Etude compare in vitro de lactivit nmatodicide de lextrait thanolique de la poudre dcorce de Canthium mannii (Rubiaceae) et du Mbendazole

J. WABO PONE1*, M. MPOAME2, C.F. BILONG BILONG1 et D. KERBOEUF3

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Dpartement de Biologie et Physiologie Animales, Laboratoire deBiologie Gnrale-Parasitologie, Facult des Sciences, Universit de YaoundI, B.P. 812 Yaound, Cameroun. Dpartement de Biologie Animale, Facult des Sciences, Universit de Dschang, B.P. 67 Dschang, Cameroun. Unit Bioagresseurs, Sant, Environnement INRA, 37380 Nouzilly, France.

* Auteur charg de la correspondance : waboponejosue@yahoo.fr

RSUM Objectifs. Lactivit nmatodicide de lextrait thanolique (EET) de la poudre dcorce de Canthium mannii (Rubiaceae) a t value in vitro par rapport celle du mbendazole (MBZ) sur les ufs et les larves L1 dAncylostoma caninum. Matriel et mthodes. Les essais biologiques ont t raliss avec six concentrations (30, 125, 250, 500, 750 et 1000 g /ml de substance active) pour lEET et le MBZ. Le MBZ (Mebencol N. D., Colorama pharmaceutical LTD), leau distille, le surnageant de la suspension dufs et lthanol (0,02 %) ont t utiliss respectivement comme anthelminthique de rfrence (tmoin positif), placebo, tmoin ngatif et tmoin thanol. Rsultats. LEET pour toutes les doses testes sest rvl actif sur les larves L1 (68, 90, 98, 100, 100 et 100 % de mortalit aprs 24 heures pour lEET contre 65, 87, 97, 100, 100 et 100% pour le MBZ respectivement aux doses 30, 125, 250, 500, 750 et 1000 g /ml) et a inhib lclosion de A. caninum (92, 54, 45, 36, 20 et 7 % pour lEET contre 80, 61, 52, 24, 9 et 8 % dinhibition pour le MBZ aux mmes doses). Conclusion. Ces rsultats valorisent lutilisation des plantes mdicinales dans le traitement des parasitoses gastro-intestinales.

SUMMARY In vitro comparison of the nematodicide activity of ethanol extract of the stem bark of Canthium mannii (Rubiaceae) and mebendazole. By J. WABO PONE, M. MPOAME, C.F. BILONG BILONG and D. KERBUF. Objectives. The nematodicide activity of the ethanol extract (EET) of stem bark of Canthium mannii (Rubiaceae) was investigated on eggs and 1st stage larvae of Ancylostoma caninum. Methods. Six concentrations (30, 125, 250, 500, 750 and 1000 g/ml) were studied using a bioassay. Mebendazole (Mebencol N. D., Colorama pharmaceutical LTD) at the same concentrations, distilled water, supernatant of the eggs and ethanol (0,02 %) were included in the assay as standard reference drug, placebo, negative control and ethanol control respectively. Results. EET exhibited high anthelmintic activity on 1st stage larvae and inhibited egg hatching of Ancylostoma caninum. Conclusion. These results support the possible use of medicinal plants in the control of gastro-intestinal parasitosis.

Mots-cls : Nmatodicide - Anthelminthique - Canthium mannii - Ancylostoma caninum - Mbendazole.

Keywords : Nematodicide - anthelmintic - Canthium mannii - Ancylostoma caninum - Mebendazole.

