distribuie larg n cadrul sistemului nervos central i sistemului cardiovascular.

85

3.1.2. Receptorii de suprafa cu activitate enzimatic Receptorii cu activitate enzimatic sunt legai de proteinele transmembrane prin domeniul de legare al ligandului de pe suprafaa exterioar a membranei plasmatice. Domeniul lor citosolic fie are o activitate enzimatic intrinsec, fie este asociat direct cu o enzim. Fiecare subunitate a unui receptor catalitic are doar un domeniu transmembranar. Cei mai importani receptori din aceast familie sunt receptorii tirozin kinazici i receptori asociai tirozin kinazei. Muli receptori cunoscui, cum ar fi receptorii factorului de cretere epidermic (EGF) [Leof, 2000], receptorii pentru insulin, receptorii pentru factorul de cretere derivat din trombocite (PDGF) i receptorii pentru factorul de cretere al endoteliului vascular (VEGF) aparin grupului de receptori tirozin kinazici [Simon, 2000]. Aceti receptori sunt singurii cu helixuri transmembranare care dimerizeaz dup legarea ligandului, excepia fiind cea a receptorului de insulin, ce este deja un dimer transmembranar [Cruce, 2000]. Dup dimerizare, are loc autofosforilarea receptorilor, care determin fosforilarea a mai multor tipuri de molecule de semnalizare la nivelul resturilor tirozin specifice. De exemplu, activitatea Ras este stimulat, i, astfel, nivelul de mesager secund crescut moduleaz factori de transcripie i alte proteine celulare. Receptorii tirozin kinazici joac un rol important n reglarea metabolismului celular, proliferarea i diferenierea celular.Receptorii pentru citokine aparin receptorilor asociai tirozin kinazei. Acetia prezint un domeniu extracelular de legare al ligandului, un singur domeniu transmembranar i un domeniu intracelular. Domeniul intracelular nu are activitate catalitic. Receptorii pentru interleukine sunt exemple de receptori asociai tirozin kinazei. Dup legarea ligandului, o tirozin kinaza asociat cu receptorul este activat prin fosforilare. Kinazele Src sau Jak sunt exemple de tirozin kinaze de acest tip. Activarea tirozin kinazei are ca rezultat fosforilarea proteinelor cu rol n transducia semnalului i activarea transcripiei (STAT) care acioneaz ca factori de transcriere. Mai mult dect att, receptorii serin/treonin kinazici mai sunt cunoscui sub numele de receptori cu activitate enzimatic de suprafa, fiind implicai n mai multe procese celulare, cum ar fi proliferarea, migrarea i diferenierea. Aceti receptori
86

conin o mic regiune extracelular, un singur domeniu transmembranar i o regiune citoplasmatic, care acioneaz ca o serin/treonin kinaz. Un reprezentant al acestei familii [Zhu, 2001] este receptorul factorului de cretere transformant (TGF)-. O alt familie de receptori celulari de suprafa cu activitate enzimatic sunt receptorii pentru guanilil/guanilat ciclaza. Receptorul pentru peptidul natriuretic atrial este cel mai cunoscut membru al acestei familii i catalizeaz formarea de GMPc. Efectele majore sunt natriureza, diureza i inhibarea sintezei de aldosteron. 3.1.3. Receptori cuplai cu proteina G (GPCRs) GPCRs reprezint cea mai mare i cea mai important familie de receptori transmembranari caracterizai prin secvene de aminoacizi, care conin apte domenii hidrofobe. Aceste domenii reprezint regiuni transmembranare ntinse ale proteinelor (7 domenii transmembranare) care au dat cel de-al doilea nume pentru aceast superfamilie - 7TM / receptorii n heptahelix [Lefkowitz, 2000]. La mamifere, aceast familie conine mai mult de 600 de membri. Ei sunt implicai ntr-un spectru larg de procese biologice care au rol n medierea semnalelor pentru o mare varietate de stimuli, cum ar fi hormoni peptidici (glucagonul, angiotensina, bradykinina), neurotransmitori (adrenalina, serotonina, dopamina), neuropeptidele (neuropeptidul Y), lumina i odorizantele. n consecin, ei joac un rol important n reglarea fiziologic, iar funcionarea lor defectuoas poate s induc numeroase boli. n general, ligandul se leag la GPCRs i produce o schimbare conformaional care conduce la asocierea de proteine G intracelulare. Aceste proteine G sunt membrii ai superfamiliei de GTP-aze ce sunt caracterizate printr-o compoziie heterotrimeric ce cuprinde subunitile , i . Clasificarea structural i funcional a proteinelor G - a fost definit de subunitile , n funcie de care pot fi mprite trei clase de proteine: Gs, Gi i Gq (fig. 3.1). Asocierea proteinei G la receptorul transmembranar provoac modificri conformaionale n proteinele G care faciliteaz eliberarea GDP i legarea GTP. Legarea GTP determin separarea subunitii de subunitile i (Cruce, 2000). Proteinele Gs cunoscute ca proteine G de stimulare, activeaz adenilil ciclaza (AC) care catalizeaz producerea
87

de mesager secund

AMPc. n schimb, proteina Gi

inhib AC, conducnd la

scderea nivelului de AMPc (fig. 3.1). Activarea proteinei Gq este urmat de stimularea fosfolipazei C (PLC) care induce producerea celui de-al doilea mesager secund diacilglicerolul(DAG) sau inozitol trifosfatul (IP3) (fig. 3.1), n timp ce Gq interacioneaz cu canalele de K. Activarea celui de-al doilea mesager conduce la o amplificare imens a semnalului [Marinissen i colab., 2001]. De exemplu, AMPc poate activa protein kinaza A (PKA), care stimuleaz fosforilarea altor proteine (fig. 3.1). n plus, se tie c subunitatea a proteinelor G poate activa proteina activatoare a mitozei (MAP) pe calea MAPK kinazei (fig. 3.1).

Fig. 3.1 Diagrama schematic a cilor de transducie a semnalului de la GPCR i a diferitelor ci ale mesagerilor secunzi care comunic cu elemente promotor nucleare. (AC, adenilil ciclaza; CRE, elementul de rspuns la AMPc; proteina de legare CREB; DAG, diacil glicerol, IP3, inozitol trifosfat; MAPK, protein kinaza mitogen activat; MEK, MAPK kinaza; NFAT, factor nuclear al celulelor T activate; NF-AT-RE, elementul de rspuns NF-AT; PKA, protein kinaza A; PKC, protein kinaza C; PLC, fosfolipaza C; PIP2, fosfatidilinozitol-4 ,5-bifosfat; SRE, element de rspuns seric; SRF,factor de rspuns seric; TPA, 12-O-tetradecanoilforbol - 13-acetat; TRE, TPA- elementul de rspuns).

88

Pe lng cile clasice, exist ci independente de proteina G, ceea ce nseamn c GPCRs poate activa molecule cum ar fi kinaza 2 legat la semnal extracelular (ERK) 2 sau STATS fr stimularea proteinei G [Cruce i colab., 2004]. GPCRs au fost clasificai n trei subfamilii: subfamilia rodopsinei (clasa 1), subfamilia calcitoninei (clasa 2) i subfamilia receptorilor pentru glutamatul metabotropic (clasa 3) [Beck-Sickinger, 1996]. Clasa 1 conine aproximativ 90% din toi GPCRs i se caracterizeaz printr-un segment N-terminal care este puternic glicozilat, i dispune de o punte disulfidic caracteristic ntre bucla 1 extracelular i bucla 2 extracelular. Odorizantele, peptidele i alte molecule mici, precum i multe glicoproteine se leag de receptorii familiei din clasa 1, cum ar fi receptorii pentru adrenalin, serotonin sau pentru neuropeptidul Y. Cel mai cunoscut membru din aceast familie este rodopsina, care confer ntreagii familii numele su. Structura cristalizat a rodopsinei a fost determinat de ctre Palczewski i colab. (2000). n principal, hormonii peptidici i neuropeptidele, cum ar fi secretina, glucagonul i calcitonina se leag de receptorii din familia GPCR din clasa 2. Acetia au un domeniu extracelular N-terminal mare, comun, care conine ase reziduri de cistein. Cel de-al treilea i, de departe, cel mai mic grup de GPCRs (clasa 3) se caracterizeaz printr-un domeniu uria N-terminal constituit din dou lobi care se nchid asemntor plantei Venus flytrap pe ligandul prins. Receptorii pentru glutamatul metabotropic i receptorii GABAb aparin acestei subfamilii de receptori. Mai muli receptori pentru liganzii de fungi i de plante au fost, de asemenea, caracterizai i clasificai n subtipuri speciale. GPCRs sunt proteine cheie n reglarea fiziologic i funcionarea lor defectuoas determin cteva boli,ale cror mecanisme au fost elucidate prin studii pe oareci GPCR knockout [Edwards i colab., 2001]. n prezent, GPCRs sunt intele pentru mai mult de 50% din actualii ageni terapeutici i, ca atare, industria farmaceutic, este interesat foarte mult de investigarea GPCRs [Sautel M, 2000]. n ceea ce privete dezvoltarea de noi medicamente, este important s se produc compui foarte specifici care se leag cu un nalt grad de afinitate i selectivitate de un anumit GPCR. Numai aceste caracteristici sunt garania eficienei terapeutice n special n ceea ce privete tolerabilitatea i specificitatea reaciilor adverse.
89

3.2. Afinitatea i activitatea liganzilor GPCR

Dup cum s-a menionat mai sus, GPCRs sunt inte pentru o varietate de medicamente, pentru c afinitatea i activitatea unui ligand pentru receptor trebuie s fie cunoscute n scopul producerii de noi medicamente. Afinitatea ca proprietate descrie aviditatea sau tenacitatea cu care un ligand se va leaga de receptorul su. De asemenea, activitatea numit eficacitate intrinsec, este proprietatea unui ligand de a produce un rspuns biologic. Potenialele medicamente ar trebui s aib o mare afinitate i selectivitate. O selectivitate nalt garanteaz o reducere a reaciilor adverse, iar o afinitate mare permite reducerea dozei de medicament. Liganzii naturali ai GPCR sunt adesea folosii ca ablon pentru design-ul medicamentelor i de aceea sunt generai noi liganzi cu structuri similare. Teste convenionale cu un radiotrasor sunt n general utilizate pentru a determina afinitatea unui ligand de un receptor. Toate celulele sau membranele celulare ce exprim GPCRs sunt incubate cu un ligand radiomarcat n prezena ligandului nemarcat care trebuie investigat. Sunt utilizate o concentraie constant de radiotrasor i diferite concentraii de ligand nemarcat. Dup ce se ajunge la echilibru, celulele sau membranele sunt separate de supernatant i radioactivitatea ligandului radiomarcat legat poate fi msurat cu un aparat de msurare. Radioactivitatea msurat este proporional cu concentraia de ligand radiomarcat, care se leag de receptor. Curba de legare poate fi determinat prin utilizarea de concentraii diferite de ligand nemarcat n prezena unui radiotrasor cu concentraie constant i valoarea IC50 poate fi obinut i transformat n valoare Ki conform ecuaiei Cheng-Prussof. Ki reflect afinitatea ligandului pentru GPCR, o valoarea Ki este cu att este mai mic, cu ct afinitatea este mai mare. Pentru a determina eficacitatea intrinsec a liganzilor, potenialul lor agonist sau antagonist, au fost introduse diferite teste care msoar activitatea proteinelor G sau mesagerilor secundari intracelulari dup legarea de ligand. Mesagerii secundari investigai depind de receptorii de activare a proteinelor G. Aceste metode sunt de cele mai multe ori mari consumatoare de timp i foarte costisitoare. Mai nti, este posibil s se msoare legarea GTP dup activarea receptorilor prin intermediul
90

ligandului. Celule sau membranele care exprim receptorii sunt incubate n prezena GTP-ului radiomarcat i ligandului cercetat. Radioactivitatea poate fi msurat dup separarea celulelor sau membranelor de supernatant. Valorile radioactivitii sunt corelate cu stimularea receptorilor care sunt asociai cu proteina G. Testele ELISA convenionale pot fi utilizate pentru a msura mesagerii secunzi ca: AMPc, GMPc, diacil glicerol sau IP3. Concentraia de AMPc mesager secund depinde de tipul de protein G activat i poate duce fie la creterea (Gs,) sau fie la scderea (Gi ) mesagerului secund. Determinarea semnalului de la nivelul celui deal doilea mesager este uneori foarte dificil pentru c nu toate celulele exprim optim proteine G sau mesagerul secund care este imediat degradat. Prin urmare, genele reporter n combinaie cu promotori speciali i elemente intensificatoare sunt folosite pentru a genera un set nou de tehnici. Dup legarea ligandulului la GPCR, este modulat concentraia de mesager secund, activitile enzimelor, i prin urmare legarea factorilor de transcriere de elementele intensificatoare. n consecin, expresia genelor reporter este dependent direct de activarea GPCR i de calea de transducie a semnalului activat. Semnalul rezultat este mai stabil i mai uor de cuantificat.

3.3. Rolul factorilor de transcripie n expresia genelor

Informaia necesar pentru sinteza unei anumite proteine este codificat n secvena de nucleotide din ADN. Aceste informaii trebuie s fie transcrise n ARN, molecula mesager, care apoi este tradus n citoplasm, de aparatul de sintez proteic. Enzime specializate, numite ARN polimeraze, catalizeaz procesul de transcripie al ADN-ului n ARN. ARN polimeraza II transcrie majoritatea genelor; cu toate acestea, multe alte proteine accesoare care interacioneaz cu polimeraza sunt eseniale pentru transcripia genelor. Numeroi factori de transcripie nucleari sunt cunoscui i rolul lor este, fie de a activa, fie de a inhiba expresia genelor [Brivanlou i colab., 2002]. Ei se leag de secvenele scurte cu semnificatie biologic, din regiunile de ADN dublu catenar, de lungimi variabile, de obicei 5-20 bp. Aceste secvene scurte sunt situate n amonte de promotorul de baz i, n general, sunt
91

specifice pentru un singur factor de transcripie sau pentru un membru al unei singure familii de factori de transcripie. Factorii de transcripie se pot lega ca monomeri, homodimeri sau heterodimeri la secvenele repetitive specifice. Dup legarea de situsul lor specific de legare, factorii de transcripie interacioneaz ntre ei, cu ARN polimeraza II i cu ali factori bazali pentru a regla expresia genei. n prezent, mai mult de 300 de factori de transcriptie au fost identificai n genomul vertebratelor. Activitatea unor factori de transcriere este modulat de fosforilarea lor. Dintre factorii de trascripie bine nelei i studiai menionm: proteina de legare a elementului de rspuns la AMPc (CREB), factorul de legare a elementului de rspuns seric, factorul nuclear al celulelor T activate (NF-AT), proteinele c-Jun i STAT. Situsurile de recunoatere a acestor factori de transcripie sunt adesea folosite n promotori pentru realizarea de sisteme de teste care utilizeaz genele reporter pentru investigarea GPCRs (fig. 3.1). 3.3.1. CREB (proteina de legare la elementul de rspuns la AMPc) CREB este implicat n calea AMPc. Dup activarea receptorilor cuplai cu proteina Gs, care regleaz pozitiv AC, nivel intracelular de AMPc este crescut. AMPc activeaz proteina kinaza A (PKA), care permite unitii catalitice a PKA s intre n nucleu unde fosforileaz CREB, pe serin n poziia 133. CREB fosforilat se leag de elementul intensificator al elementului de rspuns la AMPc (CRE). Transcrierea genelor linkate este activat dup legarea proteinei de legare CREB (CBP) la CREB. Stimularea GPCRs cuplai cu Gi scade AMPc intracelular i determin o reducere a transcripiei genei reporter CRE-linkat. 3.3.2. SRF Calea MAPK este o cale foarte important de semnalizare pentru receptorii tirozin kinazici i este necesar pentru fosforilarea SRF. SRF se leag la elementul de rspuns seric, la situsul de legare ADN prezent, de exemplu, n promotorul c-FOS, care conduce la transcrierea c-FOS, un alt factor de transcriere. Numai n combinaie cu factorul complexului ternar (TCF/Elk1), SRF se poate lega la SRE i activa
92

transcripia genei. Ambii factori de transcripie, SRF i TCF sunt activai prin fosforilarea MAPK. S-a artat c subunitile ale proteinelor Gi activeaz aceast cale, via activarea MAPK RAS-dependent. Stimularea MAPK via receptori cuplai cu Gq are n principal ca rezultat activarea protein kinazei C (PKC) [Cruce i colab., 2004]. 3.3.3. Proteinele STAT Proteinele care sunt factorii de transcriere STAT sunt activate dup stimularea receptorilor de citokine i receptorilor tirozin kinazici. n prezent, sunt cunoscute 6 proteine STAT (STAT1-STAT6). Dup activarea receptorilor prin legarea ligandului aceti receptori se asociaz cu tirozin kinaza JAK , care, la rndul su este fosforilat. Ulterior, JAK kinazele activate pot activa din nou proteinele STAT prin fosforilare, urmate de formarea dimerilor. Dimerii sunt translocai n nucleu i se leag de situsurile de legare ADN ale elementului de rspuns stimulate de interferon (ISRE), i este iniiat transcrierea genelor. Studii recente demonstreaz activarea i implicarea cii STAT3 n cile Gi i Go protein mediate [Ram , 2001]. 3.3.4. c-Jun Factorul de transcripie c-Jun este fosforilat de o protein kinaz, JNK (c-Jun-Nterminal kinaza), care este un membru nou al familiei MAPK. De asemenea aceast kinaz, fosforileaz factorul de transcripie ATF2. ATF2 i c-Jun constituie (TRE) n promotorul c-Jun. 3.3.5. NF-AT NF-AT este prezent ca factor de transcriere n limfocite i este indus de stimularea receptorului antigenic. NF-AT este fosforilat i situat n citoplasma celulelor n repaus. Controlul transcripiei mediat de NF-AT n limfocite este dependent de semnalizarea simultan prin Ca i MAPK care sunt activate dup
93

un

heterodimer, care se leag de situsul de legare ADN al elementului de rspuns TPA

stimularea receptorilor de antigen. Calea Ca activeaz calcineurin fosfataza. Calcineurina defosforileaz NF-AT i conduce la o translocare nuclear a NF-AT. Apoi, NF-AT se asambleaz ntr-un complex multimeric cu AP1 i se leag n amonte la un intensificator major al genei pentru citokina IL-2 dup care are loc transcripia genei. Izoforme distincte de NF-AT care se gsesc la oameni i oareci, sunt exprimate n celulele nonlimfoide.

3.4. Genele reporter

O gen reporter este o secven de ADN, al crei produs este sintetizat ca rspuns la activarea cascadei de semnalizare investigat. Expresia genelor reporter poate fi controlat de elemente intensificatoare, i situsuri de legare pentru factorii de transcripie specifici. Alegerea unei gene reporter specifice, depinde de urmtoarele condiii: linia de celule utilizat pentru experimente; activitatea endogen din fiecare celul este diferit i este important s demonstrm c linia de celule utilizat nu exprim gena reporter aleas; natura experimentului, deoarece trebuie s fie utilizate gene reporter diferite pentru investigarea dinamicii expresiei genei i a eficienei transfecei n acelai experiment; alegerea genei reporter depinde de asemenea, de metoda de detecie. Genele reporter au caracteristici speciale. Ele sunt caracterizate printr-o secven definit de nucleotide, activitate de fond sczut, sensibilitate mare i rspunsul care trebuie s fie uor de detectat fenotipic. n scopul de a efectua msurtori, activitatea genelor reporter trebuie s fie cantitativ, rapid, uoar, reproductibil i sigur. Metodele de msurare care sunt folosite de cele mai multe ori sunt msurtori de radioactivitate, fluorescen, luminiscen i colorimetrie. Semnalul genelor reporter trebuie s fie semnificativ peste activitatea bazal care depinde de chimia reporterului, linia de celule utilizat, sensibilitatea instrumentelor i interferenele activitilor chimice.

94

Sisteme genetice reporter au fost elaborate cu scopul de a studia expresia i reglarea genelor de la eucariote. Mai mult, ele sunt utilizate pentru studiul promotorului i secvenelor intensificatoare, mediatorilor cum ar fi factorii de transcripie, procesarea ARNm i translaia. De asemenea, sistemele de gene reporter sunt aplicate pentru a monitoriza eficiena transfeciei i pentru a studia interaciunea protein-protein, localizarea subcelular a proteinelor i de asemenea indicatorii activitii transcripionale n celule. n zilele noastre, sistemele de gene reporter au aplicaii n screeningul biologic pentru descoperirea de noi medicamente [high-throughput screening = screening de mare capacitate (HTS)] [Goetz i colab., 2000], pentru investigarea cilor de semnalizare i n terapia genic. Acestea sunt, de asemenea utilizate pentru investigarea interaciunilor receptor-ligand, n special pentru investigarea GPCRs. Sunt cunoscute mai multe gene reporter, de exemplu, cloramfenicol acetiltransferaza (CAT), -galactozidaza (-Gal), -glucuronidaza, fosfataza alcalin (AP), fosfataza alcalin secretat (SEAP), -lactamaza, luciferaza i proteina fluorescent verde (GFP). Avantaje i dezavantajele lor sunt prezentate n tabelul 3.1. Unele din aceste gene reporter sunt utilizate pentru investigarea GPCRs. 3.4.1. CAT CAT a fost prima gen reporter utilizat pentru a monitoriza activitatea transcripional n celule. CAT a fost izolat din Escherichia coli i este o protein trimeric care este format din trei subuniti identice, fiecare cu o greutate molecular de 25 kDa [Leslie i colab., 1988]. n celulele de mamifere, proteina CAT este relativ stabil, i fr transfecie nu exist exprimare endogen. CAT are proprietile necesare pentru a fi utilizat n teste tranzitorii concepute, pentru a investiga acumularea proteinelor exprimate. Reacia enzimatic natural a CAT, transferul gruprii acetil de la acetil-CoA la poziia 3-hidroxil a cloramfenicolului, este utilizat pentru a efectua teste reporter. Acetil-CoA radiomarcat permite transferul de acetil radiomarcat la substratul de cloramfenicol.
95

Produii formai pot fi determinai prin separare fizic utiliznd cromatografia n strat subire (TLC). TLC separ substratul i produsul, radioactivitatea putndu-se observa prin expunerea plcii de TLC pe filme de radiografie sau prin fosfoimagini. Metoda TLC permite vizual confirmarea reaciei. Cuantificarea este posibil prin rzuirea spoturilor, TLC, extragerea cu un solvent organic i numrarea probelor cu un dispozitiv de numrare pe baz de scintilaie. Alte teste izotopice se bazeaz pe extracia organic direct a celor mai muli produi nepolari. Alternativ, anticorpii mpotriva CAT sunt acum disponibili i ei permit cuantificarea prin Western blotting sau ELISA.
Tabelul 3.1. Comparea celor mai frecvent utilizate gene reporter Gena reporter Cloramfenicol acetiltransferaza (CAT) Avantaje - fr expresie endogen n celule mamiferelor - confirmarea vizual a activitii enzimei - formate de teste variate pentru utilizare cu extract celular - uor de testat Dezavantaje - costuri ridicate pentru izotopi i sisteme TLC - radioactivitate - liz celular - substraturi suplimentare - teste colorimetrice nu foarte sensibile - activitate endogen n anumite tipuri de celule - liz celular - activitate endogen n celulele mamiferelor - liz celular - activitate endogen n celulele mamiferelor - teste colorimetrice nu foarte sensibile - liz celular - adiie de substrat

-Galactosidase ( -Gal)

-Glucuronidaza

- formate de teste variate

Fosfataza alcalin (AP) - formate de teste variate - uor de testat - necostisitor

Fosfataza alkalin secretat (SEAP) Luciferaza

Proteina fluorescent verde (GFP)

- protein secretat - formate de teste variate - sensibil (teste fluorimetrice) - rapid i uoar - de mare sensibilitate - fr activitate endogen - variante GFP pot fi detectate n aceeai celul - investigaii n celule vii - autofluorescen (nu necesit substrat)

- liz celular - adiie de substrat - protein relativ stabil - cititor fluorescent sensibil

96

3.4.2. -Gal -Gal este o enzim bacterian bine caracterizat i este compus din patru subuniti, fiecare cu o greutate molecular de 116 kDa. Cataliza hidrolizei zaharurilor de -Gal cum ar fi lactoza este raportat ca un test funcional. Activitatea enzimatic din extractele celulare poate fi analizat cu diferite substraturi speciale, care s permit cuantificarea activitii enzimei cu un spectrofotometru, fluorimetru sau luminometru. De asemenea, au fost dezvoltate metode de colorimetrie simpl cu o-nitrofenilBD-galactopiranozid (ONPG) sau clorofenol rou BD-galactopiranzoid (CPRG) [Eustice i colab., 1991]. Metodele colorimetrice, care nu sunt foarte sensibile i au doar o gama dinamic ngust, au fost nlocuite n mare parte cu metode fluorescente sau luminiscente mai sensibile. Substraturi, cum ar fi -metil umbeliferil galactozidul i fluorescein digalactozidul (FDG) pot fi folosite pentru teste bazate pe fluorescen, iar 1,2-dioxetanul pentru teste pe baz de luminescen. Testele reporter cu galactozidaz sunt larg utilizate, n special pentru a monitoriza eficiena transfeciei. 3.4.3. -Glucuronidaza -Glucuronidaza este o glicoprotein tetrameric de la E. coli, format din patru subuniti identice de 68 kDa, localizate n special n mediul acid al lizozomilor. Enzima nltur rezidurile de acid -glucuronic terminale de la captul neredus al glicozaminoglicanilor i altor glicoconjugai. Teste colorimetrice ce pot fi detectate prin spectrofotometrie, au fost elaborate cu scopul de a msur activitatea acestei enzime. Metodele chemiluminescente au fost create pentru mbuntirea sensibilitii. -glucuronidaza este de cele mai multe ori folosit pentru investigaii la plante superioare, i din cauza activitii sale endogene n unele celule de mamifere [Paigen, 1989]. 3.4.4. AP (fosfataza alcalin) AP este o protein relativ stabil i care la pH alcalin defosforileaz o gam larg de substraturi . Metode spectrofotometrice standard se bazeaz pe hidroliza p97

nitrofenil fosfatului (PNPP) de AP. Acest test este ieftin, rapid i simplu, dar i lipsete sensibilitatea obinut prin alte metode. O metod bioluminescent n 2 trepte a fost elaborat cu scopul de a mbunti sensibilitatea. n aceast abordare cu dou etape, mai nti AP hidrolizeaz d-luciferin-O-fosfatul la d-luciferin, care servete n cea de a doua etap ca un substrat pentru luciferaz. Dei sensibilitatea este mult mai mare, manipularea este mai puin convenabil. Ca o alternativ a fost dezvoltat o metod chemiluminescent pentru detecia AP ntr-o singur etap [Schaap , 1989]. 3.4.5. SEAP (fosfataza alcalin secretat) SEAP este o form mutant de AP placentar uman, creia i lipsesc 24 de aminoacizi la captul C-terminal al proteinei. Eliminarea acestor aminoacizi mpiedic ancorarea enzimei la membrana plasmatic, i, n consecin, este secretat de celule i poate fi detectat prin prelevarea de probe din mediu de cultur [Berger i colab., 1988]. Celule rmne intacte i viabile pentru experimente ulterioare. SEAP poate fi uor detectat prin hidroliza p-nitrofenol fosfatului, care determin o schimbare de culoare. Aceast modificare poate fi cuantificat. Metodele chemiluminescente pot fi, de asemenea, utilizate n plus fa de metodele colorimetrice. Un avantaj major al SEAP este stabilitatea la cldur a enzimei i la L-homoarginina fosfataz inhibitoare. Prin urmare, celulele lizate pot s fie tratate cu cldur sau L-homoarginin pentru a inactiva activitatea bazal a AP , n celule n care poate a intrat n mediul de cultur. Astfel, activitatea bazal observat cu sisteme reporter AP este, n principal, eliminat cu sistemul SEAP. Asocierea de proteine reporter secretate, cu activitate de fond puin endogen, precum i cu o varietate larg de teste uoare i sensibile fac din SEAP un sistem convenabil i flexibil. 3.4.6. -lactamaza Proteina lactamaza (penicilin amido- -lactamhidrolaza) este o protein monomeric de 29-kDa, izolat din E. coli. Aceast enzim are activitate esterazic i funcia sa natural este clivarea ampicilinei i altor antibiotice, de exemplu, penicilina
98

i cefalosporina. lactamaza este produs industrial n trei forme: secretat, citosolic i asociat membranei plasmatice [Moore i colab., 1987]. n consecin, activitatea enzimei poate fi analizat din extracte celulare sau, atunci cnd este secretat, direct din mediu. Metode colorimetrice sunt aplicate pentru msurtori, de exemplu pentru substraturi ca nitrocefin sau (PADAC) [acid 3 -(2,4-dinitrostiril)-(6R, 7R)-7-(2tienilacetamido)-cef-3-em-4-carboxilic] i schimb culoarea dup reacia cu lactamaza. Activitatea enzimei cu PADAC ca substrat este monitorizat prin scderea absorbanei la 570 nm i cu nitrocefin prin creterea absorbanei la 570 nm. Recent, un substrat fluorescent foarte sensibil pentru -lactamaz a fost dezvoltat ca un ester membranar permeabil, care ar putea fi aplicat pentru a monitoriza expresia genei la o singur celul vie. Acest substrat fluorogenic CCF2/AM este o cefalosporin derivat, ataat la doi fluorofori. n cazul n care substratul fluorogenic este intact, fluorescena cu transfer de energie prin rezonan (FRET) apare ntre cei doi fluorofori [Zlokarnik i colab., 1998]. n cazul n care substratul este de clivat de ctre -lactamaz, cele dou pri fluorescente ale moleculei sunt separate i efectul FRET este ntrerupt. Schimbarea lungimi de und rezultat este detectabil n suspensie celular folosind sortarea celular pe baz de fluorescen, n monostraturile celulare utiliznd cititoare de plci conveninale iar n celule individuale utiliznd microscopia confocal. Tehnicile de gene reporter cu lactamaz sunt foarte sensibile, la utilizarea acestui substrat fluorogenic, dar i costisitoare. 3.4.7. Luciferaza Luciferaza se refer la o familie de enzime care catalizeaz oxidarea de substraturi diferite ca luciferina i coelenterazina, ceea ce conduce la emisie de lumin. Lucifereazele cunoscute sunt luciferaza bacterian, luciferaza Firefly (Photinus pyralis) (firefly = gndac nocturn din America tropical care produce lumina, corpul este luminiscent datorita organelor abdominale), i mai recent, luciferaza renilla din panseaua de mare bioluminiscent, Renilla reniformis.
99

Luciferazele bacteriene sunt, n general, proteine dimerice labile termic. n consecin, aplicarea lor ca gene reporter n celulele de mamifere este limitat. Cea mai cunoscut luciferaz este luciferaza firefly. Acest enzim de 60kDa, o monooxigenaz, catalizeaz o reacie utiliznd D-luciferin i ATP, n prezena oxigenului i Mg, conducnd la emisie de lumin [Branchini i colab., 2001]. Valoarea total a luminii msurate ntr-un anumit interval de timp este proporional cu activitatea luciferazei din prob. Structura cu raze X a acestei luciferaze, descoperit n 1996, a evideniat c arginina din pozitia 218 constituie situsul de legarea al luciferinei. Mai recent, au fost dezvoltai reactivi care prelungesc timpul de njumtire a flash-ului. Prelungirea luminii produse crete sensibilitatea testului i asigur o mai mare durat de njumtire a luminiscenei i, astfel, o perioad mai lung de msurare. Luciferaza din R. reniformis [Lorenz i colab., 1996] catalizeaz oxidarea coelenteramidei i este de cele mai multe ori folosit n formate de testare cu luciferaze duale. Aceste teste permit msurarea ambelor luciferaze firefly i renilla din acelai extract celular. Prin urmare, luciferaza firefly poate fi folosit ca gen reporter i luciferaza renilla ca un standard intern pentru a cuantifica eficienei transfeciei [Parsons i coalb., 2000]. Luciferaza firefly, este utilizat de cele mai multe ori pentru studiul reglrii promotorului i efectelor reglatoare ale agenilor ce cresc AMPc. n prezent, luciferaza rmne n continuare reporterul ales pentru msurtorile dinamice ale expresiei genelor, datorit sensibilitii nalte i duratei de njumtire a vieii, relativ scurt. Aceasta a permis, de exemplu, investigarea ritmurilor circadiene la plante. Mai mult dect att, tehnici de gene reporter cu luciferaza firefly au fost generate pentru investigarea GPCRs i pentru identificarea receptorilor agoniti i antagoniti. Acest sistem este foarte popular n industria farmaceutic i este utilizat pentru HTS.

100

3.4.8. Proteina fluorescent verde (GFP) GFP din petele jeleu Aequorea victoria este o fotoprotein cu 238 amino-acizi care emite lumin verde, cu o emisie maxim la 509 nm dup excitarea la 488 nm [Tsien, 1998]. ADNc a fost clonat n 1991 i structura cristalin identificat n 1996 [Ormo, 1996]. GFP are marele avantaj c este un fluorescent natural, care nu are nevoie de oricare alte substraturi, iar fluorescena nu este specific speciei. Mai mult dect att, GFP poate fi folosit n celulele vii i pentru producerea de proteine de fuziune. Cromoforul activ din GFP, necesar pentru fluorescen, este un hexapeptid care conine un trimer ciclizat Ser-dehidroTyr-Gly [Fukuda, 2000]. Acest cromofor este situat n centrul proteinei, a crei structur este menionat ca o posibil structur . Mutaii n cromoforul activ al alelei GFP de tip slbatic a condus la dezvoltarea de variante GFP cu fluorescen verde mbuntit. Au rezultat trei variante mutante: proteina fluorescent albastru-glbuie (PCP), proteina galben fluorescent (YFP) i o protein albastru fluorescent (BFP). Expresia GFP poate fi monitorizat direct n organismele vii, ca i n celule. Alte avantaje sunt stabilitatea termic, pH-ul extrem i denaturanii chimici. n ultimii ani, mai multe proteine de fuziune cu GFP au fost construite pentru a investiga proteinele de transport i localizarea lor [Welsh, 1997]. Imaginea expresiei genei este uor de realizat datorit proprietilor GFP [Chalfie, 1994]. Dezvoltarea GFP i a variantelor sale spectrale permit urmrirea simultan a diferitelor proteine la celulele vii. Mai mult, investigarea interaciunii protein-protein este posibil cu ajutorul tehnicii FRET, pentru c GFP i variantele sale pot fi utilizate ca perechi FRET [Sorkin, 2000]. S-au efectuat experimente cu proteine de fuziune GFP pentru a investiga reglarea GPCR. GFP a fost de asemenea utilizat pentru a genera sisteme de teste de gene reporter pentru investigarea GPCRs. Dinger i Beck-Sickinger (2002) au identificat agonitii i au determinat afinitatea ligandului.

101

3.5. Sisteme de teste bazate pe gene reporter pentru investigarea GPCRs

n ultimii ani, sisteme de teste bazate pe gene reporter au fost dezvoltate pentru investigarea GPCRs, sisteme care ofer o alternativ la testele biochimice convenionale, cum ar fi testele de competiie i testele AMPc. Acum este posibil investigarea cilor de transducie a semnalului de la nivelul receptorilor de la suprafaa celulelor pn la transcripia genelor nucleare n celule. Prin utilizarea aceste sisteme de testare poate fi uor msurat schimbarea mesagerului secund dup activarea GPCR prin creterea sau scderea exprimrii genei reporter. Pn acum nivelul intracelular de mesager secund trebuia s fie detectat prin metode metabolice speciale, dificile tehnic, incomode, consumatoare de timp i de cele mai multe ori costisitoare. Dezvoltarea vectorilor de gene reporter cu o secven promotor i o secven gen reporter este esenial n scopul de a investiga GPCRs cu un sistem de teste pe baz de gene reporter. Alegerea promotorului depinde de natura cii de semnalizare pentru GPCR studiat, i determin sensibilitatea i specificitatea reporterului. Situsurile ADN de legare ale factorilor de transcripie, numite elemente intensificatoare sunt utilizate n combinaie cu un promotor de baz care controleaz transcripia genei reporter. n consecin, calea pentru GPCR studiat trebuie s fie cunoscut (fig. 3.1). Dezavantajul promotorilor naturali, cum ar fi c-FOS este c trebuie s conin situsuri de legare pentru un numr de factori de transcripie i, astfel, reglarea unor astfel de promotori depinde de mai muli factori de transcripie. Cu scopul de a genera teste pe baz de gene reporter pentru o singur cascad de semnalizare, au fost construii promotori sintetici care conin numai un singur tip de situsuri pentru legarea factorilor de transcripie. Secvenele promotorilor sintetici cele mai cunoscute pentru investigarea GPCRs cuprind: elemente CRE, elemente SRE, elemente TRE i elementul intensificator NF-AT; promotorul natural c-FOS, situsul de legare AP1 i secvena activatoare GAL4 . Datele publicate demonstreaz c luciferaza este cea mai
102

popular gen reporter pentru investigarea GPCRs. n plus, punerea n practic a lactamazei i SEAP este, de asemenea, posibil. Recent, a fost prezentat o GFP ca gen reporter pentru investigarea GPCRs , care prezint unele avantaje fa de alte gene reporter menionate. 3.5.1. Aplicarea luciferazelor ca gene reporter Luciferaza firefly (vezi 3.4.7) este cea mai utilizat gen reporter pentru investigarea GPCRs [Stratowa i colab., 1995]. Gena pentru luciferaz este asociat cu diferite elemente promotor cum ar fi: elementele CRE, elementele TRE, promotorul c-FOS i elementul intensificator NF-AT. Elementul intensificator CRE este folosit pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gs i Gi. Prin urmare, expresia luciferazei este reglat de creterea sau scderea AMPc. Dup stimularea receptorilor cuplai cu Gs, urmeaz o cretere a nivelului de AMPc. AMPc determin fosforilarea CREB urmat de creterea expresiei luciferazei. n scopul de a efectua teste cu receptori cuplai cu Gs, testele sunt de obicei, efectuate n prezen de forskolin, un stimulator al AC, care crete nivelul de AMPc, astfel nct inhibiia este mai uor detectabil. Stimularea forskolinei este msurat n paralel (fig. 3.2). Himmler i colab. (1993) a utilizat sisteme de teste pe baz de gene reporter cu CRE i luciferaza pentru a investiga receptorii dopaminergici D1 i D5 la om, ambii receptori fiind cuplai cu Gs. Ei au observat o cretere a expresiei luciferazei dup stimularea cu forskolin sau cu agoniti ai dopaminei. Identificarea compuilor agoniti sau antagoniti a fost o reuit. Un test similar a fost aplicat pentru investigarea comportamentului de legare a diferiilor liganzi de serotonin, receptori 5-HT1B i receptori C1A de calcitonin [George i colab., 1997]. De asemenea, luciferaza n asociere cu CRE este folosit n industria farmaceutic pentru realizarea unor screeninguri de mare capacitate (HTSs). Punerea n aplicare a acestui sistem a fost raportat de diferite grupuri care au stabilit teste pentru investigarea rapid i sensibil a receptorilor cuplai cu Gi i Gs. Testele

103

pentru screeningurile de mare capacitate sunt realizate de cele mai multe ori n microplci.

Fig. 3.2. Sisteme de teste bazate pe gene reporter ce utilizeaz elemente CRE i luciferaza pentru investigarea GPCRs. Celulele ce coexprim GPCR, cuplai fie cu Gs, fie cu Gi au fost incubate cu ligandul. Dup ce are loc stimularea sau inhibarea AC se produce o cretere sau respectiv, o scdere a AMPc. O cretere a nivelului de AMPc conduce la activarea PKA, care activeaz prin CREB fosforilarea. Forma fosforilat a CREB interacioneaz cu elemente CRE. Ulterior, este iniiat transcripia luciferazei. Pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gi, celulele trebuie s fie incubate cu ligandul n prezena forskolinei. Luciferaza este exprimat n citoplasm, i activitatea poate fi msurat dup liza celulelor i adugarea substratului, de exemplu luciferin luciferaza. O activitate mare a luciferazei cauzeaz o luminiscen puternic. Activitatea luciferazei poate fi corelat cu activitatea ligandului care activeaz GPCR. (AC, adenilil ciclaza; CRE, elementul de legare AMPc; CREB, proteina de legare CRE; G, proteina G.)

Cu scopul de a investiga receptorii cuplai cu Gs, Gi i Gq prin acelai sistem de teste, elemente CRE au fost combinate cu elemente MRE. De asemenea, acest sistem permite investigarea receptorilor cuplai cu Gq [Fitzgerald i colab., 1999]. Aceast regiune promotor poate rspunde la creterea intracelular de calciu, pentru a stimula PKC i pentru a schimba nivelurile de AMPc. Rspunsul poate fi msurat prin creterea sau scderea activitii luciferazei, i este util pentru
104

caracterizarea farmacologic a agonitilor i antagonitilor. Parsons i colab. (2000) au utilizat luciferaza firefly i renilla n asociere cu CREs pentru investigarea receptorilor factorilor 1 i 2 umani de eliberare a corticotropinei (CRFR1 i CRFR2). De asemenea s-a reuit identificarea agonitilor i antagonitilor. n scopul de a investiga receptorii a cror ci de transducie a semnalului modific nivelul intracelular de AMPc sau nivelurile IP3/DAG, s-a fost folosit ca sistem pentru testele celulare o gen, luciferaza cu elemente TRE ca promotor. Acest sistem a permis caracterizarea receptorilor diferitelor neurokinine NK1, NK2 i NK3. Mai mult dect att, un alt sistem ce folosete luciferaza i elemente TRE a fost dezvoltat pentru de screeningul liganzilor [Kotarsky i colab., 2001]. Sistemul a fost, de asemenea, cuplat cu GFP, n scopul de a selecta celulele care exprim stabil sistemul reporter. Aceste celule au fost folosite pentru investigarea GPCRs. Agonitii i antagonitii receptorilor hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH receptorii) au fost investigai cu succes, cu un sistem de teste bazat pe gene reporter pentru luciferaz n combinaie cu promotorul C-FOS. Receptorii GnRH sunt cuplai la calea inozitol-fosfolipid i, dup activarea receptorului, transcripia genei luciferaza este indus de promotorul c-FOS. 3.5.2. Utilizarea altor gene reporter pentru investigarea GPCRs De asemenea s-a raportat utilizarea lactamazei i SEAP pentru investigarea GPCRs. Xing i colab. (2000) au realizat un sistem de teste bazat pe gene reporter cu lactamaza ca gen reporter, n combinaie cu promotorul NF-AT [Xing H i colab., 2000] i l-a folosit pentru a investiga GPCRs care sunt cuplai cu proteinele Gq. Schimbarea concentraiei mesagerului secund ar putea fi detectat prin creterea expresiei lactamazei. Pollok i colab. (1999) au folosit, de asemenea, acest sistem, pentru a investiga receptorii cuplai cu proteina Gi. Pentru a efectua aceste teste, semnalul proteinei Gi a fost convertit n semnal de la protein Gq i activitatea lactamazei a putut fi msurat. Liganzi DP i PE pentru receptorii prostanoizi GPCRs au fost caracterizai prin tehnica CRE-SEAP [Durocher i colab., 2000]. Activarea receptorilor ar putea fi
105

detectat prin schimbarea nivelurilor intracelulare ale SEAP. Un dezavantaj important de msurare a activitii luciferazei i lactamazei l constituie necesitatea de a pregti extracte de celule i de a aduga un substrat. Aceste celule nu pot fi utilizate pentru o analiza ulterioar, iar prepararea celulelor lizate este consumatoare de timp, adiia unui substrat putnd perturba sistemul celulelor sensibile. n consecin, un sistem de teste pe baz de gene reporter cu elemente CRE i GFP ca gen reporter a fost dezvoltat pentru investigarea GPCRs pentru celule vii (fig. 3.3). Avantajul acestui sistem l constituie faptul c adugarea substratului nu este necesar i nu necesit liza celulelor.

Fig. 3.3. Sisteme de teste bazate pe gene reporter utiliznd GFP i CREs pentru investigarea GPCRs. Cu ajutorul vectorului de gen reporter ce conine GFP i CRE are loc transfecia n celulele care exprim o GPCR, fie o Gs sau Gi cuplat. Dup legarea ligandului este indus stimularea sau inhibarea AC, ceea ce determin o cretere sau o scdere a AMP. O cretere a nivelului de AMPc duce la activarea PKA care activeaz CREB prin fosforilare. Forma fosforilat a CREB se leag acum la elementele CRE. n consecin, transcripia GFP este iniiat. Pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gi, celulele trebuie s fie incubate cu un ligand n prezena forskolinei. GFP este exprimat n citoplasm i poate fi msurat n mod direct n celule n via, folosind un cititor de fluorescen. Liza celulelor sau adiia substratului nu este necesar (AC, adenilil ciclaza; CRE, elementul de legare AMPc; CREB, proteina de legare CRE; G, proteina G; GFP, proteina verde fluorescent) 106

Diferii vectori cu gene reporter cu prezint un numr crescut de elemente CRE (4, 8 i 12) au fost clonai pentru stabilirea acestui sistem nou. Studiile au demonstrat c sensibilitatea acestui test a fost dependent de numrul de CREs vectorul cu 12 elemente CRE a furnizat cele mai semnificative date. Acest sistem poate fi, de asemenea, aplicat la celulele vii i a fost folosit pentru investigarea receptorului NPY Y5, o Gi cuplat cu GPCR. Receptorul NPY activat de ligand determin o scdere a nivelului de AMPc i, n consecin, o expresie sczut a GFP (fig. 3.3). S-a determinat expresia dependent de doz a neuropeptidului Y i valoarea EC50 gsit a fost comparabil cu valoarea EC50 obinut prin teste de competiie. Acum, un astfel de sistem este disponibil i el ne permite efectuarea de msurtori ntr-o singur celul. Pentru prima oar GFP a fost folosit ca gen reporter n teste pentru investigarea GPCR cuplai cu Gi. n plus, noul sistem de teste bazat pe gene reporter are unele caracteristici unice, care l fac superior oricrui alt test. Datele prezentate arat c testul este cel puin la fel de sensibil ca testul pentru luciferaz. n celulele vii, analiza este mai rapid i mai uoar, fr tulburarea sensibilitii sistemului celular. n afar de investigarea GPCRs, sistemele de teste bazat pe gene reporter pot fi folosite, de asemenea pentru a investigarea cilor de transducie a semnalului. Fiecare treapt a cii de transducie a semnalului poate fi perturbat, iar efectele pot fi uor msurate. Deoarece producerea de gene reporter este punctul final al unei ntregi cascade de semnalizare, funcionalitatea fiecrui pas al cii de semnalizare poate fi descifrat. n plus, este posibil s se determine care reactiv poate influena calea de transducie a semnalului, iar prin utilizarea sistemului de teste bazate pe gene reporter GFP fiecare pas al semnalului de transducie poate fi cu uurin detectat. Dup investigare celulele sunt nc n via i pot fi utilizate pentru alte analize. n general, sistemele de teste bazate pe gene reporter sunt sisteme convenabile i uor de detectat pentru investigarea GPCRs (Tabelul 3.2), dar i pentru ali receptori ca receptorii tirozin kinazici. n consecin, aceste sisteme reprezint oportuniti pentru screening-ul rapid al liganzilor i pentru investigarea interaciunii
107

receptor-ligand. Mai mult, investigarea i caracterizarea receptorilor orfani este mult mai uoar, iar evidenierea liganzilor lor naturali este accelerat.
Tabelul 3.2 Aplicaiile i limitrile testelor pentru genele reporter Aplicaiile testelor de gene reporter Probleme i limitri Identificarea agonitilor GPCR Studii farmacologice pe celulele vii Identificarea cilor mesagerilor secunzi de la receptor la nucleu Screening de medicamente de mare capacitate Identificarea receptorilor orfani i a Liganzilor Aparatura sensibil pentru msurtori Dezvoltarea unui sistem de testare adecvat Transfecia celulelor Nu toate sistemele sunt disponibile comercial

Cu toate acestea, interpretarea datelor din testele pentru genele reporter necesit unele precauii. Testele pentru genele reporter necesit o incubaie de 4-6 h pentru exprimarea produsului genei reporter i expunerea la unii agoniti ai GPCRs pentru aceast perioad de timp determin desensibilizarea receptorilor i pot induce o schimbare a valorii EC50. De asemenea expresia bazal a produsului genei reporter poate determina o serie de probleme. Pentru a nltura acest impediment, celulele trebuie s fie investigate pentru expresia lor endogen i o gen reporter potrivit trebuie s fie selectat. Avnd n vedere c produsul genei reporter este punctul final al ntregii cascade de semnalizare, exist de asemenea multe posibiliti pentru interferene cu cile de semnalizare de la alte surse. De exemplu, activitatea reporterului CRE poate fi, de asemenea, activat de ser. Ligandul poate activa n aval ali componeni ai cascadei de semnalizare care pot influena citirea reporterului. Cercetatori trebuie s fie contieni de aceste probleme care pot fi detectate prin feed-back negativ. n concluzie, testele de gene reporter sunt instrumente valoroase pentru investigarea GPCRs. Aceste teste sunt rapide, sigure, comode, simple i ieftine. Determinarea activitii ligandului este posibil i aceste teste reprezint un ajutor extraordinar n cutarea continu de noi medicamente.

108

CAPITOLUL 4 DE LA GENOMUL UMAN LA NOILE MEDICAMENTE: POTENIALUL RECEPTORILOR ORFANI CUPLAI CU PROTEINELE G 4.1.Introducere
Secvenierea iniial a genomului uman, completat de Proiectul Genomului Uman i Celera [Venter i colab., 2001] a stimulat comunitatea biomedical oferind numeroase oportuniti pentru nelegerea bolilor umane i pentru dezvoltarea de terapii medicamentoase inovatoare. Funcionarea anormal a anumitor celule n unele pri ale corpului uman determin apariia unor maladii. Funcionarea celulelor este n principal reglat de o varietate de semnale chimice care sunt eliberate de ctre diferite tipuri de celule care controleaz funciile organismului uman. Dup legarea mesagerilor chimici la receptori specifici exprimai de celulele int, receptorii vor fi activai i vor iniia diferite semnale n celule, determinnd modificri n funcionarea lor. Medicamentele afecteaz funcia celular prin interaciunea cu receptorul, mimnd sau blocnd legarea receptorului de ligand i, prin urmare, controlnd procesul bolii. n acest capitol, pentru a nelege importana secvenializrii genomului uman n descoperirea medicamentelor, ne vom focaliza pe producerea medicamentelor legate de receptorii cuplai cu proteina G (GPCRs). Programele pentru descoperirea medicamentelor, a mai multor companii farmaceutice, s-au concentrat asupra superfamiliei GPCR. De ce ? pentru c aceti receptori sunt o clas foarte util pentru intele medicamentelor i aproximativ 50% dintre produsele farmaceutice comercializate n prezent au ca int GPCRs. n multe boli, GPCRs sunt cunoscui sub numele de ''inte validate'', de exemplu liganzii ce interacioneaz cu GPCR sunt cunoscui pentru c pot induce anumite boli la om. n tabelul 4.1. se prezint cteva exemple de medicamente ce au int GPCRs i se subliniaz importana i frecvena utilizrii lor.
109

Analiza bioinformatic a secvenelor genomului uman a evideniat mai multe sute de noi membri ai familiei GPCR. Cum GPCRs este una dintre cele mai importante familii int pentru descoperirea medicamentelor n industria farmaceutic, este de ateptat ca diferii receptori noi identificai s ofere un potenial similar i de asemenea s se dovedeasc c sunt inte bune pentru medicamente [Jensen i colab., 2001]. Aici, vom trece n revist etapele care n cele din urm, traduc gene umane identificate ce codific GPCR pentru medicamente int validate.
Tabelul 4.1 Principalele medicamente care au drept int GPCRs GPCR int Receptor pentru acetilcolin Terapie Diciclomin (Bemote) Indicaie Sindrom de intestin iritabil Ipratropium (Atrovent) COPD Tiotropium (Spiriva) COPD Atenolol (Tenormin) Timolol (Timuptol, Inderal) Salmeterol (Albuterol) Albuterol (Ventolin) Doxazosin (Cardura) Carvedilol (Coreg) Clonidina Propranolol (Inderal) Terazosin (Hytrin) Receptorul angiotensinei II Receptor pentru histamin Receptorul pentru leukotriene Receptor opioid Losartan (Cozaar) Eprosartan (Teveten) Cetirizin, Loratadin Cimetidin, Ranitidin Pranlukast (Onon) Zafirlukast (Accolat) Buprenorfin Butorfanol Alfentanil (Alfenta) Morfin (Roxanol) Subtip GPCR Antagonist M1 Antagonist M3 Antagonist M1/M3

Adrenoreceptor

Hipertensiune Antagonist 1 Glaucom/Hipertensiune Antagoniti amestecai Astm Agonist 2 Astm Agonist 2 Hipertrofie de prostat Antagonist 1 Antihipertensiv Insuficien cardiac 1/2/1 congestiv, Antihipertensiv Antihipertensiv Agonist 2 Antiaritmic, Antagonist antihipertensiv, angin, anxietate Hipertrofie de prostat Antagonist 1 Antihipertensiv Hipertensiune Antagonist AT1 Hipertensiune Antagonist AT1 Alergii Antagonist H1 Ulcere Antagonist H2 Astm, rinite alergice Antagonist CysLTR1 Astm Antagonist CysLTR1 Analgezic narcotic, combaterea durerii Analgezic narcotic, combaterea durerii Analgezic narcotic, combaterea durerii Analgezic narcotic, combaterea durerii 110 Agonist /antagonist Agonist /antagonist Agonist Agonist

Receptor prostanoid

Epoprostenol (Flolan) Misoprostol (Cytotec)

Hipertensiune pulmonar primar Ulcere Boli abdominale, tumori intestinale Migren Anxietate Psihoze Antidepresiv Arsuri gastroesofagiene nocturne Antidepresiv Schizofrenie Cancer

Somatostatin Receptor pentru serotonin

Octreotid (Sandostatin) Sumatriptan (Imitrex) Buspiron (Buspar) Olanzapin (Zyprexa) Ritanserin (Tisterton) Cisaprid (Prepulsic) Trazodon (Desyrel) Clozapin (Leponex) Goserelin (Zoladex)

Agonist al receptorului pentru prostaciclin Agonist al receptorului pentru prostaglandin Agonist sst2 i sst5 Agonist 5HT1B/1D Agonist 5HT1A Antagonist 5HT2/D2 Antagonist 5HT2 Agonist 5HT4 Amestec antagoniti 5HT2 Agonist GnRHR/LHRHR Agoniti D2, D3, D4

Receptorul factorului de eliberare al gonadotropinei Receptor pentru dopamin

Ropinerol (Requip)

Boala Parkinson

4.2. GPCRs i genomul uman

4.2.1. Arhitectura GPCR , semnalizarea i aciunea medicamentelor GPCRs formeaz cea de-a patra familie de proteine n genomul uman [Venter i colab., 2001], i joac un rol important n multe procese fiziologice i patofiziologice. Familia cuprinde un numr mare (mai mult de 1000) de proteine transmembranare ce prezint o arhitectur similar: un domeniu extracelular Nterminal, trei bucle extracelulare i trei bucle intracelulare, apte helixuri transmembrane care se conecteaz la buclele extra i intracelulare. Datorit prezenei celor 7 domenii transmembranare aceti receptori au fost denumii ,,erpuitori din cauza asemnarii lor cu un arpe spiralat, n micare. Ei conin un situs extracelular de legare a ligandului, important pentru activarea lor difereniat, precum i domenii intracelulare de cuplare la proteine, cum ar fi proteinele G. Dei GPCRs formeaz o familie nrudit de receptori transmembranari, acetia au tendina de a fi activai selectiv de un set foarte divers de liganzi, incluznd amine biogene, peptide, lipide analoage, nucleotide, aminoacizi derivai, Ca2+, stimuli senzoriali, cum ar fi lumina
111

(fotoni), gustul i mirosul (fig. 4.1). n consecin, superfamilia de GPCRs poate fi mprit n mai multe subgrupuri, cum ar fi familia rodopsinei (familia A), familia receptorilor asemntori celor pentru secretin (familia B) i familia receptorilor pentru glutamatul metabotropic (familia C). Diverse familii GPCR reflect diferite elemente structurale, care permit receptorilor s lege diveri liganzi. Acest specificitate mare pentru recunoaterea liganzilor este, de asemenea, valorificat de la liganzii int exogeni (medicamente) la proteinele GPCR specifice, explicnd de ce GPCRs au un succes aa de mare ca medicamente int. Mai mult dect att, GPCRs sunt relativ rspunztori pentru dezvoltarea medicamentelor datorit localizrii lor transmembranare, facilitnd nevoia medicamentelor de a intra n celule pentru a fi eficiente.

Fig. 4.1. Semnalizarea prin GPCR. GPCR sunt alctuii dintr-un domeniu extracelular Nterminal, trei bucle extracelulare i trei bucle intracelulare, care sunt conectate prin apte domenii helicoidale transmembranare. GPCR este situat la nivelul membranei plasmatice i poate fi activat prin liganzi extracelulari. Activarea receptorilor are ca rezultat activarea intracelular a proteinelor G heterotrimerice prin promovarea i favorizarea schimbrii GDP-GTP la nivelul subunitii G. Odat cu activarea proteinei G heterotrimerice, proteina G se disociaz n subunitile G i G, care pot activa proteine (E) efectoare n celule pentru a genera mesageri secunzi.

Odat cu recunoaterea moleculei de semnalizare extracelular, o schimbare conformaional determin proteinele G heterotrimerice intracelulare s moduleze n aval o varietate de ci biochimice [Jensen i colab., 2001]. GPCR este n echilibru ntre dou (sau mai multe) stri diferite: o stare inactiv i o stare activ [Kenakin, 2002]. n stare activ, GPCR este capabil s se cupleze la proteina G, pentru a produce un rspuns biologic. n starea inactiv, receptorul nu este n msur s produc un rspuns biologic. Legarea moleculelor care activeaz GPCR (agoniti)
112

schimb echilibru, astfel c GPCR este stabilizat n starea activ. Multe dintre medicamentele existente pe pia n 2009 acioneaz asupra funciei GPCRs, mpiedicnd aciunea moleculelor de semnalizare endogene ce au int GPCR. Aceti liganzi, cunoscui anterior sub denumirea de antagoniti, pot fi clasificai acum ca agoniti inveri, care, stabilizeaz GPCR ntr-o conformaie inactiv, i antagoniti neutri, care nu schimb echilibrul conformaional, dar mpiedic interaciunea cu agonitii endogeni prin legarea la GPCR.

4.2.2. Identificarea GPCRs Se consider c cele apte domenii structurale transmembranare rezult din structuri foarte bine conservate. n timpul anilor 1980, tehnologia ADN-ului recombinant a fost introdus n neurotiine, amplificnd descoperirea receptorilor i a genelor ce codific peptide/proteine ligand. Purificarea i, ulterior, clonarea n 1986 a genei receptor 2 la hamster [Dixon,1986] poate fi apreciat ca un reper, n acest domeniu. S-a evideniat ca punct comun, cele apte structuri transmembranare GPCR i o secven ADN similar n regiunile transmembranare cu rodopsina bovinelor (primul GPCR care a fost clonat). Omologia de secven ntre ambii GPCRs a permis clonarea multor GPCRs ntre anii 1980-1990, pe baza omologiei. Pentru a identifica secvene GPCR nrudite au fost utilizate, fie screening-ul prin hibridizare mai puin riguros, fie reacia de polimerizare n lan degenerat(PCR). Aceast abordare a condus la un numr mare de GPCRs pentru care liganzii nativi au fost iniial necunoscui. Cu toate acestea, alinierea secvenelor relativ simpl a permis previziuni rezonabile despre liganzi pentru un numr de receptori orfani clonai mai devreme. Iniial, identificarea noilor medicamente int au fost axate n principal pe testarea liganzilor endogeni mpotriva receptorilor puternic nrudii. Aceast abordare a condus la identificarea a numeroase subtipuri de receptori. Primul GPCR deorfanizat a fost receptorul pentru 5-hidroxitriptamin (HT)1A care a fost clonat pe baza omologiei de secven nrudit cu a receptorului 2 [Fargin, 1988], aprut pentru a rspunde la serotonin. Cu toate acestea, modul de abordare nu a constituit ntotdeauna un succes, deoarece depindea de identitatea aminoacizilor din receptori
113

deja identificai. Timp de mai muli ani diverse grupuri academice i industriale au ncercat, de exemplu, s cloneze receptorul pentru histamina H3, care este definit farmacologic. n ciuda disponibilitii genelor ce codific receptorii umani H1 i H2, nc de la nceputul anilor 1990, pana n 1999 clonarea nu a reuit. Dar, Lovenberg i colab., (1999) au reuit n cele din urm s cloneze gena receptorului uman H3 histaminic folosind informaii din baza de date Incyte referitor la expresia secvenelor scurte. Analiza filogenetic indic faptul c, gena ce codific receptorul uman H3 nu este strns legat de genele care codific receptorii umani H1 sau H2 (omologia total este de aproximativ 22%); de fapt, gena receptorului H3 seamn mai mult cu genele care codific 2 adrenoreceptorii. Aceste trei gene diferite ale receptorilor pentru histamin, au evoluat de la diferii strmoi i se pare c toate cele trei au dobndit elemente de o importan deosebit pentru recunoaterea de ctre histamin. Asemnarea slab a genei receptorului H3 cu genele ce codific alte dou subtipuri de receptori pentru histamin explic de ce nu au reuit diferite abordri bazate pe omologie pentru clonarea genei receptorului H3 [Leurs i colab., 2000]. Succesul clonrii genei receptorului H3 a fost urmat imediat de clonarea genei ce codific receptorul H4 pentru histamin, pentru care au fost disponibile puine dovezi farmacologice. Gena receptorului H4 a fost clonat de mai multe grupuri, concomitent, pe baza secvenei receptorului H3, care a devenit disponibil [Liu i colab., 2001]. Noul receptor pentru histamin prezint o exprimare foarte restrns n sistemul imunitar i n prezent este considerat ca o potenial int pentru medicamente n condiii inflamatorii.

4.2.3. GPCRs n era postgenomic: receptorii orfani Pe baza informaiilor disponibile despre genomul uman, numai o analiz sistemic a genomului GPCR uman printr-o abordare genomic funcional, va permite descoperirea de noi medicamente int. Pentru a descoperi noi GPCRs n genom sunt utilizate secvene motiv foarte conservate cum ar fi cele apte domenii transmembranare care sunt comune la toi GPCRs. O astfel de utilizare a
114

bioinformaticii a permis identificarea in silico a multor secvene de ADN ce codific GPCRs umani validai. Dei genomul complet a fost secvenializat, numrul total de GPCRs nu este nc pe deplin stabilit. Se consider c numrul total de GPCRs n genomul uman variaz de la 1000 pn la 2000. Progrese recente n cercetarea genomului au relevat un total de circa 300 GPCRs, care prezint valoare farmaceutic ca inte poteniale pentru medicamente [Civelli i colab., 2001]. Dintre acetia, 160 GPCRs sunt activai de 97 transmitori cunoscui, incluznd amine biogene, aminoacizi, peptide, nucleotide, acizi grai derivai i polipeptide. Cu toate acestea, aproximativ 140 din aceti noi GPCRs nu leag orice ligand endogen cunoscut i ofer noi oportuniti interesante pentru descoperirea de medicamente care vizeaz aceste aa-numiii GPCRs orfani (oGPCRs) - GPCRs a cror funcie i liganzi sunt nc necunoscui. n plus fa de aceti GPCRs de origine uman, agenii patogeni pot purta gene ce codific GPCR care pot fi exprimate la gazd. De exemplu, virusul herpesului uman Karposi asociat (HHV-8), codific ORF74, un receptor foarte activ, care se consider c joac un rol important n dezvoltarea bolii [Cesarman i colab., 2000]. De asemenea, citomegalovirusul uman (CMV) codific patru GPCRs n genomul su. Unul dintre GPCRs codificai de CMV uman, US28, este extrem de activ [Casarosa i colab., 2001], avnd un rol important n dezvoltarea aterosclerozei i, dup ultimele descoperiri ale agonitilor inveri nonpeptidergici, aceti receptori ar putea constitui posibile inte pentru medicamente. Avnd n vedere c exist un numr mare de GPCRs neintii, n prezent numeroase companii cu profil farmaceutic/biotehnologic dar i laboratoare academice, fac eforturi pentru identificarea liganzilor pentru receptorii existeni i cei nou descoperii. Programele de cercetare ale multor companii de medicamente includ strategii care ncearc s exploateze Proiectul Genomului Uman pentru a avea acces la noi familii de GPCR, inclusiv oGPCRs, pentru a obine noi medicamente. Pentru a deorfaniza oGPCRs se impune identificarea liganzilor endogeni naturali sau nativi pentru aceti receptori. Funciile acestor noi receptorii sunt elucidate folosind abordri de genomic funcional. Cutarea liganzilor pentru receptorii orfani poate
115

implica metode clasice de screening, cum ar fi monitorizarea schimbrilor de nivel ale mesagerilor secunzi bine-cunoscui, cum ar fi AMPc i Ca2+, sau poate implica tehnologii foarte sofisticate care sunt n mare parte bazate pe o nelegere profund a biologiei care este implicat n procesul de activare a receptorilor, pe mai multe niveluri bazate pe cercetrile de biologie molecular, metode de calcul i bioinformatic, microfluide i nanotehnologii, etc. Ca atare, deorfanizarea receptorilor a devenit cu adevrat o abordare multidisciplinar, i n urmtoarele seciuni vom indica n ce msur cunotiinele fundamentale de bioinformatic, exprimarea receptorilor i sistemele de traducere a semnalului sunt exploatate pentru identificarea liganzilor pentru oGPCRs.

4.3. Investigarea liganzilor

4.3.1. Abordri de farmacologie invers pentru oGPCRs Istoric, conceptul de receptori a fost dezvoltat pe baza efectelor biologice observate ale medicamentelor administrate exogen. Muli receptori i subtipuri de receptori pentru mesageri chimici endogeni cunoscui au fost descoperii prin investigarea aciunii moleculelor biologic active. Dezvoltarea domeniului de farmacologie molecular bazat pe conceptele de receptor timpuriu a optimizat drumul spre designul raional de medicamente, pe baza interaciunii dovedite cu un sistem receptor cunoscut. Modul de aciune al medicamentelor a relevat existena unui sistem receptor care a fost exploatat chimic. Acest proces a condus la descoperirea mai multor medicamente importante din ziua de astzi i reprezint, nc, o abordare util pentru sistemele receptor cunoscute. Cu toate acestea, situaia este foarte diferit cu oGPCRs. Cunotinele despre moleculele endogene de semnalizare sunt deficitare. Mai mult dect att, este foarte dificil s se prevad n prealabil potenialul liganzilor specifici, care acioneaz la alegere cu oGPCR. Prin urmare, procesul de identificare a liganzilor endogeni pentru receptorul orfan este numit farmacologie invers. Mai nti trebuie s se stabilileasc ligandul endogen pentru oGPCR, apoi trebuie s se investigheze funcia perechii oGPCR - ligand n procese fiziologice, n cazul n care, dup potenialele
116

medicamente int, oGPCR ar putea fi dezvoltat. Dei farmacologia invers este o abordare necesar i cu un grad de risc ridicat, rezultatele finale n procesul pentru descoperirea medicamentelor sunt, de obicei, extrem de avantajoase. Mai mult dect att, n ultimii ani, evoluiile tehnologice i creterea nelegerii funciei GPCR au contribuit la dezvoltarea unor strategii de succes. 4.3.2. Abordri in silico Bazele de date pot fi folosite pentru a obine informaii cu privire la relaiile filogenetice, expresia esutului, existena unor '' variante polimorfice ''i poteniala legare de un anumit fenotip n vederea identificrii unui oGPCR in silico. Analiza filogenetic a secvenelor GPCR poate dezvlui relaia oGPCR cu ali receptori deja cunoscui i poate fi folosit ca un instrument pentru predicia clasei liganzilor pentru receptorii orfani [Joost i colab., 2002]. De exemplu pentru receptorii H4 pentru histamin, o analiz filogenetic a secvenei receptorilor H4 corespunde n mod clar cu a receptorilor H3 pentru histamin (fig. 4.2). n prezent, foarte multe date despre aranjamentul genelor i analiza lor atent ne va permite s obinem informaii importante despre expresia genelor in silico. Pentru a evalua potenialul unui oGPCR pentru aplicaii terapeutice, o cunoatere detaliat a expresiei esutului este de cea mai mare importan. Dac cineva este interesat s sintetizeze medicamente mpotriva tulburrilor sistemului nervos central, nu va fi interesat doar de oGPCRs care sunt exprimai la periferie. De asemenea informaii cu privire la expresia esutului sunt foarte importante pentru cutarea de liganzi endogeni. Disponibilitatea secvenei genomului uman, precum i a altor specii cum ar fi oarecii permite analiza larg a genomului; de exemplu, polimorfismul unui singur nucleotid (SNPs) care poate fi legat de un anumit fenotip,va permite cunoaterea funciei unei anumite gene i a proteinei codificate. Analiza la nivel de genom aduce un avans important n nelegerea funciei genei i a rolului ei n producerea bolii. O astfel de abordare de genomic funcional a fost aplicat cu succes pentru identificarea genei PTC ce codific un GPCR sensibil la feniltiocarbamid , care este
117

responsabil pentru gustul sensibil la feniltiocarbamid. Mai multe SNPs n aceast gen determin pierderea sensibilitii gustului [Kim i colab., 2003].

Fig. 4.2 . Analiza arborelui filogenetic a mai multor GPCRs aminergici plaseaz AXOR 35 aproape de receptorul H3 pentru histamin. Analiza farmacologic ulterioar a confirmat c AXOR 35 reprezint un nou receptor uman pentru histamin, receptorul H4 (dup Dingermann i colab., 2004).

Alternativ, generarea de oareci n care expresia unui anumit GPCR a fost eliminat prin manipulare genetic (receptori knock-out) poate furniza indicii pentru potenialul rol fiziologic al receptorilor. n cazul n care un anumit ligand este codificat de genom, cum este cazul liganzilor peptidergici, poate fi de asemenea generat knockout, dac un anumit trasmitor lipsete. Prin urmare, fenotipul knockout potenial poate aduce indicii cheie pentru funcia receptorului i ajut la validarea unui GPCR ca un potenial medicament int [Zambrowicz i colab., 2003]. Knockout-ul receptorilor legai de densitate, de exemplu, a demonstrat c aceti oGPCR sunt implicai n remodelarea vascular.
118

Dicionarul Deltagen i de Genetic, ofer n prezent tehnologii de knockout la mamifere in vivo de mare capacitate pentru a genera diferii oareci knockout (inclusiv diferii GPCR knockout) i analiza lor fenotipic [Abuin i colab., 2002]. Accesul la baze de date relevante (comerciale) permite obinerea de informaii cu privire la potenialul rol al oGPCR n fiziologie. 4.3.3. Expresia tisular Dup cum s-a menionat anterior, cunoaterea expresiei tisulare a oGPCR este unul dintre primii pai care decide dac oGPCR este cu adevrat de interes terapeutic. n plus fa de abordrile in silico, exist diverse alte mijloacele necesare pentru a obine date privind exprimarea tisular a oGPCR. Cele mai populare tehnici pentru profilul tisular au fost analiza expresiei ARNm prin analiza Northern blot, revers transcripia RT-PCR sau hibridizarea in situ. n analiza Northern blot, ARNm din diferite esuturi este separat n funcie de mrime prin electroforez n gel, transferat i imobilizat pe membrane de nitroceluloz sau nylon, i incubat cu oligonucleotide radioactive sau fluorescente marcate sau sonde de ADNc, care se bazeaz pe secvena ADNului, oGPCR de interes. Prin intermediul asocierii cunoscute a bazelor perechi specifice moleculelor de ADN i ARN, hibridizarea sondelor se va produce doar cu moleculele ARNm al oGPCR. Analiza semnalului radioactiv sau fluorescent ce rmne pe plci dup splare ne permite s deducem expresia tisular. Alternativ, prin efectuarea de splri mai puin stricte, (screening prin hibridizare mai puin riguroas), sonda poate hibridiza cu molecule ARN codificatoare pentru noi GPCRs care prezint suficiente secvene omoloage cu sonda. n prezent, bloturi cu diferite esuturi umane pot fi obinute comercial. De asemenea expresia ARNm tisular poate fi obinut printr-o variant a tehnicii PCR. Utiliznd enzima revers transcriptaza, ARNm de la nivelul esutului este transcris n ADNc, unde apoi moleculele de ADNc din oGPCR sunt amplificate printr-o reacie PCR cu dou oligonucleotide specifice oGPCR.

119

Datele cele mai detaliate despre expresia ARNm pot fi obinute prin hibridizare in situ. Fragmentele de esut sunt incubate n condiii adecvate cu oligonucleotide radioactiv sau fluorescent marcate sau sonde ADN, care se bazeaz pe secvena ADN a oGPCR de interes. Dup splare, citirea ofer informaii detaliate cu privire la variaiile nivelurilor expresiei n esuturi complexe, cum ar fi creierul. Cum expresia ARNm nu reflect real expresia proteinei, poate c ar trebui ncercat s se msoare nivelurile de expresie a proteinelor n loc de expresia ARNm. Cu toate acestea, pentru profilul expresiei proteinelor este nevoie de un anumit anticorp pentru analiza Western blot sau analiza imunohistochimic. Dei generarea de anticorpi pentru oGPCRs nu este imposibil, deseori necesit resurse substaniale i de aceea nu este foarte atractiv. Informaiile despre expresia GPCR sunt fundamentale pentru ntregul proces de farmacologie invers, abordri anatomice moleculare la scar mare, cartografierea nivelului expresiei (profilul expresiei) tuturor GPCRs cunoscui, inclusiv a receptorilor orfani, permind descoperirea timpurie a acelor GPCRs care se pot dovedi utili n descoperirea medicamentelor. 4.3.4 .Expresia oGPCR de interes Pentru a identifica ligandul endogen pentru un oGPCR de interes, trebuie stabilizate liniile celulare care exprim receptori orfani i folosirea acestor linii celulare pentru screening-ul potenialilor liganzi. Multe linii de celule de mamifere sunt n prezent disponibile pentru aa numita expresie heterolog a oGPCRs. Pentru a exprima un oGPCR de interes, secvena ADNc a oGPCR este mai nti clonat dintr-un esut relevant sau ADNul genomic, un epitop tag, cum ar fi un FLAG, c-myc, V5 sau hemaglutinin este adesea ncorporat n domeniu N-terminal al receptorilor, pentru a permite detectarea proteinelor receptor de la suprafaa celulelor folosind anticorpi ndreptai mpotriva epitopilor tag. ADNc al oGPCR se insereaz n vectori ADN speciali, care sunt transferai (transfecie) n celule mamiferelor (fig. 4.3). O varietate de tehnici (transfecia chimic, electropermeabilizarea, utilizarea tehnicilor de infecie i lipofecie, de exemplu, baculovirusul, adenovirusul
120

sau Virusul Semliki Forest) sunt disponibile n prezent, pentru a transfera n mod eficient ADN-ul ntr-o varietate de celule. Exemple de linii de celule frecvent utilizate pentru exprimarea GPCRs includ celulele HEK 293 (human embryonic kidney) i celulele CHO (Chinese hamster ovary ).

Fig. 4.3. ADNc ce codific GPCRs provenii din genom sunt clonai n vectori de expresie adecvai cu scopul de a obine o expresie adecvat a receptorului n celulele utilizate n procesele de identificare a liganzilor. n cazul n care celulele exprim receptorii de interes, celule pot fi stimulate prin liganzi care pot fi obinui din biblioteci compuse sau extracte tisulare i celulele sunt apoi monitorizate de exemplu, pentru schimbri n activitatea celular prin efectuarea de teste funcionale (a se vedea seciunea 4.3.5). Prin repetarea acestei strategii, GPCRs pot s induc rspunsuri specifice pentru anumite perechi GPCR-ligand .

De obicei, transfecia genelor GPCR, n aceste celule, are ca rezultat niveluri de expresie relativ nalte, care faciliteaz ntreg procesul de farmacologie invers. Trebuie luate precauii n ceea ce privete potenialele interferene cu sistemul de screening al GPCRs exprimate endogen de celulele gazd. Dimpotriv, s-ar putea foarte bine ca aceste sisteme de exprimare s nu prevad condiii corespunztoare celulare n ceea ce privete expresia proteinei G sau, poate mai surprinztor, sunt exemple ale asocierii proteinelor modificatoare ale activitii receptorilor (RAMPs) cu GPCR i formarea de GPCRs heterodimerici care sunt importani pentru formarea
121

de GPCR complet funcionabili [Sexton i colab., 2001]. n plus fa de aceast mare varietate de linii celulare de mamifere, cteva linii celulare care nu sunt de mamifere, incluznd celule de insecte, de Xenopus laevis broasca pigmentat i de drojdie de bere sunt, de asemenea, folosite pentru expresia heteroloag i caracterizare a GPCRs, inclusiv identificarea de liganzi nativi i surogat [Brown i colab., 2002] poteniali pentru oGPCRs. Un important avantaj al sistemului de expresie al drojdiei este setul limitat de proteine G native i GPCRs din drojdia de bere. 4.3.5 . Abordri de screening Exist dou strategii de pornire n identificarea liganzilor nativi pentru receptori orfani. Prima folosete esuturi native n care este exprimat un receptor. Prezena receptorilor care ofer un anumit situs de legare al ligandului n anumite esuturi i, care odat cu legarea ligandului, induce rspunsuri funcionale ce nu sunt mediate prin oricare dintre GPCRs cunoscui capabili s lege liganzi nrudii sugereaz existena de GPCRs suplimentari. Astfel, un ligand identificat este legat la un receptor neidentificat. Acesta a fost cazul pentru nocistatin, un ligand de natur peptidic derivat din acelai precursor ca nociceptinul, ligandul endogen pentru receptorul 1 pentru opiozi [Klein i colab., 1998]. Un alt exemplu de oGPCR, care a fost deorfanizat n acest mod este Bonzo coreceptorul HIV ca receptor de chemokine CXCL16 (CXCR6) [Matloubian i colab., 2000]. Prima cutare n baza de date EST, a identificat CXCL16 ca fiind un potenial nou ligand pentru receptorul pentru chemokine legat de membran. Studiile ulterioare au evideniat tipuri de celule specifice care leag celule ce exprim CXCL16. O abordare n ceea ce privete clonarea expresiei a fost apoi folosit cu succes pentru a identifica un receptor pentru CXCL16. O bibliotec de expresie de ADNc cu ARNm, a fost fcut din celulele CXCL16-legate i transfectate n celule HEK293, care au fost apoi evaluate pentru CXCL16 legate prin analiza FACS. n cele din urm, clonele de ADNc individual au fost identificate astfel c, atunci cnd sunt exprimate n celule HEK293, au artat o legare puternic specific de CXCL16. Secvenierea complet a ADNc a dezvluit identitatea CXCR6.
122

De obicei, atunci cnd s-a ncercat s se identifice un ligand pentru un oGPCR, cercettorii au stabilizat linii de celule care exprim oGPCR i apoi au folosit acest sistem artificial pentru screening-ul potenialilor liganzi. ntr-o astfel de strategie complex(a doua) genetic i chimic, celulele ce exprim oGPCR sunt utilizate ca vehicule n identificarea moleculelor int mici. Apoi, celulele care exprim receptorul de interes pot fi utilizate fie pentru teste de legare a radioligandului (teste non-funcionale) sau teste funcionale, care implic msurarea rspunsurilor celulare care pot s apar odat cu activarea receptorilor. Datorit necesitii de ligand marcat radioactiv, abordrile de legare a radioligandului sunt mai puin utile pentru receptorii deorfanizai, cu excepia cazului n care exist o ans bun ca receptorul orfan s aib o omologie ridicat cu un GPCR existent, pentru care este disponibil o afinitate crescut a liganzilor. Aceast abordare a constituit un succes pentru deorfanizarea, de exemplu, a receptorilor pentru -laurotoxin [Ichtchenko K. i colab., 1999] i poate ajuta deorfanizarea receptorilor prin confirmarea legrii ligandului identificat de receptor. Cu toate acestea, testele funcionale sunt de multe ori eseniale pentru identificarea liganzilor nativi pentru oGPCRs. Pentru identificarea liganzilor nativi pentru receptorii orfani, folosind teste funcionale, diverse biblioteci ce conin colecii mari de poteniali liganzi endogeni sunt concentrate pe rspunsurile lor biologice n celule care exprim receptorul. Astfel de biblioteci compuse pot cuprinde muli dintre agonitii cunoscui care sunt disponibili, inclusiv peptide noi, care pot fi identificate pe baz de analiz bioinformatic a genelor ce codific peptide validate. n cazul n care nu se obin rezultatele ateptate de la aceti agoniti GPCR cunoscui sau validai, o cutare de liganzi noi poate fi apoi iniiat prin screening n ciuda extractelor biologice ale esuturilor n care oGPCR sunt cunoscui a fi exprimai, la fel pentru fluide i supernatantul celular.

123

4.4. Screeningul pentru liganzi oGPCR folosind teste funcionale

Rspunsul fiziologic care este observat n urma activrii GPCR este de cele mai multe ori reglat de cuplarea i de activarea proteinelor G de ctre receptori activai. GPCRs se cupleaz la mecanismele cascadei de semnalizare prin mesageri secunzi pe calea proteinelor heterotrimerice. Cele mai multe teste clasice funcionale folosite pentru a msura activitatea GPCR sunt de obicei bazate pe msurarea fie a proteinei G, fie a activrii efectorilor. De obicei screening-ul pentru liganzii oGPCRs este efectuat prin mijloace de exploatare a biologiei sistemelor receptorilor, i poate implica metodele clasice de depistare, cum ar fi monitorizarea schimbrilor nivelurilor mesagerilor secunzi bine cunoscui (AMPc i Ca2+) sau poate implica tehnologii foarte sofisticate care se bazeaz n mare parte pe o profund nelegere a biologiei, care este implicat n activarea mediat de receptori a cascadelor de transducie a semnalui. Aceste noi teste de screening de mare capacitate (HTS) utilizeaz automatizarea i miniaturizarea, i pot fi efectuate mai repede i mai eficient dect tehnicile de screening pentru descoperirea medicamentelor tradiionale. La acestea se adaug tehnici de analiz i utilizarea sistemelor de teste convenabile pentru identificarea liganzilor pentru oGPCRs. Tabelul 4.2. prezint civa dintre oGPCRs care au fost mperecheai cu ligandul lor nativ n ultimii ani. Dup ce astfel de perechi receptor-ligand sunt identificate, testele HTS pot fi axate pe gsirea potenialului terapeutic pentru aceste noi inte. n continuare vom evidenia diversele abordri experimentale care au fost dezvoltate pentru funcionarea screening-ului pentru oGPCRs. n unele cazuri metodologia va fi evideniat prin succesul deorfanizrii oGPCRs specifici. 4.4.1. Teste de legare GTPS Testele de legare GTPS monitorizeaz activarea proteinelor G asociate receptorilor i, cu toate c testul este specific pentru receptorii cuplai cu Gi i Go, s-a demonstrat c el este, de asemenea, aplicabil pentru proteinele Gq (proteine G) cuplate cu GPCRs ce urmeaz dup procedura de imunoprecipitare [Carrillo JJ. i
124

colab., 2002]. Prin substituia GTP pentru GTPS[S35], activarea proteinelor G au ca rezultat ncorporarea GTPS nonhidrolizabil i marcat radioactiv [S35], permind cuantificarea proteinelor G activate. Dei exist exemple de oGPCRs care au fost deorfanizai folosind acest test, inclusiv identificarea eicosanoizilor ce prezint activiti agoniste mpotriva oGPCR TG1019 [Hosoi i colab., 2002], testul este foarte rar utilizat n calitate test de screening primar. Cu toate acestea, testul poate fi utilizat pentru confirmarea cuplrii i stimulrii proteinelor Gi de oGPCR activat odat ce potenialii liganzi au fost identificai.
Tabelul 4.2. Receptorii deorfanizai i liganzii identificai (dup Dingermann i colab. 2004) Receptor Testul utilizat 5-HT1A A2A A1 5-HT1D bombesina ORL-1 Y2 C3a CXCR4 (LESTR, fusin) laurotoxina Receptorul CGRP; CRLR GHS-R BLTR Orexina A i B THR2 GPR10 (hGR3) APJ CGRP BLR1 EDG 1, 3, 5, 6 i 8 125 Legare a radioligandului AMPc AMPc AMPc Ovocite AMPc Legare a radioligandului [Ca2+]i, ovocite [Ca2+]i Legare a radioligandului AMPc [Ca2+]i Legare a radioligandului [Ca2+]i Legare a radioligandului Acid arahidonic Ext.pH (citosenzor) ovocite Activitate chemotactic [Ca2+]i, AMPc, ovocite

Ligand 5-HT

Anul identificrii 1988 1990 1991 1991 1993 1995 1995 1996 1996 1997 1996, 1998 1996, 1999 1997 1998 1998 1998 1998 1998 1998 1998-2000

Adenozina Adenozina 5-HT Peptide nrudite cu bombesina Nociceptina/orfanina FQ Neuropeptidul Y AZ3B Factorul 1 derivat din celule stromale CIRL Peptidul legat de gena pentru calcitonin Grelina Leukotriena B4 Hipocretina/orexina Hormonul de eliberare al tirotropinei Peptidul de eliberare al prolactinei Apelin CRLR Chemoatractantul pentru limfocite B 1 fosfat sfingozina

Acidul lizofosfatic CIRL-2 Histamina Hormonul de concentrare al melaninei Urotensina II Motilina Leukotriena D4 Leukotriena B4 Neuromedin U Neuromedin U Prostaglandina D2 Neuropeptidul FF i AF Neuropeptidul FF Sfingozilfosforilcolina Histamina UDP-glucoza Leukotriena C4 i D4 Eskina CXCL16

EDG 2, 4 i 7 -laurotoxina H3 (GPCR97) SLC-1 (MCH1, GPR24) UII (GPR14, SENR) Motilina GPR38) Cys-LT1R (HG55, HMTMF81) BLT2 (GPR16) NMU1R (FM-3, GPR66) NMU2R (FM-4, TGR-1) PGD2 (CRTH2) NPFF2 (HLWAR77) NPFF1 (OT7T022), NPFF2 SPC (OGR-1) H4 (AXOR35) P2Y14 (KIAA0001, GPR105) Cys-LT2R (PSECO146, AXOR54) CCR10 (GPR2) BONZO, STRL33, TYMSTR (CXCR6) TA1, TA2 MCH2 (AXOR21) P2Y12 (SP1999) TA1, TA2 TDAG-8 126

[Ca2+]i, AMPc, drojdia de bere Legare a radioligandului AMPc, legare a radioligandului [Ca2+]i [Ca2+]i, [Ca2+]i, aequorina [Ca2+]i AMPc, legare a radioligandului [Ca2+]i [Ca2+]i [Ca2+]i [Ca2+]i Ovocite [Ca2+]i AMPc, legare a radioligandului Drojdia de bere [Ca2+]i, ovocite [Ca2+]i Analiz prin flowcitometrie[Ca 2+ ]i Ovocite, AMPc, legare a radioligandului [Ca2+]i Ovocite Ovocite AMPc

1998-2000 1999 1999 1999 1999 1999 1999 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000

-PEA i triptamina Hormonul de con-centrare al melaninei ADP Amine biogene, trace amine Psicozin

2001 2001 2001 2001 2001

Lizofosfatidil colina KISS-1

Sfingozilfosforilcolina i lizofosfatidilcolina NPAF NPFF Relaxina Relaxina Anioni de acid carboxilic cu lan scurt Fragmente complement Neuropeptidul W Acizi biliari 5,8,11 Acid eicosatrinoic Adenina Produsul genei proencefalina A Acid nicotinic Acid nicotinic Sfingozilfosforilcolina

G2A metastatin (GPR54, hOT7T175, AXOR12) GPR4

[Ca2+]i [Ca2+]i

2001 2001

mrgA4 mrgA1 LGR7 LGR8 GPR41, GPR43 C5L2 GPR7 i GPR8 M-bar (BG37) GPR40 Receptor pentru adenin la obolan GPCRs (SNSRs) specifici neuronilor senzoriali HM74 (GPR109) HM74A GPR12

Legarea radioligandului, Teste de gene reporter [Ca2+]i [Ca2+]i AMPc AMPc Drojdie de bere Legarea radioligandului GTPS AMPc [Ca2+]I, Teste de gene reporter [Ca2+]i [Ca2+]i

2001

2001 2001 2001 2001 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2002

[Ca2+]i, aequorina, AMPc, GTPS GTPS [Ca2+]i, aequorina

2003 2003 2003

4.4.2. Evalurile AMPc AMPc este unul dintre cele mai importani mesageri secunzi pentru controlul diferitelor ci metabolice. De-a lungul anilor au fost dezvoltate o serie de teste pentru a msura formarea de AMPc din AMP prin adenilil ciclaz (AC) dup stimularea receptorilor. Enzima efectoare AC este activat de ctre proteinele Gs i inhibat de proteinele Gi, i, prin urmare, aceste teste pot fi folosite pentru a monitoriza activarea unei game variate de GPCRs.

127

Dezvoltarea de radioimumoteste, tehnici sensibile i reproductibile i imunoteste bazate pe fluorescen au nlocuit tehnicile vechi care se bazau pe ATP marcat, urmate de extracia i de determinarea cantitii de AMPc marcat, nou format sau pe dispariia precursorilor. Testele pentru evaluarea AMPc au fost utilizate pe scar larg pentru a ajuta deorfanizarea oGPCRs (tabelul 4.2), incluznd, de exemplu, receptorii pentru relaxin i histamina H3. 4.4.3. Evalurile Ca2+ Diveri GPCRs cresc Ca2+ intracelular prin stimularea eliberrii Ca2+ din depozitele intracelulare i a influxului extracelular de Ca2+. Un rspuns tipic de Ca2+ mediat de GPCR se caracterizeaz printr-o cretere rapid tranzitorie a concentraiei intracelulare de Ca2+, care este urmat de o cretere susinut a concentraiei de Ca2+. Este acceptat pe scar larg faptul c activarea mobilizrii Ca2+, prin GPCRs este asociat cu fosfolipaza C (PLC) ce catalizeaz hidroliza inozitol fosfolipidelor membranare. Receptori cuplai cu Gq pot activa proteine G care aparin familiei de proteine Gq, pentru a activa hidroliza mediat de PLC a fosfatidil-4 ,5-bifosfatului [PI (4,5) P2] ce conduce la formarea de inozitol-1 ,4,5-trisfosfat [Ins (1,4,5) P3] i 1,2-diacilglicerol (DAG). Receptorii Ins (1,4,5) P3 din reticulul endoplasmic (ER) mediaz ulterior eliberarea de Ca2+ din ER i, prin urmare, crete[Ca2+]i, ntruct eliberarea DAG poate activa ali efectori cum ar fi izoformele proteinazei C (PKC) i protein kinazei D (PKD) i afecteaz influxul de [Ca2+]i prin activarea tranzitorie a canalelor receptorilor cu potenial de canal (TRPC)[Hofmann i colab., 1999]. Prin monitorizarea modificrilor nivelurilor intracelulare de Ca2+ n celule, s-au identificat orexinele, o familie de neuropeptide hipotalamice care au fost izolate din extracte tisulare, ca liganzi naturali pentru receptorii orfani anteriori, care sunt acum cunoscui ca receptori pentru orexin [Sakurai i colab., 1998]. Autorii au folosit Fura-2, unul dintre fluoroforii comercial disponibili care i schimb fluorescen caracteristic la legarea de Ca2+. n ultimii ani au devenit disponibile numeroase modele care pot fi utilizate pentru msurarea modificrilor [Ca2+]i [Zacharias i colab.,
128

2000]. Unul dintre cei mai cunoscui cititori de plci pentru msurarea [Ca2+]i este cititorul de plci cu imagine fluorometric (FLIPRTM), care a fost, de asemenea, utilizat pe scar larg pentru deorfanizarea oGPCRs. Sistemul FLIPR monitorizeaz rspunsul populaiilor celulare n plci (godeuri) la medicamente potenial candidate. Unul dintre ultimii oGPCRs care au fost deorfanizai folosind FLIPR este GPR40, un GPCR pentru lanul lung al acizilor grai, cum ar fi acidul eicosatrinoic [Briscoe i colab., 2002]. Un alt test de sistem de monitorizare a [Ca2+]i se bazeaz pe fotoproteina aequorina prezent la petele Aequorea Victoria. Legarea Ca2 la aequorin determin oxidarea substratului coelenterazina pentru producerea de fotoni, care pot fi detectai cu luminometru (fig. 4.4).

Fig. 4.4 Evaluarea modificrilor Ca2+ mediate de receptor pe calea sistemului de aequorine. Activarea mediat prin stimularea receptorilor a PLC fie prin intermediul Gq/11, sau, de exemplu, prin Gq5i himerice au ca rezultat formarea inozitolfosfatului i ulterior creterea intracelular a Ca2+ (a se vedea seciunile 4.4.3 i 4.4.6). Interaciunea Ca2+ cu aequorina, o fotoprotein care este coexprimat mpreun cu receptorul de interes, duce la oxidarea coelenterazinei, cu care celulele sunt ncrcate nainte de stimularea receptorilor pentru a produce fotoni, care pot fi detectai printr-un luminometru (dup Dingermann i colab., 2004).

129

4.4.4. Microfiziometru citosenzor n contrast cu evaluarea schimbrilor de Ca2+ sau AMPc intracelular, mai multe teste generice pot fi de asemenea folosite pentru msurarea activrii receptorilor. Citosensorul este un microfiziometru care utilizeaz modificrile pH-ului extracelular care sunt nsoite de schimbri ale activiti celulare (de exemplu, activarea GPCR), i a fost utilizat cu succes pentru a identifica liganzii pentru receptorii CCR5 i pentru caracterizarea farmacologic a numeroi GPCRs [Wu i colab., 1997]. Testul are o specificitate mai degrab sczut, motiv pentru care multe alte teste au ctigat popularitate fa de acest sistem de testare. Cu toate acestea, testul poate fi util pentru deorfanizarea GPCRs acolo unde nu este nevoie de cunotine anterioare despre cile de transducie a semnalelor care pot fi activate de aceti oGPCRs. 4.4.5. Teste bazate pe gene reporter De asemenea modificrile nivelurilor intracelulare de mesageri secunzi pot determina modificarea expresiei diferitelor gene, ca urmare a modulrii activitii factorilor de transcripie. Aceti factori de transcriere se pot lega la factori de transcripie specifici prezeni n regiunile promotor ale genelor pentru a intensifica sau reprima expresia genelor. Testele bazate pe gene reporter vor monitoriza activarea diferiilor factori de transcripie cum ar fi CRE, TRE, SRE, NF-kB i AP-1, transcripie mediat, de exemplu, de luciferaza i -galactozidaza, pentru care activitatea enzimatic poate fi analizat n lizatul celular, i cu proteina fluorescent verde (GFP). Tehnologia bazat pe gene reporter este acum utilizat pe scar larg pentru monitorizarea evenimentelor celulare asociate cu transducia semnalului i expresia genelor. Principalul avantaj al acestor teste l constituie sensibilitatea mare, fiabilitatea, convenabilitatea i adaptabilitate la scar larg a msurtorilor [Hill i colab., 1999]. Testele bazate pe gene reporter au fost utilizate pentru a ajuta deorfanizarea diferiilor oGPCRs, incluznd, de exemplu, receptorul pentru sfingozilfosforilcolina

130

care induce transcripia genei mediat de SRE [Zhu i colab., 2001] i receptorul H4 pentru histamin. n plus, genele reporter pot fi utilizate ca gene marker pentru a cuantifica rspunsurile proliferative celulare sau formarea AMPc. n aceste cazuri, genele reporter nu se afl sub control transcripional direct ca n cazul testelor bazate pe gene reporter. O platform de tehnologie bazat pe celule pentru evaluarea funcional a familiilor genelor pentru medicamente, inclusiv GPCRs, se numete Tehnologie de Amplificare i Selecie de Receptor (R-SATTM) i utilizeaz o astfel de gen marker ca o citire funcional [Croston i colab., 2002]. Acest test a fost recent utilizat pentru dezvoltarea de liganzi nonpeptidergici pentru receptorul pentru urotensin II i a artat c aplicarea de teste pe baz de celule poate produce liganzi cu situsuri de legare pentru receptori care sunt diferite de situsurile de legare care sunt utilizate de liganzi receptorilor nativi [Spalding i colab., 2002]. 4.4.6. Cuplarea proteinelor G cu GPCR Pentru a crete probabilitatea de a identifica un ligand nativ pentru un receptor orfan, screeningul funcional care este utilizat trebuie s fie adaptat pentru o gam larg de GPCRs. Astfel, activarea GPCRs care se cupleaz cu membrii din familii distincte de proteine G heterotrimerice necesit un rspuns uniform. Receptorii au o eterogenitate n specificitatea cuplrii fa de legarea lor i de activarea proteinelor G, i, ca rezultat un receptor poate activa proteine G care aparin de diverse familii de proteine. Dei unii GPCRs se cupleaz cu membrii de la toate familiile de proteine G heterotrimerice, cei mai muli GPCRs se cupleaz cu o anumit specificitate la diferite proteine G. Cu toate acestea, contextul celular, va determina, de asemenea, care proteine G sunt activate n cele din urm odat cu activarea anumitor GPCR. Astfel n afar de afinitatea anumitor GPCRs pentru diferite proteine G, cantitile specifice de proteine G exprimate au un rol important. Pe baza acestui principiu, proteinele G specifice pot fi coexprimate mpreun cu GPCRs pentru a promova activarea acestor proteine G ca s fie direcionate pentru transducia semnalului prin ci comune. Aceasta tehnic s-a dovedit funcional n
131

special pentru G16 i omologul su murin G15, proteine G care afieaz un model de expresie foarte restrns al exprimrii endogene. Aceste proteine G eterogene aparin familiei Gq de proteine G, a cror activare are ca rezultat activarea PLC, care duce la producerea de diacilglicerol i inositolfosfat, i crete concomitent nivelul intracelular de Ca2+ i al efectoriilor lor din aval, i prin urmare, este ideal pentru diferite screeninguri (a se vedea seciunea 4.4.3) [Offermanns i colab., 1995]. Avnd n vedere faptul c expresia att a receptorilor ct i a proteinelor G este adecvat, variabilitatea receptorilor, n principiu, ar trebui virtual s permit oricrui receptor s semnalizeze prin proteine G specifice pentru a activa o anumit cascad de transducie a semnalului. Cu toate acestea, nu toi receptorii par a interaciona cu proteinele G cu aceeai afinitate i pentru unii receptori nu este foarte evident c sunt pregtii pentru teste de screning funcional. Domeniul C-terminal al proteinei G este un domeniu cheie n interaciunea GPCR- protein G [Hamm i colab., 2001]. Proteine G himerice, n care ultimii dintre aminoacizi au fost nlocuii cu aminoacizi corespunztori care sunt prezeni n alte familii de proteine G, au fost utilizate pe scar larg n teste de screening pentru a facilita o cuplare funcional a receptorilor, care s permit un screening funcional pentru liganzii care modific activitatea receptorilor. Probabil, cele mai frecvent utilizate proteine G himerice sunt cele n care n ultimii cinci aminoacizi ai Gq au fost nlocuii de ctre cei ai Gi, Go sau Gz, i sunt n mod obinuit numii Gqi5, Gqo5 i Gqz5. Aceste proteine himerice Gq au o eterogenitate crescut n legtur cu receptorii cuplai cu Gi/o, permind receptorilor cuplai cu Gi/o s se cupleze cu creterea nivelului de intracelular Ca2+; ele sunt de obicei utilizate n teste de screening, folosind FLIPR (a se vedea seciunea 4.4.3) [Coward i colab., 2000]. Alternativ, un amestec de proteine G, inclusiv proteine G himerice, pot fi coexprimate mpreun cu oGPCR de interes pentru a crete probabilitatea oGPCR cuplai cu proteine G adecvate s produc un rspuns biologic i astfel, s creasc probabilitatea de a identifica un ligand nativ pentru oGPCR. Eterogenitatea receptorilor poate fi prelungit prin forarea receptorilor de a se cupla cu o protein G proiectat care se leag fizic de proteine GPCR, cu sensul de
132

proteine de fuziune. Astfel de receptori ai proteinelor de fuziune i proteinelor G pot fi folosii ca un instrument pentru screeningul liganzilor i n prezent au fost descrise pentru receptorii fuzionai fie cu Gs, Gi sau Gq [Milligan i colab., 2000]. Receptori legai la agoniti pot interaciona cu proteinele G i activeaz proteinele G asociate din aceste proteine de fuziune. Astfel de fuziuni GPCR-proteine G sunt folosite n scop de screening, aa cum a fost exemplificat de oGPCR TG1019, care a fost fuzionat cu proteine Gi1 i a fost exprimat n celulele de insecte pentru evaluarea funcional a TG10119 folosind teste de legare GTPS, care au condus la identificarea mai multor eicosanoizi ce manifest activiti agoniste mpotriva TG1019. 4.4.7. Activitatea GPCR independent de ligand Expresia eteroloag a GPCRs poate determina niveluri de expresie relativ ridicate i, permite adesea detectarea ''activitii receptorilor constitutivi'' indepenent de agonist. Aceast proprietate a GPCRs a fost constatat, de asemenea, pentru mai muli oGPCRs, incluznd diveri GPCRs virali [Murphy i colab., 2001]. Studii recente au demonstrat c muli antagoniti, pentru o mare varietate de tipuri de receptori au capacitatea intrinsec de a scdea activitatea receptorilor constitutivi (Dingermann i colab.,2004). De aceea muli antagoniti au fost reclasificai ca agoniti inveri pe baza mai multor teste funcionale diferite, care spre deosebire de tehnicile de legare a radioligandului pot diferenia antagonitii competitivi de agonitii inveri. Au fost utilizate cu succes teste funcionale pentru identificarea medicamentelor candidate, care reduc rspunsul celular rezultat din activitatea receptorilor constitutivi, cum ar fi agonitii inveri, i medicamentele implicate n tratarea bolilor n care activitatea receptorilor independent de ligand poate fi important. Totui ar trebui s se aib n vedere, c rpunsul biologic agonist independent, observat aparent poate fi consecina unei permanente stimulri prin liganzi ubiquitari, care sunt produi de linia de celule utilizat pentru exprimarea receptorilor.

