IMUNOLOGIE -CURS 5-

Populatiile limfocitare si markerii lor de suprafat:

Dintre toate celulele seriei limfocitare, limfocitele reprezint 25-30% (1000-2000 limfocite/mm3). Limfocitozele si limfopeniile se intalnesc in foarte multe boli.

Clasificarea limfocitelor Din punct de vedere morfologic: Limfocitele mici: reprezint clasa limfocitar major, 80-85% din totalul limfocitelor din sangele periferic, sunt celule cu diametru redus 6-9, nucleul ocup cea mai mare parte din volumul celulei, este situat central iar citoplasma este puina si este situat periferic. Exist dou varieta i: LT si LB. Limfocitele mari: reprezint 15-20% din totalul limfocitelor periferice, au un diametru foarte mare 10-15 , nucleul este limfocitoid, citoplasma este abundent, inconjoar nucleul i conine granulaii azurofile. LGL (large granular limfocites) aparin celulelor NK ce sunt implicate in imunitatea inascut i in RIC. Limfocitele mici (LT si LB): distincia intre LT si LB nu poate fi facut pe baza unor criterii morfologice niciodat. Ea se realizeaz cu ajutorul unui test funcional (testul rozetrii). Acesta realizeaz diferenierea foarte precis cu costuri sczute. Se pun in contact limfocitele separate anterior prin teste de gradient, cu eritrocite de oaie sau berbec. Singurele limfocite care realizeaz legturi cu anticorpii si realizeaz conglomerate celulare sunt limfocitele T. Un LT in centru este inconjurat de jur imprejur de limfocitele de oaie sau berbec. LT sunt celule rozetante. LB sunt celule nonrozetante. LT realizeaz legaturi cu anticorpii deoarece expun pe suprafata lor receptori de adeziune intracelular ce realizeaz legturi cu contrareceptorii de pe hematii. Receptorii CD2: sunt prezeni numai pe suprafaa LT, sunt cei mai importani receptori. LT identificate astfel prin testul rozetarii nu reprezint o clasa omogena. Exist patru subtipuri cu particularitai funcionale distincte: LTH :amplifica RIC; LTB: inhiba RI; LTC; LTCB (contrasupresoare); diferenierea nu poate fi facut pe baza unor criterii morfologice sau prin testul rozetrii pentru c toate rozeteaz. Ea se face prin evidenierea unor markeri de suprafa caracteristici fiecarei clase de limfocite.

[1]

Plancitometrie= citometrie in flux. Utilizeaz anticorpi monoclonali cu specificitatea absoluta pentru fiecare tip de marker in parte. Anticorpii sunt marcati fluorescent insa au dezavantajul ca sunt foarte scumpi.

Limfocitele T: Caractere generale: reprezint populaia limfocitar dominant, 60-65% din totalul limfocitelor periferice. Sunt celule cu durata de via lung i intens recirculante. Markerii (receptorii) de suprafa ai limfocitelor T: Receptori cu rol in recunoaterea antigenic. Complexul TCR- CD3 realizeaz recunoasterea antigenic propriu zisa, recunoaterea epitopilor prezentai. Complexul CD4 sau CD8 realizeaz recunoaterea moleculelor prezentatoare ale antigenului (MHC2 respectiv MHC1). Limfocitele T recunosc atat antigenul prezentat cat si moleculele prezentatoare ale acestuia. Ele realizeaz recunoaterea antigenic asociativ. Reprezint si principala cale de activare metabolica a limfocitelor T. Receptori cu rol accesor in activarea limfocitelor T: CD28, CD45. Receptori de adeziune intercelulara: CD2, LFA1 (antigen asociat functiei leucocitare), CD11/CD18. CD: notatia de catalog a receptorilor de la suprafata limfocitelor. A fost introdusa pentru a inlocui titulaturile descriptive. CD= clasa de diferentiere. VLA: antigen cu aparitie foarte tarzie. ICAM: molecule de adeziune intercelulara.

