El Islote Pancretico en el Desarrollo de y Tratamiento la Diabetes Lesin y Supervivencia las Clulas ?

de Pancreticas

CAPTULO 5
Amilina y Toxicidad Beta Pancretica

AUTORES

Anna Novials Sard* Slvia Casas Fontdevila**

*Endocrinloga. Investigadora bsica. Fundaci Sard Farriol **Investigadora bsica. Fundaci Sard Farriol

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1. Amiloide pancretico
Amiloidosis engloba un grupo de entidades clnicas caracterizadas por el depsito extracelular de protenas de estructura fibrilar en rganos y tejidos. Algunas formas de amiloidosis fueron consideradas como un fenmeno inespecfico asociado al proceso de envejecimiento. No obstante, el aumento de la longevidad y la mejor definicin clnica de las enfermedades crnicas han demostrado que el depsito de amiloide puede ser especfico para determinadas enfermedades, como son las placas de amiloide en el tejido nervioso de la enfermedad de Alzehimer o el amiloide pancretico en la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). El trmino amiloide fue introducido por Virchow en 1853, basndose en las propiedades tintoriales de los depsitos amorfos en las secciones histolgicas: los rganos infiltrados adquiran coloracin negruzca al ser tratados con yodo, de forma anloga al almidn (del griego amylos, almidn). A pesar que cada tipo de amiloidosis se caracteriza por la agregacin y deposicin de una protena fibrilar especfica, los depsitos de sustancia amiloide comparten caractersticas histoqumicas y una morfologa estructural parecida. En primer lugar, durante el proceso de formacin, aparecen oligomeros solubles del componente proteico, los cuales pasan a adoptar una estructura secundaria en conformacin beta, lo que significa que las cadenas polipeptdicas estn dispuestas en lminas plegadas, unidas transversalmente mediante enlaces de hidogeno intercatenarios. La presencia de una estructura cuaternaria se muestra con un aspecto tpico al microscopio electrnico, en la que la sustancia amiloide est constituida por agregados fibrilares rgidos, lineares no ramificados, de 7-10 nm de dimetro y de longitud variable. Todos los depsitos de amiloide, independientemente de la protena especfica formadora de fibras, contienen protenas comunes, como la glucoprotena denominada SAP (serum amyloid P component), los componentes del complemento C1q y C3, la apoprotena E y los proteoglicanos del tipo heparn sulfato. La presencia de depsitos de sustancia amiloide en los islotes pancreticos es una caracterstica fisiopatolgica en la diabetes mellitus tipo 2, que se ha descrito en mas del 90% de las necropsias de los pacientes afectos de dicha enfermedad. Estos depsitos fueros originalmente descritos por Opie en 1900, pero debido a su elevada insolubilidad que dificultaba el anlisis de los compuestos qumicos, se pens errneamente que consistan en depsitos de insulina. Fue en 1986 cuando Westermark et al. (1) aislaron el principal componente proteico a partir de un insu80

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linoma pancretico, siendo purificado y secuenciado parcialmente. En 1987, Cooper et al. (2) identificaron un pptido idntico en extractos de tejido pancretico rico en amiloide procedente de pacientes diabticos. Se trataba de una protena de 37 aminocidos, sintetizada y secretada por las clulas beta pancreticas, llamada amilina o IAPP (islet amyloid polypeptide).

