ESPECTROFOTOMETRA ULTRAVIOLETA 1. FUNDAMENTOS DE LA TCNICA La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin.

Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. En esta prctica se dieron a conocer las caractersticas generales y conceptos relacionados con la espectrofotometra y la explicacin del funcionamiento del espectrofotmetro se harn espectros de absorcin con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la mxima absorcin, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarn las concentraciones de distintas biomolculas. INSTRUMENTACIN PARA LA MEDICIN DE ABSORBANCIAS DE LA LUZ VISIBLE Y ULTRAVIOLETA: ESPECTROFOTMETRO UV-VISIBLE La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en unos aparatos llamados espectrofotmetros. Aunque pueden variar en diseo, en especial con la incorporacin de ordenadores para el anlisis de datos, todos los espectrofotmetros constan, segn se indica en la figura, de: 1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno. 2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difraccin. 3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV. 4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales elctricas. 5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidi sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100 La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal,

pero asume una relacin logartmica inversa. La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a travs de la solucin del cromforo y de la concentracin de ste. LEY DE LAMBERT-BEER Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud de onda fija) y concentracin de un cromforo en solucin: A = log I/Io = cl La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a su concentracin a mayor nmero de molculas mayor interaccin de la luz con ellas; tambin depende de la distancia que recorre la luz por la solucin a igual concentracin, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra ms molculas se encontrar; y por ltimo, depende de , una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de extincin- que es especfica de cada cromforo. Como A es adimensional, las dimensiones de dependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de resultan ser M-1cm-1. Este coeficiente as expresado, en trminos de unidades de concentracin molar (o un submltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extincin molar (M). Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto, la concentracin de la disolucin se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo gL-1, las dimensiones de resultan ser distintas, por ejemplo g-1Lcm-1, y al coeficiente as expresado se denomina coeficiente de extincin especfico (s). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, vara con la concentracin, debido a fenmenos de dispersin de la luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc. OBTENCIN DE UN ESPECTRO DE ABSORCIN El espectro de absorcin es una representacin grfica que indica cantidad de luz absorbida () a diferentes valores de . A partir de una solucin diluida de un compuesto, cuya absorbancia mxima entra dentro del rango de medida del espectrofotmetro, se ver el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solucin de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorcin se obtendr el valor de al que el compuesto presenta la mayor absorbancia (max). Dicho se utilizar a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El espectro de absorcin de un cromforo depende, fundamentalmente, de la estructura qumica de la molcula. No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores de max y M, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o molculas vecinas y la orientacin de los cromforos vecinos; y cada uno afecta de forma particular. Por

ejemplo, variaciones originadas por cambios de pH son debidas al efecto de ste sobre la ionizacin del compuesto. A continuacin se muestran como ejemplo los espectros de absorcin de HNTS (un reactivo empleado para la determinacin de especies oxidantes) y comprobndose que por espectrotometra se puede seguir el efecto que ejercen el pH y los oxidantes. CURVAS DE CALIBRADO Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones de diferentes concentraciones del mismo, determinndose para cada una de ellas el valor de absorbancia a max. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentracin en el eje de ordenadas (eje de y). Se observar que, a bajas concentraciones, el aumento de concentracin se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la lnea se aplana, por lo que las medidas son poco fiables. La representacin de Lambert-Beer, A = cl, nos permitir calcular el valor del coeficiente de extincin molar, que corresponde a la pendiente de la recta.