UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI, CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE CHIMIE I INGINERIE CHIMIC MASTERAT CCCMTD

CUM, CND I DE CE APAR SEMNALELE DE MBATRNIRE PE MEMBRANA HEMATIILOR UMANE: UN STUDIU AL RUGOZITII PRIN INTERMEDIUL AFM

MASTERAND OLTEAN ROXANA-OANA

CLUJ-NAPOCA 2010

CUPRINS

1. Introducere

2. Metode
2.1 Pregtirea frotiurilor pentru transformarea rugozitii ntr-un instrument de cercetare 2.3 Pregtirea eritrocitelor pentru experimentele de mbtrnire 2.3 Microscopia de for atomic 2.4 Influena parametrilor de achiziie asupra rugozitii hematiilor

3. Rezultate
3.1 Proprietile majore care fac din rugozitate un instrument util pentru investigarea biosistemelor 3.2 Interaciunea dintre rugozitate i modificrile biochimice care ajut la elucidarea mbtrnirii hematiilor 3.3 Reversibilitatea limitat a efectelor de mbtrnire aprute pe suprafa eritocitelor

4. Discuii

5. Bibliografie

1. Introducere
Eritrocitele umane (RBC) poat fi considerate asemeni unor saci cu soluii concentrate de hemoglobin (~ 20 Mm cu legturi de O2) ncapsulate de o membran subire compus dintr-un amestec complex de diverse lipide cu proteine dizolvate sau integrale. Sub aceast membran, exist o reea bi-dimensional de fibre reticulate (legate de membran prin proteine ancorate), cunoscut sub numele de scheletul membranei, care are o geometrie hexagonal remarcabil de simpl. n timpul mbtrnirii in vivo i in vitro (aceasta din urm apare de obicei n timpul stocrii de snge pentru transfuzie), hematiile sunt supuse mai multor modificri biochimice. Ca exemple avem: epuizarea adenozin trifosfatului (ATP), epuizarea de 2,3bisfosfogliceratului, scderea pH-ul intern i variaia morfologic a formei normale n repaus, pe un disc biconcav aplatizat numit discocite, ntr-un corp sferic acoperit mai mult sau mai puin cu proeminene ascuite numit spicule (i celule echinocite). Aceste conversii au loc prin procese care implic o decuplare a scheletului membranei din lipidele bistratificate [1]. Mai mult, pierderea membranei hematiilor, dup epuizarea ATP-ului sau cretere de Ca2+ din citosol in vitro, prin eliberarea de vezicule din spiculele celulelor care au suferit transformri echinocitice; n timpul duratei de via a unei eritrocite, suprafaa i coninutul de lipide scad cu 20% ca urmare a eliberrii de vezicule [2]. Mai muli ageni i solvenii pot modifica sistematic i reversibil forma normal a eritrocitelor: anioni amfipatici, concentraii mari de sare, pH-ul ridicat, mbogirea de colesterol, sau intercalaiile fosfolipidelor ce induc diverse forme crenate, ntruct cationi amfipatici, nivelul sczut de sare, pH-ul sczut, i epuizarea colesterol, produc configuraii scobite (concave)cunoscut sub numele de stomatocites [3-6]. De asemenea i bolile de snge (sferocitoza ereditar, ovalocitoza i eliptocitoz [7] ) au fost asociate cu modificri ale formei eritrocitelor . Toate aceste transformri morfologice sunt determinate n mare msur de proprietile scheletul membranei [8, 9] i reversibilitatea lor depinde de nivel celular al ATPului (1 mol / ml pentru discocite, 0.5-0.12 mol / ml pentru ecinocite, i de 0,1 mol / ml pentru sferocite). Rugozitatea este un parametru important n caracterizarea i compararea suprafeelor care au primit un nou impuls din aplicaiile microscopie de for atomic (AFM) a multor

studii [10]. ntr-adevr, comparaia de caracteristici distinctive pe suprafaa probelelor n multe aplicaii biologice poate fi mai bine descris prin analiza statistic, dect prin

compararea structurilor mici strict legate de aranjamentul probelor locale, evaluarea rugozitii fiind astfel, un instrument important. Diferite abordri matematice pot fi aplicat n urmtorul calcul; cele mai frecvente sunt bazate pe msurarea valoarii medii ptratice a nlimii de suprafa:

N este numrul de puncte de date; Zi este nlimea n punct i, Zm este nlimea medie. Este demn de remarcat faptul c rugozitatea suprafeei este, prin definiie, o morfologie legat de un parametru identificat prin limea de distribuie (gaussian) a nlimi: lrgimea nlimi de distribuie duce la valori mai mare ale rugozitii. Definiia Rrms are avantajele conservrii conceptul intuitiv de suprafa robust [11,12] i permite o simpl msurare experimental, n care nlimile suprafeei sunt punctele ale unei imagini AFM; cu toate acestea, metodele alternative pentru a calcula rugozitatea poat fi folosite [13] la ntrun cadru matematic complex. n ciuda potenialului de rugozitate a suprafeei ca un parametrul statistic sensibil pentru a compara suprafee, utilizarea sa n analiza de biosisteme a fost destul de limitat. Bine cunoscute sunt, de exemplu, studiile de influen a nano-i micro-rugozitii asupra substraturilor din celul [14,15] i importana lor pentru biomateriale, suprafee bio, i proteze, dar s-au ncercat i cteva abordri pentru utilizarea rugozitii ca parametru direct la evaluarea unui biosistem. Aceasta se datoreaz, gradului de complexitate al unui sistem cu o rugozitate fiabil bazat pe apropierea n probele cu un grad mare de variabilitate intrinsec cum ar fi n biosisteme. n acest cadru, hematiile sunt probele ideale , pentru c ntr-un studiu recent [17] s-a demonstrat c, n conformitate cu condiiile operative bine-definite evaluarea rugozitii membranei plasmatice a eritrocitelor poate fi un instrument unic pentru studiile morfometrice cu aplicaii interesante n investigarea relaiilor structur-funcie din hematii.

