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LORETO PEREZ ANA LAURA

VELASCO DE MATA JOSE DARIO

ARGUELLA CANCHOLA MARIO

ROJAS MORALES ALBERTO

1602 2
Unidades formadoras de colonias (UFC): bacteria o agrupación de
bacterias viables que forman una colonia visible.

 Una célula viable se define como aquella que es capaz de

dividirse y dar lugar a una descendencia.

Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana,

proveniente de una sola célula.

Cultivo contaminado: cultivo bacteriano colonizado por

microorganismos extraños no deseados.

Cultivo mixto: cultivo en laboratorio que contiene dos o más cepas

de organismos.

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Aislamiento de microorganismos
 Separación de microorganismos presentes en una población
mixta puede lograrse de varias maneras: separando a los
microorganismos -físicamente mediante diluciones o por
agotamiento de un pequeño inoculo en un medio de cultivo
sólido: utilizando medios de cultivo selectivos para inhibir a los
microorganismos no deseados y aprovechamiento de
características

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CUANTIFICACION DE
MICROORGANISMOS
 numerosos métodos que permiten establecer el
número de microorganismos en una muestra dada.
Algunos métodos cuantifican el número de células,
otros cuantifican la masa total de la población (la cual
con frecuencia directamente proporcional al número
de células).

1602 5
Clasificación de métodos para el conteo de microorganismos.
Muestra

Concentración o dilución

Recuento total (viable y no viable)

Recuento de viables (directos)
-métodos directos: -En placa (UFC)*
a)cuenta al microscopio, -En tubo (NMP) **
b)contadores electrónicos.
c)filtracion
-métodos indirectos:
turbidimetría *UFC= unidades formadoras de
colonias
**NMP= número más probable
Curva patrón (absorbancia vs. células viables)
Recuentos en placas
Estandarización de McFarland
Luz transmitida
 Suspensiones coloidales

 Cantidad de luz

 Turbidimetría y nefelometría
 Nefelometría
 Mide la luz difractada

 Nefelómetro
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VENTAJAS DESVENTAJAS
 Para densidades microbianas
 La turbidimetría puede
bajas; de microorganismos
realizarse en
unicelulares y tamaños de
espectrofotómetros de visible
unos cuantos micrómetros
o violeta.
 Para microorganismos mas
 La fuente de radiación más
grandes y productores de
frecuentemente usadas es la
polisacáridos esta
lámpara de wolframio, pero
metodología no es adecuada
pueden utilizarse otras
fuentes de radiación visible.

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•Método de Breed
•Recuento en cámara de Petroff-Hauser

•Contador de Coulter

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 Método de Breed (1911)
 Un volumen conocido de muestra es extendido sobre
un cuadrado de 1 cm (1 a 4 cm) de lado de un
portaobjeto. Posteriormente, la muestra es secada,
fijada y teñida y se determina el número de
microorganismos en varios campos del microscopio.
Conociendo el área de los campos del microscopio es
posible determinar el número total de
microorganismos.

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 1

2,3 4,5

1602 15
Determinar la superficie del campo
microscópico

Metodo de Breed

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 Ventajas
Desventajas
 Simple, facil ,eficaz  cuando las poblaciones son
 Se puede utilizar un microscopio de pequeñas, el margen de error es
fluorescencia, en el cual se utilizara grande
un colorante distinto (fluorenscente)
como el azul de anilina modificado.  Es muy tedioso, no es práctico
para un gran número de
 Las celulas viables se pueden
diferenciar de las no viables, para eso muestras
se puede usar la naranja de acridina
(0,01%).
 no requiere de un equipo caro

Staphyllococcus aureus
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 La muestra es distribuida en un volumen conocido de
una cámara de recuento. El número de
microorganismos presentes en un área definida de la
cámara de recuento multiplicado por el factor
apropiado, determina el número total de
microorganismos presentes en la muestra.

METODO DE PETROFF-
HAUSER
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1602 19
1602 20
1602 21
Para evitar la cuantificación de las mismas células dos veces
omitir los microorganismos ubicados en la líneas de la parte
superior izquierda de cada cuadro. Los microorganismos
omitidos son considerados en los cuadros superior y derecho
adyacentes
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1602 23
 Ventajas
 bastante exacto cuando se
trabaja con •nuestras que
contienen poblaciones
abundantes
 no requiere de un equipo
caro, tan sólo se necesita una
cámara de recuento
 puede discriminar entre las
células microbianas y las
partículas extrañas
1602
Desventajas
 Es muy tedioso, no es
práctico para un gran número
de muestras
 No es muy sensible, se
necesitan al menos 106
bact/ml para que sean
observadas al microscopio
 No distinguen células vivas de
muertas
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Contador de Coulter
 El contador de Coulter está basado
en la determinación de la resistencia
eléctrica de un medio de cultivo
líquido al pasar a través de un
orificio. Al pasar una célula, la
resistencia aumenta bruscamente y
dicho aumento es registrado por un
dispositivo electrónico. Es posible
determinar el número de partículas
y su tamaño.