133

Activitatea receptorilor constitutivi este folosit ca o metod pentru identificarea liganzilor pentru receptori. Chiar dac nu toi GPCRs de tip slbatic prezint un nalt grad de activitate constitutiv, coexprimarea acestor receptori cu proteine G adecvate poate crete proprietile de semnalizare bazal, ca s permit oportuniti mai bune pentru identificarea de compui, care reduc activitatea intrinsec a unor astfel de receptori [Burstein i colab., 1997]. Alternativ, acetia pot fi proiectai ca receptori ''mutani activi constitutiv'' (CAM) ce sunt creai prin modificri induse de substituia unor aminoacizi n conformaia receptorilor. Receptorii CAM sunt, de obicei, creai pe baza unei analogii cu efectele activitii receptorilor care apar odat cu mutaia resturilor specifice n ali GPCR. O secven care este adesea analizat cnd un receptor CAM este dorit, este secvena DRY de aminoacizi tipic GPCR care se gsete n aval de al treilea domeniu transmembranar (TM3) al celor mai muli GPCRs i este implicat n interaciunea receptor-protein G. Un alt domeniu care poate fi luat n considerare pentru a genera CAM este TM6. Orientarea relativ TM3 i TM6 este considerat a fi important pentru activitatea receptorilor n trecerea de la forma inactiv la forma activ a GPCR i este nsoit de o schimbare n orientarea relativ a acestor dou domenii TM concomitent cu rotaia TM6. Crearea unui receptor CAM face ligandul agonist (natural) incapabil s induc un rspuns funcional al receptorilor ntr-un test celular, aceasta constituind baza tehnologiei de activare a receptorilor constitutivi (CART) [Chalmers i colab., 2002]. Cnd astfel de receptori CAM sunt creai i folosii n screeningul funcional, cea mai important este identificarea liganzilor prin capacitatea lor de a reduce activitatea intrinsec a receptorilor; cu alte cuvinte, pentru a identifica agonitii inveri pentru receptorul mutant. Ligandul identificat i /sau analogii apropiai de acesta pot fi apoi utilizai pentru studiul interaciuni lor poteniale cu receptorul de tip slbatic.

134

4.4.8. Strategii noi de screening Pe lng metodele de screening descrise de mai sus, mai multe tehnologii noi devin disponibile pentru caracterizarea GPCR i, deci, pentru screening-ul oGPCR. GPCRs transduc cea mai mare parte a semnalelor la proteine G heterotrimerice. Dup schimbarea GDP legat de subunitatea G n GTP, proteinele G heterotrimerice activate se disociaz de receptor ntr-o subunitate G legat la GTP i un heterotrimer G. Testele bazate pe fluorescen cu transfer de energie prin rezonan (FRET) utilizeaz mecanismul de transfer al energiei de la o component donor la o component acceptor, care este n funcie de distana dintre aceste dou componente. Prin urmare, testele bazate pe FRET pot fi folosite pentru a monitoriza distana ntre fluorofori. Recent, un astfel de test bazat pe FRET a fost adaptat pentru disocierea proteinelor G heterotrimerice odat cu activarea receptorilor [Janetopoulos i colab., 2001], rezultnd un test funcional care, n principiu, ar putea fi folosit pentru orice GPCR, cu condiia ca proteinele G fluorescente s interacioneze cu GPCRs n acelai mod ca i cu proteinele G de tip slbatic. Una din cele mai recente tehnologii implicate n domeniul de evaluare a activitilor biologice la nivel celular este componenta mare de screening. Principiul pentru aceast tehnic de screening se bazeaz pe reamenajarea spaial a proteinelor care apar n timpul iniierii proceselor de transducie a semnalului i, de aceea, aceste tipuri de teste sunt cunoscute sub numele de teste de translocare a proteinelor. Proteinele translocate pot fi monitorizate n timp, de exemplu, stimularea receptorilor pe baza proteinelor de fuziune fluorescente, cum ar fi, GFP din petele A.Victoria [Ghosh RN. i colab., 2000]. Valoarea testului o constituie recunoaterea spaial automat i cuantificarea fluoroforilor n celule prin algoritmii proiectai special, care teoretic poate fi realizat pentru mai muli fluorofori simultan, permind astfel monitorizarea automat a activrii cascadelor de transducie a diferitelor semnale n aceeai celul n acelai timp. La fel ca multe proteine care particip n cascadele de transducie a semnalului activate de GPCR, o ntreag gam de proteine poate fi luat n considerare prin marcare fluorescent n scopuri de screening cu coninut nalt, incluznd GPCRs, proteine G , arestine i de factori de transcripie, cum ar fi NF-kB
135

[Dingermann i colab., 2004]. GPCRs sunt translocai n mod normal de la suprafaa celular n endozomii acizi intracelulari, odat cu stimularea prelungit de ctre agoniti. Prin urmare, marcarea fluorescent a GPCRs, utiliznd, de exemplu GFP este utilizat adesea pentru a confirma intirea corect a GPCR exprimai de membrana plasmatic permind detecia noninvaziv a receptorului marcat odat cu stimularea receptorilor (fig. 4.5). Cu toate acestea, marcarea receptorului, poate modifica proprietile farmacologice ale receptorului. Alternativ, proteinele marcate fluorescent care joac un rol n desensibilizarea receptorilor pot fi de asemenea utilizate. Membrii familiei arestinelor sunt cel mai frecvent utilizate [Groarke i colab., 1999]. O nou metod pentru a determina specificitatea ligandului pentru GPCRs este imobilizarea funcional a GPCRs pe suprafa de sticl [Fang, 2002]. n acest mod, mai muli GPCRs pot fi evaluai simultan pentru ligandul lor sau pentru potenialul de legare al proteinei G, folosind liganzi marcai fie radioactiv sau fluorescent, fie prin folosirea rezonanei plasmatice de suprafa [Cooper i colab., 2002]. Cu toate c aceste tehnici trebuie s fie nc puse la punct, generarea de GPCRs funcionali pentru strategii noi HTS va oferi potenialul pentru deorfanizarea GPCRs prin screening-ul lor mpotriva liganzilor cunoscui .

Fig. 4.5. Marcarea GPCRs la nivelul captului C-terminal cu o protein fluorescent permite urmrirea proteinelor receptor n timp odat cu stimularea. Proteinele de fuziune GFP ale receptorului 2-adrenergic (A) sau pentru orexina 1 (C) determin o localizare asociat la membran a receptorilor. Stimularea receptorului 2-adrenergic cu receptorul 2 izoprenalin agonist (B) sau a receptorului orexinei 1 agonist(D), au ca rezult translocarea receptorilor marcai fluorecent din membrana plasmatic n vezicule localizate intracelular. 136

4.5. Perspective
Completarea secvenializrii genomului uman va permite dezvoltarea de poteniale molecule terapeutice candidate ndreptate mpotriva intelor noi, derivate din utilizarea datelor despre genom. Speranele genomice sunt legate de identificarea de noi medicamente int incluznd GPCRs [Venter i colab., 2001]; cu toate acestea, genomica este insuficient pentru a stabili dac o gen anume corespunde la un medicament int optim. Revoluia genomicii a propulsat progresul tehnologic, care promite s aib ca rezultat un proces rapid de validare a intei pentru etiologia bolii. n absena unor medicamente int viabile, identificarea intelor tradiionale a fost eludat prin cutarea iniial de molecule eficace n sistemele model pentru boal. n acest sens, dei acidul nicotinic a fost folosit zeci de ani pentru tratamentul dislipidemiei producnd o normalizare dorit a factorilor de risc cardiovascular, mecanismul de aciune a rmas necunoscut. Tunaru i colab. (2003) i Wise i colab., (2003) au identificat doi oGPCRs ca GPCRs cu afinitate mare i mic pentru acidul nicotinic, oferind posibilitatea de a dezvolta noi terapii. n mod similar au fost identificai LGR7 i LGR8 [Hsu i colab., 2001], receptori pentru hormonul relaxina, unul dintre primii hormoni de reproducere identificai [Civelli i colab., 1999]. Acetia sunt GPCR care aparin la o familie bogat n domenii de leucin care se repet. n ceea ce privete oportunitile pentru descoperirea medicamentelor, receptorii orfani arat un incredibil potenial ca inte n descoperirea medicamentelor. Multe proiecte care au ca scop descoperirea medicamentelor int utilizeaz genomul GPCR uman pentru abordarea genomic funcional cu scopul de a descoperi noi medicamente int. Legturile anticipate ntre validarea intelor bazate pe genomic i procesele de identificare de mare capacitate a liganzilor vor defini cile de exploatare farmacologic a datelor genomului. Cutarea de liganzi nativi pentru receptori orfani a fost iniiat pentru a permite descoperirea de numeroase neuropeptide noi care sunt propuse pentru a deveni punctul central al programelor implicate n descoperirea de noi medicamente. ntr-adevr, numeroase programe pentru deorfanizarea receptorilor au identificat de exemplu orfanina FQ/nociceptina [Meunier i colab., 1995],
137

orexinele/hypocretinele [Sakurai i colab., 1998], peptidul de eliberarea de prolactin [Hinuma i colab., 1998], peptidul ciclic urotensina II [Ames i colab., 1999], grelina [Kojima i colab., 1999] i apelina [Tatemoto i colab., 1998], ca liganzi neuropeptidici pentru receptori orfani. Identificarea liganzilor pentru aceti receptori a amplificat cercetarea neuropeptidelor, i aceti receptori sunt acum implicai ntr-o mare varietate de situaii fiziologice i patofiziologice, incluznd reglarea apetitului, aterosclerozei i transmiterea durerii. Pe baza omologiei secvenei oGPCR a fost identificat o ntreag familie de gene mas legate ce codific oGPCRs. Aceste gene sunt exprimate doar n anumite subtipuri de neuroni senzoriali care sunt cunoscui ca detectori de stimuli dureroi [Dong i colab., 2001]. MrgA1 i mrgA4, au fost ulterior identificai ca poteniali NPFF i respectiv NPAF GPCRs. MrgA1 i MrgC11 s-au dovedit de asemenea, a fi activai specific de agoniti surogat, sugernd c liganzii endogeni ai receptorilor Mrg sunt susceptibili de a fi peptide nrudite cu amidele RF (Y) G i / sau RF (Y) [Dong i colab., 2001]. Interesant este c un oGPCR legat de MrgA1 a fost identificat ca receptor pentru adenin [Bender i colab., 2002]. Mai mult dect att, SNSR1, un receptor care aparine la familia de GPCRs neuro-senzoriali specifici, este strns legat de MrgC11 i s-a dovedit c este activat de produii genei proencefalina A [Lembo i colab., 2002]. n final, odat cu activarea ligandului s-a descris cea mai mare i mai provocatoare etap ce implic utilizarea ligandului identificat pentru a evalua rolul fiziologic al receptorului i potenialul acestuia ca o int terapeutic pentru descoperirea de medicamente. Prin urmare, rmne nc provocarea pentru stabilirea de sisteme fiziologice i de biologie celular relevante, n care s se testeze eficacitatea acestor molecule. Este important ca n aceast etap s avem informaii complete i detaliate despre profilurile expresiei receptorilor i liganzilor att n esuturi normale, ct i patologice, cu scopul de a direciona aceste studii n modul cel mai eficient. n plus, disponibilitatea animalelor transgenice sau cu gene knockout poate fi de asemenea util n evaluarea funciei receptorului. Interesant, GPR8, identificat ca un receptor
138

pentru neuropeptidul W [Shimomura i colab., 2002], este absent, la roztoare, fcnd validarea intei pentru un astfel de receptor mai dificil. n cele din urm, cei mai muli, dac nu toi, receptorii orfani vor fi deorfanizai. Liganzii nativi nu au fost identificai nc pentru toi oGPCRs. Dei dezorfanizarea oGPCRs poate prea destul de simpl, de multe ori nu este aa de simplu. Exist, de exemplu, oGPCRs pentru care se cunosc liganzi sintetici care se pot lega i chiar activa proteinele G, cu toate c liganzii naturali pentru aceti receptori rmn necunoscui. Un exemplu de un asemenea receptor pentru care ligandul agonist sintetic a fost identificat este receptorul pentru bombesina 3 [Weber i colab., 2002]. Cu toate c disponibilitatea acestor agoniti a permis studii de farmacologie a receptorilor, inclusiv evaluarea ciilor de semnalizare care sunt activate de acest receptor, liganzii naturali pentru aceti GPCRs rmn necunoscui. Unora dintre oGPCRs li s-a atribuit importante roluri fiziologice. Pentru unii dintre oGPCRs exprimarea este indus de stimuli speciali care furnizeaz indicii poteniale pentru funcia receptorilor. Un exemplu de oGPCR cu un important rol fiziologic potenial este GPR30 [Carmeci i colab., 1997], un GPCR care este asociat cu exprimarea receptorului pentru estrogen n cancerul de sn i care pare a inhiba creterea celulelor [Ahola i colab., 2002]. Aceti oGPCRs ofer un incredibil potenial de inte medicamentoase pentru dezvoltarea de terapii valoroase. Este puin probabil ca actualul interes pentru GPCRs ca inte pentru medicamente se va diminua, dup ce mai muli oGPCRs se vor asocia cu ligandul lor natural. Implicarea acestora ntr-o multitudine procese fiziologice conserv interesul pentru oGPCRs. Progresele tehnologice viitoare vor accelera ritmul de descoperire a medicamentelor, i timpul va decide dac GPCRs deorfanizai vor oferi medicamentele int anticipate n viitor.

139

PARTEA A II-A: SINTEZA MEDICAMENTELOR PE BAZA ENZIMELOR I ACIZILOR NUCLEICI

CAPITOLUL 5 SINTEZA STEREOSELECTIV A MEDICAMENTELOR CU AJUTORUL ENZIMELOR RECOMBINANTE 5.1. Sinteza stereoselectiv nainte de apariia ingineriei genetice
Obinerea prin fermentaie (n 1880) a acidului lactic 1 optic activ a fost unul dintre primele procese de sintez stereoselectiv evideniate care a utilizat microorganisme naturale (fig. 5.1). n 1858, Pasteur a demonstrat c fermentaia srii de amoniu a acidului tartric cu Penicillium glaucum a indus formarea acidului tartric (S,S) 2.

Fig. 5.1 (R)- i (S)- acid lactic 1; (S,S)-acid tartric (2)

Pe msur ce descoperirea noilor medicamente, cu origine att natural ct i sintetic a progresat, i structura medicamentelor a fost elucidat, ele au fost obinute fie prin extracie din sursele naturale, fie prin procedee sintetice clasice. n ultimul caz, aceasta a condus n general la formarea amestecurilor racemice cnd moleculele au avut centrii optici activi. Tabelul 5.1 prezint cteva medicamente care erau disponibile n anii 80 ca amestecuri racemice.
140

Tabelul 5.1. Exemple de medicamente disponibile n 1980 ca amestecuri racemice

Nume

Structur chimic

Observaii

De curnd a fost demonstrat faptul ca enantiomeri diferii ai aceleiai molecule optic active nu ndeplinesc obligatoriu aceleai aciuni farmacologice. Dimpotriv, n cteva cazuri, enantiomerii (vezi capitolul 7)au manifestat arii total diferite ale activitii farmacologice, iar n unele cazuri au fost chiar toxici. Tabelul 5.2 prezint exemple de medicamente ai cror enantiomeri au activiti farmacologice diferite.
141

Cercetarea legturilor ntre structura i activitatea unei molecule a ajutat la nelegerea aciunilor farmacologice ale moleculelor medicamentelor. Necesitatea cercetrii medicamentelor chirale este bazat pe urmtoarele fapte: receptorii de pe suprafaa celular sunt molecule biologice care sunt deseori chirale (vezi capitolul 7) n ele nsele; moleculele eficiente ale medicamentelor trebuie s fie simetrice cu receptorul; compliana cu necesitile reglatorii. FDA (Food and Drug Administration) recomand companiilor de cercetare farmaceutic s evalueze strict dac o molecul nou a unui medicament poate sau nu poate s fi produs sub forma unui singur izomer.
Tabelul 5.2 Influena stereochimiei asupra activitii farmacologice a unor medicamente Nume Metildopa Penicilamina Propoxifen Metorfan Izoproterenol Enantiomer D inactiv antiartritic analgezic antitusiv activitate bronhodilatatoare puternic Enantiomer L antihipertensiv foarte toxic Antitusiv analgezic activitate bronhodilatatoare slab

Se cunotea c procesele de fermentaie implicau etape stereoselective. De asemenea s-a constatat, n cazul penicilinelor, c enzimele au capacitatea de a cataliza reacii chimice ntr-o manier stereoselectiv. Fermentaia i biotransformarea la nivelul celulei cu enzime izolate au constituit bazele sintezei stereoselective. n 1921, Neuberg i Hirsch au descoperit procesul de condensare a benzaldehidei 10 i acetaldehidei n prezena drojdiilor care conduce la formarea 1-hidroxi-1-fenil-2propanonei 12 optic active (fig. 5.2), cu formarea acidului piruvic 11 ca intermediar. Reacia este catalizat de enzima piruvat decarboxilaza. Compania farmaceutic german Knoll AG a utilizat acest component pentru a sintetiza chimic L-(-)-efedrina 13 printr-o metod patentat n 1930.

142

Fig. 5.2 Producia de L-efedrin prin biotransformarea stereoselectiv microbian

O alt etap important n biotransformarea stereoselectiv nainte de dezvoltarea ingineriei genetice a constituit-o descoperirea hidroxilrii stereo- i regioselective de ctre Rhizopus arrhuis a progesteronului 14 la 11--progesteron 15, un intermediar important pentru sinteza cortizonului 16 (fig. 5.3). Sinteza chimic a cortizonului este extrem de dificil i neviabil din punct de vedere economic. Descoperirea cii microbiene pentru hidroxilare a redus preul cortizonului la 3% din preul anterior.

Fig. 5.3 Reducerea microbian stereo- i regioselectiv a progesteronului la 11-hidroxiprogesteron

Varietatea substraturilor i tipurile reaciilor catalizate stereoselectiv de ctre biocatalizatori sunt n continu cretere. n tabelul 5.3 se prezint exemple de reacii stereoselective tipice din domeniul chimiei medicale, realizate cu biocatalizatori naturali.

143

Tabelul 5.3. Reacii stereoselective tipice realizate cu ajutorul biocatalizatorilor naturali Tipul reaciei Biocatalizatorul Oxidare Oxigenaza Dezaminare oxidativ Hidroxilare Reducere Aminare reductiv Esterificare Hidroliza Izomerizare Condensarea aldolilor
D-aminoacid oxidaza benzoatdioxigenaza piruvatdecarboxilaza leucin dehidrogenaza Lipaza

Substratul Simvastatina cefalosporina C Benzen Benzaldehida acid trimetilpiruvic acid 3-benziltio-2-metil propanoic (S)-ibuprofen metoxietil ester Glucoza N-acetilmanozamina

Produsul 6- hidroximetilsimvastatina -ceto-adipinil-7-ACA 1,2-cis-dihidroxicatecol (1R)-fenilacetilcarbinol

L-tert-leucina

Lipaza Izomeraza Aldolaza

catena lateral a zofenopril ibuprofen

D-fructoza

Acid N-acetilneruaminic

5.2. Metode clasice de mbuntire a tulpinilor pentru sinteza stereoselectiv

Metodele clasice de identificare a noilor enzime i microorganisme sunt bazate pe tehnici de screening, de exemplu a probelor de sol, sau colectarea tulpinilor prin mbogirea culturilor. n general, microorganismele izolate din natur produc enzima dorit la nivele prea mici pentru a realiza un proces de producie eficient din punct de vedere al costului. De aceea, clonarea i supraexpresia acestora este foarte benefic pentru dezvoltarea procesului. Nu toate microorganismele pot fi cultivate cu ajutorul tehnologiei comune de fermentaie.Procentul microorganismelor accesibile din totalitatea celor prezente ntr-o prob este estimat a fi ntre 0,001 i 1%, n funcie de originea probei. Problema este c numai o mic parte din enzimele prezente n natur sunt potrivite pentru evenimentele sintetice, iar anumite caracteristici precum activitatea, stabilitatea, specificitatea substratului i enantioselectivitatea pot fi mult sub necesiti [Bornsheuer, 2001]. Pn recent aceste limitri au fost depite prin metode precum screening-ul biocatalizatorilor alternativi, modificri ale sistemului de reacie (de la hidroliz la
144

esterificare), modificri ale parametrilor reaciei, etc. Din acest motiv, modificarea microorganismului este foarte util pentru dezvoltarea procesului. mbuntirea tulpinilor prin evoluie direct, ca n cazurile mbuntirii prin mutaie i selecie, a fost muli ani utilizat cu succes n multe aplicaii microbiologice industriale. Succesul obinut cu metoda mutaiilor genetice aleatorii i recombinarea cauzat de evoluia direcionat in vitro a fost semnificativ. Screening-ul sau selecia ulterioar pentru proprietile dorite conduce la identificarea enzimei necesare. Atunci cnd procesele evolutive sunt realizate n laborator, aceast aa-numit microevoluie ce apare n culturile bacteriene crescute n chemostat d natere la o specificitate enzimatic alterat. Rata produciei enzimelor existente i exprimarea genelor anterior dormante sunt fenomene tipic afectate de ctre microevoluie. Metodele clasice de mbuntire a tulpinilor s-au bazat pe utilizarea mutagenilor chimici i pe tehnici de selecie creative pentru identificarea tulpinilor superioare pentru atingerea unui anumit obiectiv. Aceste metode au fost utilizate cu succes n producia industrial a antibioticelor, vitaminelor i aminoacizilor. Cu toate acestea, profilurile genetice i metabolice ale tulpinilor mutante au fost foarte puin caracterizate, iar mutageneza a rmas un proces aleatoriu [Stephanopoulus i colab., 1998]. Metodele clasice ale mbuntirii tulpinilor pot fi sumarizate dup cum urmeaz: tehnici de screening; colectarea tulpinilor prin culturi mbogite; mutaii genetice aleatorii; evoluia direcionat in vitro; mutageneza chimic. Mutageneza tradiional nu are capacitatea de a nzestra o celul cu gene de la alt microorganism i nici nu poate s transfere funciile. Asemenea posibiliti au devinit realizbile odat cu implementarea tehnologiei ADN-ului recombinant.

145

5.3. Ingineria genetic i apariia enzimelor recombinante pentru sinteza stereoselectiv

Noile tehnologii pentru descoperirea i construirea enzimelor constituie motorul utilizrii acestora n industria farmaceutic . Stereoselectivitatea este unul dintre avantajele majore ale cilor biocatalizei pentru producia compuilor chirali. Ingineria genetic mpreun cu identificarea i amplificarea genelor structurale relevante au devenit alternative viabile la mutagenez i la procedurile de screening aleatoriu. Introducerea genelor n organisme prin utilizarea tehnicilor ADN recombinant este o metod important pentru construirea tulpinilor cu genotipul dorit. Efectul net este plasarea genei transferate n noua gazd pentru a ndeplini un scop biotehnologic specific. Oportunitatea de a introduce gene heterologe i elemente reglatoare permite construcia unor configuraii metabolice cu noi caracteristici benefice. n plus, aceast abordare nltur complicaiile mutaiilor necaracterizate care sunt obinute frecvent n urma mutagenezei celulelor. mbuntirea activitilor celulare prin manipularea funciilor enzimatice, de transport i reglatorii ale celulei cu ajutorul tehnologei ADN recombinant conduce la obinerea de tulpini industriale relevante ale microorganismelor. n ultimele dou decade, pentru multe microorganisme industriale au fost identificate i descoperite - prin intermediul tehnicilor ADN recombinant grupurile de gene pentru producia metaboliilor secundari, n special antibiotice. n ultimul deceniu progresele n domeniile biochimiei, chimiei proteinelor, clonrii moleculare, mutagenezei aleatorii i direcionate, tehnologiei de fermentaie, au oferit accesul nelimitat la o varietate de enzime i culturi microbiene ca procedee n sinteza organic. Acest proces a fost i mai mult accelerat prin chimia combinatoric, screening-ul biologic de mare capacitate i design-ul structural al medicamentelor. Cu toate acestea, succesele au fost modeste, parial datorit dificultii n predicia structurii exacte a proteinei necesare pentru reacia stereoselectiv a unui anumit substrat. A fost nregistrat un progres semnificativ n implementarea metodologiei mutaiilor i seleciei. Tehnologia DNA shuffling -cunoscut i sub denumirea de PCR
146

sexual- este o metod prin care se propag rapid mutaii genetice benefice ntr-un experiment direcionat ctre evoluie, presupunnd recombinarea omolog in vitro a genelor mutante selectate printr-o fragmentare ntmpltoare i reasamblare prin PCR .Aceast metod care mimeaz evoluia natural este implicat n recombinarea artificial a ADN i o banc de peptide cu un numr mic de secvene (1-200) de la fagi (care este disponibil n comer) permite selecia rapid a proteinelor exprimate de gene mutante. Progresul rapid al ingineriei genetice i dezvoltarea mai multor tehnici noi ale ADN recombinant ne ofer mijloacele necesare pentru design-ul, modificarea i proiectarea biomoleculelor naturale. Pentru aplicaii industriale, biomoleculele proiectate trebuie s fie stabile i active pentru utilizare mai ndelungat n condiii neobinuite, n intervale largi de temperatur, pH i mediu de reacie. Activitatea i stabilitatea susinute pot fi necesare n prezena solvenilor puternici, substraturilor nalt reactive, concentraiilor nalte de sruri sau pH-ului extrem. Din acest motiv, eforturile sunt direcionate spre ingineria fiziologiei celulare pentru a obine mbuntirea procesului. Obiectivul final al ingineriei metabolice este design-ul i crearea unor biocatalizatori potrivii, care sunt capabili s produc cantiti maxime ale produilor dorii. De asemenea, un obiectiv important este eliminarea sau reducerea formrii produilor secundari. Selecia genetic ne permite alterarea selectivitii biocatalizatorilor, mrirea tipurilor de substraturi i termostabilitatea, i conferirea de noi funcii proteinelor existente. De asemenea ne permite optimizarea proceselor n mai multe etape, i identificarea noilor peptide ligand pentru receptorii biologici i caracterizarea interaciunilor ligand-receptor in vivo [Taylor i colab., 2001]. Pentru a ncerca rezolvarea problemelor industriale relevante ale proceselor enzimatice, s-au fcut ncercri pentru a crea enzime care vor conferi sau mbogi proprieti utile prin utilizarea tehnicilor biomoleculare. Dei o abordare raional a modelului bazat pe relaia structur-funcie este larg utilizat, abordarea evoluiei direcionate este n general preferat pentru multe enzime industriale datorit dificultilor de a lega aplicaiile dorite de proprietile solicitate. Genomica
147

funcional, proteomica, fluxomica i fiziomica vor contribui semnificativ la dezvoltarea ingineriei cii metabolice. Bacteriile sunt gazde ideale pentru ADN-ul recombinant. Ele cresc rapid n supa nutritiv i accept ADN-ul unei specii strine pentru a fi copiat mpreun cu genele proprii. Multe bacterii posed ADN extracromozomial (plasmide) care se replic separat de genomul bacterian. Pn la jumtatea anilor 1990, Escherichia coli a fost gazda dominant pentru producia polipeptidelor i proteinelor farmaceutice. Prin utilizarea unei noi perechi ARNt-codon, o aminoacil ARNt sintetaz i un aminoacid, codul genetic al E. coli a fost extins pentru a ncorpora aminoacizi nonnaturali cu o fidelitate care o rivalizeaz pe cea a aminoacizilor naturali. n ultimii ani, din punct de vedere economic, producia compuilor farmacologici de ctre celulele mamiferelor a depit E. coli. Principalele metodele moderne de mbuntire a tulpinilor sunt urmtoarele: identificarea i amplificarea genelor structurale relevante; ADN recombinant i tehnicile ADN recombinant pentru manipularea funciilor enzimatice, de transport i reglatorii; mutageneza direcionat, n particular a reziduurilor cu situsuri active; mutageneza aleatorie prin diminuarea proteinelor cu selecie; clonarea molecular; chimia combinatorial; screening-ul biologic de mare capacitate; tehnicile shuffling DNA; alterarea topologiei proteinelor prin utilizarea mutazelor monomerice sau evoluiei direcionate. Odat ce prin tehnicile de inginerie genetic au nceput s se obin microorganisme i enzime cu nivele dorite de activitate i alte proprieti pentru exploatarea industrial, cteva procedee de sintez stereoselectiv au fost dezvoltate i mbuntite. Aceasta a avut o influen profund asupra metodelor de fabricaie ale unor compui farmacologici activi, aminoacizi, vitamine, i ali compui de interes medicinal. Tehnicile de inginerie genetic au permis obinerea pe scar larg a
148

multor enzime la preuri sczute. Biocatalizatorii au fost implicai comercial pentru sinteza intermediarilor compleci ai medicamentelor, substanelor chimice produse pentru utilizare specializat (specialty chemicals), substanelor chimice cu valoare monetar sczut care sunt comercializate n cantiti mari (commodity chemicals) utilizate n industria alimentar, farmaceutic i agrochimic [Liese i colab., 2000].

5.4. Antibioticele -lactamice

Studiile biosintetice au dovedit c antibioticele sunt derivate din precursori metabolici primari. Exemple ale unor astfel de precursori includ acizii grai cu lan scurt (acetat i propionat) i aminoacizii. Genele structurale ale unor astfel de enzime implicate n sinteza antibioticelor au fost clonate i caracterizate cu succes. n cazul antibioticelor -lactamice, aceste gene includ genele structurale ale (aminoadipoil)-l-cisteinil-D-valin (ACV) sintetaza. ACV este tripeptidic din calea de biosintez a antibioticelor -lactamice. 5.4.1. Penicilinele Penicilin acilaza de la E. coli a fost larg studiat pentru sinteza antibioticelor semisintetice. Strategiile implicate n mbuntirea expresiei penicilin-acilazei includ schimbarea sursei de carbon, coexpresia penicilin-acilazei cu proteine chaperone, creterea eficienei transcripionale i translaionale i utilizarea combinaiilor potrivite ale sistemelor gazd-vector. Necesitatea dezvoltrii sistematice a strategiei optime de expresie pentru supraproducia penicilin-acilazei la E. coli a devenit extrem de relevant. Aceasta deoarece produsul, acidul 6-aminopenicilanic (6-APA) 18, format prin hidroliza penicilinei G 17, este un compus iniial important pentru sinteza unui numr mare de antibiotice semisintetice -lactamice 19 (fig. 5.4). Vohra i colab., (2001) au clonat gena penicilin G - acilazei (PGA) (pac) ntr-un vector asd+ stabil (pYA292) i l-au exprimat la E. coli. Aceast tulpin recombinant a produs 1000 U PGA/g de mas uscat de celule, de 23 de ori mai mult PGA produs de E. coli ATCC 11105 parental. Creterea semnificativ a produciei pac a fost nsoit de absena represiei
149
L--

intermediarul

catabolitului glucoza, absena necesitii inductorilor precum acidul fenilacetic i izopropil--D-tiogalactopiranozidul, stabilitatea 100% a plasmidului pRT4 n absena unui marker selectiv n mediul de cretere, i absena formrii corpilor de incluziune. Asemenea proprieti sunt necesare pentru aplicaiile industriale.

Fig. 5.4. Structurile penicilinei G 17, 6-APA 18 i penicilinelor semisintetice 19.

PGA de la E. coli este o enzim industrial important utilizat pentru producia antibioticelor semisintetice din precursorii -lactamici 6-APA i acidul 7aminodezacetoximetilcefalosporanic (7-ADCA) 20. Au fost dezvoltate diferite sisteme recombinante pentru expresia nalt n care gena PGA clonat este sub controlul unui promotor puternic i n consecin PGA este supraprodus. Expresia genei cromozomiale este represat ntr-un mediu nesuplimentat cu inductor i expresia sa necesit prezena acidului fenilacetic (PAA) n mediu. PAA inhib de asemenea proteoliza intracelular a pre-proenzimei (ppPA) n citoplasm. Maresova i colab., (2001) au mbuntit o tulpin recombinant de E. coli RE 3 (pKA18) care supraproduce PGA din gena PGA a plasmidului utiliznd tehnica culturii continue n chemostat. Cultura n chemostat a bacteriilor recombinante conduce la obinerea componentelor pentru crearea unei noi tulpini de producie. n acest caz particular, nou tulpin recombinant cu caracteristici modificate a fost construit prin retransformarea gazdei dezvoltate ERE3 cu plasmidul ancestral pKA18.
150

Penicilin amidaza (acilaza) a fost pentru prima dat descoperit la Penicilliun chrysogenum Q176 n 1950. Descoperirea acestei enzime a contribuit n mare msur la obinerea industrial a antibioticelor -lactamice. n zilele noastre, E. coli i Bacillus megaterium sunt tulpini utilizate n special ca surs de enzim. Tehnicile de inginerie genetic au fost aplicate nc din anul 1979 pentru a obine tulpina hibrid de E. coli 5K, care a avut o activitate de 10x mai mare n ceea ce privete producia de enzim. Calea lizinei de la P. chrysogenum a fost supus ingineriei genetice pentru supraproducia de -lactam. Acest exemplu demonstreaz faptul c dezmembrarea genelor bifurcaiilor divergente a cii biosintetice conduce la canalizarea intermediarilor ctre produii finali dorii. Pe de alt parte, amplificarea unei gene specifice care codific o enzim prespus important a unei ci biosintetice nu se traduce obligatoriu n tulpini supraproductive din moment ce alte obstacole pot aprea dup ndeprtarea primului [Dingermann i colab., 2004]. Gena penicilin-acilazei (pac) din ADN-ul genomic al E. coli ATCC 11105 a fost clonat n vectorul pUC19 utiliznd tehnicile convenionale [Gumusel i colab., 2001]. S-a demonstrat c tulpina E. coli JM 109 transformat prin aceast construcie posed stabilitate plasmidic nalt. Glucoza manifest un efect represor asupra produciei de penicilin acilaz. Au fost stabilii parametrii optimi pentru enzima pac izolat i purificat. Lin i colab., (2001) au observat c producia penicilin acilazei recombinante poate fi crescut la E. coli prin creterea concentraiei intracelulare a proteazei periplasmatice DegP. Procesarea periplasmatic i corpii de incluziune au limitat supraproducia pac. Cantitatea acestor corpi de incluziune periplasmatici a fost semnificativ redus i activitatea pac crescut n urma coexprimrii DegP. Stabilitatea pac recombinant nu a fost afectat de expresia DegP. n acest caz, pentru prima data, s-a utilizat proteaza pentru reducerea cantitii corpilor de incluziune i mbuntirea produciei proteinei recombinante. Acelai grup a exprimat heterolog la E. coli gena pac a Providencia rettgeri pentru producia la temperatur nalt a penicilin-acilazei bacteriene. A fost posibil
151

producerea enzimei la o temperatur de 37oC, pH-ul culturii fiind aproximativ neutru [Huang i colab., 2000]. Activitatea de rezisten la antibiotice a fost n mod surprinztor descoperit la fragmente de ADN fr legtur funcional. Organismul hipertermofilic Pyrococcus furiosus nu prezint activitate -lactamazic. Cu toate acestea, un fragment de ADN care confer o rezisten la ampicilin foarte sczut, a fost izolat din biblioteca ADN-ului su genomic. Dup desfurarea a 50 de runde de shuffling i screening ADN la concentraii de ampicilin crescnde, activitatea de rezisten la ampicilin a acestei clone la E. coli a crescut semnificativ [Zhau i colab., 2002].

5.4.2. Cefalosporinele A fost dezvoltat i patentat o tulpin supus ingineriei genetice de Pseudomonas cepacia BY21 (KCTC 8922F), care este capabil s produc o cantitate mare de acid glutaril 7-aminocefalosporanic. Aceast acilaz catalizeaz reacia care produce acidul 7-aminocefalosporanic (7-ACA) 21, care este materia prim pentru antibioticele cefalosporinice semisintetice. Kim i colab., (2001) au clonat i exprimat gena care codific acilaza glutaril 7-ACA de la Pseudomonas diminuta KAC-1 n E. coli. Precizm c E. coli BL 21 care poart pET2B, construcia plasmidic pentru expresia nalt a genei acilazei glutaril 7-ACA, produce aceast enzim n procent de aproximativ 30% din proteinele totale, cu 3,2 U/mg de proteine. Creterea la o temperatura sub 31oC i deleia peptidului semnal au jucat un rol major n exprimarea nalt a genei acilazei 333 a P. dimunita KAC-1 n celulele recombinante de E. coli. Acilazele cefalosporinelor sunt un grup important de enzime industriale care hidrolizeaz cefalosporina C (CPC) 22 i/sau GL-7-ACA 23 la 21 (fig. 5.5). Zheng i colab., (2001) au obinut prin inginerie dou bacterii ce pot exprima gena care codific acilaza GL-7-ACA a Pseudomonas sp. 130 cu activitate nalt. Cea mai specific activitate a acilazei GL-7-ACA a fost prezent n celulele intacte comparativ cu cea a construciilor transformante.

152

Activitatea specific a acilazei GL-7-ACA a rmas constant la cea de-a 50-a generaie a mutanilor transferai pe o plac de agar. Tulpina de Pseudomonas SY-77-1 care produce GL-7-ACA 23 atunci cnd a fost supus unei mutaii a condus la obinerea unei tulpini, numit GK-16, a crei abilitate de a produce GL-7-ACA a fost de 20 de ori mai mare dect a tulpinii parentale. Aceasta s-a dovedit a fi potrivit pentru producia industrial de 7-ACA. Mai trziu, gena amidazei GL-7-ACA a fost sub-clonat n mai multe copii de plasmid pentru a mbunti activitatea de nc 6 ori.

Fig. 5.5. 7-ADCA 20, 7-ACA 21, CPC 22 i GL-7-ACA 23.

Procesele de producie a cefalosporinelor 7-ADCA i 7-ACA de ctre P. chrysogenum ce exprim o enzim cu activitate intens au fost studiate timp de civa ani i ofer exemple tipice de inginerie metabolic pentru extinderea spectrului produilor biocatalizatorilor [Nielsen, 2001]. DSM produce penicilina G/V prin

153

fermentaie cu ajutorul tulpinilor de P. chrysogenum care au fost mbuntite att prin metode clasice ct i prin inginerie genetic. Conversia in vitro a analogilor penicilinei N la cefalosporine a fost pentru prima dat demonstrat la celulele n stare dormant i extractele de Streptomyces clavuligerus NP1. Sim i colab., (2001) au optimizat rata de conversie a unei surse solubile nalt exprimat de deacetoxicefalosporina C sintetaza a S. clavuligerus recombinante NRRL 3585 (ScDAOCS) prin intermediul caracterizrii detaliate a necesarului de cofactori. Conversia penicilinei G i a ampicilinei au fost crescute de 21, respectiv 35 de ori. Excluderea ditiotreitolului (DTT) i a ascorbatului din reacie a avut un efect benefic asupra produilor de reacie. De asemenea, sulfatul de magneziu i clorura de potasiu nu sunt eseniale pentru aceste reacii. mbuntirea produilor prin ingineria metabolic a fost demonstrat i pentru alte sisteme. Skatrud i colab., (1989) au crescut producia de cefalosporin C de ctre Cephalosporium acremonium cu 15% prin supraexpresia genei cefEF. Unul din primele exemple care demonstreaz importana ingineriei cii metabolice este cel al produciei de cefalosporine. Pn n anul 2000, sinteza cefalexinei consta dintr-o etap de sintez organic (etapa 1), o etap de fermentaie (etapa 2) i dou etape enzimatice (etapele 3, 4) ( fig. 5.6).
Etapa 1: Etapa 2: Etapa 3: Etapa 4: Conversia benzaldehidei la D-fenilglicinamida Fermentaia cu glucidul i acidul adipic pentru a obine amida acidului adipic 7-ADCA Hidroliza enzimatic a amidei acidului adipic 7-ADCA la 7-ADCA acid adipic Condensarea enzimatic a 7-ADCA cu
D-

fenilglicinamida pentru a obine cefalexina Fig. 5.6. Progresul metodelor de sintez a cefalexinei

Procesul a fost comercializat de DSM i este bazat pe productivitatea nalt a tulpinii de Penicillium. Genele enzimelor tulpinilor de Cephalosporium au fost implantate tulpinilor de Penicillium. Aceast tulpin supus ingineriei a fost capabil sa converteasc zaharul direct la jumtate de 7-ADCA. Acest proces, care este mai
154

eficient, face ca ruta chimic s fie inutil. Ca urmare, compuii chimici toxici precum acidul peracetic, diclormetanul, pentacloridul fosforic, clorura de trimetilsilil, trimetilamina clorhidric, bis(trimethyulsilil) ureea, acidul fenilacetic i n-butanolul, care erau necesare pentru sinteza chimic, nu mai sunt utilizate. Procesul ce const din dou etape pentru 7-ADCA conduce la o reducere a consumului de solvent cu aproximativ 90%, a reactivilor auxiliari cu 100%, a energiei cu aproximativ 40% i a deeurilor cu aproximativ 15%. Recent, BristolMyers Squibb a patentat un proces pentru producia direct a dezacetilcefalosporinei C prin cultivarea unei tulpini de Acremonium chrysogenum care conine acid nucleic recombinant ce codific esteraza cefalosporinei Rhodosporidium toruloides. Producia 7-ACA a fost facilitat prin utilizarea tehnicilor de inginerie genetic.
D-aminoacid

oxidaza (DAAO) este o flavoenzim nalt stereoselectiv ce catalizeaz

dezaminarea oxidativ a D-aminoacizilor pentru a produce -cetoacizii corespunztori i amoniac. Enzima este larg rspndit la mamifere i eucariote. Numai cteva enzime, precum cele din rinichiul de porc i din drojdiile Rhodotorula gracilis i Trigonopsis variabilis, au oferit o preparare omogen. Coenzima, FAD redus, este reoxidat spontan de ctre oxigenul molecular pentru a forma peroxidul de hidrogen. Studii detaliate asupra proprietilor DAAO a R. gracilis (RgDAAO) au artat c aceast oxidaz are proprieti favorabile pentru aplicaii industriale. Cea mai important aplicaie industrial este bioconversia cefalosporinei C n prima reacie a cii de dou etape pentru obinerea 7-ACA, iar cea de-a doua reacie o constituie dezacilarea catenei cefalosporinei C de ctre GL-7-ACA acilaza. Utilizarea acestei flavozime este deseori nsoit de probleme care provin din procesul de purificare costisitor, turnover-ul sczut al enzimei i pierderea coenzimei. Acelai grup a creat His-tagged RgDAAO pornind de la o protein himeric recombinant cu ase reziduuri de aminoacizi la captul N-terminal. Aceast protein His-tagged a fost exprimat cu succes la E. coli ca o protein solubil i o holoenzim complet activ. Nu au fost observate n cantiti semnificative activiti secundare, precum activitate -lactamazic sau catalazic.

155

Enzima a fost activ i a avut o stabilitate termic crescut dup imobilizarea covalent la matrice. Enzima a putut fi utilizat repetat dup simpla recuperare din mediul de reacie [Dingerman i colab., 2004]. Ca i n cazul obinerii cefalexinei, fabricarea 7-ACA din cefalosporina C prin utilizarea DAAO s-a dovedit a fi un proces de chimie verde. Utilizarea solvenilor clorinai, aditivilor toxici i a temperaturilor extrem de sczute sunt evitate. Procesarea n continuare este simplificat datorit puritii produilor rezultai. Faptul c exist peste 50 de patentri referitoare la biotransformarea cu DAAO indic semnificaia sa industrial. Tehnicile de inginerie genetic au fost utilizate cu succes pentru modificarea caracteristicilor enzimelor n vederea creterii produciei de medicamente. Esterul pnitrobenzil 24 al cefalosporinei Loracarbef 25 este puin solubil n ap i dimetil formamida este utilizat ca i cosolvent. Cu toate acestea, esteraza din Bacillus subtilis, care hidrolizeaz esterul la Loracarbef, este inhibat de DMF (fig. 5.7).

Fig. 5.7. Biotransformarea stereoselectiv n sinteza Loracarbef 25.

Combinaia epPCR i DNA shuffling a condus la generarea unei variante cu o activitate de 150 de ori mai mare comparativ cu tipul slbatic n DMF 15%. Termostabilitatea acestei enzime a fost crescut cu aproximativ 14oC prin evoluie dirijat [Giver i colab., 1998].

156

5.5. Antibioticele poliketide

Antibioticele poliketide sunt compui naturali produi de ctre organisme eucariote, procariote i plante. Ele sunt parial alctuite dintr-un lan de atomi de carbon carbociclic sau aliciclic derivat din condensarea acizilor carboxilici. Ele sunt construite din uniti simple ale unor structuri specifice ce conin ntre 2 i 5 atomi de carbon. Biosinteza lor de ctre poliketid sintaza este similar cu biosinteza acizilor grai, cu condensri repetitive ale tioesterilor acil. Modul n care aceste uniti sunt asamblate de ctre un complex enzimatic determin structura final a compuilor produi. Ele exprim un spectru larg de activiti biologice, incluznd activitate antiinfecioas (eritromicina), imunosupresoare (rapamicina) i carcinogenetic (aflatoxina). Poliketidele au reprezentat aproximativ 3% din vnzrile globale de produse farmaceutice n 1998, cu o valoare estimat de 8,5 miliarde de dolari. In tabelul 5.4 se prezint microorganismele supuse ingineriei genetice utilizate pentru producia poliketidelor de interes farmacologic.
Tabelul 5.4. Microorganisme supuse ingineriei genetice pentru sinteza poliketidelor Tulpina obinut prin inginerie genetic Streptomyces peucetius SGF107 Saccharopolyspora erytrea recombinant Mutantul ATCC 31780 i L9 al Streptomyces avermitilis Streptomyces coelicolar, clonat i exprimat cu genele Sorangium cellulosum Streptomyces galilaeus, clonat i exprimat cu genele pentru biosinteza actinorodinei Produsul, observaii producie crescut de daunomicin producie mbuntit de eritromicin producie crescut de avermectin biosinteza eficient a agentului anticanceros epotilona biosinteza antrachinonelor aloesaporanina II i dezoxi-eritrolacina

Primul exemplu de generare a unei poliketide noi prin manipulare genetic a genei poliketid sintazei (PKS) a fost raportat n 1990 de ctre grupul lui Strohl (1997). Clonarea genelor de biosintez a actinorhodinei la tulpinile productoare de aclarubicin ale Streptomyces galilaeus a condus la biosinteza de antrachinone aloesaponarin II i dezoxieritrolacina.

157

Laboratoarele lui Hopwood (1997) au dezvoltat i utilizat cu succes o abordare combinatorial a generaiei unui nou tip de produi PKS II prin combinarea i potrivirea unor gene diferite ale tipului II al PKS. Poliketidele semisintetice sunt create prin modificarea poliketidelor bioactive, naturale [Strohl, 1997]. De cnd microorganismele au nceput s dezvolte gradat rezisten la poliketide, ingineria genetic ofer mijloacele pentru crearea unei noi diversiti i eficaciti. Antraciclinele precum daunorubicina 26 (daunomicina) i doxorubicina 27 (adriamicina) (fig. 5.8) sunt antibiotice cu activitate antitumoral important. Cu toate acestea, ele sunt foarte scumpe datorit titrurilor sczute i a formrii unui amestec complex de compui de ctre bacteriile productoare, Streptomyces lividans, conducnd la utilizarea unor tehnici subsecvente costisitoare. Rosabal i colab., (2001) au clonat i secveniat fragmentul de ADN cromozomial de la Streptomyces peucetius SGF-107 productoare de daunomicin, care activeaz biosinteza a dou antibiotice poliketidice, daunomicina i actinorhodina. Secvenierea parial a ADN-ului fragmentului activator a artat c exist dou cadre de citire, ai cror produi prezint similariti cu aceia ai altor factori reglatori ai transcripiei din familiile MarR i ArsR. Producia daunomicinei a crescut de 8 ori la tulpina recombinant. Prezena plasmidului recombinant a fost testat n timpul i dup procesul de fermentaie. El a fost evideniat la sfritul procesului de fermentaie. Activarea a fost observat la cteva tulpini. Majoritatea activitii n domeniul ingineriei biosintezei poliketidelor s-a concentrat asupra ingineriei biosintezei eritromicinei 28, care este n mod natural produs de ctre Saccharopolyspora erythrea. Biosinteza implic numai trei gene gigant, fiecare codificnd o protein de peste 300kDa. Fiecare protein este n schimb constituit din dou domenii ce se repet inexact i care pot fi divizate n ase module. De fapt, moleculele noi pot fi generate prin utilizarea diferitelor combinaii i permutri ale acestor modele, precum i prin introducerea mutaiilor punctiforme n domeniile funcionale.

158

Fig. 5.8. Structurile daunorubicinei 26, doxorubicinei 27, eritromicinei A 28, avermectin A1a 29 I epotilonei A 30.

Actinomicetele n general, i speciile Streptomyces n particular, au fost considerate ca fiind printre cele mai importante microorganisme din punct de vedere industrial, datorit abilitii lor de a sintetiza o gam larg de antibiotice i ali metabolii secundari. Dintre toi metaboliii secundari ce au activitate antihelmintic, avermectina 29 este considerat cel mai important metabolit datorit potenei comerciale superioare. Avermectina a nlocuit cteva medicamente convenionale datorit activitilor antihelmintice excelente. Cteva studii de biologie molecular au fost desfurate pentru a nelege calea i reglarea biosintetic.
159

Hwang i colab., (2001) au studiat condiiile optime de pH pentru transformarea eficient a protoplastelor i celulelor intacte la mutanii de Streptomyces avermitilis ATCC 31780 i L9 productori de avermectin. Ei au descoperit c pH-ul tamponului protoplastului a fost cel mai important factor care influeneaz eficiena transformrii. Ei au dezvoltat i optimizat un proces de electroporare a celulelor intacte fr tratament cu lizozim pentru a compensa scderea productivitii ca rezultat al procesului de formare a protoplastelor. Agentul poliketid anticanceros epotilon 30 stabilizeaz microtubulii ntr-o manier similar taxolului. Calea sa biosintetic a putut fi transplantat la o gazd cu proprieti de producie mai bune. Astfel, se pare c acest produs natural poate fi transferat la alte gazde pentru a crete cantitatea i productivitatea. n timp ce productorul de epotilon Sorangium cellulosum produce numai aproximativ 20mg/L de poliketide, cu un timp de dublare de 16 ore, clonarea i expresia genelor la actinomicetul Streptomyces coelicolar a produs epotilone A i B la o replicaie de 10 ori mai rapid.

5.6. Vitaminele
Tehnicile de inginerie genetic au influenat metodele de producie a diferitelor vitamine. 5.6.1 Acidul L-ascorbic (vitamina C) Microorganismele au jucat ntotdeauna un rol important n obinerea industrial a vitaminei C 38. nc din 1923 s-a descoperit c bacteria Acetobacter suboxydans avea abilitatea s realizeze oxidarea regiospecific a D-sorbitol 32, care a fost obinut prin reducerea chimic a
D-glucozei

31 la

L-sorboz

33 (fig. 5.9). Aceast

L-sorboza

biotransformare este realizat i de Gluconobacter oxydans. sub numele de procedeu Reichstein-Gruessner.

este un

intermediar important pentru obinerea vitaminei C prin acest procedeu, cunoscut i

160

Fig. 5.9. Procedeul ReichsteinGruessner pentru sinteza acidului L-ascorbic 38.

Procedeul Reichstein-Gruessner este foarte laborios i prezint limitri din punct de vedere economic i al mediului. Din acest motiv, au fost depuse eforturi pentru a descoperi i dezvolta tehnologii alternative cu ajutorul ingineriei genetice (tabelul 5.5). Sonoyama i colab., (1982) au descris un proces de fermentaie n tandem n care oxidarea microbial a D-glucozei la 2,5diceto-D-gluconat (2,5-DKG) este realizat de speciile de Erwinia. Reducerea ulterioar a 2,5-DKG la intermediarul 2-ceto-L-gulonat (2-KLG) este catalizat de speciile Corynebacterium. ntr-un efort de a restrnge toate aceste etape ntr-un proces cu o singur etap, speciile de Erwinia herbicola au fost transformate genetic cu gena Corynebacterium, care codific 2,5-DKG reductaza, enzima care catalizeaz conversia 2,3-DKG la 2KLG. Dup optimizarea condiiilor de cultur, aceste tulpini recombinante de Erwinia au produs aproximativ 120g/L de 2-KLG n 20 de ore, cu o producie molar din glucoz de aproximativ 60%, comparativ cu aproximativ 50% pe calea clasic. Studiile ulterioare au ilustrat viabilitatea economic potenial a tulpinilor supuse

161

ingineriei metabolice pentru producia de vitamina C i au condus la un numr mare de licene n SUA [Hardy i colab., 1990].
Tabelul 5.5. Microorganisme supuse ingineriei L-ascorbic (dup Dingermann i colab., 2004) Microorganism Reacia catalizat D-sorbitol la L-sorbitol Acetobacter suboxydans Gluconobacter oxydans D-glucoza la 2,5-DKG Specii de Erwinia 2,5-DKG la 2-KLG Specii de Corynebacterium Erwinia herbicola cu gena Dglucoza la 2-KLG Corynebacterium ce codific 2,5-DKG Reductaza Gluconobacter oxydans TD-sorbitol la 2-KLG 100 clonat cu gene de la via L-sorbozon Gluconobacter melanogenus sau gluconobacter oxydans UV10 Culturi combinate de D-glucoza la 2,5-DKG via D-gluconat i 2Flavimonas oryzihabitans OA2 i KDG substraturi Pseudomonas genetice pentru sinteza acidului Observaii Oxidare 2 etape, fermentaie n tandem fermentaie ntr-o singur etap

cantiti mbuntite de 2-KLG

transformare cepacia 3/27

microbian

cu

O alt abordare este convertirea

D-sorbitolului

sau L-sorbozei la 2-KLG prin

intermediul L-sorbozonei. Gluconobacter melanogenus i Gluconobacter oxydans UV10 au enzimele necesare, o dehidrogenaz sorboz-FAD localizat n membran (SDH) i NAD(P)- L-sorbozona DH (SNDH) citoplasmic. Genele care codific SDH i SNDH au fost clonate la tulpina G. oxydans T-100 productoare de 2-KLG. Lsorboza a fost consumat complet. Tulpinile recombinante au fost capabile s mbunteasc cantitile de 2-KLG la 230%. Sulo i colab., (2001) au convertit D-glucoza la 2,5-DKG cu o producie de 92% n 150 de ore prin fermentaie utiliznd o cultur combinat de dou bacterii Gram-negative izolate din sol. Prima tulpin, Flavimonas oryzihabitans OA2, produce 2-KDG din D-glucoz via D-gluconat. Cea de-a doua tulpin, Pseudomonas cepacia 3/27 convertete 2-KDG la 2,5-DKG. Aceast abordare a oferit o nou posibilitate de a produce acid ascorbic prin transformare microbian cu substraturi mai convenabile i ofer ci importante pentru ingineria genetic.
162

5.6.2. Biotina (Vitamina B8, Vitamina H) Un nutrient esenial pentru multe microorganisme i animale, biotina 39 este obinut printr-o metod de sintez chimic complicat i costisitoare aa-numitul proces Goldberg i Sternbach. Studiile conectate la calea metabolic pentru sinteza biotinei din CoA-pimelic au fost pentru prima dat realizate la E. coli. n continuare au fost identificate toate enzimele implicate n sinteza biotinei din acidul pimelic de la Bacillus sphaericus. S-a descoperit c mutanii B. sphaericus i Serratia marcescens, care erau rezisteni la acidomicin analogii biotinei i acidul 5-(2tienil)-n-valeric, secretau cantiti semnificative de intermediari ai cii biotinei. Aceasta a condus la izolarea genelor de interes din aceste organisme. Genele implicate n sinteza biotinei sunt organizate n dou grupuri, bioXUF i bioDAYB i au fost clonate la vectori E. coli. Dup care E. coli transformat cu aceste gene a produs concentraii relativ nalte de biotin i intermediari. Similar, pentru a crete i mai mult productivitatea de biotin a mutanilor S. marcescens, operonii biotinei au fost clonai pe cteva plasmide. Aceste plasmide hibride purtau fragmente de ADN de 7,2 kb, ce codificau cinci gene ale sintezei biotinei. Reintroducerea la mutanii de S. marcesens a permis selecia unei tulpini recombinante ce prezint un nivel nalt de producie a biotinei [Baets i colab., 2000]. 5.6.3. Riboflavina (Vitamina B2) Riboflavina 40 (fig. 5.10) utilizat n nutriia i terapia uman este produs att prin procese sintetice ct i de fermentaie. Dei bacteriile (speciile de Clostridium) i drojdiile (speciile de Candida) sunt productori eficieni, doi fungi asemntori, Ashbya gossypii i Eremothecium ashbyii, sunt considerai productori exceleni de riboflavin. Calea de biosintez a riboflavinei implic o etap cheie de conversie a ribuloz-5-fosfatului la 3,4-dihidroxi-2-butanon-4-fosfat. Aceast etap este catalizat de enzima 3,4-dihidroxi-2-butanon-4-fosfat sintetaza. Aceast enzim a fost purificat din drojdia flavinogenic Candida guilliermondii precum i din E. coli. Gena sintetazei E. coli a fost clonat, secveniat i exprimat. Aceast gen codific

163

o protein de 24 kDa, avnd aceeai mrime ca i enzima drojdiei. Se ateapt ca procesele de fermentaie fie cele mai utilizate n viitor [Baets i colab., 2000].

Fig. 5.10. Structurile biotinei 39, riboflavinei 40 i nicotinamidei 42.

5.6.4 Nicotinamida (vitamina B3 sau PP) Un proces microbian pentru conversia 3-cianopiridinei 41 la nicotinamida 42 a ctigat relevan industrial n ultimii ani. Hidroliza alcalin chimic a 3cianopiridinei la nicotinamid (fig. 5.11) este acompaniat de o cantitate de 4% de acid nicotinic. Microorganismul utilizat pentru biotransformare este o tulpin de Rhodococcus rhodochrous J1 ce exprim activitate 3-cianopiridinazic (nitrilaz). Cnd enzima este indus cu benzonitril, amoniacul rezultat este utilizat ca surs de azot pentru cretere. Acidul nicotinic nu este metabolizat ulterior. Acest acrilonitrilului [Petersen, Kiener, 1999]. microorganism a ctigat importan industrial pentru producerea acrilamidei prin hidroliza

Fig. 5.11. Hidroliza 3-cianopiridinei 41 la nicotinamida 42 164

5.6.5 Vitamina B12 Sursa natural primar de vitamina B12 o constituie activitatea metabolic bacterian. n industrie, Propionibacterium shermanii i Pseudomonas denitrificans au fost utilizate pentru cantitile mari produse i pentru abilitatea lor de a crete rapid. Tratamente mutagene, precum lumina UV, etileneimina, nitrozometiluretanul, etc., au condus la o mbuntire a productivitii, dar adugarea ionilor de cobalt i frecvent 5,6-dimetilbenzimidazol (5,6-DBI) nu pot fi realizate. Precursorii poteniali precum glicina, treonina i acidul
D-aminolevulinic

au un efect benefic asupra

sintezei vitaminei B12. S-a descoperit c betaina i colina au un efect stimulator puternic asupra produciei de vitamina B12. Mai mult, mutanii cu porfirin puin i mutanii catalaz-negativi sunt n general supraproductori de vitamin B12. Fermentaia industrial este realizat n dou etape: o etap iniial anaerob care declaneaz creterea i biosinteza cobamidei, i o trecere ulterioar la un proces aerob, care promoveaz biosinteza 5,6-DBI i conversia cobamidei la cobalamin. Creterea P. denitrificans are loc n paralel cu sinteza cobalaminei n condiii de aerobioz atunci cnd 5,6-DBI i srurile de cobalt sunt adugate direct la cultur. Prin tehnici de mutaie i selecie, au fost obinute tulpini care produc peste 150 mg de vitamina B12/L. Mai mult, cteva derivate ale vitaminei B12, precum hidroxicobalamina i coenzima B11, pot fi produse prin fermentaie direct. Cteva tulpini de P. denitrificans obinute prin inginerie genetic au fost construite sistematic n laboratoarele Aventis, liderul mondial n producerea vitaminei B12. 5.6.6 Acidul pantotenic (vitamina B5) n producia industrial a acidului D-(-)-pantotenic 45, este realizat reducerea stereospecific, microbian, a ketopantoil lactonei 43 la D-(-)-pantoilactona 44 cu celule splate de Rhodotorula minuta sau Candida parapsilosis (fig. 5.12). Condensarea subsecvent cu -alanina conduce la obinerea acidului pantotenic. Takeda Chemical Industries a dezvoltat un proces de fermentaie direct pentru acidul
D-pantoic

46 i acidul D-pantotenic 45 (fig. 5.13).

165

Fig. 5.12. Reducerea microbian stereospecific a cetopantoil lactonei 43 la D-(-)pantoillactona 44

Fig. 5.13 Acidul D-pantotenic 45 i acidul D-pantoic 46

Cteva genuri de Enterobacteriaceae (Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter i Escherichia), cu rezisten la acidul salicilic i/sau acidul -cetoizovaleric, acidul acetobutiric, acidul -aminobutiric, acidul -hidroxi-aspartic i O-metil treonina, au fost selectate ca tulpini cu productivitate mare. Mutanii de E. coli i tulpinile recombinante, care au fost transformate cu plasmide purttoare de gene implicate n biosinteza acidului pantotenic, produc cantiti de acid D-pantotenic din glucoz, alanina ca precursor [Baets i colab., 2000]. Degussa a patentat recent un proces pentru prepararea acidului D-pantotenic prin fermentaia bacteriilor Coryneforme n care secvena nucleotidelor ce codific pentru gena Zwa1 este supraexprimat [Dusch, Thierbach, 2002]. Procesul include urmtoarele etape: fermentarea bacteriilor productoare de acid D-pantotenic la care cel puin o gen ce codific Zwa1 este supraexprimat; concentrarea acidului D-pantotenic n mediu sau n celulele bacteriene; izolarea acidului D-pantotenic produs.
166

5.6.7. Vitamina A Un alt exemplu de aplicaie a ingineriei metabolice pentru a converti intermediarii metabolici nativi la produii finali este producia -carotenului precursor al vitaminei A. Transformarea genetic a Zymomonas mobilis i Agrobacterium tumefaciens cu patru gene ale -carotenului a condus la formarea coloniilor galbene pe placa de agar. Aceste colonii conineau cantiti suficiente de precursor [Misawa i colab., 1990]. 5.6.8. Vitamina K (Menaquinona) Un factor antihemoragic larg utilizat n medicin pentru variate tipuri de simptome hemoragice, vitamina K este produs prin sinteza chimic. Vitamina K2 este prezent numai la bacterii (nu i la fungi i drojdii). Bacteriile facultativ anaerobe conin n particular vitamina K2 i omologii si. Flavobacterium meningosepticum a fost identificat ca un productor important al metabolitului. Un mutant al acestui microorganism, care a fost rezistent la inhibitorul biosintezei vitaminei K2, 1-hidroxi-2-naftoat (HNA) a fost selecionat. Acest mutant produce o cantitate mare de vitamina K2 intracelular ntr-un mediu ce conine -tirozin i izopentanol. Procesele de fermentaie microbian pentru sinteza specific a analogilor vitaminei K pot deveni disponibile pentru comercializare n viitorul apropiat [Baets i colab., 2000]. 5.7. Steroizii Mutanii speciilor de Mycobacterium, care sunt lipsii de activitatea de degradare a inelului steroidian, au fost utilizai la Schering pentru producia androstendionei i androstadiendionei la o scal de 200m3. Aceti intermediari sunt utilizai pentru sinteza ulterioar a medicamentelor steroidiene utiliznd cile chimice i biotehnologice. Cile biotehnologice care au obinut semnificaie comercial includ hidroxilarea (la poziiile 11 sau 11 cu specii de Curvularia), dehidrogenarea (poziia 1; hidrocortizon la prednisolon) i reducerea (17-ceto reducerea). Au fost utilizate de asemenea proteine mediator. Pe baza tehnicilor de inginerie genetic, s167

au produs noi tulpini care au fost utilizate n sinteza compuilor steroizi. Dumas i colab., (2002) au produs tulpini cu activitate 20 -hidroxisteroid dehidrogeneza sczut. Astfel, cantitatea i selectivitatea proceselor de biotransformare a steroizilor sunt mbuntite. Mai mult, produsul obinut este de puritate nalt.

5.8. Alte medicamente

5.8.1. L-Dihidroxifenil alanina (L-DOPA)
L-DOPA

este un aminoacid optic activ utilizat n tratamentul bolii Parkinson.

L-tirozina

Metoda tradiional de producere a L-DOPA pornete de la compusul dihidroxifenil i implic fie cataliza omogen, fie biocataliza. Deoarece are o grupare hidroxil fenolic mai puin dect L-DOPA, eforturile s-au ndreptat ctre hidroxilarea cu ajutorul biocatalizatorilor. Pn recent acest lucru nu era posibil datorit faptului c hidroxilarea subsecvent conducea la formarea contaminanilor trihidroxilai. Kramer i colab., (2001) au clonat genele pentru constituirea 4-hidroxifenilacetat-3hidroxilazei, monooxigenazei i FADH2-NADH oxidoreductazei, ntr-un vector pentru E. coli. Genele corespunztoare hpaB i hpaC au fost exprimate funcional i s-a produs sinteza direct a L-DOPA din L-tirozina. 5.8.2 Crixivan Compusul cis-(1S2R)-indandiol 47 este un precursor al unei ci biosintetice pentru producia inhibitorului proteazei virusului imunodeficienei umane Crixivan, care este forma sulfat a indinavirului 48 (fig. 5.14). Cu ajutorul mutagenezei aleatorii genei care codific dioxigenaza toluenului din Pseudomonas putida, Zheng i colab.,(2000) au mbuntit obinerea de indinavir.

Fig. 5.14. Cis-(1S,2R)-indandiol 47 i indinavir 48. 168

5.8.3 Acidul N-Acetil Neuraminic (NANA) NANA 51, cunoscut i sub denumirea de acid sialic, este substratul neuraminidazei virusului influenza. Aceast enzim a fost prima enzim descoperit asociat unui virus. Civa analogi ai NANA au fost dezvoltai i unii dintre ei, precum Zanamivir sunt inhibitori eficieni ai virusului influenza A. Enzima Neu5Ac (NANA) aldolaza (sintaza) catalizeaz formarea NANA din N-acetilD-manozamina 50, un epimer al N-acetilD-glucozaminei 49 (fig. 5.15).

Fig. 5.15 Biotransformarea N-acetil-D-glucozaminei 49 la NANA 51 via N-acetil-Dmanozamina 50.

Tehnicile de inginerie genetic i-au propus s obin o expresie mai bun a acestei enzime. Mahmoudian i colab., (1997) au dezvoltat i imobilizat procesul enzimatic pentru producia NANA utiliznd Neu5ac aldolaza din tulpinile recombinante de E. coli. Tulpina de E. coli TG1 (pMexAld) a fost construit i produce cantiti mai mari de Neu5Ac aldolaza. Sintetaza NANA de la Neisseria meningitidis serogrup B a fost obinut prin expresia genei clonate. Gena siaC a serogrupului B al N. meningitidis a fost clonat prin PCR cu ajutorul primerilor derivai dintr-o secven disponibil. Necesitile substratului sintetazei indic faptul c are un numeroase avantaje fa de alte aldolaze. Tehnicile de inginerie genetic au fost introduse n procesul enzimatic dezvoltat pentru NANA de ctre Kragl i colab., (1991). Tabata i colab., (2002) au cuplat bacteriile ce exprim N-acetil-D-glucozamin 2-epimeraza i sintetaza acidului N-acetil-D-neuraminic pentru a produce NANA. Gena srl1975 a Synechocystis sp. PCC6803, o cianobacterie fototropic, a fost clonat prin PCR i exprimat la E. coli,
169

iar E. coli recombinant prezint activitate GlcNAc2-epimerazic. Acesta este primul exemplu de clonare a genei GlcNAc2-epimeraza de la procariote. 5.8.4. Inhibitorii biosintezei colesterinei (HMG-CoA Reductase Inhibitors) Compusul chiral (S)-4-cloro-3-hidroxibutanoate (CHBE) 53 este un element important n sinteza acizilor 4-(2-(ariletil)hidroxifosfinil)-3-hidroxi-butanoici, o nou clas de inhibitori selectivi ai biosintezei colesterolului. CHBE a fost produs prin reducerea ceto-esterului corespunztor, esterul acidului 4-cloro-3-oxo-butanoic cu alcoolul etilic (COBE) 52 cu ajutorul unei dehidrogenaze NADPH-dependente de la Geotrichum candidum SC 5469 (fig. 5.16). Cu ajutorul clonrii moleculare i a supraexpresiei genei ce codific pentru carbonil reductaza NADPH-dependent a Candida magnoliae, aceeai biotransformare a fost realizat pentru a obine un produs cu exces enantiomeric 100%. Gena S1 a fost supraexprimat la E. coli, iar enzima astfel exprimat a fost purificat i a avut aceleai proprieti catalitice ca i enzima C. magnoliae. Biotransformarea a avut loc ntr-un sistem cu dou etape utiliznd n-butil acetatul.

Fig. 5.16 Reducerea stereoselectiv a esterului acidului (R)-4-cloro-3-oxobutanoic cu etanolul (COBE) 52 la (S)-4-cloro-3-hidroxibutanoat (CHBE) 53.

5.8.5. Omapatrilat Omapatrilat (BMS-186716) 55 este un nou inhibitor de vasopeptidaze n dezvoltare, n care compusul BMS-199541-01 54 este un intermediar chiral. Pentru a sintetiza BMS-199541-01, a fost izolat o tulpin de Sphingomonas paucimobilis SC 16113 care avea o -lizin -aminotransferaz nou.
170

Gena corespunztoare (lat) a fost clonat i supraexprimat la E. coli. Un produs al reaciei de 65-70% a fost obinut n biotransformarea utiliznd biocatalizatori (fig. 5.17).

Fig. 5.17 BMS-199541-01 54 i omapatrilat 55.

5.8.6 Hidromorfona Sinteza drogului opiaceu semisintetic hidromorfona implic oxidarea microbian a morfinei 56 la morfinona 57 de ctre o dehidrogenaz, urmat de reducerea dublei legturi printr-o transhidrogenaz pentru a obine hidromorfona 58. Transhidrogenaza nucleotidelor piridinice solubil (STH) a P. fluorescenes a fost supraexprimat la E. coli, i aplicat pentru regenerarea NADH i NADPH n producia hidromorfonei (fig. 5.18).

Fig. 5.18 Biotransformarea stereo- i regioselectiv a morfinei 56 la hidromorfona 58 via morfinona 57.

171

5.9. Concluzii
Recunoaterea importanei chiralitii moleculelor de medicamente n ceea ce privete activitatea farmacologic i dezvoltarea unor tehnici noi i mai eficiente pentru ingineria genetic a condus la o nou abordare a sintezei medicamentelor chirale. Cercetrile intensive n cteva arii ale biologiei moleculare creaz o mai bun nelegere a metodelor naturale de biotransformare, pe lng faptul c ajut la elucidarea cauzelor unor boli. Sintezele stereoselective cu ajutorul microorganismelor recombinante sau biocatalizatorilor izolai de la acestea au oferit un suport excelent pentru eforturile chimitilor de a sintetiza molecule de medicamente chirale. In 2001, aproximativ 36% din vnzrile mondiale de produse farmaceutice n valoare de 410 miliarde de dolari au fost efectuate pentru medicamente cu un singur enantiomer.

172

CAPITOLUL 6 MEDICAMENTE PE BAZ DE ACIZI NUCLEICI 6.1. Introducere

Acizi nucleici conin toate informaiile despre viaa fiecrei plante i fiecarui animal. Acizi nucleici sunt parte a fiecrei celule sau fiine vii. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) este format din dou lanuri dublu catenare de nucleotide. Nucleotidele sunt compuse dintr-o parte glucidic (riboza pentru acidul ribonucleic (ARN) i 2-dezoxiriboza pentru a ADN), o grupare fosfat i o baz azotat. n general, doar patru baze azotate diferite pot fi gsite n ADN i ARN. Acestea sunt adenina, guanina, citozina i timina n ADN, i uracil n loc de timin n ARN. Lanurile de nucleotide, numite oligonucleotide sunt dublu catenare n nucleu. Aceste lanuri dublu catenare sunt meninute mpreun n principal, datorit legturilor de hidrogen dintre bazele azotate. Perechile de baze sunt ntotdeauna guanin-citozin i adenintimin (uracil) (fig. 6.1) [Saenger i colab., 1984]. Informaiile nmagazinate n ADN trebuie s fie traduse n proteine. Prin urmare ADN-ul, trebuie mai nti s fie transcris n ARN mesager (ARNm), care prsete nucleul. ARNm va fi tradus n proteine la nivelul ribozomilor. Toate aceste procese sunt posibile puncte de atac ale medicamentelor bazate pe acizi nucleici. Mai multe concepte sau mecanisme de aciune ale medicamentelor pe baz de acizi nucleici sunt acum n curs de investigare. Cel mai important este conceptul antisens (vezi subcapitolul 6.4.1). Alte concepte n curs de investigare sunt conceptul triplului helix (triplex), conceptul ARN-ului de interferen (ARNi) i conceptul ribozimelor ca medicamente.

173

Fig.6.1. Baze perechi Watson-Crick

6.2. Sinteza chimic a oligonucleotidelor

Oligonucleotidele sunt molecule cu lan lung construite n orice ordine a secvenei nucleotidelor. Sinteza chimic const n condensarea individual a nucleotidelor pn cnd secvena i lungimea cerut este atins. Nu este important pentru sintez dac nucleotidele sunt ADN, ARN sau blocuri modificate construite. Condiiile de reacie difer numai n ceea ce privete timpii de reacie i alegerea agenilor activatori. Sinteza oligonucleotidelor n faz solid a fost dezvoltat de Letsinger n 1975. Principalul avantaj al sintezei nucleotidelor n faz solid este c purificarea este implicat doar dup ultima etap de sintez, i nu dup fiecare reacie. n plus, este posibil s se sintetizeze mai mult de un oligonucleotid, n acelai timp cu un oligonucleotid sintetizator. De-a lungul ultimilor 25 de ani au fost puse la punct mai multe metode de sintez a oligonucleotidelor. Pentru fiecare metod este necesar producerea unor blocuri de nucleotide cu grupuri diferite de protecie. Aceste metode sunt: metoda fosfordiester, metoda fosfortriester, metoda fosfonat H i metoda fosforamidat. n zilele noastre, numai metoda pe baz de fosforamidai joac un rol important n sinteza n faz solid a oligonucleotidelor. Figura 6.2 prezint ciclul de sintez al metodei fosforamidailor.
174

Primul nucleotid fixat pe suport solid, este deprotejat/descoperit n poziia 5', cu ajutorul acidului tricloroacetic (TCA). Apoi, urmtorul bloc construit este adugat, activat cu un activator i cuplat la primul nucleotid. Tetrazolul sau un derivat al su este folosit ca un activator n cele mai multe cazuri. Gruprile hidroxil nereactive sunt acoperite cu anhidrid acetic, pentru a opri construirea lanului de la aceast poziie, i acoperirea evit sinteza de secvene nedorite. Dimerul cuplat este oxidat de un amestec de iod i ap. Sinteza poate fi oprit dup acest pas sau nucleotidul final din lan poate fi descoperit pentru a ncepe un nou ciclu de cuplare.

acoperire

Figura 6.2. Sinteza n faz solid a oligonucleotidelor 175

Toate

grupurile

de

protecie,

sunt

clivate

dup

sfritul

sintezei

oligonucleotidului dorit. Purificarea poate fi realizat prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC) sau prin electroforez n gel. O alt posibilitate de a obine oligonucleotide este sinteza enzimatic, n special pentru oligonucleotidele lungi. Sinteza enzimatic utiliznd uniti construite modificat sunt o alternativ viabil la sinteza chimic. ncorporarea enzimatic a nucleotidelor trifosfat naturale sau modificate adecvat de ARN polimerazele bacteriofagilor (de exemplu T7) a fost folosit cu succes, dei aceast abordare este limitat de acceptarea polimerazei pentru zaharuri, moleculei sau modificri ale bazei. scheletul de susinere al

6.3. Modificri chimice ale oligonucleotidelor

n aceast subcapitol vom evidenia structura chimic i proprietile oligonucleotidelor derivate. Diversitatea chimic a structurii oligonucleotidelor naturale este necesar pentru a face aceste substane utile n sistemele biologice. Condiiile necesare pentru ca medicamentele pe baz de acizi nucleici s fie bune sunt urmtoarele: trebuie s fie suficient de stabile mpotriva nucleazelor din ser i din celule; ar trebui s intre n diferite organe din corp, iar dup distribuirea n esutul dorit, acestea trebuie s fie capabile s penetreze membrana celular pentru a ajunge la nivelul situsului lor de aciune; trebuie s formeze complexe Watson-Crick sau Hoogsteen stabile cu secvene int complementare sau complexe n condiii fiziologice. n figura 6.3 sunt prezentate posibilitile de modificare pentru oligonucleotide. S-au efectuat modificri la nivelul scheletului moleculei, prin modificri ale zaharurilor sau substituia la nivelul prii fosfat, precum i ncorporarea bazelor azotate care sunt substituite sau complet schimbate. De asemenea, ar trebui s fie menionate: ncorporarea conjugailor la captul 3' sau 5' , precum i acizii nucleici ce modific complet scheletul macromoleculei ca
176

acizii nucleici peptidici (ANPs) sau acizi nucleici inaccesibili (ANLs). n ultimii ani toi aceti acizi nucleici modificai au fost sintetizai i testai. Oligonucleotidele nemodificate sunt larg utilizate ca instrumente n biologia molecular. Cu toate acestea, n experimentele celulare i animale s-a observat c oligonucleotidele cu un fosfodiester natural internucleozid legat sunt degradate n ser n decurs de cteva ore, n principal, prin aciunea rapid a 3' exonucleazelor de clivare care sunt nsoite de endonucleaze de clivare lente. De asemenea, n anumite esuturi a fost observat o activitate semnificativ 5'-exonucleazic. Oligonucleotidele modificate chimic vor fi descrise n urmtoarele seciuni.

Figura 6.3. Modificarea oligonucleotidelor

6.3.1. Modificri 2' Oligonucleotidele 2'-O-modificate (fig. 6.4) pot fi considerate ca analogi ai oligoribonucleotidelor. 2'-O-metil-eterul poate fi gsit n stare natural, de exemplu n ARN n anumite poziii n ARNt, ARNr i ARNsn (ARN de talie mic). Stabilitatea heteroduplexurilor (ARN)( 2'-O-alchil - ARN) [Freier, Altmann i colab., 1997]
177

depinde clar de natura gruprii 2'-O-alchil i crete n ordinea 2'-O-dimetilalil <2'-Obutil <2'-OH <2'-O-alil <2'-O-metil <20-metoxietoxi. Anterior anului 1987, s-a raportat c 2'-O-metil ARN formeaz un duplex mai stabil, cu o caten complementar de ARN dect cu ADN nemodificat sau chiar ARN [H Inoue i colab., 1987]. 2'-O-alkilribonucleotidele prefer endo conformaia C (3') ntr-un duplex cu ARN. Acest glucid pliat a fost considerat un element structural cheie n duplexurile ARN-ARN, care sunt, n general, mai stabile dect duplexurile ADN-ADN ale aceleai secvene.

Figura 6.4. Modificri 2' ale oligonucleotidelor

Merit de menionat c modificarea 2'-O-metoxietoxi nu are ca rezultat numai intensificarea afinitii de legare la ARN, dar n acelai timp face ca oligomerul s fie mai stabil fa de degradarea nucleazic. Activitatea RNazei H nu este susinut de modificrile 2' -O, astfel nct acestea ar trebui localizate pe flancurile oligonucleotidelor antisens n principal constnd din ferestre fosforotioat cu anumite modificri care reduc efectul negativ al fosforotioailor ( vezi subcapitolul 6.3.3). n multe cazuri, n special n aplicaii pe modelele animale, chiar flancurile conin fosforotioai pentru a mbunti stabilitatea lor. Aparent efectele secundare citotoxice ale fosforotioailor nu sunt chiar att de grave n situaia cu o modificare a 2'-O-alchil. n plus, pentru modificri 2'-O-alchil, sunt cunoscute nucleotide 2'substituite cum ar fi 2'-fluoro-amino sau 2'.amino. Oligonucleotidele 2'-deoxi-2'fluoro modificate uniform prezint o afinitate considerabil crescut de legare pentru ARN, comparativ cu nucleotidele ADN, fr a compromite specificitatea bazelor perechi, avnd n vedere c modificarea 2'-amino destabilizeaz duplexul cu ARN
178

[Kawasaki i colab., 1993; Aurup i colab., 1994]. Cu toate acestea sunt necesare modificri suplimentare, cum ar fi punile de fosforotioat, pentru a produce derivai oligonucleotidici suficieni de stabili la nucleaze. Introducerea constant a zaharurilor 2'-deoxi-2'-fluoro duce la pierderea activrii RNazei H. 6.3.2. Alchil-i arilfosfonaii n ultimii ani au fost investigai mai muli alchil-i arilfosfonai diferii (fig. 6.5) . Principalii reprezentani ai acestor grupuri sunt metil- i fenilfosfonaii. n afar de fosforotionai, metilfosfonaii sunt probabil, cea de a doua clas investigat de derivai oligonucleotidici cu modificare a fosforului i ei au fost utilizai precoce pentru inhibarea antisens specific a expresiei genelor [Miller i colab., 1985]. n metilfosfonai oxigen fosfatul ncrcat negativ este nlocuit de o grupare metil neutr. Legturile metilfosfonailor sunt foarte stabile la degradarea nucleazelor. Cu toate acestea, o mare problem este reprezentat de chiralitatea punilor metilfosfonailor, care au fie o configuraie Rp, fie Sp.

Figura 6.5. Oligonucleotide aril i alkilfosfonate

Prin urmare, ca i n cazul fosforotionailor, oligonucleotidele metilfosfonate rezult de obicei prin sinteza standard, ce const dintr-un amestec de 2n diastereomeri, unde n este numrul de astfel de legturi. S-a artat c oligonucleotidele scurte cu un schelet metilfosfonat prezint toate un punct de topire (Tm) mult mai mare dect un

179

amestec de diastereomeri sau chiar corespunztor oligonucleotidelor fosfodiester atunci cnd hibridizeaz cu acizi nucleici complementari. Oligonucleotidele metilfosfonate modificate uniform nu formeaz duplexuri cu ARN care induce clivajul RNazei H. Acest lucru poate s limiteze utilizarea lor ca oligonucleotide antisens i ar putea explica nivelul relativ ridicat de concentraie necesar pentru oprirea efectiv a translaiei n experimente antisens. Oligonucleotidele himerice care conin metilfosfonai i o poriune de cel puin cinci pn la apte legturi fosfodiester menin activitatea RNazei H, i astfel solubilitatea srac a compuilor modificai uniform n sisteme biologice poate fi depit. Alkilfosfonaii sunt disponibili prin sinteza automat de oligonucleotide utiliznd metilfosfonamidai cum ar fi sintonii. Avnd n vedere c punile alkilfosfonate sunt mai labile dect legturile naturale fosfodiester, sunt necesare condiii mult mai uoare pentru clivajul de pe suportul solid i pentru descoperire. n mod similar, fenilfosfonaii i fenilfosfonotioaii care conin oligonucleotide pot fi preparai din nucleozid-3'-fenilfosfonamidai corespunztori [Dingermann i colab.,2004]. Afinitatea de legare a arilfosfonailor care conin oligomeri depinde puternic de secven, astfel nct unele duplexuri sunt destabilizate de la - 0,3 la 1,3 K, n timp ce altele sunt stabilizate de la +0,2 la +0,5 K , relativ cu congenerii lor naturali. De asemenea a fost descris sinteza pentadecamerilor oligodeoxinucleotidici care conin doi octilfosfonai legai cu o chiralitate stereoregular sau stereorandomizat [Mag i colab., 1996]. Diferena n Tm a fost de - 3,4 K per modificarea stereorandomizat i de aproximativ - 2,3 pn la - 4,0 K per modificare a oligonucleotidelor configurate stereoregular. 6.3.3. Fosforotioaii Nucleazele degradeaz oligonucleotidele printr-un atac nucleofilic la nivelul legturii fosfodiester. nlocuirea oxigen fosfatului nelegat de ali atomi este o modalitate uoar de a face rezistente oligonucleotidele mpotriva nucleazelor. Modificarea fosforotioailor (fig. 6.6) asigur o stabilizare semnificativ mpotriva degradrii de ctre nucleaze. Punile fosforotioat reprezint de asemenea un centru de
180

chiralitate. Trebuie menionat, totui, c, rezistena la nucleaze depinde puternic de configuraia fosforului. Diastereomerii Sp sunt substraturi pentru nucleazele S1 sau P1, n timp ce diasteromerii Rp sunt clivai de fosfodiesteraza din veninul de arpe. Absoria celular a oligonucleotidelor fosforotioai este similar oligonucleotidelor fosfodiester. O proprietate important a fosforotioaiilor este capacitatea lor de a media degradarea prin RNaza H a ARN-ului dup hibridizare.

Figura 6.6. Oligonucleotide fosforotioai

Aceast

modificare

sporete

stabilitatea

oligonucleotidelor

mpotriva

degradarii enzimatice i, n acelai timp, este compatibil cu activarea RNazei H. n ciuda tuturor acestor caracteristici promise, fosforotioaii prezint unele dezavantaje. Stabilitatea termic a complexului format cu ARN-ul int nu este la fel de stabil ca cea format cu oligonucleotide nemodificate. Proprietatea de hibridizare a fosforotioailor diasteroizomerici este suficient de puternic pentru ai putea utiliza n condiii in vivo, cu toate c exist o pierdere medie de 0,5 K per legtura de fosforotioat n Tm pentru amestecul racemic. Mai mult dect att, pentru motive care nu sunt bine nelese, oligonucleotidele fosforotioat pot avea o afinitate mult mai mare pentru anumite proteine, cum ar fi cele responsabile de legarea polianionilor. Acest lucru poate duce la efecte secundare nedorite adesea asociate cu citotoxicitate. De asemenea un fosforotioat, reprezint o molecul care poart un alt centru de chiralitate n comparaie cu nucleotidele nemodificate. Fosforotioaii Sp i Rp au
181

artat diferite proprieti fiziochimice. Heterodimeri formai ntre oligoribonucleotide i toi fosforotioaii Rp au artat o Tm, comparabil cu heterodimerii mai puin stabili formai cu toi fosforotioaii Sp sau amestecul randomizat, aleatoriu al diasteromerilor [Koziolkiewicz i colab., 1995]. Complexul ADN-ARN coninnd fosforotioaii configuraiei tuturor Rp este mai sensibil la degradarea dependent de RNaza H n comparaie cu hibrizi care au fie toi Sp omologi sau un amestec aleatoriu de diastereomeri. Interesant, 3exonucleaza prezent n plasma uman pare a degrada fosforotioaii ai configuraiei Rp, dar nu i pe cei ai configuraiei Sp [Dingermann i colab.,2004].

6.3.4. N3-P5 fosforamidai Oligonucleotidele N3-P5 fosforamidate (fig. 6.7) arat o rezisten remarcabil la nucleaze i hibridizare puternic, dar nu activeaz RNaza H. Probabil c se vor face numeroase studii despre inhibarea expresiei genei .

Figura 6.7. Oligonucleotide 3'fosforamidate

6.3.5. Morfolino-oligonucleotidele Morfolino-oligonucleotidele sunt foarte stabile la nucleaze i nu sunt sensibile la RNaza H. Ele au fost studiate n special n cercetrile privind dezvoltarea embrionar a petelui zebr i a lui Xenopus, unde ambele sisteme de compui pot fi administrate (injectate) la embrion.
182

6.3.6 Acizii nucleici peptidici ( ANPs,peptid nucleic acid) ntr-un ANP scheletul zaharofosfat este nlocuit de o structur poliamid bazat pe N aminoetilglicin (fig. 6.8). Un avantaj al ANPs este c ei se leag cu o afinitate mai mare la acizii nucleici complementari dect omologii lor naturali dup regulile perechilor de baze Watson Crick [Egholm i colab., 1993]. Captul N-terminal al unui ANP corespunde cu captul 5' i captul C-terminal cu captul 3' al ADN. n cazul duplexurilor ADN-ANP antiparalel sau respectiv ANP-ARN, Tm este crescut cu aproximativ 1 sau 1,5 K / de baz, respectiv, n comparaie cu duplexul ADNADN sau ADN-ARN. Un alt avantaj al ANP este c mperecherea greit a bazelor d natere adesea la o reducere semnificativ mai mare a Tm n comparaie cu ADN. ANP este extrem de stabil la nucleaze i peptidaze. Cu toate acestea, ANPs nu poate stimula clivajul RNazei H. n consecin, s-a constatat c ANPs sunt mai puin eficieni ca ageni antisens dect fosfodiesterii i oligonucleotidele fosforotioat [van der Laan i colab., 1998].

Figura 6.8. Oligonucleotide ADN i ANP

n contrast, himerele ADN/ANP[19], cu mai mult de patru nucleotide sunt capabile de a stimula clivajul ARN de RNaza H prin formarea unui duplex himerARN. Clivajul ARN se produce la ribonucleotidele cu baze perechi cu partea ADN a himerei. De asemenea, himerele ANP/ADN se supun regulilor Watson-Crick privind legarea de ADN i ARN complementar [van der Laan i colab., 1997], aa cum Tm depinde puternic de raportul ANP/ADN din himer.
183

Tm al himerelor 5-ADN/3-ANP, n care prile de ANP i ADN au lungime egal, se situeaz aproximativ ntre cele observate pentru ANP i ADN pur corespunztor. n contrast cu ANP-ul pur, n condiii fiziologice himerele 5ADN/ANP se leag exclusiv cu orientare antiparalel la ADN i ARN. De asemenea, himerele arta o asimilare celular mult mai bun dect ANP pur. 6.3.7. Acizii nucleici inacesibili (LNAs, locked nucleic acid) sterici S-a constatat c ANLs, analogi ai acizilor nucleici cu schelet de susinere reprezentat de fosfoglucide limitate conformaional, pe baz de (3'S,5'R)-2-deoxi3'5'-etano-D-ribofuranozil-adenina i timin (ADN biciclic) formeaz duplexuri mai stabile dect congenerii naturali corespunztori (fig. 6.9) [Tarkov i colab., 1993]. ADN-ul biciclic (A10) formeaz triplexuri mai stabile cu d (T10) din elementul motiv pirimidin-purin-pirimidin dect naturalul d (A10). A fost descris un nou ADN analog, ''ADN- [3.2.1]- biciclic'', [Epple i colab., 1998], ce are un schelet fosfodiester rigid, imitnd conformaia ADN-ului de tip B , la care sunt ataate baze azotate pe calea unui lan deschis de legare flexibil. Dei ADN-ul [3.2.1] biciclic formeaz duplexuri mai puin stabile cu ADN complementar dect cu ADN natural, discriminarea bazelor mperecheate greit este uor mbuntit, comparativ cu duplexurile de ADN pure. Important, oligomerii de ADN [3.2.1] biciclic sunt rezisteni la degradarea 3' exonucleazei. O nou modificare cu afinitate de legare neobinuit de mare afinitate este ANL, n care 2'oxigenul este legat printr-o punte metilen la carbonul 4' formnd un nucleozid ribofuranozil biciclic metilen-legat.

Figura 6.9. Oligonucleotide blocate steric 184

Conformaia glucidic a acestui derivat este blocat la conformaia tip N (3'endo) [Koshkin i colab., 1998]. O cretere fr precedent de +3 pn la +8 K pe modificare n stabilitate termic a duplexurilor cu privire att la ADN ct i la ARN a fost raportat cnd s-a realizat evaluarea secvenelor amestecate ale ANL codificate parial sau total. 6.3.8. Oligonucleotide conjugate De asemenea ataamentul covalent al moleculelor nonnucleozidice fie la captul 3' sau 5' al oligonucleotidelor poate modula proprietile oligonucleotidelor antisens. Acest tip de derivaie este chimic simplu i permite modularea stabilitii nucleazei, asimilarea celular i distribuia n organe a oligonucleotidelor. 6.3.8.1. Conjugaii 5'terminal Conjugarea moleculelor la captul 5' al oligonucleotidelor se poate face simplu prin cuplarea fosforamiditei sau a unui derivat fosfonat H al moleculei dorite la gruparea 5'-hidroxi a oligomerului, ce rezult dup elongarea lanului prin sintez n faz solid. O gam larg de liganzi derivai din fosforamidite, cum ar fi fluoresceina, biotina, colesterolul, dinitrofenolul, acridina i derivaii de psoralen sunt disponibili comercial. Alternativ, gruparea terminal 5'- hidroxi a oligonucleotidelor reacioneaz cu o fosforamidit aminoalkil legat, care dup descoperire are ca rezultat un aminoalkil nefuncionabil. Funcia amino a oligonucleotidelor poate fi apoi reactivat post-sintez n soluie cu derivai ai moleculelor activate corespunztor, cum ar fi esteri, izotiocianai sau iodoacetamide. 6.3.8.2. Conjugaii 3' terminal Conjugarea moleculelor la captul 3' al oligonucleotidelor este convenabil i poate fi obinut prin utilizarea suporturilor solide funcionale n mod corespunztor, care n plus poart o funcie hidroxil de la care lanul de oligonucleotide se prelungete n timpul sintezei n faz solid.

185

Dup ce sinteza oligonucleotidelor este complet, oligonucleotidul conjugat este clivat de pe suportul solid i este descoperit prin tratament cu amoniac. Folosind aceast metod, derivaii relativ exotici, cum ar fi jumtatea anionoforic a pamamicinei [Uhlmann, 1998], pot fi uor de introdus. n mod similar conjugrii 5' terminale, suporturi solide adecvate 3'-amino-modificatoare sunt disponibile comercial i permit cuplarea derivailor moleculei activai corespunztor s fie conjugai cu gruparea alkil 3'amino n etapa de dizolvare, postsintetic. Conjugarea la captul 3' al oligonucleotidelor are de obicei ca rezulat o stabilizare puternic mpotriva exonucleazelor 3', care sunt nucleaze predominante n serul uman.

6.4. Mecanismul de aciune

nc de la descoperirea structurii ADN-ului de ctre Watson i Crick n 1953, mai multe idei diferite despre mecanismele de aciune ale medicamentelor pe baz de acizi nucleici au fost dezvoltate. Cele mai promitoare sunt prezentate n figura 6.10. Ele sunt concepte antisens, anti-gene (triplu helix) i conceptul ARNi, precum i conceptul utilizrii acizilor ribonucleici ca ribozime.