Obiectivul specific al acestui studiu este de a aplica analiza rugozitii printr-un fenomen fiziologic complex: o evaluare de caracteristici specifice morfologice i biochimice ale unor modificrile care apar n timpul mbtrnirii eritrocitelor in vitro n condiii n care acestea reduc rspunsurile celulei la stimulii externi (lipsa de surse de energie extracelular).

2. Metode 2.1 Pregtirea frotiurilor pentru transformarea rugozitii ntr-un instrument de cercetare
Probele de snge, colectate n etilenediaminetetracetate (EDTA) ca anticoagulant (1,5 mg / ml de sange), au fost obinute de la oameni sntoi i dup consimmntul informat, de la pacieni din Clinica de Hematologie, Universitatea din Roma "La Sapienza".Probele au fost imediat diluate de cinci ori prin tamponare cu o soluie salin izotonic care conine 5 mM glucoz , iar frotiurile au fost realizate prin ntindere manual. Frotiurile au fost tratate n moduri diferite: (1) au fost pstrate instabile i curate (metoda uscrii cu aer), (2), au fost incubate n mediu uor hipotonic pentru mrii celulele fr a afecta structura membran-schelet, sau (3) au fost tratate conform cu procedura microscopiei de scanare de electroni cu excepia nlocuirii etanolului pentru deshidratare cu hexametildisilazan (HMDS). Aceast metod de uscare HMDS a fost demonstrat n mod similar cu uscarea punctului critice n ceea ce privete conservarea morfologie celulei n cauz [18,19]. Atunci cnd este necesar, probele de snge au fost incubate cu 80 M (Concentraia final) citocalazina D dizolvat n dimetilsulfoxid (concentraie final 0.2-1% Vol / vol) timp de 30 de minute la temperatura camerei (21-23 C) nainte de a se ntinde.

2.2 Pregtirea eritrocitelor pentru experimentele de mbtrnire

Probele de snge au fost obinute de la oameni sntoi i au fost diluate imediat de trei ori cu o soluie ce conine 1 mM EDTA (sare disodic) i 0,9% NaCl. Dup centrifugare (de patru ori timp de 15 minute fiecare, la 3000 rpm) la 4 C pentru a elimina trombocitele i leucocitele, apoi eritrocitele s-au concentrat i s-au splat de patru ori n condiii sterile ntr-un mediu de glucoz PBS (Fosfat de potasiu 4 mM, 1 mM EDTA, NaCl i 140 mM), ajustat cu NaOH la un pH de 7.35. Mai mult dect att, hematiile au fost pstrate n atmosfer de monoxid de carbon (CO) (la 760 torr) la 4 C astfel nct s se minimizeze deteriorarea oxidativ n timpul duratei de via. Pentru a evita degradarea proteolitic, a fost adugat un

inhibitor de proteaz (fenilmetilsulfonil fluor, 1 mM). Sursa de energie intracelular (n principal ATP) a fost srcit prin incubarea hematiilor (RBC ambalate / PBS: n volum 1:5) ntr-un agitator cu termostat la 37 C, uor agitat timp de 24 de ore n atmosfer de CO (Torr 760) i n prezena unui amestec de antibiotice (gentamicin 5 ml / L, penicilin 1:100, streptomicin 1:100) pentru a preveni contaminarea bacterian. Incubarea pentru ntinerirea hematiilor senescente a fost efectuat prin agitarea uoar, ntr-un agitator termostatic la 37 C, dup amestecare au fost luate cte cinci volume de soluie aditiv la 1 ml de eritrocite care au fost scoase aseptic din containerul de depozitare dup intervale diferite de timp. Soluia ntinerit (IPP mediu) este compus, dup cum urmeaz din: 10 mM inozin (Sigma grad; Sigma- Aldrich, St Louis, Missouri), 10 mM piruvat (sare de sodiu, Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri), i 75 mM fosfat. S-a efectuat tratarea eritrocitelor cu o soluie salin la aceeai temperatur i la acelai interval de timp. Dup 4 ore de incubare, eritrocitele au fost splate i centrifugate de patru ori cu o soluie tampon de PBS i apoi au resuspendate n PBS ( ntr-un raport volumetric de 1:5). Ansamblul de analize pentru polifosfat de ATP a fost efectuat folosind teste spectrofotometrice Mannheim). Frotiurilor pentru msuratorile AFM au fost fcute manual prin rspndirea unei suspensii de eritrocite din plasma uman (raportul final de diluie 1:5 ) pe lamelele de polilizin ale microscopului (Menzel Glazer, Braunschweig, Germania). bazate pe oxidarea NADH la NAD+ (Roche Diagnostic, Germania

