CUM, CND I DE CE APAR SEMNALELE DE MBTRNIRE PE MEMBRANA HEMATIILOR UMANE: UN STUDIU AL RUGOZITII PRIN INTERMEDIUL AFM

MASTERAND: OLTEAN ROXANA-OANA

M. Girasole et al / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine (2010)

Rezumat
Studiul rugozitii membranei plasmatice a eritrocitelor bazat pe utilizarea microscopie de for atomic Investigarea fenomenului fiziologic complex de mbtrnire a eritrocitelor Progresul mbtrnirii determin o scdere drastic a rugozitii, aceasta fiind dependent de proprietile scheletului membranei

Obiective
Obiectivul specific al acestui studiu este de a aplica analiza rugozitii
Evaluarea de caracteristici specifice morfologice i biochimice care apar n timpul mbtrnirii eritrocitelor in vitro

1. Introducere
Eritrocitele umane pot fi considerate asemeni unor saci cu soluii concentrate de hemoglobin ncapsulate de o membran subire , sub care exist o reea bi-dimensional numit scheletul membranei[1]. Rugozitatea este un parametru important n caracterizarea i compararea suprafeelor care a primit un nou impuls n aplicaiile microscopiei de for atomic (AFM) a multor studii[2].

2.Metode
2.1 Pregtirea frotiurilor Probele de snge au fost obinute de la oameni sntoi i colectate n EDTA ca anticoagulant (1,5 mg / ml de snge)

Frotiurile au fost tratate n moduri diferite: (1) metoda uscrii cu aer; (2) incubate n mediu uor hipotonic; (3) au fost tratate conform procedurii microscopiei de scanare de electroni [3,4].

2.2 Pregtirea eritrocitelor pentru experimentele de mbtrnire Probele de snge au fost diluate cu o soluie ce conine 1 mM EDTA i 0,9% NaCl, dup care au fost centrifugate. Eritrocitele au fost incubate n soluia de ntinerire compus din: 10 mM inozin, 10 mM piruvat (sare de sodiu) i 75 mM fosfat. Frotiurilor au fost fcute manual prin rspndirea unei suspensiei pe lamelele de polilizin ale microscopului. 2.3 Microscopia de for atomic Msurtorile AFM au fost efectuate n prezen de aer, la temperatura camerei i cu o umiditatea relativ de 30% [5]. Msurtorile n modul de contact au fost efectuate ntr-un regim uor respingtor a forei constante cu o for a sondei sub 1 nN la deflexia cantileverului 0.

3.Rezultate
3.1 Proprietile majore ale rugozitii
1. Msurarea rugozitii suprafeei - n diferite zone ale membranei plasmatice a unei singure eritrocite

Figura 1. Distribuia de valori msurate a rugozitii nregistrate n diverse zone ale membranei plasmatice 1 m2 (A). Distribuia (B) este abrupt n jurul valorii rugozitii medii.

2. Consideraii similare pot fi extinse la ntreaga populaie de eritrocite care aparin aceluia eantion.

Figura 2. Distribuia valorilor medii a rugozitii celulelor ntr-o populaie de celule roii din snge se arat n A. distribuia (B) este abrupt n jurul valorii medii care prin urmare, poate fi folosit ca o etichet a ntregului eantion.

3. n orice prob dat poate fi fcut o comparaie ntre valoarea rugozitii msurat pe celule cu diferite forme de ansamblu (discocite, sferocite, celule plate) [6].

Figura 3. ntr-o prob valoarea rugozitii nu depinde de forma ansamblului de celule. O vedere este dat n figura (A) i (B), care prezint dou celule roii din snge n form diferit.

