NOTE DE CURS

AN UNIVERSITAR 2012-2013
BIOLOGIE MOLECULAR! anul II





Specializarea Biochimie










Titular curs Prof. Dr. Marieta Costache
LP Asist. Dr. Andreea Toana












"#$#%&'() *+%),)& -./0

2



123452436 7829 :9 5431


12345243; 65<=< 745>9<5< ?36@9>

I. NOTE DE CURS BM1 - STRUCTURA MOLECULAR! A
CROMOZOMILOR "I GENELOR
II. NOTE DE CURS BM2 - ORGANIZAREA MOLECULAR!,
EXPRESIA "I REGLAREA GENELOR EUCARIOTE
III. NOTE DE CURS BM3 - REGLAREA INI#IERII
TRANSCRIP#IEI
IV. NOTE DE CURS BM4 - PROCESAREA ARN,
TRANSPORT NUCLEAR "I CONTROL POST-
TRANSCRIP#IONAL
V. NOTE DE CURS BM5 - TRADUCEREA



























3
NOTE DE CURS BM1 A STRUCTURA MOLECULAR! A
CROMOZOMILOR "I GENELOR

SLIDE 2. Reprezentare clasic$ a unei celule procariote
Figura: Reprezentare clasic! a unei celule procariote (dup! Campbell, et al.,
Biology, 2002).
Unul dintre criteriile care stau la baza clasific!rii organismelor este absen"a sau
prezen"a nucleului individualizat. Celulele procariote lipsite de un veritabil nucleu,
includ eubacteriile #i archeobacteriile. De cealalt! parte se afl! celulele eucariote care
posed! o membran! nuclear! care separ! cromozomii de restul celulei. Cromozomul
unic al celulelor procariote este format dintr-o molecul! de ADN dublu catenar
circular! care con"ine cteva milioane de perechi de baze. n general, genoamele
eucariotelor au o m!rime #i o complexitate variabil! #i con"in mai mul"i cromozomi.
Att celulele procariote ct #i cele eucariote posed! mecanisme, pe de o parte
comune #i pe de alt! parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor #i a fluxului de
informa"ie de la ADN la proteine. Transcrip"ia ADN realizat! de ARN polimeraze
constituie prima etap!, comun! la toate organismele. La celulele procariote, ribozomii
se fixeaz! pe molecula de ARNm, n curs de sintez!, #i realizeaz! traducerea imediat!
a informa"iei n proteine, n citoplasm!. Din contr!, la eucariote membrana celular!
separ! locul n care se realizeaz! transcrip"ia de cel n care are loc traducerea.
Transcriptul primar, ARNm imatur, con"ine o succesiune de secven"e netraduse,
numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul de scindare a intronilor #i sudare a
exonilor (splicing), n procesul de maturare a ARNm. n urma acestei etape,
localizat! n nucleu, ARNm trece n citoplasm! unde este tradus. Maturarea ARNm
prin splicing confer! celulei eucariote posibilitatea diversific!rii informa"iei prin
combinarea alternativ! a exonilor, o alt! etap! foarte important! n dezvoltarea
organismelor.
Bacteriile, organismele procariote cele mai simple ntlnite n toate mediile
naturale, prezint! caracteristici comune. Adesea, un perete celular, format din
peptidoglicani, nconjoar! membrana plasmatic! #i confer! celulei o form! rigid!. De
asemenea, este prezent! o membran! extern! care posed! un num!r de flageli #i pili
variabil. Bacteriile au un compartiment citoplasmatic unic care con"ine un nucleoid
format dintr-o molecul! simpl! circular! de ADN, ARN #i proteine. Pe lng! ADN
prezent n nucleoid, citoplasma majorit!"ii bacteriilor con"ine mici molecule circulare
de ADN, numite plasmide. Cel mai adesea acestea confer! celulei rezisten"! la
antibiotice #i la alte toxine. n condi"ii favorabile, bacteriile se multiplic! rapid prin
diviziune. Capacitatea lor de adaptare la condi"iile de mediu #i de diviziune rapid! fac
ca aceste celule s! constituie suporturi excelente pentru numeroase analize biochimice
#i de biologie molecular!, in vitro.
De#i cea mai mare parte a genoamelor procariote sunt mai mici de 5 Mpb
lungime, exist! #i cteva mai mari. n prezentarea tradi"ional!, genomul tipic
procariotelor con"ine o singur! molecul! circular! de ADN, localizat! la nivelul
nucleoidului.
Aceast! abordare este adev!rat! pentru E. coli #i pentru multe alte bacterii
foarte studiate, dar specific!m c! evolu"ia cunoa#terii, n sfera genomului
procariotelor, pune n discu"ie anumite concepte dezvoltate n era pre-genomic! a
microbiologiei. Aceste aspecte se refer! att la structura fizic! a genomului
procariotelor ct #i la organizarea genetic!.

4

SLIDE 3. Punctul de vedere tradi%ional asupra cromozomului bacterian
Tabel M!rimea "i complexitatea genomului la cteva virusuri "i celule
Asemeni eucariotelor, genomul procariotelor trebuie s! se ncadreze ntr-un
spa"iu foarte restrns. Cromozomul circular de la E. coli are o circumferin"! de 1,6
mm n timp ce dimensiunile celulei sunt de 1,0 x 2,0 m. Structurarea necesar! este
realizat!, ca #i la eucariote, cu ajutorul proteinelor de legare la ADN (DNA binding
proteins) care compacteaz! genomul ntr-o form! organizat!. Structura ob"inut! nu
prezint! similitudini substan"iale cu cromozomul de la eucariote cu toate c! din punct
de vedere didactic este folosit! exprimarea de cromozom bacterian.
Majoritatea cuno#tin"elor pe care le avem despre organizarea ADN n nucleoid
sunt rezultatul studiilor pe E. coli. Genomul circular al E. coli este suprar!sucit.
Suprar!sucirile apar cnd ture suplimentare sunt introduse sau ndep!rtate din
structura dublei elice (suprar!sucire pozitiv!/negativ!). Suprar!sucirea este
modalitatea ideal! de mpachetare a unei molecule ntr-un spa"iu redus. Primele
dovezi c! suprar!sucirile sunt implicate n mpachetarea genomului circular de la E.
coli au fost ob"inute n 1970 n urma examin!rii unor nucleoizi izola"i, fiind
confirmate definitiv ca o tr!s!tur! a celulelor vii n 1981. Se consider! c!, la E. coli
supra-r!sucirile sunt generate #i controlate de dou! enzime, ADN giraza #i ADN
topoizomeraza I.
Cea mai plauzibil! explica"ie privind compactarea nucleoidului este aceea c!
ADN este ata#at la proteine care restrng capacitatea de relaxare, astfel nct rota"ia la
nivelul unui situs de scindare are ca rezultat pierderea unei suprar!suciri dintr-un mic
segment al moleculei. Modelul curent propune ata#area ADN de la E. coli pe structura
unei proteine miez de la care radiaz! 40-50 bucle n interiorul celulei. Fiecare bucl!
radiaz! n interiorul celulei #i con"ine aproximativ 100 kpb de ADN suprar!sucit.

SLIDE 4. Compactarea cromozomului la E. coli
Figura Model pentru structura nucleoidului de E. coli
Componentele proteice ale nucleoidului includ ADN giraza #i ADN
topoizomeraza I, cele dou! enzime care sunt principale responsabile pentru
men"inerea st!rii de suprar!sucire, ca #i un set de aproximativ patru proteine
considerate a avea un rol mai specific n mpachetarea ADN bacterian. Cea mai
abundent! protein! este HU, care este foarte diferit! structural de histonele eucariote
dar ac"ioneaz! similar, formnd un tetramer n jurul c!ruia se nf!#oar! aproximativ
60 pb. n celula de E. coli sunt prezente aproximativ 60 000 copii ale HU care acoper!
aproximativ 1/50 din molecula de ADN, dar nu se cunoa#te dac! tetramerii sunt
distribui"i de-a lungul ADN sau sunt pozi"iona"i numai n regiunea central! a
nucleoidului.

Discu"ii pe tema structurii nucleoidului procariot
n ultimii 10 ani a devenit foarte clar c! anatomia genomului procariot
dezvoltat! pe baza studiilor pe E. coli este foarte simplist!. De#i marea majoritate a
genoamelor bacteriene sau a cromozomilor de la archeobacterii sunt circulari, a fost
descoperit un num!r mare de forme lineare. Prima a fost descris! pentru Borrelia
burgdorferi, n 1989 de c!tre Ferdows #i Barbour, urm!torii ani fiind realizate
descoperiri similare pentru genul Streptomyces #i alte bacterii.
Un alt aspect l reprezint! prezen"a plasmidelor care reprezint! mici molecule
de ADN, adesea dar nu ntotdeauna circulare, care coexist! cu cromozomul principal
5
n celula bacterian!. Anumite tipuri de plasmide sunt capabile de integrare n genomul
principal, n timp ce altele pot avea o existen"! independent!. Plasmidele con"in gene
care, de obicei, nu se g!sesc pe cromozomul principal, dar care sunt, n multe cazuri,
neesen"iale pentru bacterie, deoarece codific! pentru fenotipuri cum sunt rezisten"a la
antibiotice f!r! de care bacteriile pot tr!i n condi"ii de mediu normale. Multe
plasmide sunt capabile de transfer de la o celul! la alta, #i acelea#i plasmide sunt
adesea reg!site n bacterii care apar"in la diferite specii. Tr!s!turile diferite ale
plasmidelor sugereaz! c! ele reprezint! entit!"i independente care, n majoritatea
cazurilor, nu sunt incluse n defini"ia genomului bacterian.
Pentru o bacterie de tipul E. coli, care are un cromozom de 4,6 Mpb #i care
poate con"ine variate combina"ii de plasmide, nici una mai mare de cteva kilobaze,
toate dispensabile, putem defini cromozomul principal ca genom. n cazul altor
procariote lucrurile nu stau la fel de simplu. De exemplu, cromozomul linear al
Borrellia burgdoferi care are 910 kpb #i con"ine 853 gene, este nso"it de cel pu"in 17
plasmide circulare #i lineare care mpreun! contribuie cu alte 533 kpb #i cu cel pu"in
430 gene. De#i, majoritatea acestor gene sunt orfane (f!r! func"ie identificat!), au
fost identificate #i structuri indispensabile cum sunt genele pentru proteinele
membranare #i biosinteza purinelor. Se consider! c! m!car unele din cele 17 plasmide
de la Borrelia sunt componente esen"iale ale genomului. Astfel, este admis!
posibilitatea ca anumite procariote s! posede genoame constituite din mai multe
componente care includ un num!r separat de molecule ADN. Aceast! situa"ie este
mult mai apropiat! de ceea care exist! la eucariote dect la procariotele tipice. De
fapt, interpretarea informa"iilor privind genomul de la Borrelia este nc!
controversat!, #i complicat! datorit! existen"ei unei bacterii nrudite, Treponema
pallidum, al c!rei genom este format dintr-o singur! molecul! de ADN de 1138 kpb
care con"ine 1041 gene, este lipsit de orice omologie cu genele prezente n plasmidele
de la Borrelia.
Tabel Tr!s!turile ctorva plasmide tipice
"#$ %& $'()*#%+ ,-./0##'& 1&.&'23 45&*$'&
6&7#)8&.0+ 3&B)'(&CDE *C()F)G()$& 3FH ,* !" $%&' I) *,(& F*$(&%))
,&38#'#8(8& 5GCJ#K*%& I) (%*C'L&% 6:7
MC(%& F*$(&%))
N O& ,* !" $%&'
9/#1(:+ ;<=#''&3>? 1)C(&B* O& (GP)C& $*%& #$)O
*,(& F*$(&%))
5G, O& ,* !" $%&'Q +%GO#$& $G,)$)CE
@&13(%(8#A+ 9CB)R& +&C(%# R&(*FG,)'R#,
RG,&$#,&,G% C&GF)IC#)(&
28> +&C(%# ()*+,%-%./) 0+1',/Q
R&(*FG,)'R (G,#&C
B#3-'&.0+ @*(GK&C)(*(& 2) O& ,* 234%5/$1*4'+-
1+-*6/$'*.)Q $*+*$)(*(&* O& *
O&(&%R)C* LG%R*%&* K*,&,G% ,*
O)$G(),&OGC*(&
O alt! complica"ie privind structura fizic! a genoamelor procariote este legat!
de diferen"ele dintre sistemele de mpachetare pentru moleculele de ADN de la
bacterii #i archeobacterii. Una dintre motiva"iile pentru care archeobacteriile sunt
privite ca un grup distinct de organisme, diferite de bacterii, este faptul c! acestea nu
posed! proteine de compactare de tipul HU, dar posed! proteine mult mai
asem!n!toare cu histonele. Cu toate c!, informa"iile despre nucleoidul de la
archeobacterii sunt destul de incomplete, se presupune c! proteinele asem!n!toare
histonelor au un rol important n mpachetare.
Cunoa#tem deja c! genomul bacterian are o structur! genetic! compact! cu
foarte pu"in spa"iu ntre gene. Aceast! organizare este foarte bine demonstrat! #i tipic!
6
la genomul de la E. coli. La acest organism ADN care nu codific! pentru diferite gene
reprezint! numai 11% din total #i este distribuit pe toat! lungimea sub forma unor
segmente mici. O serie de teorii sus"in c! organizarea compact! este benefic! pentru
replicarea rapid! a genomului cu toate c! ipotezele nu pot fi sus"inute de dovezi
experimentale.

SLIDE 5. Con%inutul minim de gene &i identitatea genelor specifice
Tabel. Catalog comparativ de gene pentru E. coli, H. influentze, M. genitalium
Cu toate c! num!rul de genoame procariote secven"ializate integral cre#te
continuu, nu este nc! posibil! realizarea unui catalog complet cu con"inutul genelor
fiec!rei specii, din simplul motiv c! func"iile anumitor gene r!mn necunoscute. De
exemplu, genomul de la E. coli con"ine 4 288 gene care codific! pentru proteine dar
peste 1 500 din acestea sunt orfane. Chiar dac! informa"ia este adesea incomplet!,
este interesant s! examin!m rolul genelor ale c!ror func"ii sunt cunoscute, #i s!
apreciem num!rul diferit al genelor implicate n diferite activit!"i biochimice la o
bacterie de tipul E. coli.
Cataloagele de gene sunt mult mai interesante cnd compara"iile se realizeaz!
ntre diferite specii. De exemplu, la E. coli 243 de gene sunt implicate n
metabolismul energetic, la Haemophylus influenzae numai 112 #i la Mycoplasma
genitalium numai 31. Aceste compara"ii pot duce la specula"ii privind num!rul minim
de gene necesar pentru supravie"uirea unei celule. Majoritatea demersurilor realizate
n acest sens au demarat cu studiul celor mai mici genoame, cel al Mycoplasma
genitalium #i cel a Mycoplasma pneumoniae, care con"in numai 470 #i respectiv 679
gene. Considera"ii teoretice au dus la sugestia c! 256 gene reprezint! minimul
necesar, dar experimentele de inducere de muta"ii sugereaz! c! pentru Mycoplasma
sunt necesare minim 300. Studii similare interesante au fost realizate pentru genele
specifice care determin! distinc"ia dintre o specie #i alta. Din cele 470 gene ale
genomului de la M. genitalium, 350 sunt prezente #i la bacterii mai ndep!rtate
evolutiv, cum este Bacillus subtilis. Aceasta sugereaz! c! tr!s!turile biochimice #i
structurale care disting Mycoplasma de Bacillus sunt codificate n aproximativ cele
120 gene care sunt unice la fiecare tip. Din nefericire, astfel de compara"ii privind
genele particulare nu dau r!spunsuri cheie privind caracteristicile care
individualizeaz! fiecare tip de microorganism.

SLIDE 6. Operonii sunt caracteristici ale genoamelor procariote
Figura. "#$%&#'% '#()&# *% +(%&+,#- ./ +(%&+,)0 0.1'+23 *% 0. 45 1+0#6 7/ +(%&+,)0 '&#('+$.,
*% 0. 45 1+0#6 1/ +(%&+,)0 8#9' *% 0. :;)#$%9 .%+0#1)<
Cea de a doua caracteristic! a genomului de la procariote, ilustrat! la E. coli, este
prezen"a operonilor. Operonii reprezint! un grup de gene localizate una lng! cealalt!.
Toate genele din structura unui operon sunt exprimate ca o singur! unitate. Acest tip
de aranjament este comun genoamelor procariote #i poate fi ilustrat la E. coli cu
operonul lactozei care a fost descoperit n 1961 de c!tre Jacob #i Monod. Acesta
con"ine trei gene implicate n transformarea dizaharidului lactoz! n unit!"ile sale
componente (glucoz! #i galactoz!). Genele operonului lactoz! sunt implicate n
utilizarea lactozei ca surs! de energie de c!tre E. coli. Deoarece, lactoza nu este o
component! comun! a mediul nconjur!tor pentru E. coli, majoritatea timpului
operonul nu este exprimat #i enzimele pentru utilizarea lactozei nu sunt sintetizate de
bacterie. Cnd lactoza devine disponibil! se realizeaz! activarea operonului #i cele
trei gene sunt exprimate mpreun!. Operonul lactoz! reprezint! un exemplu clasic de
reglare a expresiei genelor la bacterii (Figura a).
7
La E. coli #i la Bacillus subtilis exist! aproximativ 600 operoni. n majoritatea
cazurilor, genele unui operon sunt corelate func"ional #i codific! pentru un set de
proteine implicate ntr-o anumit! cale metabolic!, cum ar fi utilizarea unui glucid ca
surs! de energie sau sinteza unui aminoacid (operon triptofan, Figura b). La alte
bacterii sau archeobacterii exist! posibilitatea ca operonii s! con"in! gene implicate n
diferite c!i metabolice. Este cazul unuia dintre operonii de la Aquiflex aeolicus care
con"ine #ase gene linkate care codific! pentru: i) dou! proteine implicate n
recombinare; ii) o enzim! folosit! n sinteza proteic!; iii) o protein! necesar! pentru
mobilitate; iv) o enzim! utilizat! n sinteza nucleotidic!; v) o enzim! pentru sinteza
lipidic! (Figura c). n concluzie, teoria c! expresia unui operon conduce la sinteza
coordonat! a mai multor enzime necesare pentru o singur! cale metabolic! nu este
valabil! pentru toate speciile.

SLIDE 7. Structura materialului genetic la eucariote
Nucleul celulei eucariote
Figura . Nucleul celular "i caracteristicile sale (dup! Campbell, et al., Biology, 2002).
Structura materialului genetic la eucariote
n ciuda diferen"elor evidente de form! #i de func"ie, diferitele tipuri celulare care
compun un organism multicelular, fie c! este vorba de o ciuperc! sau de un mamifer,
con"in un lot complet de gene. V!zut! din exterior o celul! din constitu"ia unui cartilaj
#i un neuron nu se aseam!n! deloc. Cu toate acestea cele dou! tipuri celulare con"in
acela#i complement de gene.
Informa"ia genetic!, prezent! ntr-o celul! eucariot! specializat!, se poate
compara cu o carte care con"ine toate informa"iile necesare construc"iei unei cl!diri cu
utilit!"i multiple. n cursul realiz!rii construc"iei, sunt probabil necesare toate
planurile dar numai o mic! parte a informa"iei va trebui consultat! n timpul activit!"ii
de construc"ie a unui etaj sau a unei singure camere. Aceast! abordare este adev!rat!
#i pentru un ovul fecundat, care con"ine ansamblul instruc"iunilor genetice, #i care este
fidel replicat #i informa"ia distribuit! tuturor celulelor organismului n dezvoltare. n
consecin"!, celulele poart! mult mai mult! informa"ie genetic! dect pot utiliza
vreodat!. Acestea posed! mecanisme care le permit s! exprime informa"ia genetic!, n
mod selectiv, urmnd numai instruc"iunile care privesc numai o singur! celul! ntr-un
moment particular al existen"ei acesteia. n acest subcapitol, o s! analiz!m
modalit!"ile care le permit celulelor eucariote s! structureze totalitatea materialului
genetic pe care l con"in, n condi"iile controlului coordonat al expresiei genelor
menite s! asigure numai sinteza anumitor proteine. Mai nti vom descrie structura #i
propriet!"ile nucleului celulei eucariote, care con"ine majoritatea informa"iei genetice
#i mecanismele de reglare a acesteia.
Nucleul celulei eucariote
n ciuda importan"ei sale pentru stocarea #i utilizarea informa"iei genetice,
nucleul celulei eucariote posed! o morfologie destul de comun!. Con"inutul nuclear
reprezint! o mas! vscoas! amorf! de materie, nchis! ntr-un nveli# nuclear
complex. n nucleul unei celule tipice, n interfaz!, se eviden"iaz!: i) cromozomii,
prezen"i sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatina; ii) matricea
nuclear! care este format! dintr-o re"ea fibrilar! care con"ine proteine; iii) unul sau
mai mul"i nucleoli, structuri amorfe, opace la microscopie electronic! care sunt sediul
sintezei ARN ribozomal #i al asambl!rii ribozomilor; iv) nucleoplasma, substan"!
lichid! care con"ine toate componentele #i elementele nucleului eucariot. n figura
sunt ilustrate schematic diferitele elemente ale nucleului eucariot.
nveli"ul nuclear
8
n opozi"ie cu termenul de membran! nuclear!, nveli#ul nuclear desemneaz!
structura complex! care se afl! la frontiera dintre nucleul #i citoplasma unei celule
eucariote. ntr-o celul!, separarea materialului genetic #i a citoplasmei care l
nconjoar! este poate caracteristica cea mai important! care distinge eucariotele de
procariote. Apari"ia nveli#ului nuclear este cu siguran"! un punct de reper n evolu"ia
biologic!. nveli#ul nuclear const! n mai multe elemente distincte. Continuitatea
nveli#ului care delimiteaz! nucleul este asigurat! de dou! membrane concentrice
separate de un spa"iu intermembranar de 10 la 50 nm. Cele dou! membrane sunt
fuzionate din loc n loc #i formeaz! pori circulari care sunt compu#i dintr-un ansamblu
complex de proteine. Densitatea porilor nucleari variaz! de la aproximativ 2 la 4 pe
m
2
n nveli#ul nuclear al eritrocitelor de pas!re, relativ inactiv din punct de vedere
metabolic, la mai mult de 60 m
2
n cel al ovocitelor care se preg!tesc s! r!spund!
nevoilor viitoare ale dezvolt!rii embrionare.
O celul! de mamifere, de m!rime medie, posed! aproximativ 3 000 de pori
nucleari. Membrana extern! este n general pres!rat! cu ribozomi #i adesea n
continuitate cu membrana reticulului endoplasmatic.
Suprafa"a intern! a nveli#ului nuclear este bordat! de o plas! fibrilar! dens!,
numit! lamina nuclear!. n anumite celule, cum este ovocitul de amfibian, aceast!
lamin! formeaz! un strat continuu, n timp ce n altele pare mult mai fragmentat!.
Consider!m c! lamina nuclear! reprezint! un suport structural pentru nveli#ul nuclear
#i serve#te la fixarea fibrelor de cromatin! la periferia nucleului.
Fibrilele laminei nucleare au un diametru de aproximativ 10 nm #i sunt
compuse din polipeptide numite lamine, care apar"in aceleia#i superfamilii de
polipeptide care compun filamentele intermediare ale citoscheletului. Ca #i pentru
componentele intermediare ale citoplasmei, integritatea laminei nucleare este
controlat! de c!tre procesul de fosforilare/defosforilare. Dezasamblarea laminei
nucleare, nainte de mitoz!, este indus! de c!tre fosforilarea laminelor de c!tre o
kinaz! specific!.

SLIDE 8 -15. Ciclul Celular
- principalele stadii ale fazei M ntr-o celul$ animal$
Ciclul celular normal "i mecanisme de control
Ciclul celular
Ciclul celular reprezint! totalitatea modific!rilor #i transform!rilor suferite de
celul! n timpul procesului de replicare #i diferen"iere.
ntr-o popula"ie de celule ce se divid, replicarea #i diviziunea unei celule n
dou! celule fiice identice cuprinde 2 faze func"ionale #i 2 faze preparatorii.
Fazele func"ionale sunt reprezentate de :
copierea precis! a ADN: faza S (de replicare a ADN);
segregarea sau mp!r"irea setului de cromosomi ntre cele dou! celule fiice:
faza M (mitoza).
Celula se pregate#te biologic pentru faza S ntr-o faz! preparatorie, numit! G1
#i pentru mitoz! ntr-o faz! mult mai pu"in n"eleas!, G2.
Celulele ce nu se mai divid pot fi permanent scoase din ciclul celular prin
diferen"iere terminal!, sau pot fi oprite ntr-o stare intermediar!, G0, (celular resting).
Evenimentele ce presupun desf!#urarea unui ciclu celular intervin ntr-un mod
organizat, astfel ncat anumite evenimente se termin! nainte ca altele s! nceap!.
Aceast! ordine a evenimentelor este controlat! de o serie de mecanisme de control
intracelulare incomplet elucidate #i este influen"at! de factori extracelulari: factori de
9
cre#tere, mitogeni #i antimitogeni, inductori de diferen"iere, contact celul!-celul! sau
factori de ancorare, nutrien"i, etc.
Fig. 1. Fazele ciclului celular
Notatii:
Go=faza de repaus
G1=faza de presintez! ADN
G2=faza de postsintez! ADN
S =faza de replicare a ADN
M=faza de mitoz!
Controlul ciclului celular
Factorii ce influen"eaz! ciclul celular sunt:
Factori extracelulari:
-factori de cre"tere;
-factori mitogeni;
-factori antimitogeni;
-inductori ai diferen#ierii celulare;
Factori intracelulari:
-cicline;
-cdk - kinaze ciclin dependente;
-proteine codate de gene supresoare ale tumorii:-p53, Rb-1;
-PCNA - proliferating cell nuclear antigen;
-gena myc.
Abilitatea celulei de a produce o copie exact! a ei ns!#i, prin diviziune, este o
component! esen"ial! a vie"ii celulare. Acest proces trebuie realizat cu mare fidelitate,
astfel nct organismele s! fie capabile s! se nmul"easc!. Mecanismul molecular de
control al ciclului celular utilizat de celul! are un nivel nalt de organizare #i este
relativ bine conservat n cursul evolu"iei speciilor.
Ne afl!m de-abia la nceputul revel!rii mecanismului implicat n acest proces
complicat, n care sunt implicate numeroase semnale intra- #i extracelulare. De#i n
timpul procesului evolu"iei #i al diferen"ierii celulare pot interveni anumite schimb!ri
subtile, genetice sau epigenetice, n orice faz! a ciclului celular, aceste schimb!ri
trebuie s! se produc! ntr-un mod controlat, pentru a preveni urm!ri dezastruoase.
Lipsa fidelit!"ii n procesul de reproducere a celulelor creaz! o situa"ie de
instabilitate genetic! care pare a fi un factor contributiv semnificativ n dezvoltarea
celulelor maligne n organismele eucariote avansate.
Deci nu este surprinz!tor c! boala canceroas! este caracterizat! printr-o
reglare anormal! a cre#terii #i a reproducerii celulare. Pentru a ntelege cum debuteaz!
cancerul #i pentru a dezvolta strategii optime pentru a elimina celulele canceroase,
trebuie s! fie identificate diferen"ele, chiar la nivel molecular, ntre celula normal! #i
celula canceroas!.
Fenomenul cheie al tranzi"iei de la o etap! la alta a ciclului celular este
reprezentat de ac"iunea enzimatic! a unei anumite kinaze ciclin-dependente. Forma
activ! a acestor enzime se realizeaz! prin formarea unui complex cu o anumit!
protein! specific! unui anumit stadiu al ciclului celular. Aceste proteine se numesc
cicline.




10
Tabel - Kinazele ciclin dependente (cdk), ciclinele #i substraturile kinazelor din
diverse faze ale ciclului celular

,CDC
EFGCDC HFHIFGJ
@4K4G@4G"L

HFHIFGC

M9NM"6C"9I
EFGCD4IO6
PQ /%=R H#/'#.( @ 6SJQ

PQTM /%=R H#/'#.( 4 6SJQ

M /%=R H#/'#.( C U

PRTV

/%=R H#/'#.( NTC U

Dat fiind c! progresia celulei n ciclul celular este condi"ionat! de activitatea
cdk, controlul activit!"ii acestor enzime #i a complexelor pe care acestea le formeaz!
cu ciclinele, constituie un mecanism esen"ial de reglare a ciclului celular. Acest tip de
control ac"ioneaz! la mai multe niveluri:
1. Sinteza ciclinelor
Condi"ionarea sintezei unui anumit tip de ciclin! se face n func"ie de etapa
ciclului celular. Din punct de vedere cantitativ, sinteza de cicline depinde de:
- amploarea semnalelor extracelulare ce favorizeaz! proliferarea (hormoni, factori de
crestere);
- intensitatea degrad!rii proteolitice a ciclinelor.
Complexul cdk-ciclin! activat fosforileaz! substraturile necesare tranzi"iei
celulei la urmatoarea faz! a ciclului.
Controlul ciclului celular prin kinaze ciclin-dependente.
2. Blocarea activit$#ii enzimatice a cdk se realizeaz! prin fosforilarea cdk sau prin
legarea lor de inhibitori ai kinazelor ciclin-dependente (CKI), proces ce mpiedic!
formarea complexului activ cu ciclinele.
Tabel- Complexele cdk-ciclin! #i inhibitorii acestora n func"ie de etapele
ciclului celular

58S@>9T4>
5:UA5<5><7;


U<@
;#.W#S#823# (# /%=?

<7U
;$328&#.&
#.W#S#82(3& ('&
=#.(7&'23?

N6=6
$OH VA5)$,)C* :

$RQ
$RX
$QYZ $Q[
$Q\Z $Q]
PQ
$OH -A5)$,)C* 9

$RQZ $RX A PQTM
$OH -A5)$,)C* 6

$ RQ J M
$OH -A5)$,)C* "

$RQ A PRTV
Mai explicit, activitatea cdk este controlat! la cel pu"in 6 nivele:
1. Fiecare ciclin! este sintetizat! ntr-un anumit stadiu al ciclului celular. Ciclinele D
#i E sunt sintetizate n faza G1, ciclina A n fazele S #i G2, ciclina B n fazele G2 #i
M;
2. Degradarea ciclinelor este reglat! n mod riguros;
3. Ciclina poate forma un complex cu o cdk (kinaz! ciclin-dependent!);
4. Acest complex devine activ prin ac"iunea unei CAK (cdk activating kinase);
11
5. Cdk sunt inactivate prin fosforilare n pozi"ia Thr14 #i Tyr15 #i pot fi reactivate
prin ac"iunea unei fosfataze n acelea#i pozi"ii,
6. Proteine inhibitoare de cdk pot fie preveni asamblarea complexelor cdk-ciclin!, fie
inactiva cdk din complexele formate.
Complexul cdk-ciclin! activat fosforileaz! substratele necesare tranzi"iei
celulei la urmatoarea faz! a ciclului.
Anumite evenimente intracelulare sau extracelulare pot determina oprirea
parcurgerii ciclului celular:
denutri"ia;
schimb!ri drastice de temperatur!;
factori de stres;
alterarea ADN, etc.
Afectarea ADN celular este cel mai studiat semnal de ini"iere a sistemelor de
control ale ciclului celular. Detectarea de erori de copiere a genomului celular
determin! sechestrarea celulelor n faza G1 sau, dac! aceasta a fost depa#it!, n faza S,
inhibndu-se att ini"ierea replic!rii, ct #i elonga"ia. Blocarea ciclului celular se face
prin intermediul inhibitorilor kinazelor ciclin-dependente.
Exist$ mecanisme specifice de reglare a fiec$rei etape ale ciclului celular:
Tranzi%ia G1 - S
n faza G1 a ciclului celular exist! un punct de control cunoscut drept punctul
de restric"ie, R. El marcheaz! fosforilarea proteinei Rb (a retinoblastomului) prin
interven"ia complexului holoenzimatic format de cdk 4 cu ciclina D. Consecin"a este
anularea ac"iunii inhibitorii pe care o are proteina Rb n forma hipofosforilat! #i
legarea acesteia la nivelul unor secven"e specifice ale ADN prin intermediul unor
factori de transcrip"ie de tipul proteinei myc. Ac"iunea inhibitorie a proteinei Rb
nainte de fosforilare se manifest! prin legarea de un alt factor de transcrip"ie, E2F.
Complexul astfel format este capabil s! lege ADN, dar nu poate ini"ia transcrip"ia.
E2F devine capabil s!-#i ndeplineasc! rolul de factor de transcrip"ie doar dup!
fosforilarea proteinei Rb, cnd factorul E2F redevine liber. Astfel se activeaz!
transcrip"ia genelor ai c!ror produ#i sunt necesari pentru trecerea la faza S a ciclului
celular #i pentru desfa#urarea corespunz!toare a copierii ADN. Se consider! c!
proteina Rb este factorul-cheie pentru trecerea n faza S a ciclului celular.
Alterarea ADN celulei aflate n faza G1 induce sinteza n cantit!"i mai mari a
proteinei oligodimerice p53. Aceasta induce transcrip"ia genei p21, sintetizndu-se
astfel cantit!"i crescute de proteina p21, un inhibitor multipotent al kinazelor ciclin-
dependente. Consecin"a final! este inhibarea fosforil!rii proteinei Rb #i, deci, blocarea
progresiei ciclului celular. Se consider! c! proteina p53 induce #i transcrip"ia unor
compusi implica"i n procesele de repara"ie a ADN. n condi"iile n care defectul este
mult prea grav pentru a fi reparat, p53 contribuie la declan#area apoptozei.
Faza S
Mecanismele de reglare a parcurgerii fazei S nu sunt suficient cunoscute. Se
#tie c!, imediat dup! ini"ierea replic!rii ADN-ului, se formeaz! complexul activator,
cdk-ciclina A. Consecin"a este fosforilarea #i, deci, activarea proteinelor care se leag!
la nivelul situsurilor de replicare autonom! unde debuteaz! acest proces. Odat! ce
ADN a fost copiat n ntregime, celula intr! n faza G2.
Tranzi%ia G2-M
Primul factor reglator descris ca fiind implicat n tranzi"ia de la faza G2 la faza
M a fost factorul de promovare a mitozei, MPF. MPF este de fapt complexul cdk2-
ciclina B care, ac"ionnd pe un substrat-cheie necunoscut, determin! trecerea la faza
M.
12
Faza M
Faza debuteaz! dup! activarea complexului cdk2-ciclina B. Iesirea din faza
mitozei #i intrarea n stadiul G1 este marcat! de distruc"ia proteolitic! a ciclinei B #i
de inactivarea cdk2.
Reglarea extracelular$ a ciclului celular
Celula integreaz! continuu semnale extracelulare cu rol n controlul
mecanismelor de diviziune celular!. Statutul nutri"ional, contactul celul!-celul! #i
peptidele extracelulare influen"eaz! evenimentele intracelulare.

SLIDE 16. Structura &i func%ia complexului porilor nucleari
Figura. Complexul porului nuclear, model schematic (dup! Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)
nveli#ul nuclear este o barier! care separ! dou! din cele mai importante
compartimente ale celulei, nucleul #i citoplasma, porii fiind por"i n aceast! barier!.
Contrar membranei plasmatice, care mpiedic! trecerea macromoleculelor ntre
citoplasm! #i spa"iul extracelular, anvelopa nuclear! este un centru activ pentru ARN
#i proteinele care se deplaseaz! n cele dou! sensuri, ntre compartimentele pe care
aceasta le separ!. Replicarea #i transcrip"ia materialului genetic, care au loc n nucleu,
necesit! participarea unui mare num!r de proteine care se sintetizeaz! n citoplasm! #i
sunt transportate prin nveli#ul nuclear. Invers, moleculele de ARNm, ARNt #i
subunit!"ile ribozomilor care sunt fabricate n nucleu trebuie s! fie transportate prin
membrana nuclear!.
Anumite elemente, cum sunt moleculele ARNsn (ARN small nuclear), se
deplaseaz! n cele dou! direc"ii. Acestea sunt sintetizate n nucleu, se asambleaz! n
particule ribonucleoproteice (RNP), n citoplasm!, #i sunt reimportate n nucleu unde
intervin n maturarea ARNm. Acest trafic intens se realizeaz! prin porii nucleari.
$innd seama c! particule materiale, de talia subunit!"ilor ribozomale, pot s! treac!
prin porii nucleari, putem presupune c! ace#tia sunt canale deschise dar, de fapt, este
exact contrar. Porii nucleari con"in un aparat complex, n form! de co#, numit
Complexul Porului Nuclear (CPN) care obtureaz! porul ca un dop #i care se reliefeaz!
n afar! n citoplasm! #i n nucleoplasm!. Structura CPN este prezentat! n modelul
schematic din figura din Slide 16 #i n micrografiile electronice din Slide 17.

SLIDE 17. Porul nuclear-imagini de microscopie electronic$
Figura Anvelopa nuclear! a ovocitelor de Xenopus vizualizat! prin microscopie electronic!:
a) fa#a citoplasmatic! a complexului porului nuclear (CPN); b) fa#a nucleoplasmatic! a
anvelopei nucleare dup! ndep!rtarea membranei nucleare a CPN, eviden#iind structura sub
form! de co"; c) fa#a nucleoplasmatic! a anvelopei nucleare dup! ndep!rtarea membranei
nucleare prin tratament blnd cu detergent. Re#eaua laminar!, care se insereaz! n inelul
nuclear al NPC, este expus! dup! acest tratament (dup! Molecular Cell Biology Lodish H., et.
al., 2000)
CPN este un enorm complex molecular cu simetrie octogonal! care se
estimeaz! c! are n structur! 100 la 200 polipeptide. Masa CPN este de aproximativ
30 ori mai mare dect masa unui ribozom. Structura molecular! a complexului CPN a
fost determinat! de-a lungul timpului gra"ie tehnicilor de microscopie electronic! #i de
analiz! de imagini din ce n ce mai performante. Dac! sunt injectate solu"ii, ale
moleculelor cu mas! molecular! mic!, n citoplasma unei celule acestea pot penetra
rapid n porii nucleari prin simpl! difuzie. Experimentul sugereaz! c! aceste substan"e
sunt capabile s! treac! printre fantele existente ntre razele co#ului.
13
Capacitatea moleculelor mai mari (proteine #i nucleoproteine) de a trece din
citoplasm! n nucleu depinde de sediul lor obi#nuit de reziden"!, n nucleu sau n afara
acestuia. De exemplu, dac! o protein! citoplasmatic!, cum este albumina seric!
bovin!, este marcat! radioactiv #i injectat! n citoplasm!, ea are tendin"a de a r!mne
acolo. Din contr!, dac! injectarea este realizat! cu o protein! cu localizare nuclear!,
nucleoplasmina, proteina marcat! va fi reg!sit! imediat n nucleu.

SLIDE 18. Mecanisme de transport
n 1982, Robert Laskey #i colaboratorii s!i de la Medical Research Council,
Anglia, au descoperit c! nucleoplasmina, una dintre cele mai abundente proteine
nucleare din ovocitele de amfibieni, con"ine o secven"! de aminoacizi n apropierea
extremit!"ii C terminale care func"ioneaz! ca un Semnal de Localizare Nuclear!
(SLN), care i permite s! treac! prin porii nucleari #i s! intre n nucleu. De atunci au
fost identificate o serie de alte SLN, cea mai mare parte a acestora fiind constituite din
scurte secven"e de aminoacizi cu sarcin! pozitiv!. n principiu, orientarea (adresarea)
proteinelor c!tre nucleu este asem!n!toare cu transportul altor proteine care sunt
distribuite n anumite organite, de tipul mitocondriei sau peroxizomilor. n toate
cazurile, proteinele posed! o etichet! specific! care este recunoscut! de c!tre un
receptor particular de la suprafa"a organitului "int!.
Importul proteinelor n nucleu trece prin mai multe etape: i) proteina care
trebuie importat! se cupleaz! cu un receptor pentru SLN care pare a fi localizat la
suprafa"a filamentelor dep!rtate de inelul extern al porului c!tre citoplasm!; ii)
interac"ia ntre proteina nuclear! #i receptorul pentru SLN permite acostarea proteinei
pe fa"a citoplasmatic! a complexului porului nuclear prin formarea unui complex de
transport; iii) deplasarea complexului de transport prin por necesit! energie eliberat!
din hidroliza ATP. Aceasta implic! o modificare a conforma"iei transportorului,
structur! mare n form! de dop (inel intern) situat! n centrul complexului porului
nuclear. Modificarea de conforma"ie deschide un canal n centrul transportorului #i
permite moleculelor situate n proximitatea acestuia s! p!trund! n nucleoplasm!.
Dup! acela#i principiu, substan"ele care trec din nucleu n citoplasm! declan#eaz!,
probabil, deschiderea transportorului n sens invers.
n figura este prezentat un model schematic de import nuclear al unei proteine
(cargo) dup! cuplarea acesteia cu semnalul de localizare nuclear! (SLN). n
citoplasm!, importinele % #i & interac"ioneaz! cooperativ cu proteina cargo care
urmeaz! a fi transportat!, prin legarea importinei % la SLN. Subunitatea importinei %,
din complexul cargo trimeric rezultat, interac"ioneaz! cu componentele CPN,
translocnd complexul n nucleoplasm! prin mecanisme destul de pu"in cunoscute.
Aceast! translocare necesit! hidroliza ATP. n nucleoplasm!, Ran-GTP
interac"ioneaz! cu importina &, determinnd disocierea complexului cargo #i elibernd
proteina transportat! n nucleoplasm!. Pentru a sus"ine un alt ciclu de import,
importina % monomer! #i complexul importin! &-Ran-GTP sunt transportate napoi n
citoplasm!. Proteina de activare RanGAP (Ran GTP activating protein), din
citoplasm!, stimuleaz! transformarea Ran-GTP la Ran-GDP avnd drept rezultat o
transformare conforma"ional! la nivelul Ran care determin! disocierea de importina &.
Importina & liber! interac"ioneaz! apoi cu importina % #i se formeaz! un nou complex
cargo purt!tor al unui semnal bazic SLN, care ini"iaz! un alt ciclu de import nuclear.
Se presupune c! Ran-GDP este #i el translocat prin porii nucleari din citoplasm! n
nucleoplasm!, unde factorul nucleotidic de schimb, Ran (RCC1), determin! eliberarea
GDP #i relegarea GTP.

14
SLIDE 19. Influen%a semnalului de localizare nuclear$
Un por nuclear individual este capabil s! importe proteine #i s! exporte ARN
#i ribonucleoproteine. Acest transport bidirec"ional poate fi vizualizat prin
microscopie electronic!. De asemenea, tendin"a de acumulare n unul dintre cele dou!
compartimente celulare a unor proteine purt!toare de semnale de localizare n
citoplasm! sau n nucleu poate fi vizualizat! prin microscopie de fluorescen"! sau
confocal!.
Semnalul de Localizare Nuclear! (SLN) al antigenului T (SV40) poate
direc"iona o protein! citoplasmatic! n nucleu:
a) piruvat kinaza normal!, localizat! n citoplasm!, vizualizat! prin
imunofluorescen"! dup! tratarea celulelor n cultur! cu un anticorp specific;
b) piruvat kinaza himer!, care con"ine un semnal SNL al SV40 la cap!tul s!u
N-terminal, este direc"ionat! c!tre nucleu. Proteina himer! a fost exprimat! n urma
transfec"iei unei gene modificate produs! prin fuziunea unui fragment al unei gene
virale care codific! NLS al SV40 cu gena piruvat kinazei (dup! Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000).

SLIDE 20. Matricea nuclear$
Figura. Localizarea situsurilor de sintez! "i de maturare a pre-ARN cu sonde
fluorescente: a) vizualizarea procesului de transcrip#ie prin colorare cu DAPI pentru
eviden#ierea genei "i cu anticorpi fa#! de heterogen nuclear ribonucleoproteine,
marca#i cu fluorescein!; b) eviden#ierea procesului de poliadenilare prin colorare cu
poli-dT marcat! cu rodamin! "i cu DAPI pentru eviden#ierea ADN; c) eviden#ierea
splicingului prin utilizarea de anticorpi monoclonali, fa#! de proteina de splicing
SC-35, marca#i cu fluorescein!
Nucleul este un organit organizat
Speciali#tii n biologie celular! se bazeaz! mult pe studiile biochimice pentru a
n"elege activit!"ile nucleului. Cu toate c! acestea furnizeaz! un num!r mare de
informa"ii, distrug toate structurile moleculare organizate care pot exista n nucleu #i
dau impresia c! acesta nu este dect un sac de elemente repartizate la ntmplare. n
acela#i timp, o serie de studii de microscopie ne fac s! realiz!m c! nucleul este n
realitate un compartiment foarte organizat. De exemplu, fibrele de cromatin!, care
compun un cromozom interfazic, nu sunt dispersate n tot nucleul, cum am putea
crede, ci ele sunt concentrate ntr-un domeniu specific care nu se suprapune deloc cu
domeniile altor cromozomi.
Interac"iunile ntre extremit!"ile cromozomilor #i anvelopa nuclear! reprezint!
un alt mod de organizare a cromozomilor n nucleu. Aceast! asociere este evident!
mai ales n meioz!, cnd cromozomii pot s! se ndep!rteze de anvelopa nuclear! #i s!
formeze un buchet.
De mai bine de treizeci de ani se #tie c! ARN ribozomal este sintetizat n
nucleol, dar se consider! c! celelalte molecule de ARN, #i mai ales ARNm se
asamblau n tot nucleul. Cercet!rile ultimilor zece ani au demonstrat clar c!
moleculele de ARNm sunt sintetizate ntr-un num!r limitat de situsuri discrete situate
n ntregul nucleu. Dac! sunt identificate cu ajutorul unor sonde marcate fluorescent,
situsurile de sintez! #i de maturare a moleculelor de pre-ARNm apar sub forma unor
pete str!lucitoare n nucleoplasma nemarcat!. Fiecare din cele 20 la 50 de pete
observate ntr-un anumit nucleu reprezint! situsul sintezei mai multor molecule de
ARNm diferite. Diferitele elemente ale nucleului sunt organizate n acest
compartiment printr-o re"ea interactiv! complex! de filamente care compun matricea
nuclear!.
15
Proba cea mai clar! privind importan"a matricei nucleare a fost furnizat! de o
serie de cercet!ri efectuate n laboratorul lui Jeanne Lawrence de la Universitatea din
Massachusetts. Utiliznd hibridizarea fluorescent!, in situ, pentru a identifica
localizarea secven"elor specifice de ADN sau ARN. Lawrence #i colaboratorii s!i au
constatat c! moleculele de ARN transcrise, pornind de la o anumit! gen!, apar ca o
tren! ntr-o serie limitat! de nuclee. Trena fluorescent! apare datorit! prezen"ei mai
multor sute de molecule de pre-ARNm transcrise pornind de la o singur! gen!.
Concentrarea transcrip"ilor ntr-un loc limitat ne sugereaz! c! ace#tia nu sunt liberi s!
difuzeze plecnd de la ADN de pe care au fost transcri#i. Se pare c! ace#tia sunt
men"inu"i stabili de unele dintre elementele nucleului pe toat! perioada matur!rii lor.
Dac! nucleele sunt tratate cu detergen"i #i cu s!ruri concentrate, practic toate
moleculele de pre-ARNm care au fost transcrise r!mn asociate matricei nucleare
reziduale. De fapt, urmele de ARNm fluorescente care au fost observate nainte de
extrac"ia dintr-un anumit nucleu #i p!streaz! exact pozi"ia #i dup! extrac"ie, deoarece
moleculele de ARNm nou formate sunt asociate elementelor matricei celulare. De
asemenea, orientarea trenelor sugereaz! c! moleculele de ARN p!r!sesc locurile de
sintez! pentru a se localiza n situsuri mai apropiate de periferia nucleului. n cursul
deplas!rii moleculelor de ARNm fa"! de gena de la care sunt sintetizate, intronii sunt
elimina"i din structura transcrip"ilor prin mecanismul de splicing. Orientarea trenei,
dinspre interiorul nucleului c!tre periferia sa, este compatibil! cu un model n care
matri"a nuclear! ghideaz! moleculele de ARN, n curs de maturare, de la locul n care
sunt transcrise c!tre porii nucleari pentru a ie#i din nucleu.

SLIDE 21. Matricea nuclear
Figura. Matricea nuclear!: a) micrografie electronic! a unui nucleu izolat n
prezen#! de detergen#i "i s!ruri 2M; b) micrografie electronic! a unei regiuni de
fibroblast de "oarece n urma tratamentului cu detergent "i nl!turare a cromatinei "i
ADN
Cnd nucleele izolate sunt tratate cu detergen"i anionici #i o concentra"ie
crescut! de s!ruri (NaCl 2M), pentru a extrage lipidele #i aproape toate proteinele
histonice #i nehistonice ale cromatinei, ADN apare ca un halou care nconjoar! un
centru nuclear rezidual. Dac! fibrele de ADN sunt apoi digerate cu nucleaz!, r!mne
o structur! care p!streaz! forma nucleului de origine, dar ea este compus! din fibrile
proteice sub"iri care se ncruci#eaz! pe suprafa"a spa"iului nuclear. Aceast! re"ea
fibrilar! insolubil! este matricea nuclear!
Matricea nuclear! nu este numai un schelet care men"ine forma nucleului sau
un e#afodaj pe care se organizeaz! buclele de cromatin!; ea serve#te #i n vederea
fix!rii pentru mecanismele care intervin n diferite activit!"i ale nucleului, cum sunt
transcrip"ia, maturarea ARN #i replicarea. De exemplu, dac! celulele sunt incubate n
prezen"! de precursori radioactivi ai ARN sau ADN n timpul unei scurte perioade,
g!sim c! aproape to"i acizii nucleici sintetiza"i sunt asocia"i fibrilelor matricei
nucleare.




SLIDE 22. Cromozomii. Structura cromozomului mitotic
16
Figura. Compara#ie ntre starea cromatinei n interfaz! "i a cromatinei compactate n
mitoz!: a) micrografie electronic! prezentnd starea dispersat! a cromatinei n
interfaz!; b) micrografie electronic! a unui cromozom mitotic (dup! Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)
Cromozomii se individualizeaz! structural la nceputul mitozei #i par s!
dispar! din nou la sfr#itul acesteia. Ace#tia sunt constitui"i dintr-un complex de
ADN #i proteine numit cromatin!. Cromatina exist! n diverse st!ri n diferite faze ale
ciclului celular. Cromozomii sunt mult mai scur"i dect lungimea moleculelor de
ADN pe care le con"in. n medie, un cromozom uman con"ine o molecul! de ADN de
aproximativ 5 cm. Compactarea acestui material genetic, n structura cromozomului,
presupune existen"a unui sistem organizat de mpachetare care s! permit! totu#i
func"ionarea genomului #i exprimarea genelor. Observate la microscopul electronic,
cea mai mare parte a organitelor intracelulare prezint! o structur! care ne ofer!
informa"ii interesante despre func"ia lor. Totu#i, micrografiile electronice ale
preparatelor fine ale nucleului ofer! destul de pu"ine informa"ii privind natura
cromozomilor n interfaz!. n aceast! etap!, cromozomii sunt mult mai pu"in vizibili
deoarece cromatina se afl! ntr-o stare mai relaxat!.

SLIDE 23. Imagine electrono-microscopic$ a unui cromozom uman n
metafaz$
Cromozomii eucariotelor, care constau ntr-un complex de ADN, ARN #i
proteine numit cromatin!, sunt entit!"i dinamice a c!ror aparen"! variaz! considerabil
#i dramatic cu stagiul ciclului celular. Cromozomii individuali se pot eviden"ia sub
form! condensat! numai n timpul diviziunii celulare (faza M a ciclului celular). n
timpul interfazei, care formeaz! restul ciclului celular, cnd cromozomii sunt
transcri#i #i replica"i, cromozomii majorit!"ii celulelor devin foarte dispersa"i.
Nucleul Celular
n ciuda importan"ei sale pentru stocarea #i utilizarea informa"iei genetice,
nucleul celulei eucariote posed! o morfologie destul de comun!: con"inutul nuclear
reprezint! o mas! vscoas! amorf! de materie nchis! ntr-un nveli# nuclear complex.
n nucleul unei celule tipice, n interfaz! (nemitotic!), se eviden"iaz!:
i) cromozomii, prezen"i sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite,
cromatin!;
ii) matricea nuclear! care este format! dintr-o re"ea fibrilar! care con"ine
proteine;
iii) unul sau mai mul"i nucleoli, care sunt structuri amorfe opace la electronii
#i care intervin n sinteza ARN ribozomal #i n asamblarea ribozomilor;
iv) nucleoplasma, substan"! lichid! care con"ine toate componentele #i
elementele nucleului eucariot .
Cromozomii
Cromozomii par s! apar! la nceputul mitozei #i s! dispar! din nou dup!
mitoz!, punnd astfel citologilor una dintre nntreb!rile cele mai importante dar n
acela#i timp #i una dintre cele mai stimulante; care este natura cromozomilor n
celulele ne-mitotice. Observate la microscopul electronic, cea mai mare parte a
organitelor infracelulare demonstreaz! o structur! care ne ofer! informa"ii interesante
despre func"ia lor. Totu#i, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului
eviden"iaz! pu"ine informa"ii privind natura cromozomului n interfaz!.


mpachetarea genomului
17
O celul! uman! normal! con"ine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze
repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent! n num!rul diploid de
cromozomi ne-replica"i). Fiecare cromozom con"ine o singur! molecul! de continu!
de ADN; cu ct cromozomul este mai mare cu att mai lung este ADN pe care l
con"ine. Dat fiind c! fiecare pereche de baze ocup! aproximativ 0,34 nm dea lungul
moleculei de ADN, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de 2
metri. Pe de alt! parte, n celul!, ADN este unit prin cantit!"i mari de ap!
(aproximativ 6 molecule de ap! pentru fiecare pereche de baze), care #i acestea duc la
cre#terea volumului. ntrebarea care se ridic! este: cum este posibil! intrarea a 2 m de
ADN hidratat ntr-un nucleu al c!rui diametru nu dep!#e#te 10 m, asigurnd #i
accesul proteinelor #i enzimelor implicate n reglare. O alt! problem! la fel de
important! este modul n care molecula de ADN dintr-un cromozom este organizat!
pentru a nu se nnoda cu moleculele altor cromozomi. R!spunsul la toate aceste
probleme l g!sim n modul remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. De mult
timp se #tie c! cromozomii sunt compu#i din fibre, numite cromatin!, formate din
ADN #i din proteine asociate. Proteinele din structura cromatinei sunt n general
mp!r"ite n dou! grupe principale: histonele #i proteinele cromozomale nehistonice.
Histonele reprezint! o colec"ie de mici proteine bazice bine definite n timp ce
nonhistonele con"in un num!r mare de proteine diferite: structurale, enzimatice #i
reglatoare, dintre care cea mai mare parte nu au fost nc! caracterizate. Cromatina mai
con"ine #i un procentaj sc!zut de ARN compus n principal din catene de ARN n
formare in diferite stadii de maturare #i din ARNsn care intervine n procesul de
splicing al ARNm.

SLIDE 24. Centromeri/Telomeri
Figura. Hibridizarea fluorescent! n situ (FISH) "i aplica#iile ei: a) utilizarea de
sonde fluorescente pentru marcarea regiunii centromerice a cromozomului 16; b)
exemplu de cariotip spectral; c) eviden#ierea prezen#ei telomerilor la cromozomi de
"oarece (adaptat dup! Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
Centromerii.
Se poate remarca c!ci to"i cromozomii reprezenta"i n figur! posed! un situs
unde suprafa"a lor exterioar! este net r!scroit! (scobit!). Aceast! scobitur! reprezint!
centromerul cromozomului. Mai sus am ar!tat c! centromerii con"in heterocromatin!
constitutiv!. Centrometrii cromozomilor umani con"in o secven"! lung! de
aproximativ 170 nucleotide (ADN satelit !) dispuse n tandem #i repetate de 2 000 la
30 000 ori per centromer. ADN centromeric fixeaz! proteine specifice, ntre altele
cele care servesc drept situs de fixare microtubulilor care separ! cromozomii n
timpul diviziunii mitotice.

SLIDE 25. Telomerii
Figura. Completarea capetelor ADN de c!tre telomeraz!: a) procesul de replicare "i
eviden#ierea form!rii capetelor incomplete ale cromozomilor pentru catena
ntrziat!; b) mecanismul de ac#iune al telomerazei cu eviden#ierea motivelor
repetitive de la capetele cromozomilor
Telomerii
Cele dou! extremit!"i ale moleculei de ADN a fiec!rui cromozom posed! un
segment particular de secven"e repetitive numite telomeri, care formeaz! un coif la
fiecare cap!t al cromozomilor. La om telomerii posed! secven"e TTAGGG/AATCCC
repetitive de mii de ori. Contrar celor mai multe tipuri de secven"e repetitive, care
18
variaz! mult ntre specii, chiar dac! ele sunt nrudite #i apropiate, n cazul telomerilor
de la om #i de la toate vertebratele studiate pn! n prezent g!sim aceea#i secven"!
telomeric!. La alte organisme cum sunt protozoarele #i drojdiile, telomerii au secven"e
diferite dar, ca #i pentru vertebrate, o caten! este ntotdeauna bogat! n resturi de
guanozin! iar complementara sa n resturi de citozin!. Catena bogat! n G este
orientat! n sensul 5-3 c!tre extremitatea cromozomului #i dep!#e#te cu 12 la 15
nucleotide extremitatea catenei bogat! n C. Datorit! existen"ei acestui dezechilibru
catena bogat! n G formeaz! o scurt! coad! monocatenar! la cele dou! extremit!"i ale
cromozomului. Aceast! dispozi"ie persist! de la o genera"ie celular! la alta datorit!
unei enzime speciale, telomeraza, care poate ad!uga noi unit!"i repetitive la
extremitatea 3 a catenei bogate n G.
Telomeraza, ale c!rei propriet!"i au fost bine studiate de c!tre Elisabeth
Blackburn #i colegii s!i de la Universitatea din California, San Francisco, este o
transcriptaz! invers! care asambleaz! fragmente de ADN folosind o caten! (matri"!)
de ARN. Telomeraza este o enzim! foarte neobi#nuit! n sensul n care ARN care
serve#te drept model, face n realitate parte din enzim!. Secven"ele telomerice sunt #i
situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante:
i) sunt necesari replic!rii complete a cromozomului;
ii) protejeaz! cromozomii de nucleaze #i de alte influen"e destabilizatoare;
iii) mpiedic! fuziunea dintre extremit!"ile cromozomilor n procesele de
recombinare;
iv) faciliteaz! interac"iile dintre extremit!"ile cromozomilor #i anvelopa
nuclear! n anumite tipuri celulare.
De asemenea, telomerii #i activitatea telomerazei par s! fie unii dintre
principalii actori implica"i n procesul de mb!trnire. Celulele normale, n cultur!, nu
sunt capabile s! se divid! dect de un num!r limitat de ori nainte de a da semne de
mb!trnire #i de a muri n final. Dintre ipotezele propuse pentru a explica aceast!
observa"ie este #i scurtarea progresiv! a telomerilor. Experien"e recente sugereaz! alte
roluri. Celulele normale nu sunt capabile s! se divid! n cultur! dect de un num!r
limitat de ori nainte de a da semne de mb!trnire #i n final de a muri.
Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica aceast! observa"ie: cea mai
recent! este scurtarea progresiv! a telomerilor. Telomerii se scurteaz! deoarece cea
mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de telomeraze. Contrar celulelor
normale celulele canceroase nu nceteaz! s! creasc! n cultur!; spunem c! acestea
devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea contribui la imortalizarea
celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care conserv! lungimea telomerilor de-
a lungul genera"iilor. De fapt, o seri de cercet!ri au demonstrat c! un anumit num!r de
cancere la om au o activitate a telomerazei care nu poate fi eviden"iat! n celulele
normale. Aceast! descoperire a declan#at cercetarea inhibitorilor specifici ai acestei
enzime spernd c! ace#tia ar putea opri cre#terea anumitor tumori.

SLIDE 26. Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului
Figura. Schema general! a organiz!rii cromatinei cu eviden#ierea principalelor
nivele cunoscute de organizare (Campbell, et al., Biology 2002).
Imagine electrono-microscopic! a unui cromozom uman n metafaz!
Cromozomii eucariotelor, care constau ntr-un complex de ADN, ARN #i
proteine numit cromatin!, sunt entit!"i dinamice a c!ror aparen"! variaz! considerabil
#i dramatic cu stagiul ciclului celular. Cromozomii individuali se pot eviden"ia sub
form! condensat! numai n timpul diviziunii celulare (faza M a ciclului celular). n
19
timpul interfazei, care formeaz! restul ciclului celular, cnd cromozomii sunt
transcri#i #i replica"i, cromozomii majorit!"ii celulelor devin foarte dispersa"i.
Nucleul Celular
n ciuda importan"ei sale pentru stocarea #i utilizarea informa"iei genetice,
nucleul celulei eucariote posed! o morfologie destul de comun!: con"inutul nuclear
reprezint! o mas! vscoas! amorf! de materie nchis! ntr-un nveli# nuclear
complex.
n nucleul unei celule tipice, n interfaz! (nemitotic!), se eviden"iaz!:
i) cromozomii, prezen"i sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite,
cromatina;
ii) matricea nuclear! care este format! dintr-o re"ea fibrilar! care con"ine
proteine;
iii) unul sau mai mul"i nucleoli, care sunt structuri amorfe opace la electronii
#i care intervin n sinteza ARN ribozomal #i n asamblarea ribozomilor;
iv) nucleoplasma, substan"! lichid! care con"ine toate componentele #i
elementele nucleului eucariot .
Cromozomii
Cromozomii par s! apar! la nceputul mitozei #i s! dispar! din nou dup!
mitoz!, punnd astfel citologilor una dintre nntreb!rile cele mai importante dar n
acela#i timp #i una dintre cele mai stimulante; care este natura cromozomilor n
celulele ne-mitotice. Observate la microscopul electronic, cea mai mare parte a
organitelor infracelulare demonstreaz! o structur! care ne ofer! informa"ii interesante
despre func"ia lor. Totu#i, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului
eviden"iaz! pu"ine informa"ii privind natura cromozomului n interfaz! (fig 12.1a).
mpachetarea genomului
O celul! uman! normal! con"ine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze
repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent! n num!rul diploid de
cromozomi ne-replica"i). Fiecare cromozom con"ine o singur! molecul! de continu!
de ADN; cu ct cromozomul este mai mare cu att mai lung este ADN pe care l
con"ine. Dat fiind c! fiecare pereche de baze ocup! aproximativ 0,34 nm dea lungul
moleculei de ADN, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de 2
metri. Pe de alt! parte, n celul!, ADN este unit prin cantit!"i mari de ap!
(aproximativ 6 molecule de ap! pentru fiecare pereche de baze), care #i acestea duc la
cre#terea volumului. ntrebarea care se ridic! este: cum este posibil! intrarea a 2 m de
ADN hidratat ntr-un nucleu al c!rui diametru nu dep!#e#te 10 m, asigurnd #i
accesul proteinelor #i enzimelor implicate n reglare. O alt! problem! la fel de
important! este modul n care molecula de ADN dintr-un cromozom este organizat!
pentru a nu se nnoda cu moleculele altor cromozomi. R!spunsul la toate aceste
probleme l g!sim n modul remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. De mult
timp se #tie c! cromozomii sunt compu#i din fibre, numite cromatin!, formate din
ADN #i din proteine asociate. Proteinele din structura cromatinei sunt n general
mp!r"ite n dou! grupe principale: histonele #i proteinele cromozomale nehistonice.
Histonele reprezint! o colec"ie de mici proteine bazice bine definite n timp ce
nonhistonele con"in un num!r mare de proteine diferite: structurale, enzimatice #i
reglatoare, dintre care cea mai mare parte nu au fost nc! caracterizate. Cromatina mai
con"ine #i un procentaj sc!zut de ARN compus n principal din catene de ARN n
formare in diferite stadii de maturare #i din ARNsn care intervine n procesul de
splicing al ARNm.
20
In interfaz! cromozomii sunt sub forma unor fibre lungi de fibre de 30 nm sub
forma unui e#afod extins. In metafaz!, e#afodul este pliat intr-un helix #i apoi ntr-o
structur! mult mai compactat! a c!rei geometrie precis! nu a fost determinat!.


SLIDE 27. Un model de mpachetare a cromozomilor metafazici
Comentariu figura - in interfaz! cromozomii sunt sub forma unor fibre lungi de fibre
de 30 nm sub forma unui e"afod extins
In metafaz!, e"afodul este pliat intr-un helix "i apoi ntr-o structur! mult mai
compactat! a c!rei geometrie precis! nu a fost determinat!
O alt! problem! este modul n care un nucleu cu un diametru de 10 m poate
con"ine o cantitate de ADN a c!rei lungime este de 200 000 de ori mai mare dect
aceast! valoare. Formarea nucleozomilor reprezint! prima etap! important! a
procesului de condensare. Dac! ntinderea ar fi complet!, cele 200 perechi de baze ale
unui nucleozom individual de 10 nm diametru ar ocupa aproximativ de 70 nm, pentru
o valoare a planului nucleotidelor de 0,34 nm. n consecin"!, raportul c! de
condensare a ADN, din structura nucleozomilor este de aproximativ 7:1.
Nivelurile structurale superioare ale cromatinei.
Deci, cel mai redus nivel de organizare al cromatinei este r!sucirea moleculei
de ADN n jurul inimii nucleozomului #i are un de diametru 10 nm. Totu#i, cromatina
nu se g!se#te n celul! sub aceast! form! relativ r!sucit! de #irag de m!t!nii.
Micrografiile electronice ale sec"iunilor de nucleu relev! un um!r de pete minuscule
cu un diametru de aproximativ 30 nm care reprezint! sec"iuni transversale la nivelul
fibrelor de cromatin!. Dac! se separ! cromatina din nucleu, n prezen"a ionilor
divalen"i, se observ! prezen"a unor filamente de aceea#i grosime.
Structura acestui filament de 30 nm r!mne nc! un subiect discutabil. n
figur! este prezentat modelul solenoid de suprar!sucire a filamentului sub"ire al
nucleozomilor (10 nm) pentru a forma un filament de ordin superior, mai gros. Se
presupune c!, fibrele condensate se formeaz! prin mpachetarea nucleozomilor ntr-o
structur! spiralat! (aranjament solenoid) care con"ine #ase nucleozomi pentru fiecare
tur de r!sucire. Acest nivel suplimentar de organizare al cromatinei cre#te de #ase ori
raportul de condensare. Filamentul de 30 nm este conservat prin interac"iunea ntre
moleculele de histon! H1 ale nucleozomilor vecini.
Dac! sunt extrase selectiv moleculele H1, filamentele groase de cromatin! se
deruleaz! #i se transform! n m!rgele (m!t!nii) mai sub"iri #i mai nguste.
Read!ugarea histonei H1 restabile#te structura de ordin superior. Studii recente de
microscopie electronic! sugereaz! c! fibrele de 30 nm sunt mai pu"in uniforme dect
modelul solenoid imaginat. Cromatina condensat! poate fi de fapt foarte dinamic!
fiind format! din structuri par"ial depliate care se pot replia rapid n structuri
solenoide ocazionale.
Cromatina din regiunile cromozomiale care nu sunt transcrise frecvent este
predominant n forma condensat! de 30 nm, n timp ce regiunile transcrise activ se
consider! c! adopt! forma relaxat! de #irag de m!t!nii.
Urm!toarea etap! de condensare a ADN, n nucleu, o reprezint! organizarea
filamentelor de 30 nm ntr-o serie de bucle mari suprar!sucite. Se estimeaz! c! fiecare
bucl! con"ine ntre 10 #i 150 kilobaze ADN. Se pare c! acestea sunt fixate la baz! cu
proteine specifice printre care #i o topoizomeraz! de tip II care intervine pentru a
controla gradul de spiralizare al ADN la nivelul buclei. Topoizomeraza elibereaz!
moleculele de ADN dac! o bucl! se ncurc!. Buclele de ADN ar putea mp!r"i
genomul n domenii, fiecare con"innd un lot mic de gene care sunt exprimate
21
printr-un mecanism comun de reglare. Normal, buclele de cromatin! sunt etalate la
interiorul nucleului #i nu sunt vizibile, dar prezen"a lor poate fi eviden"iat! n anumite
circumstan"e. De exemplu, dac! trat!m cromozomii mitotici izola"i cu reactivi care
extrag histonele, putem observa c! ADN eliberat de histone se pliaz! sub form! de
bucle plecnd de la e#afodaj proteic, format din proteine nehistonice.

SLIDE 28. Cteva caracteristici ale histonelor
Figura: Secven#a aminoacizilor histonei H4 din timus de vi#el. Aceast! protein! de
102 aminoacizi posed! 25 de resturi de arginin! "i lizin!. Histona H4 de la maz!re
difer! de aceasta numai prin dou! resturi: Val 60 "i Lys 77. Aminoacizii sublinia#i
sunt subiectul unor modific!ri post-transla#ionale
Capul spermatozoidului este bogat n spermin! #i n spermidin! (de unde #i
numele acestor poliamine), #i n particular, pentru pe#ti, n protamine. Acestea sunt
polipeptide care nu dep!#esc 5 kDa (30-40 aminoacizi), foarte bazice datorit!
con"inutului ridicat de arginin!: 21 din cei 31 de aminoacizi ai clupeinei de hering
sunt reprezenta"i de arginin!. O parte (propor"ie) din aceste molecule este fixat! pe
ADN. (Se consider! c! protaminele se fixeaz! probabil la nivelul fosei mari
determinnd o conforma"ie cu o mare propor"ie de elice alfa. ADN plasat n capul
spermatozoizilor este cel mai condensat).
n celulele somatice, ADN este asociat n propor"ii egale cu proteine: histonele
(H) majoritare #i proteinele ne-histonice. Complexul nucleoproteic care rezult! #i
datoreaz! numele reac"iei sale cu coloran"i bazici. Cromatina este un #irag de
m!t!nii unde fiecare m!rgea, nucleozomul, reprezint! asocierea spa"ial! precis! a
dou! componente.
Nucleozomii
Uniformi #i repetitivi, se formeaz! prin r!sucirea sub form! de serpentin! a ADN pe
corpi sau nuclee de histone (figura 3.2).
1. Nucleul (inima) este o asociere cuaternar!, prin intermediul domeniului lor
hidrofob, format din 2 copii de histone H2a, H2b, H3 #i H4. Octamerul are aspectul
unui cilindru plat.
2. Prin formarea de leg!turi de hidrogen ntre resturile lor #i sarcinile negative ale
grup!rilor fosfat (din structura moleculei ADN), helixurile terminale ale histonelor H3
#i H4, se ajusteaz! strns la nivelul fosei mici a ADN. Ca rezultat, pe o lungime de
aproximativ 200 pb, dubla elice se contorsioneaz! la suprafa"a cilindrului sub forma
unei elice de stnga cu dou! suprar!suciri. Astfel mpachetat, ADN prezint! fosa
mare c!tre exterior, secven"ele bazelor fiind accesibile.
Regiunea format! din ADN de leg!tur! ntre fiecare nucleozom are lungime foarte
variabil! n func"ie de tipul celular (o la o sut! de perechi de baze).
3. Histona H1 intervine n determinarea gradului superior de organizare. Prin
conforma"ia sa ter"iar! cu trei domenii prinde nucleozomii ntre ei prin trei tipuri de
contacte prezentate n figur!: H1/ADN la intrare #i la ie#ire; H1/suprafa"a nucleului
(mai ales prin intermediul H2a); H1/H1 urm!toare.
ADN supra-r!sucit din nucleozom este protejat de ac"iunea hidrolitic! a
nucleazelor, n timp ce regiunile de leg!tur! dintre nucleozomi sunt foarte sensibile.
Cu toate c! supra-r!sucirea este foarte eficient! aceasta nu reprezint! dect
primul grad (nivel) de compactare necesar pentru ADN. Sunt necesare stivuiri n
coloane ale nucleozomilor #i formarea unor tururi (ture) complexe de ordin superior
ale cromatinei, pentru a ob"ine arhitectura final! a cromozomului.
Modific!rile post-traduc"ionale reversibile ale histonelor, pe de o parte, #i cele
ale bazelor, pe de alt! parte (metilarea), confer! suple"e moleculei. Acestea modific!
22
densitatea #i reparti"ia sarcinilor #i grup!rilor hidrofobe, moduleaz! interac"iile ADN-
histone #i histone-histone necesare adapt!rii cromozomului la func"iile sale. Citologii
au denumit heterocromatin!, regiunile foarte condensate #i eucromatin!, regiunile
mai difuze. Prima este inert!, iar n cea de a doua genele au capacitate de exprimare.

SLIDE 29. Structura nucleozomal$ core a octamerului histonic
Figura. Structura a fost modelat! ca urmare a studiilor cu raze X. Acela"i model al
structurii centrale a nucleozomului (core) fiind identificat! pozi#ia histonelor
n 1974, Roger Kornberg, de la Universitatea Harvard, a propus un nou tip de
structur! secundar! pentru cromatin! bazndu-se pe rezultatele digestiei cu nucleaze
asupra cromatinei din diferite surse. Ast!zi, se cunoa#te c! nucleozomii con"in o
particul! care constituie nucleul nucleozomului, compus din 146 perechi de baze de
ADN suprar!sucit, care face aproape dou! spire n jurul unui miez proteic central care
con"ine 8 molecule din patru histone: H2A, H2B, H3 #i H4. Particulele de nucleozomi
sunt unite unele de altele printr-un segment de ADN de leg!tur!, de lungime variabil!,
dar care are n general 60 de perechi de baze. ADN din structura unui nucleozom #i
din bra"ul de leg!tur! reprezint! aproximativ 200 de perechi de baze, ceea ce
corespunde valorii fragmentelor g!site n cursul primelor experien"e cu nucleaze.
Nucleele nucleozomilor, care au un diametru de aproximativ 10 nm, #i ADN de
leg!tur!, cu un diametru de 2 nm, apar pe micrografiile electronice asemeni unui
#irag de m!t!nii. Pentru fiecare nucleozom, o molecul! de histon! H1 este
pozi"ionat! n exteriorul nucleului fiind asociat! la cele dou! extremit!"i ale ADN care
intr! #i ies de pe suprafa"a complexului proteic. Dac! se realizeaz! eliminarea
selectiv! a moleculelor de histone H1, printr-un tratament al fibrelor cu solu"ii saline
de concentra"ie sc!zut!, cromatina cap!t! un aspect mult mai dezorganizat.
In general, resturile de aminoacizi bazici ale histonelor nucleului sunt grupate
la extremit!"ile moleculei, restul structurii p!strnd un caracter relativ hidrofob.
Aceast! separare convine perfect organiz!rii nucleozomului. Regiunile nenc!rcate #i
hidrofobe ale histonelor ocup! centrul particulei #i favorizeaz! agregarea ntr-un
nucleu strns. Por"iunile polare, bazice, ale moleculelor din nucleu formeaz! cozi
flexibile orientate c!tre exteriorul particulei, unde resturile nc!rcate pozitiv pot stabili
interac"ii ionice cu grup!rile fosfat negative din structura scheletului ADN. Cu toate
c!, molecula de ADN este strns asociat! nucleului format din histone prin suprafa"a
intern! a fibrei elicoidale, suprafa"a sa extern! r!mne expus! #i poate interac"iona cu
moleculele de reglare.
Studii de cristalografie cu raze X au demonstrat c! resturile nc!rcate pozitiv
sunt reunite sub form! de perechi la suprafa"a octamerului histonic. Situsurile pereche
formeaz! un fel de spiral! pe drumul pe care se presupune c! l urmeaz! elicea ADN
care nconjoar! nucleul nucleozomului. Acestea servesc drept puncte de fixare
pentru cele dou! catene ale helixului. Deoarece toate moleculele ADN, indiferent de
origine #i secven"a nucleotidic!, posed! un schelet riboz!-fosfat identic cu cel cu care
interac"ioneaz! histonele, nu trebuie s! ne surprind! extrema conservare a moleculelor
aminoacizilor din structura histonelor.
Dac! pentru spiralizarea a 200 de perechi de baze de ADN sunt necesare
aproximativ nou! molecule de histone, o celul! uman! care con"ine 6 miliarde de
perechi de baze de ADN, poate con"ine aproximativ 300 milioane de histone necesare
mpachet!rii primare a materialului genetic. Astfel se explic!, necesitatea unui num!r
mare de exemplare de gene care codific! pentru histone n celulele care se divid rapid.
Interac"ia dintre histone #i ADN este, n principal, de natur! structural! #i
relativ independent! de secven"a nucleotidic!. In vitro, un fragment de ADN care n
23
mod normal nu este asociat cu histone, cum este cazul bacteriofagilor sau a
polinucleotidelor bicatenare sintetice, formeaz! subunit!"i nucleozomale dac! este
incubat cu histone purificate care provin de la plante #i animale. Experien"ele de acest
tip ilustreaz! clar capacitatea de autoasamblare a nucleozomilor.
Chiar dac! asamblarea histonelor cu ADN nu depinde de secven"!, aceasta nu
semnific! neap!rat c! pentru o anumit! gen!, nucleele nucleozomilor sunt localizate
la situsuri aleatoare. De fapt, s-a demonstrat c! anumite p!r"i ale genelor manifest!
interac"iuni constante cu regiunile vecine. Exemplul prezentat n micrografia
electronic! din figur! demonstreaz! c! pe cromozomul virusului SV40 particulele
nucleozomale sunt distribuite periodic, cu excep"ia unei regiuni care este lipsit! de
asocierea cu histonele.

SLIDE 30. Structura n aminoacizi a histonei H4
Histonele
Valorile de pH acide sau s!rurile determin! dezorganizarea leg!turilor ionice
#i separ! cromatina n ADN #i frac"iune proteic!. Prin cromatografie de excluziune,
de schimb ionic sau prin electroforez! (tehnica SDS-PAGE n geluri cu porozitate
redus!), au fost identificate la nivelul frac"iilor proteice 5 specii de histone.
Punctele comune ale acestora sunt:
- m!rime mic! (au numai 100 la 200 de resturi de aminoacizi);
- con"inut bogat n aminoacizi bazici: arginina #i lizina reprezint! aproximativ 1/4 din
totalul de resturi. La valorile pH celular aceste proteine sunt nc!rcate pozitiv,
policationi;
- modific!rile post-traduc"ionale ale anumitor resturi, deci a aminoacizilor bazici, sunt
reversibile enzimatic: acetilare, metilare, fosforilare...;
- o structur! ter"iar! cu un grad nalt de helix !.
**: perioad! unitar! de evolu"ie: durata necesar! pentru o schimbare de 1% din
secven"! dup! divergen"a a dou! specii.
Studiile comparative de secven#e #i de structur! tridimensional! conduc la
divizarea familiei histonelor n dou! grupuri, heterogenitate care este subliniat! #i de
pozi"ia lor n nucleozom: H2, 3 #i 4 pe de o parte #i H1 pe de alt! parte.
De fapt, histonele H4 "i H3, #i ntr-un grad mai mic H2a #i H2b, sunt proteine
foarte conservate evolutiv. Se d! ntotdeauna exemplul frapant al histonei H4 de la
bovine #i de maz!re, ale c!ror secven"e nu difer! dect prin dou! resturi, aceste
diferen"e avnd influen"e pu"in perturbatoare: o Lys n locul unei arginine #i o Leu n
locul unei Val (doi aminoacizi hidrofobi). Exist! aceste diferen"e minore n condi"iile
n care acest animal #i aceast! plant! au suferit divergen"! acum un miliard de ani.
Structura histonei H1 este mult mai variabil! de la o specie la alta.
Structura ter#iar! a celor patru histone din primul grup demonstreaz! existen"a
a dou! domenii: un domeniu central globular, hidrofob; un domeniu N-terminal,
hidrofil, nc!rcat pozitiv #i flexibil.
Histona H1, mai lung!, posed! un al treilea domeniu la nivelul cap!tului C-
terminal, hidrofil #i flexibil.
Se consider! c! histona H1 se leag! la unuitate nucleozomal! de 166 pb. ADN
face dou! ture complete #i poate lega H1 la intrare #i la ie#ire de pe structura
nucleozomului. H1 se comport! ca o agrafa care reune#te cele dou! treceri.



24
SLIDE 31. Gel electroforeza SDS a unui amestec de histone H3 &i H4
Figura. Electroforeza n SDS a unui amestec de histome H3 "i H4 de la vi#el.
Histonele H3 "i H4 din timus de vi#el con#in toate benzile anticipate pentru tetramerul
(H3)
2
(H4)
2


SLIDE 32. Nucleosomii sunt complexe ADN-histone
Figura. Modelarea structurii nucleozomului.
^*$(/W&8(3&( 1&.2*-'-# &-/(3#28
Dup! cum am eviden"iat mai sus, o celul! uman! normal! con"ine aproximativ
6 miliarde de perechi de baze repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent!
n num!rul diploid de cromozomi ne-replica"i). Fiecare cromozom con"ine o singur!
molecul! continu! de ADN. Cu ct cromozomul este mai mare cu att este mai lung!
molecula de ADN pe care o con"ine. Deoarece fiecare pereche de baze ocup!
aproximativ 0,34 nm, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de
2 metri. De asemenea, n celul!, ADN este hidratat cu cantit!"i importante de ap!
(aproximativ 6 molecule de ap! pentru fiecare pereche de baze), care #i acestea duc la
cre#terea volumului. Problema cheie a fost identificarea modalit!"ilor prin care este
posibil! localizarea a 2m de ADN hidratat ntr-un nucleu al c!rui diametru nu
dep!#e#te 10 m, asigurnd n acela#i timp, accesul proteinelor #i enzimelor implicate
n procesele de reglare. O alt! problem!, la fel de important!, se refer! la modul n
care molecula de ADN, dintr-un cromozom, este organizat! pentru a nu se nnoda cu
moleculele altor cromozomi. R!spunsurile la toate aceste probleme l g!sim n modul
remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. Se cunoa#te de mult timp c! fibrele
care formeaz! cromatina, #i intr! n structura cromozomilor, sunt formate din ADN n
asociere cu proteine. Proteinele din structura cromatinei sunt mp!r"ite n dou! grupe
principale: histonele #i proteinele cromozomiale nehistonice. Histonele reprezint! o
colec"ie de mici proteine bazice bine definite, n timp ce proteinele nehistonice sunt
compuse dintr-un num!r mare de proteine diferite cu rol structural, enzimatic #i
reglator. Cromatina mai con"ine #i un procentaj sc!zut de ARN compus, n principal,
din catene de ARNhn in diferite stadii de maturare #i din ARNsn care intervine n
procesul de splicing al ARNm.
n celulele eucariote, unitatea de baz! a organiz!rii cromatinei este
nucleozomul. Acesta reprezint! o entitate n care 146 pb sunt r!sucite n dou! ture de
super-elice stng! n jurul unui octamer de histone care con"ine cte dou! exemplare
din moleculele H2A, H2B, H3 #i H4. Nucleozomii sunt organiza"i n filamente de 10
nm n diametru prin interac"iuni cu histona H1, care se leg! la ADN care intr! #i iese
din nucleozom. Un al treilea nivel de organizare este ob"inut prin r!sucirea unui
filament de 10 nm ntr-o elice care con"ine 6 nucleotide pe tur, cu formarea unui
solenoid cu un diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt
realizate prin condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri
sunt mai pu"in cunoscute.
Microscopia electronic! a furnizat dovezi decisive privind organizarea
cromatinei n regiuni, bucle #i domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o
matrice bogat! n proteine. Fiecare bucl! pare s! aib! doar o singur! origine de
replicare #i s! se comporte ca o unitate de replicare. Buclele, sunt unit!"i de supra-
r!sucire independente, structura topologic! a fiec!reia fiind independent! de starea
celorlalte. Se pare c! acest lucru este posibil datorit! fix!rii extremit!"ilor buclelor n
matrice. Cu toate c! fiecare bucl! con"ine mai multe unit!"i de transcrip"ie, activitatea
ntregii regiuni poate fi coordonat! pentru a fi reprimat! sau poten"ial activat!.
25
Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului
mpachetarea precis! a ADN de la eucariote depinde de histone, grup
remarcabil de proteine bazice care se mparte n cinci subgrupe, n principal n func"ie
de con"inutul lor n lizin! #i arginin! care reprezint! aproximativ ' din totalul
aminoacizilor. La pH fiziologic, aceste proteine sunt nc!rcate pozitiv #i posed! o
structur! ter"iar! cu un grad mare de elice alfa. Aminoacizii bazici din structur! sufer!
modific!ri post-traduc"ionale (acetilare, metilare, fosforilare) reversibile enzimatic.
Studiile comparative de secven"! #i de structur! tridimensional! au condus la
divizarea familiei histonelor n dou! grupuri: H2A, H2B, H3 #i H4 pe de o parte #i H1
pe de alt! parte. Aceast! eterogenitate este subliniat! #i de pozi"ia lor n nucleozom.
De fapt, histonele H4 #i H3, #i ntr-un grad mai mic H2A #i H2B, sunt proteine
foarte conservate evolutiv. Exemplul cel mai frapant este al histonei H4 de la bovine
#i de la maz!re, care au acela#i num!r de aminoacizi (102) #i ale c!ror secven"e
primare nu difer! dect prin doi aminoacizi: o lizin! n locul unei arginine #i o leucin!
n locul unei valine. Aceste diferen"e minore sunt prezente n condi"iile n care
divergen"a dintre animal #i plant! s-a produs acum un miliard de ani. Structura
histonei H1 este mult mai variabil! de la o specie la alta. Aceast! conservare extrem!
sugereaz! c! to"i aminoacizii au un rol bine definit n func"ionarea proteinei.
Structura ter"iar! a histonelor din primul grup demonstreaz! existen"a a dou!
domenii: un domeniu central globular, hidrofob #i un domeniu N-terminal, hidrofil,
nc!rcat pozitiv #i flexibil. Histona H1, mai lung!, posed! un al treilea domeniu la
nivelul cap!tului C-terminal, hidrofil #i flexibil.
La nceputul anilor 1970, s-a putut observa c! n urma tratamentului
cromatinei, cu nucleaze nespecifice, cea mai mare parte a ADN era transformat! n
fragmente de aproximativ 200 perechi de baze sau n multipli ai acestora.
Din contr!, acela#i tratament aplicat moleculelor de ADN nud determin!
ob"inerea unei popula"ii de fragmente de m!rimi aleatoare. Aceast! descoperire i-a
f!cut pe cercet!tori s! considere c! fragmentele uniforme de ADN cromozomial erau
protejate de atac enzimatic probabil prin asocierea lor periodic! cu o protein!.

SLIDE 33. Structura &i dimensiunile nucleozomilor
Figura. Structura "i dimensiunile nucleozomilor: a) sedimentarea nucleozomilor n
gradient de sucroz! duce la ob#inerea unei serii de picuri care corespund formelor
monomere, dimere, trimere, etc., ale nucleozomilor; b) ADN extras din frac#iile
individuale este supus electroforezei mpreun! cu un martor ADN digerat cu
nucleaze; c) micrografie electronic! a cromatinei eliberat! dintr-un nucleu al unei
celule de Drosophila. Se observ! c! fibrele de cromatin! sunt formate din nucleozomi
conecta#i ntre ei prin segmente scurte de ADN; d) schem! care demonstreaz!
structura unei particule nucleozomale cu o molecul! de histon! H1 asociat!; e)
electroforez! n SDS a unui amestec de histone H3 "i H4 din timus de vi#el. Se
observ! toate benzile corespunz!toare componentelor tetramerului (H3)2(H4)2

SLIDE 34. Modul de legare al histonei H1 n structura nucleosomului
Figura. Dou! ture complete ale moleculei de ADN sunt conectate prin legarea
histonei H1 care vine n contact cu molecula la capete "i n mijloc. Octamerul
histonic este reprezentat printr-o sfer!. Se consider! c! histona H1 se leag! la
unuitate nucleozomal! de 166 pb. ADN face dou! ture complete "i poate lega H1 la
intrare "i la ie"ire de pe structura nucleozomului. H1 se comport! ca o agrafa care
reune"te cele dou! treceri
26

SLIDE 35. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin$
condensat$ de 30 nm
Figura. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin! condensat! de 30
nm: a) micrografia "i modul de organizare a nucleozomilor din structur!; b)
micrografie prezentnd fibrele de 30 nm "i modelul de mpachetare solenoid cu
caracteristicile sale structurale (adaptat dup! Molecular Cell Biology Lodish H., et.
al., 2000)

SLIDE 36. Cromatina exist$ n forme condensate &i relaxate
Figura. Cromatina n form! condensat! "i relaxat!
a) Cromatina izolat! la putere ionic! sc!zut! apare sub forma unor lan#uri
de m!rgele. M!rgelele sunt nucleosomii cu un diametru de 10nm diametru
Cromatina izolat! in tampon cu putere inic! fiziologic! (o,15 M KCl) apare ca o
fibr! condensat! de 30nm diametru
Influen#e globale asupra expresiei genelor
Pn! n prezent aten"ia ne-a fost ndreptat! c!tre reglarea transcrip"iei genelor
#i asupra matur!rii transcrip"ilor primari. Viteza, momentul #i localizarea acestor
procese sunt determinate de c!tre proteinele care nu recunosc dect secven"e scurte de
ADN #i/sau suprafe"ele altor proteine. Aceste interac"ii influen"eaz! ini"ierea sau
terminarea transcrip"iei sau chiar maturarea transcrip"ilor. Prezen"a sau starea
func"ional! a acestor proteine sunt adesea determinantul principal al expresiei genelor.
Totu#i, este de asemenea evident c! modific!rile reversibile ale st!rii ADN pot
influen"a expresia genelor, #i n particular competen"a acestora n realizarea
transcrip"iei. De exemplu, modificarea gradului de superhelicitate a ADN, adic! a
st!rii sale topologice, #i modific!rile conforma"ionale care decurg din aceasta (de ex.
trecerea de la topologie B la Z sau la alte forme de ADN) pot influen"a puternic
activitatea de transcrip"ie. Starea cromatinei n care se g!se#te gena, n particular
gradul de compactare a nucleozomilor, adaug! un grad de complexitate suplimentar!
n exprimarea genelor. n general, activarea din timpul transcrip"iei este n raport cu
trecerea cromatinei de la o structur! foarte condensat! c!tre o form! derulat!, sau
form! deschis!. Activitatea de transcrip"ie este de asemenea influen"at! de c!tre
gradul de metilare a citozinei din structura dinucleotidului 5-CG-3. Reprimarea
transcrip"iei este adesea asociat! cu o hipermetilare la nivelul genei sau n apropierea
acesteia, activarea fiind nso"it! de demetilare.
Compactarea ADN
Unitatea de baz! a organiz!rii cromatinei n celulele eucariote este
nucleosomul, o entitate n care 145 pb sunt r!sucite n dou! ture de super-helix stng
n jurul unui octamer de histone care con"ine dou! exemplare din moleculele H2A,
H2B, H3 #i H4. Nucleozomii sunt organiza"i n filamente de 10 nm n diametru prin
interac"iuni cu hostona H1, legat! de ADN care intr! #i iese din nucleosom. Un al
treilea nivel de organizare este ob"inut prin r!sucirea unui filament de 10 nm ntr-o
elice care con"ine 6 nucleotide pe tur: este vorba de formarea unui solenoid cu un
diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate prin
condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai
pu"in cunoscute.
Microscopia electronic! a furnizat dovezi decisive privind faptul c! cromatina
este organizat! n regiuni, bucle #i domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare
pe o matrice bogat! n proteine. Fiecare bucl! pare s! aib! doar o singur! origine de
27
replicare #i s! se comporte ca o unitate de replicare. Buclele sunt unit!"i de supra-
r!sucire independente, structura lor topologic! fiind independent! de starea buclelor
vecine. Acest lucru este probabil posibil datorit! fix!rii extremit!"ilor buclelor n
matrice. Cu toate c! fiecare bucl! con"ine mai multe unit!"i de transcrip"ie, activitatea
ntregii regiuni poate fi coordonat! pentru a fi reprimat! sau poten"ial activ!.
Cromatina reprimat$.
Numeroase gene de la organismele eucariote multicelulare nu sunt exprimate
dect n anumite momente ale dezvolt!rii #i/sau n anumite "esuturi. Aceasta
semnific! c! celulele trebuie s! posede modalit!"i eficace pentru a reprima expresia
tuturor acestor gene care nu sunt caracteristice unui anumit tip de celule. Represarea
unor regiuni (blocuri) mari de gene prin limitarea disponobilit!"ii factorilor de
transcrip"ie este un mecanism destul de pu"in probabil pentru o astfel de reglare. Ideea
este sus"inut! de faptul c! genele care nu sunt exprimate n mod normal ntr-o celul!,
pot fi produse dac! sunt introduse n aceasta prin transfec"ie. De exemplu, genele
globinei, induse prin transfec"ie n fibroblaste, sunt exprimate de o mie de ori mai
puternic dect genele rezidente ale globinei; n plus aceast! diferen"! persist! n cursul
diviziunilor succesive dac! genele transfectate sunt integrate la nivelul unor situsuri
cromozomice. De fapt, acesta este un efect destul de obi#nuit dar nu universal, ca
genele transfectate s! aib! o activitate mai mare dect genele endogene. Este general
admis c! acest! represie este rezultatul sechestr!rii genelor silen"ioase n structuri
de cromatin! superior structurate care le fac inaccesibile ma#in!riei de transcrip"ie.
n absen"a informa"iei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este
imposbil de descris starea de tranzi"ie care separ! cromatinele reprimate #i exprimate.
O indica"ie este furnizat! prin corela"ia care exist! ntre momentul n care gena este
replicat! #i cel n care ea poate fi transcris!. Genele de men"inere, exprimate n
permanen"! n toate celulele, cum este cea pentru dihidrofolat-reductaz!, actin!
citoplasmatic! sau glucozo-6-fosfat dehidrogenaz!, sunt replicate n prima jum!tate a
fazei S; genele ne-exprimate tind s! fie replicate mai trziu. n plus, replicarea genelor
este precoce n "esuturile n care ele sunt exprimate #i trzie n "esuturile n care
acestea sunt silen"ioase. La fel, la mamifere, cromozomul X inactiv este replicat
dup! cromozomul X activ. Aceste corela"ii sugereaz! c! replicarea precoce creeaz! o
stare mai accesibil! ma#in!riei de transcrip"ie sau mai eficace pentru fixarea factorilor
de transcrip"ie.

SLIDE 37. Modelul solenoid al cromatinei condensate
Figura. =+*%0)0 <+0%,+#* *% +&>.,#2.&% . $#7&%0+& *% 1&+8.'#,3 1+,*%,<.'3 *% ?@ ,8- ./
8#1&+>&.$#. A# 8+*)0 *% +&>.,#2.&% . ,)10%+2+8#0+& *#, <'&)1')&36 7/ 8#1&+>&.$#%
(&%2%,'B,* $#7&%0% *% ?@ ,8 A# 8+*%0)0 *% C8(.1D%'.&% <+0%,+#* 1) 1.&.1'%&#<'#1#0% <.0%
<'&)1')&.0% E.*.('.' *)(3 =+0%1)0.& F%00 G#+0+>H I+*#<D J5K %'5 .05K L@@@/

SLIDE 38. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei
M#>)&.5 N#O%0)&#0% <'&)1')&.0% <)(%&#+.&% .0% 1&+8.'#,%#- ./ 8#1&+>&.$#% %0%1'&+,#13
(&%2%,'B,* *+8%,## *% 1&+8.'#,3K C, 7)10% 0. 1&+8+2+8## C, (%&#% #2+0.P# *#,'&Q),
+O+1#' *% .8$#7#.,6 7/ 8+*%0 *% <'&)1')&.&% . 7)10%0+& $#7&%0+& *% 1&+8.'#,3 *% ?@
,8 #8.>#,.' C, )&8. %9(%&#%,P%0+& *% D#7&#*.&% #, <#') 1) <+,*% E: 0. J/ <#').'% 0.
*#<'.,P% O.&#.7#0% (% :"N 0#,#.&6 1/ 8#1&+>&.$#% %0%1'&+,#13 . ),)# 1&+8+2+8
8%'.$.2#1 *#, 1%0)0% J%I.K 0#(<#' *% D#<'+,% 1. )&8.&% . ),)# '&.'.8%,' 8+*%&.' 1)
*%'%&>%,P#

28
Micrografia electronic! din figur! eviden"iaz! buclele lungi de ADN ancorate
la un schelet cromozomial compus din proteine nehistonice ob"inut prin ndep!rtarea
histonelor din structura cromozomilor din celule HeLa, n metafaz!. Acest e#afodaj
flexibil are forma cromozomului metafazic #i persist! chiar #i atunci cnd ADN este
digerat cu nucleaze.
Acela#i tip de bucle se pot eviden"ia n cromozomii politeni interfazici din
celulele insectelor #i n cromozomii meiotici n perie (lamp-brush) din ovocitele
de amfibieni, ceea ce demonstreaz! c! acestea nu sunt proprii cromozomilor mitotici.
O serie de experimente de hibridizare in situ, realizate pe celule umane n
interfaz!, utiliznd diferite sonde fluorescente, au dus la imaginarea modelului
prezentat. Astfel, s-a eviden"iat c! o serie de sonde (A la H) care recuno#teau secven"e
situate la milioane de perechi de baze distan"!, n structura ADN linear, erau
pozi"ionate foarte aproape unele de altele n structura cromozomului interfazic. Se
consider! c! apropierea dintre aceste situsuri, numite #i regiuni asociate scheletului
(denumite SARs de la scaffold-associated regions sau MARs de la matrix-
attachment regions) este posibil! datorit! asocierii lor la scheletul cromozomului. n
general, regiunile asociate scheletului se g!sesc ntre unit!"ile de transcrip"ie. Deci,
genele sunt localizate prioritar la nivelul buclelor de cromatin! ale c!ror baze sunt
ata#ate scheletului cromozomului.
Cromozomul mitotic reprezint! etap! ultim! de condensarea a cromatinei. De
obicei, un m de cromozom mitotic con"ine un cm de ADN. Aceast! condensare,
realizat! ca urmare a unui proces nc! pu"in cunoscut, este nso"it! de fosforilarea
practic a tuturor moleculelor de histone H1 la nivelul celor cinci resturi de serin! din
molecul!.

SLIDE 39. Demonstra%ie experimental$ a form$rii buclelor de
cromatin$ la cromozomii interfazici
M#>)&.5 J#7&#*#2.&%. #, <#') . 1%0)0%0+& C, #,'%&$.23 . $+<' &%.0#2.'3 1) *#$%&#P#
8.&R%&# $0)+&%<1%,P# E<+,*%/ <(%1#$#1# (%,'&) <%1O%,P% <%(.&.'% (&#, *#<'.,P%
1),+<1)'% (% 1&+8+2+8)0 0#,%.&5 I#'%&%0% *#, $#>)&3 &%(&%2#,'3 <+,*%0% 1.&% (+' $#
#*%,'#$#1.'% (&#, 1)0+.&%. 0+& *#$%&#'35 :1%<'%. .&.'3 13 <%1O%,P%0% : A# G 1.&% <),'
<%(.&.'% C,'&% %0% (&#,'&Q), 8#0#+, *% 7.2% <),' %O#*%,P#.'% C, ,)10%) 1. $##,* $+.&'%
.(&+(#.'%5 S#')&#0% :QM <),' <%(.&.'% *% 8#0#+.,% *% (%&%1D# *% 7.2% *% <%1O%,P%
0#,%.&% *.& <),' $#2#1 .(&+(#.'% ),%0% *% .0'%0% C, ,)10%)0 C, #,'%&$.23

SLIDE 40. Prezentare generala a structurii cromozomilor si genelor.
ADN de la eucariotele superioare consta in secvente unice si repetitive

SLIDE 41. Micrografie electronic$ a cromatinei la
Drosofila melanogaster
Fibrele de 100 A sunt separate de #nururi ntre nucleosomi

Cromatina n form$ condensat$ "i relaxat$
O imagine electronomicroscopic! a cromatinei de la Drophila melanogaster
eviden"iind fibrele de 100A care leag! nucleosomii ntre ei.
Topologia "i conforma#ia ADN



29
Influen%a super-helicit$%ii asupra regl$rii transcrip%iei
Numeroase observa"ii indic! c! expresia genelor eucariote este modulat! de
starea de super-helicitate a ADN. Muta"ii care afecteaz! topoizomerazele sau
inhibitorii acestora, care la rndul lor influen"eaz! starea de super-helicitate a ADN,
activeaz! transcrip"ia anumitor gene nhibnd expresia altora. Deoarece leg!tura
proteinelor cu ADN supra-r!sucit negativ este facilitat! printr-o modificare favorabil!
a energiei libere, #i este posibil ca varia"iile super-helicit!"ii ADN s! influen"eze
accesul ARN polimerazei sau a proteinelor activatoare sau represoare la secven"ele
reglatoare. Alter!rile st!rii de super-helicitate sau gradul de supra-r!sucire pot #i ele
s! afecteze replierea ADN #i astfel capacitatea sa de a interac"iona cu proteinele
implicate n transcrip"ie.
Am v!zut c! cromatina de la eucariote este organizat! ntr-o serie de bucle de
lungimi variabile, ale c!ror extremit!"i sunt ancorate n matricea proteic!. Aceast!
organizare confer! fiec!rei bucle o super-helicitate proprie #i independent! de cea a
buclelor vecine. Este interesant de re"inut c! topoizomeraza II, responsabil! de
relaxarea ADN supra-r!sucit este o protein! major! a structurii cromozomiale la care
sunt acro#ate buclele. Efectele negative sau pozitive asupra transcrip"iei structurilor
care se intercaleaz! n ADN sau inhib! topoizomerazele #i altereaz! astfel ntreaga
superhelicitate a ADN, au contribuit #i ele la no"iunea c! topologia ADN este un
parametru important, care guverneaz! reglarea transcrip"iei. Totu#i, absen"a
fenotipului care s! afecteze transcrip"ia la mutan"i de drojdii deficien"i n
topoizomeraza I sau II sugereaz! c!, dac! o activitate topoizomerazic! este necesar!
transcrip"iei ADN de la eucariote, una dintre aceste activit!"i poate fi suficient!.
Cea mai mare parte a indica"iilor care implic! topoizomeraze #i efectele lor
asupra topologiei ADN n reglarea transcrip"iei, sunt indirecte #i pu"in concludente.
De fapt, nu exist! nici o prob! pentru sau contra ideii c! modificarea super-helicit!"ii
unei bucle a cromozomului influen"eaz! activitatea de transcrip"ie a ntregii regiuni
sau a genelor care sunt localizate la acest nivel.
Conforma%iile B &i Z ale ADN &i transcrip%ia
ADN poate prezenta o conforma"ie de dreapta (B) sau de stnga (Z). La
echilibru propor"iile relative ale celor dou! forme sunt influen"ate de secven"ele de
ADN, superhelicitatea sa #i diversele condi"ii de mediu, cum sunt for"a ionic!,
temperatura #i prezen"a metalelor. n circumstan"e adecvate regiunile de dreapta #i se
stnga pot fi intercalate ntr-un segment de ADN. n acest caz, secven"ele situate la
jonc"iuni, sau apropiate de acestea, se comport! ca substrate anormale pentru diferite
enzime.
Cu toate c! formarea ADN-Z a fost stabilit! in vitro, de o varietate de metode
fizice, existen"a sa in vivo, fiind pn! de curnd problematic!. Prezen"a sa este acum
bine verificat! att n celule de pro #i eucariote. Cum a fost prev!zut, propor"ia de
ADN-Z este puternic influen"at!, in vivo, de c!tre gradul de super-helicitate al ADN.
Formarea sa este de asemenea favorizat! de secven"ele nucleotidice care con"in o
alternan"! de purine #i pirimidine. De exemplu, segmentele de secven"e repetitive
d(CA)n d(GT)n au tendin"a s! adopte conforma"ia Z. n plus, metilarea resturilor C n
semente care con"in o alternan"! de C #i G (5-CGCGCG-3) favorizeaz! conforma"ia
Z corespunz!toare situsurilor de hipersensibilitate prezente n regiunile de reglare ale
anumitor gene,
Proteinele care se fixeaz! specific la ADN-Z au fost identificate #i purificate.
Astfel, mai multe proteine care se fixeaz! la ADN-Z sunt asociate cu elementul
activator (enhancer) al promotorului regiunii precoce a SV40. Totu#i, n ciuda punerii
n eviden"! a segmentelor ADN-Z n sau n apropierea regiunilor de reglare astfel
30
nct proteinele care acopera aceast! structur!, rolul s!u n reglarea transcrip"iei
r!mne speculativ. n acest caz, o protein! care se leag! la ADN-Z a fost implicat! n
recombinarea ADN, dar rolurile conforma"iei ADN #i a proteinei n acest proces nu
sunt n"eledse.

SLIDE 42. Imagini electrono-microscopice ale cromatinei

SLIDE 43. Proteinele ne-histonice furnizeaz$ un schelet pe toat$
lungimea buclelor de cromatin$
Figura: Imagine electrono-microscopic! a cromozomilotr n metafaz! lipsi#i de
histone prepara"i din celulele HeLa prin tratament cu detergen"i. Se poate observa
prezen"a unor proteine ne-histonice care formeaz! un anumit tip de e#afodaj de-a
lungul buclelor de ADN extinse.
Masa totala a histonelor asociate cu ADN n cromatin! este aproximativ egal!
cu cea a ADN. Cromatina n interfaz! #i cromozomii n metafaz! con"in #i mici
cantit!"i dintr-un set complex de alte proteine. De exemplu, multi dintre factorii
transcrip"ionali au fost identificati ca fiind asociati cu cromatina din interfaz!.
Structura #i func"ia acestor proteine nehistonice critice, implicate n realizarea
transcrip"iei va fi detaliata mai departe. Alte proteine nehistonice pu"in abundente sunt
cele implicate in realizarea replic!rii.
Cteva proteine nehistonice sunt considerate a fi prezente n cantit!"i mai mari
dect factorii de transcrip"ie #i de replicare. Unele dintre acestea manifest! o
mobilitate electroforetic! mare #i au fost denumite: proteine HMG (high mobility
group). Cteva dintre aceste HMG se consider! c! se leag! cooperativ la ADN cu
factorii de transcrip"ie, stabiliznd complexele multi-proteice care regleaz!
transcrip"ia genelor nvecinate.

SLIDE 44. n timpul interfazei cromozomii umani r$mn plasa%i n
domenii specifice n nucleu.
Limfocitele fixate n interfaz! au fost hibridizate in situ cu sonde specifice
marcate cu biotin! pentru secven"e complementare cu lungimea ntregului cromozom
7 #i apoi vizualizate cu sistemul avidin! marcat! cu fluorescein!. n celulele diploide
prezentate n figur!, fiecare dintre cei doi cromozomi 7s este restric"ionat ntr-un
anumit teritoriu sau domeniu n interiorul nucleului mai degrab! dect s! fie
dispersate n ntregul nucleu.