2.3 Microscopia de for atomic

Msurtorile AFM au fost efectuate cu ajutorul unui microscop descris n detaliu [20]. Aceast instrument, deja angajat n studiile anterioare pe eritrocite, [4,6,17] aer, la temperatura camerei i cu o umiditatea relativ constant de 30%. Msurtorile n modul de contact au fost efectuate ntr-un regim uor respingtor de for constant cu o for a sondei sub 1 nN la deflexia cantileverului 0. Imagini de nalt rezoluie au fost colectate, la o vitez de scanare de 0.25-0.35 Hz. Reproductibilitatea datelor, inclusiv absena vtmrii sau alterrii probei a fost testat atent datorit msurtorilor. poate fi operat sub condiii controlate de mediu. Msurtorile AFM au fost efectuate n prezen de

2.4 Influena parametrilor de achiziie asupra rugozitii hematiilor

Cnd se msur rugozitatea suprafeei a unei imagini AFM, mai muli parametri de achiziie ar putea avea o influen asupra valorii msurate. Aceti parametri, ale cror efecte au fost evaluate n detaliu [17], includ dependena dintre zona scanat i numrul de puncte date. Ca o consecin, atunci cnd se utilizeaz valoarea rugozitii pentru compararea unor probe diferite, zona de analizat trebuie s fie specificat i meninut constant (1 m2 n studiul de fa). Numrul de puncte pentru fiecare imagine trebuie s fie suficient de mare pentru a asigura o statistic solid. n cadrul acestui studiu a fost folosit o densitate de referin de puncte date de ~ 25.000 de puncte n imagini 1-m2. Mrimea i forma sondei AFM sunt, de asemenea, importante: vrful are o dimensiune finit care nu poate examina suprafaa ntr-un mod ideal . Mai mult dect att, diferite raze apicale i / sau fore de sond exercitate pe suprafa n timpul scanrii pot duce la diferite zone de contact (de exemplu la rezoluii diferite). Ca i consecin, rugozitatea ar putea fi subestimat de ctre o sum care este dificil de cuantificat. Pentru a evalua efectul diferitelor zone de contact, imagistica preliminar a aceleiai zone pentru diferitele eritrocite a fost efectuat cu forele sondei care acoper gama utilizat n experimente. Rezultatele au aratat efectele neglijabile (de 2 - 3%) pentru valorile rugozitii msurate . n ceea ce privete vrfurile, probelor AFM de Si3N4 ,model MSCTAUHW (Veeco, Camarillo, California), cu aceleai raze apicale (furnizate n termeni statistice de ctre productor), nlime de 3,5 M, i forma piramidal caracterizate printr-un unghi apical de 35 grade. Constanta elastic a fost 0.03 N / m. Dependena rugozitii membranei de mrimea varfului a fost evaluat prin msurarea rugozitii cu aceiai parametrii de achiziie (inclusiv fora sondei) pe aceleai celulele (ambele cu rugozit nalt i sczut) cu diferite tipuri de probe n modul de contact. S-a comparat MSCT-AUHW (Veeco, raze nominal apicale de 10-40 nm), utilizat pentru nregistrarea datelor din studiul de fa, cu modelul HWMS 06AU (Park Scientific Instruments, Santa Barbara, California; razele nominale apicale varind ntre 5-15 nm). Diferenele dintre valoarea rugozitii msurate prin aceste dou tipuri de sonde (i anume, efectele dimensiunii vrfului) sunt de circa 2-3%, n cadrul erorilor experimentale. Diferene

mai mici (aproximativ 1%) au fost observate comparnd valorile obinute cu diferite vrfuri individuale de la acelasi set de sonde MSCT-AUHW. Analiza datelor au fost efectuat utiliznd pachetul de software PW-WAVE (Visual Numerics, Houston, Texas), care permite analiza imaginii i calcularea rugozitii folosind o ordine stabilit integrat. n ceea ce privete analiza imaginii, nu a fost aplicat nici un filtru de zgomot , msurtorile care au fost realizate numai printr-o scdere de fond i atunci cnd este necesar, printr-o aliniere n plan.

3. Rezultate 3.1 Proprietile majore care fac din rugozitate un instrument util pentru investigarea biosistemelor
1. Msurarea rugozitii suprafeei se efectueaz n diferite zone ale membranei plasmatice a unei singure eritrocite i arat c valorile nregistrate sunt aproape unele de altele. Cu alte cuvinte, valoarea rugozitii membranei, practic este constant pe toat suprafaa celulei. O consecin direct este faptul c valoarea medie a msurtorilor rugozitii efectuate pe o anumit zon poat fi folosit ca o referin pentru ntreaga eritrocit. n cele ce urmeaz, o astfel de valoare medie a rugozitii este menionat ca etichet unicelular (Figura 1).

Figura 1. Distribuia de valori msurate a rugozitii nregistrate n diverse zone ale membranei plasmatice 1 m2 (A). Distribuia (B) este abrupt n jurul valorii rugozitii medii. 2. Consideraii similare pot fi extinse la ntreaga populaie de eritrocite care aparin aceluia eantion. n special, atunci cnd efectueaz pe multe probe rugoase, eritrocitele difer

i se nregistreaz ca etichet unicelular ntr-o histogram. Un exemplu concludent este dat n figura 2. Aceast remarc corespunde cu afirmaia c, n orice prob dat, rugozitatea membranei celulelor diferite este echivalent.Astfel, valoarea medie a tuturor etichetelor unicelulare potate fi introdus ca un numr convenabil care s nsumeze proprietile pe care le are rugozitatea asupra probei. Aceasta reprezint o valoare de mijloc i este definit ca rugozitatea medie a probei i a fost calculat,de obicei, pe 50 celule pentru fiecare prob (dei de multe ori, n cazul n care este un numr mai mic de celule este considerat neglijabil efectel asupra unei valori medii msurate).Valoarea medie a probei, nu se schimb atunci cnd eritrocitele din utilizarea aceeai serie de soluii se supun tratamentelor chimice care rezult din standard pentru manipularea probei(de exemplu, fixarea

protocoalelor

paraformaldehidei; colorarea albastr a cresilului; uscarea HMDS ; uscare cu aer) [17]