2. Amilina: sntesis, secrecin y funciones biolgicas

La amilina presenta homologa estructural del 43 y 46%, respectivamente, con los neuropptidos CALCA y CALCB (calcitotnin gene-related polypeptides), sintetizados por las clulas C de la glndula tiroides. Los tres pptidos tienen longitud idntica, residuos de cistena en la posicin 2 y 7, y presentan dos modificaciones postraduccionales homlogas (amidacin del residuo carboxiterminal y un puente disulfuro intramolecular). Ms del 80% de la secuencia de la amilina presenta un alto grado de conservacin entre diferentes especies de mamferos, lo que sugiere puede tener una significativa funcin biolgica. La amilina es sintetizada en la clula beta a partir de un precursor proteico de 89 aminocidos, la preproamilina. En el retculo endoplasmtico se realiza la escisin proteoltica de la secuencia de 22 aminocidos del pptido seal, liberndose la proamilina de 67 aminocidos. Las modificacioes postraduccionales para formar la amilina madura incluyen perdida de los propptidos aminoterminal (11 aminocidos) y carboxiterminal (19 aminocidos) por enzimas proteasas convertasas (NEC2 y NEC1/3) responsables tambin del procesamiento de la proinsulina. En el extremo carboxiterminal, la seal dibsica est procedida de una glicina, lo que permite la amidacin de la tirosina en la posicin 37 de la amilina madura. Modificaciones adicionales incluyen la formacin de un puente disulfuro entre los residuos 2 y 7 de cistena. La amilina se localiza juntamente con la insulina en los grnulos secretores de las clulas beta pancreticas. Existen evidencias en humanos de que se secreta juntamente con la insulina en condiciones basales y en respuesta tanto a la glucosa como a diferentes estmulos secretagogos. Experimentos in vitro con islotes humanos aislados han demostrado que la regulacin del gen de amilina depende de las concentraciones de glucosa y de las seales derivadas de su metabolismo de una forma similar al gen
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de la insulina (3,4). En la mayora de condiciones, los cambios de secrecin de la amilina se producen de forma paralela a los cambios en la secrecin de insulina, constituyendo aproximadamente una relacin equimolar entre 1/20 y 1/50. Entre sus acciones biolgicas para algunas de las cuales se han descrito receptores especficos, destaca la inhibicin de la secrecin de glucagon, el estmulo sobre el eje renina-angiotensina, el retraso del vaciamiento gstrico, y la inhibicin sobre los centros hipotalmicos reguladores del apetito. Algunas de estas acciones se estn estudiando como tratamiento coadyuvante de la insulina para ciertos casos de diabetes.

3 Factores determinantes para la formacin del depsito de amiloide en la DM2

A pesar de que ms del 80% de la secuencia de la amilina presenta un alto grado de conservacin entre diferentes especies de mamferos, nicamente humanos, primates y gatos expresan una forma de amilina capaz de formar depsitos de sustancia amiloide. Los residuos 20-29, localizados en el centro de la secuencia de aminocidos de la amilina, presentan un mayor grado de variabilidad entre especies, y son crticos para la formacin de la estructura secundaria beta. En esta regin, tres residuos de prolina estn presentes en la amilina de rata y ratn. Puesto que la prolina inhibe el cambio a conformacin beta, la presencia de tres residuos de prolina en sta regin crtica de la amilina prevendra de la formacin de lminas beta plegadas necesarias para la creacin de fibras amiloides y explicara la ausencia de amiloidosis pancretica en roedores. sta hiptesis ha sido demostrada en experimentos donde se substituyen aminocidos en la regin 20-29 de la amilina humana, vindose modificadas las propiedades amiloidognicas del pptido. En este sentido, se iniciaron estudios genticos poblacionales en busca de mutaciones en el gen de la amilina que pudieran dar origen a cambios crticos en la secuencia del pptido, y que pudieran explicar la presencia de depsitos de amiloide en individuos diabticos. La mutacin S20G fue descrita en poblacin japonesa en el 4% de pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Estudios in vitro confirmaron que, la substitucin de serina en la posicin 20 por glicina de la molcula de amilina mutada, otorga mayor potencial amiloidognico. No obstante, esta mutacin no ha sido detectada en otras poblaciones estudiadas de origen caucsico. La presencia de depsitos de amiloide es excepcional en individuos sanos no diabti82

