! Adan Meneses Cruz! ! ! ! Resumen! ! !

Recuperacin de ovocitos de ovarios de vacas sacricadas del camal Don Goyo - Arequipa!

Laboratorio de Biotecnologia Animal, Programa Profesional de Ingeniera Biotecnologica, Universidad Catolica de Santa Maria - Arequipa. !

La recuperacin y conservacin de ovocitos in vitro e in vivo de vacas de alta calidad es una de las tcnicas mas importantes en la mejora gentica de ganado vacuno. Esta tcnica sirve como base para otras tcnicas aun mas complejas como, clonacin, inseminacin in vitro y transferencia de embriones. Ademas el trabajo no consiste en solo recuperar ovocito viables sino en clasicarlos, para poder seleccionar los mejores. ! En la presente practica de laboratorio se recuper ovocitos de ovarios de vacas sacricadas en el centro de benecio Don Goyo en el departamento de Arequipa, se utiliz 2 mtodos de recuperacin; corte o incisin al ovario y inyeccin. Posteriormente se observo los ovocitos en un microscopio y estereoscopio y nalmente se los clasicaos de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas como zona pelucida, aspecto del citoplasma y caractersticas de la membrana plasmatica.!

! Palabras clave: ovocito, estereoscopio, zona pelucida, ovario.! ! Abstract ! ! !

The recovery and preservation of oocytes in vitro and in vivo high quality cows is one of the most important techniques in breeding cattle. This technique is the basis for other even more complex techniques such as cloning, in vitro fertilization and embryo transfer. Besides, the job is not only to recover but to classify viable oocyte, to select the best. ! In the present laboratory practice oocytes in ovaries of slaughtered cows prot center Don Goyo in the department of Arequipa, recovered two recovery methods I use are; cutting or incision the ovary and injection. Then the oocytes were observed under a microscope and stereoscope and nally the considered of according to their morphological characteristics as zona pellucida, cytoplasm appearance and characteristics of the plasma membrane. !

! Keywords: egg, stereoscope, zona pellucida, ovary." ! ! 1. Introduccin! ! ! !

La mejora gentica de vacas en la biotecnologia animal, consiste principalmente en el cruce selectivo de ejemplares con caractersticas fenotipicas altamente deseables como, mejores tasas de produccin de leche, carne, mejor clidas de leche, un desarrollo mas rpido de musculatura, etc. Para poder llevar a cabo estas mejores, se utiliza tcnicas como clonacion, inseminacin in vitro y transferencia de embriones. El xito de estas tcnicas consiste en la calidad de los !

gametos masculinos y femeninos; el semen y vulos u ovocitos. !

El control de la calidad del semen de un toro, es una tarea sencilla y en muchos casos rutinaria, la cual consiste en una evaluacin de la motilidad, viabilidad y morfologa de los espermatozoides utilizando un microscopio, en cambio la recuperacin, clasicacin y conservacin de ovocitos viables y adecuada es una tarea mas complicada. Ademas los ovocitos son mas difciles de conseguir y son

mas escasos, normalmente las vacas maduras solo produce 1 ovocito por ciclo estral. Para vencer este obstculo, se puede realizar una sper ovulacion inducida por hormonas.!

ser madurados, fertilizados y cultivados in vitro hasta estados avanzados del desarrollo embrionario.!

Luego se procede con la obtencin o recuperacin de ovocitos, esta etapa se puede hacer por dos diferentes estrategias; la primera estrategia consiste en una recuperacin in vivo, en donde de realiza un lavado de las trompas y ovarios utilizando un medio clular especial que asegure la supervivencia del ovocito; y la segunda estrategia consiste en el recuperacin de los ovocitos in vitro de los ovarios de una vaca sacricada. !

! 2.1 Origen de los ovocitos. ! !

a) H e m b r a s v i v a s : e s t a t c n i c a d e recuperacin de ovocitos se aplica cuando la vaca posee un alto valor gentico, teniendo caractersticas muy buenas. Se escoge ademas animales que son frtiles, evitando hembras prepberes, gestantes, infertiles y aquellas hembras que no responden al tratamiento de sper ovulacion. Las tcnicas mas usadas son:!

