Sunteți pe pagina 1din 32

4.

Gating
Procesul de gating (termen intraductibil n romn ~ cele mai apropiate aproximaii ar fi activare sau comand) reprezint probabil cel mai important grup de proprieti ale canalelor ionice, care asigur extraordinara diversitate a funciilor lor. Gatingul se refer la modularea cii de permeaie (porul idrofil) prin modificri conformaionale ale subunitilor constituente, asemntor desc iderii !i nc iderii unor pori. "deea este formulat iniial de #odg$in !i #uxle%, pornind de la constatarea c, la variaii bru!te de potenial, conductanele &a ' !i (' au o reacie instantanee linear, ns sunt modulate de o serie de procese cu cinetic lent (ms) declan!ate de variaii de potenial, numite activare !i inactivare. )n funcie de stimulul care determin activarea se poate realiza o clasificare funcional a canalelor ionice. *istingem dou categorii principale+ canale activate de volta, (voltage-gated) !i activate de ligand (ligand-gated). )n plus, n structura diferiilor receptori ntlnim !i canale activate de ali stimuli+ mecanici, termici, c imici (de exemplu, variaii ale p# extracelular).

4.1 Tehnica patch-clamp Pe parcursul ultimilor -. ani asistm n biofizic la o dezvoltare inimaginabil a metodelor de evideniere !i studiere a proprietilor canalelor ionice la nivel microscopic. Problema se nscrie ntr/o categorie mai larg, !i anume determinarea corelaiilor ntre proprietile macroscopice, la nivelul unui ansamblu statistic, !i cele microscopice, obinute prin msurtori directe pe o singur molecul, n condiii staionare sau non/staionare. Prima evideniere a caracterului discret, discontinuu, al fluxurilor ionice transmembranare pasive a fost realizat n anii 0-./12. printr/o metod statistic foarte elegant numit analiza fluctuaiilor. 3etoda a fost iniiat de 4erveen !i *er$sen, continuat de (atz !i 3iledi, 5tevens, *e6elice, &eumc$e, pe curenii de plac motorie activai de 78 , !i pe canalele de &a ' sensibile la amilorid din epitelii de 9indemann, 4an *riessc e, #elman !i :axendale. ;a se bazeaz pe

calcularea varianei curentului printr/un ansamblu statistic de canale meninute n voltage/clamp, pentru n e!antioane+
1 n = ( xi x ) = n i =1
2 i 2

x
n

2 i

2 x xi n

1 + x 2 = xi2 x 2 n

8onsidernd c fiecare din cele N canale ale ansamblului are aceea!i probabilitate a strii desc ise, p, !i acela!i curent unitar, i, obinem urmtoarele expresii pentru variana curentului !i pentru curentul macroscopic mediu I+
i2 = Npi 2 Np 2 i 2 = Np (1 p )i 2
I = Npi

*in aceste expresii se poate calcula valoarea curentului unitar i !i a densitii de canale N, dac se estimeaz corect probabilitatea strilor de non/conductan. )n plus, dac relaxrile din fluctuaii sunt monoexponeniale, spectrul de putere al transformatelor n frecven ale nregistrrilor are o form 9orentzian+
S( f ) = S ( 0) 1 + (2f ) 2

unde reprezint constanta de timp a relaxrii, la fel ca n modelul #odg$in/ #uxle%+


=
1 1 = + 2f c

Fig. 4.1 6luctuaii de curent induse de 78 la nivelul plcii motorii meninute n voltage clamp, prin desc iderea aleatoare a receptorilor nicotinici. )n dreapta, densitatea spectral de putere obinut prin transformarea 6ourier a semnalului de curent, fitat cu funcii 9orentz. 5e observ cre!terea corner frequency (fc) la cre!terea temperaturii sau la depolarizare.

Fig 4.2 8urenii de gating ai canalelor de &a' nregistrai la nivelul axonului gigant de calmar. )n timp ce curentul de gating de tip <& are o cinetic mai rapid dect curentul ionic, cel de tip <66 are exact aceea!i cinetic, ceea ce demonstreaz efectul de imobilizare a sarcinii de gating prin inactivare.

< alt te nic de studiu rafinat a proceselor de gating dezvoltat n anii 12. se bazeaz pe ipoteza lui #odg$in !i #uxle%, !i anume existena unor =sezori de volta,>, a cror deplasare n cmpul electric transmembranar intens (estimat la ?. m4@A. B C D.,...,... 4@m) trebuie s genereze un minuscul curent electric, numit curent de gating. 8onsidernd valoarea sarcinii ec ivalente de gating, calculat de #odg$in E #uxle%, de aproximativ - sarcini elementare@canal, putem estima din intensitatea curenilor de gating densitatea de canale. )nregistrarea acestor cureni este dificil, deoarece au o cinetic rapid !i o intensitate cu cteva ordine de mrime mai mic dect a curenilor ionici, deci este necesar nlturarea acestora din urm cu a,utorul unor blocani peptidici puternici (neurotoxine, precum FFG sau 5FG), care s nu afecteze ns modificrile conformaionale induse de variaiile de volta,. )n plus, curenii de lea$age prin conductane de bac$ground !i tranzienii capacitivi pot fi eliminai prin aplicarea a

dou pulsuri de volta, egale !i de sens contrar, pornind de la aceea!i valoare de olding, !i sumarea ulterioar a celor dou nregistrri, ce duce la anularea acestor componente datorit proprietilor lor de simetrie. *e aceea, curenii de gating au fost denumii !i asymmetry (nonlinear) capacitive transients . Pentru decelarea lor este necesar n plus medierea coerent a mai multor nregistrri, ceea ce duce la anularea zgomotului din diferite surse, a crui distribuie este aleatoare, deci valoarea medie n fiecare moment tinde la ., n timp ce semnalul util este =amplificat> cu fiecare nregistrare adugat. 3etoda a fost dezvoltat pe sisteme cu o densitate mare de canale+ pe receptorii di idropiridinici din tubulii transversali ai mu!c ilor sc eletici de 5c neider E 8 andler, !i pe de acum clasicul axon gigant de calmar de (e%nes E Ho,as !i 7rmstrong E :ezanilla. In exemplu de aplicaie l reprezint descoperirea efectului de imobilizare a sarcinii de gating de tip <66+ n timp ce curentul de gating de tip <& are o cinetic mai rapid dect curentul ionic de &a ', cel de tip <66 are aceea!i constant de timp de relaxare ca !i curentul ionic, deci trecerea canalelor de &a' ntr/o stare de non/conductant dup activare duce la blocarea senzorilor de volta,. < alt categorie de metode sunt cele de evideniere direct a fluctuaiilor unitare de conductan obinute prin activitatea canalelor ionice. Primele =salturi de conductan> au fost observate n JK-K de :ean et al. prin ncorporarea unei proteine bacteriene, purificat de 3Lller et al. (JK-D), numit ;"3 ( excitabilityinducing material), n bistraturi lipidice. In progres a fost trecerea la gramicidin, un antibiotic polipeptidic de origine microbian (#lad$% E #a%don, JK2D), a crei importan ca model molecular de permeaie a fost discutat n capitolul precedent. Ilterior !i alte canale ionice izolate n lipozomi au fost ncorporate n bistraturi artificiale. )ns cea mai important modernizare a metodelor electrofiziologice a fost adus de te nica patch clamp (n traducere ad literam =petic fixat>), iniiat de un grup de biofizicieni germani+ :. 5a$mann, ;. &e er, 6. 5igMort , <. #amill, !i continuat de un grup din ce n ce mai larg de entuzia!ti. Primele experimente relevante (JK2-) au constat n nregistrarea curenilor uni/canal (aceast variant

Fig. 4.3 8ircuitele electronice folosite n metoda patc /clamp. )n stnga, principiul de funcionare al convertorului "/4+ putem fixa potenialul la nivelul pipetei aplicnd o tensiune variabil pe o rezisten de feedbac$ (!feedbac$) !i msurnd eroarea cu un instrument foarte sensibil. 7ceasta aciune este realizat de un amplificator diferenial cu tranzistoare 6;F n eta,ul de intrare, cu cureni de poart extrem de mici, deci curentul prin pipet este egal cu curentul de feedbac$. 7stfel, tensiunea la ie!ire este Ipipette!feedbac$. )n dreapta, circuitul electric ec ivalent al membranei !i convertorului "/4.

