Structura biochimic a acizilor nucleici

3/31/2014

2. 1. Introducere

Gena se definete din punct de vedere biochimic ca fiind

un

segment al unei macromolecule de acid nucleic care ndeplinete o funcie specific i care din punct de vedere biologic se gsete n structura cromozomilor speciilor sau a genomului acestora.
Test de verificare

3/31/2014

2.1. Definiii

Secvena de acid nucleic care definete o gen este caracterizat de un complex de trei caracteristici:
material (M - 109 Da); Test de verificare fizic energetic i informaional succesiune de unitati biochimice.
biochimic

care permit funcionarea specifica participand la realizarea unei caracteristici ereditare subordonate ntregului organismului.
3

3/31/2014

2.1. Evoluia conceptelor

Conceptul de gen - a evoluat cu dezvoltarea cunotinelor n domeniu, bazat n particular pe evoluia tehnicilor i metodelor de laborator, care au permis verificarea sau invalidarea teoriilor despre ereditate i suportul acesteia. Descoperirile din chimie, fizic i biologie ale secolelor XVII XIX care au conferit suportul conturrii ca tiin n 1905 la propunerea profesorului W. Bateson.

3/31/2014

Test de verificare

2. 2. Definiii i concepte

Denumirea de acid nucleic provine de la cuvntul nuclein folosit de anatomistul elveian, de origine german, Friederich Miescher n anul 1868 pentru a denumi substana descoperit n nucleii celulelor prelevate din puroiul chirurgical uman.
Test de verificare

3/31/2014

2.2. Nucleina

F. Misecher, A. Kossel, A. Neumann, J. Picard, O. Altman, H. Steudel, A. Ascoli, O. Hammarsten - relev independent c, nucleinele (nucleoproteide), sunt alctuite din
parte prostetic: acizii nucleici i o parte cu un coninut ridicat n acid fosforic conferindu-le un caracter acid.
o

3/31/2014

2.2. Nucleina
1871 F. Meischer a descoperit nucleina n lapii de somon (Salmo salar) i a stabilit c nucleul spermatozoizilor este alctuit dintr-un acid (nucleinic) i proteine. Tot el a caracterizat acest acid ca fiind foarte bogat n acid fosforic. 1889, R. Altmann, histolog german, identific n nucleina de drojdie o substan macromolecular acid pe care o numete acid nucleic.

3/31/2014

2.2. W. Johansen

1905 bot genetician danez W. Johannsen public prima carte de genetic din lume intitulat Elemente de genetic n care definete termeni noi.
gena este considerat sinonim pentru factorii ereditari descoperii de Gregor Mendel n 1865, genotipul este reprezentat de constituia genetic, adic constelaia de gene a unui organism i fenotipul este definit ca exprimarea acestor gene.
Astfel
Test de verificare

3/31/2014

2.2. coala lui T.H. Morgan

dup 1910 gena reprezinta:

o

structur unitar de funcie

gena determin caracteristicile ereditare

de

mutaie
structura biochimic a genei se schimb prin mutaie responsabila de formarea alelelor mutante

i de recombinare
segregare

3/31/2014

crossing-over.

Test de verificare
9

2.2. Ipoteza o gen o enzim

1941 - G. W. Beadle i F. I. Tatum au enunat ipoteza: o gen o enzim, teorie conform creia fiecare gen ar controla sinteza, funcia i specificitatea unei Test de verificare enzime. Dupa 1944 - o gen este reprezentat de un segment dintr-o molecul de acid nucleic.

3/31/2014

10

2.2. Ipoteza o gen o enzim

Axioma central a biologiei moderne se bazeaz pe ideea c acizii nucleici reprezint substana ereditar, substratul molecular al factorilor ereditari (genelor) respectiv al caracterelor ereditare iar Gena - un segment al macromoleculei de acid dezoziribonucelic la toate organismele sau de acid ribonucleic la retrovirusuri care deine informaia ereditar ce dirijeaz sinteza unei anumite catene polipeptidice
Test de verificare
11

3/31/2014

2. 3. Funciile genei

n baza cunotinelor acumulate n perioada anilor 70, se consider c genele au cteva funcii eseniale datorate structurii lor i integrrii lor n structura genomului ca atare. Test de verificare
Transmiterea

informaiei gentice de la o celul la alta, sau de la o generaie la alta, prin autoreplicare reprezint funcia autocatalitic a genei iar dirijarea biosintezei i structurii proteinelor, prin transformarea secvenei de nucleotizi din gen n secven proteic pe baza decodificrii codului genetic reprezint funcia heterocatalitic a genei 12 3/31/2014

2.4. Descoperirile lui Levene

P. Levene demonstreaz (1902), acidul nucleic din drojdie conine 4 baze azotate: A - adenin, G - gunain, C citozin i U - uracil, precum i acid fosforic i riboz. n 1903, analizeaz compoziia chimic a acidului nucleic din timus de viel i constat c acesta conine A - adenin, G - guanin, C citozin i T - timin precum i acid fosforic i dezoxiriboz. 1903 modelul structurii tetranucleotidice a Test de verificare acizilor nucleici.
13

3/31/2014

2.4. Transformarea genetic Griffith

3 trepte experimentale cu Diplococcus pneumoniae model biologic

1928, E Griffith tulpini virulente SIII Descoper transformarea bacterian

i nevirulente RII

1932,

Alloway i 1937 MH Dawson i RHP Sia Diplococcus pneumoniae extracte filtrante 1944, OT Avery, CM MacLeod i M MacCarty ADN purificat

