Laborator 3- Obinerea inoculului sporifer i vegetativ
Culturile de microorganisme performante, selecionate pe criterii calitative i
cantitative sunt pstrate n colecii de microorganisme (micoteci) i reprezint culturi stoc, necesare studiilor de biosintez sau pentru producerea de enzime. Din culturile stoc conservate se obin culturi starter pentru procesele fermentative. Cultura starter (inoculul) reprezint biomasa de celule active, care inoculate ntr-un mediu de cultur steril declaneaz un proces fermentativ ce are ca finalitate acumularea de biomas sau de metabolii, enzime, etc. Dac inoculul este alctuit din forme de rezisten ale bacteriilor (spori) se numete inocul sporifer, iar dac este format din celule vegetative aflate n diferite faze ale procesului biologic (de obicei n faza staionar) se numete inocul vegetativ. Calitatea i cantitatea inoculului joac un rol important n desfurarea procesului fermentativ i asupra randamentelor de fermentaie. Cantitatea de inocul variaz n funcie de natura microorganismelor i se exprim n procente raportate la volumul mediului de cultur : - pentru bacterii 1-2% (~10 5 celule cm -3 ) - pentru drojdii 4-5 % (10 5 10 6 celule cm -3 ) - pentru mucegaiuri 5-10% (10 5 10 6 celule cm -3 ) De obicei se prefer utilizarea unei cantiti mai mari de inocul pentru a declana mai rapid dezvoltarea culturii concomitent cu reducerea riscului de contaminare.
Tehnici de obinere, control i dimensionare a inoculului sporifer
Metodele de obinere, control i dimensionare a inoculului sporifer sunt specifice microorganismelor- ageni productori de enzime. Pentru obinerea enzimelor fungice, inoculul sporifer poate fi obinut prin antrenarea sporilor din culturi mature formate pe suprafaa mediilor cu agar. Pentru obinerea unui inocul sporifer uniform de mucegai i o mai bun dimensionare a acestuia, n laborator se aplic metoda cultivrii n plci Petri, n care mediul nutritiv solidificat este acoperit cu o folie de celofan. Se fierb discuri de celofan (cu diametrul de 60mm) de dou ori, cte 5 minute, n ap distilat. Pentru a le menine imersate n timpul fierberii se folosesc bile de sticl. Discurile se sterilizeaz apoi la 120C, 15min. Dup rcire se acoper mediul de cultur din plcile Petri cu cte o rondel de celofan, folosind o penset sterilizat prin flambare pentru a manipula rondela i a elimina bulele de aer care se formeaz la aezarea acesteia pe mediu. Aceast operaie se realizeaz n condiii aseptice pentru evitarea contaminrii. Se inoculeaz plcile astfel pregtite cu inoculul fungic. Se utilizeaz firul metalic pentru recoltarea fragmentelor hifale de pe marginea unei culturi care crete activ, care se plaseaz apoi n partea central a plcii i se etaleaz pe toat suprafaa foliei, avnd grij ca firul s nu strpung membrana de celofan. Se poate utiliza i o suspensie de spori i fragmente de hife n ser fiziologic steril, care se depune central pe folie i apoi se etaleaz pe toat suprafaa cu ajutorul unei baghete de sticl. Plcile Petri se termostateaz optim, corespunztor tipului de microorganism. Prin termostatare sporii germineaz, hifele penetreaz porii foliei spre mediul de cultur, astfel nct are loc o cretere normal a biomasei. Sporii rezultai prin sporularea miceliului nou format rmn rmn la suprafaa foliei. La sfritul cultivrii, pentru obinerea unei suspensii uniforme de spori se desprinde folia de celofan i se trece aseptic ntr-un vas Erlenmayer cu un volum cunoscut de ap steril, obinndu-se astfel un inocul sporifer concentrat. Laborator 3- Obinerea inoculului sporifer i vegetativ Prin examen microscopic direct se verific puritatea inoculului obinut, iar pentru a stabili concentraia de spori/ cm 3 suspensie se aplic metoda direct de numrare a sporilor de mucegai folosind citometrul Thoma. In cazul bacteriilor sporogene din genul Bacillus, pentru inducerea sporulrii se folosesc medii speciale. Gradul de sporulare la Bacillus subtilis trebuie s fie de 90- 95%. Suspensia de spori se realizeaz prin antrenarea celulelor de pe suprafaa mediului de cultur cu ser fiziologic steril. Aceast suspensie este utilizabil 1- 3 luni dac se pstreaz la 0,5- 6C sau un timp mai ndelungat dac se pstreaz la -20C. Dimensionarea inoculului sporifer bacterian se realizeaz prin numrare direct aplicnd metoda Breed.