[2]

1. Complexul TCR-CD3: Pe suprafata limfocitelor T in starea de repaus exista aproximativ 40.000 de asemenea complexe. Este un heterodimer constituit din doua lanturi diferite si asociate dar ambele transmembranare: Lantul : 45 Kdal (este greu), codificat de gene situatie pe cromozomul 14. Capatul NH extern si capatul COOH este intern. Lantul : <40 Kdal (este mai usor), codificat de gene situate pe cromozomul 7. Capatul NH extern si capatul COOH intern. Lanturile sunt asociate intre ele prin punti disulfurice extramembranare. Membrana traversata de si separa trei segmente cu structura si functii diferite. Cele trei segmente sunt: extramembranar lung, transmembranar si intracitoplasmatic. Segmentulu extramembranar: lanturile si nu sunt liniare, ele sunt organizate in domenii si bucle de aproximativ 110 aminoacizi care iau nastere ca urmare a existentei unor punti disulfurice intracelulare. Pe fiecare lant exista doua bucle sau domenii pozitionate simetric fata in fata. TCR in segmentul extramembranar adopta o conformatie spatiala Ig like. Domeniile NH2 terminale au structura diferita intre ele, se caracterizata printr-un grad mare de variabilitate de la celulela la celula. Sunt domenii variabile ale TCR: V si V. Fiind pozitionate fata in fata se asociaza intre ele si constituie o cavitate de dimensiuni mici ce are rol de situs combinativ pentru antigen. Celelalte domeniu situate mai aproape de membrana au structura constanta sau aproape constanta si se regasesc pe suprafata tuturor celulelor C si C. Domeniile variabile sunt cele mai importante deoarece ele au rol in recunoasterea antigenica. Ele realizeaza legaturi punctiforme cu antigenul, pe o anumita parte din secventa. Contactele punctiforme se realizeaza cu ajutorul a trei mici secvente care provin din plicaturarea fiecarui domeniu. Aceste secvente sunt pozitionate in varful plicaturilor. Ele sunt aduse catre interiorul cavitatii si realizeaza legaturi cu complexul MHC- epitop prin complemetaritate (potrivire de forma); CDR- regiuni determinante ale complementaritatii.

[3]

Exista pe fiecare domeniu trei CDR. Exista 6 regiuni determinante ale particularitatii. Realizeaza legaturi selective, diferite cu epitopul prezentat si MHC. Aceste contacte au loc atunci cand LT vin in contact cu APC, cand are loc prezentarea si recunoasterea antigenului. Prezentarea este realizata de APC care prin MHC prezinta un anumit epitop CDR1, CDR2, de o parte si de alta (V si V) angajeaza legaturi numai cu MHC, recunosc doar domeniile polimorfe ale moleculei de MHC (MHC1-1 si2, MHC2-1 si 1). CDR3 apartinand celor doua domenii care sunt foarte apropiate intre ele, sunt singurele care realizeaza legaturi cu epitopul prezentat. Recunoasterea antigenica este asociativa, intrareceptoriala, un singur receptor recunoaste doua structuri. Zona balama este situata intre domeniile constante si membrana. TCR pote executa miscari in toate directiile planului. Aceasta functie este esentiala pentru favorizarea recunoasterii antigenice. si se asocieaza prin punti disulfurice. Segmentul transmembranar este alcatuit din 20 22 aminoacizi. Segmentul intracitoplasmatic este extrem de scurt 5-12 aminoacizi, deabia iese foarte putin pe suprafata interna a membranei. TCR indeplinesc doua functii importante: recunoasterea antigenica;

[4]

