Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza

de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007

RAPORT TIINIFIC
2010

OBIECTIVELE ETAPEI:
1. Studii in vitro asupra produselor funcionale obinute.
2. Studii in vivo ale produselor funcionale obinute.

I. MATERIALE I METODE

1. Capacitatea bacteriilor lactice de a adera in vitro la celulele HeLa i competiia pentru situsurile de aderare
fa de specii potenial patogene s-a studiat utiliznd ca substrat celular linia celular stabilizat HeLa, prin metoda
calitativ (metoda Craviato i colab. 1979, modificat de Nataro i Kaper, 1998), iar evaluarea s-a fcut prin microscopie
optic. Analiza microscopic permite i o analiz semicantitativ a gradului de intensitate a aderenei bacteriene la
substratul celular, apreciat prin 1-3 semne +. Se consider intens aderente tulpinile notate cu ++ sau +++.
Tulpinile testate provin din culturi proaspete de 24h, n bulion MRS. Un volum de 1,5 ml cultur se centrifugheaz timp
de 10 min, la 10000 rpm, iar sedimentul se resuspensioneaz n tampon fosfat steril, pH=7,2-7,4 (PBS = Phosphate
Buffered Saline, Sigma)) pentru o splare. Apoi se prepar suspensia de lucru (tot n PBS) cu o densitate comparabil cu
standardul Mc Farland 0,5 (care corespunde la 10
8
celule/ml). Celulele HeLa au fost cultivate n mediul Eagle MEM
(EMEM, Gibco) (engl. minimum essential medium) mbogit cu: 10% ser foetal bovin (Gibco BRL) inactivat termic (30
min. la 56C), cu 0,1 mM aminoacizi neeseniali (Gibco BRL) i cu 0,5 ml gentamicin (50mg/ml) (Gibco BRL).
Celulele HeLa sunt cultivate n plci de plastic cu 6 compartimente (engl. multi-well), pn la o confluen de 80-100%
(termostatare timp de 24h, la temperatura de 37C). Monostraturile celulare HeLa sunt splate de trei ori n tampon fosfat
steril PBS. Godeul 1 rmne Martor (fr tulpina de testat), n godeul 2 se adaug 2 ml din tulpina de analizat, iar n
godeurile 3 6 doar 1 ml deoarece, n acestea se mai adaug cte 1 ml din diferite culturi ale tulpinilor patogene: n 3 - E.
coli, n 4 Listeria sp., n 5 - Salmonella sp., n 6 Staphylococcus sp. (pentru evaluarea competiiei fa de patogeni
pentru situsurile de aderen) i se termostateaz timp de 2h, la temperatura de 37C. Monostraturile sunt splate de 3 ori
cu PBS, fixate cu etanol rece 8 10 minute, colorate cu soluie Giemsa (1:20) (Merck, Darmstadt, Germany) i
meninute timp de 20 minute, la temperatura de 37C. Plcile sunt splate, uscate la temperatura camerei peste noapte i
examinate la microscop cu obiectiv de imersie (grosisment 2500 X) i fotografiate cu aparat foto Contax adaptat la
microscop.

2. Evidenierea interaciunilor in vivo dintre bacteriile lactice selecionate i microorganismele patogene

A fost conceput un model experimental in vivo care a utilizat animale de laborator (obolani convenionali, holoxenici
furnizai de Institutul Cantacuzino-cresctoria de animale Bneasa) la care efectul benefic urmrit al produsului probiotic
testat a constat n evidenierea interaciunilor cu microorganisme patogene. Produsul probiotic testat a fost tulpina
16GAL de Lactobacillus sp. izolat de pe gru depozitat la -70C n bulion MRS, suplimentat cu 20% glicerol. Cultura
primar a fost obinut prin cultivare n bulion MRS pn la mijlocul fazei de multiplicare logaritmic.
Etapele realizrii modelului experimental:
Caracterizarea calitativ i cantitativ a microbiotei normale intestinale eliminate n materiile fecale la
modelul animal utilizat (obolani holoxenici convenionali)
nainte de demararea experimentului propriu-zis, animalele au fost caracterizate din punct de vedere al compoziiei
microbiotei intestinale. Astfel, s-a observat c microbiota normal intestinal eliminat n materiile fecale la aceste
animale este constituit n exclusivitate din bacterii lactozo-pozitive (evideniate prin cultivarea materiilor fecale pe
mediu McConkey, care este un mediu slab selectiv ce conine ca ageni inhibitori, sruri biliare i cristal violet).
Tehnica de ncorporare a diluiilor zecimale care a fost utilizat a permis de asemenea evaluarea cantitativ a acestor
bacterii lactozo-pozitive. Pentru evidenierea bacteriilor lactice din microbiota intestinal normal s-au nsmnat n
paralel i plci cu mediu MRS. Deoarece n materiile fecale ale acestor animale nu se elimin bacterii lactozo-
negative, mediul McConkey a putut fi utilizat n continuare pentru izolarea bacteriilor patogene lactozo-
nonfermentative cu care s-a realizat infecia.
Caracterizarea microbiologic calitativ i cantitativ a microbiotei normale intestinale care colonizeaz
diferite segmente ale tractului intestinal la animalele utilizate n modelul experimental
Dup sacrificarea animalelor (prin cloroformizare), au fost prelevate seciuni de intestin din duoden, ileon i colon,
care au fost cntrite i splate n TFS (pH=7,2-7,4) pentru ndeprtarea coninutului luminal i a microoganismelor
neaderate. Ulterior, seciunile de intestin au fost fragmentate i mojarate steril, dup care au fost realizate diluii
zecimale n ap fiziologic steril, care au fost inoculate n mediu lactozat McConkey i pe mediu pentru evidenierea
lactobacililor (MRS).
Selecia microorganismului patogen utilizat pentru realizarea infeciei experimentale
Tulpina de infecie a fost reprezentat de o tulpin de Salmonella enteritidis, agent al gastroenteritelor i
toxiinfeciilor alimentare att la om, ct i la diferite specii de animale, inclusiv psri.
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

