Sunteți pe pagina 1din 82

Virusul Papilloma uman

Virusul Papilloma Uman


(HPV)

Agentul etiologic al cancerului de col uterin
Premiul Nobel pentru medicin 2008

Vaccin profilactic antiHPV

Virusul Papilloma Uman (HPV)
Exist

- mecanismul oncogenic HPV este incomplet descifrat
- nu avem un test ideal pentru depistare i prevenie
- n ara noastr cancerul de col uterin este o problem
important de sntate public


Uniunea European
Incidena i mortalitatea cancerului cervical
Arbyn M, et al. Ann. Oncol., 2011
0 5 10 15 20 25
Finlanda
Grecia
Italia
The NL
Cipru
Franta
Suedia
Malta
Luxembourg
Spania
United Kingdom
Germania
Austria
Danemarca
Belgia
Irlanda
Slovenia
Portugalia
Cehia
Estonia
Slovacia
Ungaria
Polonia
Lituania
Letonia
Bulgaria
Romnia
Mortalitatea
Incidena
ncadrare taxonomic

Familia Papillomaviridae
Genul Alpha - papillomavirus
- HPV cu risc oncogen nalt (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,
66, 68, 73 i 82) cauzeaz leziunile precanceroase i cancerul de col uterin

- HPV cu risc oncogen mediu (26, 53)

- HPV cu risc oncogen scazut (6, 11, 40, 42, 54, 55, 61, 62, 64, 67, 69, 70,
71, 72, 81, 83, 84, IS39 i CP6108) cauzeaz condiloame genitale sau
leziuni cervicale benigne.
Virusuri mici (55 nm), fr anvelop, cu capsid
icozaedric compus din dou proteine structurale
(L1 i L2)

Genom - ADNdc, circular, covalent nchis
Regiune timpurie E: genele E1E7
Codific pentru proteine cu rol n replicarea viral i
oncogenez

Regiune tardiv L:
genele proteinelor capsidale (L1 i L2)

Regiune de control necodificatoare (LCR):
zona de control a replicrii virale i expresiei genice
Morfologie i genom
Infecia latent /subclinic (non-productiv)

Infecia productiv
(leziuni de grad sczut = CIN 1 = displazie uoar = condilom)

Infecia transformant
(leziuni precanceroase = CIN II, CIN III i CIS)

Tipurile de infecie HPV
Microtraumele epiteliale permit
accesul HPV la celula bazal
Infecia
latent
Infecia latent/subclinic (non-productiv)
Se menine constant numrul de copii virale (~ 100 de copii/ celul)

Replicarea ADN viral episomal se face n strans legatur cu replicarea
ADN celular

Genele tardive nu sunt exprimate i nu sunt generate particule virale

Nu exist nici un semn morfologic.

ADN viral poate fi pus n eviden prin metode de biologie molecular.
Infecie frecvent mai ales la persoane tinere.
Regresiv spontan de cele mai multe ori.
Replicarea ADN viral, expresia genelor virale tardive n
celulele superficiale i intermediare.
Producerea i eliberarea virionilor maturi
Modificrile citologice i histologice sunt LSIL CIN I.
Infecia productiv
Infecia productiv
Poate fi concomitent sau ulterioar unei infecii productive.
Localizat n straturile bazale.
Sunt implicate tipurile HPV cu risc nalt i mediu oncogen
Supraexprimarea oncogenelor virale E6 i E7 care duce la
instabilitate cromozomial.
Anomalii celule bazale - HSIL- CIN II, CIN III, CIS.

Infecia transformant
Infecia
transformant
Evoluia natural a infeciei genitale cu HPV
Majoritatea infeciilor cu HPV sunt tranziente i asimtomatice, rezolvndu-se
spontan datorit dezvoltrii rspunsului imun

Infecia persistent conduce la dezvoltarea leziunilor precanceroase i a
cancerului de col uterin
Tehnici de biologie molecular, citologie i
histologie utilizate pentru detecia infeciei
genitale cu HPV
Tehnici non-moleculare
Colposcopia
Citologia
Histologia
Tehnici moleculare
de amplificare a semnalului generat (captura hibrid II)
de amplificare a secvenei de ADN int - bazate pe PCR
(HPV INNO- LiPA, HPV Linear array)
Tehnici de imunocitochimie i imunohistochimie
Testul Babe-Papanicolaou - Succes i Limite

