MICROSCOPIA ELECTRONIC

Microscopia electronic utilizeaz instrumente de examinare (microscoape

electronice) care func ioneaz pe baza unui fascicul de electroni de nalt energie
(accelera i) n scopul examinrii unor detalii de dimensiuni reduse ale obiectelor
observate.
Dimensiunile relative ale structurilor biologice i sistemele de vizualizare specifice
sunt prezentate n figura de mai jos:
Tipuri de microscoape electronice
Se descriu la ora actual c!teva tipuri de microscoape electronice utile n
cercetarea biomedical sau n completarea diagnosticului de laborator:
" Microscopul electronic de transmisie (#$M)
" Microscopul electronic de baleiaj (S$M)
" Microscopul electronic de reflexie (%$M)
" Microscopul electronic de baleiaj i transmisie (S#$M)
" Microscopul electronic cu voltaj redus (&'$M)
Microscopul electronic se deosebe te de cel fotonic prin faptul c utilizeaz ca
sistem de examinare un fascicul de electroni emis ntr"un sistem vidat n locul unui
fascicul de fotoni. Scopul acestui tip de microscop este de a produce asemenea
celui fotonic o imagine mrit a preparatului. (u toate acestea microscopul
electronic are o putere de rezolu ie mai mare dec!t un microscop fotonic datorit
dependen ei acestei puteri de lungimea de und a radia iei electromagnetice
folosite. $lectronii au o lungime de und de )**.*** de ori mai mic dec!t cea a
luminii vizibile (fotoni) iar lungimea de und este invers propor ional cu puterea de
mrire. +n plus cu c!t electronii au o vitez mai mare (implicit cu c!t tensiunea de
accelerare este mai mare) cu at!t lungimea de und este mai redus i rezolu ia
microscopului electronic crescut. %ezolu ia microscopului electronic ajunge la circa
*, nm i la mriri de circa , milioane de ori n timp ce microscoapele optice
obi nuite (non"confocale) sunt limitate de fenomenul de difrac ie la o rezolu ie de
,** nm i mriri sub ,*** de ori. %ezolu ia #$M este limitat adesea de abera iile
de sfericitate dar noile sisteme corectoare i tensiunile de alimentare mari au dus la
apari ia -%#$M (.ig. resolution #$M) care are o rezolu ie sub /* pm i o putere de
mrire de circa /* de milioane de ori.
&entilele utilizate n microscopia electronic sunt electrostatice sau electromagnetice
spre deosebire de microscopia optic unde lentilele sunt din sticl sau compozite
transparente. &entilele de sticl nu pot influen0a traiectoria fasciculului de electroni.
1ormarea imaginii depinde de electronii transmi i prin preparat (#$M) sau emi i
secundar de ctre acesta (S$M).
Informa ii ob inute cu ajutorul microscopiei electronice
2nforma iile care se pot ob ine cu ajutorul microscoapelor electronice se refer la
ultrastructura unor probe biologice sau anorganice care pot cuprinde:
microorganisme celule molecule mari fragmente tisulare metale sau cristale.
3ceste informa ii pot sublinia:
" #opografia " caracteristicile de suprafa ale unui obiect textura raportul
direct dintre aceste caracteristici i propriet ile materialului din care este
compus obiectul (duritate reflectivitate)4
" Morfologia " forma 5i6sau dimensiunile componentelor unui obiect rela ia
dintre aceste structuri i propriet ile materialului din care este compus
obiectul (ductilitate rezisten reactivitate)4
" (ompozi ie " cantitatea i calit ile elementelor dintr"un obiect analizat4 rela ia
direct dintre compozi ie i propriet ile obiectului studiat4
" 7o iuni cristalografice " modul de distribu ie a atomilor i rela ia cu
propriet ile obiectului de studiat.
+n biologie scopul declarat al dezvoltrii microscoapelor electronice este de a
investiga aspecte ale universului celular inaccesibile prin examinarea cu ajutorul
microscoapelor optice. 3stzi pornind de la principiul dezvoltat de $rnst %us.8a i
Max 9noll n ):;) putem examina ultrastructura celulelor i c.iar a organitelor
celulare. +n aprilie ,*)* la centrul de microscopie de la <niversitatea (alifornia &3
S<3 a fost publicat prima imagine a unui atom ob inut prin crio"
electronomicroscopie iar posibilit ile de explorare ale universului submolecular i
c.iar subatomic par inepuizabile.