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cos. Por tanto, la secuencia crtica amiloidognica de la amilina es necesaria, pero no suficiente, para la formacin de tales depsitos en los islotes pancreticos de pacientes con DM2. En consecuencia, otros factores estaran involucrados en el proceso de amiloidognesis para explicar la frecuente asociacin entre amiloide y DM2. En condiciones fisiolgicas, la amilina no forma fibras de amiloide, sugiriendo que deben existir mecanismos en la clula beta pancretica que mantengan la estructura nativa de la amilina. El nivel de pH y la concentracin de calcio estn altamente controlados en el granulo de secrecin para permitir el correcto trfico y maduracin de la insulina y amilina. Alteraciones en ambos parmetros se han relacionado con anomalas en el proceso de formacin de amiloide. Parece que un ambiente normal dentro del grnulo de secrecin mantiene la amilina en forma soluble no fibrilar. Asimismo, estudios in vitro sugieren que una proporcin molar normal entre amilina e insulina, proinsulina o pptido C protegera de la formacin de fibras de amiloide, puesto que insulina y amilina pueden formar complejos estables que impiden el cambio a conformacin beta. Alteraciones en cualquiera de estos componentes del grnulo de secrecin, que bien se puede dar en una situacin de disfuncin de la clula beta pancretica, podran contribuir a la formacin de fibras de amiloide. La DM2 est asociada a niveles elevados de glucosa y cidos grasos libres, condiciones que pueden contribuir a la formacin de depsitos de amiloide. La hiperglucemia crnica en combinacin con el estrs oxidativo da lugar a la formacin de AGEs (advanced glycation end products). Existen evidencias de glicosilacin de amilina por AGEs en la diabetes, as como que la amilina glicosilada tiene mas potencial amilogognico que el pptido no modificado. Situaciones en que la disfuncin de la clula beta provoca una secrecin elevada de proinsulina, es decir que se incrementa el ratio proinsulina respecto a insulina, es un hecho observado en la diabetes, y en individuos con riesgo de padecer la enfermedad. Dado que proamilina es procesada por las mismas proteasas que la insulina, se postula que la disfuncin de la clula beta provocara una alteracin en el procesamiento de la amilina, que conducira a su precipitacin y acumulo en el espacio pericapilar. Se ha propuesto que la sobre-expresin de amilina podra conducir tambin a la acumulacin y agregacin del pptido. Ensayos in vitro utilizando amilina sinttica muestran que es posible generar fibras de amilina espontneamente, y que ste proceso depende mayoritariamente de la concentracin inicial de pptido (figura 1). La expresin de amilina en modelos celulares mediante promotores potentes, como
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FIGURA 1

Morfologa de los depsitos de amiloide pancreticos

A A: Obtencin de fibras de amilina humana mediante ensayos in vitro utilizando pptido sinttico, tincin negativa de stas y anlisis morfolgico mediante microscopio electrnico de transmisin. B: Morfologa ultraestructural de clulas beta pancreticas cultivadas con concentraciones amiloidognicas de amilina humana. Derecha: La formacin de fibras de amilina (indicadas con flechas) induce importantes alteraciones en la membrana plasmtica (indicadas con asteriscos), tales como plegamientos e invaginaciones. Izquierda: Cultivo control. Casas et al: (8)

promotores vricos, han reproducido la formacin de depsitos de amiloide. Existen tambin diversos modelos de animales transgnicos para la amilina humana dnde se han detectado depsitos de amiloide. En humanos, en una situacin de actividad excesiva de la clula beta, es posible observar la formacin de depsitos de amiloide, siendo el ejemplo ms demostrativo el amiloide asociado a insulinomas. Tambin se ha documentado abundante amiloide insular en pacientes con hiperpla84