Introduction
Au Cameroun plusieurs essences (sve, macration des feuilles et corce, etc.) sont utilises pour soigner diverses affections : les maladies du foie, les morsures de serpent, le paludisme, les diarrhes, les cardiopathies, limpuissance sexuelle, les helminthiases etc. En ce qui concerne les helminthiases gastro-intestinales, COUSTEIX [5] estime que la pharmacope traditionnelle africaine offre un traitement surtout vermifuge et rarement vermicide. Cependant, depuis les annes 80, cette pharmacope tend concurrencer la mdecine curative hospitalire cause des cots relativement levs de cette dernire [2]. Toutefois, la dmonstration de lactivit ovicide, larvicide et vermicide des extraits de plantes mdicinales traditionnelles reste au stade lmentaire. Quelques travaux ont nanmoins t raliss. TCHOUMBOU et coll. [13] et MPOAME & ESSOMBA [10] ont trait avec succs des poulets contre des verminoses gastro-intestinales avec de la poudre de Combretum sp. et avec les dcoctions aqueuses de graines de Carica papaya. Dautre part, ltude des proprits anthelminthiques in vitro de lextrait mthanolique des feuilles et des corces de Buchholzia coriaceae et de Gynandropsis
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gynandra sur Fasciola hepatica, Taenia solium et Pheritima pasthuma a t entreprise rcemment par AJAIYEOBA et coll. [1]. Dans le cadre de la prsente tude, nous envisageons de comparer les effets de lextrait thanolique de la poudre dcorce de Canthium mannii Hiern, 1877 et du MBZ sur les ufs et sur les larves L 1 dAncylostoma. caninum parasite du chien, du chat et des carnivores sauvages. Cette plante est utilise par les tradipraticiens de lOuest Cameroun en gnral et de Dschang en particulier pour soigner les maux de ventre et les vers intestinaux de leurs patients. Cet article prsente pour la premire fois les effets anthelminthiques in vitro de lextrait thanolique de Canthium mannii.

Matriel et mthodes
LES PARASITES
Rcolte des ufs Les ufs ont t obtenus des fces dun chien errant infest naturellement par A. caninum selon la technique

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dcrite par MICHAEL et coll. [9]. Trs brivement, 80 g de fces fraches sont homognises avec de leau de robinet et filtres travers un passe th et le filtrat est alors centrifug. Environ 20 ml de ce premier surnageant sont rcuprs et conservs dans un bcher pour tre utiliss ultrieurement comme source de bactries, aliment pour les larves. Le culot est ensuite lav 3 fois jusqu ce que le surnageant devienne clair. Le culot final est successivement filtr autravers dun tamis de maille 150 m et un autre de 45 m. Le matriel retenu par le second tamis est remis en suspension et centrifug 1000 g pendant 5 minutes pour obtenir une suspension dufs de A. caninum. Rcolte des larves Une coproculture a t effectue selon la technique dcrite par EUZEBY [6] : aprs 3 jours dincubation 20C (temprature moyenne), les larves L1 closent et sont concentres laide de lappareil de Baermann. Matriel vgtal : rcolte et extraction La plante retenue pour cette tude est une liane de la famille des Rubiaceae nomme Canthium mannii. Immdiatement aprs la rcolte, lcorce est dcoupe en petits morceaux (2 cm x 5 cm) schs 3 4 heures par jour lair libre pendant une semaine. Ces corces sont crases dans un moulin. La poudre obtenue est tamise ( laide dun tamis farine). Elle est conserve au laboratoire dans des sachets en plastique. Plus tard, cette poudre est soumise une extraction lthanol 95 suivant le procd dcrit par CIULEI [4]. Prparation de lEET et du MBZ LEET 100 mg de lEET sont dabord dissouts dans 2 ml dthanol 95. Aprs 3 5 mn, le gel obtenu est mlang 50 ml deau distille selon la mthode dIBARRA & JENKINS [7]. Lensemble bien agit donne une solution de concentration 2000 g dEET par ml (pour la solution-mre) et partir de laquelle, des dilutions en srie sont ralises et dont les concentrations finales seront : 1000, 750, 500, 250, 125 et 80 g/ml. Le MBZ Un comprim de MBZ (Mebencol N. D., Colorama pharmaceutical LTD) dos 100 mg est broy dans un mortier en porcelaine. La poudre obtenue est mlange 50 ml deau distille pour obtenir une solution homogne qui sert de solution mre et dont la concentration est de 2000 g de MBZ par ml. A partir de cette solution- mre, des dilutions en srie sont ralises pour obtenir des concentrations identiques celles de lEET. Tests biologiques Effet sur les ufs Trente 40 ufs dA. caninum (contenus dans 1 ml du surnageant conserv cf. II-1-1) sont disposs dans chacune des 15 botes de Ptri (diamtre 35 mm et de hauteur 10 mm) de lexprience. Six botes reoivent chacune 1 ml de chaque dilution de MBZ (tmoin positif) contenant respectivement 2000, 1500, 1000, 500, 250 et 160 g de cette substance ; 6 autres botes reoivent de la mme manire lEET ; trois autres botes reoivent chacune 1 ml dthanol 0,02 %

