27.03.

2011
1
Metode de
analiz a genelor
Expresia genelor
ADN ARNm Protein Caracter
5-ATTGCAAGATTACCATGT-3 Catena codogen (netranscris)
3-TAACGTTCTAATGGTACA-5 Catena anticodogen (transcris)
Transcripie
5-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3 ARNm
Translaie

Leu Ala Arg Leu Pro Cys polipeptid
Maturizare
Caracter fenotipic normal
Expresia genelor
ADN
mut
ARNm
mut
Protein
an
Caracter
an
5-ATTACAAGATTACCATGT-3 mutaie G
4
A
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
Transcripie
5-AUUACAAGAUUACCAUGU-3 ARNm
mut
Translaie

Leu Thr Arg Leu Pro Cys polipeptid
an
Caracter fenotipic anormal
Analiza genelor
Secveniere
PCR
Southern-blot
Hibridare in situ
ADN Proteine ARN
Northern-blot
RTPCR
Hibridare in situ
Western-blot
Secveniere
Analiza funciei
Analiza
histochimic
Utilizarea tehnicilor de analiz a
acizilor nucleici n medicin
Analiza ADN:
depistarea mutaiilor genice diagnostic precis al
bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce);
identificarea polimorfismului individual
dactiloscopie genomic (analiza filiaiei);
depistarea ADN strin (bacterian, viral)
diagnosticul bolilor infecioase i gradului de infectare.
Analiza ARNm:
analiza expresiei genice esut-specific;
evaluarea gradului de expresie a genei normale /
patologice.
Obinerea FR fragmentelor de restricie prin
aciunea specific a ER (enzimelor de restricie)
27.03.2011
2
RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z
M
-
+
10 kb
8 kb
6 kb
4 kb
2 kb
12 kb
10 kb
6 kb
5 kb
2,5 kb
2,5 kb
10 kb
6 kb
5 kb
PCR reacia de polimerizare n lan
Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare
Replicare semiconservativ, repetat
Specificitatea primerilor sintetici pentru genaint
Hibridizarea ADN-int primer complementar:
Denaturare termic a ADN - de cercetat
Modificarea ciclic a temperaturii:
Denaturare
Renaturare
Sintez
Componentele necesare pentru
clonarea in vitro (PCR):
ADN de cercetat
Primeri specifici secvenei de clonat
Complimentari secvenelor flancante
Taq-polimeraza ADN-polimeraz termostabil
Dezoxiribonucleozidtrifosfai (dNTP)
Instalaie de modificare ciclic a temperaturii:
- t de denaturare ADN
- t de renaturare (ADN+primer)
- t de polimerizare (elongarea catenelor noi
de ADN)
Etapele tehnicii PCR
Denaturarea ADN la 96
o
C
A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante
Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor
Elongarea catenelor ADN la 72
o
C
B. Repetarea automat a procedurilor de denaturare-
renaturare-elongare de 30-35 ori
C. Analiza produilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor
27.03.2011
3
Extragerea ADN Pregtirea
componentelor pentru
PCR
Amplificarea
ADN-int
Electroforeza
produilor PCR
Colorarea i
vizualizarea produilor
PCR
Interpretarea
rezultatelor
Avantajele PCR
Metod rapid
Metod ieftin
Utilizarea cantitilor mici de material analizat
Nu necesit izotopi radioactivi
Interpretarea uoar a rezultatelor
Dezavantajele PCR
Necesitatea cunoaterii secvenei nucleotidice
amplificate
Necesitatea primerilor sintetici, specifici secvenei
analizate
Utilizarea PCR
Identificarea inseriilor/deleiilor nucleotidice
Identificarea mutaiilor punctiforme
(substituiile nucleotidice)
Identificarea expresiei genice (RT-PCR)
Dactiloscopia genomic (filiaie)
Identificarea agenilor infecioi
Identificarea gradului de infecie (quantitative
PCR)
Identificarea produselor PCR n timp real
(Real-Time PCR)
Identificarea inseriilor / deleiilor
Identificarea mutaiilor punctiforme
27.03.2011
4
Identificarea agenilor infecioi
Stabilirea paternitii (filiaiei)
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR
Dependena cantitii de produse amplificate de concentraia ADN genomic utilizat n PCR.
S-a utilizat ADN n cantitate de: 1 0,5 g, 2 0,25 g, 3 0,1 g, 4 0,02 g
Concentraiile critice ale substanelor pentru inhibarea activitii Taq-polimerazei
Substana Concentraia critic
SDS >0.005% (m/v)
Fenol >0.2% (v/v)
Etanol >1% (v/v)
Isopropanol >1% (v/v)
CH
3
COONa >5 mM
NaCl >25 mM
EDTA >0.5 mM
Optimizarea condiiilor de
desfurare a PCR
Caracteristica primerilor utilizai n PCR
Gena Secvena Lungimea, baze % G+C Tm,
o
C
ACE
5-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 24 54 59
5-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 25 48 58
AT1 R
5-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3 20 65 58
5-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3 23 48 55
NOS
5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57
5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59
Dependena cantitii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor.
n condiiile PCR s-a utilizat: 1 t
o
C optimal -5
o
C; 2 t
o
C optimal; 3 t
o
C optimal +5
o
C.
Optimizarea condiiilor de desfurare a PCR
Dependena cantitii produselor PCR de concentraia ionilor Mg
2+
.
Concentraia utilizat de MgCl
2
: 1 2,5mM; 2 5mM.
Dependena cantitii de ADN amplificat de numrul de cicluri PCR.
1 30 cicluri; 2 35 cicluri; 3 40 cicluri.
27.03.2011
5
Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE
Analiza electroforetic n gel de agaroz de 2% a produselor PCR rezultate
din amplificarea ADN uman cu primeri corespunztori genei ACE.
M marcher al lungimii; 1 genotip I/D; 2 genotip D/D; 3 genotip I/I.
I
D
Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS

M 1 2 3
Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori genei NOS.
M marcher al lungimii; 1 genotip G/G; 2 genotip T/T; 3 genotip G/T.

G
T
Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R
Rezultatele amplificrii ADN uman cu primeri corespunztori
genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.
M marcher al lungimii; 1 genotip A/A; 2 genotip A/C
A
C
Tehnica Real-time-PCR
ARMS-PCR
Utilizarea tehnicii microarray
Izolarea ARN din diferite esuturi
Izolarea ARNm
Amplificarea prin intermediul RT-PCR
Marcarea cu ageni fluoresceni
Hibridarea cu ADN fixat n micocipuri
Analiza rezultatelor
27.03.2011
6
Tehnica Southern-blot
Bazat pe RFLPs
Hibridizare cu sonde marcate
Cu transferul FR din gel-electroforez pe un
suport solid (pe membrane de nitroceluloz)
Hibridarea acizilor nucleici
Unirea complementar a fragmentelor
(moleculelor) de acizi nucleici:
ADN de cercetat cu
sonda oligonucleotidic
n reacie particip molecule monocatenare
Moleculele ADN-int sunt fixate
Moleculele-sonde sunt marcate radioactiv
sau fluorescent
Identificarea complexelor hibride se
realizeaz prin intermediul autoradiografiei
Tehnica Southern-blot
Extragerea ADN Restriia ADN Electroforeza ADN
Denaturarea i
transferul ADN
pe membrane
Autoradiografia Hibridare cu sonda
Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor
Utilizarea tehnicii Southern-blot
Identificarea inseriilor / deleiilor mari
Identificarea mutaiilor punctiforme ce
afecteaz SR
Dactiloscopia genomic RFLPs
RFLPs i analiza genotipului
Electroforeza FR a 3 persoane A,B i C
Alela Normal cu 3 SR Alela mutant cu 2 SR, mutaie n SR2
B (Nm)
C (mm)
A (NN)
27.03.2011
7
Dezavantajele Southern-blot
Necesit cunoaterea hrii de restricie a genei int
Necesit cantiti mari de material biologic
Metod ndelungat, cu multe etape
Necesit izotopi radioactivi
Necesit materiale costisitoare
Avantajele Southern-blot
Este metod foarte precis
Nu necesit cunoaterea secvenei nucleotidice
analizate
Nu necesit primeri sintetici
Tehnica Northern-
blot
Extragerea ARN din
esutul int
Electroforeza ARN n
condiii de denaturare
Transfer pe membran de
nailon
Hibridarea cu sonda
marcat
Autoradiografia
Tehnica Northern-blot
Extragerea ARN Electroforeza ARN