SLIDE 45. Eviden%ierea heterocromatinei
Figura. Eviden"ierea heterocromatinei: a) micrografie electronic! a unei celule stem
din m!duva spin!rii. Regiunile nchise de la periferia nucleului #i din afara
nucleolului reprezint! heterocromatin!; b) prezen"a cromozomului X inactivat sub
forma corpusculului Barr ntr-o celul! de femeie

Heterocromatina "i eucromatina
Dup! terminarea mitozei, cea mai mare parte a cromatinei care compune
cromozomii mitotici foarte condensa"i se disperseaz! #i revine la starea sa interfazic!
difuz!. Totu#i, n cea mai mare parte a celulelor, aproximativ 10% din materialul
cromozomial #i p!streaz! forma condensat! compact! pe tot parcursul interfazei,
cromatina condensat! putnd fi eviden"iat! la periferia nucleului. Termenul de
heterocromatin! desemneaz! cromatina care r!mne condensat! n timpul interfazei
31
pentru a o distinge de eucromatina care desemneaz! starea dispersat!. Dac! celulele
sunt puse n prezen"a unui precursor ARN radiomarcat, la nivelul uridinei (uridin!
3
H), #i apoi fixate, sec"ionate #i observate dup! autoradiografie, se constat! c!
regiunile de heterocromatin! r!mn nemarcate deoarece acestea sunt pu"in transcrise
sau chiar netranscrise. Cercet!rile din ultimii ani demonstreaz! clar posibilitatea
trecerii reversibile dintr-o form! n alta, aceast! clasificare fiind mai degrab!
didactic!.
Numeroase gene de la eucariotele multicelulare nu sunt exprimate dect n
anumite momente ale dezvolt!rii #i/sau n anumite "esuturi. Deci, celulele trebuie s!
posede modalit!"i eficace pentru a reprima expresia tuturor genelor care nu sunt
caracteristice unui anumit tip de celul! ntr-o anumit! etap! a dezvolt!rii sale.
Represia unor blocuri mari de gene, prin limitarea disponibilit!"ii factoriilor de
transcrip"ie, este un mecanism destul de pu"in probabil pentru o astfel de reglare.
Ideea este sus"inut! de faptul c! unele gene, care nu sunt exprimate n mod normal
ntr-o celul!, pot fi transcrise dac! sunt introduse prin transfec"ie n aceasta. De
exemplu, genele globinei, induse prin transfec"ie n fibroblaste, sunt exprimate de o
mie de ori mai puternic dect genele rezidente ale globinei. Aceast! diferen"! persist!
n cursul diviziunilor succesive dac! genele transfectate sunt integrate la nivelul unor
situsuri cromozomiale. De fapt, posibilitatea ca genele transfectate s! aib! o activitate
mai mare dect genele endogene este un efect destul de obi#nuit dar nu universal. Este
general admis c! aceast! represie este rezultatul sechestr!rii genelor silen"ioase n
complexe de cromatin! superior structurate care le fac inaccesibile ma#in!riei de
transcrip"ie.
n absen"a informa"iei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este
imposibil de descris starea de tranzi"ie care separ! cromatinele reprimate #i exprimate.
O indica"ie este furnizat! de corela"ia care exist! ntre momentul n care gena este
replicat! #i cel n care ea poate fi transcris!. Genele de men"inere, exprimate n
permanen"! n toate celulele (exemplu: dihidrofolat-reductaz!, actin! citoplasmatic!,
glucozo-6-fosfat dehidrogenaza) sunt replicate n prima jum!tate a fazei S. n acela#i
context, genele neexprimate tind s! fie replicate mai trziu. De asemenea, replicarea
genelor este precoce n "esuturile n care ele sunt exprimate #i trzie n "esuturile n
care acestea sunt silen"ioase". DE exemplu, la mamifere cromozomul X inactiv este
replicat dup! cromozomul X activ. Aceste corela"ii sugereaz! c! replicarea precoce
creeaz! o stare mai accesibil! ma#in!riei de transcrip"ie crescnd eficien"a fix!rii
factorilor de transcrip"ie.
Heterocromatina
Heterocromatina poate fi divizat! n dou! categorii: constitutiv! #i facultativ!,
n func"ie de permanen"a st!rii condensate. Heterocromatina constitutiv! r!mne
condensat! tot timpul #i reprezint! regiunile din structura ADN care r!mn silen"ioase
permanent. n celulele de mamifere, cea mai mare parte a heterocromatinei
constitutive se g!se#te n apropierea centromerului tuturor cromozomilor #i n alte
cteva regiuni particulare, cum este bra"ul distal al cromozomului Y la masculi. La
multe plante, extremit!"ile cromozomului (telomerii) sunt #i ele formate din
heterocromatin! constitutiv!. n principal, ADN din structura heterocromatinei
constitutive este format din secven"e nalt repetitive #i se presupune c! este lipsit de
gene care codific! pentru proteine. Se consider! c!, heterocromatina con"ine elemente
a c!ror influen"! se face sim"it! la o anumit! distan"! #i poate afecta starea fiziologic!
a genelor nvecinate. Astfel, dac! unele gene active, care #i-au schimbat pozi"ia ca
urmare a unei transpozi"ii sau a unei transloc!ri, se afl! pozi"ionate n apropierea
32
heterocromatinei, ele prezint! tendin"a de a deveni inactive. Acest fenomen poart!
numele de efect de pozi"ionare.
Contrar formei constitutive, heterocromatina facultativ! este inactivat!
specific n cursul anumitor stadii de via"! ale organismului. Un exemplu tipic de
heterocromatin! facultativ! este furnizat de inactivarea unui cromozom X n celulele
femele de la mamifere. Celulele masculine au un mic cromozom Y #i un cromozom X
mult mai mare. Cromozomii X #i Y au pu"ine gene n comun astfel nct b!rba"ii nu
posed! dect un exemplar al genelor situate pe cromozomii sexuali. De#i, celulele de
la femele con"in doi cromozomi X, unul singur este func"ional n procesul de
transcrip"ie. Cel!lalt cromozom r!mne condensat sub forma unei mase de
heterocromatin!, numit corpuscul Barr, dup! numele cercet!torului care l-a descoperit
n anul 1949. Se consider! c!, producerea corpusculului Barr este un mecanism
normal, gra"ie c!ruia celulele femele #i mascule dispun de acela#i num!r de
cromozomi X activi #i sintetizeaz! cantit!"i echivalente de produ#i codifica"i de
genele situate pe cromozomul X.

SLIDE 46. Heterocromatin$ este compus$ din regiuni cromozomiale
ne-desf$&urate
Heterocromatina "i eucromatina - Dup! terminarea mitozei, cea mai mare parte a
cromatinei care compune cromozomii mitotici foarte condensa"i se disperseaz! #i
revine la starea sa interfazic! difuz!. n cea mai mare parte a celulelor totu#i,
aproximativ 10% din materialul cromozomic #i p!streaz! forma condensat! compact!
pe tot parcursul interfazei (aceast! cromatin! condensat! se vede la periferia
nucleoidului). Termenul de heterocromatin$ desemneaz! cromatina care r!mne
condensat! n timpul interfazei pentru a o distinge de eucromatin$ care desemneaz!
starea dispersat!. Dac! celulele sunt puse n prezen"a unui precursor de ARN
radiomarcat la nivelul uridinei (uridin!
3
H) #i apoi fixate, sec"ionate #i observate dup!
autoradiografie se constat! c! pachetele de heterocromatin$ r!mn ne-marcate; deci
acestea sunt pu"in transcrise sau netranscrise.
Heterocromatina poate fi divizat! n dou! categorii: constitutiv$ #i
facultativ$ , n func"ie de permanen"a st!rii condensate. Heterocromatina constitutiv!
r!mne condensat! tot timpul #i reprezint! ADN care r!mne silen"ios n mod
permanent. n celulele de mamifere, cea mai mare parte a heterocromatinei
constitutive se g!se#te n apropierea centromerului tuturor cromozomilor #i n cteva
locuri particulare, cum este bra"ul distal al cromozomului Y la masculi. La multe
plante, extremit!"ile cromozomului (telomerii) sunt #i ele formate din heterocromatin!
constitutiv!. ADN din structura heterocromatinei constitutive este n principal format
din secven"e nalt repetitive #i se presupune c! este lipsit de gene care codific! pentru
proteine. De fapt, dac! gene, n mod normal active, se afl! n apropierea
heterocromatinei (dup! ce #i-au schimbat pozi"ia ca urmare a unei transpozi"ii sau a
unei transloc!ri), ele prezint! tendin"a de a deveni inactive: este ceea ce numin efect
de pozi#ionare. Se presupune c! heterocromatina con"ine elemente a c!ror influen"! se
face sim"it! la o anumit! distan"! #i poate afecta starea fiziologic! a genelor
nvecinate.
Contrar formei constitutive, heterocromatina facultativ! este inactivat!
specific n cursul anumitor stadii de via"! ale organismului. Putem g!si un exemplu de
heterocromatin! facultativ! comparnd celulele unei femele cu cele ale unui mascul
de la mamifere. Celulele masculine au un mic cromozom Y #i un cromozom X mult
mai mare. Cromozomii X #i Y au pu"ine gene n comun astfel nct b!rba"ii nu posed!
dect un exemplar al genelor situate pe cromozomii sexuali. Cu toate c! celulele de la
33
femele con"in doi cromozomi X, unul singur este func"ional pentru transcrip"ie.
Cel!lalt cromozom r!mne condensat sub forma unei mase de heterocromatin!, numit
corpuscul Barr, numele venind de la cercet!torul care l-a descoperit n anul 1949. Se
consider! c! producerea corpusculului Barr este un mecanism gra"ie c!ruia celulele
femele #i masculine dispun de acela#i num!r de cromozomi X activi #i sintetizeaz!
deci cantit!"i echivalente de produ#i codifica"i de genele situate pe cromozomul X.
Inactivarea cromozomului X
n 1961, geneticiana britanic! Mary Lyon emite ipoteza c! un cromopzom X
devine heterocromatic n toate celulele de la femelele de mamifere ntr-un stadiu
precoce al dezvolt!rii embrionare. Acest mecanism este numit inactivarea
cromozomului X #i s-a demonstrat ulterior c! acest fenomen se produce n embrioni n
momentul gastrula"iei. Inactivarea n embrion este un proces aleator n sensul c!
cromozomul X de origine matern! sau patern! prezint! aceea#i probabilitate de a fi
inactiva"i n oricare dintre celule. n consecin"!, cromozomul X patern poate fi
inactivat ntr-o celul! embrionar! n timp ce cromozomul X maternal poate fi
inactivat ntr-o celul! vecin!. Din acel moment, totu#i, acela#i cromozom X este
inactiv n toat! descenden"a unei celule particulare. Cel de al doilea cromozom X este
reactivat n celulele germinale nainte de nceputul meiozei. Cei doi cromozomi X
sunt deci activi n timpul ovogenezei #i to"i game"ii primesc un cromozom X activ.
Cum cromozomii X pot proveni de la tat! #i de la mam! pot purta alele diferite
pentru acela#i caracter, femelele adulte sunt, ntr-un anumit sens, un mozaic genetic,
deoarece alele diferite func"ioneaz! n celule diferite. Mozaicismul cromozomului X
se traduce prin pete de culoare la blana anumitor mamifere, cum sunt pisicile calico
. La om, genele de pigmentare nu sunt localizate pe cromozomul X, de unde absen"a
femeilor calico. Existen"a mozaicismului datorat! inactiv!rii cromozomului X la
femei a fost totu#i demonstrat!. De exemplu, cei doi ochi ai unei femei heterozigote
pentru daltonism ro#u-verde sunt lumina"i de un fascicol de lumin! ro#ie sau verde, se
poate detecta n retin!, plaje de celule care prezint! o proast! percep"ie a culorilor,
dispersate printre plajele unde vederea este normal!.
Mecanismul responsabil de inactivarea cromozomului X a atras aten"ia dup!
ce n 1992 o publica"ie a sugerat c! inactivarea este ini"iat! de o molecul! de ARN
mai degrab! dect o protein!, transcris! plecnd de la gena Xist localizat! pe
cromozomul X de altfel inactiv. (Gena omolog! a cromozomului X activ nu este
transcris!, ceea ce reprezint! un exemplu rar de expresie ntr-o por"iune cromozomic!
devenit! heterocromatin!). Aceast! descoperire, #i multe altele, au stat la originea idei
conform c!reia moleculele de ARN pot func"iona direct ca reglatori ai genelor, ceea
ce reprezenta o func"ie nc! necunoscut! a ARN. De cnd biologii consider! ARN ca
o macromolecul! primitiv! purt!toare de informa"ie, s-au prezis noi roluri pentru
ARN care sunt #i demonstrate.


SLIDE 47. Sensibilitatea la nucleaze
Figura. S'&)1')&. >%,+8)0)# STU@5 S% %O#*%,P#.23 &%>#),%. 0#(<#'3 *% ,)10%+2+8# C,
(.&'%. <)(%&#+.&3 . $#>)&##5 Micrografiile electronice ale minicromozomilor izola#i de
la SV40 eviden#iaz! o zon! liber! de nucleozomi n ADN
Absen"a particulelor nucleozomale, la nivelul acestui fragment, care con"ine #i
originea de replicare a cromozomului viral, presupune legarea n acel loc, a unei
proteine nehistonice situs-specific! care poate influen"a pozi"ionarea particulelor
nucleozomale.
34
Pozi"ionarea nucleozomilor poate fi influen"at! #i de capacitatea ADN de a se
r!suci n jurul nucleului histonelor. Astfel, segmentele de ADN bogate n A-T sunt
mai flexibile #i se curbeaz! mult mai u#or dect regiunile bogate n G-C. n
consecin"!, nucleozomii au tendin"a s! se formeze n regiunile n care raportul A-T #i
G-C este optim deoarece este diminuat! energia necesar! pentru r!sucirea ADN n
jurul octamerilor de histone. S-a constatat c! regiunile bogate n A-T se g!sesc
preferen"ial n locurile unde fosa mic! a dublei elice este orientat! c!tre nucleul
histonic, n timp ce regiunile bogate n G-C se g!sesc, cu predilec"ie, n zonele n care
fosa mic! este orientat! c!tre exterior. De fapt, pozi"ionarea nucleozomilor poate fi
foarte important! pentru exprimarea genelor.
Regiuni lipsite de nucleozomi
Situsurile de hipersensibilitate la nucleaze apar probabil acolo unde exist! o
discontinuitate n aranjarea nucleozomilor. Acest fapt a fost demonstrat pentru prima
dat!, prin corela"iile care exist! ntre situsurile de hipersensibilitate #i zonele lipsite de
nucleozomi n genomul SV40. Micrografiile electronice ale minicromozomilor izola"i
de la SV40 eviden"iaz! o zon! liber! de nucleozomi n ADN. Aceast! zon! se ntinde
de la situsul de ini"iere a transcrip"iei genei precoce la extremitatea n amont a
elementului activator (enhancer). Cnd segmentul de 400 pb este transferat ntr-o alt!
regiune a genomului SV40 sau este integrat n ADN-ul unei plasmide ne-nrudite, se
formeaz! o zon! liber! de nucleozimi #i de situsuri de hipersensibilitate la DN-aza I n
aceste locuri. Acesta indic! c! cele dou! propriet!"i sunt probabil consecin"a secven"ei
nucleotidice a acestui segment de ADN. Totu#i, sensibilitatea la nucleaz! este
probabil modulat! de proteine ne-histonice legate la aceast! regiune, probabil proteine
care se fixeaz! la ADN-Y #i factori de transcrip"ie lega"i la elementul activator
(enhancer).
Judecnd dup! sensibilitatea la DN-aza I sau la nucleaza din Micrococus,
regiunile cromatinei activ! transcrip"ional sunt mai pu"in compacte dect cele ale
genelor silen"ioase. Acest! sensibilitate la nucleaze se ntinde adesea pe mai multe mii
de perechi de baze de o parte #i de alta a unit!"ii de transcrip"ie. Bazele acestei
sensibilit!"i diferite nu au fost stabilite, dar studiile biochimice sugereaz! c!
nucleosomii genelor active sunt s!raci n histone H1 #i boga"i n histone acetilate,
legate prin ubicuitin! #i complexate cu mai multe tipuri de proteine foarte acide
(HMG pentru High Mobility Group). Aceste modific!ri altereaz! asocierea histonelor
cu ADN #i ar putea favoriza separarea neregulat! a nucleosomilor, f!cnd ADN mai
sensibil la digestie. Astfel, periodicitatea normal! a situsurilor de clivare cu nucleaze
ale genelor proteinelor de #oc termic este modificat! n timpul inducerii acestora de
c!tre c!ldur!. Aceea#i varia"ie a situsurilor de clivare se poate observa #i pentru gena
ovalbuminei n oviduct #i n ficat #i a genelor IgL (k) din limfocite dup! reorganizare
ntr-o form! transcrip"ional! activ!.

SLIDE 48. Hipersensibilitatea la nucleaze
Genele transcrise activ prezint!, pe lng! sensibilitatea lor la nucleaze, situsuri
de hipersensibilitate n jurul unit!"ii lor de transcrip"ie. O astfel de hiper-sensibilitate
la DN-aza I nu apare ntr-un ADN gol corespunz!tor. n general, situsurile de
hipersensibilitate sunt situate imediat n amont de situsul de ini"iere a transcrip"iei, dar
sunt adesea situate #i la extremitatea 3 a unit!"ii de transcrip"ie; trebuie s! ne amintim
c! aceste situsuri pot s! con"in! secven"e de amplificare sau de terminare. n plus,
anumite gene posed! situsuri de hipersensibilitate la DN-aza I situate la distan"e mari
n amont de situsul de ad!ugare a coifului (la mai multe kb n amont de genele "-
globinei umane). n cea mai mare parte a cazurilor, aceast! hipersensibilitate este
35
restrns! la "esuturile sau celulele n care genele sunt exprimate sau programate s! fie
exprimate. Situsul de hipersensibilitate situat n 5 de gena pre-proinsulinei, de
exemplu, este prezent n insulele " ale celulelor pancreatice dar nu se g!sesc n
celulele hepatice. La fel, situsurile de hipersensibilitate sunt asociate genelor
reorganizate ale imunoglobulinelor rearanjate n celulele B, dar nu n "esuturile
hematopoietice.
Situsurile de hipersensibilitate la nucleaze #i lipsite de nucleozomi sunt
prezente #i n elementele activatoare ale genelor IgH #i IgL(k) #i n secven"ele UAS
asociate extremit!"ii 5 a genelor GAL ale metalotioneinei. Situsuri de hipermetilare
apar n elementele genelor care r!spund la glucocorticoizi n minutele care urmeaz!
ad!ug!rii de hormon la celule #i dispar rapid dup! eliminarea acestuia. Situsuri de
hipersensibilitate la DN-aza I sunt asociate #i cu activarea transcrip"iei ADNr #i apar
n amont de situsul de ini"iere #i n apropierea regiunilor separatorilor intergenici.
Astfel, hipersensibilitatea la nucleaze a devenit un indicato al regiunilor de reglare a
transcrip"iei.
Deoarece localizarea secven"elor care regleaz! transcrip"ia coincide cu
situsurile de hipersensibilitate la nucleaze #i cu situsurile lipsite de nucleozomi,
consider!m c! aceste caracteristici sunt corelate. Fixarea factorilor de transcrip"ie
deplaseaz! probabil nucleozomii sau altereaz! mpachetarea acestora avnd drept
consecin"! un vid vizibil n aranjarea cromatinei sau chiar perturb!ri mai subtile
care permit nucleoliza. Dac! totu#i, mpachetarea dens! a nucleozomilor este
stabilizat! de c!tre histona H1 sau prin replierea sub forma unei structuri mai aerate,
accesul proteinelor esen"iale transcrip"iei la secven"ele semnal poate fi restrns!,
mpiedicnd astfel ini"ierea transcrip"iei.
n acest domeniu al cercet!rilor privind diferen"ele dintre cromatina exprimat!
#i cea reprimat!, precum #i a trecerii de la o stare la alt! r!mn o serie ntreag! de
ntreb!ri care nu si-au g!sit r!spuns. Pn! n prezent #tim c! exist! regiuni ale
cromatinei care pot fi men"inute n stare condensat! #i ne-exprimat! timp de mai
multe cicluri de replicare dup! care sunt apoi disociate #i devim exprimabile sub
ac"iunea unor stimuli adecva"i, exogeni sau endogeni. Pentru moment nu putem spune
dac! activarea regiunilor specifice ale cromatinei implic! interven"ia proteinelor care
ac"ioneaz! pozitiv, sau eliminarea unor proteine care joac! rol de represor sau ambele
situa"ii.
Modelul solenoid al fibrei de 30nm condensat!
Octamerul de histone este prezentat ca un disc oranj. Fiecare nucleozom
asociat cu o molecula de H1 #i cu fibrele care sunt r!sucite ntr-o structur! solenoid!
cu un doametru de 30 nm.
Hibridizarea in situ a celulelor n interfaz! a fost realizat! cu diferi"i markeri
fluorescen"i (sonde) specifici pentru secven"e separate prin distan"e cumoscute pe
cromozomul linear. Literele din figur! reprezint! sondele care pot fi identificate prin
culoarea lor diferit!.Acestea arat! c! secven"ele A #i B care sunt separate ntre ele
printr-un milion de baze sunt eviden"iate n nucleu ca fiind foarte apropiate.

SLIDE 49. Cromozomii politeni de la Drosophila
Eviden"ierea benzilor de la cromozomii politeni din glandele salivare de la
Drosophila. To"i cei 4 cromozomi sunt "inu"i mpreun! de cedntromerii lor.



36
SLIDE 50. CARIOTIP
Etapele realizarii unui cariotip. Figura. Cariotipul cromozomilor mitotici de la om:
a) tehnic! folosit! pentru ob"inerea de preparate de cromozomi mitotici
din leucocitele sngelui
periferic; b) dup! ob"inerea unei fotografii a cromozomilor elibera"i din nucleu,
ace#tia sunt
aranja"i perechi #i dup! m!rime.

Dispersarea cromatinei n celulele n interfaz! face mult mai u#oar! replicarea
#i transcrip"ia ADN. Din contr!, cromatina celulelor mitotice este sub forma cea mai
condensat!, care u#ureaz! livrarea unui pachet intact de ADN fiec!rei celule fiice.
Cromozomii mitotici sunt foarte utili, att pentru biologi ct #i pentru medici,
deoarece ei con"in un lot complet de material genetic celular #i pot fi pu#i n eviden"!
prin tehnici simple. Cnd un cromozom se condenseaz! n timpul profazei mitotice, el
adopt! o form! distinct! #i constant! determinat!, n principal, de lungimea moleculei
de ADN #i de pozi"ia centromerului. Se pot eviden"ia cromozomii mitotici ai unei
celule n diviziune prin tehnica descris! n figura a. n aceast! tehnic!, celulele sunt
sparte dup! oprirea diviziunii celulare n mitoz! n urma folosirii colchicinei.
Cromozomii mitotici sunt fixa"i la suprafa"a unei lame unde ocup! o suprafa"! foarte
mic! #i colora"i cu diferite tipuri de reactivi. De exemplu, tehnica n care se realizeaz!
o proteoliz! limitat! #i colorarea cu reactiv Giemsa poart! numele de bandare G.
Prin aceasta se eviden"iaz! prin benzi nchise la culoare regiunile bogate n AT #i prin
benzi pale cele bogate n GC.
Dup! fotografiere cromozomii individuali sunt decupa"i #i aranja"i n perechi.
Se realizeaz! un cariotip n care cromozomii omologi sunt dispu#i n ordinea
descresc!toare a m!rimii a#a cum se prezint! n figur!. Celulele somatice de la om
con"in 46 cromozomi care pot fi grupa"i n 22 de perechi omologe #i cromozomii
sexuali care sunt XX la femei #i XY la b!rba"i. Studiul cariotipului este o tehnic! de
baz! pentru citogeneticieni. Cu colorantul Giemsa se ob"in ntre 400 #i 800 benzi
pentru un set haploid de cromozomi. Preparatele de cromozomi mitotici sunt curent
realizate pornind de la culturi de celule sanguine pentru a identifica indivizii purt!tori
de anomalii cromozomale. Exist! posibilitatea determin!rii cromozomilor
suplimentari, absen"a lor sau o serie de alte modific!ri vizibile la microscopul optic.

SLIDE 51. Tehnici de colorare folosite pentru bandarea cromozomilor
O alt! modalitate de prelucrare o reprezint! colorarea cu quinacrin! (bandarea
Q) care eviden"iaz! striuri transversale. Deoarece distribu"ia benzilor Q este
caracteristic!, fiec!rui cromozom de la fiecare specie, tehnica permite identificarea
rapid! a cromozomilor #i realizarea unor compara"ii ntre specii. De asemenea, se pot
detecta anomalii minime din structura cromozomului prin identificarea modific!rilor
care apar n reparti"ia benzilor. Benzile Q str!lucitoare con"in, de obicei, secven"e de
ADN bogate n A-T #i un num!r redus de gene care codific! pentru proteine.
Bra"ul scurt al cromozomului este desemnat cu litera p (petit), iar bra"ul lung
cu litera q (urm!toarea liter! din alfabet). n tehnicile de bandare, fiecare bra" al
cromozomului este mp!r"it n dou! sau mai multe regiuni prin benzi mari. Regiunile
sunt numerotate cu 1, 2, 3 pornind de la centromeri c!tre capete. Fiecare regiune este
divizat! n benzi #i subdiviziuni ale benzilor. De exemplu, Xp21.2 se refer! la
segmentul cromozomial localizat pe bra"ul scurt al cromozomului X, n regiunea 2,
banda 1 #i sub-banda 2.

37
SLIDE 52. Elementele morfologice &i func%ionale ale cromozomilor de
la eucariote
Figura: In ciuda diferen#ei privind num!rul de cromozomi de la aceste animale, cele
dou! genoame con#in aproximativ aceea"i cantitate de ADN. Un cariotip se ob#ine
prin tratarea celulelor n metafaz! cu un reactiv de colorare a ADN urmat de
ntinderea (etalarea) cromozomilor pe o lam! de microscop. Cromozomii omologi
identifica#i n fotografie sunt decupa#i "i cupla#i n perechi. Fiecare num!r
desemneaz! o pereche de cromozomi omologi iar ntregul consdtituie cariotipul.
Structura cromozomului mitotic
Dispersarea cromatinei n celulele n interfaz! face mult mai u#oar! replicarea
#i transcrip"ia ADN. Din contr!, cromatina celulelor mitotice este sub forma cea mai
condensat!, care u#ureaz! livrarea unui pachet intact de ADN fiec!rei celule fiice.
Cromozomii mitotici sunt foarte utili att pentru biologi ct #i pentru medici deoarece
ei con"in un lot complet de material genetic celular #i pot fi pu#i n eviden"! prin
tehnici simple.
Cnd un cromozom se condenseaz! n timpul profazei mitotice, el adopt! o
form! distinct! #i constant!, determinat! n principal de lungimea moleculei sale de
ADN #i de pozi"ia centromerului. Se pot eviden"ia cromozomii mitotici ai unei celule
n diviziune prin tehnica descris! n figura. n aceast! tehnic!, celulele sunt sparte #i
cromozomii mitotici ai unuia dintre nuclei sunt fixa"i la suprafa"a unei lame unde
ocup! o suprafa"! foarte mica. Dac! decup!m cromozomii individuali din aceast!
fotografie este posibil! dispunerea lor pe perechi (23 la om) #i realizarea unui cariotip
n care cromozomii omologi sunt dispu#i n ordinea descresc!toare a m!rimii a#a cum
se prezint! n figura. Preparatele de cromozomi mitotici sunt curent realizate pornind
de la culturi de celule sanguine pentru a identifica indivizii purt!tori de anomalii
cromozomale. Exist! posibilitatea determin!rii cromozomilor suplimentari, absen"a
lor sau modific!rile grosiere.
Cromozomii din figura au fost colora"i cu quinacrine colorant florescent
care face s! apar! pe cromozomi striuri transversale. Distribu"ia acestor benzi Q, cum
au fost numite, este foarte caracteristic!, fiec!rui cromozom al fiec!rei specii; acestea
permit identificarea rapid! a cromozomilor #i realizarea unor compara"ii de la o specie
la alta. De asemenea se poate detecta anomaliile relativ minime din structura
cromozomului prin identificarea modific!rilor care apar reparti"ia benzilor. Benzile Q
str!lucitoare con"in de obicei secven"e de ADN bogate n A-T #i un num!r redus de
gene care codific! pentru proteine.
O metod! dezvoltat! relativ recent pentru diferen"ierea distinct! a fiec!rui
cromozom uman numit! Colorarea cromozomilor simplific! mult distinc"ia dintre
cromozomii cu m!rimi #i forme similare. Acedast! tehnic! folose#te sonde specifice
pentru siturile dispuse de-a lungul lungimii fiec!rui cromozom. Sondele sunt colorate
cu unul din doi coloran"i fluorescen"i care prezint! lungimi de und! diferite. Sondele
specifice pentru fiecare cromozom sunt marcate cu o frac"ie predeterminat! pentru
fiecare din cei doiu coloran"i. Dup! ce sondele sunt hibridizate cu cromozomii #i
excesul ndep!rtat, proba este plasat! la un microscop fluorescent unde un detector
determin! frac"ia fiec!rui colorant prezent n fiecare pozi"ie fluorescent! din cmpul
microscopic. Informa"iile sunt acumulate de un computer unde un program special
furnizeaz! o imagine a fiec!rui tip de cromozom. Combinarea dintre colorarea
cromozomilor #i hibridizarea in situ fluorescent!, numit! FISH multicolor, poate
detecta translocarile cromozomale.


38
Centromerii.
Se poate remarca c!ci to"i cromozomii reprezenta"i n figura posed! un situs la
unde suprafa"a lor exterioar! este net r!scroit! (scobit!). Aceast! scobitur! reprezint!
centromerul cromozomului. Mai sus am ar!tat c! centromerii con"in heterocromatin!
constitutiv!. Centrometrii cromozomilor umani con"in o secven"! lung! de
aproximativ 170 nucleotide (ADN satelit !) dispuse n tandem #i repetate de 2 000 la
30 000 ori per centromer. ADN centromeric fixeaz! proteine specifice, ntre altele
cele care servesc drept situs de fixare microtubulilor care separ! cromozomii n
timpul diviziunii mitotice.
Telomerii
Cele dou! extremit!"i ale moleculei de ADN a fiec!rui cromozom posed! un
segment foarte particular de secven"e repetitive numite telomeri, care formeaz! un
coif la fiecare cap!t al cromozomilor. La om telomerii posed! secven"e
TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori. Contrar celor mai multe tipuri de
secven"e repetitive, care variaz! mult ntre specii, chiar dac! ele sunt nrudite #i
apropiate, n cazul telomerilor de la om #i de la toate vertebratele studiate pn! n
prezent g!sim aceea#i secven"! telomeric!. La alte organisme cum sunt protozoarele
#i drojdiile, telomerii au secven"e diferite dar, ca #i pentru vertebrate, o caten! este
ntotdeauna bogat! n resturi de guanozin! iar complementara sa n resturi de citozin!.
Catena bogat! n G este orientat! n sensul 5-3 c!tre extremitatea cromozomului #i
dep!#e#te cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogat! n C. Datorit! existen"ei
acestui dezechilibru catena bogat! n G formeaz! o scurt! coad! monocatenar! la cele
dou! extremit!"i ale cromozomului. Aceast! dispozi"ie persist! de la o genera"ie
celular! la alta datorit! unei enzime speciale, telomeraza, care poate ad!uga noi
unit!"i repetitive la extremitatea 3 a catenei bogate n G.
Telomeraza, ale c!rei propriet!"i au fost bine studiate de c!tre Elisabeth
Blackburn #i colegii s!i de la Universitatea din California, San Francisco, este o
transcriptaz! invers! care asambleaz! fragmente de ADN folosind o caten! (matri"!)
de ARN. Telomeraza este o enzim! foarte neobi#nuit! n sensul n care ARN care
serve#te drept model face n realitate parte din enzim!. Secven"ele telomerice sunt #i
situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante: ei sunt necesari replic!rii complete a
cromozomului; protejeaz! cromozomii de nucleaze #i de alte influen"e
destabilizatoare; mpiedic! fuziunea dintre extremit!"ile cromozomilor #i faciliteaz!
interac"iile dintre extremit!"ile cromozomilor #i anvelopa nuclear! n anumite tipuri
celulare. Experien"e recente sugereaz! alte roluri. Celulele normale nu sunt capabile
s! se divid! n cultur! dect de un num!r limitat de ori nainte de a da semne de
mb!trnire #i n final de a muri. Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica
aceast! observa"ie: cea mai recent! este scurtarea progresiv! a telomerilor. Telomerii
se scurteaz! deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de
telomeraze. Contrar celulelor normale celulele canceroase nu nceteaz! s! creasc! n
cultur!; spunem c! acestea devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea
contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care
conserv! lungimea telomerilor de-a lungul genera"iilor. De fapt, cercet!ri recente au
demonstrat c! un anumit num!r de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu
poate fi eviden"iat! n celulele normale. Aceast! descoperire a declan#at cercetarea
inhibitorilor specifici ai acestei enzime spernd c! ace#tia ar putea opri cre#terea
anumitor tumori.
La ADN eucariotelor, originile de replicare au fost pentru prima dat!
identificate prin func"iile lor n studiile de transformare la drojdii. Dac! celulelor de
39
drojdii le lipse#te o gen! particular! (ex, una dintre genele implicate n biosintaza
leucinei), ele pot fi transformate cu plasmide care con"in clonat! gena lips! (ex, gena
LEU). Transforman"ii LEU+, care pot cre#te pe mediu f!r! leucin! sunt ob"inu"i cu o
frecven"! mai mare dac! plasmida con"ine mai multe secven"e din genomul de drojdie
de aproximativ 100 pb, numite secven"e replicative autozomale (ARS). O ARS
ac"ioneaz! ca o origine de replicare, permitnd plasmidei circulare s! se replice n
nucledul de drojdii.
Centromerii. ntr-o cultur! celulele transformate cu o plasmid! simpl! circular! care
con"ine fragmentul LEU/ARS, numai aproximativ 5-20 % dintre progenituri con"in
plasmida datorit! segreg!rii mitotice gre#ite a plasmidelor; ca rezultat, majoritatea
plasmidelor ADN nu intr! n nmugurire. Totu#i, dac! fragmentele de restric"ie ale
ADN genomic de la drojdii sunt clonate ntr-o astfel de plasmid! circular!, o mic!
frac"iune dintre fragmente confer! o segregare egala a plasmidelor att n celulele
mam! ct #i fiice dup! mitoz!. Deoarece fragmentele cu acest efect au fost g!site ca
facnd parte din centromerii fiec!rui cromozom de drojdie, ei au fost numi"i secven"e
CEN. Astfel de experimente au condus la izolarea secven"elor care folosesc
segregarea mitotic! pentru extinderea la mai mult de 90% a num!rului progeniturilor
Leu- care con"in plasmida LEU. Aceste celule #i majoritatea descenden"ilor lor cresc
foarte bine pe mediu f!r! leucin!.
Dac! plasmidele circulare care con"in att secven"e CEN ct #i ARS sunt t!iate
cu o enzim! de restric"ie, ele devin lineare. Astfel de plasmide lineare nu se replic! n
drojdii dect dac! ele con"in secven"e telomerice speciale ligate la capetele lor. Primul
experiment de succes care a implicat transfec"ia celulelor de drojdie cu plasmide
lineare a fost realizat folosind capetele unei molecule de ADN care este cunoscut! ca
replicndu-se liniar n protozoarul ciliat Tetrahymena.
Cercet!rile au ar!tat c! ADN telomeric posed! un tip de structur!
caracteristic! care este ad!ugat! la capetele moleculelor de ADN de c!tre o enzim!
special! telomer terminal transferaz! sau telomeraz!. Au fost determinate structurile
telomerilor pentru o serie de organisme, inclusiv la om; majoritatea sunt secven"e
oligomere repetitive cu un con"inut ridicat n G la nivelul catenei orientate 5-3 c!tre
telomer. Aceste secven"e simple sunt repetitive la capetele terminale ale
cromozomilor #i variaz! de la cteva sute de de perechi de baze la drojdii #i
protozoare la cteva mii la vertebrate. Cap!tul 3 ale catenelor bogate n G sunt
extinse cu 12-16 nucleotride dincolo de cap!tul 5 al catenei complementare bogate in
C. Aceast! regiune este legat! de proteine specifice care protejeaz! capetele
cromozomilor lineari de atacul exonucleazelor.
Enzimele care adaug! secven"e telomerice sunt complexe formate att din
proteine ct #i din ARN. Deoarece secven"a ARN serve#te drept matri"! pentru
ad!ugarea de dezoxiribonucleotide la capetele telomerilor, sursa de enzim! #i nu sursa
primerului ADN telomeric determin! secven"a ad!gat!. Astfel telomeraza este o
form! specializat! de revers-transcriptaz! care posed! propria sa matri"! ARN pentru
a realiza sinteza direct! a ADN.
Ac"iunea telomerazei este important! pentru prevenirea scurt!rii
cromozomilor n timpul replic!rii ADN. (oarecii knockout care nu pot produce
ARN-ul asociat telomerazei nu exprim! activitate telomerazic! #i telomerii lor se
scurteaz! considerabil cu fiecare genera"ie. Astfel de #oareci se pot reproduce normal
timp de trei genera"ii nainte ca absen"a telomerilor s! determine fuziunea terminal! a
cromozomilor #i pierderea acestora. Dup! patru genera"ii poten"ialul de reproducere a
acesto #oareci knockout intr! n declin #i se opre#te la a #asea genera"ie.
40
O dat! ce regiunile centromerice de la drojdii care confer! segregare mitotic!
au fost clonate, secven"ele lor pot fi determinate si comparate. Compararea
centromerilor diferi"i de la drojdii au eviden"iat trei regiuni (I, II #i III) care sunt
necesare unui centromer s! func"ioneze. Regiunea II pare s! aib! o lungime constant!
(78-86 baze) #i con"ine secven"e consens nedefinite dar bogate n resturi A #i T. O
secven"! simpl! de la Drosphila care provine din regiunea centromeric! prezint!
unelele similitudini cu regiunile I #i III de la drojdii, sugernd c! mecanisme similare
con troleaz! segregarea la drojdii #i la eucariotele superioare.

SLIDE 53. Colorarea diferen%iat$ a cromozomilor furnizeaz$
posibilitatea eviden%ierii fiec$rei perechi de cromozomi
O alt! tehnic!, mult mai recent!, dar care a intrat n setul analizelor de de
rutin! pentru stabilirea cariotipului este hibridizarea fluorescent!, in situ - FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization). O metod! dezvoltat! relativ recent pentru
diferen"ierea distinct! a fiec!rui cromozom uman numit! Colorarea cromozomilor
simplific! mult distinc"ia dintre cromozomii cu m!rimi #i forme similare. Aceast!
tehnic! folose#te sonde specifice pentru siturile dispuse de-a lungul lungimii fiec!rui
cromozom. Sondele sunt colorate cu unul din doi coloran"i fluorescen"i care prezint!
lungimi de und! diferite. Sondele specifice pentru fiecare cromozom sunt marcate cu
o frac"ie predeterminat! pentru fiecare din cei doi coloran"i. Dup! ce sondele sunt
hibridizate cu cromozomii #i excesul ndep!rtat, proba este plasat! la un microscop
fluorescent unde un detector determin! frac"ia fiec!rui colorant prezent n fiecare
pozi"ie fluorescent! din cmpul microscopic. Informa"iile sunt acumulate de un
computer unde un program special furnizeaz! o imagine a fiec!rui tip de cromozom.
Combinarea dintre colorarea cromozomilor #i hibridizarea in situ fluorescent!, numit!
FISH multicolor, poate detecta translocarile cromozomiale.
Metoda prezint! o limitare tehnic! pentru stabilirea cariotipului deoarece nu
poate fi aplicat! dect celulelor n diviziune sau celor la care diviziunea este indus!, in
vitro. Aceast! problem! poate fi dep!#it! dac! se folosesc sonde ADN care recunosc
secven"e specifice de pe cromozomi. Astfel de sonde, marcate fluorescent, sunt
folosite pentru tratarea nucleelor interfazici. Sondele se leag! la secven"ele
complementare de pe cromozomi #i marcheaz! specific cromozomii care pot fi
vizualiza"i prin microscopie de fluorescen"!. Astfel, FISH poate fi folosit! pentru
identificarea cromozomilor din nucleii n interfaz!. Aplica"iile nu se limiteaz! numai
la acest aspect. Prin folosirea unor sonde specifice, pentru regiuni bine definite de pe
cromozom, FISH se folose#te pentru identificarea microdele"iilor fine #i transloc!rilor
complexe care nu pot fi detectate prin tehnici clasice. De asemenea, FISH reprezint! o
metod! de cartare a genelor, de interes clinic, nou izolate. O variant! extins! a tehnicii
FISH, numit! Chromosome Painting, permite identificarea tuturor cromozomilor
unei celule prin folosirea unor seturi de sonde marcate fluorescent care recunosc
secven"e particulare de-a lungul cromozomilor. Num!rul cromozomilor care pot fi
detecta"i simultan poate fi limitat numai de disponibilitatea coloran"ilor fluorescen"i
care pot fi excita"i la diferite lungimi de und!. De exemplu, tehnica nu poate fi
folosit! pentru vizualizarea simultan! a tuturor celor 46 de cromozomi de la om.
Aceast! limit! a fost dep!#it! prin introducerea cariotipului spectral care presupune
folosirea unor combina"ii de cinci fluorocromi #i semnale adecvate controlate de
computer. n acest fel este posibil! vizualizarea fluorescent! a tuturor cromozomilorW


41
SLIDE 54. Abera%iile cromozomiale
Abera"iile cromozomiale
Muta"iile modific! informa"ia con"inut! n genele individuale, dar cromozomii
suport!, ntre altele, modific!ri importante care apar cel mai adesea n timpul
diviziunilor celulare. Astfel, buc!"i de cromozomi se pot pierde sau segmente se pot
schimba ntre cromozomi diferi"i. Aceste abera"ii cromozomiale apar ca urmare a
unor rupturi, frecven"a lor fiind crescut! prin expunerea la agen"i capabili s! modifice
ADN: infec"iile virale, radia"iile X sau agen"ii chimici. Exist! printre altele la
cromozomii unor indivizi, zone fragile care sunt particular susceptibile la rupere.
Anumite maladii ereditare rare, ca sindromul Bloom, anemia Fanconi #i ataxia
telangiectazic! induc o instabilitate a cromozomilor care cre#te mult tendin"a de
rupere.
Consecin"a unei abera"ii cromozomiale depinde de genele afectate #i de tipul
de celul! atins!. Dac! modificarea (alterarea) intervine ntr-o celul! somatic! ne-
reproduc!toare, consecin"ele sunt n general minore deoarece numai cteva celule ale
organismului vor fi afectate. Totu#i, n cazuri rare o celul! purt!toare de abera"ii se
poate transforma ntr-o celul! malign! #i poate dezvolta o tumor! canceroas!.
Abera"iile cromozomiale care apar n timpul meoizei, particular dup! un
crossing-over anormal pot fi transmise genera"iei urm!toare. Dac! un cromozom
anormal este transmis printr-un gamet, toate celulele descenden"ei sale vor avea
abera"ia #i individul nu dep!#e#te n general stadiul dezvolt!rii embrionare.
Exist! mai multe tipuri de anomalii cromozomiale:
Inversiunile. Un cromozom este adesea rupt n dou! locuri #i segmentul situat ntre
cele dou! pozi"ii este reata#at dar n ordine invers!. Aceast! abera"ie este o inversie.
Pan! la 1% din indivizii umani sunt purt!tori ai unei inversii care poate fi detectat!
ntr-un cariotip. Deoarece un cromozom care con"ine o inversie posed!, de obicei,
toate genele cromozomului normal, individul nu este afectat defavorabil. Totu#i, dac!
o celul! cu o inversie cromozomial! intr! n meioz!, cromozomul aberant nu se poate
mperechia corect cu omologul s!u normal deoarece ordinea genelor este diferit!. n
acest caz, mperecherea cromozomial! este nso"it! de formarea unei bucle. Dac! se
produce un crossing-over n bucl!, ca n figur!, game"ii rezultan"i din meioz! posed!
o copie suplimentar! a anumitor gene (duplicare). Cnd un gamet care con"ine un
cromozom modificat fuzionat cu un gamet normal n momentul fecund!rii, zigotul
care rezult! este dezechilibrat la nivelul num!rului de cromozomi care de obicei este
invariabil.
Transloc$rile. Dac! un cromozom sau un fragment de cromozom se ata#eaz! la altul,
anomalia se nume#te translocare. Ca #i inversiunile, o translocare care survine ntr-o
celul! somatic! nu are efect deloc asupra func"ion!rii celulei #i a descenden"ei sale.
Totu#i, anumite transloc!ri cresc probabilitatea ca celulele s! devin! canceroase.
Exemplul cel mai bine cunoscut este cel al cromozomului Philadelphia, pe care l
g!sim n celulele maligne (dar nu #i n celulele normale) ale indivizilor care sufer! de
anumite forme de leucemie. Cromozomul Philadelphia, denumit astfel deoarece a fost
descoperit n acest ora# n 1960, reprezint! o versiune scurtat! a cromozomului 22 de
la om. De-a lungul anilor, s-a crezut c! segmentul care lipsea reprezenta o simpl!
dele"ie dar, odat! cu ameliorarea tehnicilor de observare a cromozomilor, s-a
demonstrat c! fragmentul care lipsea era transferat unui alt cromozom (nr. 9).
Cromozomul 9 posed! o gen! care codific! pentru o protein kinaz! care intervine n
proliferarea celular!. Ca urmare a transloc!rii, o mic! parte a acestei proteine este
nlocuit! prin aproximativ 600 aminoacizi suplimentari codifica"i de c!tre fragmentul
translocat care provine de pe cromozomul 22. Aceast! nou! protein! mult mai lung!
42
conserv! activitatea catalitic! a formei originale, dar nu mai este supus!
mecanismelor de reglare normal! ale celulei.
Ca #i inversiunile, transloc$rile sunt o surs! probleme n procesul de meioz!.
Con"inutul genetic al unui cromozom alterat prin translocare este diferit de cel al
omologului s!u. n consecin"!, game"ii forma"i n urma meiozei posed! copii
suplimentare ale anumitor gene sau sunt lipsite de aceste gene. S-a demonstrat c!
transloc!rile joac! un rol important n evolu"ie producnd modific!ri de mare
anvergur! care pot fi la originea separ!rii liniilor evolutive distincte provenite dintr-un
str!mo# comun. Acest accident genetic s-a produs probabil n timpul propriei noastre
istorii evolutive recente. Compara"ia celor 23 perechi de cromozomi ale celulelor
somatice de la om cu cele 24 perechi de cromozomi de la cimpanzeu, goril! #i
urangutan eviden"iaz! asem!n!ri frapante. Observarea precis! a doi cromozomi de
maimu"! care nu au echivalen"! la om demonstreaz! c! n ansamblu ace#tia corespund
band! cu band! cromozomului 2 de la om. ntr-un anumit moment, n cursul evolu"iei
c!tre om, un cromozom ntreg a fost translocat c!tre altul pentru a da na#tere unui
singur cromozom prin reducerea num!rului haploid de la 24 la 23.
Dele#iile: reprezint! pierderea unui fragment de cromozom. n func"ie de localizare
acestea pot fi:
i) terminale care sunt rezultatul unei singure rupturi la nivelul unui bra" al
cromozomului, producnd un fragment f!r! centromer care este nl!turat;
ii) intersti"iale care sunt rezultatul a dou! ruperi #i care se soldeaz! cu pierderea
regiunii dintre acestea.
Cum am v!zut mai sus, zigo"i cu o dele"ie cromozomial! se formeaz! adesea cnd un
gamet provine dintr-o meioz! anormal!. Pierderea unei por"iuni cromozomiale
antreneaz! de obicei pierderea de gene esen"iale #i are consecin"e severe, chiar dac!
cromozomul omolog este normal. Cea mai mare parte din embrionii umani purt!tori
ai unei dele"ii semnificative nu ajung la termen iar cei care reu#esc demonstreaz!
existen"a a numeroase malforma"ii. Jerome Lejeune a fost primul, n 1963, care a
stabilit o rela"ie ntre o malforma"ie la om #i o dele"ie cromozomial!; acest genetician
francez descoperise mai nainte cauza genetic! a sindromului Down. Lejeune a g!sit
c! un copil cu diferite malforma"ii ale fe"ei #i o dezvoltare anormal! a laringelui
(organ vocal) era lipsit de o parte a cromozomului 5. Datorit! unei deficien"e a
larinxului, "ip!tul copilului seam!n! cu cel al unui pisoi (pisic!) care sufer!. Din
aceast! cauz! cercet!torii au numit boala "ip!tul pisicii.
Duplic$rile. O duplicare provine din repetarea unei por"iuni de cromozom. S-a pus
problema rolului acestor duplica"ii n formarea familiilor multigenice. Alte duplica"ii
cromozomiale mai importante sunt responsabile de prezen"a a trei exemplare ale mai
multor gene n locul a dou! copii normale (trisomie par"ial!). Activit!"ile celulare sunt
foarte sensibile la num!rul de copii ale genelor #i exemplarele suplimentare pot avea
deci consecin"e negative grave.
Abera#iile cromozomiale. O serie de muta"ii accidentale care modific! informa"ia
con"inut! n genele individuale apar cel mai adesea n cursul replic!rii ADN sau
datorit! ac"iunii unor agen"i de mediu. F!r! a minimaliza importan"a acestora, pentru
buna func"ionare a organismului, trebuie s! ar!t!m c! modific!ri mult mai importante
pot suporta cromozomii, cel mai adesea n timpul diviziunilor celulare. Astfel, buc!"i
de cromozomi se pot pierde sau segmente importante se pot schimba ntre cromozomi
diferi"i. Aceste abera"ii cromozomiale apar ca urmare a unor rupturi iar frecven"a lor
este crescut! n urma expunerii la agen"i de mediu capabili s! modifice ADN:
infec"iile virale, radia"iile X, agen"ii chimici, etc. De asemenea, cromozomii unor
indivizi prezint! zone fragile care au o susceptibilitate particular! la rupere.
43
Anumite maladii ereditare rare, ca sindromul Bloom, anemia Fanconi, #i ataxia
telangiectazic! induc o instabilitate a cromozomilor care cre#te mult aceast!
instabilitate.
Consecin"a unei abera"ii cromozomiale depinde de genele afectate #i de tipul
de celul! atins!. Dac! modificarea intervine ntr-o celul! somatic! ne-reproduc!toare,
consecin"ele sunt n general minore, deoarece numai cteva celule ale organismului
vor fi afectate. Totu#i, n cazuri rare, o celul! purt!toare de abera"ii se poate
transforma ntr-o celul! malign! #i poate dezvolta o tumor! canceroas!.
Pot fi transmise genera"iei urm!toare, abera"iile cromozomiale care apar n
timpul meiozei, particular dup! un crossing-over anormal. Dac! un cromozom
anormal este transmis printr-un gamet, toate celulele descenden"ei sale vor avea
abera"ia #i, n general, individul nu dep!#e#te stadiul dezvolt!rii embrionare.
Exist! mai multe tipuri de anomalii cromozomiale:
Inversiuni: un cromozom este adesea rupt n dou! locuri #i segmentul situat ntre cele
dou! pozi"ii este reata#at n ordine invers!. Pn! la 1% din oameni sunt purt!tori ai
unei inversii care poate fi detectat! n urma realiz!rii unui cariotip. Inversiunile pot fi
de dou! tipuri: i) paracentric!, dac! implic! numai un bra" al cromozomului; ii)
pericentric!, dac! rupturile se produc de o parte #i de alta centromerului. Deoarece, de
obicei, un cromozom care con"ine o inversie posed! toate genele cromozomului
normal, individul nu este ntotdeauna afectat defavorabil. Totu#i, dac! o celul! cu o
inversie cromozomial! intr! n meioz!, cromozomul aberant nu se poate mperechea
corect cu omologul s!u normal deoarece ordinea genelor este diferit!. n acest caz,
mperecherea cromozomial! este nso"it! de formarea unei bucle. Dac! n bucl! se
produce un crossing-over, game"ii rezulta"i din meioz! posed! o copie suplimentar! a
anumitor gene #i apare o duplicare. Dac! un gamet care con"ine un cromozom
modificat fuzioneaz! cu un gamet normal n momentul fecund!rii, zigotul rezultat
poart! un dezechilibru la nivelul num!rului de cromozomi, care de obicei este
invariabil.
Transloc$ri: ata#area unui cromozom sau a unui fragment de cromozom la un altul.
Ca #i inversiunile, transloc!rile care survin ntr-o celul! somatic! pot s! nu aib! deloc
efect asupra func"ion!rii celulei #i a descenden"ei sale. Totu#i, anumite evenimente de
acest tip cresc probabilitatea ca celulele s! devin! canceroase. Exemplul cel mai bine
cunoscut este cel al cromozomului Philadelphia, pe care l g!sim n celulele maligne
(nu #i n celulele normale) ale indivizilor care sufer! de anumite forme de leucemie.
Cromozomul Philadelphia, denumit astfel deoarece a fost descoperit n acest ora# n
1960, reprezint! o versiune scurtat! a cromozomului 22 de la om. De-a lungul anilor,
s-a crezut c! segmentul care lipsea reprezenta o simpl! dele"ie dar, odat! cu
ameliorarea tehnicilor de observare a cromozomilor, s-a demonstrat c! fragmentul
care lipsea era transferat unui alt cromozom (nr. 9). Cromozomul 9 posed! o gen!
care codific! pentru o protein-kinaz! care intervine n proliferarea celular!. Ca urmare
a transloc!rii, o mic! parte a acestei proteine este nlocuit! prin aproximativ 600
aminoacizi suplimentari codifica"i de c!tre fragmentul translocat care provine de pe
cromozomul 22. Aceast! nou! protein!, mult mai lung!, conserv! activitatea catalitic!
a formei originale, dar nu mai este supus! mecanismelor de reglare normal! ale
celulei.
Ca #i inversiunile, transloc!rile sunt o surs! de probleme n procesul de meioz!.
Con"inutul genetic al unui cromozom alterat prin translocare este diferit de cel al
omologului s!u. n consecin"!, game"ii forma"i n urma meiozei posed! copii
suplimentare ale anumitor gene sau sunt lipsite de acestea. n figura sunt prezentate
dou! tipuri de transloc!ri: i) translocare reciproc! balansat!, n care se produce cte o
44
singur! ruptur! pe cei doi cromozomi, cu schimb de material genetic. O astfel de
translocare nu poate fi eviden"iat! f!r! utilizarea unor tehnici de bandare avansate; ii)
fuziune centric! sau translocare robertsonian!, care presupune fuziunea dintre doi
cromozomi acrocentrici. De obicei, ruperile apar n apropierea centromerilor fiec!rui
cromozom. Transferul de segmente duce la formarea unui cromozom foarte mare #i a
unuia foarte mic care se pierde.
S-a demonstrat c! transloc!rile joac! un rol important n evolu"ie producnd
modific!ri de mare anvergur! care pot fi la originea separ!rii liniilor evolutive
distincte provenite dintr-un str!mo# comun. Acest accident genetic s-a produs
probabil n timpul propriei noastre istorii evolutive recente. Compara"ia celor 23
perechi de cromozomi ale celulelor somatice de la om cu cele 24 perechi de
cromozomi de la cimpanzeu, goril! #i urangutan eviden"iaz! asem!n!ri frapante.
Observarea precis! a doi cromozomi de maimu"!, care nu au echivalen"! la om,
demonstreaz! c! n ansamblu ace#tia corespund, band! cu band!, cromozomului 2 de
la om. Se presupune c!, ntr-un anumit moment al evolu"iei, un cromozom ntreg a
fost translocat c!tre altul #i a dat na#tere unui singur cromozom prin reducerea
num!rului haploid de la 24 la 23.
Cromozomul sub form$ de inel reprezint! o form! special! de dele"ie. Aceast!
anomalie apare cnd la ambele capete ale cromozomului se produc rupturi urmate de
fuziunea regiunilor afectate. Dac! se pierd fragmente importante apar anomalii
fenotipice. Din p!cate, cromozomii sub form! de inel nu se normalizeaz! nici n
meioz! #i nici n mitoz!, avnd drept rezultat consecin"e serioase asupra organismului.
Duplic$rile: presupun repetarea unei por"iuni de cromozom. Se discut! problema
rolului acestora n formarea familiilor multi-genice. Unele duplic!ri cromozomiale,
mai importante, sunt responsabile de prezen"a mai multor exemplare ale anumitor
gene (ex, trisomie par"ial!). Cele mai cunoscute duplic!ri afecteaz! genele globinei.
Deoarece echilibrul activit!"ilor metabolice ale organismului este foarte sensibil,
existen"a unor exemplare suplimentare pentru anumite gene poate avea consecin"e
negative grave.
Izocromozomii: se ob"in cnd unul dintre bra"ele cromozomului este pierdut #i bra"ul
care r!mne este duplicat. Se ob"ine un cromozom care con"ine dou! bra"e scurte sau
dou! lungi, identice. Cele mai frecvente cazuri se ntlnesc pentru cromozomul X.

SLIDE 55. Analiza transloc$rilor cromozomiale prin bandare
M#>)&.- :,.0#2. '&.,<0+13&#0+& 1&+8+2+8.0% (&#, 7.,*.&%. A# 1+0+&.&%.
1&+8+2+8#0+& E./ A# (&#, 8.&1.&%. $0)+&%<1%,'3 . 1&+8+2+8#0+& E7/5 S% +7<%&O3
$+&8.&%. 1&+8+2+8)0)# VD#0.*%0$#. *.'+&#'3 '&.,<0+13&## ),%# &%>#),# *#,
1&+8+2+8)0 LL (% 1&+8+2+8)0 W
Anumiti coloran"i coloreaz! selectiv anumite regiuni ale cromozomilor
metafazici mult mai intens dect alte regiuni producnd benzi specifice fiec!rui
cromozom individual. Cu toate c! bazele moleculare ale regularit!"ii benzilor
cromozomilor r!mn necunoscute, aceste benzi sunt foarte utile. Cnd cromozomii
colora"i sunt vizualiza"i la microscopul optic, aceste benzi servesc drept repere de-a
lungul fiec!rui cromozom #i folosesc )i la diferen"ierea cromozomilor cu m!rimi #i
profil diferit.
Quinarina, un colorant fluorescent care se intercaleaz! ntre perechile de baze
ale helixului ADN, produce benzile Q. Totu#i, deoarece benzile Q se estompeaz! cu
timpul, n laborator sunt preferate alte tehnici. De exemplu cromozomii sunt supu)i
unei nc!lziri #i proteolize u#oare #i apoi colora"i cu reactiv Giemsa, un colorant
permanent care produce benzile G. Tratamentul cromozomilor cu solu"ie alcalin!
45
cald! nainte de colorare cu Giemsa produce benzile R cu un profil care este
aproximativ invers dect cel al benzilor G. Diferen"ele ntre aceste profile permite
citologilor s! identifice p!r"i specifice ale cromozomilor #i s! localizeze situsurile de
rupere cromozomal! #i translocare. De asemenea diferite sonde care hibridizeaz!
specific cu secven"ele cromozomilor pot fi localizate n benzi particulare.
Transloc!rile caracteristice cromozomilor sunt asociate cu unele maladii
genetice #i cu unele tipuri specifice de cancer. De exemplu, aproape la to"i pacien"ii
cu leucemie cronic! mieloid!, celulele leucemice con"in cromozomul Philadelphia 22
anormal #i un cromozom 9 anormal. Acesta rezult! din trasloc!rile care apar ntre
cromozomii 9 #i 22. Transloc!rile pot fi eviden"iate prin tehnici clasice de bandare
sau prin hibridizare in situ - tehnica FISH.

SLIDE 56. Num$rul de cromozomi la diferite organisme (celula
haploid$)
Genoamele nucleare eucariote au m!rimi variabile care pot varia de la 10 Mpb
la peste 100 000 Mpb. Adesea, m!rimea acestora coincide cu complexitatea
organismelor, genoamele organismelor eucariote fiind mai mari dect cele ale
eucariotelor inferioare. Totu#i, m!rimea nu este determinat! numai de num!rul de
gene, ci #i de cantitatea de secven"e de ADN repetitiv. Cele mai mari genoame au un
num!r de copii de secven"e repetitive este foarte mare.

SLIDE 57. M$rimea genoamelor, num$rul de gene &i distribu%ia
acestora
Dup! cum am constatat n paragrafele anterioare, la eucariote genomul nuclear
este mp!r"it ntr-un set de molecule de ADN lineare, fiecare fiind mpachetat! n
structura unui cromozom. Din acest punct de vedere nu au fost eviden"iate excep"ii n
lumea eucariotelor, toate organismele cunoscute avnd cel pu"in doi cromozomi n
care molecula de ADN este liniar!. Variabilitatea la acest nivel se manifest! numai n
ceea ce prive#te num!rul de cromozomi, care pare s! nu fie corelat cu tr!s!turile
biologice ale organismului.
De exemplu, drojdia Saccharomyces cerevisiae, un eucariot relativ simplu are
de patru ori mai mul"i cromozomi dect musculi"a Drosophila melanogaster. De
asemenea, num!rul cromozomilor nu pare s! fie corelat cu m!rimea genomului sau cu
pozi"ia evolutiv! a organismului. Anumite salamandre posed! genoame de
aproximativ 30 de ori mai mari dect omul, dar au un num!r de cromozomi redus la
jum!tate. O situa"ie similar! se poate consta #i n cazul unor plante, cum este
porumbul. Aceste compara"ii sunt foarte interesante, dar din p!cate nu sunt destul de
informative pentru genoamele n sine. Adesea, ele reprezint! numai o reflectare a
neuniformit!"ii evenimentelor evolutive care au modificat arhitectura genomic! la
diferite organisme.

SLIDE 58. M$rimea con%inutului n ADN a genomului haploid de la
diferite organisme
M!rimea con"inutului n ADN a genomului haploid de la diferite organisme.
Complexitatea morfologic! a organismelor, estimat! n func"ie de num!rul tipurilor
celulare pe care le prezint!, cre#te de jos n sus
Figura. M!rimea con#inutului n ADN a genomului haploid de la diferite organisme.
Complexitatea morfologic! a organismelor, estimat! n func#ie de num!rul tipurilor
46
celulare pe care le prezint!, cre"te de jos n sus (dup! Molecular Cell Biology Lodish
H., et. al., 2000)
Complexitatea morfologic! a ADN se poate corela cu valoarea C, care
reprezint! cantitatea de ADN din genomul haploid. Pe de alt! parte complexitatea
morfologic! a unui organism ar trebui s! reflecte complexitatea genetic!. Cu toate
acestea, coresponden"a dintre cei doi parametrii este cunoscut! drept Paradoxul
Valorii C, deoarece unele organisme au valori C nea#teptat de mari. De exemplu
genomul pe#telui-pl!mn este de 10-15 ori mai mare dect cel de la mamifere. Adesea
paradoxul valorii C este aplicabil #i unor specii nrudite (de exemplu valorile C de la
diferite specii de Drosophile sunt uneori foarte diferite).

SLIDE 59. Clasificarea secven%elor ADN de la eucariote
Analiza molecular! ncearc! s! explice #i paradoxul aparent pe care l
reprezint! faptul c! genoamele eucariotelor par s! con"in! o cantitate nsemnat! de
ADN care nu este necesar celulei. Acum mai bine de 30 de ani se consider! c!
eucariotele con"in aproximativ 50 000 gene. Cum fiecare secven"! codant! era
considerat! ca avnd, n medie, 1 200 pb, genomul acestora ar fi trebuit s! con"in!
numai aproximativ 6 x 10
7
pb. Acum se cunoa#te c! genoamele unor ciuperci sunt
mai mici dect aceast! valoare #i c! cea mai mare parte a genoamelor de mamifere #i
de plante con"in de 50 la 100 ori mai mult ADN.

SLIDE 60. Variabilitatea num$rului de introni &i exoni &i m$rimea
acestora la diferite specii
Ini"ial, pentru estimarea num!rului de gene, o serie de cercet!tori au extrapolat
situa"ia cunoscut! de la E. coli unde de 4,7 milioane pb codific! pentru 3000 de gene.
P!strnd propor"ionalitatea, ei considerau c! genomul haploid uman de 2,9 miliarde
pb trebuia s! aib! un num!r mult mai mare de gene (de 600 ori mai mare). Odat! cu
ncheierea secven"ializ!rii genomului uman a fost posibil! identificarea tuturor fazelor
de lectur! #i realizarea unei estim!ri ct mai corecte a num!rului genelor de la om. n
prezent se discut! de 30-40 000 n loc de 60-80 000 gene cum se considera n
momentul nceperii acestui program. De asemenea, evolu"ia tehnicilor de biologie
molecular! #i utilizarea unor aparate de secven"ializare performante permite
definitivarea secven"ializ!rii unui num!r din ce n ce mai mare de organisme #i
estimarea din ce n ce mai corect! a num!rului genelor con"inute de acestea. n tabel
se realizeaz! o prezentare a m!rimii unora dintre cele mai cunoscute genoame, a
num!rului genelor precum #i a distribu"iei acestora/Mb.
Aceast! varia"ie inexplicabil! a m!rimii genoamelor apare deoarece
cromozomii eucariotelor con"in, pe lng! informa"ia genetic! din structura genelor,
cantit!"i variabile de ADN, plasate n: i) introni; ii) n regiunile intra-genice #i inter-
genice; iii) regiuni repetitive n tandem sau dispersate pe toat! lungimea genomului.
Acest ADN, a c!rui func"ie nu a fost nc! demonstrat!, este adesea compus din
repeti"ii de secven"e, unele dintre ele nefiind niciodat! transcrise. El mai este denumit
#i ADN nefunc"ional. n tabel sunt trecute n revist! principalele tipuri de secven"e
prezente n structura genomului eucariotelor.
M!rimea, adesea excesiv! a genoamelor eucariote se poate datora
urm!toarelor aspecte:
i) cea mai mare parte a genelor care codific! pentru polipeptide posed! cel
pu"in un intron, un num!r mare de gene avnd mai mul"i. Totu#i, prezen"a intronilor
nu este obligatorie existnd #i gene lipsite de ace#tia. Genele care codific! pentru
47
moleculele de ARN func"ionale cum sunt ARNt #i ARNr pot s! posede #i ele secven"e
intercalate, dar ntreruperile la nivelul acestora sunt mai pu"in frecvente. n general,
cantitatea de ADN prezent! n introni dep!#e#te cu mult pe cea din exoni.
ii) anumite gene apar de mai multe ori ntr-un genom eucariot #i contribuie la
cre#terea taliei. Existen"a de copii multiple ale unei anumite gene nu este ns! o
proprietate exclusiv! a eucariotelor. De exemplu, E. coli posed! #apte gene pentru
ARNr, probabil pentru a satisface necesit!"ile, n ribozomi, ale unei cre#teri rapide.
Eucariotele posed! #i ele gene n copiii multiple pentru a rezolva astfel de probleme.
iii) o alt! cauz! a m!rimii excesive a genoamelor eucariote este prezen"a unor
familii mari de secven"e de ADN repetitiv a c!ror func"ie este, pentru moment,
necunoscut!. Astfel de familii reprezint! adesea ntre 10% la 50% din genom . Aceste
secven"e au fost pentru prima dat! identificate n urma analizei cineticii de reac"iei de
renaturare a ADN. Astfel, s-a demonstrat c! mari cantit!"i de ADN se reasociaz! mult
mai rapid dect era prev!zut pentru secven"ele unice. Viteza mare de reasociere indic!
faptul c! genoamele con"in segmente care se repet! de sute de mii sau de milioane de
ori. Curbele de reasociere Cot sunt informative pentru identificarea regiunilor care
con"in secven"e repetitive sau sateli"i. Clonarea molecular! #i secven"ializarea au
confirmat existen"a unor astfel de secven"e nalt repetitive care, asemenea genelor
repetitive, sunt aranjate n tandem sau sunt dispersate la nivelul a numeroase locusuri
necorelate.

SLIDE 61. Prezentare comparativ$ a structurii genice a cromozomului
III de la Saccharomyces cerevisiae
Figura Prezentare comparativ! a structurii genice a cromozomului III de la
Saccharomyces cerevisiae (a) "i clusterului ! globinei de la om situat pe cromozomul
11(b). Dreptunghiurile albastre marcheaz! fazele de lectur!. Se poate constata c!
genomul de S. cerevisiae are un num!r foarte mic de secven#e nefunc#ionale. La om
clusterul globinei con#ine secven#e intergenice necodante, pseudogene ("!1 "i "!2)
"i secven#e repetitive dispersate lungi ;)&/A&.0&'& :0) /(3& ($(30#. 8#$-'-# MFG4M?
;%-$+ =+0%1)0.& F%00 G#+0+>H I2%#)W _`Z &8` ('`Z Raaa?
La mamifere exist! mai multe sute de gene care codific! pentru ARNr. O alt!
parte important! din excesul de ADN este determinat de prezen"a copiilor
nefunc"ionale ale genelor. n general, aceste copii sunt numite pseudogene #i sunt
inactive din cauza existen"ei unor dele"ii sau altor alter!ri ale secven"ei ADN.
Num!rul pseudogenelor pentru un anumit tip de gen! variaz! foarte mult. Astfel, n
genoamele eucariotelor, o gen! poate fi prezent! o singur! dat!, sau foarte bine, poate
s! fac! parte dintr-o familie de gene func"ionale strns nrudite. Acestea pot fi
exprimate n momente diferite sau n "esuturi #i celule diferite. Astfel de familii pot
include #i pseudogene. n figur! este prezentat clusterul "-globinei care con"ine dou!
pseudogene. De asemenea, se remarc! cantitatea mare de ADN nefunc"ional
prezent! la om comparativ cu drojdia Saccharomyces cerevisiae.
ADN repetitiv const! n secven"e scurte repetitive sub forma unor copii
identice sau nrudite n genom. Componenta care se renatureaz! cel mai rapid n
genomul eucariotelor este reprezentat! de secven"ele nalt repetitive, #i const! n
secven"e foarte scurte care se repet! de multe ori n tandem formnd clustere mari.
Datorit! unit!"ilor repetitive scurte, aceste secven"e de ADN sunt adesea denumite
secven"e ADN simple sau secven"e satelit.

48
SLIDE 62. Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din
sursele indicate pe grafic
Figura. Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din sursele indicate pe grafic.
Se observ! procesul de renaturare rapid! a secven#elor repetitive sau care con#in sateli#i
(dup! Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
Acest tip de secven"e sunt prezente n aproape toate genoamele eucariote, dar
cantitatea lor total! este extrem de variabil!. n genoamele mamiferelor acestea
reprezint!, n mod normal, < 10% dar la Drosophila virilis, cantitatea este de #50%.

SLIDE 63. Tipuri de secven%e ADN repetitive &i distribu%ia acestora
Secven"ele repetitive n tandem pot fi corelate cu modificarea alinierilor care
apar n urma mperecherii cromozomilor. Astfel, m!rimea clusterelor n tandem
tinde s! fie foarte polimorf!, cu varia"ii largi ntre indivizi. De fapt, clusterele mai
mici, formate din astfel de secven"e, pot fi folosite pentru caracterizarea genoamelor
individuale folosind tehnica fingerprinting sau genotiparea automat!. Compararea
secven"elor simple de ADN, de la diferite specii, ofer! informa"ii interesante despre
mecanismele procesului de evolu"ie. Pentru moment nu putem spune cu precizie dac!
aceste secven"e au o func"ie structural!.
Mari familii de repeti"ii dispersate n genomul mamiferelor
Analiza clasic! a profilelor de dispersie demonstreaz! c! genomul uman #i
genoamele altor mamifere posed! profile de dispersie apropiate. Aceste concluzii sunt
confirmate de detaliile moleculare furnizate prin analiz! de restric"ie, clonare #i
secven"ializare. Cu toate c! exist! diferite familii #i sub-familii de repeti"ii dispersate,
un num!r mic dintre acestea prezint! un num!r foarte mare de copii #i domin!
genoamele. O familie dominant! poate reprezenta mai mult de 5% din ADN total, iar
totalitatea familiilor pot reprezenta 20% din acesta. Unele familii sunt constituite din
secven"e de 100 la 500 pb #i sunt denumite secven"e SINEs (Short Interspersed
Repeats). Altele, ale c!ror membri pot avea 6 kpb sau mai mult, sunt denumite LINES
(Long Interspersed Repeats). Organisme cum sunt miomicetele, l!custele,
echinodermele, pe#tii #i amfibienii con"in repeti"ii dispersate care se aseam!n! cu
SINES de la mamifere. La plante #i la nevertebrate exist! secven"e comparabile cu
LINES de la mamifere.
Fiecare specie (ordin) posed! un joc caracteristic de familii de secven"e
SINES. Una dintre familiile SINES cele mai bine studiate este familia ALU de la
primatele lumii vechi, denumit! a#a datorit! prezen"ei n aceast! secven"! a unui situs
de restric"ie Alu I. Unit!"ile Alu se g!sesc n regiuni care flancheaz! genele, n introni,
n ADN satelit #i grupate cu alte secven"e repetitive dispersate.
Pe lng! multiplele familii SINES, genoamele mamiferelor posed! toate o
abundent! familie LINES, familia LINE-1, ale c!rei membri pot avea 6 la 7 kpb. n
unele dintre aceste genoame, exist! #i alte familii LINE dar ele nu sunt la fel de
frecvente. Familiile LINE-1 de la diferite mamifere sunt toate nrudite dar divergente:
cu ct speciile sunt mai apropiate cu att familiile sunt mai similare. Secven"ele
LINE-1 sunt prezente n regiunile care flancheaz! genele, n introni #i inserate n
repeti"iile ADN satelit.



49
SLIDE 64. Trei elemente func%ionale sunt necesare replic$rii &i
mo&tenirii stabile a cromozomilor de la eucariote
Centromerii: se poate remarca c! to"i cromozomii posed! un situs la unde suprafa"a
lor exterioar! este net r!scroit! (scobit!). Aceast! scobitur! reprezint! centromerul
cromozomului. Mai sus am ar!tat c! centromerii con"in heterocromatin! constitutiv!.
Centrometrii cromozomilor umani con"in o secven"! lung! de aproximativ 170
nucleotide (ADN satelit !) dispuse n tandem #i repetate de 2 000 la 30 000 ori per
centromer. ADN centromeric fixeaz! proteine specifice, ntre altele cele care servesc
drept situs de fixare microtubulilor care separ! cromozomii n timpul diviziunii
mitotice.
Telomerii: cele dou! extremit!"i ale moleculei de ADN a fiec!rui cromozom posed!
un segment foarte particular de secven"e repetitive numite telomeri, care formeaz! un
coif la fiecare cap!t al cromozomilor. La om telomerii posed! secven"e
TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori. Contrar celor mai multe tipuri de
secven"e repetitive, care variaz! mult ntre specii, chiar dac! ele sunt nrudite #i
apropiate, n cazul telomerilor de la om #i de la toate vertebratele studiate pn! n
prezent g!sim aceea#i secven"! telomeric!. La alte organisme cum sunt protozoarele
#i drojdiile, telomerii au secven"e diferite dar, ca #i pentru vertebrate, o caten! este
ntotdeauna bogat! n resturi de guanozin! iar complementara sa n resturi de citozin!.
Catena bogat! n G este orientat! n sensul 5-3 c!tre extremitatea cromozomului #i
dep!#e#te cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogat! n C. Datorit! existen"ei
acestui dezechilibru catena bogat! n G formeaz! o scurt! coad! monocatenar! la cele
dou! extremit!"i ale cromozomului. Aceast! dispozi"ie persist! de la o genera"ie
celular! la alta datorit! unei enzime speciale, telomeraza, care poate ad!uga noi
unit!"i repetitive la extremitatea 3 a catenei bogate n G.
Telomeraza, ale c!rei propriet!"i au fost bine studiate de c!tre Elisabeth
Blackburn #i colegii s!i de la Universitatea din California, San Francisco, este o
transcriptaz! invers! care asambleaz! fragmente de ADN folosind o caten! (matri"!)
de ARN. Telomeraza este o enzim! foarte neobi#nuit! n sensul n care ARN care
serve#te drept model face n realitate parte din enzim!. Secven"ele telomerice sunt #i
situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante: ei sunt necesari replic!rii complete a
cromozomului; protejeaz! cromozomii de nucleaze #i de alte influen"e
destabilizatoare; mpiedic! fuziunea dintre extremit!"ile cromozomilor #i faciliteaz!
interac"iile dintre extremit!"ile cromozomilor #i anvelopa nuclear! n anumite tipuri
celulare. Experien"e recente sugereaz! alte roluri. Celulele normale nu sunt capabile
s! se divid! n cultur! dect de un num!r limitat de ori nainte de a da semne de
mb!trnire #i n final de a muri. Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica
aceast! observa"ie: cea mai recent! este scurtarea progresiv! a telomerilor. Telomerii
se scurteaz! deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de
telomeraze. Contrar celulelor normale celulele canceroase nu nceteaz! s! creasc! n
cultur!; spunem c! acestea devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea
contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care
conserv! lungimea telomerilor de-a lungul genera"iilor. De fapt, cercet!ri recente au
demonstrat c! un anumit num!r de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu
poate fi eviden"iat! n celulele normale. Aceast! descoperire a declan#at cercetarea
inhibitorilor specifici ai acestei enzime spernd c! ace#tia ar putea opri cre#terea
anumitor tumori.

50
SLIDE 65. Experiment pentru eviden%ierea importan%ei originii de
replicare (a)
La ADN eucariotelor, originile de replicare au fost pentru prima dat!
identificate prin func"iile lor n studiile de transformare la drojdii. Dac! celulelor de
drojdii le lipse#te o gen! particular! (ex. una dintre genele implicate n biosinteza
leucinei), ele pot fi transformate cu plasmide care con"in clonat! gena lips! (ex. gena
LEU). Transforman"ii LEU+, care pot cre#te pe mediu f!r! leucin! sunt ob"inu"i cu o
frecven"! mai mare dac! plasmida con"ine mai multe secven"e din genomul de drojdie
de aproximativ 100 pb, numite secven"e replicative autozomale (ARS). O ARS
ac"ioneaz! ca o origine de replicare, permitnd plasmidei circulare s! se replice n
nucleul de drojdii.

SLIDE 66. Experiment pentru eviden%ierea importan%ei originii de
replicare (b)
Centromerii. ntr-o cultur!, celulele sunt transformate cu o plasmid! simpl! circular!
care con"ine fragmentul LEU/ARS. Se constata ca numai aproximativ 5-20 % dintre
progenituri con"in plasmida datorit! segreg!rii mitotice gre#ite a plasmidelor.
Rezultatul este ca majoritatea plasmidelor ADN nu intr! n nmugurire. Totu#i, dac!
fragmentele de restric"ie ale ADN genomic de la drojdii sunt clonate ntr-o astfel de
plasmid! circular!, o mic! frac"iune dintre fragmente confer! o segregare egala a
plasmidelor att n celulele mam! ct #i fiice dup! mitoz!. Deoarece fragmentele cu
acest efect au fost g!site ca facnd parte din centromerii fiec!rui cromozom de
drojdie, ei au fost numi"i secven"e CEN. Astfel de experimente au condus la izolarea
secven"elor care folosesc segregarea mitotic! pentru extinderea la mai mult de 90% a
num!rului progeniturilor Leu- care con"in plasmida LEU. Aceste celule #i majoritatea
descenden"ilor lor cresc foarte bine pe mediu f!r! leucin!.

SLIDE 67. Experiment pentru eviden%ierea importan%ei telomerilor (c)
Dac! plasmidele circulare care con"in att secven"e CEN ct #i ARS sunt t!iate
cu o enzim! de restric"ie, ele devin lineare. Astfel de plasmide lineare nu se replic! n
drojdii dect dac! ele con"in secven"e telomerice speciale ligate la capetele lor. Primul
experiment de succes care a implicat transfec"ia celulelor de drojdie cu plasmide
lineare a fost realizat folosind capetele unei molecule de ADN care este cunoscut! ca
replicndu-se liniar n protozoarul ciliat Tetrahymena.
Cercet!rile au ar!tat c! ADN telomeric posed! un tip de structur!
caracteristic! care este ad!ugat! la capetele moleculelor de ADN de c!tre o enzim!
special! telomere-terminal transferaz! sau telomeraz!. Au fost determinate structurile
telomerilor pentru o serie de organisme, inclusiv la om; majoritatea sunt secven"e
oligomere repetitive cu un con"inut ridicat n G la nivelul catenei orientate 5-3 c!tre
telomer. Aceste secven"e simple sunt repetitive la capetele terminale ale
cromozomilor #i variaz! de la cteva sute de de perechi de baze la drojdii #i
protozoare la cteva mii la vertebrate. Cap!tul 3 ale catenelor bogate n G sunt
extinse cu 12-16 nucleotride dincolo de cap!tul 5 al catenei complementare bogate in
C. Aceast! regiune este legat! de proteine specifice care protejeaz! capetele
cromozomilor lineari de atacul exonucleazelor.
Enzimele care adaug! secven"e telomerice sunt complexe formate att din
proteine ct #i din ARN. Deoarece secven"a ARN serve#te drept matri"! pentru
ad!ugarea de dezoxiribonucleotide la capetele telomerilor, sursa de enzim! #i nu sursa
primerului ADN telomeric determin! secven"a ad!gat!. Astfel telomeraza este o
51
form! specializat! de revers-transcriptaz! care posed! propria sa matri"! ARN pentru
a realiza sinteza direct! a ADN.
Ac"iunea telomerazei este important! pentru prevenirea scurt!rii
cromozomilor n timpul replic!rii ADN. (oarecii knockout care nu pot produce
ARN-ul asociat telomerazei nu exprim! activitate telomerazic! #i telomerii lor se
scurteaz! considerabil cu fiecare genera"ie. Astfel de #oareci se pot reproduce normal
timp de trei genera"ii nainte ca absen"a telomerilor s! determine fuziunea terminal! a
cromozomilor #i pierderea acestora. Dup! patru genera"ii poten"ialul de reproducere a
acestor #oareci knockout intr! n declin #i se opre#te la a #asea genera"ie.

SLIDE 68. Secven%e consens la drojdii
O dat! ce regiunile centromerice de la drojdii care confer! segregare mitotic!
au fost clonate, secven"ele lor pot fi determinate )i comparate. Compararea
centromerilor diferi"i de la drojdii au eviden"iat trei regiuni (I, II #i III) care sunt
necesare unui centromer s! func"ioneze. Regiunea II pare s! aib! o lungime constant!
(78-86 baze) #i con"ine secven"e consens nedefinite, dar bogate n resturi A #i T. O
secven"! simpl! de la Drosphila care provine din regiunea centromeric! prezint!
unele similitudini cu regiunile I #i III de la drojdii, sugernd c! mecanisme similare
controleaz! segregarea la drojdii #i la eucariotele superioare.

SLIDE 69. Concluzii
Cromozomii eucariotelor pot fi vizualiza"i n timpul mitozei cnd ei
condenseaz! n metafaz!. Setul de cromozomi, n metafaz!, al unei celule se nume#te
cariotip. Speciile nrudite pot prezenta diferen"e importante la nivelul cariotipului,
indicnd c! informa"ii genetice similare pot fi organizate n diferite feluri;
Fiecare cromozom este compus dintr-o singur! molecul! de ADN,
mpachetat! n nucleozomi #i pliat! n fibre de 30 nm, care este ata#at! cu o protein!
agraf! care se leag! la anumite situsuri. Plieri suplimentare conduc la formarea unei
structuri mult mai compacte care se condenseaz! suplimentar odat! cu formarea
cromozomilor metafazici;
Cnd cromozomii metafazici decondenseaz! n timpul interfazei, anumite
regiuni, numite heterocromatin!, r!mn mult mai condensate dect regiunile de
cromatin! numite eucromatin!;
Trei tipuri de secven"e sunt necesare moleculelor lineare lungi de ADN pentru
a func"iona ca un cromozom n celulele de drojdii: o origine de replicare (ARS la
drojdii) o secven"! centromeric! (CEN) #i dou! secven"e telomerice (TEL) situate la
capete;
To"i cromozomii eucariotelor con"in una sau mai multe origini de replicare,
secven"e TEL, care sunt necesare replic!rii ADN, #i o secven"! CEN, care este util!
pentru segregarea eficient! a cromozomilor n cele dou! celule fiice;
Descoperirea elementelor func"ionale de la nivelul cromozomilor de drojdii,
care permit construc"ia unor cromozomi artificiali (vectorii YAC), face posibil!
clonarea unor fragmente de ADN de aproximativ un milion de pb.

SLIDE 70. Organitele care con%in ADN
De#i majoritatea ADN de la eucariote se afl! dispus n nucleu, anumite
cantit!"i de ADN sunt prezente #i n mitocondriile animalelor, plantelor #i fungilor #i
n cloroplastele plantelor. Aceste organite sunt principalele situri de producere a ATP,
n timpul fosforfil!rii oxidative din mitocondrie #i a fotosintezei din cloroplaste.
52
Multe dovezi indic! evolu"ia cloroplastelor #i mitocondriilor din bacterii printr-un
proces de endocitoz! ancestral!, cu formare de endosimbion"i. O dat! cu evolu"ia, o
parte a genelor bacteriene au fost transferate nucleului. Totu#i, mitocondriile #i
cloroplastele actuale au p!strat o molecule de ADN circular care codific! pentru
proteine esen"iale func"ion!rii organitelor #i pentru ARNr necesar procesului de
transcrip"ie de la acest nivel.
Mitocondriile con#in mai multe molecule de ADNmt
Mitocondriile sunt destul de mari pentru a putea fi vizualizate la microscopul
optic, iar ADN mitocondrial poate fi eviden"iat prin microscopie de fluorescen"!.
ADNmt este localizat n interiorul mitocondriei, n regiunea numit! matri"!. Dac!
judec!m dup! num!rul de puncte fluorescente galbene dintr-o celul! de Euglena
gracilis, aceasta con"ine cel pu"in 30 de molecule de ADNmt.
Dac! coloran"ii folosi"i pentru a vizualiza ADN nuclear #i mitocondrial, nu
afecteaz! cre#terea celular! #i diviziunea, replicarea ADNmt #i diviziunea re"elei
mitocondriale poate fi urm!rit! microscopic.
Astfel de studii demonstreaz! c! ADNmt se replic! n timpul interfazei. n
mitoz! fiecare celul! fiic! prime#te aproximativ acela#i num!r de mitocondrii, dar
cum nu exist! mecanisme pentru mp!r"irea exact! a mitocondriilor, unele celule
con"in mai mult ADNmt dect altele. Toate mitocondriile din celulele eucariote con"in
mai multe molecule de ADNmt. Astfel num!rul total de ADNmt ntr-o celul! depinde
de num!rul de mitocondrii, de m!rimea ADNmt #i de num!rul de ADNmt per
mitocondrie.

SLIDE 71. Dual staining reveals the multiple mitochondrial DNA
molecules in a growing Euglena gracilis cell

SLIDE 72. Genoamele mitocondriale de la om si la Saccharomyces
cerevisiae

SLIDE 73. Caracteristicile genelor mitocondriale

SLIDE 74. Mo&tenirea citoplasmatic$ a mitocondriilor mutante
Mo"tenirea citoplasmatic$ a mitocondriilor mutante
Studiile asupra mutan"ilor de drojdii #i a altor organisme unicelulare indic! c!
mitocondria exprim! mo#tenire citoplasmatic! #i deci trebuie s! con"in! propriul s!u
sistem genetic. De exemplu, muta"iile petite de drojdii manifest! anormalit!"i
structurale la nivelul mitocondriilor #i sunt incapabile s! realizeze forforilare
oxidativ!. Ca rezultat, celulele mici cresc mult mai ncet dect tipul s!lbatic #i
formeaz! colonii mici. ncruci#area genetic! ntre diferitele tulpini haploide de drojdii
demonstreaz! c! muta"ia petite nu segreg! cu nici o gen! sau cromozom nuclear
cunoscut. n ultimile studii, s-a constatat c! la majoritatea mutan"ilor petite exist!
dele"ii la nivelul ADNmt.
Mo#tenirea mitocondrial! la drojdii este biparental!: n timpul fuziunii
celulelor haploide, ambii p!rin"i contribuie egal cu citoplasm! la formarea diploidului.
La mamifere #i la majoritatea altor animale, totu#i sperma contribuie cu pu"in!
citoplasm! la zigot, virtual toate mitocondriile din embrion sunt derivate din cele ale
ovulului #i nu din sperm!. Studiile pe #oareci au demonstrat c! 99,99% din ADNmt
este mo#tenit pe cale matern!. La plantele superioare ADNmt este mo#tenit exclusiv
ntr-o manier! uniparental! de la p!rintele femel (oul) #i nu mascul (polenul).
53
ntregul genom mitocondrial de la un num!r mare de organisme a fost deja
clonat #i secven"ializat. ADNmt din aceste surse codific! pentru ARNr, ARNt #i
proteine mitocondriale esen"iale. Toate proteinele codificate de c!tre ADNmt sunt
sintetizate la nivelul ribozomilor mitocondriali. Toate polipeptidele sintetizate
mitocondrial nu sunt enzime complete ci numai subunit!"i ale unor complexe
multimere implicate n transportul electronilor #i n sinteza ATP. Majoritatea
proteinelor localizate n mitocondrie, cum sunt ADN #i ARN polimerazele, sunt
sintetizate de ribozomii citoplasmatici #i sunt importate n organite.
Muta#iile n ADNmt determin! diferite boli genetice
Severitatea bolii cauzate de o muta"ie n ADNmt depinde de natura muta"iei #i
de propor"ia de mutan"i si de tip s!lbatic prezente ntr-un tip particular de celul!. n
general, cnd se detecteaz! muta"ii n ADNmt, celulele con"in amestecuri de ADNmt
s!lbatec #i mutant condi"ie numit! heteroplasmie. De fiecare dat! cnd se divide o
celul! germinal! sau somatic! de mamifere, tipul mutant #i s!lbatec vor segrega
aleator n celulele fiice, a#a cum se ntmpl! la drojdii. Astfel, genotipul ADNmt
fluctueaz! de la o genera"ie #i de la o diviziune celular! la alta #i se poate deplasa fie
spre tipul s!lbatec dominant, fie spre tipul mutant. Dac! toate enzimele pentru
replicare #i cre#tere, cum sunt ADN #i ARN polimerazele, sunt importate din
citoplasm!, ADNmt mutant nu va prezenta vreun dezavantaj replicativ; mutan"ii care
presupun dele"ii mari ale ADNmt pot chiar s! prezinte un avantaj selectiv n replicare.
Toate celulele au mitocondrii, dar muta"iile n ADNmt afecteaz! numai
anumite "esuturi. Cele mai afectate care necesit! mult ATP produs prin fosforilare
oxidativ!, #i "esuturile care necesit! ca majoritatea sau ntreg con"inutul de ADNmt
din celul! pentru a sintetiza preteine mitocondriale func"ionale. De exemplu,
neuropatia optic! ereditar! Leber (degenerarea nervului optic acompaniat! de orbire)
este cauzat! de o muta"ie missense n ADNmt al genei care codific! subunitatea 4 a
NADH-CoQ reductaza.
Unele din dele"iile mari ale ADNmt cauzeaz! un alt set de maladii care
include oftalmopplegia extern! cronic! progresiv! #i sindromul Kearns-Sayre care
sunt caracterizate prin defecte ale ochiului #i n sindrom prin degenerarea sistemului
nervos. O a treia condi"ie care determin! fibre musculare neregulate (cu mitocondrii
asamblate impropriu) #i mi#c!ri bru#te necontrolate asociate, este datorat! unei
singure muta"ii n bucla TYCG a ARNt pentru lizin!. Ca rezultat al acestei muta"ii,
transla"ia mai multor proteine mitocondriale este aparent blocat!.
A#a cum am discutat anterior structura cloroplastelor este similar! n multe
privin"e cu aceea a mitocondriilor. Ca #i acestea, cloroplastele con"in mai multe copii
de ADN #i ribozomi care codific! pentru proteine ale cloroplastelor folosind codul
genetic standard. Alte proteine din cloroplaste sunt fabricate n citosol #i sunt
ncorporate n cloroplaste dup! transla"ie.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160000
pb, n func"ie de specie. Completa secven"ializare a a ADN din mai multe cloroplaste
de exemplu pl!mn (121024 pb) #i tutun (155844). Genomul cloroplastelor din
pl!mn prezint! dou! secven"e repetitive inverse fiecare constnd n 10058 pb care
con"in genele ARNr #i alte cteva gene duplicate. n ciuda diferen"ei de m!rime,
ntreaga organizare #i compozi"ia genelor de la pl!mn #i de la tutun este foarte
similar. Diferen"a de m!rime provine n primul rnd repeti"iilor inversate n care
anumite gene sunt duplicate.
Din aproximativ 120 de gene din cloroplaste, aproape 60 sunt implicate n
transcrip"ia #i transla"ia ARN #i include genele care codific! pentru ARNr, ARNt,
subunit!"ile ARN polimerazei #i proteinele ribozomale. Aproximativ 20 de gene
54
codific! pentru subunit!"ile complexelor transportoare de electroni din cloroplast #i
pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea sunt codificate de c!tre genomul
cloroplastelor cele dou! subunit!"i mari ale ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza, care este
implicat! n fixarea dioxidului de carbon n timpul fotosintezei.
Reflectnd originea endosimbiotic! a cloroplastelor unele regiuni ale ADN din
cloroplaste sunt similare cu cele ale ADN actual de bacterii. De exemplu, ADN din
cloroplaste codific! patru subunit!"i ale ARN polimerazei care sunt omologe cu
subunit!"ile ARN polimerazei de la E. coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste
codific! 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine ribozomale de la E. coli; ordinea
acestor gene este similar! n cele dou! tipuri de ADN. ADN din cloroplastele
pl!mnului posed! cteva gene care nu sunt n ADN din cloroplastele tutunului #i
invers. Acest lucru indic! probabil existen"a unui schimb ancestral de gene ntre ADN
din cloroplaste #i din nucleul plantelor studiate.

SLIDE 75. ADN mitocondrial uman
Surprinz!tor, m!rimea moleculelor de ADNmt, num!rul #i natura proteinelor
pe care acestea le codific!, #i chiar codul genetic mitocondrial, variaz! mult ntre
diferitele organisme.
ADNmt uman, o molecul! circular! care a fost complet secven"ializat!, este
printre cele mai mici molecule de ADNmt cunoscute deoarece con"ine 16 569 perechi
de baze. Acesta codific! pentru dou! molecule de ARNr prezen"i n robozomii
mitocondriali #i pentru cei 22 ARNt folosi"i n procesul de transla"ie mitocondrial.
ADNmt uman con"ine 13 secven"e care ncep cu codonul ATG (metionin!) #i
terminate cu un codon STOP #i sunt destul de lungi pentru a codifica o polipeptid!
mai mare de 50 aminoacizi; toate proteinele posibil codificate de aceste faze de
lectur! au fost identificate. ADNmt de la mamifere, spre deosebire ADN nuclear, este
lipsit de introni #i nu con"ine secven"e necodante.
ADNmt de la nevertebrate are aproximativ aceea#i m!rime cu ADNmt uman,
dar ADNmt de la drojdii este de aproximativ de 5 ori mai mare (78 000 pb).
Moleculele de ADNmt de la drojdii #i alte eucariote superioare codific! mul"i dintre
produ#ii acelora#i gene ca #i cele de la mamifere, ca #i pentru alte gene care la
mamifere sunt dispuse n nucleii celulelor de mamifere.
In contrast cu alte eucariote, care con"in un singur tip de ADNmt, plantele
con"in mai multe tipuri de ADNmt care par s! se recombine unele cu altele. ADNmt
de la plante este mult mai mare ca m!rime dect la alte organisme. Se poate ntmpla
ca la o singur! specie s! existe diferen"e foarte mari n m!rimea ADNmt (la pepenele
verde 330 000 pb; la pepenele galben 2 500 000 pb).
Spre deosebire de animale, drojdii #i fungii, ADNmt de la plante con"in gene
care codific! ARNr 5S, care este prezent numai n ribozomii mitocondriilor plantelor
#i a subunit!"ii alfa a ATP-azei F1. ARNr de la plante este mult mai mare dect cel de
la alte eucariote. Secven"ializarea recent! a uneia dintre cele mai mici molecule de
ADNmt de la plante a eviden"iat c! m!rimea este datorat! existen"ei regiunilor
necodante #i a secven"elor duplicate.
Diferen"ele de m!rime #i de capacitate codant! a ADNmt de la diferite
organisme reflecteaz! mi#carea ADN ntre mitocondrie #i nucleu n timpul evolu"iei.
Dovezi directe ale acestei mi#c!ri vin de la observa"ia c! multe proteine codificate de
ADNmt de la diferite specii sunt codificate de ADN nuclear la altele. Se pare c! este
vorba de o deplasare a genelor de la mitocondrie la nucleu #i invers, n timpul
evolu"iei.
55
Cel mai elocvent exemplu este cel al genei cox II, care codific! subunitatea 2
a citocrom c oxidazei. Aceast! gen! se g!se#te n ADNmt de la toate organismele
studiate cu excep"ia unei specii de legume numit! Bob (mung bean) unde gena cox II
este nuclear!.
Multe molecule de ARN transcrip"i de la plante sunt procesate (editate) prin
ac"iunea unei enzime care catalizeaz! transformarea unor resturi selec"ionate C n U #i
ocazional a U n C. Gena nuclear! cox II de la mung bean corespunde mai bine
transcrip"ilor procesa"i dect genei mitocondriale cox II prezent! n alte legume.
Aceste date sunt dovezi clare ale deplas!rii genei cox II din mitocondrie n nucleu
printr-un proces care implic! participarea unei molecule de ARN. Probabil, un
mecanism de revertranscrip"ie similar celui prin care pseudogenele procesate sunt
generate n genomul nuclear prin intermediul ARNm codificat nuclear.

SLIDE 76. Codul genetic mitocondrial difer$ de codul genetic standard
To"i transcrip"ii ARN mitocondriali #i produ#ii lor de transla"ie r!mn n
mitocondrie. Unele proteine ribozomale (una sau dou!) depinznd de specie sunt
importate din citosol.
Reflectnd vechimea bacterian! a mitocondriilor, ribozomii mitocondriali se
aseam!n! cu cei de la bacterii #i difer! de ribozomii citoplasmatici prin moleculele de
ARN #i prin compozi"ia n proteine. De exemplu cloramfenicolul blocheaz! sinteza
proteic! la bacterii dar #i n mitocondrii, dar nu #i ribozomii citoplasmatici.
Cicloheximida inhib! sinteza proteic! a ribozomilor citoplasmatici dar nu o afecteaz!
pe cea de la bacterii sau din mitocondrii. n culturile de celule de mamifere numai
proteinele sintetizate n prezenta cicloheximidei sunt codificate de ADNmt #i produse
de ribozomii mitocondriali.
Codul genetic folosit n mitocondriile animale #i ale fungilor este diferit de
codul standard folosit de toate genele procariote #i eucariote; de remarcat c! acest cod
difer! chiar #i pentru mitocondrii de la specii diferite. Cum a ap!rut acest fenomen n
cursul evolu"iei este misterios. De exemplu, UGA, este n mod normal un codon
STOP, dar este citit ca triptofan n mitocondriile umane #i de fungi; totu#i n
mitocondriile plantelor UGA este nc! un codon STOP. AGA #i AGG, codonii
nucleari standard pentru arginin! codific! de asemenea pentru arginin! n
mitocondriile fungilor #i plantelor, dar reprezint! codoni STOP pentru ADNmt de la
mamifere #i pentru serin! la ADNmt de la Drosophila.
Mitocondriile plantelor par s! utilizeze codul genetic standard. Totu#i,
compara"iile secven"elor n aminoacizi ale proteinelor mitocondriale de la plante cu
secven"a nucleotidic! a ADNmt sugereaz! c! CGG poate codifica fie pentru arginin!
(aminoacidul standard) sau triptofan. Aceast! nespecificitate aparent! a codului
mitocondrial este explicat! prin editarea transcrip"ilor ARN mitocondriali, care pot
transforma resturile de citozin! n uracil. Dac! o secven"! CGG este editat! n UGG,
codonul specific! triptofanul, aminoacidul standard pentru UGG, n timp ce codonii
CGG ne-edita"i codific! pentru arginin!. Astfel sistemul de transla"ie n mitocondriile
plantelor utilizeaz! codul genetic standard.

SLIDE 77. M$rimea genoamelor mitocondriilor &i cloroplastelor
Genoamele organitelor din celulele eucariote
Majoritatea celulelor eucariote posed! genoame mitocondriale #i toate
eucariotele capabile de fotosintez! au genoame n structura cloroplastelor. Ini"ial, s-a
considerat c! genoamele organitelor sunt molecule de ADN circulare. Aceasta
deoarece h!r"ile genetice #i fizice ob"inute, prin analiza de restric"ie a genoamelor din
56
mitocondrii #i din cloroplaste, erau circulare. n anumite organite, studiile de
microscopie electronic! au eviden"iat att molecule circulare ct #i liniare. La nceput,
s-a presupus c! formele liniare ar putea reprezenta fragmente ale genoamelor circulare
care s-au rupt n procesul de preparare. Din 1998 a fost admis c! unele eucariote
inferioare (Paramecium, Chlamydomonas #i multe su#e de drojdii) posed! structuri
lineare la nivelul genoamelor mitocondriale.
Surprinz!tor, m!rimea moleculelor de ADN mitocondrial (ADNmt), num!rul
#i natura proteinelor pe care acestea le codific!, #i chiar codul genetic mitocondrial,
variaz! mult ntre diferitele tipuri de organisme.
Majoritatea animalelor multicelulare au genoame mitocondriale mici cu o
organizare genetic! compact!, genele fiind separare numai de spa"ii foarte reduse.
ADNmt uman este tipic pentru aceast! categorie. Genomul mitocondrial este o
molecul! circular! care a fost complet secven"ializat! #i care con"ine 16 569 perechi
de baze, fiind printre cele mai mici molecule de acest tip. Acesta codific! pentru dou!
molecule de ARNr prezente n ribozomii mitocondriali #i pentru cei 22 ARNt folosi"i
n procesul de transla"ie de la acest nivel. ADNmt uman con"ine 13 secven"e care
ncep cu codonul ATG (metionin!) #i se termin! cu un codon STOP. Aceste faze de
lectur!, destul de lungi pentru a codifica polipeptide de aproximativ 50 aminoacizi, au
fost identificate cu proteinele codificate. ADNmt de la mamifere, spre deosebire ADN
nuclear, este lipsit de introni #i nu con"ine secven"e necodante.
ADNmt de la nevertebrate are aproximativ aceea#i m!rime cu cel uman, n
timp ce ADNmt de la drojdii este de aproximativ de 5 ori mai mare (78 000 pb).
Moleculele de ADNmt de la drojdii #i de la alte eucariote superioare posed! gene care
la mamifere sunt dispuse n nucleii celulelor.
In contrast cu alte eucariote, care con"in un singur tip de ADNmt, plantele
con"in mai multe tipuri de ADNmt care par s! se recombine unele cu altele. Aceste
molecule de la plante sunt mult mai mari dect la alte organisme. Se poate ntmpla
ca la o singur! specie s! existe diferen"e foarte mari n m!rimea ADNmt (la pepenele
verde 330 000 pb; la pepenele galben 2 500 000 pb).
Spre deosebire de animale, drojdii #i fungii, ADNmt de la plante con"ine gene care
codific! pentru ARNr 5S, care este prezent numai n ribozomii mitocondriilor
plantelor, #i pentru subunitatea ! a ATP-azei F1. ARNr de la plante este mult mai
mare dect cel de la alte eucariote. Secven"ializarea recent! a uneia dintre cele mai
mici molecule de ADNmt de la plante a eviden"iat c! m!rimea este datorat! existen"ei
de regiuni necodante #i de secven"e duplicate.
Diferen"ele de m!rime #i de capacitate codant! a ADNmt de la diferite
organisme poate reflecta un anumit schimb de ADN, ntre mitocondrie #i nucleu, n
cursul evolu"iei. Dovezi directe, n favoarea acestei afirma"ii au fost furnizate de
eviden"ierea unor proteine ale c!ror gene sunt la unele specii localizate n nucleu #i la
altele n mitocondrie. Se pare c! este vorba de o deplasare a genelor din mitocondrie
n nucleu #i invers, n timpul evolu"iei. Cel mai elocvent exemplu este cel al genei cox
II, care codific! subunitatea 2 a citocrom c oxidazei. Pentru toate organismele
studiate, aceast! gen! se g!se#te n ADNmt, cu excep"ia unei specii de legume numit!
Bob (mung bean) unde gena cox II este nuclear!.

SLIDE 78. Caracteristicile genelor mitocondriale
Multe molecule de ARN transcrise de la plante sunt procesate prin ac"iunea
unei enzime care catalizeaz! transformarea unor resturi selec"ionate C n U #i
ocazional a U n C. Gena nuclear! cox II de la bob este mai apropiat! structural de
moleculele de ARN procesate dect de gena mitocondrial! cox II prezent! la alte
57
legume. Aceste date sunt dovezi ale deplas!rii genei cox II din mitocondrie n nucleu
printr-un proces care implic! participarea unei molecule de ARN. Este posibil un
mecanism de reverstranscrip"ie similar celui prin care pseudogenele procesate sunt
generate n genomul nuclear prin intermediul ARNm.
Structura cloroplastelor este similar! n multe privin"e cu aceea a
mitocondriilor. Ca #i acestea, cloroplastele con"in mai multe copii de ADN #i
ribozomi care codific! pentru proteine din cloroplaste, folosind codul genetic
standard. Alte proteine specifice din cloroplastelor sunt fabricate n citoplasm! #i sunt
transportate, dup! traducere.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160 000
pb, n func"ie de specie. Multe dintre moleculele de ADN din cloroplaste au fost
complet secven"ializate. Genomul cloroplastelor din planta a c!rei denumire popular!
este pl!mn prezint! dou! secven"e repetitive inverse fiecare constnd n 10 058 pb
care con"in genele ARNr #i alte cteva gene duplicate. n ciuda diferen"ei de m!rime
(pl!mn 121 024 pb; tutun 155 844), ntreaga organizare #i compozi"ia genelor de
la pl!mn #i de la tutun este foarte similar!. Diferen"a de m!rime apare, n primul
rnd, de la repeti"iile inversate provenite din duplicarea anumitor gene.
Din aproximativ 120 de gene codificate de ADN din cloroplaste, aproape 60
sunt implicate n transcrip"ia #i transla"ia ARN #i includ genele care codific! pentru
ARNr, ARNt, subunit!"ile ARN polimerazei #i proteinele ribozomale. Aproximativ
20 de gene codific! pentru subunit!"ile complexelor transportoare de electroni din
cloroplast #i pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea, sunt codificate de c!tre
genomul cloroplastelor cele dou! subunit!"i mari ale ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza,
care este implicat! n fixarea dioxidului de carbon n timpul fotosintezei.
Reflectnd originea endosimbiotic! a cloroplastelor unele regiuni din genomul
acestora sunt similare cu cele ale ADN de la bacteriile actuale. De exemplu, ADN din
cloroplaste codific! patru subunit!"i ale ARN polimerazei care sunt omologe cu
subunit!"ile ARN polimerazei de la E. coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste
codific! 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine ribozomale de la E. coli. Ordinea
genelor este similar! n cele dou! tipuri de ADN. ADN din cloroplastele pl!mnului
posed! cteva gene care nu sunt n ADN din cloroplastele tutunului #i invers. Acest
lucru poate indica un posibil schimb ancestral ntre cloroplaste #i nucleu.

SLIDE 79. CONCLUZII
Se consider! c! mitocondriile au evoluat din bacterii care prezint! o rela"ie
simbiotic! cu celulele ancestrale care con"in un nucleu eucariot. Majoritatea genelor
originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear n timpul evolu"iei,
organitele diferitelor organisme p!strnd diferite gene;
ADNmt de la mamifere are numai aprox 16 kb; acesta nu con"ine introni #i
prezint! numai o mic! regiune neconcordant!. ADNmt de la plante #i drojdii este mult
mai mare. Toate tipurile de ADNmt codific! pentru ARNr, ARNt #i pentru cteva
proteine implicate n transportul mitocondrial al electronilor #i n sinteza ATP;
Majoritatea ADNmt este mo#tenit mai degrab! din ou (ovul) dect din sperm!,
muta"iile n ADNmt fiind mo#tenite pe linie matern!;
Ribozomii mitocondriali se aseam!n! cu ribozomii bacterieni, ca structur!,
sensibilitate la cloramfenicol #i rezisten"! la cicloheximid!;
Codul genetic pentru ADNmt de la animale #i fungi difer! de cel bacterian #i
de cel al genomului nuclear prin aceea c! numero#i codoni codific! pentru aminoacizi
sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par s! foloseasc! codul
standard nuclear #i bacterian;
58
Muta"iile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil
datorit! necesit!"ii crescute de ATP a acestor "esuturi. n general, pacien"ii prezint!, n
celule, un amestec de mitocondrii care con"in ADNmt normal #i mutant
(heteroplasmie). Severitatea fenotipic! este mai mare cu ct propor"ia de ADNmt este
mai mare;
ADN din cloroplaste este circular #i con"ine aproximativ 120-160 kb, n
func"ie de speciile de plante. Acestea codific! pentru aproximativ 120 de proteine #i
folosesc codul genetic standard.
A#a cum am discutat anterior structura cloroplastelor este similar! n multe privin"e
cu aceea a mitocondriilor. Ca #i acestea, cloroplastele con"in mai multe copii de ADN
#i ribozomi care codific! pentru proteine ale cloroplastelor folosind codul genetic
satndard. Alte proteine din cloroplaste sunt fabricate n citosol #i sunt incorporate n
cloroplaste dup! transla"ie.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160000
pb, n func"ie de specie. Completa secven"ializare a a ADN din mai multe cloroplaste
de exemplu pl!mn (121024 pb) #i tutun (155844). Genomul cloroplastelor din
pl!mn prezint! dou! secven"e repetitive inverse fiecare constnd n 10058 pb care
con"in genele ARNr #i alte cteva gene duplicate. n ciuda diferen"ei dee m!rime,
ntreaga organizare #i compoti"ia genelor de la pl!mn #i de la tutun este foarte
similar!; Diferen"a de m!rime provine n primul rnd repeti"iilor inversate n care
anumite gene sunt duplicate.
Din aproximativ 120 de gene din cloroplaste, aproape 60 sunt implicate n
transcrip"ia #i transla"ia ARN #i include genele care codific! pentru ARNr, ARNt,
subunit!"ile ARN polimerazei #i proteinele ribozomale. Aproximativ 20 de gene
codific! pentru subunit!"ile complexelor transportoare de electroni din cloroplast #i
pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea sunt codificate de c!tre genomul
cloroplastelor cele dou! subunit!"i mari ale Ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza, care
este implicat! n fixarea dioxidului de carbon n timpul fotosintezei.
Reflectnd originea endosimbiotic! a cloroplastelor unele regiuni ale ADN din
cloroplaste sunt similare cu cele ale ADN actual de bacterii. De exemplu, ADN din
cloroplaste codific! patru subunit!"i ale ARN polimerazei care sunt omologe cu
subunit!"ile ARN polimerazei de la E. Coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste
codific! 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine robozomale de la E. Coli; ordinea
acestor gene este similar! n cele dou! tipuri de ADN. ADN din cloroplastele
pl!mnului posed! cteva gene care nu sunt n ADN din cloroplastele tutunului #i
invers. Acest lucru indic! probabil existen"a unui schimb ancestral de gene ntre ADN
din cloroplaste #i din nucleul plantelor studiate.