(concentration maximale dthanol contenue dans les botes de Ptri traites avec lEET) ou 1 ml deau distille (placebo) ou aucun traitement (surnageant volume total de 1 ml ) (tmoin ngatif). Les botes sont ensuite couvertes et places dans un incubateur lobscurit 25C pendant 3 jours. Six rptitions ont t ralises pour chacune des substances (MBZ, EET, thanol 0,02 %, eau distille ). Effet sur les larves L1 A partir de la suspension de larves obtenue aprs concentration, 10 larves L1 sont pipetes sous une loupe binoculaire laide dun compte goutte, puis elles sont disposes dans chacune des 15 botes de Ptri pour tre traites de la mme manire que les ufs LOK et coll. [8]. Test dactivit Lactivit anthelminthique a t value pour les ufs laide dun microscope binoculaire au jour 0 (J0 : mise en bote des ufs) et 72 heures (J3) de contact selon MICHAEL et coll. [9] et sous une loupe binoculaire, 0 heure, 3/4 heure, 1 heure, 2 heures, 3 heures, 4 heures, 5 heures et 24 heures de contact de ces diffrents produits avec les larves L1 selon SINHA et coll. [12]. Paramtres tudis Le taux dclosion des ufs pour une dose donne a t valu par le calcul du nombre de larves L1 (mortes et vivantes) obtenu par rapport au nombre dufs mis incuber. Le taux de mortalit larvaire en fonction du temps de contact a t estim selon la formule dABBOTT [3] : Mc % = Mce % - Mt % 100 Mt %

Dans cette formule, Mc, Mt, et Mce reprsentent respectivement la mortalit corrige, la mortalit dans les tmoins et la mortalit au cours de lpreuve. Pour lestimation de la mort des larves, nous nous basons sur labsence de mobilit de ces dernires pendant 5 secondes. Les pourcentages de mortalit (pour la troisime heure de contact avec les produits) ont t transforms en probit laide dune table, puis lquation de rgression linaire du probit en fonction du logarithme dcimal de la concentration (g/ml) du produit a t dtermine. La CL50 a t estime partir de lquation de la droite de rgression y = a + bx, en remplaant y par 5 qui reprsente le probit de 50 % de mortalit. Analyses statistiques La comparaison des taux moyens dclosion dufs et de mortalit larvaire a t effectue laide du test de 2 (Chicarr) et le seuil de signification retenu au cours de ces analyses est P=0,05.

Rsultats
EFFET SUR LES UFS
Cette tude montre que le taux dclosion des ufs (%) diminue progressivement avec laugmentation de la concenRevue Md. Vt., 2005, 156, 12, 633-636

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tration des deux composs MBZ ou EET. Lclosion semble suprieure pour le MBZ aux concentrations infrieures ou gales 250 g/ml ; mais ce phnomne est inverse aux concentrations suprieures ou gales 500 g/ml (figure 1). Une diffrence significative entre EET et MBZ a t observe avec les doses 125, 500 et 750 g/ml, lEET tant plus actif. Les taux dclosion des ufs dans lthanol 0,02 %, dans leau distille (placebo) et le surnageant (tmoin ngatif) ont t trs levs (>97 %). Les CL50 ont t de 198 et 189 g/ml respectivement pour le MBZ et lEET.
FIGURE 1. Variation du taux dclosion des ufs (%) en fonction des doses du MBZ et de lEET aprs 72 heures de contact.