poart numele de single-channel recording) prin receptorii nicotinici de 78 de pe placa motorie de broasc prin presarea unei pipete cu vrful polizat termic coninnd suber%ldic olin, un analog sintetic al 78 . )n JK?. metoda este mbuntit substanial prin aplicarea unei presiuni negative (suciune) n pipet, ceea ce duce la realizarea unui contact intim ntre bistratul lipidic !i sticl n zona vrfului (gigaseal), ducnd la cre!terea rezistenei de izolaie de la cteva zeci de 3N la peste J ON, ceea ce duce la o rezoluie foarte bun a fluctuaiilor unitare de conductan ale canalului@canalelor active din peticul de membran astfel delimitat. 7ceast incredibil realizare este un rezultat al apariiei unei noi generaii de amplificatoare operaionale, avnd n eta,ul de intrare tranzistoare cu efect de cmp, al cror curent de poart este redus la doar ..P/J. p7. < analiz a surselor de zgomot din eta,ul de intrare ( eadstage) identific Q tipuri diferite+ gomotul termic (thermal noise) datorat agitaiei termice a purttorilor mobili de sarcin, descris n anii JKD. de Ro nson !i &%Suist. 7cesta este independent de frecven (zgomot alb) !i Oaussian, avnd o densitate de putere proporional cu temperatura absolut a mediului+
S (2Hz ) = ( 4k BT ) / R

4alorile medii ptratice (rms(:T)) pentru o band de J. (#z sunt ..A p7 pentru J ON, ..JQ p7 pentru J. ON, ...A p7 pentru J.. ONU astfel se explic avanta,ul adus de mbuntirea rezistenei de izolaie ( !seal sau !s suprafeei de membran a patc ului (cre!te !m !i scade "m) gomotul #de $mpu%cturi& (shot noise) datorat caracterului discontinuu al mi!crii purttorilor individuali de sarcin. ;l este tot independent de frecven !i Oaussian, avnd o densitate spectral de putere+
S(2Hz ) = 2 Iq
unt

) !i de reducerea

unde q este sarcina electric elementar (J.-VJ./JK 8). 5ursa este curentul de lea$age al porilor tranzistoarelor cu efect de cmp, de aceea amplificatorul de eadstage trebuie ales cu gri,, astfel nct biasul intrrilor s fie minim. In curent de poart de P p7 genereaz o densitate spectral a zgomotului de mpu!cturi ec ivalent cu zgomotul termic al unui rezistor de J. ON gomotul de volta' al amplificatorului poate fi modelat introducnd dou surse de eroare de volta, ((er(') !i (er(/)) n serie cu volta,ele de intrare ( (' !i (/). 7stfel, volta,ul de ie!ire+
Vout = G{[V+ +Ver ( +) ] [V +Ver ( ) ]}

va conine fluctuaii proporionale cu (er(') !i (er(/), care se vor reflecta n ifeedbac$. *ac feedbac$ul ar fi pur rezistiv, zgomotul if ar fi redus. )ns datorit prezenei unor capaciti n paralel pe intrare !i pe !f, impedana scade la frecvene nalte, amplificnd zgomotul de volta, la ie!ire. *ensitatea spectral de putere a zgomotului de volta, al amplificatorului este+
S (2BW ) = ( 2CinputVer BW ) 2

Fig. 4.4 8ontribuia diferitelor surse de zgomot la zgomotul total. )n cazul bistraturilor, datorit capacitii mai mari, zgomotul de volta, cre!te la frecvene nalte, ceea ce limiteaz lrgimea de band, deci metoda poate fi aplicat doar la studiul canalelor cu cinetic mai lent. )n dreapta, etapele procesrii semnalului de curent n metoda patc clamp+ datorit benzii de trecere limitate a convertorului "/4, este necesar un high frequency boost stage care s corecteze atenuarea frecvenelor nalte, urmat de un lo*-pass filter.

ceea ce limiteaz lrgimea de band a nregistrrilor, n special la valori mari ale "input. 8apacitatea de intrare poate fi redus tot prin reducerea suprafeei patc ului. )n plus, acoperirea pipetei n regiunea vrfului cu un elastomer ()ylgard) reduce capacitatea prin cre!terea grosimii dielectricului !i prin suprafaa exterioar idrofob. 4aloarea mare a rezistenei de feedbac$ limiteaz banda de ie!ire a primului eta,, de aceea este nevoie de un circuit activ care s compenseze atenuarea la frecvene nalte (boost stage), pentru a nu pierde evenimentele rapide. )n plus, sunt necesare dou circuite suplimentare de compensare, unul pentru anularea tranzienilor capacitivi !i altul pentru compensarea cderii de tensiune pe rezistena serie. 5emnalul refcut de boost stage trebuie filtrat nainte de conversie !i stocare, pentru a reduce zgomotul de frecven nalt, care altfel ar masca desc iderile reale ale canalelor. 3a,oritatea amplificatoarelor comerciale au ncorporate filtre active a cror frecven de tiere ( fcut C frecvena la care puterea este redus la

J@D, ec ivalent cu /Q d:) este a,ustabil. 5e folosesc de obicei filtre :essel, care au un timp de cre!tere (trise) mai scurt !i nu dau overshoot. *atorit caracteristicii de rspuns a filtrelor, evenimentele scurte sunt pierdute sau distorsionate. tdead define!te durata unui eveniment pentru care semnalul filtrat atinge J@D din amplitudinea real, deci este omis de protocoalele de detecie uzuale (P.W threshold crossing). ;l poate fi corelat cu timpul de cre!tere trise (definit ca reciproca pantei rspunsului la un semnal treapt la ,umtatea amplitudinii). Pentru un filtru Oaussian (modelul teoretic de filtru cel mai folosit datorit proprietilor matematice speciale ale funciilor sale de rspuns)+
t dead = 0.538t rise = 0.179 / f cut

< alt constant de timp important legat de intervalul de e!antionare tsamp este durata unui semnal de intrare pentru care valoarea de ie!ire dep!e!te pragul de P.W pentru un interval de timp egal cu tsamp. 7ceasta poart denumirea de tall, deoarece evenimentele avnd o durat mai mare sau egal cu ea sunt ntotdeauna detectate prin algoritmul descris. *ac se alege tsamp C tdead,

Fig. 4.5 *istorsionarea duratei evenimentelor elementare n funcie de rspunsul treapt al filtrului !i frecvena de e!antionare. 7, evenimentele cu durata real X tdead nu ating pragul de detecie de P. W. :/*, evenimentele mai lungi dect tdead pot fi detectate, dar durata lor va fi msurat distorsionat dac sunt mai scurte dect timpul de cre!tere al filtrului, trise. ;/ 6, evenimentele Y trise sunt msurate corect.

evenimentele cu durata ntre J/D tdead vor fi msurate distorsionat dup e!antionare (durata msurat mai mic dect cea real), n timp ce evenimentele cu durata mai mare de D tdead vor fi msurate corect. 7ceste considerente sunt importante n alegerea adecvat a frecvenei de e!antionare !i a caracteristicii filtrului n funcie de cinetica evenimentelor pe care dorim s le nregistrm, precum !i pentru eventuala corecie pentru evenimente reale pierdute. < alt corecie ce poate fi aplicat atunci cnd raportul semnal@zgomot este semnificativ este nlturarea evenimentelor false. 5e poate defini o rat a evenimentelor false (C Z false threshold crossings + ,-") n funcie de frecvena de tiere a filtrului !i valoarea medie ptratic n banda de filtrare a zgomotului de curent+
2 FTC = 2kf cut exp(ithresh / 2rms(2BW ) )

unde parametrul . variaz n funcie de tipul de zgomot, de la ..?AK pentru zgomotul alb la J.DP pentru zgomotul de tip fD. < estimare simpl a frecvenei evenimentelor false se poate obine alegnd un prag de P.W de partea opus a liniei de baz fa de evenimentele reale. ;ste dificil s trecem n revist n spaiul restrns al acestei prezentri larga varietate de aplicaii ale metodei patc clamp. &e vom limita la a prezenta pe scurt principalele configuraii de nregistrare, a!a cum au fost descrise de ;rMin &e er. 8onfiguraia de pornire se nume!te cell-attached. *e aici se poate fie retrage pipeta, exciznd un patc inside-out (de!i adeseori se formeaz vezicule ce pot fi sparte prin scoaterea pipetei n aer !i reintroducerea ei n baie), fie se poate perfora peticul de membran (prin suciune, electroporare sau aplicarea unui ionofor, de exemplu n%statin sau amfotericin), intrnd astfel n configuraia *hole cell. 7ceasta este ec ivalent cu o abordare folosind microelectrozi intracelulari, ns prezint un numr de avanta,e, ntre care+ rezistena de s unt este foarte mare, egal cu rezistena sealului, rezistena serie este redus deoarece se folosesc pipete largi (~ Q 3N), se pot controla concentraiile ionice intracelulare !i se pot aplica n pipet diver!i ageni farmacologici cu aciune asupra cilor de semnalizare intracelular sau mar$eri. Prin retragerea pipetei