Figura 2. Distribuia valorilor medii a rugozitii celulelor ntr-o populaie de celule roii din snge se arat n A. distribuia (B) este abrupt n jurul valorii medii care prin urmare, poate fi folosit ca o etichet a ntregului eantion. 3. n orice prob dat poate fi fcut o comparaie ntre valoarea rugozitii msurat pe celule cu diferite forme de ansamblu (discocite, sferocite, celule plate) care pot fi observate chiar i n frotiurile de snge de la donatori perfect sntoi [21]. Interesant este (Figura 3), compararea statistic a valorilor msurate pentru celulele plate i discoidale (observate n aceeai prob) care relev faptul c valoarea rugozitii este aceeai, independent de forma celulelor de ansamblu. Astfel, rugozitatea este legat mai degarb de informaii structurale care sunt mai profunde dect ceea ce apare n morfologia ansamblului de celule.

Figura 3. ntr-o prob valoarea rugozitii nu depinde de forma ansamblului de celule. O vedere este dat n figura (A) i (B), care prezint dou celule roii din snge n form diferit. 4. Valoarea rugozitii este strns legat de integritatea scheletului membranei din celul. ntr-adevr, dup cum se vede n tabelul 1, celulele cu defecte la nivelul scheletului membranei (de la oameni bolnavi [22] sau dup tratament chimic), au o rugozitate medie, valoare care poate fi cu 50% mai mic dect cea a celulelor normale. Dup tratarea rugozitii discocitelor cu citocalazin D, care trece prin membran eritrocitelor i depolimerizeaz parial reeaua citoscheletului, se observ o scdere a valorii rugozitii membranei [17]. Compararea rugozitate de celule roii (RBC) * medie valorilor msurate pe diferite probe

Tabel 1. Compararea rugozitate medie valorilor msurate pe diferite probe de celule roii (RBC) * Proba Sferocite (1) Sferocite (2) Eritrocite incubat n mediu hipotonic Aer uscat Aer uscat+ DMSO HMDS-uscat Aer uscat+ 80M citocalazin D HMDS-uscat+ 80M citocalazin Rugozitate medie -valoare eroare(nm) 1.69 0.18 1.47 0.11 3.110.22 3.18 0.22 3.10 0.23 3.30 0.24 1.56 0.10 1.700.26

*Valoarea nregistrat este joas, dac i numai dac scheletul membranei celulare este defect i, prin urmare, nu este legat corespunztor de stratul dublu lipidic. Sferocitele au fost msurate de la doi pacieni cu diferite simptome clinice; citocalazina D este un agent chimic

care rupe selectiv cteva proteine din scheletul membranei; DMSO (dimetilsulfoxid) a fost utilizate pentru transportul citocalazina D n celul. n concluzie, rugozitatea membranei eritrocitare este un parametru morfologic care leag mpreun dezvoltarea alterrii nanometrice pe membrana celulei cu apariia defectelor pe scheletul membranei. Acestea din urm, poate fi cuantificat n ceea ce privete valorile medii sau un procent al celulelor din populaia care poart defecte structurale.

3.2 Interaciunea dintre rugozitate i modificrile biochimice care ajut la elucidarea mbtrnirii hematiilor
Procesul de mbtrnire este un fenomen destul de complicat, care implic interrelaii puternice ntre celule i mediul lor. Astfel, cascada de evenimente care se ateapt s fie diferite i diverse este influenat de agenii de mediu atunci cnd apar, de exemplu, n circulaia sngelui sau ntr-un mediu artificial de stocare. n contrast cu eliminarea efectiv a operaiunilor in vivo, eritrocitele senescente nu sunt scoase din pungile de depozitare i, prin urmare, pot elibera substane care pot accelera procesul de mbtrnire in vitro. Pentru a simplifica acest cadru complex, atenia a fost ndreptat spre un proces pur de mbtrnire, un proces care apare pe eritrocitele ideal izolate ncorporate ntr-un solvent tamponat care nu ofer nici nutrieni, nici efectori extracelulari. n acest scop, eritrocitele au fost complet epuizate de ATP-ul lor original (i 2,3-bisfosfogliceratul) inute 24 de ore n incubare la 37 C n mediu de PBS. Un astfel de tratament a fost ales din urmtoarele motive: (1) se asigur o intrare rapid n calea mbtrnirii; (2) pstreaz populaia de celule aproape omogen; (3) acesta previne dependena ATP-ului de enzimele implicate n reparaia eritrocitelor pentru a funciona corect, astfel nct nici o deteriorare legat de mbtrnirea populaiei s nu poat rmne ascuns. n aceste condiii experimentale, eritrocitele au fost depozitate pe durate diferite de timp n atmosfer de CO, i apoi analizate de ctre AFM; valoarea medie a rugozitii la momente diferite de mbtrnire este raportat n Figura 4. n mod clar, variaiile legate de scheletul membranei sunt mai rapide n primele 6-7 zile atunci cnd se observ o scdere a rugozitii medii. La mai mult timp de mbtrnire, rata variaie ncetinete i valorile rugozitii msurate n diferite probe sunt mai mult sau mai puin echivalente.