EFFET SUR LES LARVES L1

Leau distille (placebo), le surnageant (tmoin ngatif) et lthanol 0,02 % nont eu aucun effet nfaste sur les larves L1. Comme pour les ufs, le MBZ et lEET se sont rvls actifs contre les larves L1 de A. caninum pour toutes les concentrations testes. Le taux de mortalit larvaire tait proportionnel la concentration teste. Cette activit est apparue plus importante et plus rapide aux concentrations leves. A partir de 500 g dEET/ml, une mortalit de 100% de larves L1 a t obtenue (figures 2 et 3). Les concentrations ltales 50 se sont rvles relativement faibles : 32 g/ml et 99 g/ml respectivement pour le MBZ et lEET de C. mannii.

FIGURE 2. Taux de mortalit moyen cumul des larves L1 dA. caninum en fonction des doses du MBZ et de lEET aprs 3/4 dheure de contact.

Discussion
Laugmentation des concentrations du MBZ et de lEET se traduit dune part, par une diminution du taux dclosion et, dautre part, par une augmentation du taux de mortalit des larves. Cette situation est similaire celle obtenue par PESSOA et coll.[11] au cours de leurs essais in vitro avec lhuile essentielle dOcinum gratissimum sur les ufs dHaemonchus contortus. De plus, le temps ncessaire pour obtenir le plus de larves mortes rduisait aussi. Ces observations se rapprochent de celles observes par SINHA et coll. 1987 sur lefficacit de quelques anthelminthiques sur la mortalit des larves infestantes de Toxocara vitulorum. La valeur de la DL50 du MBZ obtenue dans la prsente tude ( savoir 32 g/ml) se rapproche de celle trouve par IBARRA & JENKINS [7] sur Haemonchus contortus, (40g/ml), au cours de leurs essais sur leffet in vitro sur de diffrents anthelminthiques appartenant aux principales familles commercialises. Le taux dclosion des ufs trs lev (> 97%) dune part et labsence de larves L1 mortes dautre part, dans les botes de Ptri contenant de leau distille (placebo), de lthanol 0,02 % ou du surnageant, confirment que les variations du taux dclosion et de mortalit des larves L1 observes dans les botes de Ptri traites avec lEET, rsultent bien de laction ovicide et larvicide de cette substance.
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FIGURE 3. Taux de mortalit moyen cumul des larves L1 de A. caninum en fonction des doses de MBZ et de EET aprs 24 heures de contact.

Conclusion
Les essais mens dans le prsent travail ont montr dune part que lEET de la poudre dcorce de Canthium mannii inhibe lclosion des ufs de A. caninum surtout aux concentrations leves, et dautre part quil prsente des effets larvicides vis--vis des larves L1 de ce parasite. Des tudes ultrieures sont envisages et qui vont stendre aux autres stades (L2, L3 et adultes), lidentification des principales molcules actives et lvaluation de la toxicit de cette plante. En effet, la purification de lEET de la poudre

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dcorce de Canthium mannii pourrait probablement augmenter son efficacit et abaisser sa CL50. Ce travail valorise lutilisation des plantes mdicinales dans le traitement des parasitoses gastro-intestinales en particulier.

Remerciements
Nous exprimons notre profonde gratitude aux Drs. Ngnokam, D. et Tapondjou, L. du Dpartement de Chimie Organique de la Facult des Sciences de lUniversit de Dschang pour leur aide la ralisation de lextrait thanolique, au Directeur du Centre Pasteur de Yaound pour son aide matrielle et au Pr. Brigitte Enriquez de lcole vtrinaire dAlfort pour ses corrections.

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