Figura 6.10. Interferena oligonucleotidelor 186

Mecanismul de aciune al acestor concepte este discutat n aceast seciune. Pn n prezent numai medicamentele pe baz de acizi nucleici ce urmeaz conceptul antisens i ribozime sunt pe pia sau n faze clinice de testare (a se vedea subcapitolul 6.7). 6.4.1. Conceptul antisens Conceptul antisens urmrete cea mai important modalitate de aciune pentru a modula transferul informaiei genetice n proteine. Unele mecanisme de aciune prin care un oligonucleotid poate induce un efect biologic sunt complexe. Oligonucleotidele antisens pot fi clasificate n dou mari clase, pe baza mecanismului lor de aciune: oligonucleotidele RNaz H-dependente, care induc degradarea ARNm de ctre RNaza H i oligonucleotide de blocaj steric, care previn fizic sau inhib splicing-ul sau aparatul translaional. Cele mai multe dintre oligonucleotidele antisens merg pe calea mecanismului RNaz H-dependent. 6.4.1.1. Blocarea steric Informaia genetic a vieii este stocat n ADN-ul dublu helix i ADN-ul trebuie s fie tradus n proteine, pentru a obine aceast informaie, adic ADN-ul va fi transcris n ARNm, care va fi tradus n proteine. Oligonucleotidele antisens interacioneaz cu aceste catene ARNm pentru a bloca translaia ARNm n proteine la nivelul ribozomilor. Prin urmare, oligonucleotidele antisens formeaz n mod special legturi de hidrogen cu bazele azotate pe baz de complementaritate dup modelul Watson-Crick. Legarea este specific de secven, astfel nct o mperechere greit reduce semnificativ stabilitatea duplexurilor formate. n cele mai multe cazuri, n condiii fiziologice, un duplex, cu una sau mai multe mperecheri greite va fi rapid clivat. De aceea, este necesar s se cunoasc exact secvena ARNm care ar trebui s fie blocat. Acum multe secvene sunt cunoscute, iar odat cu secvenierea ntregului genom uman au devenit disponibile mai multe informaii cu privire la efectele produse de ARNm corespunztor. Aceast cunoatere face posibil sinteza oligonucleotidelor antisens specifice.
187

Un oligonucleotid antisens se poate lega la ARNm corespunztor prin legturi de hidrogen Watson-Crick, i oligonucleotidele antisens i ARNm formeaz un nou duplex. Translaia ARNm la proteine este blocat prin legarea la ARNm i formarea unui dublu helix care mpiedic enzimele translaionale s traduc helixul dublucatenar. Din cauza stabilitii temporare a acestor helixuri duble, au loc modificri ale nucleotidelor pentru a obine helixuri mai stabile n condiii fiziologice pentru mbuntirea blocrii sterice. Obiectivul acestor studii va fi de a forma un dublu helix, care va avea o durat de via mai lung dect cea a ARNm corespunztor cu scopul singular de a optimiza mecanismul de aciune. 6.4.1.2. Activarea RN-azei H Cel de-al doilea i cel mai important mecanism de aciune al oligonucleotidelor antisens dup blocarea steric este activarea RNazei H [Walder i colab., 1988]. RNaza H degradeaz n mod normal primeri ARN n timpul replicri ADN-ului sau excizeaz selectiv nucleotidele ARN ncorporate greit n catenele de ADN. n heteroduplexurile ADN-ARN, RNaza H hidrolizeaz selectiv catena ARN. ARNm clivat va fi imediat degradat de exonucleaze n timp ce ARNm intact este protejat de structuri specifice 5' i 3' mpotriva degradrii de exo-i endonucleaze. De asemenea, mecanismul RNazei H explic de ce ARN-ul antisens nu prezint nici un efect de inhibare a translaiei. Activitatea de clivare ARN a RNazei H nu va fi indus de ctre duplexurile ARN ARN [Uhlmann, 1990]. Oligonucleotidele antisens modificate chimic trebuie, de asemenea, s activeze RNaza H. n timp ce fosforotioaii activeaz RNaza H, alii ca metilfosfonaii sau nucleotidele ANP i ANL nu activeaz aceast enzim. Activarea RNazei H n fosforotioai depinde de stereochimia atomului de fosfor. Parial, pentru oligonucleotidele antisens acest dezavantaj al activrii nespecifice a fosfodiesterilor sau a oligonucleotidelor fosforotioai este schimbat n avantaj. ncorporarea a cinci sau ase nucleotide modificate ntr-o caten nemodificat este de ajuns pentru a activa RNaza H. Cu toate acestea, avnd n vedere labilitatea oligonucleotidelor nemodificate mpotriva nucleazelor i efectele antisens reduse (observate pentru cei
188

mai muli derivai care nu activeaz RNaza H), dezvoltarea oligonucleotidelor cu schelet mixt sau oligomeri himerici, n care avantajele elementelor structurale individuale sunt combinate, pare a fi modul de abordare ales n prezent. 6.4.2. Conceptul de triplu helix Primele publicaii despre triplu helix au aprut la numai 4 ani dup descoperirea de ctre Watson i Crick a structurii n dublu helix a ADN-ului . Triplu helixurile/ helixurile triple constau dintr-o singur caten polipurinic i dou catene polipirimidinice. n timp ce triplu helixurile TxAT apar rar n celule, triplu helixurile CxGC nu sunt stabile n condiii fiziologice (fig. 6.11). Citozina n a treia caten trebuie s fie protonat pentru a forma un triplu helix stabil. Pentru a protona citozina a fost necesar un pH de 6.0. Legarea celei de a treia caten la helixul dublu Watson-Crick este rezultatul legturilor de hidrogen Hoogsteen sau Hoogsteen inverse (fig. 6.11 i 6.12).

Figura 6.11. Baze perechi Watson-Crick i Hoogsteen

Oligonucleotide scurte pot lega baze-specific, formnd legturi de hidrogen Hoogsteen sau Hoogsteen inverse la nivelul incizurii mari a dublui helix al ADN ntr-un mod specific de secven. Triadele TxAT i CxGC s-au format ntr-un mod paralel i triadele GxGC, AxAT i TxAT s-au format ntr-un mod antiparalel (X=Hoogsteen i = legturi de hidrogen Watson Crick) (fig. 6.12).

189

Figura 6.12. Motive triplu helix posibile

Acizii nucleici n triplu helix pot fi utilizai pentru a regla expresia genei in vivo. n conceptul triplu-helix (concept anti-gen), cea de-a treia caten a acidului nucleic ar trebui s hibridizeze cu ADN-ul n dublu helix din nucleu inhibnd translaia ADN-ului n ARNm corespunztor. Un avantaj major al conceptului de anti-gen comparativ cu conceptul antisens l constituie faptul c fiecare celul are doar un set diploid de cromozomi, astfel c ar trebui s fie inhibate numai dou secvene egale de ADN per celul i nu sute sau mii de catene ARNm . Exist patru mecanisme posibile de aciune a acizilor nucleici n triplu helix: oligonucleotidele ce formeaz triplexuri pot interaciona cu poziia de legare al unui component al transcripiei sau secven de replicare; schimbarea conformaiei cauzat de formarea triplu helixului poate perturba legarea unei enzime importante pentru translaie; oligonucleotidele formatoare de triplex se leag n aval de o regiune promotor a ARN polimerazei care ar putea inhiba iniierea transcripiei;

190

 oligonucleotidele ce formeaz triplexuri se leag la ADN i pot aciona ca o barier pentru enzimele de transcripie sau replicare. Utilizarea in vivo a oligonucleotidelor formatoare de triplex sunt similare cu cele pentru oligonucleotidele antisens, adic asigur stabilitatea n medii biologice, absorbia la nivelul nucleului i farmacocinetica.

6.4.3. Ribozimele Ribozimele sunt componente catalitice ale ARNs care apar n mod natural sau au fost obinute prin selecie in vitro [34, 35]. De cele mai multe ori ribozimele care apar natural catalizeaz clivarea ARN i reaciile de legare. Vom analiza ribozimele de tip cap de ciocan i agraf de pr care aparin clasei de ribozime mici (fig. 6.13-6.15) [Sigurdsson i colab., 1998; Carola i colab., 1999]. Ribozimele s-au bucurat de o atenie considerabil, din cauza posibilei lor sinteze chimice, i n special, pentru ncorporarea analogilor nucleotidelor.

Figura 6.13 Structura schematic a unei ribozime de tip cap de ciocan

191

De asemenea, ribozimele sunt implicate n inhibarea expresiei genei la nivel de ARN. Aceste ribozime au fost observate iniial ca motive structurale n anumii viroizi patogeni ai plantelor pentru auto-clivarea ARN catenar [Symons, 1992]. Acest clivaj este o reacie intramolecular de transesterificare, care ulterior a fost utilizat n reacii intermoleculare prin plasarea substratului i prii ribozimelor n molecule de ARN separate [Uhlenbeck, 1987]. Astfel, a devenit posibil analiza ribozimelor care din punct de vedere cinetic, asemntor unor enzime convenionale, permit o mai bun nelegere a relaiei structur-funcie. Mai mult, separarea substratului de ribozime le fac potrivite pentru clivarea oricrui ARN i adecvat pentru inhibarea specific de secven a expresiei genei [Bramlage i colab., 1998]. 6.4.3.1. Structura i mecanismul de reacie Structura de tip cap de ciocan a ribozimelor a fost determinat prin cristalografie cu raze X n stare bazal la fel ca i n stadiul premergtor construciei strii de tranziie a reaciei [Scott i colab., 1996]. n figura 6.14 este reprezentat imaginea bidimensional a ribozimei cap de ciocan complexat cu un substrat, iar n figura 6.15 apare structura ribozimei n agraf de pr.

Figura 6.14 Structura unei ribozime de tip cap de ciocan folosind raze X

192

Figura 6.15 Ribozim de tip agraf de pr

n cele mai multe studii se arat c ribozimele sunt pregtite prin sintez chimic s permit introducerea de nucleotide modificate n anumite poziii. Ribozimele conin un miez central cu nucleotide neschimbate, un helix II care stabilizeaz miezul i dou brae de legare cu substratul, care formeaz helixurile I i III. Magneziu este necesar pentru o activitate optim i unul din rolurile ionilor metal este de a induce modificri conformaionale pentru a mbogi structura catalitic. Ribozimele catalizeaz o reacie fosforil de transesterificare a 3',5' fosfatului internucleotidic al substratului la 2', 3' fosfat nucleozidul ciclic care are ca rezultat clivarea legturii internucleotidice (fig. 6.16) [Kuimelis i colab., 1998]. Reacia este specific de secven, n care clivajul se produce la nivelul 3' al tripletului din formula general NUH n care N este orice nucleotid, U este uridin i H este orice nucleotid cu excepia guanozinei. inta unui anumit triplet NUH de clivare n ARN este determinat de succesiunea, secvena braelor de legare a ribozimelor care trebuie s fie complementar cu secvenele din amonte i din aval ale tripletului pentru a forma complexe ribozim-substrat.
193

Figura 6.16. Mecanismul clivrii ribozimelor

Ribozima este clivat cu o inversare a configuraiei fosforului, indicnd astfel mecanismul de intrare pentru reacia de transesterificare [Yoshinari i colab., 2000]. Mecanismul favorit pentru ribozima cap de ciocan se realizeaz n prezena unui ion metalic, care are un rol activ n cataliz. Cu toate acestea exist posibilitatea implicrii unui grup funcional al unei baze nucleotidice,care este mecanismul favorit pentru ribozimele n agraf de pr. Astfel gruprile funcionale ale nucleobazelor pot aciona, n principiu, ca i catalizatori generali pentru acizi-baze. 6.4.3.2. Specificitatea tripletului Ribozimele naturale cliveaz 3' din tripletele NUH. Structura cu raze X a fost realizat nu numai n forma de baz, dar de asemenea aproape de starea de tranziie. Aceasta pune accentul pe dinamica sistemului, care trebuie s adopte structura activ prin clivaj conformaional nc necunoscut. Cu toate acestea, eforturile de a obine ribozime cap de ciocan cu specificitate de clivaj modificat au avut mai multe reuite. O ribozim ar putea fi selectat s cliveze 3' la NUR unde R poate fi guanozina sau adenozina [Vaish i colab., 1998]. Acesta arat c secven specific pentru clivajul NUG este foarte limitat. O caracteristic interesant a acestei ribozime o constituie capacitatea sa de a cliva triplete n cazul n care U central poate s fie C sau G, care difer considerabil de ribozimele convenionale de tip cap de ciocan ce are cerine
194

stricte pentru U central. Cu toate acestea, ribozimele noi extind spectrul situsurilor de clivare din ARN, lucru care este important pentru inhibarea expresiei genei. 6.4.3.3. Stabilizarea ribozimelor Ribozimele sunt uor hidrolizate de RNaze care sunt deosebit de active n ser. Cnd ribozimele sunt implicate exogen pentru inhibarea expresiei genei, ele vor veni n contact cu serul i, prin urmare, stabilizarea lor mpotriva unei astfel de degradri este o condiie esenial pentru producerea cu succes a medicamentelor. O protecie simpl mpotriva RNazelor se realizeaz prin ndeprtarea gruprii 2' -OH, menindo n acele poziii, care sunt eseniale pentru activitatea catalitic a ribozimelor. ntradevr, schimbarea ribozei a nucleozidului pirimidin cu 2'-fluoro-2'-dezoxiriboz va crete considerabil timpul de njumtire, cu o mic scdere a puterii catalitice [Pieken i colab., 1991]. Acest lucru a fost mbuntit prin nlocuirea uridinei din poziiile 4 i 7 cu 2'-amino-2'-deoxiuridina . Ulterior acest lucru a artat c gruparea amino poate fi inclus n toate poziiile nucleozidului pirimidin cu efectul dorit [Beaudry i colab., 1999]. De asemenea alkilarea gruprii 2'-OH asigur protecia mpotriva degradrii i ea poate fi ncorporat n toate poziiile (n afara de nucleozidele purinice din centrul regiunii), fr afectarea activitii [ Jarvis i colab., 1996]. Degradarea de ctre exonucleaze poate fi prevenit, fie prin introducerea de fosforotioai sau nucleotide inversate cu o legtur 3',3'. Combinarea acestor modificri crete timpul de njumtire al ribozimelor de la cteva minute la zile fr afectarea grav a capacitii catalitice. n concluzie, problema stabilizrii ribozimelor mpotriva degradrii nucleazice poate fi considerat rezolvat. 6.4.3.4. Inhibarea expresiei genei Pentru suprimarea expresiei genei, ribozimele de tip cap de ciocan i, ntr-o msur mai mic, cele n agraf de pr au fost investigate, i numeroase exemple de aplicaii de succes au fost descrise [Klebba i colab., 2000]. Aceste abordri pot fi mprite n dou categorii n funcie de modul de distribuire a ribozimelor n celule. Prima abordare, descris ca aplicaie endogen, const n clonarea secvenei pentru
195

ribozime dup un promotor potrivit ntr-un vector, fie o plasmid sau un vector retroviral. Dup transfecie sau transducie, ribozima este transcris n celule pentru a-i gsi ARNm int. Aceast abordare a fost adoptat de mai multe laboratoare i avut succes, de exemplu, n interferena cu replicarea HIV [Muotri i colab., 1999]. Un avantaj al acestui mod de transmitere este c gena poate fi integrat stabil n ADN-ul gazdei, ca ntr-un protocol de terapia genetic. De asemenea, odat integrat, aprovizionarea ribozimelor devine permanent. Cu toate acestea, alegerea vectorului este esenial, n special pentru om, unde sigurana vectorului este o preocupare considerabil. Printr-un alt mod de distribuie exogen, ribozimele sunt pregtite, fie prin sintez chimic, fie prin transcriere i sunt adugate n celule de la exterior. 6.4.3.5. Colocalizarea Un aspect important pentru o interferen eficient cu expresia genei este colocalizarea ribozimelor cu ARN-ul lor int. n acest sens, disitribuia endogen are avantajul c ribozimele pot fi direcionate spre nucleu sau spre citoplasm, fie prin alegerea promotorului sau prin combinarea cu semnale de localizare subcelular [Lee i colab., 1999]. Colocalizarea ribozimelor i a intei n nucleol demonstreaz convingtor acest punct de vedere [Michienzi i colab., 2000]. n prezent, ribozimele sintetice concepute pentru distribuie exogen pierd aceste semnale i localizarea nu poate fi dirijat. Cu toate acestea se sper c ataarea de peptide semnal, cele importante pentru importul nuclear, ar putea ameliora aceast situaie. Modificarea chimic poate influena aparent o anumit localizare. Astfel, grupuri de fosforotioaii, introduse pentru a realiza stabilitatea nucleazelor, direcioneaz preferenial ribozimele spre nucleu, cu toate c interferena cu expresia genei pare s aib loc n citoplasm [Bramlage i colab., 1999]. 6.4.4 ARN-ul de interferen ( ARNi) O nou abordare pentru ARNm int este denumit silenionarea genei postranscripionale sau ARNi [Fire i colab., 1998; Tuschl i colab., 2002] (fig. 6.17).

196

ARNi este un procedeu prin care ARN dublu catenar intete ARNm pentru clivare ntr-un mod dependent de secven. Mecanismul ARNi implic iniial prelucrarea ARN-ului dublu catenar de lungime mare (n jur de 500-1000 nucleotide) n fragmente de declanare '' de 21 25 bp ' [Elbashir i colab., 2001] de ctre un membru al familiei III de RNaze ale nucleazelor numite DICER [Hammond, 2001]. Cnd sunt ncorporate ntr-un complex de nucleaze larg, multicomponent numit RISC (complex de silenionare ARN indus), catenele prelucrate formeaz ''o secven ghid'' care are int RISC la secvena ARNm dorit i contribuie la distrugerea sa [Ketting i colab., 2001]. ARNi a fost folosit cu succes pentru silenionarea genelor n diferite sisteme experimentale, incluznd petunia, planta de tutun, neurospora, Caenorhabditis elegans, insecte i petele zebr. Utilizarea de ARN dublu catenar lung pentru silenionarea expresiei n celulele de mamifere a fost ncercat, n mare msur fr succes [Yang i colab., 2001].

Fig. 6.17. Mecanismul ARNi 197

Mai multe lucrri recente, folosind interferena scurt ARN (ARNsi; a se vedea de mai jos) par a fi mai promitoare [Paddison, 2002]. S-a observat c celulele de mamifere mature, n comparaie cu celulele embrionare recunosc aceste secvene de ARN dublu catenar lung ca patogeni invadatori. Acestea declaneaz o reacie complex de aprare a gazdei care blocheaz n mod eficient toate sintezele proteinelor n celul printr-o enzim serin/treonin kinaza interferon inductibil numit protein kinaza R (PKR). PKR fosforileaz subunitatea a factorului 2 de iniiere eukariotic (EIF-2), care inhib la nivel global translaia ARNm. ARN dublu catenar lung activeaz de asemenea sintetaza 2',5' oligoadenilat, care, la rndul su, activeaz RNaza L. RNaza L cliveaz fr discriminare ARNm. Moartea celulelor trebuie neleas, ca rezultat al acestor procese. Numeroase studii au sugerat c ARNsi (ARN dublu catenar cu o lungime n jur de 21-22 nucleotide) nu pune n aciune acest rspuns de aprare al gazdei, i, prin urmare ar putea s stopeze expresia n celulele somatice de mamifere dac sunt modificate corespunztor, adic conin gruprile 3'-hidroxi i 5'-fosfat [Zamore i colab., 2000]. Universalitatea aceastei abordri i tipurile de gene, care pot fi modificate, folosind aceast strategie n celulele de mamifere sunt n conformitate cu studiile intense din acest moment.

6.5. Identificarea poziionrii situsurilor accesibile ribozimelor la nivelul ARN int

Ribozimele de tip cap de ciocan ce acioneaz pe molecule diferite pot s desfac orice ARN, atta timp ct aceasta conine oricare din tripletele clivabile. Prezena unor astfel de triplete nu este de obicei limitat, dar identificarea regiunilor accesibile ribozimelor din ARN-ul int este un aspect important pentru succesul inhibrii expresiei genei. ARNs au structuri secundare extinse i este de ateptat ca aceste regiuni care sunt deschise pentru andocarea unei oligonucleotide antisens, cum ar fi oligodeoxinucleotidele sau ribozimele s fie limitate. Pn de curnd astfel de situsuri au fost identificate de cele mai multe ori prin trialuri sau erori. Cu toate acestea, au fost elaborate noi abordri teoretice i experimentale pentru a facilita
198

detectarea situsurile ARN accesibile. O astfel de abordare este scanarea ARN-ul int marcat prin hibridizare pentru o banc de oligonucleotide cu secvena cunoscut prin microarray [Sohail i colab., 2000]. O alt abordare este cea a renaturrii oligodeoxinucleotidelor randomizate la un transcript al ARN i clivajul ulterior al acestui complex prin RNaza H. Situsurile de clivare pot fi apoi scanate pentru triplei susceptibili pentru clivaj de ctre ribozime. Analiza transcripilor nu este n ntregime satisfctoare pentru c structura secundar a ARNm n celule ar putea fi destul de diferit de cea a transcriptului. n plus, o parte din ARNm ar putea fi acoperit de proteine prevenind renaturarea oligonucleotidelor. Astfel, extinderea unor astfel de analize pentru ARNm nativ este lucrul cel mai de dorit, chiar dac experimental este foarte provocator din cauza stabilitii sczute a produilor de clivaj. ntr-adevr, analiza la murine a ADN metiltransferazei ARNm n extractul celular a fost realizat cu succes cu ajutorul oligonucleotidelor i RNaza H [Scherr i colab., 2000]. Siturile, astfel, selectate au fost eficiente n mod egal pentru inhibarea prin oligodeoxinucleotide i ribozime. Metode computaionale au fost, de asemenea puse la punct pentru a identifica astfel de situsuri [Patzel i colab., 1999]. O comparaie direct a demonstrat c situsurile identificate prin metode computaionale i metode cu RNaza H au fost n concordan. S-a constatat, c ribozimele cu brae randomizate de legare a substratului au fost folosite pentru clivarea transcripilor de ribozime n agraf de pr [Putlitz i colab., 1999].

6.6. Distribuirea exogen a ribozimelor

Distribuia exogen a ribozimelor depete problema alegerii vectorului, dar se confrunt cu probleme de degradare nucleazic a ribozimelor din ser i asimilare celular eficient. Problema degradrii ribozimelor distribuite exogen de nucleazele din ser a fost n esen soluionat prin modificri chimice aa cum s-a discutat mai sus. n general asimilarea celular n culturi celulare este realizat prin utilizarea de lipide cationice ca purttori, cnd ncrcarea pozitiv este la exteriorul lipidelor, pentru interaciunea electrostatic cu sarcina negativ a oligonucleotidelor.
199

Acum sunt disponibile diverse compoziii de astfel de lipide, unele mai potrivite pentru anumite linii celulare dect altele. Probabil c n viitor asocierea ribozimelor cu peptide cu proprieti de transport cunoscute ar putea atenua aceast situaie. De asemenea, o astfel de strategie ar putea deschide calea pentru distribuirea ribozimelor legat de tipul celular corespunztor. Cu toate acestea, exist tipuri de celule n cultur, care preiau ribozimele destul de uor, fr astfel de ajutoare, att timp ct acestea sunt modificate chimic [Mariani i colab., 2000]. Se presupune c astfel de celule, de exemplu celule ovariene de hamster chinezesc au o membran foarte activ care faciliteaz transportul oligonucleotidelor. Foarte interesant, ribozimele stablizate chimic sunt preluate de esut dup aplicare local pe modele animale, fr purttori [Salmi i colab., 2000]. Acest accept de aplicare in vivo a oligodeoxinucleotidelor antisens este, de asemenea, realizat fr purttori [Crooke, 2000]. Astfel, asimilarea oligonucleotidelor difer n culturi celulare i animale, i nelegerea acestor procese este nc nesatisfctoare. intele pentru ribozomii modificai chimic n culturi celulare au fost c-myb, Nras, luciferaza, receptorul factorului de cretere al endoteliului vascular, mai multe gene de rezisten la medicamente i repetiia 5'terminal a virusului hepatitei C. Modele de studii in vivo cu ribozime sintetice au fost realizate pentru inhibarea expresiei amelogeninei, protein kinazei C, ARNm stromelizinei i a receptorilor dopaminergici D2. n continuare vor fi detaliate numai experimentele pe culturi celulare. Surprinztor gradul de inhibiie nu variaz foarte mult n aceste studii ntre 51 77% inhibiie (tabelul 6.1). Cu toate acestea, rezultatele sunt dificil de comparat, cu diferenele existente ntre liniile celulare, intele ARNm, concentraiile de ribozime, tipurile de modificri chimice i purttorii, i, adesea, fr nici un screening pentru renaturarea ribozimelor bune sau situsul de clivare. Factorii care afecteaz eficiena inhibrii ribozimelor includ, de asemenea, durata de via a proteinelor i ARNm. Evident, cu ct durata de via a proteinelor este mai mare cu att mai dificil va fi inducia inhibiiei. Dimpotriv, ARNs cu un timp de njumtire lung sunt considerai cele mai bune substraturi pentru ribozime [Jensen, 2000].
200

Interesant, majoritatea autorilor observ un anumit grad de inhibiie a expresiei proteinelor chiar de ctre ribozimele inactive. Cea mai simpl explicaie invocat de majoritatea investigatorilor este o oprire a translaiei. Un alt mecanism care explic inhibiia ar putea fi clivajul ARN-ului int de o RNaz dublu-catenar care a fost identificat n celule umane [Yuen, 2001], sau chiar un mecanism ARNi.
Tabelul 6.1. Medicamente antisens comerciale inta Indicaia Compania Produsul CMV Retinite ISIS Vitravene CMV PKC- Cancer ISIS/Lilly Affinitac pulmonar fr celule mici C-RAF cancer ISIS ISIS 5132 ovarian H-ras Cancer ISIS ISIS 2503 pancreatic ICAM-1 ICAM-1 ICAM-1 HCV Factorul de necroz tumoral c-myc Bcl HIV Adenozina A1 Boal Crohn Psoriazis Colite ulcerative Hepatit C Boal Crohn, psoriazis Cancer, restenozare Cancer SIDA Boli respiratorii ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS ISIS2302/Alicaforsen ISIS2302/Alicaforsen ISIS2302/Alicaforsen ISIS 14803 ISIS 104838

Faza Medicament III

II II III II II II II

AVI-Biopharm Genta/Aventis Enzo Biochem EpiGenesis Hybridon Lorus Therapeutics Pharma antisens

Resten-NG Genasense HGTV43 EPI2010 Gem 231 GTI2040

III III II II II II

Protein kinaza Cancer Ribonucleotid Cancer reductaza Factorul de cretere 2 tansformant Cancer

AP 12009

I / II

201

Receptorul 1 al factorului de cretere vascular HCV

Cancer

Ribozyme Angiozyme Pharmaceuticals

II

hepatit C

Ribozyme Heptazyme Pharmaceuticals Ribozyme Herzyme Pharmaceuticals

HER2

Cancer

6.7. Aplicaiile oligonucleotidelor n inhibarea expresiei genelor

Literatura de specialitate care descrie aplicaiile oligonucleotidelor pentru inhibarea expresiei genelor este destul de cuprinztoare. Tabelul 6.1 rezum n acest sens cele mai sugestive exemple obinute din trialuri de faz clinic chiar dac ele sunt nc incomplete. Nu este surprinztor, ca aceste investigaii s fie aproape exclusiv efectuate de ctre companii avnd n vedere cheltuielile enorme implicate. Singura excepie notabil este studiul laboratorului Gewirtz pe leucemie mieloid cronic pentru tratament ex vivo [Luger i colab, 2002]. Nu toate exemplele menionate pot fi discutate aici, astfel nct uneori sunt suficiente puine comentarii. Toate oligonucleotidele utilizate n studiile clinice au n comun un aspect al naturii lor chimice, i anume toate sunt oligonucleotide coninnd fosforotioai. Primul medicament antisens aprobat a fost realizat de ISIS, Fomivirsen sau VitraveneR, un nume comercial de la Novartis. Cu toate acestea, numrul de pacieni cu retinit cauzat de citomegalovirus (CMV) a crescut mai puin din cauza tratamentului de succes al SIDA, cel puin n emisfera vestic. Moleculele de adeziune intracelulare (ICAM) -1 de la aceeai companie folosite ca medicaie pentru boala Crohn, nu a fost nc aprobate, dar se fac cercetri n continuare pentru ca medicamentul sub numele comercial AlicaforsenTM s fie pe pia. Dezvoltarea oligonucleotidelor Genta anti BCL2 GenasenseTM pentru tratamentul melanomului malign coroborat cu chimioterapia, este destul de avansat [Jensen i colab., 2000]. Genasense este implicat n trialuri clinice de faz a III dezvoltate mpreun cu Aventis. AffinitacTM este un potent inhibitor al protein kinazei C n cancerul pulmonar fr celule mici, care arat o rat aproape dubl de supravieuire (16 luni n loc de 8), n
202

combinaie cu carboplatin/taxol. Obiectivul principal este de a obine un profil sinergistic bun n combinaie cu ageni chemoterapeutici (aa cum este obiectivul cu Genasense), cu Taxol n acest caz. Affinitac este, de asemenea, testat ntr-un trial cu un singur agent (faza II) mpotriva limfomului nonHodgkin. n acest ultim caz este n curs o colaborare mpreun cu Eli Lilly [Yuen i colab., 2001].

6.8. Concluzii
Acizi nucleici, n special oligonucleotidele antisens, sunt acum considerate ca fiind medicamente candidate. Compusul, Vitravene, este n prezent pe pia i mai muli compui promitori sunt n prezent n studii clinice de faz III. Succesul lor va defini potenialul impact al oligonucleotidelor antisens. n plus, utilizarea ribozimelor pare s aib rezultate pozitive n aplicaii ale medicamentelor, cu toate c unele obstacole nc mai trebuie s fie depite. Cel mai recent concept, ARNi, este n faz incipient dar are un foarte mare potenial, deoarece presupune un concept natural. Cele mai serioase limitri sunt determinate de asimilarea celular srac, i distribuia nc ineficient n organe. Probabil c rezolvarea acestor impedimente va decide viitorul oligonucleotidelor ca medicamente.

203

PARTEA III: METODE ANALITICE IMPLICATE N PRODUCEREA I UTILIZAREA MEDICAMENTELOR

CAPITOLUL 7 TENDINE RECENTE N ENANTIOSEPARAREA MEDICAMENTELOR CHIRALE 7.1. Introducere
Domeniul enantioseparrii atrage atenia din dou perspective: (1) prepararea compuilor chirali biologic activi puri din punct de vedere enantiomeric i (2) analize enantioselective ale medicamentelor chirale n procesul de producie, formulare, depozitare i folosire al acestora. n cadrul proceselor de producie, tehnicile de enantioseparare cromatografic au concureni puternici precum cristalizarea diastereomeric, separarea kinetic, rezervele chirale, sinteza catalitic asimetric, tehnologii bazate pe membrane etc. Totui n domeniul analizei nu exist alternative viabile pentru tehnicile bazate pe metode separative. Tehnicile chiroptice cum ar fi metodele tradiionale polarimetrice, cele bazate pe dispersie (rotaia planului luminii polarizate) sau spectrometrice, precum i spectroscopia de rezonan magnetic nuclear (RMN), nu pot concura n termeni de acuratee, sensibilitate, simplitate, timp de analiz, costuri, etc. cu tehnicile pe baz de separare cum ar fi cromatografia gazoas (GC), cromatografia n lichid de nalt performan (HPLC), cromatografia supercritic n fluid (SFC), electroforeza capilar (CE) i electrocromatografia capilar (CEC). Scopul acestui capitol este s discute tendinele actuale i s prezinte perspectiva evoluiei domeniului enantioseparrii.

204

7.1.1. Stereochimia n aciunea medicamentelor Substanele chirale i enantiomerii Medicamentele chirale au dou forme structurale similare care se pot comporta foarte diferit n sisteme biologice datorit formelor lor diferite n spaiul tridimensional. Aceste dou forme posibile sunt denumite enantiomeri iar cei doi enantiomeri ai unui medicament chiral ar trebui s fie considerate dou medicamente diferite. Chiralitatea este definit ca i proprietatea geometric a unui obiect rigid (precum o molecul sau un medicament) de a nu putea fi superpozabil cu imaginea sa n oglind. Moleculele ce pot fi superpozabile cu imaginile lor n oglind sunt achirale (non-chirale). Chiralitatea este o proprietate a materiei identificat n majoritatea sistemelor biologice pornind de la elementele de baz ale vieii aminoacizii, carbohidraii i lipidele. Chiralitatea este adesea ilustrat prin ideea de nesuperpozabilitate a minilor dreapt i stng: mna stng i mna dreapt sunt reciproc imaginile n oglind ale celeilalte dar nu sunt superpozabile. Cele dou imagini n oglind ale unei molecule chirale sunt denumite enantiomeri. Ca i minile, enantiomerii sunt perechi. Ambele molecule ale unei perechi de enantiomeri au aceiai compoziie chimic i pot fi schiai identic n dou dimensiuni, dar n medii chirale cum ar fi receptorii i enzimele din organism acestea pot avea un comportament diferit. Un amestec racemic reprezint un amestec de cantiti egale din ambii enantiomeri ai unui medicament chiral. Frecvent, chiralitatea la medicamente i are sursa ntr-un atom de carbon la care sunt ataate patru grupri diferite ns pot exista i alte surse pentru chiralitate. Sub termenii de stereoizomeri sau izomeri unici sunt uneori denumii enantiomerii singuri/unici. Aceti termeni se pot aplica i n cazul medicamentelor sau moleculelor achirale i nu indic faptul c n acest caz este prezent un enantiomer. De exemplu, molecule izomere au aceeai formul molecular stoichiometric dar pot avea structuri foarte diferite. Aadar, termenii enantiomer, izomer unic i / sau stereoizomer unic se pot folosi unul n locul celuilalt.

205

Cei 2 enantiomeri ai unui medicament chiral se pot identifica cel mai bine pe baza configuraiei absolute a acestora sau pe baza rotaiei optice. Alte denumiri cum ar fi D sau L sunt utile n cazul zaharurilor sau aminoacizilor dar ele sunt specifice acestor molecule i nu sunt general aplicabile altor compui. Termenii dextro sau levo sunt considerai nvechii i ar trebui evitai. n locul lor ar trebui folosit sistemul R/S pentru configuraia absolut (R = rectus = dreapta, n sensul acelor de ceasornic S=sinister= stnga, n sens invers acelor de ceasornic, din lb. latin) i sistemul +/ pentru rotaia optic, termeni ce in cont de reguli precise bazate pe numrul atomic i mas pentru a determina dac centrul unei particule chirale are o configuraie R sau S. Un medicament chiral poate avea mai mult dect un singur centru chiral, iar n astfel de cazuri este necesar determinarea configuraiei absolute pentru fiecare centru chiral. Rotaia optic este folosit deseori pentru c este mai uor de determinat experimental dect configuraia absolut, ns ea nu ofer informaii despre configuraia absolut a unui enantiomer. Pentru o pereche dat de enantiomeri, unui enantiomer i poate fi alocat notaia (+) iar celuilalt ( ) pe baza direciei n care ei rotesc planul luminii polarizate. Rotaiile optice au fost descrise ca fiind dextrorotatorii (+) sau levorotatorii ( ). Amestecurile racemice sunt notate (R,S) sau (). 7.1.2 Medicamentele chirale n sistemele biologice Enantiomerii aceluiai medicament chiral au proprieti fizice i chimice identice n medii achirale, ns n medii chirale ele prezint comportamente chimice i farmacologice diferite (fig.7.1). Deoarece sistemele vii sunt ele nsele medii chirale, fiecare enantiomer ai unui medicament chiral se comport foarte diferit in vivo. De aceea, pentru un medicament chiral dat, cei doi enantiomeri se consider a fi dou medicamente diferite, dac nu este demonstrat contrariul. n cazul ilustrat mai sus, unul din enantiomeri este activ biologic, iar cellalt enantiomer nu este. Domeniile A,B i C ale medicamentului trebuie s interacioneze cu regiunile corespunztoare ale situsului de legare a,b i c pentru ca medicamentul s poat avea efectul farmacologic.
206

Fig.7.1 Diferena dintre doi enantiomeri ai unui medicament prin intermediul unei interaciuni ipotetice ntre un medicament chiral i situs-ul su de legare chiral.

Enantiomerul activ are o structur 3D care permite domeniului A al medicamentului s interacioneze cu situsul de legare a , B s interacioneze cu b i C s interacioneze cu c. n contrast, enantiomerul inactiv nu poate fi aliniat astfel nct s lege cele trei situsuri simultan, dei posed aceleai grupri A, B, C i D. Aceste diferene structurale 3D nu permite enantiomerului inactiv s aib efect biologic la nivelul acestui situs. n unele cazuri, poriunea unei molecule care conine centrul / centrii chirali poate fi situat ntr-o regiune care nu joac un rol n capacitatea moleculei de a interaciona cu inta acesteia. n aceste cazuri enantiomerii pot avea proprieti farmacologice foarte asemntoare sau chiar similare la nivelul situsului de legare. Chiar i n aceste cazuri, enantiomerii au un profil metabolic diferit, afinitate diferit fa de ali receptori, transportori sau enzime (Dingermann i colab.,2004). 7.1.3. Importana chiralitii pentru medicamente Aproximativ 50% din medicamentele de pe pia sunt chirale, iar dintre acestea aproximativ 50% sunt mixturi de enantiomeri. Clinicianul poate avea la dispoziie n acelai timp un medicament sub form de amestec de enantiomeri sau sub forma unui singur-enantiomer, fiind astfel foarte important distincia dintre cele dou deoarece
207

ntre acestea pot exista diferene de dozaj, eficacitate, efecte secundare i chiar de indicaii. Decizia utilizrii formei de un singur-enantiomer IC sau a amestecului de enantiomeri pentru un anumit medicament ar trebui luat pe baza datelor din trialuri clinice i a experienei clinice. Folosirea medicamentelor enantiomerice unice poate favoriza un profil farmacologic mai simplu i mai selectiv, indici terapeutici mbuntii, farmacodinamic mai simpl i scderea interaciunilor medicamentoase. n trialuri clinice (S) albuterolul, agonist al receptorilor 2 adrenergici utilizat n tratamentului astmului i (S) omeprazolul, inhibitor al pompei de protoni utilizat n tratamentul refluxului gastroesofagian, s-au dovedit a fi superioare fa de formele de prezentare racemice. n alte cazuri ns la efectele terapeutice contribuie ambii enantiomeri, iar utilizarea unor enantiomeri singuri poate avea efecte mai reduse sau poate chiar s fie duntoare fa de forma racemic, aa cum se ntmpl enantiomerului (-) al sotalolului, cu activitate blocant i antiaritmic, n timp ce enantiomerul (+) al acestuia are proprieti antiaritmice ns nu are efecte antagoniste adrenergice.

7.2. Situaia actual a dezvoltrii i utilizrii medicamentelor chirale

Necesitile industriei farmaceutice i enantiomer-singur [Stinson , 2001]. Conform unor prognoze de actualitate, cererea de materiale chirale brute, ingrediente intermediare i active, va crete cu 9,4% n anii urmtori. Aceast cretere spectaculoas este determinat de industria farmaceutic. Astfel, de la o cifr de vnzare ateptat de 15,1 miliarde de dolari, productorii de medicamente vor fi responsabili pentru 11,5 miliarde de dolari (76%). Ce face domeniul compuilor chirali un domeniu att de atractiv pentru dezvoltatorii i productorii de medicamente? Unele aspecte majore favorizeaz dezvoltarea afacerilor cu compui chirali, n mod special n cadrul industriei farmaceutice.
208

ingeniozitatea chimitilor au

determinat o cretere continu a vnzrilor compuilor cu structur specific unui

Primul i cel mai important aspect care reprezint baza tuturor activitilor din acest domeniu este reprezentat de diferena semnificativ ce se constat ntre proprietile farmacologice i cele toxicologice ale enantiomerilor compuilor chirali biologic activi. Se cunosc multe exemple i n numeroase cri, capitole de cri i overview-uri s-a analizat acest subiect [Mehvar , Brocks , 2001; Vakily i colab., 2002]. Al doilea aspect important este reprezentat de un mecanism de protecie care permite companiilor farmaceutice s i prelungeasc drepturile de proprietate asupra medicamentelor chirale, pe care anterior le-au comercializat sub forma racemic i vor fi dezvoltate i patentate ca i entitate a unui singur-enantiomer. Exemple recente de acest fel includ compusul enantiomer-singur al inhibitorului nalt potent al secreiei acide gastrice omeprazol introdus pe piaa european n 2001 de AstraZeneca, S-enantiomerul medicamentului antidepresiv chiral citalopram al Forest Laboratories, R-enantiomerul medicamentului chiral antialergic cetirizina introdus n 2001 de ctre UCB Pharm, i S-ibuprofen folosit n Austria i Elveia de civa ani i introdus recent i pe piaa din Germania. Al treilea aspect care favorizeaz domeniul compuilor chirali este cel al reglementrilor. De exemplu, n actul Ageniei Europene pentru Evaluarea Produselor Medicinale (EMA) activ de la 1 Ianuarie 1998, se menionez: dac un nou amestec racemic pare promitor, ambii enantiomeri ar trebui studiai separat ct mai curnd posibil pentru a se evalua relevana stereoizomerismului asupra efectului i evoluiei acestuia ,,in vivo. Astfel de reglementri faciliteaz intrarea pe pia a medicamentelor chirale nou dezvoltate ca i a unui singur-enantiomer. Exemplele includ medicamentul cu efect de scdere a nivelului colesterolului atorvastatina (Lipitor) aprobat n 1996 i cu vnzri de 4 miliarde de dolari americani , fiind unul din cele mai bine vndute medicamente n Statele Unite n 1999. O cretere puternic a vnzrilor pe o perioad scurt a fost observat i pentru alte medicamente chirale de tip enantiomer singur precum amprenavirul, care a fost aprobat n 1999 de ctre FDA (Administraia Alimentelor i Medicamentelor a SUA) pentru tratamentul infeciilor HIV i pentru primul reprezentant al unei clase noi de antibiotice,
209

Linezolid, care a fost aprobat de FDA n Aprilie 2000. Aceast list include i medicamentul chiral cu efect asupra sistemului respirator montelucast, antireumatoidul (iniial cu efect gastrointestinal) infliximab, agentul tamsulosin cu efect pe hiperplazia prostatei i medicamentul oftalmic latanaprost pentru tratamentul glaucomului (Dingermann i colab.,2004). Diferite companii folosesc n mod curent cteva strategii pentru a intra pe piaa de afaceri cu compui chirali. Unele companii re-lanseaz propriile medicamente sau medicamente deja cunoscute ca fiind chirale de la alte companii, ca i noi produse a unui singur enantiomer. Astfel, de exemplu, o list de produse internaionale patentate de compania Sepracor n 1999 include enantiomerii urmtoarelor medicamente: (S)- i (R)-terodilina, (-)- i (+)-pantoprazol, (-)- i (+)-zileuton, (-)-i (+)-ketoconazol, (+)- i (-)-doxazosin, (+)- i (-)-cetirizina, (+)- i (-)-sibutramina, (-)i (+)-pirbuterol, (R)- i (S)-ondasetron, (+)- i (-)-cisaprid, i (+)- i (-)-zopiclon. Alte companii dezvolt metabolii chirali farmacologic activi ai medicamentelor chirale sau prochirale ca i noi medicamente sub form de enaniomer-singur. Exemplele includ (R)- i (S)-norfluoxetina produs de Eli Lilly i metabolitul activ al zopiclon-ului. Astfel, aa cum se poate vedea din exemplele menionate mai sus, chiralitatea este un domeniu important al industriei farmaceutice. Ca i n practica clinic, chiralitatea are n vedere stabilirea unor corelaii mai bune ntre concentraiile medicamentului i efectele terapeutice, evitarea efectelor adverse ale medicamentelor innd cont mai bine de efectele vrstei, genotipurilor, dietei, interaciunilor medicamentoase, etc. asupra eficacitii terapiei cu medicamente chirale. Aa cum am menionat mai sus, tehnicile de separare nu sunt singurele metode disponibile pentru producerea medicamentelor chirale n forme pure din punct de vedere enantiomeric. Alternative valoroase sunt reprezentate de strategii bazate pe pool-ul chiral, sinteza catalitic asimetric etc. Totui, n cazul oricrui medicament chiral, sunt necesare tehnici de enantioseparare analitic pentru a avea control asupra puritii enantiomerice a etapei de producie (tehnologie de producie) i de stocare, precum i pentru a se urmri efectele enantioselective din cursul aciunii i biotransformrii acestuia.
210

7.3. Rolul tehnologiilor de separare n producerea, cercetarea i utilizarea medicamentelor chirale

Revoluia tehnologiei chirale s-a bazat pe capacitatea msurrii puritii enantiomerice [Stinson 2002]. Impactul tehnicilor de enantioseparare instrumentale asupra producerii i utilizrii medicamentelor chirale este imens. Pentru a evalua rolul efectelor enantiospecifice din cadrul aciunii medicamentoase chirale, enantiomerii trebuie preparai n cantiti cel puin suficiente pentru studii elementare farmacologice i toxicologice. mpreun cu metoda clasic a cristalizrii diasteromerice, tehnicile de separare cromatografic au avut o contribuie important n producia medicamentelor chirale enantiomeric pure. De fapt, la nceputurile dezvoltrii acestei ramuri, s-a aplicat metoda cromatografiei pe coloan lichid de joas presiune n cea mai simpl form a acesteia pentru enantiosepararea acelor medicamente chirale care erau imposibil de sintetizat prin tehnicile existente la acel moment datorit lipsei gruprilor funcionale adecvate sau a proprietilor structurale necesare. La nceputul anilor '70, tehnicile cromatografice au fcut posibil obinerea enantiomerilor medicamentelor chirale precum metfenithoina, metiprilona, glutetimid, hexobarbital, chlortalidona, oxazepam, biglumid, etc. Enantiomerii talidomidei, care a fost sintetizat iniial pe baza unui compus intermediar foarte scump, au devenit disponibili uor pentru studiile farmacologice pentru prima dat prin intermediul enantioseparrii cromatografice directe. La nceputul anilor '80 s-a comercializat prima coloan pentru enantiosepararea pe scar-analitic folosind HPLC. Acest fapt, urmat de extensia pe pia a coloanelor HPLC chirale au fost evenimente cheie n promovarea pe scar larg a tehnicilor de enantioseparare n cadrul analizelor farmaceutice i analitice. GC chiral, dei cu un istoric mai ndelungat dect HPLC nu are un rol important n dezvoltarea medicamentelor chirale, iar utilizarea acestuia este limitat datorit caracterului polar i a volatilitii sczute a majoritii medicamentelor. Merit menionate cteva studii excelente ce fac excepie de la situaia mai sus precizat [Schurig i colab., 1995; Juza i colab., 1998]. Aa cum se arat n aceste studii, GC chiral poate asigura un
211

potenial nsemnat nu numai pentru separarea la scar analitic, ci i pentru separarea la scar preparativ a unor gaze chirale. SFC chiral posed un potenial cert pentru enantiosepararea la scar analitic [Phinney, 2002.] i, n mod special, pentru enantiosepararea la scar preparativ [Terfloth, 2001]. Totui, aceast tehnic nu i-a ctigat locul pe care aparent l merit n acest domeniu. Unul din motivele pentru care lucrurile stau n acest fel pare a fi lipsa de sprijin din partea companiilor de instrumente precum i activitatea de cercetare relativ redus susinut de ctre laboratoarele academice din domeniul enantioseparrii prin SFC. Prima publicaie ce a descris enantiosepararea prin CE a aprut n acelai an (1985) cu publicaia ce descria SFC chiral. Dup 1992, CE chiral se bucur n continuare de o dezvoltare rapid i de o utilizare n cretere n mediul industrial. Aplicaiile precoce ale altei tehnici de electromigrare, CEC, n domeniul enantioseparrii a aprut n 1992 1993. n ciuda unor realizri impresionante, aceast tehnic are nc un loc important n domeniul enantioseparrii. Cerinele viitoare vor arta care tehnici vor supravieui mai bine din paleta larg de tehnici disponibile n prezent pentru enantiosepararea analitic i de producie.

7.4. Prepararea medicamentelor enantiomeric pure

Exist trei surse principale de enantiomeri puri: amestecuri racemice, marea diversitate de molecule chirale (carbohidrai, terpene, alcaloizi, peptide) ce se gsesc n mod natural ca i enantiomeri puri i compuii prochirali. Principalele metode de obinere a enantiomerilor puri pornind de la sursele amintite sunt prezentate n figura 7.2. Metodologia prezentat n acest subcapitol pornete de la utilizarea amestecurilor racemice ca i surs pentru enantiomerii puri. Modul de transformare a amestecurilor racemice n enantiomeri puri se bazeaz pe separarea kinetic sau cristalizare. Fiecare din aceste metode poate fi efectuat n mai multe moduri, care sunt discutate pe scurt mai jos.

212

Fig. 7.2 Principalele metode pentru obinerea enantiomerilor puri.

7.4.1. Separarea amestecurilor racemice Separarea amestecurilor racemice este cea mai veche tehnic i rmne n continuare principala metod de sintez industrial a moleculelor biologic active enantiomeric pure. Compuii chirali puri sau mbogii enantiomeric din amestecurile racemice pot fi obinui prin cristalizare preferenial, separarea kinetic sau separarea prin membran. Cristalizarea preferenial este fezabil din punct de vedere tehnic numai pentru amestecurile racemice aa-numite conglomerate. Mai puin de 20% din toate amestecurile racemice sunt conglomerate. Aceast tehnic este folosit la scar industrial n producia cloramfenicolului i -meti-L-dopa. n cteva cazuri este posibil i cristalizarea direct a srurilor cu acizi sau baze non-chirale. De exemplu, separarea DL-lizinei poate fi realizat prin cristalizarea preferenial a srii acesteia p-aminobenzen-sulfonate. Naproxen poate fi separat n acelai fel prin intermediul srii acestuia cu etilamina. Derivarea unui amestec racemic prin reacia cu un compus optic pur produce un amestec de diasteromeri cu proprieti fizice diferite. Astfel de mixturi pot fi separate prin metode fizice cum ar fi cristalizarea. Adesea prin separare clasic ne referim la aceast metod. Dei nu vom analiza aceast tehnic menionm c ea poate fi foarte util pentru obinerea medicamentelor chirale enantiomeric pure pentru
213

studii experimentale i clinice precoce. n plus, aceast tehnic este nc folosit pentru producerea medicamentelor chirale enantiomeric pure cum ar fi amoxicilina, captopril, cis-diltiazem, naproxen, cefalexin, cefadroxil, timolol, dextrometorfan, etambutol, etc. n figura 7.3 este exemplificat metoda industrial de obinere a (S,S)etambutolului.

Fig. 7.3 Etapele industriale de preparare a (S,S) -etambutolului prin cristalizare diastereomeric (dup Sheldon , 1993).

Cristalizarea diastereomeric are dezavantajul valabil pentru toate procedeele de enantioseparare. Concret, produsul enantiomerului dorit nu depete niciodat 50%. Dac enantiomerul nedorit nu poate fi separat sau nu se poate folosi n alte scopuri, 50% din produsul nedorit nsoete producia enantiomerului dorit. Aceasta poate constitui o problem serioas n cadrul fabricaiei pe scar larg a enantiomerilor, nu ns i n cazul produciei enantiomerilor n cantiti de cteva grame sau kilograme. O alt problem delicat a cristalizrii diastereoizomerice const n imposibilitatea raionalizrii acestei tehnologii pe baza cunotinelor actuale. Metodele de cristalizare trebuie s fie mbuntite prin trialuri i studiul erorilor, pe baza intuiiei i experienei. n anumite cazuri trebuie luat n discuie problema tehnic a disponibilitii unor ageni de separare chirali naturali n cantiti mari.

214

Metoda de separare kinetic pentru obinerea de compui chirali enantiomeric puri devine din ce n ce mai important. Aceast metod poate fi definit ca un proces prin care este transformat predominant unul dintre enantiomerii unui amestec racemic n comparaie cu cellalt. Metoda de separare kinetic poate fi aplicat cu ajutorul catalizatorilor chimici sau biologici. Prin acest proces se poate obine pn la maxim 50% produs enantiomeric, procent similar cu cel al cristalizrii diastereoizomerice. Astfel, devine foarte necesar o tehnic de enantioseparare la scar analitic sau industrial, cu racemizarea enantiomerului nedorit. Dintre avantajele enzimelor ca i catalizatori se pot aminti eficiena ridicat a acestora, selectivitatea de substrat, selectivitatea chimic, selectivitatea de regiune i stereoselectivitatea. n plus, enzimele funcioneaz n medii uoare i nu necesit solveni organici. n procesul de producie a medicamentelor pure din punct de vedere enantiomeric, pot fi folosii reprezentanii tuturor claselor principale de enzime, respectiv oxidoreductazele, transferazele, hidrolazele, enzime litice, izomerazele i ligazele. S-au pus la punct tehnici de fabricare viabile comercial a (S)-naproxen, cisdiltiazem i a altor cteva medicamente. Tehnologiile de separare cu membran sunt i ele considerate promitoare n domeniul produciei de compui chirali enantiomeric puri. De fapt exist dou metode pentru utilizarea membranelor n acest scop i anume transportul enantioselectiv [Brice , Pirkle , 1996 .] i bioreactorii membranari [Bormarius i colab.,1992.]. Prima dintre acestea nu a fost nc aplicat pe scar larg pentru fabricarea medicamentelor chirale enantiomeric pure sau intermediarilor acestora, n timp ce bioreactorii membranari sunt bine cunoscui pentru obinerea L--aminoacizilor. 7.4.2. Rezerva chiral Compuii enantiomeric puri disponibili n natur sau prin producia pe scar larg prin procese de fermentare reprezint materii prime valoroase pentru producia medicamentelor enantiomeric pure. Multe dintre aceste materiale, cum ar fi carbohidraii, amino-acizii, terpene, alcaloizi etc., au preuri comparabile cu a
215

produselor petrochimice i i gsesc o multitudine de aplicaii industriale ca i substrat chiral, auxiliari chirali i surse de liganzi chirali pentru cataliz asimetric. Carbohidraii neprelucrai, ca i produii rezultai n urma prelucrrii lor (reacii simple de oxidare sau reducere) sunt larg utilizai ca i intermediari chirali n industria farmaceutic i chimic uoar. Dintre hidroxi-acizi, att D- ct i L- acidul lactic reprezint materii prime utile pentru obinerea ierbicidelor enantiomeric pure, respectiv (R)-fluazifop-butil, (R)-mecoprop i (R)-flampropisopropil. Acidul (R,R) tartaric, solvent larg utilizat, reprezint i materii prime chirale de interes. De exemplu, n cadrul companiei farmaceutice Zambon este utilizat n sinteza (S)naproxen ului. i acidul (S,S) tartaric este un produs natural, destul de rar. Totui, acesta poate fi obinut sintetic i este folosit la producerea fosfomicinei. n privina altor hidroxi-acizi, acidul -hidroxibutiric prezint un interes deosebit pentru industria farmaceutic. Acidul (R)--hidroxibutiric poate fi utilizat pentru sinteza intermediarilor carbapenemului i a captoprilului, n timp ce acidul (S)-hidroxibutiric este util n sinteza catenei laterale a vitaminei E. Aminoacizii naturali, uor disponibili n cantiti mari, reprezint cea mai important clas de compui pentru rezerva chiral. De exemplu, L-prolina provenit din fermentaie, este materia prim cheie pentru o varietate de medicamente inhibitoare ale acetilcolin-esterazei (ACE) precum captopril, enalapril, lisinopril, etc. Ali aminoacizi uor disponibili, cum ar fi acidul L-glutamic, acidul L-aspartic i L-treonina, s-au utilizat ca i uniti structurale pentru sinteza aztreonamului i a antibioticelor carbapenemice precum thienamicina. mpreun cu compuii mai sus amintii, n strategia rezervei chirale, ca i materie prim pot fi folosii i unii aminoacizi sintetici, fabricai la scar larg, terpene, alcaloizi etc. 7.4.3. Sinteza catalitic asimetric Sinteza catalitic asimetric devine important pentru obinerea materialelor enantiomeric pure. Sinteza asimetric se poate face prin cataliza biologic, aa cum sa menionat n paragraful 7.4.1. n cele ce urmeaz se vor discuta cataliza chimic,

216

cum este cataliza metalic heterogen, complexe omogene i acizii i bazele chirale solubile. S-au fcut studii mai vechi n acest domeniu al catalizei asimetrice heterogene avnd ca scop nelegerea originii chiralitii. Pentru aceasta s-au folosit ca substrat pentru cataliza metalic materiale solid chirale precum cuarul, mtasea, celuloza etc. Procesul de sintez al L-dopa elaborat de Knowles i Sabacky la Monsanto n 1966 1968, a fost primul procedeu elaborat pentru producia la scar industrial a unui medicament farmaceutic enantiomeric pur prin cataliz asimetric. n 1971, Kagan i Dang au descris un catalizator de hidrogenare asimetric ce conine o difosfin chiral, derivat din acidul L-tartaric. n anii '80, Noyori i colaboratorii a introdus aanumita serie BINAP a liganzilor chirali derivai din gruparea binaftil chiral axial [Noyori , 2002]. Acum, hidrogenarea asimetric catalitic pe baza metodelor mai sus amintite i cele nrudite cu acestea reprezint una din cele mai comune moduri de fabricare a medicamentelor chirale enantiomeric pure. Ca exemple amintim (S)-naproxen, catena lateral a vitaminei E, alcaloizi izochinolin precum morfina, benzomorfani i morfinani precum antitusivul dextrometorfan, antibiotice carbapenemice, (R)-1,2propandiolul intermediar al levofloxacin-ului, carnitina, statinele, fosfomicina, intermediari ai antraciclinelor, denopamina, fluoxetin, duloxetin, orfenadrin, neobenodin, prostaglandinele, -blocantele, medicamentul antihelmintic (i antiinflamator) levamisol, etc. Metodele oxidative asimetrice, incluznd epoxidarea, hidroxilarea i aminoxidarea reprezint ci importante de obinere a produselor farmaceutice enantiomeric pure la scar comercial [Sharpless , 2002]. Epoxidarea de precizie mai mic este folosit pentru fabricarea (R)- i (S)-glicidolului, intermediari importani n sinteza -blocantelor enantiomeric pure. Dihidroxilarea asimetric este folosit n sinteza antagonistului canalelor de calciu cis-diltiazem. Sulfoxidarea catalitic asimetric poate cpta importan n viitor datorit unei creteri a cererii pe pia pentru inhibitorii chirali ai secreiei acide gastrice cu structur sulfoxidic, precum omeprazol, pantoprazol, rabeprazol, peprazol i
217

lansoprazol. Primul medicament enantiomeric pur al acestei clase, (S)-omeprazol ul (esomeprazol), exist deja pe pia. Acest medicament se obine prin sulfoxidarea asimetric catalitic, aa cum este prezentat schematic n figura 7.4 n plus fa de cele cteva tipuri de reacii menionate n acest subcapitol, pentru sinteza medicamentelor enantiomeric pure se pot aplica o mare varietate de transformri asimetrice catalitice, cum ar fi reacii de hidrogenare a legturii C=N, hidroxililare, izomerizare, hidroformilare, ciclopropanare, adiie, hidrocianare, condensare etc.

Fig. 7.4 Reprezentare schematic a obinerii (S)-omeprazol-ului la scar industrial (dup Cotton i colab.,2002)

7.4.4. Tehnici de cromatografie Aa cum am mai precizat, metoda cromatografiei pe coloan n cea mai simpl form a acesteia, tehnica discontinu, a avut o contribuie important la obinerea unor cantiti relativ mici de produse farmaceutice chirale enantiomeric pure [Blaschke i colab., 2000]. Totui, datorit capacitii mici de producie, diluiei mari a produselor obinute i a consumului crescut de solveni organici utilizai n producie, aceast metod s-a artat a fi ineficient economic pentru producia pe
218

scar larg a medicamentelor enantiomeri. Dintre tehnicile cromatografice, cromatografia n straturi n micare simulat (SMB) este metoda principal pentru prepararea n cantiti mici sau n producia pe scar larg a medicamentelor enantiomeric pure. Aceast tehnic este discutat n detaliu n cele ce urmeaz. n plus, n seciunea 7.4.4.2 sunt prezentate succint cteva aplicaii noi ale GC-SMB cromatografiei n contra-curent i enantiosepararea n cantiti mici prin tehnici de electromigrare. 7.4.4.1. Cromatografia n straturi n micare simulat (SMB) SMB este un proces cromatografic continuu care simuleaz o micare n contra-curent a fazei staionare i a fazei mobile. Funcionarea continu a sistemului este asigurat prin alimentarea solventului i a amestecului componentei ce trebuie separat i prin extracia continu a componentelor separate (fig. 7.5). Alimentarea cu solvent i mixturii de enantiomeri precum i extracia fraciilor separate este asigurat de patru pompe independente. O a cincea pomp este folosit pentru reciclarea n interiorul sistemului a circuitului de lichid principal. Aceast montare ne permite s economisim o cantitate important de diluant, deoarece este necesar adugarea doar a unor cantiti reduse din faza mobil rennoit pentru compensarea pierderii fazei mobile prin retragerea enantiomerilor dizolvai. Un alt avantaj semnificativ al tehnologiei SMB este faptul c acesta este un proces continuu, n timp ce toate celelalte tehnici cromatografice sunt discontinue. Micarea n contracurent a fazelor mobile i staionare este simulat n urmtorul fel: faza staionar este separat n cteva coloane cromatografice separate, care sunt conectate ntr-o serie ciclic. Fiecare intrare n coloan este echipat cu valve care permit completarea cu solvent i alimentarea, precum i extracia produsului rafinat . Liniile de intrare i ieire vor fi schimbate dup un interval de timp dat de la o coloan la urmtoarea coloan n direcia fazei mobile, simulnd astfel micarea fazei staionare n direcie opus. Dup un ciclu complet, cele patru linii ajung n poziia iniial. Parametrii tehnologici de funcionare a unui sistem SMB n condiii optime poate fi calculat prin programe software disponibile bazate pe funcii analitice.
219

Fig. 7.5 Reprezentare schematic a unei uniti SMB.[dup Francotte , Richert ,1997]

n tabelul 7.1 sunt prezentate sumar cteva exemple de enantioseparare a medicamentelor chirale prin tehnica SMB. Per ansamblu, cromatografia SMB reprezint un mijloc de mare capacitate pentru producia compuilor enantiomeric puri la scar industrial, cu o dezvoltare ntr-un interval de timp scurt. Disponibilitatea programelor software ce permit determinrile corespunztoare pentru enantiosepararea analitic prin tehnologia SMB este un avantaj esenial. Caracteristicile cromatografiei SMB, respectiv asigurarea unor produi (ambii enantiomeri) puri ntr-o manier predictibil i reducerea pierderilor, reduce timpul necesar elaborrii, indicnd premizele unei tehnici promitoare. Aplicabilitatea tehnologiei SBM unei mari varieti de compui poate favoriza transformarea cromatografiei dintr-o metod de ultim instan ntr-o metod de elecie pentru desfurarea ntr-o manier rapid i predictibil a procesului. SMB permite o scdere drastic a costurilor enantioseparrii, n principal datorit reducerii volumelor fazei staionare chirale (CSP) (cu 50-60% mai mic dect n cazul HPLC) i a consumului de dizolvant (cu pn la 10 ori fa de procedeul cromatografic discontinu).

220

Permite cote de producie de 10-100 tone pe an, cu costuri de separaie de 30 dolari/kg enantiomer pur. Combinarea SMB cu tehnicile de racemizare sau cristalizare enantioselectiv este i mai promitoare. Cteva companii farmaceutice sau de chimie uoar i-au instalat uniti SMB de capaciti diferite. Printre primele a fost UCB Pharm (Belgia), care n 1997 a adoptat o unitate SMB la scar-larg pentru producia de medicament enantiomeric pur de ordinul tonelor. Cea mai mare unitate SMB este instalat de Aeroject Fine Chemicals (Rancho Cordova, CA) cu o capacitate de 50 tone de enantiomer pe an.
Tabelul 7.1 Exemple selectate ale aplicaiilor cromatografiei SMB n producia compuilor enantiomeric puri. [dup Chankvetadze , 2001]) Compus chiral CSP Capacitate Consum al fazei mobile (l/g) Aminoglutethimid Chiralcel OJ 7,5 g/hkg CSP 0,740 ml 1,1'-Binaphthyl-2,20-diol Pirkle-type 3,52000 g DNBPG separate pe zi Medicament chiral candidat Chiralpak AD ~3060 g/hkg ~0,190 (agonist parial potent al 0,380 ml receptorilor muscarinici) CGS 26 214 Chiralcel OJ 47 g/zikg 4,561 Cycloalkanon Chiralcel OC 1082 g/zikg 0,280 DOLE Chiralcel OF 272 g/zikg 0,440 EMD 53 986 poliacrilamida 319 g/zikg 2,540 EMD 53 986 Chiralpak AD 432 g/zikg 2,600 EMD 77 697 Chiralcel OD 451 g/zikg 1,640 EMD 122 347 Chiralpak AD 311 g/zikg 0.590 Formoterol Chiralcel OJ 1,2 g/hkg 0,515 Hetrazepina triacetat de celuloz 119 g/hkg 0,094 (CTA) Guaifenezina Chiralcel OD 10,0 g/hkg 0,380 Oxo-oxazolidina L-Chiraspher 6,8 g/hkg 0,900 Feniletilalcool Chiralcel OD 0,98 g/l 5,300 Praziquantel CTA 4,7 g/hkg 0,056 Propranolol Chiralcel OD 3,3 g/hkg 0,200 Sandoz-epoxide CTA 59 g/zikg 0,800 Sandoz-epoxide Chiralcel OD 37 g/zikg 0,500 1a,2,7,7a-Tetrahidro-3CTA 1,45 g/hkg 0,400 methoxi-napht(2,36) oxirane Threonina Chirosolve LAu fost prolina separate 30 g Tramadol Chiralpak AD 50 g/hkg 0,500

221

Alturi de companiile mai-sus menionate, Bayer (Leverkusen, Germany), Universal Pharma Technologies (Lexington, MA), Daicel (Himeji, Japan) i alte cteva companii posed uniti SMB de capaciti diferite. Recent, compania danez H. Lundbeck a pus n funciune o unitate SMB cu o capacitate anual de zeci de tone. Unitatea va fi folosit n producia celui mai bine vndut medicament al companiei, S-enantiomerul andidepresivului citalopram, care s-a pus n vnzare n locul formei racemice a citalopram ncepnd din 2002. Aa cum am precizat mai sus n privina procesului SMB, liniile sunt schimbate sincron. n consecin, numrul de coloane din fiecare zon rmne acelai n fiecare moment, indiferent de locaia liniilor de intrare/ieire. Recent a fost propus un analog asincron al SMB, denumit VARICOL [Ludemann-Hombourger i colab., 2000]. Prin numeroase calcule i experimente s-a artat c aceast tehnic ofer avantaje certe fa de tehnologia SMB. Calculele numerice au indicat c un sistem VARICOL cu cinci coloane permite aceeai puritate a produsului ce poate fi atins cu SMB cu aceeai productivitate. La acelai numr de coloane i aceeai puritate, productivitatea VARICOL este cu 18,5% mai mare.

Fig. 7.6 Structura SB-553261 (dup Ludemann-Hombourger i colab.,2000)

Numrul coloanelor din aceeai zon poate varia la sistemul VARICOL. Astfel unitatea VARICOL este mai complex dect SMB, oferind o serie de avantaje: dac este proiectat adecvat, fluxul de alimentare nu contamineaz cursul de extracie sau rafinat, n zonele II, respectiv III numrul de coloane fiind temporar zero. Cnd
222

numrul de coloane din zonele I i IV este egal cu zero fluxul de eluent nu va face o diluie suplimentar nedorit a componentei extrase sau rafinate.
Tabelul 7.2 Comparaie ntre procesele SMB i VARICOL (dup LudemannHombourger i colab.,2002) Productivitate (kgprod/kgCSP/zi) SMB ase coloane (1/2/2/1) VARICOL ase coloane ({1}/{2.25}/{2}/{0.75}) VARICOL cinci coloane ({0.95}/{1.85}/{1.5}/{0.7}) VARICOL patru coloane ({0.85}/{1.5}/{1.15}/{0.5}) 0,604 0,664 0,725 0,906 Consum eluent (m3eluent/kgprod) 0,922 0,888 1,050 1,392

Enantiomerii produsului SB-553261de cercetare a GlaxoSmithKline (fig. 7.6) au fost separai prin procesul VARICOL n amiloz tris (3,5-dimetilfenilcarbamat) (Chiralpak AD). Separarea SMB s-a putut realiza cu ase coloane, iar prin VARICOL cu ase, cinci sau patru coloane. Rezultatele comparative din tabelul 7.2 indic faptul c pentru un sistem de ase coloane (aceeai cantitate de CSP), VARICOL se comport mai bine dect SB n materie de specificitate care este crescut i de reducere a consumului de eluent. Prin precizia distribuiei coloanelor n zone de lucru, VARICOL face posibil reducerea numrului de coloane din sistem. Totui acest lucru se face cu preul unui consum mai mare de eluent. 7.4.4.2. Alte tehnici cromatografice i electroforetice pentru prepararea enantiomerilor Cromatografia pe coloan de presiune joas, cromatografia cu reciclare n circuit nchis i tehnicile de peak-shaving nu sunt discutate aici, nefiind utilizate frecvent datorit capacitii reduse, consumului crescut de eluent i costurilor ridicate. Mai jos sunt discutate pe scurt cromatografia contra-curent (CCC) i enantiosepararea electroforetic de capacitate mic. Relatnd sumar situaia n privina enantioseparrii n CCC i cromatografiei prin partiie centrifug (centrifugal partition chromatography) (CPC), unul din experii n domeniu nota recent faptul c un numr total de 18 publicaii n 18 ani
223

constituie un rezultat modest fa de literatura destinat celorlalte tehnici de separare chiral. Autorul, menionnd potenialul CCC i al CPC ca tehnici de preparare importante datorit capacitii mari, al costurilor reduse ale fazei staionare (amestecul solvent) i consumul redus de solvent (de 10 ori mai mic dect n cazul HPLC), accentueaz eficiena mai degrab sczut ca principala problem a enantioseparrii prin aceste tehnici. n plus, recent a fost publicat o aplicaie promitoare a derivailor alcaloizi de cinchona ca i selectori chirali n CCC [Franco i colab., 2002]. Cteva rapoarte asupra enantioseparrii medicamentelor chirale n cantiti mari prin GC sau GC-SMB indic faptul c aceste tehnici pot fi utile pentru anumite aplicaii speciale. Primul studiu destinat explorrii potenialului clasicii electroforeze n plci de gel pentru enantiosepararea n cantiti reduse a fost publicat n 1998 de ctre Stalcup i colaboratorii. Folosind exemplul agonistului -2 adrenergic cu durat scurt de aciune terbutalina, s-a artat c electroforeza n gel este ntr-adevr o metod viabil de separare a compuilor chirali n cantiti de ordinul miligramelor. n acelai an grupul Thormann i Stalcup i colaboratorii au artat faptul c dispozitive pentru electroforeza n mediu liber disponibile pentru comer, precum RF3 i MiniPhor de la Protein Technologies (Tucson, AZ) i Mini Prep Cell de la Bio-Rad (Hercules, CA) pot fi utilizate pentru prepararea cantitilor de ordinul miligramelor de enantiomeri. Fraciile R-()- i S-(+)- metadonei colectate ntr-un studiu au fost mbogite semnificativ la extremitile anterioar i posterioar, dar a fost imposibil s se obin fracii enantiomeric pure. Analiza CE a fraciilor piperoxanului colectat n cantitate de 0,5mg ntr-un interval de migrare de 9-10 ore a artat c fraciile au fost aproape pure enantiomeric. Glukhovsky i Vigh (1997) au descris enantiosepararea n cantiti mici a DNS-Phe pe principiul focalizrii izoelectrice i folosind unitatea electroforetic de migrare n mediu liber Octopus, disponibil comercial. Alturi de electroforeza n plci de gel i electroforeza n mediu liber, i electroforeza capilar poate fi utilizat pentru separarea enantiomerilor n cantiti mici. Bazndu-se pe calcule teoretice, Kaniansky i colaboratorii (1999) au
224

demonstrat c deobicei capacitatea probei poate fi de cteva ori mai mare cnd se execut o separare izotacoforetic n comparaie cu electroforeza capilar zonal (CZE). n continuare, n sistemul experimental cu utilizarea unei combinaii de 0,1mm I.D. i 0,8mm I.D. capilare copolimer etilen-propilen fluorinate, au fost separate cantiti de micrograme de 2,4-dinitrofenil-DL-norleucin cu puritate enantiomeric mare i o recuperare de aproximativ 75% n 20 minute. Chankvetadze i colaboratorii (2001), lucrnd la creterea selectivitii separrii n electroforeza capilar bazat pe principiul contracurentului, a artat c enantiosepararea continu n cantiti mici poate fi efectuat n format capilar prin folosirea contrapresiunii, presiunea hidrodinamic, curgerea electro-osmotic (EOF) sau proprietatea de carrier a unui selector chiral n contracararea mobilitii mpotriva mobilitii electroforetice efective a enantiomerilor analizai. Aa cum s-a artat experimental n studiul lor, contrapresiunea poate fi ajustat de aa manier nct cei doi enantiomeri vor migra ctre electrozi opui sau doar un enantiomer va migra din recipientul de intrare ctre recipientul de ieire. Glukhovsky i Vigh (1997) au aplicat principiul migrrii contra-curent pe baza proprietii de carrier a unui singur izomer al heptacis-(6-sulfato)--ciclodextrinei n combinaie cu mai sus amintita unitate electroforetic Octopus i au raportat enantiosepararea terbutalinei cu productivitate de 0,1mg/h (pentru fiecare enantiomer) i o puritate enantiomeric de 99,99%. Schneiderman i colaboratorii (2002) au raportat enantiosepararea electroforetic n cantiti mici a medicamentului chiral Ritalina.

7.5. Bioanaliza medicamentelor chirale

Metodele de separare (GC, HPLC, SFC, CE i CEC) reprezint mijloace importante pentru bioanaliza enantioselectiv. Aceste tehnici sunt larg acceptate n laboratoarele universitare i industriale i i regsesc locul n farmacopeele naionale i internaionale, nlocuind tehnica tradiional polarimetric. Toate tehnicile mai-sus menionate ofer avantaje ce in de acurateea nalt, pierderile reduse de probe i sensibilitatea ridicat (limit de detecie sczut). Acoperirea substanelor de analizat, flexibilitatea, robusteea, desfurarea metodei i necesarul aplicaiei, costurile i
225

aspectele ce in de mediu sunt variabile de la metod la metod, iar alegerea metodei trebuie fcut pe baza problematicii specifice. Totui exist unele direcii generale n aplicarea fiecrei metode, care sunt discutate n detaliu mai jos. 7.5.1. Cromatografia gazoas (GC) Dac nu lum n considerare puinele studii de nceput asupra cromatografiei plane i pe coloan, GC reprezint prima tehnic instrumentar care a fcut fezabil enantiosepararea. Eficiena crescut n GC permite o enantioseparare chiar i atunci cnd factorul de enantioseparare este sczut (n jur de 1,1). GC a fost folosit relativ pe scar larg pentru analiza enantioselectiv a multor substane de importan biomedical i a unor medicamente n anii '70 i la nceputul anilor '80. GC chiral este util n special pentru gaze chirale pentru care este imposibil analiza prin tehnici n faz lichid. De exemplu, n figura 7.7 este prezentat enantiosepararea simultan a anestezicelor inhalatorii chirale desfluran, izofluran i enfluran. Dei enantiosepararea s-a realizat ntr-un timp scurt (sub 2,5min), autorii au putut scurta i mai mult timpul de analiz a enfluranului, sub 10sec (fig. 7.8).

Fig. 7.7. Enantiosepararea simultan n GC a anestezicelor inhalatorii chirale (dup Schurig i colab. 1995)

226

Fig. 7.8 Enantiosepararea enfluranului cu un timp de analiz foarte scurt (dup Schurig i colab. 1995)

Astfel de enantioseparri ultrarapide sunt, dac nu cumva imposibile, cel puin foarte greu de realizat n HPLC. Timpii de analiz foarte scuri pot fi avantajoi cnd sunt monitorizate procese farmacocinetice rapide sau relaii farmacocineticfarmacodinamice n organismele vii. Determinarea cantitativ a anestezicului inhalator izofluran n probele de snge n timpul i dup intervenia chirurgical s-a putut realiza prin GC enantioselectiv head-space (constituenii gazoi ai unui spaiu nchis deasupra unui lichid sau solid ce emite vapori) / spectrometria de mas (MS). O tendin relativ recent n domeniul GC enantioselective o constituie studiul de enantiomerizare prin cromatografia dinamic n gaz (DGC) sau cromatografia n gaz cu flux oprit (sfGC). Acest subiect este important deoarece multe reglementri cer ca protocolul de stabilitate pentru substanele sau produsele medicamentoase enantiomerice ar trebui s includ o metod capabil s aprecieze integritatea stereochimic a produsului sau substanei medicamentoase.

227

tabelul

7.3

sunt

prezentate

rezultatele

determinrii

barierei

de

enantiomerizare a medicamentului chiral thalidomida . Alte exemple de acest fel sunt diazepinele chirale. Ambele tehnici mai sus amintite, DGC i sfGC, necesit probe doar de cteva minute. n plus, n sfGC posibilul efect catalitic datorat prezenei unei CSP(faze staionare chirale) poate fi prentmpinat prin izolarea coloanei de separare de coloana rector. Doar cteva substane medicamentoase sunt compui gazoi i volatili. Metodele de obinere a compuilor derivai sunt disponibile pentru unele substane de analizat care nu aparin acestui grup. Oricum, acestea presupun costuri suplimentare, cu creterea timpului de procesare, ele pot s nu respecte ntotdeauna cantitile implicate n proces i pot afecta raportul enantiomeric din proba iniial. Din aceste motive GC acoper doar un spectru redus n bioanaliza medicamentelor chirale n prezent, n timp ce tehnicile n faz lichid precum HPLC i CE predomin.
Tabelul 7.3 Comparaie a barierelor de enantiomerizare a thalidomidei obinut prin cromatografie dinamic i simulare pe computer cu ChromWin i prin sfGC (dup Trapp i colab.2002) T (C) G(DGC) (kJ/mol) G(sfGC) (kJ/mol) 200 210 220 1542 1572 1592 1503 1543 1553

7.5.2. Cromatografia n lichid de nalt performan (HPLC) HPLC reprezint acum cea mai important tehnic de bioanaliz enantioselectiv n laboratoarele industriale . Ca avantaje, aceast tehnic este adecvat compuilor nonvolatili i termolabili, arat disponibilitate pentru serii mari de CSP i coloane chirale, i o bun compatibilitate cu probele biologice. n plus este disponibil pentru o mare varietate de detectori sensibili i precii. Att HPLC normal ct i cea n faz-invers pot fi aplicate n bioanaliz. Totui cea de-a doua tehnic pare a fi mai avantajoas datorit prelucrrii mai simple a probelor. Probele biologice pot fi injectate direct n coloana de faz-invers, dup precipitarea proteinelor. Dac sunt necesare, sunt posibile i extracia de faz solid
228

(SPE) i preconcentrarea probelor. n cazul separrii n faz normal, probele biologice trebuiesc extrase n solveni organici nainte de a fi injectate n coloana de separare. Acest lucru pare a fi laborios, necesit timp i este costisitor. n plus mai pot s apar probleme din punct de vedere al recuperrii probelor din matricea biologic. Aproape toate tipurile principale de CSP, utilizate iniial doar n metoda separrii n faz normal pot fi adaptate i pentru aplicaii n faz-invers. mpreun cu metodele de separare mai sus amintite, aa-numita metod polar-organic a devenit din ce n ce mai popular n ultimul deceniu. Ea presupune folosirea unui singur solvent organic polar (de obicei metanol, etanol 2-propanol sau acetonitril) sau amestecuri ca i faze mobile. Avantajele metodei ar fi creterea numrului de CSP adecvate, n unele cazuri selectiviti unice, care nu sunt ntlnite nici n cazul fazei normale, nici cu elueni apoi-organici, factori de separare foarte mari observai pentru substane de analizat selecionate i compatibilitate bun cu tipuri variate de detectori, n special cu spectrometrele de mas. De asemenea, alcoolurile cu mas molecular mic (ca i faz mobil), sunt mai puin poluante dect acetonitrilul sau agenii dizolvani clorinai. Coloana chiral este cea mai important component a sistemului de enantioseparare HPLC . Numrul de CSP descrise n literatura din domeniu se apropie de 200. Pe de o parte, aceasta ilustreaz marea capacitate a tehnicii, dar pe de alt parte, face extrem de dificil alegerea CSP optime. Nu exist date teoretice care s permit alegerea coloanei pe baza structurii substanei de analizat. Totui, apelnd la bazele de date existente i prin abordri statistice / chemometrice, se poate anticipa destul de bine un sistem de separare. Dintre CSP (faze staionare chirale) care sunt disponibile n comer n mod curent, CSP cel mai mult utilizate n bioanaliz includ materialele pe baz de polizaharide precum Chiralcel OD, Chiralpak AD, Chiralcel OJ and Chiralpak AS. CSP pe baz de antibiotice macrociclice precum vancomicina i teicoplanina i coloana chiral tip Pirke modificat Welk-1 sunt de asemenea bine studiate pentru studii bioanalitice.

229

CSP pe baz de polizaharide au fost elaborate pentru aplicaii n faz normal. Totui, aa cum arat studii recente, aceste materiale sunt foarte versatile i sunt folositoare i n aplicaii n faz-invers. Hage (2001) a prezentat cteva exemple ale aplicailor CSP pe baz de ciclodextrin pentru bioanaliza enantioselectiv . n schimb, aplicaiile materialelor pe baz de proteine sunt n scdere. Totui, cele mai noi dintre CSP par a fi foarte utile n studierea aspectelor stereoselective ale interaciunilor protein medicament. Alturi de cele prezentate mai sus, CSP pe baz de cinchona recent comercializat pare a fi de real interes pentru studii bioanalitice de enantioselectivitate. Cea mai recent direcie din domeniul materialelor pe baz de polizaharide o reprezint imobilizarea covalent a acestora cu scopul de a lrgi sfera de aplicabilitate a fazelor mobile ctre aplicaii la scar analitic (cantiti mici) i preparativ (cantiti mari). Miniaturizarea a devenit o tendin major n HPLC n ultimii ani i este intens promovat prin cele mai recente progrese n domeniile proteomicii, genomicii, metabonomicii, sintezei combinative i a tehnologiilor cu circuite integrate (cip-uri). Aceast tendin nu este nc suficient de puternic n HPLC chiral. Doar cteva grupuri ce lucreaz n domeniul CEC chirale fac cercetri i n LC capilar. Aceast direcie de dezvoltare ar merita mai mult atenie deoarece, cele mai recente progrese din domeniul cercetrii proteomicii i sintezei combinative vor pune n discuie aceleai necesiti viznd rapiditatea, economia, eficiena, nalta sensibilitate i poluarea redus a mediului pentru separarea chiral, deoarece multe dintre substanele candidate pentru a deveni medicamente sintetizate prin procedee combinative, ca i compuii de origine biologic, sunt chirale. Metodele de separare capilare combinate cu interfee nanospray par a fi mai sensibile dect cele cu coloane de dimensiuni obinuite. Tendinele actuale ale bioanalizei enantioselective cuprind combinaii ale HPLC i MS, detectori fluoresceni laser ultra-sensibili i polimeri imprimai molecular pentru prepararea / preconcentrarea probei prin intermediul computerului.

230

7.5.3 Electroforeza capilar (CE) CE reprezint o tehnic eficace de enantioseparare analitic. Aplicaiile acestei tehnici sunt prezentate n review-uri recente [Scriba , 2002; Amini , 2001]. n acest capitol se fac referiri la caracteristicile CE i tehnicilor de enantioseparare cromatografice folosind ca exemple cteva aplicaii recente ale CE chirale n analiza biomedical i farmaceutic. Se vor discuta criterii cum ar fi oportunitatea probelor de interes, rata de succes (puterea de separare, sensibilitatea), fiabilitatea rezultatelor (acurateea, reproductibilitatea), uurina n a nva i a folosi tehnica, viteza (de nvare a tehnicii i de desfurare a metodei), poluarea mediului (materiale periculoase utilizate i gradul lor de periculozitate), costurile (echipamente, consumabile necesare cum ar fi selectori chirali, medii tampon, accesorii etc.) i acceptarea n mediul universitar i n cel industrial. CE chiral pate fi folosit n stadiile timpurii ale conceperii i perfecionrii unui medicament (sinteza unui candidat pentru un viitor medicament chiral), n procesul de producie al unui medicament chiral, studii de formulare, studii de faz preclinic i clinic, precum i depozitarea i utilizarea medicamentului. n fazele precoce ale sintezei unui medicament enantiomerii sunt detectai ca i compui chirali puri sau ca mixturi, mpreun cu ali intermediari sintetici i produi secundari. Pentru acest gen de substane de analizat, CE asigur avantaje fa de GC (cu excepia celor cteva anestezice gazoase mai sus amintite) i este cel puin la fel de adecvat ca i HPLC. Cerine precum eficiena crescut a separrii, selectivitatea crescut, automatizarea, etc. sunt chiar mai bine ndeplinite prin CE dect prin HPLC. Formele de prezentare ale medicamentelor solide (dar i a unor lichide) conin n mod obinuit o matrice (derivai celulozici, amidon, oligozaharide cu greutate molecular mic etc.) care pot s creeze anumite probleme datorit adsorbiei acestora la nivelul peretelui intern capilar i s afecteze EOF. Compuii cu greutate molecular mare pot da probleme i n cazul HPLC (contaminarea coloanei, adsorbia ireversibil a fazei staionare, precipitarea pe filtru etc.). O posibil soluie pentru aceste probleme n CE ar putea fi pre-acoperirea peretelui capilar. Ca soluie

231

alternativ, ingredientele matricei pot fi ndeprtate de pe prob prin diverse metode de pre-tratare ale probei (filtrare prin membrane, extracie lichid-lichid etc.). n studii de faz preclinic i clinic o substan candidat pentru a deveni medicament, posibilii si metabolii (faza I i faza II) trebuie determinai n medii biologice precum plasm, ser, urin, saliv LCR i omogenate tisulare. Majoritatea acestor probe sunt mai compatibile cu CE dect cu tehnicile cromatografice. Constituenii plasmatici cu greutate molecular mare pot fi sursa unor probleme asemntoare polizaharidelor mai sus menionate datorit adsorbiei acestora pe peretele capilar intern. Medicamentul surs poate avea structur polar sau poate suferi transformri metabolice ctre compui cu astfel de structur. Acestea pot avea loc n special pentru metabolii de faz II precum glucuronoconjugai, sulfai, mercapturai etc. CE este tehnica de elecie pentru analiza compuilor ce pun astfel de probleme. Desigur, este foarte dificil ca prin GC i HPLC s se poat realiza enantiosepararea unui medicament chiral sau a metaboliilor si de ordinul I sau II din prima etap de separare. Totui, acest lucru este posibil prin CE chiral. Figura 7.9 prezint ca exemplu enantiosepararea simultan a metaboliilor de ordinul I i II ai antihistaminicului chiral dimetindena. Astfel, aa cum ilustreaz acest exemplu, CE poate funciona mai bine pentru un medicament chiral i metaboliii si ce au polariti diferite. Rata de succes a metodei este unul din cele mai importante criterii de selecie a unei tehnici analitice. Aa cum a fost menionat n subcapitolul precedent, numrul de CSP pentru procedeele de enantioseparare descrise n literatur ating numrul de 200. Numrul de selectori CE chirali efectivi este mai sczut. Dei CE permite un screening al selectorilor chirali mult mai rapid i mai eficient din punct de vedere al costurilor n comparaie cu HPLC iar perfecionarea metodei n cazul CE poate fi mult mai redus ca durat n general i doar n cazul a doi enantiomeri ratele de succes pentru cele dou tehnici par a fi comparabile. Totui, superioritatea metodei CE fa de HPLC devine evident n cazul n care este necesar separarea i enantiosepararea simultan a amestecurilor ce conin medicamentul chiral surs, metaboliii si de ordinul I i II, intermediarii sintetici i /
232

sau produii de degradare. n Figura 7.9 este prezentat ca exemplu enantiosepararea simultan a metaboliilor de ordinul I i II ai antihistaminicului chiral dimetindena. Un alt exemplu al unei enantioseparri mai complexe este prezentat n figura 7.10.

Fig. 7.9 Enantiseparare simultan prin CE a metaboliilor de ordinul I i II ai dimetindenei: 1,6-hidroxidimetindina; 2,6-hidroxi-N-demetildimetindina; 3,6-hidroxidimetindinglucoronid; 4,6-hidroxi-N-demetildimetindina-glucoronid (dup Rudolf , Blaschke 1999)

Fig. 7.10. Enantiosepararea simultan prin CE a thalidomidei i a metaboliilor ei de faz I (dup Meyring i colab.,1999) 233

Enantiosepararea thalidomidei prin HPLC, CE sau CEC nu constituie o problem. Mai dificil este mai degrab enantiosepararea simultan a thalidomidei i metaboliilor importani ai acesteia ce au fost detectai recent n probe de plasm i ficat, incubate cu fraciunea S9, ce conin amestec racemic de thalidomid, provenite de la voluntari de sex masculin crora li s-a administrat per os thalidomid racemic. Thalidomida a fost retras n 1961 datorit potenialului su teratogen. Totui, acest compus are efecte remarcabile mpotriva leprei, inhib HIV-1, inhib eliberarea TNF- etc. Recent, thalidomida a fost aprobat de ctre FDA pentru tratamentul erythema nodosum leprosum. Astfel, investigaiile asupra mecanismelor teratogene ale acestui medicament sunt foarte importante. Metaboliii thalidomidei par a fi agenii potenial teratogeni, acetia formndu-se stereoselectiv. nseamn c unii metabolii se formeaz n principal prin transformarea metabolic a (R)- iar ceilali a (S)-thalidomidei. Pentru a putea urmri fenomenul, este necesar o metod pentru enantiosepararea simultan a thalidomidei i a metaboliilor acesteia. Toate ncercrile experimentale de separare i enantioseparare a thalidomidei i a celor trei metabolii importani ai acesteia ntr-o singur etap de lucru folosind fie HPLC cu coloan chiral, fie CE cu un singur selector chiral n modul normal de polaritate, au euat. Totui, au putut fi toate separate ntr-o singur etap folosind CE cu o combinaie de doi selectori chirali (Fig. 7.10). n tehnicile cromatografice este posibil i o combinare a doi selectori chirali prin schimbarea coloanelor. Totui aceast tehnic este asociat cu cteva probleme tehnice (presiune retrograd crescut, creterea volumului mort, dispersia n exces a vrfurilor etc.). n plus, selectorii chirali pot fi amestecai n CE n orice raport dorit (aspect limitat doar de solubilitate). Acest lucru este dificil i consum mult timp n HPLC i GC. Comparnd selectorii chirali ce exprim aceeai enantioselectivitate termodinamic de recunoatere ntr-un experiment n condiii ideale, devine clar faptul c rata de succes a unei enantioseparri este mult mai mare n CE dect n HPLC. Acest avantaj este explicat prin faptul c eficiena de vrf este mult mai mare n CE iar factorul de solubilizare crete proporional la N1/2. n plus, interaciunile selector selectat pot fi enorm intensificate n CE prin creterea concentraiei
234

selectorului chiral. Acest lucru poate fi limitat de ctre solubilitatea unui selector chiral, vscozitatea mare a electrolitului de fond sau curentul crescut n cazul selectorilor chirali ncrcai (ionic). Totui, suporturile de migrare sunt destul de cuprinztoare pentru optimizarea separrii. Astfel, puterea de separare a CE este n mod cert mai mare iar instrumentele disponibile pentru ajustarea unei separri chirale sunt mult mai numeroase dect n cazul tehnicilor cromatografice. Reproductibilitatea timpilor de migrare i a separrii n ntregime au fost motive de incertitudine n CE timp ndelungat. Totui, aa cum indic cele mai recente progrese, acesta nu mai este un aspect critic. Pentru eliminarea interveniei peretelui capilar asupra motilitii substanei analizate, au aprut cteva tehnici eficiente, fie prin ajustarea motilitii EOF, fie prin supresia acesteia. n plus, selectorii chirali utilizai n CE devin din ce n ce mai bine i mai uniform caracterizai. Ambele tendine descrise faciliteaz evoluia ctre buna reproductibilitate a metodelor CE chirale. Sensibilitatea a fost considerat o problem major n CE timp ndelungat i este improbabil ca CE chiral va fi folosit n bioanaliza medicamentelor deoarece enantiomerii trebuie determinai la niveluri foarte sczute, adesea de ordinul ng/ml. Cele mai recente progrese din acest domeniu contrazic practic aceast idee, iar CE chiral este aplicat cu mare succes n domeniul bioanalizei. Exist o serie de metode de preconcentrare a probelor precum (micro)extracia capilar pe faz solid, filtrarea / preconcentrarea pe membran, aezarea probei i maturarea probei. n plus, trebuie s lum n considerare i o mare varietate de celule de detecie cu un interval de detecie optic extins. Comparnd limita de detecie (LOD) n CE i HPLC, trebuie s luam n considerare c o zon de prob elueaz sub forma unui vrf mult mai ascuit ntr-un interval de timp mult mai scurt i este mult mai puin diluat n CE dect n HPLC. ns cel mai important argument n favoarea unui viitor promitor al CE chirale n bioanaliza medicamentelor este faptul c aceast tehnic este compatibil cu o metod de detecie att de sensibil, specific i universal precum MS.

235

Un alt aspect al sensibilitii ce nu poate rmne n afara scopului acestei discuii este urmtorul. n majoritatea cazurilor este important detecia impuritii enantiomerului minor n prezena celui major. De aceea, se poate ntmpla ca limita de detecie a impuritii enantiomerului minor n prezena celui major s devin un obiectiv mai important dect LOD de ansamblu. n acest caz, n final factorul de separare va deveni la fel de important pentru succesul metodei ca i sensibilitatea de ansamblu a sistemului. Acest lucru se ntmpl deoarece metoda trebuie s permit o diferen suficient ntre timpii de migrare a doi enantiomeri pentru a permite detecia enantiomerului minor fr suprapunerea acestuia cu cel major. n acest caz poate fi foarte util i ajustarea secvenei de migrare a enantiomerilor. CE asigur avantaje evidente fa de HPLC att pentru optimizarea separrii ct i pentru proiectarea secvenei de migrare a enantiomerilor. Remarcabila simplitate a tehnicii CE este fascinant. Nu sunt necesare pompe, valve i nici celule de detecie separate. Astfel, pe lng simplificarea metodologiei experimentale, sunt eliminate sursele suplimentare de lrgire a peak-ului datorat injectrii probei i deteciei. Un singur set de materiale poate fi folosit cu succes nu doar pentru efectuarea a diverselor moduri de separare CE (electroforez capilar zonal, cromatografie capilar electrokinetic micelar, izotacoforez capilar, focalizare capilar izoelectric, electroforez capilar n gel), dar i separri prin HPLC i CEC . CE este mai rapid dect tehnicile cromatografice din punct de vedere al elaborrii metodologiei. Schimbarea i ntreinerea unei coloane n cromatografie necesit mult timp. n schimb, n CE, schimbarea unui capilar i/sau unui selector chiral necesit doar cteva minute. CE necesit cantiti mici de solveni, ca tehnic microanalitic, fiind nepoluant i ieftin. Cantitile foarte mici de selectori chirali i soluii tampon atrag reduceri suplimentare ale costurilor. Este permis astfel studierea proprietilor de recunoatere chiral ale unor materiale scumpe sau/i rare, disponibile doar n cantiti mici. Capilarele din siliciu topit folosite n CE sunt relativ ieftine, ca i majoritatea accesoriilor. Echipamentul de baz pentru CE de calitate medie nu cost mai mult dect instalaia HPLC sau GC, ns costurile de utilizare pentru acestea din urm depesc pe cele ale CE.
236

n prezent n laboratoarele universitare CE este acceptat. n industrie HPLC rmne principala tehnic de separare chiral. ns avnd n vedere experiena din instituiile academice, se pare c e foarte probabil ca n viitorul nu prea ndeprtat CE va deveni tehnica de elecie pentru enantiosepararea analitic n industriile farmaceutic, chimic, alimentar , agrochimic, dar i n laboratoarele clinice i de bioanaliz. 7.5.4. Electrocromatografia capilar ( CEC) n subcapitolul 7.5.3 au fost evideniate cteva avantaje mai importante ale CE fa de HPLC i GC n enantioseparare. Avantajele mai sus amintite sunt datorate prezenei unui selector chiral mobil n cazul CE, ca i pentru mecanismul de separare electrokinetic, n comparaie cu suportul staionar n cazul tehnicii cromatografice. Pe de alt parte, selectorul chiral mobil nu este ideal deoarece: (1) trebuie s fie schimbat dup fiecare analiz, ceea ce duce la un consum crescut de selector chiral i dificulti de reproductibilitate de la determinare la determinare pentru o separare dat i (2) prezena unui selector chiral n capilarul de separaie creeaz probleme semnificative n cuplarea CE cu un spectrometru de mas i face practic imposibil utilizarea detectorilor chiroptici n CE. Din acest motiv, la nceputul anilor '90 a fost introdus o tehnic hibrid ntre HPLC i CE, denumit CEC. De la aceast tehnic se ateapt s combine eficiena nalt caracteristic mijloacelor de separare potenate electric cu selectivitatea de separare ridicat a CSP disponibile n HPLC. n plus, suportul staionar ne permite evitarea problemelor mai sus amintite legate de aplicarea selectorului chiral mobil n CE. Evoluia recent a CEC chiral au fost prezentate sumar n cteva articole review-uri [Lmmerhofer i colab., 2002]. Dei CEC chiral a fost utilizat cu succes la enantiosepararea substanelor de analizat cu diverse structuri, n literatur sunt publicate doar cteva aplicaii pentru probleme ale analizei n domeniile farmaceutic, biomedical i mediu nconjurtor. Doar o publicaie prezint o ncercare nu prea reuit de enantioseparare simultan a thalidomidei i metaboliilor hidroxilai de faz I ai acesteia [Meyring i colab., 2000]. n acest studiu, CSP a fost un amestec destul de complex ntre doi derivai
237

polizaharidici. n afar de acest exemplu, a fost publicat o ncercare validat de CEC pentru enantiomerii -blocantului metoprolol folosind CSP ce conin vancomicin n modul polar-organic [Carlsson i colab., 2000]. Alt lucrare descrie enantiosepararea antidepresivului venlafaxina i a principalului su produs metabolic , folosind tot CSP pe baz de vancomicin. Metoda a fost aplicat i pe probe de plasm a unor pacieni sub tratament cu venlafaxin [Fanali i colab., 2001]. Alturi de aplicaiile acesteia pe medicamente pure i probe biologice, CEC poate fi aplicat i pentru controlul puritii enantiomerice al formelor de prezentare ale medicamentelor chirale, aa cum s-a artat n cazul contraceptivului Tigoa ce conine levonorgestrel i etinilestradiol ca i ingredieni activi. Alte aplicaii ale CEC legate de unele dificulti existente n domeniul farmaceutic i biomedical vor aprea n viitorul apropiat. Aceast concluzie optimist este susinut de numeroasele aplicaii ale acestei tehnici n separarea amestecurilor racemice standard ale enantiomerilor, de timpii de analiz sczui descrii deja n cazuri selecionate i de o mai bun nelegere a mecanismelor subsidiare ale CEC (chiral).

7.6. Perspective
Analiza celor mai recente progrese n domeniul enantioseparrii indic o continu cretere a importanei acordate dezvoltrii de noi medicamente i a eficienei n utilizarea celor n uz. Tehnicile miniaturizate de analiz cum ar fi CE, LC capilar i CEC care funcioneaz cel puin la fel de bine ca i HPLC, vor deveni mai importante. Tehnicile miniaturizate sunt mai flexibile, mai ieftine i mai puin poluante. Pentru aplicaii n domeniul produciei medicamentelor chirale enantiomeric pure, cromatografia SMB i variantele sale mai eficiente n anumite cazuri sunt aparent mai avantajoase dect cristalizarea diastereomeric, separarea enzimatic, rezerva chiral i sinteza catalitic asimetric. Totui, decizia final trebuie luat de la caz la caz, innd cont de timp, etapele elaborrii medicamentului, aspectele economice, nivelul produciei etc.

238

CAPITOLUL 8 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE: APLICAII N BIOFARMACEUTIC 8.1. Introducere

Conform definiiei IUPAC, termenul cromatografie de afinitate caracterizeaz varianta particular de cromatografie n care pentru separare este utilizat specificitatea unic a interaciunilor substana de analizat ligand. Ligandul este imobilizat pe un suport solid iar substana de analizat (de cele mai multe ori o protein) este adsorbit specific la trecerea pin coloan. Eluia de pe suportul de afinitate se realizeaz ntr-o etap separat n condiii definite. n timp ce iniial noiunea descria interaciuni biologice sau biospecifice cum ar fi legarea dintre o enzim i substratul acesteia sau anticorpului cu antigenul, termenul este acum folosit i cnd sunt implicai liganzi non-biologici, ca de exemplu liganzi precum borai, complexe ionice metalice sau vopseluri sintetice. Tehnica a fost utilizat nc din 1910 cnd Starkenstein a izolat -amilaza prin adsorbia pe amidon, ns conceptul modern i termenul ca atare au fost introduse de Cuatrecasas i colab., (1968). n acelai timp s-a dezvoltat tehnica activrii polizaharidelor cu cianur de brom, fapt ce a permis cuplarea nucleofilelor la o matrice de afinitate. De atunci au devenit cunoscute multe alte tehnici de cuplare i au fost comercializate multe suporturi activate i matrice. S-a estimat c peste 60% din protocoalele de purificare a proteinelor publicate implic cromatografie de afinitate. Datorit specificitii, moleculele int pot fi izolate dintr-un amestec foarte complex de compui adesea foarte apropiai ca structur, cu un randament al purificrii de sute pn la cteva mii ntr-o singur etap. n acelai timp se poate face i concentrarea compusului de interes.
239

Aceste avantaje au determinat o larg rspndire a aplicaiilor cromatografiei de afinitate n biochimie, farmaceutic, ca i n chimia mediului sau cea clinic. De la doar dou lucrri pe tema tehnicii, listate n Chemical Abstracts i Medline n 1968 cnd se puneau bazele tehnicii, n 2001 la cutarea termenului cromatografie de afinitate bazele de date arat 1383 rezultate (Chemical Abstracts), respectiv 666 rezultate (Medline). Pentru a enumera doar cteva, au fost recent publicate cri [Bailon i colab., Affinity Chromatography, Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 2000], capitole de cri precum i o ntreag ediie pe tema acestei tehnici. Acest capitol face o scurt sintez a principiilor i a celor mai importante metode ale cromatografiei de afinitate, innd cont de utilizarea acestei tehnici n chimia medical i/sau purificarea proteinelor n farmaceutic, precum i de aplicaiile analitice.