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sia de islotes pancreticos. Por otro lado, existe el caso de los pacientes no diabticos con insuficiencia renal terminal, en los que junto a elevadas concentraciones de amilina se ha descrito una mayor prevalencia de amiloide pancretico en relacin con sujetos no diabticos y sin insuficiencia renal. Estudios realizados por nuestro grupo de investigacin en poblacin diabtica han detectado en la regin promotora del gen de la amilina la presencia de una mutacin, consistente en la substitucin guanina por alanina, en la posicin -132 bp del punto de inicio de transcripcin (5)(figura 2). Dicha mutacin presenta una frecuencia significativamente superior en poblacin diabtica en relacin con la poblacin control (10.1% vs. 0.9%). Asimismo, los niveles de amilina en los individuos portadores eran significativamente superiores a los de los individuos diabticos no portadores. Estudios in vitro han demostrado que dicha mutacin causa un incremento de la actividad transcripcional del gen (6), capaz de producir una sobreexpresion de la amilina, sugiriendo que podra desempear un papel potencial en la formacin de depsitos de amiloide.

FIGURA 2

Anlisis de la mutacin 132 G/A de la regin del promotor del gen de amilina.

NO PORTADOR

HOMOZIGOTO

HETEROZIGOTO

Figura 2. Anlisis de la mutacin 132 G/A de la regin del promotor del gen de amilina. A: Deteccin de distintos patrones de migracin del ADN genmico de pacientes con DM2, mediante tcnica de SSCP. Carriles 1 y 6, patrn normal. Carriles 2,3 y 4 patrn heterozigoto. Carril 5, patrn homocigoto. B: Secuenciacin de ADN de las muestras anteriores donde se detecta el punto mutado de cambio de base guanina por adenina. En las muestras heterozigotas se detectan dos picos superpuestos que representan los dos alelos distintos de ADN. Novials et al (5)

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No existe todava un claro consenso en relacin al lugar donde se inicia la formacin de amiloide. Las necropsias de pncreas diabticos humanos, de gato, o de primates no humanos indican la formacin de los depsitos siempre extracelulares a la clula beta pancretica y cerca de los capilares. Slo en modelos de sobreexpresin de amilina, tales como animales transgnicos, lneas celulares expresando amilina humana mediante promotores gnicos potentes, o en insulinomas humanos, se ha detectado depsitos de amiloide dentro de la clula beta pancretica.