El ultimo paso es la clasicaron del ovocito recuperado, esta se realiza mediante la observacin de las caractersticas morfolgicas del ovocito usando un estereoscopio o un microscopio y se evala siguiendo una serie de criterios como la integridad de la zona pelucida, apariencia del citoplasma, membrana plasmatica, etc. !

OPU: Ovum Pick Up: la cual es una aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido. Esta tecnica permite la recuperacin de ovocitos mediante aspiracin al vaco, generalmente se usa animales con pretratamiento hormona. !

! 2. Marco terico! !

La aplicacin de los procedimientos de fertilizacin in vitro (FTV) en la reproduccin bovina se ha incrementado en los ltimos aos y en un futuro puede llegar a ser utilizada en programas de gran escala en la produccin comercial de embriones in vitro. Dentro de este concepto, la recoleccin de ovocitos es un paso necesario para poder llegar a establecer estos programas de FIV.!

Los ovarios contienen un elevado nmero de folculos que se encuentran en diferentes estados de desarrollo (primordiales, en crecimiento, atrsicos), de los cuales solamente una pequea proporcin va a ser utilizada durante la vida reproductiva del animal. La recoleccin de ovocitos permite r e c u p e r a r y a p r o v e c h a r f o l c u l o s n o ovulatorios, que bajo condiciones siolgicas se tornaran en folculos atrsicos.!

OPU no requiere que el animal tenga un ciclo reproductivo normal, cuando se usa conjuntamente con tcnicas de fecundacin in vitro, se acorta el intervalo generacional y aumenta la mejora gentica maternal produciendo mas progenie que por mtodos convencionales. !

! !

La obtencin de ovarios provenientes de vacas sacricadas en el matadero suministra una fuente abundante de ovocitos obtenidos a bajo costo, provenientes de animales en diferentes estados del ciclo estral, que pueden

b) Hembras ovariectomizadas: utilizando esta tcnica se obtiene pocos ovocitos a un elevado precio, ademas es necesario tratar a las hembras con hormonas (FSH), y es necesario conocer la situacin siolgica/ patolgica de las hembras como raza, edad, estado de lactacin, nutricin, estado reproductivo, etc.!

c) Hembras de matadero: esta consiste la fuente principal de ovocitos, es una tcnica de bajo costo, recogiendo un elevado numero de ovocitos en funcin a las hembras sacricadas, una de las desventajas principales es el desconocimiento total o parcial de la situacin siolgica/ patolgica de la hembra donante. !

conectada a una jeringa u otro mtodo de succin. Este es el metido mas usado cuando se trabaja con ovocitos de bovino. ! Se obtiene un menor rendimiento; de 30 a 60 ovocitos por cada 100 folculos aspirados, menor calidad del cumulus ( disgregacin de las clulas), menor proporcin de ovocitos de buena calidad (45%), se tiene una mayor rapidez de recogida y es necesario una seleccin mas estricta. !

! ! c) !

Slicing: !

Los principales factores tcnicos que afectan la eciencia de la aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido son el procedimiento de obtencin, el dimetro de la aguja usada y la presin de aspiracin. !

Consiste en realizar cortes longitudinales y transversales con una hoja de bistur en la supercie de los ovarios para liberar los ovocitos. Esta tcnica presenta mayor porcentaje de ovocitos recuperados por ovario, pero con una menor proporcin de ovocitos de buena calidad ( 30 a 45%), los ovocitos recuperados presentan menor integridad del cumulus. Una de sus principales ventajas es la mayor rapidez de recogida de ovocitos. !

Los factores biolgicos son; el momento del ciclo estral en el cual se realiza la aspiracin, las condiciones corporales del animal, la raza, la edad y el tipo de estimulacin del crecimiento folicular. !

! d) ! !

Otros mtodos: !

Digestin del tejido ovrico con tripsina durante 1 hora y posterior ltracin y separacin de ovocitos/ ovario. ! Digestin de tejido ovrico con colagenasa (ovocitos preantrales)!