59

NOTE DE CURS BM2
ORGANIZAREA MOLECULAR!, EXPRESIA %I REGLAREA
GENELOR EUCARIOTE
SLIDE 2. Structura &i expresia genelor eucariote
Pot fi ob"inute segmente de ADN pur #i specific din orice genom, n cantitate
suficient! astfel nct s! permit! o caracterizare chimic! complet!; utilizarea
endonucleazelor de restric"ie #i analiza secven"elor nucleotidice au f!cut din aceste
caracteriz!ri ni#te analize de rutin!.
M!rimea #i complexitatea genoamelor eucariote este formidabil!. Secven"a
nucleotidic! a unei gene #i a segmentelor care o flancheaz! nu ne furnizeaz!
informa"ii privind: i) modul de ac"iune al genei; ii) modului de reglare a expresiei sale
n timpul dezvolt!rii #i diferen"ierii celulare #i nici n cazul adapt!rii la modific!rile de
mediu; iii) modul n care expresia genelor este coordonat! pentru a asigura echilibrul
fiziologic caracteristic al celulelor #i organismelor s!n!toase; iv) modul n care,
apari"ia unui produs al genei sau varia"ia vitezei de expresie a unei gene pot afecta
func"ionarea normal! sau pot determina maladii.
Informa"ii suplimentare: genele clonate sunt introduse ntr-o celul! prin
transfec"ie sau microinjec"ie, ele sunt adesea exprimate #i pot chiar r!spunde unor
influen"e reglatoare specifice.
Permite: a) analiza activit!"ilor relative ale genelor normale #i mutante #i a
semnalelor de reglare; b) eviden"ierea alelelor mutante spontan; c) construirea de
mutan"ii experimental care pot fi analiza"i.
Consecin"a real! a dezvolt!rii tehnicilor ADN recombinat este realizarea de
studii de interdependen"! ntre structur! #i func"ie.
M!rimea #i complexitatea genoamelor eucariote este formidabil!, aceasta nu
mai reprezint! o barier! n cunoa#terea detaliilor moleculare de organizare #i
structur!. Singurele obstacole existente sunt timpul #i resursele necesare unei cercet!ri
de o asemenea amploare. La nceput au fost necesare cinci persoane, timp de un an,
pentru a determina secven"a de 50 kpb a genomului fagului $. Acum, folosind
metodele perfec"ionate de secven"ializare au fost nregistrate progrese substan"iale
reu#indu-se deja determinarea celor 4 milioane de perechi de baze din genomul E.
coli, secven"ializarea genomului Saccharomices cerevisiae #i demararea cu succes a
secven"ializ!rii genomului uman (de 10 ori mai mare dect E. coli).
Secven"a nucleotidic! a unei gene #i a segmentelor care o flancheaz! nu ne
furnizeaz! informa"ii privind modul de ac"iune al genei, asupra modului de reglare a
expresiei sale n timpul dezvolt!rii #i diferen"ierii celulare #i nici n cazul adapt!rii la
modific!rile de mediu. Secven"a nu relev! nici modul n care expresia genelor este
coordonat! pentru a asigura echilibrul fiziologic caracteristic al celulelor #i
organismelor s!n!toase #i nici cum apari"ia unui produs al genei sau varia"iei vitezei
de expresie a unei gene pot afecta func"ionarea normal! sau pot determina maladii.
Pentru a n"elege semnifica"ia fiziologic! a detaliilor moleculare este necesar! o
analiz! biochimic!. n aceste situa"ii tehnicile de biologie molecular! furnizeaz! o
abordare experimental! puternic!. Dac! genele clonate sunt introduse ntr-o celul!
prin transfec"ie sau microinjec"ie, ele sunt adesea exprimate #i pot chiar r!spunde unor
influen"e reglatoare specifice. Aceasta permite analiza activit!"ilor relative ale genelor
60
normale #i mutante #i a semnalelor de reglare; alelele mutante spontan #i mutan"ii
construi"i experimental pot fi analiza"i. Astfel, consecin"a real! a dezvolt!rii tehnicilor
ADN recombinat este faptul c! permite realizarea de studii de interdependen"! ntre
structur! #i func"ie. Aceast! abordare analitic!, genetica invers!, nlocuie#te
numeroasele metode ale geneticii clasice #i amplific! extraordinar posibilit!"ile
cercet!rilor genetice.
Aplica"iile geneticii clasice #i abord!rile citogenetice sunt n mod necesar
limitate pentru organisme de tipul omului, dar genomul acestora poate fi studiat
actualmente la nivel fundamental, ceea ce acum un deceniu nu era imaginabil dect
pentru bacterii. Cteva micrograme de ADN izolat din limfocite #i transformat ntr-o
banc! pot fi utilizate pentru a determina rela"ia care exist! ntre genotip #i fenotip.
Mai mult, universalitatea tehnicilor ADN recombinat semnific! c! genoamelor tuturor
organismelor contemporane (#i chiar a organismelor vechi sau disp!rute, dar din ale
c!ror resturi se poate prepara ADN) sunt accesibile #i c! este posibil! stabilirea
diferen"elor dar #i similitudinilor existente ntre acestea. Se pot ob"ine indica"ii
importante relativ la evolu"ia diferitelor genoame plecnd de la aceste compara"ii,
ad!ugnd astfel modalit!"i de analiz! geneticii clasice care studiaz! problemele de
evolu"ie.
Cu toat! evolu"ia metodelor de biologie molecular! #i progreselor deosebite
realizate n domeniu este necesar! o munc! sus"inut! deoarece marea majoritate a
caracteristicilor sistemelor genetice eucariote r!mne de descoperit. Cu toate aceste
n cei peste 20 de ani de cnd aceste metode au fost dezvoltate au fost elucidate o
serie de aspecte unice ale genoamelor organismelor eucariote.
Primele no"iuni relativ la structura molecular! a genelor #i a organiz!rii lor n
genomul eucariotelor au fost rezultatul studiului ini"ial pe organisme procariote.
Structura "i expresia genelor eucariote
Chiar nainte de cunoa#terea structurii genelor eucariote #i procariote, se #tia
c! sistemele genetice procariote #i eucariote posed! propriet!"i fundamentale comune.
n cele dou! cazuri materialul genetic este ADN, replicarea este semiconservativ!,
fluxul de informa"ie genetic! este direc"ionat de la ADN c!tre ARN #i proteine #i
codul genetic este universal. Pare rezonabil s! consider!m c! organismele eucariote,
mai ales cele multicelulare, con"in mai multe gene dect procariotele #i c! posed!
mecanisme de control suplimentare care permit reglarea proceselor de dezvoltare
pentru a realiza integrarea diferitelor lor func"iuni. Dar, era general admis c! structura
de baz! a genelor #i organizarea informa"iei genetice este asem!n!toare n cele dou!
tipuri de genoame. Aceste convingeri au disp!rut dup! primele analize ale genelor #i
genoamelor eucariote.

SLIDE 3. Defini%ia molecular$ a unei gene; gene ntrerupte
Gene ntrerupte
La sfr#itul anilor 1970, era evident c! secven"ele care codificau pentru
proteine n genele de mamifere nu erau, n mod necesar, furnizate de un singur
segment de ADN, cum este cazul virtual al tuturor genelor procariote. Din contr!,
regiunile codante sunt discontinue, ntrerupte de segmente de ADN care nu codific!
(necodante); acestea au fost denumite secven"e intercalare sau introni iar secven"ele
codante sunt numite exoni. n continuare, a devenit evident faptul c! intronii sunt
prezen"i la marea majoritate a genelor de mamifere dar, n acela#i timp, sunt prezente
n genoamele altor eucariote #i a anumitor virusuri animale.
61
Primele suspiciuni privind existen"a intronilor au ap!rut n momentul studierii
virusurilor animale. La acestea s-a demonstrat lipsa de colinearitate ntre secven"a
nucleotidic! a ADN #i cea a ARNm care deriv! din acesta; de fapt se p!rea c! ARNm
este ob"inut din fragmente de ADN viral care nu prezint! continuitate. n acela#i mod,
secven"ele ARNm pentru globin! erau capabile s! se hibridizeze cu o colec"ie de
fragmente din genom ob"inute prin ac"iunea endonucleazelor de restric"ie care,
asociate, formau un segment mult mai lung dect lungimea mesagerului nsu#i.
Aceast! descoperire sugera c! segmentele care constituiau mesagerul erau diseminate
de-a lungul genomului corespunz!tor.


SLIDE 4. Compara%ie ARNm la procariote &i eucariote
Procariote: operonii bacterieni ARNm este policistronic; Eucariote: ARNm
este monocistronic "i con#ine exoni "i introni.
Figura:ARN transcris de la nivelul unei unit!#i complexe (albastru) poate fi procesat
pe mai multe c!i pentru a conduce la unul sau la mai multe unit!#i ARNm
monocistronice func#ionale. Liniile punctate marchez! nl!turarea intronilor.
a) O unitate de transcrip#ie al c!rui transcript primar posed! dou! situsuri
poli(A) poate da na"tere la dou! molecule de ARNm diferite prin folosirea alternativ!
a exonilor sitiua#i n 3.
b) O unitate transcrip#ional! complex! al c!rei transcript primar sufer! nl!turarea
exonilor n timpul proces!rii produce molecule alternativede ARNm care au aceea"i
exoni n 5 "i n 3. n acest exemplu, unele tipuri celulare exprim! ARNm care
con#ine exonul 3 n timp ce altele exonul 2 este alipit exonului 4 n care lipse"te
exonul 3. Muta#iile produse n (a) "i (b) afecteaz! proteinele ambelor forme
alternative de ARNm. n contrast, muta#iile (desemnate prin c "i d) prezente n
interiorul exonului unic al uneia dintre formele alternative de ARNm afecteaz! numai
proteina codificat! de c!tre acest ARNm.
Cea mai mare parte a genelor care codific! pentru polipeptide posed! cel pu"in
un intron, un num!r mare de gene avnd mai mul"i. Totu#i, prezen"a intronilor nu este
obligatorie existnd #i gene lipsite. Genele care codific! pentru moleculele de ARN
func"ionale cum sunt ARNt #i ARNr pot s! posede #i ele secven"e intercalare, dar
ntreruperile la nivelul acestor gene sunt mai pu"in frecvente. n general, cantitatea de
ADN prezent! n introni dep!#e#te cu mult pe cea din exoni. Existen"a intronilor #i
enorma diversitate a num!rului #i a m!rimii lor explic! num!rul mare de molecule de
ARN nuclear la eucariote #i totodat! eterogenitatea foarte pronun"at! #i lungimea lor
considerabil!. Moleculele de ARN nuclear eterogen (ARNh) reprezint! o colec"ie de
transcrip"i pentru numeroase gene nucleare. Unii dintre ace#tia sunt transcrip"i
primari, m!rimea lor fiind identic! cu cea a genei, iar al"ii sunt molecule par"ial
maturate care sunt lipsite de un num!r variabil de introni. Este foarte interesant c!
moleculele de ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel de colec"ii complexe de
precursori.

SLIDE 5. Genomul eucariotelor: unit$%i de transcrip%ie simple &i
complexe
Moleculele de ARN nuclear heterogen (ARNh) reprezint! o colec"ie de
transcrip"i pentru numeroase gene nuclare:
i) transcrip"i primari, m!rimea lor este identic! cu cea a genei;
62
ii) molecule par"ial maturate care sunt lipsite de un num!r variabil de introni.
Moleculele de ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel de colec"ii complexe de
precursori.
Figura:
ARN transcris de la nivelul unei unit!#i complexe (albastru) poate fi procesat pe mai
multe c!i pentru a conduce la unul sau la mai multe unit!#i ARNm monocistronice
func#ionale. Liniile punctate marchez! nl!turarea intronilor.
a) O unitate de transcrip#ie al c!rui transcript primar posed! dou! situsuri poli(A)
poate da na"tere la dou! molecule de ARNm diferite prin folosirea alternativ! a
exonilor sitiua#i n 3.
b) O unitate transcrip#ional! complex! al c!rei transcript primar sufer! nl!turarea
exonilor n timpul proces!rii produce molecule alternativede ARNm care au aceea"i
exoni n 5 "i n 3. n acest exemplu, unele tipuri celulare exprim! ARNm care
con#ine exonul 3 n timp ce altele exonul 2 este alipit exonului 4 n acre lipse"te
exonul 3. Muta#iile produse in (a) "i (b) afecteaz! proteinele ambelor forme
alternative de ARNm. n contrast, muta#iile (desemnate prin c "i d) prezente n
interiorul exonului unic al uneia dintre formele alternative de ARNm afecteaz! numai
proteina codificat! de c!tre acest ARNm.

Cea mai mare parte a genelor care codific! pentru polipeptide posed! cel pu"in
un intron, un num!r mare de gene avnd mai mul"i. Totu#i, prezen"a intronilor nu este
obligatorie existnd #i gene lipsite. Genele care codific! pentru moleculele de ARN
func"ionale cum sunt ARNt #i ARNr pot s! posede #i ele secven"e intercalare, dar
ntreruperile la nivelul acestor gene sunt mai pu"in frecvente. n general, cantitatea de
ADN prezent! n introni dep!#e#te cu mult pe cea din exoni. Existen"a intronilor #i
enorma diversitate a num!rului #i a m!rimii lor explic! num!rul mare de molecule de
ARN nuclear la eucariote #i totodat! eterogenitatea foarte pronun"at! #i lungimea lor
considerabil!. Moleculele de ARN nuclear eterogen (ARNh) reprezint! o colec"ie de
transcrp"i pentru numeroase gene nucleare. Unii dintre ace#tia sunt transcrip"i primari,
m!rimea lor fiind identic! cu cea a genei, iar al"ii sunt molecule par"ial maturate care
sunt lipsite de un num!r variabil de introni. Este foarte interesant c! moleculele de
ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel de colec"ii complexe de precursori.

SLIDE 6. Variabilitatea num$rului de introni &i exoni &i m$rimea
acestora la diferite specii
Analizele de structur! #i func"ie ale genelor eucariote au eviden"iat c! genele
procariote #i eucariote sufer! puternic din punct de vedere al complexit!"ii secven"elor
scurte (motive) responsabile de reglarea transcrip"iei. Au fost eviden"iate trei tipuri de
motive n genele procariote. Un prim tip include secven"ele care determin! debutul
transcrip"iei: n E. coli, promotorii sunt defini"i prin dou! regiuni de ADN prezente la
10 #i 35 perechi de baze n amonte fa"! de situsul de ini"iere a transcrip"iei. Un al
doilea tip de element marcheaz! terminarea genei sau a unui grup de gene #i
favorizeaz! terminarea transcrip"iei. n sfr#it, exist! secven"e de ADN adiacente sau
nc!lecate n raport cu promotorii, care sunt recunoscute de efectori specifici cum
sunt represorii, activatorii #i terminatorii, care moduleaz! transcrip"ia. Toate aceste
secven"e de reglare specific! depind de interac"iunile care le realizeaz! cu proteinele
specifice care au rolul de a influen"a expresia secven"elor codante vecine.


63
SLIDE 7. Reglarea expresiei genelor procariote
Analizele de structur! #i func"ie ale genelor eucariote au eviden"iat c! genele
procariote #i eucariote sufer! puternic din punct de vedere al complexit!"ii secven"elor
scurte (motive) responsabile de reglarea transcrip"iei. Au fost eviden"iate trei tipuri de
motive n genele procariote. Un prim tip include secven"ele care determin! debutul
transcrip"iei: n E. coli, promotorii sunt defini"i prin dou! regiuni de ADN prezente la
10 #i 35 perechi de baze n amont fa"! de situsul de ini"iere a transcrip"iei. Un al
doilea tip de element marcheaz! terminarea genei sau a unui grup de gene #i
favorizeaz! terminarea transcrip"iei. In sfr#it, exist! secven"e de ADN adiacente sau
nc!lecate n raport cu promotorii, care sunt recunoscute de efectori specifici cum sunt
represorii, activatorii #i terminatorii, care moduleaz! transcrip"ia. Toate aceste
secven"e de reglare specific! depind de interac"iunile care le realizeaz! cu proteinele
specifice care au rolul de a influen"a expresia secven"elor codante vecine.

SLIDE 8. Reglarea expresiei genelor eucariote (a)
La eucariote:
i) secven"e cu localiz!ri variabile, situate la distan"e variabile #i cu orient!ri
diverse n raport cu situsul de demarare #i de oprire a transcrip"iei.
ii) 3 polimeraze diferite, I, II #i III, transcriu trei clase de gene distincte fiecare
asociat! cu semnale specifice de control a transcrip"iei #i termin!rii acesteia.
Secven"ele reglatoare: suit! complex! de motive de ADN relativ scurte.
Fiecare motiv - situsul de fixare al unei proteine specifice, un factor de
transcrip"ie (ex).
Concluzie: reglarea transcrip"iei fiec!rei gene reflect! cooperarea particular!
(asortarea) #i aranjamentul anumitor motive, prezen"a factorilor de transcrip"ie
adecva"i #i modul n care ace#ti factori influen"eaz! ini"ierea transcrip"iei.
Fixarea mai multor factori de transcrip"ie n regiunea de reglare faciliteaz! fie
asamblarea ARN polimerazei ntr-un complex de transcrip"ie, fie activarea acestui
complex, fie ambele.
Studii de genetic! molecular! #i de biochimie au eviden"iat temele care
guverneaz! reglarea transcrip"iei #i care furnizeaz! bazele de n"elegere a expresiei
diferen"iate a genelor. Astfel, secven"ele reglatoare sunt formate dintr-o suit!
complex! de motive de ADN relativ scurte. Fiecare motiv este situsul de fixare al unei
proteine specifice, un factor de transcrip#ie. De exemplu, genele care nu sunt
transcrise dect n celulele limfoide con"in o serie de motive care sunt recunoscute de
factori de transcrip"ie specifici acestor celule. La fel, genele care nu sunt transcrise
dect n anumite momente #i n condi"ii particulare con"in motive de reglare care
interac"ioneaz! cu proteine specifice care nu sunt prezente sau active dect n aceste
momente sau n aceste circumstan"e. n consecin"!, reglarea transcrip"iei fiec!rei gene
reflect! cooperarea particulare (asortarea) #i aranjamentul acestor motive, prezen"a
factorilor de transcrip"ie adecva"i #i de modul n care ace#ti factori influen"eaz!
ini"ierea transcrip"iei. Fixarea mai multor factori de transcrip"ie n regiunea de reglare
faciliteaz! fie asamblarea ARN polimerazei ntr-un complex de transcrip"ie, fie
activarea acestui complex, fie ambele procese.
Secven"ele de ADN care regleaz! expresia genelor eucariote au localiz!ri
variabile, sunt situate la distan"e variabile #i au orient!ri diverse n raport cu situsul de
demarare #i de oprire a transcrip"iei. n plus, trei polimeraze diferite, I, II #i III,
transcriu trei clase de gene distincte fiecare asociat! cu semnale specifice de control a
transcrip"iei #i termin!rii acesteia. Studii de genetic! molecular! #i de biochimie au
64
eviden"iat temele care guverneaz! reglarea transcrip"iei #i care furnizeaz! bazele de
n"elegere a expresiei diferen"iate a genelor. Astfel, secven"ele reglatoare sunt formate
dintr-o suit! complex! de motive de ADN relativ scurte. Fiecare motiv este situsul de
fixare al unei proteine specifice, un factor de transcrip#ie. De exemplu, genele care
nu sunt transcrise dect n celulele limfoide con"in o serie de motive care sunt
recunoscute de factori de transcrip"ie specifici acestor celule. La fel, genele care nu
sunt transcrise dect n anumite momente #i n condi"ii particulare con"in motive de
reglare care interac"ioneaz! cu proteine specifice care nu sunt prezente sau active
dect n aceste momente sau n aceste circumstan"e. n consecin"!, reglarea
transcrip"iei fiec!rei gene reflect! cooperarea particulare (asortarea) #i aranjamentul
acestor motive, prezen"a factorilor de transcrip"ie adecva"i #i de modul n care ace#ti
factori influen"eaz! ini"ierea transcrip"iei. Fixarea mai multor factori de transcrip"ie n
regiunea de reglare faciliteaz! fie asamblarea ARN polimerazei ntr-un complex de
transcrip"ie, fie activarea acestui complex, fie ambele procese.
O caracteristic! extraordinar! a acestor mecanisme o reprezint! universalitatea
lor. Este remarcabil faptul c! aceste mecanisme cu origini foarte diverse (cum este
cazul drojdiei, Drosophilei sau celulelor de mamifere) s! fie interschimbabile. Astfel,
un factor de la drojdii sau de la Drosophila poate interac"iona cu motive nucleotidice
de la mamifere #i cu celelalte proteine ale complexului de transcrip"ie la fel de bine ca
#i factorii de transcrip"ie de la mamifere. Situa"ie invers! este adesea adev!rat!.
Aceasta implic! o conservare cert! a acestor structuri n cursul evolu"iei.
Mecanismul de terminare a transcrip"iei este diferit pentru cele trei ADN
polimeraze: fiecare depinde de motivele de secven"! situate la, sau aproape de
extremitatea unit!"ii de transcrip"ie. La acest nivel, motivele interac"ioneaz! cu
proteine adecvate, factorii de terminare. Reglarea termin!rii este consecin"a
aranjamentului motivelor ADN #i formarea unui ansamblu multiproteic care
faciliteaz! terminarea #i modificarea extremit!"ii ARN.

SLIDE 9. Reglarea expresiei genelor eucariote (b)
O caracteristic! extraordinar! a acestor mecanisme o reprezint! universalitatea lor.
Remarcabil - mecanisme cu origini foarte diverse (drojdie, Drosophila, celule
de mamifere) sunt interschimbabile % o conservare evolutiv! cert! a acestor structuri.
Mecanismul de terminare a transcrip"iei este diferit pentru cele 3 ADN
polimeraze. Motivele interac"ioneaz! cu proteine adecvate, factorii de terminare.
Reglarea termin!rii este consecin"a aranjamentului motivelor ADN #i formarea unui
ansamblu multiproteic care faciliteaz! terminarea #i modificarea extremit!"ii ARN.
Expresia anumitor gene este afectat! de schimb!ri epigenetice care altereaz!
capacitatea unei gene de a se exprima f!r! a fi afectat! secven"a sa nucleotidic!.
O form! de modificare epigenetic! identificat! este asociat! cu gradul de
metilare a citozinelor la nivelul secven"elor 5-CG care flancheaz! regiunea 5 a unei
gene: a) cre#terea metil!rii este corelat! cu o reducere sau chiar cu o absen"! a
expresiei genei sau genelor vecine; b) reducere a metil!rii se traduce printr-o expresie
crescut!.
Modific!rile de structur! intrinsec! a cromatinei (acetilare, fosforilare) pot
influen"a nivelul expresiei genelor apropiate.
Nivel crescut de expresie exist! numai n regiunile decondensate ale
cromatinei.
Expresia anumitor gene este afectat! de schimb!ri epigenetice care altereaz!
capacitatea unei gene de a se exprima (de a fi exprimat!) f!r! a fi afectat! secven"a sa
nucleotidic!. O form! de modificare epigenetic! identificat! este asociat! cu gradul de
65
metilare a citozinelor la nivelul secven"elor 5-CG care flancheaz! regiunea 5 a unei
gene. O cre#tere a metil!rii n aceast! regiune este corelat! cu o reducere sau chiar cu
o absen"! a expresiei unei gene vecine, n timp ce o reducere a metil!rii se traduce
printr-o expresie crescut!. Modific!rile de structur! a cromatinei (n structura sa
intrinsec!), cu toate c! nu sunt nc! bine caracterizate pentru moment, pot influen"a,
de asemenea, nivelul expresiei genelor apropiate, un nivel ridicat de expresie
neexistnd dect n regiuni decondensate ale cromatinei.

SLIDE 10. Compara%ie ntre operonul lac (a) &i gena ovalbuminei
Figura:
a) hart! genetic! a operonului lac de la E. Coli, care reprezint! genele care mediaz!
metabolismul lactozei "i situsurile genetice care controleaz! expresia acestora.
Genele Z, Y "i A codific! pentru beta-galactozidaz!, galactozid permeaz!,
tiogalactozid transacetilaz!.
I = regiunea genelor reglatoare; P = regiunea promotoare "i O = regiunea
operatoare
b) Secven#a etapelor de producere a ARNm matur n cazul genei ovalbuminei de pui.
Dup! transcriere, transcriptului primar i se adaug! structura coif "i coada poli(A).
n continuare sunt exciza#i intronii pentru a forma molecula matur! de ARNm.
Caracteristicile nea#teptate ale genelor eucariote au favorizat discu"iile privind
subiectul defini"iei unei gene ca unitate de informa"ie ereditar!. Mai multe defini"ii
sunt posibile dar nici una dintre ele nu este total satisf!c!toare sau adecvat! tuturor
genelor. n optica acestui curs am adoptat o defini"ie molecular!. O gen$ eucariot$
este o combina#ie de segmente de ADN care, mpreun$, formeaz$ o unitate de
expresie, aceasta conducnd la formarea unuia sau mai multor produ"i specifici,
ARN, polipeptide. Segmentele unei gene con#in: regiunea transcris$ (unitatea de
transcrip#ie) care con#ine secven#ele codante, secven#ele intercalare, secven#ele
din regiunea 5 leader "i 3 trailer netraduse, care flancheaz$ aceste secven#e
codante "i segmentele reglatoare incluse n unitatea de transcrip#ie astfel c$
secven#ele reglatoare care flancheaz$ unitatea de transcrip#ie sunt necesare
expresiei sale specifice.
La procariote, ini"ierea #i oprirea transcrip"iei par s! fie primul nivel de control
al expresiei genelor, chiar dac! n anumite cazuri pot s! intervin! alte mecanisme:
atenuarea, terminarea, anti-terminarea, controlul traducerii sau reglarea propor"iei de
rennoire a ARN #i a proteinelor. De altfel, aceste mecanisme de ini"iere (pornire) #i
de oprire a transcrip"iei sunt elemente critice pentru reglarea expresiei genelor
eucariote. Maturarea #i particular schema de maturare (excizie-epissage), influen"eaz!
natura mesagerilor forma"i #i n consecin"! natura proteinelor produse. Exist!, de
asemenea, argumente foarte bune n favoarea regl!rii prin atenuare sau terminare a
transcrip"iei #i exist! #i indica"ii c! traducerea #i rennoirea ARN intervin de asemenea
n reglarea producerii de proteine. n plus, caracteristicile unice ale celulelor eucariote
#i structura genelor lor furnizeaz! posibilit!"i particulare de control al fluxului de
informa"ie genetic!. De exemplu, transcriptul unei gene nu este func"ional atta timp
ct intronii nu au fost elimina"i convenabil. De altfel, chiar #i transcrip"ii destina"i s!
devin! ARNm trebuie s! fie modifica"i la extremitatea lor 5 #i 3: numai astfel
moleculele de ARNm pot traversa membrana nuclear! c!tre citoplasm! nainte de a fi
tradu#i. Fiecare dintre aceste evenimente poate constitui un punct de control.

66
SLIDE 11. Genoamele eucariotelor superioare con%in mult ADN ne-
func%ional
Figura: Diagramele regiunii de aprox 80 kb de pe cromozomul III al S. cerevisiae "i
a clusterului genei globinei umane situat pe cromozomul 11.
a) La cromozomul de drojdie, ADN (c!su#ele albastre) indic! fazele deschise de
lectur!; nu este clar dac! toate aceste secven#e care codific! poten#ial pentru
prtoteine sunt gene func#ionale.
b) n ADN uman, dreptunghiurile albastre reprezint! regiuni transcrise care
codific! proteinele tip globin! indicate. Fiecare gen! tip globin! are un aranjament
similar de exoni "i introni (care nu sunt eviden#ia#i). Clusterul genei Beta-globinei
uman! con#ine dou! pseudogene (marcate cu diagonale); aceste regiuni sunt nrudite
cu genele func#ionale ale globinelor dar nu sunt transcrise. S!ge#ile ro"ii indic!
localizarea secven#elor Alu (secven#e repetitive de aproximativ 300 pb care sunt
relativ abundente n genomul uman). De re#inut propor#ia mare a secven#elor
necodante n raport cu cele codante n structura genomului uman fa#! de cel al
dojdiilor.

Structura genomului eucariotelor
Cu toate c! genele procariote difer! puternic de genele procariote, prin
structura lor, organizarea informa"iei genetice este foarte diferit! n cele dou! grupe
de organisme. n genomul bacterian, genele sunt continue (contigue) dea lungul ADN,
adesea chiar secven"ele lor se ncalec!. Genele care codific! pentru enzime care
particip! la aceea#i cale metabolic!, ale c!ror activit!"i sunt apropiate, sunt frecvent
asociate ntr-o singur! unitate de transcrip"ie. Acest aranjament permite o utilizare
foarte eficace a secven"ei ADN. Economia pare s! fie mult mai pu"in important! n
cursul evolu"iei eucariotelor. n ciuda enormei cantit!"i de ADN prezent! n introni,
genele eucariotelor sunt separate #i de secven"e necodante foarte lungi. Cum s-a
men"ionat mai nainte, sunt rare genele multiple ntr-o singur! unitate de transcrip"ie.
Reparti"ia ADN n mai mul"i cromozomi este un punct fundamental n
organizarea genomului eucariotelor. Cromozomii celulari con"in probabil ntotdeauna
ADN bicatenar linear chiar dac! de formeaz! bucle de ADN duplex care dau na#tere
unor domenii circulare situate de-a lungul scheletului linear. n timpul interfazei
fiecare cromozom con"ine o singur! dubl! elice ADN, ca cele dou! cromatide surori
ale unui cromozom n metafaz!. Genoamele a numeroase virusuri ale eucariotelor, ca
#i cromozomii cloroplastelor #i marea majoritate a mitocondriilor, sunt unit!"i de
ADN circular.
Exist$ tipuri de ADN eucariot care nu sunt niciodat$ transcrise
Abunden"a secven"elor necodante n genoamele organismelor superioare este
ilustrat! n figur!.
Clusterul genelor beta-globinei este neobi#nuit de bogat n secven"e codante pentru
proteine n compara"ie cu alte secven"e de la vertebrate.
De ex: n regiunea de 50 kb care con"ine gena de pui pentru lizozim, totalul exonilor
este de mai pu"in de 500 pb.
Deoarece pentru majoritatea ADN ne-codant nu au fost nc! identificate
func"ii, este foarte u#or s! l consider!m ca nefunc"ional.





67
SLIDE 12. Duplicarea genelor - rezultatul crossing-over-ului inegal
Figura.Duplicarea genelor rezultat! n urma unui crossing-over inegal. Fiecare
cromozom parental con$ine o gen! ancestral! pentru globin! ce prezint! 3 exoni si 2
introni.Secven$a repetitiv! homoloag! necodant! L1 se g!se%te ntre genele globinei
3 %i 5. Cromozomii parentali sunt dispu%i relaviv unul fa$! de cel!lalt, n a%a fel nct
secven$ele L1 s! fie aliniate. Recombinarea omoloag! ntre secven$ele L1, dup! cum
se poate observa ar trebui s! genereze un cromozom recombinant cu cte dou! copii
ale genelor globinei %i un cromozom cu o dele$ie n una dintre genele pentru globin!.
Muta$ii subsecven$iale independente la nivelul genelor duplicate pot conduce la
u%oare modific!ri n secven$!, ce ar putea avea ca rezultatpropriet!$i modificate ale
proteinelor codificate. Un crossing-over inegal poate avea drept rezultat recombin!ri
rare ntre secven$e nenrudite. [See D. H. A. Fitch et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:7396.]

SLIDE 13. Exist$ tipuri de ADN eucariot care nu sunt niciodat$
transcrise
Abunden"a secven"elor necodante n genoamele organismelor superioare este
ilustrat! n figur!. Clusterul genelor beta-globinei este neobi#nuit de bogat n secven"e
codante pentru proteine n compara"ie cu alte secven"e de la vertebrate.
De ex: n regiunea de 50 kb care con"ine gena de pui pentru lizozim, totalul exonilor
este de mai pu"in de 500 pb.
Deoarece pentru majoritatea ADN ne-codant nu au fost nc! identificate
func"ii, este foarte u#or s! l consider!m ca nefunc"ional.
Nu exist! un principiu determinant al distribu"iei genelor de-a lungul
cromozomilor. Acest lucru a fost sugerat n timpul cartografiei genelor de la
Drosophila melanogaster prin tehnici genetice #i citogenetice. Totu#i, aceste h!r"i nu
"in cont dect de o cantitate sc!zut! din ADN total, h!r"ile genetice ale genoamelor de
mamifere fiind nc! destul de incomplete. n 1973, erau localizate numai 60 de gene
umane la nivelul autozomilor #i n 1981 un num!r de 400. n ultimul timp, gra"ie
clon!rii segmentelor de ADN, acest num!r a crescut la peste 1000 n 1992 #i la
secvedn"ierea genomului uman n anul 2000. Totu#i, c!r"ile genetice cele mai
complete nu furnizeaz! #i nu eviden"iaz! o localizare sistematic! a genelor. Gene
nrudite sau gene prezente n mai multe copii pot fi grupate sau dispersate pe mai
mul"i cromozomi. Astfel, genele care codific! pentru actinele cardiace #i scheletice se
g!sesc, respectiv pe cromozomii 15 #i 1. De altfel, cu toate c! genele care codific!
pentru cinci tipuri diferite de polipeptide de "-globine umane sunt grupate pe
cromozomul 11, cele care specific! polipeptidele !-globinelor sunt grupate pe
cromozomul 16, cu toate c! aceste gene sunt nrudite #i c! cele dou! tipuri de
polipeptide sunt necesare la formarea hemoglobinei.
Genele clonate sunt adesea ob"inute mpreun! cu fragmente lungi de ADN
care le flancheaz!. Un segment care se ncalec! poate fi clonat plecnd de la o banc!
genomic! #i un segment de ADN unic prezent la nivelul ADN flancant este sub-clonat
#i folosit drept sond!. Prin repetarea acestei opera"ii se pot ob"ine h!r"i detaliate
pentru regiuni cromozomice lungi. Aceste h!r"i con"in informa"ii structurale #i
func"ionale. De exemplu: cele 65 kpb care con"in cele cinci gene ale "-globinei
umane au fost clonate n segmente nc!lecate #i secven"a nucleotidic! este cunoscut!
n ntregime, permi"nd localizarea regiunilor codante, a regiunilor de reglare #i a
intronilor.
68
H!r"ile se restric"ie ale unei regiuni cromozomice sunt foarte utile pentru detectarea
varia"iilor de secven"! de la o alel! la alta, mai ales n cazul alelelor modificate
(alterate). Astfel, folosind ca sond! de hibridizare un segment de "-globin! uman!
clonat specific, putem examina la numero#i indivizi, regiunea ADN care codific!
pentru "-globin!, doar efectund o digestie cu endonucleaze de restric"ie #i un
transfer de ADN (Southern blotting). O modificare a m!rimii segmentului care se
hibridizeaz! cu sonda indic! fie o alterare a unui situs de restric"ie m fie o dele"ie sau
o inser"ie ntre dou! situsuri de restric"ie. Absen"a hibridiz!rii cu o anumit! sond!
indic! dele"ia (lipsa) ntregii regiuni studiate. Astfel de modific!ri sau polimorfism de
restric"ie, RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorfism), chiar dac! sunt lipsite de
consecin"e fenotipice, furnizeaz! markeri genetici, la fel de utili ca #i markerii clasici,
pentru analiza genetic! a unor familii mari n popula"ia uman!. Aceast! tehnic! a fost
utilizat! pentru studierea transmiterii hemoglobinopatiilor #i altor maladii genetice. n
plus, o serie de fragmente polimorfe ob"inute cu ajutorul endonucleazelor de restric"ie
pornind de la diferite por"iuni de cromozom pot fi utilizate ca markeri pentru o analiz!
de leg!tur! genetic!, f!cnd posibil! construc"ia unei h!r"i genetice chiar #i n absen"a
markerilor fenotipici. Acest tip de analiz! a fost utilizat pentru ordonarea mai multor
gene pe bra"ul scurt al cromozomului 11 uman: centromer * catalaz! hormon
paratiroidian - &-globin! - "-globin! - insulin! - pepsinogen.
Una dintre surprizele care au derivat din aceste analize este marea frecven"! a
diferen"elor de secven"e nucleotidice ntre indivizi. Prin defini"ie, analizele muta"iilor
realizate prin genetica clasic! utilizeaz! modific!rile genomice cu evidente consecin"e
fenotipice. Era normal s! consider!m c! genoamele indivizilor normali (s!lbatici) s!
prezinte pu"ine diferen"e. aceste mod de abordare simplist a fost adesea accentuat prin
accentul pus pe existen"a alelelor dominante #i recesive, considerndu-se c! nu pot
exista dect dou! sau cel mult un num!r redus de alele pentru un anumit tip de gen!.
Totu#i, polimorfismul lungimii fragmentelor de restric"ie este foarte frecvent att la
nivelul regiunilor codante ct si necodante, demonstrnd marea diversitate a
genoamelor indivizilor unei specii, f!r! consecin"e fenotipice identificabile. Unele
dintre aceste polimorfisme pot avea efecte subtile, dar marea majoritate a acestora se
relev! a nu avea consecin"e detectabile.

SLIDE 14. Experimentele de reasociere eviden%iaz$ trei frac%ii majore
pentru ADN eucariot
Copii ADN unice (singulare) (50-60%) o copie/genom haploid;
- Secven#e ADN moderat repetitive/intermediar (< 10
6
copii/genom haploid)
repetitive (25-40%); sunt incluse elementele de ADN mobile;
- Secven#e nalt repetitive (> 10
6
/genom haploid) - secven#e simple de ADN
sau ADN satelit (10-15%) (repeti#iile n tandem ale secven#elor scurte creaz!
adesea adesea o frac#iune distinct! cu propriet!#i fizice care permit izolarea sa);
- Secven#e inversate sau fold back structures
n concluzie: cantitatea total! de ADN de la diferite animale "i plante nu
variaz! concordant cu complexitatea organismelor. De asemenea cantitatea de ADN
poate varia "i ntre specii nrudite.
Secven%e repetitive n genom
ADN repetitiv este definit prin rata sa rapid! de renaturare. Tpic acesta const!
n secven"e scurte care sunt repetitive n copii identice sau nrudite n genom.
Componenta care se renatureaz! cel mai rapid n genomul eucariotelor este
reprezentat! de secven"ele nalt repetitive, #i const! n secven"e foarte scurte care se
69
repet! de multe ori n tandem sub forma unor clustere mari. Datorit! acestor unit!"i
repetitive scurte, aceste secven"e de ADN sunt adesea denumite secven"e simple de
ADN. Acest tip de secven"e ADN sunt prezente n aproape toate genoamele
eucariote, dar cantitatea lor total! este extrem de variabil!. n genoamele mamiferelor
acestea reprezint!, n mod normal, < 10%m dar (de exemplu) la Drosophila virilis,
cantitatea este de #50%. Pe lng! clusterele mari n care au fost descoperite ini"ial
aceste secven"e, exist! clustere mao mici separate de secven"e de ADN nerepetitive.
Repeti"iile n tandem ale secven"elor scurte creaz! adesea adesea o frac"iune
distinct! cu propriet!"i fizice care permit izolarea sa. n unele cazurim secven"a
repetitiv! posed! o compozi"ie n baze distinct! fa"! de compozo"ia normal! a
genomului care i permite formarea unei frac"ii separate #i distincte datorit! densit!"ii
sale. O frac"ie de acest tip este numit! ADN satelit. Termenul satelit este
sinonimul esen"ial pentru secven"e simple ADN.
Secven"ele repetitive n tandem sunt special corelate cu modificarea alinierilor
care apar n urma mperecherii cromozomilor, #i astfel m!rimea clusterelor n tandem
tinde s! fie foarte polimorf!, cu varia"ii largi ntre indivizi. De fapt, cele mai mici
clustere de astfel de secven"e pot fi folosite pentru a caracteriza genoame individuale
folosind tehnica fingerprinting.
Compara"ii ale regiunilor corespunz!toare secven"elor simple de ADN din
interiorul speciilor ne ofer! informa"ii despre mecanismele implicate n manipularea
secven"elor ADN din perioade evolutive diferite. Pentru moment nu putem spune cu
precizie dac! aceste secven"e au o func"ie structural!.

SLIDE 15. Variabilitatea n cadrul unei familii de secven%e repetitive
A#a cum am discutat secven"ele nucleotidice ale membrilor unei anumite
familii de gene pot fi identice sau pot varia prin una sau mai multe perechi de baze. n
ultimul caz se consider! c! familia este polimorf$. Dup! cum am constatat n unele
cazuri divergen"a poate fi considerabil!. Termeni de sub-familii #i super-familii sunt
adesea desemna"i sunt folosi"i pentru a numi grupuri de membri ai unei familii care
prezint! o similitudine mai mare sau mai mic!. Divergen"a dintre membrii unei familii
poate fi estimat! prin patru metode a c!ror sensibilitate este din ce n ce mai mare:
a) compararea h!r"ilor de restric"ie;
b) compararea capacit!"ii de a forma hibrizi;
c) m!surarea termostabilit!"ii hibriziolor duplex forma"i ntre membrii familiei;
d) compararea secven"elor lor nucleotidice.
Condi"ii stricte de hibridizare (de obicei o temperatur! ridicat! de 65
0
C, #i
concenta"ie salin! destul de slab!, n jur de 0,45 M NaCl) nu permit n general
formarea unui duplex ntre segmentele de ADN care posed! mai pu"in de 85%
complementaritate Prin reducerea temperaturii #i cre#terea concemtra*iei saline
(reducerea sensibilit!"ii testului), este posibil! hibridarea unor segmente mai pu"in
nrudite, dar limita inferioar! de detectare se situeaz! n jur de 70%
complementaritate. Stabilitatea heteroduplexului format este estimat! m!surnd
transformarea n monocatene n func"ie de temperatur!. Regula reste ca temperatura
de fuziune Tm (melting) s! fie diminuat! cu 10
0
C pentru 100 de baze ne-
mperechiate.
Segmentele de ADN bicatenar se numesc omologe dac! secven"ele lor sunt
identice. Totu#i, termenul de omolog este adesea folosit pentru a descrie segmentele
de ADN similare dar nu #i identice. Frecvent, un calificativ este folosit pentru a indica
gradul de identitate. Dac! secven"ele sunt cunoscute, este posibil! realizarea de
compara"ii cantitative. Astfel, dac! dou! segmente de ADN sunt descrise ca
70
reprezentnd 70% omologie (sau 70% similitudine) nseamn! c! 70% din bazele lor
(resturi de nucleotide) sunt identice #i colineare. Aceast! modalitate de exprimare
decurge din conceptul de cromozom omolog, dar se distan"eaz! de cel folosit clasic n
literatur! asupra evolu"iei biologice. Aici, omolog semnific!, n general, c! structuri
morfologice sau de secven"! ADN provin dintr-un str!mo# comun, #i n acest caz
termenul de procentaj de omologie este lipsit de sens. Deci, folosirea frecvent! a
termenului de procentaj de omologie este un pic ambigu! n lucr!rile de genetic!
molecular!. Termenul de procentaj de similitudine evit! mai bine ambiguitatea cu
toate c! este rar ntlnit n litaratur!.
Secven#e consens
Atunci cnd o familie de secven"e repetitive posed! numero#i membri, unde
fiecare nu difer! de ceila"i dect prin cteva pozi"ii n secven"a nucleotidic!, este
adesea comod s! definim un fel de secven"! medie sau consens sau canonic$ pentru
membrii familiei. O secven"! consens con"ine baza cel mai frecvent ntlnit! la fiecare
pozi"ie n ansamblul membrilor familiei #i nu este neap!rat identic! cu secven"a
oric!ruia dintre membri. Exist! dou! moduri de a ob"ine o secven"! consens. Adesea
este posibil! izolarea unei popula"ii mari de unit!"i repetitive, lipsite de secven"e ne-
mperechiate #i apoi realizarea unei analize de secven"! a amestecului. Chiar dac!
fiecare molecul! din popula"ie difer! de celelalte n cteva pozi"ii, se ob"ine adesea o
secven"! nucleotidic! unic! deoarece metodele de secven"ializare nu detecteaz!
concentra"iile mici de nucleotide pentru fiecare pozi"ie. ntr-un alt tip de abordare se
realizeaz! compararea unui anumit num!r de secven"e ai membrilor unei familii care
au fost clonate individual, ar baza cea mai frecvent! din fiecare pozi"ie este
determinat! folosind un anumit soft pe calculator.
Este util s! amintim c! defini"ia unei familii de secven"e repetitive este
pragmatic!. n absen"a datelor despre secven"a real!, o familie este n general
considerat! ca un ansamblu de secven"e care se hibridizeaz! ntre ele, sau cu un
membru clonat din familie, aceasta n condi"ii stricte. n general, aceasta semnific! c!
secven"ele care prezint! diferen"e de 15-20% de o secven"! consens sunt abia
decelabile, #i c! secven"e mai divergente nu pot fi considerate membri ai familiei.
Printre altele, identificarea prin hibridizare a familiilor de secven"e repetitive exclude
sistematic toate familiile ale c!ror membri sunt prea scur"i pentru a se reasocia.
Astfel, membri familiei de secven"e 5 ACT(A sau T)nTA care preced genele ARNt
nu pot fi adesea detectate. Adesea, rezultatele secven"ializ!rilor eviden"iaz! c! dou!
secven"e de ADN care nu se hibridizeaz! ntre ele se aseam!n! suficient (30 la 50%)
pentru a fi grupate n cadrul unei familii sau a unei super-familii.

SLIDE 16. Secven%ele simple de ADN sunt concentrate specific la
nivelul cromozomilor
Figura: cromozomi umani n metafaz! colora#i fluorescent "i hibridiza#i in
situ cu o secev#! ADN monocatenar! particular! marcat! cu un derivat fluorescent
al biotinei. Cnd se ilumineaz! cu o lungime de und! adecvat!, ADN apare ro"u "i n
pozi#ia la care se hibridizeaz! secven#a monocatenar! apare o band! galben! pe
cromozomul 16, indicnd localizarea secven#ei numai intr+un singur loc din genom.
Analiza molecular! a relevat c! anumite tipuri de secven#e de ADN sunt asociate cu
caracteristici morfologice particulare ale cromozomilor. Regiunile numite
organizator nucleolar con#in genele pentru ARNr. Regiunile telomerice "i
centromerice ale cromozomilor eucariotici con#in secven#e repetitive (repetate) n
tandem. A"a cum am ar!tat, cu toate c! adesea aceste reprezint! peste 10% din
genom, func#iile lor nu sunt cunoscute. Astfel de secven#e ar putea s! nu fie
71
importante n func#ionarea centromerilor deoarece ele lipsesc la cromozomii de
drojdii (Saccharomyces cerevisiae) unde centromerii func#ioneaz! normal n cursul
mitozei sau meiozei.
Rearanjamentul secven#elor ADN
Aranjamentul genelor #i a marii majorit!"i a segmentelor ADN n cromozomi
este virtual stabil! ceea ce face posibil! stabilirea h!r"ilor genetice. Informa"ia
genetic! poate fi redistribuit! ntre cromozomii omologi, fie n timpul meiozei fie n
timpul mitozei, prin crossing-over reciproc. Cu toate c! aceste evenimente creeaz! noi
combina"ii de alele, ele nu determin! rearanjamente ale secven"elor ADN. De fapt,
numeroase grupuri de gene sunt mult mai vechi dect speciile individuale, #i gene
sintenice situate pe acela#i cromozom la un anumit mamifer, sunt adesea prezente #i
la alte mamifere care nu sunt nrudite din punct de vedere evolutiv. Totu#i, acestei
stabilit!"i a organiz!rii genomului i se suprapune o capacitate de reorganizare a
informa"iei genetice. Rearanjarea se poate face la ntmplare, provocnd cel mai
adesea muta"ii d!un!toare, dar anumite rearanjamente sunt procese normale care
influen"eaz! expresia genelor n mod ordonat #i programat.
De mult timp se cunosc abera"ii cromozomiale cum sunt rupturile,
transloc!rile unor por"iuni de cromozom pe un cromozom neomolog sau formarea de
cromozomi dicentrici sau acentrici. La nivel molecular, toate aceste modific!ri
morfologice se manifest! prin modific!ri ale structurii ADN. Toate organismele
posed! n programul lor genetic informa"ia pentru ma#in!ria enzimatic! (angrenajul
enzimatic) necesar! acestor rearanjamente. Acest proces cuprinde:
1) crossing-over omolog nereciproc #i nealelic #i conversii genetice;
2) transpozi"ii de segmente de ADN de la un locus la altul;
3) formarea de copii suplimentare de secven"e de ADN fie n tandem fie
dispersate, proces numit amplificare;
4) dele"ia de secven"e de ADN;
5) recombin!rii neomoloage. Recunoa#terea instabilit!"ii organiz!rii genomice
este una din cele mai mari descoperiri ale geneticii moleculare #i este n mod
particular remarcabil! deoarece rearanjamentele sunt evenimente rare. Aceasta
deoarece pentru cea mai mare parte consecin"a combin!rii preciziei geneticii
moleculare cu modalit!"ile foarte selective ale analizei genetice clasice.
Rearanjamentele genomice aleatoare
Rearanjamentele neprogramate sunt, de obicei, rezultatul hazardului att n
ceea ce prive#te momentul n care se produc ct #i secven"ele implicate. Astfel de
rearanjamente produc adesea muta"ii nefaste. Totu#i, ele pot furniza sau au putut
furniza, n trecut ocazia unor r!spunsuri noi mediului #i au putut astfel facilita
modific!rile evolutive. Evident, pentru ca aceste rearanjamente aleatorii s! influen"eze
evolu"ia, ele trebuie s! aib! loc n celulele germinale sau n precursorii acestora;
acelea#i evenimente dac! au loc n celule somatice r!mn f!r! consecin"e pentru
organismul individual. Totu#i, dac! celula somatic! este o celul! su#! (celul! stem)
rearanjamentele aleatoare pot mpiedica formarea unei descenden"e func"ionale #i
diferen"iate sau modificarea poate fi oncogen! #i poate conduce la formarea unei
tumori.
Printre tipurile cunoscute de rearanjamente genomice aleatoare, unul particular
a atras aten"ia cercet!torilor #i anume transpozi"ia segmentelor de ADN de la un situs
la altul. Genele mobile au fost vedete chiar #i pentru literatura #tiin"ific! de
popularizare. Existen"a elementelor ADN mobile a pornit de la studiile genetice #i
citogenetice asupra porumbului care au demarat pentru prima dat! n anii 40.
Dou!zeci de ani mai trziu, geneticieni care se ocupau de bacterii au ob"inut rezultate
72
experimentale care au condus la acelea#i concluzii: anumite segmente de ADN se pot
deplasa. n cele din urm!, a fost stabilit c! mai multe tipuri de elemente mobile exist!
n genomul celulelor eucariote. Clonarea molecular! a f!cut posibil! determinarea
structurilor multora dintre aceste elemente #i a permis elucidarea mecanismelor prin
care se realizeaz! schimbarea pozi"iei n genom. Elementele mobile sunt factori de
modificare genetic! #i sunt responsabile de diferite muta"ii la eucariote ct #i la
procariote. Cnd acestea se inser! n secven"a codant! a unei gene, func"ia acesteia se
pierde. Cnd elementul se inser! n vecin!tatea unei gene expresia acesteia poate fi
influen"at! complex. De fapt, multe dintre muta"iile care s-au dovedit utile, la
nceputul secolului, pentru studiul D. melanogaster sunt la ora actual! cunoscute ca
fiind rezultatul inser!rii unor elemente mobile n gene.
Rearanjamente programate
Acum este evident c! expresia genelor poate fi modificat! profund prin
modificarea mediului lor genomic. O gen! poate fi silen"ioas! cnd se afl! n
vecin!tatea unui anumit tip de secven"! #i poate fi exprimat! cnd secven"a de ADN
care o flancheaz! se modific!. Astfel de rearanjamente sunt utile pentru o mare
varietate de organisme pentru reglarea expresiei genelor #i stabilirea astfel a unor
func"iuni specifice n celulele diferen"iate. De exemplu, exist! programe genetice care
provoac! rearanjarea anumitor segmente ADN n momente oportune sau n tipuri
specifice de celule.
Mult timp nainte de a putea analiza genele #i genoamele la nivel molecular,
geneticienii presupuneau c! anumite fenomene biologice nea#teptate pot fi explicate
prin rearanjamente specifice. Unul dintre acestea era alternan"a a dou! tipuri de flageli
diferi"i la nivelul celulelor de Salmonella thyphimurium. Un alt caz, cu implica"ii mult
mai profunde, era extraordinara diversitate a anticorpilor pe care i pot produce
mamiferele. Analiza molecular! a demonstrat n prezent c! cele dou! fenomene, ca #i
multe altele, sunt rezultatul rearanjamentelor programate ale secven"elor ADN
(exemplul imunoglobulinelor). n aceste dou! exemple, reorganizarea genomului este
folosit! pentru a proteja organismul. Prin schimbarea flagelilor, Salmonella scap! de
ap!rarea imunologic! a organismului gazd!. Prin crearea de noi anticorpi organismul
se ap!r! mai bine de agen"ii externi.
Implica#ii evolutive
Istoria evolu"iei organismelor este nscris! n genomul lor. Muta"iile #i
rearanjamentele furnizeaz! varia"iile genetice de care depinde procesul evolutiv. n
trecut, rela"iile evolutive nu puteau fi studiate dect prin raportare la consecin"ele
asupra informa"iei genetice oglindite n fenotipurile organismelor. Astfel, informa"ia
biologic! era furnizat! de studiul anatomic al fosilelor #i de anatomia, fiziologia #i
embriologia comparat! a speciilor contemporane. La mijlocul acestui secol, chimia
comparativ! a proteinelor a introdus o alt! m!sur! fenotipic! a rela"iilor filogenetice.
Descoperirea c! structura anumitor proteine este conservat! la un larg spectru de
organisme a asamblat mai multe ramuri (philum) n c!i de evolu"ie comune ntr-un
mod n care studiul fosilelor nu l putea face. De exemplu, citocromul C, este prezent
n mitocondriile tuturor plantelor #i animalelor. El este indispensabil respira"iei #i
trebuie s! fie printre primele molecule proteice esen"iale. n cursul evolu"iei,
citocromul C s-a modificat foarte pu"in; numai 35 din cei 104 aminoacizi ai
citocromului C s-au modificat de la drojdii la mamifere (f!r! a "ine cont de
aminoacizii terminali suplimentari care exist! n proteina de la drojdii).
Citocromul C #i alte proteine foarte conservate nu sunt utile n analiza
genetic! a rela"iilor filogenetice ntre specii foarte nrudite deoarece n acest caz nu
exist! prea multe varia"ii: este cazul citocromului C de la om #i de la cimpanzeu. Dar
73
alte proteine evolueaz! mult mai rapid. Un exemplu este anhidraza carbonic!:
diferen"ele din structura sa la nivelul primatelor sunt suficiente pentru a putea stabili
un arbore filogenetic. Aceast! metod! se bazeaz! pe observa"ia c! num!rul
aminoacizilor diferi"i este groso-modo propor"ional cu timpul scurs ntre divergen"a
de str!mo#ul comun, a#a cum o demonstreaz! #i datele ob"inute prin analiza fosilelor.
n fine, toate metodele de analiz! a procesului evolutiv care se bazeaz! pe
expresia fenotipic! sunt indirecte deoarece responsabile de apari"ia unor noi fenotipuri
sunt modific!rile pe care le sufer! genele #i genoamele. Chiar dac! studiul formelor
str!vechi se va continua prin studiul fosilelor, compararea structurilor ADN va suplini
rapid celelalte metode n studiul rela"iilor existente ntre speciile contemporane.
Astfel, tehnica ADN recombinat a avut deja un impact major asupra biologiei
evolu"iei #i cu siguran"! influen"a sa n acest domeniu va fi enorm! n viitor.
Genatica molecular$ comparativ$
Chiar nainte de a avea posibilitatea de a clona #i secven"ializa, importan"a
compar!rii diferitelor secven"e de ADN n studiul evolu"iei era evident!, diferite
metode de m!surare a gradului de nrudire dintre genoame fiind dezvoltate pe parcurs
(n timp). Aceste tehnici includeau compararea stabilit!"ii dublului helix ADN format
din monocatene de origini diferite (heteroduplex) sau a catenelor cu aceea#i origine
(homoduplex). Cu toate c! erau utile, studiile de acest tip nu d!deau dect valori
medii pentru divergen"a dintre dou! tipuri de ADN. Alelele nu pot rivaliza cu bog!"ia
detaliilor ob"inute prin anatomie comparat! sau biochimia proteinelor. n aceste
condi"ii compara"iile directe ale secven"elor nucleotidice ADN furnizeaz! detalii
importante #i clarific! aspectele care nainte nu puteau fi abordate evolutiv. Ast!zi,
este mult mai u#or tehnic s! se realizeze clonarea #i secven"ializarea unui grup
omolog de gene dect s! se izoleze #i s! se determine secven"a n aminoacizi a
produ#ilor peptidici ai acestora.
n ceea ce prive#te regiunile codante, secven"a ADN furnizeaz! mai multe
informa"ii dect secven"a peptidic! deoarece degenerescen"a codului genetic permite o
modificare a structurii genei f!r! modificarea secven"ei n aminoacizi
corespunz!toare. De altfel, faptul c! putem #ti c! un aminoacid s-a schimbat nu indic!
neap!rat num!rul de modific!ri care au intervenit la nivelul perechilor de baze; nu
este permis! dect o estimare a num!rului minim de modific!ri necesare nlocuirii
unui aminoacid de c!tre altul. Astfel, nlocuirea unei alanine cu o valin! n pozi"ia 11
a citocromului C poate fi rezultatul modific!rii uneia (GCU GUU) sau a dou! (GCU
GUA) perechi de baze.
Un avantaj unic al secven"elor ADN este c! se poate realiza compararea
secven"elor necodante, implicit a secven"elor reglatoare. Acest lucru poate avea o
importan"! foarte mare pentru faptul, deja recunoscut, c! evolu"ia proteinelor #i
evolu"ia morfologic! se realizeaz! cu viteze diferite n grupe diferite de organisme.
Modific!ri fenotipice importante pot reprezenta nu numai rezultatul structurii
proteinelor dar #i, de exemplu, a abunden"ei relative a proteinelor individuale n
momentul expresiei genelor. Compararea secven"elor ADN poate elucida rolul
regl!rii unei gene n evolu"ia speciilor prin analiza elementelor situate n vecin!tatea
secven"elor genice luate n studiu. Aceste modific!ri pot, n anumite cazuri, implica
numai modificarea unei singure perechi de baze dar pot exista #i rearanjamente
genomice importante cum ar fi transpozi"iile de elemente mobile.
Secven"ele de ARNr, #i particular cele de ARN 16 #i 18S care intr! n
constitu"ia subunit!"ilor mici ale ribozomilor, sunt foarte utile pentru determinarea
rela"iilor filogenetice. Cum ribozomii sunt abunden"i la toate speciile, molecule de
ARN func"ional pot fi izolate #i secven"ializate direct dup! trecerea lor n ADNc. Cu
74
toate c! func"ia subunit!"ii mici este aceea#i la toate organismele vii, regiunile
moleculei posed! grade variabile de conservare. Regiunile cele mai conservate pot fi
utilizate pentru a compara organismele cu grade de nrudire slabe (ndep!rtate
evolutiv) #i segmentele care evolueaz! mai rapid n compararea organismelor cu grad
de nrudire mai mare. Astfel, toate speciile pot fi comparate folosind un singur tip de
molecul! a c!rei func"ie a fost foarte bine conservat!. Astfel, au fost analizate specii
virtual reprezentative pentru toate clasele taxonomice putnd fi analizate rela"iile
filogenetice detaliate )i realizndu-se clarificarea unor momente ale procesului
evolutiv.
Istoria evolu#iei genelor
Pn! n prezent, evolu"ia a fost analizat! din punct de vedere al rela"iilor cu
istoria diferitelor specii. Dar o alt! istorie biologic! este nscris! n structura ADN, n
cunoa#terea originii genelor. Dou! sau mai multe gene (sau secven"e de ADN)
nrudite n aceea#i specie deriv! adesea dintr-o singur! secven"! ancestral!. Dac!
segmentul ADN ancestral a fost amplificat (ca urmare a unor evenimente aleatoare), o
singur! copie poate fi suficient! pentru realizarea func"iei originale. Muta"iile ce pot
s! apar! n copiile suplimentare #i care sunt libere de constrngerea ce determin!
limitarea acumul!rii muta"iilor n gena func"ional! pot conduce la noi capacit!"i
func"ionale, care la rndul lor, pot fi p!strate de c!tre selec"ie. Copiile suplimentare
pot de asemenea achizi"iona semnale de reglare noi sau modificate care le pot permite
s! se exprime n momente diferite ale evolu"iei sau n "esuturi particular diferen"iate.
O alt! posibilitate este ca copiile suplimentare s! fie inactivate prin muta"ie #i s! fie
men"inute sub form! de pseudogene. Familia genelor globinei con"ine exemple pentru
toate cele trei posibilit!"i.
Anumite gene par s! se fi format prin asocierea copiilor de secven"e codante
(cazul exonilor). n anumite cazuri aceasta implic! amplificare n tandem a unui
singur exon, structura repetitiv! a genei reg!sindu-se n multiplele repeti"ii ale
segmentelor peptidice nrudite n protein!. n alte cazuri, genele par s! fie o
construc"ie n mozaic format! din exonii preleva"i din diferite. Astfel, exonii avnd un
str!mo# comun pot s! apar! n mai multe gene care nu par a avea un grad de nrudire.
Exonii existen"i n mai multe proteine codific! probabil pentru domenii care dau
acestor proteine diferite propriet!"i structurale sau func"ionale nrudite, cum ar fi o
structur! secundar! particular! sau capacitatea de a fixa un anumit ligand (ex., ATP).
O ipotez! interesant! privind asamblarea genelor prin repeti"ia sau amestecul
exonilor propune existen"a anumitor recombin!ri la nivelul intronilor care servesc la
asocierea exonilor, l!snd intacte regiunile codante. Aceast! manier! de a vedea
lucrurile implic! acceptarea faptului c! intronii sunt structuri str!vechi, prezente nc!
n primele gene #i celule #i care au fost pierdute n cursul evolu"iei procariotelor. O
alt! ipotez! total diferit! consider! c! intronii reprezint! inser"ii la nivelul regiunilor
codante preexistente printr-un mecanism mai frecvent la eucariote dect la procariote.
Ideea c! intronii sunt str!vechi rezolv! multe probleme inerente privind explicarea
modelului de inser"ie, #i printre altele problema muta"iilor care pot interveni n cazul
inser!rii generalizate #i la ntmplare a segmentelor necodante #i a necesit!"ii de a
elabora simultan un mecanism de excizie. Din contr!, dac! intronii erau prezen"i n
primele genoame, excizia #i episajul trebuia s! fie procese str!vechi. Descoperirea c!
anumi"i introni provoac! propria lor eliminare f!r! ajutorul proteinelor a crescut
#ansele ipotezei existen"ei anumitor introni din timpuri foarte str!vechi. Totu#i,
deplasarea intronilor de pe un segment de ADN pe altul a fost bine caracterizat! n
multiple cazuri. exemplele cunoscute, care se refer! la intronii genelor mitocondriale
de la drojdii #i genelor pentru ARNr de la Mixobacterii, formeaz! o clas! aparte de
75
introni (grupul I). Inser"ia pare s! fie rezultatul unei conserv!ri genetice specifice unui
anumit situs. Intronii putea s! apar! n diferite moduri.
Compararea structurilor proteice a furnizat suficiente date pentru a permite
formularea de diverse ipoteze privind rolul procesului de amplificare n evolu"ia
genomului. Totu#i, de cnd exist! posibilitatea clon!rii genelor, aceste ipoteze au fost
puternic extinse #i mbog!"ite. Unul dintre punctele importante, demonstrate prin
analiz! molecular!, este c! procesul de amplificare, de divergen"!, de repeti"ie #i de
amestec de exoni nu sunt rare #i nu constituie numai contribu"ii ocazionale n evolu"ia
genomului. Istoria unei p!r"i importante a ADN de la eucariote, secven"ele codante
sau necodante contopite reflect! un astfel de proces. Varietatea rearanjamentelor
observate n genoamele contemporane reflect! procese str!vechi care au fost, #i
probabil sunt nc!, motoarele esen"iale ale modific!rilor ap!rute n cursul evolu"iei.
Originea sistemelor genetice
ntrebarea care se pune este dac! vechimea intronilor poate furniza informa"ii
despre primele sisteme genetice #i dac! poate r!spunde ntreb!rii privind natura
primelor molecule purt!toare de informa"ie: ADN sau ARN. Exist! o serie de
argumente n favoarea ipotezei c! ARN a ap!rut primul #i c! a furnizat bazele
primelor sisteme de codificare. De exemplu, moleculele de ARNr, ARNt #i ARNm
reprezint! elemente centrale n sistemul de transla"ie, n aparatul de traducere al
ntregului organism #i de interpretare a codului genetic. Aceasta sugereaz! c! aceste
molecule au precedat divergen"a dintre procariote #i eucariote #i c! trebuie s! fi fost
prezente n primele sisteme genetice. n plus, molecule mici de ADN pot fi sintetizate
de pe o matrice ARN, ntr-o manier! pur chimic!, n absen"a oric!rei proteine. Deci,
este posibil ca moleculele de ARN s! fi avut capacit!"i autoreplicative #i s! fi putut fi
transcrise #i traduse dup! mecanisme primitive. Moleculele de ARN pot de asemenea
reac"iona ca enzime pentru a modifica alte molecule de ARN. Frac"ia ARN a RN-azei
din E. coli catalizeaz! clivarea specific! a unui situs la nivelul precursorilor ARNr.
A#a cum s-a men"ionat deja, intronii precursorilor ARNr de la anumite protozoare #i
drojdii pot fi cliva"i f!r! interven"ia proteinelor. Din contr!, moleculele de ADN nu
sunt capabile de astfel de reac"ii.
Deci, str!mo#ul sistemelor genetice contemporane se poate s! fi utilizat
molecule ARN informa"ionale. n aceste molecule de ARN, scurte regiuni codante
formate la ntmplare (exonii primitivi) puteau alterna cu regiuni necodante (intronii
primitivi). La un moment dat au ap!rut polipeptide mici care facilitau maturarea ARN
#i replicarea acestuia. Una dintre aceste ar fi putut avea activitate de transcriptaz!
invers!, cataliznd formarea de molecule de ADN care au putut deveni, mai trziu,
formele de stocarea informa"iei genetice celulare. Aceste molecule de ADN au putut
conserva alternan"a exon-intron existent! n ARN. Sistemul genetic care con"ine ADN
a devenit astfel str!mo#ul organismelor celulare. O evolu"ie divergent! ar fi putut da
na#tere liniilor de eucariote #i de procariote n care re"inerea sau pierderea intronilor
au fost respectiv favorizate. Dup! acest model, mu este surprinz!tor s! g!sim
ocazional un intron prezent ntr-un genom procariot. De fapt, n genomul
bacteriofagului T4 al E. coli exist! introni, la fel ca #i n genele ARNt de la
archeobacterii (n ultimul timp au fost descoperi"i #i al"i introni la procariote #i
archeobacterii).
Unul dintre aspectele cele mai tulbur!toare ale modelului este originea
independent!, plecnd de la celule ancestrale, a procariotelor #i eucariotelor. Anterior,
cea mai mare parte a specula"iilor referitor la debuturile evolu"iei presupuneau c!
eucariotele deriv! din procariote. Aceast! ipotez! se baza pe ideea c! celulele
procariote contemporane, relativ simple, se aseam!n! cu celulele primitive n timp ce
76
celulele eucariote, rezultate din procariote mai simple, au devenit n cursul evolu"iei
mai mari #i mai complexe. Descoperirea intronilor, a matur!rii (splicing) fenomenelor
de transcrip"ie celular! inverse #i a propriet!"ilor catalitice ale ARN au for"at
cercet!torii s! reevalueze vechile concepte. Cu siguran"! capacitatea noastr! de a
analiza aspectele moleculare ale sistemelor biologice informa"ionale ne va ajuta din ce
n ce mai mult s! r!spundem ntreb!rilor esen"iale pe care le ridic! biologia evolu"iei.

SLIDE 17. Generarea diferen'elor de lungime a unei secven'e ADN
simple prin crossing-over inegal n timpul meiozei
Exemplu de crossing-over inegal n interiorul unei secven*e de ADN care
con*ine 6 copii ADN (16) dintr-o anumit secven*! repetitiv! simpl! conduce la
apari*ia de celule germinale cu 8 )i 4 unit!*i repetitive aranjate n tandem

SLIDE 18. Tehnica fingerprinting se bazeaz$ pe diferen%a de lungime
a secven%elor simple de ADN
Figura: Secven#e consens ale unit!#ii repetitive a minisateli#ilor umani numi#i
#33.1 "i #33.5 bazate pe analiza a mai mult de zece seturi de unit!#i repetitive pentru
fiecare caz. Literele ro"ii indic! pozi#iile la nivelul c!rora au fost identificate
diferen#e. Punctele ro"ii indic! dele#ii. Unitatea de 62 pb a #33.1 este mult mai
conservat! dect unitatea de 17 pb a minisatelitului #33.5
Minisateli#ii sunt folositori n cartarea genetic$
Secven"ele care se aseam!n! sateli"ilor prin faptul c! sunt constituite din
repeti"ii n tandem ale unei unit!"i scurte, dar mult mai scurte, constnd n (de
exemplu) 5-50 repeti"ii, sunt comune genoamelor de la mamifere. Acestea au fost
descoperite din ntmplare ca fragmente a c!ror m!rime este extrem de variabil! n
b!ncile genomice de ADN genomic uman. Variabilitatea se poate constat! (vedea)
cnd o popula"ie con"ine fragmente de m!rimi diferite care reprezint! aceea#i regiune
genomic; cnd indivizii sunt examina"i, se eviden"iaz! existen"a unui polimorfism
extins #i faptul c! pot fi g!site alele diferite.
Aceste secven"e sunt numite minisateli"i sau regiuni VNTR (variable number
of tandem repeats). Cauza varia"iilor este aceea c! alelele individuale au numere
diferite de unit!"i repetitive. De exemplu, un astfel de minisatelit are o lungime
repetitiv! de 64 pb, #i se g!se#te n popula"ie avnd urm!toarea distribu"ie:
7% 18 repeti"ii
11% 16 repeti"ii
43% 14 repeti"ii
36% 13 repeti"ii
4% 10 repeti"ii
Cauza acestei varia"ii este recombinarea genetic! ntre unit!"ile repetitive
necomplementare (misaligned), n acela#i mod n care am discutat deja pentru ADN
satelit. Rata de modificare genetic! a secven"elor minisatelit este mare, '10-4 per kb
de ADN. (Frecven"a modific!rilor per locus actual se consider! a fi propor"ional! cu
lungimea unui minisatelit). Aceast! rat! este de '10x mai mare dect rata
recombin!rii omologe n meioz!, care este caracteristic! oric!rei secven"e ADN
aleatoare. Deci sateli"ii pot fi considera"i puncte fierbin"i pentru recombinarea
meiotic!.
Adesea prezen"a unui minisatelit este corelat! cu o rat! crescut! (ridicat!) de
modificare (schimb) n vecin!tate, dar n umele cazuri evenimente de recombinare
apar ntre cromatide surori (n astfel de cazuri se modific! lungimea minisatelitului
77
dar nu sunt afecta"i markerii care l flancheaz! pe acesta, deoarece sunt identici pentru
ambele molecule recombinate de ADN).
Variabilitatea crescut! a minisateli"ilor i face pe ace#tia extrem de utili pentru
cartarea genomic!, deoarece exist! o mare probabilitate ca indivizii s! prezinte
varia"ii ale alelelor prezente la nivelul unor astfel de locusuri. Un exemplu de cartare
cu ajutorul minisateli"ilor este ilustrat. SE prezint! un caz extrem n care doi indivizi,
ambii heterozigo"i pentru un locus minisatelit, #i de fapt pentru toate cele patru alele
sunt diferi"i. n mod normal, to"i descenden"ii vor mo#teni o alel! de la fiecare p!rinte
fiind astfel posibil! f!r! ambiguitate determinarea sursei fiec!rei alele ale progeniturii.
n terminologia geneticii umane, meiozele descrise n aceast! figur! sunt foarte
informative, datorit! varia"iei dintre alele.
O familie de minisateli"i a fost determinat! n genomul uman ca prezentnd o
secven"! core comun!. Secven"a core este o secven"! bogat! ntr-o secven"! de 10-
15 pb bogat! n G-C, cu o asimetrie a distribu"iei prinelor/pirimidinelor pe cele dou!
catene. Fiecare minisatelit individual con"ine o variant! a secven"ei core, dar ' 1000
minisateli"i pot fi detecta"i pe Southern blot cu ajutorul unei sonde care const! n
secven"a core.
S! consider!m c! situa"ia prezentat! n figur! trebuie multiplicat! cu 1000x.
Efectul varia"iei la nivelul locilor individuali este de a crea un profil unic pentru
fiecare individ. Aceasta face posibil! desemnarea f!r! ambiguitate a eredit!"ii dintre
p!rin"i #i progenitur!, ar!tnd c! 50% dintre benzile oric!rui individ sunt derivate de
la un anumit p!rinte. Acestea stau la baza tehnicii numite ADN fingerprinting
Sumar
ADN satelit const! din secven"e foarte scurte repetate de mai multe ori n
tandem. Propriet!"ile distincte manifestate la centrifugare reflect! compozi"ia n baze.
ADN satelit este concentrat n heterocromatin!, dar func"ia sa este necunoscut!.
Unit!"ile repetitive individuale din sateli"ii artropodelor sunt identice. Cele ale
sateli"ilor de la mamifere sunt corelate, #i pot fi organizate ntr-o anumit! ierarhie care
reflect! evolu"ia satelitului prin amplificarea #i divergen"a secven"elor alese la
ntmplare. Crossing-overul inegal pare s! fie un determinant major n organizarea
ADN satelit. Fixarea crossing-over explic! capacitatea varia"iilor de a se ntinde ntr-
un cluster. Minisateli"ii au propriet!"i similare sateli"ilor, dar sunt mult mai mici; ei
sunt foarte utili pentru cartarea genomic!.

SLIDE 19. Imagini fingerprint ADN uman
Sondele de minisateli*i ADN pot fi folosite pentru eviden*ierea fragmentelor
unice de restric*ie (DNA fingerprints) care pot identifica indivizi diferi*i. Probe ADN
de la 3 indivizi (1, 2 si 3) au fost supuse analizei Southern blot folosind enzima de
restric*ie Hinf1 )i trei minisateli*i marca*i diferit ca sonde (liniile a, b si c). ADN de la
fiecare individ produce un profil de benzi unice pentru fiecare individ. Condi*iile de
electroforez! pot fi ajustate astfel nct pentru fiecare persoan! s! se eviden*ieze cel
pu*in 50 de benzi cu aceast! enzim! de restric*ie. Lipsa de identitate ntre cele 3 probe
poate fi u)or diferen*iat!. [From A. J. Jeffreys et al., 1985, Nature 316:76; courtesy of
A. J. Jeffreys.]

SLIDE 20. Mari familii de repeti%ii dispersate n genomul mamiferelor
Analiza clasic! a profilelor de dispersie demonstreaz! c! genomul uman #i
genoamelor altor de mamifere posed! profile de dispersie apropiate. Aceste concluzii
sunt confirmate de detaliile moleculare furnizate prin analiz! de restric"ie #i prin
78
clonare #i secven"ializare. Cu toate c! exist! diferite familii #i sub-familii de repeti"ii
dispersate, un num!r mic dintre acestea prezint! un num!r foarte mare de copii #i
domin! genoamele. O familie dominant! poate reprezenta mai mult de 5% din ADN
total, iar totalitatea familiilor pot reprezenta 20% din acesta. Anumite familii sunt
constituite din secven"e de 100 la 500 pb #i sunt denumite secven"e SINEs (Short
Interspersed Repeats). Altele, ale c!ror membri pot avea 6 kpb #i mai mult, sunt
denumite LINES (Long Interspersed Repeats). Alte organisme cum sunt miomicetele,
l!custele, echinodermele, pe#tii #i amfibienii con"in repeti"ii dispersate care se
aseam!n! cu SINEs de la mamifere. La plante #i la nevertebrate exist! secven"e
comparabile cu LINEs de la mamifere.
SINEs
Secven"ele scurte, foarte repetitive #i dispersate de la mamifere au fost nc! de
la nceput adunate sub denumirea SINEs pur #i simplu pe baza lungimii #i abunden"ei
lor. O proprietate comun! mai semnificativ! a fost descoperit! recent. SINEs par s!
fie pseudogene mature derivate din genele din clasa III care codific! pentru mici
molecule de ARN citoplasmatic, printre care #i moleculele de ARNt #i cele pentru
ARN 7SL. Deci, SINEs sunt omologe cu secven"ele acestor ARN (sau ale genelor
lor). SINEs sunt adesea flancate de repeti"ii directe care sunt duplicate ale secven"elor
"int! inserate #i posed! secven"e 3 terminale bogate n A.
Fiecare specie (sau fiecare ordin) posed! un joc caracteristic de familii de
secven"e SINEs. Pentru a ilustra complexitatea #i diversitatea acestor secven"e vom da
cteva exemple. Una dintre familiile SINEs cele mai bine studiate este familia ALU
de la primatele lumii vechi, denumit! a#a datorit! prezen"ei n aceast! secven"! a unui
situs de restric"ie Alu I. Unit!"ile Alu se g!sesc n regiuni care flancheaz! genele, n
introni, n ADN satelit #i grupate cu alte secven"e repetitive dispersate. Pentru o
anumit! specie determinat!, secven"ele Alu diverg una de alta cu aproximativ 15% :
Cnd primatele lumii vechi sunt comparate ntre ele, secven"ele membrilor familiei
Alu variaz! la fel ca n interiorul unei singure specii.
Secven"ele Alu tipice primatelor sunt dimere, compuse din dou! secven"e de
aproximativ 130 pb. Cei doi monomeri repetitivi nu sunt identici iar diferen"a cea mai
marcant! este prezen"a unui segment suplimentar de 31 pb n cea de a doua unitate.
Fiecare monomer se termin!, n pozi"ia 3 a catenei superioare, cu o serie de resturi A
de lungime variabil!. Monomerii Alu con"in secven"e omologe cu regiuni 5 #i 3 ale
moleculelor ARN 7SL; cele 155 pb centrale ale ARN 7SL sunt absente n secven"ele
Alu.
Primele secven"e din familia Alu au fost izolate #i clonate plecnd de la ADN
uman. A fost stabilit! o secven"! consens. Membrii clona"i din familia Alu au fost
apoi folosi"i ca sonde pentru a determina num!rul de copii folosind metoda de analiz!
a cineticii de reasociere. Rezultatele indic! prezen"a a aproximativ 9 x 105 copii par
genom haploid (aproximativ 9% din totalul ADN de la om). n medie, o secven"! Alu
este prezent! la fiecare 5 kpb n genomul uman #i n cel al altor primate ale Lumii
vechi. Mai mult de 90% dintre fagii prezen"i ntr-o banc! genomic! uman! tipic! se
hibridizeaz! cu o sond! Alu, #i cea mai mare parte a segmentelor de 15 -20 pb clonate
con"in mai mult de un membru al acestei familii. Secven"ele Alu vecine pot avea
orient!ri opuse. Acestea pot fi incluse n frac"ia de ADN genomic pliat. De exemplu,
cinci din opt secven"e Alu prezente ntr-un fragment de 65 kpb de ADN uman care
con"ine familia multigenic! a "-globinei sunt orientate n direc"ia sens #i trei n
direc"ia antisens.
Dac! consider!m c! nu exist! dect trei gene func"ionale care codific! pentru
ARN 7SL n ADN uman, caracterul ubicuitar al secven"elor Alu este remarcabil!. n
79
plus, apari"ia acestor secven"e Alu la primate trebuie s! se fi produs dup! divergen"a
major! a ordinelor mamiferelor n cursul evolu"iei. Aceast! afirma"ie este sus"inut! #i
de faptul c! familia SINE la roz!toare care este omolog! cu genele pentru ARN 7SL,
este net diferit! de familiile Alu de la primate. Cele 105 copii ale familiei de tip I de la
r!z!toare au aproximativ 130 pb, adic! sunt echivalentul unuia dintre cei doi
monomeri repetitivi direc"i tipici familiei Alu de la primate. Alte secven"e SINES de
la roz!toare, cum sunt familiile de tip II #i ID sunt omologe cu diferite gene pentru
ARNt.
Omologia dintre membrii familiei SINE #i genele din clasa III cu care acestea
sunt nrudite includ elemente promotoare interne, cum sunt cutiile A #i B, unit!"ile
SINEs con"inute n segmente de ADN clonate fiind adesea transcrise in vitro de c!tre
ARN polimeraza III. Transcrip"ia ncepe foarte precis la extremitatea 5 a unit!"ii #i se
termin! la nivelul primului grup care con"ine patru resturi A sau mai multe de pe
catena considerat! matrice. Totu#i, n ciuda faptului c! unit!"ile SINE pot fi transcrise
efectiv in vitro, cea mai mare parte dintre ele nu sunt matri"e active pentru ARN
polimeraz! III in vivo. Modelele cele mai interesante care au fost propuse pentru a
explica modul de amplificare a secven"elor SINEs #i inserarea lor n ADN fac apel la
interven"ia unui proces de transcrip"ie invers! realizat de c!tre ARN polimeraza III.
Secven"ele SINE sunt transcrise #i de c!tre ARN polimeraza II. Este cazul
SINE prezente n introni, la nivelul secven"ei 5 leader sau a cozii 3 a unei unit!"i
de transcrip"ie din clasa II ne-nrudit!. Din aceast! cauz!, moleculele de ARNhn
con"in numero#i transcrip"i ai secven"elor SINE repartiza"i printre alte secven"e. n
urma matur!rii unui transcript primar n ARNm, secven"a SINE este n general
eliminat! astfel nct ARN citoplasmatic con"ine de dou! ori mai pu"ine secven"e
SINE dect ARN nuclear.

LINEs
Pe lng! multiplele familii SINEs, genoamele mamiferelor posed! toate o
abundent! familie LINEs, familia LINE-1, ale c!rei membri pot avea 6 la 7 kpb. Alte
familii LINE exist! n unele dintre aceste genoame dar ele nu sunt la fel de frecvente.
Familiile LINE-1 de la diferite mamifere sunt toate nrudite dar divergente: cu ct
speciile sunt mai nrudite cu att familiile sunt mai similare. Mai mul"i membri ai
familiei LINE-1au mai pu"in de 6 la 7 kpb. Astfel de segmente trunchiate sunt n
general deposedate de secven"ele situate la extremitatea 5. Adesea, secven"a intern!
lipse#te (secven"ele reprezint! o dele"ie n raport cu membrii mai lungi ai familiei). n
plus, to"i membri familiei nu sunt colineari. La unii dintre ace#tia, exist! regiuni
inversate sau rearanjate unele n raport cu altele. Exist! mult mai mul"i membri
trunchia"i dect membri cu lungime normal! n genoamele de #oarece #i de la primate.
n consecin"!, num!rul de copii par genom ale sub-regiunilor secven"elor lungi LINE-
1 variaz!, #i cre#te de la extremitatea stng! la extremitatea dreapt!. De exemplu, la
om exist! aproximativ 3,5 x 103 copii de secven"e la extremitatea stng! #i
aproximativ 105 copii de secven"e la extremitatea dreapt!.
Secven"ele LINE-1 sunt prezente n regiunile flancante ale genelor, n introni
#i inserate n repeti"iile ADN satelit. Analiza membrilor familiei LINE-1 pe segmente
genomice clonate, ca #i hibridizarea in situ a sondelor LINE-1 cu cromozomi ntregi,
demonstreaz! c! secven"ele LINE sunt dispersate n numeroase situsuri cromozomice.
Nu se #tie dac! dispersia este aleatoare sau nu. Anumite situsuri pot con"ine grupe de
LINE-1. De exemplu, exist! un num!r surprinz!tor de membri ai familiei ntr-un
segment de 65 kpb de ADN uman care con"ine genele "-globinei.
80
Asemeni secven"elor SINE, unit!"ile LINE-1 sunt adesea nconjurate de
repeti"ii directe scurte care par s! fie duplic!ri ale situsurilor "int!, #i ele posed! un
segment 3 terminal bogat n A. Totu#i, contrar SINE, unit!"ile LINE-1 nu par s! fie
versiuni pseudo-genice ale unor gene ordinare. Unele din unit!"ile cele mai lungi ale
LINE-1 pot fi mai degrab! elemente mobile care au fost amplificate #i transpozate
ntr-un situs nou n genom printr-un mecanism care implic! transcrip"ia ntr-un ARN
intermediar, apoi transcrip"ia invers! n ADN. Transcriptaza invers! poate fi
codificat! de o regiune de aproximativ 4 kpb a unit!"ii LINE-1, o por"iune care este
relativ bine conservat! printre speciile de mamifere #i care con"ine un cadru de lectur!
lung la nivelul celor dou! catene. Unit!"ile LINE-1 trunchiate #i rearanjate ar putea
proveni din transcrip"i sau din transcrip"i inver#i aberan"i sau incomple"i, sau n urma
unor evenimente aleatoare de recombinare care nso"esc inserarea.
Secven"ele familiei LINE-1 sunt transcrise n momentul n care ARN
polimeraza II cite#te regiunea ne-codant! a unei gene, n care un membru al familiei
este inserat. n consecin"!, molecule omologe de ARN cu fiecare caten! a secven"elor
LINE-1 sunt relativ abundente n ARNhn. Nu au fost detecta"i transcrip"i n ARN
citoplasmatic poliadenilat dect n linii celulare de teratocarcinom uman sau de
limfocite de #oarece care con"in transcrip"i comple"i ai catenei purt!toare de faz!
deschis! de lectur!. Nu a fost identificat! nici o protein! codificat! de acest ARN.

SLIDE 21. Densitatea de flota%ie a ADN de la D. Virilis. Secven%ele
nalt repetitice sunt adesea pozi%ionate la nivelul centromerilor. Este
exemplu comportamentului sateli%ilor de la D. Virilus (centrifugare in
gradient de CsCl). Densitatea de flota%ie cre&te odat$ cu cre&terea
con%inutului n G+C.
Secven%ele de ADN satelit sunt adesea corelate n heterocromatin$

Densitatea de flota"ie a duplexului ADN depinde de con"inutul s!u n G-C n
concordan"! cu formula empiric!:
D = 1, 660 + 0,00098 (%G-C) g/cm3
Densitatea de flota"ie este determinat! n mod normal prin centrifugare n
gradient de densitate de CsCl. ADN formeaz! o band! n pozi"ia corespunz!toare
propriei sale densit!"ii. Frac"iile de ADN care difer! printr-un con"inut de G-C mai
mare de 5% pot fi separate normal n gradient de densitate.
Cnd ADN eucariotic este centrifugat n gradient de densitate, pot fi distinse
dou! tipuri de material:
n majoritatea ADN genomic formeaz! o band! de fragmente continue care ca un pic
destul de larg centrat la nivelul densit!"ii corespunz!toare con"inutului n G-C al
genomului. Aceata formeaz! banda principal!.
n adesea se poate observa un pic mai mic (sau picuri) la o valoare diferit! a
densit!"ii. Acest material este denumit ADN satelit.
Sateli"ii sunt prezen"i n multe genoame eucariote. Ace#tia pot avea fie o
densitate mai mare fie una mai mic! dect banda principal!. Ceea ce au n comun
aceste secven"e este c! ele reprezint! > 5% din ADN total. Un exemplu clar este
oferit de ADN dela D. virilus. Graficul reprezint! o scanare cantitativ! a benzilor
ob"inute cnd se realizeaz! centrifugarea ADN genomic n gradient de CsCl. Banda
principal! con"ine 92% din ADN genomic #i este centrat! la nivelul unei densit!"i de
flota"ie de 1, 701g/cm3 (corespunz!toare unui con"inut de G-C de 42% tipic #i pentru
mamifere, de exemplu #oarece). Picul mai mic reprezint! 8% din genom #i posed! o
81
densitate de flota"ie distinct! de 1, 671 g/cm3. Aceasta con"ine ADN satelit de
#oarece, al c!rui con"inut n G-C corespunde valorii de 30%, mult mai sc!zut dect
alte regiuni din genom.
Comportamentul ADN satelit n gradient de densitate este adesea anormal.
Cnd se realizeaz! determinarea compozi"iei n baze a sateli"ilor, se poate constata c!
aceasta este diferit! de densitatea dedus! prin evaluarea densit!"ii de flota"ie.
Motiva"ia acestui fapt este aceea c! ( nu depinde stric de compozi"ia n baze, ci de
constitu"ia secven"ei n ceea ce prive#te capacitatea de mperechere a secven"elor
al!turate. De exemplu, pentru secven"ele simple, acestea prezint! un comportament
deviat de la rela"iile de mperechere aleatoare necesare pentru a corespunde ecua"iei
densit!"ii de flota"ie. De aemenea, ADN satelit poate fi metilat, ceea ce modific!
densitatea sa.
Adesea majoritatea secven"elor de ADN nalt repetitive dintr-un genom pot fi
izolate sub form! de sateli"i. Cnd un component de ADN nalt repetitiv nu se separ!
asemeni uni satelit, dup! izolare propriet!"ile sale se pot dovedi adesea similare cu
cele ale ADN satelit. Aceasta nseamn! c! ele constau n repeti"ii multiple n tandem
care se caracterizeaz! prin centrifugare anormal!. Materialul izolat n acest fel este
adesea denumit ADN satelit criptic. Regiunile ADN satelit criptic #i aparent
formeaz! mpreuun! blocurile de unit!"i repetitive n tandem de ADN nalt repetitiv.
Cnd un genom posed! mai mult de un tip de ADN nalt repetitiv, fiecare tip exist!
sub forma unui bloc propriu (adesea blocuri diferite pot avea pozi"ii adiacente).
Unde sunt localizate n genom blocurile de ADN nalt repetitive? O extindere
a tehnicilor de hibridizare a acizilor nucleici permite ca localizarea secven"elor satelit
s! fie determinat! direct prin complementare pe cromozom. Tehnica de hibridizare
in situ sau de hibridizare citologic$ presupune denaturarea ADN cromozomal prin
tratarea celulelor dup! au fost etalate (strivite) pe o lam!. Apoi se adaug! o solu"ie
care con"ine o sond! ADN sau ARN radioactiv!. Sonda hibridizeaz! cu secven"ele
sale complementare din genomul denaturat. Localizarea situsurilor de hibridizare
poate fi determinat! prin autoradiografie.
Astfel secven"ele de ADN satelit au putut fi localizate la nivelul
heterocromatinei. Heterocromatina este termenul folosit pentru descrierea regiunilor
de pe cromozom care sunt permanent strns condensate, n contrast cu eucromatina
prezent! n majoritatea genomului. Heterocromatina se g!se#te de obicei la nivelul
centromerilor (regiunile unde kinetocorii sunt forma"i n mitoz! #i meioz! pentru a
controla mi#carea cromozomului).
Localizarea centromeric! a ADN satelit la nivelul centromerilor sugereaz!
existen"a unei func"ii structurale n cromozom. Aceast! func"ie poate fi corelat! cu
procesul de segregare a cromozomului. Pentru moment aceasta este singura
informa"ie pe care o avem despre rolul s!u. n concordan"! cu secven"a lor simpl! #i
condensat!, sateli"ii ADN nu sunt transcri#i sau tradu#i.
Sateli#ii de la artropode posed$ repeti#ii identice foarte scurte
La artropode, simbolizate de insecte #i de crabi, fiecare satelit pare s! fie mai
degrab! omogen. n mod normal, o singur! unitate repetitiv! foarte scurt! reprezint!
mai mult de 90% din ADN satelit. Aceasta a f!cut ca aceste secven"e s! fie mult mai
u#or de determinat.
Drosophila virilis are trei sateli"i major #i un satelic criptic, care mpreun!
reprezint! > 40% din genom. Secven"ele sateli"ilor sunt prezentate n figur!. Cei trei
sateli"i majori prezint! secven"e strns nrudite. Substitu"ia unei singure baze este
suficient! pentru a genera sateli"ii II #i III din secven"a satelitului I.
82
Secven"a satelitului I este prezent! #i la alte specii de Drosaphila nrudite cu
virilis. Secven"ele sateli"ilor II #i III par s! fie specifice pentru D. virilis, care este
posibil s! fi ap!rut din satelitul I dup! specia"ie.
Sateli"ii ADN de la D. virilis sunt nrudite. Mai mult de 95% din structura
fiec!rui satelit const! n repeti"ii n tandem a secven"ei predominante.

Tr!s!tura principal! a acestor sateli"i este aceea c! sunt unit!"i repetitive foarte
scurte: numai 7 pb. Sateli"i similari au fost eviden"ia"i #i la alte specii. D.
melanogaster prezint! o varietate de sateli"i, mul"i dintre ace#tia con"in unit!"i
repetitive foarte scurte (5, 7, 10 sau 12 pb). Sateli"i cu structuri comparabile au fost
determina"i #i la crabi.
Rela"iile strnse g!site ntre sateli"ii de la D. virilis nu este neap!rat o tr!s!tur!
#i a altor genoame, unde sateli"ii pot avea secven"e nenrudite. Fiecare satelit a ap!rut
ca urmare a unei amplific!ri laterale ale unei secven#e foarte scurte. Aceast!
secven"! poate reprezenta o variant! a unui satelit anterior (ca #i la D. virilis), sau
poate avea o alt! origine.
Sateli"ii sunt genera"i #i pierdu"i continuu din genom. Acest lucru face dificil!
determinarea unor rela"ii evolutive, dac! un anumit satelit curent ar fi putut s!
evolueze dintr-un satelit anterior care apoi a fost pierdut. O tr!s!tura important! a
acestor sateli"i este aceea c! ei reprezint! lan#uri lungi de ADN ce con#in secven#e de
complexitate foarte sc!zut!, n interiorul c!rora poate fi men#inut! constan#a acestor
secven#e.
O tr!s!tur! a multora dintre ace#ti sateli"i este o pronun"at! asimetrie n
orientarea perechilor de baze pe cele dou! catene. n exemplu sateli"ilor de la D.
virilis, n fiecare dintre sateli"ii majori una dintre catene fiind mai bogat! n baze T #i
G. Aceasta cre#te densitatea de flota"ie, astfel nct dup! denaturare catena grea
(heavy strand-H) poate fi separat! de catena sa complementar! (light strans L).
Acest lucru poate fi foarte util n secven"ializatea satelitului.

SLIDE 22. Organizarea diferitelor gene pentru ARNr
Genele pentru ARNr con#in o unitate repetitiv$ n tandem
n majoritatea cazurilor discutate, exist! diferen"e ntre membrii individuali ai
unui cluster de gene care permit presiunii selective s! ac"ioneze independent asupra
fiec!rei gene. O situa"ie inser! este furnizat! de dou! cazuri de clustere mari de gene
care con"in multe copii identice ale aceleia#i sau acelora#i gene. O astfel de situa"ie
ridic! cteva ntreb!ri interesante asupra evolu"iei. Majoritatea organismelor con"in
mai multe copii ale genelor care codific! pentru proteinele histonice care sunt
componente majore ale cromozomilor; exist! pu"ine organisme care nu con"in copii
multiple ale genelor care codific! pentru ARN ribozomal.
ARN ribozomal este indiscutabil produsul predominant al transcrip"iei,
constituind 80-90% din masa total! de ARN celular att la procariote ct #i la
eucariote. Exist! mai multe molecule de ARNt, dar cu siguran"! c! acestea sunt mai
mici dect ARNs ribozomal. Att ARNr ct #i ARNt sunt reprezenta"i de c!tre gene
multiple.
Num!rul genelor pentru ARNr major variaz! de la 7 la E. coli, la 100-200
pentru eucariotele inferioare, la mai multe sute n cazul eucariotelor superioare.
Aproape n toate cazurile, genele pentru moleculele de ARNr ale subunit!"ii mari #i a
celei mici formeaz! un tandem (singura excep"ie a fost eviden"iat! la mitocondriile de
la drojdii).
83
La bacterii #i la unele eucariote inferioare, genele pentru ARN 5S fac parte din
aceea#i unitate, astfel nct num!rul total al genelor 5S este acela#i cu num!rul
genelor pentru ARNs ribozomal major; la eucariote, acesta este transcris independent.
La eucariotele superioare, genele pentru ARNr 5S sunt organizate separat n propriul
lor cluster, num!rul lor dep!#ind pe cel al genelor pentru ARNr major.
Num!rul exact al genelor pentru ARNt este dificil de determinat, deoarece
structura secundar! extins! a moleculei creeaz! dificult!"i tehnice reac"iilor de
hibridizare. Probabil c! num!rul actual este sub-estimat.
Lipsa oric!rei varia"ii detectabile n secven"ele moleculelor ARNr implic!
identitatea tuturor copiilor fiec!rei gene, sau existen"a unor diferen"e care s! se
manifeste sub pragul de detec"ie pentru ARNr ('1%). Un punct de interes major este
acela privind mecanismele care sunt utilizate pentru a mpiedica varia"iile care ar
putea s! apar! la nivelul secven"elor individuale.
La bacterii, perechile de gene multiple ARNr 16S-23S sunt dispersate. n
majoritatea nucleilor de la eucariote, genele pentru ARNr sunt con"inute ntr-un
cluster sau clustere n tandem. Adesea aceste regiuni sunt numite ADNr (n unele
cazuri, propor"ia de ADNr din ADN total, mpreun! cu compozi"ia sa atipic! n baze
este destul de mare pentru a permite separarea direct! a frac"iilor). O tr!s!tur! a
clusterului n tandem este c! acesta genereaz! o hart! de restric"ie circular!.
Presupunem c! fiecare unitate repetitiv! are 3 situsuri de restric"ie.
Fragmentele A #i B sunt n ntregime con"inute ntr-o unitate repetitiv!, #i fragmentul
C con"ine cap!tul unei unit!"i repetitive #i nceputul urm!toarei. Cnd cartografiem
aceste fragmente prin metode conven"ionale, g!sim c! A i urmeaz! lui B, B i
urmeaz! lui C, care i urmeaz! lui A, genernd o hart! circular!. Dac! clusterul este
mare, fragmentele interne (A, B, C) vor fi prezente n cantit!"i mult mai mari dect
fragmentele terminale (X, Y) care conecteaz! clusterul la regiunea de ADN adiacent!.
ntr-un cluster cu 100 de repeti"ii, X #i Y vor fi prezente la un nivel de 1% din nivelul
lui A, B, C. Acest lucru face dificil! ob"inerea capetelor unui cluster de gene n scopul
construirii unei h!r"i.
Regiunea nucleului unde are loc sinteza ARNr prezint! o caracteristic! aparte;
este o regiune core (miez) de natur! fibrilar! nconjurat! de un cortex granular.
Miezul fibrilar reprezint! regiunea n care ARNr este transcris de pe matri"a ADN;
cortexul granular este format din ribonucleoparticulele n care este asamblat ARNr.
ntreaga suprafa"! este numit! nucleol.
Regiunile particulare ale cromozomului asociate nucleolului se numesc
organizatori nucleolari. Fiecare organizator nucleolar corespunde unui cluster de
gene ARNr repetitive n tandem situate pe un cromozom. Nucleolii au o morfologie
caracteristic! datorit! concentra"iei mari a genelor repetitive n tandem #i a intensit!"ii
lor de transcriere.
Perechea de sARNr este transcris! ca un singur precursor att la bacterii ct #i
n nucleii eucariotelor. Dup! transcrip"ie, precursorul este clivat pentru a elibera
moleculele individuale de ARNr. Transcriptul ncepe la cap!tul 5 leader, este urmat
de secven"a pentru ARNr mic, apoi de o regiune numit! transcribed spacer
(spacer transcris), #i n final de secven"a moleculei de ARNr mare care este
orientat! c!tre cap!tul 3 al moleculei. (Spacerul transcris nu trebuie confundat cu
nontranscribed spacer care separ! unit!"ile de transcrip"ie. Numele s!u reflect!
faptul c! acesta este parte a unit!"ii de transcrip"ie, dar nu este reprezentat n produ#ii
maturi ARN).
84
Unitatea de transcrip"ie este mai lung! dect lungimea total! a moleculelor de
sARNr. n tabelul sunt prezentate cteva exemple ale rela"iei dintre transcriptul
primar #i moleculele de sARNr.
Unitatea transcrip"ional! este mai scurt! la bacterii, unde secven"ele ARNr
constituie 80% din lungimea total! de 6 kb. Nu se observ! nici o caracteristic!
sistematic! la nivelul eucariotelor la care lungimea transcriptului variaz! de la 7 la 8
kb, 70-80% din secven"! reprezentnd sARNr. Precursorul este mai lung la mamifere
(unde este cunoscut ca ARN 45S, n func"ie de viteza de sedimentare). Aici secven"ele
ARNr matur ocup! numai un pic mai mult de 50% din transcriptul complet.
Ce se ntmpl! cu regiunile ne-ribozomale ale precursorului ARN ? *leaderul
#i regiunile spacer transcrise sunt nl!turate n timpul matur!rii ARNr. Spacerul
transcris con"ine cteva secven"e scurte care sunt eliberate prin clivare. La mamifere
#i amfibieni, o secven"! scurt! formeaz! ARN 5,8S, o secven"! scurt! care se leag! n
ribozom, prin leg!turi de hidrogen, cu ARNr 28S. La bacterii, secven"ele ARNt sunt
localizate n spacerul transcris #i (adesea) de asemenea la cap!tul 3 al transcriptului
primar. Restul spacerului transcris, #i toate secven"ele leader sunt probabil
degradate n nucleotide.
Clusterul ADNr con"ine multe unit!"i de transcrip"ie, fiecare separat! de
urm!toarea printr-un spacer ne-transcris. Alternan"a unit!"ilor de transcrip"ie #i a
spacerului (separatorului) ne-transcris se poate observa direct la microscopul
electronic. n cazul tritonului N. viridescens fiecare unitate de transcrip"ie este intens
exprimat!, astfel nct mai multe ARN polimaraze sunt angajate simultan n
transcrip"ia unei unit!"i repetitive. Polimerazele sunt att de aproape localizate nct
alungire produ#ilor lor formeaz! o matri"! caracteristic! care se deplaseaz! de-a
lungul unit!"ii de transcrip"ie. Separatorul netranscris variaz! destul de mult ca
lungime (uneori) chiar n interiorul aceleia#i specii.
La drojdii exist! un separator netranscris scurt, relativ constant ca lungime. La
D. melanogaster, exist! varia"ii mari ale lungimii separatorului netranscris prezent
ntre diferite copii ale unit!"ii repetitive. O situa"ie similar! este caracteristic! X.
laevis. n fiecare dintre aceste cazuri, toate unit!"ile repetitive sunt prezente sub forma
unui singur cluster n tandem pozi"ionat pe un anumit cromozom (n cazul D.
melanogaster acesta este cromozomul sexual. Clusterul de pe cromozomul X este mai
mare dect cel de pe cromozomul Y, astfel nct femelele posed! mai multe copii ale
genelor ARNr dect masculii).
La mamifere unitatea repetitiv! este foarte mare, cuprinznd unitatea de
transcrip"ie de ' 15 kb #i un separator netranscris de ' 30 kb. n mod normal, genele
sunt localizate n mai multe clustere dispersate-n cazul omului #i a #oarecelui este
vorba de cinci #i #ase cromozomi.
O ntrebare interesant!: cum reu#esc mecanismele de corec"ie, care se
presupune c! func"ioneaz! n interiorul unui singur cluster pentru a asigura o secven"!
ARN constant!, s! se manifeste #i n cazul existen"ei mai multor clustere ?
Varia"iile lungimii separatorului netranscris ntr-un singur cluster contrasteaz!
cu ideea conserv!rii unei unit!"i de transcrip"ie. n ciuda acestei varia"ii, secven"ele
separatorilor netranscri#i mai lungi r!mn omologe cu cele ale separatorilor
netranscri#i mai scur"i. Aceasta implic! c! fiecare separator ne-transcris prezint!
repeti"ii interne, astfel nct varia"iile de lungime sunt rezultatul modific!rilor
num!rului de repeti"ii ale unora dintre subunit!"i.
Natura general! a separatorului ne-transcris este ilustrat! cu ajutorul
exemplului de la X. laevis. Regiunile care sunt fixe ca lungime alterneaz! cu regiunile
care variaz!. Fiecare dintre cele trei regiuni repetitive cuprind un nun!r variabil de
85
repeti"ii ale unei secven"e scurte. Un tip de regiune repetitiv! este cea care con"ine
unit!"i repetitive de 97 pb; cealalt! care are dou! localiz!ri, are o unitate repetitiv! n
dou! forme (din dou! componente), de 60 pb #i respectiv 81 pb. Varia"ia num!rului
de unit!"i repetitive la nivelul regiunilor repetitive influen"eaz! varia"ia lungimii totale
a separatorului.
Una dintre regiunile fixe (de la nceputul unit!"ii) este unic! ca lungime #i
secven"!. Celelalte sunt secven"e scurte constante numite insule Bam. (Aceast!
regiune are acest nume datorit! enzimei de restric"ie cu ajutorul c!reia a fost izolat!).
Din acest tip de organizare, se poate observa evolu"ia clusterului prin duplic!ri n care
a fost implicat! regiunea promotor.
Separatorul ne-transcris are rol n transcrip"ie. Repeti"iile 60/81 pb au rol de
ini"iere, probabil comparabil cu rolul pe care activatorii l au pentru genele transcrise
de c!tre ARN polimeraza II. Prezen"a unui separator cre#te frecven"a de ini"iere,
aparent prin faptul c! determin! mai multe ARN polimeraze I s! se lege succesiv la
promotor. Nu putem nc! n"elege natura exact! a acestei rela"ii, #i ct de mult
depinde ea de similitudinile de secven"! dintre separator "i promotor.