Fig. 4.6 4ariante de experimente utiliznd te nica patc /clamp (dup ;. &e er).

din *hole cell se formeaz un nou patc , cu faa extern a membranei expus la exterior, numit outside-out, configuraie ideal pentru studii farmacologice ale compu!ilor ce acioneaz din exterior. 3erit semnalate !i dezvoltrile te nologice recente [ metoda patch on a chip [ n care pipeta este nlocuit de o serie de perforaii cu geometrie controlat pe suprafaa unei plcue de cuar. Pe faa superioar a plcuei se depune o suspensie de celule, care vor sedimenta acoperind orificiile. Ilterior se aplic o suciune de pe faa interioar !i se scaneaz reeaua de electrozi corespunztori fiecrui orificiu, identificnd sealurile adecvate penru nregistrri. 7ceast procedur simplific extrem de mult etapele de preparare, oferind un randament

foarte nalt (high throughput) necesar n studiile de screening ntreprinse de companiile farmaceutice n dezvoltarea de noi compu!i bioactivi.

4.2 Modele cinetice de gating: Markov i fractale < problem matematic incitant desc is de realizarea nregistrrii fluctuaiilor unitare de conductan prin canale ionice este determinarea unui model cinetic adecvat care s descrie corect comportamentul sistemului real ntr/o varietate ct mai larg de condiii experimentale. 6rumuseea !i, n acela!i timp, dificultatea subiectului constau n faptul c nu exist soluii unice, de aceea trebuie definite criterii precise de comparare a diferitelor modele !i alegere a modelului optim. < prim etap n analiza unei nregistrri single/c annel (n afar de corectarea liniei de baz, stabilirea numrului de canale !i de stri de conductan !i evaluarea stabilitii) este detectarea evenimentelor reale, determinarea duratei lor [ stocat ntr/un fi!ier numit list de evenimente [ urmat de generarea unei istograme a densitii de probabilitate de tranziie n funcie de timpul de via petrecut n starea respectiv. *e fapt istogramele nu reprezint direct funcia de densitate de probabilitate de tranziie ( pdf), ci o aproximare a ei, !i anume numrul de evenimente care au duratele n limitele unui scurt interval de valori de timp numit bin. &u ntmpltor, pentru bini de durate egale istograma are o alur mono/ sau multiexponenial, corespunztoare unei singure stri sau unor stri multiple cu timpi de via diferii corespunztoare nivelului de conductan reprezentat. 5e poate demonstra c duratele medii de via ale strilor respective sunt proporionale cu constantele de timp ale exponenialelor din istogram. 6recvent, distribuiile pdf ale timpilor de via corespunztori nivelurilor de conductan sunt monoexponeniale, iar a celor corespunztori nivelului de nonconductan multiexponeniale, ceea ce corespunde unei singure stri desc ise !i mai multor stri nc ise. Pentru o identificare mai u!oar a diferitelor constante de timp dintr/o distribuie multiexponenial se folosesc bini de durate inegale, reprezentnd o scal de timp logaritmic. )n plus, scala vertical a istogramelor pdf poate fi transformat printr/o funcie rdcin

Fig. 4.7 *iferite tipuri de reprezentare a istogramelor densitii de probabilitate a tranziiilor. 7, reprezentarea clasic, cu scale lineare pentru timp !i numrul de evenimente pe bin+ componentele exponenaile cu pondere mai mic sunt greu de observat. :, reprezentare logaritmic/linear, n care cele dou componente exponeniale se disting clar, dar erorile (reprezentate n graficul de sus) sunt neuniform distribuite. 8, reprezentare logaritmic/radical, ce duce la uniformizarea erorilor pe toat lungimea scalei de timp, este varianta utilizat n mod curent pentru istogramele pdf.

ptrat, ceea ce asigur o distribuie uniform a erorilor pe ntreaga scal de timp, deci o distorsionare redus a reprezentrii. 8el mai folosit model statistic pentru descrierea cineticii de gating a canalelor ionice este lanul de evenimente discrete aleatoare descris de matematicianul rus 7ndre% 3ar$ov, bazat pe urmtoarele reguli+ exist un numr redus de stri distincte ale sistemului ntr/o anumit stare, probabilitile de tranziie sunt independente de strile prin care a trecut sistemul anterior (sistemul nu are o =memorie> a strilor anterioare) probabilitatea de tranziie de la o stare la alta este independent de timpul de via petrecut n starea respectiv. 8u a,utorul acestui set de restricii se poate demonstra c timpul de via al unei stri are o distribuie exponenial. 8onsidernd probabilitatea ca sistemul s se afle ntr/o anumit stare la momentul t, !(t), !i rata de tranziie (independent de timp), putem calcula probabilitatea ca sistemul s rmn n aceea!i stare dup un interval de timp t+
R (t + t ) = R(t )[1 t o(t )]

unde o(t) este probabilitatea unor tranziii multiple cu revenire n starea iniial. Prin mprire la t cnd t . obinem+
dR (t ) / dt = R (t )[o( dt ) / dt 0] R (t ) = exp( t )

5pre deosebire de modelul 3ar$ov, modelul fractal consider rate de tranziie dependente de timp+ unde / este un numr ntre J !i D denumit dimensiune fractal (evident, pentru / C J se revine la modelul 3ar$ov). 3odelul fractal porne!te de la presupunerea
k (t ) = !t 1

unui numr foarte mare de conformaii ale proteinei/canal, sistemul circulnd n permanen de la una la alta. 7stfel, pe msur ce trece timpul dup o modificare conformaional, sistemul se ndeprteaz din ce n ce mai mult de conformaia iniial, favorabil tranziiei, deci probabilitatea de revenire n aceast conformaie urmat de tranziie scade. Pe lng problema unor rate de tranziie infinite la t C ., s/a constatat c n multe cazuri modelele de tip 3ar$ov fiteaz mai bine distribiile pdf dect cele fractale. In test suplimentar al independenei strilor este analiza corelaiilor, n care se poate reprezenta densitatea de probabilitate a duratei unei stri n funcie de durata strii@strilor precedente. Prin aplicarea metodei s/a demonstrat c strile lungi de non/conductan sunt precedate de desc ideri scurte. < modalitate diferit de abordare a inferrii unui model cinetic superpozabil unei nregistrri sau unui ntreg set de nregistrri single/c annel este calcularea matricilor 0. Pornind de la un model cu n stri, se poate construi o matrice ai crei coeficieni .i, definesc ratele de tranziie ntre stri. 8u a,utorul ei se poate calcula probabilitatea (li.elihood) realizrii ntregii succesiuni de evenimente observate experimental sau generate de un model computerizat+

$(t1...tn ) = 0 ...Gi# (t" )...1


" =1

n care termenii Gi, sunt matrici ale cror elemente i' reprezint densitatea de
Gi# (ti ) = R (ti )%i# exp(%i#)

probabilitate a meninerii strii i pentru un interval de timp ti (!(ti)),urmat de tranziia n starea '+

reprezint intervalul standard de tranziie, definit de :all E 5ansom (JK??).