! 2.2 Tcnicas de recogida de los ovocitos. ! ! a) Diseccin:! ! !

Consiste en aislar cada folculo ovrico del resto de tejido con ayuda de pinzas y tijeras, liberando posteriormente los ovocitos tras la ruptura controlada del folculo intacto. ! En esta tcnica, el dimetro y atresia del folculo son conocidos, el rendimiento es elevado; se obtiene 90 a 100 ovocitos por 100 folculos seleccionados, la mayor proporcin de los ovocitos son de buena calidad (60%), una de las limitaciones consiste en el tiempo pues solamente se puede experimentar con pocos ovocitos.!

! 2.3 Seleccin de los ovocitos. ! ! Parmetros visuales: ! ! 3 o ms capas de clulas del cumulus ! !

! b) !

(Mayor % blastocistos: >5 capas) Intercambio de metabolitos y seales entre ovocito y clulas del cumulus ! maduracin citoplasmtica! Desechar ovocitos denudados o con cumulus incompleto! Geshi et al. (1999): terneros a partir de ovocitos madurados sin cumulus en un medio de maduracin suplementado con piruvato sdico y sin suero.!

Aspiracin: !

Consiste en la puncin y extraccin del contenido de los folculos mediante una aguja

! ! ! ! !

Cmulus compacto vs cumulus expandido!

Blondin and Sirard (1992): cumulus ligeramente expandido vs cumulus compacto o expandido! Wurth and Kriup (1992): cumulus ligeramente expandido y clulas ms oscuras vs cumulus compacto y clulas brillantes.!

! !

Si < 25 C: se producirn anormalidades del huso cromosmico ! Si > 40 C: causara poliespermia. ! Atmsfera: es estrictamente necesario utilizar una incubadora con 5% CO2, sobretodo si el medio de MIV contiene bicarbonato. Si es posible el cultivo se debe realizar en una incubadora de CO2 humidicada. !

Apariencia homognea del citoplasma vs heterognea!

Tiempo: el tiempo de maduracion y 24 h (vaca), 26 h (oveja), 27 h (cabra), 40-44h (cerda)!

Nagano et al. (1999): citoplasma heterogneo > potencial de desarrollo embrionario: presentan una mejor distribucin de los grnulos corticales (ME) disminucin de la poliespermia!

! 2.4 Sistemas de maduracion in vitro ! ! - Medios de maduracin! !

! - Sistemas de maduracin! ! Se puede utilizar , diferentes sistemas; ! !

Se puede utilizar diferentes medios, de soluciones salinas a medios mas complejos como por ejemplo:! TCM 199: sales, piruvato sdico, lactato sdico, aminocidos, vitaminas, purinas,..+/tampones: Hepes, bicarbonato sdico! pH: 7.2-7.4! Osmolaridad: 285-320 mOsm/kg.!

Microgotas 50 o 100 $l recubiertas por aceite mineral.! Placas de 4 pocillos: 500 $l! Placas de petri : 2 ml! Co-cultivo: clulas de la granulosa! clulas Vero: clulas de rin de Green monkey. Esttico sin clulas / no esttico + clulas granulosa.!

! ! - Suplementos! !

! 2.5 Factores que afectan el ovocito! ! Dimetro del folculo. ! !

Estos son los encargados de proporcionar condiciones mas especicas, varian de acuerdo a cada especie animal. ! Sueros: fuente de protenas, cidos grasos, VV, hormonas, factores de crecimiento, ..! Suero fetal bovino, suero de vaca en celo, suero de buey Hormonas: FSH, LH, estrgenos:! Epidermal Growth Factor! Cisteina, cisteamina, # -mercaptoetanol: precursores del glutation! Glutatin: su concentracin intracitoplasmtica aumenta durante la maduracin Protege al ovocito de reacciones oxidativas! Favorece la descondensacin de la cromatina! formacin del PN masculino!

