Universidad de Oriente Ncleo de Sucre Escuela de Ciencias Departamento de Biologa Ctedra: Bioqumica General

PROPIEDADES IONICAS DE LOS AMINOACIDOS. EXTRACCIN, CUANTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE PROTEINAS, GLUCGENO, ADN Y ARN EN DIVERSOS TEJIDOS DE POLLO Gallus gallus.

Bachilleres: Bermdez, Mariana C.I: 19.979.803 Cedeo, Roberkis C.I: 19.707.784 Cova, Jennifer C.I: 19.893.583 Espinoza, Rainer C.I: 19.537.148 Vicent, Luis C.I: 18.416.955 Reyes, Carmen C.I: 18.417.004 Salazar, Vanessa C.I: 16.997.605 Rengel, Emily C.I: 18.903.138 Veneris, Vicmaris C.I:12.741.757 Sec: 02 Prof. Rosa Martnez.

Cuman, Marzo 2012

INTRODUCCIN

Todos los seres vivos estamos formados por 20 elementos de la tabla peridica, los cuales son considerados bioelementos, estos en conjunto forman molculas entre las que encontramos el agua, lpidos, protenas, y los cidos nuclecos, los cuales van a formar las biomolculas que no son ms que las molculas que forman parte de los seres vivos. A primera vista podra pensarse en las protenas, estos son polmeros lineales de aminocidos unidos entre s por medio de enlaces peptdicos. Sin embargo, la secuencia lineal de aminocidos puede adoptar mltiples conformaciones en el espacio. La estructura primaria viene determinada por la secuencia de aminocidos en la cadena proteica, es decir, el nmero de aminocidos presentes y el orden en que estn enlazados. La conformacin espacial de una protena se analiza en trminos de estructura secundaria y estructura terciaria. La estructura secundaria es el plegamiento que la estructura primaria adopta gracias a la formacin de puentes de hidrgeno entre los tomos que forman el enlace peptidicos. La estructura terciaria, en cambio, se refiere a la disposicin tridimensional de todos los tomos que componen la protena. (Enciclopedia de la vida, 2002)

Estas se encuentran en diversos organismos que son consumidos por el hombre, entre estos destacan las aves. Segn Clements,(2007), Gallus es un gnero de aves

galliformes de la familia Phasianidae que incluye la especie domstica Gallus gallus o gallo rojo. Son aves de mediano tamao con la coloracin del plumaje del macho iridiscente. Es difcil verlas en la vegetacin densa donde ellos habitan debido a su coloracin crptica que las confunde con el entorno. Son comedores de semillas, insectos, particularmente los jvenes. En nuestro continente este tipo aves es criado en corrales y fincas, que luego las llevan a lugares especializados en su comercializacin. Esta ave es fuente de mltiples protenas, carbohidratos y un sin fin e nutrientes esenciales para el organismo humano. Dentro del este conseguimos por ejemplo de diversas cantidades de glucgeno, ADN y ARN, que son de muchas maneras en el anlisis bioqumico de estas estructuras.

La base del anlisis qumico es la bioqumica, esta se puede definir como el estudio de las bases moleculares de la vida, que nos va a permitir estudiar las estructuras qumicas de los componentes de la vida, mediante procedimientos experimentales que nos ayudan a obtener resultados basados en las teoras que rigen esta ciencia. Las protenas son bioquimoleculas orgnicas ms abundantes en la clulas, que contienen una o varias cadenas polipeptidicas, cada una de las cuales posee ms de cien aminocidos alfa, estas pueden ser simples, conjugadas, globulares y fibrosas las cuales cada una desempean un papel estructural e independiente en el organismo, (Briceo, 1999). Estas biomoleculas son extremadamente complejas, con el fin de mantener la multiplicidad de sus funciones, cada una tiene una estructura funcional, lgica y propia, as como determinada caractersticas comunes con todas las dems protenas, las estructuras que pueden parecer exclusivamente complejas se comprenden fcilmente cuando se entiende el modo en el que estn dictadas, su forma por sus funciones. Para la determinacin de protenas existen mtodos de cuantificacin y extraccin, que nos van permitir saber en qu concentraciones se encuentra en distintos organismos, los ms usuales son: Biuret basado en la formacin de complejos Cu++-pptidos, utilizado frecuentemente en el anlisis qumico, est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. La intensidad de la coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. (Mathews, y Van Holde, 2004).

