UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR

ION IONESCU DE LA BRAD DIN IAI

Utilizarea tehnicilor de biologie molecular

pentru identificarea organismelor
modificate genetic

Cuprins
Introducere.................................................................................................. Pag.3
1.Obinerea

OMG- Pag.5

urilor.............................................................................
2.Tehnici de identificare a OMG urilor...................................................... Pag.8
I.Tehnica PCR............................................................................... Pag.9
II.Tehnica microarray...................................................................

Pag.10

III.Metoda cromatografic............................................................. Pag.10

IV.Spectroscopia infraroie apropiat (SIA)............................

Pag.10

V. Metoda ELISA............................................................................. Pag.11

VI. Metoda LAMP............................................................................. Pag.14
3. Potenialele riscuri pentru sntatea uman i pentru mediul
nconjurtor............................................................................................. Pag.15
Concluzii.................................................................................................... Pag.16
Bibliografie

Introducere

n decursul ultimelor decenii, biotehnologia a cunoscut progrese importante datorit

descoperirilor ce in de mecanismul funcionrii acizilor nucleici (ADN-ului i ARN-ului) i
investigaiilor desfurate apoi n domeniul geneticii moleculare. Relevarea particularitilor
materialului genetic la animale, plante i microorganisme, precum i posibilitatea de
modificare

unitilor

lor

componente au lrgit considerabil domeniile aplicrii

biotehnologiei, genernd ns n societate o profund nelinite fa de gradul de securitate i

caracterul etic al unor asemenea cercetri.
Biotehnologia modern include aplicarea tehnicilor de recombinare a acizilor nucleici i
a tehnicilor de fuziune celular invitro, nlturnd barierele naturale de reproducere sau
recombinare genetic. Astfel, prin metode de inginerie genetic, metode care reprezint un
sistem de tehnici contemporane de manipulare a genomului, a fost posibil inserarea unui
spectru larg de gene de interes"(transgene) n mai mult de 120 de specii de plante care
aparin la 35 de familii.
O importan practic deosebit o au numeroasele varieti de plante modificate genetic
(PMG), rezistente la diferite erbicide, insecte duntoare, boli, patogeni fungali, bacteriali i
virali. Un rol aparte va reveni n viitorul apropiat plantelor modificate genetic, ce conin gene
ale rezistenei la stresul abiotic, inclusiv la secet i la salinitatea solurilor, care astzi
cauzeaz pn la 50% din pierderile de producie agricol mondial. Biofortificarea
plantelor de cultur prin introducerea genelor implicate n mbuntirea calitilor nutritive
ale produselor alimentare, precum coninutul de proteine, vitamine i minerale este o direcie
relativ nou, n continu dezvoltare.
Produsele alimentare derivate din PMG sunt prezente n magazinele i marketurile
Uniunii Europene (UE) din anul 1996. Acest fapt a condiionat apariia unei serii de directive
i legi emise de Comunitatea European, menite s supun unui control strict comercializarea
i cultivarea organismelor modificate genetic (OMG). Conform cerinelor, produsele

alimentare care conin cel puin 0,9 - 1% OMG trebuie supuse analizelor i etichetrii.
Necesitatea monitorizrii prezenei PMG i cantitii acestora n culturile agricole i
n produsele alimentare derivate din acestea a impus cutarea metodelor analitice eficiente n
detectarea, identificarea i cuantificarea alogenelor i a produselor de expresie, care reprezint
constituenii genetici de baz. Laboratoarele UE au elaborat i dezvoltat metode de testare a
PMG la nivel de ADN prin metoda PCR i/sau proteine, prin analize imunoenzimatice.

