Principiul tehnicilor imunochimice

Contra Gabriela Daniela Universitatea Babes-Bolyai, Cluj-Napoca Facultatea de Chimie si Inginerie chimica CATB, An IV

Imunologia studiaza functia de aparare a organismului uman si animal, care face parte din categoria functiilor de relatie si este esentiala pentru supravietuire. Imunochimia este o disciplina de granita ce apartine Imunologiei si Biochimiei, care studiaza functia imunitara sub aspect biochimic.

Antigenele - substante straine, care, consecutiv introducerii in organismul uman sau animal pe o cale parenterala (alta decat cea digestiva), declanseaza sinteza anticorpilor cu care se combina specific. Anticorpii imunoglobuline (Ig) care se sintetizeaza in organism dupa patrunderea unui antigen si au proprietatea de a se cupla specific cu antigenul inductor si de a-i anihila actiunea nociva.

 Structura Ig - 2 lanturi polipeptidice usoare 214 aminoacizi - 2 lanturi polipeptidice grele 430 aminoacizi - legate prin punti disulfurice structura flexibila in forma de Y

- cand este tratata enzimatic cu papaina => 3 fragmente

- 2 identice, au capacitatea sa lege antigene (Fab) - unul cristalizabil (Fc)

Fiecare lant polipeptidic este alcatuit din 2 regiuni distincte: regiunea constanta (C) corespunde jumatatii C-terminale a celor 4 catene polipeptidice. -asigura unitatea structurala si functionala a moleculei de Ig. regiunea variabila (V) cuprinde o secventa de circa 110 aa in jumatatea N-terminala a celor 4 catene polipeptidice. -formeaza situsul de combinare a moleculei de Ig, care confera specificitate de legare cu antigenul.

 Interactiuni antigen-anticorp -anticorpul va reactiona specific cu un antigen pentru a forma un complex Ag-Ac. -obtinerea anticorpilor se realizeaza prin injectarea unui antigen unei anumite specii de animal si recuperarea serului care contine anticorpii rezultati (antiser).
Antigen Antibody Antigen Antibody Complex

 Afinitate si aviditate
Afinitatea- forta de legare dintre un determinant antigenic si situsul complementar de legare al unui anticorp specific. Ab + Ag = AbAg ; K = [AbAg+*Ab][Ag]

Aviditatea- energia medie de legare a unui antigen multivalent cu anticorpii specifici si masoara forta rezultanta a afinitatii dintre epitopii multiplii ai unui antigen si paratopii complementari.

 RIA (Radioimunoanaliza) -tehnica de determinare cantitativa a unui numar mare de substante prezente in lichidele biologice in cantitate foarte mica. -dezvoltata de catre dr. Yalow si Berson. Metoda - este preparat un amestec format din: o cantitate cunoscuta de Ag* anticorpi impotriva acelui antigen Ag*- Ac

- apoi este adaugata o cantitate cunoscuta de Ag nemarcat, acesta concurand cu Ag* pentru un loc pe situsurile de legare ale Ac. - cu cat cantitatea de Ag nemarcat creste, acesta se leaga de Ac, inlocuind Ag*. - dupa incubare, Ag legat este separat de cel liber, fiind masurata radioactivitatea fiecaruia. - este trasata curba de calibrare.

- proba care trebuie testata (o proba din serul

pacientului cu concentratia necunoscuta de Ag) este facuta in paralel. - dupa determinarea raportului Ag legat/Ag liber, concentratia Ag poate fi citita din curba de calibrare. - in principiu, concentratia necunoscuta de Ag nemarcat din proba este obtinuta comparand efectul inhibitor al acestuia asupra legarii Ag* de un Ac specific, cu efectul inhibitor al unor standarde cunoscute.

 Tehnica ELISA (tehnica imunoenzimatica) - metoda de detectare a unor molecule cu ajutorul complexelor Ag-Ac conjugate cu o enzima. - Ag sau Ac este adsorbit pe o suprafata solida, sticla sau material plastic. Placa pentru ELISA - 96 godeuri - plastic pe care adera usor proteinele

 Tipuri de ELISA: - competitiva - necompetitiva sandwich - indirecta

ELISA competitiva - Ac adsorbit pe faza solida - este adaugat Ag-E si Ag - Ag si Ag-E concureaza pt un loc pe situsurile de legare ale Ac - incubare - spalare - se adauga substratul enzimei => reactie de culoare - coloratie maxima = nu exista Ag in proba
Ag creste Ag-E scade

 ELISA necompetitiva sandwich - Ac adsorbit - este adaugata proba continand Ag nemarcat - incubare - este adaugat Ac-E - spalare - => Ag asezat intre Ac-E si Ac nemarcat - culoarea obtinuta in urma reactiei enzimatice = direct proportionala cu cantitatea de Ag

 ELISA indirecta - Ag din proba este adsorbit pe faza solida - este adaugat Ac primar nemarcat=>incubare=>spalare - este adaugat Ac secundar marcat enzimatic=>incubare=>spalare - se adauga substratul enzimei=>reactie de culoare - intensitatea culorii este proportionala cu cantitatea de Ag

 Tehnica imunofluorescentei

- permite vizualizarea unei anumite proteine sau

unui anumit antigen din celule sau sectiuni din tesuturi prin legarea de anticorpul specific a unei substante fluorescente. - izotiocianatul de fluoresceina (FITC), lisamina rodamina B (RB 200) - substanta fluorescenta este detectata la microscop.

 Bibliografie Carl A. Burtis, Edward R. Ashwood, David E. Bruns, Fundamentals of Clinical Chemistry, 6th edition, Saunders/Elsevier, 2008 http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPa ges/R/Radioimmunoassay.html http://en.wikipedia.org/wiki/Immunofluorescence http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA http://ebooks.unibuc.ro/biologie/mihaiescu/9.htm