IMUNOGLOBULINELE I RSPUNSUL IMUN UMORAL

Cursul 3

Unii autori au folosit denumirea de anticorp pentru a desemna substanele protectoare ce apar n ser, cu specificitate fa de un Ag corpuscular (bacterii).

Heidelberger (1930) a purificat Ac din ser i a evideniat c aparin fraciei proteice. Tiselius i Kabat (1938) au demonstrat experimental c, de cele mai multe ori, funcia de Ac este asociat cu fracia gama a proteinelor serice i le-au dat denumirea de gamaglobuline.

n 1970 OMS a stabilit ca substanele cu proprieti de Ac , s fie grupate n categoria imunoglobulinelor, pornind de la faptul c toate subst din acest grup au funcie imunitar i sunt cuprinse n fracia globulinic a serului.

Anticorpii nu sunt numai gamaglobuline. Exist i alte globuline cu funcie de Ac , dup cum exist i gamaglobuline care nu au activitate de Ac (de ex, proteinele patologice Bence-Jones). Totalul Ac formeaz o familie de proteine plasmatice numite imunoglubuline.
3

Molecula de Ig are 2 funcii distincte: recunoaterea specific a patogenului care a declanat RI i funcia biologic
(recrutarea altor celule i molecule pentru distrugerea patogenului dup legarea Ac de el).

Cele 2 funcii sunt separate structural n cadrul moleculei de Ig.

Relaia dintre structura i funcia Ig este rezultatul evoluiei moleculare, prin duplicarea i diversificarea unui domeniu din structura moleculei.
4

Ac sunt Ig care se sintetizeaz n organism dup ptrunderea unui Ag i au proprietatea de a se cupla specific cu Ag inductor i de a-i anihila aciunea nociv. Termenul de anticorp n accepiunea sa
actual, a fost folosit de Ehrlich (1891) n lucrarea Studii experimentale asupra imunitii.

n molecula Ig exist un paradox: uniformitatea domeniilor omologe i diversitatea domeniilor de recunoatere. Struct. de baz a Ac este reprezentat de domeniul imunoglobulinic. i alte proteine ale SI (receptorul limfocitelor T-TCR, moleculele MHC, moleculele CD4 i CD8) conin domenii similare, fiind incluse n superfamilia imunoglobulinelor (Ig).
5

Structura imunoglobulinelor Ig

Structura molec de Ig s-a stabilit prin analiza proteinelor

omogene secretate de plasmocitoame, cu metodologii complexe: biochimice,analitice, cristalografia prin difracie cu raze X.

Unitatea structural de baz a molec de Ig este monomerul. Acesta este o unitate tetrapeptidic,format prin asocierea a 2 lanuri grele H (Heavy = greu), fiecare avnd circa 450 de AA i o greutate molec cuprins ntre 50-76 kD i 2 lanuri uoare L ( Light = uor), fiecare avnd circa 216 AA i o greut molec de 25 kD. Cele 4 catene polipeptidice sunt legate ntre ele prin puni S-S i se rsucesc n spiral - att unul fa de altul, dar i fiecare separat fa de propria-i ax, rezultnd o configuraie tridimensional, stabilizat prin 16-24 legturi S-S i prin alte interaciuni necovalente.
Monomerul tetrapeptidic tridimensional are form de T sau de Y 6

n funcie de secvena AA, fiecare lan polipeptidic este alctuit din 2 regiuni distincte: a) regiunea constant (C ) corespunde jumtii Cterminale a celor 4 catene polipeptidice. Are o secven relativ uniform a AA i asigur unitatea structural i funcional a moleculei de Ig; b) regiunea variabil (V) cuprinde o secven de circa 110 AA n jumtatea N-terminal a celor 4 catene polipeptidice. Mrimea sa nu este fix, deoarece intervin inserii sau deleii de 3-6 AA . Regiunile variabile ale fiecrei perechi de catene formeaz situsul de combinare al moleculei de Ig, care confer specificitate de legare cu Ag.
7

Lan uor

Legturi disulfidice

Lan greu

Structura moleculei de imunoglobulin

8

Studiul prin digestie enzimatic a Ig.