Figura 4. Tendina valorii medii a rugozitii n funcie de timpul de mbtrnire msurat n lipsa nutrienilor. O scdere progresiv a acestui parametru se observ n( A) (E, care este sensibil la agregarea scheletului membranei i duce la apariia i evoluia markerilor de mbtrnire microscopici din membrana celulelor roii din snge . Dup cum s-a explicat n seciunea anterioar, rugozitatea membranei eritrocitelor este sensibil la arhitectura scheletului membranei, astfel nct valorile reduse pot fi corelate cu un suport exercitat de ctre reeaua membran-schelet suprapuse pe lipide bistratificate [23]. Datorit condiiilor experimentale alese (atmosfera de CO i inhibitori de proteaz), procesul de mbtrnire neltoare (fenomenologic sugerat de valoarea rugozitii descresctoare), ca urmare a activitilor de proteaz i / sau de stres oxidativ, poate fi exclus. Cu alte cuvinte, ceea ce s-a observate direct corespunde unei remodelri legate de mbtrnirea scheletului membranei care conduce la lipsa de ATP n celul. Lund n considerare avantajele AFM pe baza datelor, rugozitatea medie a probei poate fi corelat cu modificrile morfologice la nivelul membranei n timpul perioadei de mbtrnire. Morfologiile cele mai tipice ale celulelor au fost raportate n imaginile A-E din Figura 4. Dup o incubaie de o zi la 37 C n mediu de PBS (n absena unor surse de energie), materialul membranei plasmatice este nc omogen i nanostructurat, cum sunt de obicei msurate probele proaspete (Figura 4, A). n procesul de mbtrnire in vitro, poate fi observat o evoluie morfologic definit: o dezvoltarea progresiv a proeminenelor de

dimensiuni nano (ziua 5, Figura 4, B), care evolueaz n proto-spicules (ziua 8, Figura 4, D) i apoi n spicule mature care elibereaz progresiv vezicule (Ziua 12, Figura 4, C) de diferite dimensiuni, pn la punctul de distribuie extins de vezicule cu dimensiuni nano i micro ce pot fi observate n jurul de fiecrei probe de eritrocite (ziua 16, Figura 4, E). Este demn de subliniat faptul c evoluia morfologic a celulor la nivel microscopic const n ntregime n dezvoltarea markerilor de mbtrnirea i a creterii severitii membranei. Apariia de protuberane, spicule i vezicule, care formeaz prin plierea i rearanjare lipidic bistratificat, reeaua citoscheletului ce se [23] potrivete perfect n schema de funcionalitate structural a membranei-schelet, care pot fi deduse din scdere progresiv a rugozitii medii. Una dintre consecinele acestui proces este faptul c hematiile pierd poriuni din membran, conducnd la o veziculare extins i la un volum sczut al celulei, care sunt considerai markeri ai mbtrnirii la nivel nanoscopic.

3.3 Reversibilitatea limitat a efectelor de mbtrnire aprute pe suprafa eritocitelor

Datorit scderii concentraiei de ATP sunt observate fenomenele n care hematiile stocate sunt tratate cu o soluie de ntinerire capabil de a furniza precursori necesari care permit celulelor repornirea glicolizei (adic producerea ATP-ului n eritrocite). Aceast soluie (IPP) a fost administrat prin incubarea (la 37 C timp de 3 ore) eritrocitelor mbtnite la diferitele etape de mbtrnire ( a se vedea figura 4). Pentru a testa eficiena acestei proceduri de ntinerire, au fost efectuate simultan pregtiterea eritrocitelor incubate pentru analiza AFM i msurtorile concentraiei de ATP. Rezultatele rugozitii observate i concentraia de ATP intracelular n funcie de timp sunt raportate n Figura 5, A i B; cele dou tendine sunt n mod substanial cuplate. ntr-adevr, atta timp ct tratamentul de intinerire este capabil s rencarce o cantitate suficient de ATP n celul (50% din valoarea iniial), rugozitatea i poate rectiga valoarea sa iniial. Acest lucru este adevrat, atunci cnd ntinerirea s-a ncercat dup 1 sau 4 zile de la mbtrnirea in vitro; pe de alt parte, n cazul n care tratamentul de ntinerire se face dupa 8 zile de depozitare, aceasta nu poate inversa biochimic valorile rugozitii. Acest lucru reprezint amprenta unei transformri ireversibile a hematiilor care are loc ntre ziua 6 i ziua a 8-a a mbtrnirii n lipsa nutrienilor.

Figura 5. Tendina valorii rugozitii medii (A) i coninutul de adenozintrifosfat intracelular (ATP) n celulele roii din snge revitalizat dup 1, 4, i 8 zile de mbtrnire prin incubare n soluie IPP(B). Diferene picurilor, att morfologic ct i din punctul reversibilitii biochimice, pot fi observate ntre 5 i 8 zile de mbtrnire, deoarece n acest moment incubarea n IPP nu a reuit s creasc valoarea rugozitii medii i nici concetraia de ATP intracelular. Tendinele de re-mbtrnire dup revitalizarea sunt, de asemenea raportate . Pentru a completa imaginea reversibilitii fenomenului de mbtrnire, prin imagistica AFM se poate realiza o descriere morfologic. Figura 6 ne arat topografiile AFM a membranei tipice de eritrocite ntinerite dup 1, 4, i 8 zile (Figura 6, A, B, C ). Dei membrana celulelor ntinerite dup 1 sau 4 zile apare destul de omogen i seamn satisfctor cu morfologia unei probe proaspete , membrana celulelor ntinerit, dup opt zile prezint mici proeminene i spicule slab ataat la suprafaa sa, dovedete eecul revenirii markerilor de mbtrnire la un nivel microscopic. Aceste dovezi sprijin ideea unei stop metabolic ireversibil pentru aceste probe cu repercusiuni asupra structurii stabile a eritrocitelor (producia de vezicule).