Bomba lui Avery dup J. Watson pn la acest moment se credea c proteinele ar avea rol esenial n ereditate

3/31/2014

14

Experimentul lui Griffith 1828

http://rowena-twobytwo.blogspot.ro/2011_02_01_archive.html

Tulpina nevirulenta rugoasa

Tulpina virulenta neteda

Tulpina neteda ucisa prin caldura

Tulpina nevirulenta rugoasa si tulpina neteda ucisa prin caldura

3/31/2014

soarecii: traiesc

mor

traiesc

mor

15

Experimentul lui Griffith 1828

http://nortonbooks.com/college/biology/animations/ch12a01.htm

Griffith concluded that the live R strain bacteria must have absorbed genetic material from the dead S strain bacteria, and since heat denatures protein, the protein in the bacterial chromosomes was not the genetic material. This evidence pointed to DNA as being the genetic material. Transformation is the process whereby one strain of a bacterium absorbs genetic material from another strain of bacteria and turns into the type of bacterium whose genetic material it absorbed
http://rowena-twobytwo.blogspot.ro/2011_02_01_archive.html
16

3/31/2014

1952- Hershey-Chase Experiment

Hershey i Chase au cutat un rspuns la ntrebarea : este ADN viral sau proteina virala materialul purtator de informatie ereditaracare se injecteaza in celula bacteriana? Escherichia coli, sau E. coli i virusul T2 (bacteriofag specific E. Coli)

http://rowena-twobytwo.blogspot.ro/2011_02_01_archive.html
17

3/31/2014

1952- Hershey-Chase Experiment

3/31/2014

http://rowena-twobytwo.blogspot.ro/2011_02_01_archive.html

18

2. 4. 1. Compoziia biochimic primar

Fiind substane macromoleculare, polimerice, acizii nucleici prezint o structur primar, secundar, teriar i cuaternar. Din punct de vedere biochimic, ca urmare a prezenei fie a ribozei fie a deoxiribozei, exist dou categorii de acizi nucleici:
acidul

ribonucleic (ARN) i acidul deoxiribonucleic (ADN).

Pentru nelegerea nivelelor de organizare ale acizilor nucleici este esenial cunoterea structurii lor primare.
19

3/31/2014

2.4.1. Structura primar

hidroliza acida, bazica sau enzimatica arat c acizii nucleici conin trei categorii de compui chimici distinci i anume:

3/31/2014

Acidul fosforic notat cu P prezent permament Baze azotate purinice, care au ca structur chimic de baz purina Adenina (A) i Guanina (G) comune i Baze azotate pirimidinice, care au ca structur chimic de baz pirimidina Citozina (C) i diferite: Uracilul (U) n structura ARN i Timina (T) n structura ADN Pentoze diferite: riboza (Rib) n ARN i dezoxiriboza (dR) n ADN
Test de verificare
20

2.4.1. Baze azotate

3/31/2014

Test de verificare

21

2.4.1. Dezoxiriboza i acidul fosforic

3/31/2014

Test de verificare

22

2.4.1. Baze azotate purinice i pirimidinice

substane chimice heterociclice care datorit prezenei atomilor de N prezint un caracter bazic. nlocuirea atomilor de H cu radicali OH sau NH2 scade solubilitatea lor n ap i crete punctul de topire conferind stri tautomere ca urmare a deplasrii dublelor legturi de tipul C =C i C=N spre atomul de O n cazul ceto- etanol i similar amino imino, ceea ce confer ADN o mare stabilitate structural i posibilitatea de a se prezenta sub 23 3/31/2014 Test de verificare diferite variante structurale

2.4.1. Baze azotate purinice i pirimidinice

absorbia

luminii n UV la 260 nm, caracteristic ce permite recunoaterea i dozarea lor spectrofotomeric. Atenie E. Fischer
n

1897 sintetizeaz purinele i n 1903 sintetizeaz pirimidinele

3/31/2014

Test de verificare

24

2.4.1. Pirimidine

Descoperite n 1885 - A. Pinner,

deriv

teoretic de la nucleul pirimidinic (1, 3 sau meta diazina) de unde i provine numele de PIRIdin + aMIDIN. Nucleul pirimidinic este un heterociclu aromatic alctuit din 4 atomi de carbon i 2 atomi de azot.

3/31/2014

Test de verificare

25

2.4.1. Pirimidine
2, 4 deoxipirimidina se afl n compoziia ARN-ului i a fost izolat pentru prima dat de Asconi n 1900 din ARN-ul de drojdii fiind singura baz azotat care poate fi gsit ca atare n secar. Timina, 5 metil U (2, 4 deoxi 5 metil pirimidina) a fost iniial izolat din timus de viel fiind considerat baz azotat pirimidinic a ADN.
Uracilul
3/31/2014

Test de verificare

26

2.4.1. Pirimidine
(2 oxi 4 amino pirimidina) izolat pentru prima dat de Kossel n 1894 se afl n compoziia att a ADN ct i a ARN avnd un rol foarte important n biosinteza fosfolipidelor de membran. Citozina poate s se transforme n Uracil prin dezaminare oxidativ Acidul orotic este considerat precursorul bazelor pirimidinice.
Citozina
Test de verificare

3/31/2014

27

2.4.1. Purine
Identificat prima dat n acidul uric de Medicus (i-a dat denumirea dup substratul de unde a fost izolat) este alctuita dintr-un nucleu pirimidinic condensat cu unul imidazolic i prezint fenomenul de tautomerie. Nucleul purinic este un heterobiciclu alctuit din 5 atomi de carbon i 4 atomi Test de verificare de azot.