Microscopia electronic de transmisie
$ste o metod de investiga ie microscopic n care un fascicul de electroni
este transmis printr"un preparat ultrafin interac ion!nd cu elementele componente
ale preparatului i fiind refocalizat de o serie de lentile pentru a genera imaginea
final mult mrit a obiectului de examinat.
Microscopul electronic de transmisie (#$M) utilizeaz un fascicul de electroni
de nalt energie emi i de un tun electronic care con ine un filament de tungsten sau
un cristal de .exaborur de lantan (&a=
>
)4 filamentul sau cristalul men ionate
formeaz catodul. $lectronii sunt accelera i de un anod la o diferen de poten ial
de )** 8e'. #raiectoria electronilor este controlat cu ajutorul unor lentile
electromagnetice. $lectronii sunt direc iona i n form de fascicul de ctre lentilele
condensor i sunt orienta i ctre preparat de ctre lentilele obiectiv. &entilele de
proiec ie direc ioneaz fasciculul de electroni spre sistemul de formare a imaginii.
3cest sistem poate fi reprezentat de o plac fluorescent o plac fotografic
acoperit de emulsie sau un senzor ((D care poate transmite imaginea spre un
ecran.
Re!olu ia microscopului electronic
%ezolu ia maxim (rez
max
)

pe care o poate atinge un microscop fotonic este
limitat de lungimea de und a fotonilor (?) i de apertura numeric a sistemului optic
(73).
NA n
rez
2 sin 2
max

=
3pertura numeric (73) a unui sistem optic reprezint o mrime
adimensional care caracterizeaz limita ung.iului sub care acel sistem optic poate
accepta sau emite lumin. 73 @ nAsin unde este semi"ung.iul conului maxim de
lumin emis sau acceptat de o lentil (sistem optic).
&ungimea de und a fotonilor este mult mai mare dec!t a electronilor i astfel
invers propor ional rezolu ia maxim a unui microscop electronic este mult mai mare
dec!t a unuia fotonic. &ungimea de und a fasciculului de electroni nu reprezint un
factor limitant al rezolu iei #$M deoarece aceast lungime de und este func ie de
energia electronilor i implicit de tensiunea de accelerare (ex. o rezolu ie de , pm se
ob ine la o tensiune de ;** 8'). (u toate acestea abera iile de sfericitate (care
produc curbarea mai puternic a frontului de und la marginea lentilelor fa de axul
optic) cromatice sau de astigmatism ale lentilelor electromagnetice i instabilitatea
curen ilor care le strbat limiteaz rezolu ia la /* pm c.iar i pentru cele mai scumpe
#$M.

Pr ile componente ale unui microscop electronic
<n #$M include " o surs de emisie pentru electroni (tun electronic plus surs
de alimentare) o coloan care include lentile electromagnetice i plci electrostatice
o camer a preparatului i o camer de examinare. #oate aceste sisteme sunt
situate ntr"un vid nalt generat de un sistem special de vidare. &entilele i plcile
sunt necesare manipulrii i g.idrii fasciculului de electroni. +n plus un sistem
ecluz i un dispozitiv special permite inser ia amplasarea sau ndeprtarea
preparatului n axul optic al microscopului. 3ta ate microscopului se regsesc
sistemele electronice de formare sau amplificare a calit ii imaginii (camer video
lateral sau de fund sistem de augmentare a contrastului sisteme de imprimare a
imaginii).
Sc.em de func ionare a microscopului electronic de transmisie
Br ile componente ale microscopului electronic de transmisie B.ilips (M)** din dotarea disciplinei
de =iologie (elular i foarte Molecular 2a i
"tun de electroni4 "Sistem de vidare (pompe)4 "lentile electromagnetice i aperturi4 "camera
probei cu sistem de ecluz pentru vidare4 " panouri de control (/ " pentru aliniere > " pentru
mrire i focalizare)4 "ecran pentru afi area imaginii captate de camera ((D4 "camera de
observa ie cu ecran fluorescent
#oate pr ile componente ale #$M n care circul electronii (de la filament la
sistemul de observa ie din camera de formare a imaginii) sunt dispuse n interiorul
sistemului care genereaz un vid nalt.
