CURS 9

28.11.2013

Acizi nucleici Tipuri de acizi nucleici Componenii structurali ai acizilor nucleici

Caracteristici generale ale enzimelor

Caracteristici generale ale enzimelor

Ce sunt enzimele ? catalizatori ai reaciilor chimice din organismele vii

Ce sunt acizii nucleici ?

Sunt produi de policondensare a nucleotidelor;

Pstreaz i mijlocesc transferul de informaie

genetic n lumea vie.

Dogma central a biologiei moleculare

ADN conine informaia genetic sub forma unor secvene de nucleotide
Replicare
Transcriere Traducere

ADN

ARNm

Proteine

Revers transcriere

Toat informaia din celula parental este transferat celulelor fiice.

Tipuri de acizi nucleici

ADN ARN
ARNm, ARNt, ARNr, ARN de mici dimensiuni, miARN, siARN

 ADN
stocheaz o cantitate mare de informaie cu privire la biosinteza proteinelor

informaia poate fi accesat imediat

 ARN :
mesager: transfer informaia din nucleu n citosol n form de secven de nucleotide de transport: face legtura ntre ARNm i aminoacizi; Ribozomal: intr n structura ribozomilor (complexe ribonucleoproteice, sediul biosintezei proteice); de mici dimensiuni: rol n excizia intronilor

Componenii structurali ai acizilor nucleici

Pentoza sub forma ciclic b-furanozic
Acidul fosforic (H3PO4) Bazele azotate: purine i pirimidine

Riboza i dezoxiriboza sub forma ciclic b-furanozic

HC H H
H

O OH OH
OH

HC H H C C

O OH OH
H

C C C

OH OH O OH
H OH

C C
C

H H

HOH2 C

HO CH2 C
OH

HO CH2 C

OH -D ribofuranoz

OH

H2C

OH D-Riboza

Baze azotate
6 1N 2 N 3 4 Purin 5 7 N 8 NH 9 4 3N 2 5 6 N 1 Pirimidin

Tautomeria lactam lactim a bazelor azotate

Formele lactam sunt mai stabile
O C NH forma lactam OH C N forma lactim

Tautomerie imino-amino
NH2 N C forma amino NH NH C forma imino

Purine

Adenina Guanina

Pirimidine
OH N HO HN HO O N OH CH 3 HN O CH 3

N O NH Lactim Lactam Uracil (2,4-dihidroxi-pirimidina) NH2 N HO N Lactim

N O NH Lactim Lactam Timina (5-metil-uracil) NH2 N

NH Lactam

Citozina (2-hidroxi-4-amino-pirimidina)

Legtura N-glicozidic numerotare atomi ????

Nucleozide (ribo- i dezoxiribonucleozide)

Ribonucleozidele
NH2 N N HO H2 C N 9 N O N O NH NH2 9 5` N N HO H2 C O 1` 4` 2` 3` OH OH Adenozin (A) NH2 N 1 5` O N HO H2 C O 4` 1` 3` 2` Citidin (C) OH OH 1 N O Uridin (U) OH OH

OH OH

Guanozin (G) O NH O

HO H2 C

Dezoxiribonucleozidele
NH2 N N HO H2 C N 9 N O N 9 5` N N HO H2 C O 1` 4` 2` 3` OH H Dezoxiadenozin (dA) NH2 N O 5` HO H2 C O 1` 4` 3` 2` OH H Dezoxicitidin (dC) 1 N O NH NH2

HO

H Dezoxiguanozin (dG) O

H3 C 1 N O

NH O

HO H2 C

OH H Dezoxitimidin (dT)

Nucleotidele
Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor
NH2 O O- P OO b O P OO O P OO 5` O 4` 1` 2` 3` OH X AMP (adenozinmonofosfat) ADP (adenozindifosfat) ATP (adenozintrifosfat) N N N X=H Dezoxiriboz X=OH Riboz N Adenin Adenozin sau Dezoxiadenozin (nucleozide)

-n funcie de orientarea bazelor azotate fa de legtura N-glicozidic conformerii anti i syn

Nucleotide naturale libere

Rolurile lor n esuturi:
-compui macroergici (ATP, GTP); -acceptori de fosfat n fosforilarea oxidativ (ADP); -efectori alosterici ai activitii enzimelor;