3/31/2014

28

2.4.1. Purine
este o 6 amino-purin Guanina este o 2-amino 6-oxipurin Denumirea de purin deriv de la cuvintele purum i uricum i a fost introdus pentru prima dat n tiin de Fisher.
Adenina

3/31/2014

Test de verificare

29

2.4.1. Purine
(6 amino purina), izolat iniial din pancreas i ulterior din drojdii (Kossel, 1885) se afl n compoziia ambelor tipuri de acizi nucleici (ADN i ARN), n compoziia nucleotidelor mono, di, i trifosforilate precum i n structura unor coenzime (acetil coenzima A, etc.). Dezaminarea de tip oxidativ tranform adenina n hipoxantin care iniial a fost izolat din splin n 1850.
Adenina
3/31/2014

30

2.4.1. Purine
(2 amino 6 oxi purina) iniial a fost izolat din guano de pasre de Magnus n 1844 i apoi din ambele tipuri de acizi nucleici de ctre Kossel n 1883. Acidul uric (2, 6, 8 trioxipurina) este produsul de catabolism al purinelor la om i nu se regsete n structura acizilor nucleici).
Guanina

3/31/2014

31

2.4.1. Pentozele
Prezena pentozelor n structura primar a acizilor nucleici a fost demonstrat de Fischer n 1908. D riboz n ribonucleotide monomeri ai ARN i D, 2-dezoxiriboz n dezoxiribonucleotide monomeri ai ADN. Se afl sub forma izomeric , form ce are gruparea oxidril de la C1 deasupra planului molecular. Sub aciunea unui sistem reductor enzimatic specific din D riboz deriv D, 2 dezoxiriboza.
3/31/2014

Test de verificare

32

2.4.2. Nucleozidele
Nucleozidele sunt reprezentate de N glucozidele heterociclice ale bazelor pirimidinice i purinice cu o pentoz: riboza n ribonucleozide i dezoxiriboza n dezoxiribonucleotide. Analiza n raze X a stabilit c atomii bazei azotate se dispun perpendicular pe planul pentozei aflat n conformaie iar legtura N nucleozidic se dispune n planul bazei azotate.

3/31/2014

33

2.4.2. Nucelozidele

Unirea dintre baze azotate i pentoze este realizat astfel:

N1

(atomul de azot numerotat cu numrul 1) al pirimidinei i C1 (atomul de carbon numerotat cu numrul 1) al pentozei respectiv N 9 (atomul de azot numertotat cu numrul 9) al purinei i C1 (atomul de carbon numerotat cu numrul 1) al pentozei.
3/31/2014

Test de verificare

34

2.4.3. Nucleotidele i lanurile polinucleotidice

Acizii nucleici sunt compui polimerici iar unitile reaciei de polimerizare sau monomerii se numesc nucleotide motiv pentru care acizii nucleici se mai numesc polimeri de nucleotide sau polinucleotide.

3/31/2014

Test de verificare

35

2.4.3. Nucleotidele

Nucleotidul este alctuit dintr-o nucleozid i un radical fosforic adugat prin legtur esteric la un oxidril al pentozei i pot fi ribonucleotide (ribotide) sau dezoxiribonucleotide (dezoxiribotide). Structura nucleotidelor a fost stabilit de ctre E. Chargaff n 1947 prin utilizarea cromatografiei n strat subire.Tot el a stabilit c ntre cele patru nucleotide exist anumite proporionaliti
36

3/31/2014

Cromatografie in strat subtire

Pigmeni la plante

TLC Chargaff

3/31/2014

37

2.4.3. Nucleotidele

3/31/2014

38

2.4.3. Catena de ADN

1952, Todd i Wilkins au stabilit separat prin metoda difraciei n raze X, natura legturilor chimice dintre componentele nucleotidelor. Purinele i pirimidinele realizeaz legturi chimice cu pentozele rezultnd nucleozide la care se ataeaz restul fosforic pentru formarea nucleotidelor.

3/31/2014

http://osulibrary.orst.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/people/todd.html

39

Metoda difraciei n raze X

3/31/2014

40

2.4.3. Catena de ADN

Fig. nr. 5 Structura primar a acizilor nucleici schem adaptat dup adresa de internet: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/ro/9/91/Nucleotide.png

3/31/2014

Test de verificare

41

2.4.3. Catena de ADN

Rolul restului fosforic este de a realiza legtura dintre carbonul 5 (C5) al unui nucleotid i carbonul 3 (C3) al urmtorului nucleotid din structura secvenei de ADN. Are loc formarea unei catene constituite din (n) nucleotide unite prin legturi 53 sau 35, denumit caten polinucleotidic sau lan polinucleotidic.