1.Obinerea OMG-urilor

Transformarea genetic reprezint modificarea genomului unui organism prin

tehnicile biotehnologiilor contemporane, care permit introducerea genelor noi, de interes",
sau modificarea expresiei unei/ unor gene prezente deja n celul. Organismele astfel obinute,
sunt denumite organisme modificate genetic (OMG) sau transgenice.
Evoluia tehnico-experimental a ingineriei genetice, n special a metodelor de transfer al
genelor peste barierele de sex i la distane taxonomice mari, a permis transgeneza unui numr
impuntor de plante cu importan economic: cereale, leguminoase, specii pomicole sau
forestiere etc. Obinerea autorizrii unei varieti modificate genetic (MG) n conformitate
cu reglementrile de rigoare impune respectarea urmtoarelor cerine: stabilitate n expresia i
motenirea transgenelor n generaiile succesive; segregare mendelian a fenotipului
transgenic, reglarea organ-specific a expresiei alogenelor i exploatarea produsului su n
scop agronomic, alimentar, medical, farmaceutic etc. n afara aplicaiilor practice,
manipulrile genetice permit analiza structurii i funciei genelor, oferind posibiliti de a
cunoate i a interveni n mecanismele de dezvoltare a plantelor.
Alimentele n care se pot regsi evenimente modificate genetic pot fi:

produse pe baz de porumb: mlai i gri de porumb, ulei de porumb, chips

de porumb, fulgi de porumb pentru micul dejun,

produse pe baz de soia : ulei de soia, creme-desert pe baza de soia, lapte de

soia, branz de soia,

cartofi i subproduse de cartofi,
ingrediente:
-

fain de porumb utilizat la producerea pinii, cerealelor pentru micul dejun,

biscuii aperitiv;
-

griul de porumb n : biscuii aperitiv, pesmet, bere, cereale pentru micul dejun;
- amidonul de porumb: n sosuri, mezeluri, creme pentru deserturi, preparate pentru

deserturi deshidratate, ciorbe, mncare pentru nou-nscui, produse de patiserie;

- siropul de glucoz, dextroz, maltodextrinele n : sosuri, biscuii, batoane de cereale,

bere, ciorbe, biscuii pentru aperitiv, fructe cu zahar ncorporate n iaurturi i diferite
deserturi, ngheate;
- aditivi din soia (lecitina) sau din porumb (amidon oxidat, amidon acetilat, arome).
Pentru o just apreciere a efectelor pe care alimentele modificate genetic le pot
avea asupra strii de sntate, este necesar cunoaterea modului n care sunt obinute
aceste organisme i apoi studierea potenialelor efecte.
Obinerea organismelor modificate genetic include cteva etape, care pot fi
rezumate astfel:
I.

Identificarea, izolarea i clonarea genelor de interes".

II.

Transferul genelor la plante.

III. Regenerarea, selecia i testarea plantelor MG.

Figura 1.1. Etapele transformrii genetice

1,2- Identificarea i izolarea genei de interes", obinerea ADN-ului recombinat (integrarea
transgenei n vector);
3-

Transferul genei himere n celula vegetal prin metode directe sau indirecte;

4-

Selectarea celulelor modificate genetic;

5-

Regenerarea plantelor din celulele transformate genetic;

6-

Reproducerea sexuat/ asexuat a plantelor modificate genetic.

6

Metodele folosite pentru realizarea de organisme modificate genetic sunt prezentate

schematic in figura 2.

Fig. 2.1. Prezentare schematic a metodelor de obinere a OMG-urilor

2. Tehnici de identificare a OMG -urilor

Pentru analiza calitativ i cantitativ a materialului modificat genetic n
produsele alimentare, au fost elaborate i implementate numeroase metode analitice.
Concomitent cu metodele clasice, ca PCR i ELISA, sunt utilizate i alte procedee de
analiz precum cromatografia i spectroscopia infraroie.
Necesitatea de a monitoriza i verifica prezena i cantitatea materialului modificat
genetic n culturile agricole MG i n produsele derivate a generat o cerere crescnd de
metode analitice de detecie, identificare i cuantificare a secvenei de nucleotide inserate i a
produilor de expresie a transgenei, deoarece anume aceste componente sunt considerate ca
fiind contituieni de baz.
Unele laboratoare au elaborat metode de analiz bazate pe detecia ADN-ului utiliznd
tehnica de amplificare PCR (Polymerase Chain Reaction) ori pe proteine, apelnd la
analizele imunoenzimatice ELISA (enzyme linked immunosorbent assays), care se deosebesc
prin unele avantaje i dezavantaje n funcie de scopul cercetrii i de posibilitile
laboratorului.