S. enteritidis a fost izolat din stomac de pui i identificat prin cultivare pe bulion mbogit n selenit i pe mediul
selectiv Mac Conkey. Identificarea biochimic s-a realizat comparativ prin metode clasice i prin microteste Api 20E
(Bio Merieux). Speciile au fost confirmate serologic prin aglutinare cu seruri polivalente i monovalente obinute de
la Centrul Naional de Referin pentru Salmonella sp. de la Institutul Cantacuzino Bucureti.
Capacitatea de aderare a fost analizat prin metoda Craviato adaptat. Celulele HeLa au fost cultivate n mediul Eagle
MEM mbogit, n acelai mod ca la testarea capacitii de aderare in vitro a tulpinilor Lactobacillus sp.13GAL,
14GAL, 15GAL, 16GAL, 17 GAL.
Monostraturile celulare HeLa sunt splate de trei ori n tampon fosfat steril PBS i n fiecare compartiment se
plaseaz cte 2 ml suspensie de bacterie patogen cu densitatea de 10
7
ufc/ml n mediu Eagle MEM i se
termostateaz timp de 2h, la temperatura de 37C. Monostraturile sunt splate de 3 ori cu PBS, fixate scurt cu etanol
rece 3 minute, colorate cu soluie Giemsa (1:20) i lsate 30 minute, la temperatura de 37C. Plcile sunt splate,
uscate la temperatura camerei peste noapte i examinate la microscop cu obiectiv de imersie (grosisment 2500 X) i
fotografiate cu aparat foto Contax adaptat la microscop.
Descrierea modelului de patogenez experimental pe obolani holoxenici
Realizarea modelului experimental a presupus utilizarea a 6 loturi de cte 5 animale (obolani holoxenici-
convenionali n vrst de 6-8 sptmni), care au fost tratate dup cum urmeaz:
- Lotul martor (control negativ) la care s-a administrat cu aceeai frecven ca i celelalte loturi, tampon fosfat salin
(TFS, pH=7,2-7,4) i hran solid deshidratat 300 g/zi.
- Lotul martor pentru produsul probiotic testat (tulpina Lactobacillus sp. 16 GAL), la care s-a administrat pe lng
hrana obinuit i produsul respectiv, o data/ zi (o doza de 10 ml/lot) 2 ml cultur/animal n bulion MRS n
mijlocul fazei logaritmice de multiplicare.
- Lotul martor infecie, la care s-a realizat infecia cu Salmonella enteritidis (10 ml suspensie cu densitate >10
8

UFC/ml/lot) 2ml/animal/zi pe cale oral n doz unic, n paralel cu alimentaia obinuit.
- Lotul la care concomitent cu infecia, sa administrat i produsul testat (n aceeai doz ca la lotul de control) iar
probioticul s-a administrat i n urmtoarele trei zile.
- Lotul la care infecia s-a realizat la 3 zile de la administrarea zilnic a produsului testat (probioticul) n scop
profilactic.
- Lotul la care produsul testat a fost administrat ulterior infeciei (la 24 de ore) timp de trei zile consecutiv.
Parametrii urmrii la animalele studiate au fost:
- greutatea;
- analiza microbiologic calitativ i cantitativ a materiilor fecale, pe toat durata experimetului;
- analiza microbiologic calitativ i cantitativ a coninutului intestinal din esut colectat din diferite segmente ale
tubului digestiv (duoden, ileon, colon) dup euthanasierea animalelor, la 4 zile dup infecie. esutul este splat i
omogenizat n PBS, se fac diluii zecimale (seriate) i se nsmneaz pe MRS solid pentru bacteriile lactice
(LAB) cu termostatare timp de 24h, la temperatura de 37C i pe mediul Mac Conkey att pentru microorganisme
lactozo-fermentative (LFM) ct i pentru Salmonella tot cu 24h incubare, la 37C.

3. Studiul in vivo al produsului probiotic Granolact

Descrierea modelului experimental in vivo pe obolani holoxenici
Varianta n care loturile 2 i 3 nu mai primesc alt aliment pe durata experimentului. S-au utilizat 3 loturi a cte 2
animale (obolani convenionali, holoxenici) dup cum urmeaz:
Lotul martor (control) format din obolani care au fost hrnii cu alimente obinuite (hran solid deshidratat -
300 g/zi) (Lot 1);
Lotul hrnit numai cu gru germinat Granovit 300 g/zi (Lot 2);
Lotul hrnit numai cu produs probiotic Granolact (gru germinat combinat cu tulpina 16 GAL) 300 g/zi (Lot 3).
Experimentul a durat 7 zile i s-au monitorizat urmtorii parametri:
greutatea;
analiza microbiologic calitatitiv i cantitativ a materiilor fecale pe toat durata experimetului, la fiecare lot;
analiza microbiologic calitativ i cantitativ a coninutului intestinal din esut colectat din diferite segmente
ale tubului digestiv (duoden, ileon, colon), dup euthanasierea animalelor.
Varianta n care loturile 2 i 3 primesc produsele analizate ca supliment alimentar pe lng raia obinuit de hran,
de 300g alimente deshidratate/zi (administrat la ora 14). Experimentul s-a repetat pe o durat de 15 zile cu dou
loturi de animale (5 animale/lot). La lotul 1 s-a adugat, ca supliment nutritiv, gru germinat simplu Granovit - fulgi.
Lotul 2 a primit pe lng alimentaia obinuit, produsul probiotic Granolact avnd ncorporat tulpina Lactobacillus
sp.16 GAL. Produsele s-au administrat n 3 prize/zi, fiecare priz fiind constituit din 2 g/obolan. Parametrii
urmrii au fost aceeai.
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

II. REZULTATE I DISCUII

1. CARACTERIZAREA PATTERN-ULUI DE ADERARE IN VITRO LA CELULE HELA I A
COMPETIIEI PENTRU SITUSURILE DE ADERARE FA DE SPECII DE BACTERII PATOGENE