8.2. Principiile cromatografiei de afinitate

Spre deosebire de convenionalele faze staionare care separ substanele de analizat pe baza ncrcrii electrice sau a proprietilor hidrofobe / hidrofile, cromatografia de afinitate se bazeaz pe interaciuni specifice a unei regiuni definite a unei biomolecule cu un ligand. Biomolecule cum ar fi proteinele au caracteristici unice ale distribuiei ncrcrii, a domeniilor hidrofobe i a celor hidrofile, rezultate din resturile de aminoacizi expui la suprafaa situsurilor active. Ligandul, ce poate fi o molecul mic sau o alt macromolecul, interacioneaz n mod complementar cu situsurile respective de legare. Complexul este format printr-o combinaie de interaciuni de tip electrostatic, puni de hidrogen, hidrofobe i van der Waals. Cum, de multe ori doar forma activ a unei biomolecule i expune situsurile de legare corespunztoare, tehnica poate fi folosit i pentru separarea formei active de conformaiile inactive. Exemple de perechi ligand substan dizolvat utilizate n cromatografia de afinitate sunt prezentate n tabelul 8.1.

240

Tabelul 8.1. Exemple de complexe ligand substan dizolvat utilizate n cromatografia de afinitate Ligand Anticorpi Substraturi, coenzime Lectine Acizi nucleici Proteina A, proteina G Colorani triazinici Chelatori metalici Borai inhibitori, Substane dizolvate reinue medicamente, hormoni, peptide, proteine, celule, virusuri cofactori, enzime, receptori, proteine carrier polizaharide, glicoproteine, glicolipide, receptori celulari de suprafa proteine de legare a acizilor nucleici, secvene complementare de baze imunoglobuline proteine i enzime de legare a nucleotidelor peptide i proteine ce conin resturi histidinice, cisteinice i/sau de triptofan, proteine de fuziune His zaharuri, glicoproteine

Principiul cromatografiei de afinitate este schiat n figura 8.1. Ligandul este imobilizat pe un suport solid plasat ntr-o coloan cromatografic.

Fig. 8.1 Principiile cromatografiei de afinitate 241

La aplicarea probei, numai molecula capabil de interaciuni specifice cu ligandul este reinut pe coloan n timp ce restul componentelor sunt dizolvate mpreun cu fraciunile ce sunt ndeprtate. Dizolvarea moleculei legate se realizeaz prin ntreruperea interaciunilor ligandsubstan dizolvat consecutiv unei modificri a diluantului, cum ar fi creterea ncrcrii ionice a substanei tampon sau adugarea de ligand la faza mobil. Coloana de afinitate poate fi reutilizat dup o regenerare corespunztoare. Retenia sau eluia unui compus pe o coloan de afinitate depind de intensitatea interaciunilor ligandsubtan dizolvat, cantitatea de ligand imobilizat i cinetica asocierii i disocierii complexului. Considernd un singur situs de legare ce determin un raport 1:1 de formare a complexului ntre un dizolvant S i un ligand L, formarea complexului poate fi descris prin relaia:

unde [S] este concentraia substanei dizolvate n faza mobil, [L] i [SL] reprezint concentraiile de suprafa ale ligandului, respectiv complexului ligandsubstan dizolvat. kA i kD sunt constantele de asociere i disociere ale reaciilor, iar KA este constanta de asociere a complexului. Meninerea echilibrului soluiei este definit prin relaia:

unde k' este factorul de capacitate al substanei dizolvate, mL reprezint molii de ligand din coloan, Vm este volumul neocupat al coloanei, tr este timpul de retenie al substanei dizolvate (SD), iar tm este timpul nul al coloanei. Astfel, factorul de capacitate al unei anumite SD depinde de valoarea constantei de asociere i de
242

cantitatea de ligand din coloan. Considernd o constant de asociere (KA) de 108 109 M-1 i o concentraie a ligandului (mL/Vm) de 10-5 M, k' devine 1000 10.000, iar tipul de eluie a substanei analizate legate va tinde ctre cteva zile. Singura modalitate de a realiza eluia ntr-un interval de timp rezonabil este prin modificarea variabilelor astfel nct constanta de asociere s fie micorat considerabil n condiii experimentale. Acest lucru se poate obine prin schimbarea soluiei tampon de eluie fie intr-o singur etap, fie gradual. Din motivele cele mai practice, constanta de asociere KA ar trebui s fie egal sau mai mare dect 105 -106 M-1, ceea ce corespunde unei constante de disociere KD de 1-10 M, pentru a asigura buna adsorbie a substanei de analizat. Totui, chiar i o valoare KA n intervalul 103 -106 M-1 poate avea ca rezultat o ntrziere convenabil a proteinei de interes dac densitatea ligandului este suficient de mare. Pe de alt parte, avnd interaciuni ce depesc 1010 -1011 M-1, vor fi necesare condiii severe de eluie a proteinei legate, ceea ce va determina denaturarea proteinei. Constante de disociere n intervalul 10-3 - 10-5 M (ce se transpun n KA= 103 - 105 M-1) sunt n general adecvate pentru eluia n condiii blnde, fr denaturare a proteinelor.

8.3. Ligandul
Alegerea ligandului de afinitate este cea mai important pentru matricea de afinitate, afectnd specificitatea de legare, procesul de imobilizare i costul matricei. Un bun ligand ndeplinete urmtoarele criterii [Carlsson i colab. 1998] : ligandul trebuie s formeze complexe reversibile cu proteina pentru a fi izolat sau separat cu o specificitate adecvat pentru aplicaia urmrit; stabilitatea complexului ar trebui s fie destul de crescut nct s asigure o ntrziere cromatografic suficient a proteinei; complexul ar trebui s fie uor de disociat printr-o schimbare a soluiei tampon, fr ca aceasta s afecteze stabilitatea proteinei ce trebuie izolat sau a ligandului;

243

 ligandul trebuie s aib proprieti adecvate pentru a-i permite imobilizarea pe suport; ideal, ligandul ar trebui s fie ieftin i uor disponibil. Pe baza tipului de interaciuni ce i caracterizeaz, liganzii se pot clasifica n biospecifici, biomimetici, respectiv liganzi pseudospecifici. Exemple de liganzi biospecifici sunt anticorpii, substraturile sau coenzimele, liganzii biomimetici cuprind solvenii, iar natura interaciunilor cu chelatori metalici este de tip pseudospecific. Totui, mai obinuit liganzii sunt clasificai ca monospecifici sau grup-specifici cu subclasificare consecutiv n funcie de greutatea molecular n liganzi cu greutate molecular mic i liganzi macromoleculari. 8.3.1. Liganzi monospecifici Liganzii monospecifici cum ar fi substraturile, hormonii sau anticorpii leag cu nalt specificitate structurile complementare cum ar fi enzime, receptori, proteine carrier sau antigene, astfel nct este legat n complex doar una sau un numr mic de proteine ale unui tip particular de extract celular sau fluid fiziologic. Astfel, pentru fiecare protein dat este necesar o matrice de afinitate unic. De exemplu, vitamina B12 se leag doar de factorul intrinsec din sucul gastric sau de transcobalamina II plasmatic. Anticorpii sunt liganzi macromoleculari monospecifici foarte utili n cromatografia de afinitate, n special cnd trebuie purificat un compus fr un situs de legare direct. Ei pot fi folosii pentru a izola aproape orice, de la peptide pn la celule ntregi. Ca rezultat al tehnologiei moderne a hibridomului, anticorpii monoclonali au nlocuit masiv anticorpii policlonali. n principiu, aceast tehnologie asigur i o surs constant de anticorpi uniformi cu reproductibilitate ridicat de la o serie de producie la alta. Ca avantaje menionm afinitatea de legare ridicat, de cele mai multe ori de cel puin 10 ori mai mare dect a anticorpilor policlonali, rezultnd factori de purificare de cteva mii ntr-o singur etap. Dezavantajele sunt reprezentate de costurile ridicate i susceptibilitatea la degradare proteolitic. n consecin nu ar trebui aplicate extracte neprelucrate/brute direct pe coloanele de afinitate bazate pe anticorpi monoclonali.
244

n general, liganzii nonspecifici se leag mai intens i necesit condiii de eluie mai severe dect n cazul liganzilor cu specificitate de grup ale cror complexe pot fi de obicei disociate n condiii blnde. Un exemplu de legare extrem de strns este complexul avidin-biotin cu constant de disociere KA de 1015. 8.3.2. Liganzi cu specificitate de grup Liganzii cu specificitate de grup sunt compui care leag o clas sau o familie de proteine nrudite. Cel mai mare grup de liganzi aplicai n mod curent sunt liganzii cu greutate molecular mic cu ar fi cofactori enzimatici i analogi enzimatici (tabelul 8.2). acetia pot fi de origine biologic sau non-biologic. Pentru purificarea dehidrogenazelor i kinazelor NAD+- i NADP+- dependente sau folosit n special nucleotide adeninice sau analogi precum 5'-AMP i solvenii triazinici Cibacron Blue F3G-A and Procion Red HE-3B, dar acestea sunt legate i de alte proteine precum albumina sau interferoni. n ciuda specificitii relativ largi, s-au obinut randamente de purificare ridicate folosindu-se protocoale de eluie specifice sau prin valorificarea formrii de complexe teriare pe baz de substraturi.
Tab. 8.2 Exemple de liganzi cu specificitate de grup Ligand Liganzi cu greutate molecular mic 5'-AMP Cibacron Blue F3G-A dehidrogenaze NAD+- dependente, kinaze ATP- i cAMP dependente dehidrogenaze NAD+- dependente, proteine de legare a acizilor nucleici, albumina, interferon, 2macroglobulina, factori procoagulani enzime NADP+- dependente, aldehid-reductaza, dihidrofolat-reductaza, carboxi-peptidaza G, interferon, plasminogen i activatorul plasminogenului tripsina, trombina, factorul Xa al coagulrii proteaze serice, factori procoagulani, plasminogen i activatorul plasminogenului ARNr, plasminogen i activatorul plasminogenului Exemple de molecule legate

cofactori sau

Procion Red HE-3B

Benzamidina Arginina Lizina

245

Liganzi macromoleculari Heparina factorii VII, IX, XI, XII, XIIa ai coagulrii, trombina, antitrombina III, factorii complement, lipaze, lipoproteine, ARN i ADN polimeraze, receptori steroizi, antigenul de suprafa al virusului B hepatic, interferon ATP-aze, protein-kinaze, fosfodiesteraze, neurotransmitori, interferon glicoproteine, proteine de membran, glicolipide, lipoproteine, polizaharide, hormoni, 1-antitripsina, interferon anticorpi policlonali i monoclonali anticorpi policlonali i monoclonali

Calmodulina Lectine

Proteina A Proteina G

Liganzii cu specificitate de grup includ lectine, heparina i proteinele bacteriene A i G (tabelul 8.2). Lectinele interacioneaz cu glucidele care le confer proprieti deosebite de purificare a glicoproteinelor solubile sau membranare precum hormonii, proteinele plasmatice, antigenele, anticorpii sau antigenele de grup sanguin. Pot fi legate chiar celule sau organite celulare. Lectinele difer n raport de specificitatea fa de glucide n funcie de sursa lectinelor. Concanavalina A i lectina din linte (Lens culinaris) leag -D-manoza i -D-glucoza comune i reziduurile nrudite stereoizomeric. Cele dou lectine difer n ceea ce privete puterea lor de legare, concanavalina A formnd n cele mai multe cazuri complexele cele mai stabile. Glicoproteinele care conin un numr mare de grupri N-acetilglucozamin, precum 2-macroglobulina, glicoproteinele 2-acide sau mucinele pot fi purificate folosind lectina din germeni de gru. Heparina polizaharid-sulfatat este folosit frecvent pentru izolarea factorilor de coagulare plasmatici i alte proteine plasmatice, dar i pentru purificarea enzimelor precum endonucleazele sau ARN i ADN polimerazele i receptorii steroizi. Proteinele bacteriene A i G sunt cel mai mult folosite n etapele de purificare ale anticorpilor. Ambele proteine difer n ceea ce privete specificitatea lor fa de clasele de imunoglobuline provenite de la om sau care au surs animal. Proteina G este o protein de suprafa celular provenit de la streptococi de grup G, n timp ce proteina A este izolat din Staphylococcus aureus. Este utilizat i proteina A recombinat.
246

8.3.3. Obinerea ligandului Dei prezint selectivitate nalt, liganzii de provenien natural au adesea un potenial restrns datorit disponibilitii limitate. Prin dezvoltarea chimiei i biologiei, asociat adesea cu tehnici de modelare computerizat, spectroscopie cu raze-X i rezonan magnetic nuclear, apare o nou oportunitate de a obine liganzi de afinitate non-naturali, nalt specifici. Tehnologiile phage-display permit identificarea liganzilor peptidici pentru o molecul int dat dintr-o imens banc de peptide diferite exprimate pe suprafaa bacteriofagilor. Prezentarea bncii de peptide pe suprafaa bacteriofagilor (phage display) ca pe o fuziune de peptide i o protein de nveli fagic permite legarea fizic ntre peptidul prezentat i secvena ADN ce codific pentru secvena de aminoacizi a acestuia. Varietatea de peptide/proteine poate fi introdus prin mutageneza combinativ a genei de fuziune. Pot fi creai, replicai, selectai i amplificai un numr extrem de mare de fagi printr-un proces numit biopanning. Bncile sunt incubate cu o molecul int, fie ca int imobilizat, fie naintea captrii complexului pe un suport solid. Ca i n cromatografia de afinitate, peptidele i proteinele ce nu interacioneaz sunt splate i ndeprtate, urmnd ca ulterior moleculele ce au interacionat s fie eluate. Peptidele sau proteinele ce interacioneaz prin phage-display pot fi amplificate prin infecie bacterian, pentru a le crete numrul de copii. Procesul de selecie/amplificare poate fi repetat pentru a mbogi n continuare acei membrii ai bncii cu afinitate relativ mai crescut fa de int. Rezultatul este o populaie final de peptide ce este dominat de secvene care leag intele cel mai bine. Un ligand identificat n acest fel poate fi ulterior imobilizat pe un suport i aplicat pentru izolarea unei molecule int dintr-o prob. Prin aceast abordare, liganzii derivai din domeniul proteinei A au fost selectai pentru bnci combinative prin phage-display i utilizai pentru izolarea prin cromatografie de afinitate de imunoglobuline A plasmatice de origine uman [Rnnmark i colab., 2002], anticorpi monoclonali umanizai [Ehrlich , Bailon, 2001] i factor VIII de coagulare de origine uman recombinat [Nord i colab., 2001].
247

O abordare similar cu phage-display pentru peptide, valorific bncile de oligonucleotide ce permit identificarea anumitor secvene nucleotidice, cunoscute ca aptameri, care se leag cu nalt afinitate i specificitate de o molecul int dorit. nalta afinitate a aptamerilor este atribuit capacitii lor de a ncorpora molecule n structura lor i de a se integra n structura moleculelor mari precum peptidele. n timp ce n soluii sunt deseori astructurai, aptamerii se pliaz la legarea moleculei lor int. Secvenele nucleotidice sunt identificate printr-un proces denumit evoluie sistematic a liganzilor prin mbogire exponenial (SELEX). Secvenele de legare sunt izolate din bncile aleatorii folosind o colan de afinitate cu molecula int dorit i ulterior amplificate prin reacia de polimerizare n lan (PCR). Acestea sunt urmate de alte cteva tratamente ciclice similare. Rezultatul este o populaie de oligonucleotide n care predomin secvenele care leag cel mai bine inta. Un ADNaptamer specific L-selectinei umane a fost utilizat efectiv pentru purificarea unei proteine de fuziune imunoglobulin L-selectin uman recombinat din mediu de condiionare pentru celule ovariene de hamster chinezesc. Pentru purificarea la scar redus n laborator sau ca liganzi de deschidere, liganzii de origine biologic prezint cteva neajunsuri n cazul aplicrii lor la scar larg. Astfel, acetia necesit i ei nii purificare, putnd fi contaminai cu ADN-ul gazdei sau virusuri i prezint variabilitate de la lot la lot. n plus, procedeele de sterilizare pot determina degradarea, iar instabilitatea ligandului poate cauza contaminarea produsului final cu produi de extracie potenial toxici sau imunogeni. Pe de alt parte, liganzii sintetici sunt compui bine definii care pot fi preparai pe scar larg fr probleme. Chimia combinatorie (combinatorial chemistry) n combinaie cu tehnicile de modelare computerizat i spectroscopia prin raze-X sau prin rezonan magnetic nuclear au condus ctre conceperea i obinerea de noi liganzi. Screening-ul unei bnci de peptide de sintez combinatorie a avut rezultat obinerea de tri- i tetrapeptide dimerice i tetramerice care s-au dovedit a fi liganzi utili pentru izolarea imunoglobulinelor i anticorpilor monoclonali [Fassina i colab., 2001]. Un exemplu este utilizarea phage display pentru identificarea unui ligand
248

de deschidere urmat de optimizarea prin sintez peptidic n faz solid asociat cu modelarea molecular care a dus la obinerea unei pentapeptide ca i ligand pentru regiunea de legare a unui anticorp monoclonal ndreptat mpotriva unui steroid. Peptidul imobilizat a fost ulterior utilizat pentru purificarea anticorpului [Murray i colab., 2001]. Conceperea de novo a liganzilor de afinitate a fost de asemenea obinut prin recuperarea informaiei structurale a proteinei int din rezultatele cristalografiei cu raze-X, RMN sau omologe, i identificarea situsurilor de legare adecvate fie ca situsuri active, un situs implicat n legarea ligandului natural, fie ca o regiune sau un domeniu pe suprafaa proteinei. Pn acum au fost realizate trei abordri [Lowe i colab., 2001]: (1) investigarea structurii interaciunilor normale protein ligand ca ablon pe baza cruia este modelat un ligand biomimetic, (2) modelarea unui ligand complementar resturilor aminoacizilor expui la nivelul situsului int i (3) imitarea direct a interaciunilor naturale de recunoatere biologic. Exemple de utilizare a chimiei combinatorii pot fi modelarea de novo a liganzilor pe structura de baz a triazinei. Acest mod de abordare pe baz de ablon a fost utilizat pentru obinerea liganzilor de afinitate modelai pe proteina A pentru izolarea i purificarea imunoglobulinei G umane. Modelarea prin complementaritate a fost aplicat la obinerea unui ligand pentru un precursor recombinat al insulinei iar imitarea interaciunilor biologice s-a realizat prin obinerea unei lectine artificiale ca adsorbant de afinitate pentru glicoproteine. O parte din aceste medii de afinitate au fost comercializate.

8.4. Matricea de afinitate

8.4.1. Materialul de suport Suportul solid de susinere a ligandului n coloan controleaz numeroi factori cum ar fi proprietile chimice de imobilizare i caracteristicile fluxului. Un material ideal trebuie s ndeplineasc cteva criterii: suportul trebuie s prezinte macroporoziti pentru a permite interaciunea liber cu molecule mari;
249

 suportul trebuie s fie neutru i hidrofil pentru a fi prentmpinate interaciunile nespecifice cu matricea; suportul trebuie s conin grupri funcionale adecvate pentru ataarea liganzilor prin obinerea derivailor cu acesta, prin intermediul unei mari varieti de reacii chimice; suportul trebuie s fie chimic stabil n condiiile adesea severe n cursul obinerii derivailor i regenerrii (inclusiv sterilizrii) coloanei; suportul trebuie s fie fizic stabil sub presiunea hidrodinamic din cursul cromatografiei; suportul trebuie s fie uor disponibil cu costuri reduse. Matricele de provenien natural se bazeaz pe polizaharide ce formeaz spontan geluri care ndeplinesc majoritatea condiiilor de mai sus. Agaroza, un polizaharid cu structur liniar compus din molecule alternante de D-galactoz cu legturi n poziiile 1, 3 i 3,6-anhidro-L-galactoz cu legturi n poziiile 2, 4, a fost menionat prima oar n 1968 i este nc cel mai utilizat suport datorit proprietilor deosebite ale gelului i pentru c este relativ inert biologic. Principalul inconvenient al agarozei native este instabilitatea sa chimic i fizic, dar a fost n cea mai mare parte depit prin crearea de legturi chimice ncruciate. Alte material de suport includ celuloza, dextrani cu legturi chimice ncruciate, poliacrilamida, tris(hidroximetil)acrilamida polimerizat (trisacril), geluri hidroxialkil metacrilat, vinildimetil azlacton-N,N'-metilen-bis(acrilamid) copolimeri, derivai ai polistirenului precum i derivai ai gelului de siliciu , perle de sticl i ceramice poroase. Mai sunt folosite i copolimeri micti agaroz-acrilamid i dextran-acrilamid. n funcie de suport, cromatografia de afinitate se poate subclasifica n tehnic de joas performan i tehnic de nalt performan. Cromatografia de afinitate de joas performan utilizeaz geluri nonrigide cu particule de dimensiuni mari. n aceast categorie intr majoritatea materialelor pe baz de carbohidrai i polimeri. Datorit presiunilor de mpingere relativ mici coloana poate funciona chiar i la un flux generat gravitaional sau folosind pompe peristaltice.
250

n cromatografia de afinitate de nalt performan suportul este constituit de un material rigid cum ar fi derivai ai gelului de siliciu, sticl poroas, polistiren hidroxilat sau perle de agaroz cu legturi chimice ncruciate dense cu dimensiune mic a particulelor care rezist presiunilor mari aplicate n condiii standard n cromatografia lichid de nalt performan (HPLC). Aceast tehnic este utilizat n special pentru aplicaii analitice. 8.4.2. Imobilizarea ligandului Materialele de suport difer i n funcie de metodele disponibile de obinere a derivailor. Majoritatea metodelor de imobilizare a liganzilor s-au axat pe valorificarea gruprilor hidroxil prezente n suporturile pe baz de carbohidrai. Unul din avantajele agarozei este faptul c i menine structura microporoas n solvenii organici. Cum majoritatea reaciilor organice sunt efectuate n medii organice, aceste reacii pot fi aplicate i agarozei. Acesta poate fi un alt motiv al utilizrii frecvente a acestui material. Reaciile de imobilizare sunt determinate de grupri funcionale prezente n suportul solid i n ligand, ca i de condiiile de reacie tolerate de ctre suport i ligand. O protein necesit n general condiii de reacie mai blnde dect o molecul organic mic. n majoritatea cazurilor, procedeul este constituit din trei etape: activarea suportului pentru a crea grupri funcionale reactive; cuplarea ligandului ;i dezactivarea gruprilor reactive reziduale ale suportului printr-un exces de compus cu greutate molecular mic. n tabelul 8.3 sunt exemplificate metodele uzuale de imobilizare utilizate n cromatografia de afinitate. n cele mai multe cazuri este introdus n matrice o grupare electrofilic, care va reaciona cu gruprile nucleofilice ale ligandului, precum gruprile amino, tiol sau hidroxil. Cuplarea prin grupri electrofilice ale ligandului i grupri nucleofilice ale matricei este mai rar pus n practic. Se poate efectua oxidarea diolilor cu periodat de potasiu pentru obinerea unei aldehide naintea imobilizrii ligandului.
251

Tabelul 8.3 Metode de imobilizare n cromatografia de afinitate Grupare funcional Amino Substan imobilizat Bromur de cian (CNBr) Carbonil diimidazol (CDI) 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) Esterii N-hidroxi succimidei Introducerea gruprilor amino- prin reacii de reducere (de ex. reducerea nitroderivailor) Activare epoxi sau bioxiran Clorur de tosil Clorur de tresil Divinilsulfon 2-fluoro-1-metilpirimidin toluen-4-sulfonat (FMP) Activarea azlactonei Clorur cianuric Hidroxil Carbonil diimidazol (CDI) Activare epoxi sau bioxiran Divinilsulfon Clorur cianuric Tiol Iodoacetil Bromoacetil Maleimid Piridil disulfat Activare epoxi sau boxiran Divinilsulfon 2-fluoro-1-metilpiridin toluen-4-sulfonat (FMP) Acid 5-tio-2-nitrobenzoic (TNB) tiol Aldehid Carboxil Hidrogen activ (CH) Metoda hidrazidei Introducerea gruprilor amino- prin reacii de reducere Carbonil diimidazol (CDI) 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) Sinteza diazo Condensarea Mannich

252

Reaciile puse n practic depind de suportul folosit, gelul de siliciu i perlele de sticl necesitnd introducerea gruprilor adecvate nainte de a se putea efectua cuplarea. Pentru a evita reaciile cu componentele probei, poate fi necesar blocarea gruprilor active ce rmn dup ataarea ligandului. n plus, gruprile de blocare nu ar trebui s prezinte proprieti de legare nespecific. Sunt deseori folosite molecule mici precum aminoetanol, mercaptoetanol, mercaptoetilamina sau tris(hidroximetil)aminometan. Numeroi productori pun la dispoziie multe suporturi activate i de asemenea informaii detaliate asupra procedurilor de cuplare. Alegerea substanei chimice pentru imobilizare joac un rol important pentru funcionarea final a coloanei de afinitate. Condiii de reacie improprii sau nespecifice pot afecta reactivitatea sau o varietate de posibile orientri ale ligandului pe gel. Aa numita ataare multi-situs se refer la legarea pe mai mult de o grupare reactiv a ligandului. Dei prin aceasta se obine o legare mult mai stabil dect cea pentru un singur situs, ataarea pe mai multe situsuri poate determina distorsiunea sau denaturarea situsului activ al liganzilor proteinei. Orientarea aleatorie se refer la ataarea de gruprile funcionale localizate la nivelul unor situsuri variabile ale ligandului. Dei o anumit cantitate de ligand este ataat n poziia adecvat, o parte poate fi ataat eronat, afectnd reactivitatea sau blocnd situsul activ. Per ansamblu, la aceste materiale se observ o activitate sczut a ligandului. Chiar i cnd se pstreaz orientarea adecvat, afectarea steric a reactivitii poate avea loc i atunci cnd ligandul este ataat prea aproape de suprafaa suportului sau de ali liganzi. Fenomenul de afectare steric a reactivitii prin molecule de vecintate poate fi redus prin scderea gradului de acoperire a ligandului cu ajutorul unui distanator (spacer) ce mrete distana dintre suport i ligand. Sunt disponibile diverse molecule i substane distanatoare. Molecula distanator poate fi ataat iniial pe suport urmat de cuplarea ligandului sau aceasta poate fi ncorporat n ligand cu imobilizarea consecutiv pe matrice. Molecula distanator nu ar trebui s intervin prin interaciuni nespecifice cu nici una din componentele probei. Molecule distanator frecvent utilizate n cromatografia de afinitate sunt acidul 6253

aminocapronic, diaminodipropilamina, 1,6-diaminohexan, etilendiamina, acidul succinic, glutaraldehida i epoxizii aminai. Ataarea liganzilor pe suport ar trebui realizat print-o legtur chimic ct mai stabil posibil, pentru prevenirea pierderii ligandului n timpul operrii coloanei. Totui, n anumite circumstane poate fi util ataarea ligandului printr-o legtur chimic ce poate fi clivat dac este necesar. Un exemplu este legtura disulfidic ce se poate forma i cliva n condiii blnde prin reacii de schimbare tiol-disulfid. Conceperea unui mediu de activitate presupune trei pai cheie: (1) selecia matricei, (2) selecia ligandului i (dac este necesar) a moleculei distanator, i (3) alegerea metodei de cuplare. Din literatur sau de la productori sunt disponibile multe protocoale standardizate; totui, n special pentru liganzii noi, trebuiesc studiate metode special concepute, pentru a asigura n final o bun capacitate de legare a coloanei. Civa distribuitori pun la dispoziie i matrice de afinitate ce conin diferii liganzii cu specificitate de grup. O nou strategie de imobilizare este oferit de fazele staionare monolitice caracterizate prin viteze crescute de transfer a masei. n acest caz un ligand este conjugat cu unul din monomerii unui amestec de polimeri. Polimerizarea in situ are ca rezultat un monolit de afinitate cu o structur poroas, prezentatoare de liganzi definii.

8.5. Principii de operare

Condiiile de legare i eluie pentru o substan analizat dat depind de natura interaciunilor dintre ligand i molecula int. Afinitatea prea sczut va determina producii sczute, iar substana analizat fiind antrenat prin coloan se pierde. O legare prea puternic poate duce la producii sczute printr-o eluie insuficient. Metodele de preparare a probei premergtoare aplicrii probei pe coloan ar trebui s asigure legarea moleculei int. De asemenea, coloana trebuie s fie echilibrat cu substana tampon de legare naintea utilizrii. Cnd se lucreaz cu interaciuni slabe ce ating lent starea de echilibru, trebuie reglat un flux lent fa de interaciunile de afinitate ce ating rapid echilibrul. Deoarece cromatografia de afinitate este o tehnic
254

ce implic legturi chimice, volumul probei nu afecteaz separarea atta timp ct condiiile experimentale asigur o legare suficient de solid ntre ligand i substana de analizat. Dup ce tot materialul nedorit este ndeprtat (splat) de pe coloan, se poate face eluia compuilor legai. Nu exist o schem general aplicabil tuturor mediilor de afinitate. Complexele ligand substan de analizat sunt meninute printr-o combinaie de interaciuni electrostatice i de tip hidrofob atta timp ct hidrogenul menine legturile. Condiiile care slbesc aceste interaciuni determin detaarea compuilor legai. n plus, stabilitatea ligandului i a moleculelor int trebuie s fie tratate cu atenie, mai ales n cazul proteinelor. Adesea trebuie fcut un compromis ntre condiiile severe necesare pentru o bun eluie i riscul denaturrii proteinelor. Condiiile de eluie n cromatografia de afinitate pot fi clasificate n selective i neselective. Condiiile selective sunt folosite n cazul interaciunilor cu specificitate de grup. n aceste cazuri substana tampon conine compui care competiioneaz fie pentru legarea de ligandul de afinitate n coloan, fie pentru legarea de molecula int. Eluia selectiv este deseori efectuat n esen sub aceleai condiii de solubilizare ca i cele folosite pentru prob. Condiiile de eluie neselective sunt n mod frecvent aplicate pentru interaciuni cu nalt specificitate. Acestea includ modificri ale pHului, tria ionic sau polaritatea soluiei tampon pentru eluie. pH-ul determin gradul de ionizare sau de ncrcare a gruprilor ligandului i/sau substanei de analizat legate astfel c o modificare a pH-ului influeneaz direct situsurile de legare prin scderea afinitii sau modificarea conformaional. O scdere abrupt a pH-ului soluiei tampon este metoda de eluie a materialelor puternic legate cea mai frecvent folosit. Stabilitatea chimic a proteinei i a matricei de afinitate limiteaz utilizarea n acest sens a pH-ului. O cretere a triei ionice a tamponului va determina eluia proteinelor care sunt legate predominant prin interaciuni de tip electrostatic. Aceasta este o tehnic blnd de desorbie, n special pentru enzime, 1M NaCl fiind de obicei suficient. Diverse proteine pot de asemenea s fie dizolvate prin gradiente continui sau discontinui. Reducerea polaritii poate fi obinut prin adugarea dioxanului sau etilenglicolului n eluent. n cazul legturilor strnse dominate de interaciuni de tip
255

hidrofob, eluia poate fi obinut prin utilizarea aa numiilor ageni chaotropi care denatureaz structura proteinelor, cum ar fi ureea, guanidin hidroclorat sau detergenii. Totui acestea sunt condiii drastice care pot cu mare probabilitate s denatureze proteinele. Adesea pe toat durata procesului de purificare atunci cnd sunt manipulate proteine membranare sau n cursul purificrii anticorpilor, sunt folosite concentraii sczute de detergeni pentru a se inhiba adsorbia sau agregarea de tip hidrofob nespecific. Se pot aplica i combinaii de condiii selective i neselective. Reutilizarea adsorbanilor de afinitate depinde de natura probei ca i de stabilitatea ligandului i a matricei, inndu-se cont de condiiile de eluie i curare. De regul este necesar reechilibrarea atent a coloanei nainte de folosire. n plus, suporturile pe baz de carbohidrai i liganzii proteici sunt predispuse la degradare microbian i poate avea loc i contaminarea coloanei cu resturi celulare degradate, lipide i proteine. Acestea trebuie ndeprtate complet. n plus poate fi necesar decontaminarea pentru ndeprtarea bacteriilor, virusurilor i piogenilor, dar astfel de condiii severe ar putea s nu fie aplicabile liganzilor proteici, de exemplu. Este recomandat depozitarea coloanelor la temperaturi mici.

8.6. Modele de cromatografie de afinitate

Spectrul larg al interaciunilor de afinitate a generat o mare varietate de tehnici speciale ce poart fiecare propria nomenclatur (tabelul 8.4). Dintre acestea nu toate se bazeaz pe specificitatea unic ntre ligand i molecula int, ci mai degrab pe fenomene mai generale; altele se refer la aplicaii specifice. Principalele modele vor fi discutate pe scurt. 8.6.1. Cromatografia de bioafinitate Cromatografia de bioafinitate sau cromatografia de afinitate prin bioadsorbie reprezint tehnica prin care o molecul de origine biologic este folosit ca ligand de afinitate. Aceasta a fost primul tip de cromatografie de afinitate i reprezint categoria de tehnici cea mai divers.
256

Civa dintre liganzi sunt prezentai n tabelele 8.1 i 8.2, iar n literatur au fost descrii muli alii. Acetia includ molecule mici precum aminoacizi, peptide, carbohidrai, cofactori, substraturi i inhibitori nucleotidici, precum i molecule mari cum ar fi proteine, polizaharide i acizi nucleici. Unele forme ce utilizeaz un anumit tip de interaciune sunt recunoscute ca metod de sine stttoare, ca de exemplu cromatografia de afinitate a lectinei, care se bazeaz pe interaciunea dintre lectine i carbohidrai i cromatografia de afinitate avidin-biotin ce utilizeaz legarea de nalt specificitate a biotinei de avidin.
Tabelul 8.4 Tipuri de cromatografie de afinitate i tehnici asociate Cromatografia de bioafinitate Cromatografia de imunoafinitate Cromatografia de afinitate pentru lectin Cromatografia de afinitate avidin biotin Cromatografia de afinitate ligand colorant Cromatografia de afinitate prin ioni metalici imobilizai Cromatografia prin interaciuni hidrofobe Cromatografia tiofilic Cromatografia prin inducie de ncrcare hidrofob Cromatografia prin afinitate de covalen Cromatografia de afinitate joas Cromatografia prin afinitate de receptor Cromatografia prin afinitate respingere Cromatografia prin afinitate de perfuzie Cromatografia prin afinitate de centrifugare Cromatografia prin amprentare molecular (molecular imprinting) Cromatografia prin afinitate de membran Partiia de afinitate Precipitarea de afinitate Cromatografia prin afinitate de nalt performan Electroforeza de afinitate Electroforeza de afinitate capilar

257

8.6.2. Cromatografia de imunoafinitate Cromatografia de imunoafinitate poate fi privit ca o subcategorie de cromatografie de bioafinitate din moment ce ligandul ,un anticorp, are de regul origine biologic. Uneori sunt denumite n acest fel metodele de imobilizare a antigenelor pentru purificarea anticorpilor. n funcie de natura antigenului, ligandul poate fi sau nu de origine biologic. nalta selectivitate a interaciunilor antigenanticorp i posibilitatea de producere a anticorpilor ndreptai mpotriva unei mari varieti de substane solubile au transformat cromatografia de imunoafinitate ntr-un instrument foarte util de purificare i analiz a compuilor. Se pot exemplifica astfel medicamente, hormoni, peptide, enzime, proteine recombinate, anticorpi, receptori, organite celulare, celule i virusuri. n plus fa de folosirea ca tehnic de sintez, utilizarea n scopuri analitice a cromatografiei de imunoafinitate devine din ce n ce mai atractiv.

Fig. 8.2 Structura Cibacron Blue F3G-A

8.6.3. Cromatografia de afinitate ligand-colorant Cromatografia de afinitate ligand-colorant utilizeaz drept liganzi colorani textili reactivi pe baz de triazinil. n timp ce muli liganzi de afinitate naturali sunt scumpi datorit costurilor mari de producie i purificare, disponibili n cantiti limitate i au i alte inconveniente, colorani sintetici pot fi obinui n cantiti mari la un pre sczut dnd posibilitatea ntocmirii facile a unei colane de afinitate. n plus, aceti compui prezint o stabilitate chimic i biologic excelent. Cibacron Blue
258

F3G-A (fig. 8.2) a fost primul ligand de afinitate utilizat, iar de atunci s-au folosit muli compui derivai ai coloranilor. Coloranii sunt imobilizai pe suport prin intermediul ionilor de clor reactivi pe jumtate, triazina heterociclic. n multe studii cinetice s-a demonstrat c trazinilcoloranii interacioneaz cu situsurile de legare a liganzilor nucleozidici NAD+, NADH, NADP+, NADPH, ATP sau GTP. Pn n momentul de fa prin cromatografia de afinitate ligandcolorant s-au izolat molecule precum enzime (kinaze, dehidrogenaze, endonucleaze, hidroxilaze, fosfodiesteraze i multe altele), factori ai coagulrii, interferoni i albumin seric. Dei coloranii textili pot interaciona cu o remarcabil specificitate cu proteine, n unele cazuri interaciunile acestora cu un numr mare de proteine aparent nenrudite compromit inevitabil specificitatea lor de legare ceea ce le confer dezavantaje majore. Preocuparea n ceea ce privete puritatea, toxicitatea i scprile n produsul final a coloranilor comerciali le-a limitat utilizarea n domeniul biofarmaceutic. Tehnicile raionale de proiectare molecular incluznd cristalografia cu Raze X, modelarea molecular i chimia combinatorie au dus la obinerea de colorani liganzi biomimetici cu nalt specificitate pentru o protein dat, pstrnd i majoritatea avantajelor coloranilor comerciali.

8.6.4. Cromatografia de afinitate prin ioni metalici imobilizai (IMAC) n IMAC sau cromatografia de afinitate prin chelare metalic, o tehnic introdus n 1975, un ion metalic este complexat cu un agent chelator imobilizat. Ionul metalic formeaz legturi coordinative cu aminoacizi cu grupri donor de electroni precum histidina, triptofanul sau cisteina. n timp ce interaciunile dintre ionii metalici i catenele laterale ale aminoacidului sunt uor reversibile, acestea pot fi utilizate pentru adsorbie i ulterior pot fi desfcute n condiii blnde fr denaturare. Chelatorii utilizai n mod obinuit includ acidul iminodiacetic, acidul nitrilotriacetic, acid carboximetilat aspartic sau N,N,N'-tris(carboximetil) etilendiamin. Selectivitatea n IMAC este determinat de ionii metalici care pot fi mprii pe baza reactivitilor prefereniale fa de nucleofile n ioni tari, intermediari i slabi. Ionii metalici tari sunt Fe3+, Al3+, Ca2+, care manifest afinitate
259

fa de oxigen. Ionii metalici slabi cum sunt Cu+, Hg2+ sau Ag+ au afinitate fa de sulf, n timp ce ionii intermediari Cu2+, Ni2+, Zn2+ i Co2+, formeaz legturi coordinative cu azotul, oxigenul i sulful. n ciuda faptului c multe resturi de aminoacizi cu perechi libere de electroni pot participa la formarea legturilor, n practica IMAC retenia proteic se bazeaz n principal pe disponibilitatea resturilor histidil de la suprafaa proteinelor. Ionii metalici intermediari utilizai de obicei pot fi ordonai dup creterea specificitii: Cu2+ < Ni2+ < Zn2+ Co2+. Astfel, Cu2+ va reine mai multe proteine iar numrul va scdea n cazul Ni2+, Zn2+ i Co2+ datorit afinitii mai sczute pentru situsurile de legare. Dintre proteinele care au fost purificate prin IMAC cu ajutorul resturilor expuse ale histidinei sunt proteinele serice umane, interferonul, lactoferina i activatorul tisular al plasminogenului. Afinitatea pentru resturile histidinice a dus la sinteza moleculelor de afinitate terminate n histidin pentru proteine i peptide recombinate. Aceste terminaii conin multiple histidine legate la captul C sau N terminal. Dup ce au fost evaluate cteva terminaii formate din 1 pn la 8 peptide repetitive ce conin histidin, astzi de departe cele mai folosite terminaii histidinice sunt formate din 6 resturi consecutive de histidin, care sunt comercial cunoscute sub diverse denumiri. Terminaiile histidinice par a fi compatibile cu toate sistemele de expresie folosite astzi astfel nct proteinele cu terminaii histidinice pot fi produse cu succes n celule procariote i eucariote, intracelular sau ca proteine secretate. Ca tehnic mai degrab nespecific de purificare a proteinelor, IMAC este n prezent una dintre cele mai utilizate metode pentru izolarea proteinelor recombinate . S-a estimat c peste 50% din proteinele recombinate exprimate la celulele gazd procariote sunt purificate prin IMAC. De obicei, prelungirile polihistidinice nu compromit funcionalitatea biologic a unei proteine i nu au imunogenitate important. Totui, mai ales n cazul proteinelor implicate n terapie, clivarea terminaiei ar putea fi necesar, nefiind ntotdeauna uor de realizat. n general clivarea enzimatic este aplicabil n purificarea amestecului rezultat din proteina de fuziune clivat, enzim, proteina neclivat i alii produi de clivare. n plus, trebuie luat n considerare toxicitatea ionilor metalici ce scap din coloana IMAC. Mai mult,
260

ionii metalici de multe ori catalizeaz reacii de oxidare ce pot duce la degradarea oxidativ a proteinelor. Cei mai predispui la reacii de oxidare sunt n special aminoacizii cisteina i metionina ce conin sulf. 8.6.5. Cromatografia prin interaciuni hidrofobe (HIC) HIC se bazeaz pe asocierea gruprilor hidrofobe pe suprafaa proteinelor cu liganzi mobilizai prin legturi de tip hidrofob slabe pe suporturi cromatografice. HIC este efectuat n soluii apoase, fapt ce o difereniaz de tehnica de cromatografie cu faz invers, unde sunt folosii solveni organici pentru eluia proteinelor. n plus densitatea ligandului n cromatografia cu faz invers este mai mare, astfel c faza staionar poate fi privit ca o faz continu, n timp ce n HIC liganzii interacioneaz individual cu moleculele int. Liganzi folosii uzual sunt resturi butil, octil sau fenil adesea legai prin intermediul unui eter glicidil. Sunt folosii ca liganzi i oligoetilenglicol i hidroxipropil. Retenia substanei dizolvate este controlat de tipul i concentraia srii utilizate i a aditivilor organici care schimb polaritatea solventului. Adugarea de etilen glicol n soluia tampon modific structura de ansamblu a apei n sensul unei structuri ce se aseamn unei faze organice, scznd astfel interaciunea dintre protein i liganzi. Influena srurilor asupra legrii poate fi corelat cu poziia srii n seria Hoffmeister, clasificnd anionii i cationii n liotropici sau chaotropici. Srurile liotropice cum sunt sulfatul de amoniu sau fosfatul de potasiu vor scdea solubilitatea apei n proteine crescnd astfel retenia lor n HIC; srurile chaotropice vor determina desorbia proteinelor. n practic desorbia proteinelor va fi realizat prin scderea concentraiei saline. Alegerea corect a srii este un factor important ce determin specificitatea separrilor. Dup ncrcarea probei n coloan folosind o soluie tampon cu o concentraie a srii suficient de mare pentru a determina legarea proteinei int dar suficient de sczut pentru a evita precipitarea proteinei, componentele nelegate din prob sunt splate i eliminate din coloan. Ulterior concentraia de sare este sczut n trepte sau continuu sub forma unui gradient pentru a se realiza eluia selectiv a proteinei de interes. Ali factori care trebuiesc
261

controlai pentru obinerea rezultatelor reproductibile includ pH-ul, temperatura i aditivii ce influeneaz stabilitatea proteinei. n general, HIC este o metod de separare blnd datorit aciunii stabilizatoare a srurilor iar rata de recuperare este adesea ridicat. Cromatografia prin interaciuni tiofilice poate fi considerat o metod din aceeai categorie cu HIC. Matricea poart liganzi liniari ce conin atomi de sulf. Iniial structurile tiofilice erau obinute din suporturi activate cu vinil sulfon i din 2mercapto etanol. Ambele grupri funcionale, sulfon i tioeter, prezente n structura ligandului preau s acioneze ntr-o manier complementar pentru a amplifica afinitatea de legare a proteinei. Realizrile mai recente n special n domeniul industrial implic mai mult liganzi compui din heterociclii cu atomi de azot sau de sulf. Aceast metod de separare a fost aplicat n special pentru purificarea anticorpilor din surse naturale sau provenii din recombinare datorit specificitii certe a agenilor adsorbani fa de aceast clas de proteine. Prin modul su de funcionare, cromatografia prin interaciune tiofilic seamn cu HIC prin faptul c adsorbia proteinelor este favorizat de sruri cu concentraii ridicate iar eluia are loc cnd concentraia salin este sczut. Totui, cteva diferene ntre cele dou tehnici arat modurile diferite de adsorbie a proteinelor. Interaciunile hidrofobe nu au loc cu adsorbani tiofilici din moment ce structurile tioetilsulfonice nu posed o hidrofobie pronunat. Spre deosebire de HIC, interaciunile dintre ligand i protein sunt relativ independente de temperatur i clorura de sodiu stimuleaz desorbia proteinelor. n timp ce albumina este puternic adsorbit de liganzi hidrofobi, agenii de adsorbie tiofilici manifest o afinitate deosebit pentru imunoglobuline. Cromatografia prin inducie de ncrcare hidrofob (HCIC) este o tehnic recent de adsorbie a proteinelor ce implic liganzi bazici sau acizi slabi care sunt nencrcai la pH fiziologic. Adsorbia se bazeaz pe asocieri hidrofobe n timp ce desorbia rezult din respingerea ionic dintre ligand i proteina adsorbit cnd pH-ul este schimbat ntr-o direcie adecvat. Selectivitatea crescut pentru anticorpi poate fi obinut cnd sunt folosii liganzi ce combin un situs tiofilic cu structuri
262

heterociclice ionizabile cum ar fi 4-mercaptoetil piridin [Boschetti, 2002]. Acest ligand (pKa 4.8) este nencrcat la pH neutru i se ncarc prin scderea pH-ului la 4-5, rezultnd desorbia ca i consecin a forelor de respingere dintre mediul adsorbant i anticorpul ncrcat pozitiv. 8.6.6. Cromatografia prin covalen Cromatografia prin covalen, spre deosebire de alte tehnici de afinitate, presupune formarea i ruperea unor legturi covalente ntre SD i ligand. Liganzii proteicii sunt adesea ataai prin intermediul gruprilor N- sau C- , cu scopul de a forma legturi stabile care sunt rezistente la condiiile cromatografice i dificil de eliberat fr distrugerea proteinei. Singura grupare funcional cu structur chimic adecvat pentru formarea unei legturi covalente stabile i care de asemenea poate fi desfcut n condiii uoare este grupul tiol. Astfel cromatografia prin covalen a fost aproape exclusiv aplicat n scopul izolrii peptidelor ce conin grupri tiol. Aceast tehnic este denumit de unii autori i cromatografie de adsorbie tiofilic. n timp ce gruprile tiol pot participa la un numr de racii chimice datorit proprietilor de nucleofilie, aa numitul schimb tiol-disulfid este utilizat n cromatografia prin covalen. Reacia poate fi descris astfel: R S S R + 2R1 SH 2R SH + R1 S S R1 (5)

Reacia poate fi privit fie ca o nlocuire nucleofil, fie ca un proces redox, deoarece starea oxidativ a fiecrui atom de sulf se modific n cursul reaciei. Schimbul tiol-disulfid joac un rol important n procesele biochimice cum ar fi biosinteza proteinelor, agregarea proteinelor i interaciunilor ligand - receptor. n practic ligandul este un complex reactiv disulfidic constituit dintr-un tiol alifatic i un tiol aromatic ca de exemplu 2-tiopiridina. n timpul aplicrii, o protein ce conine tiol va fi imobilizat pe faza solid ca urmare a reaciei tiol-disulfid. Desorbia proteinei se realizeaz utilizndu-se un exces de tiol alifatic cu greutate molecular mic n faza mobil. Mai nou, sunt utilizate pentru imobilizarea reversibil a tiolilor matrici cu tiosulfonai i tiosulfinai. Aa cum se poate intui din mecanismul de
263

reacie prin intermediul cromatografiei prin covalen se pot izola proteine ce conin nativ grupri tiol sau proteine la care gruprile tiol pot fi introduse de exemplu prin reacii de reducere ale punilor disulfidice existente. 8.6.7. Cromatografia de afinitate membranar Termenul de cromatografie de afinitate membranar se refer la formatul suportului. n timp ce la cromatografia de afinitate normal matricea de afinitate este susinut de coloane n timpul procesului cromatografic, n metoda prezentat sunt utilizate membrane. Prin utilizarea membranelor pot fi depite limitrile cromatografiei lichide n coloan cu strat compact date de procesele de compactare ce necesit timp, suplimentarea cu lichid la presiune mare n coloan i restriciile de transfer ale maselor. n straturile poroase, transferul maselor este limitat prin difuziunea lent a substanelor analizate n pori (la final) a materialului. Membranele sunt constituite din canale poroase consecutive ce permit difuziunea filmului la suprafaa membranei n interiorul canalelor ca singura rezisten opus transportului. Difuziunea filmului este de obicei de cteva ori mai rapid dect difuziunea prin pori, ceea ce permite ca limitarea proceselor de adsorbie s fie permutate la interaciunile ligand substan dizolvat. Aceste procese sunt identice cu cele din cromatografia pe coloan i n general foarte rapide. Structura macroporoas i faptul c membranele suprapuse n teancuri sunt subiri n comparaie cu straturile compacte din cromatografie determin curgeri la presiuni mici ceea ce permite un flux crescut i prin urmare timpi de separaie mai mici. Capacitatea de legare necesar este atins prin folosirea unor suprafee interne ale membranelor suficient de mari. Avantajul unor fluxuri mari se poate transforma n dezavantajul unui timp prea scurt de contact al soluiei. Un singur strat de membran poate avea teoretic o capacitate mare, dar capacitatea poate fi mult mai mic datorit timpului de interaciune limitat al probei. n cazul interaciunilor de afinitate puternice, procesul de eluie al moleculei int limiteaz i mai mult acest procedeu prin faptul c timpul de contact poate s nu fie suficient pentru o eluie rapid a materialului legat, rezultnd diluii crescute ale probelor recuperate. Abordri menite s depeasc aceste inconveniente includ
264

folosirea de straturi multiple de membrane n cazul legrii insuficiente sau reciclarea eluentului tampon n cazul unei desorbii lente. Compoziia chimic a membranelor este destul de variat. Sunt folosite materiale pe baz de celuloz i derivai ai acestora, poliamid, poliacrilamid, poliacrilonitril, polisulfon, polivinildien, polistiren, polipropilen, polietilen i altele. n principiu aceste materiale pot fi conjugate cu orice ligand cu structur chimic similar acelora din modulul de pe coloan. Ca i n acest din urm caz, toate tipurile de cromatografie de afinitate pot fi efectuate i n modul membranar. Acum sunt disponibile comercial membrane activate i cuplate cu ligand, car au deja multiple aplicaii.

8.7. Aplicaiile interaciunilor de afinitate

Interaciunile de afinitate pot fi exploatate att pentru aplicaii analitice ct i de sintez. Pentru scopuri preparative modul de lucru va fi n cele mai multe cazuri cromatografia de joas presiune sau tehnologia membranelor, n timp ce HPLC, electroforeza capilar sau biosenzorii vor fi utilizai n primul rnd pentru aplicaii analitice. n plus, tehnicile de afinitate analitice nu sunt folosite doar pentru determinarea unei anumite molecule n analiza farmaceutic, chimic, clinic sau a mediului, dar i pentru identificarea ligandului i studiul interaciunilor ligandsubstana dizolvat. 8.7.1. Purificarea proteinelor farmaceutice Datorit evoluiei n biotehnologie, proteinele recombinate cuprind acum, pe lng produii sanguini i proteine de origine uman sau animal, un numr crescut de produse farmaceutice. Indiferent de surs, esut animal sau uman, ou, plasm sanguin, culturi celulare obinute de la mamifere sau culturi bacteriene, sau animale/plante transgenice, toate aceste produse au origine biologic i necesit o purificare riguroas. n funcie de originea materialului, impuritile includ bacterii, virusuri, lipopolizaharide (endotoxine), prioni, ADN, ARN, proteine ale celulei gazd, carbohidrai, fosfolipide etc. n conformitate cu criteriile Administraiei pentru
265

Alimentaie i Medicamente a Statelor Unite (FDA) precum i ale Ageniei Europene de Evaluare a Produselor Medicale (EMEA), produsul final biotehnologic trebuie s fie bine caracterizat; el trebuie s aib puritate, eficien, stabilitate, farmacocinetic, farmacodinamic, toxicitate i imunogenicitate bine definite. Acestea trebuie analizate pentru identificarea materialelor contaminante menionate mai sus ce provin de la surs; totui proteinele terapeutice conin adesea un amestec de izoforme ce i au originea n modificrile posttranslaionale, plierea defectuoas, agregarea i alte reacii de degradare chimic sau fizic. Purificarea proteinelor poate varia de la un procedeu simplu de precipitare ntro singur etap pn la procese de producie la scar larg care au fost validate. n majoritatea cazurilor vor fi necesare mai mult de o etap pentru ndeprtarea tuturor impuritilor. Prelucrarea ulterioar a materialelor de producie, oricare ar fi sursa acestora, presupune de obicei trei etape majore: captarea, purificarea intermediar i rafinarea uneori cunoscute ca i CIPP. Dup prepararea extractului i separarea de resturi celulare prin procedee ca filtrarea sau extracia lichid/lichid, obiectivul etapei de captare este izolarea concentrarea i stabilizarea proteinei. Masa majoritar de impuriti este ndeprtat n timpul purificrilor intermediare ce urmeaz etapei descrise, urmnd ca n faza final de rafinare s se ating puritatea nalt. Toate cele trei etape implic adesea proceduri cromatografice; etapa de rafinare este uneori compus din dou proceduri de purificare (cromatografice). Cromatografia de afinitate este folosit cel mai eficient n etapele de captare i purificare intermediar, adesea acestea reducndu-se la o singur etap dac sunt utilizai liganzi cu nalt selectivitate. Alte tehnici cromatografice frecvent utilizate n purificarea proteic includ filtrarea n gel, cromatografia de schimb ionic i cromatografia de faz invers. Cunoaterea proprietilor proteinei int i ale impuritilor va fi util n cursul efecturii proceselor de purificare. Pn la 50-80 % din costurile de producie totale ale unui medicament proteic se datoreaz proceselor de purificare. Multe dintre tehnicile biochimice i de biologie molecular standardizate nu sunt neaprat echivalente cu eficiena de lucru i de cost a procesului tehnologic. Astfel, din motive economice, de asigurare a calitii i de
266

complian, protocoalele de purificare convenionale ce presupuneau precipitarea n sruri, la temperatur, pH sau cu polimeri cu greutate molecular mare au fost schimbate cu tehnici selective bazate pe cromatografia de afinitate. Totui i aceast abordare are inconvenientele ei. Astfel, cnd se folosete un ligand de afinitate provenit din surs natural, FDA pretinde ca ligandul folosit la obinerea produsului biologic s ndeplineasc aceleai standarde ca i produsul final. Aadar poate fi necesar o purificare riguroas a ligandului. n plus n cursul cromatografiei vor avea loc inevitabil scpri ale ligandului n produsul final. Fa de aspectele toxicologice ce in de ligand, trebuie s avem n vedere faptul c ligandul va fi asociat cu produsul, formarea complexelor selective fiind un aspect inerent al purificrii. Aceste complexe pot fi dificil de ndeprtat din produs. Pe de alt parte prin cromatografia de afinitate este posibil ndeprtarea substanelor pirogene i endotoxinelor. Liganzii biologici pot fi scumpi, crescnd astfel costurile de producie. O parte din aceste dezavantaje pot fi depite prin folosirea liganzilor sintetici, care de altfel pot fi nalt selectivi. Limitele coloanelor de afinitate datorate presiunii mari de lucru i limitrilor cineticii de transfer a maselor pot fi depite folosind tehnologia membranelor. 8.7.1.1. Proteine plasmatice Proteine cu efect terapeutic cum ar albumina, factorii de coagulare i imunoglobulinele au fost izolate din sngele uman cu muli ani n urm. n ciuda apariiei produselor obinute prin recombinare, cea mai important surs pentru asemenea produse rmne n continuare izolarea din sngele uman. Dei metodele tradiionale de fracionare a plasmei bazate pe etape de precipitare cu etanol sunt nc cele mai folosite n producia curent a preparatelor de albumin i imunoglobulin G cu rol terapeutic, cromatografia de afinitate a fost introdus n prepararea industrial a factorilor de coagulare VIII, IX i XI, von Willebrand, fibronectina, antitrombina III, inhibitorul intertripsinei i proteina C derivat plasmatic. n timp ce cromatografia de afinitate este folosit pentru captarea factorului VIII i factorului IX folosind heparin imobilizat sau anticorpi monoclonali ca i liganzi de afinitate, i antitrombin III prin captarea pe un ligand de heparin din probe proaspete, tehnica
267

este folosit ca

etap de rafinare intermediar n cazul altor produi. Uneori

cromatografia de afinitate este folosit la ndeprtarea impuritilor cum ar fi fibronectina de pe factorul von Willebrand folosind un ligand de gelatin. Factorul von Willebrand nu se leag de gelatin i este recuperat n fracia de ieire, fibronectina fiind adsorbit pe coloan. Dei albumina poate fi legat de colorani, nici un procedeu comercial nu folosete cromatografia de afinitate pentru izolarea acestei proteine. 8.7.1.2. Proteine recombinate Proteine recombinate cu implicaii terapeutice denumite i produse farmaceutice biotech (biotech pharmaceuticals), sunt produse prin tehnologia recombinrii ADN. Acestea susin o pia de desfacere mare cu o cifr de vnzare estimat de 16-17 miliarde de dolari americani n 2001. Actualmente pe pia se regsesc mai mult de 50 de astfel de produse iar peste 40 sunt n faza III i peste 60 n faza II de trialuri clinice. Anticorpii monoclonali reprezint segmentul cu cea mai rapid cretere, cu peste 20 de produse comercializate i peste 20, 45 de produse n faza III respectiv n faza II. Insulina, hormonii de cretere, eritropoietina, interferonii, interleukinele, factorii de stimulare ai coloniilor granulocitare, enzime, factori de coagulare, vaccinuri i anticorpi monoclonali reprezint produse farmaceutice biotech. Dei procesele de producie nu sunt dezvluite din cauza drepturilor de autor, acestea conin cu siguran etape de cromatografie de afinitate. Mai mult, tehnica este utilizat i mai extins n laboratoare, n cercetare i dezvoltare. Se pot distinge dou tipuri de abordri generale. n primul tip proteina nativ interacioneaz cu ligandul, iar a doua abordare implic aa numitele terminaii de afinitate fuzionate cu proteina de interes n care terminaia se ataeaz la ligand n timp ce proteina propriu-zis nu se ataeaz. Tehnologia de fuziune proteic a devenit un instrument important n producia de proteine recombinate. Au fost elaborate o varietate de vectori de expresie cu secvene terminale diferite pentru fuziunea aproape oricrui tip de proteine int ce poate fi clonat i exprimat n celule gazd.

268

Interaciunile ce au fost utilizate ca baz pentru afinitatea proteinei de fuziune includ interaciuni ale enzimelor cu substraturi sau inhibitori, interaciuni carbohidrat - protein, domenii de legare a biotinei, interaciuni antigen anticorp, aminoacizi ncrcai pentru metode bazate pe ncrctur i resturi poli(His) pentru legri metalchelator (tabelul 8.5) [Einhauer, Jungbauer, 2001]. Fiecare secven terminal are propriile avantaje i dezavantaje i selecia trebuie fcut pe baza proteinei de interes i tehnicii de afinitate adecvat.
Tabelul 8.5. Secvene terminale de afinitate pentru proteine recombinate Secven terminal fuzionat Enzime glutation-S-transferaza -galactozidaza Domenii de legare polipeptidice domeniul de legare IgG al proteinei A domeniul de legare IgG al proteinei G Domenii de legare ale carbohidrailor proteina de legare a maltozei domeniul de legare al celulozei Domenii de legare streptavidin-biotin domeniul de legare al biotinei Strep-tag Epitopi antigenici FLAGTM tag Aminoacizi ncrcai poli(Arg) poli(Asp) Interaciuni metal chelator poli(His) 4 9 kDa C, N 5 - 15 kDa 5 16 kDa C C 8 aminoacizi N 8 kDa 9 aminoacizi N C, N 40 kDa 111 aninoacizi N N 14 31 kDa 28 kDa N C 26 kDa 116 kDa N C, N Dimensiune Fuziune la captul C- sau N- terminal

Se consider c, o secven terminal nu ar trebui s intervin asupra modului natural de pliere al proteinei i nu ar trebui s inhibe funcia ei normal sau situsurile ei active i ar trebui s fie expus pe suprafaa proteinei pentru un maxim de interaciune cu ligandul.
269

n plus secvena terminal ar trebui s fie potrivit unor procedee de afinitate uoare i de preferat ieftine, i ar trebui s poat fi uor ndeprtat. n mod curent n tehnologia proteinelor recombinate sunt folosite predominant secvenele terminale poli(His), deoarece par a fi compatibile cu toate sistemele de expresie folosite n prezent. Prin folosirea unor suporturi de afinitate adecvate, cum ar fi suporturi magnetice, abordrile bazate pe secvene terminale pot fi aplicate i n procesarea robotizat a probelor pentru purificarea automatizat a proteinelor. ntrebarea dac secvena terminal trebuie sau nu trebuie s fie ndeprtat, depinde de utilizarea final a proteinei. Pentru caracterizarea proteinelor sau pentru scopuri diagnostice poate fi posibil ca secvena terminal s rmn ataat; multe cazuri pentru a certifica autenticitatea produsului. n plus, secvenele terminale pot fi imunogenice, n special terminaia FLAGTM care a fost conceput pentru a fi imunogen. Astfel, n proteinele de fuziune au fost concepute situsuri de clivaj destinate proteazelor. Totui acest lucru necesit ndeprtarea n siguran a enzimei i a secvenei clivate de pe proteina de interes i adaug n plus etape de purificare i costuri adiionale. De asemenea poate avea loc degradarea proteolitic a produsului. Astfel, dei n laborator este o tehnic excelent, pentru producia industrial, la scar larg a proteinelor, folosirea acestor secvene terminale de afinitate poate s nu fie ntotdeauna adecvat. n afara folosirii lor la purificarea prin afinitate a proteinelor recombinate, anumite secvene terminale pot fi utilizate i n domeniul deteciei specifice n aplicaii imunochimice n condiii ce produc denaturarea n tehnica Western blot dar i n stare nativ pentru ELISA, constituindu-se ntr-un instrument de analiz util pentru monitorizarea nivelului expresiei proteinelor sau pentru urmrirea unei proteine n timpul proceselor de purificare. totui pentru aplicaii farmaceutice ndeprtarea precis a peptidului fuzionat va fi necesar n cele mai

270

8.7.2. Aplicaii analitice Cromatografia de afinitate poate fi folosit sub diverse forme pentru separarea sau analiza anumitor substane solubile. Separarea cromatografic a unei substane care acioneaz cu un ligand de afinitate poate fi primul pas n cuantificarea concentraiei sale n soluie. Sistemele ce utilizeaz cromatografia de afinitate de nalt performan (HPAC) i electroforeza de afinitate capilar, au fost construite pentru a crete viteza acestui proces i pentru automatizarea msurtorilor. Metodele tradiionale de imunoanaliz pot fi proiectate pe baza liganzilor de afinitate imobilizai folosind suporturi cum ar fi perle, geluri sau plci. Detecia electronic a interaciunilor de afinitate au dus la dezvoltarea biosenzorilor de afinitate care nu fac doar determinarea concentraiei substanei de analizat ci pot face i o caracterizare cantitativ a interaciunilor de afinitate. n plus tehnica poate fi adaptat i screeningului de mare capacitate (HTS). Tehnicile de afinitate sunt ntrebuinate i pentru ndeprtarea specific a componentelor dintr-o prob ce interfer cu capacitatea sistemului analitic. Una dintre dificultile majore ale analizei peptidelor i proteinelor din serul uman este intervalul mare de concentraii pe care le pot atinge proteinele n prob. Albumina seric uman variaz de la aproximativ 55% la 75%, iar imunoglobulinele variaz de la aproximativ 8 pn la 25%. ndeprtarea acestor proteine poate fi realizat cu ajutorul matricelor de depleie prin afinitate disponibile comercial ce conin anticorpi pentru proteina G care reduc semnificativ ncrcarea proteic a probei permind analiza componentelor minoritare. Extracia prin afinitate definete procedeul prin care substana analizat este izolat specific i concentrat prin cromatografie de afinitate dintr-o prob naintea analizei prin alt metod fie off-line fie online. Metoda off-line utilizeaz tipic coloane de afinitate de joas performan ambalate n cartue de unic folosin. n metoda online, la coloana analitic este conectat o coloan HPLC ce conine matricea de afinitate prin intermediul unei valve de pornire. Tehnicile analitice sunt din ce n ce mai mult folosite la descoperirea medicamentelor pentru identificarea liganzilor (ligand fishing) i a structurilor
271

precursoare i n ADME (adsorbie, distribuie, metabolism i excreie) precoce cu scopul studierii interaciunilor dintre ligand i substana analizat, cum ar fi legarea medicament protein, inclusiv aspecte stereochimice, pentru determinarea complexului stoichiometric, pentru estimarea constantelor de legare i a dinamicii de legare. Desigur metodele pot fi utilizate i n stadii ulterioare ale elaborrii unui medicament pentru analiza potenialelor medicamente. 8.7.2.1. Cromatografia de afinitate de nalt performan (HPAC) HPAC combin specificitatea interaciunilor ligand - substan de analizat cu viteza, eficiena i automatizarea HPLC. Teoretic orice ligand poate fi mobilizat pe suporturi ce pot rezista presiunilor nalte aplicate n HPLC. Exemple de suporturi de afinitate ce sunt adecvate acestor condiii includ gelul de siliciu sau sticl modificat, perle de azlacton sau medii de polistiren hidroxilat. Stabilitatea i eficiena acestor suporturi permite utilizarea lor n echipamentul standard HPLC. Dei materialele din HPLC fac din HPAC o metod mai scump n comparaie cu cromatografia de afinitate de joas performan, HPAC poate fi un instrument foarte util pentru determinri analitice n plus fa de potenialul su de purificare a compuilor cu viteze ridicate. Probabil cel mai cunoscut exemplu de aplicaie analitic a cromatografiei de afinitate este determinarea hemoglobinei glicozilate n laboratorul clinic, ca expresie a nivelurilor medii ale glucozei sanguine n timp, pentru controlul diabetului. Hemoglobina glicozilat poate fi separat de varianta nativ folosind acid aminofenilboric ca ligand, i raporturile relative ale fraciunilor glicozilate i neglicozilate sunt cuantificate prin absorbana hemoglobinei la 414nm. Anterior au fost prezentate succint i alte aplicaii clinice. HPAC ce folosete proteina A imobilizat ca i ligand a fost utilizat pentru analiza imunoglobulinelor plasmatice sau din diferite medii de cultur, iar cromatografia de afinitate cu lectin a fost utilizat pentru determinarea izoenzimelor sau microheterogenitii glicoformelor glicoproteinelor. Totui, majoritatea aplicaiilor recente ale cromatografiei de afinitate analitice au fost n domeniul interaciunilor protein-medicament. Concret,
272

HPAC a fost folosit pentru analiza atarii medicamentului de protein (albumina), inclusiv a aspectelor legate de stereospecificitate [Hage, 2002], dar este posibil i determinarea interaciunilor enzim-substrat. n tehnica de eluie zonal (cea mai folosit metod de studiere a interaciunilor medicamentoase cu o faz staionar proteic n HPAC) schimbarea timpului de retenie al factorului de capacitate k' este monitorizat ca o funcie a concentraiei a unui agent ce competiioneaz n faza mobil. Metoda de eluie frontal este o alt tehnic utilizat n HPAC. Coloana este constant alimentat cu o soluie ce are o concentraie cunoscut a substanei dizolvate. n timp ce SD se leag de ligand, ligandul devine saturat i cantitatea de compus ce elueaz din coloan crete, formnd o curb ascendent. Din aceste experimente poate fi obinut informaia calitativ i cantitativ, incluznd comparaii ale afinitii relative de legare, nlocuirea prin competiie a unei substane analizate de ctre ali compui sau determinarea constantelor de echilibru i de debit. Cromatografia de imunoafinitate de nalt performan (HPIAC) devine un instrument din ce n ce mai comun pentru analiza compuilor biologici i sintetici. n plus fa de utilizarea acesteia pentru detecia direct a substanelor utilizate n analize cromatografice i imunoextracia substanelor analizate, coloanele de imobilizare pentru anticorpi i antigene sunt aplicate pentru diverse tipuri de imunoanalize. Aceast abordare cunoscut i ca imunoanaliz cromatografic este adecvat n special pentru determinarea unor urme de substane care prin ele nsele nu produc un semnal detectabil facil. Acest impediment este depit prin imunoanalizele cromatografice folosind un anticorp marcat sau un analog al substanei de analizat pentru detecia indirect. Modalitile comune includ analize de competitivitate, analize sandwich i analize imunometrice one-site (un situs). n locul anticorpilor pot fi folosite i fragmente Fab. Iniial marcajele erau reprezentate de enzime sau capete terminale fluorescente. Ca i n analizele staionare, principiul imunoanalizelor prin legare competitiv implic incubarea probelor cu o cantitate prestabilit de substan de analizat marcat n prezena unei cantiti limitate de anticorpi. Analiza poate fi
273

efectuat prin injectarea simultan, detectndu-se fie marcajul care elueaz cu fraciunile splate fie compusul marcat care elueaz n etapa de disociere. n injecia secvenial, marcajul este realizat dup injectarea probei i este analizat fie n materialul nereinut, fie n materialul reinut. n metoda prin substituie, coloana este nti saturat cu analogul marcat, urmnd injectarea probei, analiza cantitii de compus marcat care este splat i ndeprtat din coloan prin disocierea local i reconstituirea complexului. n analizele imunometrice tip sandwich two-site (dou situsuri), sunt utilizai doi anticorpi diferii care se leag de substana de analizat. Primul se ataeaz de suportul solid i este utilizat pentru extracia moleculei int iar al doilea anticorp este marcat i este adugat probei fie nainte, fie dup injecia acestuia n coloan. Al doilea anticorp marcheaz substana de analizat pentru a permite detecia acesteia. n analizele imunometrice one-site, proba este incubat cu o cantitate n exces cunoscut de anticorp marcat. Acest amestec este ulterior aplicat unei coloane cu un analog imobilizat al substanei de analizat care servete la extracia anticorpilor care nu au fost legai de proba de analizat. Detecia se face prin msurarea fie a componentei marcate nereinute fie a anticorpului care este disociat ulterior din coloan n etapa de eluie. Prin HIPAC au fost analizai muli compui printre care enzime, hormoni i proteine dar i molecule sintetice cum este teofilina. De asemenea este posibil i imunodetecia post-coloan pentru cuantificarea unei anumite substane de analizat ce elueaz dintr-o coloan HPLC prin utilizarea unui reactor post-coloan i a unei coloane cu anticorp sau antigen imobilizat conectat la ieirea coloanei HPLC analitice. 8.7.2.2. Electroforeza capilar de afinitate Electroforeza capilar de afinitate este o tehnic analitic n care sunt nregistrate modelele de migrare ale interaciunilor moleculare n cmp electric. Metoda este o variant a electroforezei capilare folosit la identificarea legturilor specifice i la estimarea constantelor de legare cu condiia ca interaciunile s nu fie inhibate de condiiile de separare i ca moleculele ce formeaz complexe s poat fi difereniate de cele necomplexate. Astfel interaciunea trebuie s schimbe molecula
274

ca i dimensiune, form, ncrcare sau orice ali parametrii responsabili pentru o ncrcare n sistemul de separare electroforetic. Avantajele folosirii electoforezei capilare sunt marea varietate de substane ce pot fi analizate, viteza de analiz i consumul redus de probe i substane. Un dezavantaj este limita concentraiei detectabile adesea nesatisfctoare, n special cnd se aplic detecia UV. n principiu metoda poate fi transferat i tehnologiei chip. Liganzii pot interaciona cu substana analizat fie nainte, fie n timpul desfurrii propriu-zise a electroforezei. Ultimul procedeu reprezint metoda clasic de electroforez de afinitate care este analog cromatografiei de afinitate. Pentru analiza interaciunilor cu afinitate slab sau intermediar liganzii sunt utilizai liberi n soluie sau imobilizai pe peretele capilar i substana de analizat se deplaseaz n concentraii constante de liganzi. n timpul interaciunii cu ligandul se observ o schimbare a timpului de migrare a substanei de analizat ce depinde de concentraia ligandului. Aceast metod nu necesit o concentraie cunoscut a probei i nici compuii nu trebuie s fie puri. Pot fi analizate bnci de compui. Prin electroforeza capilar sunt studiate n mod tipic interaciuni puternice, ca metod de separare i cuantificare a substanei de analizat liber sau legat ntr-un amestec de preincubare ntr-o singur etap. Electroforeza capilar de afinitate a fost utilizat la analiza constantelor de legare, a dinamicii de legare i a stoichiometriei de legare a numeroase complexe ligand substan de analizat, incluznd interaciuni peptid peptid, peptid oligonucleotid, peptid heparin, protein ion metalic i antigen anticorp. Electroforeza capilar de afinitate cu schimb de migrare poate fi utilizat n scopul cercetrii amestecurilor de compui pentru studiul afinitii fa de ligand, mai ales asociat cu spectrometria de mas, i pentru studii structur-funcie. n plus electroforeza capilar de afinitate este un element valoros pentru determinarea legrii medicament-protein inclusiv a aspectelor legate de stereochimia acestor interaciuni. Un domeniu de aplicaii analitice n extindere este imunoanaliza bazat pe electroforez capilar, definit i electroforez capilar de afinitate a probei. n aceste tehnici, substanei de analizat i se permite s acioneze cu un anticorp iar complexul
275

rezultat este separat de substana de analizat liber prin electroforez capilar. Au fost descrise dou tipuri distincte. n analiza direct sau noncompetitiv, proba pentru studiul de afinitate marcat de regul cu un fluorofor este adugat probei pentru legarea de molecula int. Detecia complexului reprezint o msur direct a probei n soluia prob. n analiza competitiv, o int marcat fluorescent i o cantitate limitat de anticorp sunt adugate probei permind intei marcate i intei din prob s competiioneze pentru anticorp. Moleculele marcate libere sau n complexe sunt separate i detectate, cantitile relative de compui marcai liberi sau legai depinznd de concentraia substanei de analizat din prob. Imunoanalizele prin electroforez capilar s-au dovedit a fi metode versatile pentru o varietate de substane de analizat i matrice prob [Heegaard, Kennedy, 2002]. S-au fcut determinri pe medicamente, hormoni, peptide, proteine, toxine, i chiar virusuri i bacterii. Substanele de analizat pot fi msurate direct n ser sau urin dar i n probe de celule sau tisulare. Interesant, prima imunoanaliz pentru scrapia, prototipul encefalopatiei spongiforme, s-a bazat i pe electroforeza capilar. n plus, imunoanalizele pot fi transferate i pe chip-uri permind timpi de analiz extrem de redui. Un exemplu este dezvoltarea unei imunoanalize electroforetice capilare bazate pe chip pentru determinarea teofilinei n ser, unde electroforeza este complet n 35 secunde. 8.7.2.3. Biosenzori de afinitate Realizrile tehnicilor de imobilizare i inovaiile din domeniul bioelectronicii au dus la elaborarea unor noi dispozitive de detecie bazate pe interaciunea specific dintre receptori, enzime i anticorpi cu moleculele lor int specifice, crendu-se dispozitive de detecie noi pentru domenii diverse cum ar fi controlul diagnosticului, tratamentului, controlul mediului i al deeurilor i analiza dinamic a interaciunilor substanelor biologice. Dei nu se bazeaz pe principii de separare cromatografice sau electroforetice, pentru funcionarea lor aceti senzori implic interaciuni de afinitate. n plus biosenzorii sunt utilizai din ce n ce mai mult n multe domenii ale descoperirii de medicamente, incluznd identificarea intei, ligand fishing, selecia
276

precursorului, elaborarea analizei, studii ADME precoce i controlul calitii [Cooper, 2002].

Fig. 8.3. Principiu schematic al biosenzorilor

Biosenzorii de afinitate sunt dispozitive biosenzor cu tranzistori ce funcioneaz fr piese mobile bazate pe afinitatea ligandului n care interaciunea molecular ligand -int este cuplat la un transductor ce convertete reacia biologic ntr-un semnal de ieire electronic (fig. 8.3). Ligandul imobilizat poate fi orice molecul (bio)specific care interacioneaz cu o molecul int. Poate fi chiar i o celul vie intact care interacioneaz cu substane specifice n soluie cu care vine n contact. Transductorul simte modificrile chimice subtile care au loc ntre ligandul imobilizat i substana analizat. Procesul de detecie poate implica efecte electrice cum ar fi modificri poteniometrice sau fluctuaii amperometrice, efecte optice cum ar fi absorbia sau difracia luminii, modificri ale densitii sau masei precum i diferene termice. Semnalele electronice sunt ulterior amplificate i nregistrate. Dintre toate sistemele de detecie probabil cel mai rspndit sistem este sistemul optic SPR (surface plasmon resonance), fiind disponibile comercial cteva tipuri de astfel de instrumente. SPR detecteaz modificri ale indicelui de refracie din imediata vecintate a stratului de suprafa a chip-ului senzor datorit legrii moleculelor de suprafaa liganzilor imobilizai. Aceast modificare este urmrit n timp real pentru determinarea concentraiei unei substane analizate legate, a afinitii substanei
277

analizate fa de ligand i a dinamicii interaciunilor de asociere i disociere (fig. 8.4). Pot fi analizate o varietate extrem de mare de molecule, de la celule i bacteriofagi pn la compui cu greutate molecular mic cu mase relative pn la 200 Da. Pot fi cercetate interaciuni de afinitate nalt sau joas.

Fig. 8.4 Curba de legare tipic a unui biosenzor optic. Concentraia substanei de analizat rezult din nivelul de rspuns la echilibrul curbei, n timp ce dinamica de legare poate fi calculat din rata de asociere respectiv rata de disociere observate. De obicei, este necesar refacerea ligandului prin eluia n trepte, multe interaciuni avnd durat de supravieuire considerabil. Ciclul de legare este repetat folosind diferite concentraii ale substanei de analizat, pentru obinerea unor date compatibile unui algoritm de legare.

Substanele chimice utilizate pentru imobilizarea ligandului sunt comparabile cu cele folosite pentru coloanele de afinitate. Un procedeu special este chimioadsorbia spacerilor (distanatorilor) ce conin sulf pe suprafee de aur. Stabilitatea acestor legturi o depete pe cea a legturilor covalente de silan (SiH4) cu sticla. Ulterior se poate realiza ataarea ligandului prin intermediul gruprilor reactive ale distanatorului. Ditiobis-succinimidil propionat este un distanator comun al protocoalelor de imobilizare bazate pe chimioadsorbie. n plus sunt disponibile comercial chip-uri cu suprafee preactivate.

278

n principiu orice molecul i chiar celule ntregi pot fi imobilizate n biosenzori pentru analiza unui compusint dat. Exist i metode prin care receptori transmembranari au fost reconstituii n lipozomi sau n straturi lipidice ataate sau adsorbite pe suprafaa chipului. Cnd se analizeaz anumite molecule, aa numiii imunosenzori ce conin anticorpi imobilizai sunt utilizai frecvent n laboratorul clinic i n chimia mediului, dar i pentru detecia bacteriilor i virusurilor n monitorizarea proceselor de igienizare i alimentaie. Exist i o lucrare asupra elaborrii unui biosenzor constituit dintr-un anticorp monoclonal mpotriva lipopolizaharidelor pirogene utilizat pentru detecia substanelor pirogene n ap avnd limite de detecie mai joase dect limitele reglementate prin Farmacopeea Statelor Unite [Taylor, i colab., 2002]. Aptasensori ce conin aptameri imobilizai par a profila o nou clas de biosenzori datorit avantajelor pe care acetia le au fa de anticorpi [O'Sullivan, 2002]. n prezent, biosenzorii optici sunt folosii n elaborarea medicamentelor pentru a confirma semnalele provenite de la HTS fluorescent, chemoluminiscent sau radiometric, i pentru optimizarea precursorilor. n plus fa de identificarea legturilor intermoleculare, biosenzorii permit cercetarea dinamicii interaciunilor biospecifice ntre liganzi i molecule int n timp real. Biosenzorii pot fi folosii i pentru identificarea partenerilor de legare n cursul experimentelor ligand fishing, inclusiv a bncilor combinatorii sau cercetarea extractelor tisulare i celulare. O dat identificat o substan de legare, poate fi efectuat secvenierea aminoacizilor prin spectrometrie de mas folosind biosenzorul ca dispozitiv de purificare prin afinitate micro preparativ. Biosenzorii apropiai de TOFMS (time-of-flight mass spectrometry) desorbie/ionizare laser matrix asistat pot fi folosite i pentru studierea evenimentelor consecutive de legare, sistemelor de legare competitive i pentru caracterizarea funcional i structural a proteinelor incluznd modificrile posttranslaionale n proteomic. Metode integrative de detecie prin spectrometrie de mas i biosenzori pot furniza informaii suplimentare despre funcia intei i specificitile de legare, ceea ce poate duce la accelerarea elaborrii de noi medicamente. n afar de determinarea interaciunii medicament int, biosenzorii
279

au fost utilizai la monitorizarea producerii anticorpilor i citokinelor, pentru precizarea legrii medicament protein n estimarea precoce a ADME i n controlul calitii, metodele de analiz putnd fi validate n concordan cu recomandrile Conferinei Internaionale pentru Armonizare (IHC) ale Cerinelor Tehnice pentru nregistrarea Produselor Farmaceutice de Uz Uman. Ulterior, tehnologia a fost aplicat analizelor serologice ale probelor din clinic pentru determinarea titrurilor anticorpilor.

280

CAPITOLUL 9 IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR PE BAZA REZONANEI MAGNETICE NUCLEARE 9.1. Introducere

Obinerea medicamentelor se confrunt cu noi provocri, odat cu numrul mare de proteine produse n era post-genomic. Determinarea structurii, care este acum mbuntit i mult mai rapid datorit cristalografiei cu raze X i a spectroscopiei prin rezonan magnetic nuclear (RMN), ofer bazele pentru noile posibiliti de producie a medicamentelor pe baza structurii. Astfel, screening-ul proteinelor pentru bncile de molecule mici, a devenit o problem important. In timp ce metodele de screening de mare capacitate (HTS) permit sute sau mii de scanri ntr-un timp scurt, necesitatea tehnologiilor de screening inteligent care pot detecta componente omise de filtrul HTS, este n continu cretere. Screening-ul inteligent, care poate identifica aspecte ale funciilor proteinelor, devine din ce n ce mai important, pe msur ce noi inte sunt obinute din baza de date genomic. Dei analizele cu raze X pot determina structurile proteinelor fr limitri datorit dimensiunii, mult mai rapid dect spectroscopia RMN, cea din urm are avantajul unei analize mai detaliate a interaciunilor liganzilor. In ciuda complexitii unor parametrii RMN, exist parametri sensibili i uor accesibili care sunt supui modificrilor n spectrul corespunztor proteinelor, n urma legrii ligandului. Muli dintre aceti parametri au putut fi utilizai pentru a observate rezonanele proteinelor. Modificrile n structura proteinelor induse de legarea ligandului, care cauzeaz transformri chimice (chemical shift, dependena energiei magnetice nucleare de mediul electronic din molecul), sunt utilizate pentru a detecta localizarea
281

dezvolta

protocoale rapide de screening. n relaia structur-activitate (SAR) prin RMN, sunt

la nivelul proteinei a locului interaciunii cu ligandul. Tehnica este utilizat pentru screening-ul iniial i pentru rafinarea subsecvent. SAR prin RMN necesit marcarea izotopic a proteinei i este de obicei limitat la proteine cu o greutate molecular mai mic de 30-40 kDa. Aceast limit a fost recent extins la proteine cu greutatea molecular de aproximativ 100 kDa prin utilizarea unor noi strategii de marcare. Alternativ, poate fi observat spectrul RMN al ligandului. Aceast clas de tehnici ofer informaii asupra legrii ligandului. Muli parametri RMN ai ligandului sunt utilizai pentru a detecta interaciunea cu proteina. Unele dintre aceste tehnici permit cartografierea epitopilor de legare, oferind astfel informaii importante pentru obinerea medicamentelor. Alte metode bazate pe ligand au un potenial important pentru HTS. Cele dou abordri sunt complementare, oferind informaii referitoare la cele dou fee ale interaciunii. Prima parte a acestui capitol descrie SAR prin RMN, iar cea de-a doua parte descrie tehnici pentru observarea liganzilor. Cteva review-uri au descris aspecte diferite ale screening-ului prin RMN [Roberts, 2000; Shapiro, Wareing, 1998; Diercks i colab., 2001]. Un referat general recent ofer o descriere comprehensiv a acestui domeniu, cu numeroare detalii tehnice. Intenia acestui capitol este de a oferi o privire general asupra celor mai importante tehnici utilizate n screening-ul RMN [Stockmann, Dalvit, 2002].

9.2. Relaia structur-activitate (SAR) prin RMN

SAR prin RMN, propus pentru prima dat de Fesik i colab. (1996), este bazat pe observarea modificrilor transformrilor chimice n spectrele H1-N15-heteronuclear single quantum spectroscopy (HSQC) datorate interaciunilor liganzilor. Semnalele n spectrele H1 N15-HSQC(coerena cu cuantum simplu a unui heteronucleu C13 sau N15) reprezint scheletul amidic al proteinelor (gruprile NH2 ale Asn i Gln). Din moment ce transformrile chimice ale amidelor sunt foarte sensibile la conformaia aminoacizilor i la interaciunile electrostatice ale scheletului HN i CO , rearanjamente minore la nivelul proteinelor, iniiate de legarea ligandului pot cauza modificri chimice semnificative. Este important definirea pragului standard pentru
282

evaluarea transformrilor chimice. Hajduk (2000) a artat c modificrile chimice sunt semnificative n evaluarea de ansamblu a dimensiunilor spectrale mai mari de 0,1 ppm:

Aceast presupunere este aproape identic cu definiia anterioar :

Ambele relaii reprezint aproximativ o perturbare a transformrilor chimice cu o valoare similar cu mrimea tipic a semnalului n spectrul HSQC. Figura 9.1 prezint exemple ale spectrelor HSQC obinute pentru concentraii crescnde de liganzi. Cele dou spectre au fost nregistrate pentru domeniul SH2 Nterminal al fosfatidilinozitol-3-kinazei n urma utilizrii a doi liganzi diferii, fosfotirozina (ptyr, stnga) i un ligand peptidic care se leag cu o constant de disociere micromolar. Cei doi liganzi determin seturi diferite de modificri ale spectrului, reprezentnd interaciuni diferite ale ligandului cu proteina. Peptidul mai mare (EEEpYMPME-NH2) determin efecte adiionale comparativ cu Ac-ptyr-NH2 i perturbri mai importante ale transformrilor chimice.

283

Figura. 9.1 Spectrele p85-N-SH2 ale PI3-kinazei nregistrate la concentraii diferite (albastru rou) ale ptyr (stnga) i pentru un peptid cu afinitate crescut. Modificrile indicate de transformrile chimice sunt dovada diferenelor caracteristice ntre cei doi liganzi.Mai puine semnale sunt afectate n cazul ptyr, iar perturbrile chemical shif sunt mai mici.

n SAR prin RMN, sunt adugai simultan civa liganzi la o protein i perturbrile transformrilor chimice sunt desfurate n experimente subsecvente cu un singur ligand. Procesul descoperirii modulatorilor cu molecule mici i optimizrii ligandului este prezentat n figura 9.2. Screening-ul iniial ofer liganzi cu afinitate sczut care trebuie optimizai. Modulatorii cu molecule mici pentru dou situsuri de legare diferite trebuie s fie identificai n procesul iniial de screening. Dou fragmente optimizate sunt unite pentru a forma un ligand mai mare cu afinitate crescut pentru protein. Combinarea cu informaiile structurale referitoare la protein ajut la adaptarea sintetic a ligandului la situsul de legare al proteinei. Publicaia iniial a SAR prin RMN de ctre Fesik i colab. (1996) a prezentat experimente de legare cu proteina de legare FK506 (FKBP). Au fost identificai numeroi compui cu afinitate sczut pentru dou situsuri de legare diferite. La final, dou molecule au fost delimitate cu ajutorul liganzilor cu lungimi diferite. n acest proces au fost obinui inhibitori cu afinitate nanomolar. Principiul SAR prin RMN era cunoscut i utilizat ocazional cu mult timp nainte de introducerea sa ca metod de screening.
284

Figura 9.2. Reprezentare schematic a SAR prin RMN. Screening-ul iniial detecteaz compui cu afinitate sczut pentru cele dou situsuri de legare. Dup ce afinitatea moleculelor modulatoare a fost optimizat, cele dou fragmente sunt conectate ntr-un mod care menine legarea la ambele situsuri.

285

n unele experimente iniiale, interaciunile domeniului SH2 au fost probate cu ajutorul HSQC i spectroscopiei totale de corelaie (total correlation spectroscopy TOCSY) [Gunther i colab., 1996]. Cu toate acestea, lucrarea lui Fesik despre SAR prin RMN a iniiat dezvoltarea screening-ului prin RMN ca o tehnologie pentru descoperirea compuilor modulatori cu afinitate sczut. n cazul screening-ului iniial, semnalele spectrului HSQC de obicei nu sunt datorate reziduurilor aminoacizilor din structura proteinelor. Astfel, informaiile obinute din SAR prin RMN sunt doar de natur calitativ, pentru a determina dac vreun reziduu este implicat ntr-o interaciune cu ligandul prezent n soluie. Pentru etapa de purificare, este important ca semnalele HSQC s fie atribuite la reziduurilor. Tehnicile de identificare a structurii proteinelor sunt tehnici de rutin n laboratoarele de RMN i pot fi obinute n cteva zile pn la cteva sptmni pentru proteine cu o greutate molecular mai mic de 30 kDa [Clore, Schwieters, 2002]. Astfel este posibil cartografierea regiunii de legare n structur, la locul unde ligandul interacioneaz cu proteina. Dei reziduurile care prezint efecte la SAR prin RMN nu sunt n mod necesar n contact direct cu ligandul, modelul transformrilor chimice ofer de obicei informaii importante pentru producia medicamentelor. Exemplul din figura 9.1 va fi utilizat pentru a demonstra potenialul metodei pentru a evalua contribuia la interaciunea cu proteina a diferitelor pri ale unui ligand. Interaciunile domeniului SH2 cu fosfopeptide a fost iniial descris printr-un model n care peptida se leag la fosfotirozin ntr-un situs/buzunar al proteinei i cu reziduurile +1 i +3 n al doilea situs al proteinei, nconjurat de o bucl mare. Perturbrile chimice observate pentru interaciunea ptyr sunt reprezentate cu albastru pe diagrama structurii domeniului p85 N-SH2 n figura 9.3 (A). Aceste efecte includ reziduurile Arg care coordoneaz inelul fosfotirozin fenil i reziduurile nconjurtoare. Extinderea ligandului la AcpYM-NH2 (fig. 9.3 B) arat efecte adiionale determinate de M n poziia +1 dup ptyr (rou), n timp ce multe dintre transformrile chimice observate pentru ptyr sunt conservate (albastru cu valori identice ale , azuriu cu valori diferite). Extinderea limitei ligandului la EEEpYMPME-NH2 determin efecte adiionale la nivelul celui de-al doilea buzunar de legare (fig. 9.3 C).
286

Figura 9.3 Diagramele Ribbon ale p85 N-SH2 a PI3 kinazei, codificate cu diferite culori ce indic transformrile chimice pentru diferii liganzi. (A) Ac-pY-NH2, (B) pYM-NH2 i (C) EEEpYMPME. (A) Modificrile chimice pentru complexul Ac-pY-NH2-SH2. Reziduurile sunt colorate cu albastru atunci cnd sufer o transformare chimic a ambilor nuclei (eq. 2) de cel puin 0,45 p.p.m. n figurile (B) i (C), transformrile chimice care nu au fost alterate comparativ cu (A) sunt marcate cu albastru, cele marcate cu rou reprezint noi modificri chimice neobservate pentru AcpY-NH2, iar verdele este utilizat pentru reziduurile care au prezentat modificri chimice n (A), dar nu i n (B) sau (C).

Cteva perturbri suplimentare sunt observate la nivelul regiunii de legare a ptyr, iar valoarea majoritii transformrilor chimice la nivelul acestei regiuni este modificat comparativ cu aceea a ptyr. Extinderea modificrilor chimice pentru peptidele cu afinitate nalt reflect regiunile de legare unde peptidul interacioneaz cu proteina. n plus, modificrile regiunii ptyr arat c potrivirea ptyr depinde de interaciunile de la nivelul regiunii opuse a proteinei. Aceast observaie a fost ulterior confirmat prin studierea legrii altor peptide i liganzi sintetici [Gunther i colab., 1996]. Acest exemplu demonstreaz faptul c poate fi util s se nceap cu liganzi peptidici derivai din parteneri de legare naturali. n cazul domeniului SH2, peptidul cu dimensiuni mici a fost derivat din antigenul T mijlociu. Deseori peptidele cu dimensiuni mici reprezint puncte de start excelente pentru producerea medicamentelor. parteneri de legare naturali. Figura 9.4 ilustreaz o schem posibil a modului n care SAR prin RMN poate fi utilizat n cazul disponibilitii unor

287

Fig 9.4 Reprezentare schematic a proiectrii ligandului utiliznd SAR prin RMN, pornind de la liganzii naturali ai unei proteine. Forma moleculei legate este alterat gradat la ambele situsuri de legtur, iar conexiunea este ndeprtat pentru a studia legarea independent la ambele situsuri. Un ligand cu afinitate nalt poate fi obinut prin delimitarea celor dou fragmente cu un linker alternativ.

9.2.1. Prepararea probelor Probele proteice pentru SAR (relaia structur-activitate) prin RMN trebuie s fie supraexprimate i marcate N15. Aceste caracteristici sunt obinute fie prin exprimarea proteinei utiliznd lizatul algal marcat N15, fie prin utilizarea mediului minimal M9 cu N15 H4Cl ca unic surs de azot. Tehnicile utilizate pentru marcarea izotopic sunt discutate n capitolul 10. N15 H4Cl este disponibil la un pre relativ sczut, ceea ce permite marcarea proteic n cantiti mari pentru SAR prin RMN. Probele utilizate pentru SAR prin RMN trebuie s aib o concentraie de 0,3 mM sau peste, pentru a obine spectre HSQC bune n 10-30 de minute. Liganzii adugai la soluia proteic trebuie s aib o concentraie mai mare (1mM pentru fiecare ligand). Acest fapt impune tehnicii o limit deoarece concentraia total a liganzilor nu trebuie s depeasc 5-10 mM. Astfel, numrul compuilor este limitat la aproximativ 10 per prob. Capacitatea maxim a acestui sistem este de aproximativ 100 de probe i 1000 de compui pe zi. Problemele pot aprea datorit solubilitii sczute a moleculelor organice (deseori sub 1 mM). Soluiile de proteine trebuie tamponate la un pH de 5-7. La valori mai mari ale pH-ului, schimbul protonilor NH cu protonii apei poate determina intensiti semnificativ sczute ale semnalului. De obicei este adugat ntre 5 i 10% D2O la soluia proteic pentru blocarea deuteriului utilizat pentru stabilizarea cmpului
288

magnetic. pH-ul soluiilor stoc de liganzi trebuie ajustat pentru a evita modificrile chimice induse de pH. De asemenea, trebuie evitat o concentraie mare de sruri n soluia de liganzi. Este recomandat prepararea soluiilor stoc n dimetilsulfoxid (DMSO) pentru a obine concentraii de aproximativ 100 mM. Aceasta permite adugarea de volume mici (3-5 ml) la soluia tamponat de proteine. Pentru compuii care nu sunt solubili n ap, DMSO poate fi adgat i la soluia proteic. Majoritatea proteinelor sunt nc active n cazul prezenei DMSO ntr-un volum de 20-30% n soluia tampon. 9.2.2. Evaluarea cantitativ 9.2.2.1 Afiniti de legare Spectrele HSQC (heteronuclear single quantum spectroscopy) obinute pentru concentraii diferite ale ligandului poart informaii semnificative referitoare la afinitatea de legare local. Nivelul transformrii chimice observat n spectrul HSQC pentru o protein titrat cu un ligand depinde de afinitatea i de rata de reacie a ligandului. n figura 9.3, se observ modificarea poziiei peak-ului (vrfului), care este tipic pentru schimbrile rapide ntre forma liber i legat a proteinei. Rata de schimb relevant este rata disocierii (koff) complexului protein-ligand. Pentru reaciile simple de legare de tipul P + L PL, constanta de disociere este kD = koff/kon. n consecin, afinitatea sczut este corelat cu rate mari. Deplasrile vrfurilor la concentraii crescnde ale ligandului sunt observate numai n cazul interaciunilor cu afinitate sczut (kD > 10-6 mM). Pentru liganzii cu afinitate crescut, n cazul crora rata de disociere a complexului este sczut, spectrele HSQC vor prezenta caracteristici de schimbri lente. n acest caz rezonanele la nivelul proteinei libere i noi rezonane apar succesiv cu transformrile chimice ale complexului proteic. Acest comportament este o consecin a ratei de disociere sczute a complexelor cu afinitate nalt. n asemenea titrri, semnalele complexului proteic trebuie adesea reatribuite, n timp ce semnalele spectrelor cu schimburi rapide pot fi atribuite prin modificri ulterioare ale transformrilor chimice datorate adugrii subsecvente de ligand n cantiti mici.
289

n limitarea schimburilor rapide, afinitatea de legare poate fi calculat din valoarea transformrilor chimice i din concentraiile corespunztoare de ligand1). Aceasta presupune ca interaciunea s fie o reacie de legare ntr-o singur etap (P + L PL). Aceast presupunere nu este ntotdeauna valabil. Raportri recente demonstreaz c mecanismul legrii ligandului la protein poate fi conectat cu formarea intermediarilor [Gunther, Schaffhausen, 2002]. Pentru mecanisme mai complexe, parametrii de legare pot fi obinui prin stimularea formelor semnalului n spectrul HSQC. O asemenea analiz detaliat este mult mai complex fa de o analiz de rutin n procedeele de screening. Cu toate acestea, o analiz detaliat a interaciunilor protein-ligand se poate dovedi benefic n procesul de mbuntire sintetic a produciei de medicamente (Dingermann i colab.,2004). 9.2.2.2. Determinarea structurii pe baza perturbrii transformrilor chimice SAR (relaia structur-activitate) prin RMN a fost utilizat pentru evaluarea calitativ a interaciunilor liganzilor. Cu toate acestea, s-a descris recent o abordare pe baza capaitii de ancorare a proteinelor (protein docking) numit HADDOCK (high ambiguity driven proteinprotein docking) care poate utiliza perturbrile transformrilor chimice pentru a determina structurile complexelor protein-protein i protein-ligand (Dingermann i colab., 2004). Aceast metod a fost validat pentru dou proteine diferite pentru care au fost disponibile structurile complexelor. Pentru un complex EIN-HPr, RMSD la interfaa ntre raza X i structura calculat prin HADDOCK a fost 2,75 ; pentru un complex E2A-HPr, RMSD la interfa a fost 2,1 . n mod cert, HADDOCK este o legtur important ntre SAR prin RMN i determinarea structurii i ofer un acces rapid la structura complexelor proteice atunci cnd sunt disponibile filtrrile HSQC.