Un test cu o vechime de 80 de ani cu un succes remarcabil

Citologia este testul de screening consacrat pentru cancerul de col uterin

Reducerea semnificativ a incidenei cancerului de col uterin

Progrese tehnice importante n ultimii ani

tehnica de recoltare mbuntit + CITOLOGIA N MEDIU LICHID SAU
MONOSTRAT
(materialul recoltat este introdus ntr-un mediu lichid, din care celulele se
transfer pe lam prin tehnici semiautomate sau automate)

Testul Babe-Papanicolaou - Succes i Limite
Limitele screening-ului
Rezultatele fals negative
Cauze
Erori de recoltare i procesare
Erori de screening
Oboseala
Omiterea aspectelor rare
Interpretare greit


Toate celulele sunt bine etalate
Transfer randomic, reprezentativ de
celule
Fixare optim
Preparat cu mai puin snge, mucus i
celule de tip inflamator, fr artefacte
de uscare la aer
Suprapunere minim
Pierderea majoritii celulelor
Transferul aleator al celulelor pe
frotiu
Agregarea i suprapunerea celulelor
Suprapunerea cu elemente
inflamatorii
Citologie convenional Citologie n mediu lichid
Testul Babe-Papanicolaou
Mai puine frotiuri sunt catalogate ca fiind nesatisfactoare sau
suboptimale (preparat cu mai puin snge, celule de tip
inflamator, mucus, fr artefacte de uscare la aer i celule
suprapuse)

Este redus suprafaa de examinat

Permite efectuarea unor investigaii suplimentare din aceeai
recoltare
(Baz pentru citologia cu precitire automatizat, testare HPV
simultan)


Citologie n mediu lichid - Avantaje
Specimen recoltat - celule ale zonei exocervicale, endocervicale i de
tranziie dintre acestea (zona de transformare)

Metoda de recoltare
Recoltarea se poate face
- cu un singur instrument (periua Cervex brush)
- sau clasic, cu dou instrumente separate pentru
exocol i endocol (spatula Ayre i periua de
endocol)
Citologia convenional
Citologia n mediu lichid (Thin Prep)
Periua cu care s-a efectuat recoltarea nu se las n recipient, ci
se cltete cu insisten, apoi se arunc.
Citologia implic
un personal administrativ i de laborator
numeros
activiti tehnice i medicale diferite
Citologie n mediu lichid
Exist dou moduri de procesare:

Semiautomat
(Sistemul CYTO-screen (SEROA)

complet automat
(ThinPrep-Hologic i B&D: SurePath)
Citologie n mediu lichid semiautomat

Sistemul CYTO-screen (SEROA)
Metode
Din ~1970 s-au fcut eforturi de ,,automatizare'' a citologiei
Hologic (fost Cytyc):
Testul PAP ThinPrep
Aprobat de FDA din 1996 ca fiind semnificativ mai bun dect citologia
convenional;
de asemenea semnificativ mai bun pentru detectarea leziunilor glandulare din
2005

B&D: SurePath
Aprobat de FDA din 2003 performan crescut n detectarea CIN-urilor

Citologie n mediu lichid automat
Citologia n mediu lichid cu precitire automatizat
Sistemul ThinPrep Imaging
cea mai avansat tehnologie de prescreening
computerasistat