SLIDE 23. Organizarea clusterului genelor histonelor la diferite
organisme
Genele pentru histone: conservarea secven#ei codante "i divergen#$ la nivelul
organiz$rii genei
Propriet!#ile generale ale genelor pentru histone
Structurile primare ale histonelor sunt bine conservate, chiar #i la eucariote
foarte diferite. Acest lucru nu este surprinz!tor, dat fiind rolul fundamental #i comun
pe care histonele l au n strutura cromatinei. Totu#i, histonele variaz!. Secven"ele
histonelor H1 sunt cele care posed! cel mai mare grad de divergen"!, cele ale H3 #i
H4 fiind cele mai pu"in divergente. Pentru o anumit! specie, n diferite etape de
dezvoltare sau ale ciclului celular sau n "esuturi diferite pot fi sintetizate molecule de
histone u#or diferite. De exemplu, expresia majorit!"ii genelor pentru histone n faza S
a ciclului celular #i deci n timpul replic!rii. Alte gene, numite gene de nlocuire, se
exprim! ntr-o propor"ie redus! n timpul ntregului ciclu celular. n contrast cu
conservarea secven"elor polipeptidice, num!rul de aranjamente ale genelor pentru
histone difer! considerabil ntre specii. Aceasta subliniaz!, cum o face de altfel #i
organiz!rea genelor pentru ARNt, c! p!strarea (conservarea) secven"elor codante nu
presupune neap!rat conservarea num!rului de copii sau a organiz!rii genomice.
Genele diferitelor familii de histone au tendin"a de a fi legate (unitate de
linkage) dar contrar genelor pentru ARNr, unde trei gene sunt prezente ntr-o singur!
unitate de transcrip"ie, fiecare gen! pentru histone este transcris! ca o unitate separat!,
adesea chiar de pe o catena opus!. O alt! diferen"! fa"! de genele pentru ARNr este c!
ordinea genelor pentru histone nu este neap!rat aceea#i de la o specie la alta #i nici
chiar n aceea#i specie. n plus, cu toate c! genele legate pentru histone sunt
repetitive n anumite organisme, ele sunt dispersate la p!s!ri #i mamifere. Cea mai
mare parte a genelor pentru histonele de tip replicativ (care sunt exprimate n faza
replic!rii ADN) sunt lipsite de introni iar moleculele de ARNm nu posed! coad!
poliA.
Pentru ob"inerea de informa"ii privind organizarea genelor pentru histone
nainte de apari"ia tehnicilor ADN recombinat au fost folosite dou! abord!ri
experimentale. n primul rnd, separarea genelor pentru histone la nivelul benzilor
sateli"ilor dup! centrifugarea ADN total n gradient de densitate a dus la eviden"ierii
86
num!rului de copii #i a organiz!rii n tandem la ariciul de mare. Apoi a fost posibil!
purificarea par"ial! a ARNmpentru histone pornind de la o surs! mbog!"it!.
Clonarea genelor pentru histone
n primele zece ore dup! fecundare, ou!lele de arici de mare se divid de 2x10
9

la 2x10
10
ori. Aceste diviziuni celulare sunt nso"ite de o replicare rapid! a ADN #i de
o sintez! important! de histone. n timpul acestei perioade, 30% dintre proteinele
sintetizate sunt proteine nucleare iar moleculele de ARNm care codific! pentru
histone sunt foarte abundente. M!rimea lor caracteristic! face ca acestea s! se
concentreze n frac"ia de ARNm care sedimenteaz! la 9S. Prin electroforez! n gel de
poliacrilamid! se pot separa moleculele de ARNm pentru histonele individuale care
pot fi apoi identificate prin traducere in vitro. Moleculele de ARNm de arici de mare
au putut fi astfel folosite drept sonde pentru clonarea genelor de histone de la plante,
ciuperci #i animale.
La ariciul de mare genele pentru histone sunt un grup particular de gene care
asigur! sinteza rapid! a histonelor n timpul stadiilor embrionare foarte precoce. Dup!
formarea stadiului de blastul!, are loc stimularea unui alt grup de gene care este
responsabil de sinteza histonelor n timpul urm!toarei perioade de dezvoltare #i la
organismul adult. Aceste dou! grupe sunt denumite ca grupul de gene precoce #i
grupul de gene tardive de la ariciul de mare. Organizarea lor variaz! de la o specie
de arici de mare la alta. n continuare vom exemplifica cu situa"ia genelor de la
Strongylocentrotus purpuratus.
Segmentele genomice care con"in genele histonelor precoce au fost clonate
plecnd de la o banc! de fragmente de ADN ob"inute prin digestie cu EcoRI #i
folosind drept sond! ARNm total de histone. Au fost ob"inute dou! fragmente care nu
se hibridizeaz! ntre ele Totu#i, prin cartografie genomic! s-a constat c! aceste dou!
fragmente sunt legate (linkate) ntr-un interval de 7 kb n genom. Prezen"a #i ordinea
celor cinci gene pentru histone n cele dou! clone, a fost stabilit! prin hibridizarea
ADN cu ARNm separat prin electroforez!. Heteroduplexurile formate au fost
analizate prin microscopie electronic!.
De asemenea, fiecare molecul! de ARNm a fost testat! prin hibridizare cu
catenele separate ale segmentelor clonate; moleculele de ARNm se hibridizeaz! toate
pe aceea#i fibr!, ceea ce demonstreaz! c! cele cinci gene sunt transcrise n acela#i
sens. n continuare, analiza secven"ei nucleotidice a confirmat toate concluziile #i a
stabilit m!rimea exact! a regiunilor codante #i a separatorilor dintre acestea. Cele
cteva sute de exemplare linkate de gene pentru histone precoce sunt formeaz! lungi
alinieri n tandem. Aranjamente comparabile se reg!sesc la mai multe specii de arici
de mare.
Genele histonelor tardive nu sunt repetate dect de aproximativ 10 ori,
situa"ia fiind diferit! de cea a genelor precoce. n afar! de num!rul lor redus de copii,
genele tardive se diferen"iaz! de cele precoce din multe ale puncte de vedere. n
primul rnd, ele nu sunt linkate n grupe de cinci #i nici organizate n repeti"ii n
tandem. Anumite gene sunt vecine (de exemplu, H3 #i H4) situate la 1 kb una de alta,
n timp ce altele sunt mult mai izolate, separate prin cel pu"in 6 kb de orice alte gene
pentru histone. Nici ordinea genelor, nici sensul de transcriere al acestora nu sunt
corelate cu aranjamentul genelor precoce echivalente. n plus, organizarea genelor
tardive este variabil! de la o specie la alta de arici de mare.
Genele histonelor precoce #i tardive clonate corespunz!toare nu se
hibridizeaz! ntre ele n condi"ii stricte de hibridizare cu toate c! produ#ii genelor au
structuri foarte asem!n!toare (uneori chiar identice). Diferen"ele dintre secven"ele
codante reflect! folosirea unor codoni diferi"i pentru acela#i aminoacid. Secven"ele
87
care flancheaz! genele precoce #i tardive corespunz!toare sunt #i mai divergente,
cu excep"ia secven"elor nucleotidice esen"iale necesare transcrierii de c!tre ARN
polimeraza II.
Genele pentru histone la alte specii. La Drosophila, hibridizarea in situ a
genelor clonate cu cromozomii politeni, a permis localizarea tuturor genelor pentru
histone ntr-o regiune a cromozomului 2. Cele 5 gene sunt legate n cadrul uneu
unit!"i repetitive de aproximativ 100 de ori; ordinea #i sensul de transcrip"ie a genelor
sunt total diferite de cele ale genelor de la ariciul de mare. Trecerea de la o sintez!
ridicat! de histone la cantit!"i sc!zute n timpul embriogenezei la Drosophila nu se
bazeaz! aparent pe expresia unor gene difeite, ca la arici, ci este rezultatul modul!rii
expresiei aceluia#i grup de gene.
ADN de la drojdii (S. cerevisiae) con"ine dou! copii ale unui segment care
con"ine o gen! pentru H2A #i o gen! pentru H2B, #i dou! copii ale unui alt segment
care con"ine o gen! pentru H3 #i una pentru H4. Genele omologe n perechile de
segmente pot codifica pentru proteine pu"in diferite (de ex pentru H2A) sau identice
(ex. H3). Nu se #tie dac! aceste varia"ii prezint! semnifica"ie func"ional!.
Ca #i la nevertebrate, vertebratele prezint! o diversitate foarte mare a
organiz!rii genelor pentru histone. La Xenopus, exist! mai multe grupe de gene
legate pentru cele cinci histone, dar genele sunt ordonate diferit, Dou! dintre grupe
se disting prin varia"ii ale genei H1. Fiecare dintre aceste gene H1 se hibridizeaz! cu
molecule ARNm diferite din ovocit, #i cei doi mesageri produc, prin traducere in
vitro, proteine H1 diferite. De asemenea, genomul de Xenopus con"ine mai multe
aliniamente n tandem ale grupelor de gene pentru histone, dar contrar genelor
precoge pentru histone de la arici, grupele vecine din interiorul aceleia#i
alinieriprezint! polimorfism de restric"ie.
Localizarea celor aproximativ 700 de gene pentru histone de la Triton
demonstreaz! c! pozi"ia genelor are importan"! sc!zut! pentru anumite aspecte ale
expresiei acestora. Segmentele de ADN care con"in genele celor cinci histone au o
lungime de 9 kpb #i fiecare este situat ntr-o lung! serie de repeti"ii n tandem ale unei
secven"e ne-nrudite situat! pe acela#i bra" al cromozomului. Se pot observa ntre 50
la 100 kpb din aceast! secven"! repetitiv! n tandem ntre fiecare grup! de gene pentru
histone. Aceea#i secven"! repetitiv! n tandem apare #i la nivelul centromerilor.
Animalele cu snge cald au relativ pu"ine gene pentru histone. Acestea nu sunt
nici grupate sistematic #i nici repetate n tandem, dar se pot eviden"ia adesea gene
vecine


SLIDE 24. Dou$ mecanisme posibile pentru men%inerea omogenit$%ii
unei familii multigenice n tandem
O dilem$ evolutiv$: Cum pot fi men%inute mai multe copii active
Aceea#i problem! se pune #i atunci cnd gena a fost duplicat!. Cum poate
selec"ia s! previn! acumularea de muta"ii modificatoare?
Duplicarea unei gene are ca rezultat o relaxare imediat! a presiunii evolutive
asupra secven"ei sale. Acum exist! dou! copii identice, modificarea secven"ei uneia
nu va lipsi organismul de o protein! func"ional!, atta timp ct secven"a original! n
aminoacizi continu! s! fie codificat! de o alt! copie. Astfel presiunea selectiv! asupra
celor dou! gene este difuzat!, pn! cnd una dintre ele achizi"ioneaz! un num!r
suficient de muta"ii #i se ndep!rteaz! destul de mult de func"ia sa original! nct toat!
presiunea selectiv! s! se reflecte asupra celeilalte.
88
Imediat dup! o duplicare genic!, modific!rile se pot acumula mult mai rapid
ntr-una din copii, conducnd eventual la o func"ie nou! (sau la modificarea genei sub
forma unei pseudogene). Dac! se dezvolt! o nou! func"ie, gena va evolua cu aceia#i
vitez! sc!zut! ca #i func"ia sa original!. Probabil acesta este tipul de mecanism
responsabil de separarea func"iilor genelor embrionare #i adulte ale globinei.
Exist! #i situa"ii n care genele duplicate r!mn cu aceea#i func"ie, codificnd
pentru proteine identice sau aproape identice. Genele !-globinei umane codific!
proteine identice, iar ntre cele dou! proteine #i )-globin! exist! numai un singur
aminoacid diferit. Cum se exercit! presiunea selectiv! pentru a men"ine secven"e
identice?
Au fost propuse dou! tipuri generale de mecanisme. Ele se bazeaz! pe
principiul c! genele nealelice nu sunt mo#tenite independent, dar trebuie regenerate
continuu dup! una dintre copiile genera"iei anterioare. n cazul cel mai simplu a dou!
gene identice, cnd o muta"ie apare n una dintre copii, fie este eliminat! din
ntmplare (deoarece secven"a altor copii este eliminat!), fie aceasta este extins! la
cele dou! replici (gene duplicate) (deoarece copia mutant! devine versiunea
dominant!). Aceast! extindere expune muta"ia selec"iei. Rezultatul este c! cele dou!
gene evolueaz! mpreun!. Acest fenomen se nume#te evolu"ie concertat$
(coincident$) (coevolu#ie ocazional$). Ea este aplicabil! unei perechi de gene
identice sau unui cluster care con"ine multe gene.
Unul dintre mecanisme presupune c! secven"ele genelor ne-alelice sunt
comparate direct una cu cealalt! #i omogenizate de enzime care recunosc orice
diferen"!. Acest lucru poate fi realizat prin schimbarea monocatenelor ntre ele, pentru
a forma gene ale c!ror catene deriv! dintr-o copie #i cealat! dintr-o alt! copie. Orice
diferen"! care apare ntre secven"e #i care determin! o mperechere
necorespunz!toare, poate atrage aten"ia unor enzime capabile s! nl!ture #i s!
nlocuiasc! o baz!, astfel nct numai mperecherile A-T #i G-C s! fie viabile. Acest
tip de eveniment este numit conversie genic$ #i este asociat cu procesele de
recombinare genetic!.
Apare necesitatea certific!ri (stabilirii) scopului unor astfel de evenimente prin
compararea secven"elor genelor duplicate. Dac! ele sunt subiectul unei evolu"ii
concertate, nu trebuie s! constat!m acumularea unor substitu"ii la nivelul situsurilor
silen"ioase ale acestora (deoarece procesul de omogenizare se aplic! #i acestora la fel
de bine ca#i n cazul situsurilor de substitu"ie). Se #tie c! extinderea mecanismului de
men"inere nu se extinde dincolo de gena ns!#i, astfel nct cazuri de gene duplicate
ale c!ror secven"e flancante sunt total diferite. ntradev!r, se poate constata existen"a
unoe catene abrupte care marcheaz! capetele secven"elor care au fost omogenizate.
Trebuie s! ne reamintim c! existen"a unui astfel de mecanism poate invalida
povestea (determinarea) istoriei unor astfel de gene prin intermediul divergen"ei lor,
deoarece divergen#a reflect! numai timpul de la ultimul eveniment de
omogenizare/regenerare, "i nu duplicarea original!.
Cnd exist! mai multe copii ale genei, efectele imediate al muta"iei pentru
orice copie trebuie s! fie foarte u#oare. De exemplu, n cazul clusterului ADNr, exist!
sute de copii de gene, aproape toate identice. Cosecin"ele unei muta"ii individuale sunt
diluate de num!rul mare de copii ale genei care p!streaz! secven"a s!lbatic!. Aceasta
sugereaz! c! o propor"ie apreciabil! de copii muante se pot acumula nainte ca efectul
s! devin! destul de puternic pentru a fi eliminate de c!tre evolu"ie.
Letalitatea devine cantitativ!, concluzie sus"inut! de observa"ia c! se poate
realiza nl!turarea a jum!tate dintre unit!"ile clusterului ADNr de la X. laevis #i D.
melanogaster f!r! nici un efect. Deci cum se realizeaz! prevenirea acumul!rii unor
89
muta"ii modificatoare? Ce #ans! au muta"iile favorabile s! #i demonstreze avantajele
n cadrul unui cluster?
Concluzia inevitabil! este c! anumite mecanisme trebuie s! permit! anumitor
variante s! fie analizate de c!tre evolu"ie (s! fie cnt!rite n procesul evolutiv). (i n
acest caz au fost propuse dou! tipuri de mecanisme.
Modelul corect$rii nea"teptate (sudden corection) presupune c! destul de
frecvent un cluster de gene este nlocuit de un nou set de copii derivat din una sau din
mai multe copii prezente n genera"ia anterioar!. Pentru a se putea realiza (impune) o
for"! selectiv!, destul de frecvent (every so often) trebuie s! fie de cteva genera"ii
(trebuie s! reprezinte cteva genera"ii); dar n termeni practici, orice mecanism trebuie
s! fie structurat pe baze periodice regulate, ceea ce nseamn! la fiecare genera"ie.
Num!rul mic de copii care dau na#tere unui nou cluster formeaz! un set
master asupra c!ruia ac"ioneaz! selec"ia; copiile nl!turate sunt irelevante pentru
selec"ie. Copiile master pot constitui un set particular care poate fi ales la
ntmplare. Mecanismul se poate presupune c! este asem!n!tor celui de amplificare,
sau de conversie pozitiv! a genelor.
Dificultatea acestui model este c! el presupune regenerarea unui cluster din
cteva unit!"i repetitive. Aceasta nseamn! c! att unit!"ile de transcrip"ie ct "i
separatorii trebuie regenera"i, astfel nct ntreaga unitate repetitiv! s! fie omogen! ca
secven"! (sau cel pu"in, s! nu aib! o variabilitate mai mare dect num!rul mic de copii
master). Dar de fapr separatorii manifest! o variabilitate continu!, n timp ce numai
unit!"ile de transcrip"ie sunt constante.
Cel!lalt model, crossover fixation, presupune c! ntregul cluster este supus
unui mecanism de rearanjare continu! prin crossing-over inegal. n esen"!, este vorba
de aplicarea la nivelul unui cluster n tandem a mecanismului deja discutat pentru
genele globinei pe baze mult mai restrictive #i ocazionale. Astfel de evenimente pot
explica evolu"ia concertat! a genelor multiple dac! prin intermediul unui crossing-
over se poate determina regenerarea fizic! pornind de la o copie.
Urmnd mecanismul descris, de exemplu, cromozomul care poart! un locus
triplu poate suferi dele"ia uneia dintre gene. Din cele dou! gene r!mase, 11/2
reprezint! secven"a uneia din copiile originale #i numai 1/ secven"a celellalte copii
originale. Orice muta"ie existent! n prima regiune va exista acum n ambele gene #i
va fi subiectul presiunii selective.
Analiznd consecin"ele crossing-overului inegal este evident c! clusterele n
tandem furnizeaz! #anse frecvente pentru mperecherea neadecvat! a genelor ale
c!ror secven"e sut aproximativ acelea#i, dar care sunt situate n diferite pozi"ii ale
clusterului. Prin expansiune continu! #i contractare a num!rului de unit!"i prin
crossing-over inegal, este posibil ca toate unit!"ile s! derive dintr-o regiune mic! a
unui cluster ancestral. Lungimea variabil! a separatorilor este concordant! cu ideea c!
crossing-overul inegal care loc cu implicarea unor separatori ntre care se realizeaz! !
imperechere inadecvat! intern!. Aceasta poate explica omogenitatea genelor
comparativ cu variabilitatea separatorilor. Genele sunt supuse selec"iei cnd unit!"ile
repetitive individuale sunt amplificate n interiorul unui cluster; dar separatorii sunt
irelevan"i #i pot acumula modific!ri.





90
SLIDE 25. Evolu%ia sintezei genelor globinei n dezvoltarea embrionar$
&i fetal$

Gene esen#iale "i num$rul total al genelor
Cte gene sunt esen"iale? O alt! abordare a chestiunii num!rului de gene este
s! determin!m num!rul genelor esen"iale prin analize muta"ionale. Dac! se realizeaz!
saturarea unor regiuni specifice de pe cromozom cu muta"ii care sunt letale, num!rul
grupurilor de complementare n care aceste muta"ii sunt distribuite va identifica
num!rul total de loci letali din acea regiune. Prin extrapolare la ntregul genom,
putem calcula num!rul total de gene esen"iale.
Cele mai extinse analize asupra num!rului esen"ial de gene au fost realizate la
Drosophila unde s-a putut realiza corelarea aspectului vizibil al cromozomilor cu
num!rul de unit!"i genetice. Acest lucru a fost posibil prin urm!rirea prezen"ei
benzilor la nivelul cromozomilor politeni de la D. melanogaster. (Ace#ti cromozomi
pot fi eviden"ia"i n anumite stadii de dezvoltare #i reprezint! o form! fizic! neobi#nuit
de extins!, n care se pot vedea serii de benzi, denumite mai mult formal cromomere).
Pornind de la conceptul ini"ial c! benzile pot reprezenta o ordine linear! a genelor, s-a
ajuns la ideea corel!rii organiz!rii genelor cu organizarea benzilor. Exista peste 5 000
de benzi n setul haploid de la D. melanogaster; acestea variaz! adesea cu un ordin de
m!rime, dar media este poate fi de aprox 20 kb/band!.
Abordarea de baz! este de a satura o regiune cromozomiala cu muta"ii. De
obicei muta"iile sunt colectate simplu ca letale, f!r! a analiza cauza letalit!"ii. Orice
muta"ie care este letal! este luat! n seam! (n eviden"!) pentru a identifica un locus
care este esen"ial pentru organism. Cnd muta"iile sunt plasate ntr-un grup de
complementare, num!rul acestora poate fi comparat cu num!rul benzilor prezente n
regiune, sau grupuri individuale de complementare pot fi alocate unor benzi
individuale. Scopul acestor experien"e este determinarea existen"ei unei corela"ii
consistente ntre benzi #i gene; de exemplu dac! fiecare band! con"ine o singur! gen!?
Un exemplu de regiune cartografiat!, n care 12 grupuri de complementare au
fost cartografiate ntr-o regiune rosy de 16 benzi. n acest caz, grupul a fost
cartografiat cu ajutorul unor markeri ADN de m!rime cunoscut!, astfel nct a fost
posibil! constatarea c! ntreaga regiune con"ine 300 kb. Aceast! distribu"ie a
grupurilor de complementare este n general paralel! cu distribu"ia benzilor, dar nu se
poate spune c! exist! o corela"ie de 1:1. Se demonstreaz! o corela"ie rezonabil! ntre
num!rul de benzi (265) #i num!rul de grupuri de complementare (215). Aceasta
corespunde la aproximativ 5% din genomul D. melanogaster. n cazurile n care
grupurile au fost cartografiate folosind ADN, se constat! existen"a unei regiuni de 10-
20 kb pentru un grup de complementare letal!, distan"! care este de dou! ori mai mare
dect m!rimea medie a unei gene.
Diferen"a dintre num!rul total de gene #i num!rul de gene letale adus! din nou
n discu"ie datorit! datelor genetice #i biochimice. La nivel molecular, se cunoa#te c!
multe gene sunt localizate n aceea#i vecin!tate, de exemplu, ele pot fi linkate pe
acelea#i fragmente genomice. Aceasta nseamn! c! astfel de gene sunt localizate n
interiorul aceleia#i benzi. Aceasta este totu#i un contrast ntre echivalen"a aparent! a
locilor letali #i a benzilor #i prezen"a mai multor gene ntr-o band!. Exist!
posibilitatea ca o band! s! con"in! mai multe gene, dar multe dintre acestea sau chiar
toate s! nu fie gene esen"iale. Pn! n prezent nu putem spune c! exist! posibilit!"i
clare de definire a unor criterii dup! care s! se poat! decide care sunt genele esen"iale
#i care cele ne-esen"iale.
91
Un experiment care a ncercat s! determine ce propor"ie din genele actuale
este esen"ial! s-a soldat cu rezultate foarte interesante n cazul S. cerevisiae. Genomul
acestei drojdii este relativ mic, #i o mare parte este transcris (>50% dac! compar!m cu
eucariotele superioare). n urma introducerii unor inser"ii la ntmplare n genom, s-a
constatat c! numai 12% dintre acestea sunt letale, #i alte 14% mpiedic! cre#terea.
Majoritatea inser"iilor (70%) nu au avut nici un efect. Dac! toate inser"iile utilizate
con"ineau semnale de terminare a transcrip"iei ne puteam a#tepta ca acestea s!
mpiedice expresia oric!rei gene n care se integrau.
Se presupune c! toate ntreruperile care nu aveau nici un efect erau pozi"ionate
n regiuni netranscrise. Propor"ia ntreruperilor de acest tip poate fi de 50% astfel
nct r!mne o propor"ie de 20% din ntreruperi f!r! efect cu toate c! sunt pozi"ionate
n regiuni transcrise (Regiunile transcrise reprezint! 50% din genom dar reprezint!
con"inutul tuturor genelor). n urma acestor rezultate se poate considera c!
ntreruperea a 20% din regiuni reprezint! ntreruperea a 40% dintre gene. Aceasta
implic! c! 40% dintre genele exprimate la drojdii nu sunt esen"iale.
Cum pot fi explicate aceste rezultate? O posibilitate o reprezint! existen"a unei
redundan"e extinse, astfel nct multe gene sunt prezente n mai multe copii. Acest
punct de vedere este cu siguran"! adev!rat pentru anumite cazuri, n care mai multe
gene trebuie inactivate pentru a ob"ine un efect. Pentru moment nu avem la ndemn!
nici o modalitate de control (supraveghere) sistematic! cu ajutorul c!reia s!
determin!m cte dintre genele actuale posed! func"ii unice #i cte sunt redundante sau
pur #i simplu organismul se poate dispensa de ele. Ideea c! anumite gene nu sunt
esen"iale (sau cel pu"in c! nu pot fi eviden"iate efecte serioase asupra fenotipului)
ridic! cteva ntreb!ri importante. Con"ine genomul gene autentic dispensabile, sau au
aceste gene actuale efect semnificativ asupra fenotipului cel pu"in n timpul lungului
progres al evolu"iei? Are fiecare gen! o func"ie unic! (a#a cum ne putem a#tepta dac!
este esen"ial!) sau exist! redundan"!: sunt prezente unele gene sub forma mai multor
copii?
Nu ne putem pronun"a dac! la eucariotele superioare exist! func"ii de care
celula s! se poat! dispensa, dar dac! exist!, trebuiesc re-gndite unele din ntreb!rile
asupra evolu"iei. (tim c! unele gene par s! fie redundante. Exist! multe cazuri n care
muta"iile locilor individuali de la drojdii #i Drosophila nu prezint! efecte aparente, dar
n prezen"a altor muta"ii la nivelul altor loci devin letale. ntrebarea dac! exist! cu
adev!rat gene redundante este foarte dificil! #i ea la rndul ei conduce la o alt!
ntrebare dificil!: cum se realizeaz! presiunea selectiv! pentru aceste gene?
Alte ntreb!ri cheie sunt: care este propor"ia de gene esen"iale din num!rul
total de gene; ce num!r de muta"ii produce pn! la urm! efecte detectabile; exist!
gene care sunt autentic dispensabile? Dac! acesta este cazul n care se g!sesc multe
gene #i anume de a nu codifica pentru proteine specifice care nu sunt esen"iale pentru
supravie"uirea organismului (n sensul n care modific!ri muta"ionale nu determin!
nici un efect detectabil), trebuie s! r!spundem de ce aceste continu! s! fie exprimate.
Alte ntreb!ri secundare despre genom ca ntreg sunt: are ADN vreo func"ie (dac!
exist! vreuna) care nu este codificat! de gene (care nu rezid! n structura genelor)? Ce
efect are o modificare important! (este cazul amfibienilor) a m!rimii totale asupra
operabilit!"ii genomului?

SLIDE 26. Organizarea structural$ a diferitelor gene pentru globine
Genele globinei sunt organizate n dou$ clustere
Exemplul cel mai bine caracterizat pentru un cluster de gene este reprezentat
de genele globinei, care constituie o familie veche, #i responsabile de o func"ie cu rol
92
central n lumea animal!: transportul oxigenului de c!tre snge. Constituentul major
al celulelor ro#ii ale sngelui este tetramerul de globin!, asociat cu gruparea hem (ion
binding-care leag! fierul) pentru a forma hemoglobina. Genele func"ionale ale
globinei de la toate speciile au aceea#i structur!, fiind mp!r"ite n trei exoni. Putem
concluziona c! toate genele globinei deriv! dintr-o singur! gen! ancestral!; astfel
nct trasnd (urm!rind) dezvoltarea (evolu"ia) genelor individuale n interiorul unei
specii #i ntre acestea, putem n"elege (nv!"a) despre mecanismele implicate n
evolu"ia familiilor de gene.
n celulele adulte, tetramerul de globin! const! n dou! lan"uri ! #i dou! "
identice. Genele ! #i " sunt pozi"ionate la nivelul unor loci genetici diferi"i a c!ror
exprimare trebuie coordonat! pentru a asigura o sintez! echivalent! a ambelor
polipeptide. Acest sistem furnizeaz! n consecin"! un exemplu de control simultan a
unor gene dispersate pentru a genera un anumit fenotip celular.
Celulele ro#ii embrionare con"in tetrameri de hemoglobin! care sunt diferi"i de
formele adulte. Fiecare tetramer con"ine dou! catene asem!n!toare lan"urilor ! #i
dou! lan"uri identice cu ", fiecare dintre acestea fiind nrudite cu polipeptidul
caracteristic adultului fiind mai trziu nlocuit de acesta. Acesta este un exemplu de
control al dezvolt!rii, n care diferite gene sunt supuse procesului de switched on and
off (de schimbare a direc"iei/orient!rii) pentru a furniza produ#i alternativi care
ndeplinesc aceea#i func"ie n diferite etape de timp.
Detaliile asupra rela"iilor dintre hemogobinele adulte #i embrionare variaz! n
func"ie de organism. Etapele urmate la om constau n trei stadii: embrionar, fetal, #i
adult. Distinc"ia dintre embrionar #i adult este comun! la mamifere, dar num!rul de
stadii pre-adulte variaz!. La om catenele zeta #i alfa sunt cele dou! lan"uri
asem!n!toare cu ! (like !), #i beta sunt chiar lan"urile " obi#nuite. Catenele
exprimate n diferite stadii de dezvoltare sunt prezentate n tabel.
* (zeta) este prima caten! like-! exprimat!, dar este foarte repede nlocuit! de
c!tre adev!rata catena !. La nivelul c!i sintezei lan"urilor de tip ", sunt exprimate mai
nti catenele & (epsilon) #i ) (gama), fiind nlocuite cu + (delta) #i " (beta) mai trziu.
La adul"i, formele !2"2 constituie 97% din totalul structurii hemoglobinei, !2+2
aproximativ 2%, #i 1% este reprezentat de persisten"a formei de la fetus !2)2.
Divizarea lan"urilor globinei n lan"uri like-! #i like-" reflect! organizarea
genelor ntr-un singur cluster. Structurile celor dou! clustere prezente la primatele
superioare sunt prezentate n figura.
ntr-o regiune de peste 50 kb, clusterul " con"ine cinci gene diferite (&, dou! ),
+ #i ") #i o pseudogen! (",). Cele dou! gene ) difer! n secven"a codant! prin numai
doi aminoacizi; varianta G posed! o glicin! n pozi"ia 136 unde varianta A are o
alanin!.

Tabel. Hemoglobinele umane se modific! n cursul dezvolt!rii
Stadiu de dezvoltare Hemoglobine
Embrionar (< 8 s!pt!mni) *2&2, *2)2, !2&2
Fetal (3-9 luni) !2)2
Adult (dup! na#tere) !2+2, !2"2

Clusterul ! este mult mai compact #i include ntr-o regiune de peste 28 kb, o
gen! activ! * (zeta), o pseudogen! * (zeta), dou! gene !, dou! pseudogene !m #i o
gen! - (teta) a c!rei func"ie nu este cunoscut!. Cele dou! gene ! codific! pentru
93
aceea#i protein!. Dou! sau (mai multe) gene identice prezente pe acela#i cromozom
sunt considerate copii ne-alelice.
Genele func"ionale sunt definite prin expresia lor n ARN, #i pn! la urm! prin
proteinele pe care le codific!. Pseudogenele sunt denumite astfel datorit! incapacit!"ii
lor de a codifica proteine; motiva"ia inactivit!"ii variaz! iar deficien"ele pot fi la nivel
transcrip"ional sau transla"ional (sau la ambele). Cteodat! (din cnd n cnd) una
dintre gene nu poate fi plasat! n nici una din clase. De exemplu structura genei - a
fost descoperit! la unul dintre capete dup! ce s-a considerat c! structura clusterului !
era bine definit!. Nu a fost nici o problema ca aceasta s! fie clasificat! ca o
pseudogen!, atta timp ct nu a fost posibil! identificarea unui produs de reac"ie. De
asemenea rolul s!u r!mne neclar.
O organizare similar! a fost g!sit! pentru clusterele genelor globinei de la alte
vertebrate, dar detalii ca tipul, num!rul #i ordinea genelor pot varia. n pozi"ia n care
la o specie este localizat! o pseudogen! la alt! specie poate fi localizat! o gen! activ!;
de exemplu, pseudogena ". de la primatele superioare este localizat! ntr-o pozi"ie
echivalent! cu o gen! embrionar! activ! de la capr!.
Caracterizarea acestor clustere de gene marcheaz! un punct general foarte
important. Pot exista mai mul#i membri ai unei familii de gene att func#ionali ct "i
ne-func#ionali, pe care i putem suspecta pe baza analizelor proteinelor. Genele extra-
func"ionale pot reprezenta duplicate care codific! pentru polipeptide identice; sau ele
pot fi nrudite cu proteine cunoscute, cu toate c! sunt diferite de ele (#i care se
presupune c! sunt exprimate numai o perioad! scurt! de timp #i n cantit!"i mici).
$innd cont de toate aceste tr!s!turi, este greu s! fim siguri c! to"i membrii unui
cluster au fost identifica"i #i c! regiunile care flancheaz! clusterul reprezint! ultimii
membri ai acestuia.
Cu privire la ntrebarea ct de mult ADN este necesar pentru a codifica o
anumit! func"ie, constat!m c! pentru regiunea care codific! pentru catene like-" la
mamifere sunt necesare ntre 20-50 kb. Aceast! regiune este mult mai mare dect ne-
am fi a#teptat analiznd proteinele "-globine cunoscute sau lund n considerare
genele individuale. Regiunea clusterului ", pare s! codifice numai pentru "-globine,
dar cu ct sunt descoperite mai multe gene sau clustere de gene care codific! pentru
proteine particulare, cu att mai mult nu se va putea identifica rapid tipul de
aranjament caracteristic.
Crossing-overul inegal rearanjeaz$ clusterele de gene
Pentru rearanjarea unui cluster care con"ine gene identice sau nrudite exist!
diferite oportunit!"i. Chiar dac! clusterele codific! pentru aceea#i func"ie, #i toate
posed! aceea#i organizare general!, fiecare este diferit ca m!rime, exist! varia"ii ale
num!rului total #i a tipurilor de gene care codific! pentru "-globine, #i este diferit
num!rul #i structura pseudogenelor. Toate acest modific!ri au ap!rut de cnd a avut
loc marea radia"ie a mamiferelor, acum 58 milioane de ani n urm! (ultimul punct al
evolu"iei comun tuturor mamiferelor).
Compara"iile demonstreaz! c! procese generale cum sunt duplicarea genelor,
rearanjarea, #i varia"ia, reprezint! factori la fel de importan"i n evolu"ie ca #i
acumularea lent! a muta"iilor punctiforme n genele individuale. Ce tipuri de
mecanisme sunt responsabile de reorganizarea genelor ?
Un cluster de gene se poate m!ri sau contracta prin crossing-over inegal, cnd
recombinarea apare ntre gene ne-alelice. n mod normal, recombinarea implic!
secven"e corespunz!toare de ADN aliniate exact ntre doi cromozomi omologi.
Totu#i, cnd exist! dou! copii ale aceleia#i gene pe fiecare cromozom, o este posibil
94
ca o aliniere ocazional! s! permit! mperecherea acestora (Aceasta implica ca
regiunile adiacente r!mn nemperechiate).
Cnd evenimentul de recombinare apare ntre copii nepotrivite ale genelor, se
genereaz! cromozomi recombina"i ne-reciproci (nonreciprocal recombinant
chromosomes), unul dintre ace#tia avnd o duplicare a genei iar cel!lalt o dele"ie.
Primul recombinat are astfel o cre#tere a num!rului de copii ale genei de la 2 la 3, n
timp ce al doilea descre#te de la 2 la 1.
n acest exemplu, noi am considerat copiile genelor ne-echivalente 1 #i 2 ca
fiind n ntregime omologe. Totu#i, crossing-overul inegal poate s! apar! #i cnd
genele adiacente prezint! un grad ridicat de nrudire (de#i probabilitatea este mai mic!
dect n cazul genelor identice).
O problem! a crossing-overului inegal este reprezentat! de ntreruperea
structurii genelor. ntr-un caz ca al globinelor, exonii corespunz!tori copiilor genelor
adiacente se pare c! sunt destul de nrudite pentru a se mperechia; dar secven"ele
intronilor prezint! o divergen"! apreciabil!. Reducerea mperecherii numai la exoni
reduce considerabil continuitatea lungimii ADN care poate fi implicat. Aceasta
nseamn! c! exist! #anse mai mici s! se produc! un eveniment de crossing-over
inegal. Aceast! divergen"! a intronilor (dintre introni) poate determina (controla) o
stabilitate a clusterelor de gene prin mpiedicarea (poten"area) apari"iei crossing-
overului inegal.
Talasemiile sunt rezultatul muta"iilor care reduc sau mpiedic! sinteza
lan"urilor ! sau ". Inciden"a crossing-overului inegal la nivelul clusterelor genelor
globinei este eviden"iat! prin natura anumitor talasemii.
Multe din cele mai severe talasemii sunt rezultatul dele"iilor unei p!r"i a
clusterului. Cel pu"in n unele cazuri, capetele dele"iei sunt pozi"ionate n regiuni
omologe, dele"iile fiind exact a#a cum ne a#teptam generate prin crossing-over inegal.
n cazul !-talasemiilor au fost determinate dou! tipuri de dele"ii. Dele"ia !-
thal-1 elimin! ambele gene !. Numele se refer! la cromozomul individual care poart!
dele"ia. n func"ie de combina"ia diploid! a cromozomilor talasemici (purt!toare de
modific!ri care genereaz! talasemia), un individ afectat poate avea orice num!r de
lan"uri ! cuprins ntre zero #i trei. Indivizii cu dou! sau trei gene ! manifest! pu"ine
modific!ri (diferen"e) fa"! de tipul s!lbatec (patru gene !). n cazul celor cu o singur!
gen! ! se formeaz! tetramerul anormal "4, care determin! maladia HbH. Absen"a
complet! a genelor ! determin! apari"ia hydrops fetalis (hidropsie fetal!), care este
fatal! nainte de na#tere.
Dele#iile care pot cauza !-talasemii. Dele"iile !-thal-1 sunt lungi, variaz! ca
localizare la cap!tul stng, pozi"iile capetelor din dreapta fiind localizate ntre gene
cunoscute. Dele"iile !-thal 2 sunt scurte. n cazul formei L sunt eliminate 4,2 kb din
ADN, care includ gena !2. Acesta este probabil rezultatul unui crossing-over inegal,
deoarece capetele dele"iei sunt localizate n regiuni omologe, chiar la dreapta genelor
!. #i respectiv !2. Forma R rezult! prin ndep!rtarea a 3,7 kb din ADN, distan"a
exact! dintre genele !1 #i !2. Se pare c! aceasta este #i ea generat! prin crossing-over
inegal ntre genele !1 #i !2.
n acela#i crossing-over inegal n urma c!ruia sunt genera"i cromozomii
talasemici se ob"ine #i un cromozom care posed! trei gene !. Indivizi cu astfel de
cromozomi au fost identifici n numeroase popula"ii. n unele popula"ii, frecven"a
locusului ! triplu este aproape aceea#i ca a celor cu un singur locus !; n altele gena
tripl! ! este mult mai pu"in comun! dect gena single !. Aceasta sugereaz! factori
95
selectivi necunoscu"i opereaz! la nivelul diferitelor popula"ii #i ajusteaz! nivelul
genelor.
Varia"ii ale num!rului de gene ! s-au observat relativ frecvent, ceea ce
reprezint! un argument c! crossing-overul inegal la nivelul clusterului este destul de
comun. El apare mult mai frecvent n clusterul ! dect n cel ", probabil deoarece
intronii genelor ! sunt mult mai scur"i mpiedicnd mai pu"in mperecherea inexact!
dintre genele ne-omologe.
Dele#iile care provoac$ "-talasemii. n unele cazuri (rare), este afectat!
numai gena ". Aceasta prezint! o dele"ie de 600 pb, care se ntinde de la cel de al
doilea intron c!tre limita regiunii 3. n alte cazuri, sunt afectate mai multe gene.
Multe dintre dele"ii sunt foarte lungi extinzndu-se c!tre cap!tul 5 (pe hart! sunt
indicate ca dep!#ind 50kb spre dreapta).
Tipul Hb Lepore furnizeaz! informa"ia clasic! c! dele"iile pot rezulta n urma
crossing-overului dintre gene linkate (linked genes). Genele " #i + difer! numai prin
7% din secven"!. Prin recombinare inegal! se nl!tur! materialul genetic dintre ele,
astfel nct genele fuzioneaz!. Genele fuzionate produc un singur lan" proteic " care
con"ine la cap!tul N-terminal secven"a polipeptidei + unit! cu cea a polipeptidei " la
cap!tul C-terminal.
n prezent sunt cunoscute diferite tipuri de hemoglobine Lepore, diferen"a
dintre acestea constnd n pozi"ia punctului de tranzi"ie de la secven"a + la secven"a ".
Astfel, cnd genele ! #i " se mperechiaz! prin crossing-over inegal, punctul exact de
recombinare determin! pozi"ia la care se trece (switch) de la secven"a + la cea " la
nivelul lan"ului de aminoacizi.
Forma reciproc! a acestui eveniment a fost g!sit! n hemoglobina Hb anti-
Lepore, care este produs! de c!tre gena care are la cap!tul N-terminal o parte din gena
" #i la cap!tul C-terminal o parte din gena +. Fuziunea se produce ntre genele
normale + #i ".
Dovada c! un eveniment de crossing-over inegal poate avea loc #i ntre gene
mult mai ndep!rtate (ca structur!) a fost furnizat! prin identificarea Hb Kenya, o alt!
hemoglobin! fuzionat!. Aceasta con"ine secven"a N-terminal! a genei )/ #i secven"a
C-terminal! a genei ". Fuziunea trebuie s! fi rezultat n urma unui crossing over
inegal ntre )/ #i ", care au o diferen"! de secven"! de peste 20%.
O varietate de dele"ii care mpiedic! att sinteza catenelor + ct #i " determin!
formarea a dou! fenotipuri. n cazul HPFH (hereditary persistence of fetal
hemoglobin), n general nu exist! simptome clinice; boala este ameliorat! deoarece
sintezele hemoglobinelor fetale (!2)2) continu! #i dup! perioada de dezvoltare n care
n mod normal este dictat! ncheierea sa. n talasemia "+ exist! simptome de anemie,
deoarece de#i expresia genei ) continu! la adult, ea este mult mai slab! dect n cazul
HPFH. Diferen"a dintre HPFH #i talasemiile "+ depinde probabil de dele"ia unor
secven"e reglatoare prezente n interiorul clusterului, dar situate n afara structuri
genelor + #i ".

SLIDE 27. Arbore filogenetic stabilit prin analiza clusterului genelor
pentru beta-globine la diferite popula%ii
Clusterele de gene sufer$ reorganiz$ri continue
Pornind de la diferen"ele observate ntre clusterele genelor globinei de la
diferite mamifere, putem concluziona c! duplic!rile urmate (uneori) de varia"ie
reprezint! o tr!s!tur! important! a evolu"iei fiec!rui cluster. Dele"iile prezente n
96
talasemiile umane demonstreaz! c! procesul de crossing-overul inegal continu! s!
apar! pentru ambele clustere ale genelor globinei. Fiecare astfel eveniment de acest
gen genereaz!, n acela#i timp, duplicare #i dele"ie, fapt care trebuie luat n
considera"ie pentru ambele tipuri de loci din popula"ie. Dele"iile pot s! apar! #i (n
principiu) prin recombinare ntre secven"e omologe pozi"ionate pe acela#i cromozom.
Aceasta nu genereaz! o duplicare corespunz!toare.
Este dificil s! estim!m frecven"a natural! a acestor evenimente, deoarece
for"ele selective ajusteaz! rapid nivelele clusterelor variabile din popula"ie. Se poate
realiza o corela"ie grosier! ntre nivelul crossing-overului inegal #i genele nrudite, cu
ct acestea sunt mai nrudite (att la nivelul exonilor ct #i a intronilor), cu att este
mai mare #ansa de mperechere imperfect! (totu#i, unele evenimente de recombinare
inegal! nu implic! genele ns!#i, ci sunt determinate de secven"e apropiate de
acestea).
n general o reducere a num!rului genelor poate fi datorat! apari"iei unei
dele"ii nso"it! apoi de selec"ia acesteia. Totu#i, n unele popula"ii, poate s! existe un
echilibru avantajos care s! men"in! forma purt!toare de dele"ie la o frecven"! redus!.
Care este rezultatul unei astfel de expansiuni? Singurul exemplu care a fost
bine caracterizat este locusul !-triplu #i anti-Lepore. Indivizii care posed! 5 gene
pentru globin! (un locus normal #i un locus triplu) nu manifest! nici o modificare n
ceea ce prive#te sinteza hemoglobinei. Totu#i, este posibil ca o cre#tere viitoare (al
homozigotului triplu) poate s! determine modific!ri, prin dezechilibrarea sintezei
globinei c!tre producerea unui exces de lan"uri !. Indivizii cu anti-Lepore posed! o
gena de fuziune +" #i au #i una dintre genele normale " #i +. Este posibil ca prezen"a
unor lan"uri n plus s! interfere cu asamblarea normal! a hemoglobinei.
Nu este de dorit ca aceste modific!ri particulare ale num!rului de gene s! aib!
un avantaj selectiv care le-ar putea asigura r!spndirea n popula"ie. Dar structurile
actualelor clustere de la om posed! numeroase duplic!ri care atest! importan"a acestui
mecanism. Secven"ele func"ionale includ dou! gene ! care codific! pentru aceea#i
protein!, genele destul de bine nrudite " #i +m #i genele aproape identice ). Aceste
duplic!ri independente relativ recente au ap!rut n popula"ie f!r! a mai men"iona
duplic!rile mai ndep!rtate (mai vechi) care au generat diferitele tipuri de gene care
codific! pentru globine. Alte duplic!ri au dat na#tere pseudogenelor sau au fost
pierdute. Este de a#teptat ca duplic!rile continue #i dele"iile s! fie o tr!s!tur! a tuturor
clusterelor de gene.
Pornind de la organizarea genelor globinei la o varietate de specii, se poate
trasa evolu"ia actualelor gene care codific! pentru globine pornind de la o gen!
ancestral!
Dat! fiind nclina"ia (orientarea/proprietatea) intronilor de a se pierde n
timpul evolu"iei, gena leghemoglobinei de la plante, care este nrudit! cu genele
globinelor, poate fi prezentat! ca o form! str!veche. Aceasta are un intron n plus,
care mparte domeniul de legare al hemului n dou! p!r"i.
Ultima etap! n procesul evolu"iei genelor globinei, nainte de apari"ia genelor
actuale, este cea reprezentat! de secven"a monocatenar! a mioglobinei, care ncepe o
evolu"ie divergent! fa"! de linia globinei (diverge fa"! de) acum aproximativ 800
milioane de ani. Gena mioglobinei are aceea#i organizare ca #i genele globinei, deci
putem considera structura cu trei exoni ca reprezentnd structura str!mo#ului lor
comun, generat! ntr-o anumit! etap! dup! separarea de plante (dup! divergen"a de
plante).
Anumite forme de pe#ti primitivi au numai un singur tip de lan" pentru
globin!, deci ace#tia trebuie s! fi suferit o evolu"ie divergent! de la linia evolutiv!
97
nainte ca gena ancestral! a globinei s! fi suferit procesele de duplicare care au dat
na#tere variantelor ! #i ". Aceste fenomen pare s! fi avut loc acum aproximativ 500
milioane de ani n urm!, n timpul evolu"iei pe#tilor oso#i.
Urm!torul stadiu al evolu"iei este reprezentat de starea genelor globinei la
broasca X. laevis, care are dou! clustere pentru genele globinei. Totu#i, fiecare cluster
con"ine att genele ! ct #i ", att la formele adulte ct #i la formele larvare. Clusterul
trebuie s! fi evoluat a#adar prin duplicarea grupelor de gene linkate !-", proces urmat
de divergen"a copiilor individuale. Mai trziu ntregul cluster a fost duplicat.
Amfibienii s-au separat de linia mamifere/p!s!ri aproximativ acum 350
milioane de ani, deci separarea genelor ! #i " ale globinelor trebuie s! fie rezultatul
unei transpozi"ii la nivelul unui precursor al mamiferelor/p!s!rilor dup! etapa de
separare a amfibienilor. Acest fenomen a ap!rut probabil n perioada timpurie a
evolu"iei vertebralelor. Odat! ce s-au eviden"iat clustere separate ale genelor care
codific! pentru ! #i " globine att la p!s!ri ct #i la mamifere, genele ! #i " trebuie s!
se fi separat fizic nainte de divergen"a mamiferelor #i p!s!rilor din acest str!mo#
comun. Un astfel de eveniment este posibil s! se fi produs acum aproximativ 270
milioane de ani.
Modific!ri la nivelul clusterelor ! #i " globinelor au mai ap!rut destul de
recent, a#a cum vom vedea mai departe din descrierea divergen"ei genelor individuale.
Divergen"a secven"elor distinge dou! tipuri de situsuri la nivelul ADN
Majoritatea modific!rilor secven"ei proteice apar ca urmare a acumul!rii ncep
n timp de mici muta"ii. Muta"iile punctiforme (point mutation), inser"iile #i dele"ii
mici apar la ntmplare cu o probabilitate mai mare sau mai mic! n toate regiunile
genomului, cu excep"ia regiunilor fierbin"i (hotspots) n care muta"iile apar mult
mai frecvent. Majoritatea muta"iilor care schimb! un aminoacid n secven"a
polipeptidic! sunt v!t!m!toare (d!un!toare/deleterious) #i vor fi eliminate de c!tre
selec"ia natural!.
Pu"ine muta"ii pot fi avantajoase, dar acelea care se pot r!spndi n popula"ie,
nlocuind probabil secven"ele fondatoare/formatoare. Cnd o nou! variant! nlocuie#te
versiunea anterioar! a genei, se spune despre aceasta c! este fixat! n popula"ie.
Un problem! discutabil! este ce propor"ie din muta"iile care determin!
modificarea unui aminoacid sunt neutre, adic! f!r! nici un efect asupra func"ionalit!"ii
proteinei, #i sunt capabile s! se acumuleze ca rezultat al random drift and fixation
(mi#c!rii/evolu"iei ntmpl!toare #i fixa"iei).
Viteza (rata) cu care se acumuleaz! modific!rile determinate de muta"ii
(muta"ionale) este caracteristic! fiec!rui tip de protein!, #i se presupune c! depinde
cel pu"in n parte de flexibilitatea acesteia fa"! de modificare. n interiorul unei specii,
o protein! evolueaz! prin substitu"ii muta"ionale, urmate de eliminarea sau fixarea n
interiorul fondului de cre#tere individual. Prezen"a n popula"ie a dou! (sau mai multe)
variante alelice este numit! polimorfism. Polimorfismul poate fi stabil, n care caz
nici una din forme nu are nici un avantaj relativ, sau poate fi tranzitoriu, cazurile n
care o variant! este nlocuit! cu alta. Cnd analiz!m fondul de gene al unei specii
eviden"iem numai variantele care au supravie"uit.
Cnd o specie se separ! n alte dou! specii noi, fiecare entitate nou constituit!
are un fond independent pentru evolu"ie. Dac! compar!m proteinele corespunz!toare
de la dou! specii, vedem diferen"ele pe care acestea le-au acumulat ntre ele din
momentul n care str!mo"ii lor au ncetat s! se interpun!. Anumite proteine sunt nalt
conservate, f!r! sau cu mici diferen"e de la specie la specii. Aceasta indic! c! aproape
orice modificare este dezavantajoas! #i este eliminat! prin selec"ie.
98
Diferen"a dintre dou! proteine este exprimat! prin divergen"a lor, care
reprezint! procentul de aminoacizi diferi"i. Divergen"a dintre proteine poate fi diferit!
de cea dintre secven"ele corespunz!toare de acizi nucleici. Sursa acestor diferen"e este
dat! de faptul c! fiecare aminoacid este codificat de un codon compus din trei baze, n
care modificarea celei de a treia baz! nu are neap!rat efect asupra citirii mesajului.
Secven"a nucleotidic! a unei regiuni codante poate fi mp!r"it! n replacement
sites (situsuri de substitu"ie) #i silent sites (situsuri mute/silen"ioase): i) la nivelul
replacement sites, o muta"ie modific! aminoacidul care este codificat. Efectul
muta"iei (deteriorat, neutru, avantajos) depinde de rezultatul nlocuirii aminoacidului;
ii) la nivelul silent sites, muta"iile determin! nlocuirea unui codon sinonim cu altul,
deci n acest caz nu este vorba de o modificare a proteinei. De obicei situsurile n care
se realizeaz! substitu"ia constituie aproximativ 75% din secven"a codant! #i cele
silen"ioase numai 25%.
Pe lng! secven"a codant! o gen! con"ine #i regiuni ne-traduse. La acest nivel
muta"iile pot de asemenea s! fie poten"ial neutre, n afar! de cele care afecteaz!
structura secundar! sau secven"a semnal reglatoare. De#i muta"iile silen"ioase sunt
neutre n ceea ce prive#te proteina, ele pot afecta expresia genei datorit! modific!rii
secven"ei ARN. De exemplu, modificarea structurii secundare poate influen"a
transcrip"ia, procesarea sau transla"ia. O alt! posibilitate este c! modificarea ntr-un
codon sinonim necesit! un alt ARNt necesar pentru traducere, acest fapt putnd
influen"a eficien"a transla"iei.
Muta"iile la nivelul situsurilor de substitu"ie pot s! corespund! cu divergen"a
aminoacizilor, care n esen"! reprezint! procentajul de modific!ri. O divergen"! a
secven"elor de acizi nucleici de 0,45% la nivelul situsurilor de substitu"ie corespunde
unei divergen"e n aminoacizi de 1% (lund n considerare c! media num!rului
situsuri de substitu"ie pentru un codon este 2,25). n realitate divergen"a m!surat!
supraestimeaz! diferen"ele care au ap!rut n timpul evolu"iei, datorit! frecven"ei
evenimentelor la nivelul unui codon. De obicei aceste estim!ri sunt supuse unei
corec"ii.
De exemplu, lan"urile globinelor " #i + de la om, prezint! 10 diferen"e n 146
de resturi, divergen"a fiind de 6,9% la nivelul proteinei. Secven"a de ADN are 31 de
modific!ri n 441 resturi nucleotidice. Totu#i, aceste modific!ri sunt distribuite foarte
diferit la nivelul situsurilor de substitu"ie #i a celor silen"ioase. Astfel, exist! 11
modific!ri pentru 330 situsuri de substitu"ie, #i 20 de modific!ri n 111 situsuri
silen"ioase. Ratele de divergen"! corecte sunt de 3,7% pentru situsurile de substitu"ie
#i de 32% pentru situsurile silen"ioase, ceea ce reprezint! deja un ordin de diferen"!.
Aceast! impresionant! diferen"! n divergen"a constatat! pentru situsurile de
substitu"ie #i cea pentru situsurile silen"ioase demonstreaz! existen"a unor
constrngeri mult mai mari la nivelul pozi"iilor nucleotidelor care influen"eaz!
constitu"ia proteinei relativ la cele nu o influen"eaz!. Astfel, probabil foarte pu"ine
modific!ri ale aminoacizilor sunt neutre.
Ceasul evolutiv traseaz$ dezvoltarea genelor globinei
Cnd o anumit! protein! este analizat! la o serie de specii, divergen"a dintre
secven"ele fiec!rei perechi comparate este (mai mult sau mai pu"in) propor"ional! cu
perioada de timp de cnd acestea sunt separate. Aceasta furnizeaz! un ceas evolutiv
care m!soar! acumularea muta"iilor la o rat! aparent egal! n timpul evolu"iei unei
proteine date. Rata divergen"ei poate fi m!surat! ca procentul de diferen"! per milion
de ani, sau prin reciproca sa, unitatea de perioad! evolutiv! (UEP), timpul n milioane
de ani care este necesar pentru apari"ia unui procent de divergen"! de 1%. Odat!
stabilit ceasul evolutiv prin compara"ii ntre perechi de specii (s! ne amintim
99
dificult!"ile practice de stabilire a timpului actual de specia"ie), el poate fi aplicat
genelor nrudite de la aceea#i specie. Din divergen"a lor putem calcula timpul scurs de
la evenimentul de duplicare care le-a generat.
Prin compararea secven"elor genelor omologe, se poate determina rata de
divergen"! att a situsurilor de substitu"ie ct #i a celor silen"ioase.
Pe baza compar!rii diferitelor perechi de gene (de la dou! specii), s-a constat
existen"a unei divergen"e medii de 10% la nivelul situsurilor de substitu"ie fie pentru
genele ! sau "-globinei de la mamifere care au fost separate nainte de marea radia"ie
a mamiferelor acum aproximativ 85 de milioane ani. Aceasta corespunde unei rate a
divergen"ei de substitu"ie de 0,12% per milion de ani.
Rata este constant! cnd compara"ia este extins! la gene a c!ror divergen"!
este mult mai veche (mai ndep!rtat! n timp). De exemplu, media divergentei de
substitu"ie dintre genele globinelor corespunz!toare de la mamifere #i p!s!ri (pui) este
de 20%. Raportat la separarea care s-a produs acum aproximativ 270 milioane de ani,
se ajunge la o rat! de 0,09 per milion de ani.
ntorcndu-ne n timp putem compara genele ! #i " globinelor n interiorul
speciilor. Acestea au suferit proces de divergen"! de cnd s-au separat tipurile de gene
acum aprox 500 milioane de ani. Ele au o divergen"! medie de substitu"ie '50%, care
determin! o rat! de 0,1% per milion de ani. Aceste date arat! c! divergen"a de
substitu"ie n genele globinei prezint! o rat! medie de 0,096% per milion de ani (sau o
UEP din 10,4). Lund n considerare incertitudinile care pot s! apar! n estimarea
timpului la care s-a produs divergen"a speciilor, rezultatele constituie un suport bun
pentru ideea existen"ei unui ceas linear.
Datele privind divergen"a la nivelul situsurilor silen"ioase sunt mai pu"in clare.
n fiecare caz, este evident c! situsurile silen"ioase au o divergen"! mai mare dect cea
a situsurilor de substitu"ie (variaz! dup! un factor 2 la 10). Deoarece divergen"a la
nivelul situsurilor silen"ioase este prea mare n cazul compara"iilor perechi
consideram c! nu poate fi aplicat un ceas evolutiv acestor situsuri (trebuie s! ne
baz!m numai pe situsurile de substitu"ie)
Rata divergen"ei situsurilor silen"ioase nu este linear! n timp. Dac!
consider!m c! divergen"a trebuie s! fie zero la zero ani de separare, constat!m c! rata
de divergen"! pentru situsurile silen"ioase este mai mare n primele 100 de milioane
de ani de la separare. O interpretare este c! o frac"ie considerat!, grosier ca
reprezentnd jum!tate din situsurile silen"ioase este rapid (n aproximativ 100
milioane ani) saturat! n muta"ii; aceast! frac"ie se transform! n situsuri neutre.
Cealalt! frac"iune acumuleaz! muta"ii mult mai ncet, la o rat! de aproximativ egal!
cu cea caracteristic! situsurilor de substitu"ie; aceast! frac"ie se identific! situsurile
care sunt silen"ioase n ceea ce prive#te proteina, dar care sunt supuse presiunii
selective din alte motive.
Dac! invers!m modul de calcul aplicat pentru rata de divergen"! putem estima
timpul de separare a genelor ntr-o specie (de cnd s-au separat anumite gene n
cadrul unei specii). Diferen"a ntre genele umane ! #i " este de 3,7% pentru situsurile
de substitu"ie. Unei UEP (Unit Evolutionary Period ) de 10,4, aceste gene trebuie s!
se fi separat (suferit divergen"!) 10,4 x 3,7 #40 milioane de ani nainte de separarea
liniilor care au condus la formarea maimu"elor Lumii Noi (New World monkeys),
maimu"elor Lumii Vechi (Old World monkeys), primatele mari #i omul. Toate aceste
primate mari au ambele tipuri de gene " #i +, ceea ce sugereaz! c! divergen"a acestor
gene a nceput imediat dup! acest punct evolutiv.
Dac! analiz!m genele ) #i & constat!m c! divergen"a dintre situsurile de
substitu"ie ale acestora este de 10% #i corespunde unui timp de separare de '100
100
milioane de ani. Separarea dintre genele globinei embrionare #i fetale trebuie s! fi
precedat sau s! fi nso"it radia"ia mamiferelor.
Arbore al evolu#iei genelor umane ale globinei. Caracteristici (tr!s!turi)
care s-au dezvoltat nainte de radia"ia mamiferelor, cum este separarea formelor "/+
de ), trebuie s! fie prezente la toate mamiferele. Caracteristicile care au evoluat dup!,
cum este separarea genelor ! #i " ale globinei, vor fi reg!site n linii individuale ale
mamiferelor. Se consider! c! n fiecare specie au avut loc modific!ri recente n
structura clusterelor, atta timp ct constat!m diferen"e n num!rul genelor (o singur!
gen! " la omul adult #i dou! la #oarece) sau n tipul acestora (nu exist! nc!
certitudinea existen"ei unei separ!ri a genelor embrionare sau "-like n cazul
globinelor de iepure #i #oarece). Este clar c! evolu"ia cercet!rilor va furniza date
suficiente asupra secven"elor unor gene particulare, #i atunci exist! mari #anse ca
aceste argumente s! fie contrazise sau confirmate. Un lucru este totu#i sigur:
compara"iile dintre gene de la diferite specii pot fi folosite pentru trasarea corela"iilor
taxonomice dintre specii pe baze moleculare.
Pseudogenele sunt capete moarte ale evolu#iei
Pseudogenele sunt definite prin faptul c! posed! secven"e nrudite cu cele ale
genelor func"ionale, dar care nu pot fi traduse ntr-o protein! func"ional!. O
pseudogen! este adesea notat! cu simbolul ..
Unele pseudogene posed! aceea#i structur! general! ca #i genele func"ionale,
cu secven"e care corespund exonilor #i intronilor din pozi"iile normale. Acestea au
devenit inactive prin muta"ii care pot afecta unul sau mai multe etape ale expresiei
genelor. Modific!rile pot fi semnale de desfiin"are (ntrerupere) a ini"ierii transcrip"iei,
mpiedicarea splicingului la nivelul jonc"iunilor exon-intron, sau terminarea
prematur! a transla"iei.
n mod normal o pseudogen! are numeroase muta"ii care provoac! modific!ri,
deoarece odat! ce gena a ncetat s! mai fie activ!, nu exist! nici un impediment ca ea
s! acumuleze n continuare muta"ii. Pseudogene care reprezint! versiuni ale genelor
active curent au fost eviden"iate n multe sisteme, incluznd globinele,
imunoglobulinele, antigenele de histocompatibilitate, unde acestea sunt localizate n
vecin!tatea clusterului genelor active sau chiar n interiorul acestuia intercalate ntre
gene.
Un exemplu tipic este pseudogena de la iepure, !"2, care are o organizare
obi#nuit! n exoni #i introni, #i este pozi"ionat! foarte aproape de gena "1 a globinei.
Eliminarea (dele"ia) unui perechi de baze la nivelul codonului 20 a ".2 determin! o
modificare de faz! care duce la terminarea fazei deschise de lectur! imediat dup!
aceast! pozi"ie (codon stop). n secven"! exist! #i alte numeroase muta"ii care
determin! modificarea altor codoni care semnific! aminoacizi bine conserva"i n
structura "-globinelor. De asemenea, nici unul dintre introni nu mai posed! capetele
de recunoa#tere a separ!rii lor de exoni, astfel nct este posibil ca intronii s! nu mai
poat! fi elibera"i chiar dac! gena ar fi transcris!. Totu#i, nu au fost eviden"ia"i
transcrip"i corespunz!tori genei, probabil deoarece exist! modific!ri #i la nivelul
regiunii 5 care flancheaz! secven"a codant!.
Cnd exist! o astfel de list! de muta"ii care mpiedic! poten"ial fiecare stadiu
al expresiei genei, nu exist! modalit!"i prin care s! putem detecta evenimentul
original care a determinat inactivarea acestei gene. Totu#i, prin divergen"a dintre o
pseudogen! #i o gen! func"ional!, putem estima cnd a ap!rut pseudogena #i cnd au
nceput s! se acumuleze muta"iile la nivelul s!u.
101
Dac! pseudogena a devenit inactiv! destul de repede dup! generarea sa prin
duplicare din forma "1, ne putem a#tepta la o rat! crescut! de divergen"! (probabil
aceea#i) att pentru situsurile de substitu"ie ct #i pentru cele silen"ioase (Nu mai este
nici o motiva"ie ca acestea s! difere dac! gena nu mai este tradus!). n acest caz sunt
mai pu"ine substitu"ii/muta"ii n situsurile de substitu"ie dect n cele silen"ioase.
Aceasta sugereaz! c! n primul rnd (n timpul n care gena era exprimat!) a existat o
selec"ie a muta"iilor la nivelul situsurilor de substitu"ie. Din dispunerea/extinderea
relativ! a modific!rilor/muta"iilor/substitu"iilor la nivelul celor dou! situsuri, putem
calcula c! pseudogena !"2 s-a separat (a suferit divergen"!) de gena "1 acum '55
milioane de ani, fiind o gen! func"ional! timp de '22 milioane de ani #i devenind
pseudogen! de cel pu"in 33 milioane de ani.
Calcule similare pot fi f!cute #i pentru alte pseudogene. Unele par s! fi fost
active un timp nainte de a deveni pseudogene, dar altele se pare c! au fost inactivate
destul de repede dup! generarea lor ini"ial!. Punctul general de vedere ob"inut cu
ajutorul structurilor acestor pseudogene este c! fiecare a evoluat independent n
timpul dezvolt!rii clusterului genelor globinei la fiecare specie. Aceasta nt!re#te
concluzia c! crearea de noi gene, urmat! de acceptarea lor ca duplicate func"ionale, cu
varia"ii ntre apari"ia unei noi gene func"ionale, sau inactivarea acestora ca
pseudogene, este un proces continuu ntr-un cluster de gene.
Pseudogena $"3 a genei globinei are o proprietate interesant!: i lipsesc ambii
introni. Aceast! secven"! poate fi mperechiat! cu ARNm pentru !-globin! ("innd
cont de muta"iile acumulate/avnd n vedere). Timpul aparent de inactivare coincide
cu duplicarea original!, ceea ce sugereaz! c! evenimentul de inactivare a fost asociat
cu pierderea intronilor. Cum au fost pierdu"i intronii? Nu exist! nici o motiva"ie ca
sistemele de reconstituire a ADN s! recunoasc! grani"ele exon-intron, acest fapt fiind
un argument important pentru acceptarea idei implic!rii ARNm n procesul de
duplicare. Este probabil ca transcriptul invers al ARNm s! fi fost inserat n genom,
probabil n urma ac"iunii unui retrovirus.
Secven"ele genomice care se aseam!n! unor molecule de transcript ARN sunt
numite pseudogene procesate/prelucrate (processed pseudogenes). Pornind de la ideea
c! acestea au luat na#tere prin inserarea unui produs derivat din ARN, la nivelul unui
situs ntmpl!tor, ele pot fi localizate n orice regiune a genomului, #i nu neap!rat pe
acela#i cromozom ca gena activ!.
Ce tr!s!turi sunt comune pseudogenelor? Majoritatea familiilor de gene
posed! membrii care sunt pseudogene. De obicei pseudogenele reprezint! o
minoritate redus! din num!rul total al genelor. ntr-un caz excep"ional, totu#i, exist! o
singur! gen! activ! care codific! pentru o protein! ribozomal! la #oarece #i exist! '15
pseudogene procesate relative. O astfel de situa"ie trebuie luat! n considerare cnd se
ncearc! calcularea num!rului de gene folosind rezultatele hibridiz!rii acestora.
Dac! pseudogenele sunt capete moarte din punct de vedere evolutiv, fiind
simple secven"e ne-dorite care nso"esc genele func"ionale, de ce sunt ele nc!
prezente n genom? ndeplinesc ele vreo func"ie sau nu au nici un scop, n acest caz de
ce nu sunt supuse presiunii selective pentru a fi ndep!rtate?
Trebuie s! ne reamintim c! noi putem detecta genele care au rezistat (sunt nc!
prezente) n popula"iile actuale. Este posibil, ca n trecut un anumit num!r de
pseudogene s! fi fost eliminat. Aceast! eliminare poate ap!rea prin eliminarea
secven"ei sub forma unui eveniment nea#teptat sau prin localizarea de muta"i la unu
asemenea nivel nct gena s! nu mai poat! fi recunoscut! ca o secven"! membr! a
familiei originale (este probabil soarta final! a oric!rei pseudogene care nu este
eliminat! pe nea#teptate).
102
Este posibil ca relicve ale evolu"iei s! fie duplicate. n cazul genelor pentru "
globin! de la capr!, exist! dou! specii adulte "A #i "C. Fiecare dintre acestea are o
pseudogen! de cteva kilobaze n amonte (numite ".Z #i ".X). Cele dou!
pseudogene sunt mai bine nrudite una cu cealalt! dect cu oricare dintre cele dou!
gene " de la adult; n particular, ele manifest! multe muta"ii care le inactiveaz!. De
asemenea, cele dou! gene pentru "-globin! de la adult sunt mult mai bine nrudite una
cu alta dect cu pseudogenele. Aceasta implic! c! structura original! !"-! a fost
duplicat!, dnd dou! gene func"ionale (care mai departe au suferit o evolu"ie
divergent! ducnd la "A #i "C) #i la dou! gene ne-func"ionale (care au suferit o
evolu"ie divergent! c!tre pseudogenele actuale).
Mecanismele responsabile pentru duplicarea genelor, dele#ie, "i evenimente
de rearanjare/redistribuire ac#ioneaz! asupra tuturor secven#elor care sunt
recunoscute ca membrii ai unui cluster, n condi#iile n care ace"tia sunt sau nu
func#ionali. Este dificil ca selec"ia s! poat! discrimina ntre produ#i.

SLIDE 28. Concluzii (1)
Genoamele procariotelor #i eucariotelor inferioare con"in pu"ine secven"e
nefunc"ionale, n timp ce ale vertebratelor con"in multe secven"e care nu codific!
pentru ARN sau care nu au nici o func"ie structural! sau func"ional!. Numai 5% din
ADN genomic uman codific! pentru proteine sau ARN func"ional;
Lipsa unei rela"ii consistente ntre cantitatea de ADN din genomul haploid de
la animale #i plante #i complexitatea sa filogenetic! este denumit! paradoxul valorii
C;
Aproximativ jum!tate din genele care codific! pentru proteine n genomul
vertebratelor sunt gene solitare, a c!ror secven"! este prezent! numai o dat! n
genomul haploid. Restul sunt gene duplicate, care au ap!rut prin duplicarea unei gene
ancestrale urmat! de muta"ii ulterioare independente;
Genele duplicate cum sunt cele care codific! pentru familia genelor "-
globinei, codific! proteine nrudite #i n general apar sub forma unui cluster ntr-o
anumit! regiune a ADN. Proteinele codificate de o familie de gene au o secven"! de
aminoacizi omolog! dar nu identic! #i exprim! propriet!"i similare pu"in diferite;

SLIDE 29. Concluzii (2)
La nevertebrate ct #i la vertebrate moleculele de ARNr, ARNt #i histone sunt
codificate de copii multiple ale genelor care sunt localizate n anumite regiuni ale
ADN genomic
Copiile singulare de ADN constau n gene solitare care codific! pentru
proteine, familii de gene slab duplicate #i secven"e ADN spacer;
Secven"ele moderat repetitive includ genele repetitive n tandem care codific!
pentru ARNr, ARNt #i histone; familii mari de gene duplicate #i elemente de ADN
mobile;
Secven"ele de ADN simple, care constau n secvente scurte #i nalt-repetitive
n regiuni extinse n tandem, sunt preferen"ial localizate la nivelul centromerilor,
telomerilor sau prezint! localiz!ri specifice pe bra"ele anumitor cromozomi;
Lungimea regiunii tandem a anumitor secven"e simple este destul de variabil!
ntre indivizii unei specii, probabil datorit! crossing-overul inegal care apare n
meioz!. Diferen"ele de lungime ale acestor secven"e simple n tandem stau la baza
fingerprinting-ului ADN.

103
SLIDE 30. ADN mobil
Secven#ele ADN moderat-repetitive "i mobile sunt distribuite de-a lungul genomelor
procariote, plante superioare "i animale.
Sunt formate din grupuri de sute la mii perechi de baze
Secven#ele sunt copiate "i inserate n pozi#ii noi prin procesul de transpozi#ie
Par s! fie secven#e nefolositoare
Secven"ele de ADN mobile care sunt pres!rate n genomul plantelor #i
animalelor variind de la cteva sute la cteva mii de pb au fost pentru prima dat!
descoperite la eucariote dar se g!sesc #i la procariote. Procesul prin care aceste
secven"e sunt copiate #i inserate ntr-un nou situs n genom se numeste transpozi"ie.
Elementele mobile ADN sau elementele mobile simple sunt n esen"! molecule
parazite, care par s! nu aib! func"ii specifice n func"ionalitatea gazdelor lor, dar
exist! numai pentru a se automen"ine. Francis Crick le-a numit secven"e selfish.
Transpozi"ia elementelor ADN se crede c! se datoreaz! unei acumul!ri
progresive (ncete) n genoamele eucariote n timpul unei perioade evolutive. Aceste
elemente pot fi #i pierdute cu o vitez! foarte sc!zut! prin procesul de dele"ie ale
segmentelor de ADN care le con"in dar #i prin acumularea muta"iilor pn! cnd aceste
nu mai sunt recunoscute ca fiind nrudite cu elementul mobil original ADN. Deoarece
elementele mobile sunt eliminate din genoamele eucariote destul de ncet, acestea
sunt acumulate pn! la punctul n care ele constituie a propor"ie semnificativ! a
genoamelor multor eucariote.

SLIDE 31. Dou$ clase de elemente mobile
Figura: a) inser#ia secven#elor "i transpozomilor prin intermediarul ADN
b) Retrotranspozomii sunt mai nti transcri"i ntr-o molecul! de ARN, care apoi este
revers-transcris! n ADN dublu-catenar. n ambele cazurim intermediarii dublu
catenari sunt integra#i la nivelul secven#ei #int! ADN.
Deplasarea elementelor mobile implic$ ADN sau ARN ca intermediari.
Primul element mobil a fost descoperit de Barbara McClintock la porumb n
1940. Ea a caracterizat aceste entit!"i ca fiind capabile s! intre #i s! ias! din gene,
modificnd fenotipul plantelor. Teoria sa a fost foarte controversat! pn! cnd
elementele mobile au fost descoperite la bacterii, unde au fost caracterizate ca
secven"e specifice de ADN, #i bazele moleculare ale transpozi"iei lor au fost
descifrate. Cnd aceste elemente au fost descoperite, nu au fost corelate cu secven"ele
moderat repetitive, care au fost anterior identificate n experimentele de reasociere.
Astfel studiul elementelor mobile la eucariote a condus la detectarea elementelor
mobile ADN la bacterii cu toate c! aparent nu existau conexiuni. O dat! cu evolu"ia
cercet!rilor elementele mobile au fost mp!r"ite de dou! categorii: 1) cele care sunt
transpozate direct ca ADN; 2) cele care sunt transpozate prin intermediul ARN
transcris de pe structura elementului mobil de c!tre o ARN polimeraz! #i apoi
transformat n ADN dublu catenar de c!tre o revers-transcriptaz!.
Elementele mobile care transpozeaz! prin intermediul unui ADN sunt
denumite transpozomi. Cele care transpozeaz! la nivelul unor noi situsuri printr-un
intermediar ARN sunt numi"i retrotranspozomi deoarece deplasarea lor este analog!
cu procesul de infec"ie al retovirusurilor. Intradev!r, retrovirusurile pot fi considerate
ca retrotranspozomi care implic! gene care codific! anvelopa viral! #i care permit
acestora s! transpozeze ntre celule. Att transpozomii ct #i retrotranspozomii pot fi
clasifica"i n func"ie de mecanismul lor specific de transpozi"ie

104
SLIDE 32. Elementele mobile sunt secven%e ADN sau ARN
La bacterii majoritatea elementelor mobile sunt transpozate direct ca ADN.
Din contr!, majoritatea elementelor mobile de la eucariote sunt retrotranspozomi dar
au fost identifica"i #i transpozomi (ex cei ini"ial descoperi"i).

SLIDE 33. Structura general$ a elementelor bacteriene IS
Prezen"a elementelor mobile la bacterii a fost pentru prima dat! eviden"iat! la
E. coli cnd au fost eviden"iate muta"ii ca urmare a inser!rii spontane a unei secven"e
de aprox 1-2 kb, n mijlocul unei gene. Astfel de elemente se numesc elemente IS
(insertion sequences). Au fost vizualizate prima dat! prin analiza microscopic! a
hibrizilor (heteroduplexurilor) formate dintre tipul s!lbatic #i cel mutant. Deoarece
elementul IS integrat ntr-o caten! mutant! nu g!se#te complement pe catena
s!lbatic!, formnd o bucl! monocatenar! extins! care se eviden"iaz! relativ u#or la
nivelul heteroduplexului. Astfel, la E. coli au fost eviden"iate peste 20 de elemente IS
diferite. Cu toate acestea transpozi"iile elementelor IS este un eveniment foarte rar,
care apare numai la 10
5
-10
7
celule/per genera"ie. Rate mai mari de transpozi"ie vor
m!ri ratele de muta"ii ale celulelor bacteriene. Cu rate foarte sc!zute de transpozi"ie,
majoritatea celulelor gazd! supravie"uiesc #i astfel propag! elementul parazit IS. La
transpozi"ia elementului IS la nivelul unor situsuri aleatoare anumite secven"e
transpozate se plaseaz! n regiuni neesen"iale ale genomului (ex. regiunile dintre
gene), crescnd numai num!rul de elemente IS din celul!. Elementele IS se pot insera
#i n plasmide sau virusuri lizogene cnd sunt transferate n alte celule. Cnd se
ntmpl! acest lucru, elementele IS vor fi transpozate n celule virgine.
Figura reprezint! structura general! a elementelor IS. Repeti#iile inversate, de
aproximativ 50 pb sunt invariabil prezente la capetele IS #i au secven"e caracteristice
fiec!rui tip de element. ntre repeti#iile inversate exist! o regiune codant! pentru
proteine care codific! una sau dou! enzime necesare transpozi"iei elementului ntr-un
nou situs.
Un important semn distinctiv al al elementelor IS o reprezint! prezen"a
repeti#iilor directe scurte, care con"in 5-11 pb, imediat adiacente ambelor capete ale
elementului inserat. Lungimea repeti#iei directe este caracteristic! fiec!rui element IS,
dar secven"a sa depinde de situl secven"ei "int! la nivelul c!reia elementul IS este
inserat. Cnd secven"a unei gene mutante care con"ine un element IS este comparat!
cu secven"a s!lbatec! dinainte de transpozare, se eviden"iaz! numai o singur$ copie
a secven#ei repetitive directe n gena s!lbatic!. Duplicarea acesteia pentru a da
na#tere unei noi secven"e repetitive adiacente elementului IS apare n timpul
procesului de inserare.

SLIDE 34. Structura general$ a transpozomilor bacterieni
Enzima care caracterizeaz! transpozi"ia unui element IS este numit!
transpozaz!. n cel mai simplu mecanism de transpozi"ie, un element IS este este
excizat dintr-o anumit! localizare #i este inserat ntr-o nou! pozi"ie n cromozomul
bacterian printr-un proces nereplicativ.
n acest mecanism, moleculele transpozabile leag! secven"ele repetitive
inversate prezente la fiecare cap!t al elementului IS din ADN donor #i l cliveaz! cu
precizie (la un situs precis). Moleculele de transpozaz! se leag! #i ele #i fac t!ieturi
decalate ntr-o secven"! scurt! din ADN "int! genernd capete monocatenare. Aceast!
enzim! remarcabil! leag! apoi capetele terminale 3 ale secven"ei "int!, umplnd
bre#ele monocatenare #i genernd o secven"! repetitiv! scurt! chiar la capetele
105
elementului IS nou inserat. Aceasta este originea repeti"iilor directe scurte care
flancheaz! elementele IS. Anumite elemente IS transpozeaz! printr-un mecanism
replicativ mult mai complicat; n acest caz o copie a elementului IS original este
generat! n secven"a "int! n timp ce copia original! este re"inut! n secven"a donoare
ADN.
Transpozomii bacterieni. Pe lng! elementele IS, bacteriile con"in elemente
genetice mobile compuse care sunt mai mari dect elementele IS #i con"in una sau
mai multe gene care codific! pentru proteine, altele dect cele necesare pentru
transpozi"ie. Denumite transpozomi bacterieni, aceste elemente sunt compuse din
gene de rezisten"! la antibiotice flancate de dou! copii ale aceluia#i element IS.
Inserarea unui transpozom ntr-o plasmid! sau n ADN cromozomial este u#or
detectabil! datorit! achizi"ion!rii rezisten"ei la un anumit antibiotic. Transpozi"ia
produce o repeti"ie direct! scurt! a secven"ei "int! de fiecare parte a transpozomului
nou integrat, ca #i pentru elementele IS.
Transpozomii sunt unelte importante pentru genetica bacterian!. Acestea pot fi
introduse n plasmidele celulare sau n genoamele virale. O dat! transfera"i ntr-o
celul!, transpozomii ac"ioneaz! ca mutageni care afecteaz! numai o singur! gen!
celular!. Deoarece transpozi"ia este un eveniment rar, celulele mutante sunt izolate
datorit!, mai ales, rezisten"ei la antibiotice pe care o achizi"ioneaz!. Situsul unei
transpozi"ii poate fi determinat prin cartare de restric"ie care eviden"iaz! inser"ia mai
ales n cazul transpozomilor mari ADN. Secven"a precis! a ADN bacterian la nivelul
situsului de inser"ie poate fi determinat! prin secven"iere, folosind un primer
complementar cu secven"a cunoscut! a repeti"iilor inversate de la cap!tul
transpozomilor.

SLIDE 35. Model pentru transpozitia IS
Etape: 1) Transpozaza, care este codificata de elementul IS (IS10 in acest
exemplu), taie ambele catene ale ADN donor n imediata proximitate a repeti"iilor
inversate (rosu nchis), exciznd elementul IS10. Transpozaza taie la nivelul unui situs
ADN "int! ales aleator. n cazul IS10, cele dou! t!ieturi sunt la o distan"! de 9 bp. 2)
Ligarea capetelor 3 ale elementelor IS la capetele t!iate ale secventei "int! este de
asemenea catalizat! de c!tre transpozaz!; 3) Cele 9-bp ale t!ieturii monocatenare
ADN, r!mase n structura intermediar! format!, sunt umplute de c!tre ADN
polimeraza celular!; n final o ADN ligaz! formeaz! leg!turi 3-5 fosfodiester ntre
capetele 3 ale secventei ADN "int! extinse #i capetele 5 ale elementului IS10. Acest
proces are ca rezultat duplicarea secven"ei "int! la fiecare dintre capetele elementului
IS inserat. De retinut ca elemental IS nu este figurat la scal!. [See H. W. Benjamin
and N. Kleckner, 1989, Cell 59:373, and 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4648.]

SLIDE 36. Retrotranspozomii virali con%in secven%e LTR &i se
comport$ n genom asemeni retrovirusurilor
Transpozomii de la eucariote.
Barbara McClintock care a descoperit prima elementele mobile a f!cut
observa"ia c! anumite muta"ii spontane care afecteaz! producerea unora dintre
enzimele necesare form!rii antocianiunei, un pigment purpuriu. O clas! din aceste
muta"ii este reversibil! cu o frecven"! destul de mare n timp ce a doua clas! nu sufer!
reversii numai dac! ele apar n prezen"a primei clase de muata"ii. McClintock a numit
agentul responsabil de prima clas! de muta"ii element activator (Ac) #i l-a considerat
responsabil de elementele celei de a doua clase elemente disociative (de disociere)
(Ds) deoarece aceste tind #i ele s! se asocieze cu ruperile (scind!rile) cromozomale.
106
La mul"i ani dup! aceast! descoperire, clonarea #i secven"ierea au eviden"iat
c! elementele Ds sunt deletate de c!tre elementul AC c!ruia i lipse#te o regiune a
secven"ei care codific! pentru transpozaz!. Totu#i, la plantele care posed! elementul
Ac #i care posed! o tranpozaz! func"ional!, elementele Ds nu se pot deplasa singure.
Structura acestor elemente eucariote este similar! cu elementele IS de la bacterii #i par
s! se deplaseze printr-un mecanism nereplicativ. O serie de elemente mobile au fost
descoperite #i la alte eucariote. De exemplu, aproximativ jum!tate din muta"iile
spontane observate la Drosophila sunt datorate inser"iei elementelor mobile. Totu#i
majoritatea elementelor mobile de la Drosophila func"ioneaz! ca retrotranspozomi.
Cel pu"in unul-elementul P fuc"ioneaz! ca un transpozom, deplasndu-se printr-un
mecanism nereplicativ similar cu cel folosit de secven"ele de inser"ie de la bacterii.
Metodele curente de contruire a drosophilelor transgenice depind de utilizarea
expresiei crescute a elementului P #i folosirea "intelor repetitive terminale pentru
transpozi"ie.
Retrotranspozomii virali con#in LTR "i se comport$ ca retrovirusurile n genom
Toate eucariotele studiate, de la drojdii la oameni, con"in retrotranspozomi,
elemente mobile ADN care transpozeaz! prin intermediul ARN folosind o
reverstranscriptaz!. Aceste elemente mobile se pot mp!r"i n dou! categorii majore:
retrotranspozomi virali #i nevirali. Retrotranspozomii virali sunt abunden"i la drojdii
(ex elementele Ty) #i la Drosophila (elementele copia). La mamifere,
retrotranspozomii neretrovirali sunt cele mai comune tipuri de elemente mobile (vor fi
descrise n continuare). Cu toate acestea, se estimeaz! c! retrotransp#ozomii umani
reprezint! aproape 4% din ADN uman.
Structura general! a retrotranspozomilor virali de la eucariote este prezentat!
n figur!. n plus, pe lng! repeti"iile directe scurte din 5 #i 3 to"i retrotranspozomii
virali sunt marca"i prin prezen"! unor repeti#ii terminale lungi (LTR-long terminal
repeats) de 250-600 pb care flancheaz! regiunea care codific! pentru protein!. LTR
sunt caracteristice ADN retroviral integrat #i sunt critice pentru ciclul de via"! al
retrovirusurilor. Mai mult, elementele Ty "i copia implic! mecanisme similare celor
prin care ADN retroviral este integrat n gennomul unei celule gazd! #i ARN
retroviral este generat.

SLIDE 37. Generarea ARN genomic retroviral din ADN integrat
retroviral
Trebuie s! "inem seam! de func"iile distincte ale ale celor dou! LTR ale ADN
retroviral integrat, n generarea ARN genomic retroviral, care corespund
intermediarului ARN implicat n transpozi"ia elementelor Ty "i copia. LTR din stnga
func"ioneaz! ca un promotor care direc"ioneaz! ARN polimeraza II din celula gazd!
pentru ini"ierea transcrip"iei ncepnd de la cap!tul 5 al secven"ei R. Dup! ce ntregul
ADN retroviral a fost transcris, secven"a ARN corespunz!toare LTR din partea
dreapt! direc"ioneaz! enzimele care proceseaz! ARN n celula gazd! pentru a cliva
transcriptul primar #i a ad!uga coada poli (A) la cap!tul 3 al secven"ei R. Genomul
retroviral rezultat este total lipsit de LTR. Totu#i, dup! ce virusul infecteaz! celulele,
revers-transcrip"ia genomului ARN de c!tre revers-transcrptaza codificat! de c!tre
virus conduce la un ADN dublu-catenar cu secven"e LTR.



107
SLIDE 38. Generarea secven%elor LTR n timpul revers-
transcrip%iei ADN genomic retroviral (1)
Figura: O serie complicat! de 9 evenimente genereaz! o copie ADN dublu-
catenar! a genomului ARN al retrovirusului. ARN genomic este mpachetat ntr-un
virion cu un ARNt retroviral specific hibridizat cu o secven"! complementar! situat!
n apropierea cap!tului 5 #i numit! Primer Binging Site (PBS). ARN retroviral are o
secven"! scurt! repetitiv! la fiecare cap!t al secven"ei R. ntreaga reac"ie este
catalizat! de c!tre revers-transcriptaz! care realizeaz! sinteza ADN #i diger! ARN din
hibridul ADN/ARN. ntregul proces conduce la o molecul! dublu-catenar! de ADN
care este mai lung! dect matri"a ARN #i posed! LTR la fiecare cap!t.
Integraza, o alt! enzim! codificat! de c!tre retrovirus, insereaz! apoi ADN
dublu-catenar retroviral n genomul celulei gazd!; n acest proces, secven"ele
repetitive scurte directe ale secven"ei "int! sunt generate la fiecare cap!t al secven"ei
virale inserate. Ca #i ADN retroviral, elementele Ty #i copia codific!
reverstranscriptaza #i integraza; se consider! c! aceste enzime func"ioneaz!
transformnd intermediarl ARN n ADN #i insernd ADN n situsul "int! ntr-o
manier! similar! retrovirusurilor.
Elementele Ty transpozeaz! ntr-o propor"ie foarte sc!zut!, probabil datorit!
inser"iei aleatoare a elementelor Ty n fiecare genom, care con"in un spacer relativ
mic #i un intron ADN, care adesea inactiveaz! genele. Totu#i, cnd celulele de drojdii
sunt transformate cu plasmide care con"in elementul Ty clonat dup! un promoter
sensibil la galactoz!, producerea ARNm pentgru Ty #i transpozi"ia Ty este mai mare
n prezen"a galactozei dect n absen"a acesteia. Aceast! cre#tere a fenomenului de
transpozi"ie a Ty este rezultatul cre#terii ARNm al Ty, care poate func"iona ca o
matri"! pentru revers-transcriptaza #i integraza exprimat! de Ty.
n contrast cu elementele Ty, regiunea codant! de a elementelor Ac de la
porumb con"ine introni. Prezen"a intronilor n elementele Ac sus"ine concluzia c! ei
transpozeaz! prin directa deplasare a secven"elor de ADN #i nu prin rfevers-
transcrierea unui intermediar ARN.

SLIDE 39. Generarea secven%elor LTR n timpul revers-
transcrip%iei ADN genomic retroviral (2)

SLIDE 40. Plasmidele recombinante folosite pentru a demonstra
ca elementul Ty de la drojdii transpozeaza prin intermediul ARN
Cnd celulele de drojdii sunt transformate cu plasmida care con"ine elementul
Ty, elementul Ty poate s! fie transpozat n noi situsuri, proces care n mod normal
apare cu o rat! sc!zut!. Folosind elementele diagramate n partea de sus a figurii,
cercetatorii au ob"inut doi vectori plasmidiali diferi"i care con"in elementele Ty
adiacente unui promotor sensibil la galactoza. Aceste plasmide au fost utilizate pentru
transformarea celulelor de drojdie care au fost crescute pe mediu cu galactoza #i pe
mediu f!r! galactoz!. n experimentul 1, cre#terea celulelor pe mediu cu galactoz! a
determinat apari"ia unui num!r mai mare de transpozi"ii dect n cazul celor crescute
pe mediu f!r! galactoz!. Acest experiment demonstreaz! necesitatea existen"ei unui
transcript ARNm intermediar n vederea transpozi"iei elementului Ty. n experimentul
2, un intron str!in (care nu are leg!tur! cu gena de drojdie) a fost inserat n faza
codant! de lectur! care codific! pentru proteina recombinant! galactoz!-elementul
Ty. Lipsa intronului n elementele Ty transpozate reprezint! o eviden"! clar! a
faptului c! mecanismul procesului de transpozi"ie presupune prezen"a unui
108
intermediar ARNm care n urma procesului de maturare (splicing) pierde intronul, a#a
cum se poate vedea n figur!. n contrast, transpozomii ADN de la eucariote, cum este
cazul elementului Ac de la porumb, con"in introni n gena care codific! pentru
transpozaz!, indicnd astfel c! ace#tia nu se deplaseaz! (nu transpozeaz!) printr-un
mecanism care necesit! prezen"a unui intermediar ARN [See J. Boeke et al., 1985,
Cell 40:491.].

SLIDE 41. Retrotranspozomii ne-retrovirali sunt lipsi%i de
secven%e LTR
Retrotranspozomii ne-retrovirali nu posed$ LTR "i se deplaseaz$ printr-un
mecanism neobisnuit
Cele mai abundente elemente mobile la mamifere sunt retrotranspozomii ne-
retrovirali c!rora le lipsesc LTR. Multe dintre acestea apar"in la dou! clase de
elemente moderat repetitive care se g!sesc la mamifere: Long Interspersed Elements -
LINES "i Short Interspersed Eledments SINE. La mamifere a fost identificat! o
clas! de secven"e SINE #i peste 10 clase de secven"e LINE. LINE au fost eviden"iate
#i la protozoare, insecte #i plante dar din motive necunoscute posed! o distribu"ie mult
mai larg! la mamifere.
Num!rul mare de secven"e SINE #i LINE la eucariotele superioare au fost
acumulate evolutiv prin copierea repetat! a unei secven"e la nivelul ctorva pozi"ii din
genom #i inserarea copiilor n noi pozi"ii. Nu con"in secven"e LTR.

SLIDE 42. Retrotranspozomii ne-retrovirali se deplaseaz$ printr-
un mecanism neobi&nuit. Elementele LINE L1
Cele mai comune elemente LINE la mamifere sunt familia L1. n genomul
uman sunt peste 600 000 copii ale L1 (aprox 15% toatal genom). Structura general! a
L1 se bazeaz! pe o secven"! consens (medie) prezentat! n figur!. Elementele L1 sunt
de obicei flancate de scurte repeti"ii directe, marca elementelor mobile. Secven"a
consens con"ine dou! faze de lectur! de aprox 1 kb #i 4 kb. ORF1 codific! pentru o
protein! de legarea a ARN iar ORF2 este similar! cu secven"a reverstranscriptazei din
retrovirusuri sau din retrotranspozomii virali.
Dovezile privind deplasarea elementelor L1 vin din analizele ADN uman
clonat de la pacien"ii cu diferite maladii genetice. Analiza ADN de la ace#ti pacien"i a
eviden"iat c! muta"iile pe care le purtau se datorau inser"iei unui element L1 la nivelul
unei gene, f!r! ca un astfel de elemt s! fie prezent la p!rin"i.
Deoarece elementele L1 nu con"in secven"e LTR nseamn! c! mecanismul lor
de transpozi"ie prin intermediul ARN trebuie s! difere de cel al reztrotranspozomilor
virali la care LTR au rol crucial. Studiile in vitro au indicat c! transcrip"ia lui L1 este
direc"ionat! de secven"e promotoare localizate la cap!tul stng al elementului. La
cap!tul din dreapta a fost eviden"iat! o regiune bogat! n A/T care se continu! cu
resturi A n transcrip"ii ARN.
Adesea secven"ele L1 con"in codoni STOP #i muta"ii frameshift la nivelul ORF1 #i
ORF2, acestea fiind acumulate n L1 n timpul evolu"iei. Men"inerea transpozi"iei L1
necesit! ca m!car o secven"! L1 s! #i p!streze intacte fazele de lectur! care codific!
pentru reverstranscriptaze #i celelalte proteine necesare transpozi"iei L1.

SLIDE 43. Structura general$ a LINE, una din cele dou$ clase de
retrotranspozomi non-LTR n ADN de mamifere
109
Lungimea situsurilor "int! care con"in repeti"ii directe variaz! prin num!rul de
copii pentru fiecare element la diferitele situsuri "int! din genom. De#i, lungimea
total! a secven"ei L1 este de 6kb, n 90% din situri de integrare n care acest element a
fost eviden"iat, nu au fost eviden"iate varia"ii n regiunea 5 (regiunea bogat! n AT).
Faza deschis! de lectur! 1(ORF1), mai scurt!, de aproximativ 1kb, codific! pentru o
proteina de legare la ARN (RNA-binding protein). Faza deschis! de lectur! 2
(ORF2), de aproximativ 4kb, codific! pentru o protein! bifunc"ional! cu activitate
reverstranscriptazic! #i endonucleazic!.

SLIDE 44-45. Mecanisme propuse pentru revertranscrierea si
integrarea LINE
Este prezentat! numai proteina produs! de ORF2. Secven"ele ADN LINE nou
sintetizate sunt colorate n negru [Adapted from D. D. Luan et al., 1993, Cell
72:595.]

SLIDE 46. Elementele ADN mobile au probabil o influen%$
semnificativ$ n evolu%ie
Cu toate c! elementele ADN mobile nu par s! aib! o func"ie direct! alta dect
men"inerea propriei existen"e, prezen"a lor probabil a avut #i are un impact major n
evolu"ia organismelor.
De exemplu:
- elementele mobile eviden"iate ca inducnd muta"ii spontane la Drosophila ca
urmare a inser!rii ntr-o sau n apropierea unei unit!"i de transcrip"ie;
- elemtele mobile detectate n genele mutante.
n plus, recombinarea omolog! ntre elementele mobile disxpersate de-a
lungul genoamelor ancestrale pot avea un important rol n duplicarea genelor #i n alte
rearanjamente de-a lungul evolu"iei. Clonarea #i secven"ializarea clusterului beta-
globinelor de la diferite specii de primate au eviden"iat c! genele G) #i A) au ap!rut
ca urmare a crossing-overului omolog inegal dintre dou! secven"e L1.
Astfel de duplic!ri #i rearanjamente ale ADN contribuie mult la evolu"ia noilor
gene. Se poate considera c! duplicarea genelor este anterioar! evolu"iei unui num!r
mic de familii de gene care ulterior au achizi"ionat func"ii utile #i distincte.
ADN mobil a putut influen"a #i evolu"ia genelor care con"in mai multe copii a
unor exoni similari care codific! domenii proteice similare (de ex gena fibronectinei).
Recombinarea omolog! ntre elementele mobile inserate n introni contribuie probabil
la evolu"ia intronilor unor astfel de gene. Unele studii sugereaz! c! n timpul evolu"iei
eucariotelor superioare, apare recombinare ntre intronii unor gene distincte, genernd
noi gene formate din noi combina"ii de exoni pre-existen"i. De exemplu, activatorul
tisular al plasminogenului, receptorul Neu, factorul de cre#tere epidermal! con"in un
domeniu EGF

SLIDE 47. Amestecarea exonilor (Exon shuffling) prin recombinare
ntre repeti%ii interspa%iatoare omologe
Recombinarea ntre repeti"ii interspa"iatoare omologe situate ntre intronii
genelor separate determin! producerea unor unit!"i de transcrip"ie cu noi combina"ii
de exoni. n exemplul din figur!, este demonstrat un dublu crossing-over ntre dou!
pozi"ii care con"in repeti"ii Alu care determin! schimbul de exoni ntre dou! gene.

110
SLIDE 48. Amestecarea exonilor (Exon shuffling) prin transpozi%ie
(a) Transpozi#ia unui exon flancat de transpozomi ADN omologi ntr-un intron al unei
a doua gene. Asa cum se vede n figur!, ntr-o prim! etap! transposaza poate
recunoa#te #i cliva ADN la capetele repetitive inversate ale transpozomului din gena 1
determinnd eliberarea transpozomului. Tot transpozaza este responsabil! de
inserarea ulterioar! a transpozomului n gena 2, ntr-un situs "int! de inser"ie care se
afl! la nivelul unui intron. Rezultatul net se traduce prin inser"ia exonului din gena 1
n gena 2. (b) Integrarea unui exon dintr-o gen! n alta prin intermediul transpozi#iei
secven#elor LINE. Anumite secven"e LINE posed! semnale slabe poliA. n astfel de
situa"ii, este posibil ca transcrip"ia acestor elemente LINE, n ARNm, s! se continue #i
cu exonul genei 1 pozi"ionat n 3 fiind astfel trancrise #i semnalele de clivare #i de
poliadenilare proprii genei 1. Aceast! molecul! de ARNm poate fi ulterior revers-
transcris! #i integrat! de c!tre LINE n faza deschis! de lectur! a proteinei 2 (ORF2)
la nivelul unui intron al acestei gene, introducnd astfel un nou exon n 3 la nivelul
acestei gene.

SLIDE 49. Domeniile structurale &i func%ionale sunt module ale
structurii ter%iare
Evolu"ia genelor care codific! aceste proteine ar fi putut implica recombin!ri
ntre elemente mobile care au avut drept rezultat inser"ia unui exon care codific! EGF
ntr-un intron al unei forme ancestrale ale fiec!reia dintre aceste gene. Termenul
exon shuffling (amestecare a exonilor) a fost introdus pentru a defini acest tip de
proces evolutiv.
Recombinarea dintre elementele mobile poate s! fi jucat un rol #i n
determinarea genelor specifice care sunt exprimate n anumite tipuri celulare
particulare #i privind nivelul expresiei acestora n anumite momente ale dezvolt!rii
celulare sau a organismului.
A#a cum am discutat genele eucariote posed! regiuni de control a transcrip"iei,
numite ENHANCER care pot opera la o distan"! de mii de perechi de baze. De
asemenea transcrip"ia unei gene poate fi controlat! prin efectul combinat a mai multor
seven"e enhancer. Recombinarea elementelor mobile inserate aleator lng!
enhancer poate contribui la evolu"ia combina"iilor de enhancers care controleaz!
genele la organismele moderne.

SLIDE 50. Concluzii (1)
Majoritatea secven"elor ADN moderat repetitive de la nivelul a numeroase
situsuri din genomul eucariotelor superioare provin din elementele ADN mobile;
Elementele ADN mobile codific! enzime care le insereaz! secven"a n noi
situsuri ale ADN genomic;
Elementele ADN mobile care transpozeaz! direct c!tre noi situsuri sunt
numite transpozomi; cele care sunt mai nti transcrise n ARN #i apoi sunt revers-
transcrise n ADN sunt denumite retrotranspozomi. Ambele tipuri produc secven"e
repetitive scurte la situsul de inserare, care flancheaz! elementul mobil. Lungimea
repeti"iilor directe depinde de tipul de element mobil.
Elementele mobile de la bacterii IS- #i transpozomii bacterieni se deplaseaz!
prin intermediari ADN. Ambii codific! pentru transpozaz!, dar trapozomii mai lungi
con"in #i alte gene care codific! pentru proteine, n general, gene pentru rezisten"! la
antibiotice.
111
Transpozomi cu structur! similar! elementelor IS sunt prezen"i #i la eucariote
(ex, elementul P de la Drosophila), dar retrotranspozomii sunt mult mai abunden"i la
eucariotele superioare.
Retrotranspozomii virali sunt flanca"i de secven"e repetitive terminale lungi
(LTR), similare celor de ADN retroviral #i care, asemeni retrovirusurilor, codific!
revers-transcriptaz! #i integraz!. Ei se deplaseaz! n genom prin transcriere n ARN,
care sufer! revers-transcriere #i integrare n cromozomul celulei gazd!)

SLIDE 51. Concluzii (2)
Retrotranspozomii ne-virali nu posedd! LTR #i au a regiune bogat! n A/T
la unul din capete. Se consider! c! aceste elemete mobile se deplaseaz! printr-un
mecanism ne-viral neobi#nuit;
Cele mai abundente elemente mobile la vertebrate sunt dou! tipuri de
retrotranspozomi ne-virali numite LINE #i SINE. Ambele par s! cauzeze muta"ii
asociate cu bolile genetice umane;
SINE manifest! o omologie crescut! cu moleculele mici de ARN celular
transcrise de ARN polimeraza III. Cele mai comune secven"e SINE, la oameni, con"in
un situs de restric"ie AluI #i sunt numite secven"e Alu. Acestea sunt secven"e de
aproximativ 300 pb dispersate n genomul uman #i reprezint! 5% din acesta;
Unele secven"e de ADN sunt derivate din molecule de ARN celular care au
fost revers-transcrise #i inserate n ADN genomic, n timpul evolu"iei. Cele derivate
din ARNm se numesc pseudogene procesate #i le lipsesc intronii (aceasta fiind o
tras!tur! care le diferen"iaz! de pseudogene care au ap!rut prin deriva unor secven"e
ale genelor duplicate);
De#i elementele mobile par nefunc"ionale pentru organismul individual, ele
trebuie s! fi influen"at semnificativ evolu"ia

SLIDE 52. Rearanjamente func%ionale la nivelul ADN cromozomial
n contrast cu transpozi"ia elementelor mobile n ADN genomic, care par s! nu
serveasc! direct, fun"ion!rii imediate a organismului, exist! diferite tipuri de
rearanjamente ale regiunilor ADN care sunt benefice pentru organism. Aceste
rearanjamente func"ionale, care au fost identificate att la eucariote ct #i la
procariote, apar prin inversii #i dele"ii ale segmentelor de ADN #i prin amplificarea
ADN. Aceste aranjamente func"ionale joac! #i un rol important n reglarea unor gene,
cel mai frecvent mecanism de control implicnd reglarea transcrip"iei.

SLIDE 53. Genele pentru anticorpi sunt asamblate prin re-aranjarea
liniilor ADN germinale
Unul dintre cele mai remarcabile aspecte ale r!spunsului imun este vasta
diversitate a anticorpilorcare pot fi orienta"i c!tre multe antigene posibile #i particule
individuale. Se estimeaz! c! un individ poate produce poten"ial mai multe milioane de
tipuri de anticorpi cu specificit!"i pentru tot attea tipuri de antigene diferite. Un
milion de molecule de anticorpi diferi"i nu pot fi codifica"i direct de genomul uman,
cnd genomul con"ine numai aproximativ 100 000 de gene. Mecanismul molecular de
generare a unei astfel remarcabile diversit!"i pornind de la o cantitate limitat! de ADN
este acum n"eles. Inversiile #i de#a"iile regulate au un rol important n proces. Pentru
a n"elege cum se realizeaz! acest lucru trebuie mai nti s! ne amintim structura
anticorpilor.

112
Structura pe domenii a anticorpilor
Anticorpii apar"in unei clase de proteine numite imunoglobuline, care
constituie aproximativ 20% din proteinele din snge. Cel mai abundent tip de
anticorpi, imunoglobulinele G (IgG) sunt molecule simetrice compuse din patru
lan"uri polipeptidice: dou! identice grele H (heavy) de 55 kDa #i dou! identice u#oare
L (light) de 23 kDa. Lan"urile u#oare sunt compuse din dou! domenii, un domeniu
terminal numit VL, deoarece este u#or diferit sau variabil ca secven"! #i ca structura
diferitelor molecule de anticorpi, #i un domeniu C terminal numit CL, care are o
structur! identic! sau constant! n toate moleculele IgG. Similar, lan"urile grele sunt
compuse din patru domenii, un domeniu N-terminal variabil VH #i trei domenii
constante denumite CH1, CH2, CH3.
Moleculele de anticorp leag! o molecul! de antigen prin intermediul
suprafe"elor create la intefa"a domeniilor VL #i VH ale antenelor n Y ale moleculei.
n consecin"!, specificitatea de legare a unui anticorp este determinat! de secven"a
dfomeniilor VL #i VH.

SLIDE 54. Organizarea lan%urilor u&oare
Organizarea lan#urilor u"oare ADN
Anticorpii sunt produ#i de limfocitele B. Genele care codific! anticorpi cu
diferite specificit!"i de legare nu sunt mo#tenite direct din oul fertilizat. Mai degrab!
acestea sunt asamblate dintr-un num!r de fragmente separate prezente n ADN-ul
liniei germinative; acest proces apare n timpul dezvolt!rii celulelor B din celulele
stem ale m!duvei spin!rii. De exemplu, un aranjament func"ional al genelor care
codific! pentru lan"ul u#or k (tipul major de la #oarece #i la om) con"ine trei segmente.
La cap!tul 5 este segmentul Lk; acesta codific! pentru o peptid! semnal sau ledader
care direc"ioneaz! proteinele nou traduse n reticolul endoplasmatic pentru prepararea
secre"iei extracelulare a acestora. n timpul procesului post-transla"ional peptida
semnal este nl!turat! din structura lan"ului u#or #i nu este prezent! n molecula de
anticorp matur!. Cel de al doilea segment codific! pentru domeniul VL al lan"ului
u#or #i al treilea segment de la cap!tul 3 codific! pentru domeniul CL.
A#a cum vedem n figur!, ADN celulelor germinative #i a altor celule cu
excep"ia limfocitelor B mature (de ex. sperm!, ou) con"in un locus k care posed! o
regiune variabil! la cap!tul s!u 5. Aceast! regiune const! ntr-o banc! segmente
leader Lk #i variabil Vk con"innd aproximativ 100Lk +Vk unit!"i la om; aceste
unit!"i sunt distribuite n tandem de-a lun gul unui fragment de ADN ( Segmentul Lk
corespunde exonului leader din gena final!; segmentul Vk prinde majoritatea dar nu
ntreg exonul final VL care codific! regiunea variabil! a lan"ului u#or). Fiecare dintre
unit!"ile Lk +Vk sunt lungi de aproximativ 400 nucleotide #i sunt separate de
aproximativ 7 kb; astfel 100 de unit!"i Lk+Vk acoper! aproximativ 740 kb. Regiunea
variabil! a locusului k este urmat! de cinci segmemente de mbinare (joining-Jk) #i un
segment constant Ck, n ADN germinativ uman. Cele 5 segmente Jk sunt dispuse n
tandem #i sunt separate de aproximativ 20 kb de cap!tul 3 al regiunii variabile.
Fiecare dintre segmentele Jk este de aproximativ 30 nucleotide #i sunt mpr!#tiate pe
o distan"! de aprox 1,4 kb. ntre segmentul 3 Jk #i segmentul circular Ck exist! un
fragment de 2,4 kb. Num!rul segmentelor Vk #i Jk variaz! cu speciile de mamifere,
totu#i exist! ntotdeauna mult mai multe segmente Vk dect Jk.


113
SLIDE 55. Rearanjarea ADN care codific$ lan%urile u&oare,
Rearanjarea lan%urilor u&oare ADN
Cnd ADN se reorganizeaz! pentru a face func"ional! o gen! k, un segment
Vk este reunit cu un segment Jk. Aceast! reunire este realizat! de o recombinaz!
situs-specific! care recunoa#te secven"ele de la cap!tul 3 al fiec!rui segment Vk #i
capetele 5 ale segmentului Jk. Recombinarea ntre aceste secven"e are ca rezultat o
dele"ie #i o inversiune la nivelul secven"ei participante, depinznd dac! unitatea Lk +
Vk posed! aceea#i orientare transcrip"ional! sau orientare opus! fa"! de segmentul Jk.
Aceast! recombinare formeaz! regiunea variabil! complet!. Mai mult, se cunoa#te c!
orice Vk se poate reuni cu cu oricare Jk alegerea fiind aleatoare. O dat! ce segmentele
Vk #i Jk sunt reunite, regiunile variabile #i constante sunt transcrise mpreun! ntr-un
transcript ARN primar. Secven"ele care intervin ntre Lk #i Vk #i ntre Jk #i Ck
(icluznd oricare dintre regiunile Jk r!mase) sunt apoi nl!turate prin splicigul ARN
pentru a ob"ine proteina lan"ului u#or k.
Atta timp ct fiecare segment Vk #i Jk are o secven"! nucleotidic! unic!,
reunirea Vk-Jk alre celor 100 segmente Vk #i 5 segmente Jk n liniile germinative
umane poate produce 500 posibile lan"uri diferite. Dar reunirea Vk-Jk genereaz! o #i
mai mare variabilitate dect pot sugera aceste calcule deoarece un num!r mic, variabil
de nucleotide sunt pierdute din segmentele Vk #i Jk atunci cnd ele sunt reunite.
Imprecizia procesului de reunire cre#te mult diversitatea secven"ei posibile de
aminoacizi a VL codificat! de c!tre regiunile Vk-Jk reunite. Semnificativ aceast!
regiune codific! mul"i dintre aminoacizii din situsul de legare a antigenului la cap!tul
domeniului VL.
Pierderea aleatoare a nucleotidelor la situsul de reunire genereaz! o diversitate
semnificativ! n acest punct, dar sistemul pl!te#te pentru aceast! diversitate. Costul
este evident dac! ne amintim constrngerile unei structuri codante. Trebuie s! "inem
seam! c! o secven"! codant! trebuie citit! sub form! de triplete, #i c! AUG
(metionin!) este codonul care define#te o faz! de lectur! care grupeaz! restul regiunii
codante in triplete. Astfel reunirea a dou! piese de fragmente de ADN cum sunt Vk #i
Jk pot produce o nou! faz! de lectur! corect! sau incorect! care produce protein! non-
sens. Deoarece reunirea segmentelor se face aleator, dou! din trei reuniuni determin!
formarea unei proteinre non-sens.
n concluzie, au fost descrise trei surse de diversitate:
- variabilitatea secven#ei multor segmente Vk la nivelul locusului k;
- variabilitatea variabilitatea secven#elor unui mic num$r de segmente Jk;
- variabilitatea num$rului de nucleotiode deletate la reunirea Vk-Jk.
Exist! #i alte procese care genereaz! o mult mai mare variabilitate prin modificarea
secven"ei ADN la nivelul reunii segmentelor.