1) KD = ([P]0 [PL])([L]0 [PL])/[PL], unde [P]0 i [L]0 sunt concentraiile proteinei libere i ligandului, iar [PL] este concentraia complexului protein-ligand. [PL] poate fi estimat din transformrile chimice, care pot fi evaluate din perturbrile chimice ([PL] =(liber obs)/total, unde liber i obs sunt transformri chimice ale proteinei i complexului la o concentraie dat a ligandului [PL], iar total este perturbarea total a transformrilor chimice.

290

9.2.3. Tehnologii avansate n SAR prin RMN Utiliznd tehnologia crioprobelor care a fost adaptat pentru aparatura RMN, concentraiile proteinelor pot fi sczute la 50 M [Hajduk i colab., 1999]. Screeningul moleculelor mici cu ajutorul crioprobelor este posibil la concentraii de 50 M n mixturi de 100 de compui, n timp ce se pstreaz concentraia total a liganzilor sub 5 mM. Aceast cretere de 10x a capacitii crete numrul de compui supui screening-ului la 10000 pe zi. Necesitatea solubilitii sczute a liganzilor (50-10 M) crete de asemenea variabilitatea compuilor adecvai pentru screening. n plus, ndeprtarea prin tiere a afinitii pentru compuii care pot fi detectai este redus la kD ~ 0,15 mM comparativ cu kD ~ 1 mM la concentraii proteice mai mari. Aceast diferen este o consecin a cantitii de protein relativ sczute n forma legat pentru concentraii proteice mici. ndeprtarea prin tiere dei este redus prezint dezavantajul nedetectrii compuilor cu afinitate sczut. Pentru HTS, rata sczut hit reduce necesitatea mixturilor vaste de deconvoluie. Lund n considerare deconvoluia, poate fi atins capacitatea de 200000 de compui pe lun. Experimentul RMN ce permite studiul proteinelor cu molecule mari i a complexelor (TROSY , transverse relation optimized spectroscopy) [Hajduk i colab., 2000] face accesibile (SAR prin RMN) proteinele de 30-50 kDa. Degenerarea transformrilor chimice devine o problem important pentru proteinele mari. Utilizarea probelor cu markeri selectivi pentru aminoacizii individuali poate reduce numrul semnalelor suprapuse. Alternativ, pentru screening-ul RMN a fost testat utilizarea proteinelor marcate C13 n locul celor marcate N15. Aceast abordare este promitoare dac sunt marcate numai gruprile metil deoarece numrul semnalelor este redus la aminoacizii care conin grupri metil. Sunt obinute linii relativ nguste datorit proprietilor de relaxare favorabile ale carbonilor din gruprile metil. n plus, intensitile semnalului gruprilor metil sunt mai mari deoarece la semnal contribuie i protonii. Fesik i colab. (2000) au dezvoltat un protocol de expresie eficient utiliznd precursorii marcai ai aminoacizilor [3,3-C]--cetoizovalerat i [3-13C]--cetobutirat.

291

n urma adugrii mediului de cretere, aceti compui sunt transformai biosintetic, specific i eficient, n izoleucin i, respectiv valin/leucin. Pentru proteinele cu o greutate molecular mai mic de 30 kDa, screening-ul bazat pe H1-C13 a fost de trei ori mai sensibil dect screening-ul bazat pe H1-N15 TROSY (fr utilizarea crioprobelor), cu spectre ale probelor cu concentraia de 50 M obinute n aproximativ 10 minute. Prin utilizarea crioprobelor, a devenit accesibil utilizarea concentraiilor de 15 M pentru proteinele mici. Pentru proteinele cu o greutate molecular peste 40 kDa, abordarea bazat pe C13 a fost mult mai sensibil dect TROSY, dar insuficient pentru screening. Screening-ul proteinelor mai mari devine practicabil cnd probele sunt perdeuterizate protonii ne-schimbabili sunt nlocuii cu H2 . Pentru proteinele marcate H2-C13 cu o greutate molecular de aproximativ 120 kDa, spectrele H1-C13 ale proteinelor cu concentraii de 0,3 mM au fost obinute n 30 de minute prin tehnologia ce utilizeaz crioprobele. Fesik (2000) raporteaz c marcarea cu C13 prin utilizarea [3,3-C]-cetoizovaleratului i [3-C13]--cetobutiratului este aproape la fel de eficient din punct de vedere al costului ca i marcarea cu N15 i mult mai puin costisitoare dect utilizarea marcrii uniforme cu C13 sau marcri metil-C13 prin utilizarea [U-C13]-cetoizovaleratului i [3-C13]--cetobutiratului. Sinteza proteinelor n afara celulelor poate deveni o alternativ interesant pentru protocoalele complexe de expresie dac aminoacizii marcai pot fi produi cu costuri mici. 9.2.4. Evaluarea datelor Interpretarea screening-ului actual prin utilizarea a mii de spectre necesit software-uri care pot vizualiza modificri ale spectrelor ntr-o manier grafic simpl. Spectrele suprapuse i inspecia manual sunt impracticabile pentru cantiti mari de date. Sunt necesare metode de analiz mai sofisticate. Cel mai comun mecanism utilizat pentru studiul variaiilor n serii de spectre este utilizarea analizei componentului principal (PCA). PCA este o metod statistic clasic utilizat pentru a reduce dimensiunea problemelor i pentru a transforma coordonatele interdependente n coordonate semnificative i independente. PCA
292

transform datele originale (intensitile i poziiile semnalului ntr-un spectru) ntrun set de scoruri pentru fiecare prob, msurate n funcie de axele componentelor principale. Scorurile componenteler principale nlocuiesc variantele originale i sunt corelate cu componentele principale succesive contoriznd descreterea variaiei i ortogonal, far nicio corelaie ntre scorurile diferitelor axe. Ca o consecin a acestor proprieti, un numr mic de componente principale pot nlocui variabilele originale fr o pierdere important de informaii. Diagramele de mprtiere (scatter plot) ale scorurilor primelor componente principale utilizate ofer un mijloc excelent de a vizualiza i uneori de a arta adunarea la un loc a probelor similare, separarea tipurilor diferite de probe sau prezena seleciei probelor cu valori diferite. Diagramele pot fi utilizate pentru a explora care dintre compui este mai implicat n separarea probelor n grupuri: cei mai importani compui tind s corespund celor mai mari valori absolute. De obicei primele patru componente principale sunt importante. Figura 9.5 prezint o diagram de mprtiere tipic obinut pentru 92 de spectre ale SAR prin RMN pentru factorul declanator al Mycoplasma genitalium [23]. Spectrele se mpart n trei clase.

Figura 9.5 Diagrama primului component principal n comparaie cu cel de-al doilea pentru spectrele 92 HSQC nregistrate pentru factorul declanator al M. genitalium. Cele patru grupuri nregistrate prin PCA sunt marcate cu verde, albastru, negru i rou. 293

A fost posibil segregarea grupurilor de liganzi n diagramele componentelor principale care prezint efecte specifice de legare i efecte legate de pH. Din pcate, PCA este sensibil la toate tipurile de modificri dintr-un spectru, incluznd artefactele liniei de baz i modificri ale intensitii semnalului. Evaluarea SAR prin RMN n stadiul de purificare a ligandului este de obicei facil. Cnd liganzii sunt titrai n soluia proteic, deplasarea gradat a semnalului i perturbrile transformrilor chimice pot fi atribuite unor modificri subtile n structura ligandului.

9.3. Monitorizarea moleculelor mici

n plus fa de metodele bazate pe spectrele RMN ale proteinelor, au fost dezvoltate numeroase tehnici bazate pe spectrele liganzilor. Multe dintre aceste tehnici depind de condiiile schimburilor rapide ntre protein i ligand. n cazul schimburilor rapide i cu un exces de ligand, rezonanele ligandului n soluie vor prezenta parial proprietile spectrale ale ligandului legat la protein. 2) O proprietate spectral care este transferat rapid este limea liniei rezonanei. Semnalul ligandului legat la protein va fi lrgit deoarece semnalele proteinelor au o lime mai mare dect aceea a moleculelor mici de ligand. Limea mare a liniei semnalului proteic este o consecin direct a timpului de autocorelare al proteinelor n soluie.3) n acelai mod, transferul unor proprieti de relaxare tipice pentru proteinele mari, a fost utilizat pentru studierea interaciunilor i pentru screening-ul legrii ligandului. Cele mai utilizate tehnici pentru observarea rezonanelor ligandului sunt bazate pe transferul magnetizrii prin efectul nuclear (nuclear Overhauser effect NOE transferul polarizrii de spin de la o populaie de spin la alta prin intermediul cross-relaxrii). Aceste tehnici nu necesit marcarea izotopic a proteinei, cantitatea de protein necesar este de obicei foarte mic i nu exist o limit superioar a mrimii proteinei.
2) Pentru schimburile rapide i populaii egale, rata schimburilor trebuie s fie k/v > /2, unde k este rata interaciunii , iar v este diferena transformrilor chimice a statusului legat i liber al ligandului. Pentru interaciunile protein-ligand, rata care determin schimburile cu rate rapide este rata interaciunii protein-ligand (P+L PL). 3) Rata relaxrii transverse R2 este mare pentru proteinele cu mas molecular mare cu timpi de corelaie crescui c. Limea liniei LW este direct proporional cu rata relaxrii (LW=R2/)

294

n schimb, trebuie utilizate soluii relativ pure deoarece orice impuritate contribuie la semnal. Din pcate, liganzii cu afinitate foarte mare au rate de disociere din complex foarte mari i sunt nregistrai ca nelegai. Experimentele competiionale pot ajuta la rezolvarea acestei probleme. Un alt factor limitator este solubilitatea ligandului deoarece multe dintre aceste metode necesit un exces de ligand. Unele dintre aceste metode sunt utile pentru HTS, unele ofer informaii mai detaliate referitoare la legarea ligandului, iar altele pot fi utilizate pentru cartografierea epitopilor de legare ai ligandului. Metodele bazate pe relaxare vor fi descrise pe scurt, n timp ce tehnicile ce implic transferul magnetizrii vor fi descrise n detaliu. 9.3.1. Metode de relaxare n spectroscopia RMN, termenul relaxare este utilizat pentru a descrie procesul care restaureaz magnetizarea de echilibru i faza aleatorie. Trebuie distinse dou mecanisme de relaxare, relaxarea transvers i longitudinal, cu ratele de relaxare R2 i R1. Relaxarea transvers poate fi asociat cu fluctuaii ale cmpului electric cu originea n dezordinea complet (overall tumbling) i n micrile din interiorul moleculei. Din moment ce moleculele mari se mic lent n soluie, timpul de corelaie a micrii de rotaie este relativ lung, cauznd rate de relaxare R2 mari i de asemenea limi mari ale liniilor semnalelor RMN (LW = R2/). Compuii care interacioneaz cu un receptor cu greutate molecular mare prezint linii lrgite i valori R2 crescute. O descriere mai detaliat a teoriei relaxrii depete obiectivul acestui capitol [ vezi Fischer i colab., 1998]. Un ligand legat la o protein adopt proprietile de relaxare ale complexului. n cazul schimburilor rapide, moleculele libere de ligand pstreaz pentru scurt timp proprietile de relaxare ale statutului de ligand legat. Trebuie s existe un exces de ligand pentru a observa semnalele ligandului. Lrgirea rezonanelor este o proprietate tipic a spectrelor moleculelor mici n prezena proteinelor mari. Acest lucru este reflectat n rate de relaxare transverse mai mari. Pentru acest motiv, limea liniei i rata de relaxare transvers pot fi utilizate drept criterii pentru screening-ul liganzilor.
295

Lrgirea este mai pronunat pentru proteine mari sau pentru proteine legate la matrix. Liganzii legai pot fi identificai prin experimente cu filtru T2. De obicei, trebuie comparate spectrele cu i fr proteine. Lrgirea semnalelor liganzilor indus de legarea la o protein a fost utilizat frecvent n trecut. Sykes i colab. (1994) au studiat interaciunea domeniului extracelular de 85-kDa al receptorului factorului de cretere epidermal (EGFR-ED) cu factorul de cretere transformant (TGF-). Linia protonilor metil a prezentat o dependen regional ce indica regiunea TGF- implicat n reacie. Acest studiu arat c aceast tehnic ofer informaii importante pentru o descriere detaliat a interaciunilor protein-ligand. Potenialul de editare a relaxrii pentru screening a fost demonstrat de Fesik i colab. (1997) prin utilizarea FKBP i un amestec de nou compui din care a fost identificat un ligand cu o constant de disociere de 200 M. Aceast metod nu este practic pentru screening-ul eficient al liganzilor deoarece trebuie utilizate diferenele ntre spectre cu i fr ligand pentru a obine rezultate relevante. T2 i T1 au fost utilizate pentru a filtra componentele spectrale ce rezult din durate de relaxare sczute . Stockmann, Dalvit, (2002) au descris o gam variat de metode de relaxare, incluznd relaxarea longitudinal, relaxarea transvers n prezena spinilor marcai i relaxarea cu cuantuum dublu. 9.3.2 Metode de difuzie Tehnicile de difuzie se bazeaz pe faptul c difuziunea translaional depinde de mrimea proteinei. Conform ecuaiei Stokes-Einstein D = kT/6r, unde k este constanta Boltzmann, T este temperatura, este vscozitatea i r este raza moleculei, coeficientul de difuzie depinde invers proporional de mrimea moleculei. Acest principiu a fost utilizat pentru a analiza amestecuri de compui n cadrul chimiei combinatorii. Shapiro i colab. (1996) au combinat tehnicile de editare cu spectrele TOCSY pentru a obine spectre 2-D cu suprapunere mic a vrfurilor i informaii valoroase asupra structurii liganzilor (DECODES, spectroscopia de difuziune codificat).
296

Coeficienii de difuzie sunt msurai prin RMN prin aplicarea pentru timp scurt a unui gradient de cmp magnetic liniar. Acest gradient aplic cmpuri magnetice diferite la diferite poziii ale probei i astfel apare defazarea spaial a semnalului care poate fi inversat prin aplicarea aceluiai gradient codificat spaial dup echo-spin. Refazarea nu este aplicabil pentru moleculele care s-au micat de la aplicarea primului gradient. n consecin, moleculele mari cu coeficieni de difuzie mici vor fi afectate ntr-un grad mai mic de filtrul de difuzie dect moleculele mici. Coeficientul de difuzie poate fi determinat prin msurarea intensitilor semnalelor n funcie de timpul de difuzie i tria gradientului. n cazul schimbrilor rapide, ligandul liber poate exprima proprieti de difuzie ale complexului. n principiu, au fost utilizate dou tipuri de experimente de difuzie, PFG-SE (pulsed field gradient spin-echo) i PFG-STE (pulsed field gradient stimulated-echo). Pierderea magnetizrii datorat relaxrii transverse este redus n ultimul caz. PFG-SE are dezavantajul c este observat numai o jumtate din semnal. O secven cu gradiente bipolare i o ntrziere a curentului turbionar sunt frecvent utilizate pentru a minimaliza artefactele turbionare. Pentru moleculele mici legate la molecule mai mari, coeficientul de difuzie este redus n comparaie cu moleculele cu mrimi similare, dar care nu se leag. Coeficienii de difuzie observai vor fi calculai n funcie de rata de schimb. Shapiro i colab. (1997) au utilizat expresia afinitate RMN pentru aceast abordare deoarece amintete de separarea cromatografic pe baza afinitii. Shapiro a utilizat afinitatea RMN pentru quinin cu un amestec de nou compui din care a putut fi selectat unul prin analiza spectrelor 1-D i experimente 2-D DECODES. De asemenea, Shapiro (1998) a aplicat afinitatea RMN pentru a studia legarea tetrapeptidelor la glicopeptidul vancomicina i pentru a studia legarea moleculelor mici la ADN. n aceste cazuri raportate ligandul i proteina au fost prezente n cantiti echimolare la concentraii de 0,5-1 mM. S- a demonstrat c difuzia RMN poate fi utilizat pentru cartografierea epitopului de legare; aceasta se bazeaz pe faptul c magnetizarea longitudinal n experimentele STE este supus relaxrii ncruciate ntre protein i ligand.
297

Prin NOE, magnetizarea e transferat ntre protoni i complex. Acest efect induce modificri ale intensitii semnalului atunci cnd se aplic intensiti sczute i nalte ale gradientului pentru un timp de difuzie ndelungat, deoarece intensitile semnalului scad cu rate diferite n timpul perioadei de difuzie. Analizele cantitative au fost realizate prin diagramele intensitii semnalului pentru gradientul ptrat g2 . Hajduk a propus utilizarea diferenelor ntre variate spectre pentru a preveni problemele care provin din lrgirea semnalului ligandului i din semnalele de fundal ale proteinei. n prima etap, spectrele STE ale amestecului de compui n prezena proteinei la gradient nalt i sczut s-au diminuat. Rezultatul a fost sczut din nou din spectrul STE al amestecului de compui n absena proteinei, nregistrat la gradient sczut. Rezultatul este un spectru care prezint numai semnalele moleculelor mici care se leag la protein. Aceast abordare dificil, care necesit trei spectre diferite a fost adecvat pentru identificarea unui inhibitor cu concentraia 20 M al stromelisinei dintr-un amestec de nou compui. Aceast abordare este limitat de asemenea deoarece liganzii legai pot avea transformri chimice diferite la schimburi rapide atunci cnd se utilizeaz cantiti egale de protein i ligand. Difuzia RMN poate fi utilizat pentru determinarea direct a afinitii liganzilor fr a fi necesar titrarea cu liganzi. Pentru ligandul legat i cel liber pentru schimburi rapide, coeficientul de difuzie observat este o medie n funcie de timp a speciilor legate i libere. Fracia ligandului legat poate fi obinut din constantele de difuzie ale proteinei Dlegat, ale ligandului liber Dliber i a ligandului n amestec prin ecuaia Dobs = xliberDliber + xlegatDlegat, presupunnd constante egale ale complexului i ale proteinei libere. Experimentele de difuzie sunt importante n screening-ul medicamentelor i, ntr-un grad limitat, pentru cartografierea epitopilor. Principalul dezavantaj este sensibilitatea relativ sczut a experimentului care necesit cantiti echimolare ale proteinei i ligandului la concentraii de aproximativ 50 M. Chiar i cantiti mai mari de substane sunt necesare pentru compuii cu afinitate sczut deoarece efectul de difuzie devine foarte mic.

298

9.3.3 Metode care implic transferul magnetizrii 9.3.3.1 NOE transferat (TrNOE) Efectul TrNOE a fost iniial descris de ctre Bothner-By (1972). Peters (1997) a propus utilizarea TrNOE pentru screening-ul compuilor n amestec. TrNOE combin NOE ntre spini adiaceni ai ligandului cu schimburi chimice ntre ligandul liber i legat.4) Moleculele mici induc NOE pozitive; moleculele mari induc NOE mari cu o magnitudine mai mare. Cnd un ligand i schimb rapid starea ntre stare legat i nelegat, el poate transfera NOE de la complexul proteic la populaia de molecule libere. n spectrul NOESY, semnalele negative apar de la liganzii care se leag la protein, n timp ce semnalele de la compuii slab legai sunt pozitive sau dispar. Este bine neleas dependena cantitativ a efectului TrNOE de timpul de amestec, cantitatea ligandului legat, i timpii corelaiei libere i legate a proteinei i ligandului. TrNOE sunt obinute din spectre NOESY obinuite. Semnalele proteinelor nu sunt de obicei observate pentru proteinele mari. Semnalele de fundal ale proteinei pot fi supresate prin filtre T2 sau T1. Peters i colab. (1999) au utilizat msurtorile TrNOE pentru screening-ul oligozaharidelor pentru E-selectina deglicozilat/imunoglobulina uman G. Iniial spectrele NOESY ale amestecului de liganzi au fost nregistrate la temperaturi diferite pn cnd toate semnalele NOE au fost pozitive. Amestecul de compui a prezentat NOE negative n prezena proteinei. Opt compui au putut fi exclui pe baza absenei semnalelor TrNOE-NOE n regiuni caracteristice ale spectrului. Din cei doi compui rmai, a fost identificat un un sialil Lewisx mimetic, a crui conformaie bioactiv a fost determinat din TrNOESY. Identificarea epitopilor de legare a fost mpiedicat de spinul puternic al difuziei care distribuie magnetizarea asupra tuturor protonilor compusului. Peters i colab. (2000) au utilizat experimentul 3-D TOCSY-TrNOESY ntr-o mixtur de 15 carbohidrai. Dei aceast abordare mai laborioas este util pentru a separa amestecurile de compui, nu este adecvat screening-ului.
4) Efectul NOE este bazat pe corss-relaxarea longitudinal dipol-dipol a spinilor adiaceni. De obicei semnalele sunt observate pentru protonii aflai la o distan mai mic de 6.

299

Metoda TrNOE este larg aplicabil pentru proteinele mari cu constante de disociere ntre 10-7 i 10-3. Dezavantajele acestei metode sunt legate de necesitatea unor concentraii relativ mari de ligand, ceea ce presupune compui foarte solubili, timpi de nregistrare prelungii i valori mari ale difuziei spin, care nu permit cartografierea epitopilor. 9.3.3.2. Transferul saturaiei (STD) STD-RMN ( experimente care detecteaz magnetizarea transferat de la o protein la ligandul legat) asigur o mbuntire a TrNOE nlturnd multe din deficienele acesteia. Dei efectul STD este cunoscut de mult timp, abia recent a fost utilizat pentru screening-ul liganzilor. Principiul STD-RMN este ilustrat n figura 9.6. Inial rezonana protonic a proteinei este saturat. Pentru molecule mari, efectul de saturaie se distribuie repede la ntreaga protein prin tranziia de flip-flop a energiei ntre protoni adiaceni.5) Transferul magnetizrii la ligadul legat cauzeaz saturaii diferite ale reziduurilor de liganzi. Este important ca gradul de saturaie s afecteze numai rezonana proteinei, nu i rezonana ligandului. Aceasta garanteaz c transferul saturaiei provine de la protein, nu de la rezonanele din ligand. Tipic, rezonanele metil cu transformri chimice sub 0 ppm sunt saturate. ntr-un experiment de referin, gradul de saturaie este aplicat la o frecven la care nu rezoneaz niciun proton al proteinelor sau liganzilor (tipic, 30 ppm). Acest spectru de referin nu prezint niciun efect al saturaiei. Pentru a minimaliza scderea artefactelor, diferena dintre cele dou spectre este obinut prin msurarea alternrilor rezonanei on- off- care sunt adugate utiliznd un ciclu de faz. Programul utilizat pentru aceste dou experimente este reprezentat schematic n figura 9.7 Semnalele de fundal ale proteinelor pot fi ndeprtate prin aplicarea unui spin-lock pulse care acioneaz ca un filtru T1.
5) Rata tranziiilor flip-flop responsabile pentru distribuia efectului de saturaie la nivelul proteinei este direct proporioal cu timpul de corelaie c al proteinei. Din acest motiv, saturaia se distribuie mai rapid n moleculele mari. Tipic, sunt aplicai timpi de saturaie de 2 s.

300

Meyer i colab. (1999) au determinat gradul saturaiei n funcie de excesul de ligand prin legarea N-acetilglucozaminei la aglutinina germenilor de gru. Efectul de saturaie crete cu rata concentraiei proteinei i ligandului. Creterea a fost observat peste rata de 210:1. Un efect STD suficient de puternic a fost observat la o rat de 60:1. Rate rapide de disociere favorizeaz efecte STD mari. Necesitatea unui exces de ligand permite msurrile STD la o concentraie sczut a proteinei. Utiliznd un exces de 1igand de 100 de ori, i o soluie de ligand 1 M, concentraia proteinei poate fi de 10 nM. Principiul STD poate fi combinat cu experimente 2-D homonucleare i hetereonucleare. STD-TOCSY a fost prezentat de Meyer i colab. (2001) prin utilizarea unui amestec de apte oligozaharide i aglutinina germenelui de gru. La oligozaharidele cu ase subuniti glucidice, grupuri diferite au artat efecte STD semnificativ diferite. Acei protoni ai glucidelor care sunt n contact direct cu proteina au un grad mai mare de saturaie. Vogtherr (2000) a utilizat corelaia STDheteronuclear multi-cuantum (STD-heteronuclear multi-quantum correlation HMQC) pentru a obine o banc de oligozaharide. Potenialul STD-RMN pentru cartografierea epitopilor a fost recent demonstrat pentru legarea metil -Dgalactozidului la o lectin de 120-kDa, aglutinina. Diferene mari ale intensitii au fost observate pentru diferii protoni ai metil -D-galactozidului, indicnd contribuia lor diferit la interaciunea cu proteina. n aceeai lucrare, au fost realizate studii de competiie, ceea ce a fcut STD-RMN accesibil la liganzi cu constante de disociere nanomolare i rate de disociere sczute. STD-RMN a fost de asemenea utilizat n asociere cu HR-MAS (un tip de RMN caracterizat prin prezena interaciunilor anizotropice). Un exemplu de spectru este prezentat n figura 9.8, unde un compus fenolic a fost legat la o dehidogenaz. Spectrul din figura 9.8 (A) reprezint spectrul STD nregistrat la saturaia de -0,45 p.p.m (sgeata). Figura 9.8 (B) prezint un spectru de referin al aceluiai compus. Spectrele sunt reduse la o scal la intensiti egale ale semnalelor aromatice la aproximativ 7 ppm. Semnalele alifatice la 3,8, 2,2 i 2 ppm au o intensitate relativ redus. Rezultatul este n conformitate cu supoziia c
301

gruparea fenil este fora motric pentru interaciunea cu proteina. Figura 9.8 (C) este controlul negativ, care nu prezint nicio protein n amestec. Spectrul a fost nregistrat la aceeai parametrii ca i spectrul STD din figura 9.8 (A). Dezavantajul STD-RMN este timpul de nregistrare dublat i faptul c liganzii care se leag strns sunt nregistrai ca nelegai, determinnd rezultate fals negative ale screening-ului. Necesitatea unui exces de ligand limiteaz STD-RMN la compuii solubili (peste 10 mM). Pentru a evita eliminarea artefactelor, spectrometrul i probele iniiale trebuie calibrate cu grij prin noile metode.

Fig. 9.6 Ilustrare schematic a experimentului STD-RMN. Rezonanele proteinelor sunt saturate selectiv fr a afecta rezonanele ligandului. Saturaia cresctoare este reprezentat prin tonuri mai nchise de gri. Compuii care interacioneaz cu proteina (triunghiuri) vor prezenta efectul saturaiei. Moleculele mici care sunt eliberate n rate de schimburi rapide ntre complex i ligandul liber pot fi detectate ulterior. Moleculele care se leag la protein au intensiti ale semnalului mai reduse, ca o consecin a transferului saturaiei. Moleculele care nu se leag (ovale) nu prezint niciun efect. 302

Fig. 9.7 Reprezentare schematic a secvenei pulsului utilizat pentru STD-RMN. Sunt evideniate dou spectre, unul cu i cellalat fr saturaia rezonanelor proteice.

Fig. 9.8 (A) Spectrul STD-RMN al unui compus fenolic legat la dehidrogenaza de 72kDa. (B) Spectrul de referin al aceluiai compus. (C) Spectrul STD-RMN de control fr nicio protein prezent n soluie. 303

9.3.3.3. Pomparea NOE (NOE pumping) Pomparea NOE este n strns legtur cu STD-RMN. n STD-RMN, saturaia este transferat la ligand; n pomparea NOE, magnetizarea e transferat de la protein la ligand. Magnetizarea poate fi de asemenea transferat de la ligand la protein ntrun experiment numit pomparea invers a NOE (RNP). Pentru pomparea NOE, semnalele proteinelor sunt selectate printr-un filtru de difuziune care anuleaz semnalele ligandului. Magnetizarea este transferat n timpul amestecului prin crossrelaxarea intermolecular. Sunt detectate moleculele de ligand cu schimburi rapide care au fost supuse transferului magnetizrii de la protein. Toate celelalte molecule nu au semnal. Aceasta a fost evideniat utiliznd albumina seric uman i un amestec de trei compui acidul salicilic, acidul
L-ascorbic

i glucoza. n spectrul

pomprii NOE au fost observate numai semnalele acidului salicilic [Chen, Shapiro, 1998]. Acest ligand nu a fost detectat ntr-un experiment pur de difuzie fr transferul NOE. Spectrul ligandului dintr-un experiment revers-NOE este selectat prin intermediul filtrului de relaxare transvers care elimin semnalele proteinei i inverseaz semnalele ligandului. Acest filtru exploateaz timpul de relaxare mult mai rapid al proteinei - T2, comparativ cu timpul mult mai lent al ligandului. Pe parcursul timpului de amestec, magnetizarea ligandului este parial transferat la protein via cross-relaxarea intermolecular. Este retras/sczut un experiment de referin n care nu se realizeaz niciun transfer al magnetizrii. n spectrul diferenial sunt observate numai acele semnale ale compuilor care interacioneaz cu proteina. Acest experiment a fost utilizat pentru albumina seric uman i glucoza i un amestec de acizi grai neramificai ca presupui liganzi. n spectrul diferenial au fost observai numai acizii grai. Ratele intensitii ntre diferii liganzi au fost utilizate pentru a ordona afinitile diferiilor compui [Chen, Shapiro, 2000]. Din cele dou experimente, revers pomparea NOE este cel mai sensibil. Pomparea NOE i RNP sunt considerate experimente foarte sensibile pentru screening-ul RMN primar. Cartografierea epitopilor este limitat de difuzia spin.

304

9.3.3.4. WaterLOGSY i ePHOGSY WaterLOGSY utilizeaz molecule de ap legate la interfaa protein-ligand pentru a transfera magnetizarea de la protein la ligand. Apa de la interfa poate fi implicat n realizarea legturilor ntre protein i ligand. Este de asemenea posibil ca hidratarea hidrofob la suprafaa proteinei n vecintatea ligandului, s aib rol de transmitor. Timpul de reziden a moleculelor de ap n cavitile proteinei variaz de la cteva nanosecunde pn la cteva sute de microsecunde [Denisov, Halle, 2002]. Acest timp este suficient de lung pentru a se realiza NOE i suficient de scurt pentru a menine rezonanele apei la schimburi rapide atunci cnd este observat un singur semnal pentru rezonanele apei libere i legate. Principiul waterLOGSY este ilustrat n figura 9.9. NOE transfer magnetizarea de la ap la protein. Semnul acestei magnetizri este neschimbat de la magnetizarea iniial.

Fig 9.9 Ilustrare schematic a experimentului ePHOGSY. Magnetizarea este transferat de la ap la protonii proteinei prin NOE sau prin schimbul protonilor labili indicai prin sgei. Ligandul din soluie prezint un transfer al magnetizrii de la ap. Semnul semnalului difer pentru moleculele care se leag la protein (+) i acelea care transfer magnetizarea fr a se lega la protein (-). 305

Alt mecanism pentru transferul magnetizrii de la ap la protein este schimbul chimic al protonilor apei cu protonii labili ai proteinei. Acest proces conserv semnul magnetizrii; aceste dou procese sunt asociate la transferul magnetizrii de la ap la protein. n etapa a doua, are loc NOE dintre apa legat i protonii ligandului. NOE este negativ pentru protonii care cad lent din complexul protein-ligand, i pozitiv i cu magnitudine sczut pentru moleculele mici precum ligandul liber din soluie. Din moment ce n experiment este utilizat un exces de ligand, ntotdeauna semnalul observat este cel al ligandului. n funcie de constanta de disociere a complexului, va domina fie contribuia NOE negativ tipic pentru protein sau NOE pozitiv al moleculelor mici. Aceasta permite o distincie rapid ntre moleculele care se leag la protein i acelea care nu se leag deoarece NOE al celor dou va avea semnale diferite n spectru. Cel mai eficient experiment utilizat pentru evaluarea efectului waterLOGSY este denumit ePHOGSY [Dalvit, 1998]. Acest experiment ncepe cu inversia selectiv a rezonanelor protonilor apei i defazarea celorlalte rezonane. NOE al protonilor proteinei i ligandului se formeaz din protonii selectai ai apei. Experimentele de titrare a ligandului au fost realizate pentru a deriva constantele de legare [Dalvit i colab., 2001] prin experimente ePHOGSY. Potenialul waterLOGSY a fost demonstrat pentru albumina seric uman n prezena triptofanului i pentru kinaza 2 ciclin-dependent (cdk2) care leag doi liganzi de natur necunoscut [Dalvit i colab., 2001]. Un experiment ePHOGSY pentru dehidrogenaza legat la la 4-n-butil fenol este reprezentat n figura 9.10. Amestecul conine de asemenea imidazol i DMSOs nicio interaciune cu proteina i, n consecin, niciun semnal negativ nu a fost observat. Experimentele ePHOGSY au potenial pentru screening-ul RMN. Experimentul este foarte sensibil, lipsit de de artefacte, i necesit concentraii mici de protein i ligand. Semnalele liganzilor nelegai sunt de semn opus fa de semnalele liganzilor care se leag cu afinitate crescut. Constanta de disociere a complexelor poate fi de 0,1 M. Din pcate, aceast metod nu poate fi utilizat pentru cartografierea epitopilor deoarece intensitatea semnalelor este o funcie
306

complex a timpului de reziden a apei i a distanei dintre protonii ligandului i ai moleculei de ap. Cu toate acestea, este o metod foarte sensibil pentru screening-ul ligandului.

Fig. 9.10 Un experiment ePHOGSY pentru dehidrogenaza legat la 4-n-butil-fenol

9.3.4. Prepararea probelor n comparaie cu probele de proteine utilizate pentru SAR prin RMN clasic, probele utilizate n tehnicile de detecie a ligandului trebuie s aib caracteristici speciale. Evident, nu este necesar marcarea izotopic i nici supraexpresia proteinei. Chiar i purificarea proteinei este necesar doar dac substanele analizate se leag de oricare alt protein din soluie. Orice alte restricii sunt mai dificile, lund n considerare pH-ul soluiei deoarece nu sunt examinai protoni labili. Cu toate acestea, poate interfera cu prezena moleculelor mici, altele dect liganzii de interes. Un exemplu tipic, glicerolul, deseori utilizat n concentraii mari pentru a stabiliza proteinele, determin rezonane de mare intensitate care pot acoperi alte semnale care se afl dedesubt.
307

Necesitatea de a evita semnalele altor compui impune o restricie stringent n alegerea soluiilor tampon fr protoni nelabili. Pot fi utilizate soluiile tampon cu protoni labili cu schimburi rapide cu apa, precum fosfatul i hidrogenul carbonat. Moleculele mici sunt deseori dizolvate n DMSO i adugate n cantiti mici din soluiile stoc de DMSO (civa microlitri). n particular, pentru compuii relativ insolubili, creterea solubilitii poate fi obinut atunci cnd solventul conine DMSO. Majoritatea proteinelor i pstreaz funcia n soluiile apoase cu concentraii ale DMSO de 20-30%. Pentru acest scop trebuie utilizat DMSO deuterizat. n acelai mod, pot fi adugai ali solveni deuterizai. n cazul d6 DMSO, este observat un semnal DMSO rezidual ascuit, mic, la 2,2 ppm care este deseori o referin pentru substanele nelegate. Tetrametilsilanul (TMS) sau acidul 2,2-dimetil-2-silapentan-5-sulfonic (DDS) pot fi adugate ca standarde pentru transformrile chimice.

9.4. Concluzii
n ultimii ani, metodele RMN au ptruns n domeniul sistemelor de analiz de mare capacitate (HTS) al compuilor ca liganzi ai proteinelor. Aceast dezvoltare este uimitoare, lund n considerare sensibilitatea relativ sczut a experimentelor RMN de baz, comparativ cu metodele ce prezint o sensibilitate ridicat precum spectroscopia cu fluorescen. Dezvoltarea recent a hardware-ului a jucat n mod sigur un rol important n dezvoltarea metodelor de screening RMN. Viteza dezvoltrii RMN este nc rapid, cu cmpuri magnetice care cresc continuu i noi tehnologii care mresc sensibilitatea i stabilitatea spectrometrelor RMN curente. Tehnologia crioprobelor a sporit sensibilitatea i a transformat experimentele RMN n experimente care utilizeaz concentraii foarte mici ale probelor. Experimentul SAR prin RMN tipic este acum accesibil pentru concentraii ale proteinelor de 50 M. Cu toate acestea, experimentele care nregistreaz spectrele proteinelor sunt limitate n mod curent la proteine relativ mici, cu greuti moleculare de pn la 40 kDa. Proteinele cu greuti moleculare de 100 kDa vor putea fi cunoscute prin metode de marcare mai sofisticate. Actual, sunt disponibile
308

numeroase tehnici, fr nicio limitare a mrimii proteinei. Cerina referitoare la constanta de disociere a complexului protein-ligand este oarecum limitatoare pentru aceste tehnici. Metodele bazate pe ligand au un potenial considerabil pentru screening-ul liganzilor (ePHOGSY, NOE pumping), cartografierea epitopilor (transferred NOE, STD-RMN) i au fost utilizate chiar i pentru a determina conformaia liganzilor legai. Valoarea real a RMN-ului n identificarea medicamentelor o constituie cantitatea mare de informaii care pot fi obinute numai din cteva msurtori. n acest sens, RMN ofer un sprijin important pentru sistemele de analiz de mare capacitate (HTS tradiional) i pentru noile metode de evaluare.

309

CAPITOLUL 10 MARCAREA PROTEINELOR CU IZOTOPII C13 I N15 PENTRU ANALIZA STRUCTURII I DINAMICII MACROMOLECULELOR BIOLOGICE 10.1. Introducere
Spectroscopia de rezonan magnetic nuclear (RMN) a cunoscut o dezvoltare rapid de-a lungul ultimului deceniu avnd o larg aplicabilitate i un imens potenial pentru studiul structurii i dinamicii macromoleculelor biologice. Ne referim mai ales la analiza structurii proteice care este principala beneficiar a progreselor tehnicilor RMN. Noile mbuntiri ale componentelor hardware i implicit ale spectrometriei RMN cu puteri ale cmpului magnetic de pn la 900 MHz au crescut sensibilitatea testrilor i au redus considerabil numrul de probe necesare analizei. Mai mult, dezvoltarea tehnicii marcrii izotopice i apariia tehnicilor de analiz multidimensionale constituie adevrate pietre de hotar pentru studiul proteinelor. Structura microproteinelor n limitele a 10 kDa a putut fi analizat fr utilizarea tehnicilor de marcare izotopic dup apariia tehnicii homonucleare bidimensionale (2-D) la sfritul anilor 1970 i nceputul anilor 1980. Cu toate acestea ns, dincolo de aceast limit de 10 kDa, complexitatea crescut datorat variabilitii structurale i fenomenelor translaionale caracteristice, mpiedic analiza structural detaliat a macroproteinelor prin intermediul acestor tehnici. Prin urmare studiul structurii macroproteinelor necesit marcri multinucleare i strategii speciale de investigare necesare pentru nlocuirea izotopilor N14 i C12 din proteine, predominant inactivi RMN cu izotopii activi RMN C13 i N15. Protocoalele au fost dezvoltate astfel nct s se lucreze fie cu proteine uniform marcate cu C13/N15 ori marcarea s fie utilizat doar pentru un situs specific.

310

Mai mult, experimentele utiliznd RMN-ul multidimensional heteronuclear au fost concepute s utilizeze numrul relativ mare de cuplaje scalare mono sau policomponente evideniate prin marcare. Folosind combinaiile chimice C13 i/sau N15 induse, rezonana H1 de translaie poate fi azi uor separat n trei sau patru dimensiuni. Combinarea acestor tehnici intereseaz n special limitrile impuse asupra studiului macroproteinelor i permite determinri structurale proteice pn la greuti moleculare de aproximativ 22kDa. Aceast limit se poate extinde pn la 44kDa prin simpla incorporare a H2 la nivelul situsurilor proteice nonschimbabile. n acest capitol vor fi detaliate recent descoperitele tehnici de ncorporare a izotopilor N15 i C13 n proteine, care au drept rezultat generarea unor analize spectrale extrem de sensibile i implicit facilitarea analizei structurale a sistemelor proteice cu greutate molecular mare. Strategiile de marcare convenionale necesitau supraproducii de proteine la nivelul structurilor bacteriene sau eucariote i dintre acestea vom aminti cele mai avansate structuri ca o condiie indispensabil a ncorporrii eficiente a izotopilor n proteine. Pe lng studiile de structur, tehnica RMN joac un rol important i n descrierea dinamicii proteinelor precum i n stabilirea relaiei de cauzalitate dintre dinamic i funcie. Prin urmare, vom prezenta tehnicile de marcare izotopic selectiv care ne permit evaluarea dinamicii lanurilor laterale proteice precum i a interaciunii dintre protein i ligandul specific. Cea de a doua parte a capitolului aduce n prim plan noile tehnici in vitro, care utilizeaz extracte acelulare pentru generarea de mostre de proteine. n timp ce sinteza de proteine de ctre sisteme acelulare, la o scar analitic, este posibil deja de civa ani, producerea programat de proteine utiliznd fraciuni de Escherichia coli sau alte surse a devenit una dintre cele mai puternice mijloace de generare a probelor marcate pretabile la analiz RMN. Prin urmare, ne vom referi la cele mai noi descoperiri n ceea ce privete sistemele de sintez acelulare i strategiile de marcare.

311

10.2. Sisteme de expresie ale ncorporrii in vivo a izotopilor C13 i N15 n proteine
Dincolo de barierele tehnice, calitatea i stabilitatea mostrelor de proteine limiteaz adesea analiza lor cu ajutorul tehnicilor RMN. Sensibilitatea relativ sczut a majoritii spectrometrelor RMN necesit pentru analiz concentraii proteice ncepnd de la 0,2nM, ns n multe cazuri agregarea proteic se realizez cu mult nainte de atingerea acestei limite. Pe lng aceasta, probele trebuie s rmn stabile mai multe zile, pentru intervalul de timp necesar finalizrii unui set ntreg de msurtori. Mai mult, pentru a obine rezoluie maxim, analiza RMN necesit de regul temperaturi relativ nalte, ntre 15-25C, care pot de asemenea s afecteze stabilitatea proteinelor. Datorit costurilor mari pe care le implic prepararea unor probe de proteine marcate multinuclear, o prob va fi utilizat de mai multe ori, n experimente succesive, iar agregarea, denaturarea sau chiar degradarea proteinelor datorat denaturrii cantitii de proteaze sau activitii auto-proteolitice, trebuie redus la minim. Prin urmare producia de probe trebuie s fie destul de crescut, ceea ce pentru sistemele de expresie proteice convenionale in vivo reprezint atingerea unei cantiti minime de cteva miligrame per litru de mediu de cultur. Pentru a obine o rat de producie proteic optim alegerea sistemului de expresie adecvat este de importan extrem. Cel mai folosit microorganism n scopul producerii de proteine recombinate marcate specific este nc enterobacteria E.coli. O varietate extraordinar de sisteme de expresie i vectori au fost creai pentru obiectivarea producerii de proteine de ctre E.coli, iar acest vast selecie este unul din motivele principale de alegere a sistemului de expresie proteic propriu lui E.coli. Majoritatea sistemele eucariote de producere a proteinelor au la baz speciile extrem de productive de Pichia pastoris. Marcarea proteinelor la nivelul celulelor de mamifere este doar rar realizat datorit costurilor mari pe care le implic att tehnica ct i obinerea unor precursori specifici dar i randamentului sczut. Iniial probele de proteine au fost obinute prin cultura celulelor pe medii de cultur specifice, minime la care s-au adugat compui marcai specific. Cei mai des folosii precursori ai marcrii includ N15H4Cl, (N15H4)2SO4, K15NO3 i Na15NO3
312

pentru marcarea cu azot i NaH13CO3, [C13]glicerol, [C13]glucoz, [C13]acetat pentru marcarea cu carbon. Numeroase elemente suplimentare cum sunt mixturi de elemente trasoare i cocktailuri de vitamine au fost testate ca elemente de potenare a creterii celulare pe medii de cultur minime sau pentru a mbunti productivitatea. Mai mult mixturi simplu sau dublu marcate de aminoacizi, complexe algale (nutritive) i ageni de hidroliz microbian au fost de asemenea adugai mediilor de cultur [Brandner i colab., 1999] cu scopul obinerii unor proteine uniform marcate. n scopul reducerii costurilor izotopilor, celulele pot fi cultivate pe medii de cultur bogate, nemarcate pn la obinerea unor densiti celulare mari, recoltate i apoi suspendate n medii de cultur cu volum redus, predefinite i marcate specific pentru producerea de proteine. Niveluri nalte de ncorporare a izotopilor, concomitent cu o cretere a recoltei cu 4 pn 8 straturi celulare a fost obinut pentru E.coli utiliznd aceast tehnic [Marley i colab., 2001]. 10.2.1. Producia de proteine i marcarea cu izotopi C13 i N15 la nivelul sistemelor de expresie proteic din E.coli Tehnicile de mbogire izotopic ale fraciunilor de E.coli sunt realizate deja de civa ani i marea majoritate a proteinelor marcate, analizate prin spectroscopie RMN sunt nc produse prin expresie heterolog la nivelul diferitelor gazde ale lui E.coli, nsumnd pn la 50% din totalul proteinelor celulare. n ciuda mbuntirilor considerabile ale sistemelor de expresie eucariote i acelulare, sistemele bacteriene rmn cele mai rapide i economice sisteme de producere a proteinelor. Metodele standard de generare a mostrelor de proteine marcate heteronuclear din fraciuni E.coli folosesc mediu minimal M9 sau derivai modificai ai acestuia, cu supliment de [C13]glucoz, i [C13]glicerol pentru marcarea cu carbon, i (N15H4)2SO4 i N15H4Cl pentru marcarea cu azot. Avantajul major al utilizrii sistemului de expresie proteic al lui E.coli este reprezentat de selecia crescut de vectori i numrul mare de subtipuri disponibile. n ceea ce privete supraproducia de proteine, este adesea necesar ca transcripia genelor int s poat fi reprimat pe ct de mult posibil pn cnd celulele ating cea mai potrivit faz a creterii, optim inducerii. "Scurgeri" ale
313

procesului de reprimare genic, anterioare inducerii, pot favoriza acumularea de mutaii la nivelul genei int, cu scopul de a suprima producerea de proteine nedorite, sau pot chiar produce lezarea sau apoptoza celular secundar efectelor toxice. Cei mai cunoscui ageni inductori care acioneaz la nivelul sistemului de expresie al lui E.coli sunt enumerai n tabelul 10.1.
Tabelul 10.1. Promotori utilizai frecvent n inducerea supraproduciei de proteine la E.coli. Promotor Plac Para Ptet 1- 10

Origine E.coli. E.coli E.coli., Tn10 Bacteriofagi T7 sau T7 ARN polimeraza Bacteriofag

Reprimare Lacl AraR TetR reprimare/inactivare Represor cl

PL

Inducere izopropiltiogalactozid (IPTG) L-arabinoza Tetraciclina Necesit intervenia T7 ARN polimeraza, IPTG Indus de cldur, modificri de temperatur de 42C

Reprimarea puternicului promotor E.coli.- lac este realizat de ctre interaciunea dintre agentul specific represor Lacl cu secvene operatorii specifice dinPlac, mpiedicnd prin urmare legarea ARN polimerazei E.coli. Proteina Lacl este eliberat de ctre operatorul su prin intervenia izopropiltiogalactozidei (IPTG), un analog nonmetabolizabil al inductorului natural. Un dezavantaj al promotorului lac l reprezint expresia sa de fundal relativ ridicat. Acest eveniment poate fi parial suprimat fie prin creterea numrului de copii Lacl exprimate pe mediul de producie, fie prin introducerea de copii adiionale ale genei lacI pe o plasmid sau prin creterea expresiei cromozomiale a genei lacI printr-o mutaie capabil de inducerea transcripiei promotorului nativ numit laclq. Numeroi derivai cum sunt promotorii tac sau trc, au fost realizai prin fuziunea Plac cu ali promotori, spre exemplu promotorii triptofanului. n sistemele de expresie bazate pe promotorii T7, cu nalt specificitate, producia de proteine este indus de rezervele de T7 ARN polimeraz. n principal T7 ARN polimeraza poate fi asigurat prin cteva modaliti. O metod folosit frecvent este exprimarea sa la nivelul unor regiuni special create purttoare de copii cromozomiale ale genei 1 T7, care codific T7 ARN polimeraza.
314

Aceast construcie, denumit DE3, reprezint o fuziune transcripional a genei 1 cu promotorul lac IPTG-indus. Pentru a asigura reprimarea strns a expresiei genice, gena 1 este acompaniat de o extra copie a genei laclq. Pentru a elimina orice cantitate adiional de T7 ARN polimeraz, rezultat din reprimri ineficiente, poate fi indus expresia genei rezultat din plasmid care codific T7 lizozimul. T7 lizozimul se leag eficient i inactiveaz T7 ARN polimeraza, iar exprimarea acestui sistem chiar permite producia i marcarea proteinelor toxice ale E.coli. n timp ce analiza structural a proteinelor native reprezint obiectivul major al tehnicilor care utilizeaz marcarea, majoritatea probelor au fost iniial produse ca fuziuni translaionale la alte proteine sau la peptide artificiale int (tabelul 10.2).
Tabelul 10.2 inte i proteine transportoare proteine n sisteme de fuziune Fuziune Efect asupra solubilitii* Poly(His)6-marker fr efect pentru supraproducia de Purificare cromatografie cu afinitate pentru ioni de metal imobili (IMAC) cromatografie de afinitate cromatografie de afinitate

Strep-tag (metoda interaci- fr efect unii streptavidin-biotin ) Proteina de legare a ++ maltozei Proteina NusA ++ Glutation S transferaza Tioredoxina + +

cromatografia de afinitate

Proteina G (domeniul B1) + Proteina D cu capat + Proteina A (domeniu Z) + *Efect asupra solubilitii proteinelor int

cromatografie de afinitate

Aceste strategii pot oferi avantaje deosebite n ceea ce privete purificarea rapid i eficient a proteinelor int i stabilizarea acestora. Mai mult, crete adiia unui partener de fuziune veritabil la captul N-terminal al proteinei int ceea ce poate stimula semnificativ producia acesteia. Complexele proteice de fuziune includ de obicei un situs de recunoatere pentru proteazele cu nalt specificitate asemenea enterokinazei sau proteazei TEV, n regiunea de unire a celor dou proteine. Dac este necesar, partenerii de fuziune pot fi dezlipii de pe proteinele int dup purificare, lsnd nemodificate proteinele marcate n vederea analizei. Cel mai
315

frecvent marker peptidic utilizat n scopul unei purificri facile este markerul poly(His)6 adugat la captul N- sau C-terminal al proteinei. Asemenea micromarkeri de obicei nu influeneaz structura sau activitatea proteic i ndeprtarea lor postpurificare, poate chiar s nu fie necesar. Proteinele ce conin markerul poly(His)6 pot fi purificate cu uurin dintr-un extract celular brut, prin formarea unui complex chelator cu ionii metalici ca Ni2+ sau Cu2+ imobilizai pe o coloan cromatografic. Prilor imidazolice ale restului adiacent de histidin sunt eseniale pentru formarea ansamblului chelator iar proteinele de legare pot fi ulterior splate din coloan cu un gradient competitiv de imidazol. Obinerea de proteine, utiliznd markerul poly(His)6 a devenit o tehnic de rutin pentru evidenierea expresiei genelor heterologe recombinate, indiferent de gazd. Doar aproximativ 25% din supraproducia de proteine este iniial pretabil sau suficient de stabil pentru a fi supus analizei structurale [Christendat i colab., 2000] i majoritatea experimentelor trebuiesc adaptate i optimizate cu scopul obinerii unor recolte de proteine corect conformate. Ca parametrii generali ai optimizrii sunt frecvent utilizate selecia unor gazde i vectori de expresie viabili, variabilitatea condiiilor de cretere i stabilirea concentraiilor de inducere, construcia de proteine de fuziune i coexprimarea proteinelor helper. O problem frecvent ntlnit n ceea ce privete expresia heterolog la E.coli o reprezint formarea de corpi de incluziune - mari agregate de proteine inactive. Marcarea proteinelor drept corpi insolubili de incluziune ar putea reprezenta o strategie de mpiedicare a activitii bactericide a proteinelor supraexprimate [Majerle i colab., 2000]. Au fost descrise mai multe protocoale de solubilizare a corpilor de incluziune dup purificare i de refacere a structurii proteinelor denaturate pn la obinerea structurii lor corecte 3-D. Cu toate acestea, strategia de reconformare trebuie optimizat pentru fiecare protein n parte i poate reprezenta o procedur laborioas cu reuite i eecuri, dei uneori rezultatele nu sunt satisfctoare. Prin urmare, intenia este aceea de a maximiza obinerea de proteine n forme complet solubile.

316

Din fericire, n multe cazuri, formarea corpilor de incluziune n timpul exprimrii proteice poate fi prevenit prin legarea la captul C-terminal al proteinei int, al unui partener de fuziune extrem de solubil. Mai multe proteine transportoare (carrier) sunt capabile s creasc solubilitatea unei proteine de regul insolubile (tabelul 10.2); n cercetrile ntreprinse pentru depistarea proteinelor capabile s confere solubilitate proteinelor int insolubile, prin fuziune la nivelul captului C-terminal, proteina de legare a maltozei din E.coli MalE i proteina NusA s-au dovedit a fi cele mai eficiente. n condiiile n care macroproteinele de transport trebuiesc ndeprtate prin intermediul proteazelor specifice, anterior analizei RMN, clivajul proteinelor de fuziune poate reintroduce probleme de solubilitate i recent eliberatele proteine int, uneori, tind s se precipite la scurt timp dup ce nu mai sunt covalent ataate la o protein transportoare. Pe lng acestea utilizarea de macroproteine transportoare ar conduce la pierderea unor cantiti preioase de precursori de marcare. Proteine transportoare cu greutate molecular mai mic, cum ar fi proteina D cu capat , domeniile proteinei A a Staphylococului sau proteinei G a Streptococului [Zhou i colab., 2001] pot fi utilizate drept elemente de ataare nonclivatoare cu scopul creterii stabilitii microproteinelor i peptidelor. Fuziunea cu domeniul B1 al proteinei G a dus chiar la mbuntirea spectrului RMN al proteinelor marcate. Pe lng mbuntirea solubilitii, proteinele transportoare pot fi folosite pentru a facilita producerea de mici peptide la E.coli i pentru a le stabiliza mpotriva degradrii. Asamblarea greit a proteinelor poate fi o problem la nivelul expresiei proteinelor eucariote n E.coli, n special dac au ncorporate mai multe legturi disulfidice, dac au n alctuire subuniti multiple sau conin grupri prostetice. O strategie frecvent utilizat de abordare a acestor probleme o constituie coexprimarea proteinelor helper accesorii (tabelul 10.3). Dac asamblarea proteinelor supraexprimate depinde de factori de monitorizare, creterea acestor factori de monitorizare prin coexpresia GroEL/ES, DnaKJ/GrpE sau a altor sisteme de monitorizare se poate dovedi extrem de avantajoas. Rata sczut de producie proteic datorat pauzelor translaionale sau a
317

ncorporrii greite a aminoacizilor ca rezultat al utilizrii codonilor ar putea fi optimizat prin coexprimarea tARNs corespunztoare.
Tabelul 10.3 Modificrile sistemelor de expresie ale E.coli Probleme/necesiti Formarea de puni disulfidice Modificri expresie a regiunilor trx- i gor-, cu obinerea unui mediu citoplasmatic cu aciune oxidant coexpresia disulfid izomerazelor ca DsbA, DsbC sau PDI expresia periplasmatic folosind peptide semnal coexpresia factorilor de monitorizare ca GroELS i/sau DnaKJ/GrpE coexprimarea tARNs corespunztoare

Asamblarea proteic dependent de cofactori de monitorizare Utilizarea rar a codonilor

O problem frecvent, care n multe cazuri nu i gsete soluionare, aprut la folosirea sistemelor de expresie ale E.coli o reprezint formarea corect a legturilor disulfidice n proteine. Strategiile care s permit formarea corect de legturi disulfidice, in vivo, includ exportul proteinelor supraexprimate la nivelul periplasmei cu efect oxidant prin adugarea de secvene semnalizatoare de export exprimate la nivelul unor regiuni special create lipsite de tioredoxin i de glutation reductaz oferind prin urmare un mediu celular oxidant i coexprimarea izomerazelor disulfidice asemenea proteinelor DsbA i DsbC ale E.coli sau a proteinei eucariote de monitorizare, disulfid-izomeraza (PDI). 10.2.2. Proteinele marcate cu izotopi C13 i N15 ale P. Pastoris Celulele din drojdia de bere combin multiple avantaje ale sistemelor de expresie pro- i eucariote. Sunt mici ca dimensiuni, totui robuste i uor de manevrat. Rata de cretere a celulelor drojdiei de bere este mult mai rapid comparativ cu alte celule eucariote iar fermentarea acestora este de regul definitivat n cteva zile. Mai mult, drojdia nu necesit adugarea de suplimente complexe pe mediul de cretere iar creterea se poate propaga pe medii simple inextensive sau pe medii de geloz asemenea celor pentru E.coli. Rata lor excelent de cretere pe medii definite minimale, face aceste celule extrem de atractive pentru utilizarea lor n producerea de
318

proteine int necesare analizei RMN. Pe lng acestea, datorit capacitii secretorii a proteinelor recombinate de P. Pastoris, purificarea se poate realiza rapid ntr-un singur pas [De Lamotte i colab., 2001]. Multe proteine de origine eucariot trebuie s treac prin modificri specifice posttranslaionale asemenea glicozilarii sau lipidrii, formrii de legturi disulfidice sau procesrii posttranslaionale. Aceste modificri sunt adesea eseniale pentru stabilitatea activitii enzimatice a proteinelor, sau pentru adoptarea conformaiei lor native. Eecul formrii legturilor disulfidice corecte poate ntrzia sau chiar bloca procesele de asamblare proteic determinnd formarea de corpi de incluziune sau chiar degradare proteic. Producerea de proteine modificate nu poate fi abordat ntr-o manier satisfctoare prin utilizarea unor gazde procariote ca E.coli. Exprimarea la nivelul celulelor de drojdie poate fi prin urmare soluia la cutrile noastre a unor gazde cu potenial de cretere rapid i posibilitatea de producere a proteinelor modificate i glicozilate [Cereghino, Cregg, 2000]. Cu toate acestea, trebuie luat n considerare faptul c modelul de modificare proteic obinut dup exprimare la nivelul drojdiei de bere poate s fie diferit de cel prezent la nivelul proteinelor native , spre exemplu, celulele de drojdie sunt capabile doar de ataarea glicanilor bogai n manoz, care reprezint polizaharida central a glicoproteinei. Abordarea tehnicilor de marcare ar trebui s ia n considerare faptul c producia de proteine heterologe din P. Pastoris este corelat cu o densitate celular mare. Creteri de aproare 100 straturi de protein n cultur au fost obinute prin fermentaia celulelor n bioreactoare spre deosebire de aa numitele culturi proteice agitate sau submerse [Van den Burg i colab., 2001]. Inducerea produciei de proteine heterologe ar trebui declanat dup atingerea unei densiti celulare mari. Au fost nregistrate chiar producii de peste 100 mg protein per litru de cultur. n culturile proteice agitate, produciile raportate de proteine heterologe uniform marcate au variat de la 2 mg/l n cazul proteinei de control a complementului virusului Vaccinia pn la cantiti de 27 mg/l pentru proteina anticoagulant a cpuei. Prin urmare, producia medie de proteine de drojdie obinut prin tehnica culturilor agitate atinge doar limita inferioar a cantitii de proteine produse prin cultivarea extractelor de
319

E.coli. n consecin, este important s subliniem c n raport cu producia de proteina la E.coli, vor fi necesare cantiti mult mai mari de izotopi marcai specific pentru a induce o cretere rezonabil a celulelor de drojdie, fiind necesare concentraii de 5 pn la 10 ori mai mari de (N15H4)2SO4 i [C13]glucoz la o cultur celular submersat de rutin. Pentru a produce 90 mg de fragment C13 marcat de trombomodulin n cultura de P.pastoris, trebuiesc adugate de asemenea 143 g [C13]glicerol sau 162g [C13]glucoz la culturile celulare crescute ntr-un fermentator de 1,25 l. Prin urmare din raiuni economice, tehnicile care folosesc drojdia de bere devin competitive doar n cazul n care proteinele nu pot fi obinute utilizndu-se E.coli. Pe medii de cultur definite minimale singura surs de nitrogen pentru P.pastoris o reprezint de obicei NH4OH, care servete n plus la neutralizarea unor cantiti considerabile de acid produse de drojdie n timpul creterii. Cu toate acestea ns, din raiuni economice NH4OH trebuie nlocuit cu (N15H4)2SO4 pentru proteinele de P.pastoris marcate cu N15. Atingerea densitii celulare necesare implic adiia de cantiti mari de (N15H4)2SO4 cu creteri concentraionale de 40 de ori mai mari dect cele necesare n procesul de fermentare al lui E.coli. Pentru a evita orice efect negativ asupra creterii celulare care deriv din creterea puterii ionice a mediului ca urmare a formrii de K2SO4, (N15H4)2SO4 trebuie adugat fracionat, la momente diferite, i opional combinat cu aciunea de schimbare a mediului anterior inducerii exprimrii proteice. Pentru marcarea proteinelor cu C13 folosind puternicul promotor AOX1, sunt necesare de regul dou surse de carbon n timpul fermentrii, i ne referim la glicerol i glucoz cu scopul de a obine o densitate celular mare i metanol necesar induciei promotorului AOX1. Dei P.pastoris poate crete cu metanolul ca unic surs de carbon, timpul lent de dublare ar mpiedica atingerea unor densiti celulare mari i necesit prin urmare surse alternative de carbon ca glicerolul sau glucoza. n timp ce glucoza ar putea cu siguran s sporeasc densitatea celular, are rol i n reprimarea promotorului AOX1, conducnd la o descretere a produciei de proteine heterologe. Cu toate acestea [C13]glucoza poate fi utilizat n experimentele de
320

marcare ca surs iniial de carbon pn la atingerea unei densiti celulare corespunztoare. Apoi celulele pot fi fermentate mai departe prin adugarea de [C13]glicerol ca surs de carbon iar inducia s aib loc sub aciunea [C13]metanolului. Aproximativ 30% din carbonul din proteinele marcate deriv din metanol i prin urmare devine indispensabil inducia producerii de proteine cu [C13]metanol pentru a obine proteine complet marcate, n special atunci cnd folosim subtipuri de drojdie cu un genotip mut+. 10.2.3. Marcarea cu izotopi C13 i N15 a proteinelor exprimate n celulele ovariene ale hamsterului chinezesc (CHO) Comparativ cu celulele drojdiei de bere, celulele ovariene ale hamsterului chinezesc (CHO) ofer alternativa unui sistem mai avansat care face posibil generarea de probe marcate care s conin toate modificrile specifice proteinelor eucariote. Asemenea celulelor de drojdie proteinele recombinate pot fi secretate eficient n mediu de cultur, fiind nregistrate rate de producie proteic la celulele CHO de peste 100 mg/l. Cu toate acestea, celulele provenind de la mamifere necesit de obicei aminoacizi, vitamine, cofactori i n multe cazuri seruri complexe ca aditivi la mediul de cultur. Pentru a reduce costurile, celulele CHO pot fi de asemenea crescute prin nlocuirea aminoacizilor marcai izotopic, care sunt extrem de scumpi, cu compui de hidroliz bacterian sau complexe algale (nutritive) fiind obinute astfel cantiti suficiente de proteine recombinate mbogite cu izotopi. Pentru prevenirea diluiei izotopilor de marcare cu aminoacizi nemarcai provenind din ser, ar trebui inclus o etap de dializ cu scopul de a elimina din ser compuii cu greutate molecular mic. De asemenea un factor extrem de important i probabil potenator al costurilor, l reprezint necesitatea nregistrrii unor concentraii destul de crescute de glutamin marcat, esenial circuitului metabolic al multor aminoacizi i a variatelor componente ale acizilor nucleici. Dei celulele CHO reprezint gazde scumpe pentru generarea de proteine marcate, ar putea reprezenta cea mai bun opiune pentru supraexprimarea glicoproteinelor complexe sau a proteinelor care nu pot fi produse de E.coli.
321

10.2.4 Marcarea proteinelor cu izotopi C13 i N15 la alte organisme O alt opiune de producere a proteinelor marcate glicozilate o reprezint supraproducia acestora la nivelul unei specii de amoeba Dictyostelium discoideum. Aceast gazd are capacitatea de a se hrni cu celule bacteriene asemenea celor de E.coli care pot fi apoi pre-mbogite cu markeri izotopici utiliznd protocoalele standard. Vectori de expresie potrivii sunt disponibili pentru D.discoideum i o protein glicozilat de 16 kDa a fost deja marcat ntr-o proporie mare cu C13/N15 [Cubbedu i colab., 2000]. n condiiile n care rata de cretere a D.discoideum este destul de lent, ntreaga procedur a durat peste 10 zile. Cu toate acestea, comparativ cu tehnicile de marcare realizate pe celule de drojdie de bere, o cantitate semnificativ mai mic de precursori de marcare a fost folosit acum cu scopul obinerii unei cantiti suficiente de proteine pentru msurtorile RMN, indicnd prin urmare D.discoideum ca alternativ mai puin costisitoare pentru producerea de glicoproteine marcate. n timp ce sistemele de exprimare discutate anterior necesit diferite cantiti de precursori de marcare, relativ scumpi, n cazul cianobacteriei de fotosintez Anabaena sp. cultivarea se poate face pe medii definite coninnd Na15NO3 i NaH13 Co3 ca unice surse de nitrogen i carbon. Un domeniu de 24-kDa a subunitii B a ADN-girazei din E.coli a fost supraexprimat cu succes n Anabaena sp. cu ajutorul unui sistem special conceput de vectori de clonare obinndu-se astfel o ncorporare de peste 90% a izotopilor de marcare C13/N15 [Desplancq i colab., 2001]. Producia de proteine (aproximativ 3-6 mg/l) a fost considerat asemntoare cu aceea obinut la E.coli. Este demn de menionat c gena exprimat s-a aflat sub controlul promotorului tac al E.coli, funcional de asemenea i n Anabaena. n timp ce marcarea cu izotop N15 la Anabaena poate fi realizat utiliznd protocoalele standard de cretere , marcarea cu C13 se dovedete problematic n condiii aerobe datorit abilitii de fixare a CO2 endogen, avnd drept rezultat o marcare incomplet cu C13 uneori de sub 30%. Cu toate acestea ns, mbogirea cu izotop C13, de peste 90%, poate fi obinut prin cultivarea celulelor de Anabaena pe medii aerate cu nitrogen n condiii anaerobe controlate. Procesul de fermentare al Anabaena necesit iluminare
322

iar durata sa total este de aproximativ cinci ori mai mare dect cea a lui E.coli, datorit timpului de dublare mai lent. Cu toate acestea n condiiile n care pot fi utilizai precursori de marcare mai ieftini , costurile totale se pot reduce cu aproximativ 10%. Poducia de proteine heterologe la Anabaena poate constitui o opiune pentru generarea de proteine cu o rat de producie sczut care necesit cantiti mai mari de mediu de cultur. Pe lng toate acestea trebuie luat n considerare c natura deprotonat a rezervelor de carbon final se poate dovedi avantajoas i economic pentru generarea unor probe de proteine deuterate necesare analizei structurale a macroproteinelor sau studiilor dinamice (Dingermann i colab., 2004). Dei producerea de proteine heterologe reprezint abordarea cea mai comun, microproduii peptidici au fost de asemenea marcai n mediul lor nativ. O condiie esenial este aceea ca organismul s se poat adapta la creterea pe medii specifice mbogite cu precursori corespunztori. Exemple de abordri ncununate de succes sunt reprezentate de marcarea ciclosporinei A la Tolypocladium inflatum, alamethicina din Trichoderma viride, belenaminei la Streptomyces nashvillensis i cianoficinei n sporii Synechocystis. 10.2.5. Strategii de producere a proteinelor marcate selectiv cu izotopi C13 i N15 Spectrul RMN al proteinelor uniform marcate a devenit din ce n ce mai complex odat cu creterea dimensiunilor proteice. Au fost elaborate mai multe metode care permit marcarea selectiv a unor domenii specifice, a aminoacizilor sau chiar marcarea uninuclear a proteinei cu scopul simplificrii analizei spectrale. Utiliznd tehnici de marcare in vivo, acest tip de marcare se poate realiza prin hrnirea celulei gazd cu precursori de marcare special creai, obinui n majoritatea cazurilor prin sintez chimic. Simplificarea spectral care deriv, faciliteaz distribuirea exact a rezonanei n macroproteine. Alegerea strategiei de marcare corecte poate fi prin urmare deosebit de important pentru distribuirea rezonanei la nivel proteic.
323

10.2.5.1. Marcarea selectiv a aminoacizilor n general orice rest de aminoacid dintr-o protein supraexprimat poate fi marcat specific prin suplimentarea mediului de cultur cu cantiti mari din aminoacidul respectiv, coninnd izotopul de marcare dorit. Rezonana corespunztoare aminoacizilor unici poate fi uor identificat raportnd-o la spectrul unei proteine care conine ali aminoacizi marcai iar asemenea abordri ar putea crete considerabil rezonana macroproteinelor. Cu toate acestea, costurile mari pe care le implic marcarea aminoacizilor previn aplicarea acestei tehnici ca analiz de rutin folosit pentru determinri structurale. Metoda marcrii selective i gsete aplicabilitate n caracterizarea dinamic i funcional a resturilor de aminoacizi, spre exemplu analiza interaciunii cu liganzii. Marcarea specific este de asemenea folosit pentru studiul denaturrii proteinelor. Proteinele neasamblate au n general o dispersie joas a rezonanei, dar urmrirea unui numr limitat de resturi de AA marcate, care ideal sunt distribuite uniform n ntreaga protein, poate facilita analiza procesului de asamblare. ntr-un studiu anterior, marcarea selectiv cu [N15]izoleucin a fost utilizat pentru detectarea intermediarilor de asamblare care acioneaz la nivelul unei proteine complexe [Biekofsky i colab., 2002]. Ca o alternativ la marcarea selectiv a aminoacizilor, prin marcarea izotopic invers, produsul n exces al unuia sau mai multor aminoacizi nemarcai este adugat la mediul de cultur n combinaie cu compui de marcare general ca N15H4Cl sau [C13]glucoz. O form de aplicabilitate interesant o reprezint marcarea invers a resturilor aromatice asemenea fenilalaninei sau tirozinei n condiiile n care lanurile lor laterale sunt adesea implicate la nivelul interfeelor de ataare de ligand sau poziionate n miezul hidrofobic al proteinei, ceea ce face ca restriciile de distan s fie extrem de importante pentru mediul intern al acestor particule [Goto, Kay, 2000]. Aplicarea marcrii izotopice inverse depinde clar de complexitatea proteinei analizate i este n general mai util n studiul proteinelor cu greutate molecular mic care s conin doar puine din resturile de aminoacizi analizate. Aplicarea tehnicilor de

324

marcare izotopic specifice sau selective este limitat datorit efectului de dezorganizare pe care izotopul de marcare l are asupra celorlalte reziduuri. Mutanii auxotrofici (bacterieni) specifici lui E.coli poate fi utilizat pentru supraexprimarea i marcarea specific a proteinelor recombinate pentru a minimaliza acest efect. 10.2.5.2 Marcarea specific cu izotopul C13 Aminoacizi marcai la nivelul unor poziii selectate ale carbonului pot fi adugai la medii de cretere specifice cu scopul ncorporrii lor n proteina recombinat. Aceti compui marcai parial au fost de obicei generai prin sintez chimic i indrodui pentru a optimiza rezoluia spectral a macroproteinelor supuse experimentelor RMN. Protonii catenelor alifatice laterale pot fi dificil de abordat dac numrul de reziduuri alifatice crete. Reziduurile de fenilalanin marcate cu izotop C13 doar n poziia pot ajuta la distribuirea rapid a protonilor inelului aromatic. Mai mult, proteinele complet marcate cu izotop C13 prezint cuplri scalare nedorite C13-C13. ncorporarea aminoacizilor marcai n centrul izotopului C13 duce la depirea acestei probleme. Marcarea fracionat a aminoacizilor cu C13 poate fi obinut prin creterea celulelor productoare de proteine mpreun cu o mixtur specific de surse de carbon marcate cu C13 i C12 [Atreya, Chary, 2001]. Analiza dinamicii poriunii interne a lanurilor laterale ale proteinelor uniform marcate cu izotop C13 poate fi de asemenea complicat datorit efectelor diferitelor interaciuni dintre diveri factori care contribuie la relaxare i implicit, datorit contribuiei cuplrilor scalare i dipolare C13-C13. Pentru a rezolva aceast problem proteinele pot fi sintetizate cu un model de marcare alternativ C12-C13-C12 realizat printr-o procedur de marcare izotopic elaborat care utilizeaz fie [2-C13] glicerol sau [1,3-C132] glicerol ca unic surs de carbon. Mai multe strategii de marcare carbon selective se dovedesc extrem de valoroase mai ales n combinaie cu protonarea selectiv pentru analiza structural a proteinelor cu greutate molecular mare.
325

10.2.5.3. Marcarea izotopic segmentar n ciuda dezvoltrii tehnicilor RMN heteronucleare multidimensionale, complexitatea crescut a determinrilor spectrale datorat lipsei de rezoluie, suprapunerii crescute a semnalelor care induc modificri chimice similare, limiteaz nc analiza structural a macroproteinelor. Cu toate acestea tentative promitoare de extindere a dimensiunii limit proteice care se preteaz evalurii structurale prin spectroscopie RMN, sunt reprezentate de tehnicile de marcare segmentare sau n bloc (Dingermann i colab.,2004). n principiu proteinele de lungime complet, parial marcate, pot fi produse de legarea posttranslaional in vitro de domenii nemarcate n asociere cu domenii marcate obinute prin diferite experimente pentru inducerea expresiei. Rezonana domeniilor unice ale macroproteinelor poate fi interesat secvenional iar structura proteic complet poate fi obinut printr-o abordare combinatorie, diviznd o macroprotein int n pri de dimensiuni cu care s se poat opera. Gndindu-ne la elucidarea structurii domeniilor proteice izolate nu trebuie s uitm c structura domeniilor marcate specific prin intermediul tehnicii de marcare segmentar este analizat n contextul proteinei complete, oferind prin urmare informaii asupra interaciunilor structurale i funcionale dintre domenii, pstrnd totodat caracterul structural de baz al proteinei. Procesul de legare este catalizat de enzime autorestrictive - intronii. Intronii sunt secvene de inserie clivate dup translaie prin auto-excizie, lsnd regiunile de flancare proteice, exonii, unite prin structura de legare nativ peptidic. n funcie de natura intronilor i de solubilitatea domeniului int, au fost elaborate mai multe protocoale modificate de marcare segmentar. Intronul este secionat la nivelul poriunii de mijloc al unei secvene din interiorul regiunii formate din bucle flexibile iar cele dou fragmente sunt exprimate separat ca elemente de fuziune la domeniul int. Proteinele izolate denaturate sunt amestecate iar cele dou fragmente de intron se asociaz eficient n timpul asamblrii, avnd drept rezultat legarea celor dou domenii int. Aceast strategie are o aplicabilitate deosebit dac intronii de fuziune sunt exprimai sub form de corpi de
326

incluziune insolubili i dac un protocol eficient de reasamblare este disponibil. Folosind introni diferii la fiecare mbinare/jonciune se pot genera chiar proteine care conin domenii marcate central. Ataarea chimic a proteinelor asamblate sub condiii native folosete un etil tioester la captul C terminal al unei proteine recombinate, generat de clivajul unui intron de fuziune, n scopul fuzionrii cu o alt protein sau peptid care conine reziduuri de cistein la captul N terminal. Ambii parteneri de fuziune pot fi combinai ntr-o structur corect asamblat, la un pH fiziologic, iar aceast strategie ar putea fi extins n principal la legarea a mai mult de dou domenii. Mini intronul din gena dnaE a cianobacteriei Synechocystis sp. conine mai puin de 200 de resturi de aminoacizi i este divizat n fragmente N- i C-terminale care sunt exprimate separat. Dac sunt combinate dup purificare cele dou fragmente interacioneaz eficient, n condiii native, cu scopul de a cataliza reaciile de mbinare i fuziune ale proteinelor covalent ataate [Evans i colab., 2000]. Domeniile int de fuziune trebuie exprimate ca fuziuni N- sau C- terminale cu fragmentele de introni. Dei au fost nregistrate creteri ale fuziunilor in vitro de pn la 90%, o serie de probleme poteniale trebuie luate n considerare atunci cnd ncercm o abordare a tehnicii marcrii segmentare. n timp ce majoritatea reziduurilor enzimatice importante sunt localizate n interiorul intronilor, un mecanism eficient de excizie i fuziune necesit i implicarea unor reziduuri cu originea n exon, reacia nefiind prin urmare complet independent de secvena de jonciuni proteice nou formate. Captul C-terminal al exonului necesit resturi de cistein sau treonin iar la captul Nterminal serin. Asigurarea acestor necesiti nu trebuie s afecteze structura sau activitatea proteinei analizate. Condiiile de asamblare i fuziune trebuiesc optimizate i individualizate pentru fiecare protein n parte, iar jonciunea de fuziune/mbinare ar trebui localizat ntr-o regiune bucl pentru a asigura flexibiliate maxim. n ceea ce privete marcarea n bloc aceasta pare a se aplica mai bine la studiul proteinelor compuse din domenii independent asamblate cu proprieti biochimice distincte.
327

10.3. Marcarea izotopic acelular

Sinteza de proteine acelular reprezint o alternativ promitoare i atractiv la tehnologiile convenionale de producere a proteinelor cu ajutorul culturilor de celule bacteriene sau eucariote. n contrast cu metodele in vivo de exprimare genic n care sinteza de proteine este realizat ntr-un context celular cuprinznd perei i membrane celulare, sinteza acelular de proteine se realizeaz ntr-un sistem complet deschis. Acest tip de sistem permite controlul direct i accesul la reacie n orice moment. Compui care pot mbunti producia de proteine sau care pot stabiliza proteinele recombinate, cum sunt proteinele de nsoire/chaperone, detergenii sau inhibitorii de proteaz, se pot aduga uor fr a determina efecte secundare asupra metabolismului celular sau sistemului de transport celular prin membran. Majoritatea funciilor celulare, cu excepia transcripiei i translaiei, nu trebuiesc ntreinute n timpul expresiei proteice acelulare. Prin urmare aplicabilitatea poate fi extins la proteine sau condiii care nu pot fi tolerate de ctre organismele vii. n timp ce producia in vivo de proteine este adesea limitat prin formarea de corpi de incluziune insolubili sau datorit instabilitii proteice cauzat de proteazele intracelulare, sistemele acelulare ofer noi posibiliti de sintez a proteinelor complexe (tabelul 10.4).
Tab. 10.4 Avantaje i dezavantaje poteniale ale sintezei proteice acelulare Avantaje poteniale Sistem complet deschis (acces uor) adaptarea condiiilor de reacie la proteinele sintetizate ncorporarea de aminoacizi marcai, glicozilai, modificai sau sintetici Translaia direct a produilor PCRrat de transfer nalt Producia de proteine toxice Producia de proteine de ataare la membran Expresia de cofactori de solicitare a proteinelor Adiia uoar de proteine de nsoire /chaperone sau PDI Miniaturalizarea (reacii de 50 l) Eliminarea organismelor viifr restricii de cretere Posibilitatea izolrii directe a produilor cu scopul scurtrii intervalului de preparare a proteinelor purificate 328 Dezavantaje Productivitate sczut adesea Sisteme complexe comparate cu sinteza de proteine in vivo Tehnic costisitoare comparativ cu modalitatea de exprimare in vivo Numrul mic de sisteme comerciale i kituri Standardizarea dificil datorat multitudinii componentelor de reacie Costuri ridicate

Asamblarea proteinelor i stabilitatea acestora poate fi promovat prin adugarea direct de proteine de nsoire/chaperone, PDI i cofactori necesari. n contrast supraexprimarea chaperonelor in vivo poate conduce la filamentarea celular sau la exprimarea altor fenotipuri nedorite care se pot dovedi duntoare pentru viabilitatea celulelor E.coli i a expresiei proteice. Parametrii de reacie asemenea pH-ului, potenialului redox i puterii ionice pot fi determinate far apariia de efecte nocive asupra creterii i viabilitii celulare dar cu sigurana c aceti parametrii vor influena direct reaciile relevante. Aceast nou oportunitate de expresie genic in vitro permite controlul deplin i flexibilitatea nalt a condiiilor de testare i totodat ofer noi perspective asupra dificultilor acociate cu citotoxicitatea, degradarea proteolitic, asamblarea improprie ori agregarea proteinelor sintetizate. Cu ajutorul PDI, chaperonelor sau virusurilor funcionale s-a observat producia de proteine citotoxice , proteine de membran. Cel mai important ns este faptul c sinteza de proteine acelular ofer noi posibiliti de incorporare a aminoacizilor marcai, glicozilai, modificai sau sintetici. Un alt element promitor al sintezei proteice acelulare poate fi constatat la nivelul implicrii sale la expresia de proteine cu rat nalt de transfer prin translaia direct a produilor reaciei de polimerizare n lan (PCR). Limitele actuale ale sistemelor acelulare sunt corelate cu nalta lor complexitate, costurile mari i adesea productivitatea sczut. 10.3.1. Componentele sistemelor de expresie acelulare n ceea ce privete sistemele de producie acelulare, toate componentele implicate n expresia genic i sinteza proteic trebuiesc adugate n amestecul de reacie (fig. 10.1). Componente precum ADN-ul, nucleotid trifosfaii (NTPs), ARNul mesager (ARNm), ARN-ul de transfer (ARNt), aminoacil-ARNt-sintetaza (ARSases), polimerazele, ribozomii, factorii de transcripie i translaie precum factorii de iniiere (IFs), factorii de elongare (EFs) sau factorii de eliberare (RFs) i de asemenea aminoacizii trebuie optimizai din punct de vedere al concentraiei, salinitii i pH-ului mediului. Procesul de transcriere/translaie necesit cantiti mari de energie liber asigurat prin hidrolizarea GTP i ATP trifosfailor. Prin urmare,
329

sinteza in vitro de proteine necesit implicarea unui sistem ATP de regenerare a energiei care s menin stabil concentraia trifosfatului. n scopul acesta au fost folosii fosfai donori de nalt energie cum sunt acetil fosfatul (AcP), creatin fosfatul (CrP) sau fosfoenol piruvatul (PEP) n prezena kinazelor proprii (acetat kinaza, creatin kinaza i piruvat kinaza).

Fig. 10.1 Ilustrarea schematic a sintezei proteice acelulare, evideniind procesele cuplate de transcripie i translaie ntr-un sistem bacterian. Iniial celulele sunt cultivate, lizate iar extractul celular este pregtit prin adugare de ribozomi, factori de translaie asemenea factorilor de iniiere (IFs), factori de elongare (EFs) sau factori de eliberare (RFs) i pe lng acetia acetat kinaza i aminoacil-tARN-sintetaza (ARS-aza). Substraturile precum aminoacizii, componentele sistemului de regenerare al energiei ori nucleozid trifosfatul (NTPs) sunt tratai cu o sare i apoi adugai la extract iar sinteza de proteine este iniiat dup adugarea copiei de ADN. ADN-ul este transcris prin adugarea unei ARN polimeraze. tARN-ul adugat este ncrcat cu aminoacizi de ctre ARS-azele, aminoacizi care vor fi utilizai n translaia mARN. Incorporarea unor aminoacizi marcai cu izotopi stabili (particulele ntunecate) poate fi realizat cu uurin n sistemul acelular, ceea ce conduce la obinerea unei proteine marcate izotopic selectiv. Regenerarea ATP i GTP i chiar NTPs din sistemul acelular este obinut printr-un sistem ATP de regenerare a energiei bazat pe hidroliza substraturilor generatoare de energie nalt n prezena kinazelor proprii. Moleculele de nsoire (chaperonele) pot fi uor adugate la mixtura de reacie pentru a asista asamblarea proteinei int. 330

Un component important este un extract celular bazat pe celule brute lizate care conine componentele necesare de reacie precum IFs, EFs, RFs, ARS-aze, ARNt i enzime ca acetat kinaza, necesare regenerrii energetice. Sistemele de expresie acelulare pot fi clasificate n funcie de originea extractului. n principiu, sistemele funcionale in vitro pot fi realizate din orice tip de celule, ns la eficacitatea produciei de proteine contribuie muli factori. Cele mai comune reacii in vitro au la baz extracte de E.coli, germeni de gru sau reticulocite lizate de iepure (tabelul 10.5).
Tabelul 10.5. Sisteme de expresie acelulare bacteriene i eucariote Sisteme bacteriene Escherichia coli Prepararea extractului S30 Fraciunea de supernatant centrifugat la 30000g din extract de E.coli preincubat pentru a diminua ADNul i mARN Conine: ARN polimeraza, ribozomi, tARNs, ARS-aze, factori de translaie 24 - 38 C (optim 37 C)a
a

Sisteme eucariote Germeni de gru

Prepararea extractului S100 Fraciunea de supernatant centrifugat la 10000g privat de toi acizii nucleici, spre exemplu prin tratament DEAE cu celuloz Conine: ARN poliConine: ribozomi, meraze, ARS-aze i tARNs, ARS-aze, factori de translaie factori de translaie Ribozomi, tARNs 20-27C pn la adugai la 24- 38C 32Ca a (optim la 37C) [Tulin i colab., 1995]b

Reticulocite de iepure Extract de Reticulocite lizate germeni de gru de iepure Utilizat direct Tratate cu RN-aze pentru expresia dependente de copiilor endogene Ca2+ i exogene Conine: ribozomi, tARNs, ARS-aze, factori de translaie 30- 38Ca [Craig i colab., 1992]b

Temperetura de reacie Referine Elemente de adugat: ADN (plasmid cu promotor potrivit pentru SP6, T7 ARN-polimeraza)+ polimeraza (bacteriofagul SP6 sau T7 ARN polimeraza) sau mARN Aminoacizi. Componente energetice: ATP sau GTP. Sistem NTP de regenerare al energiei: PEP+PK sau CP+CrP sau AcP. Formil tetrahidrofolat sau omonimele sale metenil tetrahidrofolat sau acid folinic. Compus-SH: mercaptoetanol sau ditiotreitol (DTT). Mg2+ i K+ n concentraii optime. Necesare uneori: Ca2+ i NH4+ n concentraii optime. cAMP. Poliamine, spre exemplu spermidina
b

331

Extractele obinute din E.coli conin aa numita fracie de supernatant S30, numit dup fracia solubil centrifugat la 30000 g, care conine ribozomi endogeni, enzime ca acetat kinaza i factori necesari transcripiei i translaiei, ARS-aze, ARNt, ARNm. ARNm endogen este ndeprtat de ribozomi n timpul preincubrii extractului celular brut ntr-o etap de evacuare i apoi distrus de ribonucleazele endogene. O alt modalitate de manevrare a extractelor bacteriene este descris n cadrul sistemului Gold-Schweiger. Ribozomii sunt adugai la fracia supernatant a unui extract S100 special purificat de aminoacizii endogeni i acizii nucleici prin cromatografie schimbtoare de ioni. Acest sistem ofer o acoperire destul de sczut datorit sintezelor endogene i a condiiilor de reacie mai bine controlate n detrimentul unei preparri mai complicate. Sistemul E.coli funcioneaz bine la variaii de temperatur ntre 24-38C, optim fiind temperatura de 37C. Extractele de germeni de gru prezint un nivel sczut de mesageri exprimai endogeni i prin urmare, poate fi direct utilizat n exprimarea modelelor endogene i exogene. n sistemul bazat pe extracte de germeni de gru temperatura variaz ntre 20-27C, ns poate fi crescut pn la 32C asigurnd o exprimare mai ridicat a anumitor compui. Extractul de reticulocite este preparat prin lizarea direct a celulelor sanguine obinute de la iepuri anemici, existenei acestei patologii permite creterea numrului de proeritrocite sau reticulocite care ulterior sunt tratate cu RN-aze dependente de Ca2+ cu scopul eliminrii ARNm-ului endogen. Acest sistem funcioneaz la valori ale temperaturii cuprinse ntre 30-38C. n ceea ce privete temperatura de reacie trebuie notat c, pe lng orice efect asupra procesului enzimatic de transcripie/translaie i asupra degradrii ARNm, temperatura afecteaz implicit i asamblarea proteinelor sintetizate. Pentru a asista asamblarea proteinelor, chaperonele asemenea sistemului GroEL/ES sau DnaK ori DnaJ se pot aduga la mixtura de reacie. De regul, temperaturile mai joase vor conduce la recolte mai mari de proteine recombinate, n absena chaperonelor, ns n prezena acestora recoltele nu sunt neaprat mai sczute. Mai mult, pentru a asista formarea de legturi disulfidice, PDI se poate aduga la mixtura de transcripie/translaie.
332

Sistemele de translaie mai puin comune bazate pe extracte de drojdie de bere, pe celule de mamifer asemenea celulelor umane HeLa i celulelor L de oarece sau pe cloroplaste de tutun, care depind mult de adugarea exogen de ARNm, prezint nivele nalte de degradare i producii de proteine relativ sczute. n ceea ce privete marcarea proteic acelular, s-au folosit doar extracte de E.coli i germeni de gru. Folosind o abordare extrem de elaborat, Shimizu i colab.,(2001) au elaborat un sistem de translaie acelular reconstruit din factori de translaie purificai poli(His)marcai . Sistemul lor numit sinteza de protein realizat cu ajutorul elementelor recombinate (PURE), conine 32 de componente purificate individual, cu activitate nalt specific, care s permit producerea eficient de proteine. Un avantaj al sistemului PURE, n afar de lipsa substanelor inhibitoare asemenea nucleazelor, proteazelor i enzimelor care hidrolizeaz nucleozid trifosfaii, l reprezint procesul simplu de purificare al proteinei sintetizate realizat prin eliminarea proteinei marcate prin cromatografie de afinitate. Una dintre limitrile sistemului acelular o reprezint degradarea ARNm-ului de provenien exogen. Activitile variate ale RN-azelor prezente n extractele celulare restricioneaz de obicei durata de via a ARNm, i consecutiv inhib eficacitatea sintezei proteice. Aceast problem ar putea fi rezolvat prin reintroducerea periodic n mixtura de reacie a unui sistem de translaie simplu al mesagerilor [Madin i colab., 2000]. Sistemele de cuplare ale transcripiei cu translaia, n care ARNm este continuu sintetizat din copia ADN adugat la mixtura de reacie, se pot dovedi avantajoase pentru sistemele de translaie care conin mesageri presintetizai. Transcripia direct din mixtura de reacie poate fi relizat din promotori potrivii, de ctre ARN polimeraza endogen din E.coli sau de ctre ARN polimeraza, bacteriofag exogen din sistemele bacteriene sau eucariote. Pentru a evita degradarea rapid a mesagerilor, n special n sistemele acelulare E.coli, sunt folosii inhibitori de RN-aze parial lipsii de ribonucleaz. O alegere optim de copie ADN n sistemele procariote o reprezint plasmida circular ADN. n sistemul bazat pe extracte de germeni de gru cu activitate nucleazic sczut, att plasmidele ADN ct i fragmentele lineare PCR au o funcionalitate optim. Eficiena translaiei ARNm-ului depinde de
333

trsturile sale structurale. Majoritatea secvenelor de cADN sunt de regul suficient de bine exprimate i fr adiia suplimentar a poteniatorilor de translaie. Secvenei care prezint interes trebuie doar sa-i fie asigurat o secven favorabil Kozak pentru sistemele acelulare eucariote i o secven Shine-Dalgarno pentru cele procariote, care reprezint secvenele codonului ATG responsabil de iniierea translaiei (Dingermann i colab., 2004). O alt problem implicat n sinteza proteic acelular o reprezint consumul crescut de energie biochimic oferit de rezervele de ATP i GTP. Att creatin fosfatul ct i creatin kinaza care sunt de obicei folosite pentru regenerarea ATP-ului i GTP-ului n sistemele eucariote acelulare, sau combinaia de PEP i piruvat kinaz, acetil fosfat i acetat kinaza sau un amalgam al ambelor au fost aplicate modelului de sintez bacterian proteic in vitro. Sistemul generator de energie bazat pe acetil fosfat ar putea prezenta avantajul c nivelul de ATP este meninut de dou ori mai mult n prezena PEP. Din moment ce acetat kinaza este prezent n cantitate suficient n extractele bacteriene, n sistemele bazate pe extracte de E.coli adugarea exogen a acesteia nu mai este necesar. Studii referitoare la nivelul de energie biochimic prezent n diferite sisteme acelulare a evideniat un procent crescut al hidrolizei trifosfatului la mono- i difosfai n timpul sintezei proteice att n extractele de germeni de gru ct i n extractul S30 de E.coli. S-a demonstrat c peste 80% din hidroliza ATP-ului i GTP-ului, din sistemele bazate pe extracte de germeni de gru, se produce iniial independent de sinteza proteic i a fost sugerat faptul c fosfatazele acide sunt responsabile de hidroliza nespecific a nucleotid trifosfailor. Studiile ntreprinse cu scopul creterii produciei de proteine n reaciile acelulare, s-au concentrat asupra compoziiei mixturii de reacie, n special asupra compoziiei n aminoacizi [Kim, Swartz, 2000] i asupra metodelor de preparare ale extractului celular. Spre exemplu fosfatazele endogene au fost eliminate folosind extractul S30 preparat din sferoplastele de E.coli [Kang i colab., 2000] sau prin imunodepleia fosfatazei. Tentativele de concentrare ale componentelor extractului prin ultrafiltrare sau prin dializ au fost de asemenea semnalate.
334

10.3.2. Tehnici de exprimare acelular n reaciile acelulare desfurate ntr-un mod discontinuu , condiiile de reacie se modific ca rezultat al consumrii substratului i al acumulrii de produi. Procesul de translaie se oprete de ndat ce orice substrat esenial este epuizat. De fapt, sistemele bacteriene acelulare sunt active doar pentru 10-30 min la 37C. Sistemele bazate pe reticulocite lizate de iepure sau germeni de gru sunt capabile de funcionare pe intervale de pn la o or. Cu toate acestea, sistemele de sintetizare a proteinelor in vitro, sisteme cu modalitate de lucru discontinu funcioneaz optim pentru majoritatea scopurilor analitice, ns durata scurt de via i productivitatea sczut le limiteaz aplicabilitatea n ceea ce privete sinteza unor cantiti prestabilite de proteine. Motivele productivitii sczute sunt reprezentate de degradarea ARNm, depleia nucleotid trifosfailor i acumularea produilor de hidroliz. Timpi prelungii de reacie pentru sistemele de expresie acelulare au fost iniial obinui prin utilizarea unui dispozitiv de translaie cu flux continuu acelular (CFCF) (fig. 10.2A). Ideea de baz este aceea de a asigura continuu aminoacizi, elemente regeneratoare ale energiei (AcP, CrP sau PEP) i NTPs printr-o soluie nutritiv, i de a elimina continuu produii micromoleculari (n special produi obinui prin hidroliza trifosfatului asemenea fosfailor anorganici i nucleozid monofosfaii) printr-un flux activ (forat) al soluiei nutritive printr-o membran de ultrafiltrare (greutatea molecular este redus n limitele a 10-300 kDa). n acest caz, toi produii, inclusiv proteinele sintetizate, sunt permanent eliminate din compartimentele de reacie dac mrimea porilor este suficient de mare (fig. 10.2A). Amestecarea permanent a mixturii de reacie i n anumite contexte aplicarea metodei fluxului ascendent asupra soluiei nutritive sunt aplicate pentru reducerea formrii aglomerrilor membranare. Sistemul CFCF poate funciona peste 20 de ore i are drept rezultat producia proteic de circa 0,1-1 mg proteine/ml de volum de reacie ori mai mult. Modelul pentru acest sistem poate fi reprezentat fie de ARNm, ADN-ul transcripionat de ARN polimeraza bacterian endogen, sau de adugarea bacteriofagul ARN polimeraza sau a ARN-ului auto-replicativ. Folosind sistemul CFCF, au fost
335

sintetizate cu succes proteine cum ar fi, proteina de acoperire bacteriofagul MS2, proteina de acoperire a virusului brom mozaicat, polipeptid calcitonina, globina, dihidrofolat reductaza funcional activ (DHFR), cloramfenicol acetiltransferaza (CAT), interleukinele (IL)-2 i IL-6 .

Fig. 10.2 Ilustrarea reactoarelor acelulare pentru sistemele acelulare de flux continuu (A i B) i schimb continuu (C i D). Ilustrarea schematic a unui reactor CFCF cu flux continuu unde elementele de substrat sunt pompate iar produii sunt eliminai prin filtrarea forat a soluiei nutritive printr-o pomp. (B) Reactorul CFCF cu flux Y, care conine dou membrane de ultrafiltrare cu pori de dimensiuni diferite, care separ produii proteici de reziduurile cu greutate molecular mic. (C) Reactorul CFCF ilustrat cu explicitarea soluiei nutritive (gri deschis) i componentele mixturii de reacie (gri nchis). Compartimentele sunt separate printr-o membran de dializ semipermeabil, care permite schimburile de difuziune ale substratului i ale produilor cu greutate molecular mic precum i retenia componentelor mixturii de reacie. (D) Reactorul coloan pentru fluxul de schimb alctuit din mini-vezicule grupate n coloan, coninnd mixtura de reacie, nconjurate de soluia nutritiv, modificate de fluxul din coloan. Produii cu greutate molecular mic i substratele sunt modificate de difuziunea prin membrana mini-veziculelor. Modificat dup Shirokov i colab. [Shirokov i colab., 2002].