Doar pentru recoltoarele ThinPrep

Aprobare FDA din 2003

Analiza nuclear densitometric

Sistemul selecteaz 22 de cmpuri reprezentative pentru
screening

Detectarea unei anomalii: impune evaluarea ntregului
frotiu



ThinPrep Processor 5000
Colorare automat
Coloraia Papanicolaou
Fixare alcool etilic 95% 15 minute
Splare ap distilat 1 minut
Colorare nuclei cu hematoxilin Harris 5 minute
Splare ap distilat 1 minut
Dedifereniere n alcool acidifiat
(acid clorhidric 1% n alcool etilic 95%)
20 secunde
Splare ap curent 5 minute
Deshidratare: alcool etilic de 70%; 95%; 100% cltire
Colorare citoplasm cu Orange G 3 minute
Splare alcool etilic absolut 2 minute
Colorare citoplasm cu EA 65 6 minute
Splare alcool etilic 95% i 100% consecutive cltire de trei ori
Clarificare cu toluen 20 minute
Montare lamei cu entelan prin lipirea unei lamele pe
suprafa.
- monostrat
- spot de celule de 1,9 cm
(> celule) ncadrat de puncte
de referin
Frotiul ThinPrep
ThinPrep Imaging System (IMAGER)
Citirea automatizat a frotiurilor la
microscop
Avantaje precitirii automatizate
Acuratee, eficien i productivitate sporite ale muncii de laborator
Reducerea ratei rezultatelor fals negative la jumatate (4)
Cretere important a satisfaciei cititorilor la locul de munc

Studii internaionale recente arat c screeningul automat:
crete rata deteciei leziunilor de grad sczut i crescut (1), precum i a
leziunilor glandulare (3)
permite detectarea CIN2+ n raport de 2:1 fa de citologia convenional
reduce rata rezultatelor incerte n favoarea unui diagnostic clar definit (2)
1. Automated screening of gynecological cytology: A comparision results, Feb. 2011, Alameda F, MD, Pijuan L, MD,
Lloveras B, MD, Soler I, Romro E, Carreras R, MD, Serrano S, MD, Spain
2. The italian Abruzzo study: Liquid based cytology & ThinPrep Imaging System vs conventional. Cytology &
focalpoint system (Arint study), Mai 2011, Maccallini V, Angeloni C, Palazzo F, Leo C and Abruzzo Cervical Cancer
Screening Group, Italy
3. A randomized trial comparing conventional cytology to liquid based cytology with computerassistance: Results of
the Rhine-Saar-Study, Mai 2010, Ikenberg H, Harlfinger W, Neis K, Jordan B, Knig J, Klug SJ, Germany
4. Multicyte ThinPrep Imaging: The Scottish experience, May 2012, Nicoll S, Palmer T, McKean M, Scotland
Sistemul Bethesda 2001
Gradul de adecvare a frotiului
Rezultat:
NILM- frotiu negativ pentru o leziune intraepitelial sau malign
Anomaliile celulelor scuamoase
- celule scuamoase atipice (ASC-US, ASC-H)
- leziuni intraepiteliale de grad sczut: LSIL (CIN1)
- leziuni intraepiteliale de grad nalt: HSIL (CIN 2, CIN 3, CIS)
Anomaliile celulelor glandulare
Celule glandulare atipice (AGCec, em, NOS, in favor)
Adenocarcinom endocervical in situ (AIS)
Adenocarcinom (ACec, em, extrauterin)

Caracterizarea leziunilor HPV induse

Categoria ASC (Celule scuamoase atipice)
ASC-US - Celule scuamoase atipice de semnificaie nedeterminat
Criterii citologice
-nuclei de 2,5-3 ori mai mari dect ai unei celule
intermediare normale
- raport nucleo-citoplasmatic uor mrit
- minim hipercromazie nuclear i iregularitate n
distribuia cromatinei
- parakeratoz atipic (anomalii nucleare asociate cu o
citoplasm dens i orangeofil)
- multinucleere
ASC-H - Celule scuamoase atipice ce nu pot exclude o
leziune de grad nalt


Modificrile celulelor bazale, parabazale sau metaplaziate sugestive pentru leziuni
intraepiteliale de grad nalt, insuficiente cantitativ i calitativ pentru o interpretare
tranant
Criterii citologice
- celule cu nuclei de 1,5 - 2,5 ori mai mari dect normal, raport nucleo-citoplasmatic
crescut, anizocarie i hipercromazie nuclear, contur nuclear neregulat, cromatina
distribuit neuniform.
LSI L - Leziunea intraepitelial scuamoas de grad
sczut
-modificri ale celulelor scuamoase de tip intermediar i superficial
-manifestarea morfologic a unei infecii productive cu HPV
-leziunile de grad sczut includ displazia uoar/CIN I
Criterii citologice