SLIDE 56. Organizarea &i rearanjarea secven%elor ADN ale lan%urilor
grele
Organizare &i rearanjamentul lan%urilor grele ADN
Genele func"ionale care codific! lan"urile grele ale anticorpilor sunt formate
prin procese similare celor deja descrise anterior pentru lan"urile u#oare. Analiza
situsurilor de legare ale a antigenelor la numero#i anticorpi sugereaz! c! contribu"ia
lan"urilor grele la contactul cu antigenele este chiar mai mare dect contribu"ia
lan"urilor u#oare. n concordan"! cu necesitatea de diversitate la nivelul lan"urilor
grele, trei b!nci de segmente genetice contribuie la variabilitatea regiunii func"ionale
a lan"urilor grele. Primele dou! sunt formate din b!ncile fragmentelor VH #i JH ale
114
lan"urilor grele iar cea de a treia este format! din diversitatea segmentelor D
(diversity) care sunt localizate ntre celelalte dou! b!nci.
Diversitatea este asigurat! de dou! procese de reunire, VH cu D #i D cu JH.
Cu siguran"! c! reunirea a trei fragmente ofer! o diversitate mult mai mare de
combinare. ADN din liniile germinale umane con"ine aproximativ 100 segmente Vh,
30 segmente D #i 6 segmente func"ionale JH. Pe lng! diversitatea furnizat! de
reunirile aleatoare ale segmentelor VH cu D #i a D cu JH o anumit! diversitate este
furnizat! de pierderea nucleotidelor la realizarea jonc"iunilor care apar la combinarea
segmentelor. ADN pentru lan"urile grele din liniile germinale con"in #i multiple
segmente C care codific! pentru domeniile constante ale regiunii claselor de IgG
variabile. O combinare ntre proces!rile alternative ale ARN #i aranjamentele
adi"ionale (switching-ul clasei) determin! ce clas! de IgG este exprimat! n anumite
tipuri de celule B.

SLIDE 57. Amplificarea generalizat$ produce cromozomi
politeni
Toate rearanjamentele ADN discutate anterior att func"ionale ct #i
nefunc"ionale implic! modific!ri ale pozi"iilor secven"elor n cadrul genomului. Alt
tip de rearanjament implic! amplificarea generalizat! a secven"elor ADN sau
politenizarea.
Este exemplul glandelor salivare de la Drosophila care con"in cromozomi
mari n interfaz!. Cnd fix!m #i color!m ace#ti cromozomi, ei se caracterizeaz!
printr-un mare num!r de benzi demarcate, care pot fi utilizate pentru a stabili pozi"ia
#i ordinea genelor la Drosophila. M!rirea cromozomilor din glanda salivar! #i din alte
celule de la Drosophila, apare atunci cnd ADN se replic! repetitiv #i cromozomii
ob"inu"i nu sunt separa"i. Rezultatul este formarea cromozomilor politeni compu#i din
multe copii paralele . Amplificarea ADN cromozomal cre#te mult num!rul de copii de
gene, probabil pentru a suplini necesitatea de ARNm pentru sinteza proteic! care are
loc celulele aceastei glande salivare masive. Totu#i, la majoritatea cromozomilor care
particip! la politenizare, anumite secven"e cum sunt secven"ele simple ADN de la
nivelul centromerilor #i telomerilor nu sunt amplificate. Mai mult genele ribozomale
tind s! fie amplificate mai pu"in dect alte seven"e.
Mecanismul molecular al acestor procese este necunoscut, dar se pare c!
secven"ele simple de ADN contribuie probabil la alinierea ADN amplificat de-a
lungul lungimii cromozomilor politeni.

SLIDE 58. Concluzii
Diversitatea remarcabil! a moleculelor de anticorpi este realizat! prin
asamblarea genelor func"ionale, care codific! lan"urile grele #i u#oare ale anticorpilor,
de la mai multe segmente cu secven"! unic! prezente n ADN din liniile germinale.
Segmentele care codific! pentru domeniile variabile ale lan"urilor u#oare #i grele din
b!nci alternative de regiuni codante scurte;
Num!rul mare de combina"ii posibile n care segmentele de gene ale lan"urilor
grele #i u#oare pot fi combinate reprezint! un mecanism de generare a varia"iilor
secven"ei de aminoacizi #i de cre#tere a specificit!"ii de legare a anticorpilor produ#i
de limfocite individuale. Diversitatea cre#te si datorit! pierderilor sau ad!ugirilor
aleatoare care se produc la reunirea capetelor segmentelor genelor care codific!
pentru lan"urile grele #i u#oare;
115
n unele organisme, celulele specializate #i sporesc num!rul #i m!rimea ADN
cromozomal prin amplificare, producnd cromozomi politeni cum sunt cei din
glandele larvare de la Drosophila. Cromozomii acestor celule gigante rezult! din
aproximativ 10 replic!ri f!r! diviziune celular! #i f!r! replicarea secven"elor simple
de ADN asociate centromerilor #i telomerilor













































116

NOTE DE CURS BM3
Reglarea Ini#ierii Transcrip#iei

SLIDE 2. Controlul genetic la bacterii: modelul Jacob-Monod
Figura: Cnd represorul lac se leag! la secven#a numit! operator (O), care se
leag! chiar n amonte de gena lacZ, transcrip#ia operonului de c!tre ARN polimeraza
este blocat!. Legarea lactozei la represor determin! o modificare conforma#ional! a
represorului astfel nct acesta nu se mai leag! la operator. ARN polimeraza este
apoi liber! s! se lege la promotor (P) "i ini#iaz! transcrip#ia genelor lac; ARNm
policistronic rezultat este tradus n proteinele codificate.
O combina"ie ntre experimentele genetice #i biochimice la bacterii determin!
recunoa#terea ini"ial! a
i) legarea proteinelor la secven"ele reglatoare asociate cu genele; ,
ii) proteinele a c!ror legare la secven"e reglatoare fie activeaz! fie represeaz!
transcrip"ia.
Aceste componente cheie sus"in (fundamenteaz!) capacitatea att a celulelor
procariote ct #i a celor eucariote de a activa sau inhiba (deschide sau nchide) (Turn
on or turn off) cu toate c! au fost descoperite diferite variante ale procesului de baz!.
Ce urm!rim: un rapel al modelelor experimentale timpurii privind controlul
transcrip"iei bacteriene; un rapel al modului n care ARN polimerazele bacteriene
ini"iaz! transcrierea #i mecanismele prin care acestea au capacitatea de a realiza acest
lucru.
La bacterii, controlul genetic serve#te n primul rnd pentru a permite celulelor
individuale s! se adpteze la schimb!rile mediului nutri"ional astfel nct cre#terea #i
diviziunea s! fie optimizate.
Astfel, primele orient!ri ale cercet!rilor s-au ndreptat c!tre genele care
codific! proteine a c!ror producere variaz! n func"ie de statusul nutri"ional al
celulelor.
De#i controlul genetic al organismelor multicelulare implic! adesea r!spuns la
modific!rile de mediu, este foarte caracteristic #i adesea scopul biologic esen"ial l
reprezint! reglarea unui proces genetic care sus"ine dezvoltarea embrionar! #i
diferen"ierea tisular!. Mai mult, majoritatea principiilor controlului transcrip"ional au
fost mai nti descoperite la bacterii #i apoi aplicate/adaptate celulelor eucariote

SLIDE 3. Model experimental pentru eviden%ierea secven%elor care
ac%ioneaz$ n cis
Figura: Demonstra#ie experimental! c! muta#iile O
c
ac#ioneaz! n cis
Celulele E. coli care con#in dou! copii ale operonului lac sunt prezentate n
diagram!. Liniile diagonale indic! genele "i regiunile de control purt!toare de
muta#ii. n aceste celule, operonul lac al cromozomului bacterian "i prezint! o
muta#ie O
c
la nivelul operatorului "i o muta#ie n gena lacZ (gena lacZ
-
) care
inactiveaz! enzima beta-galactozidaza. Operonul lac din plasmida F este de tip
s!lbatic. (Top) n absen#a inductorului IPTG, aceste celule exprim! constitutiv o
permeaz! func#ional! dar nu "i o beta-galactozidaz!. Aceste rezultate indic! c!
muta#ia O
c
afecteaz! numai genele ale aceluia"i ADN. Dac! muta#iile O
c
ar fi
ac#ionat n trans, transcrip#ia genei lacZ+ din plasmida F ar fi condus la o activitatea
beta-galactozidazic! observabil! (n partea de jos). n prezen#a IPTG (Isopropyl &-D-
1-thiogalactopyranoside), sunt observate att activitate galactozidazic! ct "i
117
permeazic!. A"a cum se poate constata din diagram!, transcrip#ia genei lacZ
normale (salbatice) din plasmida F conduce la o beta-galactozidaz! func#ional!.


SLIDE 4. Model experimental pentru eviden%ierea secven%elor care
ac%ioneaz$ n trans
Figura: demonstra#ie experimental! c! gena lacI+ ac#ioneaz! n trans.
Celulele care posed! o singur! gen! lacI- produc un represor inactiv, "i au ca
rezultat expresia constitutiv! a beta-galactozidazei "i permeazei. Dac! o gen!
s!lbatic! lacI+ prezent! n plasmidele factor F este introdus! n celule lacI-, celulele
transformate produc un represor func#ional, care se poate lega la operatorii lac. Ca
rezultat aceste celule nu exprim! beta-galactozidaz! sau permeaz! (lacto-permeaz!)
n absen#a inductorului.

SLIDE 5. Inducerea operonului lac conduce la cre&terea sintezei
ARNm lac
Figura: demonstra#ie biochimic! c! inductorul determin! cre"terea transcrip#iei
operonului lac.
E"antioane de celule de E. coli crescute pe mediu de glucoz!, au fost prelevate
nainte "i la scurte intervale dup! ad!ugarea IPTG. Uridin! marcat! cu tritiu a fost
ad!ugat! fiec!rei probe imediat dup! prelevare. Dup! 20 de secunde celulele au fost
lizate "i a fost izolat ARN. Fiecare prob! marcat! a fost hibridizat! cu un exces de
ADN clonat fixat pe membran!. Radioactivitatea r!mas! pe menbran! este o m!sur!
a vitezei de sintez! a ARNm n timpul perioadei scurte de marcare. Procentajul total
de ARN marcat cu tritiu care hibridizeaz! cu ADN lac n raport cu timpul dup!
ad!ugarea IPTG indic! c! propor#ia sintezei de ARNm cre"te rapid dup! ad!ugarea
IPTG, ajungnd la o rat! maximal! dup! dou! minute.

SLIDE 6: Concluzii
Multe proteine bacteriene sunt inductibile, sinteza lor fiind dependent! de
statusul nutri"ional al celulelor. Expresia diferen"ial! a genelor care codific! astfel de
proteine apare cel mai adesea la nivelul ini"ierii transcrip"iei;
n concordan"! cu modelul Jacob #i Monod privind controlul transcrip"iei,
transcrip"ia operonului lac, care codific! trei proteine inductibile este represat! de
legarea proteinei represoare lac la secven"a operator. n absen"a lactozei sau a altor
inductori represia este nl!turat! #i operonul lac este transcris;
Muta"iile la nivelul promotorului, la care se leag! ARN polimeraza, sau la
nivelul operatorului ac"ioneaz! n cis; aceasta nseamn! c! ele afecteaz! numai
expresia genelor de pe aceea#i molecul! de ADN n care apare muta"ia;
Muta"iile n secven"a unui operator care scad legarea unui represor au drept
rezultat o transcrip"ie constitutiv!. Muta"iile n secven"a promotorului, care afecteaz!
afinitatea de legarea a ARN polimerazei, pot fie s! scad! (muta"ie down) fie s!
creasc! (muta"ie up) transcrip"ia;
Represorii #i activatorii ac"ioneaz! n trans; ei afecteaz! expresia genelor
reglate de ei indifent de pozi"ionarea moleculei de ADN n celul!.

SLIDE 7. In%ierea transcrip%iei la bacterii
! ARN polimeraza ini"iaz! transcrip"ia majorit!"ii genelor la nivelul unei pozi"ii
unice situat! n amonte de secven"a codant!;
118
! Perechea de baze la nivelul c!reia se ini"iaz! transcrip"ia este denumit! situs
de ini"iere a transcrip"iei sau Punct START;
! Prin conven"ie, situl de ini"iere a transcrip"iei de pe secven"a ADN este
desemnat! cu pozi"ia +1, bazele situate n sensul transcrip"iei (downstream) sunt
desemnate cu numere pozitive iar cele pozi"ionate n sens opus (upstream) sunt
asimilate cu numere negative;
! Diferitele proteine (ARN polimeraze, activatori, represori) interac"ionedaz! cu
ADN la nivelul promotorului sau n vecin!tatea acestuia pentru a regla ini"ierea
transcrip"iei


SLIDE 8. Interac%iunile proteine-ADN identificate prin tehnica
footprinting
Figura: Technica Footprinting cu DN-aza I comun! pentru identificarea situsurilor
de legare a proteinelor la ADN.
Un fragment de ADN care este marcat la unul din capete cu 32P (bilele ro#ii)
ca #i n metoda de secven"iere Maxam #i Gilbert. Por"iuni din prob! sunt apoi digerate
cu DN-aza I n prezen"a #i n absen"a unei proteine care se leag! la o secven"!
specific! din fragment. DN-aza I hidrolizeaz! aleator leg!turile fosfodiester. La
concentra"ii sc!zute DN-aza I este utilizat! astfel nct fiecare molecul! de ADN este
clivat! numai o dat!. n absen"a proteinelor care se leag! la ADN, proba este clivat! la
toate pozi"iile posibile ntre cap!tul marcat #i nemarcat al moleculei. Cele dou! probe
de ADN sunt apoi separate de proteine, denaturate pentru desfacerea catenelor #i
supuse electroforezei. Gelul rezultat este supus electroforezei #i supus
autoradiografiei pentru a detecta numai catenele marcate #i pentru a identifica
fragmentele care se ntind de la cap!tul marcat pn! la locul de ac"iune al DN-azei I.
n dreapta se poate observa o autoradiogram! unde sunt analizate dou!
fragmente de ADN n absen"a #i n prezen"a unor proteine de legare la ADN dup!
digestia cu DN-aza I. Pentru proba digerat! n prezen"a proteinelor de legare la ADN
se observ! lipsa a dou! benzi; acestea corespund regiunii protejate de digestie prin
legarea proteinelor (spunem ca am realizat un footprinting privind legarea acestei
proteine). Aceast! regiune de protec"ie poate fi foarte u#or aliniat! cu secven"a ADN
dac! se realizeaz! o reac"ie de secven"iere a produ#ilor ini"iali #i a celor care s-au
ob"inut n urma protec"iei furnizate de legarea proteinelor. Reac"iile de secven"iere #i
fragmentele rezultazte n urma ac"iunii DN-azei sunt trecute pe acela#i gel.

SLIDE 9. Identificarea interac%iilor proteine-ADN prin tehnica gel-
shift assays
Figura: Rezultatele unei determin!ri ale mobilit!#ii eledctroforetice prin tehnica de
ntrziere n gel pentru proteinele care se leag! la ADN (EMSA-Electrophoretic
Mobility Shift Assay).
n acest exemplu, frac"ii ale unei coloane cromatografice de schimb ionic au
fost analizate pentru proteinele care se leag! la regiunea promotoare a unei gene
pentru ARNt de la EK. Un e#antion al frac"iei proteice este nc!rcat! pe o coloan!
(ON) iar frac"iile eluate de pe coloan! la concentra"ii saline crescute (numerele
frac"iilor) au fost incubate cu o sond! (fragment de restric"ie) radiomarcat! care
include regiunea promotoare; fiecare prob! a fost apoi supus! electroforezei ntr-un
gel de poliacrilamid!. Sondele libere care nu se leag! la proteine migreaz! n fa"!. O
119
protein! prezent! n frac"iile 7 #i 8 eluate de pe coloan! se leag! la sond!, formnd un
complex ADN-protein! care migreaz! mult mai lent dect sonda liber!

SLIDE 10. Eviden%ierea pozi%ion$rii ARN polimerazei la nivelul
regiunii control a represorului lac prin tehnica footprint
Figura: Imagine footprint a leg!rii ARN polimerazei "i a represorului lac la
regiunea control al ADN lac
Deoarece DN-aza I cliveaz! unele leg!turi fosfodiester mai frecvent dect
altele, densitatea benzilor n absen"a proteinelor (linia 3) nu sunt la fel de uniforme ca
#i din figura din slide-ul 8. Parantezele din dreapta indic! regiunile ADN protejate de
c!tre digestia cu DN-aza I prin legarea ARN polimerazei (linia 4) sau a represorului
lac (linia 5). Liniile 1 #i 2 arat! produ#ii celor dou! reac"ii de secven"iere Maxam #i
Gilbert: de pe aceste linii, benzile din gel pot fi corelate cu secven"a nucleotidic! a
regiunii de control lac. Pozi"iile n secven"! sunt notate pe partea stng!; capetele
s!ge"ilor indic! direc"ia transcrip"iei. Experimrentul footprinting a fost realizat ci
marcate la cap!tul 5 al cap!tului din dreapta al catenei superioare ca #i n slide-ul 6.

SLIDE 11. Regiunea control a operonului lac con%ine 3 situri critice
cis-acting
Figura: Diagrama regiunii de control a transcrip#iei a operonului lac.
Regiunea codant! a beta-galactozidazei N terminale este c!tre dreapta, #i
regiunea codant! C-terminal! a represorului lac este n stnga. Regiunile protejate de
digestia cu DN-aza I (footprints) de c!tre cAMP-CAP, ARN polimeraza #i represorul
lac sunt indicate prin barele colorate de deasupra. Analizele muta"ionale identific! trei
regiuni critice cu ac"iune n cis: dou! n promor (regiunea galben! de la 35 la -10) #i
una ntre +1 la +20 situat! la nivelul operatorului (n maron).
Regiunea footprint represoare se suprapune cap!tului din amonte a regiunii
footprint a ARN polimerazei dar nu este prea mare. Experimente similare de
footprint au demonstrat c! o a treia protein!, numit! CAP care se complexeaz! cu
cAMP ( cAMP-CAP) se leag! de asemenea la regiunea de control lac. Complexul
cAMP-CAP ac"iveaz! transcrip"ia de la nivelul promotorului lac.

SLIDE 12. ARN polimeraza se fixeaz$ specific la nivelul secven%elor
promotorului pentru a ini%ia transcrip%ia
Figura: reprezentarea schematic! modului de legare la ADN a formei majore a ARN
polimerazei de la E. Coli.
Prin conven"ie, situsul de ini"iere a transcrip"iei este numerotat, n general, cu
+1. Perechile de baze care se extind n direc"ia transcrip"iei sunt numite
downstream, n aval, fa"! de situsul de ini"iere a transcrip"iei; cele care sunt extinse
n regiunea invers! sunt considerate unstream sau n amonte. Subunitatea sigma70
se leag! la secven"e specifice situate lng! pozi"iile 10 la 35 ale promotorului.
Subunit!"ile alfa se leag! strns la ADN din amonte, iar beta #i beta sunt asociate
punctului de start.

SLIDE 13. Diferen%ele de la nivelul secven%elor promotorului E. coli
afecteaz$ frecven%a ini%ierii transcrip%iei
Figura: Promotorii recunoscu#i de c!tre ARN polimeraza (con#innd secven#a
sigma70) de la E. coli.
120
a) Secven"ele unor promotori puternici cu spa"ii (puncte) introduse pentru a
maximiza omologia la nivelul regiunii 10 la 35. Aceste secven"e corespund catenei
sens (de sus) a promotorului n condi"iile n care procesul de transcrip"ie se realizeaz!
de la stnga la dreapta. Bazele care corespund secven"ei consens din regiunea 35 la
1o sunt colorate n galben. (ase dintre secven"e corespund secven"elor control ale
genelor care codific! pentru ARN. Secven"ele din structura regiunilor promotoare ale
Lambda, T7 #i fd, care sunt prezente n genoame virale care sunt direct transcrise de
c!tre ARN polimeraza celulei gazd!.
b) Secven"ele consens ale regiunilor 35 la 10, care sunt separate de 15-17 pb.
Sunt descrise muta"iile cunoscute ca descrescnd semnificativ frecven"a transcrip"iei
unui anumit num!r de promotori. n secven"ele consens, frecven"a cu care bazele
indicate apar la fiecare pozi"ie la diferi"i promotori sigma70 este indicat! dup! cum
urmeaz!: litere n ro#u: > 70%; litere boldite negre: 50-70%; litere negre: 40-50%.
c) secventele regiunilor /35 la /10 ale promotorului lac care sunt diferite de
secven"a consens n patru pozi"ii (n albastru) Muta"iile down determin! sc!derea
expresiei operonului lac. Cele dou! muta"ii up care cresc gradul de asem!nare a
regiunii 10 cu secven"a consens, cresc expresia.

SLIDE 14. Majoritatea secven%elor operator sunt scurte repeti%ii
inversate
Figura: Secven#a operatorului lac reprezint! o secven#! repetitiv! inversat! aproape
perfect! centrat! n jurul unei secven#e GC situat! n pozi#ia 11.
Secven"a de 17 pb de pe catena sens care ncepe la 7 este identic! cu secven"a
de 17 pb situat! pe catena antisens #i ncepe la +28, cu excep"ia nucleotidelor indicate
n italic. Fiecare din aceste secven"e repetitive este denumit! jum!tate de situs
operator.

SLIDE 15. Majoritatea represorilor bacterieni sunt structuri dimere
care con%in elice $ care se insereaz$ n fosele majore adiacente ale
ADN
Figura: Modele privind represorul bacteriofagului 434 "i interac#iunea sa cu ADN
Acesta #i mul"i al"i represori bacterieni sunt homodimeri care insereaz! un helix
alfa (helixul de recunoa#tere) al fiec!rui monomer ntr-o fos! major! a operatorului
ADN. Represorii bacteriofagilor se leag! la secven"ele operator din genomul viral
prevenind astfel transcrip"ia de c!tre ARN polimeraza celulei "int!.
a) Modelul cu bile (space-filling model) al represorului dimer 434 legat la
operatorul s!u ADN specific
b) Modelul paglic! al monomerului superior (de sus) al represorului dimer 434
ar!tnd interac"ia sa cu ADN. Trei resturi de glutamine (Q), o serin! (S) #i o treonin!
(T) n helixul de recunoa#tere formeaz! leg!turi de hidrogen cu bazele din fosa major!
a ADN operator;
c) Diagrama in fire demonstrnd interac"iile dintre ADN #i monomerul
inferior #i interfa"a dimerului n represorul 434. Punctele ro#ii indic! leg!turile de
hidrogen #i ionice dintre represor #i ADN. Cercurile mici reprezint! molecule de ap!
legate.




121
SLIDE 16. Modific$rile conforma%ionale induse de liganzi modific$
afinitatea multor represori pentru ADN
Figura: Modific!ri conforma#ionale n structura apo-represorului cauzate de legarea
triptofanului.
Elicele alfa din proteina dimer!, reprezentate ca cilindri, sunt identificate prin
literele majuscule ntr-un monomer #i literele minuscule n cel!lalt. Elicele de
recunoa#tere (E #i e) sunt prea apropiate apropiate pentru a intra n fosele majore
adiacente ale operatorului ADN. Cnd aporepresorul leag! triptofanul, capetele N
terminale ale elecelor E #i e se deplaseaz! cu 8 A. Drept rezultat elecele E #i e din
represor mpreun! cu triptofanul legat (in portocaliu) se orienteaz! (se dispun) n
operatorul ADN.

SLIDE 17. Controlul pozitiv al operonului lac este exercitat de c$tre
cAMP-CAP
Figura: Control transcrip#ional pozitiv "i negativ al operonului lac de c!tre
represorul lac "i respectiv cAMP-CAP
a) n absen"a lactozei, nu se formeaz! ARNm lac deoarece represorul se leag! la
operatorul lac #i mpiedic! trancrip"ia;
b) n prezen"a glucozei #i lactozei, represorul lac se leag! la lactoz! #i sufer!
modific!ri conforma"ionale #i astfel nu se mai poate lega la operatorul lac. Totu#i,
cAMP este sc!zut, deoarece glucoza este prezent! #i atunci complexul cAMP-CAP nu
se leag! sitului CAP de pe operator. Ca rezultat, ARN polimeraza nu se leag! eficient
la promotorul lac #i este sintetizat numai pu"in ARNm lac;
c) n prezen"a lactozei #i n absen"a glucozei, apare transcrip"ie maxim! la
nivelul operonului lac. n aceast! situa"ie, represorul lac nu se leag! la operatorul lac,
concentra"ia cAMP cre#te #i coplexul cAMP-CAP format se leag! la situsul CAP,
stimulnd legarea #i ini"ierea de c!tre ARN polimeraz!.

SLIDE 18. Legarea cooperativ$ a cAMP-CAP &i a ARN polimerazei la
regiunea de control a lac activeaz$ transcrip%ia
Figura: Legarea cooperativ! a ARN polimerazei de la E. Coli "i a complexului
cAMP-CAP la promotorul lac.
Prin propria structura, ARN polimeraza #i cAMP-CAP posed! afinit!"i relativ
reduse pentru situsurile lor de legare la promotorul lac. Totu#i, interac"ia dintre
regiunile CAP #i subunitatea alfa a ARN polimerazei formeaz! un complex protein!-
protein! care se leag! mult mai stabil la promotorul ADN dect fiecare dintre cele
dou! proteine singur!.

SLIDE 19. Model de legare a cAMP-CAP la secven%a promotoare lac
promoter
Figura: Modelul cu bile de legare a complexului cAMP-CAP la promotorul lac
CAP leag! ADN dublu helix n jurul suprafe"ei sale. Cnd exist! resturi de
aminoacizi mutante complexul cAMP-CAP nu mai activeaz! transcrip"ia de la nivelul
promotorului lac. Secven"a ADN situat! la extremitatea complexului reprezint!
regiunea din apropierea pozi"iei 50 unde cap!tul C terminal al unei subunit!"i alfa se
consider! c! interac"ioneaz! resturile mai nchise la culoare din structura CAP.

122
SLIDE 20. Transcrip%ia de la nivelul unor promotori este ini%iat$ de
factorii sigma (%) alternativi
Tabel: Transcrip"ia majorit!"ii promotorilor de la E. Coli este demarat! prin interac"ia
promotorilor cu ARN polimeraza care con"ine factorul sigma70. Transcrip"ia
anumitor grupe de gene, totu#i, este realizat! de c!tre ARN polimeraze care con"in
una sau mai multe alternative de factori sigma: sigma28, sigma32, sigma38 #i
sigma54-care recunosc secven"e promotor consens diferite de sigma70. Att sigma28
#i sigma32 prezint! regiuni de omologie cu sigma70 #i recunosc secven"e situate tot n
intervalul 35 la 10.


SLIDE 21. Activarea subunit$%ii %54 a ARN polimerazei la nivelul
promotorului glnA de c$tre NtrC
Figura: Activarea subunit!"ii sigma54 a ARN polimerazei la promotorul glnA de
c!tre NtrC (Nitrogen regulatory Protein)
glnA este o gen! care codific! pentru enzima glutamin sintetaza care sintetizeaz!
glutamina pornind de la acidul glutamic "i amoniac.
Polimeraza se leag! la promotorul glnA, formnd un complex unit (strns),
nainte de activare. Ca r!spuns la concentra"iile mici de aztot organic, o protein kinaz!
numit! NtrB fosforileaz! proteina dimer! NtrC (purpurie) care apoi se leag! la doi
enhancers (portocaliu) pozi"iona"i la 108 #i 140 fa"! de situsul de START al
transcrip"iei. Dimerii NtrC fosforila"i lega"i interac"ioneaz! cu subunitatea sigma54
legat! determinnd formarea unei bucle la nivelul ADN implicat. Activitatea ATP-
azic! A NtrC stimuleaz! apoi polimeraz! s! desfac! catenele la situsul de start,
formnd un complex deschis. Transcrip"ia genei glnA poate s! nceap!.

SLIDE 22. Vizualizarea buclei ADN &i a interac%iilor leg$rii NtrC &i
subunit$%ii %54 a polimerazei
Figura: Vizualizarea buclei ADN "i interac#iilor Ntrc "i a subunit!#ii sigma54 a
polimerazei
a) Micrografie electronic! a fragmentului de restric"ie ADN cu cei doi dimeri
NtrC fosforila"i lega"i la regiunea enhancer lng! unul din capetele subunit!"ii
sigma54 a polimerazei legat! la promotorul glnA lng! cel!lat cap!t.
b) Micrografie electronic! a aceluia#i fragment demonstrnd legarea dimerilor
NtrC #i a subunit!"ii sigma54 a polimerazei unul cu altul cu formarea buclei de ADN
ntre ace#tia.

SLIDE 23. Multre r$spunsuri bacteriene sunt controlate de sisteme
reglatoare bi-componente
Figura: Sistemul bicomponent reglator PhoR/PhoB de la E. Coli
Ca r!spuns la concentra"iile sc!zute de fosfa"i din mediu #i spa"iul periplasmic,
un ion fosfat disociaz! din domeniul periplasmic a proteinei senzor PhoR (portocaliu).
Aceasta determin! o modificare conforma"ional! care activeaz! un domeniu
transmi"!tor al unei protein kinaze din regiunea citosolic! a PhoR. Domeniul
transmi"!tor activat transfer! un un gama-fosfat din structura ATP unui rest de
histidin! conservat din structura domeniului transmi"!tor. Acest fosfat este apoi
transferat unui acid aspartic din domeniul receptor al regulatorului r!spunsului ProB
(purpuriu). Mai multe proteine ProB pot fi fosforilate de c!tre una activat! ProR.
Proteinele fosforilate ProB activeaz! apoi transcrip"ia de la gbenele care codific!
123
proteine care ajut! celula s! r!spund! la cantitatea mic! de fosfat, incluznd phoA,
phoS, phoE #i ugpB.

SLIDE 24. Concluzii (I)

ARN polimerazele sunt proteine mari compuse din subunit!"i beta, beta #i
dou! subunit!"i alfa care formeaz! core polimeraza #i o subunitate sigma, din cteva
alternative, care func"ioneaz! ca factor de ini"iere;
Ini"ierea ncepe cnd subunitatea sigma a moleculei de polimeraz! se leag! la
secven"a promotor, formnd un complex unit. Polimeraza separ! apoi catenele pe o
distan"! de 12-13 pb la nivelul situsului de start a transcrip"iei, formnd un complex
deschis. Dup! ce aproximativ 10 ribonucleotide au fost polimerizate, subunitatea
sigma este eliberat! #i core polimeraza continu! transcrip"ia matri"ei;
Puterea unui promotor se refer! la ct de frecvent ARN polimeraza ini"iaz!
transcrip"ia pornind de la acesta. Subunitatea sigma70, factorul major n ini"iere la E.
coli, interac"ioneaz! cu secven"ele promotor situate n regiunea 10 la 35 fa"! de
situsul de start;
Represorii se leag! la secven"ele de ADN numite operatori, care se suprapun
par"ial cu regiunea promotoare la nivelul c!reia se leag! ARN polimeraza. Legarea
represorului interfer! cu legarea ARN polimerazei #i cu ini"ierea transcrip"iei;
Activatorii subunit!"ii sigma70 a ARN polimerazei se leag!, n general, la
ADN pe partea opus! a helixului fa"! de polimeraz!, n regiunea 20 la 50, sau chiar
n amonte de polimeraz!, n apropierea 60;

SLIDE 25 Concluzii (II)
Activatorul cAMP-CAP stimuleaz! transcrip"ia prin formarea unui complex
cu ARN polimeraza care prezint! o mai mare afinitate pentru situsuri ADN specifice
dect proteinele individuale. n plus fa"! de stimularea leg!rii polimerazei, activatorii
pot stimula #i formarea complexului deschis #i nceperea transcrip"iei;
Mul"i represori bacterieni sunt dimeri. Fiecare monomer con"ine un alfa-helix
care se insereaz! n fosa major! a operatorului ADN, astfel nct dimerul se leag! la
fose majore succesive. Afinitatea mare de legare este rezultatul form!rii multor
leg!turi de hidrogen, ionice #i van der Waals dintre proteine #i secven"e ADN
specifice;
Secven"ele de ADN care leag! proteinele reglatoare dimere sunt secven"e
repetitive inverse, care reprezint! fiec!re jum!ta"i de situsuri care leag! un monomer;
Operonii transcri#i de c!tre subunitatea sigma54 sunt reglate prin activatori
care se leag! la secven"e enhancer de aproximativ 100 pb n amonte de situsul de
ini"iere. Secven"ele enhancer care leag! activatori inetrac"ioneaz! tranzitoriu cu
polimeraza echilibrat! legat! la nivelul promotorului, stimulnd formarea unui
complex deschis #i in"ierea transcrip"iei;
n sistemele bi-componente reglatoare, o protein! ac"ioneaz! ca un senzor,
monitoriznd nivelul de nutrien"i din mediu. n condi"ii adecvate, proteina senzor
activeaz! o a doua protein!, reglatorul r!spunsului, care se leag! apoi la secven"ele
reglatoare, stimulnd sau represnd astfel transcrip"ia genelor specifice.




124
SLIDE 26. Controlul genelor eucariote: scop &i principii generale
! Spre deosebire de celulele bacteriene #i eucariotele unicelulare, celulele
organismelor pluricelulare au relativ pu"ine gene reglate reversibil de condi"iile de
mediu;
! Controlul genetic al organismelor pluricelulare este important pentru
dezvoltare #i diferen"iere #i,
! n general, nu este reversibil

n interiorul unei celule bacteriene singulare, genele sunt reversibil induse #i
represate prin control transcrip"ional pentru a ajusta ma#in!ria enzimatic! celular!
mediului nconjur!tor nutri"ional #i fizic. Eucariotele monocelulare, cum sunt
drojdiile, posed! #i ele multe gene care controleaz! r!spunsul la varia"ia mediului
(cum ar fi statusul nutri"ional, tensiunea de oxigen #i temperatura). Chiar n organele
organismelor superioare, de exemplu, ficatul mamiferelor unele gene pot r!spunde
reversibil la stimulii externi cum sunt noxele chimice. Totu#i, n general celulele
eucariotelor pluricelulare sunt protejate de influen"ele externe imediate; adic!
majoritatea celulelor #i desf!#oar! activitatea ntr-un mediu constant. Probabil, din
acest motiv genele care r!spund schimb!rilor de mediu contrituie o frac"ie mult mai
mic! din num!rul celulelor unui organism multicelular dect n organismul unicelular.
Cea mai importanta caracteristic! a controlului genetic la organismele
multicelulare este exactitatea execu"iei deciziei precise de dezvoltare astfel nct gena
necesar! s! fie activat! ntr-o anumit! celul! la un anumit moment din dezvoltarea
organismului care con"ine un num!r mare de tipuri celulare. n majoritatea cazurilor o
dat! ce etapa de dezvoltare a fost dep!#it! de o celul!, ea nu este reversibil!. Astfel,
aceste decizii sunt fundamental diferite de induc"ia sau represia bacterian!. n
executarea programului lor genetic, multe tipuri celulare diferite (ex. celulele din
piele, celulele rosii din snge, celule produc!toare de anticorpi, etc) marcheaz! o cale
c!tre moartea celular! final!. Profilele determinate ale controlului genetic care conduc
la diferen"iere servesc necesit!"ile ntregului organism #i nu supravie"uirii individuale
a celulei.

SLIDE 27 La eucariotele superioare reglarea multor gene se
realizeaz$ prin controlul transcrip%iei
Figura: Determinarea ratei de transcrip#ie a lan#urilor n formare ale unei gene prin
tehnica run-on
Nucleii izola#i au fost incuba"i cu 32P-ribonucleotid trifosfa#i pentru o perioad!
scurt!. n timpul acestei perioade moleculele de ARN polimeraze care transcriu o
gen! cnd nucleii sunt izola#i adaug! 300-500 nucleotide lan#urilor de ARN n
formare. Apar foarte pu#ine reac#ii de ini#iere. Prin hibridizarea ARN marcat cu
ADNc pentru o gen! specific! (A n acest caz), poate fi m!surat! frac#ia de ARN total
produs! de pe aceast! gen! (deci transcrip#ia sa relativ!).
M!sur!torile directe ale ratelor de transcrip"ie ale mai multor gene n diferite
tipuri celulare au ar!tat c! reglarea ini"ierii transcrip"iei este forma universal! a
controlului genetic la eucariote ca #i la bacterii. Cea mai simpl! #i mai direct! metod!
de a m!sura ratele de transcrip"ie este aceea de a expune celulele pentru un timp foarte
scurt (de exemplu 5 minute sau mai pu"in) unui precursor ARN marcat (ribonucleotid)
#i apoi s! se determine cantitatea de ARN nuclear marcat format prin hibridizarea sa
cu un ADN clonat. Aceast! metod! poate fi folosit! pentru a determina ratele de
transcrip"ie n culturile de celule dar nu #i n ntregul organism deoarece cantitatea de
ARN marcat ob"inut este insuficient! pentru m!sur!tori de acurate"e. Chiar #i n
125
celulele cultivate, o a doua metod! numit! analiza produsului n formare(nascent-
chain analysis) sau (run-on analysis) este adesea preferat!. n aceast! metod!,
nucleii sunt izola"i din celule #i permit incorporarea
32
P din ribonucleotid trifosfat n
catenele de ARN n formare. Vitezele relative de transcrip"ie determinate fie prin
marcarea culturilor de celule sau a nucleilor izola"i sunt aproximativ acelea#i,
inbdicnd c! moleculele de polimeraze care sunt active la nivelul nucleilor chiar dac!
sunt scoase din mediul celular.

SLIDE 28. Sinteza diferen%iat$ a 12 molecule ARNm codificate
specific de gene hepatice
Figura: Demonstrac#ie experimental! a sintezei diferen#iale a 12 moleculele de
ARNm care codific! proteine hepatice specifice
Nucleii din ficat, rinichi, celule din creier de "oarece au fost expuse la
32
P-
UTP, "i ARN marcat rezultat a fost hibridizat cu diferite molecule de ADNc fixate pe
nitroceluloz!. Dup! ndep!rtarea ARN nehibridizat, hibrizii au fost eviden#ia#i prin
autoradiografie. Moleculele de ADNc marcate codific! pentru 1-12 proteine
sintetizate activ n ficat (de exemplu 4 = albumin!, 3 = alfa1-antitripsin!, 6 =
transferin!) dar nu n majoritatea celorlalte #esuturi. Celelalte molecule de ADNc
testate au fost actina (A), alfa- "i beta-tubulina ($T "i !T), care sunt proteine ce se
detecteaz! n majoritatea tipurilor celulare. ARNt pentru metionin! "i ADN
plasmidial (pB) n care ADNc au fost clonate au fost folosite drept control.
Intensitatea spoturilor generat! prin hibridizarea ARN sintetizat n timpul
transcrip#iei run-on in vitro izola#i dincele trei #esuturi indic! c! genele care se
exprim! specific n hepatocite sunt transcrise n ficat dar nu sunt transcrise n
celulele altor #esuturi.
Rezultatele analizelor run-on sunt ilustrate n figur! #i demonstreaz! c!
transcrip"ia multor gene care care codific! proteine exprimate specific n hepatocite
(celulele majore ale ficatului mamiferelor) este ntradev!r detectat! #i n nucleii
prepara"i din ficat, dar nu #i n nucleii izola"i din creier #i rinichi. Analiznd
m!sur!torile sintezelor de ARN din timpul doz!rilor run-on , aceste rezultate indic!
c! sintezele diferen"iale ale proteinelor specifice ficatului sunt reglate de factori de
control a transcrip"iei genelor corespunz!toare n diferite "esuturi. Rezultate similare
au fost ob"inute n experimentele run-on realizate pe alte tipuri celulare #i pe o larg!
varietate de proteine "esut-specifice, indicnd c! controlul transcrip"ional este comun
n organismele complexe.

SLIDE 29. Analiza ADN Microarray
Analizele ADN microarray ofer! o vedere global! asupra modific!rilor n procesul
de transcrip#ie, de exemplu, ca urmare a ad!ug!rii de SFV (ser fetal) la celulele
umane n cultur!.
Serul con"ine factori de cre#tere care stimuleaz! celulele n faza sta"ionar!
c!tre cre#tere #i diviziune. Prin analiza ADN microarray se pot detecta factorii de
trasncrip"ie relativi ai genelor n dou! popula"ii celulare n cultur!. Aceast! analiz!
const! n spot-uri foarte fine de ADN ata#ate pe o lam! de microscop sau pe alt
suport. Fiecare spot const! n mai multe copii de secven"e ADN dintr-o singur! gen!
uman!. Se realizeaz! dou! preparate ARN:
i) un preparat de ARN, care con"ine toate tipurile de ARN provenind de la
celulele sta"ionare care au fost cultivate n mediu f!r! ser care este marcat cu
molecule fluorescente verzi;
126
ii) un preparat de ARN care con"ine toate tipurile de ARN de la celulele n
cre#tere #i diviziune cultivate pe mediu cu SFV #i marcate fluorescent n rosu.
Cele doua preparate sunt amestecate #i hibridizate pe lam!, unde acestea se
vor mperechea cu secven"ele genelor lor corespunzatoare. Spoturile verzi (ex. spot 3)
indic! genele care sunt transcrise n celulele nedivizate crescute n lips! de ser.
Spoturile rosii (ex. spot 4) indic! genele care sunt transcrise n celulele n diviziune,
iar spoturile galbene (ex. spot 1 #i 2) indic! genele care sunt transcrise n cele dou!
tipuri celulare (sta"ionare #i n diviziune) [From V. R. Iyer et al., 1999, Science
283:83).

SLIDE 30. Elementele reglatoare la eucariote
! Reprezint! adesea mii de kilobaze n amonte sau n aval de START;
! Principiile de baz! care controleaz! transcrip#ia la bacterii exist! "i la
eucariote: transcrip#ia este ini#iat! la nivelul unei regiuni specifice "i este controlat!
de legarea proteinelor trans-activatoare (factori de transcrip#ie) la secven#ele
cis-activatoare din structura ADN;
! Elementele cis-activatoare sunt adesea mult mai departe de promotorul pe
care l regleaz!, transcrip#ia la nivelul unui singur promotor poate fi reglat! prin
legarea mai multor factori de transcrip#ie la elementele de control alternative;
! Secven#ele care controleaz! transcrip#ia pot fi identificate prin analize de
dele#ie n serie la cap!tul 5.
Genele procariote #i eucariote sunt structurate dup! aceea#i logic! de baz!, dar
cu diferen"e importante n detaliile moleculare. O defini"ie sintetic! a unei gene
eucariote poate fi util! pentru a rezuma esen"a acestor diferen"e. Este general admis c!
o singur! defini"ie dat! genei eucariote nu poate satisface pe toat! lumea sau s!
corespund! la toate exemplele. Cea pe care am adoptat-o este rezultatul structurii
moleculare a genelor care asigur! o gam! larg! de func"iuni n diverse organisme
eucariote. Defini"ia "ine cont de diferen"ele de localizare #i de tipurile de secven"e care
influen"eaz! expresia genelor. Aceasta presupune implicit c! muta"iile fenotipice
observabile sunt rezultatul modific!rilor la nivelul semnalelor de reglare dar #i n
secven"ele codante.
Definim gena ca fiind o combina"ie de segmente de ADN care, mpreun!,
constituie o unitate de expresie, o unitate care determin! formarea unui produs
specific #i func"ional al genei #i care poate s! fie o molecul! de ARN sau un
polipeptid. Segmentele de ADN care definesc gena includ:
1. Unitatea de transcrip#ie care este constituit! dintr-un segment ADN
continuu care codific! pentru secven"a transcriptului primar; acesta include:
a) secven"a codant! a ARN matur sau a proteinei produse,
b) intronii #i
c) secven"ele leader 5 #i coad! 3 prezente la nivelul ARNm matur ca #i
secven"ele de separare care sunt eliminate n timpul matur!rii trannscrip"ilor primari
care codific! pentru ARN.
2. Secven#ele minimale necesare pentru ini"ierea corecte a transcrip"iei
(promotorul) #i pentru a da na#tere extremit!"ii 3 particulare din structura ARN
matur.
3. Elementele secven"ei care determin! frecven"a de ini"iere a transcrip"iei;
acestea cuprind secven"ele responsabile de inducerea #i represia transcri!"iei #i de
specificitatea celular!, tisular! #i temporal! a transcrip"iei. Aceste regiuni sunt foarte
variate structural, ca pozi"ie #i ca func"ie pentru a putea purta un singur nume. Dintre
acestea enumer!m elementele activatoare (enhancers) #i elementele moderatoare
127
(silencers), care sunt secven"e ce influen"eaz! ini"ierea transcrip"iei la distan"!,
independent de localizarea lor n raport cu situsul de ini"iere.
n aceast! defini"ie a genei nu sunt incluse secven"ele ADN care influen"eaz!
configura"ia unei gene n cromatin! #i nici cele care codific! proteine sau ARN care
moduleaz! expresia unei anumite unit!"i de transcrip"ie.
ntr-o reprezentare grafica, nceputul genei este n stnga #i cap!tul n dreapta,
n acord cu conven"ia general! admis! de reprezentare a transcrip"iei. Aceasta
semnific! c! bra"ul de ADN care are aceea#i structur! cu ARN transcris, este bra"ul
sens 5-3 orientat de la stnga la dreapta #i este n general reprezentat ca bra"ul
superior. Matricea de transcrip"ie, catena antisens este orientat! 3-5 de la stnga la
dreapta (bra"ul inferior). Pentru a u#ura schemele, catena sens este adesea singura
reprezentat!. Pozi"ia primei nucleotide n molecula transcript este notat! +1, iar
nucleotidele situate n aval n unitatea de transcrip"ie sunt numerotate pozitiv (ex.
+16). Nucleotidele care sunt n amont de +1 (secven"! netranscris!) sunt desemnate
cu numere negative (ex. -25).
O modalitate u#oar! de a examina rela"ia care exist! ntre noile caracteristici
structurale ale genelor eucariote #i expresia #i reglarea lor const! n a pleca de la
exemple de gene reprezentative n contextul ARN polimerazei care ini"iaz! expresia
acestora. Astfel, vor fi discutate pe rnd caracteristicile structurale ale genelor de
clas! I, clas! II #i clas! III; caracteristicilor ARN polimerazelor respective;
mecanismele de reglare a transcrip"iei. Maturarea transcrip"ilor primari ARN, n
particular mecanismul procesului de excizie-episaj care determin! producerea ARNm,
ARNr #i ARNt. ntr-o alt! sec"iune vor fi examinate motivele structurale care permit
factorilor de transcrip"ie proteici s! interac"ioneze cu secven"e specifice din structura
ADN #i ntre ei. Capitolul se va termina cu examinarea mecanismelor cele mai
generale de reglare, #i anime cele care influen"eaz! rennoirea ARNm, #i a modului n
care blocuri mari de gene sunt reglate prin modificarea ADN sau a cromatinei n care
genele sunt mpachetate.

SLIDE 31. Secven%ele promotoare ale mai multor gene structurale
eucariote
Figura: Secven#ele promotoare ale unor gene eucariote. Segmentul omolog, TATA
box, este colorat n ro"u "i prezint! propor#iile diferitelor baze precunm "i secven#a
consens cea mai probabil!.
Informatii suplimentare
Fenotipul unui organism sau a unei celule diferen"iate este, n mare m!sur!,
determinat de cantitatea #i de varietatea proteinelor pe care acesta (aceasta) le con"ine.
Acest lucru reflect!, n general, concentra"ia #i natura ARNm sintetizate. Principalul
mecanism responsabil de diferitele fenotipuri este deci expresia diferen"iat! a genelor
din clasa II. Aceast! rela"ie fundamental! ntre expresia genelor #i fenotip a fost
stabilit! prin m!sur!tori comparative ale cantit!"ii proteinelor #i ale cantit!"ii ARNm
n diferite stadii ale dezvolt!rii unui organism n diverse "esuturi diferen"iate ale
aceluia#i organism #i chiar n celule identice aflate n stadii fiziologice diferite.
n principiu, dar #i n realitate, reglarea expresiei unei gene poate s! intervin!
n orice etap! a biogenezei ARNm sau la traducerea acestuia n protein!. O serie de
experimente indic! c! determinantul esen"ial al nivelului ARNm este ini"ierea
transcrip"iei. Acest proces este reglat n principal prin interac"ia elementelor secven"ei
(elementele cis) prezente la nivelul situsului de ini"iere sau la distan"e variabile de
acesta, cu o colec"ie de proteine specifice (factori de transcrip"ie care ac#ioneaz$ n
trans) dintre care cea mai mare parte recunosc secven"e particulare de ADN. Astfel,
128
att reglarea temporal! a transcrip"iei ct #i reglarea sa specific! n func"ie de "esut
sunt determinate de prezen"a #i cantitatea diferi"ilor factori care ac"ioneaz! n trans.
Viteza #i natura procesului de excizie-episaj a pre-ARNm reprezint! cel de al doilea
mecanism important care contribuie la reglarea nivelului ARNm. Degradarea
diferen"ial! a moleculelor ARNm influen"eaz! #i ea expresia anumitor gene.
Transportul moleculelor de ARNm din nucleu c!tre citoplasm! poate s! participe #i el
la controlul expresiei genelor ce codific! pentru proteine, cu toate pn! n prezent
exist! destul de pu"ine date care s! sus"in! aceast! ipotez!. n plus, chiar traducerea
ARNm poate fi reglat! n acest sens existnd multe date probatorii. Degradarea
selectiv! a proteinelor contribuie #i ea la reglarea nivelului lor, dar importan"a acestui
proces nu este nc! clarificat!. Dac! propor"ia de re-nnoire a unei proteine
influen"eaz! echilibrul concentra"iei unui component critic al ma#in!riei de traducere,
de exemplu un factor care ac"ioneaz! n trans, influen"a sa poate fi mare asupra
sintezei moleculelor de ARNm.

SLIDE 32. Construc%ia &i analiza dele%iilor seriate n 5
Figura: Construc#ia "i analiza dele#iilor 5 seriate pentru a localiza secven#ele de
control a transcrip#iei situate n amonte de genele eucariote
Un fragment de ADN (galben) care con"ine o regiune start a transcrip"iei este
clonat! ntr-un vector plasmidial (upper-left). Plasmida este linearizat! prin digestia
cu o enzim! de restric"ie (A) care scindeaz! la cap!tul din amonte a fragmentului
linearizat. ADN linearizat este apoi digerat cu o exonucleaz! pentru diferite perioade
de timp, astfel nct lungimi diferite de ADN sunt nl!turate de la fiecare cap!t. Dup!
ad!ugarea unui linker oligonucleotidic #i digestia cu cu enzimele de restric"ie B #i C,
fragmentele nl!turate sunt clonate ntr-un vector plasmidial care con"ine o gen!
raportor slab! (albastru deschis). Plasmidele prezentnd fragmente de lungimi diferite
ale regiunii din amonte (regiunea din 5 ale situsul de demarare a transcrip"iei) sunt
apoi transfectate n culturi de celule (sau folosite la realizarea de animale transgenice)
#i este determinat! expresia genei raportor. Rezultatele acestui exemplu ipotetic indic!
c! fragmentele testate con"in dou! elemente de control. Cap!tul 5 al uneia este
cuprins ntre dele"iile 2 #i 3; cap!tul 5 al celeilalte este corelat cu dele"iile 4 #i 5.


SLIDE 33. Sinteza moleculelor de ARN este catalizat! de 3 polimeraze
Figura: Separararea "i identificarea celor trei ARN polimeraze de la eucariote prin
cromatografie pe coloan!.
Un extract proteic din nuclei celulelor de broasc! a fost trecut pe o coloan! de
DEAE Sephadex pe care proteinele nc!rcate se absorb diferit. Proteinele absorbite
sunt eluate (curba albastr!) cu o solu"ie cu concentra"ie de NaCl crescnd!. Frac"iile
care con"in proteinele eluate sunt testate pentru capacitatea lor de a realiza transcrip"ia
ADN (Curba ro#ie) n prezen"a a patru ribonucleotid-trifosfa"i. A fost m!surat! #i
sinteza ARN de c!tre fiecare frac"ie n prezen"a a 1microgram/ml de alfa-amanitin!
(curba bleu). La aceast! concentra"ie alfa-amanitina inhib! activitatea polimerazei
Iidar nu afecteaz! pe cea a polimerazelor I #i III (Polimeraza III este sensibil! la 10
micrograme/ml de alfa-amanitin! n timp ce polimeraza I este neafectat! chiar #i la
concentra"ii mai mari) .
Informa#ii suplimentare
Transcrip"ia genelor din clasa I este realizat! de ARN polimeraza I #i
reprezint! jum!tate din activitatea de transcrip"ie pentru majoritatea celulelor
eucariote. Singurul produs al acestei transcrip"ii este un precursor de ARN ribozomic
129
(pre-ARNr), care este transformat prin clivare secven"ial! pentru a forma speciile de
ARNr 5,8S, 18S #i 28S (cel de al patrule tip de ARNr 5S este codificat de c!tre o gen!
din clasa III). Num!rul de gene care codific! pentru ARNr variaz! de la o sut! la mai
multe mii, n func"ie de specie. Acestea sunt localizate pe unul sau pe mai mul"i
cromozomi specifici, n regiuni morfologice distincte numite organizatori
nucleolari. n timpul interfazei, aceste regiuni sunt ncorporate n nucleol, structur!
n care moleculele de ARNr sunt transcrise activ, se transform! pre-ARNr #i se
asambleaz! ribozomii.
ARN polimerazele au fost purificate dintr-o mare varietate de celule utiliznd
metode clasice de separare a proteinelor. Contrar ARN polimerazelor II #i III
localizate n nucleoplasm!, ARN polimeraza I este asociat! nucleolului #i poate fi
izolat! de nucleosol. Numai ARN polimeraza I catalizeaz! transcrip"ia grupului de
gene ARNr. Specificitatea ARN polimerazei I pentru genele ARNr este sugerat! de
insensibilitatea sintezei ARNr #i de rezisten"a polimerazei I la !-amanitin!.
Caracteristicile moleculelor ARN de clas! II
Gene din clasa II codific! pentru toate moleculele de ARNm citoplasmatic
moleculele ARN U din snRNP (small nuclear ribonucleoproteine), cu excep"ia U6.
Moleculele transcript ale genelor din clasa II posed! modific!ri caracteristice la
extremitatea 5 (coif): 7-metil guanozin! pentru ARNm #i 2, 2, 7- trimetil guanozin!
pentru ARN U. n ambele cazuri, guanozina metilat! a coifului este legat! de primul
nucleotid transcris printr-o leg!tur! trifosfat cu nucleotidele din pozi"iile lor 5.
Aproape toate moleculele de ARNm posed! #i o coad! poliadenilat! (poli A)
caracteristic! care debuteaz! la distan"e diferite dincolo de sfr#itul regiunii codante;
coada poli A nu este codificat! de gena care a determinat ob"inerea transcriptului ci
este ad!ugat! n urma unei reac"ii post-transcrip"ionale. La drojdii #i alte eucariote
inferioare lungimea cozii poli A este de ordinul a 75 la 185 resturi. Moleculele de
ARNm nuclear de la majoritatea vertebratelor au o coad! poli A de 200 la 300
nucleotide, dar extensia poli A a moleculelor ARNm citoplasmatice este mai scurt! #i
caracteristic! fiec!rui tip de ARNm n parte. Din contr!, multe molecule de ARNm
care codific! histone sau ARN U sunt lipsite de aceast! coad!. Anumite molecule
ARNm con"in adenin N6-metilate #i toate moleculele ARN U au caracteristic un
num!r mare de resturi uracil modificate. Aceste modific!ri sunt probabil realizate n
timpul sau dup! transcrip"ie, func"iile lor fiziologice fiind necunoscute.
Cu excep"ia unor cazuri foarte rare, moleculele ARNm #i ARN U deriv! din
transcrip"i primari ale c!ror secven"e sunt colineare pe ntreaga lungime cu ADN de
pe care au fost transcrise. n afar! de coif #i clivarea extremit!"ii 3 nainte de
poliadenilare, principala etap! de maturare necesar! form!rii unei noi molecule de
ARNm func"ional! este excizia-episajul (splicing). Cu toate c! absen"a intronilor n
pre-ARN U face aceast! opera"ie inutil!, moleculele transcript primar necesit!
clivarea endo #i exonucleotidic! pentru formare extremit!"ilor 3 mature.
Moleculele de ARN transcrise de pe structura genelor din clasa III nu codific!
proteine. De fapt, produ#ii acestora sunt molecule mici de ARN implicate n sinteza
proteinelor (ARNt #i ARNr 5S), n transportul intercelular al proteinelor (ARN 7 SL)
#i n maturarea post-transcrip"ional! (ARN U6). Genele din clasa III codific! #i multe
alte molecule de ARN al c!ror rol fiziologic este necunoscut (ARN 7SK, ARN Alu).
Genoamele adenovirusurilor posed! dou! gene de clas! III, VA1 #i VA2, ai c!ror
produ#i de transcrip"ie (de 157 #i 140 nucleotide) deturneaz! ma#in!ria de transcrip"ie
a celulei infectate f!cnd-o mai eficace pentru sinteza proteinelor necesare structurii
virale. Dou! molecule mici de ARN, EBER I #i EBER II (166 #i 172 nucleotide) sunt
#i ele produse de gene din clasa III ale genomului virusului Epstein-Barr.
130
Genele din clasa III sunt repartizate n dou! grupe. n prima, care codific!
pentru ARN 5S #i ARN 7SL, 7SK, U6 #i VA, transcrip"ii primari au aceea#i lungime
cu moleculele ARN func"ionale; nu exist! deci maturare a acestor transcrip"i.
Trifosfatul din pozi"ia 5 rezultat n urma ini"ieri transcrip"iei reprezint! extremitatea
5 #i ultimul rest care este transcris corespunde extremit!"ii 3 a ARN matur. Genele
clasei III din a doua grup! codific! pentru moleculele ARNt ale c!ror forme mature
sunt produse prin eliminarea extremit!"ilor 5 #i 3 ale transcrip"ilor primari de c!tre
endonucleaze specifice. Secven"a -CCA 3 terminal!, necesar! func"ion!rii tuturor
ARNt nu este codificat! de c!tre gen! #i este ad!ugat! de o enzim! particular!.
Deoarece anumite gene care codific! ARNt con"in introni este necesar procesul de
maturare (excizie/episaj) pentru producerea moleculelor ARNt mature.

SLIDE 34. Structura ARN polimerazelor eucariote determinat$
prin cristalografie electronic$
Figura: Structurile ARN polimerazelor eucariote determinate prin cristalografie
electronic!.
a) ARN polimeraza II de la drojdii la o rezolu#ie de aproximativ 16 A. Proteina
are aprox 140x136x110 A.
b) Este ARN polimeraza I de la drojdii la o rezolu#ie de aprox 30 A. Proteina
are aproximativ 150x110x110 A.

SLIDE 35. Compara%ie: subunit$%ile structurale ale ARN
polimerazei de la drojdii &i E. coli RNA
Figura: Reprezentare schematic! a subunit!#ilor structurale ale ARN polimerazelor
de la drojdii n compara#ie cu ARN polimeraza de la E. coli.
Toate trei polimerazele de la drojdii prezint! patru subunit!"i centrale (core)
care exprim! aceea#i omologie cu subunit!"ile beta, beta #i subunit!"ile alfa de la E.
coli. Cea mai mare subunitate (L) de la ARN polimeraza II con"ine #i domeniul C
terminal (CTD). ARN polimeraza I #i III con"ine acelea#i dou! subunit!"i like-alfa
neidentice, n timp ce ARN polimeraza II are dou! copii a unei subunit!"i diferite like-
alfa. Toate trei polimerazele prezint! alte cinci subunit!"i comune (dou! copii ale celei
mai mari dintre acestea). n plus, fiecare polimeraz! din drojdie con"ine de la 4 la 7
subunit!"i mici unice.
Informa#ii suplimentare
ARN polimeraza II
Genele din clasa II sunt transcrise n nucleu de c!tre ARN polimeraza II.
Enzima a fost izolat! de la numeroase organisme printre care drojdiile, Physarum,
Aspergilius, Acathamoeba, vegetale superioare insecte, Xenopus #i mamifere.
Compozi"ia n subunit!"i a enzimelor din diferite organisme este foarte asem!n!toare
#i adesea de ne-departajat pe baza unor criterii fizice. Un num!r de nou! sau zece
subunit!"i pare s! fie o regul!. Toate enzimele analizate con"in dou! subunit!"i mari.
Una, de aproximativ 220 kD, este cea mai mare polipeptid! pe care o reg!sim n
structura celor trei tipuri de ARN polimeraze; alta de aproximativ 140 kD. Trei
subunit!"i mici ale ARN polimeraza II sunt comune cu ARN polimeraza I #i II;
celelalte patru sau cinci subunit!"i sunt specifice enzimei. Existen"a unei similitudini
structurale #i chimice ntre cele dou! subunit!"i mari la cele trei ARN polimeraze
eucariote a fost ini"ial suspectat! datorit! reac"iilor imunologice ncruci#ate pe care
acestea le d!deau #i datorit! existen"ei unor peptide comune: aceast! asem!nare este
acum confirmat! prin compararea secven"elor genelor clonate. n plus, cele dou!
131
subunit!"i mari ale fiec!reia dintre cele trei polimeraze eucariote posed! secven"e n
aminoacizi cu un nalt grad de asem!nare cu secven"ele subunit!"ilor mari ale ARN
polimerazei de la E. coli.
Dintre cele trei ARN polimeraze, ARN polimeraza II este cea mai sensibil! la
!-amanitin!. Toxina permite ini"ierea lan"ului de ARN dar blocheaz! elongarea
acestuia. Situsul de ac"iune al !-amanitinei pare s! fie situat la nivelul subunit!"ii
celei mai mari. La Drosophila #i la S. cerevisiae muta"iile care confer! rezisten"a la
amanitin! sunt localizate n gena care codific! pentru subunitatea de 220 kD. Aceast!
subunitate mare este #i subiectul reac"iilor de fosforilare #i defosforilare la nivelul mai
multor situsuri. Forma nalt fosforilat!, g!sit! in vivo, atunci cnd activitatea de
transcrip"ie este important!, este considerabil mai activ! dect enzima defosforilat!
din vitro, cel pu"in n prezen"a promotorului regiunii tardive din adenovirus.
Domeniul carboxi-terminal al subunit!"ii celei mai mari a ARN polimerazei II
de la drojdii, de la Drosophila #i de la mamifere con"ine multiple repeti"ii n tandem
ale hexapeptidului Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Num!rul acestor copii este 26 la
drojdie la 52 la #oarece. Aceast! secven"! repetitiv! este unic! #i esen"ial! pentru
activitatea enzimei. Modificarea acestei regiuni n gena de drojdie demonstreaz! c!
subunit!"ile care con"ine mai pu"in de 13 la 13 copii nu sunt func"ionale in vivo.
Serinele #i treoninele, abundente n aceast! regiune, pot fi situsurile de fosforilare
men"ionate mai sus, dar rolul precis al acestui heptamer nu este deplin elucidat.

SLIDE 36. Cea mai mare subunitate a ARN polimerazei II con%ine o
repeti%ie esen%ial$ carboxi-terminal$ care este fosforilat$ n timpul
transcrip%iei
Figura: Demonstra#ia experimental! c! domeniul carboxi-terminal (CTD) al ARN
polimerazei II este fosforilat n timpul transcrip#iei n vivo.
Cromozomii politeni de la nivelul glandelor salivare au fost preparati din
larvele de Drosophila chiar nainte de n!prlire. Preparatul a fost tratat cu un anticorp
de #oarece pentru regiunea CTD fosforilat! #i cu un anticorp de capr! pentru regiunea
CTD nefosforilat!. Preparatul a fost apoi colorat cu un anticorp anti-capr! marcat
fluorescent cu fluorescein! (verde) #i cu un anticorp anti-#oarece marcat fluorescent
cu rodamin! (ro#u). Moleculele de polimeraze care prezint! regiuni CTD nefosforilate
vor fi colorate n verde iar cele care prezint! regiuni CTD fosforilate n ro#u.
Hormonul de n!prlire ecdizona induce rate nalte ale transcrip"iei n regiunile
bufante74EF #i 75B; de re"inut c! n aceaste regiuni sunt prezente numai CTD
fosforilate. Regiunile bufante mici transcrise la rate mari sunt vizibile. Situsurile ne-
bufante care sunt colorate n ro#u (s!geata n sus) sau verde (sageata orizontal!), ca #i
siturile colorate att n ro#u #i verde, care produc o culoare galben! (s!geata n jos).
Informa#ii suplimentare
Factorii de transcrip#ie
ARN polimeraza II, ca #i celelalte ARN polimeraze necesit! o serie de
proteine adi"ionale pentru a forma un complex de transcrip"ie func"ional. Multe sunt
proteine care se fixeaz! pe ADN #i recunosc una sau mai multe secven"e care, par s!
constituie promotorul genei. Anumi"i factori de transcrip"ie reac"ioneaz! prin
intermediul interac"iilor protein!-protein! sau cu al"i factori #i s! modifice astfel
specificitatea #i afinitatea acestora. Prin interac"ii mutuale sau cu diferite secven"e de
ADN, diferi"ii factori de transcrip"ie formeaz! ansamble proteice complexe care
regleaz! capacitatea ARN polimerazei II de a ini"ia transcrip"ia. Cea mai mare parte a
complexelor reac"ioneaz! pozitiv crescnd frecven"a ini"ierilor, dar sunt cunoscute #i
132
altele care ac"ioneaz! negativ fiind deci represori. Exist! chiar #i factori care
stimuleaz! transcrip"ia unei gene dar inhib! pe cea a alteia. Mul"i dintre ace#ti factori
sunt specifici unui "esut sau unor celule #i nu reac"ioneaz! dect n anumite stadii de
dezvoltare; acest lucru permite genelor s! fie transcrise diferit n func"ie de "esut sau
de moment (timp). ntr-un anumit sens, ARN polimeraza reprezint! ma#in!ria de
transcrip"ie, iar interac"iile factorilor cu semnalele de reglare de pe ADN sau ntre ei,
determin! unde, cnd #i cu ce vitez! va func"iona aceast! ma#in!rie.
Num!rul de factori proteici care ac"ionnd n trans sunt implica"i n sistemele
de transcrip"ie utilizare de ARN polimeraza II este mereu n cre#tere cu toate c! nu
to"i au fost foarte bine caracteriza"i. Rolul unui factor este n func"ie de tipurile de
aranjamente ale secven"elor de ADN, elementele cis care constituie regiunea de
reglare a unei gene. Complexitatea lor este att de mare nct anumi"i factori se leag!
la mai mult de o secven"! de ADN #i anumite secven"e de ADN reprezint! situsuri de
fixare pentru mai multe tipuri de factori. n plus, anumite motive organizate n tandem
se suprapun (se ncalec!) crend adesea situsuri de leg!tur! suplimentare absente n
motivele individuale unde favorizeaz! fixarea unui factor sau a altuia. Complexitatea
acestor interac"iuni, ct #i num!rul mare de detalii ne-explicate, fac, n momentul de
fa"!, imposibil! o descriere de ansamblu a acestui domeniu important. n plus, exist!
nc! nomenclaturi diferite #i adesea f!r! raport care au fost folosite pentru a desemna
factorii de transcrip"ie. Acestea sunt, n general, bazate pe originea , tisular! sau
celular!, pe o caracteristic! a situsului de legare sau rezult! pur #i simplu dintr-o
alegere a aleatoare a autorului.

SLIDE 37. Analiza transcrip%ilor marca%i n formare permite cartarea
situsului de ini%iere a transcrip%iei
Figura: Cartarea aproximativ! a situsului de ini#iere a transcrip#iei prin analiza
transcrip#ilor n formare sintetiza#i in vivo.
O sec"iune de ADN care este n curs de transcriere este eviden"iat! n imagine.
Dup! ce celulele sunt marcate pentru timp scurt, producnd molecule de ARN n
formare, celulele sunt rupte #i moleculele de ARN izolate sunt separate pe baza
m!rimii lan"urilor estimat! prin centrifugare n gradient de densitate. Frac"iile de
diferite m!rimi sunt apoi hibridizate cu fragmentele de restric"ie prezentate n
diagrama de sus (de la A la E). Cei mai scur"i ARN marca"i vor hibridiza ci
fragmentul de restric"ie B care con"ine situsul de ini"iere; nucleotidul exact la care
ncepe transcrip"ia nu poate fi determinat. Succesiv moleculele de ARN mai lungi vor
hibridiza cu fragmente din aval fa"! de situsul de ini"iere. Cel mai lung ARN
hibridizeaz! cu fragmentul D care con"ine #i situsul de terminare.

SLIDE 38. ARN polimeraza II ini%iaz$ transcrip%ia secven%elor ADN
corespunt$toare cap$tului 5& al ARNm
Figura: Cartarea precis! a situsului de ini#iere a unit!#ii de transcrip#ie trzii a
adenovirusului prin transcrip#ie in vitro
Stnga: Liniile du sus arat! situsurile de restric#ie ale HindIII (cu negru),
XmaIII (albastru) "i SmaI (ro"u) din regiunea genomului adenovirusului unde a fost
localizat situsul de ini#iere a transcrip#iei prin analiza transcrip#ilor n formare
(aproximativ 16 unit!#i cartate). Fragmentele de restric#ie HindIII, XmaIII "i SmaI
care com#in situsurile de ini#iere au fost incubate individual cu un extract nuclear
preparat din celule HeLa "i ribonucleotid trifosfa#i marca#i cu alfa-32P. Transcrip#ia
fiec!rui fragment ncepe la situsul de start: cnd o molecul! de ARN polimeraza II
133
care transcrie un fragment ajunge la cap!tul t!iat, "i p!r!se"te matri#a (run-off
remplate).
Dreapta: Transcriptul rezultat este apoi supus electroforezei n gel "i
autoradiografiei. Dac! sunt cunoscute pozi#iile situsurilor de restric#ie de pe ADN
matri#!, lungimea transcrip#ilor run-off (n nucleotide, nt) a fragmentelor produse
de SmaI (linia 1). XmaIII (linia 2) "i HinIII (linia 3) carteaz! precis situsul de start la
16,4 unit!#i de cartare pe genomul adenovirusului. Secven#ele acestei regiuni a
adenovirusului ADN "i a cap!tului 5 al ARNm corespunz!tor "i a transcrip#ilor ARN
produ"i in vitro sunt prezenta#i n partea stng! jos. Astfel punctul de start pentru
transcrip#ia in vitro realizat! de c!tre ARN polimeraza II corespunde situsului cap
al ARNm. Proba din linia 1a este aceea"i cu cea din linia 1, cu excep#ia prezen#ei
alfa-amanitinei, ca inhibitor al polimerazei II, care a fost inclus n amestecul de
transcrip#ie. Benzile din partea superioar! "i inferioar! agelului reprezint!
moleculele cu mase moleculare ale transcrip#ilor mari "i mici care se formeaz! n
condi#ile acestui experiment.

SLIDE 39. Concluzii
Principalul scop al controlului genetic n organismele multicelulare este
realizarea deciziilor precise de dezvoltare astfel nct gene particulare sunt exprimate
n celule particulare n timpul dezvolt!rii #i diferen"ierii celulare;
Controlul transcrip"ional este principalul sens al regl!rii expresiei genice att
la eucariote ct #i la procariote;
n genoamele eucariote, elementele de control care ac"ioneaz! n cis #i care
regleaz! expresia de la nivelul promotorului sunt adesea localizate la multe kb
dep!rtare de situsul de start. n contrast, elementele de control bacterian sunt dispuse,
n general, pe o distan"! de 60 pb fa"! de promotorul pe care ace#tia l regleaz!;
Eucariotele con"in trei tipuri de ARN polimeraze nucleare. Toate trei con"in
dou! subunit!"i mari #i dou! subunit!"i mici care constituie structura central! omolog!
cu subunit!"ile ", " #i ! ale ARN polimerazei de la E. Coli, ct #i numeroase
subunit!"i mai mici adi"ionale. Unele dintre aceste subunit!"i mici sunt comune iar
altele sunt unice pentru fiecare polimeraz!;
ARN polimeraza I sintetizeaz! numai pre-ARNr, ARN polimeraza II
sintetizeaz! ARNm #i unele molecule mici de ARN nuclear care particip! la
splicingul ARNm iar ARN polimeraza III sintetizeaz! ARNt, ARNr 5S #i multe alte
molecule relativ scurte #i stabile de ARN.
O secven"! heptapeptidic!, domeniul carboxi-terminal (CTD), din subunitatea
cea mai mare a ARN polimerazei II este fosforilat! n timpul ini"ierii #i r!mne
fosforilat! ct timp enzima transcrie matri"a;
Similar! cu ARN polimerazele bacteriene, ARN polimeraza II ini"iaz!, de
obicei, transcrip"ia genelor la nivelul unor perechi de baze specifice sau baze vecine
alternative din ADN matri"!. Nucleotidul din 5 c!ruia i se adaug! capi#onul la nivelul
ARNm corespunde nucleotidului de pe catena matri"! la care transcrip"ia este ini"iat!.

SLIDE 40. TATA box este cel mai bine conservat promotor la eucariote
Figura: Compara#ii ale secven#elor nucleotidice situate n amonte de situsul de start
la 60 de gene care codific! pentru proteine diferite de la vertebrate
Fiecare secven"! a fost aliniat! pentru a maximiza omologia regiunii 35 la
20. Numerele introduse n tabel reprezint! frecven"a fiec!rei baze la fiecare pozi"ie.
Omologie maxim! apare pentru o regiune de 6 baze, care se refer! la TATA box #i a
134
c!rei secven"! este prezentat! n partea de jos. Baza ini"ial! cea mai frecvent! din
ARNm codificat de genele care con"in o TATA box este A.

SLIDE 41. Identificarea elementelor de control transcrip%ional cu
linker mutants
Figura: Analize de scanare muta#ional! care identific! elementele de control-
transcrip#ional.
O regiune de ADN eucariot (galben) care sus#ine nivele de expresie crescute
ale unei gene raportor (albastru deschis) este clonat! ntr-un vector plasmidial
ob#inndu-se un num!r de clone. Muta#ii pozi#ionate la nivelul regiunii de control n
diferite regiuni sunt introduse de la un cap!t la altul al fragmentului. Aceste muta#ii
sunt rezultatul nl!tur!rii aleatroare a unei scurte secven#e din ADN. Plasmidele
mutante sunt transfectate separat n celule !n cultur! "i este determinat! activitatea
genei raportoare. n exemplul ipotetic muat#iile LS (linker scaning) 1,4,6, 7 "i 9 nu au
efect sau au efect slab asupra expresiei genei raportor, indicnd c! regiunile afectate
n ace"ti mutan#i nu con#in elemente de control. Exprfesia genei raportor este
semnificativ afectat! pentru mutan#ii 2, 3, 5, "i 8 indicnd c! elementele control (in
maron) sdunt situate n pozi#iile indicate n partea inferioar! a figurii.

SLIDE 42. Elementele din proximitatea promotorului pot interveni n
reglarea genelor eucariote
Figura: Identificarea elementelor din proximitatea promotorului care controleaz!
gena timidin-kinazei (tk) sin virusul herpex simplex (HSV) prin analiza LS (linker
scaning) a muta#iilor.
a) O serie de contruc#ii ADN a fost preparat!, n fiecare construc#ie o regiune
de aproximativ 10 pb situat! n amonte de situsul start al genei tk este mutant! prin
nlocuirea cu un linker sintetic care con#ine un situs de restric#ie. Fiecare construc#ie
a fost co-injectat! cu o gen! tk pseudo-s!lbatic! n ovocitele de Xenopus Laevis n
care gena tk a HSV este transcris! cu o frecven#! ridicat!. Dup! 24 de ore, a fost
izolat ARN "i dozat prin metoda de extinc#ie a primerului folosind un primer ARN
marcat (ro"u deschis) complementar cu o scurt! sec#iune a ARNm pentru tk. Gena
pseodo-s!lbatec!, care posed! o dele#ie de 10 pb, serve"te drept control intern a
activit!#ii transcrip#ionale a ovocitelor injectate "i a recuper!rii ARN.
b) Produ"ii de extindere a primerilor au fost analiza#i prin gel electroforez! "i
autoradiografie. Dozarea ARN produs! de muta#"ii LS (linker scaning) conduce la
dou! tipuri principale de produ"i: unul con#ine 90 de nucleotide corespunt!toare
extensiei tuturor ncepnd de la cap!tul 5 al ARN; cel de al doilea este mult mai mic
datorit! incompletei extensii. Determinarea ARN transcris de la nivelul genei pseudo-
salbatice conduce "i ea la doi produ"i: unul lung de 80 de nucleotide "i altul mult
mai scurt. Benzile marcate ale fiec!rui mutant linker scaning sunt comparate cu
cele ale genei pseudo-salbatice injectate n acela"i ovocit (benzile sub#iri de fond sunt
ignorate). Mutan#ii LS sunt numi#i prin intervalul din amonte la nivelul c!ruia
secven#a s!lbatec! din amonte a tk este mutat!. De re#inut c! densitatea
descresc!toare a benzilor indic! descre"terea transcrip#iei tk, pentru moleculele de
ADN LS mutante marcate n ro"u.
c) Pe baza rezultatelor au fost cartate elementele din regiunea proximal!
promotorului (in maron) genei tk.

135
SLIDE 43. Transcrip%ia catalizat$ de ARN polimeraza II este adesea
stimulat$ de secven%e enhancer dep$rtate
Figura: Identificarea regiunii enhancer a SV40.
Au fost construite plasmide con#innd gena beta-globinei cu sau f!r! prezen#a
unui fragment de 366 pb provenind de la SV40. Fiecare plasmid! a fost transfectat!
separat n fibroblaste n cultur!, care n mod normal nu exprim! beta-globin! (etapa
1). Cantitatea de ARNm pentru beta-globin! sintetizat! de celulele transfectate a fost
determinat! prin metoda de protec#ie cu nucleaz! S1. Sonda folosit! n aceast!
determinare a fost un fragment de restric#ie, generat din ADNc pentru beta-globin!,
complementar cu cap!tul 5 al ARNm pentru beta-globin! (etapa 2). Cap!tul 5 al
sondei a fost marcat cu 32P (punctele ro"ii). Cnd ARNm pentru beta-globin! a fost
hibridizat cu sonda, un fragment de aproximativ 340 nucleotide din sond! a fost
protejat de digestia cu nucleaz! S1 (etapa 3). Autoradiografia fragmentelor protejate
de S1 (etapa 4) eviden#iaz! c! celulele transfectate cu plasmida 1 (linia 1) produc
mai mult ARNm pentru beta-globin! dect cele transfectate cu plasmida 2 (linia 2).
Linia C reprezint! controlul ARNm pentru beta-globin! izolat din reticulocite care
sintetizeaz! activ beta-globin!. Aceste rezultate demonstreaz! c! fragmentul de ADN
pentru SV40 con#ine un element, numit enhancer (activator) care stimuleaz! mult
sinteza ARNm al beta-globinei.

SLIDE 44. Majoritatea genelor eucariote sunt reglate prin mai multe
mecanisme de control
Figura: Comportamentul general al elementelor de control care ac#ioneaz! n cis
pentru reglarea expresiei genelor la drojdii "i la orgamismele multicelulare
(nevertebrate, vertebrate "i plante).
a) Genele organismelor multicelulare con#in att elementele proximale
promotorului "i enhancerii (activatorii) ct "i TATA box sau alte elemente
promotoare. Ultimile pozi#ioneaz! ARN polimeraza II pentru a ini#ia transcrip#ia la
situsul de start "i influen#eaz! rata transcrip#iei. Activatorii pot fi pozi#iona#i fie n
amonte fie n aval "i la o distan#! de aproximativ 50 kb fa#! de situsul de start al
transcrip#iei. n unele cazuri, elementele din proximitatea promotorului apar la fel de
bine "i n aval de situsul de start al transcrip#iei.
b) majoritatea genelor de drojdii con#in numai o regiune reglatoare, numit!
secven#a activatoare n amonte (Upstream Activating Sequence-UAS) "i o TATA
box, care este de aproximativ 90 pb n amonte de situsul de start.

SLIDE 45. Concluzii
Expresia genelor eucariote care codific! pentru proteine este reglat! prin
interven"ia unor elemente multiple care ac"ioneaz! sub forma unor regiuni de control
n cis. Unele elemente de control sunt localizate n apropierea situsului de start
(elemente din proximitatea promotorului), n timp ce altele sunt localizate la distan"!
(activatori sau enhanceri);
Promotorii determin! situsul de ini"iere a transcrip"iei #i legarea direct! a ARN
polimerazei II. Au fost identificate trei tipuri de secven"e promotor pentru ADN de la
eucariote. TATA box, tipul cel mai comun este dominant pentru genele transcrise
rapid. Promotorii de tip ini"iator sunt reprezenta"i cu o frecven"! sc!zut! n anumite
gene n timp ce insulele CpG sunt caracteristice genelor transcrise;
136
Elementele din proximitatea promotorului sunt localizate ntr-un interval de
200 pb fa"! de situsul de start. Multe astfel de elemente, con"innd mai pu"in de 20 pb,
pot fi utile n reglarea unei gene particulare;
Activatorii, care au de obicei o lungime de aproximativ 100-200 pb, con"in
mai multe elemente control de 8 la 20 pb. Acestea pot fi localizate de la 200 pb la 10
kb n amonte sau n aval de promoter, n interiorul unui intron, sau n aval de exonul
final al genei;
Elementele din proximitatea promotorului #i activatorii sunt adesea specifici
unui tip celular, func"ionnd numai tipuri celulare diferen"iate specific.

SLIDE 46. Factoriii implica%i n transcrip%ie sunt identifica%i prin
tehnici biochimice
Figura: Purificarea factorilor de transcrip#ie
a) Mai multe etape cromatografice sunt folosite pentru purificarea unui factor de
transcrip"ie (protein! inrudit!, asem!n!toare, similar!) care se leag! specific la un
element reglator din structura ADN. Purificarea final! este ob"inut! prin
cromatografie de afinitate pe o coloan! care este cuplat! cu cu catene lungi de ADN
care con"in mai multe copii al situsului de legare a factorului proteic. Un preparat
proteic partial-purificat care con"ine factorul de transcrip"ie este aplicat pe o coloan!
cu o t!rie ionic! sc!zut! (100 mM KCl). Proteinele care nu se leag! deloc la situsurile
specifice vor fi eluate cu tampoane cu salinitate sc!zut!. Proteinele cu afinitate
sc!zut! pentru situsul de legare sunt sp!late de pe coloan! cu toampoane de salinitate
intermediar! (300 mM KCl). In final, factorii proteici inalt purifica"i sunt elua"i cu
solu"ii saline concentrate (1 M KCl);
b) Proteinele separate prin cromatografie pe coloan! sunt testate pentru
capacitatea lor de legare la un element reglator identificat. n acest exemplu, test!rile
ADN footprintingpentru proteinele separate prin cromatografie de schimb ionic
indic! c! frac"iile de interes sunt 9-12. Aceste proteine pot fi testate si prin tehnica de
intarziere in gel.
Informa#ii suplimentare
Ca #i la E. coli, diferitele elemente transcrip"ionale de control prezente la
eucariote sunt situsuri de legare a proteinelor reglatoare care ac"ioneaz! n trans. Mai
departe o sa discut!m despre identificarea, purificarea #i structura acestor factori de
transcrip"ie care sunt activatori #i represori ai genelor proteice care codific! pentru
proteine.
Dup! identificarea elementelor reglatoare cu ajutorul analizelor muta"ionale
descrise anterior, pasul urm!tor l reprezint! identificarea proteinelor care recunosc
aceste structuri si se leag! specific la ele.
Figura eviden"iaz! modul n care un extract proteic nuclear este supus mai
multor etape cromatografice #i apoi unor analize de footprinting cu DN-aza I sau
de intarziere n gel folosint fragmente de ADN care con"in elementele reglatoare n
cis deja identificate. Frac"iile care con"in proteine care se leag! la elementele
reglatoare este foarte probabil s! con"in! un posibil putativ factor de transcrip"ie. O
tehnic! bun! pentru etapa de purificare final! a factorilor de transcrp"ie o constituie un
tip particular de cromatografie de afinitate specific! unei secven"e de ADN. Ca un test
final, capacitatea proteinelor izolate de a stimula transcrip"ia unei matrici care con"ine
un situs corespunz!tor de legare a proteinei, se realizeaz! o reac"ie de transcrip"ie in
vitro.
O dat! ce factorul de transcrip"ie a fost izolat, secven"a sa par"ial! n
aminoacizi poate fi determinat! #i folosit! pentru pentru clonarea genei sau a ADNc
137
codificat de aceasta. Gena izolat! poate fi folosit! apoi pentru a testa capacitatea
proteinei codificate de a stimula transcrip"ia ntr-o reac"ie de transcrip"ie in vitro.

SLIDE 47. Determinarea in vitro a activit$%ii factorilor
de transcrip%ie
Figura: testarea in vitro a activit!#ii de transcrip#ie
Sistemul experimental folosit necesit! prezenta a dou! plasmide. O plasmid!
con"ine gena care codific! pentru un factor posibil (putativ) de transcrip"ie-proteina X.
Cea de a doua plasmismid! con"ine o gen! raportor si unul sau mai multe situsuri de
legare a proteinei X. Ambele plasmide sunt simultan introduse n celule gazd! c!rora
le lipsesc gena care codific! pentru proteina X #i gena raportor. Este m!surat!
transcrip"ia ARN produs! de gena raportor; alternativ, activitatea proteinelor
codificate poate fi determinat!. Dac! transcrip"ia genei raportor este mai mare in
prezen"a plasmidei care codific! proteina X, nseamn! c! proteina este un activator;
dac! transcrip"ia este mai sc!zut!, atunci este un represor. Prin folosirea unor
plasmide care codific! au factor de transcrip"ie mutant sau care con"ine o rearanjare,
pot fi identificate domeniile importante ale proteinei.

SLIDE 48. Identificarea genetic$ a genelor care codific$ pentru factori
de transcrip%ie
Ex: serii de mutan#i Gal4 purt!tori de dele#ii-demonstreaz! c! factorii de transcrip#ie
sunt compu"i din domenii separate de legare "i de activare
La drojdii, genele care codific! pentru factori de transcrip"ie au fost mai nti
identificate prin analize genetice clasice. De ex, una dintre genele de la drojdii
necesare cresterii este numit! Gal4. Incubarea unor celule s!lbatice ntr-un mediu care
con"ine galactoz! are drept rezultat cre#terea de aproximativ o mie de ori a cantit!"ii
de ARNm pentru enzimele implicate n metabolismul galactozei. Aceast! activare nu
se poate observa n cazul mutan"ilor gal4. Studii de mutagenez! dirijat! asem!n!toare
celor prezentate anterior pentru determinarea regiunilor UAS pentru genele
inductibile. S-a determinat c! fiecare regiune UAS con"ine mai mult de o copie a
secven"ei de 17 pb nrudite numit! UASGAL. Cnd o copie a UASGAL a fost clonat!
n amonte de o secven"a TATA box urmat! de o gen! raportor lacZ, expresia lacZ a
fost activat! in celulele s!lbatice cultivate pe mediu cu galactoz!, dar nu #i n cazul
mutantelor gal4. Aceasta indic! c! UASGala este un element de control al
transcrip"iei activat de c!tre proteina Gal4 pe mediile cu galactoz!.
Gena Gal4 a fost izolat! prin complementare mutantului gal4 cu o banc! de
ADN de drojdii s!lbatec. Prin folosirea tehnicilor de recombinare a ADN, proteina
Gal4 a fost exprimat! n E. coli #i s-a determinat legarea acesteia la UASGAL. Cnd
proteina Gal4 se leag! la secven"ele UASGAL #i activeaz! transcrip"ia din apropierea
promotorului cnd celulele sunt plasate pe mediu cu galactoz!.
Studii genetice clasice au fost realizate si pe multe alte organisme cum sunt
Drosophila, C. elegans si plantele superioare au dus la descoperirea mai multor gene
care codific! pentru factori de transcrip"ie.
Activatorii transcrip#ionali sunt proteine modulare compuse din domenii
func#ionale distincte
Un remarcabil set de experimente realizate cu proteina Gal4 de la drojdii au
demonstrat c! acest factor de transcrip"ie este compus din domenii func"ionale
separabile: un domeniu de legarea a ADN care interac"ioneaz! cu secven"e specifice
de ADN #i un domeniu de activare, care interac"ioneaz! cu alte proteine pentru a
138
stimula transcrip"ia de la nivelul secven"elor din apropierea promotorului. n aceste
experimente o serie de mutan"i de dele"ie gal4 au fost testa"i pentru capacitatea lor de
a activa transcrip"ia unei gene raportor (lacZ) legat! la UASGAL. M!surarea activ!rii
transcrip"iei a fost m!surat! n celulele care gena GAL4 #i deci #i proteina gal4 nu vor
interfera cu analiza. Legarea proteinei mutante Gal4 la secven"a UASGAL poate fi #i
aceasta testat!. Rezultatele acestor experimente, eviden"iate n figur! demonstreaz! c!
Gal4 con"ine un un domeniu N-terminal de legare la ADN de 74 aminoacizi #i un
domeniu activator C-terminal. Cnd domeniul N-terminal de legare la ADN a fost
fuzionat cu difrerite fragmente C-terminale, proteinele trunchiate rezultate p!streaz!
capacitatea de a stimula expresia genei raportor. Deci regiunea intern! a proteinei nu
este necesar! pentru func"ionarea Gal4 ca factor de transcrip"ie.
Experimente similare au fost realizate #i pentru factorul de transcrip"ie de la
drojdii Gcn4, care regleaz! genele necesare pentru sinteza multor aminoacizi, indic!
existen"a unui domeniu de legare de aproximativ 60 aa #i un domeniu de activare C-
terminal de aproximativ 20 aa pozitionat n apropierea mijlocului secven"ei.
Studii de acest fel au fost realizate pentru mul"i factori de transcrip"ie de la
drojdii. Domeniile de activare ale factorilor de transcrip"ie de la mamifere au fost
adesea determinate frecvent prin fuzionarea lor cu domeniul de legarea al Gal4 cnd
celuzlele de mamifere nu con"in un factor endogen capabil s! se lege la secven"a
UASGAL. Modelul structural a activatorilor de la eucariote care a fost emanat din
aceste studii este unul modular n care unul sau mai multe domenii activatoare sunt
conectate unui domeniu de legare capab il s! recunoasc! secven"e specifice de legare
la ADN. n unele cazuri, aminoacizii inclu#i in domeniul de legare contribuie #i el la
activarea transcrip"ional!. A#a cum s-a discutat anterior, domeniile de activare se
crede c! func"ioneaz! prin intermediul interac"iilor protein!-protein! cu factorii de
transcrip"ie lega"i la promotor. Domeniile proteice ale activatorilor, care conecteaz!
domeniile de legare la ADN cu domeniile de activare pot explica de ce modific!rile n
spa"iul dintre elementele de control sunt att de bine tolerate la nivelul regiunilor de
control de la eucariote. Cnd domeniile de legare din apropierea factorilor de
transcrip"ie sunt deplasate de pe pozi"iile lor relative de pe ADN, domeniile lor de
activare pot inc! s! interac"ioneze deoarece ata#area lor la domeniile de legare este
flexibil!.

SLIDE 49. Activatorii transcrip%ionali sunt proteine modulare compuse
din domenii func%ionale distincte
Figura: Diagrame schematice care ilustreaz! structura modular! a activatorilor de
transcrip#ie de la eucariote
Ace#ti factori de transcrip"ie pot con"ine mai mult de un domeniu de activare
dar arareori con"in mai mult de un domeniu de legare la ADN. Receptorul
glucocorticoid (GR), care con"ine #i un domeniu de legare a hormonului activeaz!
transcrip"ia genelor "int! n prezen"a anumitor hormoni. Sp1 se leag! la regiunea
promotoare bogat! n elemente GC ntr-un num!r mare de gene de mamifere.
Domeniile proteice cu flexibilitate mare din structura activatorilor sunt extrem de
sensibile la digestia cu proteaze.
Informa#ii suplimentare
Factorii de transcrip#ie se leag$ la ADN "i activeaz$ transcrip#ia prin
intermediul domeniilor independente
Factorii de transcrip"ie #i alte proteine reglatoare sunt necesari pentru dou!
tipuri de activit!"i:
139
- Ei trebuie s! recunoasc! secven#ele #int! specifice localizate n activatori,
promotori, sau alte elemente reglatoare care afecteaz! o anumit! gen!. (Pentru o
protein! represor, legarea la ADN poate fi suficient! pentru a-#i exercita func"ia:
prezen"a proteinei serve#te pentru a mpiedica expresia genei).
- Pentru un factor se transcrip"ie sau o protein! reglatoare este necesar mai
mult; odat! legat! la ADN, proteina "i exercit! func#ia prin legarea altor
componente care fac parte din aparatul de transcrip#ie.
Putem caracteriza domeniile factorilor de transcrip"ie care sunt responsabili
pentru aceste activit!"i? Adesea domeniile care leag! ADN #i activeaz! transcrip"ia
sunt separate, #i fiecare func"ioneaz! independent. De fapt, putem vedea (considera)
func"ia domeniului de legare a ADN ca fiind complet! odat! ce domeniul de activare
a fost adus n vecin!tatea punctului de start. n principiu, este necesar ca conexiunea
dintre domeniile de legarea a ADN #i cel de activare s! fie destul de flexibil! pentru a
permite domeniului de activare s! g!seasc! "intele sale proteice f!r! a "ine seama de
situsul exact con"inut de domeniul de legare a ADN la nivelul promotorului. Proteina
"int! este cel mai probabil un factor de transcrip"ie bazal. Experimentele cu diferite
sisteme sugereaz! c! principiul domeniilor independente este comun pentru activatorii
transcrip"iei.
Natura modular! a activatorilor transcrip"iei a fost bine caracterizat! pentru
activatorul GAL4 de la drojdie, care controleaz! transcrip"ia genelor ai c!ror produ#i
sunt responsabili de metabolizarea galactozei. Reglarea se realizeaz! la UASG (o
secven"! de activare din amonte care la drojdii este echivalentul unui activator).
Proteina GAL4 are 4 situsuri de legare n UASG. Fiecare situs este o copie a
palindromului care are o secven"! consens de 17 pb. Totu#i, o singur! copie a
secven"ei consens este adecvat! pentru a conferi susceptibilitate (sensibilitate) la
reglarea GAL4.
Proteina GAL4 are trei func"ii: ea se leag! la ADN; ea activeaz! transcrip"ia;
#i ea leag! o alt! protein! reglatoare, numit! GAL80. Aceste func"ii pot fi separate.
Domeniul de legare a GAL4 const! n 65 de aminoacizi terminali. Fragmentul
N-terminal poate lega secven"a consens obi#nuit!, dar nu activeaz! transcrip"ia.
Capacitatea de a activa transcrip"ia poate fi conferit! de c!tre dou! alte regiuni
ale proteinelor: fie secven"a 148-196 fie 768-881, dac! ata#area la domeniul de legare
a ADN poate activa transcrip"ia.
Regiunea 65-94 permite proteinei s! formeze dimeri (dimerizeze). Este destul
de normal pentru factorii de transcrip"ie s! posede domenii adiacente pentru legarea
ADN #i dimerizare.
Regiunea 851-881, localizat! n interiorul unuia dintre domeniile dezactivare,
leag! GAL80. DE fapt, aceasta este modalitatea prin care GAL4 r!spunde la
galactoz!. Expresia genelor GAL este indus! de c!tre galactoz!, care se leag! la
proteina GAL80. n absen"a galactozei, proteina GAL80 leag! GAL4 #i o mpiedic!
s! realizeze activarea transcrip"iei. Galactoza induce transcrip"ia prin eliberarea
GAL80, permi"nd astfel GAL4 s! func"ioneze efectiv. Aceasta este una dintre
variantele unei teme comune: o protein! (sau oricare alt ligand) se leag! la un factor
de transcrip"ie pentru a regla (direct sau indirect) domeniul s!u activare a transcrip"iei.
Este natural c! legarea la ADN este prealabil! activ!rii transcrip"iei. Depinde
activarea de un anumit domeniu de legare la ADN (DNA-binding domaine).
Represorul bacterian LexA are un cap!t N-terminal al domeniului de legare la
ADN care recunoa#te un operator specific; legarea LexA la acest operator reprim!
promotorul adiacent. ntr-un experiment de schimbare, aceast! secven"! poate fi
140
nlocuit! cu domeniul de legare al GAL4. Gena hibrid poate fi introdus! n drojdii
mpreun! cu gena "int! care con"ine fie operatorul US fie LexA.
O protein! GAL4 autentic! poate activa o gen! "int! numai dac! are un
operator UAS. Represorul LexA singur nu are capacitatea de a activa nici un fel de
"int!. Hibridul LexA-GAL4 nu mai poate nici el s! activeze o gen! cu un UAS, dar
acum poate activa o gen! care are un operator LexA.
Acest rezultat corespunde punctului de vedere modular asupra activatorilor
transcrip"iei. Domeniul de legare a ADN serve#te n aducerea proteinei ntr-o
localizare corect!. Cum #i unde acesta se leag! la ADN nu este relevant, dar, odat!
legate, domeniile de activare a transcrip"iei pot determina ini"ierea transcrip"iei. n
acord cu acest punct de vedere, nu mai are importan"! att de mare dac! domeniile de
activare a transcrip"iei sunt aduse n vecin!tatea promotorului prin recunoa#terea UAS
via domeniului de legare a GAL4 sau prin recunoa#terea operatorului LexA via
specificit!"ii modului LexA. Capacitatea celor dou! tipuri de module de a func"iona n
proteine hibride sugereaz! c! fiecare domeniu al proteinei se pliaz! independent ntr-o
structur! activ! #i nu este influen"at! de restul proteinei.
Ideea c! factorii de transcrip"ie au domenii independente care leag! ADN #i
care activeaz! transcrip"ia este nt!rit! de capacitatea proteinei tat a virusului HIV de
a stimula ini"ierea f!r! a se lega deloc la ADN. Proteina tat se leag! la o regiune a
structurii secundare a produsului ARN; partea ARN necesar! pentru ac"iunea tat este
numit! secven"a tar.
Secven"a tar este localizat! chiar n aval de punctul de start, astfel nct cnd
tat se leag! la tar, este adus! n vecin!tatea complexului de ini"iere. Acest lucru este
suficient pentru a asigura ca domeniul s!u de activare s! fie destul de aproape de
complexul de ini"iere. Domeniul de activare interac"ioneaz! cu unul sau mai mul"i
factori de transcrip"ie lega"i la complex n acela#i fel ca #i un factor de transcrip"ie
situat n amont (De re"inut c! cel pu"in primul transcript trebuie s! fie nceput n
absen"a tat pentru a furniza astfel situsul de legare).
O demonstra"ie extrem! privind independen"a localiz!rii #i activ!rii
domeniilor a fost dat! de cteva construc"ii n care tat integrat astfel nct domeniul de
activare a fost conectat la domeniul de legare a ADN n locul secven"ei obi#nuite de
legare tar: cnd un situs "int! adecvat este plasat n promotor, domeniul de activare tat
poate activa transcrip"ia. Aceasta sugereaz! c! putem considera domeniul de legare al
ADN (sau n acest caz domeniul de legare al ARN) ca furniznd o func"ie de fixare
(de priponire), al c!rei scop principal este s! se asigure c! domeniul de activare se afl!
n vecin!tatea complexului de ini"iere.
No"iunea de priponire este un exemplu mult mai specific pentru ideea general!
c! ini"ierea necesit! o concentra"ie mare de factori de transcrip"ie n vecin!tatea
promotorului. Acest deziderat poate fi atins cnd factorii se leag! de activator care se
afl! la o anumit! distan"! pe ADN linear, cnd factorii se leag! n amont de
componentele promotorului, sau n caz extrem prin priponirea (fixarea) unui produs
ARN. Cerin"a comun! a tuturor acestor situa"ii este flexibilitatea exact cele n trei
dimensiuni a aranjamentului format din ADN #i proteine.
Exist! diferite modalit!"i prin care factorii de transcrip"ie situa"i n amont
activeaz! transcrip"ia, dar cea mai obi#nuit! modalitate este probabil interac"ia
protein!-protein! cu un factor de transcrip"ie bazal. Cele mai comune "inte pentru
activare par s! fie TFIIID #i TFIIIB.
Domeniile de activare ale factorilor de transcrip"ie GAL4 #i GCN4 de la
drojdie au multe sarcini negative, de unde descrierea lor drept activatori acizi. Un alt
activator efectiv particular de acest tip este proteina VP16 a virusului Hepex Simplex
141
(VP16 nu are un domeniu de legare la ADN, dar interac"ioneaz! cu aparatul de
transcrip"ie via o protein! intermediar!. Experimentele realizate pentru a putea
caracteriza func"ionarea activatorului acid au fost realizate adesea folosind regiunea
de activare a VP16 legat! la cteva motive de legare a ADN.
Nu este clar dac! sarcinile negative sunt necesare pentru func"ionarea
activatorilor acizi. Pe de o parte, secven"ele care au capacitate activatoare cnd se
leag! la domeniul de legare a ADN al GAL4 pot exista sub forma unei serii de
secven"e polipeptidice scurte care au n comun numai faptul c! posed! sarcini
negative. Aceasta sugereaz! c! regiunea de activare este reprezentat! de un lob acid
(regiune acid!) care interac"ioneaz! ntr-o manier! relativ nespecific! cu alte proteine
implicate n transcrip"ie. Se consider! c! muta"iile care determin! ndep!rtarea
(pierderea) aminoacizilor acizi reduc abilitatea de activare, n timp ce muta"iile care
ndep!rteaz! aminoacizii bazici genereaz! activatori mult mai eficien"i. Totu#i,
mutarea sistematic! pentru a ndep!rta grup!rile nc!rcate din GAL4 nu afecteaz!
asupra capacit!"ii de activare. Probabil este important! lipsa sarcinilor pozitive.
Domeniile de activare ale GAL4 #i GCN4 formeaz! foi " ("-sheets, pliere ") care
furnizeaz! probabil o interfa"! pentru contactarea altor proteine.
Activatorii acizi func"ioneaz! prin schimbarea capacit!"ii TFIIB s! lege
complexul bazal de ini"iere. Experimentele in vitro arat! c! legarea TFIIB la
complexul de ini"iere pentru un promotor al adenovirusului este stimulat! de prezen"a
activatorilor acizi GAL4 sau VP16; VP16 se poate lega direct la TFIIB. Asamblarea
TFIIB n complex pentru acest promotor (al adenovirusului) reprezint! o etap!
limitant! de vitez! care este stimulat! de prezen"a unui activator acid.
Alte tipuri de motive de activare sunt mult mai pu"in bine caracterizate, dar
includ o regiune bogat! n glutamin! pentru Sp1 #i o regiune bogat! n prolin! n
CTF. Sp1 pare s! necesite proteinele TAF (TAFs= TBP asociated factors) care sunt
asociate cu TBP (TATA binding protein) pentru aceast! ac"iune, astfel nct "inta sa
de activare s! fie complexul TFIID. Exist! date care indic! c! activatorii pot ac"iona
cu TFIID.
Elasticitatea promotorului ARN polimerazei II fa"! de rearanjarea elementelor,
#i chiar prezen"! unor elemente particulare, sugereaz! c! evenimentele (etapele,
procesele) prin care acesta este activat sunt ntr-o oarecare m!sur! independente
context #i relativ generale (destul de generale). De fapt, orice factor situat n amont #i
a c!rui regiune de activare este adus! n aceea#i orientare (la acela#i nivel) cu
complexul bazal de ini"iere poate fi capabil s! stimuleze formarea acestuia. Cteva din
dovezile izbitoare ale acestei vesatilit!"i (multiplicit!"ii/elesticit!"ii) au fost furnizate
prin construirea unor promotori care constau n noi combina"ii de elemente. De
exemplu, cnd elementul UASG de la drojdie este inserat lng! promotorul unei gene
de la un eucariot mai evoluat, aceast! gen! poate fi activat! de GAL4 n culturi
celulare de mamifere.
Deoarece GAL4 activeaz! promotorul se pare c! aceast! protein! este bine
conservat! evolutiv ncepnd de la drojdii #i pn! la eucariotele superioare. Proteina
GAL4 trebuie s! recunoasc! anumite tr!s!turi ale aparatului de transcrip"ie de la
mamifere care se aseam!n! cu punctele sale normale de contact de la drojdie. O
interpretare este aceea c! de fapt exist! componente comune, fie ale ARN polimerazei
fie ale altor factori de transcrip"ie, care pot fi recunoscu"i de c!tre unul sau mai mul"i
factori pentru a activa transcrip"ia. Componentul comun poate fi mai degrab! un
motiv dintr-o protein! dect o protein! ntreag!.

142
SLIDE 50. Domeniile de legare la ADN pot fi clasificate n mai multe
tipuri structurale
! Proteine care con#in homeodomenii
! Proteine Zinc-finger
! Proteine Winged-helix (forkhead)
! Proteined Leucine-zipper
! Proteine Helix-loop-helix
Factorii de transcrip#ie de la eucariote con#in o varietate de motive structurale
care interac"ioneaz! cu secven"e de ADN specifice. Ca #i la majoritatea activatorilor #i
represorilor bacterieni, elicele alfa ale factorilor de transcrip"ie de la eucariote sunt
orientate astfel nct s! fac! posibil! legarea la fosa major! a ADN unde atomii din
structura proteinelor particip! la formarea leg!turilor de hodrogen #i a leg!turilor Van
der Waals cu atomi din structura ADN. Interac"iile cu atomii scheletului fosfat, #i n
unele cazuri cu atomii din structura ADN de la nivelul fosei minore contribuie #i
acestea la legare.
Analizele cristalografice cu raze X ale complexelor dintre situsuri de legare
specifice din structura ADN #i factori de transcrip"ie izola"i au eviden"iat un num!r de
motive structurale care pot prezenta un alfa-helix in fosa major!.
Informa#ii suplimentare
Exist$ multe tipuri de domenii de legare a ADN (ADN binding domains)
Compara"iile ntre secven"ele mai multor factori transcrip"ionali (implica"i n
transcrip"ie) sugereaz! c! pot fi reg!site tipuri comune de motive care sunt
responsabile pentru legarea ADN (pentru legarea la ADN). Motivele sunt ntotdeauna
destul de scurte #i cuprind numai o mic! parte a structurii proteinei. Motivele au fost
de asemenea identificate ca fiind responsabile de activarea transcrip"iei via
interac"iilor dintre proteinele aparatului de transcrip"ie. Exist! informa"ii detaliate
despre numeroase grupuri de proteine care regleaz! transcrip"ia folosind motive
particulare (anumite tipuri de motive) pentru a lega ADN:
- Receptorii steroizi sunt defini"i ca grup printr-o rela"ie func"ional!: fiecare
receptor este activat prin legarea unui anumit steroid (un steroid particular).
Receptorul pentru glucocorticoid este cel mai studiat. mpreun! cu al"i receptori, cum
sunt receptorul pentru hormonul tiroidian sau receptorul pentru acid retinoic,
receptorii steroizi sunt membrii unei superfamilii de factori de transcrip"ie cu acela#i
mod general de operare (modus operandi).
- Motivele degete cu zinc (zinc finger) cuprind un domeniu de legare a ADN
(care leag! ADN). Au fost original recunoscute n factorul TFIIA, care este necesar
ARN polimerazei III pentru a transcrie genele care codific! ARNr 5S. De atunci au
fost identificate n numero#i al"i factori de transcrip"ie (#i presupu#i factori de
transcrip"ie). O form! distinct! a motivului a fost g!sit! #i n receptorii steroizi.
Motivul Winged-helix (naripat) sau Forkhead (ramificat) este
caracteristic domeniilor de legare la ADN ale histonei 5 #i a altor factori de
transcrip"ie care au fost eviden"ia"i ca fiind implica"i n func"ionarea timpurie la
Drosophila #i mamifere. Asemeni proteinelor zinc-finger C2H2, proteinele
winged-helix se leag! n genmeral la ADN ca monomeri.
Motivul helix-turn-helix (helix-cotitur!-helix) a fost original identificat ca un
domeniu de legare a ADN al fagilor represori. Un !-helix se leag! n fosa mare a
ADN; cel!lalt helix se leag! transversal (de-a curmezi#ul) peste ADN. O form!
nrudit! a motivului este prezent! n domeniul homeo (homeo domain), secven"!
care a fost pentru prima dat! caracterizat! la numeroase proteine codificate de gene
143
implicate n reglarea dezvolt!rii la Drosophila. Aceste domenii au fost identificate
acum n gene care codific! pentru factorii de transcrip"ie de la mamifere.
- Motivul amfipatic helix-loop-helix (helix-bucl!-helix) (HLH) a fost
identificat n cazul ctorva regulatori de dezvoltare #i n genele care codific! pentru
proteine care leag! ADN. Fiecare helix amfipatic prezint! o faz! format! din resturi
hidrofobe #i cealalt! format! din resturi nc!rcate (sarcini). Lungimea buclei (loop) de
conectare variaz! de la 12 la 28 de aminoacizi. Motivul permite moleculelor s!
dimerizeze, #i o regiune bazic! (nc!rcat! pozitiv) situat! lng! acest motiv intr! n
contact cu ADN.
- Motivul fermoar de leucine sau agrafe cu leucin! (leucine zippers) const!
ntr-o regiune (ntindere) format! din aminoacizi n care fiecare al #aptelea aminoacid
este o leucin!. O secven"! leucine zipper (fermoar leucin!) de pe o polipeptid!
interac"ioneaz! cu o alt! secven"! de acela#i tip de pe o alt! polipeptid! pentru a forma
un dimer. Adiacent (n apropierea) fiec!rui fermoar (zipper) exist! o por"iune
(ntindere) de resturi nc!rcate pozitiv care este implicat! n legarea ADN.
Activitatea unui factor de transcrip"ie inductibil poate fi reglat! n mai multe
moduri:
a) un factor este specific de "esut ("esut specific) deoarece el este sintetizat
numai ntr-un anumit tip de celul!. Mai mul"i factori de acest tip sunt cunoscu"i, mul"i
dintre ei incluznd domenii homeobox.
b) activitatea unui factor poate fi direct controlat! prin modificarea acestuia.
HSTF este transformat n forma activ! prin fosforilare. AP1 (un heterodimer
constituit din subunit!"ile Jun #i Fos) este transformat n forma activ! prin
defosforilarea subunit!"ii Jun.
c) un factor este activat sau inactivat prin cuplarea unui ligand. Receptorii
steroidieni sunt primele exemple. Cuplarea (ata#area) ligandului poate influen"a att
localizarea proteinei (afectnd transportul din citoplasm! n nucleu) ct #i direct
abilitatea (capacitatea) sa de a se lega la ADN.
d) disponibilitatea unui factor poate varia; de exemplu, factorul NFkB (care
activeaz! genele k ale imunoglobulinelor n limfocitele B) este prezent n multe tipuri
de celule. Acesta poate fi ns! re"inut n citoplasm! de c!tre inhibitorul proteic I-kB.
n limfocitele B, NFkB este eliberat de I-kB #i se deplaseaz! n nucleu, unde activeaz!
transcrip"ia.
e) un factor cu structur! dimer! poate avea comportamente diferite. Exist!
posibilitatea ca un partener s! l inactiveze; sinteza partenerului activ poate deplasa
partenerul inactiv. Vom putea vedea mai departe c! astfel de situa"ii pot fi amplificate
n re"elele n interiorul c!rora diferi"i parteneri se mperecheaz! alternativ unul cu
altul. Situa"ie este valabil! mai ales n cazul proteinelor HLH (helix-loop-helix)
Totu#i, trebuie s! re"inem c! muta"ii la nivelul factorilor de transcrip"ie din unele din
aceste clase (categorii) d! na#tere unor activa"i ne-adecvat (incorect) sau inhib!
activarea transcrip"iei; ei pot avea lor n generarea tumorilor. .
n continuare vor fi discutate mai detaliat reac"iile de legare a ADN #i de
activare, realizate de unele dintre aceste clase de proteine. n multe cazuri, legarea
ADN este realizat! de o scurt! regiune de !-helix care face contact fie cu bazele fie
cu scheletul fosfat de la nivelul fosei majore.