3aximizarea probabilitii se realizeaz prin metodele variaionale uzuale (de exemplu algoritmul simplex). < implementare eficient a metodei a fost realizat

de un grup din *epartamentul de 6iziologie !i :iofizic al Iniversitii de 5tat din &eM \or$ la :uffalo, condus de 6. 5ac s !i 7. 7uerbac , sub forma pac etului softMare 0u1. 7cesta introduce segmentarea nregistrrilor !i un algoritm recursiv de reestimare a parametrilor. Fot pe matrici 0 se bazeaz !i metoda modelelor 3ar$ov ascunse ( hidden 2ar.ov models [ #33). 7ceasta consider o matrice 3 a probabilitilor de tranziie la intervale de timp discrete, egale cu intervalul de e!antionare, ai,Cexp(.i,t) , !i calculeaz probabilitatea modelului pentru toate secvenele de evenimente posibile )i (secvena real este incert datorit suprapunerii unei surse de zgomot alb, Oaussian)+
$ = & ( data, Si !) = & ( data Si ) & ( Si !)
a"" S a"" S

4.3 Activarea dependent de voltaj i dependent de ligand ;xistena a dou forme fundamentale de manifestare a materiei, substana !i cmpul electromagnetic, a generat de/a lugul secolelor !i n biologie discuii aprinse asupra naturii propagrii informaiei n organismele vii. 7tt n domeniul propagrii influxului nervos ct !i n transmiterea sinaptic au aprut grupuri de susinere fie a ipotezei electrice fie a celei c imice. 6aimoasele studii ale lui #odg$in, #uxle% !i (atz din anii A.1 au clarificat prima dintre probleme, artnd c potenialul de aciune al nervului reprezint o succesiune de reacii c imice (modificri de permeabilitate prin desc iderea unor =pori>) ale cror rate de reacie sunt controlate de potenialul transmembranar dup o distribuie :oltzmann cu dou niveluri de energie. *e!i la vremea respectiv nu au putut furniza un mecanism molecular exact al activrii conductanelor de &a ' !i (', #odg$in !i #uxle% au calculat a!a/numita sarcin echivalent de gating, definit drept sarcina care s/ar deplasa pe ntreaga ntindere a cmpului electric transmembranar (de pe o fa a membranei pe cealalt) pentru a desc ide o poart. *in faptul c fraciunea de conductan activat n funcie de amplitudinea depolarizrii atinge o pant maxim de Q.K m4@cre!tere de e ori a g&a !i A.? m4@cre!tere de e ori a g(, folosind distribuia+

) 1 = ) + C 1 + exp[( ( z * e' ) / k BT ]

Fig. 4.8 5tudiu comparativ de aliniere a secvenelor segmentului 5A, cu evidenierea reziduurile pozitive H !i ( conservate, ce constituie senzorul de volta,. )n dreapta, experimentele de mutagenez punctiform cu neutralizarea sarcinii scad sarcina ec ivalent de gating ( g), iar cele cu conservarea sarcinii menin sau cresc g.

deducem c

C DA m4@Q.K m4 C -.JP sarcini elementare pentru g&a' !i P sarcini


g

elementare pentru g(. *eterminri ulterioare au plasat

pentru &a' la

aproximativ JD sarcini elementare. < alt predicie extrem de important a modelului #odg$in/#uxle% este necesitatea desc iderii independente a A pori pentru activarea g(, ce prefigureaz ar itectura omotetrameric a canalelor de (' dependente de volta,. ;xistena senzorilor de volta, a fost pus n eviden direct prin nregistrarea curenilor de gating, descris anterior. *up secvenierea urmat de clonarea canalelor de &a ' dependente de volta,, !i realizarea faptului c fiecare din cele patru subuniti are !ase domenii transmembranare (5J/5-), au fost ntreprinse studii de mutagenez pentru a dovedi c reziduurile pozitive nalt conservate din 5A (arginin !i lizin, repetate la fiecare a treia poziie) reprezint senzorul de volta,. ]innd seama de multiplicitatea strilor nc ise, 7lmers (JK2?) a postulat c panta maxim a activrii, numit de el sensibilitate logaritmic la potenial, nu poate fi msurat corect dect la poteniale foarte negative, pentru c odat cu depolarizarea apare o acumulare a sarcinii n stri nc ise intermediare. 6olosirea acestor poteniale implic msurarea unor probabiliti ale strii desc ise foarte mici (J. /Q[J./A), sau folosirea unor modele de gating multistare care s poat fi extinse dincolo de limita observaiilor experimentale. < alt dificultate, evideniat tot de 7lmers, este distorsionarea msurtorilor prin inactivare rapid [ aceasta poate fi ns nlturat. )n fine,

exist o metod direct de determinare a sarcinii de gating, independent de model+ evaluarea sacinii totale obinut prin integrarea curentului de gating de tip <& !i mprirea la numrul de canale, estimat prin diverse metode. Primele studii de mutagenez ale reziduurilor pozitive din 5A, ntreprinse de ec ipa lui Talter 5tL mer, au stabilit c neutralizarea primelor patru poziii externe reduce

corespunztor

. Fransformarea unei arginine n

istidin (HJAA?#) face ca

Fig. 4.9 7ctivarea senzorilor de potenial ai canalelor voltage/gated const ntr/o mi!care de rotaie a domeniului 5A, cu translocaia reziduurilor ncrcate pozitiv din crevasa intern, in contact cu mediul intracelular, n crevasa extern, n contact cu mediul extracelular (din #ille D..J).

gatingul s devin dependent de p#, datorit tranziiei ntre forma protonat, ncrcat pozitiv, la p# -.D, !i forma neutr la p# 2.?. Fransformarea aceluia!i reziduu n cistein face ca el s fie accesibil pentru reactivi 3F5 aplicai fie pe faa intracelular, la iperpolarizare, fie pe faa extracelular, la depolarizare. *eci reziduul respectiv strbate complet membrana. 5tudii ulterioare ale lui 6. :ezanilla prin metode optice (6H;F [ fluorescence resonance energy transfer C transferul unui foton de la un fluorofor la altul, a crui eficien depinde de distana ntre cele dou molecule) au stabilit c domeniul 5A sufer de fapt o rotaie la activare, transfernd reziduurile pozitive de la interstiiul format de 5J !i 5P (crevasa intern) la cel format de 5D !i 5Q (crevasa extern). < alt dovad a acestui mecanism este apariia unui carrier de protoni prin mutarea reziduurilor de pe 5A n istidin !i blocarea curentului ionic [ protonii circul n sensul gradientului de concentraie. 8oeficientul termic al acestui curent de protoni ( 0J.) este mai aproape de cel al proceselor de gating dect de cel al difuziei libere. 5pre deosebire de gatingul prin volta,, gatingul prin ligand folose!te un mecanism diferit pentru a declan!a modificrile conformaionale premergtoare desc iderii cii de conductan+ interaciunea cu un compus c imic. ;xist o larg categorie de canale ionice ligand-gated, care ndeplinesc roluri eseniale n comunicarea inter/ !i intracelular. ;le realizeaz transmiterea !i modularea sinaptic, recepia unor semnale c imice, sau intervin n ci ale mesagerilor secunzi. < categorie aparte o reprezint gatingul prin 8a D' intracelular !i prin p#, care vor fi tratate separat. 9a originea studiilor biofizice asupra transmiterii sinaptice se afl lucrrille lui 6att E (atz (JKPJ), care au studiat proprietile potenialelor de plac terminal miniaturale (3;PPs) de la nivelul plcii motorii musculare, dovedind c sunt produse prin eliberarea spontan !i individual n fanta sinaptic a veziculelor de mediator (acetilcolina [ 78 ), !i c procesul respectiv necesit prezena 8a D'. *in faptul c exist o dependen de volta, a constantei de timp de relaxare a curenilor de plac motorie (nregistrai n voltage clamp) care nu poate fi atribuit direct aciunii 78 , 3agleb% E 5tevens (JK2J) au emis ipoteza c acest fenomen reflect mai degrab cinetica de desc idere !i nc idere a receptorilor colinergici

! ... .. !R* R !R c"osed c"osed open (')

nicotinici (&78 H), sensibilizai prin legarea 78 . 6olosind modelul de activare a complexului agonist/receptor (7H) (del 8astillo E (atz JKP2)+ ei au presupus c rata de nc idere a receptorului, , este cea care confer dependena de volta,, ceea ce ar explica coeficientul de variaie cu temperatura al constantei de timp de relaxare, 0J. C D.?, prea mare pentru un proces de difuzie. ;xperimentele prin metoda analizei fluctuaiilor ((atz E 3iledi JK2.[JK2J) au confirmat aceast ipotez, ns o serie de studii ((atz E F esleff JKP2, 7dams JK2P) indicau un fenomen de cooperativitate pozitiv la legarea 78 de receptor, exprimat printr/un coeficient #ill ntre J.P[D.D. *up apariia !i perfecionarea metodei patc clamp, ale crei nceputuri sunt legate c iar de acest receptor, :ert 5a$mann !i *avid 8olSu oun (JK?J, JK?P) au reu!it s pun n eviden nc ideri foarte scurte (gaps), cu durate de cteva zeci de s, care nu pot fi
k1 ! k2 ! R !R !2 R c"osed c"osed c"osed k +1 k2