- prezena de koilocite
(celule de tip intermediar cu halou perinuclear,
membrana citoplasmatic ngroat i atipii nucleare)

- nuclei de 3 ori mai mari dect ai unei celule intermediare normale

- binucleree, multinucleree

- raport nucleo-citoplasmatic crescut

- membran nuclear neregulat

- anizocarie, hipercromazie nuclear

- cromatina dens i opac, fie granular

- keratinizare citoplasmatic (hiperkeratoza i parakeratoza atipic)

HSI L - Leziune scuamoas intraepitelial cu grad nalt

Include CIN II (displazia moderat) i CIN III (displazia sever) i carcinomul in
situ (CIS)

Criterii citologice
-celule bazale i parabazale atipice izolate, n placarde
-anizocitoz
-raportul nucleo-citoplasmatic crescut
- hipercromazie nuclear i anizocarie
-cromatina poate fi fin granular, grunjoas sau dens
-conturul nveliului nuclear este neregulat
-iar nucleoli sunt n general abseni
HSI L - Leziune scuamoas intraepitelial cu grad nalt
Criterii citologice
- celule scuamoase cu forme bizare incluznd celulele fibr i
celulele mormoloc;
- celule bazale mature i imature, izolate sau n agregate
sinciiale cu margini slab definite, cu raport nucleo-
citoplasmatic ridicat;
- anizocarie, membrana nuclear neregulat,
- cromatina grunjoas, distribuit neregulat;
- modificari keratotice asociate (hiperkeratoza i parakeratoza);
- fondul conine debriuri celulare, celule inflamatorii
(numeroase neutofile i histiocite) i hematii degradate -
diateza tumoral
Carcinomul scuamos
AGC ec - Celulele glandulare endocervicale atipice
Criterii citologice

- celulele cilindrice sunt dispuse n grupuri compacte
cu dispozitie radiar a nucleilor n periferie, palisade,
rozete cu nuclei ngrmdii i suprapui; se pierde
modelul de fagure de miere
- raport nucleo-citoplasmatic uor mrit
- nuclei de mrimi variabile, ovali sau alungii cu
cromatin fin granular sau grunjoas
- cantitatea de citoplasm i de mucin este diminuat
- nucleoli pot fi prezeni
Tehnici moleculare de detecie a ADN-HPV

Hybrid Capture II (hc2)

Primul test ADN HPV aprobat de FDA
utilizeaz principiul chemiluminiscenei

Discrimineaz 13 tipuri HPV HR (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,
59 i 68) de 5 tipuri HPV LR (6, 11, 42, 43 i 44)

test de hibridizare cu amplificare de semnal pe microplac pentru
determinarea calitativ a ADN-HPV


Testul COBAS (Roche)
ABBOTT RealTime HR-HPV-DNA test: 14 HR-
HPV (+individual HPV 16/18)

Teste calitative bazate pe tehnologia PCR n timp real i detecie prin
fluorescen

12 tipuri cu risc nalt oncogen analizate ca grup de risc (respectiv 31, 33,
35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68)
tipurile 16 i 18 genotipate individual.

Detecia HPV se realizeaz la sensibilitate clinic (corespunzatoare
prezenei sau riscului pentru CIN i cancer)



Indicaiile testului de detecie
Citologia echivoc, clasificat ASC-US.

Screening n asociere cu citologia la femeile peste 30 de ani.

Supravegherea dup tratament conservator pentru CIN (conizaie, excizie
diatermic).

Discordanele cito-colposcopice.

Discriminarea infeciei HPV cu risc nalt de cea cu risc sczut, care difer
ca agresivitate.