Digestia proteolitic cu papain duce la obinerea din molecula de Ig a 3 fragmente: 2 sunt identice (cu o greutate molec de aproximativ 50kDa) i conin activitatea de legare a Ag numite Fab (fragment antigen binding); cel de-al 3 fragment (cu o greutate molec de aproximativ 80 kDa) nu leag Ag , dar poate fi cristalizat uor i a fost numit Fc (fragment crystallizable). Fragmentul Fab este constituit din lanul uor complet i o poriune din lanul greu, este univalent- conine situsul de legare al Ag .
Fragmentul Fc este format prin alturarea poriunilor rmase din cele 2 lanuri grele i rspunde de funciile biologice efector ale Ac
9

Fab Locul de aciune al papainei

Fab

Fc

Clivajul proteolitic cu papain

10

Reg variabile sunt identice n proporie de 7099%, dar specificitatea antigenic va fi diferit chiar dac regiunile variabile difer doar printrun singurAA Molecula prototip de Ig este IgG1. Este format din 4 lanuri polipeptidice reunite ntr-un complex macromolecular prin puni disulfidice. 2 lanuri sunt mai mici i sunt numite lanuri uoare iar cele 2 lanuri mari sunt numite lanuri grele .
(light chains), (heavy chains)

Datorit faptului c doar una din cele 2 gene pentru lanul greu i respectiv uor se exprim n celula formatoare de Ac cele 2 lanuri dintr-o molecul de Ig sunt identice
( o singur alel funcioneaz pentru lanul H sau L),
11

Studiul prin digestie enzimatic a Ig.

Metodele de clivare i de denaturare chimic a molec de Ig. au contribuit la nelegerea str. i funciei sale. Clivarea s-a realizat cu enzime proteolitice
(papain, pepsin, tripsin).

Primele studii care au adus informaii despre lanurile monomerului de Ig au fost efectuate de Edelman i Porter
(a tratat Ac. obinui la iepure cu enzima proteolitic papain i apoi a separat produii obinui).
12

Digestia proteolitic cu papain duce la obinerea din molecula de Ig. a 3 fragmente: 2 sunt identice (cu o greutate molecular de aproximativ 50kDa) i conin activitatea de legare a Ag numite Fab (fragment antigen binding); cel de-al 3 fragment (cu o greutate molecular de aproximativ 80 kDa) nu leag Ag, dar poate fi cristalizat uor i a fost numit Fc (fragment crystallizable). Fragm Fab este constituit din lanul uor complet i o poriune din lanul greu, este univalent- conine situsul de legare al Ag. Fragm Fc este format prin alturarea poriunilor rmase din cele 2 lanuri grele i rspunde de funciile biologice efector ale Ac
13

Nisonoff a tratat molecula de Ig. cu pepsin, obinnd un rezultat diferit. Pepsina cliveaz molecula de Ac.ntr-un fragment F(ab)2 i mai multe poriuni mici din fragmentul Fc. Fragmentul F(ab)2 const din cele 2 fragmente Fab i poriunea din lanul greu care conine una sau multe puni disulfidice ntre lanurile grele. F(ab)2 este divalent - are 2 situsuri de legare a Ag.

Fragmentul Fc este clivat n multiple fragm mici, cel mai mare fiind numit pFc.
14

F(ab)2

Locul de aciune al pepsinei

PFc

Clivajul proteolitic cu pepsin

15

Unele studii ale structurii Ig au utilizat Ac ca Ag. Au fost folosite ca surse de Ig omogene proteine din mielomul uman (tumor rezultat prin transformarea malign a plasmocitelor), plasmocitomul murin sau hibridoame. Au fost obinute antiseruri heterologe (folosind metode de absorbie), care subdivizau Ig ntr-un numr finit de grupe. Aceste grupe au fost denumite izotipuri i sunt consecina faptului c exist cteva tipuri diferite de regiuni constante ale lanurilor grele i uoare.
16

Exist 5 tipuri de clase de lanuri grele (, , ,

, ) i 2 clase de lanuri uoare (, ) Izotipul

unei molecule de Ac depinde de clasa lanului

greu i tipul lanului uor utilizat (). Datorit

faptului c funciile efectoare ale Ac sunt

consecina doar a tipului de lan greu, de obicei

este suficient referirea la clasa de lan greu
lan , IgG lan ).
17

(IgM

Fiecare lan greu i uor poate fi divizat n domenii, fiecare format din aproximativ 110 AA.
Lanul uor are 2 domenii: VL, corespunztor reg variabile a

lanului uor(L) iCL care este reg constant a lanului L( sau )

