ALIMENTE MODIFICATE GENETIC SI CU DESTINATII SPECIALE

CURS 7
Capitolul 3:

ALIMENTATIA IN CAZUL DEREGLARILOR METABOLICE

01. 04.2014

In acest capitol vorbim despre

Erori innascute de metabolism

1. Dereglari ale metabolismului aminoacizilor si proteinelor: fenilcetonuria, dereglari ale metabolismului tirozinei, celiachia. (continuare)

DEREGLARI ALE METABOLISMULUI

AMINOACIZILOR SAU PROTEINELOR (continuare)

FENILCETONURIA (PKU)
boala congenitala care, netratata, afecteaza serios creierul si, deseori, produce moartea la cateva saptamani de la nastere. Organismul bolnav nu este capabil sa biosintetizeze

fenilalanin

hidroxilaza

(EC 1.14.16.1), enzima care catalizeaza transformarea fenilalaninei in tirozina. Acumularea fenilalaninei si a derivatilor sai (fenilpiruvat, fenilacetat si fenillactat) in sange si in lichidul cefalorahidian produce convulsii, anemie, alterarea functiilor cerebrale insotita de retardare mintala, iar pielea devine rugoasa. Boala poate fi detectata si prin nivelul crescut de fenilacetilglutamina in urina pacientilor, de unde si numele bolii.

Metabolismul fenilalaninei
- in conditii normale:
Transformare biochimica dependenta de cofactorul

5,6,7,8-tetrahidrobiopterina

fenilalaninhidroxolaza

Variante tehnologice

1. Proteina este mai intai descompusa, prin hidroliza acida, in aminoacizii constituenti, dupa care Phe este indepartata din amestec cu ajutorul carbunelui activ.
Inconveniente: randament mic (max. 50%), deoarece se adsorb pe carbunele activ si alti aminoacizi. Aminoacizii hidrofobi sunt adesea retinuti aproape integral pe carbune ei trebuie adaugati ulterior in produs. In plus, carbunele activ folosit drept adsorbant nu poate fi regenerat metoda este f. scumpa.

2. Indepartarea Phe cu ajutorul rasinei Amberlite XAD-4 din hidrolizatul acid de cazeina.
Prin aceasta metoda se reduce procentul de Phe din amestecul de aminoacizi de la 3.42% la 1.35%, cantitate inca prea mare pentru ca produsul sa poata fi utilizat ca sursa de azot proteic de catre pacientii cu PKU.

Instalatie pentru obtinerea hidrolizatului acid lipsit de fenilalanina

Variante tehnologice
3. Indepartarea Phe dintr-un hidrolizat proteic acid cu ajutorul unei rasini puternic schimbatoare de anioni. Inconvenient: Rasinile puternic schimbatoare de anioni necesita utilizarea solutiilor tampon varianta tehnologica nu poate fi extinsa la scara industriala. 4. Materia prima este constituita din lapte praf degresat sau cazeinat, care se supune hidrolizei enzimatice, mai intai cu o proteaza produsa de o tulpina de Aspergillus oryzae, apoi cu papaina. Hidrolizatul obtinut este amestecat cu carbune activ (raport masic carbune activ: proteina = 3:1) se indeparteaza 92% din cantitatea de Phe, la un randament in proteina de 50%. 5. Hidroliza acida este inlocuita de o hidroliza enzimatica, cu scopul indepartarii aminoacizilor aromatici C-terminali in forma libera. Inconvenient: Phe nu se elimina complet (chiar si la utilizarea a 425% C activ fata de materialul proteic), iar pierderile tehnologice sunt de aprox. 50%.

Instalatie pentru hidroliza enzimatica a proteinelor si retinerea Phe pe carbune activ

Variante tehnologice
6. Pt. imbunatatirea gustului si conferirea unor calitati cat mai apropiate de ale unei proteine native, la inceputul anilor 70 au demarat cercetarile privind producerea proteinei PKU prin metode enzimatice. Una dintre aceste metode, in doua etape, utilizeaza pepsina pt. hidroliza proteinei din zer, a.i. Phe sa se regaseasca la capatul C-terminal al peptidei. Mai departe, Phe este indepartata ca aminoacid liber prin actiunea unei carboxipeptidaze sau a unui preparat comercial cu activitate carboxipeptidazica.

7. Hidroliza proteinei are loc intr-o singura etapa, cu ajutorul unei enzime care poseda atat activitate endopeptidazica, cat si exopeptidazica, Phe fiind separata din amestecul rezultat prin cromatografie in faza de gel.

Inconvenient: Aceste metode nu sunt satisfacatoare din punctul de vedere al utilizarii lor la nivel industrial, productivitatea fiind mica, iar produsul proteic obtinut, prea scump si lipsit de un gust acceptabil.

Variante tehnologice
Varianta tehnologica optima 8. Etapa 1: Material proteic: orice sursa de proteine: zer (35-85% proteine), cazeina sau concentrat proteic de soia (52% proteine). Continutul proteic al materiei prime influenteaza continutul proteic al produsului preferabil ca m.p. sa contina min. 70% proteine. In prima etapa a procesului, proteina de start este hidrolizata in proportie de 30-60% cu ajutorul unei enzime proteolitice (pancreatina, 3% fata de proteina).