Fig.2.1. Detecia, identificarea i cuantificarea OMG

Alte laboratoare s-au orientatat spre dezvoltarea unor tehnologii analitice care pot oferi
soluii alternative la metodele de testare a OMG existente. Acestea includ masspectrometria,
cromatografia, tehnologia ADN - chip, Electro.spray.ionisation (ESI), spectroscopia
infraroie apropiat etc. (fig. 2.1.).
I. Tehnica PCR
Reacia PCR permite amplificarea selectiv, ntr-un numr foarte mare de copii, a
unei secvene ADN prezent ntr-o proporie relativ redus n cadrul unui amestec
complex de fragmente ADN. Analiza produilor rezultai prin amplificare ntr-o reacie
PCR clasic permite formularea unei concluzii calitative (da" sau nu") asupra prezen ei
OMG-urilor

proba

testat.

practic,

evaluarea ampliconilor se face, n

general,prin separare electroforetic n gel de agaroz, marcare cu EtBr, vizualizare n prezea

luminii UV i compararea cu probe standard.
Pentru obinerea informaiilor cantitative referitoare la coninutul de acizi nucleici,
este utilizat tehnica real-time PCR care reprezint o variant mult mai performant a
reaciei PCR clasice.
Principiul real-time PCR
Tehnica real-time PCR utilizeaz primeri specifici pentru amplificarea secven ei int,
iar n tandem cu acetia constructe oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de
molecule incluse n mediul de reacie indic acumularea produsului PCR . Astfel,
lungul
de

mai

asemenea

multor

cicluri

specifice

de

amplificare

secvenei

de-a

constructele oligonucleotidice care sunt

int vor

determina modificarea semnificativ a

semnalului fluorescent.
PCR este o tehnica de laborator ce necesita personal instruit si echipament special.
Caracteristici de baza ale analizei prin PCR:
-

poate fi foarte sensibil, capabil de detecia uneia sau mai multor copii ale genelor

sau secvenei int de interes n cadrul unui material genetic al unui organism sau genom.
Trebuie luate toate masurile pentru evitarea contaminrii ncruciate.
-

necesit puin timp de reacie n comparaie cu testele imunologice, aproape toi

reactivii necesari, sunt disponibili n comer i pot fi uor obinui.

9

impul de analiz a probelor este de aproximativ o zi.

PCR faciliteaz diferenierea ntre anumite tipuri de modificri genetice. Metodele de

diagnostic pentru identificarea evenimentelor transgenice specifice necesit timp de

dezvoltare adiional i eforturi de validare.

II. Tehnica microarray

Tehnica microarray are la baza hibridarea molecular dintre dou fragmente
complementare de ADN. n contextul testrii OMG, este utilizat n combina ie cu
amplificarea PCR multiplex, corespunznd, practic, etapei post-PCR - analiza produilor de
reacie. Aceast tehnic are o mare capacitate de procesare, constituind o strategie
foarte potrivit pentru o problem major cu care se confrunt domeniul testrii OMG creterea numrului de evenimente de transformare.

III. Metoda cromatografic

Metoda cromatografic permite identificarea OMG la nivelul metaboliilor dizaharide (trehaloza, maltoza i izomaltoza), alcooli (maltitolul) sau al diferenelor depistate
n profilul chimic, constatate la analiza uleiului provenit din rapia modificat genetic.
Combinarea metodelor de cromatografie lichid i masspectrometrie au permis evidenierea
diferenelor din cadrul paternelor de trigliceride. Rapiditatea, sensibilitatea nalt i analiza
cantitativ a diferitor metabolii, implicai n metabolismul carbonului (glucidele di- i
trimere), azotului (aminele, aminoacizi, acizi organici), ofer posibilitatea identificrii
simultane a diferitor metabolii ntr-o singur prob, fr a impune o separare ulterioar a
acestora.