SLIDE 51. Homeodomeniile proteinei engrailed care
interac%ioneaz$ cu domeniile specifice din structura ADN
Figura: Homeodomeniul proteinei engrailed care interac#ioneaz! specific cu
situsul s!u specific ADN
144
Factorul de transcrip"ie engrailed este exprimat n timpul embriogenezei de
la Drosophila. Perechile de baze ale situsului de recunoa#tere care intr! n contact
direct cu proteina sunt eviden"iate n alb. Regiunile mai deschise din protein! con"in
resturile care intr! n contact cu fosa mare.
Informa#ii suplimentare
Domeniile Homeo se pot lega la secven#e #int$ nrudite de pe ADN
Homeobox este o secven"! care codific! pentru un domeniu de 60
aminoacizi prezent! n proteinele multor sau chiar a tuturor eucariotelor. Numele s!u
deriv! de la identificarea ini"ial! la Drosophila a locilor homeotici (acele gene care
determin! identitatea structurilor corpului). Homeobox este prezent! n multe gene
care regleaz! dezvoltarea timpurie la Drosophila, un motiv nrudit fiind determinat n
genele unui mare num!r de eucariote superioare. Este foarte atractiv! ipoteza c!
domeniile homeo identific! (sau m!car sunt comune acestora) genele implicate n
reglarea dezvolt!rii. Secven"e nrudite cu domeniul homeo au fost g!site n multe
tipuri de factori de transcrip"ie de la animale. Extinderea de la domeniile homeo
originale de la Drosophila la mamifere, corela"iile (rela"iile) dintre regiunile
conservate scad semnificativ.
La Drosophila genele homeo, adesea domeniul homeo (dar nu ntotdeauna)
sunt localizate n apropierea cap!tului C-terminal. Adesea genele posed! o secven"!
mic! conservat! situat! n afara homeobox. Conservarea secven"elor homeobox
variaz!. Un grup major de homeobox care con"ine #i genele de la Drosophila are o
secven"! bine conservat!, cu 80-90% omologie (asem!nare) ntre perechile de
secven"e comparate. Adesea, n factorii de transcrip"ie animali domeniul homeo este
combinat cu alte motive. Un exemplu este prezentat de c!tre proteinele Oct (octamer-
binding), care reprezint! un grup n care regiunea de 75 aminoacizi conservat! este
denumit! regiunea Pou #i este localizat! n imediata vecin!tate a unei regiuni care se
aseam!n! cu domeniul homeo. Secven"ele corespunz!toare prezente n domeniile
homeo ale proteinelor din grupul Pou sunt cele mai ndep!rtate rude ale grupului
original, constituind astfel cea mai cea mai ndep!rtat! ramur! a familiei (cea mai
ndep!rtat! extensie a familiei).
Domeniul homeo este responsabil pentru legarea la ADN, experimentele de
schimbare a domeniilor homeo ntre proteine sugereaz! c! specificitatea
recunoa#terii ADN este nscris! n interiorul homeo domeniului. Dar (ca #i n cazul
fagilor represori) nu poate fi dedus un cod simplu care leag! proteina #i secven"ele de
ADN. Regiunea C-terminal! a domeniului homeo arat! o omologie cu motivul
helix-turn-helix al represorilor de la procariote. A#a cum ne amintim represorul
lambda posed! un helix de recunoa#tere (!-helix-3) care intr! n contact cu fosa
major! a ADN, n timp ce cel!lalt helix (!-helix-2) se leag! ntr-un anumit unghi
transversal (de-a curmezi#ul) de-a lungul ADN. Domeniul homeo poate fi organizat
n trei regiuni sub form! de helix poten"iale; Partea cea mai bine conservat! a
secven"ei se leag! de cel de al treilea helix. Diferen"ele dintre aceste structuri #i
structurile represorului de la procariote sunt legate de lungimea helixului care
recunoa#te ADN, helixul 3, care este cu 17 aminoacizi mai lung n domeniul homeo,
fa"! de o lungime de 9 resturi n cazul represorului lambda.
Structura cristalin! a domeniului homeo al produsului genei D. melanogaster
engrailed (pictat!) este prezentat! schematic n figura. Helixul 3 se leag! la nivelul
fosei mari a ADN #i realizeaz! majoritatea contactelor dintre protein! #i acidul
nucleic. Majoritatea contactelor care orienteaz! helixul n fosa major! sunt realizate
cu coloana fosfat, deci ele nu sunt specifice pentru secven"a ADN. Aceasta se leag!
larg pe fa"a dublului helix, #i flancheaz! bazele cu care au fost realizate contacte
145
specifice. Celelalte puncte de contact r!mase sunt realizate de bra"ul N-terminal al
domeniului homeo, secven"a care precede exact primul helix. Ea este proiectat!
(orientat!/azvrlit!) n fosa minor!. Astfel, regiunile N- #i C-terminale ale
domeniului homeo sunt primele r!spunz!toare de contactul cu ADN (de intrarea n
contact cu ADN).
O interesant! demonstra"ie a caracterului general al acestui model deriv! din
compararea structurii cristaline a domeniului homeo de la D. melanogaster
engrailed cu proteina !2 de mating de la drojdie. Domeniul de legare al acestei
proteine se aseam!n! cu domeniul homeo, #i poate forma trei helixuri similare:
structura sa n fosa ADN poate fi suprapus! aproape exact cu cea a domeniului
homeo de la engrailed. Aceste asem!n!ri sugereaz! c! toate domeniile homeo se
leag! la ADN (leag! ADN) n acela#i mod. Aceasta nseamn! c! un num!r relativ mic
de resturi din helixul 3 #i din bra"ul N-terminal sunt responsabile de specificitatea
contactelor.

SLIDE 52. Interac%ia ADN-Proteine Modelul helix-turn-helix (HTH)
Figura: Modelul helix-turn-helix (HTH) este o structur! comun! de recunoa#tere a
ADN #i la procariote. n figur! avem o imagine ob"inut! prin difrac"ie cu raze X
pentru dimerul cAMP-CAP care formeaz! un complex cu aproximativ 30 pb de
duplex ADN.
a) Complexul v!zut cu cele dou! plieri fa"! de axa orizontal! n planul h!rtiei.
Proteina este reprezentat! prin structurile sale alfa cu domeniul N-terminal de legare a
cAMP, colorat n albastru #i cel C-terminal de legare la ADN n mov/ro#u;
b) Legarea dimerului CAP prin intermediul motivelor HTH n fosele mojore
succesive ale ADN. Cap!tul N-terminal al motivului HTH este albastru n timp ce
helixul de recunoa#tere este ro#u.

SLIDE 53. Interac%ia ADN-ProteineModelul HTH (represorul 434 al
bacteriofagullui P22)
Figura: Structura ob#inut! cu raze X a represorului 434 al fagului P22 (este
eviden"iat numai domeniul cap!tului de 69 de resturi amino-terminal) n complex cu
un fragment "int! de 20 pb cu structura d(TATACAAGAAAGTTTGTACT)
a) Modelul sub form! de schelet cu ADN n stnga si cu cele dou! subunit!"i
identice ale proteinei (dou! elice alfa) n stnga.
b) Reprezentare schematic! a motivului helix-turn-helix, care eviden"iaz!
interac"ia elicelor alfa2 #i alfa3 cu ADN "int!. Barele scurte din structur! sunt
grup!rile peptidice NH, leg!turile de hidrogen sunt reprezentate de linii punctate,
grup!rile fosfat ale ADN prin numere ncercuite. Cercurile mici sunt molecule de ap!.
c) Modelul cu bile corespunz!tor rep#rezent!rii din figura a. Proteina este
reprezentat! n galben.

SLIDE 54. Interac%ia ADN-Proteine Modelul HTH (represorul TRp de
la E. Coli)
Figura: Structura cu raze X a complexului represor-operator pentru operonul trp de
la E. Coli.
Cele dou! subunit!"i identice ale proteinei sunt reprezentate sub form! de
panglici una verde #i cealalt! mov. Ambele formeaz! motivul HTH (elicele D #i E).
Represorul trp se leag! la operator numai cnd L-triptofanul (n ro#u) este legat
simultan
146

SLIDE 55. Interac%iile domeniilor C2H2 &i C4 zinc-finger cu ADN
Figura:
a) O protein! C2H2 cu cinci degete numit! GL1. Aceast! protein! monomer!
este codificat! de o gen! care este amplificat! ntr-un num!r de tumori umane.
Regiunile helicale sunt reprezentate prin cilindri iar catenele beta prin panglici.
Degetul 1 nu interac"ioneaz! cu ADN, n timp ce celelalte patru degete da. Cercurule
negre indic! ionii de Zn2+;
b) regiunile sub form! de helix sunt reprezentate ca spirale iar catenele beta sub
form! de s!ge"i. Dou! elice alfa, una din fiecare monomer, interac"ioneaz! cu ADN.
Ca to"i homodimerii Zinc-finger C4, acest factor de transcrip"ie posed! o simetrie
de pliere rota"ional!; centrul de simetrie este aviden"iat prin elipsa galben!. Cercurile
negre indic! ionii de Zn2+.
Informa#ii suplimentare
Motivul zinc finger poate furniza un domeniu de legarea a ADN (poate constitui un
domeniu de legare a ADN)
Zinc fingers (degete cu zinc) #i-au luat numele dup! structura pe care o
posed!. n aceasta, un mic grup de aminoacizi conserva"i leag! ionul de zinc, #i
formeaz! un domeniu relativ independent n protein!. Dou! tipuri de proteine care se
leag! la ADN (DNA-binding proteins) au structuri de acest tip: proteinele clasice
zinc finger #i receptorii steroidieni.
O protein! finger tipic! are o serie de degete cu zinc, a#a cum este prezentat
n figur!. Secven"a consens a unui singur deget este:
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His
Motivul #i trage numele (#i-a luat numele) de la bucla (loop) de aminoacizi
care dep!#e#te ca o protuberan"! situsul de legare al zincului, care este descris ca un
deget Cys2/His2. Zincul este prins ntr-o structur! tetraedric! format! prin
conservarea resturilor de Cys #i His. Degetul n sine con"ine aproximativ 23
aminoacizi, iar leg!tura dintre degete este, n mod normal, de 7-8 aminoacizi.
Factorul de transcrip"ie TFIIIA (necesar ARN polimerazei III s! transcrie
genele care codific! ARN 5S) con"ine o serie de 9 degete organizate n repeti"ii n
tandem (tandem repeats= secven"e repetitive n tandem). Trei repeti"ii ale secven"ei
deget sunt prezente #i n factorul de transcrip"ie SP1 care este implicat n ini"ierea
transcrip"iei la mai mul"i promotori folosi"i de ARN polimeraza II. Degetele sunt
necesare pentru legarea ADN (sau legarea la ADN).
Este necesar s! se manifeste precau"ie la interpretarea prezen"ei (sau
putativelor/posibilelor degete) degetelor cu zinc, mai ales cnd proteina con"ine numai
un singur motiv deget. Degetele mai pot fi implicate #i n legarea la ARN (legarea
ARN) sau chiar f!r! a fi corelate cu activitatea de reglare la vreun tip de acid nucleic.
Prototipul proteinei cu degete (finger protein) este TFIIIA care se leag! att la
gena ADNr 5S ct #i la produsul acesteia ARNr 5S. Un factor de ini"iere a transla"iei
eIF2" are un deget cu zinc; muta"iile la nivelul motivului deget influen"eaz!
recunoa#terea codonului de ini"iere. Proteinele capsidei retrovirale au un motiv nrudit
cu motivul deget care poate fi implicat n legarea ARN viral.
Degetele zinc au un motiv comun n proteinele care leag! ADN (care se leag!
la ADN). De obicei, degetele sunt organizate ca o singur! serie de unit!"i repetitive n
tandem; ocazional exist! mai mult dect un singur grup de degete. Regiunea degetelor
variaz! ca ntindere de la o lungime de 9 repeti"ii, care ocup! aproape ntreaga
protein! (este cazul TFIIIA), la numai un mic domeniu care const! n dou! degete (ca
147
n cazul proteinei reglatoare ADT1 de la Drosophila) Factorul general de transcrip"ie
Sp1 posed! un domeniu de legare a ADN format din trei degete cu zinc.
Partea C-terminal! a fiec!rui deget formeaz! un !-helix care leag! ADN;
partea N-terminal! formeaz! o structur! "-pliat!. (Pentru simplificare conforma"ia "-
pliat! #i localizarea ionului de zinc nu au mai fort configurate n partea de jos a
figurii). Cele trei regiuni !-helix se potrivesc (se fixeaz!) ntr-o r!sucitur!
(ntoarcere/cotitur! a fosei majore); fiecare ! (#i astfel fiecare deget realizeaz! dou!
contacte specifice de secven"! (secven"! specifice) cu ADN (indicate prin s!ge"i).
Dac! acest tip de structur! este tipic! degetelor cu zinc, ne putem a#tepta ca
aminoacizii ne-conserva"i de la cap!tul C-terminal s! fie responsabili de
recunoa#terea specific! a situsurilor "int!. (De re"inut c! ipoteze similare despre
motivul helix-turn-helix prezent la represorii de la procariote au fost dificil de
sus"inut, acum ezitnd dubii (semne de ntrebare) dac! putem dovedi existen"a unui
cod care coreleaz! secven"ele n aminoacizi ale elicei cu perechile de baze ale
secven"ei ADN "int!.
Cunoscnd c! degetele cu zinc se g!sesc n factori de transcrip"ie autentici
care nso"esc (asist!) att ARN polimeraza II ct #i III, putem privi proteinele cu
motive deget dintr-o perspectiv! invers!. Cnd se determin! c! o protein! con"ine mai
multe degete cu zinc, aceasta constituie cel pu"in prima premis! (prima facie) n
sensul investig!rii proteinei ca avnd un posibil rol ca factor de transcrip"ie. Astfel s-a
identificat c! diferi"i loci implica"i n dezvoltarea embrionar! la D. melanogaster sunt
reglatori ai transcrip"iei.
Receptorii hormonilor steroizi (#i alte proteine) au un alt tip de motiv deget.
Structura se bazeaz! pe o secven"! cu (un posibil/putativ) un situs consens de legare a
zincului:
Cys-X2-Cys-X1-3-Cys-X2-Cys
Acestea sunt denumite degete Cys2/Cys2. Proteinele cu degete de acest tip au
adesea degete ne-repetitive, n contrast cu repeti"ia n tandem a tipului Cy2/His2.
Secven"ele de legare de pe ADN sunt scurte #i palindromice. Analiza muta"iilor a
ar!tat c! regiunile proteinelor reglatoare care se leag! la ADN includ motive finger.
Degetele Cys2/Cys2 sunt distincte de degetele Cys2/His2. Studiile pe
receptori steroidieni au ar!tat c! muta"iile care transform! cea de a doua Cys n His,
schimbnd astfel tipul de deget, determin! pierderea capacit!"ii de activare a genelor
"int!. Deci cele dou! tipuri de structuri sub form! de deget nu sunt interschimbabile.
Receptorii pentru glucocorticoid #i estrogen au fiecare cte dou! degete,
fiecare cu un atom de zinc n centrul tetraedrului format de cisteine. Cele dou!
structuri deget formeaz! !-helixuri care se pliaz! mpreun! pentru a da na#tere unui
domeniu globular mare. P!r"ile aromatice ale !-helixurilor formeaz! mpreun! un
centru hidrofob unde o structur! "-pliat! conecteaz! cele dou! helixuri. O parte a
helixului N-terminal vine n contact cu fosa major! a ADN. Doi receptori
glucocorticoizi dimerizeaz! pentru a se lega la ADN, #i fiecare angajeaz! o scobitur!
(r!sucire/turnur!) succesiv! a fosei majore. Acest aspect este n concordan"! cu natura
palindromic! a elementului r!spuns.
Fiecare deget controleaz! o proprietate important! a receptorului. Dintre
aminoacizii relevan"i (cu relevan"!), cei de pe partea dreapt! a primului deget
controleaz! legarea la ADN iar cei de pe partea stng! a celui de al doilea deget
controleaz! capacitatea de a forma dimeri.
Dovezi directe privind legarea ADN la degete au fost ob"inute printr-un
experiment de modificare a specificit!"ii (specificity swap). Motivul deget al
receptorului pentru estrogen a fost nl!turat #i nlocuit cu cel al unui receptor
148
glucocorticoid. Noua protein! recunoa#te secven"a GRE (secven"a obi#nuit! pentru un
receptor glucocorticoid) n locul secven"ei ERE (secven"a obi#nuit! pentru un receptor
estrogen). Aceast! recunoa#tere stabile#te specificitatea cu care este recunoscut ADN.
Secven"ele GRE #i ERE sunt destul de asem!n!toare (similare), #i alte
experien"e de modificare a specificit!"ii au ar!tat c! diferen"ierea dintre ele const! n
doi aminoacizi care sunt diferi"i la primul motiv deget. Diferen"ele dintre secven"ele
receptorului glucocorticoid #i a celui estrogen sunt determinate n principal pe baza
motivului deget. Substituirea a dou! dintre pozi"iile importante face ca receptorul
glucocorticoid s! se lege la o secven"! ERE n loc de una GRE.

SLIDE 56. Interac%ia dintre proteina C6 zinc-finger(Gal4) &i ADN
Figura: Diagrama interac#iei dintre gal4, o protein! zinc-finger C6, "i ADN
Aceast! protein! se leag! la ADN ca un homodimer care interac"ioneaz!
pentru a forma o structur! suprar!sucit! care se leag! perpenticular pe helixul ADN.
Legarea resturilor de cistein! la doi ioni Zn2+ (n galben) pe fiecare monomer care
formeaz! cte un domeniu globular de legare la ADN.

SLIDE 57. Interac%ia proteinei homodimere leucine-zipper &i ADN
Figura: Dou! imagini ale interac#iunii factorului Gcn4 de la drojdii, o protein!
homodimer! leucine-zipper, cu ADN
Regiunile alfa-helix extinse ale monomerului prind ADN la nivelul foselor
majore adiacente. Domeniul suprar!sucit de dimerizare al Gcn4 con"ine resturi de
leucine precis pozi"ionate. Unele proteine de legare la ADN care con"in acela#i model
general con"in al"i aminoacizi hidrofobi n aceste pozi"ii; din aceast! cauz! modelul
prezentat aici se nume#te modelul fermoar de leucin! de baz!.

Informa#ii suplimentare
Motivele leucine zipper pot fi implicate n formarea dimerilor
Interac"iile dintre proteine constituie o tem! comun! n constituirea
complexului transcrip"ional. Un motiv g!sit (caracteristic) mai multor factori de
transcrip"ie (#i altor proteine) este implicat att n interac"iile homo- ct #i
heterodimerice. Motivul leucine zipper este o secven"! (regiune/lungime) de
aminoacizi bogat! n resturi de leucin! care furnizeaz! un motiv dimer. ns!#i
formarea dimerilor a ap!rut ca un principiu comun n ac"iunea proteinelor care
recunosc secven"e specifice de ADN. n cazul leucine zipper rela"iile acestui motiv
cu legarea ADN sunt clare, deoarece dimerizarea juxtapune regiunile de legare a
ADN de pe fiecare subunitate.
Un !-helix amfipatic prezint! o structur! n care grup!rile hidrofobe (inclusiv
leucin!) se orienteaz! c!tre una dintre p!r"i, n timp ce grup!rile nc!rcate se
orienteaz! c!tre cealalt! parte. Motivul leucine zipper formeaz! un helix amfipatic
n care leucinele fermoarului unei proteine se pot intercala printre leucinele altui !-
helix care apar"ine altei proteine paralele care poart! acela#i motiv (protuberan"ele
leucinelor unei p!r"i a fermoarului unei proteine se intercaleaz! cu leucinele celeilalte
p!r"i a fermoarului celeilalte proteine dispus! paralel). Cele dou! elice de mn!
stng! (r!sucite c!tre stnga) se rotesc una n jurul celeilalte, cu 3,5 resturi pe tur!,
astfel nct motivul se repet! integral dup! 7 resturi.
Cum se leag! aceast! structur! la ADN? Regiunea adiacent! resturilor
repetitive de leucin! este foarte bazic! n fiecare protein! fermoar, #i poate cuprinde
situsul de legare a ADN. Cele dou! fermoare leucin! formeaz! de fapt o structur! n
form! de Y, n care fermoarele constituie stemul (tulpina), iar cele dou! regiuni bazice
149
se bifurc! simetric pentru a forma bra"ele care leag! ADN. Aceast! structur! este
cunoscut! drept motivul structural bZIP. Aceasta explic! de ce secven"ele "int! ale
unei astfel de proteine sunt repeti"ii inverse ne-separate ntre ele (secven"e repetitive
inverse care nu sunt distan"ate ntre ele).
Fermoarele pot fi utilizate pentru a sponsoriza (asigur! formarea
homodimerilor #i heterodimerilor. Ele sunt motive lungi. Leucina ocup! fiecare al
#aptelea rest n poten"ialul motiv fermoar. n proteina C/EBP (factor care se leag! sub
form! de dimer att la CAAT box ct #i la miezul/core activatorului SV40) exist! 4
repeti"ii, iar n factorii Jun #i Fos (care formeaz! factorul heterodimer de transcrip"ie,
AP1). AP1 a fost original identificat ca o secven"! care leag! ADN prezent! n
activatorul (n regiunea activatoare) SV40.
Preparatul activ al AP1 include mai multe polipeptide. Un component major
este Jun, produsul genei c-jun care a fost identificat! prin rela"ia sa cu oncogena v-jun
purtat! de virusul sarcomului aviar. Genomul de #oarece con"ine o familie de gene
nrudite, c-jun (izolat! original) #i junB #i junD (identificate datorit! omologiei de
secven"! cu jun). Aceste trei proteine au o considerabil! omologie de secven"!; ele
posed! motive leucine zipper care pot interac"iona pentru a forma homodimeri #i
heterodimeri.
Un alt component major al AP1 este produsul unei alte gene cu o copie
oncogen!. Gena c-fos este un omolog celular al oncogenei v-fos purtat! de virusul
sarcomului murin (virusul sarcomului de #oarece). Expresia c-fos activeaz! genele ai
c!ror promotori posed! un situs "int! pentru AP1. Produsul c-fos este o fosfoprotein!
nuclear! care face parte din acest grup de proteine. Celelalte au fost descrise ca fiind
antigeni nrudi"i cu Fos (Fos-related antigenes = FRA); ele constituie familia
proteinelor Fos (Fos-like proteins).
Fos are #i ea un motiv leucine zipper, nu poate forma homodimeri dar
formeaz! un heterodimer cu Jun. Pentru reac"ie este necesar un motiv leucine zipper
pentru fiecare protein!. Capacitatea de a forma dimeri este partea crucial! (cea mai
important!) a interac"iei acestor factori cu ADN. Fos singur! nu poate lega ADN,
probabil datorit! incapacit!"ii sale de a forma dimeri. Heterodimerul Jun-Fos se poate
lega la ADN cu aceea#i specificitate pentru secven"a "int! ca #i dimerul Jun-Jun; acest
heterodimer se leag! la situsul AP1 cu o afinitate de aproximativ 10 ori mai mare
dect homodimerul Jun.
Unul dintre modelele imaginate presupune c! att n cazul homodimerului
Jun-Jun ct #i al heterodimerului Jun-Fos, ambele subunit!"i intr! n contact cu ADN.
Afinitatea crescut! a heterodimerului pentru ADN poate reflecta capacitatea
situsurilor de legare ale subunit!"ilor Jun #i Fos de a intra mai puternic n contact cu
ADN fa"! de situsurile celor dou! subunit!"i Jun.

SLIDE 58. Interac%ia proteinei homodimere helix-loop-helix &i ADN
Figura: Interac#ia domeniului HLH (helix-loop-helix) din proteina homodimer!
Max cu ADN
Motivul HLH se extinde #i dincolo de elicele de legare la ADN, n stnga
(capetele N-terminale ale monomerilor) pn! n apropierea regiunii de r!sucire a
catenelor; aceast! regiune este urmat! imediat de o regiune de r!sucire de tip leucine
Zipper n proteina dimer!.
Informa#ii suplimentare
Proteinele helix-loop-helix interac#ioneaz$ prin asociere combinat$
Cele dou! tr!s!turi comune ale proteinelor care se leag! la ADN sunt prezen"!
regiunilor sub form! de helix care leag! ADN, #i capacitatea proteinei de a dimeriza.
150
Ambele tr!s!turi sunt caracteristice #i grupului de proteine helix-loop-helix care
con"in un tip comun de motiv de secven"!: o regiune (ntindere) de 40-50 de
aminoacizi con"in dou! !-helixuri amfipatice separate de o regiune de legare (linker
region=the loop), bucla, care are o lungime variabil!. Proteinele din acest grup
formeaz! att homodimeri ct #i heterodimeri prin intermediul interac"iunilor care se
stabilesc ntre resturile hidrofobe situate pe fe"ele (p!r"ile) corespunz!toare celor dou!
helixuri. Regiunile sub form! de helix au o lungime de 15-16 aminoacizi, fiecare
con"innd mai multe resturi conservate. Capacitatea de a forma dimeri rezid! (se afl!)
n aceste helixuri amfipatice, #i este comun! tuturor proteinelor HLH (helix-loop-
helix). Bucla este probabil important! numai pentru a oferi libertate celor dou! regiuni
s! interac"ioneze independent una de cealalt!.
Majoritatea proteinelor HLH con"in o regiune adiacent! motivului HLH care
este foarte bazic!, #i care este necesar! pentru legarea ADN. Pe o lungime de 15
aminoacizi aproximativ 6 resturi sunt conservate. Membrii grupului care con"in o
astfel de regiune sunt numi"i proteine bHLH. Se pot lega la ADN att un homodimer
ct #i un heterodimer n care ambele subunit!"i con"in o regiune bazic!. Se pare c!
domeniile HLH au rolul de a orienta corect cele dou! regiuni bazice con"inute de
subunit!"ile individuale. Nu se cunoa#te nc! mult despre modalitatea n care
proteinele HLH activeaz! transcrip"ia.
Membrii grupului bHLH includ: dou! proteine E12 #i E47 care se leag! la un
element prezent ntr-un activator al genei imunoglobulinelor, myoD, miogenina,
factorul de transcrip"ie myf-5 care este implicat n miogenez! (formarea mu#chiului),
genele myc (care sunt copii/dubluri ale oncogenelor implicate n reglarea cre#terii), #i
un grup de gene care specific! (sunt responsabile) dezvoltarea sistemului nervos la D.
melanogaster.
Proteinele bHLH se mpart n dou! subgrupe (categorii) generale:
- clasa A const! n proteinele care sunt exprimate ubicuitar, incluznd proteinele
E12/E47 de la mamifere #i musca da (musca domestic!);
- clasa B const! n proteine care sunt exprimate specific n func"ie de "esut, care
includ Myo D de la mamifere #i AC-S de la musca domestic!. Proteinele clasei bHLH
"esut specifice pot fi factori de reglare transcrip"ionali (reglatori transcrip"ionali) care
func"ioneaz! mult mai eficient prin formare de heterodimeri cu un partener cu
distribu"ie ubicuitar!. Nu se cunoa#te dac! acesta este singurul tip de activitate, sau
dac! homodimerii forma"i de proteinele bHLH ubicuitare sunt uneori folosite pentru a
regla transcrip"ia. Proteinele myc formeaz! o categorie (clas!) separat! de proteine
bHLH ai c!ror parteneri #i secven"e "int! sunt diferite.
Dimerii forma"i de proteinele bHLH difer! prin capacitatea lor de a se lega la
ADN. De exemplu, homodimerii E47, heterodimerii E12-E47, #i MyoD-E47 se
formeaz! eficient #i se leag! puternic la ADN. E12 homodimerizeaz! bine, dar se
leag! slab la ADN, n timp ce homodimerii MyoD homodimerizeaz! destul de slab.
Astfel, att formarea dimerilor ct #i legarea ADN pot reprezenta punte reglatoare
importante. n aceast! conjunctur!, este posibil! definirea unor grupuri de proteine
HLH ai c!ror membri formeaz! diferite tipuri de combina"ii (tipuri de
mperecheri/cuplaje), dar nu pentru prezice secven"ele cele mai puternic implicate n
formarea dimerilor sau legarea ADN. To"i dimerii acestui grup care leag! ADN
recunosc aceea#i secven"! consens. Nu se #tie nc! dac! diferi"ii homo- sau
heterodimeri manifest! preferin"e pentru situsurile "int! u#or diferite care sunt corelate
cu func"iile lor.
Diferen"ele de legare a ADN sunt determinate de propriet!"ile regiunii situate
n sau din apropierea motivului HLH; de exemplu, E12 difer! de E47 prin faptul c!
151
posed! o regiune inhibitoare chiar dup! regiunea bazic! #i/sau con"ine resturi de
prolin! care par s!-i deranjeze func"ia. Proteinele de acest tip au aceea#i capacitate de
dimerizare ca #i proteinele bHLH, dar un dimer care con"ine o subunitate de acest tip
nu se mai poate lega specific la ADN. Aceasta reprezint! o demonstra"ie eficace
(puternic!) a importan"ei dubl!rii motivelor de legare a ADN n proteinele care se
leag! la ADN (sau care leag! ADN).
Importan"a distinc"iei dintre proteinele ne-bazice HLH #i bHLH este sugerat!
de propriet!"ile a dou! grupe de proteine HLH: grupul da-AC-S/emc #i tipul Myo/Id.
La D. melanogaster, gena emc (extramacrochaetae) este necesar! pentru stabilirea
orient!rii normale a organelor senzoriale adulte. Ea func"ioneaz! prin suprimarea
func"iilor mai multor gene inclusiv da (daughterless) (care mpiedic! formarea de
progenituri) #i a complexului AC-S (achaete-scute), care n caz contrar (altfel)
determin! celulele adi"ionale (complementare/suplimentare) s! nu urmeze acest
destin. AC-S #i da sunt gene care apar"in tipului bHLH. Supresorul emc codific!
pentru o protein! HLH c!reia i lipse#te regiunea bazic!. Se presupune c!, n absen"a
func"iei emc, proteinele da #i AC-S formeaz! dimeri care activeaz! transcrip"ia unor
gene "int! adecvate, dar producerea proteinei emc determin! formarea heterodimerilor
care nu pot lega ADN. Astfel, producerea proteinei emc n celule adecvate (n
anumite celule) este necesar! pentru a suprima func"ia AC-S/da.
Formarea celulei musculare este dirijat! (orientat!/direc"ionat!) de o
modificare n programul transcrip"ional care necesit! numeroase proteine bHLH,
inclusiv MyoD. MyoD este produs! specific n celulele cu func"ie miogenic!; s-a
constata c! super-exprimarea MyoD n orice alt! celul! poate induce nceperea unui
program miogenic. Semnalul (declan#atorul ,mecanismul responsabil de declan#are)
diferen"ierii celulare este mai probabil un heterodimer care const! n MyoD-E12 sau
MyoD-E47 dect un homodimer MyoD/MyoD. nainte de nceperea miogenezei, un
membru al tipului de proteine HLH ne-bazice, proteina Id, se poate lega la MyoD
#i/sau E12 #i E47 pentru a forma heterodimeri care nu pot lega ADN. Acestea se leag!
la E-12/E47 mai bine dect la MyoD, #i poate func"iona prin sechestrarea partenerului
bHLH ubicuitar. Supraexpresia Id poate mpiedica miogeneza. Astfel, ndep!rtarea Id
poate fi semnalul care elibereaz! MyoD pentru a ini"ia miogeneza.
Comportamentul proteinelor HLH este ilustrat n dou! principii generale ale
regl!rii transcrip"iei. Un mic num!r de proteine formeaz! asocieri combinate; este
posibil ca aceste combina"ii particulare s! aib! diferite func"ii n ceea ce prive#te
legarea ADN #i reglarea transcrip"iei, dar pentru moment nu sunt n"elese n ntregime
func"iile relative ale proteinelor bHLH specifice unui anumit "esut #i ubicuitare.
Membrii aceleia#i clase de proteine pot func"iona ca supresori prin participarea la alte
combina"ii asociative. Diferen"ierea poate depinde fie de prezen"a fie de ndep!rtarea
unor proteine supresor particulare (anumitor proteine supresor) apar"innd clasei HLH
de proteine ne-bazice.

SLIDE 59. Factorii transcrip%ionali heterodimeri cresc op%iunile
controlului genetic
Figura: Posibilit!#i de combinare datorate form!rii factorilor de transcrip#ie
heterodimeri
a) n modelul ipotetic prezentat, factorii de transcrip"ie A, B #i C fiecare
interac"ioneaz! unul cu cel!lalt, permitnd celor trei factori s! se lege la 6 secven"e
diferite de ADN (situsurile 1-6) #i creaz! 6 combina"ii ale domeniilor de activare (de
re"inut c! fiecare situs de legare este mp!r"it n dou! jum!t!"i de situsuri #i c! un
singur factor heterodimer con"ine domeniile de activare al fiec!ruia dintre monomerii
152
constituen"i). Patru factori monomeri diferi"i se pot combina pentru a forma 10 factori
homo #i heterodimeri; cinci monomeri vor duce la formarea a 15 factori dimeri #i a#a
mai departe;
b) Cnd un factor inhibitor (n verde) se consider! c! interac"ioneaz! numai cu
factorul A, situsurile de legare 1, 4 #i 5 sunt inhibate dar situsurile 2, 3 #i 6 nu sunt
afectate
Informa#ii suplimentare
Trei tipuri de proteine de legare la ADN discutate anterior pot forma
heterodimeri: proteinele Zn finger C4, proteinele bazice zipper #i proteinele
helix-loop-helix. Alte clase de factori de transcrip"ie ale c!ror structuri nu sunt
considerate specific formeaz! #i ele proteine heterodimere. n unii factori de
transcrip"ie heterodimeri, fiecare monomer posed! un domeniu de legare a ADN cu
specificitate de secven"! echivalent!, dar rareori permite domeniilor de activare
asociate cu fiecare monomer s! fie adunate mpreun! ntr-un singur factor de
transcrip"ie. Totu#i, dac! monomerii posed! diferite specificit!"i de legare la ADN,
formarea heterodimerilor cre#te num!rul de secven"e poten"iale de ADN pe care
factorii le pot lega.
n plus, exist! exemple proteine inhibitoare bazice zipper sau de helix-
loop-helix care blocheaz! legarea ADN cnd dimerizeaz! cu un partener polipeptidic
normal capabil s! lege ADN. Cnd ace#ti factori inhibitori sunt exprima"i, ei
represeaz! activarea transcrip"ional! prin intermediul factorilor cu care ei
interac"ioneaz!.
Regulile care guverneaz! interac"iile membrilor unei clase de factori de
transcrip"ie sunt complexe. Aceast! complexitate combina"ional! poate fi extins! #i
num!rului de situsuri ADN la nivelul c!rora ace#ti factori pot activa transcrip"ia dar #i
modalit!"ilor prin care aceasta poate fi reglat!. Acest lucru nu este posibil pentru
factorii de transcrip"ie care se leag! sub form! de monomeri sau homodimeri.

SLIDE 60. Domeniile de activare manifest$ o considerabil$ diversitate
structural$
Figura 1: Structura domeniului fosforilat de activare acid CREB complexat cu
domeniul s!u de interac#iune "i co-activatorul s!u CBP
Structura polipeptidic! a domeniului activator fosyforilat acid al CREB este
reprezentat sub forma unei spirale roz. Resturile de aa din CREB care interac"ioneaz!
cu suprafa"a CBP sunt indicate prin abrevieri cu o singur! liter!. Suprafa"a domeniuli
de interac"ie cu CBP accesibil! apei este reprezentat! n spatele figurii cu regiuni de
poten"ial pozitiv #i negativ prezentate n albastru #i ro#u.
Figura 2: Efectul leg!rii ligandului asupra conforma#iei domeniilor de legare a
liganzilor n cazul a doi receptori nucleari nrudi#i de la om. Structura determinate
prin cristalografie cu raze X.
a) n absen"a leg!rii ligandului (acid 9-cis retinoic), domeniul de legare a domeniului
n receptorul RXRalfa prezint! o conforma"ie deschis!. n aceast! form!, el
func"ioneaz! ca un domeniu represor;
b) Cnd se leag! la all-trans acid retinoic, domeniul de legare a ligandului din
receptorul uman RARgama are o conforma"ie compact!. n aceast! form! acesta
poate stimula transcrip"ia.
Cilindrii reprezint! alfa-helixurile. Regiunile domeniului de legare a
ligandului care nu #i schimb! semnificativ conforma"ia datorit! leg!rii ligandului
sunt reprezentate n verde iar regiunile care o fac n galben.
Informa#ii suplimentare
153
Un domeniu de activare este o secven"! polipeptidic! care activeaz!
transcrip"ia cnd fuzioneaz! cu un domeniu de legare la ADN. De exemplu, un num!r
mare de secven"e polipeptidice pot activa transcrip"ia n celule eucariote de la un
promotor care posed! n amonte situsuri UASGAL care leag! domeniul de legare la
ADN al Gal4. S-a constatat c! aprox 1% din proteinele de fuziune compuse din
domeniul Gal4 de legare la ADN #i segmente aleatoare ale proteinelor activatoare de
la E. coli, activeaz! transcrip"ia la nivelul unui promotor de la drojdii #i mamifere care
posed! n amonte o secven"! UASGAL.
Aceste rezultate demonstreaz! c! un grup divers de secven"e peptidice pot
func"iona ca domenii de activare, chiar dac! aceste au alte func"ii n mod obi#nuit. Cu
toate aceste multe domenii de activare posed! un procentaj crescut de aminoacizi
particulari. De exeplu Gal4 #i Gcn4 ca #i majoritatea factorilor de transcrip"ie de la
drojdii sunt foarte boga"i n acid aspartic #i acid glutamic. Acestea sunt numite #i
domenii acide de activare #i sunt capabile s! activeze transcrip"ia aproape pentru toate
tipurile de celule animale, fungi, plante.
Studii biofizice recente pe modele de activatori acizi eviden"iaz! c! exist! ca
structuri polipeptidiced nestructurate, pliate la ntmplare pn! n momentul n care
ace#tia interac"ioneaz! cu o protein! co-activator. Aceast! interac"iune induce plierea
domeniului de activare ntr-o structura alfa-helix amfipatic! care intr! n contact cu o
suprafa"! complementar! a proteinei co-activatoare.

SLIDE 61. Complexele multiproteice ac%ioneaz$ la nivelul enhancer-
ilor
Figura: Model de enhanceozome (complex activator) care se formeaz! la nivelului
activatorului pentru beta-interferon.
Heterodimerii cJun/AFT2 (Activation Transcription Factor 2), IRF-3, IRF-7
(iron responsive elements/iron binding protein or iron responsive factors) #i NF-kB
(un heterodimer format din p50 #i p65) se leag! la cele 4 elemente de control ale
activatorului de aproximativ 70 pb. Legarea cooperativ! a acestor factori de
transcrip"ie este facilitat! de HMGI care se leag! la fosa minor! a ADN. Proteinele c-
jun, AFT-2, p50 #i p65 toate par s! interac"ioneze direct cu o HMGI pozi"ionat! n
apropierea lor. Plierea secven"ei activatoare determinat! de legarea HMGI este critic!
pentru formarea enhanceozomului (complexului activator). Alte proteine care se
leag! la ADN #i determin! plierea ac"ioneaz! similar la nivelul altor activatori.
Protooncogenele C-jun "i c-fos codific! proteine care uneori se asociaz!
pentru a forma un factor de transcrip#ie heterodimer, numit AP1 care se leag! la
secvren#e din regiunea promotoare "i activatoare a diferitelor gene. Att Fos ct "i
Jun pot ac#iona independent ca factori de transcrip#ie.
NF-kB (factorul nuclear pentru transcrip#ia lan#urilor k n celulele B) este un
factor de transcrip#ie heterodimer care a fost descoperit n urma unor experimente
biochimice pornind de la necesitatea acestui factor de c!tre celulele B pentru
transcrip#ia lanturilor k ale imunoglobulinelor. NF+kB este un heterodimer format
din dou! proteine nrudite p50 "i p65. Aceste proteine manifest! o regiune de
omologie la capetele lor N-terminale care este necesar! pentru legarea ADN "i
dimerizare.
Complexele multiproteice se formeaz$ la nivelul enhancerilor
Enhancerii sau activatorii sunt n general secven"e cu o lungime cuprins!
ntre 50 #i 200 pb #i con"in numeroase situsuri de legare a factorilor transcrip"ionali.
Factorii transcrip"ionali multipli care se leag! la un singur activator se
consider! c! interac"ioneaz!. Analizele activatorului care regleaz! expresia beta-
154
interferonului, o protein! important! implicat! n ap!rarea organismului uman fa"!
de infec"iile virale, furnizeaz! un bun exemplu privind modul de interac"iune al
acestor factori. La nivelul acestui activator de aproximativ 70 pb au fost identificate
patru elemente de control prin analiz! muta"ional!. Studii mai detaliate au eviden"iat
c! factorii care recunosc activatorul se leag! simultan. n prezen"a unei proteine mici
abundente asociat! cu cromatina, numit! HMGI(high-mobility-group), legarea
factorilor de transcrip"ie este nalt cooperativ!, similar! cu legarea proteinei CAP de
la E. coli #i a ARN polimerazei n regiunea promotorului operatorului lac. Aceast!
legare cooperativ! duce la formarea unui complex multi-proteic la nivelul
activatorului ADN. Termenul de enhaceozom a fost desemnat pentru a denumi
astfel de complexe nucleoproteice asamblate din factori transcrip"ionali n momentul
n care ace#tia se leag! cooperativ la situsurile multiple de legare din structura
activatorilor.
HMGI se leag! la fosa minor! a ADN indiferent de secven"! #i are drept
rezultat ndoirea rapid! a moleculei de ADN. Aceast! pliere a activatorului ADEN
permite factorilor de transcrip"ie s! interac"ioneze adecvat (curat). Interac"iile relativ
slabe dintre proteinele legate sunt activate datorit! leg!rii factorilor de transcrip"ie n
zonele vecine, men"innd proteinele la o concentra"ie relativ! foarte ridicat!.
Studiile realizate cu activatorii genei receptorului alfa din celulele T, de
asemenea important n r!spunsul imun, asamblarea enhaceozomului s-a determinat
a fi dependent! de o alt! protein! (diferit! de HGMI) care interac"ioneaz! cu fosa
minor! a ADN #i induce o curbur!. Astfel de proteine implicate n ndoirea ADN au
fost denumite proteine arhitecturale, dearece sunt necesare pentru construc"ia
acestor complexe nucleoproteice.

SLIDE 62. Mul%i represori interac%ioneaz$ cu activatorii
! Transcrip%ia de la eucariote este reglat$ de represori ct &i de activatori ;
! Situsurile de legare a represorilor pot fi identificate &i represorii purifica%i
prin acelea&i tehnici folosite pentru activatori;
! Mul%i represori din sistemele eucariote posed$ dou$ domenii: un domedniu
de legare a ADN &i un domeniu represor
Studii genetice #i biochimice au demonstrat c! transcrip"ia la eucariote este reglat!
att prin proteine represoare ct #i activatoare. De exemplu, geneticienii au identificat
muta"ii la drojdii care au implica"ii n exprimarea constitutiv! a anumitor gene,
indicnd c! aceste gene sunt n mod normal reglate de c!tre un represor. n alte studii,
au fost identificate situsuri de legare arepresorilor prin analize muta"ionale sistematice
ale regiunilor implicate n procesul de transcrip"ie de la eucariote, similare cu cele
realizate pentru procariote. n timp ce o muta"ie la nivelul unui situs de legare a
activatorilor conduce la descresterea expresiei genei raportor corelate, muta"ia la
nivelul situsului de legare a represorului conduce la cre#terea expresiei genei raportor.
Proteinele represoare care se leag! la astfel de situsuri au fost purificate #i
caracterizate folosind cromatografie de afinitate #i secven"e specifice, ca #i n cazul
proteinelor activatoare.
Absen"a unei activit!"i represoare adecvate poate avea consecin"e
devastatoare. De exemplu, proteina codificat! de c!tre gena WT1 (tumoarea Wilm)
este un represor care se exprim! preferen"ial n dezvoltatrea rfinichiului. Copii care
mo#tenesc muta"ii att la nivelul genei materne ct #i paterne a WT1, nu vor produce
o protein! func"ional! WT1 #i vor dezvolta invariabil tumori renale de foarte
timpuriu. Proteina WT1 care are un domeniu de legare a ADN de tip C2H2 zinc
finger, se leag! la regiunea control a genei care codific! un factor de transcrip"ie
155
numit EGR-1. Aceast! gena asemeni altor gene de la eucariote este supus! att
activ!rii ct #i repres!rii. Legarea WT1 represeaz! transcrip"ia genei EGR-1 f!r! a
inhiba legarea a doi activatori care n mod normal stimuleaz! expresia acestei gene.
Represorii transcrip"ionali eucariotici de tipul WT1 par s! fie opu#ii func"ionali ai
activatorilor. Ei pot inhiba transcrip"ia unei gene pe care ei n mod normal nu o
regleaz! cnd situsul lor de recunoa#tere este plasat ntr-un intervalul de cteva sute
de perechi de baze fa"! de situsul de start al genei respective.
Assemeni activatorilor, mul"i represori prezint! dou! domenii func"ionale:
domeniul de legare #i domeniul de represare. A#a cum se ntmpl! #i n cazul
domeniilor activatoare, o varietate de secven"e de aminoacizi pot func"iuona ca
domenii represoare. Multe dintre acestea sunt relativ scurte (de aproximativ 20
aminoacizi) #i con"in por"iuni ntinse de animoacizi hidrofobi. Alte domenii
represoare con"in por"iuni mari de aminoacizi bazici. n unele cazuri, domeniile
represoare sunt mai mari #i bine structurate. De exemplu, n absen"a ligandului,
domeniul de legare RXRalfa func"ioneaz! ca un domeniu represiv. Cnd acela#i
domeniu leag! ligandul s!u de recunoa#tere acidul 9-cis retinoic, el este transformat
ntr-un domeniu de activare. Ca #i pentru domeniile de activare, diferitele structuri ale
domeniilor represoare sunt probabil a reflectare a mai multor posibile mecanisme de a
reglare a transcrip"iei la eucariote.

SLIDE 63. Concluzii
Factorii de transcrip"ie, care stimuleaz! sau reprim! transcrip"ia, se leag! la
elemente situate n proximitatea promotorului #i la enhancers (activatori) din
structura ADN la eucariote;
Activatorii sunt n general proteine modulare, care con"in un singur domeniu
de legare #i unul sau mai multe domenii activatoare; diferitele domenii sunt adesea
legate prin regiuni polipeptidice flexibile. Acestea permit domeniilor diferi"ilor
activatori s! interac"ioneze chiar #i cnd domeniile de legare la ADN recunosc situsuri
separate de zeci de perechi de baze;
Activatorii con"in, n general, mai multe situsuri de legare pentru factorii de
transcrip"ie grupate sub form! de clustere. Legarea cooperativ! a mai multor
activatori la situsuri nvecinate din structura unui activator formeaz! un complex
multi-proteic numit complex activator. Asamblarea acestuia necesit! adesea
proteine mici care se lreag! la fosa minor! a ADN #i determin! curbarea rapid! a
secventei permitnd proteinelor de pe fiecare parte a curburii s! interac"ioneze mult
mai bine;
Majoritatea represorilor de la eucariote sunt proteine modulare. Similar cu
activatorii, ace#tia con"in de obicei un singur domeniu de legare #i unul sau mai multe
domenii represoare, #i pot controla transcrip"ia cnd sunt lega"i la situsuri situate la
sute sau mii de baze fa"! de situsul de start;
Domeniile de legare la ADN ale factorilor de transcrip"ie de la eucariote
exprim! o varietate de structuri. Printre cele mai comune motive structurale sunt
homeodomeniile, domeniile bazice fermoar de leucin! (leucine zipper), HLH #i
diferite tipuri de degete zinc (zinc finger). n general una sau mai multe alfa-elice din
domeniul de legare la ADN interac"ioneaz! cu fosa major! la nivelul unor situsuri de
recunoa#tere;
Capacitatea anumitor factori de transcrip"ie de a forma heterodimeri cre#te
num!rul de situsuri ADN pe care ace#ti factori le pot controla #i modalit!"ile prin care
le pot controla;
156
De#i anumite domenii de activare #i de represare sunt bogate n aminoacizi
particulari, aceste domenii func"ionale manifest! o varietate de secven"e de
aminoacizi #i structuri proteice caracteristice diferi"ilor factori transcrip"ie.

SLIDE 64. Complexul ARN polimerazic II de ini%iere a transcrip%iei
! Ini%ierea de c$tre Pol II necesit$ factori generali de transcrip%ie, care
pozi%ioneaz$ Pol II la nivelul situsului de ini%iere &i sunt necesari pentru
transcrierea marii majorit$%i a genelor transcrise de c$tre aceast$
polimeraz$;
! Factorii generali de transcrip%ie sunt structuri multimere &i nalt conservate;
! Proteinele cuprinse n complexul Pol II de ini%iere a transcrip%iei se
asambleaz$ ntr-o ordine specific$ in vitro dar majoritatea proteinelor se
pot combina pentru a forma un complex holoenzimatic in vivo.
Anterior am discutat c! ARN polimeraza de la E. coli lipsit! de subunitatea
sigma70 nu poate ini"ia transcrip"ia. Totu#i, cnd core polimeraza este asociat! cu
subunitatea sigma70, holoenzima rezutat! poate ini"ia transcrip"ia in vitro pornind de
la promotori puternici. Astfel, subunitatea sigma70 func"ioneaz! ca un factor de
ini"iere care este absolut necesar pentru nceperea transcrip"iei #i care este eliberat de
pe matri"! o dat! ce s-a produs polimerizarea primilor aproximativ 10
ribonucleotidtrifosfa"i.
Din contr!, transcrip"ia in vitro cu ARN polimeraza II purificat! necesit!
ad!ugarea unui num!r mare de factori de ini"iere care sunt separa"i de complexul
polimerazic n timpul purific!rii. Ace#ti factori de ini"iere, care pozi"ioneaz! ARN
polimeraza II la nivelul situsurilor de ini"iere a transcrip"iei, sunt numi"i factori
generali de transcrip"ie, deoarece se consider! c! ei sunt necesari pentru transcrip"ia
majorit!"ii genelor de c!tre acest tip de polimeraz!. Un complex de ini"iere a
transcrip"iei con"ine ARN polimeraza #i diferi"i factori generali implica"i n
transcrip"ie care se leag! al regiunea promotoare.
Mul"i dintre factorii generali de transcrip"ie necesari polimerazei II pentru
ini"ierea transcrip"iei de la nivelul majorit!"ii promotorilor care con"in o TATA box au
fost izola"i #i caracteriza"i.
Aceste proteine au fost desemnate cu terminologia TFIIA, TFIIB, etc,
majoritatea fiind proteine multimere. TFIID este unul dintre cei mai mari factori
avnd o mas! molecular! de aprox 750 kDa. Acesta con"ine o singur! protein! de
aprox 38 kDa numita TATA box-binding protein (TBP) #i 11 factori asocia"i TBP
numi"i TAF (TATA Asociated factors) care nu au fost foarte bine caracteriza"i. Factori
generali de transcrip"ie cu activit!"i similare au fost izola"i din celule umane n
cultur!, ficat de #obolan, embrfioni de Drosophila, #i drojdii. Genele care codific!
aceste proteine la drojdii au fost secven"ializate o dat! cu secven"ializarea complet! a
genomului de drojdii ca #i n cazul ADNc uman #i a celui de la Drosophila. n toate
cazurile, factorii de transcrip"ie echivalen"i de la diferitele tipuri de eucariote sunt
foarte bine conserva"i. De#i factorii genera#i de transcrip"ie permit polimerazei II s!
ini"ieze transcrip"ia in vitro la nivelul acelora#i situsuri prezente in vivo, proteine
adi"ionale sunt necesare pentru ini"ierea transcrip"iei in vivo.

SLIDE 65. Etapele procesului de asamblarea a complexului Pol II de
ini%iere a transcrip%iei in vitro
Figura: Etapele asambl!rii complexului de ini#iere atranscrip#iei pornind de la ARN
pol II #i factori de transcrip#ie izola#i.
157
O dat! ce ntreg complexul de ini"iere a fost asamblat, se produce separarea
catenelor ADN la situsul de start pentru a forma complexul deschis care necesit!
hidroliza ATP. O dat! ce transcrip"ia ini"iaz! #i transcrip"ia ncepe s! se deruleze de la
nivelul prpmotorului, CTD se fosforileaz! #i factorii generali de transcrip"ie disociaz!
de complexul de legare TBP de la nivelul promotorului. Numeroase alte proteine
particip! la ini"ierea transcrip"iei in vivo.
n majoritatea studiilor biochimice asupra asanbl!rii complexului de ini"iere al
Pol II, cercet!torii au folosit mai degrab! TBP (TATA binding protein) dect
complexul TFIID coimplet format din multe subunit!"i #i care este dificil de purificat.
Legarea TBP #i a altor factori generali de transcrip"ie la promotorii cu secven"e
consens TATA a fost analizat! prin tehnica de foot-printing cu DN-aza I #i prin
tehnica electroforetic! de ntrziere n gel. Aceste studii demonstreaz! c! complexul
PolII de ini"iere este asamblat in vitro n conformitate cu secven"a de reac"ii
determinat! #i prezentat! n imagine.
In vitro, TBP este prima protein! care se la promotorul TATA box. Toate
proteinele eucariote TBP analizate prezint! domenii C-terminale foarte similare de
aproximativ 180 de aminoacizi. Secven"a acestei regiuni prezint! o omologie de 80%
de la drojdii la om, majoritatea diferen"elor fiind substitu"ii conservative. Acestea
conserv! func"iile domeniului C-terminal ca #i ntreaga lungime a proteinei n urma
transcrip"iei in vitro. Domeniul N-terminal al TBP, care variaz! foarte mult ca
secven"! #i lungime la diferite eucariote, func"ioneaz! n transcrip"ia genelor care
codific! pentru ARNsn.

SLIDE 66. Asamblarea in vitro assembly a complexului de preinitiere a
ARN polimerazei II
Factorii de transcriptie generali se leaga secvential la ARN polimeraza II
purificata (Pol II), la nivelul secventei ADN TATAbox pentru a forma complexul de
preinitiatiere. Hidroliza ATP furnizeaza energia pentru desfacerea moleculelor de
ADN la situsul de start prin legarea subunitatii TFIIH subunit. Initierea transcriptiei
de catre Pol II conduce la formarea complexului deschis, iar polimeraza se deplaseaza
de la nivelul promotorului iar domeniul CTD este fosforilat. In vitro, factorii generali
de transcriptie (cu exceptia TBP) disociaza de complexul TBP si promotor, dar nu se
stie inca care dintre factori raman asociati cu regiunea promotoare pentru fiecare
runda de initiere a transcriptiei, in vivo.

SLIDE 67. Domeniile C-terminale conservate ale TBP de legare la
TATA-box DNA
Figura: Structura domeniului C-terminal al TBP legat la ADN TATA-box.
De#i TBP este un monomer, lan"ul polipeptidic al acestui domeniu este pliat
ntr-o conforma"ie care are o simetrie bilateral!. Totu#i, resturile de de suprafa"! ale
proteinei se disting clar n dou! p!r"i. TBP se leag! la fosa minor! a ADN TATA-box,
distorsionnd structura normal! a dublului helix ndoind dramatic ADN.
Figura se bazeaz! pe analizele de cristalografie cu raze X #i demonstraz!
legarea la TATA-box. Asemeni HMGI #i altor proteine care produc ndoirea ADN
care particip! la formarea enhanceozomului sau complexului de activare.
O dat! ce TBP se leag! la TATA-box, se poate lega #i TFIIB care este o
protein! monomer mai mic! dect TBP. Domeniul s!u C-terminal vine n contact att
cu ADN ct #i cu TBP. Domeniul N-terminal al al TFIIB se extinde c!tre situsul de
start, dar structura sa tridimensional! nu este nc! cunoscut!. Dup! plierea TFIIB, un
158
complex pre-format din TFIIF (un tetramer alfa2beta2) #i Pol II se leag! #i
pozi"ioneaz! polimeraza peste situsul de start. n complexul de preini"iere, care este
stabil, cele dou! subunit!"i mai mari ale Pol II (L #i L) interac"ioneaz! cu promotorul
ADN de-a lungul unui canal de aproximativ 240 A care se extinde n amonte #i in
aval de situsul de start. La majoritatea promotorilor, se leag! nc! doi factori generali
nainte de separarea duplexului ADN #i expunerea catemei matri"!. Primul care se
leag! este TFIIE (un tetramer alfa2beta2) care creaz! un situs de legare pentru TFIIH,
un alt factor multimer care con"ine nou! subunit!"i. Legarea TFIIH completeaz!
complexul de ini"iere a transcrip"iei in vitro.
n prezenta ATP, se manifest! activitatea helicazic! a TFIIH care desface
duplexul ADN la nivelul situsului de start, permitnd ADN Pol II formarea
complexului deschis. Dac! sunt ad!uga"i nucleotidtrifosfa"i Pol II ncepe transcrip"ia
matri"ei. n timp ce polimeraza ncepe transcrierea dincolo de regiunea promotoare o
alt! subunitate a TFIIH fosforileaz! Pol II CTD la multiple situsuri.
Complexele minimale de transcrip"ie in vitro con"in numai aceste elemente
generale #i Pol II purificat!. Dup! ini"iere TBP r!mne legat! la TATA-box n timp ce
polimeraza realizeaz! transcrip"ia dincolo de promotor n timp ce ceilal"i factori
disociaz!. Asa cum am discutat se pare c! in vivo transcrip"ia necesit! si al"i factori
transcrip"ionali; nu este clar care dintre factori r!mn asocia"i cu regiunea promotoare
dup! ini"iere.

SLIDE 68. Modelul structural al complexului promotor ADN,
TBP, TFIIB, &i Pol II
Figura: Modelul structural al complexului compus din promotorul ADN, TBP, TFIIB
"i ARN polimreraza II indicnd m!rimile relative ale componentelor.
Cele dou! vederi ale complexului cu 180
o
din fa"! #i din spate.

SLIDE 69. Concluzii
ARN polimeraza II necesit! mai mul"i factori generali de transcrip"ie pentru a
localiza clar punctul de start la nivelul matri"ei ADN #i a ini"ia transcrip"ia. Acestea
includ TFIID care se leag! la TATA-box prin intermediul TBP;
Transcrip"ia genelor care codific! pentru proteine este controlat! de c!tre
ARN polimeraza II care poate fi ini"iat! in vitro prin legarea secven"ial! a factorilor:
TBP, care se leag! la TATA-box; TFIIB; un complex Pol II #i TFIIH; TFIIE; #i final
TFIIH;
Activit!"ile helicazice ale celor dou! subunit!"i TFIIH separ! catenele la
nivelul situsului de start la majoritatea promotorilor, un proces care necesit! hidroliza
ATP. Dup! ce pol II ncepe transcrierea dincolo de situsul de start, elementele CTD
sunt fosforilate de c!tre o alt! subunitate a TFIIH;
Ini"ierea de c!tre Pol II in vivo necesit! un complex multimediator
multiproteic, care se asociaz! cu elementele CTD nefosforilate ale Pol II, formnd un
mare complex holoenzimatic care include #i majoritatea factorilor de transcrip"ie. Se
crede c! aceast! holoenzim! preasamblat! se leag! la ADN promotor ntr-o singur!
etap! in vivo;
Complexul de ini"iere a transcrip"iei care se asambleaz! la nivelul
promotorilor in vivo poate cuprinde 60-70 polipeptide cu o mas! total! similar! cu
cea a unui ribozom.

159
SLIDE 70. Mecanismele moleculare ale controlului transcrip%ional la
eucariote
Controlul transcrip"ional n celulele eucariote poate fi vizualizat ca implicnd
numeroase nivele de reglare. Concentra"iile #i activit!"ile activatorilor #i represorilor
care controleaz! transcrip"ia multor gene care codific! pentru proteine sunt reglate n
timpul diferen"ierii celulare #i ca r!spuns la hormoni #i la semnalele celulelor
nconjur!toare.
Ace#ti activatori #i represori regleaz! n schimb #i modific!rile n structura
cromatinei #i n acetilarea #i deacitilarea histonelor, influentnd astfel capacitatea
factorilor generali de transcrip"ie s! se lege la promotori. n plus, activatorii #i
represorii regleaz! direct asamblarea complexelor de ini"iere a transcrip"iei.
Reglarea prin controlul structurii cromatinei
Cromatin!-Nucleosomi (care con"in 146 pb ADN)-fibre de cromatin! de 30 nm.
Capetele N-terminale ale fiec!rei histone (20-60 aminoacizi n func"ie de
fiecare histon!) se extind c!tre suprafa"a nucleosomului. Aceste capete histonice N-
terminale sunt bogate n resturi de lizin! care pot fi modificate reversibil prin
acetilare, fosforilare #i metilare ca #i prin ad!ugarea unei molecule singulare de
ubiquitin!, o protein! nalt conservat! de 76 de resturi.
Fosforilarea are un rol important dar este nc! pu"in n"eleas! func"ia sa n
condensarea cromozomului n timpul mitozei. Func"iile altor modific!ri sunt de
asemenea pu"in n"elese, cu excep"ia acetil!rii. Acetilarea histonelor N-terminale este
asociat! cu controlul genetic n timpul interfazei. Alte proteine mai pu"in abundente
dect histonele sunt #i ele asociate cu cromatina. Acestea includ proteinele HMG care
particip! la formarea enhanceozomilor (complexelor activatoare).

SLIDE 71. Aranjament al locilor de conjugare pe cromozomul III de la
drojdie
Figura: Genele de pe cromozomul III implicate n controlul conjug!rii (mating) la
drojdii (S. Cerevisiae)
Genele silen"ioase (ne-exprimate) implicate n conjugare (fie a sau alfa n
func"ie de su#!) sunt localizate pe locusul HML. Genele de tip opus sunt prezente pe
locusul silen"ios HMR. O dat! la fiecare diviziune celular!, secvedn"a ADN de pe
HML este transferat! locusului MAT; n diviziunile celulare alternative, secven"a
ADN de pe HMR este transferat! locusului MAT. Cnd secven"ele alfa #i a sunt
prezente la locusul MAT, ele pot fi transcrise n ARNm ale c!ror proteine codificate
sunt factori de transcrip"ie care regleaz! expresia genelor specifice implicate n
conjugare. Secven"e silen"ioase de legare a proteinelor situate lng! HML #i HMR
leag! proteinele care sunt critice pentru represia acestor loci silen"io#i.
Diferite experimente au demonstrat c! represia locilor HML #i HMR este
rezultatul condens!rii structurale a cromatinei care blocheaz! steric interac"ia
factoriilor de transcrip"ie cu ADN. ADN din structura locilor silen"io#i este inaccesibil
proteinelor in general (nici macar metilazei), inclusiv factorilor de transcrip"ie #i ARN
polimerazei. Studii asupra regiunilor N-terminale ale histonelor H3 #i H4 au
eviden"iat c! acestea derepreseaz! locii silen"io#i, lasnd de exemplu Dam metilaza s!
aiba acces la secven"ele GATC din strunctura HML #i HMR. Aceste rezultate indic!
c! interac"iile specifice care implic! regiunile N-terminale ale histonelor H3 #i H4
sunt necesare pentru represia la nivelul locilor silen"io#i de conjugare.
Informa#ii suplimentare
160
Activatorii #i represorii care se leag! specific la situsurile ADN #i regleaz!
expresia genelor care codific! pentru proteine associate, realizeaz! acest lucru prin
dou! mecanisme generale; aceste gene reglatoare ac"ioneaz! concertat cu alte proteine
pentru a modula structura cromatinei, influentnd astfel capacitatea de legare la
promotori a factorilor generali de transcriptie. Trebuie s! ne reamintim c! ADN din
celulele eucariote nu este liber ci asociat cu o mas! aproximativ egal! de proteine
pentru a forma cromatina. Unitatea structural! de baz! a cromatinei este nucleosomul,
care este compus din aproximativ 147pb ADN strns nf!#urat n jurul unei structuri
n form! de disc format! din histone. Resturile din regiunile N-terminala #i C-
terminal! a histonelor (ex. H2A), numite cozile histinei (histone tails), dep!#esc
suprafa"a nucleosomului #i pot fi modificate reversibil. Astfel de modific!ri, n special
acetilarea cozilor histonelor H3 #i H4, influen"eaz! condensarea relativ! a cromatinei
#i astfel #i accesibilitatea proteinelor necesare pentru ini"ierea transcriptiei. Pe lng!
rolul lor n medierea controlului transcrip"ional, realizat! prin intermediul cromatinei,
activatorii #i represorii interac"ioneaz! cu un complex multiproteic mare numit
complexul mediator al transcrip"iei (mediator of transcription complex) sau simplu
mediator. Acest complex se leag! la randul lui la Pol II #i regleaz! direct asamblarea
complexelor de preini"iere a transcrip"iei. n aceast! sec"iune, reluam n"elegerea
curent! a modului n care activatorii #i represorii sunt controla"i, astfel ncat expresia
genelor s! fie adaptat! la nevoile celulei #i ale organismului.
Formarea heterocromatinei silen#iaz$ (atenueaz$) expresia genelor la nivelul
telomerilor, n proximitatea centromerilor dar "i n alte regiuni.
Ani la rnd a fost clar c! inactivarea genelor n celulele eucariote este adesea
asociat! cu prezen"a heterocromatinei, regiuni ale cromatinei care sunt mult mai
condensate #i se coloreaz! mult mai nchis, cu cloran"i pentru ADN, dect
eucromatina, la nivelul c!reia se afla cele mai transcrise gene. Regiunile de la nivelul
cromozomilor situate n proximitatea centromerilor #i telomerilor #i adesea alte
regiuni adi"ionale specific care variaz! n diferitele tipuri celulare sunt organizate n
heterocromatin!. ADN din heterocromatin! este mai pu"in accesibil #i "n consecin"!
este adesea numit cromatina nchis!. De exemplu, a#a cum am v!zut n capitolul
anterior, ADN din genele inactive a fost g!sit ca fiind mult mai rezistent la digestie cu
DNazaI dect ADN din genele intens transcrise.
Studiul regiunilor de ADN din S. cerevisiae care se comport! ca #i
heterocromatina de la eucariotele superioare furnizeaz! informa"ii pre"ioase privind
represia transcrip"iei mediate de cromatin! (chromatin-mediated repression of
transcription). Aceasta drojdie are n ciclul s!u de cre#tere att forme haploide ct #i
diploide. Celulele haploide manifest! una din cele dou! forme celulare care pot
participa la procesul de conjugare: tipul a #i ! (alfa). Celulele apar"innd la tipuri
diferite de conjugare se pot conjuga sau fuziona pentru a genera celule diploide.
Cnd o celul! haploid! se divide prin nmugurire, celula mai mare, mam! suport!
o modificare (switches) a tipului celular de conjugare. Analizele genetice #i
moleculare au eviden"iat existen"a a trei loci genetici pe cromozomul III de drojdie
care controleaz! procesul de conjugare a celulelor de drojdie. Dintre cei trei loci,
numai locusul central MAT este transcris activ. Ceilalti loci adi"ionali, numi"i HML #i
HMR, situa"i lng! telomerii din stanga #i respectiv din dreapta, con"in copii
silen"ioase (silent) netranscrise ale genelor a sau ! (alfa). Aceste secven"e sunt
transferate alternativ de pe HML sau HMRa pe locusul MAT printr-un tip de
recombinare nereciproc! ntre cromatidele surori n timpul diviziunii. Cnd locusul
MAT con"ine secven"a ADN din HML!, celulele devin ! (alfa). Cnd locusul MAT
con"ine secven"ele ADN din HMRa, celulele devin a. n acest capitol noi suntem
161
interesa"i s! ntelegem cum se realizeaz! represia transcrip"iei la nivelul locilor
silen"io#i de conjugare HML #i HMR. Dac! genele de la nivelul acestor loci sunt
exprimate, a#a cum se ntmpl! n cazul suselor mutante cu defecte n mecanismele
de represare, att proteinele a #i ! (alfa) sunt exprimate, determinnd celulele sa aib!
un fenotip asemanator cu cel al celulelor diploide, care nu se pot conjuga. Promotorii
#i UAS (Upstream activating sequences) #i regiunile care controleaz! transcrip"ia
genelor a #i ! (alfa) se afl! n apropierea centrului secven"ei care este transferat! #i
sunt identice indiferent dac! secven"ele sunt pe locusul MAT sau pe unul dintre locii
silen"io#i. n consecin"!, func"ia factorilor de transcrip"ie care interac"ioneaz! cu
aceste secven"e este ntr-ul fel blocat! la nivelul HML #i HMR. Aceasta represie la
nivelul locilor silen"iosi depinde de secven"ele cu rol de silen"iere (silencer
sequences) localizate n apropierea regiunii de transfer a secven"elor ADN la nivelul
locusurilor HML #i HMR. Se constat! c! dac! silen"iatorul este nl!turat, locusul
silen"ios este transcris.
Remarcabil, orice gen! situat! lng! secven"a silen"iatoare a procesului de
conjugare, prin tehnici de recombinare a ADN, este represat! sau silen"iat! chiar dac!
gena ARNt transcris! de c!tre ARN polimeraza III, care folose#te un set diferit de
factori generali de transcrip"ie fa"! de ARN polimeraza II.
Numeroase studii indic! c! represia locilor HML #i HMR este determinat! de o
structur! cromatidic! condensat! care blocheaz! steric factorii de transcrip"ie care
interac"ioneaz! cu ADN. ntr-un experiment, gena care codific! pentru enzima care
metileaz! resturile de Adenina din secven"ele GATC, la E. coli, a fost introdus! n
celulele de drojdii sub controlul unui promotor de drojdie astfel nct enzima s! fie
exprimat!. Cercetatorii au eviden"iat c! secven"ele GATC din interiorul locusului
MAT #i din multe alte regiuni ale genomului acestor celule au fost metilate, dar nu #i
cele din structura locilor HML #i HMR. Aceste rezulate indic! c! secven"ele ADN de
la nivelul locusurilor silentioase sunt inaccesibile metilazei de la E. coli #i n general
tuturor proteinelor, inclusiv factorilor de transcrip"ie #i ARN polimerazei.
Experimente similare realizate cu diferite suse mutante de drojdii la nivelul histonelor
au indicat existen"a unor interac"ii specifice care implic! cozile histonelor H3 #i H4
sunt necesare pentru formarea unor structuri cromatinice nalt represate. Alte studii au
ar!tat c! telomerii fiec!rui cromozom de drojdie devin structuri de tip silen"ios. De
exemplu, cnd o gen! este plasat! la cteva kilobaze de orice telomer de drojdie,
expresia sa va fi represat!. n plus, aceasta represie este exonerat! de acelea#i muta"ii
n structura cozilor histonelor H3 #i H4 care interfer! cu represia la nivelul locilor
silen"iosi de tip conjugare.
Studiile genetice au condus la identificarea mai multor proteine, RAP1 #i 3
proteine SIR, care sunt necesare pentru represarea #i silen"ierea locilor tip conjugare #i
a telomerilor de la drojdii. RAP1 a fost identificat! ca fiind legat! la nivelul
secven"elor ADN de silen"iere asociate cu HML #i HMR #i cu o secven"! multi-
repetitiv! care se g!se#te la nivelul fiec!rui telomer din cromozomii de drojdie.

SLIDE 72. Numeroase gene codific$ proteine care leag$ locii silen%io&i
specific la nivelul telomerilor de drojdii
Figura: Co-localizarea proteinei Sir3 cu heterocromationa telomeric! n nucleii de
drojdii
a) Micrografii confocale pentru trei celule diploide de drojdii, fiecare con"innd
cte 34 telomeri. Telomerii au fost marca"i prin hibridizare cu o sond! marcat!
fluorescent, specific! telomerilor (galben). ADN a fost colorat n ro#u pentru a
162
eviden"ia nucleii. Cei 34 telomeri se ntrep!trund ntr-un num!r mult mai mic de
regiuni situate la periferia nucleului.
b) #i c) sunt imagini de microscopie confocal! ale celulelor de drojdii marcate
prin hibridizare cu o sond! specific! telomerilor de drojdii (b) #i cu anticorp specfic
fa"! de Sir3 marcat fluorescent (c). De re"inut c! Sir3 este localizat! la nivelul
heterocromatinei represate de la nivelul telomerilor. Experimente similare au fost
realizate #i cu Rip1, Sir2 #i Sir4 au demonstrat c! aceste proteine sunt #i ele co-
localizate cu heterocromatina telomeric!.
Au fost realizate studii genetice cu numeroase gene: RAP1 #i 3 SIR (silent
Information regulator) care sunt necesare pentru represia locilor silen"io#i implica"i n
conjugare #i prezen"i la nivelul telomerilor. De exemplu, RAP1 codific! pentru o
protein! care se leag! n interiorul unor secven"e de ADN silen"iose asociate cu HML
#i HMR #i cu o secven"! care este repetat! de mai multe ori la nivelul fiec!rui telomer
al cromozomului de drojdie. Studii biochimice mai recente au demonstrat c! aceste
proteine se leag! ntre ele #i c! mpreun! se leag! la capetele terminale ale histonelor
H3 #i H4. Microscopia confocal! n imunofluorescen"! asupra celulelor de drojdii
marcate cu anticorpi fa"! de proteinele Sir #i Rap #i hibridizate cu o sond! ADN care
recunoa#te regiunea telomeric!, eviden"iaz! c! aceste proteine formeaz! structuri
multiproteice mari cu localizare telomeric! asem!n!toare heterocramatinei eviden"iate
la eucariotele superioare.

SLIDE 73. Model schematic al silencing la telomerii de drojdii (1)
Figura: Modelul schematic al mecanismului de atenuare (silencing) la nivelul
telomerilor de drojdii
Mai multe copii ale Rap1 se leag! la o secven"! repetitiv! simpl! situat! n
fiecare regiune telomeric!, care este lipsit! de nucleozomi (sus). Aceasta determin!
asamblarea unui complex multiproteic (jos) prin realizarea unor interac"ii protein!-
protein! ntre Rap1, Sir2, Sir3 #i Sir4 #i cozile aminoterminale hipoacetilate ale
histonelor H3 #i H4 din structura nucleozomilor nvecina"i. Asterixurile marcheaz!
prezen"a cozilor amino-terminale hiperacetilate ale histonelor. Structura
heterocromatinei cuprinde aproximativ 4 kb din secven"a ADN situat! n vecin!tatea
situsurilor de legarea ale Rap1 #i respectiv a secven"ei acesteia.
Structura actual! a heterocromatinei nalt organizate nu este nc! cunoscut! #i
n"eleas!.
silencing (amortizare, atenuare) la organismele superioare
Reglarea transcrip"iei prin intermediul represiei mediate de heterocromatin!
este foarte important! la eucariotele superioare. De exemplu, expresia factorilor de
transcrip"ie Hox, care regleaz! factorii de transcrip"ie, care regleaz! dezvoltarea
planul corpului (de exemplu, anatomia normal!) la majoritatea animalelor.
Mecanismul acestei represii este nc! n curs de studiu dar analizele genetice realizate
la Drosophila au eviden"iat c! multe proteine nucleare sunt implicate n formarea
regiunilor de heterocromatin! la nivelul unor situsuri specifice din structura genelor
Hox.

SLIDE 74. Model schematic al silencing la telomerii de drojdii (2)
Mai multe copii ale RAP1 se leag! la o secven"! simpl! repetitiv! de la nivelul
fiec!rei regiuni telomere care este lipsit! de nucleozomi (sus). Acestea determin!
asamblarea unui complex multiproteic (jos) printr-un mecanism de interac"ie protein!-
protein! dintre RAP1, SIR2, SIR3, SIR4 #i cozile N-terminale hipoacetilate H3 #i H4
ale nucleozomilor nvecina"i. SIR2 are rolul de a deacetila cozile histonelor. Structura
163
heterocromatinic! pentru fiecare telomer con"ine aproximativ 4kb ADN din
vecinatatea situsurilor de legare RAP1 indiferent de secven"!. Asocierea mai multor
telomeri condensa"i formeaz! complexe de cromatin! nalt-ordonate care blocheaz!
steric alte proteine n interac"ia cu ADN [Adapted from M. Grunstein, 1997, Curr.
Opin. Cell Biol. 9:383.]
Alte studii biochimice arat! c! proteinele SIR se leag! una la cealalt! #i c!
dou! astfel de proteine se leag! la cozile N-terminale ale histonelor H3 #i H4 care sunt
men"inute ntr-o stare neacetilat! extins! prin activitatea deacetilazic! a SIR2. Mai
multe experimente bazate pe microscopia confocal! de fluorescen"! pe celule de
drojdii, fie prin marcare cu anticorpi marca"i la oricare dintre proteinele SIR sau
RAP1 sau prin hibridizarea cu o sond! marcat! specific! telomerilor, au eviden"iat c!
aceste proteine formeaz! structuri nucleoproteice condensate cu telomerii,
asem!n!toare heterocromatinei g!site la eucariotele superioare.
Modelul silen"ierii mediate de c!tre cromatin! la telomerii de drojdie se
bazeaz! #i pe alte studii. Formarea heterocromatinei la telomeri este nucleat! prin mai
multe proteine RAP1 care se leag! la secven"e repetitive ntr-o regiune lipsit! de
nucleozomi la extremitatea extern! a telomerilor. Se formeaz! o re"ea de interac"ii
proteine-proteine care implic! telomerii la care se leag! RAP1, trei proteine SIR (2,3
#i 4) #i histonele H3 #i H4 hipoacetilate #i care creeaz! un complex nucleoproteic
supraorganizat care include mai multi telomeri #i n care ADN nu este deloc accesibil
(sau este pu"in accesibil) proteinelor externe. O alt! protein!, SIR1, care este necesar!
pentru silen"ierea locilor silen"iosi implica"i n conjugare. De#i func"ia SIR1 nu este
inca bine inteleasa, se stie ca aceasta este asociata cu regiunea de silentiere, unde se
considera ca ar putea determina asocieri ulterioare a complexului de silen"iere
multiproteic de la nivelul telomerilor astfel nct procesul de silen"iere se r!spande#te
mai departe pornind de la capetele cromozomilor cuprinznd HML #i HMR.
O trasatur! import!nt! a acestui model este dependen"a silen"ierii de
hipoacetilarea cozilor histonelor. Aceasta a fost demonstrat! n experien"e pe drojdii
mutante care exprim! histone, n care histonele de la capetele N-terminale sunt
substituite cu arginine sau glutamine. Arginina este pozitiv nc!rcat!, asemeni lizinei,
dar nu poate fi acetilat!. Se consider! c! aceasta func"ioneaz! n cozile N-terminale
ale histonelor la fel ca lizina neacetilat!. Represarea la nivelul telomerilor #i la nivelul
locilor silen"io#i de conjugare a fost g!sit! deficient! la mutan"ii cu substitu"ii pentru
glutamin! dar nu #i la mutan"ii cu substitu"ii pentru arginin!. Hiperacetilarea cozilor
histonelor H3 #i H4 ulterior a fost g!sit! ca interfernd cu legarea SIR3 #i SIR4. De#i,
represia transcrip"iei mediat! de cromatin! este de asemenea important! la eucariotele
multicelulare, mecanismul acestei represii este inactiv n curs de elaborare. Studii
genetice #i biochimice la Drosophila au eviden"iat c! mai multe proteine asociate ntr-
un complex multi-proteic mare particip! la acest proces. Acestea se numesc complexe
"Polycomb". Ca #i n cazul leg!rii proteinelor SIR la telomerii de drojdie, aceste
proteine Polycomb de la Drosophila pot fi vizualizate legate la genele pe care le
represeaz! n mai multe pozi"ii specifice din genom prin folosirea de anticorpi marca"i
fa"! de cromozomii politeni din glandele salivare.






164
SLIDE 75. Metoda de imunoprecipitare a cromatinei eviden%iaz$ starea
de acetilarea a histonelor din structura cromatinei

Histonele pot fi usor cross-legate la ADN, in vivo, dac! se folose#te un agent
chimic care asigur! cros-linkarea reversibil! #i pentru care celula este permeabil!. n
figur!, nucleosomii cu cozile histonelor acetilate sunt marca"i !n verde.
Etape:
1) cromatina cross-linkat! este izolat! #i t!iat! la o lungime medie care
corespunde la 2-3 nucleozomi;
2) se folose#te un anticorp fa"! de secven"a unei cozi histonice pentru
recunoa#tere;
3) nucleozomii care se leag! sunt imunoprecipita"i;
4) ADN din fragmentele de cromatin! imunoprecipitate este eliberat prin
reversarea cross-link!rii #i apoi este cuantificat folosind o metod! PCR sensibil!.
Metoda poate fi folosit! pentru analiza asocierii in vivo a oric!rei proteine cu o
secven"! specific! de ADN prin folosirea de anticorpi fa"! de proteina de interes din
aceea etapa. [See S. E. Rundlett et al., 1998, Nature 392:831.]

SLIDE 76. Analiza st$rii de acetilare a histonelor n cromatina asociat$
cu regiuni specifice ale genomului
Figura: Metod! experimental! pentru analiza st!rii de acetilare a histonelor n
cromatina asociat! cu o regiune specific! a genomului.
Nucleozomii sunt slab nre"ela"i cu ADN in vivo folosind un agent de
nre"elare reversibil permeabil la nivel celular. Este izolat! apoi cromatina #i scindat!
pe o lungime medie de trei nucleozomi fiind supu#i imunoprecipit!rii cu un anticorp
specific fa#! de o secven"! histonic! particular! N-terminal! specific!. ADN din
fragmentul de cromatina imunoprecipitat este eliberat prin reversarea agentului de
nre"elare #i apoi este cuantificat folodin o tehnic! PCR sensibil!.

SLIDE 77. Represorii &i activatorii pot orienta deacetilarea histonelor
genelor specifice
Figura: Rolul deacetil!rii "i hiperacetil!rii cozilor N-terminale ale histonelor n
controlul transcrip#iei la drojdii.
a) Deacetilarea dirijat! de represor la nivelul cozilor N-terminale ale histonelor.
DNA binding Domain (DBD) al represorului Ume6 interac"ioneaz! cu un element
de control situat n amonte (URS1) ale genelor pe care le regleaz!. Domeniul represor
al Ume6 (RD) leag! Sin3, o subunitate a unui complex multiproteic care include
Rpd3, o deacetilaz! histonic!. Deacetilarea capetelor terminale ale histonelor din
structura nucleozimilor din regiunea de legarea a Ume6 inhibnd legarea factorilor
generali la TATA box, represnd mai degrab! expresia genelor.
b) Hiperacetilarea dirijat! de c!tre activatori asupra cozilor N-terminale ale histonelor.
Domeniul ADN de legare a Gcn4 interac"ioneaz! cu secven"ele specifice situate n
amonte (UAS) de secven"ele activatoare ale genelor pe care le regleaz!. Domeniul de
activare al Ggn4 (AD) interac"ioneaz! apoi cu un complex multiproteic de acetilare a
histonelor care include subunitatea catalitic! Gcn5. Hiperacetilarea ulterioar! a
capetelor N-terminale ale histonelor din structura nucleozomilor afla"i n vecin!tatea
situsului de legare a Gcn4 faciliteaz! accesul factorilor generali de transcrip"ie
necesari pentru ini"iere. Represia #i activarea unor gene din eucariotele superioare
apar prin mecanisme similare.
165
Informa#ii suplimentare
Rolul deacetil!rii histonelor n represia genetic! mediat! de c!tre cromatin!
este sus"inut de descoperirea proteinelor de la drojdii care represeaz! transcrip"ia mai
multor gene situate n regiuni interne ale cromozomului. Acum se #tie c! aceste
proteine ac"ioneaz! par"ial determinnd deacetilarea regiunilor N-terminale ale
histonelor din structura nucleozomilor care sunt lega"i la TATA box ale genelor pe
care acestea le reprim!. Studiile in vitro au demonstrat c! dac! secven"a de ADN
promotor este asamblat! ntr-un nucleozom cu histone neacetilate, factorii generali de
transcrip"ie nu se pot lega la TATA box #i la regiunea de ini"iere. n histonele
neacetilate, lizinele N-terminale sunt nc!rcate pozitiv #i interac"ioneaz! puternic cu
grup!rile fosfat din structura ADN, crescnd afinitatea acestuia fa"! de suprfa"!
nucleozomului. Prevenind interac"ia factorilor generali de transcrip"ie cu regiunea
promotor. Din contra legarea factorilor de transcrip"ie n cazul hiperacetil!rii
histonelor este mai pu"in represat! fiind din contr! sti,mulat! de c!tre activatorii
transcrip"ionali.
Leg!tura dintre deacetilarea histonelor #i represarea transcrip"iei a fost #i mai
clar! cnd a fost purificat! prima deacetilaz! histonic! din celule umane #i ADNc a
fost clonat. Aceste deacetilaze au fost g!site ca fiind asociate cu represorii la
euacriotele superioare. Acestea includ doi represori heterodimeri care particip! la
reglarea ciclului celular la mamifere #i un grup de receptori nucleari care sunt regla"i
de c!tre hormoni liposolubili.
Studii recente furnizeaz! o explica"ie pentru observa"iile anterioare c!
regiunile inactive transcrip"ional de la vertebrate con"in adesea resturi de 5-metil-
citidin! (mC) urmate imediat de G, n timp regiunile active transcrip"ional sunt lipsite
de mC. S-a determinat c! regiunile care con"in mC leag! specific o protein! care la
rndul ei interac"ioneaz! cu mSin3. Aceste descoperiri sugereaz! c! asocierea mSin3
care con"ine cxmplexe de deacetilaz! histonic! cu situsurile metilate din structura
ADN conduce la deacetilarea histonelor din structura nucleozomilor vecini, f!cnd
regiunea inaccesibil! la factorii de transcrip"ie generali #i la Pol II, f!cnd-o
transcrip"ional inactiv!.

SLIDE 78. Mecanismul propus pentru deacetilarea histonelor &i
hiperacetilare n controlul transcrip%iei la drojdii
a) Deacetilarea cozilor N-terminale ale histonelor controlat! de represori. Domeniul
de legare la ADN (DNA-binding domain - DBD) al represorului UME6
interac"ioneaz! cu elementul specific de control situat n amonte (upstream control
element - URS1) al genelor pe care le regleaz!.
Domeniul de represie (RD) al UME6 se leag! la SIN3, o subunitate a unui
complex multiproteic care include RPD3, care este o deacetilaz! a histonelor.
Deacetilarea cozilor N-terminale ale histonelor din nucleozomi n regiunea de legare
a UME6- (binding site) inhib! accesul factorilor generali de transcrip"ie TATA box,
reprimnd astfel expresia genelor.
b) Hiperacetilarea coordonat! de activatori a cozilor N-terminale ale histonelor.
Domeniul de legare la ADN al activatorului GCN4 interac"ioneaz! cu secven"e
activatoare situate n amonte (upstream activating sequences UAS) ale genelor pe care
le regleaz!. Domeniul de activare al GCN4 (AD) interac"ioneaz! ulterior cu un
complex multiproteic cu activitate de acetilare a histonelor care include subunitatea
catalitic! GCN5. Hiperacetilarea ulterioar! a cozilor N-terminale ale histonelor de la
nivelul nucleosomilor din vecinatatea situsului de legare a GCN4 faciliteaz! accesul
166
factorilor generali de transcrip"ie necesari pentru ini"iere. Represia #i activarea mai
multor gene la eucariotele superioare apar prin mecanisme similare.
Represorii pot directiona deacetilarea histonelor pentru gene specifice
Importan"a deacetil!rii histonelor n represia genic! mediat! de c!tre
cromatin! este sus"inut! de studii pe represorii de la eucariote, care regleaz! genele
situate pe pozi"ii interne n cromozomi. Aceste proteine sunt cunoscute acum ca
ac"ionnd n parte prin deacetilarea cozilor histonelor din nucleozomii care se leag! la
TATA box #i la regiunea promotoare proximal! a genelor pe care acestia le
represeaz!.
Studiile in vitro au ar!tat c! atunci cnd un promoter ADN este asamblat ntr-
un nucleosom cu histone neacetilate, factorii generali de transcrip"ie nu se pot lega la
TATA box #i la regiunea de in"iere a transcriptiei. n histonele neacetilate, lizinele
terminale sunt nc!rcate pozitiv #i interac"ioneaz! puternic cu gruparile fosfat din
structura ADN. Cozile neacetilate ale histonelor interac"ioneaz! #i cu octamerii vecini
de histone favoriznd plierea cromatinei n structuri condensate #i nalt-ordonate a
c!ror conforma"ie precis! nu este bine cunoscut!. Efectul net este acela c! factorii
generali de transcrip"ie nu se pot asambla ntr-un complex de preini"iere la nivelul
promotorilor care con"in histone hipoacetilate. n contrast, legarea factorilor generali
de transcrip"ie este represat! mult mai pu"in de prezen"a histonelor care con"in cozi
hiperacetilate n care lizinele nc!rcate pozitiv sunt neutralizate #i intrac"iile
electrostatice cu moleculele fosfat din ADN sunt eliminate.
Leg!tura ntre deacetilarea histonelor #i represia transcrierii la aproape to"i
promotorii drojdiilelor a devenit foarte clar! cnd a fost demonstrat! homologia ntre
ADNc ce codific! pentru deacetilaza histonic! uman! #i gena RPD3, despre care se
cunoa#te c! este necesar! pentru represia normal! a unui num!r ridicat de gene la
drojdie. S-a demonstrat c! proteina RPD3 de"ine activitate histon deacetilazic!.
Capacitatea proteinei RPD3 de a deacetila histone la un anumit num!r de promotori
depinde de dou! alte proteine: UME6, un repressor care se leag! la o secven"!
specific! reglatoare (URS1) #i SIN3, care este parte a unui complex multiproteic,
mare care con"ine #i RPD3. SIN3 se leag!, de asemenea, la un domeniu de represare
al UME6, pozitionnd deacetilaza histonic! RPD3 n cadrul complexului, astfel nct
sa poat! interac"iona cu promotorii asocia"i nucleosomilor, ndep!rtnd grup!rile
acetil de la nivelul histonelor n zona N-terminal!. Experimente suplimentare,
folosind tehnica de imunoprecipitare a cromatinei, au demonstrat c!, la drojdiile de tip
s!lbatic, unul sau doi nucleosomi din apropierea situsurilor de legare la UME6, sunt
hipoacetilate.
Aceste regiuni din ADN include promotori ale unor gene represate de UME6.
n mutan*ii cu dele*ii sin3 )i rpd3, promotorii nu erau represa*i, dar )i nucleosomii din
zonele zonele adiacente situsurilor de legare a UME6, erau hiperacetilate.
Aceste descoperiri sus*in modelul deacetil!rii direc*ionate de repressor. n
cadrul acestui model, este demonstrate faptul c! complexul SIN3-RPD3 func*ioneaz!
ca un co-represor. Complexele co-represor con*in deacetilaze histonice, care au fost
associate cu mul*i represori de la nivelul celulelor mamaliene. Unele dintre aceste
complexe con*in omologul mammalian al SIN3 (mSin3), care interac*ioneaz! cu
proteina represor.Alte complexe histonice deacetilazice identificate n celulele
mamaliene con*in proteine ce se leag! la represori, diferite sau suplimentare.
Aceste combin!ri represori sau co-represori au ca scop mediarea deacetil!rii
histonelor la nivelulul unor promotori specifici, printr-un mechanism similar cu cel de
la drojdii. Totu)i, ca urmare a observa*iei conform c!reia la un num!r ridicat de
167
eucariote, proteinele represor inhib! trascrip*ia in vitro, n absen*a histonelor, se pare
c! exist! )i alte mecanisme de represie, exceptnd deacetilarea histonelor.
Identificarea complexului de deacetilare a histonelor ce con*ine mSin3, ofer! o
explica*ie pentru observa*iile anterioare conform c!rora, la vertebrate, regiuni de
ADN inactive din punct de vedere transcrip*ional, con*in frecvent resturi de citidin!
modificat! (5-metilcitidin! mC), urmat! de G, n timp ce regiuni de ADN active din
punct de vedere transcrip*ional nu prezint! resturi de mC. ADN ce contine mC se
leag! la o serie de proteine specifice care interac*ioneaz! cu mSin3. Aceste observa*ii
sugereaz! o asociere a corepresorilor ce con*in mSin3 cu zone metilate din ADN, ceea
ce duce la deacetilarea histonelor situate n apropierea nucleosomilor. Apar astfel
zone inaccesiblie factorilor de trancrip*ie )i Pol II, devenind astfel inactive
transcrip*ional.
Activatorii pot direc&iona acetilarea histonelor la nivelulul unor gene specifice
Studii genetice )i biochimice la drojdii au duc la descoperirea unor complexe
multiproteice mari ce con*in GCN5, cu activitate histon acetilazic!. O alt! subunitate
a complexului histon acetilazic de leag! la nivelul domenilor acide de activare a
proteinelor activatoare precum GCN4. Activarea maxim! a transcriptiei de c!tre
GCN4 depinde de complexul histon-acetilazic, care func*ioneaz! ca )i co-activator.
Modelul prezentat este n concordan*! cu observa*iile conform c!rora
nucleosomii din apropierea regiunii promotor a unei gene reglate de activatorul
GCN4, sunt hiperacetilate ntr-o maniera specific!. Acest proces modific! (deschide)
structura cromatinei facilitnd legarea altor proteine necesare ini*ierii transcrip*iei.
Un mecanim similar apare )i la nivelul eucariotelor superioare. De exemplu,
mamiferele exprima dou! proteine cu mai multe domenii (+400-kD), denumite CBP
)i P300, care se presupune c! func*ionez! n acela)i mod. Dup! cum s-a men*ionat
anterior, un domeniu al CBP leag! domeniul activator fosforilat acid de la nivelul
factorului de transcrip*ie CREB. Alte domenii din CBP interac*ionez! cu diferite
domenii activatoare de la nivelul factorilor transcrip*ionali. Totu)i un alt domeniu al
CBP prezint! activitate histon-acetilazic!, )i un altul se asociaz! cu un complex
multiproteic histon-acetilazic, care este omologul complexului GCN5 de la drojdii.
CREB )i mul*i al*i activatori mamalieni func*ioneaz! prin dirijarea CBP )i ata)area
complexelor histon-acetilazice la nucleosomi specifici, unde acetileaz! cozile
histonelor. Astfel este facilitat! interac*ia factorilor transcrip*ionali generali cu
promotrii de la nivelul ADN.
De asemenea, cea mai mare subunitate TFIID prezint! activitate histon-
acetilazic! )i poate func*iona ca )i co-activator, prin acetilarea cozii N-terminale a
histonei ce se g!se)te n vecin!tatea cutiei TATA.

SLIDE 79. Example ale codului histonelor
Figura: Modific!ri post-transla*ionale specifice la nivelul cozilor N-terminale ale
histonelor H3 )i H4 au fost eviden*iate n eucromatina, care este accesibil! proteinelor
)i care este transcrip*ional activ!. Modific!ri diferite au fost g!site n heterocromatin!,
care este condensat! )i astfel mult mai inaccesibil! proteinelor )i transcrip*ional
inactiv!. Secven*ele cozilor de histone sunt prezentate n codul cu o liter! al
aminoacizilor. CENP-A este o variant! a histonei H3 g!sit! n nucleosomii asocia*i cu
centromerii cromozomilor de la mamifere. [Adapted from T. Jenuwein and C. D.
Allis, 2001, Science 293:1074.]
Modific$ri ale resturilor specifice ale cozilor histonelor controleaz$ condensarea
cromatinei
168
Pe lng! acetilarea reversibil!, cozile histonelor pot suferi fosforilarea
reversibil! a resturilor de serin! )i treonin!, monoubiquitinarea resturilor de lizin! din
coada C-terminal! a H2A, metilare ireversibil!.
Exist! dovezi c! nu numai nivelul total de acetilare a histonelor controleaz!
condensarea cromatinei )i prin urmare accesibilitatea la ADN. Mai degrab! anumi*i
aminoacizi cu pozi*ii precise n cozile histonelor care sunt acelita*i si astfel modifica*i
pot constitui "codul histonelor" care ajut! controlul condens!rii cromatinei. De
exemplu, lizina din pozi*ia 9 din histona H3 este adesea metilat! n heterocromatin!.
Codul histonelor este "citit" de proteinele care se leag! la aceste modific!ri specifice
)i care la rndul s!u promoveaz! condensarea )i decondensarea cromatinei, formnd
structuri cromatinice "nchise" sau "deschise". De exemplu, eucariotele superioare
exprim! un num!r de proteine asociate cu heterocromatina con*innd a)a-numitele
cromodomenii, care se leag! la cozile histonelor H3 cnd aceasta este metilat! la
lizina 9. Se postuleaz! c! aceste proteine contribuie la plierea nalt-ordonat!
caracteristic! heterocromatinei, oarecum, la fel ca proteinele SIR la nivelul
telomerilor de drojdii. Alternativ, bromo-domeniul g!sit ntr-un num!r de proteine
asociate eucromatinei se leag! la cozile acetilate ale histonelor. Cea mai mare
subunitate a factorului TFIID, de exemplu, con*ine dou! bromodomenii apropiate,
care poat ajuta asocierea cu cromatina care con*ine un cod activ,n timp ce activitatea
histon-acetilazic! al aceleia)i subunitate men*ine cromatina ntr-o stare hiperacetilat!.

Factorii care remodeleaz$ cromatina ajut$ la activarea sau represarea anumitor
gene
Pe lng! complexele histon-acetilazei, un alt tip de complex multiproteic,
numit "SWI/SNF chromatinremodeling complex" este necesar pentru activare la
nivelul unor promotori de drojdie. Mai multe subunit!*i SWI/SNF prezint! omologie
cu ADN helicazele, enzime care folosesc energia ob*inut! prin hidroliza ATP pentru a
rupe interac*iile dintre perechile de baze din structura acizilor nucleici sau dintre
ace)tia )i proteine. Complexul SWI/SNF se consider! c! disociaz! tranzitoriu ADN
de pe suprafa*a nucleozomului, permitnd nucleozomului s! alunece de-a lungul ADN
)i s! promoveze desfacerea structurilor de cromatin! condensate )i nalt-ordonate.
Rezultatul net al unei astfel de remodel!ri a cromatinei este facilitarea leg!rii
factorilor de transcrip*ie la ADN din structura cromatinei. S-a demonstrat legarea
ctorva domenii de activare la complexul SWI/SNF, aceast! legare stimulnd
transcrip*ia in vitro de pe matritele de cromatin! (de pe ADN legat la nucleosomi).
Astfel complexele SWI/SNF reprezint! un alt tip de complex de coordinare. Alte
complexe multi-proteice cu activit!*i de remodelare a cromatinei similare au fost
identificate la drojdii, crescnd posibilitatea ca diferitele complexe de remodelare a
cromatinei s! fie necesare pentru diferite familii de activatori.
Eucariotele superioare con*in )i ele complexe multi-proteice omologe cu
complexul SWI/SNF. Aceste complexe izolate din extractele nucleare de la mamifere
)i celulele de Drosophila, s-a demonstrat c! asist! legarea factorilor de transcrip*ie la
situsurile lor de recunoaltere din ADN nucleosomal printr-un proces care necesit!
consum de ATP. n figur! se demonstreaz! cum un domeniu de activare poate
determina decondensarea unei regiuni de cromatin!. Acest lucru se consider! c! este
rezultatul interac*iei dintre domeniile de activare )i complexele care acetileaz!
histonele remodelnd cromatina.
n mod surprinz!tor, complexele SWI/SNF sunt necesare )i pentru represia
anumitor gene, probabil deoarece acestea ajut) expunerea cozilor de histone la
ac*iunea deacetilazelor sau deoarece acestea asist! legarea activatorului la situsul lui
169
de recunoa)tere ADN )i a PolII la promotor. n plus, una dintre subunit!*ile mediator
au activitate histon-acetilazic! )i pot func*iona n scopul men*inerii unei regiuni
promotoare ntr-o stare hiperacetilat!.
Experimente cu mutan*i de drojdii sensibili la temperatura indic! c! anumite
subunit!*i mediatoare sunt necesare pentru transcrip*ia aproape a tuturor genelor de la
drojdii. Aceste subunit!*i ajut!, cel mai probabil, la men*inerea structurii n ansamblu
a complexului mediator sau la legarea la PolII, )i, prin urmare, sunt necesare pentru
activarea realizat! de c!tre toate tipurile de activatori. n contrast, alte subunit!*i
mediator sunt necesare pentru activarea unor subseturi specifice de gene.
Analizele ADN microarray pentru expresia genic! la mutan*ii cu defecte la
nivelul acestor subunit!*i mediator indic! c! fiecare astfel de subunitate influen*eaz!
transcrip*ia a aproximativ 3-10% din toate genele. Aceste subunit!*i mediatoare se
consider! c! interac*ioneaz! cu domenii specifice de activare; astfel, atunci cnd una
dintre subunit!*i este defectiv!, transcrip*ia genelor reglat! de c!tre activatorii care se
leag! la acea subunitate este sever depresat! n timp ce transcrip*ia altor gene nu este
afectat!. n concordan*! cu aceast! explica*ie sunt studiile de legare care arat! c!
anumite domenii de activare interac*ioneaz! ntradevar cu subunit!*i mediatoare
specifice. Complexele mediatoare mari, izolate din culturi celulare de mamifere, sunt
necesare pentru activatorii de mamifere pentru a stimula transcrip*ia realizat! de c!tre
PolII in vitro. Deoarece genele care codific! subunit!*i omologe ale mediatorului de
mamifere au fost identificate n secven*ele genomice de la C. elegans )i Drosophila,
se pare c! majoritatea animalelor multicelulare (metazoare) au complexe mediatoare
omologe.
Aproximativ 1/3 dintre subunit!*ile mediatoare de la metazoare sunt clar
omologe cu subunit!*ile mediatoare de la drojdie, dar subunit!*ile care r!mn, )i care
par s! fie distincte fa*! de alte proteine de drojdie, pot interac*iona cu domeniile de
activare care nu au fost eviden*iate n drojdie. Ca )i n cazul mediatorilor de la drojdii,
unele dintre subunit!*ile mediatoare de la mamifere au ar!tat c! interac*ioneaz! cu
domenii activatoare specifice. De exemplu, subunitatea Sur2 a mediatorului de la
mamifere se leag! la domeniul de activare al factorului de transcrip*ie TCF care
controleaz! expresia genei EGR-1. Func*ia activatorului TCF in vivo este reglat!
normal ca r!spuns la hormoni proteici specifici prezen*i n ser. Celulele stem
embrionare de )oarece cu knockout la nivelul genei sur2 e)ueaz! inducerea expresiei
proteinei EGR-1 ca r!!spuns la ser, ntruct mul*i al*i activatori func*ioneaz! normal
n celulele mutante.
Aceste constat!ri demonstreaz! implicarea subunit!*ii mediator Sur2 n
activarea func*iei TCF. Diferitele rezultate experimentale care indic! c! subunit!*ile
mediator individuale se leag! la domenii de activare specifice sugereaz! c! mai mul*i
activatori influen*eaz! transcrip*ia unui singur promotor prin interac*ia simultan! cu
un complex mediator.
Activatorii care se leag! la "enhancer" sau la elemente promotor proximale pot
interac*iona cu mediatorii asocia*i cu un promotor deoarece ADN este flexibil )i poate
forma o bucla care poate aduce regiunile reglatoare )i promotorii apropia*i mpreun!.
Astfel de bucle au fost observate n experimentele cu activatorul NtrC de la E. coli )i
cu 54 ARN polimeraza. Complexele multiproteice cu nucleoproteine care se formeaz!
la nivelul promotorilor de la eucariote pot s! con*in! nu mai pu*in de 100 polipeptide
cu o mas! total! de aproximativ 3 megadaltoni (MDa), la fel de mare ca ribozomul.


170
SLIDE 80. Activatorii stimuleaz$ strnsa cooperare n asamblarea
complexelor de ini%iere
Figura: Situsurile de legare ale activatorilor care controleaz! transcrip#ia genei
trantiretinei (TTR) din hepatocitele de "oarece
HNF= hepatocyte nuclear factor; EBP=enhancer binding protein; AP1=factor
transcrip"ional heterodimer cjun/cfos
Dup! participarea la hiperacetilarea cromatinei n vecin!tatea regiunii
promotoare, activatorii transcrip"ionali se crede c! stimuleaz! asamblarea unui
complex de ini"iere #i regleaz! frecven"a cu care noi molecule de Pol II reini"iaz!
transcrip"ia. Aceast! func"ie a activatorilor care furnizeaz! un al doilea nivel de
control transcrip"ional, poate fi demonstrat adesea n reac"ii in vitro, n lipsa
histonelor.
De exemplu, unii activatori stimuleaz! legarea TFIID sau legarea simultan! a
TFIID #i TFIIH la TATA box in vitro. Al"i activatori interac"ioneaz! cu al"i factori
generali de transcrip"ie #i cu subunit!"ile complexului mediator asociat cu elementele
CTD ale subunit!"ii mari a Pol II.
Asamblarea complexului multiproteic de ini"iere la nivelul promotorului se
consider! c! este rezultatul unor interac"ii cooperative multiple. La organismele
superioare, cooperativitatea puternic! a ini"ierii asambl!rii complexelor este par"ial
responsabil! pentru expresia genic! specific! tipului celular.
De exemplu, gena TTR codific! transtiretina de la mamifere care se exprim!
n hepatocite #i n celulele plexului coroid. Transcrip"ia genei TTR n hepatocite este
controlat! de cel pu"in 5 factori transcrip"ionali diferi"i:
- HNF1, o protein! hepatic! specific! homeobox;
- HNF3, o protein! hepatic! specific! winged-helix;
- HNF4, un receptor nuclear care este exprimat #i n celulele epiteliale #i
celulele tubulilor renali;
- C/EBP, un heterodimer bazic cu elemente Zipper care este exprimat #i n
celulele epiteliale, celulele grase #i n unii neuroni.
-AP1, o familie mic! de proteine bazice zipper care sunt exprimate n toate
tipurile celulare.
Cu toate c! trei dintre ace#ti activatori sunt exprima"i #i n alte tipuri celulare,
gena TTR nu este transcris! n aceste celule. Aceasta deoarece ntregul set de
activatori este prezent numai n hepatocite. To"i activatorii trebuie s! fie prezen"i
pentru a contribui la asamblarea nalt cooperativ! a complexului de ini"iere a
promotorului TTR.
Diferite gene care codific! proteine hepatice specifice, cum sunt albumina
seric! sau alfa1-antitripsina, posed! diferite aranjamente ale situsurilor de legare a
proteinelor #i folosesc seturi de factori comuni dar nu identice. Cu toate acestea nu
numai factorii activatori sunt cei care dicteaz! proportia #i tipul proteinelor care vor fi
transcrise (de exemplu albumina este sintetizat! in cantitate mult mai mare dect
transtiretina) deci mecanismele de reglare aexpresiei sunt mult mai complexe.