Por otra parte se debe destacar otro tipo de polisacrido til en el anlisis bioqumico como lo es el glucgeno. Este es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hgado y en el msculo representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso hmedo, respectivamente. Las propiedades fsicas y qumicas de muchos polisacridos neutros difieren lo bastante de las de otras biomolculas, para permitir su fcil aislamiento. El glucgeno se puede liberar del hgado por calentamiento con una base fuerte, hasta la destruccin total del tejido. Al aadir cido tricloroactico al homogeneizado anterior, precipitan numerosas sustancias de peso

molecular elevado, como las protenas y los cidos nuclecos, en tanto que el glucgeno contina disuelto. El glucgeno puede separarse de los monosacridos y otros compuestos hidrosolubles por precipitacin con alcohol, porque los polisacridos son mucho menos solubles en alcohol acuoso que los monosacridos. La determinacin del grado de pureza de la preparacin obtenida se puede realizar mediante el tratamiento con antrona y comparando con una solucin estndar de glucgeno. (Dapena, Padilla, Martnez, Brcena y Garca, (s/f)).

Por consiguiente Mathews y Van Holde, 2004,

establece que el glucgeno

constituye la principal fuente de energa para la contraccin del musculo esqueltico. Dado que el hgado obtiene la mayor parte de su energa metablica de la oxidacin de los cidos grasos y el glucgeno heptico, el cual tiene una funcin muy distinta como fuente de glucosa sangunea que se transporta a otros tejidos para su catabolismo. Este acta fundamentalmente como regulador de las contracciones sanguneas de glucosa, en parte mediante el control de su glucgeno sintetasa y fosforilasa. En el hgado la conversin de glucosa almacenada en forma de glucgeno a glucosa libre en sangre, est regulada por la hormona glucagn y adrenalina. En las clulas este se almacena dentro de vacuolas en el citoplasma de las clulas que lo utilizan para la gluclisis. Estas vacuolas contienen las enzimas necesarias para la hidrlisis de glucgeno a glucosa.

Por otra parte los cidos nucledos, son molculas formadas por la unin de nucletidos, unidos por fuentes fosfodieste entre el grupo 3 hidroxilos y el 5 hidroxilo del siguiente de los cuales los principales son ADN y el ARN. Desatancado el ADN (acido desoxirribonucleicos) contiene solamente desoxirribonucleotidos y desempean el papel de almacenar la informacin gentica, la mayor parte de ellos poseen pesos moleculares extremadamente elevados. El ARN (acido ribonucleico), contiene tres tipos principales de ARN, uno que contiene la secuencia complementaria de los genes en el ADN, y consecuentemente la informacin para la sntesis de protenas, considerado ARN mensajero, otro transporta los aminocidos de forma activa para la formacin de los enlaces peptidicos en los ribosomas durante la sntesis de protenas, llamado ARN de transferencia,

y el ARN ribosmico que es el principal componente de los ribosomas y es el ms abundante entre los tres tipos. (Mathews y Van Holde, 2004).

El metabolismo energtico en las aves, est relacionado con la reserva de energa para poder realizar posteriormente diversas funciones dentro del ecosistema, al igual que esta energa puede ser obtenida de diversas formas, dependiendo del tipo de animal.