1 1
*

2 2
* 2

! k2 ! R * !R 2 open open k*

explicate prin desfacerea ligandului, ci prin nc iderea canalului. 7ceast serie de desc ideri succesive punctate de scurte nc ideri a primit denumirea de burst, durata sa per ansamblu fiind egal cu timpul de via al complexului receptor/ ligand. ]innd seama de noile date, modelul cinetic al &78 H devine+ )n plus, prezena prelungit a 78 duce la apariia fenomenului de desenzitizare, n care canalele nu mai rspund prin activare la agonist. *esenzitizarea poate explica mecanismul de aciune al curarizantelor depolarizante (leptocurare) folosite n interveniile c irurgicale pentru miorelaxare. 8ele dou situsuri de legare a 78 au fost puse n eviden cu a,utorul bungarotoxinei, o neurotoxin peptidic extras din veninul de !arpe. ;a a fost folosit pentru purificarea &78 H din organul electric al torpilei electrice. 8analul are o ar itectur pentameric, D (Teill et al. JK2A, Hafter% et al. JK?.), pe subunitile fiind localizate situsurile de legare a 78 . 6iecare subunitate

conine A / elixuri transmembranare. 5tudii ulterioare au artat c ar itectura pentameric este comun mai multor canale ligand/gated, incluznd receptorii O7:77 !i de glicin, cu rol in ibitor la nivelul sistemului nervos central. 7ceste canale anionice, activate de barbiturice, benzodiazepine !i alcool, iperpolarizeaz membrana neuronal, ceea ce explic efectele sedative ale compu!ilor menionai. Principalul neurotransmitor excitator central, glutamatul, acioneaz pe diverse tipuri de receptori, dintre care o parte sunt canale ionice. ;le sunt numite receptori &3*7 (&/met %l/*/aspartate, un analog al glutamatului), prezint o selectivitate pentru 8a D', iar prin blocarea de ctre 3g D' intracelular dobndesc proprietatea de in*ard rectification, participnd la fenomenul de long/term potentiation, implicat n memorie (vezi capitolul D). )n fine, receptorii purinergici PDG, activai de 7FP extracelular, au fost implicai n nocicepie. 9a nevertebrate (melcul 4elix aspersa) a fost descris un canal din familia canalelor epiteliale de &a ' (*eg@;&a8) activat de neurotransmitorul peptidic 63H6amid, numit 6a&a8 (9ingueglia et al. JKKP).

4.4 nactivarea de tip ! i de tip " "nactivarea a fost definit de #odg$in !i #uxle% ca un proces cu cinetic monoexponenial care reduce conductana de &a ', dup activarea ei printr/o treapt de potenial. ;i au modelat acest proces prin nc iderea unei =pori de inactivare> a crei probabilitate de a fi desc is este hU ratele de desc idere !i de nc idere, !i , sunt dependente de volta,, desc iderea fiind favorizat la poteniale negative ( iperpolarizare) iar nc iderea la poteniale pozitive (depolarizare). #odg$in !i #uxle% au tratat activarea !i inactivarea ca dou procese independente, deci probabilitatea strii desc ise a canalelor de &a ' este egal n modelul lor cu produsul probabilitilor strii desc ise a porilor de activare !i inactivare, mQh. "nadvertena acestui model a fost dovedit n anii 1-. de 8 andler !i 3eves, prin faptul c n axonul gigant de calmar inactivarea curenilor de &a' este incomplet, c iar la poteniale pozitive mari. ;i au sugerat existena a dou stri desc ise ale porii de inactivare, una dintre ele fiind

Fig. 4.10 5tudiile lui 7ldric , 8ore% !i 5tevens pe canalele de &a ' dintr/o linie de neuroblastom au relevat faptul c, de!i constanta de timp macroscopic de inactivare este dependent de volta,, timpul mediu de via al strii desc ise este independent. 7stfel, aceea!i cinetic macroscopic poate fi descris prin modele microscopice diferite. Prin nregistrri single/c annel ei au dovedit c desc iderea este lent !i inactivarea rapid !i independent de volta, (modelul 7:785).

favorizat de depolarizare. )nregistrarea curenilor de gating n anii 12. a adus noi surprize+ 7rmstrong !i :ezanilla au demonstrat imobilizarea sarcinii de gating pentru curenii de tip <66. 8u ct pulsul de depolarizare era mai prelungit cu att scdea sarcina aparent de gating, obinut prin integrarea curentului, astfel

nct raportul ntre sarcina de gating <66 !i cea <& ( 0off@0on) urma o cinetic similar celei a inactivrii curentului macroscopic de &a ' n acela!i preparat. 7cest rezultat sugereaz un cupla, ntre cele dou procese+ inactivarea imobilizeaz senzorii de volta, n poziia activat iar revenirea lor la poziia iniial are loc numai dup ie!irea din inactivare, deci foarte lent. Pe baza modelului cuplat, 7rmstrong !i :ezanilla au dedus c inactivarea nu trebuie neaprat s prezinte o dependen de volta, intrinsec, !i, mai mult, c rata de inactivare a curentului macroscopic nu reflect n mod real ratele proceselor microscopice de activare !i inactivare. < confirmare strlucit a acestei ipoteze a fost adus n JK?Q de 7ldric , 8ore% !i 5tevens, prin nregistrri de tip single/c annel ale canalelor de &a' volta,/dependente dintr/o linie de neuroblastom de mamifere, utiliznd te nica patc clamp. 7stfel, de!i constanta de timp aparent de inactivare ( ) a curentului macroscopic elicitat de un puls de depolarizare (obinut prin sumarea coerent a unui mare numr de nregistrri single/c annel) era de Q ms, durata medie de desc idere a canalelor pe nregistrrile individuale era de doar ..KP ms. 9atena primei desc ideri prezenta variaii largi, iar ma,oritatea nregistrrilor (?PW) conineau o singur desc idere. 8oncluzia logic este c, n acest caz, activarea este un proces lent !i inactivarea unul rapid (constanta de timp microscopic ..KP ms), canalele fiind =absorbite> n starea inactivat la scurt timp dup desc idere. 3ai mult, aceast constant microscopic de inactivare este independent de volta,. )n plus, dependena de volta, a conductanei =de vrf> de &a ' este distorsionat de aceast inactivare rapid. 8elebrele studii ale lui 8la% 3. 7rmstrong (02J/12P) cu derivai cuaternari de amoniu (analogi ai F;7 precum tetrapent%lamoniul [ FPe7, sau non%ltriet %lamoniul [ 8K) au artat c aplicarea intracelular a acestor compu!i modific cinetica clasic a canalelor de (' volta,/dependente (dela%ed rectifiers) introducnd o inactivare dependent de concentraie ce le face asemntoare canalelor de &a'. )n plus, curba "4 se modific prin apariia unei rectificri de tip inMard. 7rmstrong a sintetizat aceste date ntr/un model cinetic numit open channel bloc.+ aminele cuaternare exercit efectul blocant numai dup

desc iderea canalelor, deci trebuie s treac de o poart de activare situat pe endodomeniul canalului, ptrunznd ntr/un vestibul intern de dimensiuni suficient de mari pentru a le acomoda, !i producnd astfel procesul asemntor inactivrii. ;le pot fi nlturate din acest situs intern numai de ctre ionii care ptrund dinspre exterior (curenii de inMard), ceea ce explic rectificarea. 5tudii similare au artat c anestezicele locale ptrund n vestibulul intern, mimnd inactivarea !i imobiliznd sarcinile de gating (\e E 7rmstrong JK2?, 8a alan E 7lmers JK2K).
Fig. 4.11 3odelul de inactivare de tip & ( ball and chain). *up activarea canalelor, captul &/terminal (bila) obtureaz orificiul intern, ducnd la inactivare. )ndeprtarea acestei particule prin tratament enzimatic duce la dispariia inactivrii (din 7rmstrong E :ezanilla JK22).