Figura 6. Imaginile de nalt rezoluie a membranei plasmatice a celulelor ntinerite dup 1 zi (A), 4 zile (B), i 8 zile (C) de mbatranire. Eecul legat de efectul rugozitii dup opt zile rezultat prin meninerea markerilor morfologici de mbtrnire, cum ar fi spiculele i umflturi mici pe membran

n cele din urm, este remarcabil faptul c, n urma tendinelor de rembtrnire a probei ntinerite ( n Figura 5), reapariia n ordine cronologic a markerilor morfologici de mbtrnire pentru proba original este descris n Figura 4 . Exemple de apariie i evoluie a markerilor morfologici n timpul re-mbtrnirii sunt prezentate n Figura 7. Rezultatele cele mai evidente sunt (1), cu ct mai repede se face tratamentul de ntinerire, cu att mai bine funcioneaz din punct de vedere morfologic i (2) cu ct se face mai trziu ntinerirea, cu att mai repede markerul morfologic (spiculele) se observ n timpul ulterioarei re-mbtrniri.

Figura 7. Evoluia morfologic n timpul re-mbtrnirii dup ce celule roii din snge au fost ntinerit la momente diferite. Datele prezentate n (A) i (B) corespund celulelor revitalizate dupa o zi de mbtrnire i a evoluiei lor la 3 si 7 zile dup re-mbtrnire. n mod similar, datele prezentate n (C) i (D) i n (E) i (F) arat probele ntinerit dup 4 i 8 zile de mbtrnire.

4. Discuii
S-a demonstrat [1, 17] c rugozitatea membranei este un parametru morfologic sensibil la structura membranei-schelet. S-a dovedit c, atunci cnd sprijinul mecanic exercitat de ctre membrana-schelet pe suprafaa lipidic bistratificat (ca n cazul unor patologii de snge sau dup tratamentul cu agenii de polimerizare ai citoscheletului), valoarea rugozitii msurate scade dramatic (vezi tabelul 1). n studiul de fa a fost raportat tendin descresctoare n funcie de timp a rugozitii membranei, prin urmare au fost propuse unele consideraii n scopul interpretrii ultimelor evenimente ale acestui fenomen complex (de exemplu, cele localizate pe membran). n condiiile experimentale alese, modificrile membranei pot fi atribuite dinamicii pure a reelei membran-schelet, modulate de concentraia intracelular de ATP i cuantificarea prin schimbrile valorii rugozitii. ntr-adevr, sursele posibile de rezultate falspozitive au fost prevenite prin adugarea de fluor i fenilmetilsulfonil, ndeprtarea extracelulare de cationi bivaleni (pentru a bloca activitatea proteolitic), prin meninerea eritrocitelor n atmosfer de CO (pentru a evita stresul oxidativ), i prin absena nominal de Ca2+ (pentru a mpiedica activitatea transglutaminazelor care duce la reticularea proteinelor din membrana schelet). Exist dovezi c membrana-schelet a eritrocitelor este un sistem de neechilibru ntr-o stare de echilibru [24,25] susinut de ATP hidrolizabil (convertit la adenozin monofosfat (AMP) din pirofosfat). ATP moduleaz fiziologic flexibilitatea membranei-schelet i rearanjamentul[24-26] prin declanarea gradul de disocieri al fibrelor de schelet. Mecanismul molecular, ntr-adevr, depinde de AMP activat protein kinaza, care fosforileaz proteine citoscheletului i induce disocierea tranzitorie a reelei de filamente de la membrana ataat de proteine [27,28] La fel ca nivelurile de ATP, fosforilarea de proteine (corespunztoare la o disociere a unei reea mai mari) crete, deoarece AMP-activat de proteine kinaza activitate este stimulat de AMP [1,28] Aceste evenimente transformate ntr-o reducere progresiv a conexiunilor mecanice ntre reele i proteinele integral ncorporate ntr-un strat bistratificat i ca o consecin este de ateptat o valoare mai mic a rugozitii msurate la creterea timpului de mbtrnire. n cadrul tratamentului de ntinerire (cu IPP), care prevede precursorii necesari pentru a reporni glicoliza i pentru a reconstrui ATP-ul intracelular, se determin o revenire la variaile rugozitii. Cu toate acestea, nici o leziune mbtrnire nu este reversibil dup 8 zile de mbtrnire in vitro, probabil din cauza eecului transportului transmembranar n eficiena