Test de verificare
3/31/2014

42

2.4.3. Catena de ADN

Legturile 53 sau 35 sunt legturi chimice covalente internucleotidice fosfodiesterice realizate ntre acidul fosforic i gruprile hidroxilice (-OH ) ale pentozei din poziiile 3 i 5cu esterificarea a dou grupri hidroxilice ale restului fosforic.
Test de verificare

3/31/2014

43

2.4.3. Catena de ADN

Legturile fosfodiesterice sau punile fosfodiesterice

sunt

legturi covalente stabile, pe seama lor realizndu-se o structur liniar, monocatenar, avnd la un capt gruparea hidroxil, iar la cellalt gruparea fosfat. constituie o veritabil coloan vertebral a monocatenei ADN.

3/31/2014

Structura monocatenar reprezint Test de verificare structura primar a ADN.

44

2.4.3. Catena de ADN

In cursul replicarii la alctuirea monocatenei ADN nucleotidele se afl sub form de nucleotide tri-fosfat dup cum urmeaz:
dezoxiadenozintrifosfat

(dATP) dezoxitimidintrifosfat (dTTP) dezoxiguanozintrifosfat (dGTP) dezoxicitidintrifosfat (dCTP)

3/31/2014

Test de verificare

45

2.4.3. Catena de ADN

Acid fosforic - P Baze Azotate B Purine i Pirimidine

Rest glucidic - S

Caten de ADN
3/31/2014

Test de verificare

46

Capt 5

P B
5 3 dR

P B
5 3 dR

P B
P fosfat dR dezoxiroboz B baz azotat (purin sau pirimidin) 5 3 dR

Capt 3

3/31/2014

47

2.4.3. Catena de ADN

4
3 2

3/31/2014

48

2. 5. Greutate molecular
depete 10.000 Da, ajungnd la 1074x108 Da. ADN este cel mai mare polimer natural, mrimea acestuia putnd fi mai uor intuit dac se ia n consideraie faptul c greutatea molecular a unui nucleotid purinic este de 354 Da, iar a unui nucleotid pirimidinic de 314 Da.

3/31/2014

Test de verificare

49

2. 5. Greutate molecular
Specie specifica mrimea ADN fiind o caracteristic de specie i depinznd de regul de complexitatea informaiei ereditare pe care o deine fiecare specie. Bacteriofagul X 174 este de 1,7x106 Da, Bacterii - de 4-5 x 106 Da.

3/31/2014

50

2. 5. Greutate molecular

De reinut: exist o regul a constanei cantitii de ADN implicate n diferenierea celular i evoluia speciilor.
Experienele

cu 3H-timidin au demonstrat faptul c odat ncorporat timidina n celul nu mai este eliminat atta timp ct celula triete odat sintetizat molecula de ADN aceasta nu mai este dezagregat pentru a fi resintetizat
3/31/2014

Test de verificare

51

2.5. Lungimea ADN

Ca regul general: ADN de 100 are 30 pb i. 20.000 Da. Lungimea ADN uman (n = 22 A + X)= 2,9x109 pb (2,9 x 106 kilobaze) = 1m ADN

dac

moleculele de ADN de la fiecare cei 23 cromozomi ai complementului cromozomial haploid ar fi puse una n continuarea celeilalte i ar fi n stare extins, nu compactat, superspiralizat cum se afl ele n mod normal n cromozomi.
52

3/31/2014

Complement cromosomial la om

3/31/2014

53

2.5. Lungimea ADN

Dac am considera lungimea moleculelor de ADN din cromozomii tuturor celulelor umane de ordinul mai multor miliarde n condiiile artate mai sus, lungimea ADN uman ar depi de cteva ori distana de la Pmnt la Soare.

3/31/2014

54

2.5. Specificitate de structur

Nucleotidul prezint o regiune specific, reprezentat de baza azotat i o regiune nespecific reprezentat de dezoxiriboz i restul fosforic.

3/31/2014

Test de verificare

55

2.5. Specificitate de structur

n cadrul structurii primare, monocatenare, punile fosfodiesterice se stabilesc ntotdeauna ntre aceleai grupri nespecifice (pentoz i restul fosforic), ceea ce confer o mare regularitate, fiind identic la toate moleculele de ADN de orice provenien fr un coninut informaional specific.
Test de verificare
56

3/31/2014

2.5. Specificitate de structur

Dar, nu acelai lucru se poate spune despre bazele azotate care constituie regiunea specific a nucleotidelor, modul de niruire a lor de-a lungul monocatenei, variind de la o molecul de ADN la alta, adic de la ADN al unei specii la ADN al altei specii.

3/31/2014

57

2.5. Specificitate de structur

Ordinea sau secvena de baze azotate din catena ADN este caracteristic fiecrei specii i reprezint modalitatea de nscriere a informaiei ereditare n structura ADN sub forma codificrii biochimice.

3/31/2014

Test de verificare

58

2.5. Specificitate de structur

nelegem deci prin informaie ereditar ordinea de succesiune a bazelor azotate din ADN, secvena acestor baze azotate fiind caracteristic fiecrei specii, fiecare specie avnd propria sa informaie ereditar.

3/31/2014

Test de verificare

59

2.5. Specificitate de structur

Este corect s vorbim de secvena de baze azotate i nu de secvena de nucleotide, atunci cnd dorim s redm specificitatea informaional a unei specii n raport cu o alt specie. Test de verificare Secvena de baze azotate din ADN dirijeaz secvena aminoacizilor din proteine i prin aceasta realizarea diferitelor caractere ereditare la confruntarea dintre genotip i mediu.