Irmnd aceast linie de raionament, 7rmstrong E :ezanilla au imaginat inactivarea ca ptrunderea unui g em proteic n orificiul intern al porului, atunci cnd acesta este desc is, ceea ce explic cupla,ul cu activarea. 5/a artat c tratamentul cu enzime proteolitice (papain, pronaz, etc.) aplicate pe faa intern a membranei nltur inactivarea, ceea ce duce !i la dispariia imobilizrii sarcinii de gating, iar aplicarea peptidelor solubile rezultate prin acest tratament reinstaureaz componenta de inactivare. In model foarte frumos de studiu al acestui tip de inactivare a aprut dup clonarea canalelor de (' de tip )ha.er din /rosophila (#os i, ^agotta, 7ldric JKK.), canale ce produc a!a/numiii cureni tranzieni de ( ' de tip 7 (pentru c au forma literei 7). 5tudii de mutagenez deleional au artat c nlturarea primelor D. de reziduuri din captul &/terminal al unei subuniti (canalele sunt omotetrameri) nltur inactivarea, iar adugarea lor sub forma unei peptide sintetice solubile o restaureaz. )ndeprtarea unei pri din urmtoarele -. de reziduuri accelereaz inactivarea, n timp ce alungirea secvenei respective o

ncetine!te. 7ceste rezultate contureaz modelul numit inactivare de tip N sau modelul bil-lan, n care, evident, primele D. reziduuri formeaz =bila> iar urmtoarele -. =lanul>. )n plus, studiile cu peptide sintetice ball-li.e arat c rata inactivrii este proporional cu concentraia de peptid, n timp ce rata revenirii din inactivare este independent de ea. Pentru canalele de &a ' voltage/gated s/a descoperit prin studii de mutagenez un mecansim asemntor de inactivare, ce implic lin$erul dintre subunitile """ !i "4. In alt tip de inactivare a canalelor de &a ' este cel numit inactivare lent, care este favorizat de depolarizri prelungite (secunde sau minute) !i are un timp de revenire de acela!i ordin de mrime, dup repolarizare. 7cesta a fost denumit inactivare de tip " (#os i et al. JKKJ) deoarece variantele naturale de splicing ale genei )ha.er prezint modificri ale acestui proces atunci cnd sunt afectate reziduurile din treimea 8/terminal a secvenei. "nactivarea de tip 8 este ncetinit de F;7 aplicat extracelular !i nu intracelular (Orissmer E 8a alan JK?K), !i de cationii extracelulari permeani, n special ( ' !i Hb'), ceea ce sugereaz o modificare conformaional a filtrului de selectivitate al porului (9_pez/:arneo et al. JKKQ). )n absena ( ' extracelular, canalele inactivate devin permeabile pentru &a'. 7stfel, inactivarea de tip 8 reflect importana cationilor extracelulari n stabilizarea conformaiei funcionale a canalelor ionice.

4.# Alte tip$ri de gating c$ implica%ii &n tran'd$c%ia 'en(orial: mecano'en(itivitatea i termo'en(itivitatea )n afara tipurilor clasice de gating discutate anterior, a cror importan n funcionarea sistemului neuromuscular este evident, canalele ionice sunt implicate, ntr/un fel sau altul, n diferitele etape ale transduciei sen oriale, procesul biofizic prin care energia diferiilor stimuli din mediul intern sau din lumea ncon,urtoare declan!eaz serii de poteniale de aciune repetitive pe cile nervoase aferente. 6uncionarea unui sistem senzorial poate fi sistematizat !i generalizat ntr/o diagram simpl, reprezentnd o nlnuire de trei procese+ detecie, amplificare !i semnalizare. *etecia reprezint o modificare conformaional a unei molecule receptoare sub aciunea stimulului (de exemplu

Fig. 4.12 5c ema de principiu a unui receptor, cu ilustrarea celor trei procese nlnuite+ detecia, amplificarea !i semnalizarea, !i a cilor de feed/bac$ ce le controleaz (5teven :loc$ JKKJ).

izomerizarea trans/cis a retinalului sub aciunea unui foton din spectrul vizibil). 7mplificarea folose!te cascadele enzimatice ale cilor de semnalizare intracelular (de exemplu, sistemul proteinelor O) al cror rezultat este variaia potenialului transmembranar al celulei receptoare ( potenialul de receptor), n sensul depolarizrii sau al iperpolarizrii. 7 treia etap, semnalizarea, reprezint corelarea variaiilor potenialului de receptor cu frecvena de declan!are a potenialelor de aciune ce vor fi propagate pe cile sensibilitii respective, cu alte cuvinte o modulare n frecven, care reduce efectul factorilor perturbatori ce acioneaz de/a lugul cii de comunicaie (se !tie c semnalele modulate n frecven sunt mai rezistente la perturbaii dect cele modulate n amplitudine [ un exemplu banal este diferena de calitate ntre o transmisie radio modulat 73 !i una modulat 63). )ntr/o discuie teoretic a principiilor fizice ale transduciei sensoriale, biofizicianul 5teven :loc$ remarca faptul c, dintre cele patru tipuri fundamentale de

interaciuni (fore), numai dou sunt detectate n lumea vie+ interaciunea electromagnetic !i cea gravitaional, ale cror distane de aciune includ intervalul de dimensiuni ale fiinelor vii. &u s/a descoperit nc (!i este improbabil s se descopere n viitor) un receptor biologic pentru interaciunea nuclear (tare), care asigur legturile ntre nucleoni, avnd o raz de aciune de J. /JD m, sau pentru interaciunea slab (rspunztoare, de exemplu, de dezintegrarea ). 8omparnd nivelul elementar de energie al diferiilor stimuli cu valoarea .:-, a!a/numita >cuant de energie termic> (dublul energiei cinetice pe grad de libertate al unei molecule ~ cu o valoare de J@A. e4 sau ..P? $cal@mol la temperatura camerei ~ Q.. () distingem dou tipuri de traductori+ cei limitai cuantic, pentru care cuanta de energie este mai mare dect .:-, !i cei limitai clasic, pentru care este mai mic, uneori cu multe ordine de mrime. In exemplu din prima grup este, din nou, fotorecepia+ energia unui foton vizibil cu C P.. nm, care corespunde culorii verde/albstrui, este hc@ (unde h C -.-DJ./QA Rs este constanta lui Planc$) egal cu P2 $cal@mol, deci cu dou ordine de mrime deasupra =cuantei termice>. ;xperiene psi ofizice efectuate la nceputul secolului D. au artat c oc iul uman adaptat la ntuneric poate distinge fotoni individuali sub forma unor scurte strfulgerri. `i c emorecepia intr tot n categoria limitat cuantic+ considernd constanta de disociere 5* n intervalul J./
J

[J./JJ 3, !i utiliznd expresia 5* exp(/6@.:-), obinem un interval de energii

ntre D .:- !i DP .:-. < situaie complet diferit o reprezint auzul, pentru care energia =cuantei de sunet> (fonon) n spectrul de frecven J.[J..,... #z este de J.? [ J.JJ ori mai mic dect cuanta termic. 7ceasta face ca deplasrile membranei bazilare din urec ea intern, la pragul audibil, s fie cu cteva ordine de mrime mai mici dect amplitudinea medie a fluctuaiilor termice ale cililor celulelor auditive (..J[J B comparativ cu D nm). 7ceast diferen poate fi surmontat prin limitarea temporal a benzii de trecere a detectorului, !tiut fiind c zgomotul termic are o distribuie spectral uniform a densitii de putere, cu alte cuvinte este =alb>. Fotu!i, limitarea lrgimii de band nu funcioneaz dect pentru un circuit rezonant activ, pentru un sistem pasiv ntreaga putere de