pompelor de ion [29] i / sau perturbarea cilor metabolice centrale. Hematiile constituie materia vie, att timp ct acestea i pstreaz capacitatea de a colecta precursori de energie din mediu (prin aciunea proteinelor cu transport specific sau transmembranar) i pentru ca acestea s ruleze metabolismul simplificat trebuie s produc ATP; n contrast acetia mor cnd cile membranare de transport nu mai funcioneaz (cu consecine negative asupra cilor metabolice ) i citoscheletul devine mai rigid dect este normal [26, 30]. Datele prezentate n aceast lucrare prezint un context aplicativ natural att sub aspecte teoretice ct i sub aspecte practice ale conservrii i transfuzie de snge. ntr-adevr, mbtrnirea eritrocitelor (care, ca o regul, duce la moartea celulelor) depinde de condiiile de mediu. Eritrocitele circulante reprezint, de obicei o gam complet de celule tinere i mature, iar circuitul de zi cu zi al hematiilor este de aa natur nct la persoanele sntoase, mai puin de 1% din celule sunt eliminate n fiecare zi. Studiile relevante [31,32] au artat c 20-30% din eritrocite sunt pierdute n primele 24 de ore dup transfuzie de snge i c exist un timp mediu de supravieuire redus pentru majoritatea celulelor rmase transfuzate; durata medie de via a eritrocitelor stocate scade de la valoarea normal de 120 de zile la 94 zile. Aceste observaii au fost explicate de ctre accelerarea proceselor fiziologice ale sngelui, i n special a mbtrnirii celulare care implic formarea veziculelor [33] n acest cadru, datele furnizeaz dovezi c, n condiiile din lucrarea de fa (absena unor surse de energie extracelular), rspunsul probei de eritrocite, msurat prin rugozitate membranar, pare foarte omogen i progresiv de-a lungul senescenei sale. Ca o dovad a ntregii cercetri, cutarea unui parametru este important att pentru a msura vrsta biologic a hematiilor ca o predictor posibil de soartare a lor dup transfuzie ct i pentru a mbunti condiiile de depozitare prin reducerea efectelor secundare nocive. ntr-adevr, dei organismul are mecanisme de compensare pentru celule n vrst, hematiile senescent asociate cu transfuzie are consecine patologice (un risc crescut de complicaii postoperatorii i reducerea supravieuirii pacientilor dup chirurgia cardiac) [34]. n concluzie, s-a aplicat o dezvoltare recent pe baza AFM, metoda de caracterizare a procesului de mbtrnire a eritrocitelor realizat n absena presiunilor exterioare (oxidare, efect de cationi i peptidaze) i n condiii ATP sczut. Datele prezint o scdere puternic a valorii medii a rugozitii membranei plasmatice odat cu creterea timpului de mbtrnire care a fost atribuit dinamicii reversibile dependente de ATP prin desfacerea legturii membranei-scheletul din membran. Slbirea structurale ale celulei corespunztoare duce la scderea rugozitii care a fost legat de depistarea n timp a evoluia markerilor morfologici ai procesului de mbtrnire. n cele din

urm, evaluarea morfologic i biochimice ale reversibilitii efectelor imbatranirii permite detectarea n limitele de timp nainte de transformarea ireversibil din structura eritrocitelor i metabolismul care are loc. Rezultatele raportate n acest articol (1) arat utilitatea rugozitii pentru a caracteriza procesul de mbtrnire al eritrocitelor printr-o metod nedistructive bazat pe colectarea cantitative i de imagini tridimensionale, i (2) sugereaz c analiza AFM a rugozitii eritrocitelor poate duce la identificarea de evenimente care afecteaz supravieuirea eritrocidelor n timpul depozitrii i dup transfuzie. Datorit faptului c vrsta eritrocitelor are un efect masurabil asupra rugozitii, se realizeaz compararea celulelor, se caut diferene pentru a prezice vrsta celulelor individuale i se ofer o baz intervenii raionale pentru a preveni eliminarea prematur a hematiilor. n concluzie, aceste rezultate ofer un cadru de referin pentru viitoarele studii spre dezvoltarea condiiilor de stocare mai bune i tratamente celulare pentru a reduce efectele secundare ale transfuzie de eritrocite. n acest cadru, informaii furnizate printr-o abordare bazat pe AFM pare a fi destul de inovatoare i promitoare.

5. Bibliografie
1. Sens P, Gov N. Force balance and membrane shedding at the red-bloodcell surface. Phys Rev Lett 2007;98:18102-4. 2. Were JM, Willekens FLA, Bosch FH, de Haans LD, van der Vegt SG, van den Bos AG, et al. The red cell revisited: matters of life and death, cellular and molecular biochemistry. 2004;50:139-46. 3. assessment. Biochemistry 1985; 24:2849-57. 4. Girasole M, Cricenti A, Generosi R, Congiu Castellano A, Boffi F, Arcovito A, et al. Atomic force microscopy study of erythrocyte shape and membrane structure after treatment with a dihydropyridinic drug. Appl Phys Lett 2000;76:3650-2. Ferrell JE, Lee KJ, Huestis WH. Membrane bilayer balance and erythrocyte shape: a quantitative

5.