4. Citotoxicidad de la amilina
Actualmente se considera que la asociacin entre formacin de amiloide y citotoxicidad es comn para la mayora de amiloidosis, y se produce por induccin de apoptosis. La formacin de depsitos de amiloide en los islotes pancreticos se caracteriza in vivo por presentar una reduccin del 40 al 50% de masa celular beta pancretica en pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Estudios con animales transgnicos o lneas celulares expresando amilina humana han demostrado su capacidad citotxica. Asimismo, varios estudios in vitro muestran que la citotoxicidad por amilina humana es concentracin-dependiente para varios tipos celulares, incluidas las clulas beta pancreticas. Sin embargo, existen aun varios puntos crticos que estn por clarificar. Por ejemplo, cabe preguntarse cual es el estado de agregacin y conformacin de la amilina citotxica? as cmo cual es el mecanismo detallado de induccin de apoptosis? Los primeros estudios dirigidos a investigar los mecanismos de citotoxicidad por amilina en islotes pancreticos humanos fueron realizados por Lorenzo et al. (7), y demostraron una correlacin directa entre muerte celular por apoptosis y presencia de fibras insolubles de amilina humana en contacto con los islotes. Se demostr tambin que los agregados solubles de amilina humana no eran txicos, ni tampoco amilina de rata que no es capaz de formar fibras insolubles. La citotoxicidad de amilina humana fue confirmada en varias lneas celulares neuronales y pancreticas, tratadas con elevadas dosis del pptido en forma insoluble, aportando evidencias adicionales de la apoptosis como el proceso responsable de muerte celular. Por otra parte, estudios in vitro identificaron alteraciones en la expresin de varios genes relacionados con vas especficas
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de induccin apopttica. Se ha asociado citotoxicidad de la amilina humana con formacin de ROS (reactive oxygen species). De hecho, han sido descritos marcadores de estrs oxidativo en clulas tratadas con amilina humana. Otra caracterstica de la citotoxicidad de la amilina humana es la induccin de alteraciones en los niveles intracelulares de calcio, documentada en estudios in vitro en varios modelos celulares. Resultados preliminares obtenidos por nuestro grupo de investigacin muestran que alteraciones en la homeostasis intracelular del calcio son crticas para la viabilidad de la clula beta pancretica. Tales alteraciones conllevan a la aparicin de estrs de retculo endoplasmtico, que a su vez influirn sobre la cascada de sealizacin de apoptosis (8). En las necropsias de pncreas diabticos humanos y de animales transgnicos se observan alteraciones morfolgicas en la membrana plasmtica de las clulas beta pancreticas en contacto con los depsitos de amiloide extracelulares. Lorenzo et al. (7) demostraron que para detectar citotoxicidad por amilina humana era necesario el contacto de las fibras insolubles con los islotes. Para el estudio de las interacciones de la amilina humana con la membrana celular plasmtica se han utilizado, en la mayora de los trabajos, membranas fosfolipdicas artificiales. Mirzavecov et al. (9) demostraron que concentraciones citotxicas de amilina humana causaban un incremento de la conductancia a travs de la membrana celular, sugiriendo como posible mecanismo de accin, la formacin de canales permeables a iones. Se obtuvieron resultados similares con concentraciones citotxicas del pptido amiloide de Alzehimer pero no con amilina de rata. Estos hallazgos corroboran la especificidad de la molcula humana para desarrollar fibras txicas. Por otro lado, el grupo de Janson et al. (10) evidenciaron diferencias en la capacidad de elevar la conductancia de membrana al tratar in vitro con concentraciones de amilina humana recin disuelta versus administracin de fibras de amilina maduras. A partir de estos trabajos surgi la hiptesis de que durante la formacin de fibras de amilina, aparecen oligomeros solubles de amilina, especies transitorias con conformacin diferente al monmero original, y que serian desde el punto de vista citotxico, ms agresivas que las fibras de amilina maduras. sta capacidad seria compartida por otros pptidos amiloides, tales cmo Ab, pero se propone cmo mecanismo el incremento de la permeabilidad de membrana, independiente a la formacin de canales inicos o a la disrupcin de la integridad de la membrana plasmtica. En la actualidad, ste es un campo interesante de investigacin en pleno desarrollo.
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5. Depsito de amiloide y DM2: un componente precoz o tardio?

Cul seria la relacin entre amiloide pancretico y la patogenia de la DM2?, Podemos establecer realmente si el fenmeno de amiloidognesis es una complicacin de la diabetes o se trata de un efecto casual? Desafortunadamente, la relacin entre amiloide, diabetes, resistencia a la insulina y disfuncin de la clula beta, es muy difcil de establecer in vivo, y no existen marcadores clnicos que puedan cuantificar el proceso, debido en parte a que las biopsias pancreticas son ticamente inaceptables. Estudios longitudinales en monos muestran la aparicin de depsitos de amiloide antes del desarrollo de la diabetes. En cambio, en pacientes diabticos de larga evolucin, en el anlisis de las autopsias de pncreas el grado de amiloidosis puede ser muy variable, desde tan solo un 1% de los islotes con pequeos cmulos perivesculares, hasta un 90% de afectacin con grandes cmulos que desplazan y destruyen las clulas insulares. De estos hallazgos podemos deducir que el papel del amiloide en el inicio y progresin de la diabetes en el hombre es extremadamente complejo y se requiere ms amplios estudios para determinar su importancia etiopatognica. La creacin de animales transgnicos proporcion la oportunidad de estudiar el efecto de un factor determinado en una enfermedad multifactorial como es la diabetes. Los ratones transgnicos heterocigotos iniciales que sobreexpresaban la amilina humana no fueron capaces de formar depsitos de amiloide, pero si en ciertos casos en ratones homocigotos. Estos hallazgos indican que la citotoxicidad de la clula beta inducida por el transgn depende de los valores de expresin del gen. Incrementos en la incidencia de aparicin de amiloide se consigui al tratar los animales transgnicos con hormonas de crecimiento y dexametasona para inducir resistencia a insulina, o al cruzarlos con animales modelos genticos de obesidad (mutantes para los genes Agrp o leptina). En los animales trangnicos para amilina humana y ob/ob, el grado de amiloidosis se correlacion significativamente con la severidad de diabetes. Mediante el estudio de los diferentes animales transgnicos se propuso que los depsitos de amiloide eran tanto causa como consecuencia de la DM2. As, los depsitos de amiloide podran ser una consecuencia de la sobreproduccin de amilina que acompaa a la sobreproduccin de insulina, y a continuacin, contribuiran a la degeneracin y prdida de masa celular beta del islote.