3/31/2014

60

2.6. Structura secundar a ADN

2. 6. 1. Elemente introductive
Caracteristica lumii vii de a utiliza redundana de tip informaional, aceleai uniti care se repet i se gsesc n mai multe cpii ntruct este esenial pentru asigurarea transmiterii ct mai fidele a coninutului informaional.
3/31/2014

61

2.6. Jocul n doi

factorii ereditari exist sub form de pereche gene alele cromozomii exist sub form de perechi (crs.omologi) fiecare cromozom este alctuit din dou cromatide (cromatide surori).

3/31/2014

62

2.6. Jocul n doi

Structura macromoleculei ADN nu face excepie de la acest joc de doi pe care l realizeaz fenomenul ereditar, deoarece, starea nativ a ADN eucariot este aceea de macromolecul bicatenar, ADN-ul fiind alctuit din dou catene polinucleotidice care sunt unite ntre ele prin legturi de hidrogen.
63

3/31/2014

2.6. Modelul molecular bicatenar

Descifrarea structurii de tip bicatenar a moleculei de ADN s-a realizat cu metode ca: spectrofotometria, rezonana magnetic nuclear, absorbia n UV, cromatografia, electroforeza. Dintre toate aceste metode, cea a difraciei n raze X a dat cele mai sigure i neechivoce rezultate.
64

3/31/2014

2.6.1. Difracia n raze X

Primele cercetri privind descifrarea structurii ADN prin analiza imaginilor obinute prin difracie n raze X au fost ntreprinse de ctre Astbury n anul 1938. n acelai an Astbury i Bell au artat c macromolecula de ADN are o structur fibrilar, pe axa sa lung bazele azotate fiind poziionate perpendicular, ntre dou baze azotate vecine de pe coloana glucido-fosforic existnd o distan de 3,4 . Cele mai bune imagini ale difraciei ADN n raze X sunt ns obinute n perioada 1950 1952 de ctre M. H. F. Wilkins i R. Franklin.
Test de verificare
65

3/31/2014

2.6.1. Difracia n raze X

ADN ul provenit din surse diferite produce prin difracie n raze X un model foarte clar de benzi, practic identice, ceea ce a fundamentat ideea ordonrii monomerilor n cadrul moleculei de ADN care are o structur helical.

3/31/2014

66

2.6.1. Legile lui Chargaff

De o deosebit importan n elucidarea structurii secundare a ADN s-au dovedit a fi cercetrile lui Chargaff din 1950, prin care s-a stabilit c cele patru baze azotate principale nu intr n proporii egale n structura ADN de la diferitele specii analizate aa cum era prezentat teoria lui Levene.

3/31/2014

67

2.6.1. Legile lui Chargaff

Regula echivalenei ntotdeauna cantitatea de A este egal cu cea a T (A=T), iar cea de C este egal cu aceea de G (C=G), de unde rezult un raport A/T=1, ca i cel C/G =1 la organisme foarte diferite precum Mycobacterium tuberculosis avium, Saccharomyces cervisiae, Pisum sativum, Bos taurus sau Homo sapiens. Raportul A/G este diferit de unitate, ca dealtfel i raportul C/T constituindu-se n alt regul important n genetica molecular - genomica
Test de verificare
68

3/31/2014

2.6.1. Legile lui Chargaff

Studiile de hidroliz a macromoleculei de ADN urmate de cromatografie i estimare spectrofotometric a proporiei de baze azotate a fundamentat idea c ADN ul provenit de la diferite specii are o compoziie foarte diferit
Om

A 31.0%, T 31.5% G 19.1% C 18.4% Drojdie de bere A 31.7% T 32.6% G 18.8% C 17.4% E. coli A 26.1% T 23.9% G 24.9% C 25.1%

3/31/2014

Test de verificare

69

2.6.1. Legile lui Chargaff

n aceste constatri cunoscute i sub denumirea de legile lui Chargaff i are izvorul ideea mperecherii bazelor azotate purinice cu bazele pirimidinice - idee ce a constituit piatra de temelie n elaborarea de ctre J. D. Watson i F. C. H. Crick a modelului de structur secundar a ADN. Raportul A+T/G+C este caracteristic fiecrei specii, fiind mult mai apropiat la organismele nrudite filogenetic.

3/31/2014

70

2.6.1. Modelul lui Watson i Crick

n anul 1953, Watson i Crick au propus modelul de structur bicatenar al ADN, care a fost ulterior unanim acceptat i considerat ca fiind cea mai mare descoperire din domeniul biologiei sec. XX i una dintre cele mai mari n istoria tiinei.

3/31/2014

Test de verificare

71

2.6.1. Modelul lui Watson i Crick

n elaborarea modelului dublului-helix, Watson i Crick au inut seama i de fotografiile privind difracia n raze X a ADN puse la dispoziie de Rosalind Franklin i realizate n laboratorul de la Londra al lui Wilkins.

3/31/2014

72

2.6.1. Modelul lui Watson i Crick

Modelul structurii bicatenare helix al ADN-ului este fundamentat de cercetri care au utilizat tehnica difraciei radiaiilor X (A. Wilkins, R. Franklin, Gossling i pe de alt parte de cele ale lui James Watson i Francis Crick) n anul 1963
cea

mai important descoperire din istoria biologiei secolului XX.