-componeni structurali ai coenzimei FAD

NH2 N O CH 2 H3C N N NH H3C N O
lumicrom lumiflavin riboflavin (H) (H) (H) (H) flavin adenin dinucleotid (FAD) (OH) adenozin 5`-monofosfat (AMP)

N N

O P O
-

CH CH CH CH 2 O OH OH OH

P O O
-

O H2 C

N O

O OH OH
adenozin

flavin adenin mononucleotid (FMN)

 componeni structurali ai coenzimelor NAD+, NADP+

CONH 2

COOH

CONH 2 O

O P O O

H2 C O
-

N O

N Acidul nicotinic (niacina)

N Amida acidului nicotinic (niacinamida)

NH2 OH OH
-

N N

P O O

N N

H2 C

OH O R
Nicotinamid-adenin dinucleotid (NAD+)

(R = H formeaz NAD+ ; R = -PO3H2 formeaz NADP+)

mesageri secunzi (AMPc i GMPc);

 donori ai gruprilor metil

Metilxantinele
(compui naturali cu proprieti farmacologice)
O HN 1
3 7

O H3 C O N N CH 3

CH 3 N N Cofeina (1,3,7-trimetilxantina)

N NH NH Xantina (2,6-dioxipurina)

O H3 C N N CH 3 N HN O NH Teofilina (1,3-dimetilxantina) O N CH 3 O

CH 3 N N Teobromina (3,7-dimetilxantina)

Analogi structurali sintetici ai

bazelor azotate, nucleozidelor i nucleotidelor

Inhib sinteza ADN Sunt folosii n chimioterapie

O F N 5 O HO H2 C O SH 2` OH N3 OH Azidotimidina 5-Iodo-2`-deoxiuridin H2 N N 6 N N NH HN N 5 O I N SH 6 N 9 NH

O NH 5-Fluorouracil HO H2 C T imin O

N 6-Mercaptopurina

6-Tioguanina

O HN O HO H2 C O N 6N O HO H2 C N

NH2

O HN 6 N
8N

CH 3 N N S N 6 NO2 N
8

N O HO

H2 N

NH

8-Azaguanina HO N 6 9 N NH

OH OH 6-Azauridin

OH Arabinozil citozin

N Alopurinol

NH N Azatioprin

Structura primar covalent a acizilor nucleici

Nucleozidele legate fosfat diesteric formeaz: -oligonucleotide -polinucleotide Polinucleotidul ARN conine:
b-Riboz i A, G, C, U

Polinucleotidul ADN conine:

b-Dezoxiriboz i A, G, C, T

N
O O
-

NH
G

P
O
-

5`

5` GCA 3`
NH2

N
O
3`

NH2

X
O O C O
-

N CH 2
3`

P
O

N
O

NH2
X O

N
A O

NH

P
O
-

CH 2

N
O

3` 3`

OH

 Cine determin diversitatea polinucleotidelor ???

Conformaia moleculei de ADN; tipuri de conformaii

Structura secundar de dublu-helix a ADN

a fost propus de

Watson i Crick

-analiza cromatografic
n toate tipurile de ADN numrul de baze purinice este egal cu

cel de baze pirimidinice

A+G=T+C

-difracia razelor X, efectuat pe cristale de ADN

existena a dou perioade de identitate de-a lungul axei lungi a moleculei: una mare de 34 i una mic de 3,4 .

Dou catene antiparalele (una cu polaritate 5-3 i cealalt antiparalel cu polaritatea 3-5) complementare nu identice
formeaz o dubl helice cu orientare dreapt
O H2 C O N O H Dezoxiguanozin H G N N H O O Dezoxicitidin CH 2 O H O H2 C O N O H O Dezoxiadenozin O Dezoxitimidin H2 C O N A N H N T N H O N N H O N H N C N H O N O H N H

 Dublul helix cu conformaiile

A B Z

Caracteristici structurale ADN forma B

2 catene complementare NU identice, formeaz o scar n spiral cu 10 trepte; Scheletul extern al dublului helix:
cicluri de riboz legate fosfat diesteric,
ionizat i ncrcat negativ la pH fiziologic;

Bazele azotate, sunt orientate spre interior i perpendicular pe axul helixului.