Tehnici de obinere, control i dimensionare a inoculului vegetativ
In vederea obinerii de producii ridicate n mod constant i asigurarea reproductibilitii procesului biotehnologic este necesar obinerea i asigurarea unui inocul de calitate, standardizat i transferarea acestuia din laborator n producie astfel nct s nu genereze modificri ale caracteristicilor fiziologice sau ciclul evolutiv al productorului. In laborator, obinerea inoculului vegetativ este etapa n care microorganismul productor este trecut din starea de anabioz (starea de laten) n starea de multiplicare activ (metabioz), prin asigurarea unor condiii optime de cultivare (temperatur, pH, agitare, aerare, etc.). Pe parcursul acestei etape se va urmri obinerea unei culturi viabile viguroase, cu potenial de multiplicare rapid. Pentru obinerea inoculului vegetativ n laborator se utilizeaz sistemul de cultivare submers, cu agitare i aerare, precum vasele Erlenmayer de capaciti diferite plasate pe agitator sau n bioreactor de dimensiuni reduse, 0,5- 10dm 3 . Indiferent de agentul microbian utilizat, pentru obinerea inoculului vegetativ n laborator, cultura activat, obinut din cultura stoc pstrat n laborator, se repic n volume de 100cm 3 mediu de cultur steril aflat n vase Erlenmayer i, dup cultivare pe agitator (~ 200 rot min -1 ), timp de 24 ore, cnd celulele ajung la sfritul fazei exponeniale de cretere, sunt transferate n mediul de producie i cultivate pentru biosinteza enzimelor. In cazul culturilor de fungi filamentoi, pentru obinerea inoculului vegetativ, sporii asexuai sunt inoculai ntr-un mediu specific, dup care se realizeaz cultivarea pe agitator, n condiii submerse, la 25- 28C, minimum 48 ore, timp necesar ca sporii s germineze i s formeze hife vegetative. De obicei inoculul vegetativ n vrst de 48 ore se inoculeaz n mediul de producie n proporie de 5-10%, pornind de la o inoculare iniial cu spori de 10 5 - 10 6 cm -3 . Prin cultivarea pe medii lichide n condiii submerse, n funcie de condiiile fizico- chimice, creterea poate avea loc - dezordonat, ceea ce determin formarea unui miceliu difuz sau - simetric, n toate direciile plecnd de la un punct iniial, formndu-se pelei. Fungii filamentoi pot crete n dimensiuni fr s se modifice raportul ntre volumul protoplastului i aria suprafeei sale. Aceasta deoarece schimbul de substan ntre miceliu i mediu implic transportul numai pe distane scurte. In acest mod creterea mucegaiurilor este limitat n mod caracteristic la extremitatea liber a hifelor i poate continua prin extinderea hifelor periferice att timp ct mediul conine suficiente substane nutritive. Laborator 3- Obinerea inoculului sporifer i vegetativ Controlul calitii inoculului vegetativ de mucegai se realizeaz microscopic, prin dimensionarea n plan orizontal a stadiului de cretere a fungilor. Se determin: - lungimea i limea hifelor - gradul de ramificare a acestora - numrul de septuri. 2 (H t H 0 ) E = B 0 + B t
Pentru calculul ratei medii a extensiei hifale se recomand relaia:
E rata medie de extensie a hifelor, m h -1 ; H 0 lungimea iniial a hifelor (timpul t 0 ), m; H 1 lungimea hifelor dup 1 or de cultivare, m; BB 0 numrul de vrfuri hifale dup timpul t 0 ; BB 1 numrul de vrfuri hifale dup 1 or.
Rata medie a extensiei hifelor poate fi estimat i cu formula: E= G G lungimea medie a unitii de cretere hifal, m; viteza specific de cretere, h -1 .
Medii de cultur recomandate pentru obinerea inoculului vegetativ sunt: - pentru bacterii: zaharoz .................. 2,0g pepton .................. 1,0g NaCl .................. 0,5g ap distilat pn la 100cm 3 - pentru mucegaiuri: amidon ................10,0g glucoz ................ 0,5g extract drojdie ........ 0,5g soluie sruri Czapeck pn la 100cm 3 Mediul se repartizeaz cte 50cm 3 / vas Erlenmayer cu capacitatea de 250cm 3 i se sterilizeaz la 120C, 20 minute.