Phe este eliberata ca aminoacid liber in proportie de 70-90% (aprox. 3.6-3.8% din hidrolizatul proteic obtinut este Phe). Dupa hidroliza enzimatica, hidrolizatul proteic este ultrafiltrat (pt. indepartarea proteinei nehidrolizate si a fragmentelor peptidice cu masa moleculara mare), iar permeatul este recuperat si concentrat prin evaporare pana la s.u. 50%. Ulterior, acesta se poate utiliza ca atare, sau se usuca prin pulverizare. Inainte de tratarea cu rasina adsorbanta pt. indepartarea Phe, concentratul sau pudra de proteina hidrolizata se disperseaza in apa fierbinte pana la 20-30% s.u.

Variante tehnologice
Varianta tehnologica optima Tratamentul cu rasina adsorbanta poate fi realizat la pH diferit, in functie de continutul in Phe urmarit al produsului. Astfel, la pH 6.5-7 continut max. de Phe de 0.5%; la pH 3-4 continut max. de Phe de 0.1%; in plus, profilul aminoacizilor in produsul final este mai echilibrat decat in cazul variantei tehnologice in care se foloseste o solutie neutra. Trebuie apreciat si nivelul ridicat de Tyr obtinut prin folosirea solutiei acide (deoarece adaugarea ulterioara a acestui aminoacid in produsul final este dificila, datorita solubilitatii sale reduse).

Atentie!

Este necesara indepartarea sarii rezultate in urma neutralizarii solutiei acide.

Etapa 2:

Hidrolizatul proteic este trecut pe o coloana umpluta cu rasina adsorbanta, la o viteza de curgere liniara de 0.1-1.3 m/h. Procesul de retentie necesita un anumit timp de reactie minim, determinat empiric ca fiind suficient atunci cand vit. de curgere liniara nu depaseste 1.3 m/h. Adsorbtia se imbunatateste la viteze de curgere mai mici, in schimb creste timpul necesar procesului costuri de productie mai mari.

Variante tehnologice
Varianta tehnologica optima

Coloana cu rasina astfel tratata este eluata cu apa, la aceeasi viteza de curgere cu care a fost trimis hidrolizatul proteic pe coloana. Proteina PKU este eluata din coloana inainte de Phe si de peptidele care contin Phe. Daca este cazul, sarurile (de ex. NaCl) sunt indepartate din fractiunea libera de Phe prin electrodializa. In final, aceasta fractiune proteica este concentrata pana la 70-80% s.u. La nevoie, concentratul proteic se usuca prin pulverizare. Randamentul in proteina al metodei este de 45-65%, in functie de caracteristicile produsului final.

Avantajul metodei consta in faptul ca rasina adsorbanta folosita poate fi regenerata cu sol. de NaOH 4%, dupa care poate fi imediat reutilizata.

Instalatie pentru hidroliza enzimatica a materialului proteic si indepartarea fenilalaninei cu rasina adsorbanta

Caracteristicile produsului final

Gradul de indepartare al Phe din materialul proteic este de 92-100%. Prin aceasta metoda se obtine o proteina PKU cu un continut de Phe mai mic decat acela al produselor obtinute prin metode mai vechi, bazate tot pe hidroliza proteinei (gradul de indepartare al Phe 90-95%). Profilul de aminoacizi al produsului proteic lipsit de Phe astfel obtinut este corespunzator in ceea ce priveste continutul in aminoacizi esentiali. Este necesara doar adaugarea unor cantitati suplimentare de Tyr si Met. Produsul este bogat in di- si tripeptide cu valoare nutritiva ridicata si contine aproximativ 25% aminoacizi liberi. Gustul preparatului este mult mai placut comparativ cu cel al altor produse similare. In plus, pudra este usor solubila in apa fierbinte.

Mai mult
S-a sugerat gasirea unor metode prin care Phe sa fie eliminata din creier sau prin care deficientele in aminoacizi cerebrali sa poata fi corectate. In plus, tratamentul de restrictionare a Phe in hrana devine tot mai greu de realizat pe masura inaintarii in varsta a pacientilor. Solutia este administrarea unui amestec de Val + Ile + Leu (VIL), alaturi de o dieta saraca in Phe. Pt. copiii mici, doza VIL este aprox. egala cu nivelul acestor aminoacizi din ratia zilnica de substitut proteic sarac in Phe (se dubleaza aportul de aminoacizi cu catena ramificata). Suplimentul VIL se adauga direct in formula proteica cu continut scazut de Phe, fiind administrat in timpul meselor si inainte de culcare. Pt. sugari, dozele VIL s-au ales tinand cont de concentratia acestor aminoacizi in laptele matern (aprox. de 2 ori mai mari decat necesarul). Raportul V:I:L = variabil (de la 1:1:1.5 la 1.5:1:2). Concentratia de Phe plasmatica se poate realiza si prin aport suplimentar de Thr. S-a realizat astfel un preparat de uz nutraceutic care contine min. 8g Thr la 100 g aminoacizi.