De igual forma se tiene entendido que los organismos toman del alimento ingerido la energa necesaria para la reproduccin y la almacenan en rganos y/o tejidos de reserva (glndula digestiva, msculo aductor y manto). Una vez que el organismo canaliza estas reservas, principalmente en forma de carbohidratos, lpidos y protenas, puede suceder lo siguiente: 1) utilizacin inmediata, 2) almacenamiento en rganos especializados y/o 3) utilizacin y almacenamiento, segn las necesidades. En lneas generales, la movilizacin de reservas entre los tejidos somticos, vara durante el crecimiento y de acuerdo a los requerimientos reproductivos. Por lo tanto evaluar los cambios en la composicin bioqumica en diferentes tejidos permite conocer como es la transferencia de energa que se produce dentro del organismo en un momento determinado. (Gabbott, 1976; 1983).

Pero no solo protenas, glucgeno, AND y ARN, se encuentra en nuestro organismo, tambin se observa una serie de aminocidos que son importantes para el buen funcionamiento de nuestro organismo, entre estos destacan el HCL y el NaOH, los cuales tiene propiedades inicas, que varan dependiendo las reacciones de acido-base. En el caso del HCL es uno de los principales componentes de los jugos gstricos los cuales son vitales en el proceso de digestin, cumpliendo la funcin de digerir lo mas posibles los alimentos, y el NaOH acta como base, la cual es muy corrosiva, y le va a ser frente a los cambios de ph del HCL, durante la evaluacin de sus propiedades inicas. (S. Mahan, K. Escott 1996)

OBJETIVOS Determinar las propiedades inicas de los aminocidos. Aplicar el mtodo de valoracin de Biuret. Construir una recta de calibracin con la solucin de albumina de suero bovino para cada uno de los mtodos de colormetro de biuret. Aislar el glucgeno del tejido del hgado de Gallus gallus.

Cuantificar por el reactivo de Antrona los niveles de glucgeno en el tejido (hgado de Gallus gallus).

Aislar ADN a partir del tejido del hgado de Gallus gallus.

Aislar ARN a partir del tejido del hgado de un Gallus gallus.

Determinar colorimtricamente la concentracin de ADN y ARN a travs de la reaccin de la difeniamina y orcinol.

MATERIALES

Determinacin de la solubilidad de los diferentes aminocidos Aminocidos: Glicina, histidina y lisina (100 mmol/l) Acido glutaminico (50 mmol/l) HCl (100 mmol/l) Naoh (100 mmol/l) Etanol Cloroformo Buretas pH-metro Agitadores Tubos de ensayo Cuantificacin de protenas Hgado de pollo (tejido) Albumina de suero Bovino(10mg/ml) Biuret Agua destilada Sol salina (ml) Balanza analtica Beaker 50ml Homogenizador Pipetas Gradillas Espectrofotmetro Centrifuga Tubos de ensayo

Extraccin y cuantificacin de glucgeno Agua destilada Sal salina(ml) Balanza analtica Beaker 50ml Homogenizador Pipetas Gradillas Espectrofotmetro Centrifuga Bao de Mara NaOH Tubos de ensayo Glucosa Reactivo de Antrona: 2g/1000ml de H2SO4 Aislamiento de ADN y ARN ADN estndar (0,2 mg/ml). ARN estndar (0,2 mg/ml). Buffer salino (NaCL 0,15mol/l; Citrato de Sodio o,o15 mol/l, pH7). Reactivo de difenilamina (1g de difenilamina/100 ml de Acido aceticoglacial, 2, 5 ml de acido sulfrico concentrado). Reactivo de orcinol: 0,1 gr de FeCl3.6h20 en 100 ml de HCl concentrado y 3,5 ml de orcinol en alcohol al 6 % p/v. Bao de Maria. Sal salina (ml). Tubos de ensayo y gradilla Beaker 50ml Homogenizador Gradillas Espectrofotmetro

METODOLOGA

Determinacin de la solubilidad de los diferentes aminocidos 1. Se tomo 50 ml de un aminoacido problema en un vaso precipitado y se le determino su pH. 2. Se titul de 0,5- 0,5 ml (1ml-1ml), aadiendo 0.5ml por vez y observando los cambios de pH hasta aproximadamente 1.5. 3. Se construyo las curvas de titulacion en papel milimetrado colocando en el eje de las Y cambio de pH en funcion de mEq de acido o base. 4. Se sealo en la grafica las zonas posibles de pK y comparamos con los valores teoricos, para el calculo del el punto isiselectrico.