zgomot termic fiind deplasat n vrful de rezonan, conform teoremei de fluctuaie/disipaie a lui 9andau E 9ifs itz (JK22). )nregistrri electrofiziologice la nivelul celulelor ciliate din co lee (8ore% E #udspet JK?Q) au evideniat cureni cationici activai de deplasarea lateral a cililor, cu o laten de activare mai mic de J. s !i un timp mediu de desc idere sub A. s. ;i au presupus c activarea acestor canale este produs direct de un stimul mecanic (o for de ntindere transmis prin filamente extracelulare ce leag cilii nvecinai), energia de activare fiind similar celei a senzorilor de volta, din canalele voltage/gated. 7daptarea la desc ideri prelungite este datorat influxului de 8aD' prin aceste canale, care sunt cuplate cu un motor intracelular reprezentat de molecule de miozin ce interacioneaz cu citosc eletul de filamente de actin asociat membranei, meninnd o tensiune mecanic constant asupra canalelor. 7mplificarea activ a oscilaiilor mecanice, stipulat teoretic, este realizat de celulele ciliate externe, dispuse n mai multe rnduri. *epolarizarea lor activeaz un alt motor molecular numit prestin, identificat (^ eng et al D...) printr/o metod genetic original, amplificarea diferenial. *ou biblioteci de c*&7, obinute prin HF/P8H din extractele mH&7 ale celulelor ciliate externe !i interne au fost amestecate n exces de c*&7 din celulele ciliate interne, deci secvenele comune au ibridizatU restul secvenelor libere, specifice celulelor ciliate externe, au fost amplificate n continuare !i exprimate ntr/un sistem eterolog. 5tudii anterioare asupra celulelor ciliate externe (7s more JK?2, 5antos/5acc i JKKJ) artaser c electromotilitatea !i curenii capacitivi neliniari sunt in ibai reversibil de salicilatul de &a (5 e ata et al JKKJ). 7ceast proprietate a fost regsit n sistemele celulare n care a fost exprimat prestina. *in punct de vedere molecular, ea prezint similariti cu transportorii de sulfat, ns !i dou clustere de reziduuri pozitive n regiunea 8/terminal (reziduurile PP2/P?. !i PK-/-JQ, lungimea total a secvenei fiind 2AA).

Fig. 4.13 *iferite canale ionice cu rol presupus sau cert n mecanosenzitivitate !i@sau termosenzitivitate. ;le aparin unor familii diferite+ FHP (transient receptor potential) !i 8&O (c%clic nucleotide gated), cu - domenii F3 pe subunitate, provin din canalele de ( ' voltage/gated, *eg@;&a8 (degenerine@canale epiteliale de &a) !i receptorii purinergici PDG, cu D domenii F3 pe subunitate.

5tudii la nivelul procariotelor au dus la identificarea unui canal ionic mecanosenzitiv (3sc9 [ 5u$ arev et al. JKKA, JKK2) a crui structur Q* a fost rezolvat prin difracie de raze G. 8analul este un omopentamer format din subuniti DF3, neselectiv !i cu o conductan enorm (Q... p5). < alt linie de studii a identificat la nematodul ". elegans mutaii ale unor gene din familia

*eg@;&a8 care altereaz sensibilitatea la atingere. )ntruct membri ai acestei familii sunt exprimai n neuronii senzitivi ai mamiferelor (genele 75"8J/75"8A), se presupune c ei ar fi implicai n mecanosenzitivitate. *ovezi suplimentare n acest sens sunt furnizate prin aplicarea stimulilor mecanici de deformare asupra neuronilor izolai din ganglionii spinali. 9a subpopulaia care rspunde prin cre!teri ale activitii 8aD' intracelular, &iD' !i verapamilul in ib acest rspuns (Ooto E Fa$a as i JKKK). < alt categorie de mecanosenzori candidai sunt membri ai familiei FHP (transient receptor potential [ fotoreceptorul din /rosophila), de exemplu nomp8 sau 5"8 (stretc /in ibitable c annel), a crui secven este nrudit cu receptorul vaniloid (4HJ). Fermosenzitivitatea este alt domeniu care a reprezentat o terra incognita pn recent, datorit dificultii de abordare electrofiziologic direct a receptorilor subcutanai, de dimensiuni minuscule. )n prezent au fost identificate !i clonate cteva canale ionice din familia FHP responsabile de detecia temperaturilor extreme+ cldura nociv !i frigul. 7stfel, n JKK-, P. 8esare !i P. 3c&aug ton identific n neuronii spinali nociceptivi un curent cationic cu un prag de activare ridicat (~ AD a8), senzitizat de bradi$inin prin activarea protein$inazei 8 (isoforma ). )n JKK2, o ec ip de la *epartamentele de 7nesteziologie !i 6armacologie ale Iniversitii din 8alifornia la 5an 6rancisco (3. 8aterina, *. Rulius, 3. Fominaga, etc.) reu!e!te s cloneze un canal ionic (4HJ) , activat de multipli stimuli nocivi+ cldur, p# sczut !i compu!i vaniloizi. *up numai civa ani este identificat, tot ntr/un grup de neuroni spinali, un curent activat de frig (prag de activare ~ JP a8) !i de */ment ol (Heid E 6lonta D..J). Hecent, canalul ionic candidat pentru acest efect a fost clonat tot de ec ipa lui *. Rulius, fiind numit 83HJ (cold and ment ol receptor J). ;ste interesant faptul c 4HJ !i 83HJ sunt nrudite, ambele aparinnd familiei FHP. Oraficul de idrofobicitate al celor dou secvene arat existena la 83HJ a dou regiuni idrofobe suplimentare, n afara celor !ase domenii transmembranare cunoscute. 7cest fapt poate a,uta la explicarea activrii sale prin frig. 5e presupune c activarea termic este o reacie controlat entropic. )ntruct G C 4 / -), reaciile cu variaie pozitiv de entropie vor fi favorizate la temperaturi crescute, iar cele cu

variaie negativ de entropie la temperaturi sczute. 4ariaia negativ de entropie


Fig. 4.14 7naliza comparativ a idrofobicitii secvenelor receptorului vaniloid 4HJ !i receptorului de rece !i ment ol 83HJ. )n afara regiunilor idrofobe corespunztoare celor - / elixuri transmembranare, 83HJ prezint dou zone idrofobe suplimentare, cu rol presupus n activarea la rece.

n 83HJ ar putea fi reprezentat de deta!area acestor dou domenii idrofobe la temperaturi sczute, ntruct entropia lor n soluie este mai mic dect ntr/un mediu idrofob (efectul imobilizrii moleculelor de ap din =cu!ca de idratare>). Referine 7ldric HT, 8ore% *P, 5tevens 86. JK?Q. 7 reinterpretation of mammalian sodium c annel gating based on single c annel recording. &ature Q.-(PKAD)+AQ-/AJ. 7lmers T. JK2?. Oating currents and c arge movements in excitable membranes. Hev P %siol :ioc em P armacol ?D+K-/JK.. 7rmstrong 83. JK2J. "nteraction of tetraet %lammonium ion derivatives Mit t e potassium c annels of giant axons. R Oen P %siol P?(A)+AJQ/Q2. 7rmstrong 83, :ezanilla 6. JK2Q. 8urrents related to movement of t e gating particles of t e sodium c annels. &ature DAD(PQK?)+APK/-J. 7rmstrong 83, :ezanilla 6. JK22. "nactivation of t e sodium c annel. "". Oating current experiments. R Oen P %siol 2.(P)+P-2/K..