Lanul greu are 4 domenii: VH reg variabil i 3 domenii pt reg constant CH1, CH2, CH3. ntre domeniile CH1 i CH2 exist o reg balama, care ofer poriunii Fab o mare libertate de micare fa de Fc. Reg constante i variabile ale lanurilor grele i uoare sunt codate de gene separate. Din acest motiv, fiecare tip de reg VH sau VLse poate combina cu orice reg CH sau CL. Fiecare domeniu V sau C prezint o omologie n secven, care arat c deriv dintr-o gen ancestral comun.
18

O caracteristic a structurii domeniilor Ig. este prezena a 2 cisteine care formeaz o punte disulfidic intradomeniu. Exist o singur legtur disulfidic intradomeniu care menine structura teriar a Ig. Punile disulfidice sunt importante pt structura teriar a Ig. Punile disulfidice sunt importante pt structura cuaternar a moleculei de Ig. n general lanul uor este ataat de lanul greu printr-o punte disulfidic. Lanurile grele sunt legate covalent prin puni disulfidice amplasate n reg balama.
19

Structura monomerului de imunoglobulin

20

Fiecare pereche format dintr-un lan greu i unul uor are capacitatea s recunoasc i s lege acelai epitop.n acest fel o molecul intact de Ig poate interaciona simultan cu 2 epitopi identici. Monomerul de Ig are valena 2. Ig pot forma multimeri prin legarea covalent a monomerilor bazici de Ig. Nu toate izotipurile pot forma multimeri IgA formeaz dimeri, iar IgM pentameri, prin intermediul unei molecule accesorii, numit lanul J. Polimerizarea monomerilor de Ig duce la creterea valenei pentru Ag: polimerii pot lega n principiu, proporional cu nr total de situsuri pt Ag din molecul. Dimerii de IgA ,forma secretorie conin n plus o molecul asociat numit componenta secretorie, care are rol n transportul IgA prin membrana epiteliilor.
21

Domeniul imunoglobulinic

Ig sunt formate din combinarea liniar a unei subuniti structurale de baz,numit domeniu
Domeniul imunoglobulinic are o struct tridimensional globular compact. Studiul prin difracie cu raza X a lanurilor de Ig cristalizate a demonstrat c, un domeniu este format din 7 lanuri polipeptidice antiparalele -pliate. Fiecare domeniu conine 2 straturi: unul constituit din 4 lanuri -pliate i al doilea cu 3 lanuri pliate. Cele 2 straturi formeaz un sandwich hirofob i sunt stabilizate printr-o legtur disulfidic intradomeniu.
22

Lanurile sunt reunite la capete prin bucle peptidice, frecvent bogate n glicin, care le mrete flexibilitatea. Acest prototip structural 2 straturi constituite din lanuri - pliate, care formeaz o structur cilindric cu un miez hidrofob, mai este numit fold-ul imunoglobulinei sau model -barrel. Toate domeniile regiunii constante a Ig conserv aceast structur. Domeniile regiunii variabile au o structur uor diferit cteva din buclele care leag lanurile sunt mai lungi.
23

Poriunea din lanul peptidic care conecteaz domeniile V i C (CLsau CH1) este numit switch i confer flexibilitate Posibilitatea de rotaie este important deoarece n momentul n care se combin un lan greu i unul uor pt a forma o pereche intact H-L, domeniile CH1 i CL fac contact prin stratul cu 4 lanuri, n timp ce domeniile VH i VL fac contact prin stratul cu 3 lanuri mperecherea domeniilor CH-CL creeaz un miez compact hidrofob ntre straturile , care ofer o ancor pt domeniile variabile. mperecherea domeniilor VH i VL formeaz ntre straturile un miez mai puin hidrofob, care va delimita un buzunar n care se pot potrivi molecule mici de Ag. Acest an mpreun cu buclele de la capetele regiunii variabile formeaz situsul de combinare cu Ag al moleculei de Ac.
(permite domeniilor C i V s se roteasc unul fa de cellalt). (plasate n planeu) (un an)
24