4.Valoarea rugozitii este strns legat integritatea scheletului membranei celulare [7].

de

Tabel 1. Compararea rugozitii medii msurate pe diferite probe de celule roii

Proba Rugozitate medie -valoare eroare(nm)

Sferocite (1) Sferocite (2) Eritrocite incubat n mediu hipotonic

1.69 0.18 1.47 0.11 3.110.22

Aer uscat Aer uscat+ DMSO HMDS-uscat Aer uscat+ 80M citocalazin D HMDS-uscat+ 80M citocalazin

3.18 0.22 3.10 0.23 3.30 0.24 1.56 0.10 1.700.26

3.2 Interaciunea dintre rugozitate i modificrile biochimice care ajut la elucidarea mbtrnirii hematiilor

Figura 4. Variaia valorii medii a rugozitii n funcie de timpul de mbtrnire msurat n lipsa nutrienilor. O scdere progresiv a acestui parametru se observ n ( A) (E) care este sensibil la agregarea scheletului membranei i duce la apariia i evoluia markerilor de mbtrnire microscopici din membrana celulelor roii din snge .

3.3 Reversibilitatea limitat a efectelor de mbtrnire aprute pe suprafa eritocitelor

Figura 5. Imaginile de nalt rezoluie a membranei plasmatice a celulelor ntinerite dup 1 zi (A), 4 zile (B), i 8 zile (C) de la mbatranire. Eecul legat de efectul rugozitii dup opt zile rezultat prin meninerea markerilor morfologici de mbtrnire, cum ar fi spiculele i umflturi mici pe membran.

Figura 6 Evoluia morfologic n timpul re-mbtrnirii dup ce celule roii din snge au fost ntinerite la momente diferite. Datele prezentate n (A) i (B) corespund celulelor revitalizate dupa o zi de mbtrnire i a evoluiei lor la 3 si 7 zile dup re-mbtrnire. n mod similar, datele prezentate n (C) i (D) i n (E) i (F) arat probele ntinerit dup

4 i 8 zile de mbtrnire.

4. Discuii
Rugozitatea membranei este un parametru morfologic sensibil la structura scheletului membranei. Tendina descresctoare n funcie de timp a rugozitii membranei n cadrul tratamentului de ntinerire se determin o revenire la variaile rugozitii. Aplicarea unui studiu AFM-metod de caracterizare a procesului de mbtrnire a eritrocitelor realizat n absena presiunilor exterioare i n condiii de ATP sczut.

 Rezultatele raportate n acest articol : (1)arat utilitatea rugozitii pentru a caracteriza procesul de mbtrnire al eritrocitelor printr-o metod nedistructiv bazat pe colectarea cantitativ i de imagini tridimensionale, (2) sugereaz c analiza AFM a rugozitii eritrocitelor poate duce la identificarea de evenimente care afecteaz supravieuirea eritrocidelor n timpul depozitrii i dup transfuzie.

5. Concluzii
n concluzie, aceste rezultate ofer un cadru de referin pentru viitoarele studii spre dezvoltarea condiiilor de stocare mai bune i tratamente celulare pentru a reduce efectele secundare ale transfuzie de eritrocite.

Bibliografie
1.Sens P, Gov N. Force balance and membrane shedding at the red-bloodcell surface. Phys Rev Lett 2007;98:18102-4. 2.Bonnell D. Scanning probe microscopy and spectroscopy: theory, techniques and applications. New York: Wiley; 2000. 3. Bray DF, Bagu J, Koegler P. Comparison of HMDS and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microsc Res Tech 1993;26:489-95. 4.Braet F, De Zanger R, Wisse E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. J Microsc 1997;186:84-7. 5.Cricenti A, Generosi R. Air operating atomic force-scanning tunnelling microscope suitable to study semiconductors, metals and biological samples. Rev Sci Instrum 1995;66:2843-7. 6.Simpson LO. Blood from healthy animals and humans contain nondiscocytic erythrocytes. Br J Haematol 1989;73:561-4. 7.Liu SC, Derick LH, Agre P, Palek J. Alteration of the erythrocyte membrane skeletal ultrastructure in hereditary spherocytosis, hereditary elliptocytosis, and pyropoikilocytosis. Blood 1990; 76:198-205.