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ventajas desventajas
 fácil y rápido, muy sensible.  no distingue entre
microorganismos viables,
muertos o partículas

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 The coulter counter

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Fuentes de error en elRecuento en placa
recuento en placa.
El número de colonias que se obtiene en una
determinación de viables depende:
Por extensión
 tamaño del inoculo.
 El medio de cultivo.
Siembra por vertido en placa
 Condiciones de incubación.
Por diluciones seriadas
Asa calibrada
Miles Misra
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 Recuento en placa
Método de extensión en placa

La muestra se extiende
La muestra Resultado
uniformemente sobre la
(0.1mL o menos). típico de la
superficie del agar
Se pipetea sobre siembra por
usando una asa de
la superficie de la extensión
vidrio estéril
placa con agar
UFC/mL

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Recuento en placa
-por extensión

Ventajas Desventajas

La técnica es rápida Tiempo de incubación

barato Uniformidad en la
extensión de los
microorganismos

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  Método del vertido en placa

La muestra se Se añade
pipetea en la medio estéril y Resultado típico
placa estéril se mezcla bien del vertido en
con el inóculo placa

UFC/mL

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Recuento en placa
-siembra por vertido en placa

Ventajas Desventajas

Poco material Tiempo de incubación

Poca muestra

No hay dilución

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1602 33
 promedio de colonias X el factor de
dilución= UFC/mL

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1602 35
Recuento en placa
-por diluciones seriadas
Desventajas
ventajas Temperatura del medio de
cultivo
Muy sensible
Preparación de las diluciones
Permite detectar pocos
microorganismos /ml Material
Tiempo de incubación y
técnica
Restricción del conteo
(entre 30 a 300 colonias)
Procesamiento de la muestra

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Recuento en placa
-asa calibrada
Técnica:
 Muestra liquida concentrada
homogenizada
 Utilizar una asa que dispensa un
volumen conocido
 Realizar siembra en masivo
(estriado cerrado) en el medio de
cultivo.
 Incubar
 Contar colonias
Número de colonias X el factor de
dilución

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Recuento en placa
- asa calibrada

Ventajas Desventajas
La técnica es rápida Tiempo de incubación
No hay restricción para Uniformidad en la
el conteo extensión de los
microorganismos
Poca muestra

barato

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METODO DE GOTA O DE MILES
MISRA
Se emplean pipetas Pasteur previamente calibradas.
Desengrasar con cloroformo
Se comprueba su exactitud.
Se liberan de 48 a 52 gotas por mL.
Colocar un número determinado de gotas de la muestra
diluida sobre las placas de agar seco,
después de que las gotas son absorbidas por el agar .
se invierten las placas y se incuban.
RECUENTO POR FILTRO DE
MEMBRANA
Es viable
Útil para establecer el número de microorganismos en
muestras que contengan una población muy reducida.
Los volúmenes grandes de aire o liquido se filtran a
través de una membrana porosa en donde se
concentran los microorganismos.
RECUENTO POR FILTRO DE
MEMBRANA
 Filtro de membrana (0.2 μm o 0.45 | μm)

 Cultivo sólido.

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Colonias bacterianas desarrolladas sobre un
filtro de membrana
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VENTAJAS DESVENTAJAS

 Proporciona recuentos  Interfieren los altos niveles de

directos turbiedad

 Rápido y fácil de realizar

Método NMP

Bacterias coliformes en agua

Tablas estadísticas.

Bajas concentraciones (leche y agua)

Tamaño de poblaciones.

Viables

1602 46
1602 47
Referencias
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http://inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=Book&func=displayarticl
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1602 51
1602 52
Método de Breed (1911)
1. En un portaobjetos desengrasado marcar un área de 2 cm2 ,
invertir el portaobjetos
2. Homogeneizar el tubo o matraz con el cultivo problema.
3. Tomar 0.01 mL del cultivo y transferirlo al portaobjetos
previamente marcado, extendiendo la muestra en el área
marcada con el asa de platino estéril.
4. Dejar secar al aire y fijar.
5. Cubrir el frote con solución de azul de metileno de Lóeffler
durante 2 min.
6. Lavar con agua y dejar secar al aire.

1602 53
7. Determinar la superficie del campo microscópico, aplicando la
siguiente fórmula:
8. r2 en cm X 3.1416 = Superficie de campo microscópico en cm
9. 7 Determinar el número de campos microscópicos que existen
en la preparación con la siguiente fórmula:

Superficie de la preparación
Número de campos
microscópicos
Superficie del campo microscópico

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Calcular el número de microorganismos que hay en la preparación
(0.01 ml) y en 1.0 ml del cultivo, mediante la siguiente fórmula:

Numero de Numero de
Numero de campos en el microorganismos
microorganismos microscopio en la preparación
100

Numero de microorganismos /ml de cultivo

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 En condiciones de asepsia, colocar en el área hundida de la
plataforma de Petroff-Hauser, una gota y extenderla
rápidamente. Pequeños excesos del cultivo, se acumulan en
los canales de la orilla de la plataforma; en el caso de que
éstos se inunden totalmente (el cubreobjetos no reposará al
nivel de la superficie), limpiar la cámara y repetir el
procedimiento.
 Coloque el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X
y 100X.
 Cuente las células en cuadros individuales
 Cuente cuando menos 10 campos para obtener coeficientes
de variación de 10%

1602 56
 Aplique la siguiente fórmula y calcular el número de
microorganismos por mililitro o gramo de la muestra
original.

1 Promedio del
numero de
Factor
Microorganismos
por ml de la
de
microorganismos muestra original
Volumen del dilución
contados
cuadro

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