Mohandas

N,

Chasis JA. Red blood cell deformability, membrane material properties and shape: regulation by transmembrane, skeletal and cytosolic proteins and lipids. Semin Hematol 1993;30:171-92. 6. Girasole M, Cricenti A, Generosi R, Congiu-Castellano A, Boumis G,Amiconi G. Artificiallyinduced unusual shapes in erythrocytes: an atomic force microscopy study. J Microsc 2001;203:1-8. 7. Liu SC, Palek J, Yi SJ, Nichols PE, Derick LH, Chiou SS, et al. Molecular basis of altered red blood cell membrane properties in Southeast Asian ovalocytosis: role of the mutant band 3 in band 3 oligomerization and retention by the membrane skeleton. Blood 1995; 86:349-58. 8. material. Curr Opin Cell Biol 2007;19:101-7. 9. Naka M. New insights into regulation of erythrocyte shape. Curr Opin Hematol 2002;9:127-32. 10. Bonnell D. Scanning probe microscopy and spectroscopy: theory, techniques and applications. New York: Wiley; 2000. 11. Washburn NR, Yamada KM, Simon Jr CG, Kennedy SB, Amis EJ. High-throughput investigation of osteoblast response to polymer crystallinity: influence of nanometer-scale roughness on proliferation. Biomaterials 2004;25:1215-24. 12. size and surface roughness. J Colloid Interface Sci 2006;304:524-9. 13. Simpson GJ, Sedin DL, Rowlen KL. Surface roughness by contact versus tapping mode AFM. Langmuir 1999;15:1429-34. 14. Haves JS, Richards RG. Surfaces to control tissue adhesion for osteosynthesis with metal implants: in vitro and in vivo studies to bring solutions to the patient. Exp Rev Med Devices 2010;7:131-42. Katainen J, Paajanen M, Ahtola E, Pore V, Lahtinen J. Adhesion as an interplay between particle Kasza KE, Rowat AC, Liu J, Angelini TE, Brangwynne CP, Koenderink GH, et al. The cell as a

15.

McLucas

E,

Moran MT, Rochev Y, Carroll WM, Smith TJ. An investigation into the effect of surface roughness of stainless steel on human umbilical vein endothelial cell gene expression. Endothelium 2006;13:131-42. 16. Girasole M, Cricenti A, Generosi R, Longo G, Pompeo G, Cotesta S, et al. Different membrane modifications revealed by atomic force/ lateral force microscopy after doping of human pancreatic cells with Cd, Zn, or Pb. Microsc Res Tech 2007;70:912-7. 17. Girasole M, Pompeo G, Cricenti A, Congiu-Castellano A, Andreola F, Serafino A, et al. Roughness of the plasma membrane as an independent morphological parameter to study RBCs: a quantitative atomic force microscopy investigation. Biochim Biophys Acta 2007; 1768:1268-76.

18.

Bray DF, Bagu J, Koegler P. Comparison of HMDS and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microsc Res Tech 1993;26:489-95.

19. study on hepatic endothelial cells. J Microsc 1997;186:84-7. 20.

Braet

F,

De

Zanger R, Wisse E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a

Cricenti semiconductors, metals and biological samples. Rev Sci Instrum 1995;66:2843-7.

A,

Generosi R. Air operating atomic force-scanning tunnelling microscope suitable to study Simpson LO. Blood from healthy animals and humans contain nondiscocytic erythrocytes. Br J Haematol 1989;73:561-4. 22. Liu SC, Derick LH, Agre P, Palek J. Alteration of the erythrocyte membrane skeletal ultrastructure in hereditary spherocytosis, hereditary elliptocytosis, and pyropoikilocytosis . Blood 1990; 76:198-205. 23. Liu SC, Derick LH, Duquette MA, Palek J. Separation of the lipid bilayer from the membrane skeleton during discocyte-echinocyte transformation of human erythrocyte ghosts. Eur J Cell Biol 1989;49:358-65.

21.

24. from cytoskeleton. Biophys J 2007; 93:1369-79. 25. human erythrocyte membrane. J Biol Chem 2006;381:22360-6. 26. cytoskeletal defects. Biophys J 2005; 88:1859-74. 27.

Borghi

N,

Brochard-Wyat F. Tether extrusion from red blood cells: integral proteins unbinding

Anong

WA,

Weis TL, Low PS. Rate of rupture and reattachment of the band 3-ankyrin bridge on

Gov

NS,

Safran SA. Red blood cell membrane fluctuations and shape controlled by ATP-induced

Klarl

BA,

Lang PA, Kempe DS, Niemoeller OM, Akel A, Sobiesiak M, et al. Protein kinase C mediates erythrocyte programmed cell death following glucose depletion. Am J Physiol 2006;290:C244-53. 28. by AMP-activated protein kinase. FASEB J 2009;23:1072-80. 29. apoptotic death of erythrocytes. Cell Death Differ 2003;10:249-56. 30. Tuvia S, Levin S, Bitler A, Korenstein R. Mechanical fluctuations on the membrane-skeleton are dependent on F-actin ATPase in human erythrocytes. J Cell Biol 1998;141:1551-61. 31. transfusion. Transfusion Med Rev 1999; 13:275-96. 32. Bosman GJCGM, Were JM, Willekens FLA, Novotn VMJ. Erythrocyte ageing in vivo and in vitro: structural aspects and implications for transfusion. Transfusion Med 2008;18:33547. 33. Willekens FLA, Were JM, Groenen-Dpp YAM, Roerdinkholder- Stoelwinder B, de Pauw B, Bosman GJCGM. Erythrocyte vesiculation: a self-protective mechanism. Br J Haemotol 2008;141:549-56. Hgman CF, Meryma HT. Storage parameters affecting red blood cell survival and function after Lang KS, Duranton C, Poehlmann H, Myssina S, Bauer C, Lang F, et al. Cation channels trigger Fller M, Sopjani M, Koka S, Gu S, Mahmud H, Wang K, et al. Regulation of erythrocyte survival

34.

Koch CG, Li L, Sessler DI, Figueroa P, Hoeltge GA, Mihaljevic T, et al. Duration of red-cell storage and complications after cardiac surgery.N Engl J Med 2008;358:1229-39.