Tunul electronic (sursa de electroni) este format din:
" filament (catod)
" circuit de polarizare
" cilindru Cen.elt (se cite te DveneltD)
" anod de extrac ie
Sursa de electroni reprezentat de filamentul de tungsten sau de cristalul de
.exaborur de lantan (sau de ceriu) (catodul) nclzite de un circuit special.
Sursa de tensiune de voltaj nalt de obicei de )**";** 8' alimenteaz
anodul i catodul. +n plus exist un circuit electric suplimentar pentru nclzirea
filamentului. (re terea curentului care trece prin filament duce la o satura ie a curbei
de emisie a electronilor. Bentru prelungirea duratei de exploatare a filamentului
trebuie s existe un ec.ilibru ntre nclzirea filamentului i tensiunea de accelerare.
Sistemul de extrac ie6filtrare a electronilor " cilindrul Cen.elt. 3cesta este
format dintr"un circuit de polarizare cuplat la o diferen de poten ial de numai c!teva
sute de vol i fa de filament (catod). $ste util pentru focalizarea i controlul
fasciculului de electroni. 3 fost inventat n ):*, de ctre fizicianul german 3rt.ur
%udolp. =ert.old Cen.elt. 3re rolul de a nu permite dispersia electronilor emi i de
filament.
Sistemul de accelerare a electronilor " anodul. $ste format dintr"o plac de
metal perforat ncrcat pozitiv.
Func ionarea sursei de electroni. 1ilamentul (sau cristalul) genereaz
electroni prin fenomenul de emisie termoionic (efect $dison) sau prin emisie
electronic asistat de c!mp n mediu vidat. Brin emisie termoionic electronii sunt
emi i de filamentul nclzit printr"un circuit electric separat. (urentul care traverseaz
filamentul controleaz temperatura acestuia (optim ,/**9) i implicit numrul de
electroni emi i. +n general avem nevoie de un numr mare de electroni emi i de o
regiune ngust a filamentului4 putem ob ine acest efect prin DsaturareaD filamentului
implicit cre terea curentului n filament p!n la un prag limit (unde numrul de
electroni emi i rm!ne constant) $lectronii sunt emi i cu o anumita vitez c! tigat
prin ciocniri cu atomii care au o agita0ie violent datorat temperaturii generate de
alimentarea filamentului (catod). E parte mic din ace ti electroni ating anodul c.iar
in lipsa unui c!mp electric aplicat. $lectronii sunt apoi extra i i selecta i cu ajutorul
cilindrului Cen.elt accelera i i focaliza i cu ajutorul anodului. (ircuitul de polarizare
controleaz dimensiunea regiunii de filament care emite electroni. Dac polarizarea
este prea mare nu exist emisie de electroni. 'aria ia curentului de polarizare
influen eaz iluminarea probei. Erificiul specific al anodului emite un fascicul
divergent de electroni. $lectronii de energie nalt permit examinarea unor probe cu
grosimi mai mari dar determin i afectarea probei.
Lentilele electromagnetice au rolul de a focaliza razele paralele la o anumit
distan focal. #$M utilizeaz lentile electromagnetice pe baz de solenoizi
(bobine) care formeaz lentile convexe. (!mpul electromagnetic generat de aceste
lentile trebuie s fie simetric radial n caz contrar apr!nd abera ii de sfericitate
cromatice sau astigmatism. &entilele sunt alctuite din fier fier"cobalt i aliaje nic.el"
cobalt cum ar fi permalloF"ul.
&entilele #$M sunt dispuse pe ; nivele " condensor obiectiv proiector:
" lentilele condensor au rolul de a forma fasciculul primar de electroni4
" lentilele obiectiv au rolul de a focaliza fasciculul de electroni dup trecerea prin
preparat4
" lentilele proiector au rolul de a proiecta fasciculul care provine de la lentilele
obiectiv pe ecranul fluorescent sau pe senzorul ((D.
&entilele posed i un sistem de rcire bine calibrat care disip cldura
format n timpul utilizrii.