Cuando se obtiene ovocitos procedentes de folculos pequeos (1-2 mm) estos tienen maduracin nuclear pero son inmaduros citoplasmticamente.! Ovocitos procedentes de folculos medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm): poseen un porcentaje de maduracin nuclear mayor.!

! Dimetro del ovocito. ! ! ! !

Existe una relacin entre el tamao del folculo y el desarrollo del ovocito, y tambin existe una relacin entre el crecimiento del ovocito y su capacidad del desarrollo in vitro. ! Competencia meitica aparece cuando el ovocito alcanza el 80-90% de su tamao pero hasta que no alcanzan su tamao mximo, no puede completar la maduracin citoplasmtica (Thibault et al).! % 90 $m: Incapaces de reiniciar la meiosis <100 $m: 21 % ovocitos alcanzan la MII 100-109 $m: 42% ovocitos alcanzan la MII 110-119 $m: 76% ovocitos alcanzan la MII & 120 $m: 81% ovocitos alcanzan la MII!

! - Condiciones de cultivo ! !

Temperatura: la temperatura mas adecuada para el cultivo de ovocitos es de 38.5 grados Centgrados. !

Folculo<1: ovocito 98.9 $m Folculo 1-1.9: ovocito 106.8 $m Folculo 2-2.9: ovocito 112.9 $m Folculo 3-3.9: ovocito 116.0 $m Folculo >4: ovocito 117.2 $m! 115 $ m: reinican la meiosis/ 120 $ m: maduracin nuclear y citoplasmtica!

! Morfologa del ovario! ! Gandol et al. (1997) seala: ! ! ! Edad! ! !

! 3.2 Procedimiento. ! !

Visturi.! Tijera. ! Pipetas.! Papel toalla.! Guantes.! Estereoscopio.! Microscopio.!

A) Presencia de un folculo > 10 mm dimetro! B) Presencia de ms de 10 folculos de 2 a 5 mm de dimetro y ninguno de >10 mm! C) Presencia de menos de 10 folculos de 2 a 5 mm de dimetro y ninguno de > 10 mm!

Se recolecto ovarios de una vaca la cual habia sido sacricada. Se los almaceno a bajas temperaturas para evitar la muerte de los ovocitos, es recomendable que el proceso de almacenamiento no dure mas de 8 horas, de lo contrario se veria comprometida la integridad de los ovocitos.!

Se recomienda evitar trabajar con animales prepberes o muy adultos. ! Un factor muy importante es el estado hormonal Ciclo estral.! Para mejorar estos factores se recomienda tratamientos hormonales (FSH o PMSG)!

Luego se corto el tejido muscular que se encontraba cerca del ovario.! Fig. 2. Se cort el tejido perifrico del ovario,

! ! 3. Materiales y mtodos! ! 3.1 Materiales! ! -

Ovarios de vacuno recolectados post morten.! Cloruro de sodio 0,9%.! Vaso de precipitados de 200 ml.! Jeringa de 5 ml.! Placas petri.! Pinzas.!

utilizando pinzas y bistur. !

- Se lav el ovario con suero siologico 3 veces. !

Fig. 1. Materiales utilizando en la practica.!

Fig. 3. Se lav el ovario para eliminar la sangre. !

Metodo de corte.!

Despus de lavar el ovario, se lo coloc sobre una placa petri, se seleccion un folculo de 3 mm de dimetro, se sujet el ovario y se lo realiz un corte supercial de manera transversal al folculo seleccionado. Se vaci todo el contenido folicular sobre una lamina porta-objetos y se lo observ en el microscopio o estereoscopio. !

! 4. Resultados ! !

Despus de realizar los dos mtodos propuestos en la practica, se pudo localizar ovocitos de manera exitosa utilizando ambos mtodos.!

Fig. 6. Visualizacin de un ovocito obtenido por el mtodo de aspirado folicular, utilizando un microscopio ptico, con objetivo 10X.!

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Fig. 4. Se utiliz para este mtodo ovarios de vaca con mltiples folculos.!

! Mtodo de aspirado folicular. ! !