IV. Spectroscopia infraroie apropiat (SIA)

Spectroscopia infraroie apropiat (SIA) are o gam larg de aplicare n
agricultur, industria farmaceutic, controlul produselor alimentare etc. i reprezint o metod
analitic rapid, care permite msurarea compoziiei chimice a materialelor. Legturile
covalente dintre atomii de C, N, H, O i P absorb energia n regiunea infraroie, n care
posed frecvene oscilatorii specifice, iar combinaiile formate sunt detectabile la lungimea de
und de 400 - 2500 nm, adic n regiunea infraroie. Unele transgene pot modifica structura
fibrelor n plante, diferene care nu pot fi evideniate dup coninutul de proteine sau ulei, ns
se evideniaz cu uurin prin SIA.
10

V. Metoda ELISA
ELISA, implica testarea pentru detecia proteinelor specifice prin exploatarea
specificitii legturii ntre antigenul exprimat i anticorpul int.
Testul de marcare enzimatic (enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (metoda
ELISA) este unul de alternativ PCR i permite identificarea proteinelor (enzimelor)
codificate de transgene, cum ar fi, de exemplu, neomicin- fosfotransgeraza (nptII), EPSPS,
proteinele Bt, enzima PAT etc.
Metoda ELISA are ca principiu utilizarea unui marker enzimatic legat de un anticorp,
antigen sau hapten (substan care reacioneaz cu anticorpii, dar nu induce sinteza de
anticorpi - adic nu determin un rspuns imun). Prezena markerului enzimatic permite
detectarea reaciei antigen-anticorp. Deci antigenele sau anticorpii sunt cuplai covalent cu o
enzim (n locul radioizotopului sau fluorocromului). Cuplarea markerului enzimatic cu
antigenele sau cu anticorpii se face cu ajutorul unor molecule bifuncionale care leag cei doi
compui (fig.2.2). Evidenierea reaciei antigen-anticorp se realizeaz prin degradarea unui
substrat specific (marker enzimatic), urmat de o modificare de culoare, msurat
spectrofotometric. De exemplu, paranitrofenil fosfatul (galben) se utilizeaz pentru fosfataza
alcalin; 3,3',5,5'-tetrametil-benzidina (galben) sau 3-Amino-9-etilcarbazolul (rou) - pentru
peroxidaza.

Fig. 2.2 Prezentare schematic a principiului testului ELISA

11

A - Anticorpii specifici antigenelor se ataeaz de suprafaa solid;

B - Adugarea probei n care se pot conine sau pot lipsi antigenele;
C Adugarea enzimelor legate de anticorpi i conjugarea lor;
D Adaugarea substratului cromogenic. n prezena enzimei se formeaz produi de reactie
cu culoare modificata, care poate fi masurata spectofotemetric.
Actualmente, exist mai multe tipuri ale acestei metodologii, i anume procedeul Sandwich" ELISA i ELISA competitiv.
Metoda sandwich" ELISA. O varietate a tehnicii imunoenzimatice este procedeul
ELISA cu utilizarea a doi anticorpi (sandwich" ELISA) (fig. 3.2.), fiind unul dintre cel
mai des utilizat n analiza transgenelor. Acest procedeu este rapid i simplu n efectuare. Dac
antigena standard purificat este competent, atunci tehnologia permite i determinarea
cantitativ a antigenului n proba cercetat. Testul dat necesit doi anticorpi, unul numit
anticorp de captare i altul de detectare.
Denumirea sandwich" a acestei variante de ELISA provine de la complexul format
dintre cei doi anticorpi ntre care se afl legat antigena. Produsele formate sunt
cuantificate prin msurarea cantitii de anticorpi secundari legai de matrice, utiliznd
substrate colorimetrice.

Fig. 3.2 Etapele principale ale metodei sandwich" ELISA

12

Metoda ELISA competitiv. n cazul n care o pereche de anticorpi nu sunt potrivii

pentru scopul propus, exist o alt varietate a tehnologiei imunoenzimatice i anume testul
ELISA tip competitiv (fig. 4.2.). Pentru utilizarea acestui tip de ELISA, este necesar ca un
reagent s fie conjugat cu enzima de detecie. Enzima poate fi linkat cu alt imunogen sau
anticorp primar.

Fig.4.2 Etapele principale ale metodei ELISA competitiv

Principale caracteristici ale analizelor ELISA:

-

mai putin sensibila decat PCR, de aceea mai putin susceptibila decat PCR in rezultate
pozitive false cauzate de mici nivele de contaminare;

costuri mari pentru dezvoltarea testelor si generarea de standarde pentru anticorpi si

proteine;

cost mic pentru proba din momentul elaborarii rectivilor;

metodele bazate pe proteina necesita timp pentru reactivi si dezvoltarea metodei;

testarea bazata pe proteina furnizeaza un proces de testare cantitati 656f59g va in cazul

in care este produsa proteina detectabila. Totusi produsele MG pot fi produse numai

13

urmand anumite etape sau numai in anumite parti ale plantelor si aceste organisme
modificate genetic sunt putin probabil de a fi usor detectate prin ELISA.
-

Aditional, procesarea industriala denatureaza usor proteinele, lucru ce face

problematica utilizarea metodelor ELISA pentru alimentele procesate.

VI. Metoda LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification)

Noua metod permite identificarea Organismelor Modificate Genetic (OMG) chiar i

n concentraii mai mici, de pn la 0,1%. Tehnologia folosit se bazeaz pe o combinaie de
tehnici de amplificare bioluminiscent i izoterm care poate monitoriza contaminarea
alimentelor cu ingrediente ce conin OMG-uri.
Metoda se bazeaza pe amplificarea DNA-ului la o temperatur constant, urmat de
aplicarea noii tehnologii de reportare a biolumiscenei (BART), pentru determinarea n timp
real a coninutului de OMG. Aceast metod necesit doar un echipament standard pentru
extragerea ADN-ului i asigurarea unei temperaturi constante pentru detectarea i
amplificarea ADN-ului. n acest fel, soluia LAMP-BART poate asigura monitorizarea n
timp real a existenei culturilor modificate genetic, precum i a interaciunii acestora cu plante
sau culturile nemodificate genetic.

14

3. Potenialele riscuri pentru sntatea uman i pentru mediul

nconjurtor prezentate de organismele modificate genetic
Pe de o parte, aceste organisme sunt promovate ca fiind sigure i necesare societii
umane, n timp ce opozanii le consider neeseniale i potenial cauzatoare de efecte negative
asupra sntii i mediului. Niciuna dintre aceste opinii nu poate fi ns corect, din simplu
considerent c OMG-urile nu reprezint o categorie omogen, punerea n balan
a beneficiilor i riscurilor trebuind fcut pentru fiecare caz n parte.
Analiza impactului potenial al introducerii i utilizrii OMG-urilor are n vedere o
serie de factori ca: implicaiile tehnice pentru practica agricol, inputurile din
agricultur, fluxul de

gene,

biodiversitatea,

sistemul sanitar, riscurile pentru

impactul economic,

avantajele

pentru

sntatea consumatorilor i organismele non-int,

asigurarea securitii alimentare, implicaiile de natur etic sau cultural.

Fig 4. Aspecte cu impact pe sntatea public date de utilizarea OMG

15

Concluzii
1. OMG-urile reprezint o realitate a societii moderne, iar utilizarea lor prezint o
serie de avantaje, dar i poteniali factori de risc pentru mediul nconjurtor, pentru cel
economico-social i pentru sntatea consumatorilor.
2. Utilizarea OMG-urilor n obinerea produselor alimentare, ca n cazul oricrei
alte tehnologii, prezint o serie de avantaje, dar poate genera i riscuri pentru mediu i
sntate, de aceea trebuie acionat n sensul identificrii i eliminrii riscurilor pentru
ndeplinirea celor dou deziderate principale ale Organizaiei Mondiale a Sntii
privind alimentaia: securitatea i sigurana.
3. Testarea molecular reprezint un instrument esenial n contextul implementrii
politicilor europene din domeniul OMG.

16

Bibliografie

1. BADEA E.M., SNDULESCU D. Biotehnologii.vegetale, Bucureti, 2001

2. DUCA M., KALOSHIAN I. Tehnici de cercetare n biologia molecular, Chiinu, CE
USM, 2002.
3. http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/
4. http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/GUS_assay.html.
5. http://www.brutarul.ro/index.php/ro/altestiri/481-soluie-pentru-identificarea-culturilormodificate-genetic.html

17