SISTEME DE DIAGNOSTICARE FOLOSIND ACIDUL NUCLEIC

Hibridizarea acidului nucleic reprezint baza pentru testele rapide i de ncredere. Materialul genetic conine informaii eseniale despre funciile i caracteristicile unui organism.

O hibridizare efectuat n laborator urmeaz paii:

1.
2.

Legarea ADN monocatenar int de un suport membran.

Se adaug ADN monocatenar marcat (proba) innd cont de temperatur i concentratia de ioni pentru a favoriza cuplarea bazelor dintre prob i ADN int. Se spal suportul pentru a elimina excesul de ADN marcat nelegat. Detectarea secvenei hibride.

3.

4.

 Proba trebuie s hibridizeze exclusiv cu secvena de acid nucleic int selectat. Se poate: - deosebi ntre 2 sau mai multe specii - determina anumite tulpini aparinnd unei specii - identifica diferenele dintre gene.

Exemplu: Diagnosticarea bolii Chagas

n prezent cel mai rspndit test pentru detectarea bolii este cel de PCR. Secvena traget este un fragment de 188 pb care nu se regsete n ADN altor parazii.

Proceduri de hibridizare non-radioactive

n cele mai multe laboratoare de cercetare, acidul nucleic hibridizat este detectat prin adugarea unui izotop radioactiv n prob, cel mai frecvent fosforul-32. Prezena radioactivitii este detectat cu ajutorul razelor X.

 Semnalele de detecie non-radioactiv obin un semnal de amplificare prin conversie enzimatic a substraturilor cromogenice (i schimb culoarea) sau chimioluminiscente (emit lumin).
Semnalul este detectat prin incorporarea nucleotidelor marcate cu biotin n proba cu ADN i respectarea ulterioar mai mult sau mai puin a unei proceduri standard.

Molecule fluorescente
Metoda folosit pentru detectarea anumitor secvene de ADN. O molecul fluorescent obisnuit are 25 de nucleotide.

O molecul fluorescent (fluorofor) este ataat la captul 5 i o molecul nonfluorescent (atenuator) care poate absorbi energia emis de fluorofor nainte de fluorescent este atasat la capatul 3.

Amprentarea genetic
Pentru aceast prob se folosesc minisatelii de ADN uman, secvene ntlnite n ntreg genomul i care se repet n tandem.

RAPD
Metod util pentru a distinge ntre diferite soiuri de plante. Se foloseste un primer oligonucleotidic arbitrar (10 pb) care s nu conin secvene de tip palindrom. Secventa de ADN este amplificat prin PCR. Se folosesc mai muli primeri pentru soiurile de plante foarte nrudite.

Real-time PCR
Se foloseste o substant fluorescent care se ataseaz de ADN dublu catenar, iar pe masur ce se acumuleaz produii n tubul de reacie se emite un semnal fluorescent i se poate masura n timp real kinetica produsilor acumulai.

Cuantificarea n real-time PCR se face msurnd numrul de cicluri necesare pentru ca semnalul fluorescent s ating un anumit prag pentru a fi nregistrat.
Ciclul la care acest punct este ntlnit se numete ciclu prag (cycle threshold).

 Metoda este folosit i pentru a cuantifica ARNm.

Anterior trebuie efectuat reverstranscripia n urma cruia va rezulta ADN complementar.

Pentru a afla originea unui individ pot fi analizate: 1. ADN autosomal

2. ADN patern (cromosomul Y) 3. ADN matern (cromosomul X i ADN mitocondrial) De obicei se folosesc probe de snge sau celule din cavitatea bucal.

Bibliografie
Genomica Volumul 1. Principii de ereditateFundamentele moleculare i celulare ale ereditii, Gavrila Lucian et al, Editura Enciclopedica, 2003.

Molecular Biotechnology, Glick Bernard et al, 2003.