73

3/31/2014

2.6.1. Modelul lui Watson i Crick

Watson and Crick
"It has not escaped our notice that the specific (base) pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. April 25, 1953 3/31/2014

74

2.6.1. Modelul lui Watson i Crick

macromolecula de ADN este format din dou helice coaxiale, adic din dou catene polinucleotidice paralele, nfurate n jurul unui ax comun:
una

avnd o direcie ascendent (nucleotidele se leag prin puni intracatenare fosfodiesterice de la 3 la 5, iar cealalt direcie descendent (nucleotidele se leag prin puni intracatenare fosfodiesterice de la 5 la 3, rezultand dou catene polinucleotidice dispuse 75 3/31/2014 Test de verificare antiparalel.

2.6.1. Modelul lui Watson i Crick

Rsucirea celor dou catene ale dublului helix ADN este dextral, spre dreapta, i n toate sistemele biologice se ntlnete acest tip de spiralizare spre dreapta, astfel c n mod normal ADN este dextral.

3/31/2014

Test de verificare

76

2.6.1. Modelul lui Watson i Crick

Bazele azotate se afl spre interiorul dublului helix, pe cnd gruprile fosfat sunt dispuse la exterior, unind dezoxiribozele nucleotidelor nvecinate prin legturi covalente puternice, fosfodiesterice, intracatenare, alctuind o veritabil coloan glucido-fosforic.

3/31/2014

77

2.6.2. Complementaritatea de structur a ADN

Realizarea structurii bicatenare este consecina imperecherii pe baza de complementaritte a bazelor azotate purinice cu cele pirimidinice. Prin proprietile sale structurale A este complementara T si n structura ADN, se leaga prin dou puni de H, formnd perechi A=T/T=A. Pe de alt parte, G este complementar C si n structura ADN, se leaga prin trei puni de H, formnd perechi CG/G C.
Test de verificare
78

3/31/2014

2.6.2. Complementaritatea de structur a ADN

Watson i Crick: perechile de baze A:T i G:C sunt specifice. mperecherea bazelor regleaz replicarea. 3/31/2014

79

P d R d R d R d R d R d R A 5 3 d R 1 T 1 3 5

P P T 5 3 d R 1 A 1 3 5

P P G 5 3 d R 1 C 1 3 5

P P C 5 3 d R 1 G 1 3 5

P P A 5 3 d R 1 T 1 3 5

nucleotid P A 5 3 d R 1 T 1 3 5

Fig. 7. Reprezentarea schematic a catenei duble de ADN P fosfat, dR dezoxiroboz, B baz azotat (purin sau pirimidin),

3/31/2014

Test de verificare

80

2.6.2. Complementaritatea de structur a ADN

Complementaritatea strict purin pirimidin sau pirimidin purin confer structurii helicoidale bicatenare de ADN
o

form regulat, cu un diametru constant dea lungul ntregului su traiect. impune restricii secveniale

3/31/2014

Test de verificare

81

2.6.2. Geometrie steric

Structura

bicatenar prezint repetiii ale nfurrii sale dup fiecare 10 perechi de baze azotate, adic dup fiecare lungime de 34 (10x3,4 ),= pasul helixului sau pasul helicei. Planurile sterice ale bazelor azotate sunt orientate perpendicular pe axa macromoleculei de ADN.

3/31/2014

82

2.6.2. Geometrie steric

Diametrul

ADN este de 20 i prezint o rotire de 36 la fiecare pb. Cele dou catene polinucleotidice sunt antiparalele, la una legturile fosfodiesterice realizndu-se ntre C3 al dezoxiribozei unui nucleotid i C5 al dezoxiribozei nucleotidului urmtor, pe cnd la cealalt caten, legturile fosfodiesterice au orientarea C5 C3.

3/31/2014

Test de verificare

83

2.6.2. Geometrie steric

3/31/2014

84

2.6.2. Geometrie steric

Structura bicatenar a ADN prezint de regul o mare stabilitate fizic, asigurat

pe

vertical de punile fosfodiesterice intracatenare, pe orizontal de punile de H intercatenare i de stivuirea perechilor de baze azotate, n cadrul dublului helix,

toate acestea fcnd ca ADN dublu catenar s apar ca o structur oarecum rigid, paracristalin.
85

3/31/2014

2.6.2. Geometrie steric

Caracteristicile structurale finale ale dublului helix ADN sunt dictate de moleculele de dezoxiriboz care se aeaz cu oxigenul inelului orientat n sus n cadrul unei catene i orientat n jos n cadrul catenei complementare.

3/31/2014

86

2.6.2. Geometrie steric

Din cauza acestui aranjament opus al moleculelor de dezoxiriboz n cele dou catene i deoarece zahrul se leag la o poziie excentric a bazelor azotate, ntreaga molecul de ADN este obligat s se rsuceasc, s se spiralizeze, rezultnd nu o structur bicatenar dreapt, ci una spiralizat, rsucit helicoidal (de unde denumirea de dubluhelix ADN) n care fiecare pereche succesiv de baze azotate se ntoarce cu 36o n direcia acelor de ceasornic, dublul helix fcnd un tur complet (360o) la fiecare 10 perechi de nucleotide, acesta reprezentnd de fapt pasul helicei ADN.
87

3/31/2014

2.6.2. Geometrie steric

n cadrul dublului helix ADN, din nfurarea plectonemical a celor dou catene, rezult o alternan regulat de adncituri minore i majore, astfel c la un nivel dat al dublului helix o adncitur minor de pe o parte corespunde la o adncitur major de pe cealalt parte.