En ambos ovarios utilizados se encontr ovocitos, a pesar de que haba transcurrido un tiempo considerable desde la muerte de la vaca. !

Despus de lavar el ovario, se lo coloc sobre una placa petri, se seleccion un folculo de 3 mm de dimetro, se sujet el ovario y se aspir el contenido del folculo utilizando una jeringa de 5 ml, luego se vaci el contenido del folculo sobre una lamina porta-objetos. Se observ en un microscopio o estereoscopio y nalmente se evalu la calidad de los ovocitos. !

Fig. 7. Visualizacin de un ovocito obtenido por el mtodo de corte, utilizando un estereoscopio.!

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Fig. 5. Mtodo de aspirado folicular.!

Ademas de localizarlos se los evalo de acuerdo a sus principales caractersticas morfolgicas, utilizando ! Se pudo observar ovocitos a diferentes estadios de maduracin, as como diferentes calidades de estos. !

5. Conclusiones.!

! Se pudo concluir:! ! ! !

ovulara usando hormonas, la recuperacin se realiza in vivo usando la tcnica de aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido. Se utiliza !

Primero, el metido de puncin folicular, tuvo mejores resultados que el mtodo de corte.! Segundo, la localizacion del los ovocitos usando un microscopio optimo es mas fcil y rpida que usando el estereoscopio.! Tercero, la recuperacin de ovocitos es una tcnica compleja que requiere mucha experiencia y conocimiento del operador para poder ser llevada a cabo con xito y en poco tiempo. !

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un medio de recuperacin de ovocitos rico en aminocidos y a los ovocitos recuperados se los clasica de acuerdo a su estadio de maduracin.! A los ovocitos que han sido clasicados como aptos, se los puede inseminar in vitro. Luego se los cultivo en medios celular especco, por ejemplos Dulbeccos o RPMI, luego cuando el embrin a llegado a un estado de estabilidad. el embrin se implanta en una vaca de comprobada fertilidad, la cual por lo menos ha salido preada una ves. !

! 6. Discusin.! !

Los resultados encontrados coinciden con lo reportado por Takagi et. al. que menciona mayores valores de ovocitos para el mtodo de aspiracin, que para el mtodo de corte seriado. Esto podra deberse a que cuando se realizan los cortes, parte del liquido folicular escapa. !

! 6. Aporte biotecnologico.! !

La recuperacin de ovocitos en biotecnologa puede ser usada en casos de que se tenga una vaca con excelentes caractersticas y esta no puede quedar preada cuando se le practica una inseminacin articial, a pesar de tener una calidad buena. !

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En estos casos se puede recuperar los ovocitos de la vaca, a la cual ha sido sper

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Cuestionario

1. Indicar otras mtodos de recuperacin de ovocitos. Diseccion . consiste en aislar cada folculo del resto de tejido con ayuda de pinzas y tijeras , liberando posteriormente os ovocitos tras la ruptura controlada del folculo intacto Recogida en masa: se realiza uun digestin del tejido ovrico con tripsina durante 1 hora y luego se realizas una filtracionovocitos/ ovario. Digesion del tejido ovrico con colagenasa.

2. Que aspectos deberan de tomarse en cuenta para hacer la clasificacin de ovocitos.

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! ! !

Durante mucho tiempo se ha intentado relacionar la morfologa del ovocito con el potencial de desarrollo del futuro embrin por ello es tan importante dar unos parmetros definidos respecto a lo que se considera un ovocito con una buena morfologa y por lo tanto con una buena calidad. De forma general se considera un ovocito maduro de buena calidad a aquel que presenta una forma esfrica, con una zona pelcida regular, un corpsculo polar intacto y con un citoplasma homogneo y sin inclusiones. As mismo presentar una buena expansin de las clulas del cmulus y clulas de la corona radiata. Segn estas caractersticas podramos dividir los ovocitos segn su calidad en: Grado A excelentes: COC S " con citoplasma granular homogneo, y con 4 o ms capas de clulas del cmulos. Grado B buenos: COC S " con citoplasma granular homogneo y con 2-3 capas de clulas del cmulus. Grado C regulares-malos: ovocitos parcial o totalmente denudados o con las clulas del cmulus expandidas y con el citoplasma no homogneo y oscurecido. -7Eckert and Niemann (1995) demostraron que no se encuentran diferencias en el potencial desarrollo entre los ovocitos de tipo A y B, por lo que en nuestro estudio los clasificaremos en excelentes-buenos y regulares-malos. Segn De Santis (2007), la seleccin de ovocitos con las mejores caractersticas morfolgicas no aseguran la llegada a buen trmino de los embarazo por lo que se debern de buscar parmetros ms fiables. 3. Indique la clasificacin, diferencias y las caractersticas caractersticas de los ovulos en cada una de sus etapas. de lo folculos y las