Teste Genotipare ADN HPV
HPV Linear Array (Roche) - identific 37 tipuri de HPV ano-genitale n probele
analizate
HPV 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62,
64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 i CP6108


INNO LiPA HPV Genotyping EXTRA ( Innogenetics) identific 28 tipuri HPV cu
risc sczut, mediu i nalt
HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52,56, 58, 59, 68, 73, 82, 26, 53, 66, 6, 11, 40, 43,
44, 54, 70

Nr.
HPV Linear
Array
INNO LiPA HPV
Genotyping
EXTRA
1 HPV 16 HPV 16
2 HPV 18 HPV 18
3
HPV 31 HPV 31
4
HPV 33 HPV 33
5
HPV 35 HPV 35
6
HPV 39 HPV 39
7
HPV 45 HPV 45
8
HPV 51 HPV 51
9
HPV 52 HPV 52
10
HPV 56 HPV 56
11
HPV 58 HPV 58
12
HPV 59 HPV 59
13
HPV 68 HPV 68
14
HPV 73 HPV 73
15
HPV 82 HPV 82
16
HPV 66
HPV 66
Nr.
HPV Linear
Array
INNO LiPA HPV
Genotyping
EXTRA
1 HPV 26 HPV 26
2 HPV 53 HPV 53
Nr. HPV Linear Array INNO LiPA HPV
Genotyping EXTRA
1 HPV 6 HPV 6
2 HPV 11 HPV 11
3 HPV 40 HPV 40
4 HPV 54 HPV 43
5 HPV 70 HPV 44
6 HPV 61 HPV 54
7 HPV 62 HPV 70
8
HPV 81
9
HPV 55
10
HPV 42
11
HPV 83
12
HPV 67
13
HPV CP6108
14
HPV 84
15
HPV IS39
16
HPV 72
17
HPV 71
18
HPV 64
19
HPV 69
Indicaiile testului de genotipare
Citologia echivoc, clasificat ASC-US.
Screening n asociere cu citologia la femeile peste 30 de ani.
Supravegherea dup tratament conservator pentru CIN
(conizaie, excizie diatermic).
Discordanele cito-colposcopice.
Identificarea tipului de infecie HPV cu risc nalt, care difer
ca agresivitate.
Identificarea i monitorizarea infeciei HPV persistente.
Stratificarea riscului pacientelor cu infecie HPV multipl.
Monitorizarea pacientelor vaccinate HPV.
Investigare selectiv nainte de vaccinarea HPV (testarea HPV
i vaccinarea HPV).
Testul de genotipare HPV Linear Array (Roche)

Tehnica PCR
Reacia de hibridizare
Detecia reaciei
Testul de genotipare HPV Linear Array
Interpretarea rezultatelor
Material i metod
Studiu retrospectiv (2006-2011)
9766 cazuri (15 - 71 ani)
Distribuia pe zone geografice
8251 cazuri (84,49 %) din Bucureti
1515 cazuri (15,51 %) din provincie
685
280
218
197
108
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Moldova Dobrogea Transilvania Muntenia Oltenia
Studiul distribuiei genotipurilor HPV
n populaia feminin din Romnia
4913
50,31%
4853
49,69%
HPV (+)
HPV (-)
Rezultate
Rezultate HPV pozitive
monoinfecia i infecia multipl
HPV (-)
50,31%
Infecie multipl
25,54%
Monoinfecie
24,15%
HPV (+)
49,69%
Distribuia pe grupe de vrst a pacientelor HPV pozitive
4,31
19,53
27,94
23,61
13,49
6,84
2,47
1,17 0,49
0,14
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
%
1
5

-

2
0
2
1

-

2
5
2
6

-

3
0
3
1

-

3
5
3
6

-

4
0
4
1

-

4
5
4
6

-

5
0
5
1

-

5
5
5
6

-

6
0
>
6
0
Vrsta
Distribuia general tipurilor de HPV
cu risc nalt, mediu i sczut
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Nr.
cazuri
1
6
5
3
3
1
5
1
4
2
6
2

C
P

6
1
0
8
6
6
5
4
8
4
6
16
5
8
5
2
1
8
5
6
3
9
7
3
4
5
3
3
5
9
8
1
5
5
7
0
6
8
3
5
8
3
6
7
1
1
8
2
4
0
2
6

I
S

3
9
7
2
7
1
6
4
6
9
Tip HPV
Frecvena tipurilor cu risc nalt
1,61
2,50
2,86
3,75
4,40
4,74
5,18
5,27
5,31
5,65
6,07
6,46
7,55
9,33
10,50
18,82
0 5 10 15 20
16
31
51
66
58
52
18
56
39
73
45
33
59
68
35
82
T
i
p

H
P
V
%
Frecvena tipurilor cu risc mediu
94,91
5,09
0 20 40 60 80 100
53
26
T
i
p

H
P
V
%
Frecvena tipurilor cu risc sczut
0,13
0,42
0,45
1,15
1,62
2,28
2,88
3,35
4,16
4,58
4,98
9,24
9,53
9,64
9,85
10,68
12,49
12,57
0 2 4 6 8 10 12 14
42
62
CP 6108
54
84
61
6
81
55
70
83
67
11
40
IS 39
72
71
64
T
i
p

H
P
V
%
Monoinfecia (2359 cazuri)
HPV RS
35,92%
HPV RM
6,32%
HPV R
57,76%
Distribuia tipurilor de HPV
n monoinfecie
Infecia multipl-numr de tipuri (2-12)
0,08
0,04
0,16
0,36
0,76
1,24
2,29
6,01
13,03
25,46
50,56
0 10 20 30 40 50 60
%
12 tipuri
11 tipuri
10 tipuri
9 tipuri
8 tipuri
7 tipuri
6 tipuri
5 tipuri
4 tipuri
3 tipuri
2 tipuri
N
r
.

t
i
p
u
r
i

H
P
V
Detecia ARN mesager E6 i E7 este un indicator
pentru activitatea oncogen a HPV i nu doar al
prezenei acestuia.
Metode noi pentru testarea HPV
Detecia ARNm E6 i E7
Test Metoda inta Control
Intern
HPV
OncoTect
Citometrie n flux ARNm E6/E7 pentru toate
tipurile HPV cu risc nalt
oncogen, msurat celul
cu celul
DA
Aptima
HPV
Assay
Amplificare mediat de transcripie
(TMA Transcription Mediated
Amplification)
ARNm HPV E6/E7 - 16, 18,
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59, 66, 68.
NU
PreTect
Proofer
Amplificarea secvenelor de acizi
nucleici (NASBA Nucleic Acid
Sequence Amplification)
ARNm HPV E6/E7 - 16, 18,
31, 33 i 45
DA
NucliSens
EasyQ
HPV
Amplificarea secvenelor de acizi
nucleici (NASBA Nucleic Acid
Sequence Amplification)
ARNm HPV E6/E7 - 16, 18,
31, 33 i 45
DA

Test detecie HPV ARNmesager E6/E7 (grup 14 tipuri HR)

este cel mai important indicator clinic pentru evoluia leziunilor precanceroase
(identific acele femei cu risc nalt de a dezvolta cancer)

HPV OncoTect are sensibilitate similara si specificitate mult mai mare decat
ADN HPV si celelalte metode ARNm

Analizare automata, cantitativa, cu un flow citometru dedicat

Identific procentul de celule n care E6 i E7 sunt supraexprimate

Specific tipul celulei afectate (scuamoas sau endocervical)





HPV OncoTect
1ml de ThinPrep (max 10
6
cells)
Fixare, permeabilizare
Hibridizare cu mix de probe
oligonucleotidice marcate
fluorescent
Spalarea
Determinarea procentului de celule
fluorescente
flow citometru
Celule hibridizate
Determinarea prin Citometrie n flux a E6/E7
ARNm pentru tipurile HPV HR
Markerul p16
INK4a

p16
INK4a
este o protein celular, un inhibitor de kinaze cyclin-
dependente, implicat n reglarea diviziunii celulare.
Supraexprimarea proteinei p16
INK4a
este corelat cu iniierea
procesului de transformare oncogen a celulelor cervicale.
Este marker pentru infeciile HPV TRANSFORMANTE.
Are aplicabilitate att n frotiurile citologice, ct i pe seciuni
histologice



Detecia imunocitochimic a markerului
p16INK4a
Biomarker care localizeaz pe frotiu celulele cu expresie
activat de oncogene HPV.
Utilitate clinic n :
- citologiile raportate ASC-H,
- triajul cazurilor cu rezultat citologic LSIL i ASC-US.
Detecia imunohistochimic a markerului p16
INK4a
Epiteliu normal i displazic n coloraii uzuale (HE) i
imunohistochimice p16
INK4a
V mulumesc pentru atenie!