20 A

Curbura mic Curbura mare

Pasul spirei 34 A
36 unghi de rotire per nucleotid

3.4 A per nucleotid

3/31/2014

Test de verificare

88

2.6.2. Stabilitatea ADN

Forele fizice

Fore electrostatice datorate ionizrii.

Gruprile

ionizabile din bazele nucleotidice accept H+ sub un pH 4-5. Radicalii HO- enolici ionizeaz la pH > 9 i modific echilibrul tautomeric ceto enol n favoarea formei ceto. Astfel, la pH biologic (5- 9) ADN ul se comport ca un polielectrolit anionic.

3/31/2014

Test de verificare

89

2.6.2. Stabilitatea ADN

Forele fizice

Fore electrostatice
Aceste

fore determin stabilitatea dar i desfacerea dublului helix ntruct la concentraii reduse de ioni (10-4 10-5 M) sau de ADN (sub 10 g/ml) se produce ruperea spontan a dublului helix iar cationii polivaleni i compuii polianionici cresc stabilitatea moleculei de ADN (fa de agenii denaturani)
90

3/31/2014

2.6.2. Stabilitatea ADN

Forele fizice

forele de nstivuire - date de interaciunile hidrofilice a nucleotidelor (suprapunerea perechilor de nucleotide n cadrul structurii bicatenare). Bazele azotate orientate perpendicular pe axul helixului de ADN interacioneaz din punct de vedere fizic i pe vertical prin intermediul electronilor p ai nucleelor aromatice din structura bazelor cu nucelu benzenic i aceste interaciuni devin importante atunci cnd distana dintre nucleele care se suprapun este redus.
Test de verificare
91

3/31/2014

2.6.2. Stabilitatea ADN

Forele fizice

legturile de hidrogen intercatenare sunt considerate ca fiind implicate direct n mecanismele prin care molecula de ADN i exercit funciile biologice n sinteza directoare a secvenei specifice ADN nou format (conservarea informaiei genetice) precum i biosinteza ARN inclusiv ARNm (mesager) i prin aceasta contribuie la transmiterea informaiei genetice n secvena de aminoacizi.

3/31/2014

92

2.6.2. Stabilitatea ADN

Forele fizice

Forele hidofobe i hidrofile n ansamblu determin stabilitatea conformaiei ADN i solubilitatea sa datorit n special a gruprilor fosfat, ndreptate spre mediul apos i a bazelor heterociclice situate n interiorul dublului helix.

3/31/2014

Test de verificare

93

2.6.2. Stabilitatea ADN

Forele fizice

Aceste fore ce asigur stabilitatea macromoleculei de ADN fac ca o molecul de acid nucleic ce are mai mult de 10 perechi de nucleotide s fie stabil la temperatura camerei (18C) i s reziste pn la 6 luni de zile n sol prin adsorbie pe suprafaa caolinului care are posibilitatea de fixare a moleculei de ADN n afara organismului.

3/31/2014

94

2.6.2. Stabilitatea ADN

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e4/DNA_chemical_struc ture.svg/350px-DNA_chemical_structure.svg.png

3/31/2014

95

2.6.2. Stabilitatea ADN

3/31/2014

96

2.6.2. ADN de stnga

La unele polinucleotide sintetice, n care o caten este format numai din G, iar cealalta din C, denumite generic poli d(G-C), s-a constatat existena unei spiralizri cu orientare spre stnga (senestr), numindu-se ADN de stnga care prezint aceeai regularitate intern, aceleai asocieri de baze azotate, dar care prezint diferene structurale considerabile. n molecula ADN de stnga grupele fosfat se dispun nu dup un traiect rectiliniu, ci dup un traiect n zig-zag, ADN de stnga numindu-se i ADN-z.
97

3/31/2014

2.6.2. ADN de stnga

Dac n ADN nativ, normal, de dreapta, perechile de baze azotate sunt ascunse la interiorul dublului helix, n ADN de stnga perechile de baze sunt expuse mai spre exteriorul dublului helix Pasul helicei cuprinde nu 10 ci 6 pb, Diametru este mai mic. Forele de stivuire sunt mai reduse ADN-z apare mai fragil,

3/31/2014

Test de verificare

98

2.6.2. ADN de stnga

Este posibil ca structuri de tip ADN-z s apar n anumite condiii chiar i n cadrul structurii ADN nativ, cu spiralizare de dreapta, doar pe anumite segmente ale sale, n cadrul desfurrii anumitor procese fiziologice normale, cum ar fi replicarea i transcrierea, regiunile dextre i cele senestre putnd fi reparate doar de dou perechi de nucleotide.
99

3/31/2014

2.6.2. ADN de stnga

Este posibil ca spiralizarea de stnga a ADN, n care perechile de baze azotate sunt mai expuse interaciunilor cu substane mutagene sau carcinogene, s stea la baza genezei unor stri patologice de generare a tumorilor benigne i maligne.
100

3/31/2014

2.6.2. Variabilitate de structur

n acizii nucleici nu se nregistreaz o repetiie monoton a monomerilor, ca n cazul celulozei unde se repet un acelai monomer-glucoza, ci are loc o niruire statistic, aparent aleatorie a celor patru nucleotide, ceea ce d posibilitatea realizrii unui numr nelimitat de aranjamente de secvene de pb, fiecare aranjament reprezentnd o alt informaie ereditar. Aceasta st la baza enormei diversiti a vieuitoarelor, ntlnit n natur, de la apariia lor pn astzi.
101