Desde la fecundacin y hasta que tiene lugar la transferencia en el tero materno, los ! embriones siguen un desarrollo que es valorado por los embrilogos diariamente. Aquellos

embriones que hayan llevado una correcta evolucin y se encuentren en mejor estado son los que sern seleccionados para su transferencia.! Dicha valoracin se realiza fundamentalmente siguiendo criterios morfolgicos (nmero de clulas, grado de fragmentacin, presencia de vacuolasetc), y teniendo en cuenta el da de desarrollo embrionario en el que se encuentran. No obstante, existe una gran heterogeneidad debido a la existencia de diferentes criterios de valoracin y a la subjetividad derivada de la observacin realizada por los embrilogos. La Asociacin para el Estudio de la Biologa Reproductiva (ASEBIR) estableci en 2007 una clasicacin con cuatro categoras dentro de las cuales se clasican los embriones antes de su transferencia. Esta clasicacin est basada en los resultados obtenidos de estudios multicntricos realizados en centros de reproduccin nacionales y en la literatura cientca publicada. En base a ellas, las cuatro categoras que se establecen son:!

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Categora A: Embrin de ptima calidad con mxima capacidad de implantacin.! Categora B: Embrin de buena calidad con elevada capacidad de implantacin.! Categora C: Embrin regular con bajas posibilidades de implantacin.! Categora D: Embrin de mala calidad con muy pocas posibilidades de implantacin.!

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4. Insique y seale con imgenes los vulos que deben de estar listos para una fertilizacin de embriones In vitro.

El mtodo ms comn y efectivo es la evaluacin morfolgica del embrin, usando criterios estndar que calican los embriones de acuerdo a la cantidad de clulas, rasgos del ncleo y el citoplasma, cubiertas embrionarias, procesos de degeneracin celular, y caractersticas asociadas al tiempo de cultivo embrionario. Dichos criterios establecen varias categoras en funcin de la velocidad de divisin, del grado de fragmentacin del embrin, asimetra de las blastomeras, multinucleacin, etc. En este sistema, el embrilogo, realizando un seguimiento diario, crea un registro de cada embrin con el objetivo de comparar cada una de las caractersticas y de acuerdo a estas transferir solo el mejor embrin.! Los embriones son rutinariamente cultivados entre dos y cinco das, e incluso hasta seis das despus de la recuperacin de los ovocitos. A veces es muy difcil decir qu embriones son los mejores, especialmente cuando slo tienen dos o tres das en cultivo. Varios embriones procedentes de una misma pareja pueden parecer muy similares en esta etapa. Por ello en algunos casos y dependiendo de las condiciones de la mujer y el nmero de embriones, es

recomendable llevarlos al estado de blastocisto, cultivndolos In Vitro hasta por cinco das. Solo los embriones ms sanos llegan al estado de blastocisto, en cultivo alrededor del 40% de los embriones alcanzan este estado. Los embriones que no logran avanzar, en la mayora de los casos son cromosmicamente anormales y no tienen la capacidad de mantener un embarazo saludable. As, el mayor benecio de extender el cultivo del embrin hasta el da cinco es una seleccin natural de los embriones de mejor calidad. Esto se traduce en un aumento en el nmero de embarazos y una reduccin en el riesgo de embarazos mltiples.!