+n plus fa de lentile coloana #$M mai include plci metalice inelare
(aperturi) care au rolul de a exclude electronii care sunt mai ndeprta i de o anumit
distan fa de axul optic. 3ceste plci sunt practic formate din discuri mici
metalice cu orificiu central care sunt suficient de groase pentru a mpiedica trecerea
electronilor prin disc n timp ce trecerea electronilor axiali este permis. 3perturile au
rolul de a reduce intensitatea fasciculului de electroni precum i filtrarea electronilor
mpr tia i sub ung.iuri mari prin procese determinate de abera ii cromatice sau de
sfericitate.
3justarea lentilelor electromagnetice astfel nc!t planul imaginii este nlocuit cu
planul focal posterior determin ob inerea unui spectru de difrac ie pe sistemul de
formare a imaginii. Brobele cristaline formeaz o imagine cu un spectru multipunct n
timp ce probele policristaline sau amorfe genereaz un spectru de difrac ie inelar.
Spectru de difrac ie cristalin pentru o
granul de o el austenitic
"ormarea ima#inii pentru #$M depinde de modul de operare. +n modul de operare
obi nuit (c!mp luminos) formarea contrastului este clasic prin obstruarea sau
absorb ia electronilor n prob. Gonele mai groase ale preparatului sau zonele cu
atomi mai grei vor aprea ntunecate n timp ce zonele fr preparat apar
luminoase de unde i denumirea de Dc!mp luminosD. 2maginea final reprezint o
proiec ie bidimensional a probei de"a lungul axului optic.

Microscopia electronic de baleiaj
Microscopia electronic de baleiaj se distinge de #$M prin faptul c
analizeaz fasciculul de electroni emi i de preparat n urma impactului cu electronii
primari emi i de surs.
$lectronii de nalt energie emi i de surs baleiaz suprafa a probei dup un
model prestabilit (de la st!nga la dreapta i de sus n jos).
$lectronii primari interac ioneaz cu nucleii i electronii atomilor din prob.
3ceste interac iuni genereaz mai multe tipuri de semnale: electroni secundari (cei
care sunt analiza i i care formeaz imaginea electroni de retrodifuzie electroni
3uger radia ii H luminiscen de catod.
Structura S$M:
). Sursa de electroni (tunul electronic) care accelereaz electronii n coloana
microscopului.
,. &entile electromagnetice (condensor i obiectiv) care pot controla diametrul
fasciculului de electroni i l pot focaliza pe preparat.
;. 3perturi (filme metalice cu orificii punctiforme) care filtreaz electronii
deflecta i sau cu un ung.i incident prea mare.
I. Sistem de control al pozi iei probei (deplasri n plan orizontal balans
rota ie)
/. E suprafa de interac iune ntre fascicul i prob care genereaz
semnalele men ionate mai sus. 3ceste semnale produc imagini sau
spectre.
>. #oate elementele men ionate sunt men inute n vid de diferite niveluri
(vidul din coloana superioar este mai nalt dec!t n camera probei).
%ezolu ia S$M la ora actual este de *I nm pentru microscoapele industriale (voltaj
nalt " ;*8') i de *: nm pentru microscoapele biologice (Magellan de la 1$2) (voltaj
redus " ) 8')
Modul de func ionare al SEM
" tunul electronic genereaz un flux monocromatic de electroni
" fluxul de electroni este condensat de ctre prima lentil condensor4 lentila este
util pentru formarea fasciculului de electroni c!t i pentru limitarea curentului
din fascicul
" fasciculul de electroni este condi ionat de apertura condensorului elimin!ndu"
se astfel electronii care au un ung.i incident prea mare
" a doua lentil condensor formeaz un fascicul de electroni sub ire coerent i
controlabil
" o a doua apertur condensor filtreaz electronii cu ung.i de inciden crescut
un set de bobine produc baleierea fasciculului de electroni dup un model
prestabilit (de la st!nga la dreapta i de sus n jos)4 viteza de baleiere este
reglabil fasciculul insist!nd c!teva microsecunde asupra fiecrui punct al
probei
" lentilele finale " obiectiv " focalizeaz fasciculul de electroni n zona dorit de
la suprafa a probei
" c!nd fasciculul de electroni atinge proba sunt produse semnalele men ionate
mai sus (electroni secundari de retrodifuzie radia ii H etc)
" sistemele de detec ie interpreteaz semnalele emergente i formeaz
imaginea sau dau alte date analitice
" procesul de formare a imaginii dureaz ;*">* sec.
Sc.em de func ionare a S$M
Granule de polen SEM