SLIDE 81. Structura complexelor mediator de la drojdii (i de la om
(a) Imagine reconstituit! a mediatorului de la S. Cerevisiae legat la Pol II. Imaginile
de microscopie electronic prezint! structura tridimensional! a Pol II n albastru
deschis asociat! cu complexul mediator de la drojdie (albastru nchis).
(b) Reprezentarea diagramat! a subunit!*ilor mediatoare din celulele umane.
Subunit!*ile reprezentate n aceeia)i culoare se pare c! formeaz! un modul.
Subunit!*ile n portocaliu, galben )i verde sunt omoloage cu subunit!*ile din modulul
171
de la drojdie. Studii de genetic!, la drojdii au demonstrate c! muta*ii la nivelul unei
subunit!*i dintr-un modul inhib! asocierea celorlalte subunit!*i !n acela)i modul u
restul complexului.
[Part (a) courtesy of Francisco J. Asturias, 2002, Mol. Cell 10:409. Part (b) adapted
from S. Malik and R. G. Roeder, 2000, Trends Biochem. Sci. 25:277.]

SLIDE 82. Modelul asambl$rii cooperative a unui complex de ini%iere
activat la nivelul promotorului TTR
Figura: Modelul asambl!rii cooperative a complexului de ini#iere a transcrip#iei la
nivelul promotorului TTR din hepatocite.
Patru activatori bine reprezenta"i n hepatocite plus factorul ubiqitar AP1 se
leag! la situsurile specifice de la nivelul enhancerului #i regiunea proximal!
promotorului genei TTR. Domeniile de activare ale activatorilor lega"i interac"ioneaz!
extensiv cu co-activatorii. Subunit!"ile TAF ale TFIID, proteinele Srb/Mediator #i
factorii generali de transcrip"ie determin! plierea ADN #i formarea unui complex
activat stabil de ini"iere. Datorit! naturii nalt cooperativ! a procesului de asamblare,
complexul de ini"iere nu se formeaz! la nivelul promotorului TTR din celulele
epiteliulu intestinal, care con"in numai dou! din cei patru factori transcrip"ionali mai
bogat reprezenta"i n ficat. Mul"i dintre factorii generali de transcrip"ie, proteinele
Srb/Mediator #i ARN polimeraza II (Pol II) vor fi pre-asamblate ntr-un complex
holoenzimatic.

SLIDE 83. Represorii interfer$ direct cu ini%ierea transcrip%iei n mai
multe feluri
Figura: Diferi#ii represori de la eucariote pot inhiba transcrip#ia prin mecanisme
care nu implic! deacetilarea histonelor.
n cele trei mecanisme exemplificate mai sus, represorul fie inhib! activarea
fie interfer! direct cu formarea complexului de ini"iere. n plus, unii represori
interac"ioneaz! cu proteine co-represoare, care se consider! c! interac"ioneaz! la
rndul lor cu factorii generali de transcrip"ie pentru a inhiba ini"ierea.
Un represor este orice protein! care interfer! cu ini"ierea transcrip"iei cnd se
leag! la un situs specific din structura ADN. Mai sus am ar!tat c! unii represori pot
direc"iona deacetilarea histonelor prezente n nucleosomii din apropierea situsurilor de
recunoa#tere a acestora. La rndul ei deacetilarea histonelor inhib! interac"ia factorilor
generali cu situsurile de legare ADN represnd astfel transcrip"ia. Totu#i, studiile care
demonstreaz! c! anumi"i represori sunt capabili s! represeze transcrip"ia in vitro, n
absen"a histonelor indic! existen"a altor mecanisme de represie direct!.
De#i mecanismele de represie nu sunt foarte bine n"elese, unii dintre represori
ac"ioneaz! conform mecanismelor prezentate mai sus.
Dou! dintre mecanisme presupun legarea competitiv! dintre represor #i
activator sau un factor general de transcrip"ie. n ambele cazuri, legarea unei molecule
represoare la un situs ADN specific blocheaz! legarea proteinelor necesare ini"ierii
transcrip"iei. Totu#i, n multe cazuri represorii eucariotici inhib! transcrip"ia f!r! a
interfera cu legarea unui activator sau a unui factor general de transcrip"ie. n astfel de
cazuri, represorul legat poate interac"iona cu un activator din imediata vecin!tate,
mpiedicnd func"ionarea acestuia, sau cu factorii generali lega"i la promotor
mpiedicnd asamblarea acestora n complexul de ini"iere.

172
SLIDE 84. Hormonii liposolubili controleaz$ activit$%ile receptorilor
nucleari
Figura: Exemple de hormoni lipo-solubili care se leag! la membrii superfamiliei
receptorilor factorilor de transcrip#ie. Cortizolul este un hormon care se leag! la
receptorul glucocorticoid (GR).
Asemeni altor hormoni steroizi, acesta este sintetizat din colesterol. Acidul
retinoic este un metabolit, derivat de la vitamina A care are efecte puternice asupra
dezvolt!rii mugurelui limbic la embrioni #i n rennoirea pielii la mamiferele adulte.
Ligandul pentru acidul retinoic este RAR (receptorul pentru acid retinoic). Tiroxina
este sintetizat! din resturi de tirozin! n proteina tiroglobulin! la nivelul glandei
tiroide. Este un ligand pentru receptorul hormonului tiroidian (TR).
Activit!"ile multor factori de transcrip"ie sunt reglate de c!tre hormoni care
func"ioneaz! ca semnale extracelulare n organismele multi-celulare. Hormonii sunt
secreta"i de un anumit tip celular #i circul! prin fluidele extracelulare pentru a ac"iona
asupra func"ion!rii celulelor situate n diferite regiuni ale organismului la distan"!
considerabil! de locul sintezei lor. O clas! de hormoni cuprinde molecule mici, lipo-
solubile, care pot difuza prin plasm! #i membranele nucleare. A)a cum am discutat
anterior, ace#ti hormoni lipodo-solubili, incluznd mul"i hormoni steroidieni, retinoizi
#i hormoni steroidieni, se leag! #i regleaz! factori de transcrip"ie specifici apar"innd
super-familiei de receptori nucleari.
Domeniul structural al receptorilor nucleari.
Clonarea #i secven"ializarea genelor care codific! pentru mul"i receptori
nucleari au permis compararea secven"ei n aminoscizi a acestora. Aceste studii au
eviden"iat o remarcabil! conservare att a secven"ei n aminoacizi ct #i a diferitelor
regiuni func"ionale ale diferi"ilor receptori nucleari. To"i receptorii nucleari posed! o
regiune N-terminal! de lungime variabil! (100-500 aa) con"innd regiuni care
func"ioneaz! ca domenii de activare a transcrip"iei. Domeniul de legare la ADN este
localizat lng! centrul secven"ei primare #i posed! 4 motive C4 zinc finger.
Domeniul de legare a hormonului este localizat cap!tul C-terminal al acestor receptori
#i con"ine un domeniu de activare hormon-dependent. n unele cazuri domeniul de
legare a hormonului func"ioneaz! ca un domeniu represor n absen"a ligandului.

SLIDE 85. Domeniile structurale ale receptorilor nucleari
Figura: structura general! a factorilor de transcrip#ie din super-familia receptorilor
nucleari
Domeniul de legare a ADN localizat central manifest! o considerabil!
omologie de secven"! ntre diferi"ii receptori #i are un motiv C4 zinc fingger.
Regiunea C-terminal! de legare a hormonului prezint! o omologie mult mai redus!.
Regiunile N-terminale ale diferi"ilor receptori variaz! ca lungime, au o secven"! unic!
#i pot con"ine unul sau mai multe domenii de activare. Aceast! configura"ie general! a
fost determinat! pentru receptorul estrogen (553 aa), receptorul pentru progesteron
(946 aa), receptorul glucocorticoid (777 aa), receptorul pentru hormonii tiroidieni
(408 aa) #i receptorul pentru acid retinoic (432 aa).

SLIDE 86. Response elements sunt secven%e de ADN care leag$ mai
mul%i receptori nucleari majori
Figura: secven#e consens ale situsurilor ADN, numite elemente r!spuns, care leag!
receptorul glucocorticoid (GRE), receptorul estrogen (ERE), receptorul pentru
173
vitamina D (VDRE), receptorul pentru hormonii tiroidieni (TRE) "i pentru acid
retinoic (RARE).
Repeti"iile inverse din GRE #i ERE #i repeti"iile directe din VDRE, TRE #i
RARE sunt indicate prin s!ge"i ro#ii
Secven"ele nucleotidice caracteristice ale situsurilor de legare din structura
ADN, numite elemente r!spuns, care leag! numero#i receptori nucleari majori au fost
determinate. Secven"ele consens ale elementelor r!spuns la glucorticoizi #i estrogeni
sunt secven"e repetitive inverse de 6 pb separate de oricare trei perechi de baze.
Aceste descoperiri sugereaz! c! ace#ti receptori ai hormonilor steroizi se vor lega la
ADN sub form! de dimeri simetrici, a#a cum s-a demonstrat deja prin cristalografie
cu raze X asupra receptorului homodimer al hormonului glucocorticoid.
Unele elemente r!spuns ale receptorilor nucleari, cum sunt cele pentru
vitamina D3, hormonii tiroidieni #i receptorii acidului retinoic, sunt secven"e
repetitive directe ale aceleia#i secven"e recunoscute de c!tre receptorul pentru
estrogen, separate de trei la cinci perechi de baze. Receptorii care se leag! la astfel de
elemente r!spuns direct repetitive ca #i heterodimerii care con"in un monomer comun
receptorilor nucleari numit RXR. De exemplu, elementul r!spuns la vitamina D3 este
legat de c!tre heterodimerul RXR-VDR #i elementul r!spuns la acidul retinoic este
legat de c!tre RXR-RAR. Monomerii care compun ace#ti heterodimeri
interac"ioneaz! unii cu al"ii ntr-un mod care face ca cele dou! domenii de legare la
ADN s! se lege la fel dar ntr-o orientare invers!, permitnd heterodimerilor RXR s!
se lege la repeti"iile directe ale situsului de legare pentru fiecare monomer. n contrast,
monomerii receptorilor nucleari homodimeri (ex, GRE #i ERE) au o orientare invers!.
Informa&ii suplimentare
Receptorii steroidieni posed! domenii pentru legarea ADN, legarea
hormonilor #i activarea transcrip"iei
Hormonii steroizi sunt sintetiza"i ca r!spuns la o varietate de activit!"i
neuroendocrine #i exercit! efecte majore asupra cre#terii, dezvolt!rii "esuturilor #i
homeostaziei corpului n lumea animal!.
Glandele adrenale secret! peste 30 de steroizi, cele dou! grupuri majore fiind
glucocorticoizii #i mineralocorticoizii. n categoria steroizilor intr! hormonii
reproduc!tori (hormonii de sex masculin #i hormonii de sex feminin). Vitamina D este
necesar! pentru o bun! dezvoltare a oaselor.
Al"i hormoni cu structuri #i func"ii nenrudite pot ac"iona la nivel molecular n
mod similar hormonilor steroidieni. Hormonii steroizi #i tiroidieni pot avea #i ei un rol
important n metamorfoz! (steroizii insectelor #i hormonii tiroidieni de la broa#te).
Acidul retinoic (vitamina A) este o substan"! morfogen! responsabil! de
dezvoltarea axei antero-posterioare n timpul dezvolt!rii mugurelui membrelor la pui.
Metabolitul s!u, acidul-9-cis retinoic se g!se#te n "esuturi care sunt situsuri majore de
stocare #i de metabolizare a vitaminei A.
Pe lng! aceste diferite ac#iuni care presupun reglarea dezvolt!rii corpului
trebuie s! mai ad!ug!m "i func#iile de reglare a c!ilor de expresie genic!. Ace#ti
compu#i diferi"i manifest! un mod de ac"iune comun: fiecare reprezint! o molecul!
mic! care se leag! la un receptor specific care activeaz! transcrip#ia genelor.
(Receptorul poate s! nu fie nominalizat: proteina este un receptor pentru un hormon
steroid sau tiroidian n acela#i sens n care represorul lac este receptor pentru "-
galactozid: nu este un receptor n sensul de protein! legat! de membran!
(membranar!) care este expus! la suprafa"a celulelor).
Despre interac"iunea glucocorticoizilor cu receptorul lor se cunoa#te mai mult.
Un hormon steroid poate str!bate membrana celular! pentru a intra n celul! prin
174
simpl! difuzie. n interiorul celulei, glucocorticoidul se leag! la receptorul
glucocorticoid. (Studiile pe receptorul glucocorticoid au fost realizate cu hormonul
steroid sintetic, dexametazon!). Localizarea receptorilor liberi nu este pe deplin
clarificat!; ei pot fi n echilibru ntre nucleu #i citoplasm!. Dar cnd hormonul se
leag! la receptor, proteina este transformat! ntr-o form! activat! cu o afinitate de 10x
mai mare pentru ADN ne-specific; complexul hormon-receptor este totdeauna
localizat n nucleu.
Receptorul activat recunoa#te o secven"! consens specific! care identific!
GRE, elementul r!spuns la glucocorticoid. GRE este localizat tipic la nivelul unui
activator situat n vecin!tatea general! a unei gene care r!spunde la ac"iunea
glucocoiticoizilor. Secven"a GRE poate fi pozi"ionat! la mai multe kilobaze n amont
sau n aval de promotor. Cnd complexul steroid-receptor se leag! la activator, este
activat promotorul din vecin!tate (corespunz!tor) iar transcrip"ia este ini"iat!.
Activarea activatorului furnizeaz! mecanismul general prin care steroizii regleaz!
un set larg de gene "int!. Ac"iunea corespunde formal modelului bacterian de inducere
a regl!rii pozitive de c!tre un reglator pozitiv (co-inductorul activeaz! inductorul
proteinei).
Prin clonarea ADNc care codific! receptorii hormonilor steroizi, au fost
deduse structurile proteinelor corespunz!toare. Introducerea ADNc, care codific!
pentru un receptor, ntr-o celul! confer!, n continuare, acelei celule capacitatea de a
r!spunde la steroid prin activarea oric!rei gene corelat! cu unul dintre elementele
r!spuns. Acest sistem poate fi folosit pentru a analiza propriet!"ile receptorilor
codifica"i de c!tre ADNc n care au fost introduse muta"ii.
Receptorii diferitelor grupe de hormoni steroizi, hormoni tiroidieni, #i acid
retinoic reprezint! o nou! super-familie de gene reglatoare, factori de transcrip"ie
care r!spund la liganzi (ligand-responsive transcription factors).
To"i receptorii prezint! domenii independente de legare a ADN #i a
hormonilor.
Pentru diferi"ii receptori steroizi domeniile centrale de legare a ADN sunt bine
corelate iar pentru al"i receptori r!mn identificabile. Anumi"i liganzi posed! receptori
multipli care sunt strns corela"i, cum este cazul celor trei receptori ai acidului
retinoic ( !, " #i )) #i a celor trei receptori ai acidului 9-cis -retinoic (RXR!, ", )).
Conversarea secven"ei reflect! probabil cerin"ele comune de legare la ADN, n timp
ce varia"ia este responsabil! pentru selec"ionarea diferitelor secven"e "int!. Actul
(procesul) de legare a ADN nu poate fi deconectat de capacitatea de activare a
transcrip"iei, deoarece muta"iile prezente n acest domeniu afecteaz! ambele activit!"i.
Regiunile N-terminale ale receptorilor arat! secven"a minim! conservat!. Ele
includ alte regiuni necesare activ!rii transcrip"iei.
Domeniile C-terminale leag! hormonii. Cele din familia receptorilor steroizi
prezint! o nrudire de 30 la 57%, reflectnd specificitatea pentru hormonii individuali.
Rela"iile cu al"i receptori sunt minime, reflectnd specificitatea pentru o varietate de
compu#i: hormoni tiroidieni, vitamin! D, acid retinoic etc.
Regiunea C-terminal! regleaz! activitatea receptorului, diferit pentru fiecare
tip de receptor individual n parte. Dac! domeniul C-terminal al receptorului
glucocorticoid este eliminat, proteina N-terminal! r!mas! este constitutiv activ!:
aceasta nu mai necesit! steroizi pentru activare (pentru activitate). Aceasta sugereaz!
c!, n absen"a steroidului, domeniul de legare a steroidului mpiedic! receptorul s!
recunoasc! secven"a GRE; acesta func"ioneaz! ca reglator negativ intern. Ad!ugarea
hormonului steroid inactiveaz! inhibi"ia, dnd posibilitatea receptorului s! se lege la
secven"a GRE #i s! activeze transcrip"ia. Baza represiei poate fi intern!, corelat! cu
175
interac"iunile cu o alt! parte a receptorului. O alt! ipotez! este c! represia poate fi #i
rezultatul interac"iunilor cu alte proteine, care sunt eliberate (deplasate) cnd se leag!
steroidul.
Interac"ia dintre domenii este diferit! n cazul receptorului pentru estrogeni.
Dac! domeniul de legare a hormonului este nl!turat, proteina este incapabil! s!
activeze transcrip"ia, chiar dac! continu! s! se lege la secven"a ERE. Deci, aceast!
regiune este mai degrab! necesar! s! activeze dect s! reprime activitatea.
Fiecare receptor recunoa#te elementele r!spuns care sunt nrudite cu o
secven"! consens. A#a cum este prezentat n slide, aceste elemente r!spuns au o
tr!s!tur! caracteristic!: fiecare consens const! n dou! secven"e repetitive scurte (or
half sites=jum!t!"i de situs). Aceast! structur! sugereaz! imediat c! legarea
receptorului se face sub form! multimeric!, astfel nct fiecare jum!tate a secven"ei
consens este contactat! de c!tre o subunitate (reminescen"e ale interac"iei operatorului
#i represorului fagului $).
Elementele r!spuns ale diferi"ilor receptori pot fi palindroame sau repeti"ii
directe n care jum!t!"ile de situs sunt separate de 0-4 pb a c!ror secven"! este
irelevant! (nensemnat!). Numai dou! dintre aceste jum!t!"i de situs sunt folosite de
diferi"i receptori. Orientarea lor #i distan#a dintre ele determin! tipul de receptor
(receptorul) care va recunoa#te elementul r!spuns. Acest comportament permite
elementelor r!spuns, care au secven"e consens limitate (restrnse) s! fie recunoscute
specific de o varietate de receptori. Regulile care guverneaz! recunoa#terea nu sunt
absolute, dar pot fi modificate de context, #i exist! #i cazuri n care elementele
r!spuns palindromice (cu structur! de palindrom) sunt recunoscute permisiv de mai
mult dect un receptor.
Receptorii se mpart n dou! grupe:
1) Receptorii glucocorticoizi (GR), mineralocorticoizi (MR), androgen (AR) #i
progesteron (PR) sunt to"i homodimeri. Ei recunosc elementele r!spuns ale c!ror
jum!t!"i de situs au o secven"! consens TGTTCT. Jum!t!"ile de situs sunt aranjate
sub form! de palindroame, iar distan"a dintre situsuri determin! tipul de element.
Receptorul pentru estrogen (ER) func"ioneaz! ntr-un mod asem!n!tor dar are ca
jum!tate de situs secven"a TGACCT.
2) Receptorii tiroidieni (T3R), pentru vitamina D (VDR), pentru acid retinoic (RAR)
#i pentru acid -9-cis-retinoic (RXR) formeaz! heterodimeri, care recunosc jum!t!"i
de elemente a c!ror secven"! este TGACCT. Jum!t!"ile de situs sunt aranjate ca
unit!"i repetitive directe, recunoa#terea lor fiind influen"at! de separarea lor dup! cum
urmeaz!:
1 pb% RXR
3 pb% VDR
4 pb% T3R
5 pb% RAR
Acest mod de recunoa#tere caracteristic celui de al doilea grup este valabil
pentru receptorii dimeri a c!ror prim! subunitate este receptorul de pe list! #i cea de a
doua este format! din RXR (n concluzie prima pozi"ie de pe list! este un
homodimer). Necesit!"ile form!rii unui heterodimer au fost descoperite deoarece
receptorii pentru acid retinoic #i hormoni tiroidieni (RARs #i TRs) se leag! mult mai
eficient la situsurile "int! n prezen"a unui factor adi"ional, care se pare c! este
reprezentat de RXR. Receptorul heterodimer r!spunde ligandului prin intermediul
primei subunit!"i, #i aparent nu necesit! RXR pentru a cupla (lega) ligandul. Ace#ti
receptori pot forma #i homodimeri care recunosc secven"ele palindromice.
176
Acum suntem n situa"ia de a putea n"elege bazele specificit!"ii de
recunoa#tere. Recunoa#terea secven"ei unei jum!t!"i de situs se realizeaza prin
intermediul secven"ei de aminoacizi caracteristic! primului deget. Specificitatea de
formare a dimerului este dat! de secven"a n aminoacizi a celui de al doilea deget. Se
pare c! formarea dimerilor determin! probabil distan"a dintre subunit!"ile care sunt
pozi"ionate n curburile succesive ale fosei majore, controlnd astfel r!spunsul la
distan"a dintre jum!t!"ile de situs.

SLIDE 87. Translocarea hormon-dependent$ a receptorilor
homodimeri
Figura: Demonstra#ie experimental! c! domeniul de legare a hormonului al
receptorului glucocorticiod (GR) mediaz! translocarea c!tre nucleu n prezen#a
hormonului.
Celule animale n cultur! au fost transfectate cu vectori de expresie care
codific! proteinele prezentate n partea de jos a imaginii. Marcarea imunofluorescent!
a fost ob"inut! cu un anticorp specific pentru beta-galactozidaz! #i folosit pentru a
detecta proteinele exprimate n celulele transfectate.
a) Cnd celulele au fost transfectate numai cu beta-galactozidaz! enzima
exprimat! a fost localizat! n citoplasm! n prezen"a #i n absen"a hormonului
glucocorticoid dexametazon! (Dex);
b) Cnd o protein! de fuziune constnd din beta-galactozidaz! #i ntregul
receptor glucocorticoid de #oarece de 974 aa (GR) a fost exprimat! n celulele n
cultur!, a fost prezent! n citoplasm! n absen"a hormonului dar a fost transportat! n
nucleu n prezen"a hormonului.
c) O protein! de fuziune compus! dintr-o regiune de 382 aa a GR incluznd
domeniul de legare a ligandului (portocaliu) #i beta-galactozidaz! prezint!, de
semenea, un transport c!tre nucleu dependent de hormon.
Mecanismul de control hormonal al activit$#ii receptorilor nucleari
Legarea hormonilor la receptorul nuclear regleaz! activitatea acestuia ca factor
de transcrip"ie. Aceast! reglare difer! sub unele aspecte ntre receptorii nucleari
heterodimeri #i cei homodimeri.
Cnd receptorii nucleari heterodimeri (ex. RXR-VDR, RXR-TR #i RXR-
RAR) sunt lega"i la situsurile lor de recunoa#tere din structura ADN, ei ac"ioneaz! ca
represori sau activatori ai procesului transcrip"ional depinznd de tipul de hormon
care ocup! situsul de legare a ligandului. n absen"a hormonului, ace#ti receptori
nucleari direc"ioneaz! deacetilarea histonelor de la nivelul nucleozomilor situa"i n
vecin!tate. n prezen"a hormonului, domeniul de legare a hormonului sufer! o
modificare conforma"ional! drastic!. Ace#ti receptori nucleari pot dirija
hiperacetilarea histonelor nucleosomilor vecini, reversnd n felul acesta efectele
represoare ale domeniului de legare f!r! hormon. Domeniul N-terminal de activare al
acestor receptori nucleari reac"ioneaz! probabil apoi cu factori adi"ionali, stimulnd
asamblarea cooperativ! a complexului de ini"iere.
n contrast cu receptorii nucleari heterodimeri, care sunt localiza"i exclusiv n
nucleu, receptorii homodimeri se g!sesc att n citoplasm! ct #i n nucleu, iar
activitatea lor este reglat! prin controlul transportului lor din citoplasm! n nucleu.
Translocarea hormon-dependent! a receptorului homodimer glucocorticoid (GR) a
fost demonstrat! prin experien"e de transfec"ie conform figurii de mai sus. Domeniul
de legare a hormonului glucocorticoid (GR) singur mediaz! acest transport.
Studii ulterioare au ar!tat c! n absen"a hormonului, receptorul glucocorticoid
este ancorat n citoplasm! ca un agregat proteic mare complexat cu proteine
177
inhibitoare incluznd Hsp90, o protein! nrudit! cu Hsp70, proteina heat-shoc cea mai
mare. n aceast! situa"ie, receptorul nu poate reac"iona cu genele "int!; deci, nu apare
activare transcrip"ional!. Legarea hormonului elibereaz! receptorul glucocorticoid de
ancora sa citoplasmatic!, permitnd acestuia s! intre n nucleu el se va lega la
elementele r!spuns asociate genelor "int!. O dat! ce receptorul la care este legat
hormonul interac"ioneaz! cu elementul r!spuns, el activeaz! transcrip"ia prin
determinarea hiperacetil!rii histonelor #i facilitarea asambl!rii cooperative a
complexului de ini"iere.
Receptorii orfelini
Liganzii pentru domeniile de legare a hormonilor ai multor membrii ai super-
familiei de receptori nucleari sunt nc! necunoscu"i. De exemplu, HNF4, care este
implicat n expresia genei transtireninei n hepatocite. Majoritatea acestor proteine de
legare la ADN sunt denumite receptori orfani/orfelini, au fost descoperite prin
screening-ul b!ncilor de ADNc cu sonde specifice pentru secven"ele nucleotidice
nalt conservate ale domeniilor de legare a ADN ale receptorilor nucleari. Rolul precis
al receptorilor orfelini #i identificarea hormonilor necunoscu"i care se presupun c!
regleaz! activitatea acestora sunt nc! subiecte importante de cercetare.

SLIDE 88. Model de activare hormon-dependent$ a genelor de c$tre
receptorul glucocorticoid
Figura: Modelul de activare homon-dependent! a genelor activate de c!tre
receptorul glucocorticoid (GR).
n absen"a hormonului, GR este legat ntr-un complex cu Hsp90 n citoplasm!
via domeniului s!u de legare (portocaliu). Cnd hormonul este prezent, el difuzeaz!
prin membrana plasmatic! #i se leag! la domeniul de legare GR, determinnd
modific!ri conforma"ionale n domeniul de legare a ligandului care elibereaz!
receptorul de Hsp90. Receptorul cu ligandul legat este apoi translocat n nucleu unde
domeniul s!u de legare la ADN (portocaliu deschis) se leag! la elementele r!spuns,
permitnd domeniului de activare (verde) s! stimuleze transcrip"ia genelor "int!.


Diapozitiv 89. Hormonii polipeptidici semnalizeaz$ fosforilarea unor
factori de transcrip%ie
Figura: Modelul de activare genic! a IFNgama prin fosforilarea "i dimerizarea
Stat1alfa.
JAK kinaza este activat! cnd receptorul IFNgama dimerizeaz! prin legarea la
IFNgama. Kinaza JAK activat! fosforileaz! un rest specific de tirozin! din monomerii
Start1alfa n citoplasm!. Stat1alfa fosforilat! dimerizeaz!, #i dimerul fosforilat
transloc! apoi n nucleu unde el se leag! elementele r!spuns corespunz!toare,
promovnd transcrip"ia genelor reglate de c!tre IFNgama.
Hormonii polipeptidici semnalizeaz$ fosforilarea unor factori de transcrip#ie
De#i hormonii lipo-solubili pot difuza prin membrana plasmatic! #i
interac"ioneaz! direct cu factorii de transcrip"ie din citoplasm! sau nucleu, cea de a
doua clas! major! de hormoni, peptidici #i proteici, nu poate. n schimb, ace#ti
hormoni func"ioneaz! prin legarea la receptori specifici de pe suprafa"a celular!, care
apoi transmit semnalul c! au legat hormonul la proteinele din interiorul celulei, un
proces numit transducerea semnalului.
n multe cazuri, mecanismul prin care un semnal hormonal este transdus ntr-
un semnal de activare pentru factorii de transcrip"ie implic! fosforilarea. Un exemplu
178
simplu este furnizat de c!tre interferonul gama (IFNgama), un hormon eliberat de
c!tre limfocitele T-helper stimulate antigenic, care sunt critice n r!spunsul imun.
Cnd IFNgama se leag! la protein! receptoare specific! care este prezent! la suprafa"a
majorit!"ii celulelor, acesta induce expresia unui num!r de gene, producnd o stare
antiviral! care scade susceptibilitatea celulelor la infec"iile determinate de o serie de
virusuri. INFgama stimuleaz! func"ionarea altor celule care particip! la r!spunsul
imun. Pentru a analiza cum acest hormon determin! induc"ia unui set specific de gene,
cercet!torii au identificat mai nti elementul r!spuns la la IFNgama #i apoi au
purificat o protein! din nucleii celulelor tratate cu IFNgama care se leag! la aceast!
secven"!. Proteina izolat! are aproximativ 91 kDa #i este numit! Stat1alfa, pentru
signal transductor &i activator al transcrip%iei.
Dup! ce celulele n cultur! au fost tratate cu IFNgama, activitatea de legare la
ADN a Start1alfa cre#te rapid, n paralel cu cre#terea transcrip"iei genelor inductibile.
Aceast! inducere a activit!"ii de legare a Stat1alfa apare chiar #i n tratate cu un
inhibitor al sintezei proteice, indicnd c! unele tipuri de modific!ri post-transla"ionale
ale proteinei pre-existente Stat1alfa activeaz! activitatea sa de legare la ADN. Prin
marcarea (colorarea) celulelor cu anticorpi anti-Stat1alfa marca"i fluorescent,
cercet!torii demonstreaz! c! Stat1alfa transloc! din citosol n nucleu n urma
tratamentului cu IFNalfa, cu cinetici similare cu cele ale inducerii genelor.
Analizele proteinei Stat1alfa din celulele tratate cu IFNgama demonstreaz! c!
tratamentul hormonal conduce la fosforilarea unui rest specific de tirozin! din
structura proteinei. Mai mult, proteina fosforilat! Stat1alfa formeaz! homodimeri n
timp ce proteina nefosforilat! este un monomer. Cnd restul critic de tirozin! a fost
schimbat cu o fenilalanin! prin mutagenez! dirijat! situs-dirijat!, proteina mutant!
Stat1alfa nu mai activeaz! genele "int! ntr-un experiment de transfec"ie, #i opre#te
translocarea n nucleu.
Fosforilarea unor resturi specifice de serin! #i de treonin! regleaz! de
asemenea activitatea unui num!r mare de factori de transcrip"ie. Diferitele c!i de
transducere a semnalului care regleaz! factorii de transcrip"ie vor fi prezentate mai
trziu (capitolul 20).
n unele cazuri (de exemplu Stat1alfa), fosforilarea factorilor de transcrip"ie
liberi moduleaz! activitatea sa de legare la ADN. n alte cazuri, (ex, CREB), factorii
de transcrip"ie inactivi, monofosforila"i se leag! la secven"ele de recunoa#tere din
structura ADN; fosforilarea modific! apoi func"ionarea domeniului de activare, astfel
nct proteina poate stimula transcrip"ia.

SLIDE 90. Concluzii
Controlul transcrip"ional la eucariote opereaz! pe trei nivele:
i) modularea nivelelor #i/sau activit!"ilor activatorilor #i represorilor;
ii) modific!ri n structura cromatinei determinate de activatori #i represori;
iii) influen"a direct! a activatorilor #i represorilor n asamblarea complexelor
de ini"iere;
Heterocromatina se refer! la regiunile de cromatin! condensat! n care ADN
este relativ inaccesibil factorilor de transcrip"ie #i altor proteine, astfel nct expresia
genei este represat!;
Represarea mediat! a heterocromatinei apare la nivelul telomerilor #i a locilor
implica"i n conjugare la S. cerevisiae. Interac"iile diferitelor proteine #i hipoacetilarea
regiunilor N-terminale ale histonelor H3 #i H4 sunt responsabile pentru represarea
structurii cromatinei n aceste regiuni;
179
Unii represori func"ioneaz! par"ial prin interac"ia cu complexele de deacetilare
a histonelor, avnd drept rezultat deacetilarea histonelor din structura nucleosomilor
situa"i n vecin!tate. Aceasta inhib! interac"ia dintre promotorul ADN #i factorii
generali de transcrip"ie, represnd astfel ini"ierea transcrip"iei;
Unii activatori func"ioneaz! par"ial prin interac"ia cu complexele de
deacetilare a histonelor, avnd drept rezultat deacetilarea histonelor din structura
nucleosomilor situa"i n vecin!tate. Aceasta faciliteaz! interac"ia dintre promotorul
ADN #i factorii generali de transcrip"ie, activnd ini"ierea transcrip"iei;

SLIDE 91. Concluzii
Factorii care remodeleaz! cromatina determin! disocierea tranzitorie a ADN
de miezul histonic printr-o reac"ie ATP-dependent! #i promoveaz! astfel legarea
altor proteine necesare procesului de ini"iere care se desf!#oar! la nivelul anumitor
promotori ADN;
In vitro, combinarea activatorilor poate stimula asamblarea complexelor de
ini"iere din vecinatatea promotorului. Se crede c! acest efect direct al activatorilor
apare in vivo n urma acetil!rii histonelor;
In vivo, asamblarea nalt cooperativ! a complexului de ini"iere necesit! mai
mul"i activatori. O celul! trebuie s! produc! un set specific de activatori necesari
pentru transcrip"ia unei anumite gene n scopul regl!rii expresiei acesteia;
Unii represori inhib! competitiv legarea activatorilor sau factorilor generali de
transcrip"ie. Al"ii interac"ioneaz! direct cu factorii generali sau cu activatorii;
Activit!"ile super-familiei recptorilor nucleari sunt reglate de hormonii lipo-
solubili. Legarea hormonilor la ace#ti factori de transcrip"ie induce modific!ri
conforma"ionale care modific! interac"iile lor cu alte proteine;
Activit!"ile unor factori de transcrip"ie sunt reglate prin fosforilare indus! de
legarea hormonilor polipeptidici la receptorii lor situa"i la suprafa"a celulelor.

SLIDE 92. Transcrip%ia initia%iat$ de Pol I &i Pol III este analog$ celei
realizat$ de Pol II
n continuare vom discuta procesul de ini"iera a transcrip"iei realizat de alte
ARN polimeraze.
Totu#i, aceste sisteme, n particular reglarea acestora, sunt mult mai pu"in
cunoscute dect sistemele de transcrip"ie de la E.coli. (i cele patronate de ARN
polimeraza II.
Ini#ierea transcrip#iei realizat$ de Pol I "i de Poli III este anolog$ cu cea de la Pol
II.
S! ne reamintim c! ARN polimeraza I (Pol I) este dedicat! sintezei pre-ARNr,
iar ARN polimeraza III (Pol III) transcrie genele ARNt, genele ARNr 5S #i genele
care codific! multe alte molecule de ARN mici. Formarea complexelor de ini"iere a
transcrip"iei care implic! Pol I #i Pol III este similar! n unele privin"e cu asamblarea
realizat! n cazul Pol II. Totu#i, fiecare din cele trei ARN polimeraze eucariote
nucleare necesit! factori generali de transcrip"ie specifici (sau de ini"iere) care
recunosc diferite elemnete de control diferite. Pe de alt! parte nici Pol I #i nici Pol III
nu necesit! hidroliza ATP pentru a ini"ia transcrip"ia, n timp ce Pol II da.
Ini#ierea de c$tre Pol I. Genele umane pentru pre-ARNr prezint! dou!
regiuni de control: un element core, care include situsul de start #i care este esen"ial
pentru transcrip"ie, este un UCE (upstream control element) de aproximativ 50 pb,
care ncepe la aproximativ 100 pb fata de situsul de start, #i care stimuleaz!
transcrip"ia in vitro de aproximativ 10 la 100 ori. Dou! proteine de legare la ADN
180
asist! Pol I pentru a ini"ia #i transcrie corect genele pre-ARNr. Primul dintre ele este
factorul de legare din amonte UBF (upstream bin ding factor), care se leag! att la
UNC ct #i la por"iunea din amonte a elementului core, chiar dac! se consider! c!
acestea au n aparen"! o secven"! pu"in similar!. Factorul de selectivitate I (SL1), o
protein! multimer! se leag! #i stabilizeaz! astfel complexul. Dup! legarea
subunit!"ilor SL1, Pol I se leag! #i ini"iaz! transcrip"ia. Una dintre subunit!"ile SL1
este TBP, aceea#i protein! cu cea care joac! rolul central n ini"ierea Pol II.
Ini"ierea de c!tre Pol III. Spre deosebire de genele care codific! pentru
proteine #i pre-ARNr, regiunile promotoare ale genelor pentru ARNt #i ARNr 5S sunt
n ntregime n interiorul secven"ei transcrise. Dou! astfel de elemente promotoare
interne, numite box A #i box B sunt prezente n toate genele pentru ARNt. Aceste
seven"e nalt conservate nu func"ioneaz! numai ca promotori dar codific! #i dou!
por"iuni ale moleculelor de ARNt eucariot care sunt necesare sintezei de proteine. La
nivelul genelor ARNr 5S se afl! numai o regiune de control intern! numit! cutia C,
care ac"ioneaz! ca un promotor.
Factorii generali de transcrip"ie necesari lui Pol III pentru a ini"ia transcrip"ia
genelor pentru ARNt #i ARNr 5S au fost bine caracterizate la S. Cerevisiae. Doi
factori multimeri, THIIIC #i TFIIIB particip! att la ini"ierea ARNt #i ARNr 5S la
drojdii. Asamblarea complexului de ini"iere ale genelor ARNt ncep prin legarea
singular! a TFIIIC la cutia A #i cutia B. Interac"ia factorului TFIIIC cu TFIIIB l
direc"ioneaz! pe acesta din urm! s! se lege la secven"ele de aproximativ 30 pb situate
n amonte de situsul de start al transcrip"iei. Asamblarea complexului de ini"iere al
genelor pentru ARNr 5S ncepe cu legarea celui de al treilea factor, TFIIIA #i cutia C.
Apoi TFIIIC se leag! la TFIIIA #i este pozi"ionat prin intermediul interac"iilor
protein!-protein! ntr-o pozi"ie similar! fa"! de situsul de start ca #i n cazul leg!rii
TFIIIC la genele pentru ARNt. TFIIIB interac"ioneaz! analog cu TFIIIC #i se leag!
apoi la o secven"! ADN situat! la aproximativ 30 pb, asemeni leg!rii la gena ARNt.
Jum!tatea N-terminal! a uneia dintre subunit!"ile TFIIIB, numit! BRF (pentru
TFIIB related factor), este similar! cu secven"a TFIIB (un factor al Pol II).
Similarit!"ile sugereaz! c! BRF #i TFIIB realizeaz! o func"ie similar! n ini"iere, adic!
direc"ionarea polimerazei la situsul corect de start. O dat! ce TFIIIB se leag! att la
genele pentru ARNt ct #i pentru ARNr 5S, Pol III se poate lega #i ini"ia transcrip"ia n
prezen"a ribonucleotidtrifosfa"ilor Subunitatea BRF a TFIIIB interac"ioneaz! specific
cu una dintre subunit!"ile polimerazice unice pentru Pol III, aceasta fiind elementul
specific important pentru ini"ierea procesului de transcrip"ie de c!tre Pol III. Dup!
legarea TFIIIB, TFIIIC poate fi nl!turat f!r! a afecta ini"ierea realizat! de c!tre Pol
III. Astfel, TFIIIC se poate considera c! ca fiind un factor de asamblare critic legarea
factorului de ini"iere TFIIIB.
O alt! subunitate din cele trei care compun TFIIIB #i TBP, care este o
component! a a factorului general de transcrip"ie comun pentru toate cele trei ARN
polimeraze nucleare. Aceste descoperiri c! TBP particip! n ini"ierea transcrip"iei att
cu Pol I ct #i cu Pol III au fost surprinz!toare, deoarece promotorii recunoscu"i de
aceast! protein! nu con"in TATA box. Pe de alt! parte, studii recente indic! c! TBP
ca subunitate a TFIIIB interac"ioneaz! cu ADN similar cu interac"ia cu TATA box.

SLIDE 93. Alte sisteme de transcrip%ie
! T7 #i al"i bacteriofagi nrudi"i exprim! ARN polimeraze monomere
! ADN mitocondrial este transcris de c!tre ARN polimeraze care prezint!
similarit!"i cu enzimele bacteriofagilor sau bacteriene
! Transcrip"ia ADN din cloroplaste se aseam!n! cu transcrip"ia bacterian!
181
! Transcrip"ia de la archaea este mai apropiat! de transcrip"ia de la eucariote
dect de cea de la bacterii
T7 #i al"i bacteriofagi nrudi"i exprim! ARN polimeraze monomere
Bacteriofagul T7 domin! complet sinteza macromoleculelor n gazdele sale de E.
coli timp de cteva minute dup! transfec"ie. To"i ribozomii celulei realizeaz! sinteza
exclusiv! a proteinelor codificate de virus. Virusul realizeaz! acest lucru prin
direc"ionarea ini"ial! a sintezei ARN polimerazei codificat! de virus, care nu
recunoa#te promotorii E. coli ci un set de promotori care inactiveaz! ARN polimeraza
de la E. coli. n consecin"! cnd ARN polimeraza gazdei este inactivat!, transcrip"ia
genomului gazd! se opre#te; deoarece ARNm de la E. coli au o durat! de via"! foarte
sc!zut!, sinteza marii majorit!"i a proteinelor de la E. coli nceteaz! curnd. T7 ARN
polimeraza ini"iaz! transcrip"ia de la promotori care se suprapun cu situsrile de start
din ADN viral. Secven"a de 23 pb a promotorului T7 este complet diferit! de
promotorii de la E. coli.
T7 ARN polimeraza, un singur lan" polipeptidic de 98 kDa, este cea mai
simpl! ARN polimeraz! cunoscut!. Enzima este probabil cea mai simpl! posibil
molecul! proteic! capabil! s! realizeze func"iile unei ARN polimeraze: legarea
specific! la promotori, ini"ierea, elongarea #i terminarea. Deoarece virusul este
orientat s! sintetizeze proteinele care formeaz! capsula virionului la un nivel maxim,
T7 ARN polimeraza nu este reglat! semnificativ. O astfel de ARN polimeraz! foarte
activ! #i nereglat! cum este T7 ARN polimeraza #i cum sunt polimerazele
bacteriofagilor nrudi"i T3 #i SP6 sunt foarte utile sintezei ARN in vitro #i expresiei
sistemelor bacteriene.
ADN mitocondrial este transcris de c!tre ARN polimeraze care prezint!
similarit!"i cu enzimele bacteriofagilor sau bacteriene
Mitocondria con"ine un genom ADN distinct #i un sistem de sintez! proteic!
n interiorul membranei mitocondriale interne, n compartimentul cunoscut sub
numele de matrixul mitocondrial. Acest ADN codific! un subset de proteine esen"ial
pentru principalelor func"ii: sinteza ATP prin fosforilare oxidativ!. ADNmt este
transcris de c!tre ARN polimeraze care sunt codificate de c!tre ADN nuclear. Acestea
sunt mult mai simple dect cele trei ARN polimeraze eucariote care transcriu ADN
nuclear #i chiar de c!tre polimerazelor sistemelor bacteriene actuale.
ARN polimeraza mitocondrial! de la S. cerevisiae const! ntr-o subunitate
polipeptidic! de 145 kDa cu activitate polimerazic! #i un factor specific de 43 kDa
esen"ial pentru ini"ierea transcrip"iei la situsurile de start ADNmt. ARN polimeraza
mitocondrial! purificat! de la Xenopus laevis are o structur! similar!. Subunitatea
mare a ARN polimerazei mitocondriale de la drojdii este clar nrudit! cu ARN
polimeraza monomer! din a bacteriofagului T7 #i din bacteriofagii similari. Totu#i,
enzima mitocondrial! este distinct! func"ional de enzima din bacteriofagi n ceea ce
prive#te dependen"a sa de subunitatea mic! pentru a ini"ia transcrip"ia de al nivelul
situsului de start. Aceast! subunitate mic! este nrudit! cu factorii sigma ai ARN
polimerazelor bacteriene care interac"ioneaz! cu promotorul ADN. Astfel, ARN
polimerazele mitocondriale se pare c! sunt structuri hibride ntre ARN polimeraza
simpl! a bacteriofagilor #i ARN polimeraza bacteriana posednd o complexitate
intermediar!.
Similar cu ARN polimeraza din bacteriofagi, secven"ele promotor recunoscute
de c!tre ARN polimerazele mitocondriale includ situsul de start, o secven"!
promotoare bogat! n care a fost bine caracterizat! la drojdii, plante #i animale.
Genomul mitocondrial uman, circular con"ine dou! secven"e promotoare nrudite de
15 pb, cte una pentru transcrip"ia fiedc!rei catene. Fiecare caten! este transcris! n
182
integritatea sa; primul transcript primer lungeste apoi procesat la molecule de ARNm,
ARNr #i ARNt. O protein! bazic! de 22 kDa numit! mtTF1, care se leag! imediat n
amonte de cei doi promotori mitocondriali, stimuleaz! foarte mult transcrip"ia. O
protein! omolog! g!sit! n mitocondriile de drojdie este necesar! pentru men"inerea
ADMmt #i are probabil o func"ie similar!.
Transcrip"ia ADN din cloroplaste se aseam!n! cu transcrip"ia bacterian!
ADN circular existent n cloroplaste este considerabil mai mare dect ADNmt,
variind ntre 120 la 160 kpb la diferite plante. ARN polimeraza care transcrie ADN
din cloroplasteeste codificat! de c!tre acest genom. Enzima prezint! subunit!"i care
au o omologie considerabil! cu subunit!"ile alfa, beta #i gama ale ARN polimerazei
de la E. coli, dar aparent lipse#te subunitatea echivalent! factorului sigma de la E.
coli.
Unii promotori de la cloroplaste prezint! reminescen"e ale promotorului
reconoscut de subunitatea sigma de la E. coli, avnd secven"e similare n regiunile
10 #i 35. Totu#i, transcrip"ia unor promotori depind de secven"e situate n regiunile
20 la +60, foarte diferi"i de majoritatea promotorilor de la E. coli. Acest promotor
poate fi recunoscut de o a doua ARN polimeraz! care este cel mai adesea codificat!
de genomul nuclear #i important n organit. Analizele transcrip"iei din cloroplaste sunt
destul de pu"in dezvoltate, dar n acest moment este clar c! cel pu"in un sistem de
transcrip"ie prezint! o omologie ridicat! cu transcrip"ia de la E. coli #i de la alte
bacterii.
Transcrip"ia de la Archaea este mai apropiat! de transcrip"ia de la eucariote
dect de cea de la bacterii
Archeobacterii constituie cea de a treia ramur! n evolu"ia oranismelor, al!turi
de bacterii #i eucariote. Analize genomice recente sugereaz! puternic c! evolu"ia
ramurii bacteriilor din str!m!#ul comun nainte de desp!r"irea archeobacteriilor #i
eucariotelor dovede#te c! archeobacteriile sunt mult mai apropiate de eucariote dect
bacteriile.
Ca #i bacteriile, archeobacteriile au o singur! ARN polimeraz!, dar aceasta
con"ine 13 subunit!"i distincte (chiar 14 la unele), o complexitate echivalent! cu cea a
ARN polimerazelor eucariote. Secven"a de aminoacizi dedus! pentru 7 subunit!"i
arat! o semnificativ! omologie cu subunitp"ile eucariote, incluznd pe cele dou! mai
mari, care sunt comune la toate trei ARN polimerazele nucleare. Totu#i, unele dintre
subunit!"ile de la archeobacterii manifest! o similaritate sc!zut! cu alte secven"e ale
subunit!"ilor de la bacterii sau de la eucariote.
De#i archoebacteriile, ca #i bacteriile, transcriu operoni n ARNm
policistronic, promotorii archeo sunt similari cu promotorii de la eucariote. O
secven"! promotoare consens bogat! n A/T este pozi"ionat! la 26 pb n amonte fa"!
de situsul de start de la acrheobacterii. Ca #i promotorii TATA box de la eucariote,
inser"iile #i dele"iile din apropierea acestei secven"e conduc la o pierdere a situsului de
start pentru men"inerea spa"iului din amonte fa"! de promotor. n plus,
archeobacteriile con"in factori de ini"iere cu o omologie nalt! cu TBP #i TFIIB. n
consecin"!, mecanismul ini"ierii transcrip"iei la archeobacterii este probabil similar cu
cel de la eucariote. n concluzie, se cunoa#te pu"in privind modul n care este reglat!
transcrip"ia la acest grup fascinant de organisme.

SLIDE 94.Asamblarea in vitro a complexului de ini'iere a transcrip'iei
Pol I la drojdii
UAR si CF, factori transcrip*ionali multimerici, se leag! la un element
upstream (UE) )i la elemental core, din promotorul ADN. TBP )i un factor
183
monomeric (Rnr3p) asociat cu ARN polimeraza I (Pol I) particip! )i el la formarea
complexului de ini*iere.. [Adapted from N. Nomura, 1998, in R. M. Paule,
Transcription of Ribosomal RNA Genes by Eukaryotic RNA Polymerase I, Landes
Bioscience, pp. 157172.]

SLIDE 95. Elemente de control transcrip'ional transcrie de
polimerazele ARN
Att genele pentru ARNt, ct )i pentru ARNr-5S, con*in elemente promotor
interne (galben) localizate downstream de situsul de start )i denumite A-, B- )i C-.
Asamblarea complexului de trancrip*ie la nivelul acestor gene ncepe cu legarea
factorilor de transcrip*ie TFIIIA, TFIIIB )i TFIIIC la Pol III, )i legarea complexului
rezultat la elementele de control. S!ge*ile verzi indic! interac*ii puternice, secven*a-
specifice protein-ADN. S!ge*ile albastre indic! interac*ii ntre factori de transcrip*ie
generali. S!ge*ile mov indic! interac*ii ntre factori generali de trascrip*ie )i Pol III.
[From L. Schramm and N. Hernandez, 2002, Genes Dev. 16:2593.]

SLIDE 96. Concluzii
Ini"ierea transcrip"iei de c!tre Pol I este dirijat! de c!tre un element promotor
core, care se suprapune cu situsul de start, #i o regiune de control situat! n amonte
(UCE). Aceata necesit! doi factori de transcrip"ie generali, SL1 #i UBF;
Ini"ierea transcrip"iei de c!tre ARN polimeraza III este cel mai adesea dirijat!
de c!tre elemente promotoare interne. Doi factori generali de transcrip"ie sunt
necesari pentru ini"ierea transcrip"iei ARNt (TFIIIC #i TFIIIB); un factor suplimentar
(TFIIIA) este necesar pentru ini"ierea transcrip"iei genelor ARNr 5S;
Ini"ierea transcrip"iei de c!tre toate cele trei ARN polimeraze nucleare
eucariote necesit! un factor de transcrip"ie specific general care con"ine TBP ca
subunitate;
Ini"ierea de c!tre Pol I #i Pol III nu necesit! ATP spre deosebire de ini"ierea
realizat! de Pol II care depinde de hidroliza ATP;
Bacteriofagul T7 #i bacteriofagii nrudi"i exprim! o ARN polimeraz!
monomer! simpl!. Aceste polimeraze recunosc o regiune promotoare de 23 pb care
include situsul de start;
Mitocondria con"ine molecule circulare de ADN transcrise de c!tre o ARN
polimeraz! codificat! nuclear compus! din dou! subunit!"i. O subunitate este
omolog! cu ARN polimeraza simpl! din bacteriofagul T7; cealalt! se aseam!n! cu
factorii bacterieni sigma;
Cloroplastele con"in ADN care este transcris de c!tre o ARN polimeraz!
codificat! de cloroplast omolog! cu ARN polimerazele bacteriane, cu excep"ia c!
aceasta este lipsit! de factorul sigma;
Archeobacteriile utilizeaz! o ARN polimeraz! format! din mai multe
subunit!"i care se aseam!n! cu ARN polimerazele eucariote nucleare. Ini"ierea
transcrip"iei n celulele de archeobacterii necesit! o protein!, omolog! cu factorul
eucariotic TBP, care se leag! la un element promotor bogat n A/T situat imediat n
amonte fa"! de situsul de start #i o protein! omolog! cu TFIIB. Aceste rezultate sus"in
ipoteza c! eucariotele #i acheobacteriile actuale au evoluat dintr-un str!mo# comun.





184
7829 :9 5431 "SV

PROCESAREA ARN, TRANSPORT NUCLEAR "I CONTROL POST-
TRANSCRIP#IONAL


Silde 2.Elongarea ARN de c$tre ARN polimeraza
Figura: Elongarea catenei ARN de c!tre ARN polimeraz!
n regiunea care va fi transcris!, dublul helix este deschis (desf!cut) cu
aproximativ un tur pentru a permite catenei sens s! formeze un scurt segment hibrid
ADN/ARN dublu catenar cu cap!tul 3 ARN. Cu ct ARN polimeraza avanseaz! de-a
lungul matri"ei ADN (n dreapta), ADN este derulat n fa"a furcii de transcrip"ie n
deplasare #i re-rulat n spatele acestuia, elibernd astfel ARN nou sintetizat de catena
matri"! (antisens).
a) O cale poate s! fie urmat! este aceea n care ARN polimeraza urmeaz!
deplasarea catenei matri"! astfel nct transcriptul va r!mne ata#at la nivelul elicei
duplexului;
b) O a doua posibilitate, mult mai plauzibil!, este aceea c! ARN se deplaseaz! n
linie dreapt! o dat! ce ADN se rote#te dedesubtul s!u. n acest caz ARN nu se va
r!suci n jurul ADN dar ADN va r!mne suprar!sucit n fa"a sa (lua"i n considerare
plasarea degetului ntre catrenele de ADN r!sucit !n acest model #i npingnd c!tre
dreapta). Modelul presupune c! capetele ADN ca #i ARN polimeraza sunt protejate de
ata#amente n interiorul celulei.

Silde 3.Transcrip%ia a dou$ gene ribozomale contigue la E. coli
Figura: O micrografie electronic! "i o reprezentare schematic! care prezint! dou!
gene supuse transcrip#iei la E. coli.
S!ge"ile structurale rezultate o dat! cu cre#terea lungimii lan"urilor de ARN n
formare in timp ce moleculele de ARN polimeraza responsabile de sinteza se
deplaseaz! de la situsul de ini"iere a transcrip"iei c!tre situsul de terminare din
structura ADN.

Silde 4. Micografie electronic$ a transcrip%iei &i transla%iei simultane la
E. coli
Figura: Micrografie electronic! "i reprezentare schematic! a realiz!rii simultane a
transcrip#iei "i transla#iei unei gene de la E. Coli.
Moleculele de ARN polimeraza transcriu ADN de la dreapta la stnga n timp
ce ribozomii traduc moleculele de ARN n formare.

Silde 5. Legarea actinomicinei D la duplexul ADN
Figura: Structura determinat! prin analize cu raze X a complexului format de
actinomicina D "i duplexul ADN la nivelul unei secven#e complementare
d(GAAGCTTC).
Complexul este redat sub forma unui model cu bile n care structura catenei
fosfat este prezentat! n galben, bazele n alb #i actinomicina D este colorat! n func"ie
de tipurile de atomi: C n verde, N n albastru #i O n ro#u. Cele dou! molecule de
ADN cu simetrie nrudit! sunt prezentate vertical pentru a forma un pseudo-continuu
helix. Actinomicina D se leag! la nivelu fosei mari a ADN. Actinomicina D este un
185
agent antineoplazic (anticancer) care este produs de c!tre Streptomyces antibioticus,
inhib! puternic transcrip"ia #i replicarea ADN probabil prin interferen"! cu trecerea
ARN #i ADN polimerazei.

Silde 6. Terminarea Transcrip%iei
! Exist$ mai multe mecanisme care regleaz$ terminarea transcrip#iei la
bacterii "i celule eucariote
! La bacterii principalele mecanisme implic$ ARN polimeraza, unul dintre
mecanisme necesitnd "i factorul de terminare Rho
! La eucariote, mecanismele pentru terminarea transcrip#iei difer$ pentru
cele trei tipuri de ARN polimeraze
Terminarea transcrip#iei ADNr
Deoarece transcrip"ii pre-ARNr se termin! n apropierea (proximitatea) sau
exact la extremitatea 3 a secven"ei ARNr 28S, s-a crezut mai nti c! aceast! regiune
con"inea un teminator recunoscut de ARN polimeraza I. Experien"ele ulterioare au
demonstrat c! transcrip"ia, in vitro, a genelor care codific! ARNr continu! dincolo de
extremitatea 3 a ARNr 28S matur. La Xenopus, transcrip"ia se realizeaz! dincolo de
regiunea care con"ine separatorul intragenic, #i se termin! la aproximativ 200 pb n
amont de inima promotorului pre-ARNr 35S urm!tor; o clivare endonucleotidic!
realizat! dincolo de extremitatea ARNr 28S formeaz! extremitatea 3. La drojdii,
transcrip"ii care ncep la nivelul inimii promotorului, se termin! la nivelul
separatorului intergenic, dincolo de ARNr 5S #i la 300 pb n amont de nceperea
secven"ei pre-ARNr urm!tor.
La ADNr de #oarece, terminarea transcrip"iei are loc ntre 550 #i 600 pb
dincolo de extremitatea 3 a ADNr 28S. Semnalul de terminare a acestui sistem este o
secven"! foarte conservat! pozi"ionat! pe catena sens (5-
AGGTCGACCAATTANTCCG-3numit! cutia SalI) #i precedat!, n general, de unul
sau mai multe grupe de pirimidine bogate n timin! (T). Se g!sesc 8 grupe de acest tip
ntre perechile de baze 500 #i 1 200 plecnd de la extremitatea 3 a ADNr 28S, dar n
general terminarea se realizeaz! n grupul T care precede cutia Sal I. Secven"a
conservat! de 18 pb poate ea ns!"i s! determine terminarea, dar aceasta este mai
eficient! #i mai precis! cnd cele 18 pb sunt precedate #i urmate de grupuri
(fragmente) bogate n T. Dele"ii mici #i inser"ii sau numai schimbarea unor perechi de
baze la nivelul segmentului de 18 pb, la fel ca #i inversarea sa, duc la pierderea
activit!"ii sale de terminator. Se consider! c! un aranjament destul de asem!n!tor de
secven"e repetitive conservate (5- GGGTTGACCA-3) furnizeaz! probabil semnalul
de terminare a pre-ARNr la om. Secven"e repetitive conservate (5-GACTTGC-3
precedate de grup!ri de T) exist! n separatorii intergenici de la Xenopus, terminarea
realizndu-se cel mai adesea la nivelul secven"ei repetitive care precede promotorul
situat la extremitatea 3 a regiunii separatoare.
Exist! argumente indirecte care sugereaz! c! terminarea la nivelul acestor
situsuri depinde de fixarea unor proteine pe aceste situsuri specifice. Aceste indica"ii
au fost confirmate prin demonstra"ia c! unul sau mai mul"i factori proteici din
extractul nuclear se fixeaz! de secven"a de 18 pb. n acest caz, fixarea proteinei la
secven"a de terminare a fost eviden"iat! de protec"ia fa"! de digestie cu endonucleaz!
III a unui fragment marcat la 5 #i care con"inea acest semnal. Principiul acestei
experien"e este c! digestia enzimatic! a unui segment este oprit! de proteina legat!.
Trebuie s! ne amintim c! endonucleaza III diger! ADN bicatenar pornind de la
extremit!"ile 3. n aceste condi"ii vor rezulta fibre marcate n 5, care vor avea
lungimea determinat! de locul n care digestia a fost blocat! de proteina legat!. Cum
186
fiecare caten! poate fi marcat! independent la cap!tul s!u 5, se vor putea determina
cele dou! limite ale secven"ei blocate. n figura 8.18 este redat experimentul realizat
cu dou! segmente care con"ineau secven"e de terminare probabile (cutiile Sal I #i
secven"ele vecine cuprinse ntre 583 #i 685 n aval de extremitatea 3 a ADNr 28S).
Se constat! c! profilul fragmentelor ob"inute n urma digestiei cu exonucleaza III este
alterat de o incubare prealabil! n prezen"a unui extract nuclear. Alterarea profilului
de digestie indic! c! o protein! (sau proteine) se leag! la secven"a cutiei Sal I.
Modific!ri la nivelul secven"ei cutiei Sal I sau modificarea distan"elor ntre cele dou!
secven"e mai conservate mpiedic! legarea #i afecteaz! terminarea. n plus, dac! un
oligonucleotid corespunz!tor secven"ei consens a cutiei Sal I, este introdus ntr-o
unitate de transcrip"ie a ARN polimerazei I, acesta favorizeaz!, in vitro, terminarea
transcrip"iei. Proteina care se leag! la cutia Sal I a fost purificat! #i mecanismul s!u de
ac"iune cunoscut (este n curs de deslu"ire).
Cuplarea termin$rii "i ini#ierii transcrip#iei
O caracteristic! original! a secven"elor de terminare este c! acestea sunt adese
situate imediat n amont de promotorii gene care codific! pentru ARNr urm!tor.
Astfel de secven"e de terminare au fost detectate la aproximativ - 170 pb n raport cu
demararea transcrip"iei ADNr de la #oarece, la - 185 n amont de regiunea control a
ADNr de la om #i la - 200 n amont de regiunea control a ADNr de Xenopus. O
curiozitate o reprezint! faptul c! eliminarea sau modificarea acestor secven"e de
terminare provoac! o reducere marcant! a transcrip"iei care demareaz! la pozi"ia + 1 a
nucleului promotor urm!tor. Ini"ial, s-a presupus c! un factor de terminare putea s!
reac"ioneze cu un factor de ini"iere sau cu ARN polimeraza I, sau c! activarea putea fi
rezultatul localiz!rii favorabile a enzimei la nivelul unor situsuri de juxtapunere
apropiate promotorului ADNr. O alt! explica"ie este c! terminarea mpiedic!
polimerazele ocupate cu transcrierea s! se rup! complet de complexele de transcrip"ie
care sunt asamblate n imediata vecin!tate a urm!torului promotor.
Numeroase ntreb!ri s-au pus privind transcrip"ia genelor de ARNr, n
particular n ceea ce prive#te coordonarea expresiei acestor gene care codific! pentru
ARNr, ARNr 5S #i proteinele ribozomale. Implica"iile mecanice #i reglatoare ale
prezen"ei elementelor promotoare, activatoare #i de terminare ntr-o regiune
considerat! nainte ca silen"ioas! sunt de-a dreptul tulbur!toare. Aceste descoperiri
pun de asemenea problema cunoa#terii modalit!"ilor de coordonare a termin!rii #i
ini"ierii transcrip"iei #i a propriet!"ilor expresiei genelor din clasele II #i III. Din punct
de vedere biochimic este important! izolarea #i caracterizarea factorilor de transcrip"ie
#i de terminare astfel nct s! fie posibil! descifrarea complet! a modului de ac"iune a
acestora pe baze moleculare.
Terminarea transcrip#iei de c$tre ARN polimeraza III
Dac! ini"ierea transcrip"iei de c!tre ARN polimeraza III necesit! secven"e de
reglare complexe #i mai multe proteine, terminarea nu necesit! dect enzima #i un
grup de resturi dezoxiadenilate la nivelul matricei. Terminarea este realizat! perfect in
vitro cu o ARN polimeraz! III nalt purificat! #i cu o matrice de ADN duplex. O
terminare corect! #i eficace se realizeaz! chiar pentru genele din clasa III lipsite de
RCI, eliminnd astfel ipoteza c! asocierea matri"ei cu TFIII A, B sau C pot juca un rol
n procesul de terminare. Au fost utilizate matri"e de transcrip"ie formate din ADN
clonat special pentru a ncerca definirea semnalului de terminare. Aceste experien"e
au demonstrat c! terminarea depinde de existen"a unui num!r de resturi
dezoxiadenilate grupate pe catenele matricei #i de secven"ele situate de o parte #i de
alta a acestui grup. De exemplu, patru dezoxiadenozine nconjurate de dezoxitimidin!
nu determin! terminarea eficace dar patru dezoxiadenozine flancate de o parte de CG
187
#i de cealalt! parte de GC (5-GCAAAACG-3), ca n ADNr 5S din celulele somatice
de Xenopus borealis, sunt un semnal de terminare eficace. Muta"iile care modific!
num!rul de resturi adenilate reduc eficacitatea termin!rii. Sinteza ARN se opre#te la
nivelul unui rest uridilat complementar unei adenine din grup. n acest caz nu par s!
existe influen"e asupra termin!rii nici din partea unor secven"e dep!rtate #i nici a unor
secven"e secundare. Dac! extremitatea 3 a ADNr 5S este eliminat! din gena clonat!,
transcrip"ia este continuat! pn! cnd polimeraza III ntlne#te un semnal adecvat n
secven"a flancant! a vectorului. Dac! o serie de dezoxiadenozine este inserat! la un
situs incorect din structura matricei unei gene din clasa III, terminarea se realizeaz!
adesea la acest situs modificat.

Silde 7. Secven%a ipotetic$ de baze care formeaz$ un terminator
eficient la E. coli
Figura: Secven#a de baz! a unui element ipotetic puternic (eficient) a terminatorului
de la E. Coli dedus! din secven#a mai multor transcrip#i.
a) Secven"a ADN mpreun! cu ARN-ul s!u corespunz!tor. Secven"ele bogate n
A-T #i G-C sunt prezentate n albastru #i ro#u. Axa de simetria de pliere eviden"iaz!
segmentele care flankeaz! segmentele care formeaz! o repeti"ie invers!.
b) Structura su form! de ac de p!r #i coada poli A care dirijeaz! terminarea
transcrip"iei.

Silde 8. Terminarea Rho-independent$ apare la nivelul unor secven%e
caracteristice ale ADN din E. coli
Figura: Secven#a de terminare a operonului triptofanului trp, un situs independent
Rho.
Operonul triptofan, compus din cinci gene (n albastru), este urmat de o
secven"! de 36 pb la cap!tul c!reia apare terminarea. Cap!tul 3 al ARNm
corespunz!tor la care apare terminarea. Cap!tul 3 al ARNm corespunz!tor prezint! o
structur! sub form! de bucl! bogat! n GC care precede ultimile patru resturi U, o
tr!s!tur! caracteristic! a ARNm produs de gene cu situsuri de terminare Rho
independente. n general, situsurile de terminare bacteriene apar ntre operoni dar nu
ntre gene din interiorul unui operon. Din acest motiv, genele din interiorul unui
operon pot fi reglate coordonat, n timp ce cele din diferi"i operoni sunt reglate
independent
Silde 9. Terminarea prematur$ prin atenuare ajut$ la reglarea
expresiei unor operoni bacterieni
Figura: Atenuarea furnizeaz! un mecanism secundar de control a expresiei
operonului Trp
Secven"a Leader (L), care este localizat! ntre operator (O) #i prima gen!
structural! (E). Con"ine un situs atenuator (banda ro#ie) la care transcrip"ia este
terminat! n func"ie de concentra"ia citosolic! a triptofanului. Regiunea promotor-
operator-leader, care are o lungime de aproximativ 200 pb, nu este reprezentat! la
scar! cu genele structurale. AUG indic! codonii start pentru translocarea secven"ei
leader (ro#u) #i aARNm pentru trpE (negru).

Silde 10. Mecanismul de atenuare pentru transcrip%ia operonului trp
Figura: Mecanismul de atenuare a transcrip#iei operonului trp.
188
a) Diagrama celor 140 nucleotide ale ARN trp leader. Patru regiuni prezentate n
culori pot forma structuri sub form! de bucl! alternative, numai una dintre
acestea putnd duce la atenuare.
b) Transla"ia secven"ei trp leader ncepe de la cap!tul 5 imediat dup! ce acesta
este sintetizat, n timp ce este realizat! sinteza restului moleculei ARNm trp.
La concentra"ii crescute de trp, formarea buclei stem 3-4 urmat! de o serie de
resturi U n 3 determin! terminarea printr-un mecanism Rho-independent. La
concentra"ii sc!zute de Trp, regiunea 3 este sechestrat! n bucla stem 2-3 #i
nu se poate mperechea cu regiunea 4. n absen"a structurii sub form! de bucl!
necesar! pentru terminare, transcrip"ia secven"elor care codific! trp continu!.

Silde 11. Siturile pentru terminarea Rho dependent$ sunt prezente n
unele gene ale fagului # &i ale E. coli
! Factorul Rho factor este o protein! hexamer! dispus! de-a lungul unui
segment de 70 80 baze al transcriptului ARN n formare
! Rho alunec! apoi de-a lungul ARN n direc"ia 30 pn! cnd acest! desface
hibridul ARN-ADN de la nivelul situsului activ al ARN polimerazei
! Dac! transcrip"ia este terminat! sau dac! nu depinde de factorul Rho, acesta se
elibereaz! de pe ARN polimeraz!
! Siturile Rho dependente nu posed! secven"e consens clare #i mecanismul de
terminare Rho dependent este caracteristic numai ctorva operoni

Silde 12. Cele 3 ARN polimerazele folosesc diferite mecanisme de
terminare
! ARN polimeraza I realizeaz! terminarea printr-un mecanism care necesit!
factori specifici de terminare care se leag! n aval de unitatea de transcrip"ie
! ARN polimeraza II con"ine semnalul de terminare la nivelul unei regiuni de
0.5-2 kb apar"innd situsului de ad!ugare a cozii poli(A), iar terminarea este
cuplat! cu procesul care cliveaz! #i poliadenileaz! cap!tul 30 al transcriptului
! Transcrip"ia realizat! de c!tre ARN polimeraza III este terminat! dup!
ad!ugarea unei serii de resturi U
De#i se cunoa#te foarte pu"in despre terminarea transcrip"iei la eucariote
comparativ cu bacteriile, cteva tr!s!turi de baz! #i similitudinile lor cu aceasta dar #i
diferen"ele fa"! de terminarea de la bacterii este n"eleas!.
Transcrip"ia genelor pre-ARNr de c!tre ARN polimeraza I este terminat! printr-un
mecanism care necesit! un factor de terminare specific polimerazei. Aceast! protein!
de legare la ADN se poziu"ioneaz! n aval de unitatea de transcrip"ie, diferit de modul
de legare a factorului Rho de la E. coli, care este un factor de terminare care se leag!
la ARN.
ARN polimeraza III purificat! realizeaz! terminarea dup! polimerizarea unei
serii de U; spre deosebire de terminarea Rho independent! de la bacterii, totu#i,
terminarea realizat! de ARN polimeraza III nu necesit! o structur! secundar! sub
form! de bucl! stem situat! n amonte n structura transcriptului ARN.
La majoritatea genelor de mamifere care codific! pentru proteine, ARN
polimeraza II poate termina la situsuri multiple localizate la nivelul unei regiuni de
0,5-2 kb apar"innd situsului de ag!ugare a cozii poli(A). Experimentele cu gene
mutante demonstreaz! c! terminarea cu procesul care cliveaz! #i poliadenileaz!
transcriptul ARNm n formare la nivelul unor secven"e specifice asociate cu domeniul
fosforilat carboxil terminal (elementele/domeniul CTD) ale ARN polimerazei dup!
189
ini"iere. Acest complex de clivare/poliadenilare poate suprima terminarea ct timp
secven"a care semnalizeaz! scindarea #i poliadenilarea este transcris! de c!tre
polimeraz!. Studii pe mutan"ii de drojdii indic! c! scindarea transcriptului n formare,
mai mult dect poliadenilarea, reprezint! un eveniment critic care semnaleaz! ARN
polimerazei s! termine.
A#a cum am discutat anterior terminarea transcrip"iei la bacterii poate fi
reglat! prin atenuare #i prin mecanisme de antiterminare. Mecanisme analoge de
control, care implic! o decizie ntre elongarea catenei #i terminare apar la unele gene
transcrise de c!tre ARN polimeraza II

Silde 13. Secven%e la nivelul c$rora ARN polimeraza III termin$
transcrip%ia

Silde 14. Transcrip%ia genomului virusului HIV este reglat$ printr-un
mecanism de antiterminare
Figura: Complexul de antiterminare compus din proteina HIV tat "i multe proteine
celulare eucariote
Elementul TAR al transcriptului HIV con"ine secven"e recunoscute de c!tre
Tat #i proteina celular! ciclina T. Ciclina T activeaz! #i ajut! pozi"ionarea Cdk9, o
protein kinaz!, lng! substratul s!u, domeniul CTD al ARN polimerazei II.
Transcrip#ia virusului HIV este reglat$ printr-un mecanism de antiterminare
Curent, transcrip"ia genomului virusului imunodeficien"ei (HIV) de c!tre ARN
polimeraza II furnizeaz! cel mai bine n"eles exemplu de reglare a termin!rii
transcrip"iei la eucariote. Exprimarea eficient! a genelor HIV necesit! a mic! protein!
viral! codificat! de locusul tat. Celulele infectate cu mutan"i tat- produc transcrip"i
virali scur"i care hibridizeaz! cu fragmente de restric"ie care con"in regiuniule
proximale promotorului ADN HIV dar nu #i cu fragmentele de restric"ie pozi"ionate
mai departe n aval fa"! de promotor. n contrast, celulele infectate cu tipul s!lbatic
HIV sintetizeaz! transcrip"i lungi care hibridizeaz! cu fragmente de restric"ie
corespunz!toare ntregii #i singurei unit!"i de transcrip"ie HIV. Astfel, proteina tat
func"ioneaz! ca un factor antiterminator, care permite ARN polimerazei II s! citeasc!
de-a lungul unui bloc transcrip"ional, mai mult dect proteina N a fagului lambda.
Deoarece mecanismul de antiterminare coordonat de proteina tat este necesar pentru
replicarea HIV, n"elegerea n viitoar a acestui mecanism de control poate oferi
posibilit!"i de determinare efectiv! a unor terapii pentru rezolvarea sindromului de
imunodeficient! dobndit! (AIDS, Acquired immunodeficiency sindrom)
Asemeni proteinei N, proteina Tat este o protein! care se leag! la o secven"!
specific! din structura ARN. Ea se leag! la o copie ARN a unei secven"e numite TAR,
care este localizat! lng! cap!tul 5 al transcriptului HIV. Ca"i secven"a mut din
transcrip"ii lambda, TAR con"ine dou! situsuri de legare: unul care interac"ioneaz! cu
Tat #i unul care interac"ioneaz! cu o protein! celular! numit! ciclina T. Structurile
secundare ale mut #i TAR, inclus amndou! o bucl! stem, sunt analoge #i trebuie s!
fie intacte pentru ca s! se produc! legarea proteinei. Mai mult, domeniul de legare la
ARN al Tat, ca #i cel al proteinei N, con"ine o regiune bogat! n arginin!.
Asa cum putem vedea n figur!, proteina Tat a virusului HIV #i ciclina T
celular! se leaga cooperativ la ARN TAR. Interac"ia ciclinei T cu o protein kinaz!
numit! Cdks9 activeaz! kinaza, al c!rei substrat este domeniul CTD al ARN
polimerazei II.
190
(Ciclinele sunt familii de proteine omologe care se leag! #i regleaz! kinazele
dependente de cicline, sau Cdk. Func"ia important! a ciclinelor #i a moleculelor Cdk
este reglarea diviziunii celulare).
Studiile de transcrip"ie in vitro folosind inhibitori specifici ai Cdk9 sugereaz!
c! moleculele de ARN polimeraz! II care ini"iaz! transcrip"ia la nivelul promotorului
HIV termin! dup! transcrierea a aproximativ 50 de baze, numai dac! CTD este
hiperfosforilat! de Cdk9. Legarea cooperativ! a ciclinei T #i a Tat la secven"a TAR la
cap!tul 5 al transcriptului HIV pozi"ioneaz! Cdk9 astfel nct aceasta poate fosforila
domeniul CTD, prevenind astfel terminarea #i permitnd polimerazei s! con"inue
elongarea lan"ului.
De remarcat c!, Spt5 una dintre proteinele complexului ciclinei T-Cdk9,
posed! o regiune a sec<ven"ei de aminoacizi omolog! cu NusG, una dintre proteinele
implicate n procesul de antiterminare dirijat de proteina N al bacteriofagului lambda.
Aceast! omologie sugereaz! c! aceste similitudini n medcanismul de reglare a
elong!rii de la bacterii la animale.

Silde 15. Procesarea ARNm de la eucariote
Figura: Schem! general! a proces!rii ARNm la eucariote
La pu"in timp dup! ini"ierea transcrip"iei de c!tre ARN polimeraza II la primul
nucleotid al primului exon al unei gene, la cap!tul 5 al moleculei ARN n formare se
adug! 7-metilguanin!: Transcrip"ia realizat! de c!tre ARN polimeraza II se termin! la
unul sau mai multe situsuri de terminare situate n aval de situsul poli(A), care este
localizat la cap!tul 3 al exonului final. Dup! ce transcriptul primar este scindat la
nivelul situsului poli(A), se adaug! o prelungire format! din A. Coada poli(A) con"ine
aproximativ 250 resturi la mamifere, 150 la insecte #i 100 la drojdii. Pentru
transcrip"ii primari cu pu"ini introni, poliadenilarea, clivarea #i splicingul urmeaz! de
obicei terminarea. Pentru genele mari, cu un numar mare de introni, intronii sunt
adesea nl!tura"i din pre-ARNm n formare nainte ca transcrip"ia genei s! fie
complet!. De re"inut c! capi#onul r!mne n moleculele de ARNm mature.

Informatii suplimentare
Terminarea transcrip#iei "i poliadenilarea
Transcrip"ia a numeroase gene eucariote se continu! dincolo de locul n care
ARN este clivat pentru a se forma extremitatea 3 a ARNm matur. Terminarea are loc
la situsuri diferite care se ntind pe sute sau chiar mii de perechi de baze ADN. Astfel,
regiunea n care se opre#te transcrip"ia "-globinei la vertebrate este situat! la mai mult
de 1 kpb de situsul de poliadenilare. La fel, transcrip"ia primelor dou! gene n tandem
ale !-globulinei de la mamifere se opre#te n regiunea de separare de aproximativ 2
kpb care separ! cele dou! gene. Un exemplu #i mai frapant este furnizat de
transcrip"ia regiunii tardive a adenovirusurilor. n acest caz, transcrip"ia continu!
dincolo de cele cinci situsuri de poliadenilare nainte de a se termina la cap!tul ADN
viral.
Din contr!, anumite gene eucariote par s! aib! un semnal autentic semnal de
terminare a transcrip"iei. De exemplu, n gena gastrinei umane, semnalul de terminare
este situat la 193 pb n aval de situsul de poliadenilare. Aceast! secven"!, care
dicteaz! terminarea transcrip"iei, att in vivo ct #i in vitro, este un segment bogat n
T, 5-T9A2T5AT4AT4AT5-3. Transcrip"ia unui ADN care posed! aceast! secven"!
undeva de-a lungul secven"ei sale se termin! exact n 5 de acest semnal. O secven"!
similar!, dar cu cteva diferen"e, este prezent! n amont #i n aval la mai multe gene
de vertebrate. Acest semnal care se presupune a fi de terminare #i anumite secven"e
191
bogate n T din genele de drojdii, 5-CAATCTTG-3 #i 5- T5ATA-3, amintesc
semnalele de terminare dependente de ( dependente de la E. coli.
Independent de prezen"a semnalelor specifice de terminare, transcrip"ia
dep!#e#te aproape ntotdeauna situsurile de poliadenilare. n consecin"!, extremit!"ile
3 poliadenilate trebuie s! fie create prin clivare endonucleotidic! urmat! de
polimerizarea de resturi adenilate la nivelul hidroxilului 3 astfel format. Pentru
determinarea situsului de clivare sunt necesare dou! secven"e situate la distan"! mic!.
Una dintre acestea cvasi-invariant!, AATAAA, este localizat! ntre 10 #i 30 pb n
amont de un nucleotid CA n apropierea situsului de clivare-poliadenilare. nlocuirea
lui T cu G n AATAAA reduce puternic eficacitatea poliadenil!rii dar cele cteva
extremit!"i formate sunt poliadenilate. nlocuirea ultimului A din secven"! cu G la
cap!tul primei gene din tandemul celor dou! care codific! pentru !-globulinei reduce
producerea normal! a !-globulinei. Aceast! experien"!, la fel ca #i altele, indic!
necesitatea absolut! a secven"ei AATAAA. Totu#i, deoarece secven"a AATAAA
exist! #i n regiunea codant! a numeroase gene, unde nu exist! poliadenilare, este
evident necesar! o a dou! secven"! pentru a provoca reac"iile de clivare #i de
poliadenilare. Localizarea acestui semnal a fost studiat! examinnd efectul dele"iilor
situate n vecin!tatea situsului de poliadenilare. Experien"ele demonstreaz! c!
secven"a #i pozi"ia precis! a acestui semnal variaz! de la o gen! la alta. n numeroase
gene de vertebrate semnalul cel mai probabil este un segment bogat n GT sau T, 5-
YGTGTGYY (Y fiind o pirimidin!), situat cam la 25 pb n aval de situsul de
poliadenilare #i adesea urmat la o distan"! variabil! de o scurt! secven"! de T.
n anumite circumstan"e situsurile autentice de poliadenilare pot s! nu fie
efective. n maturarea ARNm tardiv al adenovirusului de tip 2, un singur situs de
poliadenilare din cinci poten"iale este utilizat pentru producerea fiec!ruia din
transcrip"ii primari. Abunden"a relativ! a celor cinci clase de ARNm tardiv la
adenovirus reflect!, n parte, frecven"a cu care transcriptul primar este clivat #i
poliadenilat la unul din situsurile sale caracteristice. n acest caz, abunden"a relativ! a
moleculelor de ARNm produse plecnd de la transcriptul primar de modific! n cursul
infec"iei, indicnd c! alegerea situsului de poliadenilare este controlat!. Un al doilea
exemplu este cel de trecere de la producerea formei membranare la cea a formei
secretate n cazul imunoglobulinelor. Aceste dou! forme difer! printr-o regiune a
lan"urilor lor grele. n acest caz poliadenilarea pre-ARNm la prima pereche de
semnale, cea care este folosit! pentru formarea ARNm care codific! forma secretat!,
este suprimat!; molecula de ARNm este t!iat! la semnalul urm!tor producnd un pre-
ARNm care poate fi maturat pentru a da na#tere ARNm care codific! forma
membranar!. Deci, trecerea de la forma membranar! la forma secretat! rezult! din
utilizarea regl!rii diferen"iale a reac"iei de poliadenilare. Fenomenul "i modalit!#ile
sale de control nu sunt deplin elucidate.
Secven"a AATAAA a fost implicat! #i n terminarea transcrip"iei. Aceast!
secven"! situat! la extremitatea 3 a secven"ei codante a "-globinei majore de #oarece
este necesar! pentru terminarea care se realizeaz! la o distan"! de 1,5 kb. n plus,
acelea#i dele"ii #i modific!ri care blocheaz! poliadenilarea corect! reduc #i
eficacitatea cu care se realizeaz! terminarea n aval. Aceasta sugereaz! c!
recunoa#terea situsului de poliadenilare trebuie s! se realizeze nainte de terminarea
transcrip"iei la secven"a adecvat! situat! n aval. Ipoteza prin care consider! c!
complexul de transcrip"ie nu achizi"ioneaz! capacitatea de a realiza terminarea
transcrip"iei dect dup! cea realizat transcrierea semnalului de poliadenilare constituie
o modalitate interesant! de a asocia poliadenilarea #i terminarea. Ea poate fi valabil!
n cazul n care complexul de transcrip"ie ar con"ine un factor care ar putea mpiedica
192
termin!rile inoportune n timpul transcrip"iei matricei #i l-ar pierde pe acesta la
trecerea peste semnalul de poliadenilare. Dac! lucrurile s-ar petrece astfel, complexul
de transcrip"ie lipsit de acest factor s-ar putea desprinde de matrice la nivelul
secven"ei bogate n T pe care o ntlne#te n continuare. Acest model este urmarea
studiilor realizate in vitro cu ARN polimeraz! II purificat!, care demonstreaz! c!
transcrip"ia mai multor tipuri de matrice ADN se termin! frecvent la nivelul
secven"elor bogate n T prezente n gen!. Este posibil ca clivarea transcriptului la
semnalul de poliadenilare s! permit! unei ARN nucleaze sau unei proteine de tip ( s!
se fixeze la polimeraz! #i s! induc! terminarea la nivelul secven"ei bogate n T
prezent! n aval.
Clivarea #i poliadenilarea se pot realiza n diferite tipuri de extracte celulare
singura condi"ie fiind ca acestea s! posede moleculele ARN substrat purt!toare de
semnale adecvate. Studiile realizate in vitro cu astfel de sisteme au clarificat diferite
aspecte ale acestor reac"ii. Astfel, clivarea #i poliadenilarea se pot realiza independent
una de cealalt!. n prezen"a unor analogi ai ATP (ex. cordicepina, care este 3
dezoxiadenozin trifosfat), t!ierea (ruperea) se realizeaz! la situsul exact dar nu este
urmat! de poliadenilare. Poliadenilarea se poate realiza la nivelul radicalului oxidril
din 3 terminal! care este precedat! de o secven"! AAUAA. Frac"ionarea unui extract
de celule Hela care au capacitate de clivare #i de poliadenilare a unui substrat ARN
furnizeaz! multe frac"ii proteice care, mpreun!, catalizeaz! aceste dou! reac"ii. Una
dintre componente este o poli A polimeraz!, o alt! frac"ie con"ine una sau mai multe
particule ribonucleoproteice nucleare mici (snRNP) #i cea de a treia este o protein!
(64 kD) care se leag! la o regiune care con"ine secven"a AAUAAA. Ace#ti trei factori
sunt necesari pentru a asigura cuplarea cliv!rii cu poliadenilarea, n condi"iile n care
singur!, poli A polimeraza poate realiza poliadenilarea unei catene de ARN clivat!
corect. Cu toate c! mecanismul nu este pe deplin elucidat se poate considera c!
snRNP U11 mpreun! cu proteina 64 kD #i probabil cu alte snRNP pot forma un
complex n imediata vecin!tate a secven"ei AAUAAA care asigur! clivarea ARN #i
permit o poliadenilare corespunz!toare. Implicarea snRNP se bazeaz! pe descoperirea
unor fragmente care con"in secven"a AAUAAA n imunoprecipitalelor ob"inute cu
anticorpi anti snRNP #i pe inhibarea poliadenil!rii, in vitro, realizat! de ace#ti
anticorpi. Rolul snRNP n poliadenilare este coerent n maturarea ARN: U7 snRNP
este implicat! n crearea extremit!"ilor 3 ale ARNm de histone, U3 snRNP n
producerea extremit!"ii corecte a ARNr 28S #i U1, U2, U5 (I U4/U6 n maturarea
pre-ARNm. Cum genelor de la drojdii #i probabil de la celelalte eucariote inferioare le
lipsesc semnalul canonic de poliadenilare, AAUAAA, formarea cozii poli A poate fi
cuplat! cu terminarea transcrierii. Secven"e ca 5-T5ATAT, care favorizeaz!
terminarea, pot fi utile n crearea extremit!"ii 3 necesare poliadenil!rii. Formarea
extremit!"ii 3 poate fi #i rezultatul cliv!rii endonucleotidice a unui trancript mai lung
urmat! de poliadenilarea realizat! de poli A polimeraza. Nu s-a stabilit nc! dac! la
drojdii intervin snRNP.

Silde 16. *Procesarea post-transcrip%ional$. Formarea coifului
ARNm de la eucariote
Figura: Structura capului la ARNm eucariot. Acesta este prezentat drept cap 0, cap
1 sau cap 3 dac! nu prezint! alte modific!ri ulterioare n func"ie de pozi"ia de
metilare a nucleozidului (n O2), sau dac! primele dou! nucleozide sunt O2
metilate.


193
Informatii suplimentare
Coiful
n afar! de o excep"ie cunoscut! (ARNm de la picornavirus) toate moleculele
de ARNm de la eucariote, celulare #i virale, posed! un coif la extremitatea 5.
Coifurile transcrip"ilor nucleari #i citoplasmatici ai polimerazei II sunt asociate cu
proteine care se leag! specific. Pentru moment rolurile acestor proteine "i ale coifului
nu sunt deplin clarificate. S-a stabilit totu#i c! coiful interac"ioneaz! specific cu
factorii de ini"iere n asamblarea complexului de traducere.
Formarea coifului la extremitatea 5 a transcrip"ilor polimerazei II are loc
imediat dup! ini"iere; chiar #i moleculele de ARN cele mai scurte posed! acest coif.
Unul dintre substratele enzimei care realizeaz! ad!ugarea coifului (guanil transferaza)
este GTP; cel!lalt este extremitatea difosfat creat! prin eliminarea fosfatului terminal
al trifosfatului primului nucleotid al ARN n formare. n reac"ia de ad!ugare a
coifului, fosfatul terminal al pre-ARNm este nlocuit cu gruparea guanil a GTP cu
pierderea a doi fosfa"i terminali din GTP. Nu se poate realiza reac"ia dac! pre-ARNm
nu posed! dect un monofosfat 5 terminal. Astfel coifurile marcheaz! primul
nucleotid la nivelul c!ruia ncepe transcrip"ia. Restul de guanidin! ad!ugat este
metilat n pozi"ia 7 a ciclului purinei de c!tre guanin-7-metil transferaza; radicalii
hidroxil 2 ai primelor dou! nucleotide sunt apoi metila"i de c!tre 2-O-metil
transferaza. Gruparea 7-metil-GTP nu poate constitui substrat pentru reac"ia de
ad!ugare a coifului. Moleculelor ARN U sunt li se adaug! coiful n acela#i mod; dar
n aceste caz metil!rile ulterioare furnizeaz! 2, 2 -7-trimetil guanozina la fel ca #i
substituen"ii 2-O-metil prezen"i la primele nucleotide ale transcriptului. Deoarece
moleculelor de pre-ARNm formate n extractul celular, sau cu ARN polimeraz! II
purificat! li se adaug! coiful corect, activit!"ile enzimatice responsabile sunt probabil
asociate polimerazei. Reac"iile de ini"iere ale procesului de ad!ugare a coifului
realizate de c!tre polimeraza II sunt probabil cuplate obligatoriu deoarece transcrip"ii
nucleari forma"i de c!tre ARN polimeraza III, care posed! o extremitate trifosfat (ex.
ARN U6, ARNr 5S #i pre-ARNt), nu sufer! procesul de ad!ugare a coifului. Ne
ntreb!m care sunt parametrii care determin! diferitele tipuri de coifuri ale pre-ARNm
#i pre-ARN U.
Rolul coifurilor n timpul transcrip"iei #i matur!rii transcrip"ilor primari n
ARNm nu este clar. De exemplu, rezultatele ob"inute privind implicarea coifului n
maturare sunt contradictorii. Este posibil ca coiful s! aib! un rol n formarea
complexelor nucleare de ribonucleoproteine (nRNP) n care moleculele de pre-ARNm
sunt sechestrate n timpul transportului ARNm n afara nucleului sau n asamblarea
particulelor ribonucleoproteice citoplasmatice (cRNP). Exist! indica"ii care sugereaz!
c! coifurile #i proteinele asociate acestora asigur! protec"ia moleculelor de ARNm de
o degradare care ar putea s! demareze la extremitatea 5. Mai bine stabilit! este
necesitatea coifului pentru ata#area ARNm de ribozomi nainte de demararea
traducerii. Unul dintre factorii de ini"iere, eIF-4 E, este un factor de recunoa#tere
specific coifului n timpul asocierii subunit!"ii 40S a ribozomului la extremitatea 5 a
ARNm. Se consider! c! eliminarea coifului unei molecule de ARNm mpiedic!
traducerea sa in vivo. In vitro s-a dovedit c! moleculele de ARNm care nu posed! coif
pot fi totu"i traduse. Singura excep"ie cunoscut! de la aceast! exigen"! este ARN
genomic de la picornavirus (de ex. virusul polio) care func"ioneaz! ca ARNm pentru
toate proteinele codificate de virus. n plus, n celulele infectate de c!tre virusul polio
se opre#te sinteza proteinelor gazdei deoarece o protein! viral! inactiveaz! proteinele
celulare legndu-se la nivelul coifului.

194
Silde 17. Cap$tul 5& -cap este ad$ugat moleculei n formare dup$
ini%ierea transcrip%iei de c$tre ARN polimeraza II

Figura: Ad!ugarea coifului la transcrip#ii ARNm n formare prin ad!ugarea 7-
metil citozin!
Primele dou! reac"ii sunt catalizate de o enzim! responsabil! de ad!ugarea
coifului care se asociaz! cu domeniul CTD al ARN polimerazei II la scurt timp dup!
ini"ierea transcrip"iei. Dou! metil-transferaze diferite catalizeaz! reac"iile 3 #i 4. S-
adenozin metionina (S-Ado-Met) este sursa de grup!ri metil (CH3) pentru cele dou!
etape de metilare; restul guanilat (G) este metilat primul, apoi hidroxilul din pozi"ia 2
al primului sau primelor dou! nucleotide (N) din transcript.

Silde 18. Pre-ARNm este asociat cu proteine hnRNP care con%in
domenii conservate de legare a ARN
Figura: Vizualizarea hnRNP (heterogen nuclear ribonucleoproteine) asociate cu
transcrip#ii n formare ntr-un ovocit de la Nophthalmus viridescens (triton)
O por"iune a cromozomului n perie. ADN din axa cromozomului este
colorat n alb cu colorantul specific pentru ADN, DAPI. Filamentele lungi ro#ii sunt
transcrip"i n formare lega"i cu hnRNP, care prezint! fluorescen"! ro#ie dup!
colorarea cu un anticorp fa"! de proteine hnRNP.

Silde 19. Interac%ia unui motiv RNP la nivelul proteinei U1A &i a ARN
Figura: Structura complexului format ntre un motiv RNP format din proteina U1A "i
ARN
a) Diagrama unui motiv al domeniului RNP. Regiunile conservate RNP1 #i
RNP2 sunt localizate n dou! catene beta pozi"ionate n mijloc;
b) Reprezentare a suprafe"ei complexului format din proteina U1a #i ARN
determinat! prin cristalografie cu raze X. ARN formeaz! a bucl! stem cu
por"iunea monocatenar! a buclei legat! la suprafa"a proteinei. Capetele C #i N
terminale sunt orientate c!tre dreapt a#i stnga. Aminoacizii acizi sunt colora"i
n ro#u #i albatru respectiv.

Silde 20. Proteinele hnRNP pot fi implicate n procesarea &i
transportul ARNm
Figura: Hibridizarea moleculelor de ARN in vitro accelerat! de c!tre proteinele
hnRNP.
Prezen"a structurilor secundare complexe n structura moleculelor de ARN,
hibridizarea ntre secven"ele lungi complementare din molecule separate. Asocierea
dintre proteine hnRNP #i ARN se consider! c! previne formarea structurilor ARN
secundare, facilitnd astfel mperecherea diferitelor molecule complemntare. Aceste
molecule pot avea func"ii similare in vivo.

Silde 21. Pre-ARNm sunt scindate la situsuri specifice 3& &i rapid
poliadenilate
Figura: Model de clivare "i poliadenilare a ARNm n celulele de mamifere
Factorul specific de poliadenilare #i clivare (CPSF) se leag! la o regiune n
amonte AAUAAA de situsul de poliadenilare. CStF interac"ioneaz! cu o secven"p din
aval bogat! n GU sau U #i cu CPSF legat, formnd o bucl! n ARN; legarea CFI #i
195
CFII ajut! stabilizarea complexului. Legarea poli(A) polimerazei (PAP) stimuleaz!
apoi clivarea la nivelul situsului poli(A), care este de obicei pozi"ionat la 10-35
nucleotide n 3 fa"! de semnalul de poliadenilare din aval. Factorii de clivare sunt
elibera"i, ca#i produsul de clivare din aval care este rapid degradat. Legarea PAP
adaug! apoi aproximativ 12 resturi A la o rat! sc!zut! la gruparea hidroxil 3 generat!
prin reac"ia de clivare. Legarea proteinei de legare PABII (Poli(A) binding protein la
coada poli(A) ini"ial! scurt! accelereaz! rata de ad!ugare catalizat! de PAP. Dup!
ad!ugarea a 200-250 resturi, PABII semnalizeaz! oprirea polimeriz!rii.

Silde 22. Etapa final$ de maturare: intronii sunt nl$tura%i iar exonii
sunt suda%i mpreun$
Figura: Demonstra#ie c! intronii sunt nl!tura#i, prin tehnica electronomicroscopica
asupra hibrizilor ADN-ARN forma"i de adenovirusul ADN #i ARNm care codific!
hexon, o protein! viral! major!.

Informatii suplimentare
Secven"ele codante ale genelor eucariote (exonii) sunt frecvent ntrerup"i de
c!tre regiuni necodante (intronii). Aceast! descoperire curioas! a ridicat numeroase
ntreb!ri fundamentale.
1) Unde, cnd #i cum au ap!rut intronii la nivelul genelor #i care este rolul lor
n evolu"ie?
2) Cum transcrip"ii primari ai acestor gene mozaic sunt transforma"i n
molecule ARN mature, lipsite de introni?
3) Care este influen"a procesului de excizie-epissage asupra regl!rii expresiei
genelor?
4) Care este func"ia, dac! exist! vreuna, intronilor n multitudinea opera"iilor
care afecteaz! genoamele contemporane. Sunt intronii vestigii ale evolu"iei genelor #i
au vreun rol n via"a organismelor contemporane?
Scopul nostru principal este de a expune ceea ce #tim despre structura
intronilor, despre mecanismele prin care ace#tia sunt elimina"i #i despre influen"a
procesului de maturare asupra expresiei genelor eucariote.
Roberts #i Sharp au ob"inut premiul Nobel pentru Fiziologie #i Medicin! n
1993, pentru descoperirea structurii discontinue a genelor.


Silde 23. *Electrono-micrografie care eviden%iaz$ formarea hibridului
pre-ARNm/ARNm
Figura: O micografie electronic! "i reprezentarea sa schematic! privind formarea
unui hibrid ntre catena antisens a genei de ovalbumin! de la pui (a#a cum a fost
ob"inut! prin clonare molecular!) #i ARNm corespunz!tor. Segmentele
complementare ale ADN (linia punctat! ro#ie) #i ARNm (linia ro#ie) au fost anelate
pentru a eviden"ia pozi"ia exonilor. Segmentele care formeaz! bucle externe (I la VII),
care nu au secven"e suplimentare cu structura ARNm, sunt intronii.

Informatii suplimentare- Frecven%a intronilor
Frecven"a genelor n mozaic variaz! foarte mult n func"ie de speciile
eucariote. Ace#tia sunt foarte frecven"i la vegetale #i la animale #i la virusurile care le
infecteaz!. Intronii sunt mult mai rari n genele nevertebratelor (ex. Drosophila,
nematodele #i ariciul de mare). Totu#i, mai multe gene care guverneaz! morfogeneza
196
la Drosophila (ex. grupele Ultrabitorax #i Antennapedia) prezint! aranjamente
complexe de introni #i exoni. Cea mai mare parte a genelor S. cerevisiae sunt lipsite
de introni (genele pentru actin! #i pentru alte cteva molecule de ARNt sunt excep"ii)
dar genele mozaic sunt mult mai numeroase la o specie nrudit! numit!
Schizosaccharomyces pombe. Cu toate c! intronii sunt rari n genele nucleare, ei sunt
mult frecven"i n genele mitocondriale ale acestei drojdii. La descoperirea lor s-a
crezut c! genele mozaic sunt o caracteristic! proprie genelor eucariote. Eviden"ierea
lor n gena timidilat sintetazei bacteriofagului T4 a demonstrat c! aceast! idee era
fals!. De atunci, au mai fost descoperi"i introni #i n gena care codific! ARNtSer #i n
gena pentru ARNr de la Archeobacterii, etc. Acum nu mai este surprinz!tor c!
cercet!ri mult mai avansate eviden"iaz! al"i introni n genele procariotelor . Au fost
descoperi"i introni #i la anumite bacterii.
Intronii exist! n genele nucleare care codific! pentru ARNm. ARNr (dar
numai n genele lungi pentru ARNr de la eucariotele inferioare) #i pentru un grup de
gene care codific! ARNt. De asemenea, intronii sunt frecven"i n genele mitocondriale
#i din cloroplaste, care codific! pentru moleculele ARN mesager, ribozomic #i de
transfer din aceste organite. Totu#i, n genele mamiferelor unde prezen"a intronilor
este o regul!, exist! #i excep"ii. Cea mai mare parte a genelor pentru histone nu con"in
introni, ca #i cele dou! familii de gene care codific! pentru interferonii ! #i ", n timp
ce gena pentru interferon ) con"ine foarte mul"i. Nu se cunosc nc! exemple privind
prezen"a intronilor n genele pentru ARNr 5S #i 5,8S #i nici pentru ARN U, 7SL #i
7SK.
Diferite tipuri de introni
To"i intronii sunt transcri#i ca p!r"i integrante ale moleculelor precursoare de
ARN #i sunt apoi elimina"i printr-un proces de t!iere-legare numit excizie-episaj.
Structura #i mecanismele de episaj stau la baza clasific!rii diferitelor tipuri de introni.
Not!: Bazele sunt notate a"a cum apar n structura ARN. Y reprezint! o pirimidin! "i
indicele n indic! un num!r multiplu de pirimidine. R reprezint! o purin!. Literele
subliniate sunt bazele invariante "i s!ge#ile indic! situsurile de t!iere.

Silde 24. Secven%e consens la nivelul a diferite tipuri de situsuri de
splicing

Silde 25. Splicing-ul se produce la nivelul unor secven%e conservate,
scurte
Figura: Secven#ele consens din jurul situsurilor de splicing 5 "i 3 din structura
pre-ARNm de la vertebrate
Cu toate c! bazele 5(GU) #i 3(AG) sunt aproape invariabile n structura
intronului, totu#i bazele care le flancheaz! pe acestea sunt prezente la frecven"e mai
mari dect cele a#teptate n cazul unei distribu"ii aleatoare. O regiune bogat! n
pirimidin! (albastru deschis) situat! n apropierea cap!tului 3 al intronului este
prezent! n majoritatea cazurilor. Punctul de ramificare adenozinic, de asemenea
invariant este format de obicei de 20 la 50 baze n direc"ia 3. Regiunea central! a
intronului, care poate fi cuprins! ntre 40 pb #i 50 kilobaze lungime nu este necesar!
procesului de spicing.

Informatii suplimentare
Intronii genelor nucleare pentru ARNm - Intronii genelor nucleare care
codific! pentru proteine, primii care au fost descoperi"i, au o m!rime de la 10 pb la
197
10kpb. Intronii genelor omologe de la diferite specii de vertebrate pot s! difere prin
lungime #i secven"! asemeni intronilor din genele nenrudite. M!rimea exonilor pare
s! se situeze n jurul valorilor de 52, 140, 223 #i 229 pb, ultima fiind cea mai
frecvent!. Exist! #i situa"ii (rare) n care lungimea intronilor este de 15 la 30 pb sau de
mai multe sute sau mii de pb. Caracteristicile cele mai comune ale intronilor sunt
secven"ele din 5 (secven"e situate n amont sau donatoare) #i n 3 (n aval sau
acceptoare) adic! jonc"iunile exon-intron sau situsurile de excizie-episaj.
Secven"ele nucleotidice ale fiec!rei jonc"iuni exon-intron sunt conservate
remarcabil n aproape toate genele nucleare pentru ARNm la aproape toate speciile
studiate. Secven"a care flancheaz! cel mai frecvent situsul de episaj din 5 este CRG
(unde R reprezint! o purin!), cea care formeaz! cap!tul din 3 fiind adesea
reprezentat! de un singur G. Cele mai mari varia"ii se ntlnesc n secven"ele care
nconjoar! intronii, ns! muta"ii la nivelul acestor situsuri nu mpiedic! niciodat!
episajul, chiar dac! exist! cazuri n care poate fi afectat! viteza. Structurile cele mai
pu"in variabile se g!sesc n intron. Primele dou! nucleotide ale extremit!"ii 5 ale
intronului n ARN sunt aproape ntotdeauna GU (GC n cazuri excep"ionale);
urm!toarele cinci nucleotide nu sunt invariabile, cu toate c! secven"a AGAGU pare s!
fie consensus. Modific!rile lui nucleotidelor G sau U prezente la nivelul jonc"iunii
mpiedic!, n general, realizarea episajului, n timp ce modific!rile pozi"iilor adiacente
afecteaz! diferit episajul. Cele #ase nucleotide de la extremitatea 5 a intronului sunt
suficiente pentru situsul de episaj. Chiar #i jonc"iunile criptice (ascunse), care nu sunt
folosite dect rar sau cnd situsurile dominante sunt pierdute sau modificate, posed!
secven"a GU la extremitatea 5 a fragmentului care trebuie eliminat. Cap!tul 3 al
intronului se termin! invariabil prin AG, foarte adesea precedat, n intronii de
mamifere, de o secven"! bogat! n pirimidin! (YnNYAG). (i n acest caz muta"iile
care nlocuiesc invariabilele A sau G printr-o alt! baz! mpiedic! episajul acestei
jonc"iuni.
Un rest A apropiat de extremitatea 3 a intronului este un participant esen"ial
la episajul moleculelor pre-ARNm. n intronii mamiferelor, pozi"ia acestui A nu este
invariabil! deoarece poate fi utilizat orice A dintre nucleotidele situate n pozi"iile 18
la 37 n amont de situsul de episaj. Totu#i, muta"ii la nivelul secven"ei vecine acestui
A (cel utilizat) provoac! o important! diminuare a eficacit!"ii episajului in vitro;
astfel, cu toate c! nucleotidul A esen"ial nu apare ntr-un context invariant, secven"a
vecin! influen"eaz! folosirea sa. Din contr!, n cazul moleculelor de pre-ARN
nucleare de la drojdie, restul A este furnizat de un heptanucleotid , 5-UACUAAC-3,
situat ntre nucleotidele 6 #i 59 n amont de situsul de episaj.
Prezen"a secven"elor consensus ale situsurilor de excizie-episaj nu semnific!
ntotdeauna c! intronul poate fi excizat. n anumite cazuri, una sau dou! secven"e ale
acestui situs sunt situate n exoni #i n introni n locuri unde nu se produce n mod
normal excizie-episaj. Totu#i, astfel de situsuri criptice (ascunse) pot func"iona n
anumite circumstan"e (ex., cnd situsurile autentice sunt modificate sau absente).
Ocazional, intronii posed! mai mult de o jonc"iune 5 sau 3, permi"nd
procese de excizie-episaj alternative. De exemplu, ntr-o regiune precoce a SV40 sunt
doi introni care au amndoi acela#i situs 3 dar jonc"iunile 5 sunt diferite. Rezultatul
acestor procese de episaj alternativ duc la formarea a dou! molecule de ARNm
plecnd de la acela#i transcript primar. n anumite circumstan"e, alegerea episajului
este reglat! n timp n func"ie de "esut. Adesea, situsuri de episaj exist! dar nu sunt
folosite. Astfel, genoamele retrovirale provin din transcrip"i de ADN proviral care nu
au suferit excizie-episaj, dar producerea de ARNm care codific! pentru anumite
proteine virale necesit! excizie. n acest caz acela#i transcript poate fi excizat sau nu.
198
Cum s-a men"ionat anterior, intronii pot con"ine alte elemente genetice, cum
sunt elementele activatoare (enhancers) ale altor gene, semnale de replicare #i de
mpachetare a cromozomului sau secven"e necesare asambl!rii pre-ARNm n
particulele ribonucleoproteice (RNP).

Silde 26. *Etapele procesului de producere a ARNm matur (gena
ovalbuminei de pui)
Figura: Secven#a etapelor de producere a ARNm eucariot a"a cum se poate vedea
pentru gena ovalbuminei de la pui.
n urma transcrip"iei, transcriptului primar i se adaug! capul #i coada
poliA. Intronii sunt apoi exciza"i #i exonii suda"i mpreun! pentru a forma structura
ARNm matur.

Informatii suplimentare
Splicingul intronilor moleculelor pre-ANRm nucleare
Studiul mecanismelor de splicing n cazul pre-ARNm nucleari a fost facilitat
de existen"a genelor mozaic clonate #i n particular a formelor modificate natural sau
deliberat ale acestor gene. Substrate special preparate, prin fuziune de exoni #i introni,
au ajutat mult la identificarea structurilor necesare pentru un splicing fidel. Cea mai
bun! a fost ns! abordarea biochimic!, gra"ie folosirii de extracte celulare capabile s!
realizeze splicing #i de asemenea purificarea elementelor ma#in!riei acestei reac"ii.
Au fost utilizate substrate ARN purt!tore de coif; acestea au fost ob"inute prin
transcrierea matri"elor ADN special preparate, inserate n aval de promotorul fagului
SP6 #i utiliznd ARN polimeraza specific! acestuia.
Caracteristici generale
Splicingul pre-ARNm nucleari are loc n nucleu, n acela#i timp cu transcrip"ia
pentru anumite gene sau dup! transcrip"ie pentru altele. Exist! indica"ii care sugereaz!
c! ad!ugarea coifului la extremitatea 5 a transcriptului are implica"ii asupra
procesului de maturare. Conceptual #i practic, este foarte important s! se cunoasc!
cum o molecul! pre-ARNm care con"ine mai mul"i introni poate fi maturat! astfel
nct exonii vecini s! poat! fi asocia"i corect. Deoarece se #tie c! situsul 5 al unui
intron poate fi clivat n acela#i timp cu situsul 3 al altuia, este foarte important s! se
n"eleag! cum, n cursul unei reac"ii normale, acest lucru poate fi evitat pentru a se
putea realiza un splicing alternativ.