Lanul greu prezint o reg numit Fd (format din domeniile VH i CH), regiunea balama i regiunea Fc. Reg Fd mpreun cu lanul uor constituie reg Fab. Domeniul VH are capacitatea de a lega Ag, iar domeniul CH1 reprez att o ancor ct i un spacer (distanier) pt VH, stabilizeaz i menine la distan reg care leag Ag de reg Fc Regiunea Fc, constituit din domeniile CH2 i CH3, are funcii efectorii. Aceast reg poate exista sub 2 forme: membranar i secretat. Diferena se afl la nivelul captului carboxiterminal: forma membranar prezint n plus un spacer foarte hidrofil, o secven hidrofob transmembranar cu configuraie -helix i o scurt coad citoplasmatic hidrofil. Pentru forma membranar exist 2 exoni adiionali M1 i M2. Sinteza celor 2 forme de reg Fc este determinat prin procesarea post-transcripional diferit a ARN-ului
25

Structura lanurilor grele (H)

n toate cele 3 domenii constante (CH1, CH2, CH3) ale lanului greu exist 3 AA nalt conservai: 2 cisteine (formeaz legtura disulfidic intradomeniu) i un tripofan (are rolul de protejare a legturii disulfidice de agenii reductori). AA cei mai conservai ntre clasele de Ig sunt plasai la nivelul lanurilor . Regiunea Fc a lanurilor i are n plus o secven de 18 AA la captul carboxi-terminal. Aceast secven este situsul de legare al lanului J, implicat n formarea multimerilor de IgM i IgA. Identitatea total a reg Fc interclase este de aproximativ 30%. Identitatea dintre lanurile i este semnificativ mai mare dect media. Domeniile carboxi-terminale ale lanurilor , , au o identitate medie de 41%. Omologia ntre clasele de Ig interspecii este > dect omologia interclase la aceeai specie.n fiecare domeniu exist AA plasai la exterior, cu rol funcional, n timp ce AA dispui la interior sunt elemente structurale.
26

Balamaua acioneaz ca un spacer mai flexibil, care permite fragmentului Fab s se mite mult mai uor n spaiu. Regiunile balama prezint cea > variabilitate interclase. Lanurile i umane nu au o reg balama, fiind nlocuit cu un ntreg domeniu (C2, C2). Reg balama conine multe reziduuri de cistein i prolin. Reg balama de la molecula de IgG1 conine secvena cistein-prolin-prolin-cistein pe ambele lanuri. Cisteina particip la formarea legturilor disulfidice dintre lanurile grele, cu apariia unui octamer ciclic. Octamerul acioneaz ca un pivot, conferind reg balama o flexibilitate foarte mare. Balamaua moleculei de IgG3 conine patru astfel de octameri ciclici i prezint o flexibilitate excepional.
27

Regiunea balama

Regiunea balama lipsete la o minoritate de IgG; aceste proteine sunt denumite Dob i McG si au flexibilitate mult redus.

Regiunile balama ale lanurilor i 1 reprezint sediul atarii carbohidrailor. Carbohidraii din regiunea balama a lanurilor 1 i 2 confer rezisten la clivajul de ctre proteazele intestinale (i enzimele bacteriene pentru 2), proprietate esenial pentru IgA secretorie
28

Rolurile funcionale posibile ale carbohidrailor

Rol n meninerea structurii teriare a Ig

un spacer plasat n centrul fragmentului Fc)

(acioneaz ca

Rol n sinteza i secreia imunoglobulinelor

Rezisten la digestia proteolitic

Creterea solubilitii Ig n soluii apoase

Rol n catabolizarea Ig din ser

interaciunea carbohidrailor cu receptori specifici de pe celulele hepatice).

(clerence-ul Ac este modulat prin

29

Lanurile uoare sunt formate din domeniile VL i CL i conin aprox. 214 aminoacizi Domeniul constant poate fi de tip sau , produse de gene diferite, plasate pe cromozomi diferii. Domeniile constante i sunt n mod particular similare: sunt mai nrudite ntre ele i mai conservate ntre specii dect lanurile grele. Ca i la domeniile constante ale lanurilor grele, cele dou cisteine i tripofanul sunt nalt conservate, ca i aminoacizii care formeaz lanurile . Raportul de utilizare / la om este de 70/30 i se coreleaz cu numrul de segmente genice pentru regiunea variabil (la om exist aproximativ 300 gene V i 100 V).
(gr. Mol. de 23 kDa).
30

Structura lanurilor uoare.