Avantajul major al sistemului CFCF l reprezint extragerea permanent a proteinelor sintetizate din mixtura de reacie , ceea ce se poate solda cu o puritate de 80- 85% a produsului proteic aa cum am demonstrat, permanent prin filtrarea ntr-un sistem bacterian CFCF sintetizator de DHFR i ntr-un sistem CFCF bazat pe extract de germeni de gru, sintetizator de IL-6. Proteina sintetizat difuzeaz din reactorul CFCF ntr-o cantitate considerabil i este destul de diluat. Pentru a reduce efectul

336

de diluie a fost propus folosirea aa numitului reactor cu flux n Y, avnd caracteristic o separare a fluxului. Reactorul cu flux Y (fig. 10.2B) are dou membrane cu pori de dimensiuni diferite. Iniial, produii cu greutate molecular mic sunt transportai printr-o membran cu pori mici, la o rat crescut, iar proteina sintetizat este colectat n consecin i transportat printr-o membran cu pori mari la o rat sczut. Aici, fluxul produsului proteic este controlat de o pomp de separare. Cu toate acestea un numr mare de tentative laborioase de realizare a sistemului CFCF au ntmpinat dificulti n elaborarea i calibrarea acestui sistem complex. Problemele principale sunt reprezentate de degradarea ARN consecutiv folosirii extractelor bacteriene, chiar i n modele de cuplare ale transcripiei cu translaia i eficacitatea sczut a formrii complexului de iniiere, care poate cauza scurgeri i prin urmare pierderea unor componente ale procesului de translaie prin ultrafiltrare sau blocarea membranei de ultrafiltrare. Cu toate acestea, exist o cale alternativ de ndeplinire a sintezei proteice prelungite, care folosete n special difuziunea n loc de pomparea rezervelor de substrat i eliminarea produilor cu greutate molecular mic (fig. 10.2C). Acest sistem care folosete o mixtur de reacie separat de soluia de hrnire prin aplicarea unei membrane de dializ, este denumit sistem acelular de schimb continuu (CECF) ori sistem acelular cu flux semicontinuu (SFCF). Cel mai simplu dispozitiv de asigurare permanent a substratului i de eliminare a produilor cu greutate molecular mic folosind schimbul pasiv cu o mixtur nutritiv, este reprezentat de o pung de dializ. n practic, pungile de dializ, simple, fabricate manual sau dializoarele standard comerciale, cum sunt MicroDialyzer sau DispoDialyzer de la Spectrum se pot utiliza cu succes. Dimensiunea porilor membranelor reactoarelor este de regul situat ntre 10- 50kDa. Cu toate acestea au fost raportate i performane bune ale reactoarelor cu membran cu dimensiuni mai crescute ale porilor. Amestecarea doar a soluiei de hrnire sau att a soluiei de hrnire ct i a mixturii de reacie este necesar pentru asigurarea unor rezerve eficiente de substrat. Folosind aceast abordare s-a observat sinteza a 1,2mg/ml de CAT pe durata a 14 ore din extractul S30 de E.coli. Obinerea acestui produs,
337

cuantifiact prin ELISA, a depit cantitativ producia obinut prin reacia analog discontinu de 10 pn la 12 ori. Apoi s-a reuit sinteza proteinelor CAT i Ras n cantiti de pn la 6mg/ml pe o perioad de 18 ore folosind varianta lor de sistem bacterian CECF, iar Madin i colab. ( 2000) au atins producii de 1-4 mg/ml pentru mai multe proteine active funcional precum DHFR, proteina verde fluorescent (GFP), luciferaza sau ARN replicaza a virusului mozaicul tutunului (TMV). Figura 10.3 descrie sinteza acelular a GFP printr-o metod CECF care utilizeaz un MicroDialyzer. Avantajul sistemului CECF este reprezentat de acumularea produilor sintetizai n mixtura de reacie. Sinteza de proteine i polipeptide fuzionate cu GFP ofer o modalitate direct i nalt demonstrativ de a vizualiza acumularea de produs prin intermediul fluorescenei jumtii GFP a complexului. Sinteza unei proteine HIV, aa numitul antigen Nef, fuzionat cu GFP [Chekulayeva i colab., 2001] i a unei polipeptide antibacteriane Cecropina P1 fuzionat cu GFP [Martemyanov i colab., 2001], au fost raportate ntr-un sistem bacterian de transcripie/translaie CECF T7.

Fig. 10.3 Sinteza acelular a GFT ntr-un sistem bacterian CECF folosind un MicroDialyzer de 100 l. Punctele kinetice arat media a trei reacii iar barele de eroare indic deviaia mediei. Reacia a fost realizat la 30C folosind o mixtur nutritiv de 17 straturi comparativ cu volumul mixturii de reacie i sub urmtoarele condiii de reacie: 0,05% NaN3, 2% fosfoenolglicol, 196 M acid folinic, 2mM 1.4-ditiotreitol, 1,2 mM ATP, 0.8 mM din urmtoarele: CTP, GTP i UTP, 20mM acetil fosfat, 1mM din fiecare aminoacid cu excepia argininei, acidului aspartic, cisteinei , acidului glutamic, metioninei i triptofanului din care au fost utilizai 2mM, 100mM HEPES-KOH (pH 8.0), 2,8mM EDTA, 1X inhibitor complet de proteaz (Roche), 280mM K+, 13mM Mg2+, 40l/ml piruvat kinaza, 500g/ml tARN (E.coli), 3U/l T7-ARN polimeraza, 0.3 U/l RNasin, 35% extract S30 (E.coli) i 15g/ml plasmid. 338

De asemenea cu ajutorul unor reactoare s-a combinat att tehnica de schimb ct i cea de flux. n una dintre aceste versiuni, mixtura de reacie este ncapsulat n minivezicule polizaharide care se pot dispune n coloan, i n care soluia nutritiv este vehiculat prin coloana respectiv (fig. 10.2.D). n acest caz schimbul produssubstrat de-a lungul pereilor veziculelor are loc n cursul fluxului. Versiuni mai sofisticate ale reactorului CECF sunt azi n curs de dezvoltare pentru obinerea unor prototipuri care s corespund cerinelor oamenilor de tiin i biotehnicienilor. Primul reactor CECF comercial a fost lansat de curnd pe pia de ctre Roche Diagnostics. Sistemul CECF Roche ofer o producie mare de proteine de peste 2mg/ml. Alte siteme comerciale au la baz sistemul de cretere discontinuu, n care nutrientul este adugat n totalitate de la nceput, dar i ele au cunoscut recente i reale mbuntiri. Spre exemplu a fost propus un sistem inovator de regenerare a NTP, care s evite acumularea de fosfai anorganici prin adugarea de piruvat oxidaz, care genereaz AcP din piruvat i fosfaii anorganici direct n mixtura de reacie. Ulterior s-a demonstrat c adiia de oxalat, un inhibitor potent al PEP sintetazei, va crete substanial producia de CAT sintetaz prin mbogirea rezervei de ATP cu circa 47% [Kim, Swartz, 2000]. Mai mult Kim i Swartz (2000) au reuit prin cultivri n sistem semidiscontinuu (fed-batch), cu adugarea treptat de nutrient limitator al creterii, n care adugarea coordonat de PEP, magneziu i aminoacizii: arginina, cisteina i triptofan, permite obinerea unei concentraii finale de CAT sintetizat acelular de aproximativ patru ori mai mare dect ntr-un sistem discontinuu (batch). Drept rezultat al acestor mbuntiri a devenit posibil sintetizarea a circa 350g/ml CAT sau 450l/ml de protein recombinant uman trombopoietina printro reacie de tip discontinuu. 10.3.3 Aplicaii specifice ale tehnicii de marcare acelular Tehnicile convenionale de marcare in vivo sunt adesea urmate de producii sczute de proteine datorate creterii ntrziate pe un mediu minimal iar, n cazul marcrii izotopice selective, datorit efectului de amestecare ce reduce drastic
339

eficacitatea i selectivitatea marcrii. Prin urmare un avantaj major al tehnicilor de marcare acelulare l reprezint absena oricrul efect de amestecare sau conversie metabolic a aminoacizilor marcai [Betton i colab., 2002]. ncorporarea selectiv a aminoacizilor n proteine sintetizate acelular destinate cercetrii RMN a fost deja demonstrat n repetate rnduri [Guignard i colab., 2002]. Similar n tehnica revers a marcrii izotopice, majoritatea aminoacizilor sunt simplu sau dublu (N15, C13) marcai, excepie fcnd cteve reziduuri. Figura 10.4 (A) ilustreaz spectografia heteronuclear 2-D H1-N15, cu spectru RMN, utiliznd un singur spectru de corelare (HSQC) pentru evaluarea domeniului C-terminal de legare a ADN al factorului reglator transcripional RcsB (cRcsB), generat acelular i marcat izotopic reversibil, care a fost uniform marcat cu N15 cu excepia resturilor de asparagin (N) i glutamin (Q). cRcsB marcat uniform cu N15 i exprimat in vivo este reprezentat n fig. 10.4(B). Spectrul 2-D H1-N15 HSQC al proteinei marcate cRcsB sintetizate in vitro este n concordan cu cel al proteinei sintetizate in vivo, uniform marcate (excepie fcnd vrfurile de asparagin i glutamin care lipsesc n sistemul in vitro). Exprimarea n sistem acelular este extrem de potrivit pentru generarea de mostre de proteine marcate doar la nivelul unor resturi distincte de aminoacizi. Marcarea unor situsuri specifice este extrem de util pentru simplificarea procedurilor de observare i de distribuire a rezonanei aminoacizilor a unor resturi prestabilite de aminoacizi care prezint un interes particular, i i poate de asemenea dovedi utilitatea n analiza structurilor locale ale macroproteinelor i a interaciunilor protein-protein. ncorporarea unui reziduu specific, marcat C13 la nivelul unui codon stop prin translatarea secvenei modificate ntr-un sistem in vitro suplimentat cu supresorul ncrcat ARNt a permis detectarea reziduurilor marcate prin spectroscopie RMN n urma denaturrii i reasamblrii proteice. Cantiti de ordinul miligramelor de protein marcat izotop specific la nivelul unui situs pot fi obinute ntr-un sistem acelular implicnd strategia de supresie a unei secvene specifice de codon stop, secvena UAG. Supresorul E.coli al secvenei codonice, ARNt, poate fi preparat prin transcripie in vitro cu T7 ARN polimeraza i ulterior prin adugare de
340

aminoacil, prin introducerea amino ARS-azei E.coli, potrivit purificat, i a aminoacidului marcat specific. Codonul specific pentru restul de aminoacid selectat din protein a fost anterior modificat ntr-un codon UAG (codon stop) prin tehnici standard.

Fig. 10.4 Comparaie ntre spectrul 2-D HSQC H1-N15 al generrilor in vitro i in vivo ale domeniului C-terminal purificat al factorului bacterian reglator transcripional RcsB (cRcsB) folosind un spectometru Bruker DRX-800 MHz RMN cu o crioprob. (A) Marcarea acelular cu izotop N15 a cRcsB sintetizat ntr-un sistem CECF optimizat, utiliznd un DispoDialyzer. Toi aminoacizii cu excepia asparaginei (N) i glutaminei (Q) au fost marcai cu N15. Cum era de ateptat, resturile de N i Q (cercuri) sunt absente n spectrul 2-D HSQC H1-N15.(B) cRcsB exprimat in vivo uniform marcat izotopic cu N15. Acest spectru este n bun dependen cu cRcsB marcat izotopic generat acelular, iar resturile de N i Q pot fi uor identificate. (dup Dingermann i colab., 2004). 341

Marcarea segmentar in vivo este limitat de cerinele specifice cum ar fi, organizarea proteinei int n domenii, prezena reziduurilor specifice i problemelor de asamblare. Pavlov i colab., (1997) au pus la punct o tehnic acelular bazat pe translaia in vitro a mARNs matrix-cuplate, care n principal este lipsit de orice cerin conformaional sau la nivelul secvenelor. Dimensiunea regiunii marcate este controlat prin folosirea codonilor fr a exista o limit superioar intrinsec a dimensiunii proteinelor care pot fi marcate izotopic la nivelul regiunii selectate. Aceast metod are la baz folosirea mixturilor de translaie lipsite fie de un aminoacid i/sau de ARNt propriu i/sau de amino ARS-aza n trei etape. Folosirea de copii ARN cuplate columnar face ca mixtura de reacie s fie uor schimbabil. Iniial regiunea nemarcat N-terminal, cu ajutorul unei mixturi de reacie nemarcate, este sintetizat pn la primul codon fr existena unui amino acil-ARNt potrivit n extract. La acest nivel datorit pauzei ribozomale mixtura de translaie poate fi nlocuit cu o alta coninnd aminoacizi marcai izotopic, aceasta din urm deficitar n alt aminoacid, ARNt sau amino ARS-az. Translaia se reia, marcnd n consecin regiunea pn ce ribozomii ntlnesc urmtorul codon lipsit de ARNt corespunztor. n ultima etap, poriunea C-terminal este sintetizat far s fie marcat iar proteina este eliberat de ribozom. Cu toate acestea tehnica a avut drept rezultat producii sczute de proteine, putnd n cel mai bun caz, produce determinarea stoichiometriei proteice pentru ARNm imobilizat. Un avantaj, destul de promitor al marcrii izotopice acelulare l reprezint posibilitatea efecturii msurtorilor RMN in situ aa cum ne descriu Guignard i colab.,(2002). Acetia au prezentat analize RMN ale proteinelor sintetizate in vitro fr a folosi purificri cromatografice i cu o manevrare minim a probelor utiliznd un reactor CECF optimizat la care s-a adugat sensibilitatea unei crioprobe. Aa cum era de ateptat, ei nu au observat nici o urm de trecere pentru nici un aminoacid marcat N15 i doar proteina int a fost mbogit cu resturile izotop marcate. Ei sugereaz o nou posibilitate de analiz proteic rapid i economic aplicabil pe scar larg n proteomic, n care proteinele selectiv marcate pot fi expimate n 0,5 ml de mediu de reacie, utiliznd cantiti reduse de aminoacizi marcai i pretabil
342

analizei RMN. Toate etapele de la exprimare pn la efectuarea spectrului RMN complet au fost finalizate n mai puin de 24 de ore. Datorit avantajelor excepionale ale sintezei proteice acelulare, marcarea izotopic poate fi obinut i pentru proteine care sunt n mod normal dificil de exprimat. Utiliznd tehnici de marcare acelulare poate deveni posibil sintetizarea unor proteine marcate izotopic care sunt toxice, tehnici ce necesit cofactori sau chaperone pentru adoptarea unei conformaii active, sau chiar a proteinelor membranare. Marcarea subunitilor de oligomeri, cercetrile mai amnunite asupra formrii punilor disulfidice sau oxidarea proteic sunt tehnici care probabil vor deveni posibile n viitorul apropiat.

343

CAPITOLUL 11 UTILIZAREA FRAGMENTELOR DE ANTICORPI CA MEDIATORI AI CRISTALIZRII PROTEINELOR MEMBRANARE N VEDEREA DESCOPERII DE NOI MEDICAMENTE 11.1. Introducere
O dat cu decodarea genomului uman i dup ce au devenit disponibile din ce n ce mai multe genomuri ale organismelor patogene, cum ar fi Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium falciparum, au crescut speranele legate de stimularea descoperirii de noi medicamente. Deoarece majoritatea genelor acioneaz la nivelul proteinelor, acum se fac eforturi uriae n proiecte de genomic structural pentru accelerarea determinrilor experimentale ale structurii proteinelor prin intermediul cristalografiei cu raze-X i rezonanei magnetice nucleare. n descoperirea medicamentelor sunt utilizate structuri intens disociate: (1) prin modelarea raional a medicamentelor; (2) prin analiza complexelor structurale int ligand pentru validarea variantelor reuite sau pentru mbuntirea raional a liganzilor care au fost obinui prin screening-ul sistematic al bncilor de compui rezultai prin procedee chimice combinatoriale; sau (3) prin screening-ul liganzilor in-silico ce permite reducerea costurilor experimentelor i accelereaz descoperirile. n final, dar nu n ultimul rnd, structurile intens disociate sunt sursa unor informaii eseniale pentru nelegerea mecanismelor moleculare ale proteinelor ce acionez n celule ntr-o mare varietate de structuri specifice care constituie baza funciilor lor foarte diverse. Cea mai utilizat metod pentru determinarea structurii atomice a proteinelor cu masa molecular mai mare de 30kDa (inclusiv proteine membranare) este
344

cristalografia cu raze-X, pentru care sunt necesare cristale bine coordonate tridimensional (3-D) provenite din soluii proteice. n ciuda interesului foarte mare pentru structura proteinelor membranare (inte moleculare pentru majoritatea medicamentelor), dup 1985 cnd a fost prezentat prima structur a unei proteine membranare a centrului reactiv de fotosintez la o bacterie s-au determinat pn acum structurile integrale pentru mai puin de 50 de proteine membranare. Moleculele detergenilor sunt amfofile, fiind alctuite dintr-o extremitate (un capt) polarizat sau ncrcat electric i o coad hidrofob. La concentraii mici, detergenii sunt prezeni n soluii apoase sub form de monomeri i formeaz un monostrat la interfaa lichid aer. Peste o anumit concentraie a detergentului, denumit concentraie micelar critic (CMC), se formeaz micelii prin inter-asocieri. n alctuirea acestor agregate sferice, cozile hidrofobe ale moleculelor de detergeni sunt orientate ctre interiorul miceliilor iar gruprile de la extremitatea hidrofil se orienteaz ctre exterior. Proteinele membranare sunt solubile n soluii micelare de detergeni i formeaz complexe protein detergent. Un miceliu detergent acoper suprafaa hidrofob a proteinei membranare ca un bru, n acest caz, gruprile de la extremitile polarizate orientndu-se ctre faza apoas (fig. 11.1) Pornind de la complexele detergent protein, proteinele membranare pot fi reconstituite ntr-un bistrat fosfolipidic prin ndeprtarea detergentului i adugarea concomitent a fosfolipidelor prin dializ sau prin adsorbie n faz solid. n anumite condiii determinate empiric proteinele respective formeaz structuri bine ordonate, bidimensionale (2-D), aa numitele cristale 2-D care pot fi utilizate pentru determinarea structurii prin microscopie electronic [Dingermann i colab.,2004]. Astfel, au fost obinute structurile ctorva proteine membranare la rezoluie medie (n jur de 5 10A). Determinri structurale la rezoluii apropiate de cele atomice prin microscopie electronic sunt posibile dar sunt anevoioase. ncercrile experimentale de cristalizare 2-D necesit cantiti mai mici de proteine iar obinerea cristalelor prin aceast metod ar putea fi mai rapid.

345

Totui, atunci cnd pot fi obinute cristale 3-D de bun calitate, determinarea rapid a structurii la rezoluie mare prin cristalografie cu raze X este mult mai eficient. Caracterul amfifil al suprafeei proteinelor membranare permite formarea cristalelor 3-D n dou moduri (vezi fig. 11.1).

Fig. 11.1. Tipurile elementare de cristale 3-D ale proteinelor membranare. Cristalele tip I sunt constituite din straturi ordonate de cristale 2-D care sunt prezente n bistrat. Suprafeele hidrofobe ale proteinelor membranare sunt acoperite de un miceliu n conformaie solubilizat prin detergent. Aceste complexe detergent-protein membranar formeaz aa-numitele cristale 3-D tip II. Contactele de legtur stabile din cristale se formeaz ntre suprafeele hidrofile ale proteinei. ntr-o form modificat a tipului II (tip IIb), fragmente de anticorp legate strns i specific adaug un domeniu hidrofil complexului. Aceste expansiuni ale suprafeei confer noi situsuri pentru contacte de legtur i spaiu pentru miceliile detergent.

Cristalele de tip I sunt n principiu straturi suprapuse ordonat de cristale 2-D ce conin moleculele proteice ordonate ntre aceste planuri. Cristalele de tip II se pot forma prin integrarea proteinelor membranare n micelii de detergeni ntr-un mod asemntor proteinelor solubile. n acest din urm caz asamblarea cristalelor se face prin intermediul suprafeelor polare ale acelor domenii ale proteinelor care proemin
346

din miceliul detergent. n acest caz condiiile de cristalizare sunt foarte similare acelora pentru proteinele solubile. Este posibil i formarea cristalelor mixte tip I i II, dei cele mai multe cristale ale proteinelor membranare aparin tipului II. Evident, miceliile de detergent necesit spaiu n matricea cristalelor. Dei forele de atracie dintre micelii permit stabilizarea structurii cristaline, acestea nu pot contribui la constituirea contactelor de legtur rigide din cadrul structurii cristaline. Astfel, sunt dificil de cristalizat n mod special proteine cu domenii hidrofile mici, cum ar fi multe proteine transportoare sau proteine canal care sunt alctuite n principal din poriuni transmembranare helicoidale i bucle foarte scurte expuse mediului solvent. O metod menit s creasc probabilitatea de a obine cristale de tip II bine ordonate este creterea suprafeei polare a proteinei membranare prin ataarea de domenii polare cu fragmente de anticorpi cu legare specific. Aceast metod dezvoltat de Michel i colab.,(2001) a fost pentru prima dat aplicat cu succes pentru cristalizarea i determinarea structurii Citocrom C oxidazei (COX) din Paracoccus denitrificans legat cu un Fv (fragment variabil) de anticorp. Pe lng cerinele specifice pe care trebuie s le ndeplineasc un detergent pentru cristalizarea 3D a proteinelor membranare, a doua problem n cadrul analizei structurale este procurarea unor cantiti suficiente de proteine. Cristalizare 3D presupune consumul a cel puin 10 mg de protein pur per etap de examinare. Aproape toate structurile proteinelor de membran care au fost determinate aparin proteinelor ce se gsesc n cantiti mari n mediul lor natural, cum ar fi proteinele lanului respirator sau de membrane fotosintetice. Totui, majoritatea proteinelor membranare cum ar fi receptorii i proteinele transportoare sunt prezente intracelular n concentraii mici. Prin folosirea sistemelor de producie bazate pe recombinare, inseria proteinei ntr-o membran limiteaz eficiena produciei, cu excepia cazurilor n care decidem producerea prin intermediul formrii corpului de incluzie i repliere. Ultima metod a fost aplicat cu mult succes pentru proteine membranare barrel foarte stabile, din membranele bacteriene externe. S-au realizat progrese nsemnate n aplicarea sistemelor de supraexpresie pentru proteine membranare cu origine bacterian, ca de exemplu pentru determinarea structurii canalului ionic
347

mecano-senzitiv din M. Tuberculosys produs n Escherichia Coli. Este foarte important dezvoltarea n continuare a sistemelor de supraexpresie la nivel nalt pentru producerea de proteine membranare recombinate din eucariote pentru explorarea cu succes a structurii acestora. n plus, tehnicile de recombinare au avantajul c proteinele pot fi proiectate s fie sintetizate cu terminaii de afinitate ce permit o purificare facil. De asemenea, secvena poate s fie modificat pentru a conferi o surs proteic omogen ca de exemplu prin ndeprtarea situsurilor de glicozilare. Mai mult, cu secvenele genomice disponibile n numr din ce n ce mai mare, sistemul de recombinare permite o nou abordare: evaluarea expresiei i purificarea proteinelor omoloage din cteva organisme prin testarea proprietilor de cristalizare a acestora. Pentru determinarea cu succes a structurii canalului mecanosenzitiv MscL au fost supuse unor experimente de cristalizare omologi provenii de la 9 specii procariote. Proteinele omoloage provenite de la diferite specii au nu numai proprieti eseniale diferite cum ar fi stabilitatea proteinei sau capacitatea de producie, dar pot prezenta i mici variaii ale proprietilor de suprafa ce pot fi responsabile pentru reuita cristalizrii, deoarece contactele de legtur n cristal sunt mediate prin suprafaa proteinei. n acest capitol, ne vom concentra asupra descrierii metodei de cristalizare a proteinelor membranare mediat prin fragmente de anticorpi, aceast abordare promitoare fiind deja folosit cu succes pentru determinarea structurii a 5 complexe protein membranar anticorp.

11.2. Cristalizarea proteinelor membranare mediat prin fragmente de anticorp

11.2.1. Consideraii generale Dup aplicarea cu succes a cristalizrii mediate prin fragmente de anticorp pentru COX (cicloxigenaza)bacterian, metoda a fost utilizat pentru determinarea structurilor ctorva proteine membranare, ce vor fi prezentate mai jos. COX din P. denitrificans a fost cristalizat sub form de complex cu un fragment Fv de anticorp recombinat. A fost determinat structura acestui complex la
348

o rezoluie de 2,8, compus din toate cele patru subuniti ale COX i cele dou polipeptide ale fragmentului Fv. Fragmentele Fv sunt implicate n toate contactele de legtur din cristal. Totui, lipsa interaciunilor directe protein protein pe axa-c determin anizotropie n difracie i dificulti de reproducere a cristalelor. S-au obinut cristale mai bine ordonate printr-o sintez a COX ce conine numai cele dou subuniti catalitice eseniale I i II. Cristalele produc difracia razelor X la o rezoluie mai mic de 2,5. Noul mod de asamblare al cristalului implic interaciunea direct dintre suprafeele citoplasmatic i periplasmatic cu moleculele COX adiacente. Toate celelalte contacte sunt mediate exclusiv prin intermediul fragmentului Fv. n toate aceste structuri, complexul COX-Fragment Fv a fost purificat prin cromatografie indirect de imunoafinitate (a se vedea mai jos). Complexul este format prin combinarea membranelor solubilizate cu periplasm ce conine fragment Fv i apoi este purificat ntr-o singur etap prin cromatografie de afinitate cu streptavidin, folosindu-se secvena terminal strep (strep-tag) fuzionat la fragmentul Fv. A doua protein membranar cristalizat prin aceast tehnic este complexul citocrom bc1 (QCR) din drojdie, o component fundamental a lanului respirator mitocondrial. Ca i n cazul COX bacteriene, complexul a fost cristalizat cu un fragment Fv recombinat. Acesta din urm se leag la domeniul extrinsec al subunitii catalitice Rip1p, aa numita protein Rieske. Anticorpul monoclonal parental 18E11 a fost obinut prin tehnici standard de hibridom prin imunizarea oarecelui cu QCR din drojdie solubilizat cu detergent i purificat . Anticorpul nu recunoate proteina n Western Immunoblot dup separarea complexului prin electroforez n gel poliacril amid-duodecil sulfat sodic (SDSPAGE), dar se leag de un epitop discontinuu nativ. Dei acest complex format din mai multe subuniti (230kDa per monomer) are un domeniu hidrofil mare ce ptrunde n spaiul matriceal (aproximativ 86kDa) i o poriune hidrofil destul de mare prezent n spaiul intermembranar (aproximativ 46kDa), cristale de QCR din drojdie adecvate pentru analiza n raze-X au fost obinute doar n complex cu fragment Fv. Structura complexului a fost determinat la rezoluie de 2,3.
349

Fragmentele Fv legate au determinat o asamblare spaial rarefiat a cristalului (grup spaial C2) cu un coninut ridicat de solvent de 74%, fcnd loc miceliilor detergent de mari dimensiuni ale detergentului undecilmaltopiranozid (fig. 11.2). Principalele contacte de legtur n cristal sunt mediate prin fragmente de anticorp. Acelai mod de lucru a fost utilizat i pentru cristalizarea QCR din drojdie cu legtura substratului su citocromul c. Condiiile de cristalizare diferite au determinat alterarea reelei cristaline (P21). Din nou, fragmentele Fv au avut contribuia major n interaciunile dintre moleculele adiacente. Acestea nu au stnjenit nici legarea citocromului c i nici nu au interferat cu activitatea QCR (Dingermann i colab.,2004).

Fig. 11.2 Fragmentele de anticorp sunt eseniale pentru cristalizarea citocromului bc1 din drojdie, contactele de legtur ale cristalului (sgeile albe) din co-complexul Fv18E11 complex citocrom bc1 din drojdie fiind mediate de fragmentul Fv (ncercuit). Fragmentul se leag de domeniul extrinsec al subunitii Rip1p i ofer spaii ample pentru miceliile detergent n care este mpachetat poriunea transmembranar a complexului (linii punctate), prezentat schematic n detaliu.

350

Cristalizarea i determinarea structurii canalelor de potasiu KcsA a fost realizat prin legarea unui fragment Fab (fragment antibody binding). Anticorpul monoclonal utilizat a fost obinut prin tehnologia hibridomului iar clonele au fost selectate pentru recunoaterea formelor native homotetramerice, nu i a celor monomerice ale canalului. Cristalizarea s-a efectuat cu fragmente Fab proteolitice obinute prin proteoliz cu papain i purificate prin cromatografie prin schimb anionic . Cristalele complex canal fragment Fab au permis determinarea elegant a structurii. Fazele au fost determinate prin nlocuirea molecular folosind o structur cunoscut a altui fragment Fab, plierea imunoglobulinei pstrndu-se foarte bine. n plus, fragmentul Fab de aproximativ 54 kDa reprezint cea mai mare component a complexului, comparativ cu subunitatea canal de aproximativ 11kDa. Cristalele complexului au prezentat o difracie substanial mbuntit (sub 2) fa de precedentele forme ale cristalelor canalelor K+ KcsA (rezoluie 3,2). Fragmentul Fab formeaz legturi la nivelul suprafeei extracelulare a subunitii canalului. Toate contactele de legtur din cristal se formeaz ntre fragmentele Fab, lsnd un spaiu central relativ mare pentru molecula canalului cu miceliul detergent, decilmaltozida. Dimensiunea unui fragment Fab pare a fi foarte potrivit pentru cristalizarea canalelor i altor proteine membranare ale cror domenii ce ies n afara bistratului lipidic nu au o dimensiune prea mare. 11.2.2. Generarea anticorpilor adecvai pentru co-cristalizare Pn n prezent, fragmentele de anticorpi folosite cu succes n co-cristalizarea proteinelor membranare erau derivate din anticorpii monoclonali obinui prin clasica tehnologie a hibridomului. Pentru a se realiza stabilitatea complexului necesar pentru cristalizare, anticorpii parentali precum i derivaii acestora trebuie: (1) s lege antigenul n conformaia nativ a acestuia, (2) s aib o afinitate de legare mare pentru a permite formarea complexelor stoichiomerice stabile i (3) s formeze un complex rigid cu antigenul lor nativ. Sunt de preferat anticorpi cu afinitate de legare pentru un epitop discontinuu i nu unul linear. Adesea, ntr-un rspuns imun sunt recunoscute ca epitopi capetele N- i C- terminale ale polipeptidelor precum i
351

buclele expuse. Totui, deseori aceste peptide sunt flexibile, iar legarea unei molecule de anticorp va introduce foarte probabil un domeniu mobil ce va fi nefavorabil cristalizrii. Specificitatea pentru un epitop discontinuu poate fi uor verificat prin Western imunoblot dup separarea proteinei denaturate prin SDS-PAGE, n care anticorpul nu ar trebui s se lege de polipeptidul linear. 11.2.2.1. Imunizarea Una din primele etape importante pentru obinerea cu succes a unor anumite clone de hibridom este imunizarea animalelor cu antigen i obinerea unui titru suficient de anticorp. Proteinele membranare solubilizate prin detergent i purificate au fost utilizate cu succes ca i antigene pentru obinerea liganzilor de nalt afinitate pentru membranare native, ca de exemplu pentru obinerea anticorpului monoclonal 18E11 specific QCR din drojdie sau diveri anticorpi monoclonali specifici pentru proteina schimbtoare de ioni Na+/H+ (sistem antiport) NhaA. n general, protocoalele de imunizare pe termen lung sunt folositoare pentru obinerea multor liganzi de nalt afinitate. ntr-un protocol standard aplicat pentru obinerea anticorpilor ndreptai mpotriva QCR din drojdie i NhaA, oareci BALB/c femele n vrst de 10 sptmni au fost imunizai prin injecii intraperitoneale cu protein nalt purificat, solubilizat n detergent [100g protein n 50% (v/v) adjuvant (ABM2; Pan Biotech, Aidenbach, Germany) ntr-un volum total de 250l]. Imunizarea iniial a fost urmat de 4 injecii cu suspensie proteic la interval de 4 sptmni[50g protein n 50% (v/v) adjuvant (ABM1; Pan Biotech) ntr-un volum total de 250l]. Pentru administrarea final, ultima injecie a fost repetat trei zile consecutiv iar n ziua urmtoare oareci au fost sacrificai pentru recoltarea splinei. Sa recoltat plasm sanguin de la oareci naintea imunizrii i la 10 zile dup fiecare injecie. Dup a treia imunizare, s-au obinut semnale clar pozitive pn la o diluie a serului de 105 ntr-un test standard ELISA, folosind NhaA purificat drept antigen. Evident, un asemenea regim de imunizare la mamifere mici pentru proteine membranare nalt omologe (derivate umane, de murine, de obolan, de maimue) este mai puin probabil s aib ca rezultat producerea anticorpilor datorit mecanismelor
352

de self-toleran. Totui, exist cteva modaliti de stimulare a rspunsului imun cum ar fi imunizarea genetic sau simpla utilizare a adjuvanilor pe baz de nanoparticule lipidice mbuntite. 11.2.2.2. Selecia anticorpilor Anticorpii corespunztori co-cristalizrii proteinelor membranare trebuie s recunoasc antigenul respectiv ca pe un complex. Totui, se impun anumite cerine pentru selecia anticorpilor monoclonali de conformaie specific. Tipul i concentraia detergentului este foarte important pentru meninerea proteinei n conformaia sa nativ. Unii detergeni pot preveni legarea proteinelor de suprafeele de plastic i polistiren folosite n mod curent ca suporturi pentru testul ELISA. n plus, adsorbia pe faza solid poate determina denaturarea parial a proteinei. Cnd s-a realizat obinerea anticorpilor monoclonali mpotriva QCR din drojdie, s-au obinut 35 de clone ce recunosc proteina denaturat n Western-blot i a fost selectat numai o clon ce recunoate specific proteina nativ . Pentru aceasta s-a aplicat un test ELISA standard n care complexul solubilizat n detergent a fost ataat matricei de polistiren. Pentru mbuntirea randamentului liganzilor nativi pentru proteinele membranare a fost conceput o strategie uoar i sigur, aa numita his-tag ELISA, pentru imobilizarea corespunztoare i prezentarea antigenului nativ reprezentat de proteinele membranare recombinate his-tagged (cu o secven terminal ataat polihistidinic), demnstrat pentru sistemul antiport NhaA. Proteina este imobilizat pe plci ELISA acoperite cu Ni2+-NTA n aceleai condiii tampon ca i pentru purificarea antiportului prin cromatografie de afinitate metalic. n aceste condiii, n prezena detergentului duodecil--D-maltopiranozid, proteina este pliat corespunztor i complet funcional i se poate face acum trierea anticorpilor pe baza acesteia. Pornind de la peste 2000 de clone hibridom, s-au putut izola prin histag ELISA 6 anticorpi monoclonali tip IgG. Toi aceti anticorpi obinui sunt sensibili conformaional i leag antiportul solubilizat n detergent precum i forma sa membranar. Doar unul din acetia este pozitiv n Western-blot dup separarea SDSPAGE a proteinei. Acest anticorp (1F6) se leag la un epitop linear expus la
353

suprafa localizat la nivelul captului N-terminal al enzimei. Interesant, anticorpul monoclonal 1F6 leag NhaA ntr-un mod dependent de pH ce reflect dependena de pH a activrii proteinei i modificrile conformaionale asociate demonstrate prin digestia cu tripsin. Acest anticorp poate fi folosit pentru purificarea de imunoafinitate a transportorului din extracte membranare neprelucrate prin legarea NhaA de anticorpul monoclonal 1F6 imobilizat i eluia acestuia specific printr-un schimb de pH. His-tag ELISA este o metod important ce combin sensibilitatea, specificitatea i raportul crescut semnal/zgomot al unui test de imunoadsorbie cu chimia proteinelor recombinate. Poate fi adaptat uor la toate proteinele recombinate purificate cu ajutorul unui his-tag. Din cunotinele noastre este primul exemplu de selecie a anticorpilor mpotriva epitopilor conformaionali folosind o protein membranar solubilizat prin detergent, respectiv cea mai comun form de cretere a cristalelor 3-D tip II. Au fost raportate i metode alternative de prezentare a proteinelor membranare n conformaiile lor native, cum ar fi selecia cu probe reconstituite prin lipide, fraciuni membranare native mbogite sau celule intacte. Etapa cheie a seleciei anticorpilor adecvai din fuziuni hibridom sau bnci de anticorpi recombinai este reprezentat de screening-ul intit. Cercetrile adaptate specific permit selecia anticorpilor specifici pentru conformaia proteic definit. Anticorpii selectai corect pot ajuta la captarea unei proteine flexibile ntr-o conformaie fix. Co-cristalizarea cu fragmente de anticorpi a facilitat determinarea structurii domeniului flexibil gp120. 11.2.2.3 Fragmentele de anticorpi Anticorpii nativi nu sunt corespunztori co-cristalizrii. Acetia sunt flexibili n regiunea de legtur dintre domeniile variabile i cele constante, iar modul de legare bivalent este n cele mai multe cazuri indezirabil. Fragmentele de anticorpi monovalente pot fi obinute prin clivajul proteolitic al ntregului anticorp rezultnd dou fragmente Fab pentru fiecare molecul de anticorp. Obinerea unei cantiti suficiente de material de start pentru anticorpul monoclonal este realizat fie prin producerea ascitei fie prin culturi celulare cu linii celulare de hibridom de murine.
354

Apoi anticorpii monoclonali sunt purificai prin cromatografie de afinitate cu Proteina A. n etapa urmtoare, fragmentele Fab sunt obinute n mod obinuit prin proteoliza cu papain care cliveaz specific n regiunea mobil/balama. Fragmentele Fab pot fi purificate prin depleia proteinei A a domeniului de clivaj constant al anticorpului, urmat de excluderea dimensional sau cromatografia schimbtoare de ioni. Fragmentele Fab sunt relativ uor de obinut prin proteoliz, dar trebuie acordat atenie pentru producerea omogen a fragmentelor, adecvate cristalizrii. Pri reziduale ale ligandului flexibil i n unele cazuri glicozilarea pot mpiedica cristalizarea. n ciuda acestor probleme, au fost cristalizate un numr mare din acele fragmente Fab singure sau n complexe cu haptena respectiv sau cu antigenul respectiv, inclusiv cu o protein membranar (canalul potasic KcsA). Pe viitor, o alternativ promitoare la obinerea anticorpilor monoclonali de la oareci va fi adaptarea tehnologiilor phage-display sau ribosome-display la selecia in vitro a liganzilor pentru proteinele membranare. Pn acum, sunt rare exemplele de selecie reuit a anticorpilor specifici pentru proteinele membranare prin intermediul phage-display a bncilor non-imune. Anticipm faptul c alte strategii vor fi probabil mai adecvate pentru stabilirea screening-ului anticorpilor acestor inte prin phagedisplay, i anume: (1) punerea n uz a unor bnci de anticorpi mult mai diverse (peste 1010 componente diferite), (2) utilizarea unui helper fagic ce permite prezentarea multivalent a anticorpilor i (3) screening-ul liganzilor dup o singur etap de biopanning urmat de maturarea de afinitate in vitro. Clonarea fragmentelor de anticorpi. Cel mai mic domeniu de legare pentru antigen a unui anticorp, respectiv fragmentul Fv, este constituit din domeniul variabil al lanului greu i a celui uor, VH, respectiv VL. Fragmentele Fv nu pot fi obinute prin proteoliz, necesitnd recombinarea pentru producerea lor. Pentru acest scop, genele ce codific VH i VL trebuie s fie clonate i exprimate pornind de la linii celulare de hibridom. Aici este descris clonarea fragmentelor Fv prin reacia de polimerizare n lan revers-transcriptaza (RT-PCR) (fig. 11.3). ARNm sau ARN total este izolat din linii celulare de hibridom de murine ce produc anticorpul de interes. n etapa urmtoare, sinteza ADNc poate fi efectuat simplu prin utilizarea oligo(dT) ca
355

i primer. Pentru a amplifica genele VH i VL, sunt folosii primeri degenerai care se potrivesc captului terminal 5' al cadrului 1 i captului 3' al cadrului 4, corespunztor capetelor N-terminale ale lanului greu i uor ale moleculei de anticorp, respectiv capetelor C-terminale ale domeniilor variabile. Secvena regiunilor cadru este foarte bine conservat, fiind elaborat un set de perechi de primeri pentru amplificarea specific a genelor ce codific lanul V, subclasele 1, 2, 3 i 5 ale lanului Vk, subclasele 4 i 6 ale lanului Vk, i VH. Aceti primeri conin situsuri de restricie unice, care permit inseria produsului PCR n plasmida pASK68 care este utilizat pentru producerea fragmentului Fv n periplasma E. coli (a se vedea mai jos).

Fig. 11.3. Reprezentare schematic a strategiei pentru clonarea i expresia fragmentelor Fv din linii celulare hibridom monoclonale prin RT-PCR. Genele care codific pentru domeniile variabile ale lanurilor grele i uoare (VH i respectiv VL) sunt inserate n plasmida bicistronic pASK68 pentru expresie periplasmatic n E. coli. Secvenele semnal OmpA i PhoA sunt utilizate pentru intirea polipeptidelor la periplasm. Pentru purificare este ataat un strep-tag la lanul greu; fuziunea myc-tag permite detecia lanului uor cu anticorpul monoclonal 9E10. 356

Digestia H RN-azei antisens-direcionat poate fi utilizat pentru inhibarea amplificrii produilor de transcripie ARNm nefuncionali introdui n liniile celulare de hibridom n cursul fuziunii cu linia celular de mielom nonsecretoare. Aceast abordare rapid i robust a fost folosit pentru clonarea ctorva fragmente de anticorpi, inclusiv fragmentele Fv ale anticorpului monoclonal 7E2 specific pentru COX a P. denitrificans, anticorpul monoclonal 18E11 specific pentru QCR din drojdie i anticorpii monoclonali 2C5 i 5H4 specifici pentru antiporter-ul (proteina transportoare mpotriva gradientului) NhaA din E. coli. Totui, n unele cazuri prin aceast metod nu s-a reuit amplificarea genelor dorite. Din acest motiv, a fost conceput un nou set de primeri care ia n considerare secvenele diferite ale subgrupelor, aa cum sunt listate n banca de date Kabat (fig. 11.4). Pentru fiecare subgrup de anticorpi a fost realizat un anumit forward primer. Poziia backward-ului primer a fost modificat n aval ctre regiunea constant cea mai bine conservat. Mai mult, situsurile de restricie au fost omise pentru o mai bun acuratee. Produii PCR au fost apoi clonai fie prin legarea TA, fie la capetele terminale ale vectorilor de secveniere. Dup confirmarea secvenei anticorpului, s-au introdus prin PCR situsuri de restricie pentru potrivirea la vectorul de expresie dorit. O strategie similar, bazat pe primeri degenerai, poate fi utilizat pentru clonarea fragmentelor Fab. Mai mult, pot fi produse fragmente Fab hibride prin inseria genelor VH i VL ntr-un vector care conine deja domenii constante ale unei molecule de anticorp. Au fost publicate i strategii alternative bazate pe PCR i seturi de primeri, incluznd clonarea prin amplificarea rapid a capetelor terminale ale ADNc (RACE). Adesea, sunt legate covalent lanuri grele i uoare prin interpunerea unui peptid de legtur, genernd aa numitele fragmente Fv sc (single-chain, lan unic) sau prin conectarea lanurilor prin intermediul unei puni disulfidice (fragmente dsFv). Dei aceste msuri sunt menite s stabilizeze fragmentele recombinate, n anumite cazuri pot afecta n mod negativ proprietile de legare ale fragmentului. Fragmentele Fv7E2 i Fv18E11, care au fost utilizate la cristalizarea COX i QCR nu conin un ligand sau o punte disulfidic adiional ( vezi fig. 11.4).
357

Fig.11.4 (A). Seturile de primeri folosii pentru amplificarea genelor ce codific VH i VL ale anticorpilor monoclonali murini. (A). Primerii degenerai cu situsuri de restricie unice au fost elaborai pentru clonarea genelor compatibile pentru inseria n plasmida pASK68 folosit pentru expresia periplasmatic n E. coli.

358

Fig.11.4 (B) Amplificarea genelor VH i VL este mbuntit considerabil folosind setul primer specific de subgrup. Folosind acelai model ADNc, fiecare combinaie de primeri este testat n paralel la diferite temperaturi n majoritatea cazurilor gena corect este amplificat printro anumit combinaie primer. 359

Fig.11.4. (C) Secvenele corespunztoare de aminoacizi ale anticorpilor de diferite subgrupuri pentru partea complementar a setului primer II. Resturile VH i VL sunt numerotate n conformitate cu Kabat i colab.(1991).

Producerea fragmentelor de anticorpi. Pentru producerea fragmentelor de anticorpi recombinai, cum ar fi pentru E. coli, Pichia pastoris sau celule de la mamifere, s-a folosit o varietate de sisteme de expresie. Genele ce codific domeniile variabile ale lanurilor uoare i grele sunt inserate n operonul digistronic al plasminei pASK68 permind expresia periplasmatic n E. coli sub controlul promotorului inductibil lac. Fuziunea N-terminal a secvenelor semnal OmpA i PhoA faciliteaz secreia lanurilor grele i uoare la nivelul periplasmei. O peptidligand a streptavidinei (strep-tag) este ataat la nivelul captului C-terminal al domeniului VH pentru purificare prin cromatografie de afinitate cu streptavidin, iar un myc-tag (recunoscut de anticorpul monoclonal 9E10) este prezent la nivelul captului C-terminal al domeniului VL fiind folosit pentru detecia fragmentului de anticorp prin Western-blot sau Elisa.
360

Cnd se produce expresia unui fragment de anticorp care se leag de o protein membranar ce i are sediul n mod normal la nivelul membranei citoplasmatice a gazdei, noi va trebui s lum n considerare faptul c anticorpul inhib activitatea proteinei i astfel creterea celulei. n cazul sistemului antiport NhaA, chiar dac majoritatea anticorpilor au avut un efect inhibitor asupra activitii acestuia, expresia periplasmatic a fragmentelor Fv i Fab a fost posibil deoarece transportorul are importan vital doar n anumite condiii de cretere, cum sunt concentraiile mari de sodiu sau litiu, sau pH n prezena sodiului. n plus, epitopii respectivi ar putea fi expui pe suprafaa extracelular sau s nu fie accesibili. n sisteme de expresie bacteriene, fragmentele Fv i Fab sunt produse n mod normal n spaiul periplasmatic, unde mediul oxidativ permite formarea legturilor disulfidice eseniale pentru plierea adecvat i activitatea anticorpilor. Producia proteic variaz pentru diferite fragmente de anticorp cu producii de 1,5mg de protein/l de cultur bacterian n cazul fragmentelor Fv stabile. Fragmentele Fab sunt exprimate n cantiti i mai mici (0,1-0,4mg/l de cultur), mai probabil datorit complexitii mai mari a legturilor disulfidice i masei mai mari. Producia lor reprezint o problem delicat n experimentele de co-cristalizare. Producia fragmentului Fab proteolitic este un proces care implic multe etape, necesit mult timp i este costisitor. Adesea producia de protein pur este sub 30% din proba de protein iniial. Fragmentele Fab au fost produse ca proteine chimerice cu domeniile constante CH1 i CL ale altui anticorp, i anume anticorpului monoclonal D1.3 specific lizozimului, prin subclonarea domeniilor VH i VL a 3 anticorpi diferii n vectorul pASK85-D1.3. Aceast plasmid confer un his-tag la nivelul captului C-terminal al lanului greu pentru purificare prin intermediul cromatografiei de afinitate metalic prin imobilizare. Acesta este destinat expresiei periplasmatice n E. coli sub controlul sistemului represor/promotor tetraciclinic. Fragmentele de anticorp pentru anticorpul monoclonal 2C5 au rat de producie bun de 1,5 i 0,5mg/l pentru Fv respectiv Fab. Fragmentele de anticorp ale 5H4 sunt produse la niveluri mult mai mici (0,1 i 0,03 pentru fragmentele Fv respectiv Fab).
361

nlocuirea resturilor ncrcate i voluminoase ale captului N-terminal al domeniului variabil al lanului uor a mbuntit proprietile de pliere i solubilizare ale ultimilor anticorpi. Producia poate fi considerabil crescut prin expresia acelorai fragmente hibride ntr-o citoplasm bacterian oxidativ folosind tulpina FA113 E. coli i nou structuratul vector de expresie pFAB1. Aceasta a dus la producii sporite de 10-30mg fragmente Fab pure, funcionale pe litru de cultur E. coli, ceea ce reprezint o cantitate adecvat pentru studii calitative de cristalizare. n plus, fragmentele scFv derivate din bncile phage-display au fost recent exprimate cu succes ntr-o tulpin similar co-exprimnd chaperone moleculare.

11.2.3. Purificarea i cristalizarea proteinelor Pornind de la o surs bun de proteine natural sau recombinant, purificarea trebuie s asigure preparate proteice pure i omogene n cantiti suficiente. n general metodele de purificare ale proteinelor membranare sunt aceleai cu cele aplicate pentru proteine solubile cu excepia faptului c proteinele membranare integrale sunt purificate ca i complexe protein-detergent. Proteinele membranare sunt meninute solubile n soluii detergent micelare la o concentraie de lucru pentru detergent de 1,5 pn la 2 ori CMC. Alegerea detergentului pentru solubilizare i purificare este important. Majoritatea materialelor de purificare tolereaz o gam larg de detergeni. Sistemele de purificare prin afinitate au avantajul vitezei de lucru crescute i specificitii mari n comparaie cu procedeele cromatografice standard cum ar fi cromatografia de schimb anionic sau cromatografia prin excludere de dimensiuni. Pentru anumite aplicaii, ca de exemplu pentru cristalizare, fragmentele de anticorpi recombinai pot fi folosii n cromatografia de imunoafinitate indirect pentru purificarea ntr-o singur etap a complexelor membranare protein-anticorp aa cum este menionat mai jos.

362

11.2.3.1. Purificarea prin imunoafinitate indirect Fragmentele de anticorp recombinat sunt instrumente adaptabile pentru analiza structural a proteinelor. Ele pot fi folosite pentru prepararea complexelor proteice membranare, cu producie de materiale nalt purificate pentru cristalizare ntr-o singur etap de cromatografie prin imunoafinitate. n comparaie cu metodele clasice cum ar fi cromatografia de schimb anionic sau cromatografia prin excludere de dimensiuni, cromatografia de imunoafinitate ofer un factor de purificare excelent de obicei ntre 100 i 10.000 datorit naltei specificiti a interaciunilor dintre antigen i anticorp sau fragmentul de anticorp. Totui, datorit acestor interaciuni puternice, de obicei sunt necesare protocoale de eluie intens dac anticorpii sau fragmentele acestora sunt cuplai covalent la matricele activate sau captai de Proteina A sau G imobilizat. Fragmentele de anticorpi prelucrai pot fi totui legai non-covalent i reversibil la o matrice corespunztoare prin intermediul tag-urilor (secvenelor terminale repetitive adugate), cum ar fi strep-tag. Ulterior proteina este supus eluiei sub form de cocomplex cu fragmentul de anticorp (fig. 11.5) i poate fi folosit ca atare pentru experimentele de cristalizare. Aceast abordare prin cromatografia de imunoafinitate combin avantajele tehnicilor bazate pe interaciunea antigen/anticorp i afinitate, i anume nalta specificitate i protocoalele de purificare bine stabilite, rapide de larg aplicabilitate. Tehnica permite izolarea proteinei din sursa ei natural precum i din sistemele de expresie n forma sa nativ fr ataarea markerilor de afinitate. Evident, proteina purificat este prezent ntr-un complex cu fragmentul de anticorp legat, ce nu ar trebui s afecteze activitatea biologic a proteinei, excepie fcnd cazurile cnd acest lucru este dorit. COX din P. denitrificans precum i produii de oxidare quinolici din P. denitrificans i E. coli au fost purificai eficient prin cromatografia de imunoafinitate indirect ntr-o singur etap folosind fragmente de anticorp recombinat fr afectarea proprietilor funcionale ale acestor complexe proteice membranare.

363

Fig.11.5 Reprezentarea schematic a purificrii unei proteine membranare format din mai multe subuniti n complex cu un fragment de anticorp (fragment Fv strep-tag) prin cromatografie de imunoafinitate indirect. Membranele celulare solubilizate sunt combinate cu extracte periplasmatice ale tulpinii de E. coli ce produce fragmentul Fv i aa-numitul complex este format. Amestecul este aplicat unei coloane de afinitate cu streptavidin, ca i complexul, fragmentele Fv singure fiind de asemenea legate prin intermediul strep-tag. Acestea sunt specific eluate prin nlturarea competitiv cu un ligand corespunztor dup ndeprtarea tuturor celorlalte proteine ntr-o etap de splare. Fv n surplus poate fi separat prin cromatografie de excludere prin dimensiune, rezultnd complexul pur al proteinei membranare i fragmentului Fv.

364

n contrast, cromatografia de afinitate cu streptavidin nu poate fi utilizat pentru purificarea co-complexului QCR fragment Fv. Un singur helix transmembranar ancoreaz subunitatea Rip1p de la periferia poriunii transmembranare a complexului, iar tragerea de domeniul extrinsec prin intermediul fragmentului Fv determin dezintegrarea QCR pn la un anumit punct. Din acest motiv, fragmentele Fv i QCR au fost purificate separat iar complexele au fost formate ulterior prin fragmente Fv n surplus, ndeprtate apoi prin cromatografie de excludere prin dimensiune. 11.2.3.2. Cristalizarea Cristalele proteice membranare sunt obinute prin tehnici i condiii de cristalizare standard care sunt utilizate de rutin pentru proteine solubile, iar identificarea condiiilor de cristalizare optime nu pare a fi un impediment. Caracterizarea biochimic riguroas a preparatelor proteice combinat cu cercetarea detergentului cel mai adecvat poate reprezenta cea mai eficient strategie pentru a face fa dificultilor cristalizrii proteinelor membranare. Heterogenitatea proteic trebuie evitat; ea poate fi determinat de proteoliz, diversele condiii de reacie sau de modificri post-translaionale, cum ar fi glicozilarea. Cristalizarea canalului de ap AQP1a fost efectuat cu probe proteice complet deglicozilate. n general, cristalizarea poate fi limitat de terminaiile flexibile sau buclele i clivajul proteolitic, iar produsele recombinate ce omit aceste terminaii pot fi folositoare. De exemplu cristalizarea canalului de potasiu KcSA a fost obinut numai dup clivajul proteolitic a 35 aminoacizi c-terminali. Mai mult, mutageneza restrns la nivelul suprafeei polare a proteinelor membranare exterioare OmpA i OmpX a fost folosit pentru optimizarea cristalizrii. Aici ar trebui menionat un alt aspect important. Multe proteine membranare i modific considerabil conformaia n timpul activitii biologice. Pentru reuita cristalizrii ar pute fi necesar fixarea anumitor domenii mobile, de exemplu prin utilizarea unor inhibitori specifici. Domeniul mobil extrinsec al subunitii Rip1p a complexului de citocromi bc1 nu a fost rezolvat n prima structur a complexului din
365

mitocondria bovin. Structura domeniului a fost vizibil numai dup imobilizarea acestuia prin contactele de legtur din cristal sau prin adiia inhibitorilor Qo specifici de situs. Pot fi folosite diferite metode pentru mbuntirea stabilitii unei proteine. Dac nu pot fi identificate metode sau detergeni pentru meninerea proteinei stabile i adecvate pentru cristalizare, este recomandabil selecia mutantelor stabile. Fragmentele de anticorpi pot fixa o conformaie proteic definit sau pot stabiliza un domeniu flexibil pentru susinerea ncercrilor de cristalizare dac au fost selectai anticorpi adecvai. Condiiile de cristalizare a proteinelor membranare n complex cu fragmente de anticorp cuprind diverse valori al pH-ului i concentraiei saline ce indic stabilitatea crescut a complexelor antigen-anticorp. Nu sunt disponibile date referitoare la constantele de legare reale ale exemplelor reuite; totui, n toate cazurile fragmentele de anticorpi sunt folosite n exces molar n cursul purificrii iar complexele stoichiometrice sunt obinute folosind filtrarea n gel ca etap final de purificare. Utilizarea complexelor antigen-anticorp stoichiometrice pentru cristalizare este un indicator clar al afinitii nalte a anticorpilor. 11.2.3.3. Abordri alternative pentru expansiunea suprafeei polare Dac este disponibil un sistem de expresie recombinat, proteinele de adiie sau fuziune par a fi alternativa rapid pentru creterea suprafeei accesibile pentru solvent a proteinei membranare i astfel a potenialului de cristalizare. Totui, fuziunile proteice sunt intermediate printr-o regiune de legare cu proteina de interes. Acest linker va permitea introducerea unui domeniu flexibil, un aspect nefavorabil cristalizrii. ntr-o ncercare de a mbuntii calitatea cristalului a citocromului ubiquinol oxidaz bo3 legat de membran din E. coli, proteina a fost produs ca i fuziune C-terminal a proteinei Z la subunitatea IV. Proteina de fuziune a cristalizat n condiii similare cu complexul nativ dar cristalul a fost i mai puin ordonat. Experimentele de nlocuire molecular nu au fost reuite iar proteina Z nu a putut fi plasat n model. Acest lucru se poate datora rezoluiei sczute a datelor de difracie (6) sau poate indica dezordinii ale proteinei Z. Strategia de fuziune pentru creterea suprafeei hidrofile poate fi folositoare n general i de asemenea poate fi
366

valoroas pentru proiectele genomice structurale dac partenerii de fuziune pot fi ataai rigid. S-a ncercat adugarea partenerilor de fuziune nu la nivelul terminaiei protidice, ci ntre dou poriuni helicoidale transmembranare. Citocromul solubil b562 a fost inserat n una din buclele citoplasmatice ale lactoz-permeazei, o protein transportoare secundar cu 12 helix-uri transmembranare. Red-permeaza (permeaza roie) avea activitate de transport i a permis obinerea de cristale 2-D, ns nu s-a raportat obinerea de cristale 3-D cu o bun difracie. Alegerea partenerilor de reacie fiziologic stabili sau stabilizarea interaciunilor protein- protein poate reprezenta o alternativ pentru creterea domeniilor de expunere la solvent a proteinelor membranare pentru cristalizare.

11.3. Concluzii
n ultimii ani, cercetarea n domeniul structurii proteinelor membranare a evoluat rapid, deschiznd calea descoperirilor raionale a medicamentelor. Totui, numrul structurilor proteice membranare la rezoluie aproape atomic este nc mic n comparaie cu cel al proteinelor solubile. Fragmentele de anticorpi sunt utilizate pentru creterea suprafeelor hidrofile a proteinelor membranare mbuntind astfel ansele cristalizrii 3-D. Prin aceast metod s-au obinut deja structuri de nalt rezoluie pentru 3 proteine membranare diferite. Toate fragmentele de anticorp utilizate pentru co-cristalizarea cu succes a proteinelor membranare pn n momentul de fa au fost derivate din anticorpi monoclonali obinui prin tehnologia clasic a hibridomului. Acetia recunosc epitopii nativi, non-lineari a antigenelor respective i se leag cu nalt afinitate. Pentru a conferi acestei strategii statutul de metod cu caracter general n domeniul cristalizrii proteinelor membranare, tehnicile de recombinare a anticorpilor trebuie optimizate pentru a permite accesul rapid la liganzii de nalt afinitate. Cristalizarea mediat prin fragmente de anticorpi poate fi folositoare n mod deosebit pentru proteine membranare constituite n principal din helixuri transmembranare cu bucle expuse la solvent foarte scurte, precum i pentru consolidarea proteinelor flexibile ntr-o conformaie fix.

367

PARTEA IV: ELEMENTE DE CINETIC, METABOLISM I TOXICOLOGIE ALE MEDICAMENTELOR

CAPITOLUL 12 FARMACOGENETICA: EFECTUL VARIANTELOR GENETICE N DISPONIBILITATEA I RSPUNSUL MEDICAMENTELOR 12.1. Consideraii generale
Este bine cunoscut faptul c n practica clinic exist o variaie interindividual remarcabil n ceea ce privete rspunsul biologic al pacienilor la administrarea unui medicament. Aceast variabilitate poate fi rezultatul a numeroi factori, cum ar fi patogeneza i severitatea bolii tratate, bolile asociate, vrsta pacientului, funcionarea rinichilor i a ficatului, starea de nutriie i interaciunile dintre medicamente. n ciuda relevanei acestor factori, variaiile comune ale genelor ce codific enzime de metabolizare a medicamentelor (DMEs), transportatorii de medicamente i receptorii medicamentelor int - aa-numitele polimorfisme - contribuie n mod semnificativ la heterogenitatea rspunsului la medicamente observat n cadrul populaiei [Renegar , 2001]. Investigarea sistematic a influenei polimorfismului genetic n variabilitatea interindividual a rspunsului biologic la medicamente este denumit ''farmacogenetic''. Mai detaliat, farmacogenetica se ocup cu: detectarea diferenelor ereditare, motenite n rspunsul la medicamente, evaluarea mecanismelor moleculare fundamentale de la nivel genetic i la nivel de proteine, stabilirea de relaii valabile ntre genotip i fenotip, evaluarea relevanei clinice a rspunsului medicamentelor polimorfice, i dezvoltarea de metode de testare pentru a identifica pacienii care ar putea prezenta un risc terapeutic crescut sau beneficiu terapeutic
368

sczut

datorit

predispoziiei

lor

genetice,

nainte

de

nceperea

terapiei

medicamentoase. Prima observaie n ceea ce privete diferenele motenite n rspunsul la un produs chimic, a constituit-o incapacitatea de a simi gustul feniltioureei evideniat nc din 1932 [Snyder, 1932]. Farmacogenetica i are nceputurile n anii 1950, atunci cnd variaiile determinate genetic au fost considerate a fi cauza efectelor adverse ale medicamentelor. De exemplu, hemoliza dup tratamentul antimalaric a fost corelat cu lipsa activitii glucozo-6-fosfat dehidrogenazei eritrocitare. n mod similar, o deficien n activitatea enzimei de acetilare N-acetiltransferaza 2 (NAT2) a fost considerat cauza neuropatiei periferice dup izoniazid. Elucidarea bazelor geneticii moleculare a diferenelor motenite n rspunsul la medicamente a nceput la nceputul anilor 1980, cu clonarea i caracterizarea unei gene umane polimorfice ce codific CYP2D6 (debrisoquin hidroxilaza DME citocrom P450 monooxigenaza II D6) [Gonzalez i colab., 1988]). De atunci, au fost stabilite pentru un numr tot mai mare de gene umane relaii ntre variantele alelice, modificrile funcionale la nivel de protein i rezultatul clinic (rspunsul la medicamente) .

12.2. Relaii ntre genotip i fenotip

Efectul farmacologic global al unui medicament atunci cnd se administreaz la un individ este rezultatul metabolismului medicamentului i disponibilitii sale, interaciunii medicament-int, care la nivel molecular sunt mediate de enzime [Evans, 1999; Weinshilboum, 2003]. Diferenele genetice pot induce modificri la nivel enzimatic prin diverse mecanisme moleculare: gena ce codific enzima poate s fie absent, determinnd lipsa complet a enzimei; dac mutaiile survin n regiunea de reglare a genei, poate s conduc la formarea de ARNm puin i o cantitate redus de enzim; o mutaie la grania intron-exon poate duce la splicing-ul incorect al pre-ARN i astfel, la formarea unei enzime incomplete sau inactive;
369

o mutaie n cadrul unui exon poate provoca schimbri nonsinonime i nonconservative de aminoacizi n proteine, care au ca rezultat fie pierderea complet sau numai modificarea activitii enzimatice, dac schimbrile de aminoacizi sunt importante pentru activitarea enzimei sau nu;

n contrast cu situaiile care conduc la absena sau scderea activitii enzimatice, existena mai multor copii ale genei n cauz ar putea conduce la creterea expresiei enzimei codificate. n contrast cu aceste alterri genetice funcionale, exist de asemenea

modificri genetice silenioase. De exemplu, schimbrile de nucleotide de la nivelul intronilor nu vor conduce la nici o variaie observabil a structurii/activitii enzimatice (de fapt, majoritatea polimorfismelor genomice aparin tipului silenios) . n plus fa de aceste mecanisme, la nivel macroscopic relaia dintre variaia genetic (genotipul) i schimbrile interindividuale msurabile/observabile interindividual n rspunsul la medicamente n populaie (fenotipul) depinde puternic de numrul de modificri genetice presupuse. Dac o singur variaie genetic determin o trstur, fenotipurile vor urma un model de transmitere mendelian sau monogenic. n acest caz, n populaia observat, rezultatul va fi o frecven de distribuie bimodal. n special, n studiile familiale, diferitele fenotipuri vor fi clar separate unele de celelalte. Metabolismul medicamentelor este adesea o trstur monogenic, unde concentraia plasmatic a medicamentelor depinde numai sau n principal de activitatea unei singure enzime de metabolizare [Evans, i Johnson, 2001]. n acest caz, de obicei, cohortele celor dou fenotipuri sunt mprite n metabolizani/metabolizatori leni (PMs) i metabolizani/metabolizatori buni/normali (EMs) [Wormhoudt i colab., 1999]. Un scenariu similar rezult n cazul n care un polimorfism al unei singure gene determin diferene n sensibilitatea receptorilor medicamentelor la un anumit medicament, discriminnd fenotipurile responsive i nonresponsive. Pe de alt parte, n cazul n care o trstur este rezultatul mai multor variaii genetice, atunci superpoziia efectelor moleculare difereniale va conduce la o
370

frecven de distribuie mai mult sau mai puin unimodal, n care diferitele fenotipuri nu mai sunt clar separate unele fa de altele. n general rspunsul la medicamente este poligenic, din cauza complexitii cascadelor fiziologice implicate, care, eventual, sunt controlate de jocul combinat al unei varieti de gene codificatoare de enzime.

12.3. Stabilirea relaiilor ntre genotip i fenotip

Pn de curnd, relaia dintre fenotip i genotip a fost stabilit ncepnd cu observaiile clinice a variaiilor interindividuale n rspunsul la medicamente. Analiza distribuiei a condus la descoperirea fenotipurilor. n consecin, genele poteniale de baz i variantele lor alelice au fost identificate prin clonare i secveniere, n timp ce ereditatea trsturilor a fost elucidat prin studii familiale i ale gemenilor. Fiind bazate pe fenotipul clinic, aceste abordri de farmacogenetic clasic au permis, probabil, ca polimorfismele detectate s fie legate cauzal i validate clinic. Cu toate acestea, dei funcioneaz destul de bine pentru trsturile monogenice, abordrile nu sunt capabile de a corelara genotipul cu fenotipul n cazul trsturilor poligenice. Implementarea relaiilor dintre genotip-fenotip pentru trsturile poligenice necesit o strategie diferit i mai larg, care realizeaz abordarea de baz a noii discipline- farmacogenetica. Abordarea farmacogenetic este bazat pe faptul c genomul uman conine polimorfisme numeroase, cum ar fi repetiii scurte n tandem i polimorfime mononucleotidice (SNPs), care ar putea sau nu ar putea s determine modificri funcionale la nivel de protein, ce ar fi n dezechilibru de linkage cu alelele funcionale [Nowotny, 2001; Brookes , 1999]. n consecin, aceste polimorfisme comune pot aciona ca markeri pentru alelele funcionale. Scanarea unei regiuni ADN pentru aceste polimorfisme produce o hart a markerilor, care sunt apoi testai pentru asocierea cu fenotipul n cauz. Este posibil s se identifice asociaii ntre markerii genetici i rspunsurile individuale la medicamente care pot fi sau nu de cauzalitate, fr a necesita cunotine de biochimie a funciei genei implicate. Bazat pe genotip, aceast abordare poate fi aplicat pentru orice trstur, independent de faptul c este monogenic sau poligenic. Scopul final

371

este acela de a crea hri de biomarkeri la nivel genomic, care ar putea fi corelate cu anumite fenotipuri pe baza studiilor de asociere nonfamiliale. n scopul realizrii de cartografieri ale polimorfismelor cu densitate nalt, SNPs par a fi polimorfismele de alegere. n comparaie cu alte tipuri de variante genetice, cum ar fi variaii ale numrului de repetiii n tandem (VNTRs), SNPs ofer o serie de avantaje. SNPs sunt cele mai frecvente forme de polimorfism ale genomului uman, care se produc, n medie, la fiecare 1000-2000 de perechi de baze, ce prezint prin urmare o densitate de polimorfisme maxim. Ele sunt binare, ceea ce le face, bine adaptate pentru a fi automatizate i pentru analize de mare capacitate. n cele din urm, SNPs par s aib rate de mutaii reduse, i, astfel, sunt relativ stabile n timp. O varietate de tehnologii pot fi utilizate pentru identificarea i caracterizarea polimorfismelor [Shi, 2001]. Acestea includ: polimorfismul conformaional monocatenar (SSCP); electroforeze n gel sensibile conformaional; detecia clivrii nepotrivirii/ mperecherii greite enzimatice sau chimice; electroforeza n gradient de gel denaturant ; analiza heteroduplexurilor prin denaturarea cromatografic n faz lichid de nalt performan (HPLC) ; secvenierea ADN de mare capacitate; spectrometrie de mas (MS); scanarea i resecvenierea pe membrane de nucleotide (scaning array). Crearea hrilor SNP ale ntregului genom a devenit acum fezabil odat cu progresele uriae fcute n analiza de mare capacitate a genelor. n 2001, Grupul de Realizare a Hrilor SNP a publicat o hart de variaie a secvenelor genomului uman coninnd 1,42 milioane SNPs [International SNP Map Working Group., 2001]. Depozitul de date SNP ale consoriului conine n prezent aproape 1,8 milioane SNPs (disponibil prin intermediul websitul-ui TSC Centrul Coordonator de Date la http://snp.cshl.org [Thorisson GA, 2003]).

372

n ciuda acestui progres semnificativ n cartografierea SNP, ncercrile de a stabili asociaii ntre fenotipurile poligenice i harta polimorfismelor genomului nc nu au reuit. O ntrebare esenial, n acest context, este ci markeri polimorfici trebuie s fie inclui ntr-un studiu de asociere la nivel de genom. n principiu, numrul de polimorfisme pentru a fi evaluate ntr-un studiu este determinat de extinderea dezechilibrului de linkage. Cu toate acestea, dezechilibrul de linkage prezint o variabilitate genomic marcat, care este cauzat de o varietate de factori cum ar fi distana ntre polimorfisme, rata de recombinare, vrsta polimorfismelor, istoricul populaiei, procesele de selecie i abatere genetic. n consecin, ncercri de a estima numrul minim de SNPs pentru a fi incluse n studii de asociere cu acoperire genomic au produs rezultate discutabile. Simulri recente utiliznd un model simplificat n populaia general sugereaz c nivelurile dezechilibrului de linkage, nu depesc de obicei o distan medie de 3 kb (1 kb = 1000 de baze perechi) n cadrul populaiei generale, ceea ce implic faptul c pentru studii asupra ntregului genom, ar fi necesare aproximativ 0,5 milioane de SNPs [Kruglyak, 1999]. Datele experimentale au produs dezechilibre de linkage foarte variate, mrimea blocurilor estimate variaz de la 5 la cteva sute de kilobaze (kb), cu diferene n ceea ce privete dezechilibrul de linkage extins, care este adesea dependent de etnia i/sau rasa populaiei examinate [Reich i colab., 2001 ; Abecasis , 2001]. n ceea ce privete fezabilitatea, mrimea blocurilor cu dezechilibru de linkage poate fi avantajoas. De exemplu, un dezechilibru de linkage extins la 60 kb ar permite studii la nivelul genomului cu doar 30000 SNPs [Collins, 1999]. Cu toate acestea, chiar i n acest caz, numrul de polimorfisme ce urmeaz a fi luate n considerare depete capacitile tehnologice actuale. n plus, chiar i dup ce asocierea ntre genotip i fenotip a fost demonstrat, mecanismele care stau la baza acestor asociaii ar avea nevoie de studii suplimentare. n consecin, stabilirea relaiilor genotip-fenotip pe baza studiilor de asociere la nivel de genom pare a fi deosebit de important n viitor.

373

n acelai timp, aplicarea abordrilor farmacogenetice ntr-o manier mai concentrat pentru una sau mai multe ,,gene candidate, care sunt suspectate de a contribui la fenotipul n cauz, pare a fi cea mai indicat. Cteva exemple de succes de abordare a genei candidate, sunt cunoscute n literatura de specialitate, demonstrnd corelaiile ntre polimorfismele intei medicamentului n a modifica rspunsul la medicamente (vide infra). n unele cazuri SNPs unice au oferit suficiente asociaii cu rspunsul medicamentelor, n timp ce n altele corelaia dintre trsturi cu haplotipul complet a dat rezultate mai bune.

12.4. Fenotiparea versus genotipare i predicia rspunsului individual la medicamente

Odat ce un polimorfism este cunoscut, i relaia dintre variantele genetice i fenotip a fost validat, este posibil s se prezic rspunsul la medicamente fie prin fenotiparea, fie prin genotiparea subiecilor [Lockhart i colab., 2000; Cronin, 2001]. n general, fenotiparea poate fi efectuat prin msurarea direct a proprietilor oricrui biomarker specific unui sistem, organ sau esut, de exemplu, activitatea enzimatic i interaciunile medicament-receptor. Abordarea general include probe de ndeprtare i determinare a activitii biomarkerului prin teste biochimice relevante. Acest tip de fenotipare se numete fenotipare funcional [Shi i colab., 2001]. Dei fenotiparea funcional permite un test direct al nivelului de proteine sau enzime, exist limitri n cazul n care activitile enzimatice se suprapun peste substraturi specifice, de exemplu, n cazul de DMEs. Un alt dezavantaj al fenotiprii funcionale este c necesit adesea metode invazive de prelevare a probelor, de exemplu, biopsie hepatic. n cazul DMEs, fenotiparea funcional poate fi nlocuit de fenotiparea metabolic. Fenotiparea metabolic necesit aplicarea unui medicament sond, care este cunoscut a fi metabolizat de enzima n cauz, urmat de determinarea medicamentului nemodificat versus metaboliii lui n plasm sau urin.

374

n mod ideal, o procedur de fenotipare ar trebui s fie uor de a efectuat i ieftin. Medicamentul sond aplicat ar trebui s fie specific pentru enzima polimorfic n cauz, cu model metabolic cunoscut, uor de testat i n condiii de siguran. Metoda de analiz ar trebui s fie sensibil i simpl. Metodele de fenotipare au fost utilizate nainte ca instrumentele de biologie molecular s devin disponibile i acum ele au fost pe deplin validate. Avantajul fenotiprii este acela c rezultatul reflect n mod real activitatea metabolic individual. Cu toate acestea, chiar i n cazul metodelor optimizate, fenotiparea este susceptibil de a identifica greit factori, cum ar fi comedicaia, nutriia sau boala. n plus, aceasta necesit un efort/timp semnificativ pentru obinerea de rezultate i presupune o ncrctur suplimentar de medicamente asupra subiectului testat. n contrast cu fenotiparea, genotiparea nu se adreseaz activitii enzimatice reale, dar anticipeaz rspunsul individual la medicamente pe baza polimorfismelor genetice identificate [Zuhlsdorf , 1998]. Din punct de vedere tehnic, este relativ uor a efectua genotiparea cu probe de ADN genomic, deoarece identificarea alelelor unei persoane la nivelul unui anumit locus al genei poate fi realizat folosind diferite metode, incluznd metode de genotipare pe baz de electroforez n gel, cum ar fi reacia de polimerizare n lan (PCR) polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie (PCR-RFLP), PCR cu alele specifice, genotipare pe baz de colorani fluoresceni omogeni ( metoda TaqMan sau metoda Invader), spectrometria de mas i tehnologia ADN microarray (ADN cip) [Brennan, 2002; Kwiatkowski i colab., 1999]. Genotiparea necesit mai puin timp dect fenotiparea, nu este influenat de interaciunile medicament-medicament sau aliment-medicament i nu exist probleme cu compliana subiecilor din test. Pe de alt parte, numai polimorfismele bine investigate pot fi determinate, aa cum diferite alele s-au dovedit a codifica enzime ce induc un polimorfism metabolic, i trebuie s fie disponibil secvena informaional a alelelor mutante i wild-type (de tip slbatic) . O analiz de corelaie cu rezultatele de la fenotiparea corespunztoare este ntotdeauna necesar pentru a demonstra valabilitatea procedurii de genotipare. Relevana fenotiprii i genotiprii
375

const n potenialul lor de a anticipa nainte de nceperea tratamentului cu un medicament dac un pacient are sau nu un risc terapeutic crescut sau un beneficiu terapeutic sczut datorit predispoziiei genetice. n practic, ns, o serie de provocri rmn. De exemplu, aplicarea unui proceduri de genotipare i fenotipare la acelai individ poate produce rezultate neconcordante. n mod similar, rezultatele fenotiprii pot fi influenate de tipul metodei i/sau medicamentul sond. n consecin, numeroi autori au remarcat c procedurile de genotipare i fenotipare trebuie s fie selectate i efectuate atent [Zaigler i colab.,2000].

12.5. Polimorfismul genetic al enzimelor de metabolizare a medicamentelor (DMEs)

Cea mai mare parte a cunotinelor farmacogenetice au fost dobndite n domeniul DMEs. De ce? pentru c polimorfismele DME sunt cel mai adesea trsturi monogenice, pentru c efectul individual rezultat, de exemplu, rata metabolic, poate fi uor analizat cantitativ i pentru c fenotipurile caracterizate prin diferene interindividuale ale ratei metabolice pot fi sesizate cu uurin. Este posibil s se disting persoanele cu metabolism normal, care sunt n mod implicit EMs, de metabolizanii/metabolizatorii PMs, la care s-a redus semnificativ activitatea DME. n unele cazuri, este de asemenea, posibil s discrimineze persoanele cu metabolism crescut, care sunt clasificate ca metabolizani/metabolizatori ultrarapizi (UMs). Potentialele consecine ale metabolismului medicamentelor polimorfice includ [Meyer, 2000]: efect farmacologic extins; reacii medicamentoase adverse; lipsa de activare a precursorilor, toxicitatea medicamentului; creterea dozei eficace; metabolizare alternativ, ci nocive; interaciuni medicament-medicament exacerbate.

376

DMEs sunt de obicei clasificate n funcie de tipul modificrii metabolice pe care o catalizeaz. Enzimele de faza I catalizeaz transformrile de grup funcional, cum ar fi oxidarea, reducerea sau hidroliza. Enzimele de faza a II-a catalizeaz conjugarea substanelor cu substitueni endogeni. Pentru c, DMEs de faza a II- sunt ntotdeauna implicate n eliminarea substanelor bioactive i metaboliii acestora, ne putem atepta c activitatea enzimatic sczut va conduce la creterea sistemic a nivelurilor de medicament, care pot fi asociate cu un efect terapeutic crescut, dar de asemenea cu creterea efectelor adverse i a toxicitii. n cazul enzimelor de faz I, consecinele polimorfismului depind dac DME catalizeaz inactivarea unui medicament activ, sau formarea unui metabolit activ, fie dintr-un medicament fie dintr-un precursor. Contribuia relativ individual a DMEs la metabolismul global de faz I sau II este redat n figura 12.1.

Fig. 12.1 Contribuia relativ individual a DMEs n faza I sau II a metabolismului medicamentelor (modificate dup [Evans i Johnson, 2001]). Mrimea seciunii n graficul figur indic procentul de metabolism de faz I i II al medicamentelor la care contribuie enzima respectiv. Enzimele cu polimorfisme la care s-a demonstrat deja c determin diferene relevante din punct de vedere clinic n rspunsul la medicamente sunt tiprite cu caractere bold. Abrevieri: ADH = alcool dehidrogenaza; ALDH = aldehid dehidrogenaza; CYP = citocromul P450; DPD = dihidropirimidin dehidrogenaza; NQOH1 = NADPH: quinon oxidoreductaza; COMT = catecol-O-metiltransferaza; GST = glutation S-transferaza; HMT = histamin metiltransferaza; NAT = N-acetiltransferaza; ST = sulfotransferaza; TPMT = tiopurin metiltransferaza, UGT = uridin 5'- trifosfat glucuronoziltransferaza. 377

Aproape toate DMEs prezint polimorfism genetic. Cu toate acestea, nu toate polimorfismele s-au demonstrat a fi relevante clinic. n general, importana clinic a metabolismului/rspunsului medicamentului polimorfic crete sau descrete n raport terapeutic pentru un medicament dat. Au fost publicate o serie de reviewuri excelente despre farmacogenetica DMEs (vezi capitolul 15). Prin urmare, o descriere detaliat despre polimorfismul DMEs se va concentra pe CYP2D6. O privire de ansamblu asupra diferitelor polimorfisme cunoscute ale DMEs este prezentat n tabelul 12.1.
Tabelul 12.1 Polimorfismul DMEs Gena/ Substratul medicamentos (efect) produsul genei DMEs de faz I CYP1A1 Fenacetina CYP1A2 Acetaminofen Amonafida Cafeina Paraxantina Etoxiresorufin Propranolol Fluvoxamina CYP1B1 Metabolii estrogeni CYP2A6 Cumarina Nicotina (dependena de igar) Halotan CYP2B6 Ciclofosfamida Aflatoxina Mefenitoin CYP2C9 Tolbutamida (hipoglicemia) Warfarina (variaii al efectului anticoagulant al warfarinei, hemoragie) Fenitoina (toxicitate crescut) Antiinflamatoare nesteroidiene Diazepam Ibuprofen Glipizida (hipoglicemia) Losartan (scderea efectui antihipertensiv) CYP2C19 Mefenitoina (PM: toxicitate crescut, EM:eficacitate sczut) Omeprazol (PM: toxicitate crescut, EM: eficacitate sczut, rate de vindecare mai mari n combinaie, cnd este luat cu claritromicina) Hexobarbital (PM: toxicitate crescut, EM: eficacitate sczut) Mefobarbital (PM: toxicitate crescut, EM: eficacitate sczut) Propranolol (PM: toxicitate crescut, EM: eficacitate sczut) Proguanil (PM: toxicitate crescut, EM: eficacitate sczut) Fenitoina (PM: toxicitate crescut, EM: eficacitate sczut) Citalopram (PM: toxicitate crescut, EM: eficacitate sczut) Diazepam (PM: toxicitate crescut, sedare prelungit, EM: eficacitate sczut) Benzodiazepine 378

CYP2D6

-blocante ( efect -blocant) Propranolol (PM: bradicardie, hipotensiune arterial) Timolol (PM: eliminare sczut- acumularea de compui iniiali au ca rezultat toxicitate, bradicardie, hipotensiune arterial) Bufuralol (PM: eliminare sczut acumularea de compui iniiali au ca rezultat toxicitate, bradicardie, hipotensiune arterial) Metoprolol (variaie n activitatea de blocare, PM: eliminare sczut, acumularea de compui iniiali au ca rezultat toxicitate, bradicardie, hipotensiune arterial) Antipsihotice (diskinezie tardiv de la antipsihotice, PM: toxicitate crescut, UM: eficacitatea insuficient) Desipramina (PM: toxicitate crescut, hipotensiune arterial, stupoare, UM: eficacitate insuficient) Nortriptilina (PM: toxicitate crescut, hipotensiune arterial, UM: eficacitate insuficient) Amitriptilina [PM: scderea eliminrii de compui iniiali i metabolii activi (activ=nortriptilina), toxicitate crescut, hipotensiune arterial, UM: eficacitate insuficient] Imipramina [PM: scderea eliminrii metabolitului activ (=desipramina)] Clomipramin (PM: eliminare sczut - acumularea de compui iniiali ce au ca rezultat toxicitate) Codeina [PM: lips de eficacitate ca analgezic, scderea activrii medicamentului (activ =morfina) reacii adverse narcotice, dependen] Debrisoquina (PM: toxicitate crescut, hipotensiune arterial, tensiune ortostatic apreciabil, UM: eficacitate insuficient) Dextrometorfan (PM: toxicitate crescut UM: eficacitate insuficient) Encainida (PM: scderea activrii medicamentului (activ=O-desmetil encainida), EM: lrgirea complexului QRS) Flecainida (PM: eliminare sczut- acumularea de compui iniiali au ca rezultat toxicitate crescut, -blocad inconsistent, UM: eficacitate insuficient) Fluoxetin (PM: toxicitate crescut, UM: eficacitate insuficient) Guanoxan (PM: toxicitate crescut, hipotensiune arterial, UM: eficacitate insuficient) Metoxiamfetamina (PM: toxicitate crescut, UM: eficacitate insuficient) Nortriptilina (PM: scderea eliminrii- acumularea de compui iniiali ce au ca rezultat creterea toxicitii, UM: eficacitate insuficient) N-propilajmalina (PM: toxicitate crescut, UM: eficacitate insuficient) Perhexilina (PM: toxicitate crescut, neuropatie periferic, agranulocitoz, UM: eficacitate insuficient) Fenacetina (PM: toxicitate crescut, UM: eficacitate insuficient) Fenformin (PM: toxicitate crescut, acidoz lactic, UM: eficacitate insuficient) Propafenona (PM: toxicitate crescut, UM: eficacitate insuficient) Sparteina (PM: eliminare sczut - acumularea de compui iniiali ce au ca rezultat creterea toxicitii, depresie cardiac, contracii uterine, UM: eficacitate insuficient) Mexiletina (PM: eliminare sczut - acumularea de compui iniiali ce au ca rezultat creterea toxicitii)

379

Amiodarona Indoramina Perfenazina (PM: eliminare sczut - acumularea de compui iniiali, de origine ce au ca rezultat toxicitate) Zuclopentixol (PM: eliminare sczut - acumularea de compui iniiali ce au ca rezultat toxicitate) Itioridazina Carvedilol (variaii n blocada 1/2) Antiaritmice (proaritmic i alte efecte toxice) CYP2E1 N-nitrozodimetilamina Acetaminofen Etanol (posibil efect asupra consumului de alcool) CYP3A4/A5/A7 Macrolide Ciclosporina Tacrolimus Blocante ale canalelor de calciu Midazolam Terfenadina Lidocaina Dapsona Quinidina Triazolam Etoposid Teniposid Lovastatin Alfentanil Tamoxifen Steroizi ALDH2 Ciclofosfamida Etanol (metabolizatori leni: nroirea feei, metabolizatori rapizi: protecie fa de ciroz hepatic) ALDH3 Etanol (creterea consumul de alcool i dependen) DPD Fluorouracil (posibil toxicitate sporit, 5-fluorouracil neurotoxicitate, mielotoxicitate) NQO1 Ubiquinona Menadiona (urolitiaz asociat menadionei) Mitomicina c Pseudocolinesteraza Succinilcolina (hidroliz lent a esterilor: apnee prelungit) plasmatic COMT Levodopa (metilatori sraci: rspuns crescut) Metildopa(metilatori sraci: rspuns crescut) Estrogeni (abuz de substane) Acid ascorbic GSTM1 Aminocrom Dopacrom Adenocrom Noradrenocrom GSTP1 Acid 13-cis-retinoic Acid etacrinic Acroleina Epirubicina HMT Histamina 380

NAT1 NAT2

STs

TPMT

UGT1A1 UGT2Bs

Acid p-aminosalicilic Acid p-aminobenzoic Sulfametoxazol Izoniazida [EM (autozomal dominant): hepatit, PM: (autozomal recesiv): neurotoxicitate isoniazidic, lupus eritematos, neuropatie periferic, inhibarea oxidazei hepatice, creterea toxicitii fenitoinei atunci cnd este coadministrat] Hidralazina (PM: lupus eritematos indus de hidralazin) Procainamida (PM: dezvoltarea lupusului eritematos mai devreme i mai frecvent) Fenelzina (PM: grea, somnolen) Sulfasalazina (PM: reacii severe, mai probabil, atunci cnd sunt folosite doze mari) Dapsona (PM: efecte hematologice) Sulfonamide (hipersensibilitate la sulfonamide) Cafeina Amonafida (acetilatori rapizi: eficacitate sczut, toxicitate crescut, mielotoxicitate, cancer colorectal) Steroizi Acetaminofen Estrogeni Dopamina Epinefrina Naringenina 6-mercaptopurinA (PM: toxicitate tiopurinic i eficacitate, risc de cancere secundare, mielotoxicitate, toxicitate hematopoietic, reducere a mduvei osoase) 6-tioguanina (PM: toxicitate tiopurinic i eficacitate, risc de cancere secundare, mielotoxicitate, toxicitate hematopoietic) Azatioprina (PM: toxicitate tiopurinic i eficacitate, risc de cancere secundare, mielotoxicitate, toxicitate hematopoietic) Irinotecan (diaree, mielosupresie) Bilirubina Flavopiridol Opioizi Androgeni Morfin Naproxen Ibuprofen

12.6. Polimorfismul CYP2D6

Polimorfismul CYP2D6 a fost pentru prima oar descoperit prin observarea diferenelor interindividuale n metabolismul debrisoquinei i sparteinei. Ambele medicamente, la fel ca desipramina i metoprololul, au fost folosite pentru a fenotipa subiecii [Tamminga i colab., 2001; Lledo, 1993], permind a distinge PMs de EMs. n unele cazuri UMs ar putea fi, de asemenea, discriminat [Lovlie, 2001].
381

Gena uman CYP2D6 este localizat la om la nivelul locusului CYP2D de pe cromozomul 22 [Gough, 1993], care conine, de asemenea, alte dou gene, o gen (CYP2D7), ce conine o mutaie care lezeaz cadrul de lectur, precum i o pseudogen (CYP2D8P), care conine mai multe mutaii i nu codific o enzim funcional [Kimura, 1989]. n prezent sunt cunoscute mai mult de 75 de variante alelice ale CYP2D6 ; cu toate acestea, multe dintre variantele genetice nu produc efecte msurabile la nivel de protein (compilaii de diverse alele ale CYP2D6 i alte CYPs sunt disponibile pe internet la websitul Comisiei de Nomenclatur al Alelelor Citocromului P450 (CYP) http://www.imm.ki.se/cypalleles). Exist cinci alele cu mutaii silenioase determinate de modificarea unui singur nucleotid. De obicei alela numit CYP2D6 * 2 [Tsuneoka, 1993] cuprinde un grup de alele cu diverse mutaii care au ca rezultat schimbarea nivelului enzimatic n acelai mod (Arg296Cys i Ser486 Thr). Enzima codificat de CYP2D6 * 2 are o activitate de aproximativ 80% comparativ cu tipul slbatic. Alte alele ce codific o enzim funcional sunt CYP2D6*33 i CYP2D6*35 [Marez., 1997]. Toate aceste alele pot fi clasificate ca fiind corespunztoare funcional activitii enzimei codificate. Alelele funcionale sunt asociate cu fenotipul EM. Pn n prezent au fost descrise 23 de alele, care codific o enzim inactiv. n consecin, acestea pot fi clasificate ca alele non-funcionale. Pierderea activitii enzimatice este cauzat de diferite mecanisme, cum ar fi decalarea cadrului de citire (de exemplu, CYP2D6 * 3A, CYP2D6 * 6, CYP2D6 * 41), defecte de splicing (de exemplu, CYP26D6 * 4) sau codon stop (CYP2D6 * 8). n cazul alelei CYP2D6 * 5, gena complet este pierdut. Alelele non-funcionale sunt asociate cu fenotipul PM. ase alele (CYP2D6 * 9, CYP2D6 * 10A, CYP2D6 * 10B, CYP2D6 * 17, CYP2D6 * 36, CYP2D6 * 41) sunt cunoscute, a codifica o enzim cu activitate sczut, comparativ cu tipul slbatic. Aceste alele cu funcionare redus au fost asociate cu un fenotip intermediar de metabolizare [Kagimoto, si colab., 1990]. n cele din urm, exist, de asemenea, alele n care gena complet CYP2D6 a fost duplicat sau chiar multiplicat. n aceste cazuri, unde genele ce codific enzima complet activ sunt amplificate, adic CYP2D6 * 1XN, CYP2D6 * 2XN i CYP2D6
382

* 35X2, rezultatul este o cretere a sintezei enzimei. n consecin, alelele acestea sunt asociate cu un fenotip UM [Dahl, i colab., 1995]. Activitatea alelei CYP2D6 variaz semnificativ printre grupurile de rase/etnii [Bradford, 2002]. S-a observat c exist o frecven semnificativ mai mare de alele nonfuncionale la caucazieni n comparaie cu alte populaii (26% fa de 6% la asiatici i africani). n consecin, purttorii homozigoi ai alelei, reprezint 6-7% din populaia caucazian. Cele mai importante dintre alelele nonfuncionale sunt CYP2D6*4 i CYP2D6*5. Alelele cu funcie redus sunt mult mai frecvente n Asia i Africa dect n populaia caucazian. Alelele CYP2D6*10 sunt abundente n populaiile asiatice (41%), dar prezente numai la 3% din caucazieni. Alele motenite cu funcie amplificat exist, cu o frecven destul de sczut, n toate populaiile. CYP2D6 contribuie n mod semnificativ la metabolismul oxidoreductor general la brbat (aproximativ 25% din toate medicamentele prescrise, vezi figura 12.1), dei este doar o form relativ minor n ficatul uman, cu o abunden de numai 1,5% . De cnd CYP2D6 a fost, de asemenea, gsit n creier [Gilham, 1997], este posibil ca aceasta s acioneze ca un mecanism de aprare, protejnd sistemul nervos central, de neurotoxinele din mediu. CYP2D6 catalizeaz metabolismul primar pentru o mare varietate de droguri, inclusiv antidepresive triciclice (TCAs), antiaritmice, blocante i codein, i prin urmare sunt susceptibile a fi influenate de polimorfismul DME. Urmtoarele exemple vor ilustra relevana clinic a polimorfismului CYP2D6. Metabolismul TCAs, cum ar fi nortriptilina, desipramina i imipramina urmeaz o schem comun, n care hidroxilarea de ctre CYP2D6 conduce la inactivarea medicamentelor [Jann, Cohen, 2000]. n consecin, tratamentul cu doze normale pot expune PMs tratai cu debrisoquin la risc crescut de toxicitate, iar doza standard la UMs ar putea eua n a realiza efectul farmacodinamic dorit. De asemenea, este important din punct de vedere clinic c un numr de medicamente antidepresive, de exemplu, fluoxetina, haloperidolul i paroxetina, sunt inhibitori ai CYP2D6 [Brsen, Gram, 1993]. Acest lucru ar putea duce

383

la creterea toxicitii dac TCAs sunt coadministrate cu astfel de medicamente. n mod similar, agenii -blocani, cum ar fi metoprololul sunt inactivai de CYP2D6 [Lee, i colab., 1990]. PMs ai debrisoquinei sunt supui unor concentraii mai mari de medicament activ i, n consecin, crete -blocarea. n cazul propafenonei din clasa de antiaritmice 1c, polimorfismul CYP2D6 conduce la o schimbare de profil farmacodinamic [Lee i colab., 1990]. Farmacodinamic, propafenona acioneaz att ca blocant al canalelor de sodiu, ct i ca -blocant. Medicamentul este racemic i, n timp ce ambii enantiomeri exercit blocade ale canalelor de sodiu comparabile, activitatea de blocare este limitat la izomerul S. CYP2D6 catalizeaz hidroxilarea propafenonei. Produsul, 5hidroxipropafenona, este un metabolit activ, care este n principal un blocant al canalelor de sodiu, dar are de asemenea o activitate limitat de blocare. PMs ai propafenonei sunt supui la o -blocad crescut i la un risc nalt de evenimente adverse severe, comparativ cu EMs. Medicamentul carvedilol este un amestec racemic de doi enantiomeri cu farmacodinamic i metabolism diferit. Enantiomerul S arat 1activitate precum i 2-activitate, n timp ce enantiomerul R este n primul rnd -blocant. Izomerul R este metabolizat de ctre CYP2D6 ntr-o mult mai mare msur dect enantiomerul S. Ca rezultat activitile relative 1/2 sunt dependente de genotipurile CYP2D6 ale pacienilor tratai [Swynghedauw, 2001]. Efectul analgezic al codeinei este mediat prin metabolitul activ morfina. Deoarece codeina este O-demetilat la morfin de CYP2D6, efectul analgezic dorit este dependent de genotipul CYP2D6. n consecin, un efect analgezic dup tratamentul cu codein este limitat la EMs (EMs arat o mult mai mare eficacitate dect PMs msurat prin ventilaia pe minut n condiii de odihn ) [Sindrup, Brsen, 1996].
384

12.7. Polimorfsmul genetic al transportorilor de medicamente

n contrast cu DMEs, pn n prezent nu sunt cunoscute multe despre polimorfismul transportorilor de medicamente. Transportorii membranari sunt responsabili de absorbia medicamentelor n tractul gastro-intestinal, excreia urinar sau biliar, transportul de o parte i de alta a barierei hemato-encefalice i la nivelul situsurilor de aciune, cum ar fi esutul cardiovascular, celulele tumorale i microorganismele infecioase. n consecin polimorfismul transportorilor poate influena biodisponibilitatea medicamentelor. Transportorii includ glicoproteina P (Pgp; MDR1), 1 acid glicoproteina, MRP1-6 (proteina de rezisten multipl la medicamente) i perechea ei P-gp (SP-gp).

12.8. Gena de rezisten multipl la medicamente (MDR) marker versus polimorfismul funcional
Gena MDR1 codific glicoproteina P (P-gp), o protein membranar cu apartenen la superfamilia de transportori membranari de legare la adenozin trifosfat [Choi, i colab., 1988]. P-gp contribuie la excreia xenobioticelor de la nivelul rinichilor, ficatului i intestinului. n celulele endoteliale ale sistemului nervos central mpiedic ptrunderea medicamentelor de o parte i alta a barierei hematoencefalice. Supraexprimarea P-gp n celulele tumorale are ca rezultat un fenomen cunoscut ca rezisten multipl la medicamente, la agenii antineoplazici. Medicamentele cunoscute a fi eliminate prin P-gp, includ digoxina, antraciclina, vinblastina, daunomicina i ciclosporina A. Polimorfismul genei MDR1 ce influeneaz nivelul de exprimare sau secvena proteinei P-gp, ar putea avea prin urmare, un impact asupra biodisponibilitii acestor medicamente. Gena MDR1 conine 28 de exoni, ADNc constnd din 3843 bp. Pn n prezent, 16 alele au fost identificate; cu toate acestea, cea mai mare parte a polimorfismelor detectate sunt intronice sau silenioase [Cascorbi i colab., 2001]. Interesant, un polimorfism mononucleotidic silenios n exonul 26 (C3435T) a fost asociat cu nivelul de exprimare al P-gp la nivel intestinal i biodisponibilitatea oral a digoxinei [Hoffmeyer i colab., 2000].
385

Persoanele cu genotipul TT au artat o expresie semnificativ redus a nivelului de P-gp, comparativ cu persoanele cu genotip CC. Astfel, dup administrarea pe cale oral, valorile Cmax digoxinei au fost mai mari n cazul genotipului TT, comparativ cu genotipul CC. ntr-o investigare a distribuiei polimorfismului MDR1 n populaia alb, SNP C3435T par a fi cele mai frecvente polimorfisme, cu mai mult de 50% heterozigoi i 28% homozigoi purttori ai variantei alelice. Alte studii au artat c polimorfismul C3435T este supus unei remarcabile variaii interetnice [Ameyaw , i colab., 2001]. Avnd n vedere c SNP C3435T nu poate determina o schimbare de aminoacizi la nivelul proteinei, cel mai probabil este, un polimorfism marker pentru un polimorfism funcional. Un candidat potenial este un SNP nonsinonim n exonul 16 (G2677T), care este n dezechilibru de linkage cu SNP C3435T SNP. Polimorfismul G2677T a fost asociat cu creterea funciei P-gp in vitro i concentraii plasmatice mai mici de fexofenadin [Kim, i colab., 2001]. ntruct aceste observaii sunt contradictorii pentru efectele digoxinei raportate, sunt necesare mai multe investigaii pentru a elucida contribuia diferitelor polimorfisme MDR1 n biodisponibilitatea la medicamente. Cteva exemple de polimorfisme ale transportorilor de medicamente sunt redate n tabelul 12.2.
Tabelul 12.2. Polimorfismul transportorilor de medicamente Gena/Produsul genei Substratul medicamentului (efect) MDR-1 Medicamente produse natural anticancerigene Vinblastina (supraexprimare n cancer: rezisten la medicamente) Doxorubicina (supraexprimare n cancer: rezisten la medicamente) Paclitaxel (supraexprimare n cancer: rezisten la medicamente) Substraturi CYP3A4 Digoxin Fexofenadin BSEP MRPs conjugai Glutation Conjugai glucuronid Conjugai sulfat Antivirale nucleozide

386

12.9. Polimorfismul genetic al intelor medicamentelor

Polimorfismul intei unui medicament influeneaz direct efectele farmacodinamice ale medicamentului. Identificarea i investigarea polimorfismului printre intele medicamentelor este o sarcin complicat, pentru c, cel puin n condiii in vivo, efectul msurabil al medicamentului este mai mult sau mai puin sub control poligenic, ceea ce face dificil segregarea fenotipurilor implicate. n ciuda acestui fapt, au existat numeroase ncercri de a stabili relaii ntre polimorfismele izolate ntr-o singur gen ce codific inta unui medicament i rspunsul anticipat al medicamentului . Unele din aceste ncercri au avut succes, n timp ce altele au artat inconsecvene de-a lungul studiului, sugernd c n aceste cazuri sunt implicate mecanisme genetice mai complexe. Acest lucru va fi ilustrat prin exemplele urmtoare. 12.9.1. Polimorfismul proteinei de transfer a esterilor de colesterol (CETP) ca biomarker la rspunsul terapiei de scdere a lipidelor CETP, care este implicat n controlul plasmatic al nivelurile de lipoproteine cu densitate nalt (HDL), s-a dovedit a fi polimorfic. Polimorfismul CETP include un polimorfism de restricie n intronul 1 din gena CETP, numit TaqIB. Prezena situsului de restricie este denumit B1 i absena lui este denumit B2. La caucazieni, 30% din populaie sunt purttori ai genotipului B1B1 i respectiv, 19% ai genotipului B2B2, ceea ce corespunde la o frecven de 59% pentru alela B1 i 41% pentru alela B2 [Kuivenhoven, i colab., 1998]. Varianta B1 a genei CETP a fost asociat cu concentraii plasmatice ridicate ale CETP i mai mici de HDL dect n cazul variantei B2. n plus, s-a constatat o asociere ntre alelele B1 i un grad mai mare de ateroscleroz coronarian, cu progresia cea mai pronunat a aterosclerozei la purttorii B1B1, un grad intermediar de progresie la purttorii B1B2 i cu progresia cea mai redus la purttorii B2B2.