ADN forma B
3,4 ; 34 ; 20

Polaritatea catenei
5`

O CH 2 5` 3` B1 B1 3` P B2 B2 5` P B3 B3 5` O 5`

3`

P
5` 3` 3`

P
5`
3`

3` O

3` CH 2 O

5`

O H2 C O N O H Dezoxiguanozin H G N N H O N H N N O H N

C N O

H O

Dezoxicitidin CH 2 O

H O H2 C O N
HO

N A N

N N

O H N T N O O H2 C Dezoxitimidin

Denaturarea ADN

Ruperea legturilor de hidrogen i a interaciunilor van der Waals dintre catenele moleculei ADN aflate n soluie.

Renaturare ADN

Denaturare ADN

Ce factori influeneaz denaturarea ?

creterea temperaturii (topire);
la valori extreme de pH
(molecula de ADN este stabil la pH-uri cuprinse ntre 4 i 10);

modificarea triei ionice;

prezena formaldehidei ;

Proprieti fizice ale ADN care se modific prin denaturare

scade vscozitatea;
crete absorbana la 260 nm.

Efectul hipercrom
Prin denaturarea ADN-ului, creste capacitatea de absorbtie a acestuia la l=260 nm.

Compoziia ADN n baze azotate influeneaz temperatura de topire

Hipercromicitate (l=260)

1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0 70 80

100

Denaturare (%)

G:C A:T

A:T G:C

75 50 25 0

Tm

90

100

Renaturare
Refacerea duplexului ADN prin legarea catenelor complementare Renaturarea depinde de: -temperatur; -concentraia catenelor complementare. Renaturarea este proces folosit n tehnica hibridrii -determinarea poziiei intronilor n molecula ADN -evidenierea deleiilor cromozomiale.

 Ce sunt enzimele ? catalizatori ai reaciilor chimice din organismele vii

nsuirile comune cu catalizatorii

acioneaz n concentraii foarte mici; nu se consuma n cursul reaciei; nu modific constantele de echilibru ale reaciilor pe care le catalizeaz; grbesc numai atingerea strii de echilibru pentru reaciile termodinamic posibile.

nsuiri caracteristice enzimelor

A.Sunt macromolecule proteice
B. Au eficien catalitic mult mai mare C.Au specificitate

D. Activitatea lor poate fi reglat

A.Cu excepia ribozimilor (ARN)

enzimele sunt invariabil proteine

 Structur: a. enzime cu structura strict proteic: ribonucleaza chimotripsina lizozimul din mucusul nazal i lacrimi;

b. enzime cu structura heteroproteic: parte proteica numit apoenzim partea neproteic numit cofactor:
coenzim = component neproteic organic, legat slab necovalent de apoenzim;

grupare prostetic = component organic legat puternic de apoenzima (ex. hemul)

metal- legat permanent sau temporar

B.Enzimele asigur viteze mari reaciilor

reaciile enzimatice sunt de 106 - 1012 ori mai rapide ca cele neenzimatice a.hidratarea CO2 este catalizat de anhidraza carbonic , cea mai activ enzim:

CO2 + H2O

H2CO3

105 molecule/ secund reacia este de 107 ori mai rapid dect reacia necatalizat

b.descompunerea H2O2 catalizat de Fe3+ i de

catalaz:

2 H2O2

2 H2O + O2
2x106 ori mai

activitatea catalazei este de

mare ca a Fe3+

C.Specificitate
1. de reacie 2. de substrat: -absolut -relativ: -de grup
-mai larg

3. stereospecificitate

1.Specificitate de reacie
Substrat + Reactant clasificarea enzimelor:
Oxido-reductaze; Transferaze; Hidrolaze; Liaze; Ligaze.

Produi

2.Specificitate de substrat
(selectivitate n alegerea substratului) a.Specificitate absolut E utilizeaz ca S un singur compus chimic:
-ureaza catalizeaz hidroliza ureei:

H2N

CO

NH2 + 2 H2O

CO2 + 2 NH3

-acetilcolinesteraza catalizeaz hidroliza esterului colinei cu acidul

acetic:

H3 C COO CH2 CH2

H2O

H3 C COOH + H2 C HO

CH2 N (CH3 )3
+

N+(CH3 )3
-anhidraza carbonic

b.Specificitate relativ: de grup

E catalizeaz un tip de reacie pentru o familie de compui

R CH2 OH

Alcool dehidrogenaza NAD+ NADH + H+

R CH

Enzima are afinitate mare pentru alcoolul etilic

Vitamina PP
CONH 2 N O NH2 O O P O O
+

COOH

CONH 2 O

O P

H2 C O
-

N Acidul nicotinic (niacina)

N Amida acidului nicotinic (niacinamida)

OH OH

N N

N N

H2 C

OH O R
Nicotinamid-adenin dinucleotid (NAD+)

(R = H formeaz NAD+ ; R = -PO3H2 formeaz NADP+)

b.Specificitate relativ mai larg

Glicozidazele
CH 2-OH O
OH

CH 2-OH O
OH

(H, OH) OH

HO
HO CH 2-OH O
OH

O OH

CH 2-OH O O
OH

(H, OH) OH

OH

CH 2-OH O
OH 1

HOH 2C
2 H

O
HO

H
5

HO OH

O HO
H

CH 2 OH

Proteazele

Pepsin NH CH CO R2 NH CH CO R3 R3 = fenilalanin, tirozin metionin, leucin

Tripsin NH CH CO R2 NH CH CO R3 R2 = lizin, arginin

Chimotripsin NH CH CO R2 NH CH CO R3 R2 = Phe, Tyr, Trp

Carboxil esterazele

O R C O R1

3.Specificitate stereochimic
Enzimele disting -un enantiomer levogir de cel dextrogir; -un izomer cis de cel trans.
COOH Lactat dehidrogenaza HO C H NAD+ NADH + H+ CH 3 Acid L-lactic COOH C O

CH 3 Acid piruvic

COOH CH 2 CH 2 COOH Acid succinic FAD FADH2

succinatdehidrogenaza

H C C HOOC

COOH

Acid fumaric

acidul maleic (izomerul cis) nu se obine nici n urme:

Vitamina B2
Conine heterociclul numit izoaloxazin NH
N O CH 2 H3C N N NH H3C N O
lumicrom lumiflavin riboflavin (H) (H) (H) (H) flavin adenin dinucleotid (FAD) (OH) adenozin 5`-monofosfat (AMP)
2

N N

O P O
-

CH CH CH CH 2 O OH OH OH

P O O
-

O H2 C

N O

O OH OH
adenozin

flavin adenin mononucleotid (FMN)

 6.Activitatea catalitic a enzimelor poate fi modulat de anumii ageni reglatori.

Centrul activ al enzimelor

reprezentare reacii enzimatice :

E + S

ES

E + Produsi

Ce este centrul activ al enzimelor ?

Enzimele sunt macromolecule care prezint
Centrul activ = entitate tridimensional unde se leag substratul

 Centrul activ al enzimelor =

o regiune restrns din protein cu structur chimic i geometric bine determinate

Cine confer structura Centrului Activ ?

natura resturilor aminoacidice i organizarea secundar,

teriar i
cuaternar a proteinei.

Centrului activ al chimotripsinei

S A S S B S S -chimotripsina contine 5 legturi disulfurice S S C S S S

His - 57 din lanul B; Ser - 195 din lanul C; Asp - 102 din lanul B.

Structura tridimensional a chimotripsinei

 Centrul activ conine resturi aa ce creaz o entitate tridimensional complementar cu substratul

Centrul activ al enzimelor

centru de legare prezint resturi aminoacidice care asigur legarea substratului centru catalitic prezint resturi aa responsabile de catalizarea propriu-zis Resturile de aa din situsurile catalitice ale enzimelor sunt: Cys, Ser, His, Tyr, acid Glu i Asp, Lys cu gruprile funcionale:
OH, SH, NH3+, COOHN
+

NH

imidazol

Complexul enzim substrat (ES)

structuri labile, cu o via foarte scurt ntre E i S se stabilesc: - fore necovalente (puni de hidrogen, interaciuni hidrofobe, interaciuni electrostatice) sau -covalente reversibile

Complementaritatea chimic i geometric determin legarea E-S

Modelul clasic (lact cheie)

al CA al enzimei n raport cu structura substratului, propus de Emil-Fischer

Substrat

Enzim Modelul lact cheie

Complexul ES

Este un model rigid.

Modelul dinamic centrul indussau complementaritate indus,

produs de Koshland, este acela de mna n mnu

Modelul indus presupune o flexibilitate a zonei n care se afl centrul activ

Substrat

Complexul ES Enzim Modelul centrului indus