3/31/2014

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

n condiii normale, macromolecula de ADN se prezint ca o structur stabil aceast caracteristic fiind conferit de legturi fosfodiesterice intracatenare (legturi covalente) i de forele fizice. Peste anumite limite de temperatur (ntre 63C i 100C), stabilitatea punilor de H cedeaz, are loc desfacerea dublului-helix n cele dou catene polinucleotidice complementare, fenomen numit denaturare termic
Test de verificare
102

3/31/2014

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

3/31/2014

103

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

La denaturarea termic ADN trece de la starea dublu catenar la cea monocatenar, fenomen nsoit de reducerea puternic a vscozitii soluiei de ADN. Cea mai sczut temperatur de denaturare cunoscut este de 65C i se nregistreaz n cazul polinucleotidului sintetic poli d(A-T).
104

3/31/2014

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

Temperatura

de denaturare - punct de topire sau temperatur de topire i este diferit la diferitele specii, n funcie de bogia n perechi G-C din ADN a speciei respective cu ct acesta conine un numr mai mare de perechi G-C ntre care exist trei puni de H, fa de numrul perechilor A-T, ntre care exist doar dou puni de H, cu att temperatura necesar pentru ruperea legturilor de hidrogen i separarea catenelor este mai mare.
3/31/2014

105

2.7.Denaturarea i renaturarea ADN

Dac amestecul de monocatene rezultate prin denaturarea dublului helix ADN se rcete brusc, monocatenele rmn permanent separate i un asemenea ADN se numete ADN denaturat. Dac amestecul de monocatene se rcete treptat, are loc refacerea legturilor de hidrogen i restabilirea structurii bicatenare a ADN fenomen denumit renaturarea ADN.

3/31/2014

106

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

Temperatura de topire specific pentru denaturarea ADN poate constitui un indicator indirect grosier al compoziiei n baze azotate a ADN considerat. Astfel un ADN bogat n perechi A-T va prezenta o temperatur de denaturare mai mic fa de un ADN n care predomin perechile G-C. Cnd o soluie de ADN este supus unor temperaturi mai mari de 100C are loc ruperea legturilor fosfodiesterice cu ruperea coloanei fosfoglucidice i nu este posibil renaturarea.
Test de verificare
107

3/31/2014

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

Denaturarea ADN este nsoit de efectul hipercromic: creterea intensitii absorbiei UV de soluia ADN denaturat, urmare a expunerii catre exterior a bazelor azotate. Aceast demascare este realizat prin trecerea de la structura bicatenar la cea monocatenar Atentie!!! -n monocatene bazele azotate sunt expuse razelor UV acestea fiind cromofile i hidrofobe.
Test de verificare
108

3/31/2014

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

Renaturarea ADN este nsoit de efectul hipocrom: reducerea absorbiei UV. Dac denaturarea este iniiat la nivelul unor segmente ADN bogate n A=T, renaturarea este iniiat la nivelul unor segmente ADN bogate in GC, mai stabile dect A=T. Regiunile la nivelul crora se iniiaz renaturarea ADN se numesc puncte de nucleaie sau nuclee de renaturare, respectiv de reasociere.
Test de verificare

3/31/2014

109

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

La ce folosesc aceste cunotine?

Studiul relaiilor filogenetice dintre specii Speciile nrudite filogenetic au o secven de baze azotate (o informaie genetic) cu un grad nalt de similitudine sau de omologie i deci i temperaturi apropiate de denaturare a ADN, realiznd i o renaturare mai rapid a monocatenelor lor, atunci cnd sunt amestecate, fa de speciile mai ndeprtate filogenetic. Tehnologia ADN recombinant
Test de verificare
110

3/31/2014

2. 7. Denaturarea i renaturarea ADN

Procentul de renaturare ntre monocatene de ADN de la om i monocatene de ADN de la cimpanzeu este de 75% pe cnd cel dintre ADN uman i ADN de oarece este de numai 25%. n tehnologia ADN recombinant, hibridarea molecular ajut la stabilirea exact i rapid a transferului unor gene eucariote n celula bacterian prin folosirea a ceea ce s-a numit sonda radioactiv, care nu este altceva dect o monocaten ADN sau ARN marcat radioactiv i care este complementar segmentului genei eucariote transferate. Dac are loc reasocierea unei asemenea sonde radioactive cu un segment de ADN extras de la celula bacterian n care a fost clonat gena eucariot, nseamn c transferul acestei gene n celula bacterian a fost eficient, real.
111

3/31/2014

2.8. Excepii de existenta ADN dc

Sinsheimer (1959) prin utilizarea ca material biologic a bacteriofagului x174 a demosntrat prin utilizarea fosfodiesterazei de la E.coli c
ADN este monocatenar i circular raportul A/T i G/C este diferit de 1

Ulterior aceast caracteristic a fost descoperit i la ali bacteriofagi Virusuri la plante

3/31/2014

112

2.6.3. Acidul ribonucleic ARN

Riboza

Acid fosforic
ADENIN

GUANIN

Baze azotate Purine Pirimidine

CITOZIN

3/31/2014

URACIL

113

2.6.4. Aspecte comparative

3/31/2014

114

2.6.4. Aspecte comparative

3/31/2014

115

Nu-i aa c genetica

este super....
3/31/2014

116