387

Terapia cu pravastatin ncetinete progresia aterosclerozei coronariene la transportorii B1B1, dar nu i la purttorii B2B2 (reprezentnd 16% din pacienii care iau pravastatin). Acest lucru a sugerat c polimorfismul CETP pare a anticipa dac brbaii cu boli coronariene ar putea beneficia de tratamentul cu pravastatin pentru a ntrzia progresia aterosclerozei coronariene. Totui, de cnd polimorfismul TaqIB este localizat la nivel intronic n gena CETP, o relaie de cauzalitate ntre genotip i rspunsul la medicamente pare s fie exclus. Este mult mai probabil ca acest polimorfism s constituie un marker nefuncional, care este n dezechilibru de linkage aproape complet cu polimorfismul CETP /-629, un polimorfism funcional n regiunea promotorului genei CETP [Maitland-van der Zee i colab., 2002]. 12.9.2. Receptorul 2-adrenergic: predictibilitatea haplotipului versus SNPs S-a demonstrat c efectul bronhodilator al agonitilor receptorului 2adrenergic este condiionat de polimorfismul receptorilor. Receptorul 2-adrenergic, un exemplu tipic de receptor cuplat cu proteina G, interacioneaz cu cotecolaminele endogene i diverse medicamente. Receptorul exist ntr-o varietate de esuturi, i este implicat n reglarea cardiac, vascular, pulmonar i funcionarea metabolic. Activarea 2-adrenoreceptorilor n plmni are ca rezultat relaxarea musculaturii netede a cilor respiratorii i, astfel, agonitii 2-adrenoreceptorilor sunt frecvent utilizai ca bronhodilatatori la astmatici. Multiple mutaii n gena 2-adrenoreceptorului sunt cunoscute, iar unele dintre ele sunt n dezechilibru de linkage. Un studiu recent a identificat un total de 13 SNPs organizate n 12 haplotipuri [Drysdale i colab., 2000]. Au fost mai multe ncercri de a corela rspunsul la terapia cu bronhodilatatoare cu diferite polimorfisme ale genei 2-adrenoreceptorului. De exemplu, rspunsul la albuterol s-a fost dovedit a fi puternic asociat cu un SNP n gena 2-adrenoreceptorului, avnd ca rezultat schimbri de aminoacizi n receptor la nivelul codonului 16 (ArgGly).
388

Creterea FEV1 a fost de 6,5 ori mai mare la pacienii care au fost homozigoi pentru 16Arg/16Arg comparativ cu pacienii cu genotip Gly/Gly. Totui aceast relaie nu a putut fi confirmat constant de ctre alte studii [Tan i colab., 1997]. Aplicnd abordri de gene candidate, un alt grup de cercettori a determinat rspunsul la tratamentul bronhodilator cu albuterol la indivizii cu cele mai frecvente 5 haplotipuri de receptori 2-adrenergici. Ei au artat c rspunsurile variaz de mai mult de 2 ori i sunt asociate n mod semnificativ cu perechile de haplotipuri, dar nu sunt legate de SNPs individuale. 12.9.3. Polimorfismul intei unui medicament poligenic: rspunsul la tratamentul cu Clozapin Clozapina, un antipsihotic atipic, interacioneaz cu o varietate de receptori pentru medicamente, de exemplu, receptorii adrenergici, receptorul dopaminergic D3 i receptorul pentru neurotransmitorul serotonin. Dei, se consider c variaia alelic a receptorului pentru neurotransmitorul serotonin 2A (5-HT2A) este un factor n determinarea rspunsului la clozapin, aceasta nu poate explica dect parial variaiile interindividuale [Arranz i colab., 1998]. Un studiu implicnd multiple gene candidat a fost realizat n scopul de a gsi asocieri, cu valori de predicie mbuntite. Au fost studiai nousprezece polimorfisme dintr-un set de nou subtipuri de receptori int pentru clozapin plus un transportor de neurotransmitor . Cea mai puternic asociaie a fost gsit pentru o combinaie de patru polimorfisme ale 5-HT2A, un polimorfism 5-HT2C, un polimorfism al promotorului transportorului de serotonin (5-HTTLPR) i receptorului pentru histamin, conducnd la 76% predictibilitate pentru rspunsul la clozapin i o sensibilitate de 95% pentru un rspuns satisfctor [Arranz i colab., 2000]. Alte exemple de polimorfism ale receptorilor pentru medicamente sunt redate n tabelul 12.3.

389

Tabelul 12.3 Polimorfismul receptorilor pentru medicamente Gena/ produsul genei Substrat medicamentos (efect) Proteina de transport a esterilor Pravastatin (nivel sczut de HDL, progresia de colesterol (CETP) aterosclerozei) Receptorul 2-adrenergic Albuterol (rspuns la astmatici, control slab al astmului) Ventolin (rspuns la astmatici, control slab al astmului) 5-HT2A Clozapina i alte neuroleptice (eficacitate medicamentoas variabil, rspuns antipsihotic tipic i rezultate pe termen lung) 5-HT26 Clozapina (rspuns la schizofrenici) 5-HT6 Clozapina i alte neuroleptice (rspuns la medicamente) Transportorul serotoninei Antidepresive, de exemplu, clomipramina, fluoxetina, (5-HTT) paroxeina, fluvoxamina (neurotransmisia 5-HT, rspuns antidepresiv) Receptori dopaminergici D2, Antipsihotice, de exemplu, haloperidol, clozapina, D3, D4 tioridazina nemoraprida [rspuns antipsihotic (D2, D3,D4), diskinezie tardiv indus de antipsihotice (D3), akatizie acut indus de antipsihotice (D3), hiperprolactinemia la femei (D2)] 5-Lipoxigenaza la nivelul Inhibitori ai sintezei de leukotriene (rspuns la promotorului (ALOX 5) astmatici) Enzima de conversie angiotensinei (ACE) a Inhibitori ACE, de exemplu, enalapril, lisinopril, captopril (efecte renoprotective, reducerea bp, reducerea masei ventriculare stngi, mbuntirea funciei endoteliale, inhibitorii ACE induc tuse, nefropatie IgA) Receptorul pentru bradikinina Inhibitori ACE ( inhibitorii ACE induc tuse) B2 Stromelizina Pravastatin (eficacitate n ateroscleroza coronarian i restenozare) -Fibrinogen Pravastatin (progresie sczut a bolii coronariene arteriale) Lipaza hepatic Lovastatin / colestipol sau niacin / colestipol (mbuntirea stenozei coronariene) Receptorul pentru sulfoniluree Tolbutamida (eliberare de insulin indus de sulfoniluree, rspuns la insulin i peptidul C seric) Canalul HERG Quinidina (sindrom de QT lung indus de consumul de medicamente) Canalul KvLQT1 Terfenadina (sindrom de QT lung indus de consumul de medicamente) Meflaquina (sindrom de QT lung indus de consumul de medicamente) Disopiramida (sindrom de QT lung indus de consumul de medicamente) Cisaprid (polimorfismul Y315C torsada vrfurilor) Canalul hKCNE2 Bactrim quinidina (aritmie indus de medicamente) Bactrim (aritmie indus de medicamente) Procainamida(aritmie indus de medicamente) Oxatomida (aritmie indus de medicamente) Claritromicina (torsada vrfurilor) 390

Inozitol-p1p Apolipoproteina E4 Receptorul ryanodinic Receptorul FC trombocitar (FCR II) Proteina Gs Glicoproteina IIIa subunitate a receptorului glicoproteinei IIb/IIIa Receptorul de estrogen Proteina G 3 -Adducina Angiotensinogen Gena protrombinei Factorul V Metilguanin metiltransferaza

Litiu (rspuns la boala manico- depresiv) Simvastatin (mortalitate ameliorat) Tacrina (rspuns la boala Alzheimer) Halotan sau succinilcolina (hipertermie malign indus de consumul de medicamente) Heparina (trombocitopenie indus de heparin) -blocani, de exemplu, metoprololul (efect antihipertensiv) Aspirin (efect plachetar) inhibitorii glicoproteinei IIb/IIIa, de exemplu, abciximab (efect antiplachetar) Estrogeni conjugai (creterea densitii minerale osoase); nlocuire hormonal (creterea HDL) Antidepresiv (rspuns la tratamentul antidepresiv), diuretic (efect diuretic) Diuretice (efect hipotensiv) Inhibitorii ACE (efect hipotensiv ??) Contraceptive orale (polimorfismul G20210A: tromboz venoas cerebral) Contraceptive orale (polimorfismul G1691A: tromboz venoas cerebral) Carmustina (rspuns al gliomului)

12.10. Concluzii
Cercetrile farmacogenetice au demonstrat c polimorfismul genetic este un factor important n disponibilitatea i rspunsul medicamentelor la om. n special n domeniul metabolismului medicamentelor, cunotinele actuale ne permit s explicm diferenele farmacokinetice interindividuale prin polimorfismul genetic. Cu toate acestea, elucidarea relaiei dintre rspunsul individual la medicamente i genotip este mult mai dificil din cauza naturii sale poligenice i, prin urmare, aceasta nu poate fi realizat prin abordri de mecanisme farmacogenetice. Strategiile care sunt capabile s abordeze polimorfismul poligenic sunt la nivel de cutri genomice pentru polimorfismele asociate cu efectele medicamentelor, utiliznd hri SNP anonime de nalt densitate i strategii de gene candidate, care preiau avantajul cunotinelor existente despre farmacodinamica i disponibilitatea medicamentelor. n prezent, abordrile candidate par a fi mai promitoare, pentru c se concentreaz pe un numr uor de manageriat de gene i polimorfisme care par a fi
391

importante, i primele rezultate par a fi promitoare (de exemplu, n cazul rspunsului la tratamentul cu clozapin, aa cum s-a prezentat anterior). Dincolo de capacitile tehnologice curente i cerinele rezonabile de resurse, abordrile genomului la nivel farmacogenetic are potenialul de a descoperi determinani genetici n rspunsul la medicamente ntr-o manier mai cuprinztoare i mai precis. Astfel, bazat pe o mai bun nelegere a relaiei dintre variabilitatea genetic i succesul terapeutic, farmacogenetica ne va permite s facem predicii referitoare la rspunsul individual la terapia medicamentoas. Cunotiinele de farmacogenetic n practica clinic ar trebui s fac posibil selecia cea mai potrivit a medicaiei sau ar trebui s permit ajustarea dozelor individuale, n funcie de genotipul fiecrui pacient. n ceea ce privete dezvoltarea de noi medicamente, preselecia genetic a pacienilor care urmeaz s fie recrutai pentru studiile clinice, n respondeni i nonrespondeni ar putea ajuta la optimizarea trialurilor clinice, pentru c eliminarea nonrespondenilor ar putea determina o reducere a numrului de pacieni necesar pentru a se atinge semnificaia statistic. n cele din urm se urmrete nlocuirea strategiei curente care consider c un medicament este potrivit pentru toi indivizii, prin terapii individualizate cu medicamente sigure care sunt administrate in funcie de constituia genetic specific unui anumit pacient.

392

CAPITOLUL 13 FARMACOGENOMICA BIODISPONIBILITII I ELIMINRII MEDICAMENTELOR 13.1. Introducere

Efectele interindividuale ale medicamentelor fac obiectul unei substaniale variabiliti. La baza acestei afirmaii stau numeroase motive de ordin fiziopatologic, datorate interaciunilor din mediu intern dar i raiuni de ordin genetic. nc din 1953 s-a observat la pacienii care primeau un medicament tuberculostatic, i anume izoniazida, c dozarea n urin a produsului acesteia acetilat era diferit de la un pacient la altul. Conceptul de farmacogenetic a fost elaborat prima oar n 1958 de ctre geneticianul german Vogel, care a observat c variabilitatea individual a farmacocineticii se supune ntr-o oarecare msur ereditii familiare. De atunci, s-au obinut succese remarcabile n domeniul farmacogenomicii. n special identificarea polimorfismului genelor sistemului citocromului P450 (CYP) a contribuit considerabil la explicarea variabilitii individuale a farmacocineticii pentru anumite medicamente. Mai mult, de curnd au fost elucidate variaiile ereditare ale genelor transportorilor membranari ai medicamentelor. Alturi de aceti factori care pot influena farmacocinetica s-au fcut eforturi pentru clarificarea rolului polimorfismului genetic al receptorilor sau a proteinelor traductoare de semnal cu rol n modularea eficienei medicamentelor. Farmacogenomica ncearc s elucideze interaciunea complex a multor gene polimorfice pentru a putea explica i dezvolta n consecin strategii terapeutice optime, n special destinate bolilor frecvente, cum ar fi bolile cardiovasculare i cancerul. Aceast ncercare reprezint pe de o parte o adevrat provocare, att tehnic ct i logistic, determinat de milioanele de polimorfisme nucleotidice unice (SNPs) cunoscute pn acum.
393

13.2 Contribuia metabolismului la clearance-ul medicamentelor

13.2.1 Enzimele polimorfice ale citocromilor P/CYPs Enzimele de faza aIa catalizeaz reaciile de oxidare i reducere ale componenilor metabolici strini precum i transformarea anumitor lipide i steroizi.
Tabelul 13.1 Substratele enzimelor polimorfice ale citocromului importante funcional i frecvena lor la caucazieni [Ingelman-Sundberg, 2001] CYP Substrate (selectate) Alele (ADNc Consecine relevant i/sau funcionale varianta proteic) * CYP2A6 -variate: cumarinice, 2(T479A,L160H) enzim inactiv * 4(deleia genic) nicotine fr enzim * 9(T-48G) expresie sczut * CYP2B6 -citostatice: 5(C1459T,R487C) activitate sczut ciclofosfamida,ifosfamida *7(G516T,Q172H; activitate sczut A785G,K262R; benzodiazepine: C1459T,R487C) diazepam, tenazepam, midazolam -variate: clopidrogel, nicotina, tamoxifen * CYP2C8 -variate: paclitaxel, 2(A805T,1269F) activitate sczut * rosiglitazona 3(G416A;R139K; activitate sczut A1196G,K399R) * CYP2C9 antiinflamat. nesteroidiene: 2(C430T,R144C) activitate sczut * diclofenac, ibuprofen, (S) 3(A1075C,1359L) activitate sczut naproxen, meloxicam, piroxicam, tenoxicam -antidiabetice orale: glibenclamid, glipizida, tolbutamina -AT1-antagoniti: irbesartan, losartan, valsartan -variate:amitriptilina, fluoxetina, fenitoina, sulfametoxazol, tamoxifen, torasemid,(S)-varfarina * CYP2C1 -inhibitoare de pomp de 2(G681A, mutaie enzim inactiv protoni: lansoprazol, a situsului de omeprazol, pantoprazol clivare) * anticonvulsivante: 3(G636A, stop) enzim inactiv diazepam, fenitoina, (S)-mefenitoina -antipsihotice: citalopram,clomipramina, imipramina -variate:moclobemid, proguanil, propanolol 394 P450, alelele Frecvena alelelor (%) 1-3 1 5 14 1

0 13 8-13 7-9

13 0

CYP2D6 --blocante: alprenolol, carvedilol, metoprolol, propanolol antiaritmice:propafenona, encainida, flecainida, mexiletin, sparteina -neuroleptice: haloperidol, perhexilina, perfenazina, risperidon, tioridazina -antidepresive: amitriptilina, clomipramina, desipramina, fluoxetina, fluvoxamina, imipramina, maprotilina, nortriptilina, paroxetina,codeina, dextrometorfan, tramadol, amfetamina, fenacetina metoxiamfetamina, Debrisoquine, ondasetron, CYP2E1

2XN(duplicaie genic) * 2(R296C;S486T)

activitate crescut 1-5 activitate uor sczut enzim inactiv fr enzim fr enzim 12-21

4(G1846A mutaie a situsului de clivare) * 5(deleie genic) * 6[T1707cu decalarea cadrului de citire (frameshift)] * 10(P34S) * 17(T107I;R296C) * 41(G-1584C)

4-6 1 1-2

activitate sczut activitate sczut expresie sczut

<1 10-20

* -anestezice: 2(R76H) enfluran, halotan, izofluran, metoxifluran, *3(V381I) * sevofluran, 4(V179I) -variate: paracetamol, clorzoxazona, etanol CYP3A5 se suprapun larg cu *3 (mutaia substratele CYP3A4 intronului 3 A6986G la nivelul situsului de clivare)

activitate sczut enzim inactiv enzim inactiv

0 <1 <1

fr enzim

94

Enzimele CYPs sunt cele mai importante iar familia CYP3A contribuie la aproximativ 50% din totalul activitii CYP la nivelul ficatului adult uman i metabolizeaz aproximativ 60% din toate medicamentele uzuale. Principalul subiect al polimorfismului ereditar l constituie genele CYP2C9, 2C19 i 2D6 care contribuie la metabolizarea a circa 30% din medicamente (tabelul 13.1). Mai mult, exist polimorfisme cunoscute la nivelul genelor CYP1A1, 1A2, 1B1, 1A6, 2B6, 2C8, 2E1, 3A4, 3A5, 3A7, 5A1 i 8A1 ns importana lor funcional rmne controversat.

395

13.2.1.1. CYP2C9 La nceputul anului 1999 a fost publicat un studiu n care se arta c pacienii care au primit doze sczute de derivat cumarinic-varfarina pentru profilaxia accidentelor trombotice au prezentat episoade semnificativ mai crescute de hemoragie dect un grup de control care a primit nite doze superioare. Aceast descoperire aparent paradoxal a fost determinat de faptul c, un numr mare de metabolizatori leni (PMs) ai CYP2C9 au fost decelai la grupul care a primit un regim cu dozaj sczut. Clerance-ul S-enantiomerului efector al varfarinei a fost decelat ca semnificativ sczut la aceti pacieni determinnd concentraii plasmatice intermediar crescute i nu concentraii sczute aa cum era de ateptat la pacienii care au primit doze reduse. Consecutiv, sinteza de factori de coagulare dependeni de vitamina K a fost puternic inhibat n raport cu valorile Ratei Normalizate Internaionale (INR) prezentnd i o crescut tendin la episoade hemoragice. CYP2C9 aparine grupului de gene de pe cromozomul 10, care cuprinde CYP2C8, 2C9, 2C18 i 2C19. Deficiena de CYP2C9 este determinat ntr-o mare proporie, de dou mutaii punctiforme care conduc la schimbul de aminoacizi: Arg144Cys (CYP2C9*2) i Ile359Leu (CYP2C9*3). Frecvena alelelor la populaia germanic este cuprins ntre 11 i 7%. Homozigoi reprezentativi pentru fenotipul PMs au o prevalen de 3,2%. n mod interesant, la asiatici o schimbare alternativ de aminoacizi: Ile359Thr a fost decelat, i denumit CYP2C9*4. Mai mult, un polimorfism al exonului 7 (2C9*5; Asp360Glu) [Dickmann i colab., 2001] i un codon stop prematur, datorat unui polimorfism de deleie 818delA care nu a demonstrat activitate (2C9*6), au fost evideniate la populaia afro-american. Pn azi, 12 alele diferite au fost recunoscute de Comitetul de Nomenclatur al Alelelor Citocromului Uman P450 (CYP). Pe lng varfarin (prezentat ns ntr-o concentraie mult mai redus- fenprocumonul) multe antiflogistice nestreroidiene cum sunt diclofenacul, ibuprofenul i meloxicamul, antidiabetice orale ca tolbutamida glimenclamida, antagoniti ai receptorilor angiotensinei ca irbesartan i losartan ca i alte medicamente dintre care amintim fenitoina sunt metabolizate de CYP2C9 [Kirchheiner i colab., 2003]. Exist probe din ce n ce mai certe despre clerance-ul
396

antidiabeticelor orale care este direct dependent de genotipul CYP2C9. Consecinele nu sunt pe deplin elucidate. Dup administrarea de glibenclamid zona de sub curb (AUG) a crescut cu trei sau patru straturi, ns nivelul de glucoz la purttorii heterozigoi de variaii CYP2C9 nu a fost diferit. La purttorii homozigoi de CYP2C9*3 aceste efecte sunt mai pronunate i sunt reflectate ntr-un rspuns accelerat la stimularea cu glucoz. 13.2.1.2. CYP2C19 CYP2C19, aa numita mefenitoin hidroxilaza, catalizeaz n special hidroxilarea inhibitorilor pompei de protoni cum sunt omeprazolul i lanozoprazolul. Pe lng alte mutaii, o mutaie a situsului de clivare conduce la o inactivare complet a enzimei la 3-5% dintre caucazieni. n mod interesant, exist unele dovezi c purttorii PMs profit mai mult de terapia de eradicare a lui Helicobachter pylori. Doar 80% dintre pacienii purttori de tipuri slbatice de CYP2C19 au fost tratai cu succes n timp ce purttorii de CYP2C19*2 au prezentat toi mbuntiri [Kawamura, 2003]. Aceste rezultate interesante nu au putut fi ns confirmate prin alte studii ns efecte similare celor CYP2C19 dependente pot fi evideniate n cadrul tratamentului refluxului gastroesofagian [Furuta, 2002]. CYP2C19 prezint un polimorfism ridicat, SNPs noi fiind recent descoperite [Blaisdell, 2002]. n prezent sunt confirmate 15 alele diferite, ns majoritatea variantelor genetice identificate sunt caracterizate de o prevalen extrem de sczut. Pe lng mutaia situsului de clivare G681A, de asemenea G636A (CYP2C19*3) ar trebui luat n considerare la alctuirea genotipului persoanelor de ras neagr i orientalilor. Cu toate acestea, acest codon stop prematur, din codonul 212 apare rar la caucazieni. 13.2.1.3. CYP2D6 Pe lng CYP3A, enzima cu nalt polimorfism CYP2D6 este una dintre cele mai studiate enzime CYP. Acum aproximativ 40 de ani s-a observat c variabilitatea interindividual extrem de crescut a concentraiilor plasmatice ale nortriptilinei are un fundal genetic extrem de puternic i este bazat pe ratele metabolice diferite de la
397

individ la individ (pentru detalii vezi Bertilsson i colab., 2002). Ulterior s-a demonstrat c metabolismul debrisochinei, medicament antihipertensiv, i al sparteinei, un antiaritmic, este polimorfic iar metabolizarea este realizat de ctre aceeai enzim CYP2D6. n special antidepresivele i neurolepticele, care prezint un numr considerabil de efecte adverse, sunt de asemenea metabolizate de ctre hidroxilaza sparteinei/debrisochinei. Prin urmare, a devenit clar ntr-un timp scurt c aceast trstur genetic poate avea consecine clinice severe. CYP2D6 este azi cunoscut a fi una dintre cele mai importante gene polimorfice implicate n metabolismul medicamentelor. Aproximativ 7-10% din populaia european a PMs prezint CYP2D6 i un metabolism redus pentru numeroase medicamente asemenea antiaritmicelor, antidepresivelor, neurolepticelor i de asemenea pentru unele blocante i opiacee. n cadrul acestui subgrup, apariia efectelor secundare clinic relevante ale medicamentelor sunt mai probabile comparativ cu persoanele care prezint metabolizatorii buni/inteni (EMs). Lipsa ocazional a unor efecte secundare este explicat n unele cazuri pe seama fenomenului de duplicaie genic i apare la circa 1-3% din persoanele din Europa Central. CYP2D6 aparine unei agregri genice a pseudogenei, puternic omolog inactiv, CYP2D7, care conine un singur cadru de citire ce perturb inseria la nivelul primului su exon i pseudogena real CYP2D8. Gena CYP2D6 este legat de cromozomul 22q13.1 i conine 9 exoni cu un cadru de citire deschis, de 1383 bp, care codific 461 de aminoacizi. Polimorfismele sunt bine i extensiv caracterizate de ctre Sachse i colab.,(1997). Astzi, peste 73 de haplotipuri diferite de CYP2D6 sunt nregistrate de ctre Comitetul de Nomenclatur al Alelelor Citocromul Uman P450 (CYP) (http://www.iim.ki.se/cypalleles). Alelele pot fi clasificate pe baza nivelului de activitate la care codific enzimele CYP2D6 n grupuri funcionale, nonfuncionale i cu funcionalitate redus. Unul dintre defectele genetice primare de la nivelul locusului CYP2D este CYP2D6*4, care apare cu o frecven de 20,7% la caucazieni. O translocaie a G1846A genereaz o modificare a situsului de clivare la limita dintre intronul 3 i exonul 4, determinnd n continuare apariia unor noi proteine nefuncionale. ntreaga regiune de codificare sufer o deleie la 4-6% dintre
398

caucazieni i alte grupuri etnice. Prin urmare, alela *5 este considerat a avea o origine strveche. Alte variante relevante sunt reprezentate de deleii ale 2549A la nivelul alelei *3 (2,0%) i ale 1707T la nivelul alelei *6 (0,9%), genernd modificri de cadru de citire. Contrastnd cu aceste polimorfisme fatale, o deleie tripl a perechii de baz la nivelul alelei *9 (1,8%) nu altereaz neaprat activitatea enzimei, iar un schimb al prolinei cu serina la nivelul codonului 34 este asociat cu o activitate enzimatic mai sczut i n mod particular cu o scdere a stabilitii CYP2D6.10 [Nakamura i colab., 2002]. Aceast variant apare la 1-2% dintre caucazieni, ns reprezint cauza major a activitii sczute a CYP2D6 la orientali. La rasa neagrafrican, alela *17 reprezint una dintre motivele majore ale activitii sczute a CYP2D6. Activitate extrem de crescut a CYP2D6 a fost identificat la circa 1-2% dintre caucazieni ca urmare a duplicaiei genice a alelelor *1 (*1X2) i *2 (*2X2). n Europa de Nord prevalena scade sub 2%, ns n anumite regiuni din Spania au fost nregistrate i frecvene de peste 7%. n rile Arabe, precum i n nord-estul Etiopiei, au fost raportate prevalene ale metabolizatorilor ultrarapizi (UMs) de pn la 29%. n cteva cazuri au existat familii cu peste 13 copii genice identificate. n contrast, n China, duplicaiile genei CYP2D6 sunt extrem de rare, dar media ratei de metabolizare a debrisochinei/4-hidroxidebrisochina este mai crescut dect la caucazieni. Acest fapt se datoreaz prevalenei crescute a variantelor alelice CYP2D6 *10 puin active. Cu toate acestea, la populaia de culoare pare s existe o heterogenitate extins. Fenotipul metabolizatorilor intermediari (IMs) poate fi i rezultatul ratelor de expresie sczute ale CYP2D6, spre exemplu exist dovezi considerabile c homozigoii cu polimorfism C/G 1584, prin contrapoziionarea codonului strat, prezint o expresie proteic de doar 50%, comparativ cu purttorii variantei 1584G [Zanger i colab., 2001]. Aceast variant CYP2D6*2 linkat, denumit CYP2D6*41 poate mbunti activitatea aa numiilor IMs. Pn acum au fost raportate multe alele, ns unele extrem de rare au fost evideniate doar la populaii specifice [Ingelman-Sundberg i colab., 2001]. Dei rata
399

de metabolizare a dextrometorfanului spre exemplu, poate varia foarte mult ntre indivizii cu acelai genotip, cu mai mult de un grad de magnitutidine, genotiparea realizeaz o valoare predictiv de ncredere a statusului PM, IM, EM i UM pentru CYP2D6. Primul caz de duplicare genic a fost identificat la un pacient care prezenta un nivel plasmatic extrem de sczut al nortriptilinei post terapie oral. Fenotipul UM al CYP2D6 este azi bine determinat drept cauz relevant a lipsei de rspuns la terapia antidepresiv. Clerance-ul unor asemenea medicamente cum este nortriptilina, desipramina, i pn la un anumit nivel imipramina i amitriptilina, depinde n mod evident de polimorfismul CYP2D6. Inhibitori ai recaptrii serotoninei ca fluoxetina, citalopramul sau paroxetina au fost demonstrai drept inhibitori ai CYP2D6. n mod interesant, un studiu axat pe efectele secundare asemenea miclotoniilor i convulsiilor, post tratament cu antidepresive, nu a putut arta nici un pacient cu un status PM al CYP2D6, ns jumtate au fost tratai concomitent cu medicamente ce aveau efecte potenial inhibitorii asupra CYP2D6. Efectele polimorfismului CYP2D6 asupra terapiei antipsihotice par a fi mai pronunate pe neuroleptice. Compui ca perfenazina, zuclopentixolul, tioridazina, haloperidolul i risperidona sunt metabolizai pn la un nivel ridicat de ctre CYP2D6. Purttorii PMs par s prezinte un risc crescut de afectare de ctre efectele secundare asemenea simpomelor extrapiramidale [Scordo i colab.,2002; Brockmoller i colab., 2002]. Mai mult, eficiena antipsihoticelor pare a fi influenat de numrul de copii active ale genelor CYP2D6. Descoperirile recente au artat c este necesar genotiparea anterioar tratamentului cu antipsihotice polimorfic metabolizate [Dahl , 2002]. Impactul enzimelor cu polimorfism ridicat asupra terapiei bolilor cardiovasculare este controversat i pentru certificare sunt necesare mai multe date, spre exemplu propafenona prezint o inhibiie ridicat a receptorilor , la purttorii PMs, i s-a sugerat c determin efecte adverse puternice la un pacient PM pentru CYP2D6. ns, flecainida este parial metabolizat de CYP2D6, dar aparent comportarea electrofiziologic a inimii nu a fost influenat determinant de ctre genotip. blocantele, asemenea metoprololului, i ntr-o anumit msur carvedilolul,
400

sunt de asemenea substraturi CYP2D6. Chiar dup terapia de durat, la purttorii PMs, media ajustat a concentraiilor plasmatice ale metoprololului a fost de circa 6,2 ori mai mare comparativ cu purttorii EMs [Rau i colab., 2002]. Dintr-un studiu al efectelor adverse ale terapiei cu metoprolol, acelai grup de cercettori au concluzionat c efectele adverse s-ar putea datora genotipului CYP2D6, n condiiile n care, frecvena PMs a fost ridicat la un grup restrns de pacieni care prezentau i efecte adverse extrem de pronunate [Wuttke i colab., 2002]. Cu toate acestea, n prezent nu exist date care s ateste dac rezultatul clinic al terapiei cu blocante este influenat de polimorfismul genetic al CYP2D6. Beneficiul genotiprii CYP2D6 asupra terapiei medicamentoase a fost relevat recent, n cadrul tratamentului senzaiei de grea i simpomatologiei de vom n cadrul chimioterapiei anticanceroase cu antiemeticul antagonist al receptorului 5-HT3, topisetron [Kaiser i colab., 2002]. ntr-un studiu n care au fost inclui 42 de pacieni, cu cancer, care primeau chimioterapie, aproximativ 32% dintre acetia experimentau senzaii de grea i vom. Purttorii CYP2D6 UMs, ns, prezentau o frecven mult mai crescut a manifestrilor de vom dup terapie. Autorii au concluzionat c tratamentul antiemetic cu topisetron sau, ntr-o mai mic msur, cu odansetron ar putea fi mbuntit prin ajustarea dozelor prin genotiparea CYP2D6 i c aproximativ 50 de pacieni ar trebui genotipai pentru a proteja un singur pacient de efectele emetice severe. 13.2.1.4. CYP3A Familia CYP3A const ntr-un numr determinat de enzime implicate n metabolizarea unor medicamente bine cunoscute. Din aceast familie fac parte enzime ca CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 fetal i recent identificata CYP3A43. Variabilitatea interindividual a activitii totale a CYP3A este datorat n parte prezenei sau absenei CYP3A5 active. Mai puin de o treime dintre caucazieni i 66% din populaia neagr-african prezint expresia CYP3A5, datorat unei schimbri G/A de baz ADN n interiorul intronului 3. Aceast SNP conduce la clivare alternativ i la generarea unui codon stop prematur n exonul 3B, avnd drept
401

rezultat inactivarea CYP3A5*3. Acest polimorfism explic, cel puin parial, distribuia bimodal a cineticii midazolamului. Adiional, n rndul afro-americanilor a fost identificat o SNP G/A rar la nivelul exonului 7, asociat cu reducerea activitii CYP3A5 (CYP3A5*6). n afar de CYP3A5, CYP3A4 contribuie la clerance-ul midazolamului. Recent, a fost descoperit un polimorfism semnificativ funcional al CYP3A4 (L373F) . Acesta reduce afinitatea midazolamului la CYP3A4 de la KM de 8,7M la 36,4M. Mai mult SNPs nou descoperite conduc parial la scderea sau chiar absena expresiei. Cu toate acestea, datorit raritii acestor polimorfisme, ele nu contribuie la explicarea variabilitii individuale ale activitii CYP3A4. CYP3A pot fi puternic induse de medicamente ca rifampicina, carbamazepina, fenobarbitalul sau altele. Ele interacioneaz cu receptorul nuclear X (PXR), interaciune uramat de dimerizarea cu receptorul al acidului 9-cis-retinoic (RXR) i legarea la elementele responsive ale promotorului respectiv. Prin urmare, variantele genetice ale genei PXR ar putea fi implicate n determinarea variabilitii activitii CYP3A. ntr-adevr, PXR prezint numeroase variante, cel puin ase dintre ele genernd schimburi de aminoacizi. Varianta 163G induce 15 falduri/mpachetri la rifampicin n comparaie cu doar 5 falduri la cei cu variant 163D. Alte variante asemenea V140M i A370T prezint efecte de semnificaie minor. Aceste descoperiri arat importana major a interaciunii dintre gene i mediu nconjurtor, n condiiile n care, polimorfismul PXR nu afecteaz activitatea bazal a CYP3A ns inducia CYP3A sufer modificri. De asemenea, n polimorfismul CYP3A4, prevalena SNPurilor PXR este relativ aczut, prin urmare activitatea CYP3A poate fi explicat doar n mic msur, de ctre aceast variabil. 13.2.2 Enzimele de faza aIIa 13.2.2.1. (Aril)amine N-acetiltransferaze (NAT2) Dup o perioad relativ scurt de la introducerea izoniazidei n tratamentul clinic al tuberculozei, s-a observat c exist diferene interindividuale considerabile n ceea ce privete excreia urinar a metabolitului acetilat. Enzima responsabil, NAT2,
402

catalizeaz acetilarea unor substraturi ca sulfametazina iar aparentele diferene interindividuale ale acetilrii izoniazidei au fost cauzate de polimorfismul genetic al genei NAT2. Acetilarea lent la oameni, s-a demonstrat a fi bazat mai degrab pe activitatea redus dect pe ratele sczute de expresie. NAT2 este exprimat de regul n ficatul uman, n timp ce gena nrudit NAT1 poate fi exprimat ntr-o mare varietate de esuturi. Studii ale fenotipului desfurate pe parcursul ultimelor patru decenii au relevat o variabilitate etnic a frecvenei de acetilare lent. Extremele pot fi gsite n Africa de Nord, cu o frecven a alelelor care codific acetilarea lent de 95%, iar la polul opus n regiunea Est Pacific ndeprtat unde frecvena este de doar 11%. Aa cum era de ateptat, repartiia acetilatorilor leni, la aceste populaii, este cuprins ntre 90 i 1,2%. Determinri ulterioare, datorate genotiprilor adiacente au relevat c modelul alelic difer semnificativ ntre populaia caucazian, asiatic, aborigen i, n special, la populaia de culoare. La caucazieni, alelele predominante sunt cele lente NAT2*5B (40,9%) i *6A (28,4%) i cele rapide *4 (23,4%). Toate celelalte alele au o frecven mai sczut de 3%. La asiatici, n cadrul acetilatorilor leni, alela NAT2*6A este cea mai comun n comparaie cu alela*5B, spre exemplu frecvena este de 23% pentru prima alel n comparaie cu 19% pentru a doua n Japonia. n mod interesant, mutaia 857A care are loc la nivelul alelei *7B, are o frecven de 11% la aborigenii australieni. n Africa, pe lng mutaiile G191A, frecvent observate, poate fi de asemenea decelat o mare diversitate a halotipurilor. Pe lng alela rapid *4, au fost identificate de asemenea i *12A i *3 n probele obinute de la diferite triburi. NAT2 este responsabil de conjugarea unor medicamente ca izoniazida, dapsona, procainamida i multe altele. Acetilatorul lent NAT2 se presupune a fi supus unui risc crescut de afectare datorit efectelor secundare ca neuropatia periferic post terapie cu izoniazid sau datorit unor afeciuni asemenea lupusului eritematos indus medicamentos i sindromului Stevens-Johnson. Aceste afeciuni severe pot fi cauzate, la indivizi susceptibili, de ctre un numr mare de medicamente implicate n metabolismul de acetilare, cu meniunea c nu exist nici o asociere cu
403

forma idiopatic a lupusului eritematos [Zschieschang i colab., 2002]. Neuropatia periferic cauzat de supradozajul cu izoniazid poate reprezenta o problem real n cadrul grupurilor etnice cu o frecven crescut a acetilatorilor leni aa cum ntlnim n Africa de Nord. Eficiena sczut a medicamentelor este de ateptat s apar la cei care prezint acetilare rapid. 13.2.2.2. Tiopurin-S-metiltransferaza (TPMT) Un efect secundar rar dar extrem de grav post terapie cu antimetaboliii 6mercaptopurina i azatioprina o reprezint aplazia medular sever, care poate deveni un efect secundar cu potenial letal. Detoxifierea are loc prin intervenia TPMT, o enzim de faz aIIa care este homozigot deficitar cu o inciden de aproximativ 1:300 de indivizi. La aceti pacieni, metabolizarea urmeaz o cale alternativ apelnd la 6-tioguanin nucleotida (6-TGN). Concentraiile plasmatice ale 6-TGN sunt corelate cu severitatea efectelor secundare medicamentoase. Cu toate acestea, apare o problem deoarece TPMT poate suferi un numr ridicat de mutaii care permit doar o genotipare limitat. Pn acum 8 mutaii care determin schimburi de aminoacizi i o mutaie a situsului de clivare, sunt cunoscute. Aparent exist chiar mai multe mutaii, dar sunt puine SNPs care pot determina o PM a TPMT. Multe clinici prefer nc proceduri de stabilire a fenotipului ex vivo, dar cunotinele actuale despre rarele variaii i aplicabilitatea unor tehnici cum ar fi cromatografia de denaturare de nalt performan, vor permite o predicie viabil a statusului TMPT prin intermediul genotiprii.

13.3. Transportorii medicamentelor: Glicoproteina P (P-gp)

Transportorii medicamentelor aparin superfamiliei casetei de legare a ATPului (ABC) din membrana proteic, i ei pot influena concentraia intracelular a unor compui numeroi dintr-o mare varietate de celule i esuturi. Iniial s-a observat c transportorii ABC, de tip P-gp au fost supraexprimai n celulele tumorale, conferind acestora proprietatea binecunoscut de rezisten medicamentoas multipl mpotriva agenilor antineoplazici cum sunt paclitaxelul, antraciclina, alcaloizii de
404

vinca i etoposidul. Gena care codific P-gp a fost definit prin urmare gena rezistenei medicamentoase multiple (MDR1) (ABCB1). Cu toate acestea, este bine stabilit c P-gp este responsabil de transportul apical al altor medicamente lipofilice variate cum sunt digoxina i blocantul celiprolol, i talinolol, inhibitoare ale sintezei colesterolului ca lovastatina, atorvastatina i simvastatina, inhitoarele proteazei HIV, indinavir i saquinavir, opioide i de asemenea ciclosporina A cu efect imunosupresor. Din moment ce P-gp mediaz transportul acestor compui importani prin membranele intestinale sau ale celulelor endoteliale de la nivelul capilarelor cerebrale, proteina poate de asemenea servi drept barier funcional mpotriva ptrunderii medicamentelor sau poate contribui la excreie (fiind exprimat la nivelul canaliculelor hepatocitelor sau la nivelul celulelor tubulare din rinichi). Mai mult, exprimarea la nivelul celulelor endoteliale ale barierei sanguine cerebrale protejeaz mpotriva penetrrii medicamentoase la nivelul sistemului nervos central. Prin urmare oarecii knockout P-gp prezint dispoziii semnificativ nalte ale substraturilor P-gp. La oameni, expresia P-gp prezint o mare variabilitate interindividual i face subiectul unor interaciuni medicament-medicament, spre exemplu agentul antituberculos rifampicina este un inductor eficient al P-gp ca i al MRP2 datorit elementului PXR din regiunea promotor a MDR1. Inducia P-gp a fost de asemenea observat dup coadministrarea de St. John Wort (extract de suntoare folosit adesea ca antidepresiv). Pe de alt parte competiia cu verapamilul poate determina de asemenea inhibarea activitii transportorului. Dei pare c P-gp este coreglat, sub multe aspecte, alturi de CYP3A4, nu exist nici o legtur cu exprimarea CYP3A4, ceea ce explic marea variabilitate interindividual. Prin urmare identificarea variantelor genetice n cadrul genei MDR1 a stimulat un numr mare de studii care au ncercat s investigheze corelaia dintre expresia P-gp i activitatea n dependen a SNPs din MDR1. MDR1 cuprinde 28 de exoni iar ADNc const n 3843 bp. Mickley i colab.,(1998) au descoperit SNPs cu dou sensuri, o transversie G2677T n exonul 21 i o translocaie a G2995A n exonul 24 al MDR1. Aceste SNPs au condus la un schimb Ala/Ser n codonul 893 i
405

respectiv o schimbare Ala/Thr n codonul 999. n mod notabil, alelele diferite au artat exprimri similare la nivelul esuturilor normale, liniilor celulare neselectate i la nivelul limfoamelor maligne netratate. Studii in vitro au confirmat aceste observaii [Kimchi-Sarfaty i colab., 2002]. Secvenionarea sistematic a tuturor exonilor MDR1 i ale regiunii 5' la indivizii caucazieni au relevat multiple SNPs. 12 din 15 mutaii nu au avut nici un efect asupra secvenei proteice. n mod ciudat a existat o corelaie semnificativ a unui polimorfism silenios la nivelul exonului 26 (C3435T) cu nivelul exprimrii intestinale a P-gp i biodisponibilitatea oral la digoxin. SNPul C3435T prezint o frecven a alelelor de 53,9% n cadrul unui grup de 461 de germani caucazieni, ns variaz semnificativ n cadrul altor grupuri etnice. Prevalena este mult mai sczut (0,17-0,27) la negrii-africani, n timp ce la populaia oriental valorile sunt cuprinse ntre 0,41 i 0,47. Aceste date se pot dovedi importante pentru determinarea probabilitii diferenelor interindividuale n ceea ce privete rspunsul la medicamente a anumitor populaii. n codonul 893, 6 genotipuri diferite pot exista ca i rezultat al combinaiilor celor trei alele 2677G, T i A cu frecvene alelice de 56,7%, 41,6% i 1,7% conducnd la aminoacizii Ala, Ser i respectiv Thr. Studii ulterioare au identificat un numr de mutaii cu frecven variabil i importan funcional discutabil. Aa cum am menionat mai sus, n investigaiile iniiale expresia P-gp a diferit semnificativ fiind dependent de C3435T, situat ntr-o poziie instabil a codonului 1145. SNP a fost asociat cu expresii sczute ale P-gp la nivelul mucoasei umane duodenale i activitate transportoare sczut. Mecanismul molecular prin care C3435T influeneaz expresia P-gp nu este nc pe deplin neles din moment ce nu exist nici o dovad a unui dezechilibru genetic linkat al diferitelor variante din regiunile promotoare ale genei MDR1 sau ale secvenelor care controleaz procesarea ARN-ului mesager. Cu toate acestea, descoperirea a fost susinut prin determinarea efluxului de rodamin 123 din celulele natural killer CD56+ [Hitzi i colab., 2001]. Acest efect remarcabil a fost de asemenea detectat la nivelul exonului 26 SNP, dei este mai puin pronunat la pacieni cu o stare stabil i tratai cu 0,25mg digoxin pe zi. Purttorii TT au prezentat o reducere cu 20% a AUC n primele 4 ore, iar
406

diferenele au fost mai pronunate dac ne gndim la haplotipurile C3435T i G2677T. Rezultate similare au fost obinute de un studiu francez asupra digoxinei [Verstuyft i colab., 2003]. Probabil c asemenea polimorfisme pot juca un rol important n cazul pacienilor care nu rspund la tratament. ntr-adevr, Schwab i colab.,(2003) au demonstrat o asociere cu bolile intestinale inflamatorii. Cu toate acestea, impactul funcional al C3435T nu este consistent. ntr-un studiu realizat pe 124 de germani care au suferit transplanturi renale i care au primit o microemulsie de ciclosporin cu substrat P-gp timp de cel puin 6 luni s-a constatat absena unor probe suficiente. AUCs nu au diferit n funcie de polimorfismul C3435T. Pe de alt parte, formula administrat coninea surfactantul nonionic Cremophor EL, care este cunoscut ca inhibitor al P-gp n ceea ce privete transportul paclitaxelului. Nici o asociere pentru C3435T nu a fost raportat la un grup de populaie de provenien japonez, la care sa evaluat dac expresia MDR1 se coreleaz cu expresia trofoblastului placentar P-gp i asta pe 100 de placente obinute de la femei japoneze. n contrast, n alte dou studii japoneze asupra cineticii digoxinei, nivelul AUC a fost semnificativ mai crescut n primele 4 ore la grupul homozigot pentru CC dect la cel pentru TT [Moriya si colab., 2002]. Studii ulterioare au investigat de asemenea efectele polimorfismului MDR1 asupra expresiei duodenale a ARNm, punnd n valoare expresii mai crescute la purttorii TT comparativ cu purttorii CC, ceea ce ar putea explica concentraiile sczute de digoxin la purttorii 3435CC. Investigaiile din cadrul unui studiu german care a testat 55 de voluntari aflai sub tratament cu blocantul talinolol, ca i medicament de testat, au relevat c exonul 26 SNP este de importan minor. ns, schimbul de aminoacizi Ala893Thr din exonul 21 se afl n corelaie cu concentraii plasmatice semnificativ alterate de talinolol. La purttorii variantelor TT/TA ale G2677T/A, valorile AUC ale talinololului oral au fost uor dar semnificativ mai ridicate comparativ cu purttorii a cel puin unui tip de alel slbatic (p=0,014), dar nu au existat modificri ale mARN sau ale expresiei proteice cel puin n ceea ce privete polimorfismele studiate.

407

Rezumnd, importana funcional a polimorfismului MDR1 rmne nc s fie elucidat. Posibil dezechilibrul de linkaj dintre exonul 26 C3435T i exonul 21 Ala893Ser poate contribui la variaiile activitii P-gp; cu toate acestea, nu exist nc o explicaie pentru asocierea dintre C3435T i expresia P-gp aa cum este descris n unele studii. Prin urmare se poate lansa o ipotez c C3435T reprezint un marker genetic pentru variante nc neidentificate situate la nivelul regiunii reglatoare a genei MDR1.

13.4. Concluzii
Adaptarea timpurie a schemelor terapeutice la trsturile genetice ar putea avea drept rezultat evitarea efectelor secundare i mbuntirea rezultatelor clinice ale farmacoterapiei. Genotiparea n loc de fenotipare pentru medicamentele de testat este de preferat a se realiza n timpul unei farmacoterapii n desfurare, din moment ce unele medicamente pot inhiba, de exemplu, activitatea CYP2D6. Cel puin majoritatea alelelor deficitare proprii diferitelor grupuri etnice, ar trebui caracterizate i folosite n aprecierea fenotipului sau genotipului. Beneficiul adaptrii dozelor conform genotipului este cel mai bine descris de studiile realizate pe medicaia antipsihotic; cu toate acestea, exist nc o mare nevoie de studii prospective care s genereze dovezi certe. Dozele iniiale recomandate, dependente de trsturile farmacogenetice, au fost publicate pentru toate medicamentele antidepresive de Kirchheiner i colab.,( 2001). Acesta a reprezentat un pas major n ncercarea de a mbunti terapia medicamentoas individual, ns este nevoie de studii clinice mult mai standardizate, care s testeze eficacitatea i efectele secundare genotipic adaptate i nonadaptate ale diferitelor scheme terapeutice.

408

CAPITOLUL 14 TOXICOGENOMICA: INTEGRAREA NOILOR METODE PROPRII BIOLOGIEI MOLECULARE N TOXICOLOGIE 14.1. Dezvoltarea toxicologiei
Efectele toxice produse aupra unui organism i induse de substanele din mediu au fost studiate ani la rnd. Iniial toxicologii au luat n considerare n studiile lor, morfologia i fiziologia organismului, incluznd determinarea dozelor de substane, potenial letale, greutatea corpului i a organelor i inclusiv patologia brut. Dezvoltarea tehnicilor histopatologice a permis examinarea microscopic a esuturilor i determinarea efectelor toxice la nivel celular. n anii 1980, tehnicile moleculare au devenit accesibile constituind modaliti de identificare precoce i cu o nalt sensibilitate a punctelor moleculare afectate i a evideniat deosebirile existente ntre diferitele tipuri de toxicitate. Aceste tehnici au avut drept rezultat scurtarea timpului dintre administrarea medicamentului i detectarea efectelor sale, adic a timpului de expunere. Acum sunt frecvent cercetate modificrile legate de nivelul anumitor proteine sau metabolii tisulari, din snge sau urin, n strns corelaie cu tipuri specifice de toxicitate. Majoritatea parametrilor chimici convenionali, specifici analizelor clinice, au fost stabilii empiric. Ei sunt rezultatul proceselor celulare aberante, n mai mare msur dect componentelor mecanismului toxic. Spre exemplu pasajul enzimelor la nivelul membranelor lezate este un proces secundar unei faze trzii a apoptozei celulare. Determinarea punctelor lezate avnd la baz o singur molecul pot s-i gseasc aplicabilitate dac exist noiuni prestabilite asupra modului de aciune al agentului aflat n studiu. Prin urmare aceste experimente primare pot contribui la confirmarea ipotezei. Cercettorii i propun s descopere markeri
409

specifici ai

toxicitii care pot fi gsii la nivelul modificrilor nivelelor de expresie genic, proteic i a metaboliilor care determin rspunsul celular la o injurie provenit din mediul intracelular. Ca urmare a eforturilor de elucidare a secvenelor genomice majore, tehnologii funcionale genomic au fost elaborate ca s narmeze toxicologii cu noi posibiliti de studiu ale toxicitii n organism, la nivel molecular printr-o abordare celular de anvergur. Teoretic toate biomoleculele celulare pot fi azi determinate concomitent. Toxicogenomica, prin urmare, este definit ca domeniu de aplicare a tehnologiilor funcionale genomice n toxicologie. n cadrul acestei definiii, toxicogenomica integreaz genomica funcional cu metode toxicologice convenionale. Figura 14.1 prezint dezvoltarea toxicologiei de la nceputurile ei pn n era toxicogenomicii.

Fig.14.1. Istoricul evoluiei toxicologiei 410

n acest capitol, mai nti, vom trece n revist diferitele tehnologii genomice funcionale i apoi vom discuta despre aplicabilitatea lor n studiile toxicologice. Toxicogenomica are potenialul de a mbunti aprecierea efectelor compoziiei genomice asupra rezultatelor toxicologice, oferind o mai bun nelegere a mecanismelor toxicitii; ea va facilita evaluarea toxicitii compuilor necunoscui, va ajuta la producerea unor markeri indui de mecanismul toxicologic, va mbunti corespondena toxicologic ntre specii i extrapolrile in vitro-in vivo, i nu n cele din urm va facilita dezvoltarea unor subdiscipline toxicologice care se vor ocupa de mixturile chimice.

14.2. Genomica funcional: noi tehnologii ale biologiei moleculare

Tehnologiile genomice funcionale msoar rspunsurile moleculare, dintr-un organism ntr-o manier extins din punct de vedere celular. Informaiile disponibile n ceea ce privete secvenele genomice, proteinele celulare i coninutul n metabolii, sunt utilizate pentru a deduce rolul funcional al mecanismelor i cilor celulare ale diferitelor molecule. Genomica este aria de cercetare care studiaz genomul prin intrermediul studiului secvenelor nucleotidice, structura genomic i compoziia sa. Studiul transcripiei, proteomica i determinarea metaboliilor duc la aflarea nivelurilor de expresie ale transcripiei genice, proteinelor i respectiv metaboliilor.

14.2.1. Genomica O multitudine de oportuniti au fost oferite biologiei i stiinelor care se ocup cu studiul vieii de ctre dezvoltarea proiectelor de secvenionare genomic, precum i eforturilor ntreprinse n scopul determinrii secvenelor genoamelor altor specii cum ar fi obolanul sau maimua. Acizii nucleici sunt depozitarii informaiei genetice, care reprezint informaia de baz necesar produciei proteinelor celulare. nelegerea acestei informaii genetice de baz reprezint un pas important pentru elucidarea mecanismelor moleculare care au loc la nivelul acestor proteine.
411

Mai mult, detaliile asupra organizrii cromozomiale a genelor i a elementelor reglatoare transcripionale, contribuie la elucidarea funciei genice i rolul acesteia n procese specifice. Comparaii ntre genomul complet al diferitelor organisme faciliteaz identificarea originii moleculare care determin mecanismele celulare, comune sau specifice i de asemenea proprietile fiziologice ale diferitelor specii. Un alt nivel n cadrul cercetrilor genomice l reprezint identificarea micilor modificri proprii genoamelor individuale, polimorfismele uni-nucleotidice (SNPs), care sunt responsabile pentru multe diferene interindividuale i implicit pentru o mare gam de boli genetice. Diferenele interindividuale care se evideniaz prin intermediul SNPs la nivelul genelor specifice sunt de mare importan n cercetrile toxicologice. Dac gena ce codific o enzim care metabolizeaz un medicament, este uor diferit, activitatea catabolizatoare a enzimei corespondente ar putea suferi modificri. Rata de activare i metabolizare a unui xenobiotic i mecanismele de protecie stabilesc, n ce msur, toxicitatea se manifest n organism. 14.2.2. Transcriptomica Majoritatea proceselor celulare sunt controlate la nivelul expresiei genice. Determinarea exprimrii genetice prin estimri ale nivelurilor ARNm, s-a dovedit important pentru evaluarea sintezelor proteice i implicit a activitii proteice (activitatea enzimatic total care acioneaz asupra unui substrat), cel puin pentru anumite clase de enzime. n mod tradiional concentraiile de ARNm au fost determinate utiliznd tehnici Northern blot cu nucleotide radiomarcate. Determinarea ARNm specific, extrem de sensibil calitativ, a fost posibil odat cu dezvoltarea revers transcrierii i a reaciei de polimerizare n lan (RT-PCR). O metod adaptat principiului de mai sus (RT-PCR) a fost de asemenea folosit pentru a cuantifica modificrile n ceea ce privete cantitatea de ARNm comparativ cu o gen cu expresie constitutiv (housekeeping). Din moment ce aceste tehnici sunt extrem de laborioase i nu sunt potrivite pentru obinerea de rezultate pretabile standardizrii, determinarea simultan a nivelurilor de expresie a multor gene nu este realizabil. Analiza seriat a expresiei genelor (SAGE) este o metod care este corelat cu
412

determinarea secvenelor de ARNm specific, prezent n cadrul unei populaii randomizate de ARNm izolat dintr-o celul. Recent decelarea microstucturilor care au la baz ADNc i oligonucleotide, au fost realizate pe scar larg ca metode de expresie genic, msurtori care beneficiaz de disponibilitatea unor colecii de fragmente genice cu dispunere cunoscut a secvenelor i adesea cu adnotarea funciei lor la nivelul celulei. Pe lng acestea, microstructurile pot fi generate de la nivelul coleciilor de secvene exprimate ale markerilor (EST)-ADNc derivate din moleculele de ARNm pentru cele mai multe dintre ele funciile fiind nc supuse determinrii. n tehnica Northen blot, capacitatea ADN-ului i ARN-ului unicatenar de a hibridiza specific catena complementar, este utilizat pentru determinarea nivelului de ARNm al genei de studiat. Cu toate acestea, n loc de o singur gen, moleculele de ADNc unicatenare, pentru mii de gene, sunt depozitate la nivelul unui punct fix de pe suprafa (spre exemplu, lam de sticl, plastic, membran de nailon), denumit microstructur ADNc sau cip de ADN. Prin hibridizarea microstructurii ADNc ntr-o baie de ARNm izolai, fiecare ARNm specific va fi hibridizat doar cu ADNc, la nivelul punctului care conine ADN-ul complementar pentru fiecare gen specific n parte. Cantitatea de ADNc hibridizat n fiecare punct poate fi detectat prin msurarea fluorescenei, ncorporat n aceast mostr. O privire de ansamblu asupra evalurilor nivelurilor de ARNm bazate pe procesul care cuprinde ADNc i microstucturi, este prezentat n figura 14.2. n practic, 2 probe sunt ntodeauna hibridizate mpreun pe microfragmentul ADNc, unde una dintre probe este marcat cu un anumit tip de fluorofor (exemplu, fluorescen verde) i alt prob de referin sau control este marcat cu un alt tip de fluorofor (exemplu, fluorescen roie). Cuantificarea ambelor tipuri de fluorescen permite determinarea unei rate de expresie pentru fiecare gen, din proba de cercetat comparativ cu proba de control. n timp ce o mare parte din miile de gene msurate nu vor prezenta modificri ale nivelurilor de expresie, cnd probele provenite de la bolnavi sau tratai sunt comparate cu cele de control, genele gsite ca induse sau reprimate aduc o multitudine de informaii asupra mecanismelor celulare care sunt afectate la nivelul expresiei genice de ctre boal sau din contr de ctre aciunea terapiei
413

medicamentoase. DeRisi i colab,(1997) prezint detalii mai amnunite asupra tehnologiilor care folosesc microstructurile ADNc.

Fig.14.2. Msurtori transcriptomice bazate pe microstructurile de ADNc. ARNm extras din fragmente tisulare este marcat fluorescent i hibridizat la o microstructur ADNc, care conine mii de molecule ADNc diferite n poziii fixate. Scanarea microfragmentelor are drept rezultat dou imagi care sunt cuantificate i utilizate pentru a calcula expresia relativ a genelor la nivelul unui esut comparativ cu fragmentul tisular de control.

14.2.3. Proteomica Nu toate mecanismele celulare pot fi msurate n ceea ce privete nivelul de ARNm. Modificarea rapid a redistribuirii subcelulare a proteinelor deja prezente la nivelul celulei, ar putea fi necesar, n special n ceea ce privete mecanismele protectoare de rspuns celular . Tehnologiile de analiz proteic ar putea permite o vizualizare mai bun a proceselor care nu implic biosinteze active, sau cel puin, vor putea fi complementare analizei de expresie genic. Termenul de proteom este utilizat pentru a nota ntreaga populaia complet de proteine exprimate ntr-o celul. Pe lng transcriptomic, tehnologiile proprii proteomicii pot fi aplicate pentru msurarea simultan a miilor de proteine dintr-o celul. Din moment ce proteinele acioneaz cu precdere n reaciile celulare mai degrab dect n transcripia genic, proteomica se va dovedi a fi mai important dect determinrile transcriptomice. Determinarea proteomului este mai complex dect transcriptomica, unde populaia total de ARNm poate fi izolat deodat i, relativ uor, miile de elemente de transcripie care difer doar n secvena nucleotidic, sunt sortate n procesul hibridizrii microfragmentelor ADNc. n contrast, separarea tuturor proteinelor
414

diferite dintr-o celul reprezint o sarcin extrem de complicat, deoarece proteinele au proprieti diferite (mas, punct izoelectric (pI), solubilitate, stabilitate, etc.). Modificrile posttranslaionale i capacitatea de a forma complexe proteice nu pot fi trecute cu vederea n abordarea proteomicii. Variate metode au fost dezvoltate n cercetarea proteomic. Prima generaie de metode proteomice combin tehnicile, relativ vechi, de electroforez bidimensional n gel de agaroz cu dezvoltarea tehnicilor puternic automatizate de analiz software, evolueaz ctre spectrometria de mas i schimbul global de informaii care are la baz Internetul. Cantitatea total de proteine dintr-o prob este mai nti separat pe baza punctului izoelectric al proteinelor, folosind o lam cu un gradient de pH imobil ataat. Gradiente diferite de pH pot fi alese pentru a obine o clasificare exact a elementelor de interes. Dup axarea pe activitatea izoelectric, proteinele sunt transferate pe un gel de poliacrilamin, i avnd la baz masa proteic se efectueaz separarea prin gel electroforeza standard. Proteinele separate sunt apoi vizualizate folosind marcarea fluorescent sau cu argint. Gelurile sunt scanate, imaginile sunt analizate cu tehnologii de software specifice i volumele cuantificate. Drept exemplu, imaginile gel caracteristice reprezint modele proteice obinute att din ficat provenind de la obolani de control dar i de la cei expui la hepatotoxicul, bromobenzen (fig.14.3). Consecutiv, din gel se pot izola puncte de interes, ulterior purificate i anlizate prin mijloace de spectrometrie de mas. Proteinele pot fi identificate dup o fragmentare specific (spre exemplu, digestia cu tripsina), care genereaz fragmente peptidice cu o mas extrem de specific determinat prin tehnica ionizrii prin desorbie de matrice cu ajutorul laserului i calculul masei prin msurarea timpului de zbor (MALDI-TOF-MS). Modelul de fragmentare este apoi utilizat pentru identificarea proteinei care corespunde acestui model dintr-o baz de date n care sunt introduse modele fragmentare prestabilite ale tuturor secvenelor proteice cunoscute.

415

Fig.14.3. Imagini de gel electroforez bidimensionale ale msurtorilor proteomice. Este prezentat compoziia proteic a ficatului de obolan fr (imaginea 1) i cu (imaginea 2) tratament cu bromobenzen.

De asemenea, secvenionarea peptidic poate fi realizat prin tehnicile MS/MS pentru a confirma, i mai mult, identitatea proteic. n lipsa izolrii din gel (tehnic practicat actual) punctele proteice pot fi identificate funcional pe baza unei asemnri cu o alt protein identificat anterior n exact aceeai poziie, ntr-un gel de referin. O alt metod proteomic, aflat nc n cercetare, este reprezentat de aplicarea microregiunilor proteice ntr-o manier comparabil cu cea a microfragmentelor ADNc din transcriptomic. Proteinele sau anticorpii antiproteine sunt decelai pe o suprafa solid i utilizai pentru a lega specific proteinele marcate la o prob. Un mare dezavantaj al acestei tehnici n comparaie cu microfragmentele ADNc o constituie variaia afinitii de legare printre proteine. Condiii optimizate de legare pot fi aplicate doar pentru o parte din proteine, iar legarea n condiii suboptime va genera rezultate prtinitoare. Recent, s-au dezvoltat metode care aplic aceste diferene de afinitate de legare pentru a sorta proteinele n funcie de acestea. Acest fapt permite separarea proteinelor bazat doar pe cteva proprieti caracteristice, ns nu separ toate proteinele din mixtura izolat dintr-o celul.
416

Diferii produi chimici de suprafa sunt utilizai pentru a atrage proteinele n regiuni n care apoi vor fi direct analizate prin spectrometrie de mas. Ca exemplu oferim tehnica ICAT, care ofer o dispoziie diferit a dou probe proteice, folosindu-se de cromatografia lichid-MS/MS cu markeri de afinitate codificai izotopic, i SELDI (desorbia/ionizarea de suprafa laser dependent). 14.2.4. Metabolomica Derularea proceselor celulare este adesea reflectat de ctre nivelurile de metabolii care pot fi determinate att n celul ct i n fluidele extracelulare. Reaciile biochimice din celul pot fi studiate, n timpul i dup, desfurarea lor prin monitorizarea apariiei respectiv dispariiei produilor de reacie. Dinamica proceselor celulare poate fi monitorizat utiliznd profilul metaboliilor. Procese precum metabolizarea i biotransformarea xenobioticelor, pot fi urmrite, i de asemenea clerance-ul metaboliilor poate fi determinat n urin. Un alt avantaj important l reprezint faptul c, metodele noninvazive pot fi folosite pentru colectarea de probe de snge (plasm), urin sau alte fluide corporale. Acestea cresc cu mult aplicabilitatea att n experimentele animale ct i n cele efectuate pe om. Recent, analiza RMN a fost de asemenea realizat pe esuturi i celule. Tehnicile de spectometrie de mas (gaz cromatografia/MS) permit determinarea unor concentraii sczute ale componentelor individuale. Pentru un screening global spectroscopia H1-RMN reprezint o abordare atractiv, deoarece o mare varietate de metabolii poate fi cuantificat concomitent fr a fi necesar prepararea de probe costisitoare. Este obinut un spectru cu vrfuri de rezonan caracteristice pentru toate biomoleculele de mic dimensiune. n acest mod este obinut o amprent metabolic caracteristic fluidului biologic aflat n studiu. Semnalele individuale pot fi cuantificate i identificate n spectru pe baza unui spectru de referin disponibil. Spectrul RMN al fluidelor biologice este foarte complex datorit mixturii de numeroi metabolii prezeni n aceste fluide. Variaiile ntre probe sunt adesea prea reduse pentru a fi recunoscute cu ochiul liber.

417

Cu scopul de a mbunti gradul de comparabilitate al spectrului RMN, i prin urmare de a maximiza certitudinea analizei consecutive a datelor, un algoritm liniar parial ajusteaz micile modificri din spectru i menine totodat rezoluia. Pentru a descoperi diferene semnificative este necesar o analiz a datelor multivariat pentru a explora modelele recurente dintr-un numr de spectre RMN. Un factor de spectru este utilizat pentru a identifica vrfurile RMN ale metaboliilor care difer n urina unui subiect supus terapiei comparativ cu un subiect de control (fig.14.4). Corelaiile dintre elementele variabile din complex i multitudinea de date (mii de semnale n spectru) sunt relaionate cu o int variabil cum este statusul toxic. Combinaia profilului MS cu analiza multivariat a datelor ofer o metodologie de amprentare puternic. O alturare a tehnicilor analitice este de dorit pentru o analiz complet a unei mixturi complexe de metabolii [Robertson, Orrenius , 2000; Holmes i colab., 2001].

Fig.14.4 Amprenta metabolic. Acest factor de spectru vizualizeaz diferenele dintre modelele RMN ale urinii de obolan cu i fr tratament toxic inductor. Vrfurile reprezint metaboliii care difer n coninut ntre cele dou probe.

418

14.2.5. Procesarea datelor i bioinformatica Manevrarea datelor obinute n urma experimentelor desfurate la scar mare necesit echipamente de procesare a datelor i algoritmi. Informatica de laborator care descrie condiiile experimentale ar trebui nmagazinat i pstrat imediat [spre exemplu, Sistemul de Management al Informaticii de Laborator(LIMS)] i organizat ntr-o manier care s permit accesul facil. Rezultatele experimentale ar trebui corelate cu informaiile experimentale i dipuse ntr-o manier organizat folosind o aplicaie a computerului denumit depozit de date (data warehouse). Procesarea datelor include corecii (n majoritate tehnice) ale factorilor care influeneaz datele, dar nu reprezint condiiile supuse studiului. Filtrarea msurtorilor incerte este esenial pentru mbuntirea bazei de date. Cuantificarea raportului semnal per zgomot (signal to noise) i aplicarea unor limite mai sczute ar putea conduce la excluderea semnalelor slabe din interpretrile ulterioare. Deviaii specifice introduse n baza de date spre exemplu, datorate eficienei fluorescenei ncorporate, sunt corectate folosind proceduri normalizatoare. Procesarea greoaie a datelor depinde de utilizarea att a aprecierilor despre originea tehnic ct i biologic. n transcriptomic, se presupune frecvent, c majoritatea dintre miile de gene nu-i schimb nivelul de expresie n urma modificrilor (modeste) aprute n condiii experimentale. Standardizarea, normalizarea sau gradarea sunt metode aplicate pentru a transforma bazele de date n forme apte de a fi comparate ntre ele n ceea ce privete msurtorile interne i cele provenite din surse externe. Deviaiile sistematice care deriv din variate surse tehnologice ar trebui corectate. Dup procesarea brut a datelor, sunt obinute fiiere secundare care ar trebui salvate alturi de cele care descriu metodele de analiz a datelor. O nou provocare pentru cercetarea biomedical o constiutie transformarea bazelor mari de date, cu cantiti mari de zgomot i fr o nsemntate biologic evident n descoperiri relevante, care s includ selecia unor subseturi dintre miile de gene, proteine sau metabolii care s aib caracteristici biologice relevante. Acele subseturi vor putea fi supuse unor cercetri ulterioare elaborate. Tehnici matematice sunt aplicate pentru a aglomera datele n grupuri interpretabile sau modele structurate.
419

Metodele aplicate n acest scop, algoritmi de agregare asemenea agregrii ierarhice (fig.14.5), metoda de clusterizare folosind media (K-mean) i hri cu auto-organizare, apreciaz gradul de similaritate dintre profilele de expresie ale genelor.

Fig.14.5. Dendrograma agregatelor ierarhice ale datelor transcriptomice provenind din observarea ficatului obolanilor netratai, de control-la care s-a administrat ulei de porumb (CO) i obolanii tratai intens cu bromobenzen (BB). Genele sunt ierarhizate orizontal, n timp ce coloanele, reprezint fiecare o prob diferit. Intensitile diferite ale culorii gri corespund nivelurilor de expresie genice crescute i respectiv sczute.

Agregatele reprezint dispuneri ale genelor care se comport mai asemntor ntre ele comparativ cu genele provenind din afara aglomerrii. Numrul de agregate formate poate fi introdus n baza de date sau poate fi determinat automat prin utilizarea algoritmilor de agregare. Odat ce subtipurile au fost decelate acestea sunt analizate n ceea ce privete modificrile induse de condiiile de mediu, iar moleculele din aceste subtipuri sunt mai departe analizate n ceea ce privete relevana lor biologic. Alte metode asemenea analizei componentelor principale (PCA) determin structura intrinsec din interiorul bazei de date, fr cunotine anterioare. Beneficiind de asemenea metode o comparaie direct ntre bazele de date este realizat iar subbaze de date sunt obinute doar pe baza similaritii spectrelor RMN. Metodele supervizate asemenea analizei ptratelor pariale (PLS) i analizei discriminante a componenilor majori sunt mijloace mult mai eficiente, care folosesc
420

informaie adiional n baza de date precum date biochimice, histopatologice sau clinice pentru a identifica diferenele dintre grupurile predefinite. Pentru o detaliere a diferitelor metode de analiz a datelor din genomica funcional v recomandm s citii Brazma, Vilo , (2000); Fielden i colab., (2002). 14.2.6. Interpretarea biologic Nu este posibil s analizm datele de expresie una cte una, pentru o singur gen sau baz proteic deoarece aceasta ar determina pierderea unei cantiti mari de informaii care rezult din coerena datelor colectate n urma unui studiu. Relaia dintre genele i proteinele exprimate n anumite situaii, lund n considerare timpul, localizarea i condiiile experimentale sunt cele mai valoroase informaii care se pot obine prin studiile genomice funcionale. Determinarea nivelului de expresie genic, proteine sau metabolii nu este suficient pentru a cpta un profil biologic intern complet al celulei. Studierea interaciunii i integrrii diferitelor entiti biologice este de mare importan n descifrarea mecanismelor celulare. Descoperind interaciunile intracelulare, proprii unei celule, poate fi realizat n consecin un model complex, dinamic al cilor celulare. Modificrile observate la nivel celular/molecular devin biologic relevante doar dac se reflect asupra fiziologiei organismului. Funcionalitatea este asumat odat cu interpretarea modificrilor care apar la nivelul exprimrii; cu toate acestea, la final, aceast funcionalitate trebuie determinat i la nivel fiziologic. Privind efectele (asupra fiziologiei) ale anumitor boli genetice, cercettorii pot privi din interior fenomenul funcionalitii genelor care sunt afectate. Spre exemplu, mutaia unei gene poate avea efecte asupra componentelor din aval, dintr-un mecanism celular, reglat de ctre gena care a suferit mutaia. O alt abordare o constituie examinarea funciei fiecrei gene, una cte una, cu ajutorul deleiei unei gene, realiznd aa numitele lanuri knockout ale organismului. O mare varietate de aspecte fiziologice i comportamentale sunt monitorizare fr elaborarea unei ipoteze a priori.

421

Teoria conform creia cunoaterea funciei unor gene individuale ar fi suficient pentru nelegerea mecanismelor complete pe care le presupun aceste gene, este nc discutabil.Tehnologiile genomice funcionale sunt concepute ca tehnologii la scar larg de mare capacitate. n consecin s-au obinut cantiti mari de informaii (tabelul 4.1), dei cu un nivel tipic, oarecum sczut, de ncredere din punct de vedere cantitativ i comparativ cu determinrile realizate la nivelul unei singure gene sau proteine. Cu toate acestea, tehnologiile de care vorbeam i-au dovedit din plin utilitatea n ceea ce privete monitorizarea holistic a efectelor, aflarea unor rezultate surprinztoare i generarea de ipoteze i mecanisme de aciune. ns, descoperirile majore despre modificrile biomoleculelor specifice sau proceselor rmn de confirmat i investigat, mai mult cu ajutorul unor metode specifice. Aceste fapte necesit de asemenea implicarea unor experi cercettori din domenii de cercetare specifice, a unei expertize elaborate i implicit a unui echipament complex. Tehnici cum este RT-PCR cantitativ i Northern blot sunt utile pentru validarea tehnic, dar asemenea microregiunilor ADNc, determin niveluri ale ARNm care au doar valoare predictiv. Tehnica Western blot i tehnicile imunologice (ELISA) pot fi utilizate pentru a confirma prezena nivelurilor de proteine n mostre, avnd o acuratee mai mare dect tehnologiile proteomice bidimensionale bazate pe gel, cel puin aunci cnd ne referim la nivelul de proteine totale. Un dezavantaj al determinrilor unice de gen sau protein este reprezentat de pierderea de informaie din parametrii circumstaniali, precum genele care sunt n relaie de interdependen cu cea studiat. n cel mai bun caz, sunt determinate nivelurile a cel puin una sau dou proteine adiionale de referin n plus, iar aceste determinri se realizeaz sub premiza c acestea nu se modific n condiiile experimentale (aa numitele proteine housekeeping). Cu toate acestea genele i proteinele chiar dac se apreciaz c sunt prezente la un nivel constant, indiferent de condiii, de fapt prezint variaii ale expresiei n anumite circumstane. Determinarea n sine a nivelului proteic nu ofer probe pentru implicarea efectiv a proteinelor n mecanismele celulare. Teste specifice pentru activitatea enzimatic ne ofer o confirmare n plus ce determin capacitatea funcional a proteinelor (enzimelor) din mostr. Mai mult,
422

nivelul de metabolii ofer informaii asupra reaciilor biochimice care au avut deja loc. Cea mai relevant confirmare biologic a modificrilor o reprezint relaionarea lor cu efectele fiziologice. Doar la acest nivel modificrile au relevan i prezint consecine asupra organismului. Modificrile expresiei genice i proteice sau ale coninutului n metabolii pot fi desemnate drept efecte adverse dup corelarea cu efectele fiziologice cunoscute ca nsoind strile toxice.
Tabelul 14.1 Referine privind genele i tehnologiile genomice Swissprot Institutul European de Bioinformatic (EBI) Profilare a expresiei la EBI NCBI's Unigene, GenBank, OMIM, etc. GeneCards Hri genetice KEGG Hri genetice Biocarta http://us.expasy.org/ http://www.ebi.ac.uk/ http://ep.ebi.ac.uk/EP/EPCLUST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://bioinfo.wiezmann.ac.il/cards/ http://www.genome.ad.jp/kegg/ http://www.biocarta.com/genes/index.asp

14.3. Integrarea tehnologiilor genomice funcionale n toxicologie

Toxicologia poate fi definit drept distorsionarea proceselor biologice dintr-un organism, organ sau celul. Mii de expresii ale genelor sau proteinelor i diferite niveluri de metabolii, dintr-o mostr, caracterizeaz statusul specific al probei n cauz. Prin urmare, prin investigarea mecanismelor celulare/moleculare proprii unei celule, tehnologiile genomice funcionale pot fi de real valoare n toxicologie precum i n alte tiine care se ocup de studiul vieii. Profilele expresiei genice, spre exemplu, pot fi folosite la descoperirea mostrelor expuse la diferite clase de substane toxice, pot prezice toxicitatea unor compui necunoscui i pot contribui la studiul mecanismelor celulare ce pot determina efecte toxice, sau pot deriva din efectele toxice. n schimb, transcriptomica, reprezint un evaluarea rspunsurilor toxice [Bulera i colab., 2001]. n subcapitolele ce urmeaz vor fi discutate aplicaiile majore ale tehnologiilor genomice funcionale care prezint un potenial uria pentru mbuntirea tiinele toxicologice.
423

mecanism foarte bun pentru

14.3.1. Elucidarea mecanismelor Interaciunile dintre genele i proteinele aflate la baza majoritii proceselor biologice i expresia coordonat a genelor sau proteinelor, n circumstane specifice, ofer o indicaie asupra relaiei dintre molecule ntr-un mecanism biologic. Un mecanism toxic poate prin urmare s fie reconstruit la nivel molecular prin urmrirea modificrilor de la nivelul expresiei genice care interacioneaz sau se influeneaz reciproc. Cum mii de molecule sunt investigate simultan, ansa de a identifica molecula int care declaneaz un efect toxic la interaciunea cu xenobioticul, a crescut azi simitor. Aceast molecul int poate fi un receptor celular care iniiaz un efect advers n celul la ataarea ligandului (xenobiotic). Experimentele transcriptomice se pot realiza cu scopul de a identifica organele sau organitele, dintrun organism, care pot forma cel mai uor situsurile int ale efectelor adverse, fr informaii anterioare. Evaluarea multi-organic iniial poate ajuta la decelarea unor modificri caracteristice ale expresiei genice care pot indica organele ce ar trebui alese pentru studii ulterioare toxicologice amnunite, limitnd prin urmare numrul acestor studii extrem de laborioase.

14.3.2. Amprentarea transcriptomic i aprecierea toxicitii O aplicaie extrem de avantajoas a toxicogenomicii poate fi reprezentat de recunoaterea proprietilor toxice, n stadii incipiente, la candidaii pentru screening medicamentos. Programele de producere a medicamentelor dezvolt noi compui activi ca i candidai pentru diverse terapii, la o rat extrem de crescut, folosind tehnologii precum chimia combinatorie. Muli dintre miile de compui nou-sintetizai nu vor ajunge niciodat pe pia, n timp ce doar civa, vor fi selectai ca medicamente poteniale, i vor fi evaluai ntr-un program extrem de elaborat, cu ntindere mare n timp i costuri ridicate, care s testeze eficacitatea i toxicitatea. Alegerea pacienilor pentru testarea medicamentelor pentru eventuale efecte toxice poate oferi un criteriu valoros pentru o selecie precoce. Determinarea profilelor expresiilor proteinelor sau genelor, realizate n urma expunerii compuilor la diferite substane pot fi utilizate ,asemenea amprentrii pentru a clasifica compuii n funcie
424

de asemnare n ceea ce privete comportarea n urma expunerii la substane toxice cunoscute (model). Baze mari de date realizate cu informaiile obinute prin integrarea acestor profile expresionale, permit clasificarea modelului de expresie din mostra care prezint interes toxicologic n ceea ce privete potena toxicului, tipul de mecanism, organele int, doza i timpul de expunere. Prin urmare un nou compus poate fi clasificat din punct de vedere toxic, n funcie de rspunsul transcripional la substanele toxice comune. Aceast aplicabilitate specific a fost denumit toxicogenomic n anumite publicaii, nglobnd astfel un coninut mult mai restrns. 14.3.3. Identificarea markerilor primari ai toxicitii Din moment ce modificrile de expresie a mii de gene i proteine sunt azi determinate, se ateapt identificarea de noi markeri genici sau proteici, specifici, care pot detecta sau chiar prezice anumite tipuri de toxicitate. Cu toate acestea, pentru a diferenia uor diferitele tipuri de mecanisme moleculare care au condus la rezultate toxice similare, nu vor fi suficieni doar markerii de toxicitate specifici unei singure gene sau proteine. Probabil c niveluri de expresie uor alterate ale multor gene determin mecanismul de toxicitate, necesitnd msurtori precise i pe scar larg a modelelor de expresie a mii de gene i proteine. Un model pluricelular al expresiei genice i proteice, n analogie cu amprentarea, poate fi utilizat pentru a discerne o celul sntoas de una aflat n diferite faze de distorisiune net diferit de una normal. Cunoaterea profilului metabolitului aduce un avantaj n plus toxicologiei i farmacologiei din moment ce toxicul (prin metaboliii si) sau medicamentele pot fi detectate n plasm sau urin i permit aprecierea gradului de expunere sau pot confirma succesul terapiei. 14.3.4. Extrapolrile realizate interspecii Dei sunt foarte diferite sub multe aspecte, animalele de laborator i oamenii inclui n trialurile clinice prezint caracteristici extrem de similare la nivel molecular.

425

Majoritatea genelor identificate la oameni sunt de asemenea prezente la alte organisme precum oarecii sau obolanii. Unele gene sunt identice la specii diferite, n timp ce genomul omului i obolanului prezint o similaritate de peste 90%. Utiliznd tehnicile de biologie molecular sau toxicogenomic, similaritatea la nivel molecular se va dovedi un beneficiu mare n ceea ce privete extrapolarea rezultatelor. n timp ce rspunsurile fiziologice ar putea fi diferite, mecanismele moleculare evideniate ar putea coincide ntr-o msur foarte mare ntre diferitele specii. 14.3.5. Etrapolarea din experimentele in vitro la situaiile in vivo n timp ce efectele toxicitii asupra fiziologiei nu pot fi identificate in vitro, mecanismele moleculare care probabil conduc la apariia acestor efecte pot fi studiate prin intermediul acestor experimente. n funcie de sistemul model in vitro ales, procesele moleculare sunt mai mult sau mai puin conservate. Adiional circumstanele de realizare a experimentelor in vitro pot fi controlate i monitorizate ntr-o manier mai precis dect cele in vivo. 14.3.6. Reducerea utilizrii animalelor de laborator Odat cu posibilitatea de a msura parametrii celulari multiplii n detaliu, ansa de a observa detaliile toxicitii este mult crescut. Refacerea multor msurtori ar putea fi necesar pentru a stabili, ct mai precis, modificrile la nivelul unui marker empiric al toxicitii. Este de ateptat ca odat cu noile tehnologii ale biologiei moleculare, experimentul de generare a efectelor nu va mai trebui refcut de attea ori, dac sunt descifrate i nelese mecanismelor celulare. Pe lng acestea, toxicogenomica ne-ar putea ajuta la identificarea efectelor folosind modele alternative mai degrab dect animale vii. Recunoaterea precoce a toxicitii scade utilizarea metodelor de laborator costisitoare i de lung durat. n special, atunci cnd evalum proprietile carcinogenetice ale compuilor, putem s preconizm o ameliorare considerabil.

426

14.3.7. Toxicologia combinatorie Este de ateptat ca efectele nocive s fie cauzate de mai mult de o singur substan la nivelul amestecurilor complexe, cum sunt poluanii de mediu. O analiz corect a toxicitii acestor mixturi este azi greu realizabil. Pentru a evalua efectele toxice nsumate ale compuilor, ar trebui realizate studii elaborate care s includ att expunerea indivizilor la substane chimice unice dar i la combinaii. De cele mai multe ori markerii descriptivi empirici ai toxicitii sunt monitorizai, dar discriminarea efectelor aditive i sinergice n diferitele grupuri de tratament este limitat. Tehnologiile genomice funcionale permit monitorizarea a mii de efecte i cresc probabilitatea de a gsi efecte diferite ale expunerii. Mecanismul efectelor combinate poate fi studiat i/sau prezis la nivel molecular. Cnd molecule similare sau ci celulare se dovedesc a fi inte ale diferitelor substane din mixtur, este de ateptat s apar efecte sinergice sau aditive. Cnd modificrile sunt povocate la nivelul diferitelor ci biologice, nu este de ateptat intervenia direct a compuilor de mixtur. Cu toate acestea, datorit complexitii unui organism, efectele secundare ar putea influena alte mecanisme ale toxicitii. Spre exemplu o depleie xenobiotic indus a sistemului antioxidant de aprare intracelular ar putea cobor valoarea prag de injurie din partea altor xenobiotice care au primar alte situsuri int. n prezent, Heijne i colab.,(2004) studiaz efectele fiziologice ale expunerii combinate la aditivi alimentari, n combinaie cu o abordare transcriptomic. Utilizarea aditivilor alimentari este autorizat n Uniunea European cu condiia de a nu leza n nici un fel consumatorii. Consumarea aditivilor alimentari individuali este sigur n condiiile n care nu s-a observat nici un efect advers (NOAEL). Cu toate acestea normele NOAEL folosite pentru evaluarea riscurilor consumului acestor aditivi au adesea la baz tiine empirice, inclusiv chimia clinic i patologia. ns, sunt puine informaii despre potenialele efecte asupra sntii ale aditivilor consumai simultan sau diferit de normele NOAEL. Recent a fost efectuat o evaluare pentru a decela potenialele interaciuni care au loc ntre peste 300 de aditivi alimentari aprobai [Groten i colab., 2000]. Aciuni posibil combinate nu au putut fi excluse pentru patru aditivi alimentari, care au ficatul drept organ int.
427

Pentru a evalua efectele create de o expunere joas la mixturile toxice, obolanii au fost expui timp de 28 de zile la concentraii sczute de aditivi alimentari selectai, care cauzeaz efecte hepatice (inducia enzimelor cu rol n metabolizarea medicamentelor i hepatomegalie) la concentraii mai mari ns dect cele utilizate n studiul fcut de Heijne i colab.,(2004). Efectele asupra ficatului induse de aditivii alimentari sunt destul de subtile i de aceea au fost explorate modificrile ce au loc la nivelul expresiei genice. Experimentele transcriptomice pentru patru compui au oferit o multitudine de informaii biologice, incluznd schimbri ale enzimelor cu rol de metabolizare a medicamentelor, proliferarea peroxozimilor i alterarea cilor metabolice ADN dependente. Menionm c descoperirile transcriptomice au putut fi confirmate la nivel biochimic. Rezultatele vor fi folosite la evaluarea interaciunilor expunerii combinate la aceti aditivi alimentari. Prin urmare, aplicabilitatea mecanismelor de producie toxicogenomice se va realiza la nivel molecular acolo unde nu s-a putut face identificarea cu ajutorul tehnicilor convenionale. Studii ale unor mixturi ale acestor aditivi alimentari se afl n desfurare i vor fi utilizate pentru a evalua ipotezele formulate n urma studiilor pe compui unici.

14.4.

Aplicaiile

toxicogenomicii

studiul

mecanismului

hepatotoxicitii indus de bromobenzen

Toxicitatea hepatic este azi monitorizat de rutin cu ajutorul unei largi game de parametrii determinai empiric. Modificrile de greutate hepatic i observaiile patologice, cum sunt culoarea sau textura tisular sunt indicatori nonspecifici ai toxicitii. Toxicitatea hepatic specific cum este necroza, hipertrofia, colestaza, steatoza, hepatita i hiperplazia implic modificri celulare mai specifice la nivel celular i molecular. Atunci cnd apare necroza, hepatocitele se rup iar distrucia membranar conduce la scurgerea enzimelor intarcelulare n fluidele extracelulare. Fosfataza alcalin, lactat dehidrogenaza i aminotransferazele sunt enzime utilizate adesea ca indicatori ai necrozei hepatice. Valoarea tehnologiilor funcionale genomice reflectat asupra toxicologiei este ilustrat printr-un studiu care
428

demonstreaz hepatotoxicitatea bromobenzen indus la obolani [Heijne i colab., 2003]. Scopul studiului a fost acela de a elucida mai bine, mecanismul toxicitii i de a identifica proteinele i genele, markeri specifici ai hepatotoxicitii. Toxicitatea acut hepatic (24h) a fost indus de ctre bromobenzen, iar nivelurile de expresie genic i proteic au fost determinate la nivelul ficatului. La doze mari de bromobenzen, glutationul celular hepatic scade, evocnd procese secundare cum sunt peroxidarea lipidic, care conduce n ultim instan la moartea celular. n plus, toxicitatea bromobenzenului a fost corelat cu legarea covalent a metaboliilor reactivi de bromobenzen la proteinele endogene, n special la cele care conin grupri sulfidril [Koen i colab., 2000]. Tratamentul cu bromobenzen a alterat modelul expresiei genice din ficatul de obolan, aa cum arat determinarea PCA i analiza agregatelor (fig. 14.5). Animalele de control la care s-a injectat ulei de porumb, nu au putut fi difereniate de grupul animalelor netratate. Importana depleiei nivelului intracelular de GSH datorat hepatotoxicitii indus de bromobenzen a fost coroborat cu decelarea unor grade diferite de expresie ale genelor implicate n metabolismul GSH. Subunitile GST, care catalizeaz conjugarea metaboliilor reactivi la GSH, au fost reglate ca i -glutamilcistein sintetaza, care este enzima de limitare a sintezei GSH. La verificare, s-a observat o cretere semnificativ a activitii GST enzimatice la nivelul fraciilor citosolice din ficatul de obolan tratat cu bromobenzen comparativ cu grupul de control. Inducia epoxid hidroxilazei microsomale este corelat cu rolul acesteia n hidroxilarea intermediarilor de epoxidbromobenzen. Alte enzime specifice metabolizrii medicamentoase au fost de asemenea modificate. S-a artat c multe dintre genele induse au fost sub controlul transcripional al elementului de rspuns electrofil (EpRE, cunoscut anterior ca ARE) [Tsuji i colab., 2000]. Inducia genic specific precum hem oxigenaza-1, peroxidoxina1, metalotioneinele , feritina i TIMP1 indic prezena stresului oxidativ. Doza crescut de bromobenzen faciliteaz clar un rspuns bine cunoscut cum este rspunsul de faz acut. Tehnologia proteomic care folosete gel electroforeza bidimensional a fost utilizat pentru a separa mostrele de proteine din ficat. n figura 14.5(A) este prezentat modelul proteic obinut de la un animal netratat. Figura 14.5(B)
429

prezint o analiz gel bidimensional tipic a proteinelor hepatice dintr-un ficat al unui obolan tratat cu bromobenzen. Modificri semnificative focale au fost identificate n MS. Printre altele, s-a observat c bromobenzenul induce o cretere a aldehid-dehidrogenazei 2 mitocondriale, i o scdere n stocurile proteinei de oc termic 60 i a subunitii proteice a ATP-azei. Bromobenzenul a indus specific o modificare a conformaiei proteice, de la proteine cu greutate molecular mare ctre proteine cu greutate molecular mic i transcripia genic a multor factori implicai n sinteza proteinelor cum ar fi proteinele ribozomale, iniierea translaiei i factorii de elongare care sugereaz o rat crescut a turnoverului proteic. Probe de plasm i urin au fost colectate de la obolanii expui la bromobenzen. Spectrul RMN plasmatic i urinar al obolanilor tratai cu bromobenzen a fost diferit fa de cel obinut din probele de control.

14.5. Concluzii
Toxicogenomica definit ca o aplicaie i un element de integrare al transcriptomicii, proteomicii i metabolomicii n toxicologie, va servi multor scopuri n ceea ce privete recunoaterea i tratarea toxicologiei la nivel molecular. Mai nti este important ca descoperirile experimentelor funcionale genomice s fie puse n legtur cu cunotinele deja existente i determinrile toxicologice convenionale. Rezultate ale laboratoarelor de specialitate arat c un progres uria n domeniul toxicologiei se va realiza odat cu dezvoltarea tehnologiilor funcionale genomice. Mecanismele de aciune ale toxicitii vor putea fi elucidate n detaliu, la momente iniiale ale evoluiei lor i la doze sczute, comparativ cu parametrii convenionali ai toxicitii. Se ateapt mbuntiri n domeniul toxicologiei din aplicarea toxicogenomicii, ce presupun descoperirea unor noi markeri, extrapolri crescute i evaluarea toxicitii combinatorii. n special, n ceea ce privete testarea siguranei medicamentelor, unde importana unei complete monitorizri a posibilelor efecte adverse induse de ctre un compus asupra ntregului organism este deosebit de important, se observ c abordarea genomic funcional se dovedete a fi din ce n ce mai util.
430

CAPITOLUL 15 IMPORTANA POLIMORFISMULUI GENETIC I A INTERACIUNILOR MEDICAMENTOASE N TRATAMENTUL DURERII 15.1. Introducere
Variabilitatea interindividual farmacocinetic i farmacodinamic pentru numeroase analgezice poate fi abordat din punct de vedere farmacogenetic, prin studierea bazelor ereditii diferenelor rspunsului la un tratament medicamentos. Anumite enzime ce acionez pentru metabolizarea medicamentelor, transportul medicamentelor sau pentru medicamentele int sunt ntr-adevr supuse unui polimorfism genetic care este definit prin diferenele existente n expresia genic ce au o frecven mai mare de 1% n populaie. Polimorfismul enzimatic (mai ales citocromii P450(CYP)) i transportorii membranari [cum ar fi glicoproteina P(P-gp)] sunt deosebit de importani n domeniul analgezic. Populaia difer n patrimoniul su genetic i n rspunsul su la medicamente. Consecinele clinice posibile ale administrrii dozelor standard de substane metabolizate de ctre enzimele supuse unui polimorfism genic vor merge de la toxicitatea medicamentoas la absena eficacitii dup analgezic i polimorfismul considerat. Polimorfismul enzimatic este important cnd medicamentul este eliminat n proporie de 50% de ctre o enzima polimorfic, cnd medicamentul are o fereastr terapeutic ngust, sau n sfrit cnd activitatea medicamentului depinde de un metabolit format de ctre o enzim polimorfic (promedicament). De asemenea, interaciunile medicamentoase sunt o surs important de variabilitate care merit sa fie luat n consideraie datorit existenei inhibitorilor i inductorilor CYP sau P-gp care pot sa imite defectele genetice.
431

Xenobioticele, i mai ales medicamentele analgezice sunt frecvent hidrofobe i de aceea trebuie s fie transformate n compui mai hidrofili pentru a fi eliminai din organism. Pentru a realiza aceast transformare, organismul dispune de enzime capabile s metabolizeze un numr mare de xenobiotice. Aceste enzime sunt clasificate n dou categorii: enzime de funcionare, sau de faza Ia, care grupeaz reductazele,oxidazele, i hidrolazele, i enzimele de conjugare, sau de faza IIa, care grupeaz toate transferazele (glucuronidaze, sulfataze, acetilaze, metilaze). Anumite enzime de faza IIa prezint un polimorfism genetic, i familia de uridine difosfatice (UDP)-glucuroniltransferazele (UGTs) hepatice particip la metabolismul anumitor analgezice, cum ar fi morfina. Pentru c importana clinic a enzimelor de faza a IIa nu a fost pe deplin elucidat, vom prezenta n continuare familia de enzime de faza Ia, enzimele CYP deoarece au un rol important in metabolismul analgezicelor (figura 15.1).
CYP 1A2 2B6 2C9 2C19 2D6 2D1 3A4 Aceclofenac Acid mefenamic Alfentanil Amitriptilina Buprenorfina Celecoxib Citalopram Clomipramina Codeina Dextrometorfan Diclofenac Dihidrocodeina Escitalopram Fentanil Fluoxetina Flurbiprofen Fluvoxamina 432

Hidrocodon Ibuprofen Imipramina Indometacin Maprotilina Meloxicam Metadona Mianserina Naproxen Nortriptilin Oxicodon Paracetamol Paroxetin Piroxicam Sertralin Tenoxicam Tramadol Trimipramin Valdecoxib Cale metabolic major Cale metabolic minor Fig.15.1 Cile metabolice ale analgezicelor substraturi ale citocromilor P450 (CYP) Substraturile sunt clasificate n ordine alfabetic dup denumirea lor internaional (list non exhaustiv). Diferiii citocromi P450 implicai n metabolismul analgezicelor listate sunt indicate sus. Ptratele negre indic o cale metabolic important, ptratele gri: o cale metabolic mai puin important.

Polimorfismul genetic al CYP i impactul lor clinic vor fi evideniate n cele ce urmeaz.Transportorii prezint n egal masur o variabilitate genetic i P-gp,care este pompa transmembranar de eflux, ar putea influena variabilitatea rspunsului la anumite opiacee prin modularea biodisponibilitii lor sistemice i cerebrale. Metodele diagnostice, cum ar fi fenotipajul i genotipajul, care sunt acum disponibile vor putea permite o individualizare terapeutic selecionnd analgezicul i
433

pozologia optim pentru fiecare pacient. De aceea noi vom prezenta n continuare diferitele tehnici i perspective pentru viitor.

15.2. Polimorfismul genetic:efectele asupra diferitelor analgezice

15.2.1. CYP, polimorfism genetic, interaciuni medicamentoase i consecine clinice Localizate n reticulul endoplasmic al celulelor hepatice, CYPs catalizeaz oxidarea substanelor lipofile endogene (steroizi, acizi grai, acizi biliari) i exogene (medicamente) transformndu-le n produi mult mai polari facilitnd astfel eliminarea lor (Rogers i colab., 2002). Superfamilia CYP este clasificat pe baza omologiei secvenelor de aminoacizi n familii (sub 40% omologie a secvenei proteice n aceeai familie, de ex.CYP2) i n subfamilii (peste 50% omologie,de ex,CYP2D). Samer i colab., (2005) arat c superfamilia CYP conine 74 familii de gene din care 35 la om, i se clasific n 14 familii. Membrii subfamiliilor care reprezint o anumit gen sunt n continuare desemnai printr-un numr care succede descripiei subfamiliei (de ex.CYPD6). O gen care se situeaz pe un locus specific de pe un cromozom dat se poate manifesta sub diferite forme sau alele. Cele dou alele sunt purtate de ctre un individ pe un locus reprezentnd genotipul. Un asterix i un numr care desemneaz o alel, alela *1 corespunde la o activitate enzimatic normal(alela slbatic). Un polimorfism genetic cu o traducere funcional este descris pentru anumii citocromi implicai n metabolismul analgezicilor (figura 15.1), cum ar fi CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 i CYP3A4/5. Aceeai citocromi sunt pe de o parte inductibili i/represibili; cantitatea de proteine enzimatice poate ntr-adevar s varieze cnd, la co-administrarea de substane cunoscute pentru capacitatea lor de a induce sau inhiba CYPs (figura 15.2 i 15.3) se va antrena o modificare a profilului activitii enzimatice (fenotip).