Aderarea este un important factor determinant al colonizrii unor situsuri specifice i supravieuirea microorganismelor
n diferite habitate este dependent de capacitatea lor de a adera la diferite suprafee sau substraturi.
Procesul de aderen implic o interaciune ntre molecule complementare de pe suprafaa microorganismelor (adezine)
i substrat (receptori). Celulele biofilmului care se formeaz sunt net diferite fenotipic de forma lor planctonic
(plutitoare, aflate n suspensie) fiind mai rezistente la condiiile de stress, realiznd o homeostazie primitiv, o
cooperare metabolic, fiziologic, fiind asemntoare cu esuturile formate din celule eucariote (manifest integralitate
proprietate esenial a unui sistem biologic) (Costerton, 1995). Grosimea biofilmelor poate varia de la civa m pn la
civa mm i difer de adsorbia unor molecule solubile la anumite suprafee (care este mai rapid i modific
proprietile fizico-chimice ale acestora). Aderena microorganismelor este un fenomen lent i este urmat de
multiplicarea acestora cu rate de cretere superioare fa de cele ale microorganismelor planctonice. Aderena mpiedic
ndeprtarea microorganismelor respective prin mecanismele fizice i fiziologice care constituie prima linie de aprare a
organismului gazd (peristaltism, tuse, fluxul diferitelor secreii, mobilitatea cililor, microvililor) asigurnd astfel
colonizarea anumitor situsuri. Pentru a adera viabilitatea celulelor nu este obligatorie. Astfel s-a inhibat capacitatea de
aderen i invazie a unor bacterii patogene la celule intestinale umane cultivate in vitro prin preaderarea unor celule de
Lb. acidophilus vii sau omorte prin cldur. Experimentul a demonstrat c o dat ocupate situsurile de ataare de ctre
lactobacilli, acestea nu mai sunt disponibile pentru aderena enteropatogenilor (Coconier i colab., 1993).
Sinteza de novo a adezinelor se realizeaz cu consum de energie i aa se explic de ce celulele aflate n faza
exponential de cretere ader mai repede la substraturi dect cele n faza staionar, btrne sau moarte. n etapa de
colonizare, celulele legate ireversibil de substrat, dar nu i ntre ele, formeaz un monostrat continuu, iar cele legate i de
substrat i ntre ele, formeaz microcolonii i biofilme. Ulterior biofilmele devin pluristratificate i faciliteaz
colonizarea altor microorganisme incapabile singure s realizeze acest fenomen. Unele bacterii au un pattern de aderen
localizat n anumite zone de pe suprafaa celulelor unde gsesc receptorii specifici, altele ader dup un pattern difuz la
celulele epiteliale din mucoasa intestinal (formeaz ca un tiv pe suprafaa celulelor), iar altele prezint un pattern
agregativ celulele bacteriene fiind suprapuse asemenea unor crmizi.
Tulpinile Lactobacillus plantarum 13GAL, 14GAL, 15GAL i Lb. brevis 16GAL au un model de aderare difuz n
absena patogenilor, iar tulpina Lb. brevis 17GAL a prezentat aderen agregativ. Competiia cu patogenii pentru
substratul celular reprezentat de celulele HeLa a determinat modificarea fenotipului de aderen i a intensitii
aderenei.
Tulpinile Lactobacillus plantarum 13 GAL, 14 GAL i 15 GAL i-au conservat patternul de aderen difuz n prezena
patogenilor pe care i-a inhibat n proporie de 25% pn la 5%. Tulpina Lb. plantarum 15 GAL aderar difuz (+++), pe
toat suprafaa celulelor HeLa (formnd o bordur uniform, pe toat suprafaa membranei plasmatice) i blocheaz
situsurile de aderare ale patogenilor (n special fa de Staphylococcus sp.) (fig.1).



Fig.1. Tipul de aderen difuz manifestat de Fig. 2.Tipul de aderen localizat-agregativ manifestat Lb.
plantarum 15GAL n comp. cu Staphylococcus sp. Lb. brevis 16GAL n competiie cu E. coli

Tulpina Lb. brevis 16 GAL prezint un pattern de aderare localizat-agregativ n competiie cu patogenii formnd
microcolonii sau agregate prin suprapunerea celulelor ca nite crmizi. Inhibiia competitiv a fost foarte evident
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

fa de E. coli, Salmonella sp. i Staphylococcus sp. i este foarte bun (+++) i mai puin evident (+) fa de Listeria
sp. (fig. 2, 3, 4).



Fig.3. Tipul de aderen localizat-agregativ Fig. 4.Tipul de aderen localizat-agregativ manifestat
manifestat Lb. brevis 16GAL n competitie cu de Lb. brevis 16GAL n competiie cu Staphylococcus sp.
Salmonella sp.
Tulpina Lb. brevis 17GAL a manifestat un pattern de aderare localizat agregativ (+++) n competiie cu patogenii i
capacitate de inhibiie foarte mare fa de E. coli, Listeria sp. i Salmonella sp.(fig.5, 6, 7). n prezena celulelor de
Staphylococcus sp. pattern-ul de aderen s-a convertit la aderen difuz, probabil prin modificarea hidrofobicitii
peretelui celular n prezena patogenilor (fig.8).


Fig.5. Tipul de aderen localizat-agregativ Fig.6. Tipul de aderen localizat-agregativ
al tulpinii Lb. brevis 17 GAL manifestat de Lb. brevis 17 GAL
n competiie cu E. coli n competiie cu Listeria sp.



Fig.7. Tipul de aderen localizat-agregativ Fig. 8.Tipul de aderen difuz al tulpinii
manifestat de tulpina Lb. brevis 17 GAL Lb. brevis 17 GAL
n competiie cu Salmonella sp. n competiie cu Staphylococcus sp.
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

2. TESTE IN VIVO PENTRU CERTIFICAREA POTENIALULUI PROBIOTIC AL TULPINII LB. BREVIS
16 GAL N CULTUR PUR I N PRODUSUL FUNCIONAL GRANOLACT

2.1. Evidenierea interaciunii in vivo a culturii pure de Lb. brevis 16GAL cu specia patogen Salmonella enteritidis
Tractul intestinal expune o uria suprafa de absorbie i de interaciune cu mediul i acesta implic probleme inerente
privind aprarea mpotriva infeciilor, toxinelor i produilor alergenici din intestin. Steril la natere, intestinul este rapid
populat cu o microflor comensal i apare astfel un ecosistem complex n tractul digestiv. Bacteriile probiotice, i n
special bacteriile lactice (LAB), sunt folosite pentru restabilirea balanei (echilibrrii) florei comensale i pentru a
preveni colonizarea cu bacterii ca E. coli sau Salmonella sp. ce pot cauza infecii intestinale sau pot chiar eradica
patogenul (un consum de aproximativ 500 ml lapte acidofil zilnic, scurteaz durata bolilor cauzate de Salmonella sp.).
Sunt pe pia numeroase produse probiotice dar exist nc mult scepticism n privina utilizrii lor fie datorit unui
suport tiinific srac, fie datorit unei insuficiente popularizrin mass media.
Mecanismul de aciune include pe de o parte producerea de acizi (ce determin o scdere a pH mecanismul major prin
care LAB inhib dezvoltarea altor bacterii strict anaerobe), producerea de ap oxigenat sau de substane antimicrobiene,
pe de alt parte competiia pentru nutrieni sau pentru situsurile de aderare i aciuni antitoxice i de stimularea a
sistemului imunitar.