Reg variabile au 2 caracteristici importante: 1. Un nr f mare de gene care codeaz reg variabile (peste 1.000), spre deosebire de reg constante ale lanurilor grele i uoare (codate de cel mult 15 gene) 2. Variabilitatea. Pt exprimarea cantitativ a variabilitii Wu i Kabat au imaginat o metod pt descrierea i determinarea variabilitii. Variabilitatea era exprimat ca raportul dintre nr AA diferii la o anumit poziie i frecvena celui mai comun AA la aceea poziie (frecvena este dat de nr
apariiilor aminoacidului cel mai comun la poziia dat, raportat la nr proteinelor studiate).
31

Variabilitatea este o trstur comun a proteinelor. n cazul regiunii variabile, variabilitatea nu este distribuit uniform i apar nite vrfuri de variabilitate, care depesc de cel puin 3 ori variabilitatea proteinelor obinuite Ariile cu variabilitate nalt sunt denumite regiuni hipervariabile (HVR) sau reg determinante ale complementaritii (CDR). Ariile conservate sunt numite regiuni cadru Exist 3 reg hipervariabile delimitate de 4 reg cadru. Poziia celor 3 CDR-uri coincide cu buclele care reunesc lanurile , iar regiunile cadru corespund chiar lanurilor .
(citocromul c). (framework regions). (pt VH plasate la poziiile 31-35, 50-65, 95-102; pt VL la poziiile 24-34, 50-56, 89-97)
32

Atunci cnd domeniile VH i VL se combin pentru a forma situsul pentru Ag, regiunile hipervariabile din domeniu se altur rezultnd o singur zon hipervariabil plasat n vrful fragmentului Fab. Datorit faptului c cele 3 reg.hipervariabile din fiecare domeniu constituie situsul pt. Ag i determin specificitatea molec. de Ac prin realizarea unei suprafee complementare antigenului, mai sunt numite regiuni determinate ale complementaritii (CDR).
33

Molecule accesorii

Lanul J (joining chain) este constituit din 137 de aminoacizi (215 kDa) i are rol n polimerizarea moleculelor de Ig: IgA formeaz dimeri iar IgM pentameri Lanul J este produs de aceeai celul B care sintetizeaz Ig i conine multe cisteine Genomul uman i cel murin conin o singur gen pt lanul J, gen care nu este nlnuit cu nici unul din locii genelor pt Ig. Secvena de AA a lanului J nu este semnificativ nrudit cu cea a domeniului imunoglobulinic. Oricum, se pare c lanul J are o structur tip -barrel
(i uneori tetrameri), (i uneori hexameri). (minim 6).
34

Limfocitele B nestimulate conin o cantitate mic sau nu conin lan J: dup stimularea celulelor B cu mitogen apare o cretere dramatic a nivelului de mARN i de protein pentru lanul J. Fiecare dimer de IgA sau pentamer de IgM este asociat cu un singur lan J. Mecanismul exact al polimerizrii nu este cunoscut. Se tie c toate cozile monomerilor sunt implicate n interconectare pentru realizarea multimerului. Mecanismul exact prin care polimerizarea se oprete la 5 pentru IgM i la 7 pentru IgA este necunoscut.
35

Componenta secretorie a fost descris iniial ca polipeptid asociat covalent sau necovalent cu IgA din secreiile externe ale organismului. Ulterior a fost descris i sub form liber, n secreiile glandelor mamare i parotide. Componenta secretorie reprezint domeniul de legare al unui receptor transmembranar pentru complexele de polimeri de Ig (pentamer de IgM sau dimer de IgA). Molecula complet de receptor se numete receptor Poly-Ig (PolyIgR) i este membru al superfamiliei imunoglobulinelor (conine domenii imunoglobulin-like i un al 7-lea domeniu cu structur diferit). Acest receptor este sintetizat la nivelul multor epitelii glandulare i este exprimat pe membrana bazolateral a celulelor epiteliale.
36

Receptorul Poly-Ig leag multimerii de Ig, iar complexul rezultat este endocitat i transportat prin citoplasma celulei ntr-o vezicul (transcitoz). n momentul n care vezicula ajunge la nivelul polului apical al celulei endoteliale, complexul este exocitat. n timpul transportului prin celul receptorul Poly-Ig este clivat, rezultnd componenta secretorie, care rmne ataat la regiunile Fc. Acest proces necesit o cooperare ntre limfocitele B din mucoas i celulele epiteliale secretorii. Componenta secretorie are rolul de a proteja dimerul de IgA de clivajul proteolitic. Cele mai importante sedii de sintez a IgA sunt intestinul, tractul respirator, gl. mamar (n timpul lactaiei), gl. salivare i lacrimale. Principala funcie a IgA este protejarea suprafeelor epiteliale de agenii infecioi i asigurarea primei linii de aprare fa de multipli patogeni.
37

Situsul de legare a antigenului

n cadrul fiecrui domeniu variabil exist 3 reg. caracterizate printr-o variabilitate extrem de mare a AA, denumite reg. hipervariabile (HV1, HV2 i HV3) sau determinani ai complementaritii CDR (CDR1, CDR2 i CDR3), care corespund celor 3 bucle situate la capetele fiecrei foie . Ele determin specificitatea Ac prin formarea unei suprafee complementare fa de Ag (epitop). Partea cea mai variabil este CDR3. Restul de 80-85% din AA , dispui ntre CDR, prezint o variabilitate mai sczut i formeaz regiunile cadru (frame work region) FR (FR1-FR4), care sunt formate din foie .
38

n total exist 6 reg hipervariabile (3 n VL i 3 n VH), care se mperecheaz n proteina compactat, deci sunt juxtapuse (cele ale lanului L cu cele ale lanului H) pt a constitui mpreun situsul de combinare cu Ag, sau situsul de legare al Ag ori paratopul, care este specific pentru epitopul Ag. Paratopul este format din aproximativ 20-30 AA (din cei aproximativ 200 ai ntregului domeniu variabil VL plus VH)care contribuie fiecare, n medie cu cte un atom, la formarea unei legturi cu cte un atom al epitopului Ag. Molecula de IgG este bivalent, deoarece posed doi paratopi identici.
39

Funciile imunoglobulinelor
Imunoglobulinele au dou categorii de funcii: funcia biologic de legare a Ag, de decelare i recunoatere a acestuia, realizat de regiunile variabile; funciile biologice efectoare, ndeplinite de regiunile constante.Ambele funcii sunt bivalente. 1.Funcia de legare a Ag, care se produce la nivelul situsului de combinare al Ac, se realizeaz prin complementaritate (structuri spaiale complementare), iar fixarea lui se face prin legturi necovalente: legturi de hidrogen, fore electrostatice, van de Waals i interaciuni hidrofobe.
40

2. Funcia efectoare reprezint poriunea de manipulare a Ac i este dependent de izotipul Ig. Dup legarea Ag, la nivelul CH2 (CH3 n cazul IgM i IgE) devin accesibile zonele de legare ale fraciunii C1q a complementului, ducnd la activarea n cascad a acestuia, pe calea clasic, avnd ca efect final liza celulelor strine. Prin intermediul domeniului CH3, fragmentul Fc se leag de receptorii Fc (FcR) situai pe leucocite (neutrofile, eozinofile, monocite, celule NK), precum i pe trombocite i macrofage (citoadeziune). Au fost evideniate 3 tipuri de receptori pentru IgG (FcR): FcRI (CD64), FcRII (CD32), FcR III (CD16) i 2 pt IgE: FcRI i FcRII (CD32). Prin legarea Ac de FcR este favorizat opsonizarea, fagocitoza microbilor i degranularea neutrofilelor.
41

Un rol important l constituie implicarea n ADCC (citotoxicitatea celular dependent de anticorpi) realizat prin legarea Ac de FcR de pe cel NK, macrofage sau neutrofile. Fixarea de FcR intervine n transportul i catabolismul IgG, precum i n transferul transplacentar, de la mam la ft, a IgG. Prin intermediul FcRI i FcRII, IgE se leag de bazofile i mastocite, intervin n degranularea acestor cel. i eliberarea unor factori implicai n inflamaie, n citotoxicitatea antiparazitar i hipersensibilitatea imediat. Au mai fost descrii receptori pentru Fc al IgM (pe celulele NK, unele limfocite B i unele fagocite activate), IgA (pe monocite, neutrofile) i IgD (unele limf.T)
42