Solutii alternative
Ingineria genetica

Cea mai noua posibilitate de a realiza o proteina lipsita de Phe este modificarea genetica a proteinelor. Se rezolva astfel si problema palatabilitatii si cea a prelucrarii, deoarece se obtine o proteina intacta (nehidrolizata), dar lipsita de Phe, fara miros sau gust neplacut. Aceasta proteina este, cel mai adesea, o proteina vegetala care a fost modificata (dar nu prin hidroliza), in vederea eliminarii Phe. Termenul proteina intacta este folosit pt. desemnarea unei proteine naturale/native nehidrolizate. Proteinele naturale, modificate genetic, se pot folosi ca suplimente in formule nutritive sau combinate cu produse alimentare cu continut proteic scazut, putand fi prelucrate in mod similar alimentelor traditionale. Avantaje: pastrarea majoritatii proprietatilor fizice ale proteinei de origine (solubilitate, gust si miror aproape nesesizabile), ceea ce permite utilizarea lor in amestec cu diferite lichide sau alimente traditionale si prelucrari termice (fierbere, coacere) confera produsului o superioritate neta comparativ cu formulele clasice, care contin aminoacizi in stare cristalina, hidrolizate proteice sau polipeptide sintetice.

Obtinerea proteinei PKU prin inginerie genetica

Metoda consta in modificarea secventei aminoacizilor din proteina naturala, in scopul reducerii sau eliminarii Phe din structura proteica primara.

Numeroase surse proteice sunt incomplete dpdv nutritional (din compozitia lor lipsesc unul sau mai multi aminoacizi esentiali) avantajul metodei: imbunatatirea calitatii nutritive a proteinelor native. Este posibila crearea unei proteine care sa contina toti aminoacizii, cu exceptia Phe.

In terapia PKU se prefera utilizarea proteinelor tota lipsite de Phe, dar se pot utiliza si proteinele naturale modificate care contin 1-3 resturi de Phe.

Obtinerea proteinei PKU prin inginerie genetica Etape:

- Identificare genei care codifica o proteina nativa cu un continut relativ scazut de Phe; - modificarea secventei de baze azotate din codonii Phe; - expresia genei modificate; - izolarea proteinei a carei expresie genetica a fost modificata. Phe este codificat in ADN de tripletele TTT si TTC. Eliminarea acestor 2 codoni din fragmentul de gena va conduce la o gena modificata, capabila sa determine biosinteza unei proteine lipsite de Phe.

Obtinerea proteinei PKU prin inginerie genetica

Tehnici de modificare a genelor care codifica Phe: - Eliminarea secventelor nucleotidice care codifica Phe: a) cu ajutorul unor endonucleaze de restrictie se rupe gena structurala in anumite locuri, rezultand numeroase fragmente de acid nucleic al genei. Se indeparteaza fragmentele care codifica Phe, restul fragmentelor ramase se pot reasambla proteina intacta modificata lipsita de Phe. b) prin digestie cu o endonucleaza, urmata de tratamentul cu o exonucleaza si apoi reasamblarea fragmentelor de ADN ramase. - Modificarea secventelor nucleotidice care codifica Phe: mutageneza localizata.

ARN

Obtinerea proteinei PKU prin mutageneza localizata

Metoda implica o modificare minora a genelor structurale care codifica proteinele naturale proteinele rezultate vor pastra majoritatea proprietatilor fizice ale proteinei initiale (inclusiv dimensiunile, solubilitatea). Codonii Phe pot fi inlocuiti cu codoni ai altor aminoacizi nepolari asemanatori (Ile) pastrarea proprietatilor fizice ale proteinei de plecare. Este de preferat ca MG sa se aplice proteinelor care sunt in mod natural sarace in Phe (sub 12 resturi de Phe, preferabil maxim 7).

Ex.: proteinele vegetale de rezerva (proteinele care se acumuleaza in cantitati mari in procesul de formare a semintelor si sunt rapid hidrolizate in cursul germinarii)
sunt prezente in celulele veg. in conc. mare si intr-o forma stabila;

genele care le codifica au fost complet caracterizate pentru porumb, fasole, mazare, orez, floarea-soarelui, bumbac, sorg, soia si arahide.

Aplicatie:
Modificarea zeinei din porumb

Zeina reprezinta 60% din totalul proteinelor din endospermul semintelor de porumb.
dpdv al masei moleculare: gama-zeine (16 si 27 kDa); alfa-zeine (22kDa); beta-zeine (19 kDa). sunt solubile in alcool si se pot purifica prin extractie cu o solutie alcoolica in prezenta unui agent reducator (2-mercaptoetanol) sau cu sol bisulfit de Na 0.3M in izopropanol 10%. Contine 2 resturi de Phe;

Aminoacizi limitanti Lys si Trp simultan cu indepartarea Phe se poate imbogati proteina in Lys si Trp (prin inlocuirea codonilor Phe cu codonii caracteristici Lys si Trp) creste valoarea biologica a proteinei initiale