7s more R6. JK?2. 7 fast motile response in guinea/pig outer air cells+ t e cellular basis of t e coc lear amplifier. R P %siol Q??+QDQ/A2. :all 6O, 5ansom 35. JK??. 5ingle/c annel autocorrelation functions+ t e effects of time interval omission. :iop %s R PQ(P)+?JK/QD. :ean H8, 5 ep erd T8, 8 an #, ;ic ner R. JK-K. *iscrete conductance fluctuations in lipid bila%er protein membranes. R Oen P %siol PQ(-)+2AJ/ P2. :ezanilla 6. D..D. 4oltage sensor movements. R Oen P %siol JD.(A)+A-P/2Q. :loc$ 53. JKKJ. :iop %sical principles of sensor% transduction. "n+ 8ore% *P, Hoper 5*, editors. 5ensor% Fransduction. &eM \or$+ Hoc$efeller Iniversit% Press. p J/J2. 8a alan 3*, 7lmers T. JK2K. "nteractions betMeen Suaternar% lidocaine, t e sodium c annel gates, and tetrodotoxin. :iop %s R D2(J)+QK/PP. 8aterina 3R, 5c umac er 37, Fominaga 3, Hosen F7, 9evine R*, Rulius *. JKK2. F e capsaicin receptor+ a eat/activated ion c annel in t e pain pat Ma%. &ature Q?K(--PQ)+?J-/DA. 8esare P, 3c&aug ton P. JKK-. 7 novel eat/activated current in nociceptive neurons and its sensitization b% brad%$inin. Proc &atl 7cad 5ci I 5 7 KQ(D-)+JPAQP/K. 8 a ine 3, Oeorge 79, Rr., ^ ou 3, Ri 5, 5un T, :arc i H9, #orn H. JKKA. 5odium c annel mutations in param%otonia congenita uncouple inactivation from activation. &euron JD(D)+D?J/KA. 8 andler T(, 3eves #. JK2.. Hate constants associated Mit c anges in sodium conductance in axons perfused Mit sodium fluoride. R P %siol DJJ(Q)+-2K/2.P. 8olSu oun *, #aM$es 7O. JKKP. F e Principles of t e 5toc astic "nterpretation of "on/8 annel 3ec anism. "n+ &e er :5a;, editor. 5ingle/8 annel recording. D ed. &eM \or$+ Plenum Press. p QK2/A?D. 8olSu oun *, 5a$mann :. JK?J. 6luctuations in t e microsecond time range of t e current t roug single acet%lc oline receptor ion c annels. &ature DKA(P?A.)+A-A/-. 8ore% *P, #udspet 7R. JK?Q. (inetics of t e receptor current in bullfrog saccular air cells. R &eurosci Q(P)+K-D/2-. *e6elice 9R. JK?J. "ntroduction to 3embrane &oise. &eM \or$+ Plenum. P.. p. del 8astillo R, (atz :. JKP2. "nteraction at endplate receptors betMeen different c oline derivatives. Proc H 5oc 9ond : JA-+Q-K/Q?J. 6att P, (atz :. JKPJ. 7n anal%sis of t e end/plate potential recorded Mit an intracellular electrode. R P %siol JJP+QD./Q2.. 6ertig &, :lic$ H#, :e rends R8. D..D. T ole cell patc clamp recording performed on a planar glass c ip. :iop %s R ?D(-)+Q.P-/-D. Ooto #, Fa$a as i 7. JKKK. 3ec anical stimuli induce intracellular calcium response in a subpopulation of cultured rat sensor% neurons. &euroscience KD(A)+JQDQ/K. Orissmer 5, 8a alan 3. JK?K. F;7 prevents inactivation M ile bloc$ing open (' c annels in uman F l%mp oc%tes. :iop %s R PP(J)+D.Q/-.

#amill <P, 3art% 7, &e er ;, 5a$mann :, 5igMort 6R. JK?J. "mproved patc / clamp tec niSues for ig /resolution current recording from cells and cell/ free membrane patc es. Pflugers 7rc QKJ(D)+?P/J... #elman 5", :axendale 93. JK??. <pen c annel probabilit% of apical &a c annels in epit elial frog s$in. 675;: R D+72P.. #lad$% 5:, #a%don *7. JK2.. *iscreteness of conductance c ange in bimolecular lipid membranes in t e presence of certain antibiotics. &ature PDQJ(DQJ)+APJ/Q. #odg$in 79, #uxle% 76. JKPD. 7 Suantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. R P %siol JJ2+P../PAA. #os i F, ^agotta T&, 7ldric HT. JKKJ. FMo t%pes of inactivation in 5 a$er (' c annels+ effects of alterations in t e carbox%/terminal region. &euron 2(A)+PA2/P-. (atz :, 3iledi H. JK2.. 3embrane noise produced b% acet%lc oline. &ature DD-(DAK)+K-D/Q. (e%nes H*, Ho,as ;. JK2A. (inetics and stead%/state properties of t e c arged s%stem controlling sodium conductance in t e sSuid giant axon. R P %siol DQK(D)+QKQ/AQA. 9indemann :, 4an *riessc e T. JK22. 5odium/specific membrane c annels of frog s$in are pores+ current fluctuations reveal ig turnover. 5cience JKP(AD2P)+DKD/A. 9ingueglia ;, 8 ampign% O, 9azduns$i 3, :arbr% P. JKKP. 8loning of t e amiloride/sensitive 63H6amide peptide/gated sodium c annel. &ature Q2?(-PP?)+2Q./Q. 9_pez/:arneo R, #os i F, #einemann 5#, 7ldric HT. JKKQ. ;ffects of external cations and mutations in t e pore region on 8/t%pe inactivation of 5 a$er potassium c annels. Heceptors 8 annels J(J)+-J/2J. 3c(em% **, &eu ausser T3, Rulius *. D..D. "dentification of a cold receptor reveals a general role for FHP c annels in t ermosensation. &ature AJ-(-?2-)+PD/?. 3Lller P, Hudin *<, Fien #F, Tescott T8. JK-D. Heconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable s%stem. &ature JKA+K2K/K?.. &e er ;, 5a$mann :. JK2-. 5ingle/c annel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. &ature D-.(PPPA)+2KK/?.D. &eumc$e :. JK?D. 6luctuation of &a and ( currents in excitable membranes. "nt Hev &eurobiol DQ+QP/-2. Heid O, 6lonta 3. D..Ja. 8old transduction b% in ibition of a bac$ground potassium conductance in rat primar% sensor% neurones. &eurosci 9ett DK2(Q)+J2J/A. Heid O, 6lonta 39. D..Jb. P %siolog%. 8old current in t ermoreceptive neurons. &ature AJQ(-?PP)+A?.. 5antos/5acc i R. JKKJ. Heversible in ibition of voltage/dependent outer air cell motilit% and capacitance. R &eurosci JJ(J.)+Q.K-/JJ..

5c neider 36, 8 andler T(. JK2Q. 4oltage dependent c arge movement of s$eletal muscle+ a possible step in excitation/contraction coupling. &ature DAD(PQKP)+DAA/-. 5 e ata T;, :roMnell T;, *ieler H. JKKJ. ;ffects of salic%late on s ape, electromotilit% and membrane c aracteristics of isolated outer air cells from guinea pig coc lea. 7cta <tolar%ngol JJJ(A)+2.2/J?. 5igMort 6R, (lemic (O. D..D. Patc clamp on a c ip. :iop %s R ?D(-)+D?QJ/D. 5tarace *3, 5tefani ;, :ezanilla 6. JKK2. 4oltage/dependent proton transport b% t e voltage sensor of t e 5 a$er (' c annel. &euron JK(-)+JQJK/D2. 5tevens 86. JK2D. "nferences about membrane properties from electrical noise measurements. :iop %s R JD(?)+J.D?/A2. 5tL mer T, 8onti 6, 5uzu$i #, Tang G*, &oda 3, \a agi &, (ubo #, &uma 5. JK?K. 5tructural parts involved in activation and inactivation of t e sodium c annel. &ature QQK(-DD-)+PK2/-.Q. 5u$ arev 5", :lount P, 3artinac :, :lattner 6H, (ung 8. JKKA. 7 large/ conductance mec anosensitive c annel in ;. coli encoded b% msc9 alone. &ature Q-?(-A-?)+D-P/?. 4en$ataramanan 9, 5igMort 6R. D..D. 7ppl%ing idden 3ar$ov models to t e anal%sis of single ion c annel activit%. :iop %s R ?D(A)+JKQ./AD. 4erveen 77, *er$sen #;. JK-K. 7mplitude distribution of axon membrane noise voltage. 7cta P %siol P armacol &eerl JP(Q)+QPQ/2K. Tonderlin T6, 6renc HR, 7rispe &R. JKK.. Hecording and 7nal%sis of 8urrents from 5ingle "on 8 annels. "n+ 7. 7. :oulton O::, 8. #. 4anderMolf, editor. &europ %siological Fec niSues+ :asic met ods and 8oncepts. 8lifton, &R+ F e #umana Press "nc. \ang &, #orn H. JKKP. ;vidence for voltage/dependent 5A movement in sodium c annels. &euron JP(J)+DJQ/?. ^agotta T&, #os i F, 7ldric HT. JKK.. Hestoration of inactivation in mutants of 5 a$er potassium c annels b% a peptide derived from 5 :. 5cience DP.(AK?.)+P-?/2J. ^ eng R, 5 en T, #e *^, 9ong (:, 3adison 9*, *allos P. D.... Prestin is t e motor protein of coc lear outer air cells. &ature A.P(-2?Q)+JAK/PP.