Fig.9. Efectele citotoxice manifestate de Salmonella enteritidis asupra
celulelor HeLa cultivate n monostrat
Rezultatelor testelor asupra capacitii de aderare au artat c tulpina de Salmonella enteritidis utilizat n acest studiu
manifest un model de aderen difuz i un indice de aderen de 15 20% de monostrat prin efectele citotoxice
realizate asupra celulelor la care ader i n care se internalizeaz. Celulele i mresc volumul, devin balonizate,
gigantice i prezint numeroase vacuole i alterri membranare, nucleul nu mai este bine delimitat, iar n interior se pot
vedea bacteriile inconjurate de un halou clar (fig.9).
Acest studiu a vizat evaluarea rolului protector mpotriva infeciilor cu Salmonella enterica serovar. enteritidis a tulpinii
Lactobacillus brevis 16 GAL prin studii in vivo.
Caracterizarea calitativ i cantitativ a microbiotei intestinale normale eliminat n materii fecale la lotul
control negativ
Prin cultivare pe mediul selectiv MacConkey (de culoare roz pal) s-au difereniat coloniile bacteriilor lactozo-
fermentative (LFM) pigmentate n rou (n jurul lor mediul devine rou i opalescent), cu perimetru circular i aspect
bombat, de coloniile bacteriilor lactozo-non-fermentative (LNF) care sunt albicioase, mai mari i mai aplatizate i care
nu modific n jurul lor culoarea mediului de cultur.
Caracterizarea biochimic a coloniilor dezvoltate pe mediul McConkey a evideniat faptul c aceste bacterii lactozo-
pozitive sunt catalazo-negative, oxidazo-negative, se dezvolt pe medii cu concentraii crescute de sruri biliare (40%) i
de esculin, tolereaz concentraii crescute de sare (se dezvolt n medii cu 6,5% NaCl) i cresc la temperatura de 42
o
C.
Aceste caracteristici biochimice particulare au confirmat apartenena acestor bacterii la genul Enterococcus (sau grupul
streptococilor de grup D). Identificarea biochimic a fost confirmat prin diagnostic serologic, prin aglutinarea cu serul
monovalent anti-D din schema de serogrupare Lancefield, care se bazeaza pe identificarea unor fraciuni antigenice de
natura polizaharidic din constituia peretelui celular.
Inocularea materiilor fecalen mediul MRS a evideniat faptul ca lactobacilii constituie componenta predominant
numeric la aceste animale, fiind eliminai n densiti foarte mari.
Rezultatele demonstreaz c microbiota normal eliminat n materii fecale este reprezentat de microorganisme lactozo-
fermentative (LFM) (310
6
610
7
ufc/g) cnd se cultiv pe mediul Mac Conkey i n special bacterii lactice (LAB)
(10
10
- 910
11
ufc/g) cnd se cultiv pe mediul MRS solid. Bacteriile lactozo-nonfermentative lipsesc din materiile fecale
la lotul control negativ (fig.10).
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

1
,
0
0
E
+
0
0
1
,
0
0
E
+
0
1
1
,
0
0
E
+
0
2
1
,
0
0
E
+
0
3
1
,
0
0
E
+
0
4
1
,
0
0
E
+
0
5
1
,
0
0
E
+
0
6
1
,
0
0
E
+
0
7
1
,
0
0
E
+
0
8
1
,
0
0
E
+
0
9
1
,
0
0
E
+
1
0
1
,
0
0
E
+
1
1
1
,
0
0
E
+
1
2
L
A
B
L
F
M
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
L
A
B
L
F
M
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
L
A
B
L
F
M
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
L
A
B
L
F
M
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
1 zi inainte de
infectie
2 zile dupa
infectie
3 zile dupa
infectie
4 zile dupa
infectie
ufc/g
Control
negativ
Control
infectie
Control
probiotic
Infectie
Salmonella
+ 16GAL

Fig.10. Analiza microbiologic cantitativ pentru LAB, LFM, Salmonella sp.
din materiile fecale ale obolanilor utilizai pentru teste
Caracterizarea calitativ i cantitativ a microbitei intestinale normale care colonizeaz diferite segmente ale
mucoasei intestinale la obolanii din lotul control negativ
Analiza rezultatelor a demonstrat c diferitele regiuni ale tractului intestinal arboreaz bacterii lactozo-negative, chiar
dac acestea nu sunt eliminate n materiile fecale. Acestea au fost regsite n special n colon (~10
3
ufc/g), n densiti
mult mai mici ns n comparaie cu microbiota lactozo-pozitiv ce colonizeaz att ileonul (710
2
ufc/ml), ct i colonul
(~510
4
ufc/g) (fig.11).
Inocularea seciunilor de intestin pe mediu MRS, a revelat faptul c LAB colonizeaz n densiti crescute att duodenul
(710
6
ufc/g), ct i colonul (610
7
ufc/g), ns sunt abseni n ileon (fig.11).

1
,
0
0
E
+
0
0
1
,
0
0
E
+
0
1
1
,
0
0
E
+
0
2
1
,
0
0
E
+
0
3
1
,
0
0
E
+
0
4
1
,
0
0
E
+
0
5
1
,
0
0
E
+
0
6
1
,
0
0
E
+
0
7
1
,
0
0
E
+
0
8
1
,
0
0
E
+
0
9
1
,
0
0
E
+
1
0
L
A
B
L
F
M
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
L
A
B
L
F
M
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
L
A
B
L
F
M
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
COLON ILEON DUODEN
ufc/g
Control
negativ
Control
infectie
Control
probiotic
Infectie
Salmonella
+probiotic
16GAL

Fig.11. Analiza microbiologic cantitativ pentru LAB, LFM, Salmonella sp.
din diferite segmente ale tubului digestiv, la obolanii utilizai pentru teste
Caracterizarea calitativ i cantitativ a microbiotei intestinal la lotul martor de infecie
Tulpina de infecie a fost reprezentat de Salmonella enteritidis. Acest agent patogen a fost evideniat ntr-o mare
varietate de alimente, dar mai ales n carne i produsele din carne de pasre, pentru c diferitele serotipuri de Salmonella
infecteaz n special ginile i curcanii, iar infecia la om se produce n urma ingerrii de produse contaminate.
n ceea ce privete lotul martor de infecie, s-a observat ca eliminarea patogenului n materiile fecale dup infecie (110
3

ufc/g n a II-a zi, 510
3
ufc/g n a III-a zi i 110
4
ufc/g n a IV-a zi) s-a realizat cu o rat de ~ 40-50% din doza de infecie
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

(~10
8
ufc/g). Eliminarea patogenilor a fost nsoit i de o scdere a ratei de eliminare a bacteriilor lactice (10
8
10
9
ufc/g
comparativ cu controlul negativ 10
10
910
11
ufc/g). Scade i rata de eliminare a LFM de la 10
7
la 10
5
ufc/g (fig. 10).
La sacrificarea animalelor i recoltarea fragmentelor de tract intestinal s-a observat ca bacteria patogen colonizeaz cu
rate similare duodenul i ileonul (410
2
ufc/g coninut intestinal) i cu rate mai crescute colonul (410
4
ufc/g).
Spre deosebire de lotul control negativ, s-a observat o redistribuire a populaiei de bacterii lactice, care colonizeaz cu
densiti ridicate (>10
6
ufc/g) toate cele 3 segmente analizate (duoden 710
6
ufc/g, ileon 10
9
ufc/g, colon 210
7

ufc/g) (fig.11). Aadar, aceste rezultate ar putea sugera c n urma ptrunderii unui agent infecios alohton n tubul
digestiv, are loc creterea brusc a densitii microbiotei normale i distribuirea uniform a acesteia pe toat lungimea
tubului digestiv, pentru a asigura blocarea situsurilor de colonizare.
Se poate oberva de asemenea o cretere a densitii microorganismelor lactozo-pozitiven regiunile proximale ale
tractului intestinal (ileon), care n mod normal sunt mai putin colonizate cu microorganisme datorit prezenei unor
factori limitani ai multiplicrii bacteriilor n intestinul subire reprezentai de: aciditatea gastric, peristaltismul intestinal
care asigur tranzitul relativ rapid spre intestinul gros i existena unor substane care inhib creterea
microorganismelor. Dac la lotul control negativ, LFM ating densitatea de 710
2
ufc/g n ileon, dup administrarea
patogenului aceste bacterii ating densiti de 10
5
ufc/g n ileon i de 510
4
ufc/g n colon. n duoden nu au fost regsite
LFM (fig. 11).
Caracterizarea calitativ i cantitativ a microbiotei intestinale la lotul martor probiotic
La lotul martor pentru produsul probiotic, administrarea preparatului probiotic reprezentat de cultura n faz logaritmic
de Lactobacillus brevis 16 GAL, produce o modificare cantitativ n populaia de bacterii lactice eliminate (de la 10
10

910
11
ufc/g materii fecale - la lotul control negativ, la 10
9
ufc/g - la martorul cu produs probiotic) (fig.10). Dup
sacrificarea animalelor i analiza cantitativ a microbiotei care colonizeaz diferite segmente ale tubului digestiv, rezult
c microbiota lactozo-pozitiv este absent n duoden, fiind prezent doar n ileon i colon, ns cu o densitate mai
sczut dect la lotul control negativ datorit modificrii constantelor fizico-chimice ale habitatului intestinal sub
aciunea lactobacililor administrai, care determin reducerea viabilittii microorganismelor alohtone. n schimb, toate
segmentele tractului intestinal analizate au fost colonizate cu bacterii lactice cu densiti de 10
7
210
9
ufc/g coninut
intestinal (duoden: 10
7
UFC/g coninut intestinal, ileon: 210
9
ufc/g coninut intestinal, colon: 210
7
ufc/g coninut
intestinal). Administrarea probioticului determin ca bacteriile lactice s colonizeze cu densiti crescute i ileonul, acest
segment intestinal fiind srac reprezentat n microorganisme n mod normal (datorit peristaltismului intestinal crescut
precum i datorit nivelelor ridicate ale enzimelor digestive) (fig.11).
Caracterizarea calitativ i cantitativ a microbiotei intestinale la loturile de obolani la care s-a administrat i
patogenul i probioticul
n ceea ce privete lotul de animale la care infecia experimental s-a realizat concomitent cu nceperea administrrii
produsului probiotic (care a fost continuat timp de 3 zile) s-a observat c lactobacilii administrai favorizeaz eliminarea
mai rapid a celulelor de Salmonella, de la 10
3
ufc/g la martorul de infecie la 10
4
ufc/g n primele zile (II, III)
concomitent cu reducerea de 10 100 de ori a densitii microbiotei normale eliminate, care probabil ader la situsurile
intestinale, pentru a bloca aderarea patogenilor (fig.10).
Analiza compoziiei microbiene a diferitelor segmente ale tubului digestiv a confirmat aceste rezultate, indicnd
diminuarea densitii microbiotei lactozo-pozitive (asupra creia se manifest chiar un efect bactericid) i lactozo-
negative n toate segmentele analizate, cu conservarea unei densiti crescute de bacterii lactice pe tot traseul tractului
intestinal, aceste bacterii fiind rezistenten noile condiii fizoco-chimice generate. Ileonul expune situsuri de aderen
libere care pot fi ocupate de patogeni n timpul procesului infecios. Aderena bacteriilor lactice la aceste situsuri ar putea
explica absena bacteriei patogene la loturile experimentale la care s-a administrat i patogenul i probioticul n timp ce
la lotul martor de infecie densitile patogenului n toate segmentele intestinului sunt ridicate (fig. 11). Deci bacteriile
lactice protejeaz mucoasa intestinal de colonizarea cu enteropatogeni. Acest efect anti-colonizator nu este ns selectiv
fapt dovedit i de reducerea ufc/g i pentru LFM din microbiota intestinal normal. Acesta ar putea constitui un
important criteriu de selecie pe viitor a tulpinilor probiotice.
La lotul de animale la care preparatul cu lactobacili a fost administrat timp de 3 zilenainte de infecie, aadar n scop
profilactic, s-a constatat o scdere general semnificativ a densitii microbiotei lactozo-pozitive i a bacteriilor
lactozo-negative (bacterii cu care s-a realizat infecia) eliminate n materiile fecale, cu conservarea densitii bacteriilor
lactice eliminate. Aceste rezultate confirm faptul c lactobacilii administrai exercit un efect de epurare asupra
microbiotei normale ca i alohtone prezente la un moment dat n tractul digestiv, probabil prin mecanisme nespecifice
reprezentate de acumularea de produi de metabolism care afecteaz condiiile fizico-chimice locale (ex. reducerea pH-
ului prin acumulare de acid lactic).
La lotul de animale la care preparatele de lactobacili au fost administrate timp de 3 zile, la 24h dup realizarea infeciei
experimentale, aadar, n scop terapeutic, curativ, s-a observat ca produsul probiotic are acelai efect, ca i n cazul
administrrii concomitente, i anume, determin eliminarea bacteriilor lactozo-negative cu care s-a realizat infecia,
acestea fiind absente din tubul digestiv, aa cum arat rezultatele analizei microbiologice a diferitelor segmente.
Lactobacilii se cantoneaz n acest caz n special la nivelul colonului, unde s-a observat o cretere a densitii bacteriilor
lactice, fa de lotul martor control negativ i martor probiotic.
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

2.2. Efectul probiotic in vivo al produsului Granolact asupra microflorei intestinale
Varianta n care loturile 2 i 3 de obolani holoxenici nu mai primesc alt aliment pe toat durata experimentului
Analiza greutii corporale
obolanii hrnii n timpul experimentului numai cu produs probiotic nregistreaz n primele zile de experiment o
scdere n greutate (probabil datorit adaptrii la noua alimentaie sau aportului proteic mai sczut) pe care o recupereaz
n ultimele 3 zile. obolanii din lotul martor au prezentat o cretere total n greutate de 22,5 g, cei din lotul hrnit cu
Granovit au luat n greutate cel mai bine: 30g, iar animalele hrnite cu produsul probiotic Granolact au nregistrat cea mai
mic cretere n greutate de 10g (fig.12).
150
170
190
210
230
250
0 1 2 3 4 5 6 7
Durata experimentului, zile
G
r
e
u
t
a
t
e

c
o
r
p
o
r
a
l
`
,

g
LOT 1
LOT 2
LOT 3

Fig.12. Variaia greutii corporale medii a obolanilor n decursul experimentului in vivo cu diet exclusiv cu Granovit
(lot 2) sau Granolact (lot 3) comparativ cu martorul (lot 1)
Analiza microbiologic a materiilor fecale
Aceasta s-a realizat n a a asea zi a experimentului. Din analiza graficului din figura 13 reiese c lactobacilii din
produsul probiotic determin o reducere semnificativ (de peste 1000 de ori) a numrului de bacterii lactozofermentative
eliminate n materii fecale ceea ce nseamn o mai bun ocupare a situsurilor de aderen din epiteliul intestinal i deci o
competiie mai eficientn raport cu eventualii patogeni din acest ecosistem. Acest fapt este asociat i cu scderea
numrului de bacterii lactice eliminate n materiile fecale ceea censeamn c acestea au tendina de a coloniza mai
eficient epiteliul intestinal.
1
,0
0
E
+
0
0 1
,
0
0
E
+
0
2 1
,0
0
E
+
0
4 1
,0
0
E
+
0
6 1
,
0
0
E
+
0
8 1
,0
0
E
+
1
0 1
,
0
0
E
+
1
2 1
,0
0
E
+
1
4 1
,
0
0
E
+
1
6
LOT 1 LOT 2 LOT 3
Lotul experimental
u
f
c
/
g
LAB
LFM

Fig.13. Analiza microbiologic cantitativ pentru LAB i LFM eliminate n
materiile fecale ale obolanilor utilizai n experiment
Dac la lotul 2 (hrnit numai cu Granovit) crete numrul de bacterii lactice i lactozofermentative eliminate prin
materiile fecale comparativ cu martorul, la lotul 3 (hrnit exclusiv cu Granolact) se reduce rata de eliminare a acestora
att comparativ cu martorul ct i comparativ cu lotul 2, ceea ce nseamn o colonizare mai bun a situsurilor din tractul
digestiv fcndu-le indisponibile pentru eventualii patogeni sau pentru bacteriile oportuniste aflate n tranzit din
microbiota alohton i care ar putea cauza mbolnviri.
Se remarc lipsa bacteriilor LNF din materiile fecale deoarece sunt mai rezistente la factorii antibacterieni specifici
elaborai de bacteriile lactice i ader mai bine la epiteliul intestinal, iar grul germinat le ofer substratul de aminoacizi
pentru care au un echipament enzimatic adecvat.


Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

Analiza microbiologic a diferitelor segmente ale tractului digestiv (fig. 14)
Lotul martor arboreaz bacterii lacticen toate segmentele tubului digestiv (>10
4
ufc/g), bacterii lactozofermentative n
duoden i ileon (<10
4
ufc/g), iar bacterii lactozonegative n ileon i colon (<10
4
ufc/g).
Lotul 2 (hrnit exclusiv cu Granovit) bacteriile lactice se regsesc de asemenea n toate segmentele la densiti
comparabile cu lotul 1, bacteriile lactozofermentative coboar n ileon i colon, iar cele lactozonegative avanseaz i se
regsesc doar n duoden.
La lotul 3 (hrnit exclusiv cu Ganolact) se remarc efectul bactericid al tulpinii probiotice Lb. brevis 16 GAL din produs
asupra microbiotei lactozofermentative care lipsete din tractul intestinal, iar situsurile rmase libere sunt ocupate de
LNF, mai rezistente la condiiile fizico-chimice creeate de tulpina probiotic i care gsesc n grul germinat un substrat
adecvat echipamentului enzimatic pe care-l dein.
1
,0
0
E
+
0
0
1
,0
0
E
+
0
1
1
,0
0
E
+
0
2
1
,0
0
E
+
0
3
1
,0
0
E
+
0
4
1
,0
0
E
+
0
5
LAB LFM LNF LAB LFM LNF LAB LFM LNF
Duoden Ileon Colon
Segmentul intestinal
u
f
c
/
gLOT 1
LOT 2
LOT 3


Fig.14. Analiza microbiologic cantitativ pentru LAB, LFM, LNF n diferite segmente ale tubului digestiv la obolanii
din loturile experimentale

Comparnd lotul martor (1) cu lotul alimentat cu gru germinat normal (2), se constat c n duoden se inverseaz
raportul LFM/LNFn favoarea dezvoltrii bacteriilor lactozo-nonfermentative probabil datorit aportului crescut de
aminoacizi liberi n grul germinat. Aceste bacterii posed un echipament enzimatic bogat n dezaminaze: fenilalanin-
dezaminaza, triptofan-dezaminaza .a., enzime care au gsit n grul germinat substratul specific.
Bacteriile lactozo-nonfermentative dispar din ileon i colon la lotul 2 fa de lotul 1 i cum acestea nu au fost regsite
nici n materiile fecale,nseamn c are loc o redistribuie a acestora ctre segmentele superioare, respectiv duoden, unde
ele nu exist n mod normal.
Comparnd lotul martor (1) cu lotul hrnit cu alimentul probiotic (3) din analiza ufc/g pe MRS se constat c bacteriile
lactice se tripleaz n duoden i sunt de 4 ori mai numeroase n colon, deci se intensific colonizarea acestor segmente
blocnd astfel situsurile de aderen pentru patogeni. n ileon, se reduce numrul bacteriilor lactice probabil datorit
peristaltismului intestinal, a tranzitului coninutului i datorit competiiei cu microbiota normal (LFM, LNF).
Dispariia bacteriilor lactozofermentative reprezentate de ctre specii ale genului Enterococcus la lotul 3, demonstreaz
c tulpina de Lb. brevis 16 GAL manifest efect bactericid asupra acestora.
Analiza comparativ a lotului 2 fa de lotul 3 evideniaz dispariia microbiotei LFM ceea ce denot c efectul
bactericid al tulpinii 16 GAL de Lb. brevis se manifest i asupra genurilor nrudite. Acest efect se datoreaz unui factor
bactericid cu aciune specific pe microorganismele Gram pozitive i nu datorit acidului lactic.
Aportul de microorganisme probiotice adsorbite pe grul germinat determin inversarea raportului LFM/LNF fa de
lotul hrnit numai cu gru germinat simplu n favoarea dezvoltrii bacteriilor lactozo-nonfermentative probabil datorit
factorului antibacterian specific care distruge microbiota LFM, iar situsurile rmase libere sunt ocupate de bacteriile LNF
mai rezistente;
Concentraia LAB se dubleaz n duoden la lotul hrnit cu alimentul probiotic fat de cel alimentat doar cu gru
germinat i se tripleaz fa de martor ceea ce nseamn c administrarea probioticului determin "avansarea"
colonizrii spre regiunile proximale ale tubului digestive n scopul blocrii situsurilor de aderent pentru
patogeni. Aceeai cretere semnificativ se regsete i n colon n timp ce n ileon se reduc (probabil datorit
peristaltismului intestinal i tranzitului mai rapid al coninutului).


Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

Varianta n care cele dou loturi de 5 animale au primit produsele analizate (lotul 1 - Granovit i lotul 2 -
Granolact) ca supliment alimentar, n plus fa de raia de hran solid deshidratat obinuit
Suplimentul probiotic s-a administrat n cantitate de 2 g/obolan/priz, 3 prize /zi, iar dieta normal (de 300 g/animal/zi)
este administrat la ora 14 astfel nct s nu coincid cu a doua priz de supliment probiotic.
Analiza greutii corporale (fig.15)
Animalele crora li s-a administrat Granovit ca supliment nutritiv (lotul1) au luat n greutate 11 g, pe durata de 15 zile ct
a durat experimentul. obolanii din lotul 2, a cror diet a fost suplimentat cu Granolact au evideniat o cretere medie
n greutate de 17 g pe durata a 15 zile ct a durat experimentul.
Produsul probiotic Granolact care are ncorporat tulpina Lb. brevis 16 GAL a exercitat efectul scontat de cretere n
greutate asupra animalelor supuse experimentului atunci cnd a fost consumat ca supliment nutritiv pe o perioad mai
lung de timp (deoarece n primele 3 zile s-a nregistrat o uoar scdere n greutate ca i n varianta precedent).

125
130
135
140
145
150
155
160
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Durata experimentului, zile
G
r
e
u
t
a
t
e

c
o
r
p
o
r
a
l
`
,

g
LOT 1
LOT 2


Fig.15. Evoluia greutii corporale medii a obolanilor n cazul experimentului in vivon varianta suplimentrii dietei
acestora cu produsul Granolact (lot 2), comparativ cu lotul hrnit cu Granovit (lot 1)

Analiza microbiologic a materiilor fecale (fig. 16)

1
1
0
1
0
0
1
0
0
0 1
0
0
0
0 1
E
+
0
5 1
E
+
0
6 1
E
+
0
7 1
E
+
0
8 1
E
+
0
9 1
E
+
1
0 1
E
+
1
1 1
E
+
1
2 1
E
+
1
3
LAB
1
LFM LAB
4
LFM LAB
6
LFM LAB
12
LFM LAB
15
LFM
Ziua de experiment
ufc/g
LOT 1 LOT 2


Fig. 16.Distribuia LAB i LFM n materiile fecale ale obolanilor n cazul testului in vivo n varianta cu diet
suplimentat cu Granovit (lot 1) sau Granolact (lot 2)
Administrarea alimentului probiotic sub form de supliment n dieta animalelor determin o reducere a eliminrii
microbiotei normale lactozofermentative n materiile fecale ( de la 310
5
ufc/g n prima zi la 510
3
ufc/g n ultima zi de
experiment) ceea ce nseamn o mai bun aderare a acesteia la situsurile disponibile la nivelul epiteliul tractului
intestinal.
Comparativ cu lotul 1 (care nu are n diet specia de Lb. brevis) scderea eliminrii bacteriilor lactozo-fermentative LFM
este i mai evident ajungnd la finalul experimentului la aproximativ 50% (de la 310
6
ufc/g la lotul 1 n ziua 15, la
510
3
ufc/g la lotul 2).
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

Aceeai reducere se poate observa i n cazul bacteriilor lactice LAB (de la 310
12
ufc/g la lotul 1,n ziua 15, la 410
9

ufc/g la lotul 2). Cauza ar putea fi aderarea mai bun a bacteriilor lactice la situsurile mucoasei intestinale sau la
suprafaa inert oferit de fibrele aduse n lumen de grul germinat.
Cantonarea la nivelul tractului digestiv a bacteriilor LFM i LAB din microbiota intestinal normal, le face mai
competitive pentru situsurile de aderare fa de bacteriile nonindigene aflate n tranzit i care pot fi patogene sau
oportuniste fiind cauze posibile de mbolnviri
Analiza microbiologic a diferitelor segmente ale tractului digestiv (fig.17)
La lotul 1 predomin colonizarea segmentului colonic cu LAB (610
7
ufc/g), LFM (4,810
4
ufc/g) realiznd o protecie
local fa de bacteriile alohtone (rol profilactic). Dar i LNF (1,110
3
ufc/g) au densitatea cea mai mare tot n colon.
LAB sunt mai numeroase n ileon (310
5
ufc/g) dect n duoden (610
3
ufc/g), iar LFM sunt mai numeroase n duoden
(510
3
ufc/g) dect n ileon (710
2
ufc/g) probabil datorit enzimelor digestive, srurilor biliare sau peristaltismului
intestinal i tranzitului mai rapid al coninutului.
LNF lipsesc n duoden, au o densitate de 10
2
ufc/g n ileon i de 10
3
ufc/g n colon.
Comparativ cu lotul 1, la lotul 2 (care are n diet Lb. brevis adsorbit pe suprafaa grului germinat) n duoden LAB se
dubleaz, LFM scad de 10 ori (de la 510
3
ufc/g la 310
2
ufc/g) i apar LNF (210
2
ufc/g) care lipsesc la lotul cu diet
suplimentat cu Granovit probabil deoarece LNF sunt mai puin sensibili la pH-ul acid generat la cald n prezena unor
densiti crescute de bacterii lactice.

1
,
0
0
E
+
0
0
1
,
0
0
E
+
0
1
1
,
0
0
E
+
0
2
1
,
0
0
E
+
0
3
1
,
0
0
E
+
0
4
1
,
0
0
E
+
0
5
1
,
0
0
E
+
0
6
1
,
0
0
E
+
0
7
1
,
0
0
E
+
0
8
LAB LFM LNF LAB LFM LNF LAB LFM LNF
Duodenum Ileon Colon
ufc/g
LOT 1
LOT 2


Fig. 17. Distribuia microbiotei n diferite segmente ale tubului digestiv la animalele de experien, n varianta n care
dieta acestora este suplimentat cu Granovit (lot 1) sau Granolact (lot 2)

n ileon, la lotul 2, se remarc scderea densitii LAB (probabil datorit ascensiunii lor n duoden), n rest nu apar
modificri evidente n distribuia microbiotei.
n colon, crete semnificativ numrul bacteriilor lactice (5,510
7
ufc/g) fa de celelalte segmente ale tubului digestiv,
densitatea lor fiind comparabil cu cea din lotul 1 (610
7
ufc/g).
Varianta experimental 2 se remarc prin aceea c efectul bactericid manifestat de tulpina probiotic asupra bacteriilor
lactozofermentative (n varianta 1 de experiment cnd animalele primesc diet exclusiv cu produsele analizate) este mult
diminuat probabil datorit alimentaiei obinuite.

III. CONCLUZII

Toate tulpinile analizate au prezentat un pattern de aderen difuz n absena patogenilor, cu excepia tulpinii Lb.
brevis 17GAL care a prezentat aderen agregativ. n prezena patogenilor, tulpinile de Lactobacillus sp. 13GAL,
14GAL, 15GAL, 16GAL, 17GAL analizate devin mai competitive, manifestnd o capacitate foarte bun de
aderare.
n cursul infeciei experimentale cu administrarea unei doze crescute de microoroganisme patogene (> DMI ), are
loc o redistribuire a microbiotei normale, care avanseaz spre regiunile proximale ale tubului digestiv, n scopul
blocrii situsurilor de aderen i colonizare prezente la acest nivel.
Administrarea de cultur de lactobacili determin eliminarea bacteriilor patogene n materiile fecale, n proporie
semnificativ, cu reducerea concomitent a eliminrii microbiotei normale, care, n prezena agentului patogen,
Bacterii lactice probiotice pentru alimente functionale pe baza
de cereale germinate ID_658 nr. 315/01.10.2007
RAPORT TIINIFIC
2010

ader i colonizeaz mai intens tractul intestinal, pe toat lungimea acestuia, blocnd astfel aderarea patogenilor i
iniierea procesului infecios cu poart de intrare digestiv. Acest efect se manifest att n cursul administrrii
profilactice (doze repetate) concomitente (n doz unic) ct i n cazul administrrii terapeutice (doze repetate,
postinfecie), ceea ce permite selectarea unor metode variate de administrare a acestor produse ca probiotice, n
funcie de diferite raiuni economice sau tehnologice.
n ceea ce privete influena lactobacililor administrai n preparate probiotice asupra compoziiei microbiotei
lactice alohtone, s-a observat c determin o cretere a densitii bacteriilor lactice, att a celor care colonizeaz
diferite segmente ale tubului digestiv, ct i a celor luminale, eliminate n materiile fecale.
Bacteriile lactice sunt capabile s produc adezine antipatogene numite biosurfactani cu efect inhibitor asupra
unei game largi de patogeni inclusiv asupra speciilor de Salmonella sp. Probabil, aceti biosurfactani de natur
proteic, sunt produi in situ, proces favorizat de pH sczut al mediului creat prin producerea de acizi precum:
acidul lactic, acetic, succinic, fenil-lactic.
Efectul bacteriostatic sau chiar bactericid anti-Salmonella manifestat de unele tulpini de bacterii lactice este anulat
prin neutralizarea pH-ului demonstrnd c acesta este mecanismul major al activitii antimicrobiene i nu acela al
producerii de bacteriocine.
Produsul probiotic Granolact care are ncorporat tulpina Lb. brevis 16 GAL are efectul scontat de cretere n
greutate asupra animalelor supuse experimentului atunci cnd este consumat ca supliment nutritiv, pe o perioad
mai lung de timp.
Efectul probiotic al produsului Granolact se evideniaz prin reducerea eliminrii microbiotei intestinale normale
prin materii fecale datorit intensificrii capacitii acestor microorganisme de a coloniza toate segmentele tubului
digestiv, dar mai ales duodenul (unde n mod normal numrul acestora este mult mai mic) i colonul (sediul cel
mai frecvent al cantonrii i manifestrii patogenilor).