Silde 27. Analiza produ&ilor ARN forma%i ntr-o reac%ie de splicing in
vitro
Figura: Analiza produ"ilor ARN forma#i printr-o reac#ie de splicin in vitro.
Un extract nuclear de celule Hela a fost incubat cu 497 nucleotide ARN
radiomarcate (n partea de sus) care con"in por"iuni din doi exoni (ro#u #i roz) din
ARNm pentru beta-globin! separa"i de un intron de 130 nucleotide (albastru). Dup!
incubare perioade diferite de timp, ARN a fost purificat #i supus electroforezei #i
autoradiografiei n prezen"! de markeri ARN (linia M). Este indicat num!rul de
nucleotide din diferite specii. Majoritatea moleculei ini"iale de care migreaz! mai
ncet (497 b) a fost corect maturat! conducnd la un produs de 367 nucleotide.
Intronul excizat (aprox 130 b) migraz! mai lent dect ne-am fi a#teptat "innd cont de
masa sa molecular!, indicnd c! nu este o molecul! linear!. De asenmenea, unul din
intermediarii reac"iei (339 b) manifest! o mobilitate electroforetic! anormal de lent!.
Analize suplimentare au indicat c! n ambele cazuri intronul nu este o molecul!
199
linear! ci op molecul! sub formp de laso. Banda de 252 b, un produa aberant n
reac"ia in vitro este mult redus! n reac"iile n care ARN posed! structura cap.

Informatii suplimentare
Traseul reac#iilor de splicing
n primul rnd vor fi discutate etapele de clivare #i de legare care constituie
reac"iile de splicing. Etapa ini"ial! o constituie asamblarea unui complex de maturare
(splicing). Primii produ#i detecta"i in vitro sunt rezultatul cliv!rii la nivelul situsului
de splicing 5: unul con"ine exonul 5, cel!lalt intronul #i exonul 3. Cum pentru nici o
specie de ARN nu s-a eviden"iat o alterare a produsului clivat la nivelul situsului 3,
nseamn! c! t!ierea la nivelul situsului 5 trebuie s! precead! decuparea situsului 3.
O dat! ce reac"ia progreseaz! se acumuleaz! doi produ#i: exonii asocia"i corect #i
intronul complet liber. Att produsul cliv!rii ini"iale #i intronul excizat con"in o
structur! n loso asem!n!toare celei descrise pentru intronii mitocondriali de tip doi
ob"inu"i prin auto-splicing. Structura n laso a fost pentru prima dat! sugerat! de
mobilitatea electroforetic! anormal! a intronului eliberat, de incapacitatea sa de a
servi drept matri"! pentru realizarea unei transcrip"ii inverse pornind de la un punct
apropiat de extremitatea 3 #i de rezisten"a acestuia la digestie complet! cu mai multe
ribonucleaze. Structura a fost apoi confirmat! prin izolarea ribonucleotidelor
punctului de ramificare (nchidere a lasoului). Acesta con"ine ntotdeauna, indiferent
de intronul eliberat, fosfatul 5 al guanozinei de la nivelul jonc"iunii intronului
asociat! printr-o leg!tur! diester cu hidroxilul din pozi"ia 2 al unei adenozine. A fost
astfel explicat! existen"a nea#teptat! a unor molecule de ARN nuclear care posedau o
ramificare pornind de la hidroxilul 2 al unui rest adenozil.

Silde 28. Mecanismul de splicing presupune dou$ reac%ii de
transesterificare
Figura: splicingul exonilor din molecula pre-ARNm apare prin intermediul a dou!
reac#ii de transesterificare.
n prima reac"ie, leg!tura ester dintre griparea 5-fosfat a intronului #i oxigenul
din 3 (ro#u) al exonului 1 este schimbat! pentru o leg!tur! ester cu oxigenul 2
(albastru nchis) al restului A de ramificare. n cea de a doua reac"ie, leg!tura ester
dintre fosforul din 5 al exenului 2 #i oxigenul 3 (albastru deschis) al intronului este
schimbat! pentru o leg!tur! cu oxigenul 3 al exonului 1, elibernd intronul sub forma
unei structuri in laso #i resudnd cei doi exoni. S!ge"ile arat! unde atomii de oxigen
din grup!rile hidroxil activare reac"ioneaz! cu atomii de fosfor.

Silde 29. Secven%a reac%iilor de transesterificare implicare n unirea
exonilor
Figura: Secven#a reac#iilor de transesterificare care aduc mpreun! exonii
moleculelor de pre-ARNm (exonii #i intronii sunt desena"i n albastru #i portocaliu; R
#i Y reprezint! purina #i pirimidina):
1) Gruparea 2-OH a unui intron specific A atac! nucleofil gruparea 5-fosfat de la
cap!tul 5 al cap!tului intronilor pentru a ajunge la o structur! sub form! de laso;
2) Gruparea 3-OH eliberat! formeaz! o leg!tur! 3-5-fosfodiester cu restul terminal
5 a exonului 3 , determinnd astfel unirea celor doi exoni #i eliberarea intronului sub
form! de laso.

200
Silde 30. Moleculele de small nuclear RNAs (snRNAs) asist$ reac%ia
de splicing
Figura: Diagrama interac#iilor dintre pre-ARNm, U1ARNsn "i U2ARNsn n procesul
de splicing-ul timpuriu
Regiunea 5 a U1ARNsn ini"ial mperecheate cu nucleotide la cap!tul 5 al
intronului (albastru) #i cap!tul 3 al exonului din 5 (ro#u nchis) al pre-ARNm;
U2ARNsn se mperecheaz! cu o secven"! care include punctul de ramificare A, de#i
acest rest nu este mperechiat. n figur! este prezentat! secven"a punctului de
ramificare de la drojdii. Structurile secundare ale ARNsn care nu sunt alterate n
timpul splicingului sunt prezentate sunt form! de linii diagramate. Dreptunghiurile
ro#ii reprezint! secven"e care leag! proteine snRNP recunoscute de c!tre anticorpii
anti-Sm. Din motive necunoscute, antiserurile de la pacien"i cu boli autoimune
sistemice cum este lupus eritematos (SLE) con"in ace#ti anticorpi. Ace#ti anticorpi
au fost utili n caracterizarea componentelor reac"iilor de splicing.

Silde 31. Spliceozomul complex ribonucledoproteic compus din multe
molecule de snRNPs
Figura: Micrografia eloectronic! a unui spliceozom
Extractele din celulele HeLa au fost amestecate cu pre-ARNm pentru beta-
globulin!; reac"ia a fost ntrerupt! nainte ca splicingul s! fie complet, astfel nct s!
poat! fi purificat spliceozomul care con"ine RNPsn #i pre-ARNm.

Informatii suplimentare
Asamblarea spliceozomilor
Deoarece splicingul are loc la nivelul spliceozomilor apare necesitatea
cunoa#terii structurii, asambl!rii #i mecanismelor de ac"iune ale acestora. Particulele
de splicing izolate dintr-un amestec de reac"ie n care clivarea n 3 a fost inhibat!,
sunt de form! elipsoidal! #i cu dimensiuni de 25 x 50 nm. n particular, intronul este
asociat fiec!ruia dintre snRNP U1, U2, U4/U6 #i U5. Spliceozomii func"ionali con"in
#i alte proteine #i n particular pe cele care sunt implicate n legarea snRNP la "intele
lor care sunt normal fixate pe structura pre-ARNm nuclear.
O secven"! minimal! a exonului este necesar! leg!rii snRNP la intron. Dup!
schema actual! de asamblare a spliceozomilor, se leag! primele particulele snRNP U1
la func"iunea 5, chiar dac! exist! sau nu situsuri func"ionale pentru fixarea, n
continuare, a snRNP U2 #i U5; dar aceast! singur! leg!tur! este insuficient! pentru a
provoca clivarea situsului 5. Prima legare este apoi urmat! de asocierea snRNP U2.
U5 #i U4/U6, asociere care necesit! ATP. Legarea snRNP U2 la situsul s!u de pe
intron se bazeaz! pe mperecherea de baze; n timp ce ncorporarea complexului
snRNP U4/U6 #i U5 n spliceozom depinde de interac"iile dintre snRNP. O schem!
asem!n!toare este valabil! pentru asamblarea particulelor de splicing pentru pre-
ARNm de la drojdii. Dup! legarea exonilor evolu"ia spliceozomului este incert!, dar
snRNP sau sub-ansamble ale acestora sunt probabil reciclate atunci cnd ARN
intronic este degradat. Acest mers al reac#iilor reprezint! a secven#! posibil! dar nu
obligatorie a asambl!rii spliceozomilor. Pentru a fi mult mai siguri este necesar!
analiza rela#iilor precursor-produs. Modelul nu explic! cum se realizeaz! clivarea
situsului 3', cum se realizeaz! legarea exonilor "i nici de ce acesta este limitat! la
exonii adecva#i.


201
Silde 32.Ciclul de ac%iune la nivelul spliceozomului
Figura: Ciclul de splicing al sliceozomului
RNPsn implicate n splicing (U1, U2, U4, U5 #i U6) asociate cu pre-ARNm
#i ntre ele ntr-o anumit! ordine secven"ial! n scopul form!rii spliceozomului.
Acest complex ribonucleoproteic catalizeaz! apoi cele dou! reac"ii de
transesterificare care au ca rezultat splicingul (sudarea) exonilor (ro#u nchis #i
deschis) #i eliberarea intronului (albastru) sub forma unei structuri laso. Cu toate c!
pentru reac"iile de transesterificare nu este necesar! hidroliza ATP, se consider! c!
acesta este necesar pentru a furniza energia necesar! rearanjamentele structurii care
apar n timpul ciclului. De re"inut c! proteinele snRNP din structura spliceozomului
sunt distincte fa"! de RNPhn discutate anterior. La eucariotele superioare asocierea
U2ARNsn cu pre-ARNm este asistat! de o protein! RNPhn numit! U2AF, care se
leag! o regiune baogat! n pirimidin! situat! lng! situsul 3 de splicing. De asemenea
U2AF ac"ioneaz! probabil #i cu alte proteine necesare pentru splicing prin intermediul
uni domeniu care con"ine repeti"ii dipeptidice serin!-arginin! (motivul SR). Punctul
de ramificare A din structura pre-ARNm este indicat cu caracter ro#u boldit.

Silde 33. Auto-splicing-ul intonilor de grup II furnizeaz$ indicii
pentru evolu%ia snRNPs
Figura: Diagrame schematice care compar! structurile secundare de auto-splicing
ale intronilor de grup II (a) "i UARNsn prezent n spliceozomi (b).
Prima reac"ie de transesterificare este indicat! prin s!ge"i negre; ce a doua
reac"ie prin s!ge"i albastre. Punctul de ramificare A este prezentat boldit.
Similitudinile acestor structuri sugereaz! c! structurile ARNsn evolueaz! din introni
de grup II, cu aceste ARNsn care ac"ioneaz! n trans #i este func"ional analog cu
domeniile corespunz!toare intronilor de grup II.

Informatii suplimentare
Splicing autacatalitic sau catalizat de spliceozomi
Rezultatul final al splicingului intronilor din grupa II #i a pre-ARNm este
acela#i: intronul eliberat sub form! de laso #i cei doi exoni vecini uni"i ntre ei. n
plus, mecanismul reac"iilor celor dou! procese este asem!n!tor. n cele dou! cazuri,
hidroxilul 2 al intronului serve#te drept centru nucleofil pentru realizarea cliv!rii
situsului 5 #i un hidroxil 5 al exonului situat n amont este centrul nucleofil care
cliveaz! situsul 3 pentru a forma leg!tura exon-exon. Diferen"a cheie este c! anumi"i
introni din grupa II sunt automatura"i in vitro, n timp ce splicingul pre-ARNm
nucleari necesit! o ma#in!rie elaborat! format! din mai multe snRNP #i proteine
accesorii. Totu#i, anumi"i introni din grupa II necesit! maturaze pentru reac"ia in vitro
cu toate c! nucleotidele #i centrele catalitice implicate n cele dou! procese sunt
acelea#i. Presupunnd c! splicingul autocatalitic necesit! o repliere foarte specific! a
ARN, maturazele ar fi necesare pentru stabilirea #i stabilizarea unei structuri care
permite transesterific!ri secven"iale adecvate. Astfel, singura diferen"! ntre cele dou!
mecanisme ar fi maniera n care intronul achizi"ioneaz! conforma"ia sa catalitic
activ!.
Acelea#i condi"ii sunt valabile pentru splicingul catalizat de c!tre particule.
Este posibil ca snRNP #i factorii asocia"i s! creeze un e#afodaj pe care intronul s!
poat! fi corect pliat, astfel nct cele dou! jonc"iuni #i punctul de ramificare s! fie
juxtapuse #i active. n acest sens, implicarea spliceozomilor n splicingul pre-ARNm
nucleari, este analog! celei a maturazei pentru intronii din grupa II. Ne putem ntreba
de ce replierea pre-ARNm nucleari necesit! un astfel de complex n timp ce numai
202
maturaza este suficient! pentru anumi"i introni din grupa II. R!spunsul se poate g!si
n complexitatea matur!rii care trebuie s! se realizeze. Intronii mitocondriali din
grupa II se aseam!n! fiecare posednd mai multe secven"e foarte conservate. Una sau
dou! proteine sunt probabil suficiente pentru a realiza #i a men"ine conforma"ia activ!
a intronilor. Problema este evident mult mai complex! pentru pre-ARNm nucleari
dat! fiind diversitatea de m!rime #i de secven"! a acestora #i deci #i num!rul de
introni. O singur! protein! nu ar putea determina adoptarea unei conforma"ii active
pentru to"i intronii. Particulele snRNP, foarte conservate se pot mperechia cu dou!
sau trei secven"e conservate prezente n to"i intronii, pot interac"iona ntre ele #i pot
impune o conforma"ie care favorizeaz! cele dou! transesterific!ri catalizata de c!tre
ARN.
Alt tip de auto-splicing
Intronii din grupa II din structura moleculelor de pre-ARNm mitocondriale de
la drojdii posed! #i ei secven"e conservate #i structuri secundare definite dar aceste
sunt distincte de cele caracteristice intronilor grupei I. (i intronii din grupa II sunt
supu#i procesului de auto-splicng dar , din p!cate, cuno#tin"ele noastre sunt mai
reduse n ceea ce prive#te structurile secundare #i ter"iare ale acestor substrate, #i
privind detaliile moleculare ale reac"iei de maturare. Sunt clare dou! puncte ale
acestui mecanism: 1) contrar reac"iilor de automaturare pe care le suport! intronii din
grupa I, maturarea intronilor din grupa II nu necesit! un nucleotid ini"iator #i 2)
produsul de reac"ie are o structur! de laso.
Ca #i n cazul intronilor din grupa I, procesul de auto-splicing implic! dou!
etape de transesterificare, una n urma cliv!rii la nivelul situsului 5, #i cealalt! pentru
clivajul situsului 3 #i legarea celor doi exoni. Totu#i, diferen"a fundamental! const!
n natura atacului nucleofil: guanozina pentru intronii din grupa I #i hidroxilul 2
apar"innd unui nucleotid al intronului n cazul intronilor din grupa II. Structura n
laso rezult! din realizarea unei nou leg!turi 2-5 fosfodiester n mijlocul secven"ei
ARN.
Structura tridimensional! a intronului, spontan! sau facilitat! de proteine
asociate, trebuie s! aduc! hidroxilul 2 al lasoului n apropierea situsului de splicing
5 #i s! activeze transesterificarea. Alegerea leg!turii internucleotidice care este
clivat! depinde probabil de secven"ele, specifice grupei II, GUGCG prezent! la
extremitatea 5 #i secven"a YAU prezen"! la extremitatea 3 a intronului. Acest
mecanism se aseam!n! cu cel folosit la maturarea pre-ARNm nucleari. Necesitatea
particulelor ribonucleoproteice care ac"ioneaz! n trans pentru realizarea splicingului
intronilor din pre-ARNm este datorat! faptului c! procesul, n acest caz, este mult mai
complex #i specific diferitelor tipuri de pliere a diferitelor specii de pre-ARNm,
necesare asigur!rii splicingului corect la nivelul jonc"iunilor exon-intron.

Silde 34. Secven%ele elementelor conservate n mai mul%i introni din
clasa I
Slide 35. Auto-splicing-ul intronilor de grup 1 - ARN catalitic
Figura: Mecanismele de splicing ale intronilor din grupul I "i din grupul II
automatisabili "i spiceozomul care catalizeaz! splicingul ARNm.
Intronul este marcat n albastru #i exonii care urmeaz! a fi matisa"i n ro#u.
In intronii din grupul I, un cofactor guanozinic (G) care nu face parte din catena ARN
se asociaz! cu situl activ. Gruparea hidroxil 3al acestei guanozine particip! la o
reac"ie de transesterificare cu fosfatul de la cap!tul 5 al intronului. Aceast! reac"ie
este analog! cu cea care implic! gruparea hidroxil 2 a situsului de ramificare A din
intronii de grup I #i din intronii pre-ARNm matiza"i n spliceozomi.
203
Transesterificarea urm!toare care leag! capetele 5 #i 3 ale celor doi exoni este
similar! n toate cele trei mecanisme de splicing . De re"inut c! intronul de grup I se
elibereaz! sub forma unei structuri lineare spre deosebire de produ#ii ramifica"i din
celelalte dou! cazuri.

Autosplicingul intronilor din grupa I.
Splicingul intronului pre-ARNr de la Tetrahymena, care reprezint! prototipul
grupei I, se realizeaz! printr-o serie de transesterific!ri concertate n cursul c!rora
fosfoesterii sunt schimba"i f!r! hidroliz! intermediar!. Cu excep"ia etapei de ini"iere,
favorizat! de prezen"a guanozinei libere sau a nucleotidelor sale, toate grupele
reactive implicate n transesterificare sunt con"inute n secven"a intronului. n plus,
specificitatea de schimb a leg!turilor este o consecin"! a organiz!rii tridimensionale a
intronului, rezultat! din mperecherea ntre secven"e distante dar conservate ale
intronului.
Prima etap! a splicingului este legarea guanozinei la o secven"! a intronului.
Perechea de electroni liberi ai hidroxilului 3 ai guanozinei poate provoca un atac
nucleofil asupra fosfatului jonc"iunii exon-intron 5 (-UpA-) provocnd clivarea
acestui situs. Hidroxilul 3 creat la situsul de clivare (extremitatea 5 a exonului)
reac"ioneaz! cu fosfatul 3 al jonc"iunii, provocnd legarea celor doi exoni #i
eliberarea intronului linear, de 413 nucleotide. Segmentul de intron linear suport! apoi
alte dou! transesterific!ri intramoleculare #i hidrolize, cu eliberarea mai nti a 15
nucleotide #i apoi formarea intronului final prin eliberarea altor 4 nucleotide. Trebuie
s! re"inem c! reac"iei globale nu i este asociat! nici o modificare net! de energie:
fiecare rupere a unei leg!turi fosfodiester fiind compensat! prin formarea
concomitent! a unei alte leg!turi fosfodiester.
Guanozina sau unul dintre deriva"ii ei 5 fosforila"i, este specific! ini"ierii
reac"iei de splicing. Modificarea grup!rilor hidroxil 2 sau 3, sau poten"ialului de
mperechere a guanozinei cu un rest de citozin!, modific! (altereaz!) capacitatea de
ini"iere a splicingului. Evident, mperecherea guanozinei cu un rest complementar al
intronului este important! pentru pozi"ionarea corect! a hidroxilului 3 al guanozinei
#i pentru reac"ia sa cu fosfatul 5 al jonc"iunii.
Cele dou! jonc"iuni exon-intron sunt probabil apropiate una de alta pentru a
permite legarea celor doi exoni dup! clivarea ini"ial! realizat! de guanin!. Acest
proces este u#urat de replierea intronului astfel nct cele dou! jonc"iuni s! se poat!
suprapune, probabil, n vecin!tatea situsului de leg!tur! al guanozinei. O posibilitate
este ca, n intron, o anumit! secven"! s! fie capabil! s! se mperecheze cu o secven"! a
exonului situat! la fiecare jonc"iune. Prezen"a unei astfel de secven"e ghid intern ar
permite reac"ia grup!rii hidroxil 3, creat! prin clivarea jonc"iunii exon-intron 5 de
c!tre guanozin!, cu fosfatul 3 al situsului de splicing pentru a forma produsul
matisat. Restul G care termin! intronul #i nucleotidele adiacente acestuia determin!
situsul de splicing 3. Modific!rile conforma"ionale n intronul linear eliberat se
presupune c! faciliteaz! circularizarea #i eliberarea de mici oligonucleotide.
Mecanismul de autosplicing eviden"iat pentru gena ARNr de la Tetrahymena
este aplicabil #i altor introni din grupa I. Ace#tia posed! cu to"ii 4 secven"e conservate
(A, B, 9L #i 2) #i alte dou! secven"e neconservate 9R #i 9R (tabel 8.5 #i figura 8.75).
Aceste 6 elemente apar ntotdeauna n aceea#i ordine: 5-9R-A-B-9L-9R-2-3. n
plus, cea mai mare parte a intronilor din grupa I posed! #i o secven"! care poate servi
drept ghid intern. Muta"ii care mpiedic! splicingul au fost eviden"iate #i caracterizate
la drojdii #i ciuperci. Astfel de muta"ii modific! n general posibilitatea mperecherii
204
bazelor. Astfel, de exemplu, inactivarea splicingului determinat! de modificarea
secven"elor 9R sau 9R este reversibil! prin schimb!ri compensatorii n alt! secven"!.
Splicingul in vitro al anumitor introni din grupa I apar"innd genelor
mitocondriale de drojdie pentru pre-ARNm depinde de acelea#i secven"e conservate
ca #i cele care sunt necesare splicingului pre-ARNr de la Tetrahymena, produ#ii de
reac"ie fiind analogi. Totu#i, ace#ti pre-ARNm nu sufer! procesul de auto-splicing in
vitro. Splicingul acestor introni depinde de proteine, care ac"ioneaz! n trans,
codificate de acelea#i gene sau de gene nrudite, de c!tre secven"e de lectur! deschise
constituite din exoni #i introni. Aceste proteine, maturaze, nu sunt prezente dect
pentru o perioad! scurt! de timp #i par s! favorizeze replierea intronului din structura
pre-ARNm ntr-o conforma"ie care permite splicingul. Aceasta explic! de ce muta"iile
f!r! sens (non-sens) sau alunecarea fazei de lectur! n secven"a intronului care
codific! pentru maturaz!, mpiedic! splicingul acestui intron ca #i pe cel al intronilor
din grupa I caracteristici altor gene mitocondriale. Acest model explic! #i de ce
muta"iile supresoare sau care con"in o alunecare de faz!, care readuc la normal
producerea maturazei restabilesc #i splicingul corect. Plierea corect! a anumitor
introni din grupa I este spontan! #i stabil! in vitro n timp al"ii necesit! proteine pentru
formarea #i/sau stabilizarea structurii active autocatalitic. Exist! #i posibilitatea ca
diverse interac"ii proteine-proteine s! aib! rol n pliere.

Splicingul n trans
Reac"iile de splicing trecute n revist! pn! n prezent sunt intramoleculare #i
sunt deci reac"ii n cis. Se pune problema existen"ei unor procese de splicing
intermolecular deci despre care putem considera c! se desf!#oar! n trans. Mai
specific, se pune problema dac! doi exoni situa"i pe molecule de ARN separate se pot
asocia cu eliminarea concomitent! a intronilor pe care i con"in. Existen"a acestui
proces de splicing intermolecular a fost demonstrat in vitro utiliznd substrate ARN
special preparate. S-a stabilit c! splicingul in trans este o etap! esen"ial! n producerea
celular! a tuturor moleculelor de ARNm la Trypanosoma #i a trei din cei patru ARNm
ai genelor actinei de la C. elegans. Primul exemplu de splicing in trans n care erau
implicate unit!"i transcrip"ionale situate pe cromozomi diferi"i a fost descris n cazul
proto-oncogenei c-myb (Vellard et al, Oncogene, 1991). n fiecare caz, situsurile de
clivare sunt de tip clasic, GU la jonc"iunea 5 #i AG n pozi"ia 3, produsul fiind #i el o
structur! ramificat! (laso).
Pentru demonstrarea splicingului in trans au fost utilizate dou! modele
experimentale. n primul, exonul 5 #i intronul care l flancheaz! fac parte din aceea#i
molecul! de ARN, iar exonul 3 #i intronul asociat cu acesta pe o a doua caten! ARN
(lan" ARN). mperecherea bazelor complementare ntre secven"ele celor dou!
segmente intronice are loc cu o eficacitate de 15% (n extractele celulare) fa"! de
rezultatele ob"inute n cazurile n care intronii sunt pe aceea#i molecul! de ARN.
Deci, nici existen"a structurilor secundare nici ntreruperea covalent! a intronului nu
mpiedic! splicingul.
Cea de a doua experien"! se bazeaz! pe prezen"a secven"elor complementare la
nivelul a doi introni necesare pentru ntlnirea (apropierea) moleculelor de ARN
maturabile (supuse procesului de splicing), n aceast! configura"ie este posibil!
ob"inerea a patru produ#i: doi forma"i prin splicingul n trans #i doi prin splicing in
cis. Rezultatul splicingului in vitro al acestui substrat este formarea produ#ilor de
reac"ie trans 5 adeno-adeno 3 #i cis 5 globin!-adeno 3. Se ob"in produ#ii cis 5
adeno-globin! 3 #i trans 5 globin!-globin! 3, dar n cantit!"i reduse probabil din
cauza apropierii bazelor mperechiate de punctul de ramificare.
205
Formarea ARNm al actinei func"ionale #i a multor alte molecule de ARNm de
la C. elegans se realizeaz! prin splicing n trans (trans-splicing). n cazul actinei,
coiful #i primele 22 nucleotide ale ARNm provin dintr-un transcript de 100 nucleotide
ob"inut plecnd de la ADNr 5S situat pe un cromozom diferit. Totu#i, exemplul cel
mai bine studiat de splicing in trans este cel de formare a ARNm de la Trypanosoma.
Toate moleculele de ARNm de la tryponosoma con"in o secven"! 5 identic! de 35
nucleotide, netradus!, care preced! o secven"! codant! ntrerupt!. Ace#ti mini-exoni
5 provin de la extremitatea 5 a unui ARN de 137 nucleotide transcris plecnd de la
sute de copii n tandem ale unui segment de ADN de 137 pb. Un splicing n trans
asociaz! mini-exonul 5 de 35 nucleotide cu un ARN al c!rui exon codific! pentru o
protein! cu un alt ARN formnd o molecul! de ARN ramificat!. n etapa urm!toare,
situsul de maturare 3 este clivat #i cei doi exoni sunt reuni"i. Segmentul ramificat,
con"innd secven"ele intronilor de la dou! molecule de ARN separate, este apoi
t!iat de o enzim! care realizeaz! deramificarea (debran#area) rezultatul fiind
separarea intronilor care erau asocia"i celor dou! molecule de ARN. n exemplul
analizat mai sus trebuie remarcat: 1) secven"a situat! imediat n aval de mini-exonul
de la Trypanosoma este conform cu secven"a consens 5(GUAUGA), 2) jonc"iunea
intronului asociat cu exonul codant este analog! secven"ei 3 a situsurilor de excizie
([C/Un NNAG) 3) un nucleotid al intronului reprezint! punctul de ramificare,
sugernd c! mecanismele de splicing n trans #i n cis sunt analoge. Pentru moment
modul de realizare a complexului de splicing, pentru dou! molecule de ARN separate,
nu este pe deplin elucidat.

Slide 36. Auto-splicingul pre-ARNr de la Tetrahymena

Figura: Auto-splicingul pre-ARNr de la Tetrahymena thermophila

Informatii suplimentare
Intronii din grupa I au diferite localiz!ri. Ei apar n gene care codific! pentru ARNr n
nucleul eucariotelor inferioare cum sunt Tetrahymena thermophila (un ciliat) #i
Physarum polycephalum (viermele de noroi sau rma). Ei sunt comuni n genele
mitocondriale ale fungilor. Prezen"a lor la nivelul a trei gene din genomul fagului T4
extinde ntinderea lor evolutiv! pn! la procariote. Intronii au fost pierdu"i n
ntregime de eubacterii, iar aceste gene prezente la T4 sunt unicul exemplu unde
splicingul este necesar la eubacterii. Intronii din grupul una au comune dou!
propriet!"i:
1) ARN izolat are capacitatea de a se matura singur, reac"ie numit! self-
splicing (auto-maturare sau auto-splicing). Proprietatea nu este unic! deoarece se
ntlne#te #i la intronii din grupa II. n vitro reac"ia de maturare se realizeaz! prin self-
splicing n timp ce in vivo aceasta trebuie asistat! de proteine.
2) Un intron din grupa I se poate organiza ntr-o structur! secundar! distinct!,
cu 9 (stem-loop) bucle pe structur! (bucle pe tij!). Unele dintre aceste bucle sunt
generate prin reac"ia dintre secven"e consensus scurte. Lungimea intronilor din grupa
I variaz! larg, secven"ele consensus fiind localizate la o distan"! considerabil! de
jonc"iunile implicate n splicing.
Auto-splicingul a fost descoperit ca o proprietate a transcrip"ilor genelor
ARNr de la T. thermophila. Genele pentru cele dou! forme majore de ARNr au
organizarea obi#nuit!, n care ambele sunt exprimate ca o parte a unei unit!"i comune
de transcrip"ie. Produsul este un precursor ARN 35S care posed! secven"a pentru
206
molecula mic! de ARNr n regiunea 5, #i secven"a pentru molecula ARNr mare (26S)
c!tre cap!tul 3.
La anumite tulpini de T. thermophila, secven"a care codific! ARNr 26S este
ntrerupt! de un singur intron mic. Cnd precursorul 35S este incubat, in vitro,
splicingul apare ca o reac"ie autonom!. Intronul este excizat (eliminat) de pe precursor
#i se acumuleaz! ca o form! linear! de 400 pb, care este apoi convertit! ntr-o form!
circular!. Reac"ia necesit! numai un cation monovalent, un cation divalent un
guanidin nucleotid ca cofactor. Nici o alt! baz! nu poate substitui guanina, f!r! a fi
neap!rat necesar! prezent! unui trifosfat (se poate utiliza la fel de bine GTP, GDP,
GMP sau chiar guanozin! liber!). Nucleotidul guanilic trebuie s! posede gruparea 3-
OH liber!
Parcursul nucleotidului guanilic poate fi urm!rit prin marcare radioactiv!.
Radioactivitatea ini"ial! intr! #i elimin! intronul linear. Restul G r!mne legat de
cap!tul 5 al intronului printr-o leg!tur! fosfodiester normal!. n proces apar trei
reac"ii de transfer. n primul transfer, nucleotidul guanilic se comport! ca un cofactor
care furnizeaz! 3-OH liber la cap!tul exonului. Al doilea transfer implic! o reac"ie
chimic! similar!, n care acest 3-OH atac! cel de al doilea exon. Cele dou!
transferuri sunt conectate; nu au fost observa"i exoni liberi, deci legarea lor trebuie s!
apar! ca o parte a aceleia#i reac"ii n care se elibereaz! intronul. Intronul este eliberat
ca o molecul! linear!, dar cel de al treilea transfer l transform! n una circular!.
Fiecare stadiu al reac"iilor de auto-splicing constau ntr-o transesterificare, n
care un ester fosfat este convertit direct n altul f!r! hidroliz! intermediar!. Datorit!
leg!turilor care sunt schimbate direct, energia este conservat!, deci reac"ia nu necesit!
energie din hidroliza ATP sau GTP
Dac! fiecare dintre reac"iile consecutive de transesterificare nu implic! o
modificare net! de energie, de ce reac"ia de splicing se realizeaz! complet n loc s!
apar! un echilibru ntre produ#ii matura"i #i precursor? Concentra"ia GTP este relativ
mare fa"! de cea a ARN, #i astfel reac"ia este orientat! nainte. Reac"ia invers! este
prevenit! de modific!rile structurii secundare a ARN.
Sistemele in vitro nu includ proteine care s! fie absolut necesare auto-
matur!rii ARN. ARN formeaz! o structur! secundar!/ter"iar! specific! n care
grup!rile relevante sunt juxtapuse astfel nct nucleotidul guanilic se poate lega la un
situs specific, astfel nct s! fie apoi posibil! reac"ia de rupere #i de reunire. De#i
reac"ia poate fi realizat! numai de ARN, se pare c! in vivo acesta este asistat de
proteine, care pot s! stabilizeze structura ARN.
Abilitatea de a se angaja n astfel de reac"ii de transfer rezid! n structura
intronului, care continu! s! fie reactiv #i dup! eliminarea sa sub forma unei molecule
lineare. Sunt nsumate urmatoarele activit!"i:
1. Intronul se poate circulariza cnd G situat 3 terminal atac! fiecare dintre
cele dou! pozi"ii de lng! cap!tul 5. Leg!tura intern! este rupt! #i cap!tul 5 eliberat
este transferat cap!tului 3-OH al intronului. Ciclizarea primar! implic! de obicei
reac"ia dintre G
414
terminal #i A
16
. Aceasta este cea mai comun! reac"ie. Mai rar G
414
reac"ioneaz! cu U
20
. Fiecare reac"ie genereaz! un intron circular #i un fragment linear
care reprezint! regiunea 5 original! 8lung de 15 baze dac! atacul se produce la A
16
#i
de 19 baze dac! atacul se face la U
20
). Fragmentul terminal con"ine nucleotidul
guanilic ad!ugat.
2. Fiecare tip de cerc poate genera o molecul! linear! in vitro prin hidroliza
specific! a leg!turii (G
414
-A
16
sau G
414
-U
20
) care au nchis cercul. Acesta se nume#te
reversul cicliz!rii #i molecula linear! generat! prin inversarea cicliz!rii la A
16
r!mne
reactiv! #i poate realiza o a doua ciclizare prin atacarea U
20
.
207
3. Produsul final al reac"iilor spontane elibereaz! intronul ARN L-19, o
molecul! linear! generat! prin reversarea formei circulare scurte. Aceast! molecul!
are activitate enzimatic!, #i poate cataliza extinderea oligonucleotidelor scurte.
4. Reactivitatea intronului eliberat se extinde numai prin inversarea reac"iei de
ciclizare. Ad!ugarea oligonucleotidului UUU redeschide cercul primar reac"ionnd cu
leg!tura G
414
-A
16
.
Oligonucleotidul UUU (care se aseam!n! cu cap!tul 3 de 15 baze eliberat n
prima ciclizare) devine cap!tul 5 al moleculei lineare formate. Aceasta este o reac"ie
intermolecular!, #i demonstreaz! astfel capacitatea de conectare a dou! molecule
diferite de ARN.
Aceste serii de reac"ii demonstreaz! clar c! activitatea autocatalitic! reflect! o
abilitate generalizat! a moleculei de ARN pentru a forma un centru activ care poate
lega cofactorii guanilici, recunoa#te oligonucleotidele, #i poate aduce mpreun!
grup!ri reactive ntr-o conforma"ie care s! permite ruperea #i reformarea de leg!turi.
Al"i introni din grupa I nu au fost a#a investiga"i n detaliu ca intronul de la
Tetrahymena, dar propriet!"ile lor sunt n general similare.
Reac"ia de automaturare (auto-splicing) este o proprietate intrinsec! a ARN, in
vitro, dar n ce grad sunt implicate proteinele in vivo? Cteva indica"ii pentru
implicarea proteinelor au fost furnizate de c!tre sistemele mitocondriale, unde
splicingul intronilor din grupa I necesit! trans-activare de c!tre produ#i ai altor gene.
Unul dintre cazuri l reprezint! mutantul cyt 18 al N. crassa, care este defectiv n
realizarea splicingului mai multor exoni din grupa I. Produsul acestei gene se pare a fi
tirozil-ARNt sintetaza. O posibil! implicare este aceea c! intronul se poate dispune
ntr-o structur! ter"iar! asem!n!toare cu structura ter"iar! a ARNt #i astfel poate fi
recunoscut de sintetaz!. Legarea enzimei poate fi implicat! direct n splicing sau
poate avea un efect indirect cum ar fi stabilizarea conforma"iei ARN.
Rela"ia dintre sintetaz! #i splicing este n concordan"! cu ideea c! splicingul
este originar o reac"ie mediat! de ARN, care cu timpul a fost asistat! de proteine care
se leag! la ARN #i care originar au alte func"ii. Capacitatea de auto-splicing a ARN in
vitro poate reprezenta interac"ia biochimic! de baz!; structura ARN creeaz! situsul
activ, dar este capabil! s! func"ioneze eficient in vivo numai cnd este asistat! de un
complex proteic.
Conservarea structurii #i a mecanismului de splicing printre intronii din grupa
I sugereaz! c! membrii nucleari #i mitocondriali au o origine evolutiv! comun!. O
migrare trebuie s! fi avut loc ntre nucleu #i mitocondrie, dar pentru moment nu avem
nici o informa"ie privind direc"ia n care aceasta a avut loc.

Slide 37. Secven%e consens la nivelul a diferite tipuri
de situsuri de splicing

Slide 38. M$rimea moleculelor ARN U

Slide 39. Proteine din structura snRNP de la mamifere


Slide 40. Majoritatea transcrip%iei &i procesarea ARN apare ntr-un
num$r limitat de domenii din nucleul celulelor de mamifere
Figura: Localizarea poliadenil!rii ADN "i afactorilor de splicing n nucleul
fibroblastelor de mamifere
208
Imagine microscopic! digital! folosit! pentru reconstruirea unei sec"iuni de groase de
1 micro-metru dintr-un nucleu de fibroblaste colorat.
a) Sec"iune colorat! n urma marc!rii cu poli-dT cu rodamin! ro#ie pentru a
detecta procesul de poliadenilare a ARN (ro#u) #i cu DAPI pentru a detecta ADN
(albastru). ARN poliadenilat este localizat la un num!r limitat de loci discre"i
pozi"ionate ntre regiunile de cromatin!, de#i nu toate regiunile care con"in nivele
sc!zute de ADN con"in ARN poliadenilat detectabil (s!ge"ile).
b) Aceea#i sec"iune prezentat! n a) colorat! pentru a detecta ARN poliadenilat
(ro#u) #i proteina esen"ial! implicat! n splicing SC-35, care a fost vizualizat cu un
antcorp monoclonal marcat cu fluorescein! verde. Regiunile unde coloran"ii s-au
suprapus apar n galben. SC-35 este prezentat n centru multor loci (s!ge"i).

Slide 41. Concluzii

Precursorii ARNm de la eucariote sunt procesa"i prin ad!ugarea structurii cap,
scindare 3 #i poliadenilare, sudarea exonilor (splicing) #i nl!turarea intronilor nainte
de transportul ARNm n citoplasm! unde urmeaz! a fi tradus de c!tre ribozomi;
Structura cap este ad!ugat! la cap!tul 5 al pre-ARNm, n formare, de c!tre
o enzima specific! care este asociat! cu domeniul CTD fosforilat al ARN polimerazei
II, la pu"in timp dup! ini"ierea transcrip"iei;
Transcrip"ii pre-ARNm, n formare, sunt asocia"i cu o clas! de proteine de
legare a ARN numite hnRNP;
La majoritatea genelor care codific! pentru proteine, un semnal de
poliadenilare conservat (AAUAAA) este situat la 10-30 nucleotide n amonte de
situsul poli(A) unde apare clivarea #i poliadenilarea.
Un complex multiproteic care include poli(A) polimeraza (PAP) realizeaz!
scindarea #i poliadenilarea pre-ARNm. O protein! nuclear! de legare la poli(A),
PABII, stimuleaz! ad!ugarea de resturi A de c!tre PAP #i opere#te procesul odat! ce
coada poli(A) atinge 200-250 resturi;
Splicingul ARN este realizat de c!tre un complex ribonucleo-proteic, numit
spliceozom, care este asamblat prin interac"iile a cinci particule RNPsn diferite,
ntre ele, #i de asemenea cu pre-ARNm. Spliceozomul catalizeaz! dou! reac"ii de
transesterificare care sudeaz! exonii #i inl!tur! intronul sub forma unei structuri in
laso, care este ulterior degradat!.
Intronii autocatalitici de grup II, care au fost eviden"ia"i n genele
cloroplastelor #i mitocondriilor de la plante #i fungi, prezint! o structur! secundar!
nalt conservat!, care este necesar! pentru auto-splicing. Se consider! c! particulele
RNPsn din spliceozomi c! au o structur! secundat! similar! cu cea a intronilor de
grup II;
Majoritatea transcrip"iei #i procesarea ARN din nucleii celulelor eucariote se
realizeaz! la nivelul unui num!r limitat de domenii. O re"ea proteic! fibroas! din
interiotul nulcleului formeaz! o matrice nuclear!. Aceasta poate servi la organizarea
unor centre de transcrip"ie #i procesare a ARN

Slide 42. Reglarea proces$rii ARNm: proteina U1A inhib$
poliadenilarea propriului pre-ARNm
Figura: Diagrama cap!tului 3 al pre-ARNm care codific! proteina U1A, o secven#!
specific! a unei proteine de legare la ARN care este parte component! a complexului
U1RNPsn.
209
Legarea proteinei U1A la ambele situsuri situate n amonte de blocurile situsului
poli(A) de poliadenilare, dar nu de clivare, a pre-ARNm. De re"inut c! secven"a
semnalului de poliadenilare din amonte difer! u#or de semnalul singular uzual
AAUAAA. Aceast! secven"! neobi#nuit! se g!se#te n pu"ine molecule pre-ARNm.

Silde 43. Splicing-ul %esut specific controleaz$ expresia
fibronectinelor alternative
Figura: Splicingul pre-ARNm al fibronectinei specific fibroblastelor "i
hepatocitelor (splicing specific tipului celular).
Gena fibronectinei (sus) con"ine mai mul"i exoni care se pare c! provin dintr-o
gen! ancestral! care a suferit un num!r de duplic!ri ale exonilor. Exonii cu secven"e
omologe sunt prezenta"i cu aceea#i culoare. n aceast! diagram!, intronii (liniile
sub"iri albastre) nu sunt desena"i la scal!; majoritatea lor sunt mult mai lungi dect
orice al"i exoni. ARNm pentru fibronectin! produs de c!tre fibroblaste include exonii
EIIIA #i EIIIB, n timp ce ace#tia sunt elimina"i din structura ARNm pentru
fibronectin! prezent n hapatocite.

Informatii suplimentare
Splicingul alternativ: mai multe proteine codificate de o singur$ gen$
Cea mai mare parte a genelor pre-ARNm sunt maturate dup! un mecanism
care exclude fiecare intron decupndu-l la nivelul situsurilor de clivare 5 #i 3. Astfel,
diferi"ii exoni ai unui transcript sunt conserva"i n ordinea ini"ial! sub forma unei
secven"e continue n molecula de ARN matur (splicing constitutiv). Totu#i, anumite
molecule de pre-ARNm pot fi maturate n mai multe moduri determinnd formarea
unei familii de ARNm nrudite structural, fiecare posednd o n#iruire diferit! de
exoni diferi"i, #i putnd codifica o familie de proteine izoforme. Acest tip de maturare
a ARN este numit splicing alternativ. Un num!r mare de gene de la Drosophila, om
#i virusuri sunt transcrise ntr-o molecul! pre-ARNm care sufer! maturare (splicing)
alternativ!. Aceste gene codific! pentru un num!r mare de proteine dintre care unele
sunt implicate n constituirea citoscheletului, n contac"ia muscular!, sunt receptori
membranari, hormoni polipeptidici, sunt implicate n metabolismul intermediar #i n
transpozi"ia ADN.
Splicingul alternativ furnizeaz! o modalitate de diversificare a informa"iei
purtate de o gen! f!r! a modifica organizarea sa genomic!. Acest mod de maturare
reprezint! o manier! eficace de a produce o varietate de ARNm care codific! pentru
proteine nrudite n care secven"ele comune sunt specificate de exoni comuni n timp
ce secven"ele distincte deriv! din exoni matura"i diferit. n anumite cazuri, moleculele
de ARNm maturate diferit sunt produse n acela#i timp, #i diferitele molecule proteice
izoforme pot asigura func"ii identice sau diferite. Cele patru proteine izoforme care
stau la baza constituirii mielinei sunt toate componente ale anvelopei mielinice ale
celulelor sistemului nervos central; cele dou! izoforme de imunoglobuline sunt
respectiv membranar! #i secretat!. Anumite molecule transcript sunt maturate diferit
n func"ie de "esut. Astfel, o gen! unic! exprim! calcitonina n tiroid! #i izoforma sa, o
protein! nrudit! prezent! n creier, fiecare fiind format! de la acela#i pre-ARNm
maturat distinct. n anumite sisteme genetice (ex. gena troponinei T de la mamifere #i
din complexul Ultrabitorax de la Drosophila), cantit!"ile relative #i tipul de splicing
al moleculelor pre-ARNm sunt reglate n cursul dezvolt!rii. Splicingul alternativ are
un rol important n determinarea sexului n cursul embriogenezei la Drosophila.
Diferen"ele de activitate ale genelor de reglare la masculi #i femele sunt datorate, n
principal, diferitelor tipuri de splicing, specific pentru sex, care conduce la producerea
210
de molecule transcript cu func"ii distincte la cele dou! sexe. n plus, activitatea
genelor individuale n aceast! ierarhie de reglare nu este controlat! numai la nivel de
splicing, dar determin! o schem! de splicing care ac"ioneaz! ca urmare a rezultatului
acestei ierarhii.

Schema de splicing alternativ
Au fost eviden"iate trei clase generale de splicing. Tipul I este rezultatul
utiliz!rii de promotori diferi"i pentru a da na#tere la molecule de pre-ARNm nrudite
formate din regiuni 5 proximal distincte #i de lungimi variabile. Genele amilazei de
la #oarece #i a lan"ului u#or al miozinei (CLM) de la vertebrate sunt exemple
caracteristice acestei clase. Gena CLM este transcris! plecnd de la doi promotori
situa"i la aproximativ 10 kpb unul de cel!lalt. Molecula de pre-ARNm cea mai lung!
con"ine to"i exonii n timp ce celei mai scurte i lipse#te primul. Splicingul alternativ
produce dou! molecule de ARNm aproape egale con"innd fiecare cinci exoni
constitutivi n regiunea 3 proximal! dar difer! prin exonii pozi"iona"i n 5. Maturarea
celui mai lungi molecule de pre-ARNm, exonul 1 este legat de exonul 4, fiind
ignorate situsurile de clivare 3 ale exonilor 2 #i 3. Din contr!, la maturarea pre-
ARNm mai scurt sunt asocia"i exonii 2, 3 #i 5 #i nu se produce asocierea exonilor 3 #i
4. Analiza secven"ei a demonstrat c! situsul 3 care flancheaz! exonul 2 este defectiv,
ceea ce explic! defectul de asociere a exonilor 1 #i 2. Absen"a jonc"iunii exonilor 1 #i
3, 3 #i 4 este atribuit! altor cauze distincte pe care le vom discuta mai trziu.
Cel de al doilea tip de splicing implic! moleculele pre-ARNm care posed!
secven"e 3 proximal de lungimi variabile, n general deoarece poliadenilarea
transcriptului se face plecnd de la situsuri diferite. Cele cinci grupe diferite de
ARNm tardiv de la adenovirusul 2 sunt rezultatul splicingului alternativ posibil numai
datorit! folosirii a cinci situsuri de poliadenilare diferite. Aceea#i explica"ie "ine cont
de originea celor dou! specii de ARNm ale lan"urilor grele ale imunoglobulinei. Gena
unic! a calcitoninei de la mamifere produce dou! molecule de ARNm; una provine
dintr-un pre-ARNm scurt, cealalt! codific! pentru o peptid! nrudit! cu calcitonina.
Cei patru exoni ai pre-ARNm scurt ai calcitoninei sunt re"inu"i. Molecula pre-ARNm
lung con"ine doi exoni suplimentari, 5 #i 6; ace#tia sunt prezen"i n ARNm al peptidei
nrudite, dar exonul 4 este absent. Situsul de jonc"iune 3 al intronului 4 este
partenerul preferat al situsului 5 al celui de al treilea intron. n acest caz, matur!rile
realizate sunt determinate de utilizarea de semnale de poliadenilare diferite #i
specifice de (pentru) "esut.
n al treilea tip de splicing alternativ, care este cel mai variat #i cel mai
nea#teptat, o molecul! de pre-ARNm d! na#tere la diferite molecule de ARNm
func"ionale. Sunt prezen"i to"i exonii poten"iali n pre-ARNm #i alegerea posibilit!"ilor
de maturarea se realizeaz! folosind exonii existen"i. Schema jonc"iunilor ! #i " este
realizat! n numeroase gene. Un bun exemplu l constituie gena pentru troponina T
din mu#chii scheletici rapizi. Grupele ! #i " de ARNm ale troponinei T con"in
respectiv exonul 16 sau exonul 17. Acesta este rezultatul asocierilor exonilor 15, 16 #i
18 sau 15, 17 #i 18. Alegerea exonului utilizat este reglat! n cursul dezvolt!rii.
Astfel, exonul 16 este specific ARNm pentru troponina din mu#chiul adult #i exonul
17 este folosit n moleculele ARNm adulte #i embrionare. Cele 32 de combina"ii
posibile care implic! exonii 4 la 8 sunt reprezentate n grupele ! #i "; e#antionul de
molecule ARNm mature merge de la excluderea complet! la re"inerea tuturor celor
cinci exoni.
Pot exista #i procese de maturare care implic! situsurile de clivare 5 #i 3
interne ale exonilor sau ale intronilor. Astfel, clivarea la nivelul unui situs 5 autentic
211
este de obicei nso"it! de clivarea la nivelul situsului 3 normal de la extremitatea
intronului, dar exist! posibilitatea cliv!rii unui alt situs 3 situat n intron, avnd ca
rezultat lungirea exonului urm!tor. Un rezultat similar se ob"ine dac! are loc o clivare
alternativ! n intron sau n exon. Existen"a #i folosirea, unor astfel de situsuri de
jonc"iune, criptice presupune c! splicingul alternativ determin! formarea unor faze
de lectur! reale. Un astfel de splicing alternativ este folosit de c!tre SV40 #i de c!tre
virusul polioma pentru a exprima mai multe molecule de ARNm plecnd de la un
singur transcript al regiunii precoce. Aceast! modalitate de splicing atenueaz!
distinc"ia ntre propriet!"ile codante ale exonilor #i intronilor.
Un exemplu interesant de splicing alternativ specific pentru "esut este cel al
genei care codific! pentru elementul transpozabil P de la Drosophila. n acest caz,
conservarea intronului care con"ine un codon f!r! sens (STOP), mpiedic! expresia
transpozazei (proteinei responsabile de transpozi"ie) n "esuturile somatice. Expresia
acesteia n "esuturile liniei germinale este rezultatul elimin!rii intronului n aceste
"esuturi, permi"nd extinderea secven"ei fazei deschise de lectur! la un exon necesar
activit!"ii acestei enzime (transpozazei).
Un exemplu extrem de splicing diferen"ial exist! n expresia genelor pentru
retrovirus. Provirusul integrat este transcris ntr-o copie complet! de ARN genomic
viral care este n final mpachetat! n virion: nu are loc nici o clivare n molecula de
ARN destinat! virionilor. Dar acela#i transcript reprezint! #i ARN, care codific!
pentru transcriptaza invers! #i proteina core. n plus, acela#i transcript este un pre-
ARNm care n urma matur!rii produce ARNm pentru proteinele anvelopei. n cazul
leucemiei umane a celulelor T #i a imunodeficien"ei umane, diferitele moduri de
splicing al transcriptului primar produc diferite molecule de ARNm care produc
fiecare o protein! particular! necesar! multiplic!rii virale sau patogenit!"ii.
Selec#ionarea situsului de clivare
Principala enigm! relativ la splicingul constitutiv sau alternativ al pre-ARNm,
este modul n care sunt alese perechile de jonc"iune corect! a exonilor. Pentru acest
fenomen exist! dou! mari categorii de explica"ii posibile. Una presupune existen"a
unor structuri intrinseci ale pre-ARNm sau a unor intermediari care apar n cursul
form!ri ARNm: ace#tia sunt factorii cis. O alt! explica"ie presupune implicarea unor
factori care sunt pozi"iona"i n trans, proteine sau alte molecule de ARN care pot
influen"a alegerea intronului care trebuie eliminat. Este foarte probabil s! existe o
ierarhie de eficien"! a situsurilor de clivare, care ar putea reflectarea avantajului
relativ al form!rii spliceozomilor la situsurile 5 #i 3 cele mai favorizate. n cazul
moleculelor de ARNm pentru dou! antigene T ale SV40, cele dou! reac"ii de clivare
alternativ! sunt determinate prin alegerea punctului bran#are a intronului. Exist!
numeroase exemple care demonstreaz! c! prezen"a unei muta"ii la nivelul unui situs
de jonc"iune determin! folosirea altui situs care de obicei nu era utiliza. Exist!
numeroase argumente n favoarea idei c! factorii care ac"ioneaz! n trans determin!
rezultatul reac"iilor de splicing. Acest lucru este adev!rat cnd molecule de pre-
ARNm, presupuse identice, sunt maturate diferit, n func"ie de condi"iile fiziologice
sau n "esuturi particulare. Este posibil ca particulele snRNP sau proteine de tipul
maturazelor s! poat! fi exprimate, #i s! func"ioneze, ntr-un mod programat n timpul
dezvolt!rii specifice a anumitor "esuturi, influen"nd astfel schema de splicing. Multe
dintre aceste puncte vor fi clarificate cu certitudine n anii urm!tori.




212

Silde 44. Expresia proteinei Sxl 11.3 (Sex-lethal) n timpul
embriogenezei la Drosophila

Figura: Expresia proteinei Sex-lethal (Sxl) n timpul embriogenezei la Drosophila.
n moleculele de pre-ARNm, exonii sunt prezenta"i sub forma unor cutii ro#ii #i
intronii ca ni#te linii albastre; splicingul este indicat prin linii punctate. O s!geat!
vertical! ro#ie indic! codonul de start AUG de la care ncepe transla"ia ARNm.
a) Timpuriu, n dezvoltare, pre-ARNm sxl este sintetizat din PE, care este activ!
numai la embrionii femeli. Acest pre-ARNm este ntotdeauna maturat a#a cum este
prezentat n figur!.
b) Mai trziu, n timpul dezvolt!rii, este sintetizat un pre-ARNm pentru sxl este
sintetizat din PL att la femele ct #i la masculi. La masculi, acest transcript este
maturat (spilice) pentru a da na#tere unui ARNm format din patru exoni. Deoarece
exonul 3 con"ine n structur! un codon stop (banda ro#u nchis), la masculi nu se
produce o molecul! func"ional!. La femele, fixarea proteinel Sxl timpurii la pre-
ARNm pentru Slx, mpiedic! splicingul exonilor 2 #i 3. ARNm rezultat, care con"ine
trei exoni, este tradus ntr-o protein! func"ional! Sxl, care #i aceasta se leag! la pre-
ARN pentru Sxl sintetizat mai trziu, asigurnd producerea sa continu! la femele. De
re"inut c! exonul 2 al transcriptului timpuriu prezentat n a) este identic cu exonul 4 al
transcriptului tardiv; b) Acest exon codific! domeniul RNP care mediaz! legarea
proteinei Sxl la ARN.

Silde 45. Cascada splicing-uluiadaptativ care controleaz$
diferen%ierea sexual$ la Drosophila
Figura: Cascada splicingului adaptativ (regulated = de reglare) care controleaz!
expresia genelor sxl (sex-lethal), tra (transformer) , "i dsx (doule-sex) din embrionii
de Drosophila.
Pentru claritate, numai exonii (dreptunghiurile ro#u deschis) #i intronii (liniile
albastre) supu#i splicingului reglator sunt prezenta"i. Splicingul este indicat prin linii
punctate n fa"! (femele) sau n spate (mascul) fa"! de pre-ARNm. Benzile ro#u nchis
semnific! prezen"a unor codoni stop n fazele de lectur!, care mpiedic! sinteza unei
proteine func"ionale. Numai embrionii femeli produc proteine func"ionale Sxl, care
mpiedic! splicingul ntre exonii 2 #i 3 din pre-ARNm Sxl #i dintre exonii 1 #i 2 din
pre-ARNm pentru tra. n contrast, legarea complexului Tra-Tra2 la pre-ARNm pentru
dsx activeaz! splicingul ntre exonii 3 #i 4. Ca un rezultat al acestei cascade de reglare
a splicingului, proteine Dsx distincte sunt produse n embrionii femeli #i masculi.
Ace#tia represeaz! transcrip"ia genelor necesare pentru diferen"ierea sexual! a sexelor
opuse.

Silde 46. Mai multe izoforme proteice sunt comune sistemului nervos al
vertebratelor
Figura: Splicingul alternativ al ARNm pentru slo care codific! canalul pompei de
Ca2+/K+, n celulele perilor auditivi care contribuie la percep#ia sunetelor de
diferite frecven#e. (splice=matisare, mbinare)
a) Cohlea de pui, un tun de 5 mm, con"ine un epiteliu cu celule ale peri#orilor
auditivi care sunt adaptate unui gradient de frecven"e vibra"ionale de la 50 Hz la
cap!tul apical (stnga) la 5000 Hz la cap!tul bazal (dreapta).
213
b) Proteina Slo con"ine 7 alfa elice transmembranare (S0 la S6), care se asociaz!
pentru a forma canalul de K+. Domeniul citosolic, care include 4 regiuni hidrofobe
(S7 la S10), regleaz! deschiderea canalului ca r!spuns la Ca2+. Izoformele canalului
Slo, codificate de izoforme ARNm ob"inute prin de splicing alternativ pornind de la
acela#i transcript primar, se deschid la concentra"ii diferite de calciu. Numerele ro#ii
se rtefer! la regiunile n care splicingul alternativ produce diferite secven"e
aminoacide n diferitele izoforme Slo. De exemplu, dou! secven"e aminoacide
(prezentate n codul cu o liter!) ob"inute prin splicing alternativ n regiunea 3 sunt
prezentate n partea de jos a figurii. Liniile de unire indic! jonc"iunile exonice.
Splicingul la unul dintre situsurile de mbinare #i de reunire...AVS codific! n unul
din exoni la GRK.... Celulele peri#orilor de la cap!tul apical al cohleei realizeaz!
numai splicing de secven"e scurte, n timp ce celulele peri#orilor de la cap!tul bazal
realizeaz! ambele tipuri de splicing alternativ. Alte forme de splicing alternativ sunt
mbog!"ite n celulelor peri#orilor auditivi n diferite localiz!ri specifice de-a lungul
lungimii cohleei.

Silde 47. Concluzii
Expresia anumitor proteine este reglat! prin controlarea proces!rii
transcriptului primar al genei care codific! pentru aceasta. Acest tip de reglarea genic!
este n special comun pentru genele care codific! proteine importante pentru
func"ionarea sistemului nervos la vertebrate;
Poliadenilarea pre-ARNmcare codific! proteina U1A este inhibat! prin chiar
legarea proteinei U1A la dou! situsuri identice situate foarte aproape n amonte fa"!
de situsul poli(A) al pre-ARNm pentru U1A. Drept rezultat, nu se produce ARNm
func"ional, expresia proteinei U1A fiind represat!. Reglarea de acest fel nu este foarte
comun!;
Splicingul alternativ al transcrip"ilor primari produ#i din unit!"i complexe
este adesea reglat. Ca rezultat, pot fi exprimate diferite tipuri de ARNm pentru aceea#i
gen! n diferite tipuri celulare sau n diferite stadii de dezvoltare;
Splicingul alternativ poate fi reglat de c!tre proteinele care se leag! la diferite
situsuri specifice din apropierea situsului reglare a matis!rii din structura ARN. Se
consider! c! inhibitorii de splicing ac"ioneaz! pentru a bloca steric accesul acestor
factori la secven"a ARN. Activatorii procesului pot determina splicingul prin
asocierea lor cu situsurile dfe reglarea a mbin!rii (matis!rii).

Silde 48. Porii nucleari asigur$ transportul activ al macromoleculelor
ntre nucleu &i citoplasm$
Figura: Complexul porului nuclear (NPC)
a) Anvelopa nuclear! a ovocitelor de Xenopus vizualizat! prin microscopie
electronic!
Sus: fa"a citoplasmatic! a complexului porului nuclear (NPC);
Mijloc: fa"a nucleoplasmic! a anvelopei nucleare dup! ndep!rtarea membranei
nucleare a NPC, ar!tnd structura sub form! de co#;
Jos: Fa"a nucleoplasmatic! a anvelopei nucleare dup! ndep!rtarea membranei
nucleare prin tratament blnd cu detergent. Reteaua laminar!, care se insereaz! n
inelul nuclear al NPC, este expus dup! acest tratament.
b) Modelul schematic al NPC

214
Silde 49. Model pentru trecerea moleculelor de mRNP prin
complexele porului nuclear
Figura: Modelul trecerii moleculelor RNPm prin complexul porului nuclear (NPC)
bazat pe studiile de microscopie electronic! la Chironomous tentans
Dup! curbare RNPm se deplaseaz! prin inelul terminal, se extinde si trece prin
regiunea central! a NPC cu cap!tul 5 nainte asociindu-se cu ribozomii din
citoplasm!. Se crede c! NPC sufer! o modificare conforma"ional! n timpul
transportului.

Silde 50. Determinarea heterocarionului eviden%iaz$ diferen%ele dintre
proteina A1 &i proteina C din hnRNP de la om privind trecerea prin
porii nucleari
Figura: Utilizarea heterocarionilor demonstreaz! c! proteina A1hnRPN poate cicliza
n "i n afara citoplasmei, n timp ce proteina umana C hnRNP nu poate
Heterocarionii au fost separa"i prin tratamentul celulelor Hela #i a celulelor de
Xenopus n cultur! cu polietilen glicol. Celulele au fost tratate cu cicloheximid!
imediat dup! fuziunea lor pentru a mpiedica sinteza proteic!. Dup! 2 ore, celulele au
fost fixate #i colorate anticorpi specifici pentru proteinele C #i A1 hnRNP marca"i cu
fluorescein!. Ace#ti anticorpi nu se leag! la proteinele de Xenopous omologe.
a) Un preparat fixat vizualizat prin microscopie n contrast de faz! con"ine celule
HeLa (cap!tul s!ge"ii) #i de Xenopous nefuzionate (s!geata punctat!) ca #i
heterocarioni fuziona"i (s!geata solid!). n heterocarionul din figur!, nucleul rotund
HeLa este n dreapta nucleului oval de Xenopous.
b) #i c) Cnd acela#i preparat este vizualizat prin microscopie de fluorescen"! ,
proteinele colorate ChnRNP sunt colorate n verde #i A1 hnRNP n ro#u. De re"inut c!
celulele nefuzionate de Xenopous sunt necolorate confirmnd c! anticorpii sunt
specifici pentru proteinele umane. n heterocarion, hnRNP C apare n ambii buclei
HeLa c);
b) Cu toate c! sinteza proteic! a fost blocat! dup! fuziunea celular!, o parte din
hnRPN A1 trebuie s! fi p!r!sit nucleul celulelor HeLa s! se deplaseze prin citoplasm!
#i s! intre n nucleul de Xenopous di heterocarion.

Silde 51. Model privind exportul proteinelor nucleare cargo purt$toarea
a unui semnal de export nuclear bogat n leucin$
Figura: Mecanismul propus pentru transportul proteinelor cargo con#innd un
semnal de export nuclear bogat n leucin! (NES nuclear export signal)
n nucleoplasm!, proteina exportina 1 se leag! cooperativ la NES din structura
proteinei cargo pentru a fi transportat! #i la Ran-GTP. Dup! formarea complexului
cargo, acesta trece prin complexul porului nuclear NPC #i RanGAP, localizat n
citoplasm!, stimuleaz! transformarea ran-GTP n Ran-GDP. Modific!rile
conforma"ionale la nivelul Ran care nso"esc acest proces conduce la disocierea
complexului. Proteina cargo care con"ine semnalul de export nuclear NES este
eliberat! singur! n citosol, n timp ce exportina 1 #i Ran-GDP sunt transportate
napoi n nucleu prin intermediul prin complexele porului nuclear. RCC1 localizat! n
nucleu stimuleaz! transformarea Ran-GDP n Ran-GTP. Repetarea acestui ciclu duce
la exportul mai multor molecule de protein! cargo.


215
Silde 52. Model de export nuclear al moleculelor de ARNm mediat de
hnRNP
Figura: Mecanismul propus pentru exportul nuclear al ARNm prin intermediul
hnRNP
a) Cap!tul 5 al complexului format din ARNm-hnPNP (RNPm) se asociaz! cu
CBC (Cap Binding Complex), care trece mai nti prin Complexul Porului Nuclear
(NPC).
b) hnRNP care trebuie s! r!mn! n nucleu (potocaliu si albastru) sunt
ndep!rtate n timpul trecerii RNPm prin NPC, aceste proteine c!rora le lipse#te
secven"ele NES (Nuclear Export Signal) vor r!mne !n nucleu n timp ce hnRNP
purt!toare de NES, cum este A1 hnRNP , sunt transportate pri NPC mpreun! cu
ARNm pe care l transport! n citoplasm!.
c) Complexul RanGAP stimuleaz! hidroliza GTP de c!tre Ran. Proteinele
navet! hnRNP disociaz! apoi de pe proteinele receptoare (exporetina 1 pentru
semnale de export nujclear bogate n leucin!) care sunt transportate napoi n nucleu.
Apoi ARNm este disponibil s! interac"ioneze cu prpteinele citosolice RNPm, inclusiv
cu poli(A) binding protein (PABP), care se leag! n 3 la coada poli(A) a ARNm.

Silde 53. Proteinele purt$toare de semnale nucleare de localizare sunt
recunoscute de receptori &i transportate n nucleu
Figura: Demonstra#ie c! Semnalul de Localizare Nuclear! (NLS Nuclear
Localization Signal) al antigenului T al SV40 poate direc#iona o protein!
citoplasmatic! n nucleul celular.
a) Piruvat kinaza normal!, vizualizat! prin imunofluorescen"! dup! tratarea
celulelor n cultur! cu un anticorp specific, este localizat! n citoplasm!.
b) O piruvat kinaz! himer!, care con"ine un semnal NLS al SV40 la cap!tul s!u
N-terminal, este direc"ionat! c!tre nucleu. Proteina himer! a fost exprimat! n urma
transfec"iei unei gene modificate produs! prin fuziunea unui fragment al unei gene
virale care codific! NLS al SV40 cu gena piruvat kinazei.

Silde 54. Model de import a proteinelor citosolice purt$toare de semnale
NLS
Figura: Mecanismul propus pentru proteinele de transport cargocare con#in un
semnal de localizare nuclear! (NLS) din citoplasm! n nucleu.
n citoplasm!, importinele alfa #i beta interac"ioneaz! cooperativ cu proteina
cargo pentru a fi transportate, cu NLS care se leag! la importina alfa. Subunitatea beta
a importinei beta al complexului cargo trimeric rezultat cu componentele NPC,
translocnd complexul n nucleoplasm! prin mecanisme slab n"elese, mecanisme care
necesit! hidroliza ATP. n nucleoplasm!, Ran-GTP interac"ioneaz! cu importina beta,
determinnd disocierea complexului cargo, elibernd proteina cargo liber! n
nucleoplasm!.
Pentru a sus"ine un alt ciclu de import, importina alfa monomer! #i complexul
importin! beta-Ran-GTP sunt transportate napoi n citoplasm!. Proteina de activare
RanGAP (Ran GTP activating protein) din citoplasm! stimuleaz! transformarea ran-
GTP la Ran-GDP avnd drept rezultat o transformare conforma"ional! la nivelul Ran
care determin! disicierea de importina beta. Importina beta liber! interac"ioneaz! apoi
cu importina alfa #i se formeaz! un nou complex cargo purt!tor al unui semnal bazic
NLS, care ini"iaz! un alt ciclu de import nuclear. Se presupune c! Ran-GDP este de
216
asemenea translocat prin porii nucleari din citoplasm! n nucleoplasm!, unde factorul
nucleotidic de schimb Ran (RCC1) determin! eliberarea GDP #i relegarea GTP.

Silde 55. Proteina Rev a HIV Rev regleaz$ transportul moleculelor de
ARNm viral ne-maturate
Figura: Rolul proteinei Rev !n transportul moleculelor de ARNm ale HIV din nucleu
c!tre citoplasm!
Genomul HIV, care con"ine regiuni codante suprapuse, este transcris ntr-un
singur transcript primar de 9 kb. n urma splicingului se ob"in mai multe molecule
ARNm de aproximativ 4 kb n urma splicingului unuia dintre introni (linia albastra n
unghi), #i mai multe molecule de ARNm de aproximativ 2 kb n urma splicingului a
doi sau mai multi introni. Dup! transportul n citoplasm!, fiecare specie de ARNm
este tradus! n citoplasm! n diferite proteine virale. Proteina Rev, codificat! de c!tre
ARNm de 2 kb, interac"ioneaz! cu RRE (rec Reponse Element) de la nivelul
moleculelor supuse #i nesupuse procesului de splicing, stimulnd transportul lor n
citoplasm!.

Silde 56. Concluzii
Anvelopa nuclear! con"ine numeroase complexe ale porilor nucleari (NPC), sub
forma unor structuri complicate, mari, compuse din multe copii a aproximativ 50-100
proteine numite nucleoporine;
Ionii, metaboli"ii #i proteinele mici difuzeaz! liber prin porii nucleari, dar
macromoleculele mai mari de 60 kDa trebuie transportate activ prin procese care
necesit! ATP #i presupun probabil modific!ri conforma"ionale la nivelul complexului
porului nuclear;
Att n importul ct #i n exportul nuclear, proteinele care trebuie transportate
con"in o secven"! de aminoacizi specific! care func"ioneaz! ca semnal de export
nuclear (NES) sau ca semnal de localizare nuclear! (NLS). Proteinele prezente numai
n nucleu con"in un semnal NLS dar nu #i unul NES, n timp ce proteinele care fac
transferul ntre nucleu #i citosol con"in ambele semnale;
n concordan"! cu modelele actuale, semnalele NES #i NLS din structura unei
proteine cargo interac"ioneaz! cu proteine receptor specifice implicate n transportul
nuclear localizate n nucleu n cazul exportului n citosol sau n citosol n cazul
importului. Ambele procese de transport necesit! #i participarea proteinei Ran o
GTP-az! care exist! n diferite conforma"ii cnd leag! GTP sau GDP;
O dat! ce este asamblat un complex cargo se consider! c! proteina receptor
din complex are contacte multiple cu nucleoporinele, transportnd astfel complexul
prin porul nuclear. Dup! ce un complex cargo ajunge la destina"ie (citoplasm! n
timpul exportului #i nucleu n timpul importului), disociaz!, elibernd proteina
cargo #i celelalte proteine. Ultimele sunt transportate prin porii nucleari n direc"ie
invers! pentru a participa la transportul altor molecule.

Silde 57. Concluzii
Dimensiunea unidirec"ional! att a exportului ct #i a importului se consider! c!
deriv! din localizarea factorului RCC1 (Ran nucleotide-exchange factor) n nucleu #i
a RanGAP (Ran GTP-ase-activating protein) n citoplasm!;
n timpul exportului unei RNPm nucleare, compus! dintr-o molecul! de
ARNm matur!, func"ional! #i proteine hnRNP, sunt nl!turate moleculele hnRNP cu
localizare nuclear!, n timp ce moleculele hnRNP purt!toare de semnale NES leag!
217
molecula de ARNm #i o transport! prin complexul porului nuclear. Dup! trecerea n
citosol, aceste molecule hnRNP navet! care posed! #i semnale NLS sunt eliberate de
ARNm #i transportate napoi n nucleu pentru a participa la alt! etap! de export
nuclear;
Au fost identificate multe tipuri diferite de semnale NES #i NLS. Se consider!
c! fiecare clas! de semnale nucleare de transport interac"ioneaz! cu receptori proteici
specifici. Receptorii implica"i n transportul nuclear se caracterizeaz! prin prezen"a
unor regiuni omologe care interac"ioneaz! cu Ran #i cu anumite nucleoporine;
Moleculele pre-ARNm din structura unui spliceozom nu sunt exportate din
nucleu. Nu se cunoa#te mecanismul acestei inhibi"ii de transport care ac"ioneaz! pn!
n momentul proces!rii corecte. Sunt exportate numai moleculele de ARNm
func"ionale care pot fi traduse n citoplasm!;
Proteina Rev a virusului HIV, care con"ine un semnal NES, poate anula
restric"iile privind transportul moleculelor pre-ARNm cu situsuri specifice.

Silde 58. Editarea ARN modific$ secven%ele moleculelor pre-ARNm

Figura: Editarea pre-ARNm pentru apo-B
ARNm pentru apo-B produs! n ficat are aceea#i secven"! ca #i exonii din
transcriptul primar. Acest ARNm este tradus n Apo-B 100, care prezint! dou!
domenii func"ionale: unul N terminal (verde) care se asociaz! cu lipidele #i un
domeniu C-terminal (portocaliu) care se leag! la receptorii LDL de pe membrana
celular!. n cazul ARNm pentru apo-B din intestin, codonul CAA din exonul 26 este
editat la codonul UAA stop. Ca rezultat celulele intestinale produc Apo-B48, care
corespunde domeniului N-terminal al Apo-B100.

Informatii suplimentare
Editarea ARN (RNA editing) utilizeaz! informa"ii din diferite surse. O prim!
axiom! a biologiei moleculare este aceea c! secven"a ARNm poate reprezenta numai
ceea ce este codificat n ADN. Dogma central! propune o rela"ie linear! n care o
secven"! de ADN este transcris! ntr-o secven"! ARNm care este direct transformat!
ntr-o protein!. Existen"a genelor ntrerupte #i ndep!rtarea intronilor prin splicingul
ARN introduce un pas n plus n procesul de expresie al genelor: secven"ele codante
(exonii) din ADN trebuie s! reconstitui"i n ARN. Procesul r!mne astfel unu transfer
al informa"iei n care codul purtat de secven"a ADN nu este modificat.
Modific!ri ale informa"iei codificate de ADN apar n circumstan"e
excep"ionale, cel mai reprezentativ exemplu fiind generarea de noi secven"e care
codific! pentru imunoglobuline la mamifere #i p!s!ri. Aceste modific!ri apar specific
n celulele somatice (limfocitele B) n care imunoglobulinele sunt sintetizate. Noua
informa"ie este generat! n ADN-ul unui individ n timpul procesului de reconstruc"ie
a genei imunoglobulinei; informa"ia codificat! n structura ADN este modificat!
printr-o muta"ie somatic!. Informa"ia din ADN continu! s! fie transcris! cu exactitate
n ARN.
Editarea ARN (RNA editing-prelucrarea ADN) este un proces n care
informa"ia este modificat! la nivelul ARN. S-au eviden"iat situa"ii n care secven"a
codant! din ARN difer! de secven"a ADN dup! care a fost transcris!. Prelucrarea
ARN apare n dou! situa"ii diferite, determinate de diferite cauze. n celulele de
mamifere sunt situa"ii n care substitu"ia (modificarea) apare la o singur! baz! din
structura ARNm, determinnd o modificare a secven"ei proteinei codificate. n
218
mitocondriile de la Trypanosoma, modific!ri mai extinse apar n transcrip"ii multor
gene, cnd bazele sunt sistematic ad!ugate sau nl!turate.
n figur! sunt prezentate secven"ele genei pentru apolipoproteina-B (apo-B)
din intestinul #i ficatul mamiferelor. Genomul con"ine o singur! (ntrerupt!) gen! a
c!rei secven"! este identic! n toate "esuturile, cu o regiune codant! de 4563 codoni.
Gena este transcris! ntr-un ARNm care este tradus ntr-o protein! de 512 000 Da
reprezentnd ntreaga secven"! codant! n ficat.
O form! mai scurt! a proteinei, aproximativ 250 000 Da, este sintetizat! n
intestin. Aceast! protein! const! n regiunea A-terminal! a proteinei ntregi. Ea este
tradus! de pe o molecul! de ARNm a c!rei secven"! este identic! cu cea din ficat cu
excep"ia unei modific!ri a lui C n U la codonul 2153. Aceast! substitu"ie modific!
codonul CAA pentru glutamin! n UAA codon Stop (ocru).
Cine poart! responsabilitatea acestei substitu"ii (ce realizeaz! aceast!
modificare)? Nu a fost eviden"iat! n genom o gen! alternativ! sau un exon care s!
codifice pentru noua secven"!, #i nici nu a fost descoperit! o modificare a modului de
splicing (de maturare). n aceste mprejur!ri se impune concluzia c! modificarea s-a
realizat direct n secven"a transcriptului. Exist! o enzim! care recunoa#te specific
transcriptul apo-B #i modific! C2153 n T? O astfel de enzim! trebuie s! recunoasc! o
anumit! regiune a structurii secundare n mod analog enzimelor capabile s! modifice
structura ARNt. Conceperea unui sistem in vitro pentru acest cercetarea acestui
proces de prelucrare sugereaz! c! o secven"! relativ mic! (aprox. 50 baze) situat! n
vecin!tatea situsului de editare este o "int! suficient!.
Prelucrarea n acest mode este rar!, dar apo-B nu este unic!. Un alt exemplu
este furnizat de receptorul pentru glutamat din creierul de #oarece. Prelucrarea unei
singure pozi"ii modific! codonul pentru glutamin!, de pe ADN, ntr-un codon pentru
arginin! pe ARN; arginina joac! un rol important n controlul fluxului ionic prin
neurotransmi"!tor, astfel nct prelucrarea (editarea) este n mod clar necesar! pentru
func"ionarea fiziologic!.
Modific!ri dramatice ale secven"ei au fost detectate la numeroase gene
mitocondriale de la Trypanosoma. n primul rnd s-a descoperit c! n secven"a
subunit!"ii II a citocrom oxidazei proteina are -1 frameshift (o modificare de cadru)
fa"! de secven"a genei coxII. Secven"ele genei #i proteinei, sunt conservate la mai
multe specii de Trypanosoma. Cum func"ioneaz! aceast! gen!?
ARNm al coxII prezint! un insert de patru nucleotide (toate uridine) lng!
situsul de frameshift. Inser"ia restaureaz! faza de lectur! corespunz!toare; aceasta
insereaz! un aminoacid n plus #i modific! aminoacizii pe fiecare parte pentru a crea
faza de lectur! corect!. Nu a mai fost descoperit! o a doua gen! pentru aceast!
secven"!, #i oamenii de #tiin"! sunt for"a"i s! conchid!, pentru moment, c! aceste baze
n plus au fost inserate n timpul sau dup! realizarea transcrip"iei. O discrepan"!
asem!n!toare ntre ARNm #i secven"ele genomice a fost g!sit! pentru genele SV5 #i
n cazul para-mixovirusului care provoac! pojarul. n aceste cazuri este vorba de
ad!ugarea unui rest G n structura ARNm.
Au fost eviden"iate secven"e ARN prelucrate similar #i pentru alte gene.
Aceste includ dele"ii sau adi"ii de uridin!. Este interesant cazul extraordinar al coxIII.
Mai mult de jum!tate din resturile din structura ARNm constau n uridine care nu
sunt codificate de gen!. Compararea ADN genomic #i a ARNm demonstreaz! c! nu
exist! structur! mai mare de 7 nucleotide care s! nu fie modificat!; inser"iile sunt
formate din fragmente care con"in mai mult de 7 uridine.
De unde provine informa"ia pentru inserarea specific! a uridinelor? O molecul! de
ARN ghid con"ine secven"a care este complementar! cu ARNm corect prelucrat
219
(editat). n figura este redat un model pentru aceast! ac"iune n gena citocromului b de
la Leishmania.
Secven"a de sus arat! transcriptul original, sau ARN pre-editat. Golurile
reprezint! bazele care urmeaz! a fi inserate n urma procesului de prelucrare (editare).
Pentru a crea o secven"! ARNm valid!, n aceast! regiune, trebuiesc inserate 8
uridine.
ARN ghid este complementar cu ARNm pe o distan"! semnificativ! care
includ regiunile din jurul regiunii care urmeaz! a fi prelucrat! (edited region). Tipic,
complementaritatea este mai extins! n regiunea 3 a regiunii de prelucrare #i adesea
mai redus! n regiunea 5. mperecherea dintre ARNm ghid #i ARN pre-editat (pre-
edited RNA) las! spa"ii (locuri) unde resturi nemperechiate din ARN ghid nu g!sesc
complementaritate n ARN pre-editat. Cnd reac"ia este complet!, ARN ghid se
separ! de ARNm, care devine disponibil pentru transla"ie (traducere).
Specificarea secven"ei finale editate poate fi complex!; n acest exemplu n
acest exemplu o secven"! mai lung! este editat! prin inserarea mpreun! a 39 de
resturi U, dar acest proces pare s! necesite dou! molecule ARNs ghid, care ac"ioneaz!
la situsuri adiacente, fie simultan fie succesiv. Ne putem imagina situa"ii mult mai
complicate n care, de exemplu, dup! ce o molecul! ARN ghid ajut! la crearea
secven"ei prelucrate, aceasta este preluat! de o alt! molecul! ghid pentru continuarea
edit!rii.
Moleculele ARNs ghid sunt codificate ca unit!"i de transcrip"ie independente,
exemplu la harta regiunii mitocondriale la Leishmania Aceasta include gena pentru
citocromul b, care codific! pentru secven"ele pre-editate #i dou! regiuni care specific!
moleculele ARNs ghid. Genele pentru regiunile codante majore #i pentru moleculele
lor ARNs ghid sunt r!spndite (separate)
n principiu, o muta"ie fie n gen! sau n structurile care codific! ARNs ghid
pot schimba secven"a primar! a ARNm, #i astfel pe cea a proteinei. Pe criterii
genetice, fiecare dintre aceste unit!"i pot fi considerate c! con"in o regiune gen!.
Dac! unit!"ile sunt exprimate independent, ele pot complementa desigur in trans.
Dac! muta"iile sunt valabile, putem g!si prin urmare c! sunt necesare 3 grupe de
complementare pentru a codifica pentru secven"a primar! a unei singure proteine.
Analiza #i caracterizarea intermediarilor par"ial edita"i (prelucra"i) sugereaz!
c! reac"ia se desf!#oar! de-a lungul ARN pre-editat n direc"ia 3-5. Molecula ARN
ghid are nu numai rolul de a dicta specificitatea inser!rii uridinelor prin mperecherea
sa cu ARN pre-editat dar #i de a furniza concret resturile U care sunt inserate.
Molecula ARN ghid se termin! n cu regiuni de 3-5 resturi de uridin!, dup!
care urm!toarele uridine sunt ad!ugate pentru a genera cozile 3-oligo U. Cozile au o
lungime eterogen!, variind de la 5 la 24 resturi U. Aceste uridine sunt inserate n
ARN prelucrat printr-o reac"ie care se aseam!n! cu splicingul intronilor din grupa I.
mperecherea dintre ARN ghid #i ARN pre-editat se aseam!n! cu mperecherea dintre
regiunea IGS a intronului #i exonul 5. Reac"ia se realizeaz! prin dou!
transesterific!ri.
n primul transfer, regiunea care urmeaz! a fi prelucrat! este atacat! de 3-OH
al ultimului rest de uridin! din coada ARN ghid cu care este mperechiat. Aceasta
realizeaz! ruperea ARN pre-editat n dou! p!r"i. O parte o reprezint! regiunea 5,
terminat! printr-o grupare 3-OH. Cealalt! parte este o molecul! hibrid n care coada
3 a ARN ghid este legat! covalent la ARN care urmeaz! a fi prelucrat. Acest
intermediar este o molecul! linear! a c!rei structur! este men"inut! prin mperecherea
bazelor.
220
n cel de al doilea transfer, gruparea 3-OH generat! n urma primului transfer
atac! leg!tura dintre cele dou! resturi U din regiunea cozii ARN ghid. Se reface astfel
integritatea moleculei ARN pre-editat!, care a c#tigat un rest U #i se reface structura
ARN ghid, care a pierdut un rest uridin! din coad!. Ciclul se repet! pn! la terminarea
procesului.
Structurile moleculelor par"ial prelucrate sugereaz! c! resturile de uridin! sunt
ad!ugate una cte una #i nu n grup. Este posibil ca reac"ia s! se realizeze prin mai
multe cicluri n care resturi de uridin! sunt ad!ugate, testate pentru
complementaritatea lor cu molecula ATN ghid, re"inute dac! sunt acceptate #i dac! nu
nl!turate. Astfel ia na#tere gradat o molecul! de ARN corect prelucrat!. Nu se #tie
nc! dac! acela#i tip de reac"ii se desf!#oar! #i n cazul n care prelucrarea moleculelor
presupune nl!turarea de resturi U sau ad!ugarea de C.

Silde 59. Editarea ARN la protozoare
Figura: Mecanismele de editare a moleculelor de ARNm din kinetoplastul de la
Tripanosoma.
O secven"! ancor! (albastru) din molecul! de pre-ARNm ne-editat!
hibridizeaz! cu o secven"! ancor! (galben) situat! n pozi"ia 5 a unei secven"e ARN
ghid (ARNg), care direc"ioneaz! apoi ad!ugarea sau ndep!rtarea de resturi U. Este
prezentat! numai o mic! regiune a pre-ARNM. Resturile U ad!ugate sunt prezentate
n ro#u iar cele !ndep!rtate prin delta. Numerele ncercuite identific! situsurile la
nivelul c!rora apare editarea.

Silde 60. Durata de via%$ a moleculelor de ARNm

Silde 61. Efectul stabilizator al secven%elor AUUUA asupra timpului de
njum$t$%ire al ARNm (t1/2)
Figura: Demonstra#ia experimental! a efectului de destabilizare a secven#elor
AUUUA asupra jum!t!#ii de via#! (T1/2) a ARNm
Celulele n cultur! au fost transfectate separat cu vectori de expresie care
con"in secven"ele beta-globinelor prezentate n diagram! #i au fost determinate
jum!t!"ile de via"! ale ARNm exprima"i . Secven"ele AUUUA (ro#u) au fost ale genei
care codific! pentru o citokin! numit! factor care stimuleaz! coloniile granulocite-
macrofage (GMCSF), al c!ror ARNm are o durat! de via"! de aproximativ o or!.
Inserarea lor n genele beta-globinei, care n mod normal exprim! o molecul! de
ARNm stabil!, avnd drept rezultat scurtarea vie"ii ARNm recombinant pentru beta-
globin!.

Silde 62. Viteza de degradare a moleculelor de ARNm de la eucariote
este reglat$
Figura: Reglarea Fe-dependent! a stabilit!#ii ARNm pentru receptorul pentru
transferin!
Elementele de r!spuns la Fe (IRE) pozi"ionate n 3 n structura ARNm
prezint! o structur! stem sub form! de bucl! bogat! n secven"e AU (galben) care
promoveaz! degradarea ARNm. La concentra"ii intracelulare sc!zute n Fe,
conforma"ia IRE-BP (verde nchis) este aceea care se leag! la IRE, inhibnd astfel
degradarea. Drept rezultat, nivelul receptorului pentru transferin! cre#te, astfel nct
mai mult Fe poate fi adus n celul!.

221
Silde 63. Transla%ia unor molecule de ARNm este reglat$ specific de
proteine de legare
Figura: Reglarea dependent! de Fe a transla#iei ARNm pentru feritin!.
La concentra"ii sc!zute n Fe legarea IRE-BP blocheaz! ini"ierea transla"iei.
Acela#i mecanism controleaz! transla"ia ARNm care codific! ALA sintaza.
Elementele IRE ale acestor dou! molecule de ARNm sunt localizate la cap!tul 5 #i
nu con"in secven"e bogate n AU care s! promoveze degradarea #i sunt prezente n
regiunea 3 a ARNm al receptorului pentru transferin!.

Silde 64. ARN antisens regleaz$ transla%ia ARNm al transpozazei la
bacterii
Figura: Controlul antisens al transla#iei ARNm al transpozazei codificat! de
elementul bacterian mobil IS10
Cap!tul 5 al ARNm al transpozazei (ro#u) produs de pe catena mai mic! care
ncepe la PIN, este complementar cu cap!tul 5 al moleculei ARN antisens (negru),
produs! de catena de deasupra care ncepe la POUT. Deoarece POUT posed! un
promotor mai puternic dect PIN, se va produce mai mult ARN antisens dect
transpozaz!, astfel nct tot ARNm pentru transpozaz! hibridizeaz! cu ARN antisens
mai abundent. Att timp ct codomul de start AUG (verde) #i secven"a de legare la
ribozom Shine-Dalgarno (galben) sunt n regiunea hibridizat!, ini"ierea transla"iei
ARNm al transpozazei este blocat!. Foarte rar transla"ia ARNm pentru transpozaz!
este ini"iat! naintea hibridiz!rii cu ARN antisens, conducnd la o rat! redus! a
transpozi"iei IS10

Silde 65. Concluzii

Editarea ARN reprezint! modificarea secven"ei nucleotidice a pre-ARNm n nucleu.
Cele cteva exemple de editare descoperite la vertebrate implic! dezaminarea unei
singure baze din secven"a ARNm, avnd drept rezultat modificarea aminoacidului
specificat de codonul corespunz!tor #i producerea unei proteine func"ionale diferite.
Procese de editare mult mai ample sunt prezente la ARNm mitocondrial de la
protozoare;
Anumite molecule de ARNm sunt direc"ionate c!tre localiz!ri subcelulare de
c!tre secven"e pozi"ionate, de obicei, n regiunea 3 netradus!. Se consider! c! aceste
secven"e sunt "inte pentru proteine care se leag! specific la ARNm #i care sunt
asociate cu proteinele motoare. Proteinele motoare transport! apoi ARNm n pozi"ii
specifice prin deplasarea de-a lungul filamentelor de actin! ale citoscheletului sau
microtubulilor;
Stabilitatea diferitelor molecule de ARNm n citoplasm! variaz! foarte mult.
Totu#i, multe molecule de ARNm de la eucariote sunt destul de stabile iar altele au
durate de via"! foarte scurte. Acestea din urm!, codific! adesea pentru proteine si, n
general, posed! copiii repetitive ale secven"ei AUUUA la cap!tul 3 netradus. Printr-
un mecanism necunoscut aceste secven"e bogate n AU stimuleaz! degradarea
ARNm;
Celulele eucariote pot regla rata de degradare sau traducere a unor molecule
de ARNm. De exemplu, interac"ia unei proteine specifice de legare la ARN cu
situsurile regiunii 3 netraduse din structura ARNm pentru receptorul transferinei
protejeaz! ARNm de degradarea mediat! de secven"ele bogate n AU. Aceea#i
protein!, a c!rei activitate este reglat! de concentra"ia intracelular! de Fe, blocheaz!
222
transla"ia mai multor tipuri de ARNm legndu-se la secven"e specifice din regiunea
5 netradus!;
La bacterii, transla"ia anumitor molecule de ARNm este represat! de molecule
ARN antisens, care hibridizeaz! la cap!tul 5 al ARNm, prevenind astfel transla"ia
prin blocarea accesului subunit!"ii ribozomale mici la codonul de ini"iere.

Silde 66. Genele pre-ARNr sunt similare la toate eucariotele
Figura: Structura general! a unit!#ilor transcrip#ionale pre-ARNr
Cele trei regiuni codante (albastru) codific! pentru ARNr 18S, 5,8S #i 28 S
prezente n ribozomii eucariotelor superioare sau a echivalen"ilor lor de la alte specii.
Ordinea acestor trei regiuni codante n genom este ntotdeauna 5-3. Varia"iile de
lungime ale regiunilor spacer transcrise (tan) sunt responsabile de diferen"a major! de
lungime a unit!"ilor de transcrip"ie de la diferite organisme.

Silde 67. Genele pre-ARNr func%ioneaz$ ca organizatori nucleolari
Figura: Micrografie a cromozomilor politeni prepara#i de la musc! "i care con#in o
singur! transgen! pre-ARNr

Silde 68. snoRNAs (small nucleolar RNAs) asist$ procesarea ARNr &i
asamblarea subunit$%ilor ribozomale
Figura: Procesarea pre-ARNr "i asamblarea ribozomilor la eucariote
a) Intermediarii majori "i timpul necesar pentru diferitelor etape de procesare a
pre-ARNr la eucariotele superioare. Proteinele ribozomale "i nucleolare asociate cu
pre-ARNr 45S imediat dup! sinteza sa, formeaz! o molecul! pre-RNP de 80S. Sinteza
ARNr 5S apare n afara nucleolului. Secven#a secundar! extins! a ARNr nu este
reprezentat!. De re#inut c! acest ARN constituie aprope 2/3 din masa subunit!#ilor
ribozomale "i proteina numai 1/3.
b) Calea de procesare a transcriptului primarpre-ARNr de 6,6 kb (35
S) la Sacharomices cerevisiae. Regiunile spacer transcrise (tan) care sunt nl!turate
n timpul proces!rii, separ! regiunile corespunz!toare formelor mature 18S, 5,8 S "i
25 S ARNr. Au fost identifica#i to#i intermediarii trecu#i n diagram!.

Silde 69. Moleculele de pre-ARNt sufer$ scindare &i modificarea
bazelor
Figura: Procesarea pre-ARNt pentru tirozin! implic! patru tipuri de modific!ri
Un intron de 14 nucleotide (albastru) din bucla anticodon este ndep!rtat prin
splicing. O secven"! de 16 nucleotide (verde) de la cap!tul 5 este clivat! de c!tre RN-
aza P. Resturile U de la cap!tul 3 sunt nlocuite de c!tre secven"a CCA (ro#u) care se
g!se#te n toate moleculele ARNt mature. Numeroase baze din bucla stem sunt
transfoirmate n baze modificate caracteristice (galben). Nu to"i ARNt con"in introni
care sunt matisa"i n timpul proces!rii, dar to"i sufer! alte tipuri de modific!ri
eviden"iate n figur!.
D=dihidrouridin!; ,=pseudouridin!

Silde70. Splicing-ul moleculelor pre-ARNt difer$ de celelalte
mecanisme de splicing
Figura: Mecanismul splicingului !n pre-ARNt
223
pre-ARNt este clivat n dou! locuri, de o parte #i de alta a intronului, exciznd
astfel intronul. Mecanismul de clivare genereaz! un fosfomonoester 2-3 ciclic la
cap!tul 3 al exonului 5. Reac"ia de jonc"iune dintre doi exoni este o reac"ie n multe
etape care necesit! doi nucleozid trifosfa"i: GTP, care contribuie la gruparea fosfat
(galben) pentru jonc"iunea 3-5 din molecula final! ARNt; #i o molecul! ATP care
formeaz! un intermediar ligaz!-AMP activat- Gruparea 2 fosfat a exonului 5 este
nl!turat! n etapa final!.

Informatii suplimentare
Splicingul ARNt
Modul n care sunt elimina"i intronii ARNt a fost cel mai bine studiat #i n"eles
la drojdie, dar anumite informa"ii au fost oferite n urma studiului altor eucariote
inferioare #i plante. Toate enzimele implicate sunt cunoscute #i purificate #i to"i
intermediarii sunt caracteriza"i. O endonucleaz! specific! pentru ARNt taie pre-ARNt
la nivelul jonc"iunii 5 a intronului, formnd un 2, 3-fosfodiester ciclic la
extremitatea regiunii 5 a ARNt. Aceea#i enzim! taie jonc"iunea celuilalt intron
producnd o grupare 5 hidroxil la extremitatea p!r"ii 3 a ARNt. Aceste cliv!ri ne
aduc aminte de cele realizate de anumite RN-aze. Fosfodiesterul ciclic este apoi
deschis de c!tre o fosfodiesteraz! ciclic! pentru a forma un 2 fosfomonoester. Dup!
fosforilarea extremit!"ii sale 5 hidroxil, exonul 3 este adenilat de c!tre o ligaz!
specific! pentru ARNt; aceast! ultim! reac"ie este identic! cu cea catalizat! de c!tre
ADN ligaze. Legarea celor dou! jum!t!"i de molecule prin intermediul extremit!"ilor
lor activate creeaz! o leg!tur! neobi#nuit! 2 fosfat, 3, 5 fosfodiester. Eliminarea
fosfatului din 2, de c!tre o fosfataz! duce la formarea ARN matur. De re"inut c!
fosfatul noii leg!turi diester provine din ATP. Aceasta este o caracteristic! care
distinge maturarea ARNt de la drojdii de cea de la vertebrate. n aceast! serie de
reac"ii, clivarea endonucleazic! ini"ial! determin! formarea de extremit!"i 5 hidroxil
#i 3 fosfomonoester, acesta din urm! fiind convertit n 2, 3 fosfodiester de c!tre o
ciclaz! ATP dependent!. O ligaz! specific! pentru ARNt une#te apoi cele dou!
jum!t!"i f!r! a necesita activarea extremit!"ilor.
Frac"ionarea sistemului de splicing de la drojdii a dus la ob"inerea unor
preparate nalt purificate a dou! enzime. Una catalizeaz! clivarea endonucleotidic! la
nivelul jonc"iunilor intronului, iar cealalt! posed!, la nivelul unei singure polipeptide,
activitatea fosfodiesterazic!, kinazic!, de adenilare #i ligazic!. Cele dou! enzime sunt
foarte specifice pentru reac"iile de splicing ale ARNt; ele reac"ioneaz! totu#i f!r! a
face distinc"ie asupra tuturor intronilor ARNt #i unesc oricare dou! fragmente de
ARNt. Astfel au putut fi construite molecule de ARN hibride foarte interesante,
formate din dou! jum!t!"i de molecule de la ARNt diferi"i.

Silde 71. *Organizarea transcriptului primar ARNr 45S
Structura cap de ciocan a unei ribozime
Figura: Organizarea transcriptului primar ARNr 45S;
Structura cap de ciocan a unei ribozime

Informatii suplimentare
Capacitatea catalitic$ a ARN de a schimba con#inutul informa#ional al ARN "i
rolul intronilor
Ideea c! numai proteinele au activitate enzimatic! a fost total r!sturnat! n
biochimie.
224
Mult! vreme identificarea enzimelor cu proteinele a condus la punctul de vedere c!
numai proteinele, cu variatele lor structuri tridimensionale #i grup!ri laterale, posed!
flexibilitatea s! creeze situsuri active care s! catalizeze reac"iile biochimice.
Caracterizarea sistemelor implicate n procesarea ARN a demonstrat c! acest punct de
vedere era deosebit de simplist.
Numeroase tipuri de reac"ii catalitice sunt acum cunoscute ca fiind catalizate
de ARN. Pentru a desemna un ARN cu propriet!"i catalitice se folose#te termenul de
ribozime #i este deja posibil! caracterizarea activit!"ii enzimatice ca #i n cazul
enzimelor conven"ionale. Unele activit!"i catalitice ale ARN sunt direc"ionate c!tre
substrate separate, n timp ce altele sunt intramoleculare #i sunt descrise ca auto-
maturare sau auto-splicing, n func"ie de tipul de reac"ie:
- Enzima ribonucleaza P este o ribonucleoprotein! care con"ine o singur!
molecul! de ARN legat! la o protein!. ARN posed! capacitatea de a cataliza clivarea
substratului ARNt, n timp ce componenta proteic! are un rol indirect, probabil n
men"inerea structurii ARN catalitic.
- Moleculele mici de ARN din clasa viroizilor au capacitatea de a realiza
reac"ii de auto-clivare (self-cleavage). Cu toate c! aceste reac"ii sunt intramoleculare,
molecula poate fi mp!r"it! ntr-o parte enzimatic! #i o parte substrat ale c!ror
func"ii sunt independente.
- Intronii din grupa I posed! capacitatea de a-#i realiza propria maturare din
pre-ARNm n care sunt con"inu"i Reac"ia poate fi realizat! n vitro numai de c!tre
ARN, dar in vivo ea este asistat! de proteine. Ac"iunea intronilor din grupa I
genereaz! molecule ARN care posed! multe alte activit!"i catalitice corelate cu
activitatea de origine.
Tema comun! a acestor reac"ii este c! ARN poate realiza reac"ii intra #i inter-
moleculare care implic! clivarea sau reunirea leg!turilor fosfodiester in vitro. Cu toate
c! specificitatea reac"iilor #i a activit!"ii catalitice de baz! este furnizat! de ARN,
proteinele asociate cu acesta sunt necesare pentru realizarea reac"iei in vivo.
Splicingul ARN nu reprezint! singura modalitate prin care se pot introduce
modific!ri n con"inutul ARN. n procesul de ARN editing, modific!rile sunt
introduse la nivelul unor baze individuale, sau prin ad!ugarea de baze particulare n
anumite pozi"ii din interiorul ARNm. Inserarea de baze (de obicei resturi de uridin!)
apare pentru transcrip"ii diferitelor gene mitocondriale de la anumite eucariote
inferioare; anumite forme de splicing sunt utilizate pentru ruperea sau refacerea
leg!turilor dintre nucleotide, dar necesit!, n acela#i timp, o matri"! pentru codificarea
informa"iei n noua secven"!.
Intronii au fost prima dat! descoperi"i la eucariotele superioare. Nu au fost
eviden"ia"i la eubacterii (E. coli) dar au fost descoperi"i acum c"iva ani la anumite
archeobacterii (ceea ce ridic! cteva probleme de filogenie). Acum nu se mai admite,
cum se credea n anii 1970-1980, c! eucariotele descind din procariote. La ora actual!
consider!m, n urma diferitelor studii comparative ale secven"elor acizilor nucleici c!
nu exist! omologie, c! archeobacteriile, procariotele #i eucariotele sunt linii
independente. n 1981, Woese propune s! se considere c! cele trei direc"ii au un
str!mo# comun progenotele. De aceea Woese propune termenul de archeas n
locul celui de archeobacterii pentru a evita ideea unei filia"ii ntre acestea #i bacterii.
Intronii din grupa I au o structur$ secundar$ caracteristic$
To"i intronii din grupa I au o structur! secundar! caracteristic! (#i probabil #i
secundar!). n figur! este dat un model pentru structura secundar! a intronului de la
Tetrahymena care const! n formarea a 9 scurte regiuni de baze perechi (P1-9). Dou!
dintre aceste perechi de baze sunt generate ntre elemente de secven"! conservate care
225
sunt comune intronilor din grupa I. P4 este construit din secven"ele P #i Q, care au
fiecare o lungime de 10 baze; 6-7 baze fiind implicate n mperechere. P7 este format
din secven"ele R #i S, care au o lungime de 12 baze, dar numai 5 baze sunt implicate
n mperechere. Celelalte perechi de baze variaz! ca secven"! n fiecare intron
individual. Analize de muta"ii au identificat un o regiune core (intron core) care
con"ine P3, P4, P6 #i P7, care furnizeaz! a regiune minim! care poate realiza reac"ia
catalitic!. P1 include cap!tul 3 al exonului stng. Secven"a din interiorul intronului
care se mperecheaz! cu exonul este denumit! IGS (internal guide sequence). (Acest
nume reflect! faptul c! ini"ial regiunea situat! imediat n 3 fa"! de secven"a IGS se
considera c! se mperechiaz! cu jonc"iunea de splicing 3, aducnd astfel cele dou!
jonc"iuni mpreun!). O secven"! foarte scurt! de dou! perechi de baze situat! ntre P7
#i P9 se mperecheaz! cu secven"a care precede imediat guanina reactiv! (G414 la
Tetrahymena) la cap!tul 3 al intronului.
Importan"a mperecherii bazelor n crearea structurii core n ARN este
demonstrat! de propriet!"ile muta"iilor cu ac"iune n cis (cis-acting) care mpiedic!
splicingul intronilor din grupa I. Astfel de muta"ii au fost izolate pentru intronii
mitocondriali de la mutan"i care nu putea ndep!rta un intron in vivo, #i au fost izolate
pentru intronul de la Tetrahymena prin transferarea reac"iei de splicing ntr-un mediu
bacterial.
Construc"ia ar!tat! n figur! permite ca reac"ia de splicing s! fie realizat! la E.
coli. Intronul auto-maturabil (intronul care sufer! auto-splicing) este plasat ntr-o
pozi"ie care ntrerupe cel de al 10-lea codon secven"ei codante a "-galactozidazei.
Proteina poate fi astfel tradus! cu succes dup! ARN numai dup! nl!turarea
intronului.
Sinteza "-galactozidazei n acest sistem indic! c! splicingul poate s! apar! n
condi"ii foarte diferite de cele n care s-a realizat pentru Tetrahymena in vitro. O
interpretare a acestor rezultate este c! auto-splicingul poate s! se realizeze #i n
celulele bacteriene. O alt! posibilitate este aceea ca enzimele bacteriene s! realizeze
aceast! reac"ie.
Folosind aceast! ncercare, putem introduce muta"ii n intron pentru a vedea
dac! acestea mpiedic! reac"ia. Muta"iile n secven"ele consens ale intronilor din
grupa I care modific! mperecherea bazelor mpiedic! splicingul. Muta"iile pot fi
inversate (reversie) prin realizarea unor modific!ri compensatoare care s! restaureze
mperecherea bazelor.
Muta"iile n secven"ele consensus corespunz!toare intronilor mitocondriali din
grupa I au efecte similare. O muta"ie ntr-o secven"! consens poate fi inversat! printr-
o muta"ie n secven"a consens complementar! pentru a restaura mperecherea; de
exemplu, muta"iile n regiunea consens R pot fi compensate prin muta"ii n regiunea
consens S.
mpreun! aceste rezultate sugereaz! c! reac"ia de splicing a intronilor din
grupa I depinde de formarea structurii secundare ntre secven"ele consensus pereche
din interiorul intronului. Principiul stabilit n urma acestor cercet!ri este c! secven#ele
distante de jonc#iunile de splicing sunt necesare pentru formarea situsului activ care
este capabil s! realizeze auto-splicingul.
Ribozimele pot avea activit$%i catalitice variate
Activitatea catalitic! a intronilor din grupa I a fost descoperit! n virtutea
capacit!"ii lor de automaturare, dar ace#tia pot realiza #i alte reac"ii catalitice in vitro,
care le-a adus numele de ribozime. Toate reac"iile pe care ei le realizeaz! se bazeaz!
pe transesterific!ri. Noi analiz!m aceste reac"ii n termenii rela"iilor acestora cu
reac"ia de auto-splicing.
226
Activitatea catalitic! a intronilor din grupa I este conferit! de abilitatea
acestora de a genera o structur! secundar! #i ter"iar! particular!, care creeaz! situsuri
active, echivalente cu situsurile active ale enzimelor conven"ionale. n figur! este
ilustrat! reac"ia de splicing n termenii acestor situsuri (lund n considerare formarea
acestor situsuri)(este vorba de aceea#i serie de reac"ii prezentat! anterior.
Helixul P1 reprezint! formarea situsului care leag! substratul (substrate-
binding site), n care cap!tul 3 al primului intron se mperecheaz! cu IGS ntr-o
reac"ie intramolecular! . Situsul care leag! guanozina (guanosin binding site) este
format de secven"ele din P7. Acest situs poate fi ocupat fie de un nucleotid guonozilic
liber, fie de un rest de guanozin! din pozi"ia 414. n prima reac"ie de transfer este
folosit nucleotidul guanozilic care apoi este nlocuit cu G414. De re"inut c! acest fapt
implic! modific!ri ale conforma"iei (comparabile probabil cu modific!rile
conforma"ionale care au loc ntr-o enzim!). Cel de al doilea transfer realizeaz! unirea
exonilor #i cel de al treilea creeaz! intronul circular.
ARN L-19 este generat prin deschiderea intronului circular. Acesta p!streaz!
nc! abilit!"i enzimatice. Acestea sunt asem!n!toare cu activit!"ile implicate n reac"ia
original! de splicing. consider!m c! o molecul! are func"ie de ribozim! n condi"iile
n care p!streaz! capacitatea de a se lega la o secven"! intramolecular!
complementar! cu IGS la nivelul situsului de legare a substratului, n timpul leg!rii
fie a nucleotidului G414 terminal sau a nucleotidului guanilic liber la G-binding site.
n figur! este ilustrat mecanismul prin care se realizeaz! extensia unui
nucleotid C5 pentru a genera un lan" C6. Oligonucleotidul C5se leag! la nivelul
substrate binding site, n timp ce G414 ocup! G-binding site. Prin reac"iile de
transesterificare, un C este transferat de pe C5 pe G situat n pozi"ie 3 terminal! #i
apoi napoi pe o nou! molecul! C5. Urm!toarele reac"ii de transfer conduc la
acumularea unui oligonucleotid citozinic mai lung. Reac"ia este o adev!rat! cataliz!
deoarece ARN L-19 r!mne neschimbat, #i este disponibil s! catalizeze mai multe
cicluri. Ribozimul se comport! astfel ca o nucleotidil-transferaz!.
O serie de alte reac"ii enzimatice sunt prezentate n figur!. Ribozima poate
func"iona ca o endoribonucleaz! specific! pentru un anumit tip de secven"! prin
folosirea capacit!"ii IGS de a se lega la secven"e complementare. n acest exemplu,
IGS leag! o matri"! extern! care con"ine secven"a CUCU, n loc s! lege secven"a
analog! care se afl! de obicei la cap!tul exonului stng. Un nucleotid guanilic este
prezent n G-binding site, #i atac! secven"a CUCU exact n modul n care este
atacat exonul n prima reac"ie de transfer. Se realizeaz! clivarea secven"ei "int! ntr-o
molecul! 5 care se aseam!n! cu exonul stng, #i ntr-o molecul! 3 care poart! la
cap!t un rest G. Prin introducerea de muta"ii la nivelul elementului IGS, este posibil!
modificarea specificit!"ii ribozimei, astfel nct acesta s! recunoasc! secven"ele
complementare noii secven"e din regiunea IGS.
Reac"ia de clivare poate fi realizat! #i cu un substrat dezoxiribonucleotidic
complementar dar legarea moleculei de ADN se realizeaz! mult mai slab ier reac"ia
de clivare are lob mult mai lent. