Imunofluorescena indirectmetod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Biol. Monica Cristina Gheorghiu Dr. Mihaela Blaj Departamentul de Imunologie BIOCLINICA S.A. Timisoara

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Bolile autoimune constituie un grup heterogen de afeciuni caracterizate de prezena anticorpilor circulani orientai mpotriva constituenilor celulari

Definiie:

Fiecare boal autoimun sistemic are un Importana spectru de anticorpi antinucleari specifici clinic:

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

OBIECTIVE Evaluarea sensibilitii i specificitii tehnicilor ELISA/EIA versus IFI Imunofluorescena indirect este considerat metoda gold standard pentru determinarea anticorpilor antinucleari(ACR)
3

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

MATERIAL I METOD

07.04.2009 - 10.06.2010

IFI 2851

EIA 184

IB 184
4

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Tehnici folosite pentru detectarea anticorpilor antinucleari (AAN)

AAN screening

AAN confirmare

IFI indirect EIA n faz solid

EIA, IB n faz solid ID, CIE, RIA n faz fluid Hemaglutinare pasiv
5

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

IFI
NOVA LITE Hep2 ANA NOVA LITE Crithidia luciliae (dsDNA)

EIA
ORGENTEC antigene singulare

IB
EUROIMMUN Profile autoimmune disease

ORGENTEC mixturi de antigene

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

IFI pe substrat Hep-2

descrie pattern-uri noi, asociate cu boli autoimune (35 de pattern-uri nucleare i citoplasmatice corespunznd la peste 100 de antigene diferite)
7

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari Diferitele tipuri de pattern-uri de pe substratul Hep-2 se asociaz cu boli autoimune i structuri biochimice

Pattern

Structuri biochimice

Boal autoimun

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari Principiul IFI

Ag

Ac

Ag

Ac

conjugat

Ag

Ac

conjugat

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

10

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari 5 regiuni principale ale celulelor Hep-2

Membran nuclear

Nucleoplasm

Nucleoli

Fusul mitotic

Citoplasm

11

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

diluia productor
1/40

1/80 1/160

diluia literatur

diluia utilizat
1/160

12

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Corelaia dintre diluie i procentul de anticorpi antinucleari pozitivi
date proprii 40 35 Procent pozitivi 30 25 20 15 date literatura (ACR)

10 5 0 1/40 1/80 1/160 Titru

13

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari Principiul EIA i IB

14

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

EIA
alternativ viabil, uor de efectuat i standardizat pot fi determinate cantitativ 8-14 antigene (din cele peste 100 de autoantigene identificabile pe Hep-2) antigenele determinate sunt: ADN nativ, histone, nucleozom, Sm, U1-snRNP, SS-A/Ro (Ro-52 i Ro-60), SS-B/La, Scl-70, Jo-1, centromer, gp210, sp 100
15

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

IB este o metod calitativ se identific simultan mai multe tipuri de anticorpi nRNP-Sm, Sm, SS-A, Ro-52, SS-B, SCL-70, Pm-SCL, Jo-1, centromer, PCNA, ds-DNA, histone, nucleozom
16

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

REZULTATE
Rezultate IFI
474

pozitive negative 2377

17

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Probe IFI negative lucrate EIA i IB

IFI EIA IB

50

50
NEGATIVE

50
18

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Probe pozitive IFI lucrate EIA i IB

158
290 IFI IFI IFIEIA IFIIB 121

184 2377

19

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Repartizarea pacienilor pe grupe de vrst (ani)
11%

4% 5%

12%

26%

23%

19%

0-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 >70

20

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Distribuia pacienilor n funcie de sex
100% 90% 86%

80%
70% 60% 50% 40% 30% 20% 14% femei brbai

10%
0%
21

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

LES, AR sero-negativ S. Sjgren, S. antifosfolipic
Membran nuclear linear

Ciroz biliar primitiv

Membran nuclear punctat

Lamine A, B, C

Gp210, p62 din porul nuclear

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

LES, AR
Omogen

Constitueni ai cromatinei: ADN dublu catenar, histone, nucleozomi

23

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Conectivit mixt de esut conjunctiv
Matrice nuclear

Constituieni ai granulelor intercromatinice: hnRNP

24

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Conectivit mixt de esut conjunctiv, LES
Dens ptat (Sm)

Constituieni ai spliceozomei: antigen Smith (Sm), U1-RNP

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

S. Sjgren, LES, dermatomiozite
Fin ptai Fin ptai

SS-A

SS-B
26

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Scleroderma, S. Raynaud
Granulaii foarte fine (Scl 70)

Topoizomeraz I
27

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Ciroz biliar primitiv, Hepatite cronice active
Puncte nucleare

Ciroz biliar primitiv, LES

Multiple puncte nucleare

P80-coilin

Sp-100, PML
28

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

S. Sjgren, F. Raynaud, Scleroderma/ Polimiozita overlap, LES, AR Nucleolar omogen (PM-Scl)

Scleroderma
Nucleolar clumpy

PM-Scl, Th/ To, Nucleolin

Constituieni nucleolari: U3RNP

29

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Scleroderma
Nucleolar ptat (ARN polimeraza I)

F. Raynaud, Scleroderma
Nucleolar ptat cu puncte mitotice

Constituieni nucleolari: RNA pol.I

NOR-90, RNA pol I, ASE-1

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Scleroz sistemic, LES, Conectivite de esut nedifereniate
Nucleolar dens ptat

RNA-helicaza II
31

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

LES
PCNA

DNA polimeraza ciclina

32

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Scleroderma, F. Raynaud, S. Sjgren, Ciroz biliar primitiv
Centromer

Proteine ale centromerului A, B, C

33

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Infecie cu Mycoplasma pneumoniae
Spindle pole pattern (NUMA)

LES
Spindle fibre pattern

Numa 235

HsEg5
34

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Polimiozit, LES
Granulaii dense perinucleare (ribozomi)

Ciroz biliar primitiv

Reea granulo-filamentoas (mitocondrie)

Constituieni ai ribozomilor: aminoacil tRNA sintetaza, Ribo-P0, P1, P2

Proteine M1-9, piruvat dehidrogenaz (M2)

35

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Miozite, Polimiozite
SRP

LES, AR, S. Sjgren, atrofia cerebral

Granulaii perinucleare la un pol al nucleului (aparatul Golgi)

Complex de nucleoproteine

Constituieni ai aparatului Golgi: golgina, giantina

36

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Polimiozite, dermatomiozite
Granulaii fine perinucleare (Jo-1)

Histidil t-RNA sintetaza

37

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Aspectul pattern-ului
9% 9% Aspect ptat Aspect omogen Aspect nucleolar Alte aspecte

26%

56%

38

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Antigene nucleare determinate EIA
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 44

42

19 14

21

18

6 0

4 0

39

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Antigene nucleare determinate IB
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

39

37

19 15 11 6 4 3 0 3 3

18 8

40

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Concordana antigenelor nucleare solubile din EIA i IB cu aspectul ptat din IFI
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
44 39 42 37

14 11

19 15 8 6 6 4 43

EIA IB 3 00

41

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari

Concordana antigenelor nucleare din EIA i IB cu aspectul omogen din IFI
21 21 20 19 19 18 18 18 EIA IB

17
16 ds-DNA

nucleozom

42

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari Date EIA i IB

EIA

Real Real Fals Fals pozitivi negativi pozitivi negativi 184 50 0 26

IB

184

50

63

43

Imunofluorescena indirect-metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari Sensibilitatea i specificitatea obinute cu metodele EIA i IB

Sensibilitate Specificitate

EIA IB

88% 66%

100% 100%
44

CONCLUZII
1. IFI poate fi folosit cu succes ca metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari punnd la dispoziie ntregul spectru antigenic 2. Evideniaz anticorpii orientai mpotriva unor antigene nc nedescoperite, neizolate 3. Un rezultat pozitiv, nsoit de titru i aspectul pattern-ului orienteaz spre boala autoimun sau spre autoanticorp 4. ELISA i IB pot fi folosite pentru confirmare i monitorizarea bolilor autoimune 5. Intruct aspectele de tip nucleolar i puncte nucleare nu au nc corespondent n ELISA, pledeaz pentru folosirea IFI ca metod screening
45

Anticorpi antinucleari (depistajIFI) Se repeta Anticorpi antinucleari (depistajIFI), daca suspiciunea persista (2-3 luni)
slab

Anticorpi antinucleari titrare (aspect, titru)

Posibile granulatii citoplasmatice

Aspect de tip Jo1

Nici o afectiune, remisiune, tratament

Aspect ribozomal Proteina P ribozomala

Aspect aparat Golgi

Aspect mitocondrial Auto-anticorpi anti mitocondrii

Auto-anticorpi anti Jo1

Polimiozite

% de LES

Ciroza biliara primitiva

Aspect omogen

Aspect fin patat

Aspect dens patat

Aspect nucleolar
Scleroza sistemica progresiva, Scleroderma overlap, S. Raynaud

Aspect de tip centromer

S. Crest, Scleroza sistemica, Fenomene Raynaud

Aspect PCNA

Aspect puncte nucleare

Aspect inelar

Profil antigene nucleare solubile

Antigene nucleare solubile

Marker pentru LES

Profil antigene specifice hepatice

Ciroza biliara primitiva

ADN nativ si sau cromatina

Posibil LES activ, Artrita reumatoida (AR), Lupus indus medicamentos

Auto anticorpi anti-Sm

Auto anticorpi anti-RNP

Conectivita mixta de tesut (MCTD)

Auto anticorpi anti-SSA

S. Sjogren, LES

Auto anticorpi anti SSB

LES neonatal, S. Sjogren

Auto anticorpi anti Scl 70

Marker scleroderma

Auto antic. anti RNA Pol (III)

Scleroderma mai ales difuza cutanata

Fara specificitate
LES, MCTD, AR, EBV, Hepatita cronica

Marker LES

46

47