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6. Conclusiones
El papel de la amilina sigue siendo enigmtico, a pesar que hace ya ms de un siglo que se conoce su implicacin en la diabetes. La complejidad de este pequeo pptido pancretico lo ha hecho muy atractivo para un gran nmero de cientficos que siguen investigando a nivel molecular el proceso de amiloidognesis, as como la forma de revertir la formacn de fibras de amilina. La sntesis de nuevos frmacos que inhiban la formacin de fibras de amiloide podr representar una nueva opcin teraputica para la DM 2.

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7. Bibliografa seleccionada
1. Westermark P, Wernstedt C, Wilander E, Hyden DW, OBrien TD, Johnson KH. Amyloid fibrils in human insulinoma and islets of Langerhans of the diabetic cat are derived from a neuropeptide-like protein also present in normal islet cells. Proc Natl Acad Sci USA 84:38813885, 1987. 2. Cooper GJ, Willis AC, Clark A, Turner RC, Sim RB, Reid KB. Purification and characterization of a peptide from amyloid-rich pancreases of type 2 diabetic patients. Proc Natl Acad Sci USA 84:8628-8632, 1987. 3. Novials A, Sarri Y, Casamitjana R, Rivera R, Gomis R. Regulationa of islet amyloid polypeptide in human pancreatic islets. Diabetes 42: 1514-1519, 1993 4. Gasa R, Gomis R, Casamitjana R, Rivera F, Novials A: Glucose regulation of islet amyloid polypeptide gene expression in rat pancreatic islets. Am J Physiol 272: E543-E549, 1997 5. Novials A, Rojas I, Casamitjana R, Usac EF, Gomis R. A novel mutation in islet amyloid polypeptide (IAPP) gene promoter is associated with Type II diabetes mellitus. Diabetologia 44:10641065, 2001. 6. Novials A, Mato E, Lucas M, Franco C, Rivas M, Santiesteban P, Gomis R: Mutation at position 132 in the islet amyloid polypeptide (IAPP) gene promoter enhances basal transcriptional activity through a new CRE-like binding site. Diabetologia 47:1167-1174, 2004. 7. Lorenzo A, Razzaboni B, Weir GC, Yankner BA. Pancreatic islet cell toxicity of amylin associated with type-2 diabetes mellitus. Nature 368:756-760, 1994. 90 8. Casas S, Gomis R, Gribble FM, Altirriba J, Knuutila S, Novials A. Impairment of the ubiquitin-proteasome pathway is a downstream ER stress response induced by extracellular human islet amyloid polypeptide and contributes to pancreatic -cell apoptosis. Diabetes 56: 22842294, 2007 9. Mirzabekov T, Lin MC, Yuan WL, Marshall PJ, Carman M, Tomaselli K, Lieberburg I, Kagan BL. Channel formation in planar lipid bilayers by a neurotoxic fragment of the beta-amyloid peptide. Biochem Biophys Res Commun 202:11421148, 1994. 10. Janson J, Ashley RH, Harrison D, McIntyre S, Butler PC. The mechanism of islet amyloid polypeptide toxicity is membrane disruption by intermediate-sized toxic amyloid particles. Diabetes 48:491-498, 1999.