 genereaza stimuli activatori care nu pot fi transmisi direct catre profunzimea citoplasmei, catre enzimele implicate. Functia de transmitere a semnalelor activatoare o realizeaza complexul CD3. Acesta este alcatuit din cinci lanturi diferite si asociate (trei lanturi scurte diferite: ,, 22-25 Kdal si doiua lanturi identice intre ele, cel mai frecvent, foarte lungi, efilate, lanturile zeta). Cele cinci lanturi sunt asociate prin punti disulfurice intre ele si la complexul TCR astfel formeaza un complex heptameric TCR-CD3 care realizeaza transmiterea din lant in lant a semnalelor activatoare catre profunzimea citoplasmei. 2. CD4: este o glicoproteina transmembranara cu GM= 60 Kdal codificata de gene localizate pe cromozomul 12. Este distribuit pe LTH, este un marker definitoriu pentru acestea. Este un receptor transmembranar cu captele NH si COOH extramembranar. Segmentul extramembranar este alcatuit din patru domenii diferite intre ele. Segmentul intracitoplasmatic este foarte lung. Are rol in cooperarea dintre LTH si APC care este ocazionata de prezentarea si recunoasterea antigenului. Realizeaza legatura dintre CD4 si MHC prin intermediul domeniului D1 care angajeaza legaturi cu domeniul monomorf al MHC2 (2). Controlul activarii LTH se realizeaza prin segmentul intracelular care se afla in contact fizic cu o proteinkinaza (P56). 3. CD8: glicoproteina transmembranara hetrodimerica, GM 72Kdal, codificata de gene prezente pe cromozomul 2. Este alcatuita dintr-un lant si un lant , prezinta in segmentul extramembranar cate un domeniu domeniile sunt pozitionate fata in fata. CD8 are o configuratie Ig like. Prezinta un segment intracitoplasmatic foarte lung. Este prezent pe suprafata LTC / LTB. Este un marker definitoriu pentru LTC si LTB. Are rol in cooperarea dintre APC si LTC/ LTB, pe suprafata caruia exista CD8. Cooperarea este favorizata de prezentarea si recunoasterea antigenului. CD8 recunosc moleculele MHC1 de pe suprafata APC. Contactul se realizeaza intre unul dintre domeniile CD8 si domeniul monomorf MHC1 (3). TCR, CD3, CD4, CD8 au rol important in recunoasterea antigenica asociativa. Aceasta are loc in urma prezentarii antigenului de catre APC si recunoasterea sa in complex cu molecula MHC. Recunoasterea antigenica se realizeaza prin TCR si unul dintre cei doi coreceptori (CD4 pentru LTH si CD8 pentru LTC). Exista doua cupluri receptoare: Recunoastere antigenica intrareceptoriala prin TCR. Recunoastere antigenica intereceptoriala. TCR recunosc epitopul iar CD4/CD8 recunoscc moleculele de MHC. Prin aceasta recunoasterea are loc un contact cu: epitopul (doua contacte) si molecula MHC ( cinci contaccte). Toate moleculele MHC sunt exprimate doar pe membrana celulara. LT recunosc doar antigenele membranare expuse in complex cu MHC. Ele nu recunosc antigenii solubili Receptori cu rol accesor in activarea LT: CD28: glicoproteina transmembranara, GM=50 Kdal, homodimer, alcatuite din doua lanturi identice asociate care au doua domenii puse fata in fata. Au un domeniu extramembranar, un segment CT lung.
[5]

Sunt prezente pe LTC si LTH, niciodata pe LTB. CD28 favorizeaza cooperarea dintre APC si LTC/ LTH. Se realizeaza legaturi intre CD28 si CD80 si si apar stimuli activatori care se transmit catre citoplasma. Are loc activarea productiei de interleukine (LTH) si de citokine cu rol distructiv (LTC). CD45: este prezent pe suprafata LT unde ocupa 10% din aceasta. Este asociat la lanturile zeta-zeta ale CD3. Cand are loc recunoasterea antigenului prin TCR semnale se transmit si la CD45 care se activeaza si actioneaza ca o enzima protein-tirozin-fosfataza (PTP). PTP+PTK formeaza un cuplu functional enzimatic foarte important. Receptorii de adeziune intercelulara: Au rol in cooperarea dintre APC si LTH care reprezinta prima etapa a oricarui raspuns imun fata de antigenele timodependente. CD2 sunt receptori prezenti pe toate limfocitele T (receptori pan T; prezenti pe limfocitele T naive). In segmentul extramembranar exista doua bucle sau domenii. CD2 realizeaza legaturi prin complemetaritate cu contraligandul LFA3 prezent pe suprafata tuturor APC. LFA1: este un heterodimer format dintr-un lant CD11a si un lant CD8; au in segmentul extramembranar doua bucle, domenii. Realizeaza legaturi cu un contraligand ICAM. Cuplul LFA1-ICAM este un cuplu de linia doi, se formeaza legaturi dar afinitatea este scazuta. LFA1 este prezent pe toate LT dar in mod special pe LT cu memorie. Cele doua cupluri au functia de a stabili contacte intime intre membranele celor doua celule; favorizeaza prezentarea si recunoasterea antigenului ce permite stabilirea de contacte intre MHC si CD3 care nu au in cadrul membranelor aceeasi pozitie. Moleculele difuzeaza lateral prin membrana pana in momentul in care ajung fata in fata si vin in contact avand loc recunoasterea antigenica.

[6]

[7]