Transferul ARN
pe membrane
Autoradiografia Hibridare cu sonda
Vizualizarea i
interpretarea
rezultatelor
Utilizarea tehnicii
Northern-blot
Identificarea expresiei genice n
anumite esuturi, anumite condiii
Identificarea variantei de splicing a
proARNm
Identificarea nivelului de expresie
Identificarea agenilor infecioi
(ribovirusuri)
Identificarea nivelului
de expresie i a variantei
de splicing
27.03.2011
8
Secvenierea ADN
Stabilirea secvenei de nucleotide
Metoda chimic (tehnica Maxam-Gilbert,
1973)
Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975)
Metoda automat (cu utilizarea agenilor
fluoresceni)
Tehnica
dideoxi
Sinteza enzimatic a
ADN

Utilizarea n paralel
a nucleotidelor ce
conin deoxiriboz
i dideoxiriboz

Stoparea sintezei n
cazul incorporrii
ddNTP
5-ATTACAAGATTACCATGT-3 catena codogen
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5 catena anticodogen (matri)
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTAC-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAA-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAG-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGA-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGATT-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACA-3
3-TAATGTTCTAATGGTACA-5
5-ATTACAAGAT-3
A, T, C, T ddNTP (2,3-ddNTP)

pentru stoparea sintezei
5-ATTA -- primer marcat P
32
pentru ADN-polimeraz
A, T, C, T dNTP (2-dNTP)

pentru sinteza noilor catene
5-ATTACAA-3
5-ATTACAAG-3
5-ATTACAAGA-3
5-ATTACAAGATT-3
5-ATTACA-3
5-ATTACAAGAT-3
5-ATTACAAGATTA-3
5-ATTACAAGATTACCA-3
5-ATTACAAGATTACCAT-3
5-ATTACAAGATTACCATG-3
5-ATTACAAGATTACCATGT-3
+
-
A T C G
5-ATTAC-3
5-ATTACAAGATTAC-3
5-ATTACAAGATTACC-3
5-ATTACAAGATTACCATGT-3
A
T
G
C
Tehnica dideoxi
Extragerea ADN
Denaturarea ADN
Sinteza catenelor complementare
utiliznd primeri marcai cu
32
P n
prezena dNTP i ddNTP
Electroforeza n condiii de denaturare
Vizualizarea fragmentelor marcate prin
autoradiografie
+
-
(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)
27.03.2011
9
Metoda automat
Hibridarea
in situ
Pregtirea
preparatelor de
cromozomi

Denaturarea ADN

Hibridarea cu sonda
marcat

Vizualizarea la
microscopul optic
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici
Hibridarea in situ cu
utilizarea preparatelor
cu nuclei interfazici
Hibridarea in situ pentru
depistarea secvenelor ADN
Hibridarea in situ cu
utilizarea probei sens(stnga)
i antisens (dreapta)
Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenelor ARN
Analiza
histochimic
identificarea
proteinelor n esut
27.03.2011
10
Rolul practic al tehnicilor de analiz a acizilor nucleici:
Cercetare secvenierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul
expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinelor
mutaiilor.
Depistarea persoanelor purttoare de mutaii patologice - prenatal sau
postnatal, cu scop de prevenire a naterii copiilor cu anomalii genetice
sau manifestrii unor patologii severe.
Terapie genic (alegerea genei int, construirea vectorilor de gene etc.).
Depistarea ADN strin (viral sau bacterian) n diagnosticul bolilor
infecioase.
Identificarea polimorfismelor individuale n analiza filiaiei, n
criminalistic.