434

CYP 2C9 Aminoglutamida Amprenavir Carbamazepina Ciclofosfamida Dexametazona Efavirenz Etanol Felbamat Ifosfamid Meprobamat Millepertuis Nevirapina Oxacarbazepina Fenobarbital Fenilbutazona Fenitoina Primidona Rifabutin Rifampicina Ritonavir Topiramat Inhibitor puternic Inhibitor moderat 3A4

Fig.15.2 Principalii inductori ai citocromilorP450(CYP) 2C9 i 3A4. Inductorii sunt clasificai n ordine alfabetic dup denumirea lor. Puterea de inducie este indicat printr-un ptrat negru (inductor puternic) sau gri (inductor moderat). Nu exist inductori ai citocromului 2D6. Impactul interaciunii va depinde de importana relativ a cii de eliminare inhibat n raport cu clairence-ul i concentraia plasmatic a inhibitorului. Administrarea concomitent a unui substrat i a unui inhibitor pentru acelai citocrom accelereaz eliminarea substratului. Dac tratamentul inhibitor este oprit,activitatea citocromului revine la normal dup eliminarea inhibitorului .

435

CYP 2C9 2D6 3A4 Acid valproic Amiodarona Amprenavir Bupropion Celecoxib Silibinina Clorochina Clorpromazina Cimetidina Ciprofloxacin Citalopram Claritromicina Clomipramina Clopidogrel Delavirdin Desogestrel Dihidralazina Diltiazem Difenhidramina Efavirenz Eritromicina Etilynestradiol Flecainida Fluconazol Fluoxetin Fluvastatina Fluvoxamin Gemfibrozil Gestoden Grapefruit Halofantrin Izoniazida Itraconazol Ketoconazol Levomepromazina Losartan Metadona Metronidazol Miconazol Moclobemid Nateglinid Nefazodon Nelfinavir Nifedipin Nitrendipin Paroxetin Fenilbutazona Fenitoin Prometazin Propafenona Timidina Risperidon Ritonavir Roxitromicina Saquinavir Sertralin Simvastatina Terbinafin Tioridazin Tacrolimus Valdecoxib Venlafaxin 436
2C9

CYP 2D6 3A4

Haloperidol Imatinib Indinavir Irbesartan Inhibitor puternic Inhibitor moderat

Verapamil Voriconazol Zafirlukast

Figura 15.3 Principalii inhibitori ai citocromilor P450(CZP)2C9, 2D6 i 3A4. Inhibitorii sunt clasificai n ordine alfabetic dup denumirea internaional. Puterea de inhibiie este indicat printr-un ptrat negru (inhibitor puternic) sau gri (inhibitor moderat). Impactul interaciunii va depinde de importana relativ a cii de eliminare inhibat n raport cu clearence-ul total i concentraiile plasmatice ale inhibitorului. Administrarea concomitent a unui substrat i a unui inhibitor pentru acelai citocrom ncetinete eliminarea substratului. Dac tratamentul inductor este oprit, activitatea citocromului revine progresiv la normal (> 2 sptmni).

15.2.2. Polimorfismul CYP2C9 i anti-inflamatoarele nonsteroidiene 15.2.2.1. Aspecte genetice Subfamilia CYP2C cuprinde patru enzime (Samer i colab,2005): 2C8, 2C9/10, 2C18 i 2C19 a cror gen este localizat pe cromozomul 10. CYP2C9/10 este proteina cea mai abundent din aceast subfamilie. Cea mai mare parte a substraturilor pentru CYP2C9 sunt acizii slabi i o interaciune electrostatic pare s fie determinant n afinitatea compuilor pentru CYP2C9.Acesta posed un polimorfism genetic i ase variante alelice (Scordo i colab.,2001). Trei dintre ele sunt descrise la caucazieni: CYP2C9*1, *2 i *3. CYP2C9*1 (80-82%) codific pentru o enzim a crei activitate este normal (tipul slbatic) n timp ce CYP2C9*2 (11%) prezint o substituie a aminoacidului din poziia 144 unde arginina este nlocuit de ctre cistein ceea ce reduce activitatea enzimatic a lui CYP2C9*2. A treia varianta alelic CYP2C9*3 (7 9 %) prezint o substituie a izoleucinei cu leucina n poziia 359 ce antreneaz o diminuare a activitii enzimatice de cinci pn la zece ori n funcie de substrat. Exist o variabilitate interetnic n distribuia acestor alele. Astfel, prevalena lui CYP2C9*2 este de 4% la etiopieni, n timp ce este absent n Extremul Orient, pe cnd CYP2C9*3 este identic n aceste populaii (2%). De asemenea a fost descris un polimorfism la nivelul promotorului (Shintani i colab.,2001).
437

15.2.2.2. Consecine clinice Polimorfismul lui CYP2C9 ar putea juca un rol important n eficacitatea analgezicului i toxicitatea anti-inflamatoarelor nonsteroidiene (AINS). Studiile in vitro au identificat anumite AINS ca substraturi ale CYP2C9: ibuprofen, indometacin, flurbiprofen, naproxen, diclofenac, piroxicam, lornoxicam, acid mefenamic, meloxicam i celecoxib. Astfel, la purttorii homozigoi ai CYP2C9*3 tratai cu ibuprofen sau cu celecoxib clairance-ul oral al acestor substane este diminuat de peste dou ori i perioada de njumtire este prelungit, n comparaie cu genotipul CYP2C9*1/*1 (slbatic). CYP2C9 are un efect enantiospecific asupra parametrilor farmacocinetici ai enantiomerului S de la ibuprofen. El acioneaz pe de alt parte asupra parametrilor farmacodinamici inhibnd ntr-o manier evident prostaglandina E2 la purttorii homozigoi ai CYP2C9*3 (Kirchheiner i colab.,2003). Sub celecoxib, concentraiile plasmatice ale metaboliilor sunt diminuate la indivizii homozigoi sau heterozigoi purttori ai alelei CYP2C9*3. Concentraiile crescute de celecoxib ar putea altera beneficiile selectivitii pentru ciclooxigenaza-2 (COX-2),modificnd astfel rata sa de eficacitate-toxicitate. Alte studii nu au constatat totui impactul semnificativ al CYP2C9 asupra parametrilor farmacocinetici sau selectivitii diclofenacului sau celecoxibului n condiii de echilibru (Brenner si colab.,2003). Pe de alt parte, un alt studiu retrospectiv nu a gsit o corelaie ntre ulcerele gastrice induse de ctre substraturile AINS ale CYP2C9 i genotipul CYP2C9. Totui datorit numrului mic de pacieni (n=24) nu s-a constatat o legatur ntre genotipul CYP2C9 i hepatotoxicitatea indus de diclofenac.

15.2.3. Polimorfismul CYP2D6 15.2.3.1 Aspecte genetice Polimorfismul CYP2D6 rmne unul din exemplele cel mai bine studiate i cel mai bine inelese ale polimorfismului farmacogentic. Descoperit n anii 70 de dou grupuri de cercetare independente el a fost recunoscut ca polimorfismul debrisokin/spartein, din cauza efectelor indezirabile, neobinuite i marcante puse n eviden n urma administrrii unui antihipertensor simpaticolitic, debrisokina, sau
438

a unui alcaloid antiaritmic, sparteina. Studiile familiale au artat c deficitul oxidativ este sub control monogenic. Gena este situat pe cromozomul 22, transmis pe cale autosomal recesiv i are 80 de variante alelice (http://www.imm.ki.se./CYPalleles) (Zanger i colab.,2004). Pe baza activitii enzimatice (fenotip) indivizii au fost mprii n patru grupe: metabolizatori leni (poor metabolizer PM) cu o deficien enzimatic complet, reprezentnd 5 pn la 10% dintre caucazieni; metabolizatori intermediari (intermediate metabolizersIM) cu activitate enzimatic diminuat (10% caucazieni); metabolizatori buni, care au o activitate enzimatic normal (extensive EM) reprezint 60-70 % dintre caucazieni; metabolizatori ultrarapizi (ultrarapid metabolizersUM) care au un metabolism accelerat (1-10% dintre caucazieni). Metabolizatorii/metabolizanii leni-PM sunt homozigoi pentru o alel defect (cel puin 15 variante descrise), sau mai rar, combinnd dou alele defecte distinct. n Europa mai mult de 90% dintre PM pot fi detectai prin cercetarea celor trei variante mai frecvente care la caucazieni sunt: CYP2D6*4 (20 la 25%, prezent la 70-90% dintre PM) datorat unei mutaii ce antreneaz un episaj deficient i un codon stop prematur, CYP2D6*5 (5%) care prezint o deleie complet a genei i CYP2D6*3 (2%) care este rezultatul deleiei unei baze. Metabolizanii intermediari-IM sunt purttorii unei alele ce antreneaz o diminuare a activitii enzimatice (exemplu:CYP2D6*17). Metabolizanii ultrarapizi-UM sunt purttori ai unei gene duplicat i multiplicat (CYP2D6*1,*2x/N) ca urmare a unui crossingover inegal. Duplicaiile genice i mutaiile nu explic totui toate fenotipurile. Polimorfismul genetic al CYP2D6 prezint o variabilitate interetnic pe care-l explicm prin distribuia principalelor variante alelice. Astfel cu excepia caucazienilor, PM sunt rari n alte populaii etnice. Ceea ce se explic parial prin frecvena unei variante alelice ce codific pentru o enzim inactiv prezent la 1020% dintre caucazieni i cvasiabsent la asiatici i africani (sub 2%). Metabolizanii intermediari-IM sunt mai frecvent prezeni n Asia, pn la 50% dintre asiatici fiind
439

purttori ai CYP2D6*10 care codific pentru o enzim instabil (sub 2% la caucazieni). n sfrsit, duplicaiile genetice prezint de asemenea o variabilitate interetnic, frecvena UM este estimat la 20% n Orientul Apropiat i de pn la 29% n Etiopia. n Europa, exist un gradient Nord/Sud cnd ne referim la frecvena duplicaiilor genei CYP2D6: 1- 2% la suedezi, 3,6% la germani, 3,9% la elveieni, 7 pn la 10% la spanioli i 10% la sicilieni care sunt UM (Bertilsson i colab.,2002). 15.2.3.2. Consecine clinice CYP2D6 joac un rol primordial n metabolismul unui sfert dintre medicamentele prescrise curent. Acestea au o adesea o marj terapeutic ngust cum este n cazul a numeroi opioizi i antidepresori. Consecinele terapeutice vor varia n funcie de importana moleculei mam sau de activitatea metabolitului n eficacitatea i toxicitatea moleculei. Astfel, metabolizatorii ultrarapizi ai CYP2D6 care au o activitate enzimatic crescut vor accelera eliminarea antidepresorilor substraturi ale CYP2D6 i la doze ordinare ne putem atepta la o ineficacitate a tratamentului. n schimb la PM, nivelurile plasmatice vor crete la dozele obinuite i de asemenea crete eficacitatea dar i toxicitatea, i ca urmare ajustarea pozologiilor este indispensabil. 15.2.4. CYP2D6 i opioidele Opioidele slabe cum ar fi codeina i tramadolul, dar i anumite opioide considerate ca puternice cum ar fi hidrocodonul i oxicodonul sunt bioactivai de ctre CYP2D6, ceea ce poate afecta eficacitatea i toxicitatea lor. Codeina trebuie s fie activat de ctre CYP2D6 (O-demetilare) pentru a-i desfura efectul su analgezic (fig. 15.4). La indivizii EM ai CYP2D6, aproximativ 10% din codein este bioactivat n morfin (Gasche i colab.,2004). Studiile randomizate controlate au demonstrat ineficacitatea codeinei la PM. Eficacitatea analgezic a codeinei ar fi deci limitat la pacienii PM. n schimb, la UM se va constata c efectele codeinei i a derivailor si se accentuez, iar producia morfinei crete. Astfel, o intoxicare sever cu codein la pozologiile standard a antrenat o
440

com prelungit la un pacient al crui genotipaj i fenotipaj al CYP2D6 a pus in eviden un metabolism ultrarapid al CYP2D. Tramadolul foarte apropiat structural de codein are o eficacitate opioid asemntoare. Analgezic cu aciune central, tramadolul posed proprieti farmacologice care l difereniaz de alte opioide. Tramadolul posed o slab afinitate pentru receptorul opioid , spre deosebire de metabolitul su M1, O-demetiltramadolul, produs sub aciunea CYP2D6, care are proprieti analgezice i o afinitate pentru receptorul opioid ce este de 200 de ori superioar substanei mam (Samer i colab., 2005). Activitatea CYP2D6 are un rol important n efectul analgezic al tramadolului confirmat de studiile experimentale i clinice. Tramadolul poate sa-i exercite efectul su analgezic pe calea activrii monoaminergicelor inhibitoare descendente, inhibnd recapturarea serotoninei i nonadrenalinei. Din cauza acestui mod dublu de aciune, tramadolul este deci diferit de opioidele tradiionale datorit efectelor indezirabile i activitii analgezice. Spre deosebire de codein, el rmne activ la indivizii PM din cauza proprietilor monoaminergice ale substanei mam. Astfel la un metabolizator lent, mecanismul analgezic al tramadolului se poate modifica. Dac activitatea CYP2D6 scade, efectul opioid se atenueaz,n timp ce efectul monaminergic crete. Dimpotriv, o cretere a numrului de alele funcionale ale CYP2D6 crete cantitatea metabolitului M1, confirmnd legtura ntre producia metabolitului i genotipul CYP2D6. Un studiu prospectiv realizat pe 300 de pacieni a evaluat impactul genotipului CYP2D6 asupra rspunsului la tramadol n analgezia postoperatorie dup chirurgia abdominal. Pacienii care nu rspund sunt de dou ori mai numeroi printre PM (46,7%), comparativ cu EM (21,6%); PM au de dou ori mai frecvent nevoie de antialgice de siguran (tramadol i piritramid) n sala de trezire(43vs 21%) i consumul de tramadol prin injectarea auto-controlat prin pompa iv crete la PM (26,7% vs11,6%). Consumul de tramadol la PM fiind pe de alt parte mai mare cu 30% fa de cei EM (Levo i colab.,2003).

441

Activitate opioida cerebrala

Codeina

CYP3A4

CYP2D6

Morfina-6glucuronid

Morfina Norcodeina

Codeina-6-glucuronid

Morfina-3glucuronid

Figura 15.4.Cile de metabolizare ale codeinei i eliminarea metaboliilor si. Codeina este metabolizat n principal (305) n codein 6-glucuronid i ntr-o mic msur n norcodein prin intermediul citocromului P450 3A4. La un individ care este un bun metabolizator pentru citocromul 2D6 proporia de morfin produs echivaleaz n medie cu 10% din doza de codein. Dimpotriv, la un metabolizator ultrarapid, producia de morfin crete. Morfina este n continuare metabolizat n morfin 6-glucuronid (care posed o activitate opioid) i n morfin 3-glucuronid. Aceti doi metabolii ca i codeina 6-glucuronid sunt n continuare eliminai pe cale renal.

442

Metadona este un opioid puternic care este uneori utilizat ca analgezic. Exist diferene inter-individuale importante n concentraiile metadonei care se explic parial prin activitatea CYP2D6. Concentraiile sanguine ale metadonei n stare de echilibru au fost studiate la 256 de pacieni toxicomani i au fost mai crescute la PM i mai sczute la UM. Mai mult de 70% dintre PM aveau un tratament de substituie eficace (fa de 40% la UM). La fel, 50% dintre UM i numai 28% dintre PM au primit doze de metadon superioare la 100mg pe zi (Eap i colab.,2001). 15.2.5 CYP2D6 i blocanii N-metil-D-aspartat(NMDA) Dextrometorfanul (DEM) este un derivat morfinic i nonarcotic (analog dextrogirului codeinei) lipsit de activitate opioid care acioneaz in vivo ca antagonist necompetitiv al receptorului NDMA. De asemenea DEM pare s posede o activitate neuromodulatoare. El este metabolizat n dextrorfan (DOR) de ctre CYP2D6 i este utilizat ca substrat test pentru a fenotipa aceasta cale metabolic. DEM este rapid transformat n DOR la EM. Datele experimentale arat c DEM exercit un efect antinociceptiv i neuromodulator mai evident la CYP2D6 al PM, spre deosebire de efectele de durat mai scurt observate la EM. Deci, CYP2D6 ar putea juca un rol important n efectul neuromodulator al DEM i ar explica contradiciile asupra impactului su clinic n studiile randomizate controlate perioperator n prevenia durerilor. 15.2.6. CYP2D6 i dependena de opiacee Se pare ca PM ar putea fi protejai mpotriva dependenei la opiacee pentru anumite molecule. Astfel, niciun PM nu a fost regsit prin genotipaj i fenotipaj n grupele de pacieni dependeni de opiacee de tipul codeinei, spre deosebire de pacienii care n-au fost niciodat dependeni de aceste substane (4%) sau dependeni de numeroase alte substane (alcool, cocain, amfetamine; 6,5%). Aceast submparire a metabolizatorilor leni la pacienii dependeni de opiacee sugereaz c acetia au o protecie farmacogenetic mpotriva dependenei orale la opiacee (odd ratio > 7). Inhibiia CYP2D6, care blocheaz producia de morfin, ar putea astfel s
443

permit modularea riscului de dependen blocnd aceste ci metabolice. Totui primele teste clinice n-au confirmat aceast ipotez (Fernandes i colab.,2002).

15.2.7. CYP2D6 i antidepresorii ca co-analgezice Antidepresorii sunt utilizai adesa drept co-analgezice. Un anumit numr de mecanisme au fost implicate n efectul lor analgezic. Antidepresorii triciclici au rol s inhibe recapturarea presinaptic a adrenalinei (NA) i serotoninei (5-HT) i s blocheze receptorii alfa-1 adrenergici, muscarinci i histaminici. Inhibitorii selectivi de recapturare a serotoninei (ISRS) acioneaz mai ales asupra 5-HT. Venlafaxina este un nou agent chimic specific triciclicilor i ISRS, ce inhib recaptura NA i 5-HT, mai ales la doze sczute i se dovedete eficace n tratamentul durerilor neuropatice. Antidepresorii sunt asociai cu o inciden relativ crescut a efectelor indezirabile care pot limita administrarea lor la pacienii care au dureri. Principalii antidepresori sunt metabolizai de ctre CYP2D6 (fig.15.1). Mai mult de 25% dintre pacieni nu rspund la antidepresori i fenotipul UM este acum recunoscut ca factor de risc al ineficacitii terapeutice. Dimpotriv, PM exprim efecte toxice la doze uzual recomandate ceea ce s-ar putea explica prin variabilitatea concentraiilor plasmatice (30 la 40 de ori) observat n urma administrrii unor doze similare. Studiile farmacocinetice indic de exemplu ca la PM, clairence-ul amitriptilinei, clomipraminei, desipraminei, imipraminei, nortriptilin, trimipraminei, paroxetinei, citalopramului, fluvoxaminei, fluoxetinei i venlafaxinei este diminuat i n consecin concentraiile plasmatice sunt crescute (Bertilsson i colab.,2002). De asemenea, asocierea dintre efectele indezirabile i genotipul CYP2D6 a fost bine studiat. O metaanaliz arat o corelaie pozitiv ntre riscul toxicitii neurologice i concentraiile plasmatice medicamentoase (Samer i colab.,2005). O frecven crescut a CYP2D6 a fost observat la pacienii PM care prezint efecte indezirabile. Dintr-un studiu prospectiv al pacienilor tratai cu desipramin (100mg/zi - timp de trei saptmni), s-a observat c numai pacienii cu fenotip PM pentru CYP2D6 au prezentat efecte indezirabile (confuzie, sedare, hipotensiune ortostatic). Pe de alt
444

parte, aceste efecte au fost corelate cu nivelurile plasmatice crescute ceea ce necesit reducerea dozei (Spina i colab.,1997). S-a sugerat c exist o relaie ntre fenotipul PM i cardiotoxicitate (palpitaii, dispnee, aritmie) la pacienii PM tratai cu venlafaxina. Printre pacienii ce prezint efectele indezirabile la tratamentul cu substraturi antidepresoare pentru CYP2D6 sunt de dou ori mai muli PM. Trebuie s menionam c exist o variaie a dozelor eficiente n tratamentul depresiei care ar fi de 25 la 300mg pentru clomipramin fie la PM, fie la UM. Chinezii (majoritatea indivizi UM) metabolizeaz antidepresorii (desipramin, nortriptilin, clomipramin) mai lent i vor primi n general doze mai sczute de antidepresori. Astfel, primele recomandri de doze n funcie de genotip/fenotip al CYP2D6 privind 14 antidepresori au fost fcute de Kirchheiner i colab.,(2001). Pentru antidepresorii triciclici PM este recomandat o reducere a dozelor de la 50 la 80% ,iar pentru ISRS de 30%. Pentru UM dozele recomandate cresc la 260% pentru desipramin, 300% pentru mianserin, i 300% pentru nortriptilin (Samer i colab.,2005). Astfel, genotipajul ar putea s permit individualizarea pozologiilor. 15.2.8. Polimorfismul CYP3A Familia CYP3A are rol n biotransformarea n proporie de 45-60% a medicamentelor dintre care menionm opioidele naturale (codeina) sau sintetice (tramadol, buprenorfin, metadon, fentanyl i dextrometorfan) (Desmeules i colab., 2004). n anumite populaii exist diferene interindividuale n expresia CYP3A. Subfamilia CYP3A cuprinde patru gene: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 i CYP3A43 situate pe cromozomul 7. n subfamilia CYP3A, enzima cea mai abundent i mai important la nivelul reaciilor oxidative este CYP3A4. Ea a fost izolat pe baza activitii sale oxidante asupra nifedipin i variabilitii metabolismului nifedipinului (de peste 10 ori), ceea ce sugereaz existena unui polimorfism genetic. Dei sunt descrise variantele alelice ale CYP3A, niciuna nu determin o modificare semnificativ a activitii enzimatice. CYP3A5 este exprimat la 20-30% dintre caucazieni, ceea ce reprezint cel puin 50% din coninutul total al CYP3A hepatice la persoanele care l exprim, participnd
445

la variabilitatea interindividual n eliminarea medicamentelor dependente de CYP3A. S-a artat c numai pacienii posednd cel puin o alel a CYP3A5 *1 exprim CYP3A5, n timp ce CYP3A5*3 i CYP3A5*6 nu exprim CYP3A5 (Kuehl i colab.,2001). Specificitatea substratului CYP3A5 este asemntoare cu a CYP3A4 (dar el este n general mai puin activ) i CYP3A5 pare s metabolizeze cea mai mare parte a substraturilor CYP3A4. Astfel, chiar dac s-a raportat o larg variabilitate interindividual a CYP3A4, nu s-a identificat un polimorfism fenotipic i noiunea de metabolizator lent sau de metabolizator ultrarapid nu poate fi aplicat. 15.2.9. Interaciunile medicamentoase i CYP Medicamentele administrate concomitent pot, datorit interaciunii medicamentoase farmacocintetice, s modifice activitile CYP (fig. 15.1, 15.2 i 15.3). Inhibiii competitive pot interfera cu activitatea lor. Astfel concentraiile plasmatice ale substraturilor CYP2C9 pot s creasc odat cu administrarea de amiodaron, fluvastatin, fluconazol, fenilbutazon, sulfinpirazon, sulfafenazol sau sulfamide, care sunt inhibitori puternici i selectivi ai CYP2C9. Dimpotriv, substraturile CYP2C9 pot fi induse sub aciunea urmtoarelor medicamente: carbamazepin, etanol sau fenobarbiton i o scdere a concentraiilor i eficacitii AINS ar putea fi previzibil (Desmeules i colab.,2004). Nu se cunosc inductori ai CYP2D6, dimpotriv inhibitorii CYP2D6 sunt bine descrii cum ar fi de exemplu, antiaritmicele (chinidina) sau neurolepticele cum ar fi clorpromazin, haloperidol, levopromazin sau tioridazin i un mare numr de antidepresori (fig. 15.3). Odat cu administrarea unui inhibitor i a unui substrat al CYP2D6 sunt posibile diferite scenarii n funcie de activitatea moleculei mam respective. Astfel, se poate pune n eviden o cretere a concentraiilor plasmatice ale antidepresorilor ce sunt substraturi ale CYP2D6 sau o inactivare a promedicamentelor de tipul opioidelor slabe. Factorii de mediu (de exemplu, la nivel alimentar, sucul de grepfrut fiind inhibitor al CYP3A4) i interaciunile medicamentoase (inhibiia sau inducia; fig.15. 2 i 15.3) contribuie n mare parte la variabilitatea activitii catalitice a CYP3A4. n
446

plus, consecinele lor clinice vor depinde de activitatea substanei mam i de metaboliii si. Metadona este metabolizat de ctre CYP3A4 (i CYP2D6) cum o demonstreaz studiile in vitro i studiile indirecte care arat o diminuare sau o cretere a concentraiilor plasmatice ale metadonei la pacienii sub tratament de ntreinere dup administrarea inductorilor sau inhibitorilor CYP3A4. Astfel, simptomele de sevraj la opioide sunt descrise la pacienii sub metadon tratai pentru tuberculoz prin rifampicin, pe calea reducerii metadonei. Inhibitorii CYP3A4 ca macrolidele i anumii antidepresori ca paroxetin,sau neuroleptice ca olanzapin (fig. 15.3) vor determina pe de alt parte o reducere a clairence-ul metadonei i vor crete riscul de supradozaj. Shinderman i colab.,(2003) au observat o corelaie ntre concentraiile plasmatice ale metadonei i starea de echlibru i activitate a CYP3A4. Alte studii in vitro arat c antiproteazele (ritonavir, indinavir, saquinavir) sunt inhibitori in vitro ai metabolismului metadonei i buprenorfinei. La fel, CYP3A4 este izoforma cea mai responsabil de dezalchilarea fenantyl, alfentanil i sulfentanil. Astfel rifampicina un inductor al CYP3A4 crete de trei ori clereance-ul alfentanil, spre deosebire de macrolide care-l scade de patru la cinci ori. Midazolamul este un benzodiazepin hidrosolubil cu o scurt durat de aciune, care este (ca majoritatea benzodiazepinelor) substrat al CYP3A4. Interaciunile farmacocinetice cu substanele inhibtoare ale CYP3A4 (fig.15.2) pot s conduc la o cretere a efectelor sale indezirabile, din cauza creterii concentraiilor sale plasmatice. Astfel, la un pacient de 61 de ani a fost descris o com prelungit dup ce a primit midazolam (doz total cumulat 300 mg) pentru o sedare n timpul cardioversiunii electrice, amiodaron n cadrul episoadelor de tachiaritmii supraventriculare, ca i pentru o antibioterapie prin eritromicin pentru o pneumopatie acut. Coma (ase zile) a fost indus n prelungirea perioadei de njumtire a midazolamului mai mult de 24 de ore, de ctre inhibitorii CYP3A4 care sunt ritromicina i amiodarona (Samer i colab.,2005). concentraiilor plasmatice ale

447

15.3. P-gp:un alt exemplu al variabilitii genetice

15.3.1 P-gp i aspectele genetice P-gp este un produs al genei MDR1 (protein rezistent la mai multe medicamente) care aparine la o superfamilie de transportori ABC (caseta de legare la ATP). Iniial MDR1 a fost identificat i studiat la nivelul celulelor tumorale rezistente la chimioterapia anticanceroas. Ea este o protein de transport membranar care expulzeaz medicamentele n afara celulelor i le scade concentraia la nivelul intelor tisulare. Localizarea sa la nivel intestinal, hepatic, renal i al barierei hematoencefalice explic probabil rolul su protector asupra anumitor regiuni, cum ar fi creierul mpiedicnd acumularea medicamentelor n organele int. P-gp este acum subiectul unei variabiliti interindividuale de expresie i de funcionare datorit pe de o parte polimorfismului genetic la care este supus gena MDR1 i pe de alt parte datorit posibilelor interaciuni medicamentoase (inductori i inhibitori ai P-gp). Pentru gena MDR1 au fost descrise treizeci de mutaii (Hoffmeyer i colab.,2000). Dou dintre ele au fost investigate: mutaia G2677T/A care antreneaz o schimbare de aminoacid i mutaia silenioas C3435T. Aceast ultim mutaie este supus la o variabilitate interetnic: frecvena indivizilor homozigoi pentru alelele C i T este prezent la 25% dintre caucazieni i asiatici i numai la 6% dintre africani. Variabilitile sunt raportate n Europa de Est, frecvena genotipurilor CC i TT fiind de 42%,41% i 17%. n Quebec ea este de respectiv 16%, 55% i 29% (Samer i colab., 2005).

15.3.2 P-gp i consecinele clinice Variabilitatea expresiei P-gp poate avea un impact asupra absorbiei i distribuei medicamentelor.Cnd un individ dispune de o cantitate scazut de P-gp intestinal, cantitatea substraturilor absorbite i concentraiile plasmatice vor fi mai ridicate. Genotipul 3435TT a fost astfel asociat cu o expresie de dou ori mai sczut a transportorului la nivel de duoden dect genotipul CT i TT (Hoffmeyer i colab.,2000). Pe de alt parte s-a constatat c de regul concentraiile digoxinei n

448

stare de echilibru sunt mai ridicate la voluntarii sntoi purttori ai alelei T (Jolme i colab., 2002). Substraturile P-gp au n comun proprieti fizice cum ar fi, un ciclu aromatic, o hidrofobicitate, o greutate molecular cuprins ntre 200 i 1800Da sau un grup azotat cationic. Pe de alt ,trebuie menionat c majoritatea substraturilor i inhibitorilor Pgp sunt de asemenea substraturi i inhibitori ai CYP3A4. Genele lor sunt dispuse n apropiere pe acelai cromozom (7q22.1 i 7q21.1) i la nivel intestinal ar putea exista o corelaie ntre polimorfismul C3435T al MDR1 i nivelul expresiei CYP3A4. Opioidele au n comun o structur aromatic cu trei inele i un inel piperidin substituit, i sunt din aceast cauz candidai buni pentru a fi substraturi ale P-gp. Studiile in vitro au demonstrat c loperamidul, morfina, metadona, meperidin, hidromorfon, naloxon, naltrexon, pentozacin sunt transportai de ctre P-gp. Exist rezultate contradictorii pentru fentanyl. Sulfentanyl-sulfentanil i alfentanyl-alfentanil nu sunt substraturi pentru P-gp. Dimpotriv, aceste ultime trei substane sunt inhibitori in vitro ai P-gp (la concentraii puin comparabile cu cele administrate n clinic). Anumite endorfine i enkefaline sunt de asemenea substraturi ale P-gp (Oude i Zadina, 2001). Studiile experimentale in vivo la animale au artat pe de alt parte un rol posibil al P-gp asupra modulrii medicamentelor anti-nociceptive. Astfel la oarecii deficieni n P-gp a fost evideniat o cretere a efectului anti-nociceptiv al enkefalinei sintetice (DPDE) n comparaie cu oarecii normali datorit unei ameliorri a biodisponibilitii cerebrale. n aceeai manier la obolanul care a primit un inhibitor puternic al P-gp i o doz unic iv de morfin, efectele antinonciceptive sunt prelungite n raport cu obolanii netratai. Aceste schimbri nu sunt dect imperfect corelate cu schimbrile farmacocinetice plasmatice ale morfinei. Activitatea in vivo la animal a altor opioide cum ar fi meperidin, metadon i fentanyl ar putea s fie influenat de expresia P-gp. La om, loperamidul, un opiaceu utilizat pentru efectul su antidiareic, acioneaz asupra receptorilor pentru opiaceele intestinale reducnd motilitatea intestinal i este la doze standard, lipsit de efecte centrale. Dimpotriv, un pretratament cu chinidin (600mg administrat cu o or
449

nainte), un inhibitor al P-gp conduce la o depresie respiratorie (Skarke i colab.,2003) i o diminuare a diametrului pupilar. Dei chinidina crete absorbia i concentraiile plasmatice ale morfinei, metadonei i fentanylului,dup administrare oral chinidina nu are efect asupra farmacodinamiei celor trei substane dup administrarea intravenoas. Pe de alt parte, utilizarea dozelor unice ai inhibitorilor P-gp (valspodar, chinidin) la voluntari sntoi la care s-au administrat iv doze mici de morfin nu s-a asociat cu o modificare a parametrilor farmacocinetici sau farmacodinamici ai morfinei (Skarke i colab.,2003). Aceste rezultate ar putea s indice la om c P-gp nu ar influena dect n mic msur biodisponibilitaea cerebral a morfinei,metadonei i fentanylului.

15.4. Fenotipaj i genotipaj: perspective

Anumite metode diagnostice sunt acum disponibile n majoritatea spitalelor universitare. Ele permit identificarea rapid (1-2 zile) a anomaliilor i variaiilor metabolismului la nivelul citocromilor. Sunt mai frecvent utilizate dou metode: fenotipajul care permite identificarea activitii enzimatice a citocromilor, fenotipul reflectnd caracteristicile observate ale activitii enzimatice ale unui pacient, i genotipajul care detecteaz variantele alelice descrise pn acum reflectnd caracteristicile de la nivelul ADNului. 15.4.1. Tehnici Fenotipajul estimeaz activitatea enzimatic a citocromilor. Un substrat test ( probe drug ) ce corespunde la un citocrom specific este administrat la un pacient, apoi are loc msurarea cantitii de substan mam i metabolismul su n snge sau urin. Aceste dozaje permit calculul ratei metabolismului sau raportul ntre cantitatea de molecul mam (neschimbat) i cantitatea metabolitului su la un anumit timp dup ingestia substratului test, dar de asemenea i a altor parametrii farmacocionetici cum ar fi clairance-ul total. Astfel pentru CYP2D6 substraturile test utilizate sunt sparteina, debrisochina, sau dextrometorfan. De exemplu, dup ingestia a 25 mg de dextrometorfan seara la culcare i vezica goal, urina de peste noapte este colectat la
450

8-12 ore i concentraiile de dextrometorfan (Bexine) i dextrorfan sunt apoi dozate din urin. Dup care raporturile metabolice sunt calculate. Ele definesc activitatea enzimatic i variaz n funcie de substratul test utilizat. Raporturile metabolice ce definesc fenotipul PM sunt: >12,6 pentru debrisochin, >20 pentru spartein, i >0,3 pentru dextrometorfan. Fenotipul UM este definit prin urmtoarele raporturi metabolice: <0,2 pentru debrisochin, <0,15 pentru spartein , <0,003 pentru dextrometorfan. Spre deosebire de PM care constituie un grup distinct, definiia valorilor prag ce corespund la fenotipul UM este fcut de manier mai arbitrar. Substraturile test ce pot fi utilizate pentru fenotipajul CYP2C9 sunt flurbiprofen, diclofenac, losartan, tolbutamid, i warfarina. Fenotipajul CYP3A4 poate fi realizat cu midazolam, cortizol endogen, eritromicin sau dapson (Streetman i colab.,2000). Amestecuri (cocktails) de substraturi test administrate concomitent au nceput s fie utilizate sau studiate. Ele au oferit avantajul de a realiza simultan fenotipajul diferiilor citocromi (1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4) (Zhou i colab., 2004; Jerdi i colab., 2004). Fenotipajul permite detectarea inteaciunilor medicamentoase pertinente cnd fenotipul pacientului este cunoscut n prealabil i dac un genotipaj este realizat n paralel. ntr-adevr, inhibitorii i inductorii CYP tesai pot s modifice concentraiile substratului test i deci rata metabolic fenomen numit fenocopiere. Fenotipajul prezint avantajul de a fi o metod rapid, simpl, ieftin i reproductibil. Administrarea unei substane farmacologic active n scop diagnostic poate s pun probleme de ordin etic. Pe de alt parte, informaiile de care dispunem asupra fenotipajului anumitor grupuri (copiii, persoane n vrst, insuficiene renale i hepatice) sunt limitate. Genotipajul permite analiza mutaiilor genetice importante funcional,care codific pentru enzime specifice prin tehnica reaciei de polimerizare n lan (PCR) cuplat cu o analiz a polimorfismului prin msurarea lungimii fragmentelor de restricie dup hidroliz cu ajutorul enzimelor de restricie. Jannette i colab.,(2004) descriu n detaliu tehnicile de genotipaj. Informaiile genetice despre individ sunt determinate n mod direct far s necesite un substrat test. De altfel testul nu este influenat de administrarea concomitent de medicamente, sau de factorii de mediu i
451

ofer avantajul de a fi realizat odat pentru toat viaa. Tehnica aceasta este costisitoare i sensibilitatea sa variaz n funcie de citocromul analizat. Astfel datorit genotipului specific i/sau mutaiilor nc necunoscute, CYP2D6 ai UM nu sunt toi detectai (Zanger i colab.,2004). Progresul tiinific n domeniu este rapid i noi variante alelice sunt puse acum n eviden. Metodele de detecie rapid prin microarray ADN sunt frecvent utilizate. Microarray-urile sunt suporturile solide de civa centimetrii ptrai pe care pot s fie fixate de manier organizat mii de secvene de ADN diferite. Aceste fragmente servesc drept sonde genetice pentru a msura nivelul expresiei genetice. Sondele genetice captureaz de manier foarte specific fragmentele de ADN complementare coninute ntr-un eantion biologic ce trebuie testat. Acest fenomen (hibridizare) poate fi evideniat prin tehnicile optice sub lumin fluorescent sau prin detecia radioactivitii. Cuantificarea semnalelor obinute i identificarea fragmentelor de gene recunoscute sunt posibile datorit unui sistem de achiziie de imagini, apoi pentru analiza datelor se face apel la programe informatice special concepute. Rezultatele obinute vor fi n continuare validate statistic i interpretate n context biologic. Acum sunt utilizate dou metode macro i microarray cu depozitarea direct a moleculelor de ADN pe suportul lor i cu fragmente de oligonucleotide sintetizate in situ ca sonde oligonucleotidice pe o suprafa solid. Ele vor permite detecia mai rapid i la scar mai mare a diferitelor variante alelice. 15.4.2. Indicaii n practica clinic i perspective La ora actual, genotipajul i fenotipajul citocromilor se justifc retrospectiv la pacienii care nu rspund la un tratament adecvat, adic insuficient (eec terapeutic) sau dimpotriv la cei care au parte de un tratament excesiv (toxicitate medicamentoas). Astfel se poate face distincia ntre o problem de complian i un metabolism foarte rapid, cnd medicamentul este ineficace sau cnd concentraiile sunt infraterapeutice ca n cazul antidepresorilor. Pe de alt parte , aceste tehnici permit distincia ntre o suspiciune de dependen medicamentoas i un deficit metabolic n cazul unui consum important de opiaceu slab, cum ar fi codeina
452

considerat ineficace pentru pacientul PM. Cuplajul celor dou tehnici permite pe de alt parte detecia interaciunilor medicamentoase pertinente cnd fenotipul pacientului este cunoscut n prealabil sau dac un genotipaj este realizat n paralel. Totui, la ora actual, testele farmacogentice sunt limitate la spitalele universitare i centrele specializate. Recomandrile de doze n funcie de genotip trebuie s fie considerate ntr-adevr ca un concept preliminar care trebuie s fie verificat. Eficacitatea i utilitatea clinic a acestor teste diagnostice rmne s fie validat prin studii prospective randomizate controlate, ca i prin analizele farmacoeconomice (numrul de teste necesar pentru a evita un caz de toxicitate i costurile asociate).

15.5. Concluzii
Terapia antalgic este un prototip important de individualizare a prescripiei medicamentoase. Cea mai mare parte a analgezicelor este metabolizat de ctre CYP, ei nii fiind supui unui polimorfism genetic. Aceste polimorfisme pot s explice ineficacitatea sau dimpotriv toxicitatea medicamentului. n perspectiv, detecia prin fenotipaj i genotipaj a acestor polimorfisme ar putea s ne ofere metode rapide i fiabile pentru a optimiza strategiile terapeutice anticipnd efectele indezirabile (ineficacitate terapeutic), identificnd medicamentul potrivit , prezicnd pozologia cea mai eficace i cea mai sigur pentru fiecare pacient. Pe de alt parte ne permite s distingem o problem legat de un metabolism ultrarapid, de un abuz medicamentos a unui deficit metabolic. Analiza cost/beneficiu a acestor metode trebuie s fie totui confirmat de ctre studii prospective adecvate.

453

BIBLIOGRAFIE

ABECASIS GR, NOGUCHI E, HEINZMANN A, TRAHERNE JA, BHATTACHARYYA S, LEAVES NI, ANDERSON GG, ZHANG Y, LENCH NJ, CAREY A, CARDON LR, MOFFATT MF, COOKSON WOC. 2001. Extent and distribution of linkage disequilibrium in three genomic regions. Am J Hum Genet 68, 1917. ADAMS MD, CELNIKER SE, HOLT RA, EVANS CA, GOCAYNE JD, AMANATIDES PG, SCHERER SE, LI PW, HOSKINS RA, GALLE RF. et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. 2000. Science 287, 218595. ALBANO CL, BENTLEY WE, RAO G. 2001. High throughput studies of gene expression using green fluorescent proteinoxidative stress promoter probe constructs. J Biomol Screen 6, 421 8. AMEYAW MM, REGATEIRO F, LI T, LIU X, TARIQ M, MOBAREK A, THORNTON N, FOLAYAN GO, GITHANGA J, INDALO A, OFORI-ADJEI D, PRICE-EVANS DA, MCLEOD HL. 2001. MDR1 pharmacogenetics: frequency of the C3435T mutation in exon 26 is significantly Pharmacogenetics 11, 21721. ANGERS S, SALAHPOUR A, JOLY E, HILAIRET S, CHELSKY D, DENNIS M, BOUVIER M. 2000. Detection of beta 2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Proc Natl Acad Sci USA 97, 36849. ARDELEAN A, TRIPA M, 2001. Mecanisme de transport n sistemele biologice. Foreign Languages Press Group, Arad, 9-22,26-36,150-195. ARRANZ MJ, MUNRO J, BIRKETT J, BOLONNA A, MANCAMA D, SODHI M, LESCH KP, MEYER JF, SHAM P, COLLIER DA, MURRAY RM, KERWIN RW. 2000. Pharmacogenetic prediction of clozapin response. Lancet 355, 16156. ARRANZ MJ, MUNRO J, SHAM P, KIROV G, MURRAY RM, COLLIER DA, KERWIN RW. 1998. Meta-analysis of studies on genetic variation in 5HT-2A receptors and clozapine response. Schiz Res 32, 939. ATREYA HS, CHARY KVR. 2001. Selective unlabeling of amino acids in fractionally 13 C labeled proteins: an approach for stereospecific NMR assignments of CH3 groups in Val and Leu residues. J Biomol NMR 19, 26772. BAETS S, VANDEDRINCK S, VANDAMME EJ, in: LEDERBERG J, editorin-chief. 2000. Encyclopedia of Microbiology, 2nd edn, vol. 4, 83753, Academic Press, San Diego, CA. BAKKER RA., LEURS R. 2004, From the human genome to new drugs: The potential of orphan G-protein coupled receptors in: DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. 95 -123, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim BALARAM P, BOTHNER-BY A, DADOK J. 1972. Negative nuclear Overhauser effects as probes of macromolecular structure, J Am Chem Soc 94, 40157. BARAK LS, FERGUSON SS, ZHANG J, CARON MG. 1997. A beta-arrestin/green fluorescent protein biosensor for detecting G protein-coupled receptor activation. J Biol Chem 272, 27497500. BARTOSIEWICZ MJ, JENKINS D, PENN S, EMERY J, BUCKPITT A. 2001. Unique gene expression patterns in liver and kidney associated with exposure to chemical toxicants. J Pharmacol Exp Ther 297, 895905.

454

BAUMANN W, LEHMANN M, BITZENHOFER M, SCHWINDE A, BIRSCHWEIN M, EHRET R, WOLF B. 1999. Microelectronic sensor system for microphysiological application on living cells. Sensors and Acuators B 55, 7789. BAXTER DF, KIRK M, GARCIA AF, RAIMONDI A, HOLMQVIST MH, FLINT KK, BOJANIC D, DISTEFANO PS, CURTIS R, XIE Y. 2002. A novel membrane potential-sensitive fluorescent dye improves cell-based assays for ion channels. J Biomol Screen 7, 7985. BTRNESCU GH. i colab., 2006. Procese de membran n biotehnologii. Ars Docendi. Universitatea din Bucureti, 15-80 BECK-SICKINGER AG. 1996. Structural characterization and binding sites of G-proteincoupled receptors. Drug Discov Today 1, 50213. BERGER J, HAUBER J, HAUBER R, GEIGER R, CULLEN BR. 1988. Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66, 110. BERTILSSON L, DAHL ML, DALEN P, Al SHURBAJI A. 2002. Molecular genetics of CYP2D6: clinical relevance with focus on psychotropic drugs. Br J Clin Pharmacol 53, 11122. BERTILSSON L, DAHL ML, DALEN P, et al., 2002. Molecular genetics of CYP 2D6: clinical relevance with focus and psychotropic drugs. Br J Clin Pharmacol, 53: 111-122. BIEKOFSKY RR, MARTIN SR, MCCORMICK JE, MASINO L, FEFEU S, BAYLEY PM, FEENEY J. 2002. Thermal stability of calmodulin and mutants studied by 1H-15N HSQC NMR measurements of selectively labeled [15N]Ile proteins. Biochemistry 41, 68509. BLAISDELL J, MOHRENWEISER H, JACKSON J, FERGUSON S, COULTER S, CHANAS B, et al. 2002. Identification and functional characterization of new potentially defective alleles of human CYP2C19. Pharmacogenetics 12, 70311. BLAKE JA, RICHARDSON JE, BULT CJ, KADIN JA, EPPIG JT, and the members of the Mouse Genome Database Group. MGD: The Mouse Genome Database. 2003. Nucleic Acids Res 31, 1935. BLEICHER K, LIN M, SHAPIRO M, WAREING J. 1998. Diffusion edited NMR: screening compound mixtures by affinity NMR to detect binding ligands to vancomycin, J Org Chem 63, 848690. BOWIE JU. 2001. Stabilizing membrane proteins, Curr Opin Struct Biol 11, 397402. BRADFORD LD. 2002. CYP2D6 allele frequency in European Caucasians, Asians, Africans and their descendants. Pharmacogenomics 3, 229 43. BRANCHINI BR, MAGYAR RA, MURTIASHAW MH, PORTIER NC. 2001. The role of active site residue arginine 218 in firefly luciferase bioluminescence. Biochemistry 40, 24108. BRANDNER G, PHALIP V, KELLENBERGER E, ZHANG CC. 1999. Optimization of a cyanobacterial culture for production of isotope-labeled recombinant proteins. Biotechnol Tech 13, 177 80 BRAZMA A, VILO J. 2000, Gene expression data analysis, FEBS Lett 480, 1724. BRENNAN MD. 2002. High throughput genotyping technologies for pharmacogenomics. Am J Pharmacogenomics 1, 295302. BRENNER SS, HERRLINGER C, DILGER K, et al., 2003. Influence of age and cytochrome P450 2C9 genotype on the steady-state disposition of diclofenac and celecoxib. Clin Pharmacokinet, 42:283-292. BRINKMANN U, EICHELBAUM M. 2001. Polymorphisms in the ABC drug transporter gene MDR1. Pharmacogenomics 1, 5964. BRIVANLOU AH, DARNELL JE, Jr. 2002. Signal transduction and the control of gene expression. Science 295, 8138. BROACH JR, THORNER J. 1996. Highthroughput screening for drug discovery. Nature 384, 146. BROCKMOLLER J, KIRCHHEINER J, SCHMIDER J, WALTER S, SACHSE C, MULLER-OERLINGHAUSEN B, et al. 2002. The impact of the CYP2D6 polymorphism on

455

haloperidol pharmacokinetics and on the outcome of haloperidol treatment. Clin Pharmacol Ther 72, 43852 BROOKES AJ. 1999. The essence of SNPs. Gene 234, 17786. BRSEN K, GRAM LF. 1993. The pharmacogenetics of the selective serotonin reuptake inhibitors. Clin Invest 71, 10029. BRUNET A, ROUX D, LENORMAND P, DOWD S, KEYSE S, POUYSSEGUR J. 1999. Nuclear translocation of p42/p44 mitogen-activated protein kinase is required for growth factorinduced gene expression and cell cycle entry. EMBO J 18, 66474. BULERA SJ et al., 2001, RNA expression in the early characterization of hepatotoxicants in Wistar rats by high-density DNA microarrays, Hepatology 33, 12391258. BURMESTER J, PLCKTHUN A. 2001. Construction of scFv fragments from hybridoma or spleen cells by PCR assembly, in: KONTERMANN R, DBEL S, eds, Antibody Engineering 19 40, Springer, Berlin. BURNASHEV N, ROZOV A. 2000. Genomic control of receptor function. Cell Mol Life Sci 57, 1499507. BYRNE B, IWATA S. 2002. Membrane protein complexes, Curr Opin Struct Biol 12, 23943. CAMILLERI-BROET S, VANDERWERFF H, CALDWELL E, HOCKENBERY D. 1998. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp Cell Res 239, 27792. CARLSSON J, JANSON J-C, SPERRMAN M, in: JANSON J-C, RYDEN L, eds, 1998. Protein Purification: Principles, High- Resolution Methods and Applications, 2nd edn, 375442, Wiley, New York CASCORBI I, GERLOFF T, JOHNE A, MEISEL C, HOFFMEYER S, SCHWAB M, SCHAEFFELER E, EICHELBAUM M, BRINKMANN U, ROOTS I. 2001. Frequency of single nucleotide polymorphisms in the P-glycoprotein drug transporter MDR1 gene in white subjects. Clin Pharmacol Ther 69, 16974. CELIS JE, KRUHOFFER M, GROMOVA I, FREDERIKSEN C, OSTERGRAAD M, THYKJAER T, GROMOV P, VU J, PLSDOTTIR H, MAGNUSSON N, ORTNTOFT TF. 2000. Gene expression profiling: monitoring transcription and translation products using DNA microarrays and proteomics. FEBS Lett 480, 216. CEREGHINO JL, CREGG JM. 2000. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris. FEMS Microbiol Rev 24, 4566. CHADEE DN, HENDZEL MJ, TYLIPSKI CP, ALLIS CD, BAZETT-JONES DP, WRIGHT JA, DAVIE JR. 1999. Increased Ser-10 phosphorylation of histone H3 in mitogen-stimulated and oncogenetransformed mouse fibroblasts. J Biol Chem 274, 2491420. CHALFIE M, TU Y, EUSKIRCHEN G, WARD WW, PRASHER DC. 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 8025. CHANKVETADZE B. 2004, Recent trends in enantioseparation of chiral drugs in: DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. 181 -211, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim CHEBIB M, JOHNSTON GA. 2000.GABA-activated ligand gated ion channels: medicinal chemistry and molecular biology. J Med Chem 43, 142747. CHEKULAYEVA MN, KURNASOV OV, SHIROKOV VA, SPIRIN AS. 2001. Continuousexchange cell-free protein synthesizing system: synthesis of HIV-1 antigen Nef. Biochem Biophys Res Commun 280, 9147. CHEN A, SHAPIRO MJ. 1998. NOE pumping: a novel NMR technique for identification of compounds with binding affinity to macromolecules, J Am Chem Soc 120, 102589. CHEN A, SHAPIRO MJ. 2000. NOE Pumping. 2. A high-throughput method to determine compounds with binding affinity to macromolecules by NMR, J Am Chem Soc 122, 4145. CHOI KH, CHEN CJ, KRIEGLER M,RONINSON IB. 1988. An altered pattern of crossresistance in multidrug-resistant human cells results from spontaneous mutations in the mdr1 (Pglycoprotein) gene. Cell 53, 51929. 456

CHRISTENDAT D, YEE A, DHARAMSI A, KLUGER Y, SAVCHENKO A, CORT JR, BOOTH V, MACKERETH CD, SARIDAKIS V, EKIEL I, KOZLOV G, MAXWELL KL, WU N, MCINTOSH LP, GEHRING K, KENNEDY MA, DAVIDSON AR, PAI EF, GERSTEIN M, EDWARDS AM, ARROWSMITH CH. 2000. Structural proteomics of an archaeon. Nat Struct Biol 7, 9039. CLORE G, SCHWIETERS C. 2002. Theoretical and computational advances in biomolecular NMR spectroscopy, Curr Opin Struct Biol 12, 14653. COLLINS A, LONJOU C, MORTON NE.1999. Genetic epidemiology of singlenucleotide polymorphisms. Proc Natl Sci Acad USA 96, 151737. CONWAY BR, MINOR LK, XU JZ, GUNNET JW, DEBIASIO R, DANDREA MR, RUBIN R, DEBIASIO R, GIULIANO K, DEBIASIO L, DEMAREST KT. 1999. Quantification of G-protein coupled receptor internalization using G protein coupled receptor-green fluorescent protein conjugates with the ArrayScanTM high-content screening system. J Biomol Screen 4, 7586. CRAIG D, HOWELL MT, GIBBS CL, HUNT T, JACKSON RJ. 1992. Plasmid cDNAdirected synthesis in a coupled eukaryotic in vitro transcriptiontranslation system. Nucleic Acids Res 20, 4987995. CRONIN MT, PHO M, DEBJANI D,FRUEH F, SCHWARCZ L, BRENNAN T.2001. Utilization of new technologiesin drug trials and discovery. Drug Metab Dispos 29, 58690. CRUCE M, 2000. Biologie celular i molecular. Ed.Aius. Craiova, 193-252. CRUCE M, ARDELEAN A, STNOIU B i colab. 2004. Ci i reele de semnalizare celular. Ed. Aius Craiova: 49-63, 67-87, 157-173. CUBBEDU L, MOSS CX, SWARBRICK JD, GOOLEY AA, WILLIAMS KL, CURMI PMG, SLADE MB, MABBUTT BC. 2000. Dictyostelium discoideum as expression host: isotopic labeling of a recombinant glycoprotein for NMR studies. Protein Express Purif 19, 33542. DAHL ML, JOHANSSON I, BERTILSSON L, INGELMAN-SUNDBERG M, SJOQVIST F. 1995. Ultrarapid hydroxylation of debrisoquine in a Swedish population. Analysis of the molecular genetic basis. J Pharmacol Exp Ther 274, 51620. DAHL ML. 2002. Cytochrome p450 phenotyping/ genotyping in patients receiving antipsychotics: useful aid to prescribing? Clin Pharmacokinet 41, 45370. DALVIT C, FOGLIATTO G, STEWART A, VERONESI M, STOCKMAN B, WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: practical aspects and range of applicability, J Biomol NMR 21, 34959, 2001. DALVIT C. 1998. Effective multi-solvent suppression for the study of organic solvents with macromolecules, J Biomol NMR 11, 43744. DE LAMOTTE F, BOZE H, BLANCHARD C, KLEIN C, MOULIN G, GAUTIER MF, DELSUC MA. 2001. NMR onitoring of accumulation and folding of 15Nlabeled protein overexpressed in Pichia pastoris. Protein Express Purif 22, 31824. DE WIT R, HENDRIX CM, BOONSTRA J, VERKLEU AJ, POST JA. 2000. Largescale screening assay to measure epidermal growth factor internalization. J Biomol Screen 5, 13340. DEAN M, HAMON Y, CHIMINI G. 2001. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter super family. J Lipid Res 42, 100717. DENISOV V, HALLE B. 2002. Hydrogen exchange rates in proteins from water 1H transverse magnetic relaxation, J Am Chem Soc 124, 102645. DERISI JL et al. 1997., Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale, Science 278, 6806. DESMEULES JA, PIGUET V, EHRET GB, et al., 2004. Pharmacogenetics, pharmacokinetics, and analgesia. in: Mogil J S(Ed.). The genetics of Pain, Progress in Pain Research and Managenment. IASP Press, 211-238. DESPLANCQ D, KIEFFER B, SCHMIDT K, POSTEN C, FORSTER A, OUDET P, STRUB JM, VAN DORSSELAER A, WEISS E. 2001. Cost-effective and uniform 13C- and 15N-labeling of the 24-kDa Nterminal domain of the Escherichia coli gyrase B by overexpression in the photoautotrophic cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Protein Express Purif 23, 20717. 457

DICKMANN LJ, RETTIE AE, KNELLER MB, KIM RB, WOOD AJ, STEIN CM, et al. 2001. Identification and functional characterization of a new CYP2C9 variant (CYP2C9*5) expressed among African Americans. Mol Pharmacol 60, 3827. DIERCKS T, COLES M, KESSLER H. 2001. Applications of NMR in drug discovery, Curr Opin Chem Biol 5, 28591. DING GJ, FISCHER PA, BOLTZ RC, SCHMIDT JA, COLAIANNE JJ, GOUGH A, RUBIN RA, MILLER DK. 1998. Characterization and quantitation of NF-kappaB nuclear translocation induced by interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha. Development and use of a high capacity fluorescence cytometric system. J Biol Chem 273, 28897905. DINGER MC, BECK-SICKINGER AG. 2002. The first reporter gene assay on living cells: green fluorescent protein as reporter gene for the investigation of Gi-protein coupled receptors. Mol Biotechnol 21, 918. DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. 2004. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 133-134 DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. 2004. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 136-137 DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. 2004. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 142. DRYSDALE CM, MCGRAW DW, STACK CB, STEPHENS JC, JUDSON RS, NANDABALAN K, ARNOLD K, RUANO G, LIGGETT SB. 2000. Complex promoter and coding region beta2-adrenergic receptor haplotypes alter receptor expression and predict in vivo responsiveness. Proc Natl Acad Sci USA 97, 104838. DUROCHER Y, PERRET S, THIBAUDEAU E, GAUMOND MH, KAMEN A, STOCCO R, ABRAMOVITZ M. 2000. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-proteincoupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells. EAP CB, BROLY F, MINO A, 2001. Cytochrome P4502D6 genotype and methadone steadystae concentrations. J Clin Psychopharmacol, 21:229-234. EAVES CJ. 1995. Assay of hematopoietic progenitor cells. In Beutler E, MA Lichtman, BS Collier, TJ Kipps (eds), Williams Hematology, 5th edn. New York: McGraw-Hill, 226. EDWARDS BS, KUCKUCK FW, PROSSNITZ ER, RANSOM JT, SKLAR LA. 2001. HTPS flow cytometry: a novel platform for automated high throughput drug discovery and characterization. J Biomol Screen 6, 8390. EDWARDS SW, TAN CM, LIMBIRD LE. 2000. Localization of G-proteincoupled receptors in health and disease. Trends Pharmacol Sci 21, 3048. ENGBERG J, JENSEN LB, YENIDUNYA AF, BRANDT K, RIISE E. 2001. Phage-display libraries of murine antibody Fab fragments, in: KONTERMANN R, DBEL S, eds, Antibody Engineering, 6592, Springer, Berlin. ENGELS JE, PARSCH J. 2004, Nucleic acid drugs in: DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. 153 - 179, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim EPSTEIN CB, BUTOW RA. 2000. Microarray technology enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol 11, 3641. EUSTICE DC, FELDMAN PA, COLBERG-POLEY AM, BUCKERY RM, NEUBAUER RH. 1991. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques 11, 73940, 7423. EVANS TC, MARTIN D, KOLLY R, PANNE D, SUN L, GHOSH I, CHEN L, BENNER J, LIU XQ, XU MQ. 2000. Protein trans-splicing and cyclization by a naturally split intein from the dnaE gene of Synechocystis species PCC6803. J Biol Chem 275, 90914. EVANS WE, JOHNSON JA. 2001. Pharmacogenomics: the inherited basis for interindividual differences indrug response. Annu Rev Genomics Hum Genet 2, 939. EVANS WE, MCLEOD HL. 2003. Pharmacogenomics drug disposition, drug targets and side effects. N Engl J Med 348, 53849. 458

EVANS WE, RELLING MV. 1999. Pharmacogenomics: translatingfunctional genomics into rationaltherapeutics. Science 286, 48791. FARR SB, TODD MD. 1998. Methods and kits for eukaryotic gene profiling. President and Fellows of Harvard College (Cambridge, MA, Xenometrix, Inc.). US Patent 5,811,231. FERNANDES LC, KILICARSLAN T, KAPLAN HL, et al., 2002. Treatment of codeine dependence with inhibitors of cytochrome P450 2D6. J Clin Psychopharmacol, 22:326-329. FIEHN O. 2002. Metabolomics the link between genotypes and phenotypes. Plant Mol Biol 48, 15571. FIELDEN MR et al., 2002, In silico approaches to mechanistic and predictive toxicology: an introduction to bioinformatics for toxicologists, Crit Rev Toxicol 32, 67112. FISCHER MW, MAJUMDAR A, ZUIDERWEG ERP. 1998. Protein NMR relaxation: theory, application and outlook, Prog Nucl Magn Reson Spectrosc 33, 20772. FITZGERALD LR, MANNAN IJ, DYTKO GM, WU HL, NAMBI P. 1999. Measurement of responses from Gi-, Gs- or Gq-coupled receptors by a multiple response element/cAMP response element-directed reporter assay. Anal Biochem 275, 5461. FUKUDA H, ARAI M, KUWAJIMA K. 2000. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry 39, 1202532. FURUTA T, SHIRAI N, WATANABE F, HONDA S, TAKEUCHI K, IIDA T, et al. 2002. Effect of cytochrome P4502C19 genotypic differences on cure rates for gastroesophageal reflux disease by lansoprazole. Clin Pharmacol Ther 72, 45360. GARAVITO RM, FERGUSON-MILLER S. 2001. Detergents as tools in membrane biochemistry, J Biol Chem 276, 324036. GASCHE Y, DAALI Y, FATHI M, et al. 2004. Codeine intoxication associated with ultrarapid CYP2D6 metabolism.N Engl J Med, 351:2827-2831. GEORGE SE, BUNGAY PJ, NAYLOR H. 1997. Functional coupling of edogenous serotonin (5-HT1B) and calcitonin (C1a) receptors in CHO cells to a cyclic AMP-responsive luciferase reporter gene. J Neurochem 69, 127885. GHOSH RN, CHEN YT, DEBIASIO R, DEBIASIO RL, CONWAY BR, MINOR LK, DEMAREST KT. 2000. Cell-based, high-content screen for receptor internalization, recycling and intracellular trafficking. Biotechniques 29, 1705. GIFFORD DK. 2002. Blazing pathways through genetic mountains. Science 293, 204951. GILHAM DE, CAIRNS W, PAINE MJ, MODI S, POULSOM R, ROBERTS GC, WOLF CR. 1997. Metabolism of MPTP by cytochrome P4502D6 and the demonstration of 2D6 mRNA in human foetal and adult brain by in situ hybridization. Xenobiotica 27, 111 25. GLASSBROOK N, BEECHER C, RYALS J. 2000. Metabolic profiling on the right path. Nat Biotechnol 18, 11423. GLOOR GB. Gene-targeting in Drosophila validated. 2001. Trends Genet 17, 54951. GOETZ AS, ANDREWS JL, LITTLETON TR, IGNAR DM. 2000. Development of a facile method for high throughput screening with reporter gene assays. J Biomol Screen 5, 37784.. GONZALEZ FJ, SKODA RC, KIMURA S,UMENO M, ZANGER UM, NEBERT DW, GELBOIN HV, HARDWICK JP, MEYERUA. 1988. Characterization of thecommon genetic defect in humansdeficient in debrisoquine metabolism. Nature 331, 4426. GOSSEN M, BUJARD H. Studying gene function in eukaryotes by conditional gene inactivation. 2002. Annu Rev Genet 36, 15373. GOTO NK, KAY LE. 2000. New developments in isotope labeling strategies for protein solution NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol 10, 58592. GOUGH AC, SMITH CA, HOWELL SM, WOLF CR, BRYANT SP, SPURR NK. 1993. Localization of the CYP2D gene locus to human chromosome 22q13.1 by polymerase chain reaction, in situ hybridization, and linkage analysis. Genomics 15, 4302. GREENWALT DE, SZABO J, MANCHEL I. 2001. High throughput cell-based assay of hematopoietic progenitor differentiation. J Biomol Screen 6, 38392.

459

GROTEN JP et al.., 2000, An analysis of the possibility for health implications ofjoint actions and interactions between food additives, Regul Toxicol Pharmacol 31, 7791. GU H, ZOU YR, RAJEWSKY K. Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through CreloxP- mediated gene targeting. 1993. Cell 73, 115564. GNTHER U, LIU Y, SANFORD D, BACHOVCHIN W, SCHAFFHAUSEN B. 1996. NMR analysis of interactions of a PI-3 kinase SH2 domain with phosphotyrosine peptides reveals interdependence of major binding sites, Biochemistry 35, 1557081. GNTHER U, SCHAFFHAUSEN B. 2002. NMRKIN: simulating line shapes from twodimensional spectra of proteins upon ligand binding, J Biomol NMR 22, 2019. HAJDUK P, BOYD S, NETTESHEIM D, NIENABER V, SEVERIN J, SMITH R, DAVIDSON D, ROCKWAY T, FESIK S. 2000. Identification of novel inhibitors of urokinase via NMR-based screening, J Med Chem 43, 38626. HAJDUK P, GERFIN T, BOEHLEN J, HABERLI M, MAREK D, FESIK S. 1999. Highthroughput nuclear magnetic resonance-based screening, J Med Chem 42, 23157. HAJDUK P, OLEJNICZAK E, FESIK S. 1997. One-dimensional relaxation- and diffusionedited NMR methods for screening compounds that bind to macromolecules, J Am Chem Soc 119, 1225761. HAJDUK PJ, AUGERI DJ, MACK J, MENDOZA R, YANG J, BETZ SF, FESIK SW. 2000. NMR-based screening of proteins containing 13C-labeled methyl groups, J Am Chem Soc 122, 7898904. HANAHAN D, WEINBERG RA. 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100, 5770. HEASMAN J. Morpholino oligos: making sense of antisense? 2002. Dev Biol 243, 209214. HEFTI JP, KUMAR A. 1999. Sensitive detection method of dielectric dispersions in aqueous based, surface bound macromolecular structures using microwave spectroscopy. Appl Phys Lett 75, 18024. HEIJNE WH et al., 2003, Toxicogenomics of bromobenzene hepatotoxicity: a combined transcriptomics and proteomics approach, Biochem Pharmacol 651, 85775. HITZL M, DRESCHER S, VAN DER KH, SCHAFFELER E, FISCHER J, SCHWAB M, et al. 2001, The C3435T mutation in the human MDR1 gene is associated with altered efflux of the Pglycoprotein substrate rhodamine 123 from CD56+ natural killer cells. Pharmacogenetics 11, 293 8. HOFFMEYER S, BURK O, VON RICHTER O, ARNOLD HP, BROCKMOLLER J, JOHNE A, CASCORBI I, GERLOFF T,ROOTS I, EICHELBAUM M, BRINKMANN U. 2000. Functional polymorphisms of the human multidrug resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with Pglycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 97, 34738. HOFFMEYER S, BURK O, VON RICHTER O, et al ., 2000. Functional polymorphisms of the human multidrug-resistence gene: multiple sequence variations and correlation of one allele withP-glycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 97:3473-3478. HOLMES E et al., 2001, Metabonomic characterization of genetic variations in toxicological and metabolic responses using probabilistic neural networks, Chem Res Toxicol 14, 18291 HONDA A, ADAMS SR, SAWYER CL, LEV-RAM V, TSIEN RY, DOSTMANN WR. 2001. Spatiotemporal dynamics of guanosine 3,5-cyclic monophosphate revealed by a genetically encoded, fluorescent indicator. Proc Natl Acad Sci USA 98, 243742. HUNTE C, KANNT A. 2003. Antibody fragment mediated crystallization of membrane proteins, in: HUNTE C, VON JAGOW G, SCHGGER H, eds, Membrane Protein Purification and Crystallization 20518, Elsevier Science, Amsterdam. HUNTE C, MICHEL H. 2002. Crystallisation of membrane proteins mediated by antibody fragments, Curr Opin Struct Biol 12, 5038.

460

HUNTE C, MICHEL H. 2003. Membrane protein crystallization, in: HUNTE C, VON JAGOW G, SCHGGER H, eds, Membrane Protein Purification and Crystallization, 14360, Elsevier Science, Amsterdam. HUNTE C. 2001. Insights from the structure of the yeast cytochrome bc1 complex: crystallization of membrane proteins with antibody fragments, FEBS Lett 504, 126132. HWANG LY, LIEU PT, PETERSON PA, YANG Y. 2001. Functional regulation of immunoproteasomes and transporter associated with antigen processing. Immunol Res 24, 24572. INGELMAN-SUNDBERG M, OSCARSON M, DALY AK, GARTE S, NEBERT DW. 2001. Human cytochrome P-450 (CYP) genes: a web page for the nomenclature of alleles. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10, 13078. INGELMAN-SUNDBERG M. 2001. Genetic susceptibility to adverse effects of drugs and environmental toxicants. The role of the CYP family of enzymes. Mutat Res 482, 119. INTERNATIONAL SNP MAP WORKINGGROUP. 2001. A map of the human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature 409, 92833. ITO T, CHIBA T, YOSHIDA M. 2001. Exploring the protein interactome using comprehensive two-hybrid projects. Trends Biotechnol 19, S237. JANN MW, COHEN LJ. 2000. The influence of ethnicity and antidepressant pharmacogenetics in the treatment of depression. Drug Metab Drug Interact 16, 3967. JANNETTO P J, LALELI-SAHIN E,WONG S H, 2004.Pharmacogenomic genotyping methodologies. Clin Chem Lab Med, 42:1256-1264. JANSEN G, HAZENDONK E, THIJSSEN KL, PLASTERK RH. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. 1997. Nat Genet 17, 11921. JHONE A, KOPKE K, GERLOFF T, et al., 2002. Modulation of steady- state kinetics of digoxin by haplotypes of the P-glycoprotein MDR1 gene. Clin Pharmacol ther, 72:584-594. JORGENSEN EM, MANGO SE. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. 2002. Nat Rev Genet 3, 35669. KAGIMOTO M, HEIM M, KAGIMOTO K, ZEUGIN T, MEYER UA. 1990. Multiple mutations of the human cytochrome P450IID6 gene (CYP2D6) in poor metabolizers of debrisoquine. Study of the functional significance of individual mutations by expression of chimeric genes. J Biol Chem 265, 1720914. KAISER R, SEZER O, PAPIES A, BAUER S, SCHELENZ C, TREMBLAY PB, et al., 2002. Patient-tailored antiemetic treatment with 5-hydroxytryptamine type 3 receptor antagonists according to cytochrome P-450 2D6 genotypes. J Clin Oncol 20, 280511. KANG SH, OH TJ, KIM RG, KANG TJ, HWANG SH, LEE EY, CHOI CY. 2000. An efficient cell-free protein synthesis system using periplasmic phosphatase-removed S30 extract. J Microbiol Methods 43, 916. KARP PD. 2001. Pathway databases: a case study in computational symbolic theories. Science 293, 20404. KAWAMURA M, OHARA S, KOIKE T, IIJIMA K, SUZUKI J, KAYABA S, et al. 2003. The effects of lansoprazole on erosive reflux oesophagitis are influenced by CYP2C19 polymorphism. Aliment Pharmacol Ther 17, 96573. KIM DM, SWARTZ JR. 2000. Prolonging cell-free protein synthesis by selective reagent additions. Biotech Prog 16, 38590. KIM RB, LEAKE BF, CHOO EF, DRESSER GK, KUBBA SV, SCHWARZ UI, TAYLOR A, XIE HG, MCKINSEY J, ZHOU S, LAN LB, SCHUETZ JD, SCHUETZ EG, WILKINSON GR. 2001. Identification of functionally variant MDR1 alleles among European Americans and African Americans. Clin Pharmacol Ther 70, 18999. KIMCHI-SARFATY C, GRIBAR JJ, GOTTESMAN MM., 2002. .Functional characterization of coding polymorphisms in the human MDR1 gene using a vaccinia virus expression system. Mol Pharmacol, 62, 16.

461

KIMURA S, UMENO M, SKODA RC, MEYER UA, GONZALEZ FJ. 1989. The human debrisoquine 4-hydroxylase (CYP2D) locus: sequence and identification of the polymorphic CYP2D6 gene, a related gene and a pseudogene. Am J Hum Genet 45, 889904. KIRCHHEINER J, BROSEN K, DAHL ML, GRAM LF, KASPER S, ROOTS I, et al., 2001. CYP2D6 and CYP2C19 genotype based dose recommendations for antidepressants: a first step towards subpopulation-specific dosages. Acta Psychiatr Scand 104, 17392. KIRCHHEINER J, MEINEKE I, STEINBACH N, MEISEL C, ROOTS I, BROCKMOLLER J., 2003. Pharmacokinetics of diclofenac and inhibition of cyclooxygenases 1 and 2: no relationship to the CYP2C9 genetic polymorphism in humans. Br J Clin Pharmacol, 55, 5161. KIRCHHEINER J, STORMER E, MEISEL C, et al., 2003. Influence of CYP2C9 genetic polymorphisms on pharmacokinetics of celecoxib and its metabolites. Pharmacogenetics, 13: 473480. KOEN YM et al., 2000, Identification of three protein targets for reactive metabolites of bromobenzene in rat liver cytosol, Chem Res Toxicol 13, 132635. KOTARSKY K, OWMAN C, OLDE B. 2001. A chimeric reporter gene allowing for clone selection and high-throughput screening of reporter cell lines expressing G-protein-coupled receptors. Anal Biochem 288, 20915. KRUGLYAK L. 1999. Prospects for whole-genome linkage disequilibrium mapping of common disease genes. Nat Genet 22, 13944. KUEHL P, ZHANG J, LIN Y, et al., 2001.Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. Nat Genet, 27: 383-391. KUHLBRANDT W. 2003. Two-dimensional crystallization of membrane proteins: a practical guide, in: HUNTE C, VON JAGOW G, SCHGGER H, eds, Membrane Protein Purification and Crystallization, 25384, Elsevier Science, Amsterdam. KUIVENHOVEN JA, JUKEMA JW, ZWINDERMAN AH, DE KNIJFF P, MCPHERSON R, BRUSHCKE AV, LIE KI, KASTELEIN JJ. 1998. The role of a common variant of the cholesteryl ester transfer protein gene in the progression of coronary atherosclerosis. The Regression Growth Evaluation Statin Study Group. N Engl J Med 338, 8693. KWIATKOWSKI RW, LYAMICHEV V, DE ARRUDA M, NERI B. 1999. Clinical, genetic, and pharmacogenetic applications of the Invader assay. Mol Diagn 4, 35364. LANDER ES, et al. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome, Nature 409, 860921. LANGE C, HUNTE C. 2002. Crystal structure of the yeast cytochrome bc1 complex with its bound substrate cytochrome c, Proc Natl Acad Sci USA 99, 28005. LEE JT, KROEMER HK, SILBERSTEIN DJ, FUNCK-BRENTANO C, LINEBERRY MD, WOOD AJ, RODEN DM, WOOSLEY RL. 1990. The role of genetically determined polymorphic drug metabolism in the beta blockade produced by propafenone. N Engl J Med 322, 17648. LEFKOWITZ RJ. 2000. The superfamily of heptahelical receptors. Nat Cell Biol 2, E1336. LEOF EB. 2000. Growth factor receptor signaling: location location location. Trends Cell Biol 10, 3438. LESLIE AG, MOODY PC, SHAW WV. 1988. Structure of chloramphenicol acetyltransferase at 1.75-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA 85, 41337. LEVO A, KOSKI A, OJANPERA I, 2003. Post-morten SNP analysis of CYP2D6 gene reveals correlation between genotype and opioid drug (tramadol) metabolite ratios in blood. Forensic Sci Int, 135:9-15. LIESE A, SEELBACH K, BUCHHOLZ A, HABERLAND J, in: LIESE A, SEELBACH K, WANDREY C. 2000. Eds Industrial Biotransformations, 95392, Wiley-VCH, Weinheim. LIN M, SHAPIRO M. 1996. Mixture analysis in combinatorial chemistry, application of diffusion-resolved NMR spectroscopy, J Org Chem 61, 76179. LIN M, SHAPIRO MJ, WAREING JR. 1997. Diffusion-edited NMR-affinity NMR for direct observation of molecular interactions, J Am Chem Soc 119, 524950.

462

LLEDO P. 1993. Variations in drug metabolism due to genetic polymorphism. Drug Invest 5, 1934. LOCKHART DJ, WINZELER EA. 2000. Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature 405, 82736. LORENZ WW, CORMIER MJ, OKANE DJ, HUA D, ESCHER AA, SZALAY AA. 1996. Expression of the Renilla reniformis luciferase gene in mammalian cells. J Biolumin Chemilumin 11, 317. LOVLIE R, DALY AK, MATRE GE, MOLVEN A, STEHEN VM. 2001. Polymorphisms in CYP2D6 duplicationnegative individuals with the ultrarapid metabolizer phenotype: a role for the CYP2D6*35 allele in ultrarapid metabolism? Pharmacogenetics 11, 45 55. MADIN K, SAWASAKI T, OGASAWARA T, ENDO Y. 2000. A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes. Proc Natl Acad Sci USA 97, 55964.. MAHAJAN NP, LINDER K, BERRY G, GORDON GW, HEIM R, HERMAN B. 1998. Bcl 2 and Bax interactions in mitochondria probed with green fluorescent protein and fluorescence resonance energy transfer. Nat Biotechnol 16, 54752. MAITLAND-VAN DER ZEE A, KLUNGEI OH, STRICKER BHC, VERSCHUREN WMM, KASTELEIN JJP, LEUFKENS HGM, DE BOER A. 2002. Genetic polymorphisms: importance for response to HMG-CoA reductase inhibitors. Atherosclerosis 163, 21322. MAJERLE A, KIDRIC J, JERALA R. 2000. Production of stable isotope enriched. antimicrobial peptides in Escherichia coli: an application to the production of a 15N-enriched fragment of lactoferrin. J Biomol NMR 18, 14551. MALAKOFF D. The Rise of the Mouse, Biomedicines Model Mammal. 2000. Science 288, 24853. MANNING AM. 1996. Transcription factors: a new frontier for drug discovery. Drug Discov Today 1, 15160. MAREZ D, LEGRAND M, SABBAGH N, GUIDICE JM, SPIRE C, LAFITTE JJ, MEYER UA, BROLY F. 1997. Polymorphism of the cytochrome P450 CYP2D6 gene in a European population: characterization of 48 mutations and 53 alleles, their frequencies and evolution. Pharmacogenetics 7, 193202. MARINISSEN MJ, GUTKIND JS. 2001. G-protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci 22, 36876. MARLEY J, LU M, BRACKEN C. 2001. A method for efficient isotopic labeling of recombinant proteins. J Biomol NMR 20, 71-5 MARTEMYANOV KA, SHIROKOV VA, KURNASOV OV, GUDKOV AT, SPIRIN AS. 2001. Cell-free production of biologically active polypeptides: application to the synthesis of antibacterial polypeptide cecropin. Protein Expr Purif 21, 45661. MAYER M, MEYER B. 2001. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor, J Am Chem Soc 123, 610817. METZGER D, CHAMBON P. Site- and time-specific gene targeting in the mouse. 2001. Methods 24, 7180. MAYER TU, KAPOOR TM, HAGGARTY SJ, KING RW, SCHREIBER SL, MITCHISON TJ. 1999. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science 286, 9714. MEYER B, WEIMAR T, PETERS T. 1997. Screening mixtures for biological activity by NMR, Eur J Biochem 246, 7059. MEYER UA. 2000. Pharmacogenetics and adverse drug reactions. Lancet 356, 166771. MICHEL H. 2001. Crystallization of membrane proteins, in: ROSSMANN MG, ARNOLD E, eds, International Tables of Crystallography F: Macromolecular Crystallography, 949, Kluwer, Dordrecht.

463

MICHIENZI A, CAGNON L, BAHNER I, ROSSI JJ, 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97, 895560. MILLIGAN G, REES S. 1999. Chimaeric G alpha proteins: their potential use in drug discovery. Trends Pharmacol Sci 20, 11824. MITCHELL P. 2001. Turning the spotlight on cellular imaging. Nat Biotechnol 19, 10137. MOORE JT, DAVIS ST, DEV IK. 1997. The development of beta-lactamase as a highly versatile genetic reporter for eukaryotic cells. Anal Biochem 247, 2039. MORIYA Y, NAKAMURA T, HORINOUCHI M, SAKAEDA T, TAMURA T, AOYAMA N, et al. 2002., Effects of polymorphisms of MDR1, MRP1, and MRP2 genes on their mRNA expression levels in duodenal enterocytes of healthy Japanese subjects. Biol Pharm Bull 25, 1356 9. NAGY A, ROSSANT J, NAGY R, ABRAMOW-NEWERLY W, RODER JC. Derivation of completely cell culture derived mice from early-passage embryonic stem cells. 1993. Proc Natl Acad Sci USA 90, 84248. NAKAMURA K, ARIYOSHI N, YOKOI T, OHGIYA S, CHIDA M, NAGASHIMA K, et al. 2002. CYP2D6.10 present in human liver microsomes shows low catalytic activity and thermal stability. Biochem Biophys Res Commun 293, 96973. NICHOLSON JK, CONNELLY J, LINDON C, HOLMES E. 2002. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function. Nat Rev Drug Discov 1, 15361. NICHOLSON JK, LINDON JC, HOLMES E. 1999. Metabonomics: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica 29, 11819. NOWOTNY P, KWON JM, GOATE AM. 2001. SNP analysis to dissect human traits. Curr Opin Neurobiol 11, 63741. ORMO M, CUBITT AB, KALLIO K, GROSS LA, TSIEN RY, REMINGTON SJ. 1996. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science 273, 13925. OUDE ELFERNIC R P,ZADINA J, 2001. MDR1 P-glycoprotein transports endogenous peptides. Peptides, 22:2015-2020. PADAN E, HUNTE C, REILANDER H. 2003. Production and purification of recombinant membrane proteins, in: HUNTE C, VON JAGOW G, SCHGGER H, eds, Membrane Protein Purification and Crystallization, 5583, Elsevier Science, Amsterdam. PAIGEN K. 1989. Mammalian betaglucuronidase: genetics molecular biology and cell biology. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 37, 155205. PALCZEWSKI K, KUMASAKA T, HORI T, BEHNKE CA, MOTOSHIMA H, FOX BA, LE TRONG I, TELLER DC, OKADA T, STENKAMP RE, YAMAMOTO M, MIYANO M. 2000. Crystal structure of rhodopsin: a G protein-coupled receptor. Science 289, 73945. PARSONS SJ, RHODES SA, CONNOR HE, REES S, BROWN J, GILES H. 2000.Use of a dual firefly and Renilla luciferase reporter gene assay to simultaneously determine drug selectivity at human corticotrophin releasing hormone 1 and 2 receptors. Anal Biochem 281, 18792. PELLETIER JN, CAMPBELL-VALOIS FX, MICHNICK SW. 1998. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proc Natl Acad Sci USA 95, 121416. PEREZ OD, NOLAN GP. 2002. Simultaneous measurement of multiple active kinase states using polychromatic flow cytometry. Nat Biotechnol 20, 15562. POLLOK BA, HEIM R. 1999. Using GFP in FRET-based applications. Trends Cell Biol 9, 5760. RAAMSDONK LM, TEUSINK B, BROADHURST D, ZHANG N, HAYES A, WALSH MC, BERDEN JA, BRINDLE KM, KELL DB, ROWLAND JJ, WESTERHOFF HV, VAN DAM K, OLIVER SG. 2000. A functional genomics strategy that uses metabolome data to reveal the phenotype of silent mutations. Nat Biotechnol 19, 4550. RAM PT, IYENGAR R. 2001. G protein coupled receptor signaling through the Src and Stat3 pathway: role in proliferation and transformation. Oncogene 20, 16016. 464

RAO NN, LIESE A. 2004, Stereoselective synthesis with the help of recombinant enzymes in: DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. 125 -153, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim RAU T, HEIDE R, BERGMANN K, WUTTKE H, WERNER U, FEIFEL N, et al. 2002. Effect of the CYP2D6 genotype on metoprolol metabolism persists during long-term treatment. Pharmacogenetics 12, 46572. REICH DE, CARGILL M, BOLK S, IRELAND J, SABETI PC, RICHTER DJ, LAVERY T, KOUYOUMJIAN R, FARHADIAN SF, WARD R, LANDER ES. 2001. Linkage disequilibrium in the human genome. Nature 411, 199204. REMINGTON SJ. 2002. Negotiating the speed bumps to fluorescence. Nat Biotechnol 20, 289. REMY I, MICHNICK SW. 1999. Clonal selection and in vivo quantitation of protein interactions with proteinfragment complementation assays. Proc Natl Acad Sci USA 96, 53949. RENEGAR G, RIESER P, MANASCO P. 2001. Pharmacogenetics: the Rx perspective. Expert Rev Mol Diagn 1, 25563. ROBERTS G. 2000. Applications of NMR in drug discovery, Drug Discov Today 5, 23040. ROBERTSON JD, ORRENIUS S. 2000, Molecular mechanisms of apoptosis induced by cytotoxic chemicals, Crit Rev Toxicol 30, 60927. ROGERS JF, NAFZIGER AN, BERTINO JS., 2002. Pharmacogenetics affects dosing, efficacy and toxicity of cytochrome P450- metabolized drugs. Am J Med, 113: 746-750. RONG YS, TITEN SW, XIE HB, GOLIC MM, BASTIANI M, BANDYOPADHYAY P, OLIVERA BM, BRODSKY M, RUBIN GM, GOLIC KG. Targeted mutagenesis by homologous recombination in D. melanogaster. 2002. Genes Dev 16, 156881. ROSSANT J, NAGY A. Genome engineering: the new mouse genetics. 1995. Nat Med 1, 5924. SAENGER W, 1984, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer Verlag, New York. SAMER CF, PIGUET V, DAYER P, et al., 2005. Polymorphisme genetique et interaction medicamenteuses: leur importance dans le traitement de douleur. Can J Anesth, 52:806-821. SARVER JG, KLIS WA, BYERS JP, ERHARDT PW. 2002. Microplate screening of the differential effects of test agents on Hoechst 33342, rhodamine 123, and rhodamine 6G accumulation in breast cancer cells that overexpress Pglycoprotein. J Biomol Screen 7, 2934. SAUTEL M, MILLIGAN G. 2000. Molecular manipulation of G-proteincoupled receptors: a new avenue into drug discovery. Curr Med Chem 7, 88996. SCHAAP AP, AKHAVAN H, ROMANO LJ. 1989. Chemiluminescent substrates for alkaline phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays and DNA probes. Clin Chem 35, 18634. SCHAUFELE F. 2001. Shedding light on molecular timing. Nat Biotechnol 19, 212. SCHERR M, REED M, HUANG C-F, RIGGS AD, ROSSI JJ, 2000, Mol Therapy 2, 2638. SCHLESSINGER J. 1993. Cellular signaling by receptor tyrosine kinases. Harvey Lect 89, 10523. SCORDO MG, AKLILLU E, YASAR U, et. al., 2001. Genetic poymorphism of cytochrome P450 2C9 in a caucasian and a black African population. Br J Cin Pharmacol, 52: 447-450. SCORDO MG, SPINA E, ROMEO P, DAHL ML, BERTILSSON L, JOHANSSON I, et al. 2000. CYP2D6 genotype and antipsychotic-induced extrapyramidal side-effects in schizophrenic patients. Eur J Clin Pharmacol 56, 67983. SCRIBA G. 2004, Affinity chromatography in: DINGERMANN TH, STEINHILBER D, FOLKERS G. eds. Molecular Biology in Medicinal Chemistry. 211 - 242, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim SHAPIRO M, WAREING J. 1998. NMR methods in combinatorial chemistry, Curr Opin Chem Biol 2, 3725.

465

SHARKE K, JARRAR M, SCHMIDT H, et al., 2003.ABCB1 (multidrug resistance transporter) gene mutations on disposition and central nervous effects of loperamide in healthy volunteers. Pharmacogenetics, 74:651-660. SHI MM, BLEAVINS MR, DE LA IGLESIA FA. 2001. Technologies for detecting genetic polymorphisms in pharmacogenomics. Drug Metab Dispos 29, 5915. SHINDERMAN M, MAXWELL S, BRAWAND-AMEY M, et al., 2003. Cytochrome p450 3A4 metabolic activity, methadone blood concentrations, and methadone doses. Drug Alcohol Dependence, 69: 205-211. SHINTANI M, IEIRI I, INOUE K, et al., 2001. Genetic polymorphysms and functional characterization of the 5- flanking region of the human CYP2C9 gene: in vitro and in vivo studies. Clin Pharmacol Ther 70: 175-182. SHIROKOV V, SIMONENKO PN, BIRYUKOV SV, SPIRIN AS. 2002. Continuous-flow and continuous exchange cell-free translation systems and reactors. In Spirin AS, ed., Cell free Translation Systems, 91108, Springer, Berlin.References 299 SHUKER SB, HAJDUK PJ, MEADOWS RP, FESIK SW. 1996. Discovering high-affinity ligands for proteins: SAR by NMR, Science 274, 15314. SIGURDSSON STH, THOMSON JB, ECKSTEIN F, IN: RW SIMONS, M GRUNBERGMANAGO, 1998, eds, RNA Structure and Function, 33976, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY SIMON MA. 2000. Receptor tyrosine kinases: specific outcomes from general signals. Cell 103, 135. SINDRUP SH, BRSEN K. 1996. The pharmacogenetics of codeine hypoalgesia. Pharmacogenetics 10, 33546. SINGH M, OHAGAN DT. 2002. Recent advances in vaccine adjuvants, Pharm Res 6, 715 28. SMITHIES O. Animal models of human genetic diseases. 1993. Trends Genet 9, 11216. SNYDER LH. 1932. The inheritance of taste deficiency in man. Ohio J Sci 32, 43668. SOMOGYI R, GRELLER LD. 2001. The dynamics of molecular networks: applications to therapeutic discovery. Drug Discov Today 6, 126777. SONOYAMA T, TANI H, MATSUDA K, KAGEYAMA B, TANIMOTO M, KOBYASHI K, YAGI S, KYOTANI H, MITSUSHIMA K. 1982. Appl Environ Microbiol 43, 10649. SORKIN A, MCCLURE M, HUANG F, CARTER R. 2000. Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Curr Biol 10, 13958. SPINA E, GIOTTO C, AVENOSO A, CAMPO GM, et al., 1997. Relationship between plasma desipramine levels, CYP2D6 phenotype and clinical response to desipramine: a prospective study. Eur J Clin Pharmacol, 51:395-398. STEPHANOPOULOS G, KELLEHER J. 2001. Biochemistry. How to make a superior cell. Science 292, 20245. STEPHANOPOULUS GN, ARISTIDOU AA, NIELSEN J. 1998. Metabolic Engineering Principles and Methodologies, Academic Press, San Diego, CA. STOCKMANN B, DALVIT C. 2002. NMR screening techniques in drug discovery and drug design, Prog Nucl Magn Spectrosc 41, 187231. STRATOWA C, HIMMLER A, CZERNILOFSKY AP. 1995. Use of a luciferase reporter system for characterizing G-protein-linked receptors. Curr Opin Biotechnol 6, 57481. STRAUB B, MEYER E, FROMHERZ P. 2001. Recombinant maxi-K channels on transistor, a prototype of ionoelectronic interfacing. Nat Biotechnol 19, 121124. STREETMAN D S, BERTINO J S JR, NAFZIGER A N, 2000.Phenotyping of drugmetabolizing enzyme In adults: a review of in vivo cytochrome P450 phenotyping probes. Pharmacogenetics, 10:187-216. SUBRAMANIAM R, DESVEAUX D, SPICKLER, MICHNICK SW, BRISSON N. 2001. Direct visualization of protein C interactions in plant cells. Nat Biotechnol 19, 76972. 466

SULLIVAN E, TUCKER EM, DALE IL. 1999. Measurement of [Ca2+] using the Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR). Methods Mol Biol 114, 12533. SWYNGHEDAUW B. 2001. Cardiovascular pharmacogenetics and pharmacogenomics. J Clin Basic Cardiol 4, 20510. SYKES B. 1994. Interaction of transforming growth factor-a with the epidermal growth factor receptor: binding kinetics and differential mobility within the bound TGF-a, Biochemistry 33, 1528392. TAMMINGA WJ, WERNER J, OOSTERHUIS B, BRAKENHOFF JPG, GERRITIS MGF, DE ZEEUW RA, DE LEIJ LF, JONKMAN JH. 2001. An optimized methodology for combined phenotyping and genotyping on CYP2D6 and CYP2C19. Eur J Clin Pharmacol 57, 1436. TAN S, HALL IP, DEWAR J, DOW E, LIPWORTH B. 1997. Association between beta 2 adrenoceptor polymorphism and susceptibility to bronchodilator desensitisation in moderately severe stable asthmatics. Lancet 350, 9959. THOMAS KR, CAPECCHI MR. Site directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. 1987. Cell 51, 50312. THOMAS RS, RANK DR, PENN SG, ZASTROW GM, HAYES KR, PANDE K, GLOVER E, SILANDER T, CRAVEN MW, REDDY JK, JOVANOVICH SB, BRADFIELD CA. 2001. Identification of toxicologically predictive gene sets using cDNA microarrays. Mol Pharmacol 60, 118994. THORISSON GA, STEIN LD. 2003. The SNP Consortium website: past, present and future. Nucleic Acids Res 31, 1247. TSIEN RY. 1998. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67, 509 44. TSUJI Y et al., 2000, Coordinate transcriptional and translational regulation of ferritin in response to oxidative stress, Mol Cell Biol, 20, 581827. TSUNEOKA Y, MATSUO Y, IWAHASHI K, TAKEUCHI H, ICHIKAWA Y. 1993. A novel cytochrome P-450ID6 mutant gene associated with Parkinsons disease. J Biochem 114, 263 6. TUCKER CL, FIELDS S. 2001. A yeast sensor of ligand binding. Nat Biotechnol 19, 10426. TULIN EE, KEN-ICHI T, SHIN-ICHIRO E. 1995. Continuously coupled transcriptiontranslation system for the production of rice cytoplasmic aldolase. Biotechnol Bioeng 45, 5116. UDVADIA AJ, LINNEY E. Windows intodevelopment: historic, current, and future perspectives on transgenic zebrafish. 2003. Dev Biol 256, 117. UINGS IJ, FARROW SN. 2000. Cell receptors and cell signaling. Mol Pathol 53, 2959. VAN DEN BURG HA, DE WIT PJGM, VERVOORT J. 2001. Efficient 13C/15N double labeling of the avirulence protein AVR4 in a methanol-utilizing strain (Mut+. of Pichia pastoris. J Biomol NMR 20, 25161. VENTER JC, et al. 2001. The sequence of the human genome, Science 291, 130451. VENTURI M, HUNTE C. 2003. Monoclonal antibodies for the structural analysis of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli, Biochim Biophys Acta Biomembr 1610, 4650. VENTURI M, SEIFERT C, HUNTE C. 2002. High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm, J Mol Biol 315, 18. VERSTUYFT C, SCHWAB M, SCHAEFFELER E, KERB R, BRINKMANN U, JAILLON P, et al., 2003, Digoxin pharmacokinetics and MDR1 genetic polymorphisms. Eur J Clin Pharmacol 58, 80912. VOGT A, ADACHI T, DUCRUET AP, CHESEBROUGH J, NEMOTO K, CARR BI, LAZO JS. 2001. Spatial analysis of key signaling proteins by high-content solid-phase cytometry in Hep3B cells treated with an inhibitor of Cdc25 dual-specificity phosphatases. J Biol Chem 276, 2054450. VOGTHERR M, PETERS P. 2000. Application of NMR based binding assays to identify key hydroxy groups for intermolecular recognition, J Am Chem Soc 122, 60939. WARREN MK, ROSE WL, BEALL LD, CONE J. 1995. CD34+ cell expansion and expression of lineage markers during liquid culture of human progenitor cells. Stem Cells 13, 167 74. 467

WEINBERGER SR, DALMASSO EA, FUNG ET. 2002. Current achievements using Protein Chip Array technology. Curr Opin Chem Biol 6, 8691. WELSH S, KAY SA. 1997. Reporter gene expression for monitoring gene transfer. Curr Opin Biotechnol 8, 61722. WHITE MA. 1996. The yeast twohybrid system: forward and reverse. Proc Natl Acad Sci USA 93, 100013. WORMHOUDT LW, COMMANDEUR JN, VERMEULEN NP. 1999. Genetic polymorphisms of human N-acetyltransferase, cytochrome P450, glutathione-S-transferase, and epoxide hydrolase enzymes: relevance to xenobiotic metabolism and toxicity. Crit Rev Toxicol 29, 59124. WUTTKE H, RAU T, HEIDE R, BERGMANN K, BOHM M, WEIL J, et al.2002. Increased frequency of cytochrome P450 2D6 poor metabolizers among patients with metoprolol-associated adverse effects. Clin Pharmacol Ther 72, 42937. XING H, TRAN H, KNAPP TE, NEGULESCU PA, POLLOK BA. 2000. A fluorescent reporter assay for the detection of ligands acting through Gi protein-coupled receptors. J Recept Signal Transduct Res 20, 189210. XING H, TRAN HC, KNAPP TE, NEGULESCU PA, POLLOK BA. 2000. A fluorescent reporter assay for the detection of ligands acting through Gi protein-coupled receptors. J Recept Signal Transduct Res 20, 189210. XU JZ, WANG X, ENSIGN B, LI M, WU L, GUIA A, XU J. 2001. Ion-channel assay technologies: quo vadis? Drug Discov Today 6, 127887. ZABIN I. 1982. A model of protein interaction. Mol Cell Biochem 49, 87 96. ZAIGLER M, TANTCHEVA-POOR I, FUHR U. 2000. Problems and perspectives of phenotyping for drug-metabolizing enzymes in man. Int J Clin Pharmacol Ther 37, 19. ZANGER UM, FISCHER J, RAIMUNDO S, STUVEN T, EVERT BO, SCHWAB M, et al. 2001. Comprehensive analysis of the genetic factors determining expression and function of hepatic CYP2D6. Pharmacogenetics 11, 57385. ZANGER UM, RAIMONDO S, EICHELBAUM M, 2004. Cytochrome P450 2D6: overview and update on pharmacology, genetics, biochemistry. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 369:23-37. ZHANG H, HASTY P, BRADLEY A. Targeting frequency for deletion vectors in embryonic stem cells. 1994. Mol Cell Biol 14, 240410. ZHOU H, TONG Z, MCLEOD J F, 2004. Cocktail approaches and strategies in drug development: valuable tool or flwedscience? J Clin Pharmacol 44:120-134. ZHOU P, LUGOVSKOY AA, WAGNER G. 2001. A solubility-enhancement tag (SET) for NMR studies of poorly behaving proteins. J Biomol NMR 20, 114. ZHU HJ, BURGESS AW. 2001. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Mol Cell Biol Res Commun 4, 32130. ZHU M, FAHL WE. 2000. Development of a green fluorescent protein microplate assay for the screening of chemopreventive agents. Anal Biochem 287, 2107. ZLOKARNIK G, NEGULESCU PA, KNAPP TE, MERE L, BURRES N, FENG L, WHITNEY M, ROEMER K, TSIEN RY. 1998. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science 279, 848. ZSCHIESCHANG P, HIEPE F, GROMNICA-IHLE E, ROOTS I, CASCORBI I., 2002. Lack of association between arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2) polymorphism and systemic lupus erythematosus. Pharmacogenetics 12, 55963. ZUHLSDORF MT. 1998. Relevance of pheno- and genotyping in clinical drug development. J Clin Pharmacol Ther 36, 60712.

468

469