Cuantificacin de protenas

Para la determinacin de protenas se utilizo el mtodo de Biuret

1.

Se realizo una solucin con la albumina de suero bovino (10mg/ml). Para esta se peso 1g de tejido, se homogenizo en 9ml de solucin salina, y luego se centrifugo a una velocidad mxima por 5min, para tomar el sobrenadante que fue el suero que utilizamos.

2. Se colocaron en una gradilla 8 tubos de ensayos limpios y secos. 3. Los tubos de ensayos fueron numerados del uno al seis permanente as como tambin los muestras problemas con un rotulador

4. Seguidamente con las pipetas se adiciono cada uno de los volmenes de la disolucin patrn de albumina de suero bovino al 10mg/ml (BSA) y de agua destilada, posteriormente se agregaron los reactivos en el siguiente orden: albumina, agua destilada, solucin alcalina o biuret. 5. Cada uno de los tubos se agito suavemente y se dejaron reposar durante un periodo mximo de 20 minutos, luego se procedi a medir en el espectrofotmetro en la longitud de onda de 540 nm ajustando el cero de absorbancia con l con la solucin blanco exenta de protenas (tubo 1).

6. A continuacin se midieron las absorbancia de los tubos 2 a 6, luego se procedi a a medir la concentracin de la muestra problema (tubo 7).

Extraccin y cuantificacin de glucgeno 1. Se tomo una muestra del tejido del hgado de un organismo, esta fue pesada, fragmentada y homogeneizada en una solucin salina en proporcin (1 g: 10ml de agua), se procedi a tomar un 1 ml del homogeneizado y se paso rpidamente en un tubo de ensayo con 2ml de KOH al 60%. 2. Se calentaron las muestran en un bao de agua hirviendo por un periodo de tiempo de 20 minutos mientras se cumpla la digestin, la cual fue acelerada agitando el matraz. 3. Luego fue aadido 1ml de sulfato de sodio y 4 ml de alcohol etlico al 95%,debido a que el mtodo presenta una alta tasa de interferencia se hizo necesario realizar un una precipitacin con acido tricloroactico (TCA). 4. Para acelerar la precipitacin de glucgeno la muestra fue sometida a ebullicin, teniendo cuidado de no dejar botar la muestra. 5. Una vez terminada la ebullicin de la muestra, esta fue sometida a centrifugacin durante 15 minutos a 7000rpm. Se descarto el sobrenadante y se eliminaron con esto las protenas que contaminan la muestra. 6. Se dejo enfriar las muestras y se procedi a realizar las lecturas de absorbancia en el espectrofotmetro u una longitud de onda de 620nm.

Aislamiento de ADN

El proceso de aislamiento de ADN consta de los siguientes pasos. 1. Se picaron nuestras muy pequeas de tejido de un rgano animal, 1,0g de tejido y fueron homogeneizado en 10ml de buffer salino frio durante un tiempo de 1 minuto aproximadamente, se centrifugo la suspensin a 5000rpm por 5 minutos. 2. Una vez terminado el ciclo de centrifugado se descarto el sobrenadante y el sedimento fue re-suspendido en NaCL 2mol/L hasta obtener un volumen total de 2ml. 3. El precipitado fue descartado y el sobrenadante colocado en un tubo de ensayo con 2ml de agua destilada

4. Con la aparicin del precipitado fibroso se retira el exceso de agua con un papel de filtro. 5. Se disolvi la desoxirribonuproteina en 2ml de NaCl 2mol/l, luego se agreg un volumen igual de mezcla de cloroformo: alcohol amlico y se homogenizo por 30seg. 6. Se centrifug la emulsion a 5000g por 15 minutos, y se recogio la capa superior acuosa. Esta se hizo por succion con mucho cuidado para no mezclar la prteina que estaba presente en la interfase. 7. Se aadio el doble de 2ml de alcohol frio para precipitar las fibras de ADN. 8. Se dej evaporar el eter remanente colocando el ADN en un vidrio de reloj por 10 minutos.

9. Se reservo para ser luego utilizado.

Aislamiento de ARN 1. Se suspendi 10g de tejido en 40ml de agua a 37o C y se espero 15 minutos. 2. Se agrego 50ml de solucin concentrada de fenol. 3. Se agito mecnicamente la suspensin durante 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Luego se centrifugo en frio a 3000g durante 15 minutos. 5. Con una pipeta pasteur se removi cuidadosamente la capa superior acuosa y se centrifugo a 10.000g por 5 minutos para separar la protena desnaturalizada.

6. Se agreg acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentracin final de 20g/l y precipito el ARN aadiendo 2 vol de etanol y dejndolo enfriar en hielo por una hora.

7. Se recogi el precipitado por centrifugacion a 2000g por 5 minutos. 8. Se lavo el ADN con una mezcla de etanol-agua (3:1), luego con etanol y finalmente con eter. Se dejo secar y se peso.

RESULTADOS

Propiedades inicas de los aminocidos

TABLA N 01. Titulacin de los aminocidos en solucin de NaOH diluida. pH (NaOH) 1ml = 8,64 2ml= 8,83 3ml= 8,56 4ml= 8,72 5ml= 8,82 6ml= 8,96 7ml= 9,04 8ml= 9,14 9ml= 9,23 10ml= 9,30 11ml= 9,35 12ml= 9,43 13ml= 9,46 14ml= 9,52 15ml= 9,58 16ml= 9,64 17ml= 9,70 18ml= 9,73 19ml= 9,79 20ml= 9,82 21ml= 9,86 22ml= 9,87 23ml= 9,92 24ml= 9,94 25ml= 10,02 26ml= 10,70 27ml= 10,11 28ml= 10,11 29ml= 10,17 30ml= 10,22 31ml= 10,27 32ml= 10,27 33ml= 10,34 34ml= 10,39 35ml= 10,42 36ml= 10,49 37ml= 10,51 38ml= 10,58 39ml= 10,57 40ml= 10,72 41ml= 10,78 42ml= 10,83 43ml= 10,88 44ml= 10,88 45ml= 11,06 46ml= 11,11 47ml= 11,26 48ml= 11, 26 49ml= 11,41 50ml= 11,53 51ml= 11,61 52ml= 11,69 53ml= 11,75 54ml= 11,85 55ml= 11,91 56ml= 11,95 57ml= 11,96 58ml= 11,99 59ml= 11,99 60ml=12,07

TABLA N 02. Titulacin de los aminocidos en solucin de HCl diluida. pH (NaOH) 1ml= 3,42 2ml= 2,80 3ml= 2,24 4ml= 2,24 5ml= 2,06 6ml= 2,03 7ml= 1,99 8ml= 1,94 9ml= 1,88 10ml= 1,84 11ml= 1,78 12ml= 1,74 13ml= 1,72 14ml= 1,68 15ml= 1,64 16ml= 1,62 17ml= 1,57 18ml= 1,55 19ml= 1,52 20ml= 1,50

Cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret

TABLA N 01. Determinacin de la solubilidad de los diferentes aminocidos Albmina Agua Biuret 0 2 3 0,2 1,8 3 0,4 1,6 3 0,6 1,4 3 0,8 1,2 3 1,0 1,0 3 0,5 1,5 3 0,5 1,5 3

TABLA N 02. Lectura del espectrofotmetro de las diferentes concentraciones de aminocidos Concentraciones Tubo 01 Muestra en blanco Tubo 02 Tubo 03 Tubo 04 Tubo 05 Tubo 06 Tubo 07 Muestra problema 65 53 31 27 25 19 0,1870 0,2757 0,5086 0,5686 0,6020 0,7212 Transmitancia Absorbancia -

Extraccin y cuantificacin de glucgeno.

TABLA N 05. Curva de calibracin del glucgeno. Glucosa Tubos 01 02 03 04 05 06 07 10mg/100ml 0 2 4 6 08 10 Agua destilada (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0,5 Antrona (ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 Transmitancia Absorbancia

0 34 9 3 1 0 0

0,4685 1,0457 1,5228 2 -

Nota: los mg/ml fueron transformados por la relacin 10mg --- 1ml

Extraccin y cuantificacin de ADN y ARN

Tabla N 01. Resultados curva patrn del aislamiento de ADN en un tejido de hgado de pollo.

Patrn 1 2 3

Tubos 4 5 6

Estndar 0,2 mg/ml

0,25

0,50

Buffer

1,75

1,50

Difenilamina

Transmitancia (595nm)

54

14

__

Absorbancia

1,73

1,15

__

Tabla N 02. Resultados curva patrn del aislamiento de ARN en un tejido de hgado de pollo.

Patrn 1 2 3

Tubos 4 5 6

Estndar 0,2 mg/ml

0,25

0,50

Buffer

1,75

1,50

Orcinol

Transmitancia (595nm)

57

34

12

Absorbancia

1,73

1,53

0,90

1,08

Grafica 1: curva patrn de las concentraciones obtenidas en la Cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret

Valores Y
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 Valores Y Linear (Valores Y)

Grafica 2: curva patrn de las concentraciones obtenidas en la extraccin y cuantificacin de glucgeno.

Valores Y
2.5

1.5 Valores Y 1 Linear (Valores Y)

0.5

0 0 2 4 6 8 10 12

Grafica 3: curva patrn de las concentraciones obtenidas en el aislamiento de ADN en un tejido de hgado de pollo.

Valores Y
2

1.5

0.5

0 0 -0.5 5 10 15 20 25

Grafica 4: curva patrn de las concentraciones obtenidas en el aislamiento de ARN en el tejido de hgado de pollo.

Valores Y
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20 25

CALCULOS Y TRANSFORMACIONES DE LA PENDIENTE:

y= mx + b

m=

Protenas y glucgeno

Transformaciones: Tubo N 1: 0 muestra patrn

Tubo N 2 10mg X 1ml X= 0,2mlx10mg/1ml= 2 mg

0,2ml Tubo N 3

10mg X

1ml

X= 0,4mlx10mg/1ml= 4 mg

0,4ml

Tubo N 4 10mg X 1ml X= 0,6mlx10mg/1ml= 6 mg

0,6ml

Tubo N 5 10mg X 1ml X= 0,8mlx10mg/1ml= 8 mg

0,8ml

 Tubo N 6 10mg X 1ml X= 1mlx10mg/1ml= 10 mg

1 ml Tubo N 7 y 8

10mg X

1ml

X= 0,5mlx10mg/1ml= 5mg

0,5ml

ADN: Datos: X1= 2,5 mg X2= 5 mg y1= 1,73 y2= 1,15

Clculos: y= mx + b m=

m=

= 0,232

y= 0,232 + 0 = 0,232

Transformaciones: Tubo N 1: 0 muestra patrn

Tubo N 2 10mg X 1ml X= 0,25mlx10mg/1ml= 2,5 mg

0,25ml

Tubo N 3:

10mg X

1ml 0,50ml

X= 0,50mlx10mg/1ml= 5 mg

Tubo N 4: 10mg X 1ml 1ml X= 1mlx10mg/1ml= 10 mg

Tubo N 5: No se realiz.

Tubo N 6: 10mg X 1ml 1ml X= 1mlx10mg/1ml= 10 mg

ARN: Datos: X1= 2,5 mg X2= 5 mg y1= 1,76 y2= 1,53

Clculos: y= mx + b m=

m=

= 0,092

y= 0,092 + 0 = 0,092

Transformaciones: Tubo N 1: 0 muestra patrn

 Tubo N 2 10mg X 1ml X= 0,25mlx10mg/1ml= 2,5 mg

0,25ml

Tubo N 3: 10mg X 1ml 0,50ml X= 0,50mlx10mg/1ml= 5 mg

Tubo N 4: 10mg X 1ml 1ml X= 1mlx10mg/1ml= 10 mg

Tubo N 5: 10mg X 1ml 2ml X= 2mlx10mg/1ml= 20 mg

Tubo N 6: 10mg X 1ml 2ml X= 2mlx10mg/1ml= 20 mg

DISCUSIN

Las propiedades inicas de los aminocidos radican de su comportamiento acido-bsico, en esa curva se puede observar que al agregar NaOH el pH cambia rpidamente al principio y luego se estabiliza de tal manera que casi no vara al agregar ms NaOH (zona plana). Despus de esta regin de estabilizacin ocurre un cambio brusco de pH por adicin de ms NaOH. La regin "estable" es una sigmoidea, cuyo centro se encuentra a un pH correspondiente al valor de pKa. Una molcula ionizable se caracterizar siempre por un pKa y tambin por un rango de pH (pKa -1< pH < pKa + 1) en el cual toda variacin de pH ser amortiguada. (Harris, 2004). En el caso de esta prctica no se obtuvieron los

resultados que esperbamos por diversos factores, entre estos la falta de aminocidos, ya que trabajamos con 15ml en vez de 50ml de HCL, adems el pH-metro presento errores desde un comienzo afectando directamente los resultados de esta experiencia. (Harris, 2004)

En la cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret, el reactivo de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, cualitativamente se observo un cambio de azul a violeta notablemente a simple vista principalmente en los tubos 4, 5 y 6 correspondiente a la albumina lo que se corrobora en ya que a mayor absorbancia mayor concentracin de protenas sin embargo tanto cualitativa como cuantitativamente la mayor absorbancia y por ende mayor concentracin lo presenta la muestra problema en el tubo 7 como se indica en la tabla 2 de esta experiencia(tejido de hgado de pollo). Esta grafica nos muestra cmo va en aumento la concentracin de glucgeno a medida que se acerca a la muestra problema la cual es el tubo 6 a pesar que la recta no corta dos puntos, si podemos notar cmo pasa muy pero muy cerca de dos de ellos, donde est la mayor concentracin de este, confirmando lo dicho tericamente por Dapena, Padilla, Martnez, Brcena y Garca, (s/f), que el

glucgeno es la mayor fuente de energa en el organismo no solo en animales si no tambin en los humanos.

Durante la experiencia de extraccin y cuantificacin de glucgeno, En los valores se tena que observar que cuando hay mayor absorbancia hay mayor concentracin de carbohidrato,

esto se debe que cuando la muestra reacciona con la solucin de antrona es directamente proporcional a la concentracin de carbohidratos presentes en la muestra, por lo tanto la muestra se torna de un color que a medida que se oscurece se puede notar a simple a vista que hay mayor concentracin de carbohidrato, pero en este caso la muestra no fue leda por el espectrofotmetro, ya que se torno demasiado oscura y no pasaban los rayos de luz a travs de dicha muestra. En la grafica podemos observar una curva de calibracin casi perfecta, donde en los puntos altos se encuentra la mayor cantidad de protenas de la muestra, y por lo menos uno de estos puntos es cortado por la pendiente, dando a entender que en este tejido es alta la concentracin de las mismas, teniendo en cuenta que el pollo, en especial su hgado es uno de los alimentos ricos en protena de nuestra dieta.

En la extraccin y cuantificacin de ARN, la absorbancia de la muestra problema que es la del tubo 6 no es representativa con respecto a las dems soluciones, esto quiere decir que no se encontraba una gran concentracin de ARN en la muestra del tejido, adems que en el transcurso de la experiencia se presentaron muchos inconvenientes dentro del laboratorio, como falta de materiales y entre uno y otro error que influyeron en los resultados obtenidos. En esta grafica se observa claramente los errores de la experiencia, ya que en las muestras 5 y 6 se muestra una lnea recta la cual no debera existir en esta curva patrn, la cual tendra que ser ascendente en estos puntos y la recta no corta a ninguno de estos.

En cambio en la extraccin y cuantificacin de ADN, no se conto la la solucin estndar necesaria para poder terminar el ejercicio, por lo cual en el tubo nmero 5 no hubo lectura de la Transmitancia y el la muestra problema se ley con lo poco que quedaba, afectando en el resultado final de nuestra experiencia. Esto tambin se refleja en la grafica donde la muestra se vuelve constante despus de los valores del tubo 4, y no se muestra como tal la curva de calibracin adecuada para la lectura del ADN, ya que esta debera ser ascendente con respecto a las dems muestras en los puntos 5 y 6, y la recta debera cortar por lo menos a dos puntos en esta grafica.

CONCLUSIN En la determinacin de las propiedades inicas de los aminocidos, no se obtuvieron los resultados deseados debido a fallas con el pH-Metro y la falta de aminocidos dentro del laboratorio, ya que se trabajo con la mitad de la cantidad necesaria para llevar a cabo con xito la experiencia. En la aplicacin el mtodo de valoracin de Biuret, se obtuvo la coloracion necesaria para la identificacion de proteinas pero no era la mas adecuada para la lectura en el espectofotometro, debido a que resulto muy oscura a la hora de ser leida por el espectofotometro. En la elaboracin de la recta de calibracin con la solucin de albumina de suero bovino para cada uno de los mtodos de colormetro de biuret, se obtuvo a pesar de los errores una muy buena recta de calibracion que nos permitio reflejar los datos obtenidos en la practica. Al aislar el glucgeno del tejido del hgado de Gallus gallus, se conto con los materiales deseados, lo cual nos permiti obtener los resultados un poco ms prximos a la realidad, logrando confirmar el fundamento terico de esta actividad. En el momento de cuantificar por el reactivo de Antrona los niveles de glucgeno en el tejido (hgado de Gallus gallus), se pudo notar las altas concentraciones de este polisacrido, vital en el organismo de esta especie. A la hora de aislar ADN y ARN a partir del tejido del hgado de Gallus gallus, no se pudo obtener los resultados deseados debido a la falta de material en el laboratorio, esta prctica se realizo solo como piloto para las dems secciones, ya que no se contaba con los reactivos necesarios para su realizacin. La determinacin colorimtrica de las concentracines de ADN y ARN a travs de la reaccin de la difeniamina y orcinol, no se observo adecuadamente por la falta de reactivos a la hora de aislar estas estructuras del tejido.

BIBLIOGRAFA

Clements, J. F. 2007. The Clements Checklist of Birds of the World. 6th Edition. Cornell University Press. Downloadable from Cornell Lab of Ornithology. Enciclopedia de la Vida. (2002). Milenium. Crculo de lectores. Harris, D. (2004). Anlisis qumico cuantitativo. Segunda edicin. Editorial Reverte. Barcelona, Espaa. Mahan, S y Escott, K. (1996). Nutricin y Dietoterapia de Krause. Mathews, C y Van Holde, K (2004). BIOQUMICA. Editorial Person. 2da edicin. Madrid1330 p.p. Murray, R; Mayes, P; Granner, D y Rodwell, V. (2001). Bioqumica de Harper. 15a edicin.

ANEXOS

Fig.1 Cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret.

Fig.2 identificacin de la protena mediante Biuret.

Fig.3 Extraccin y cuantificacin de glucgeno.

Fig.4 Cambio de coloracin al someterse al calor la muestra de glucgeno.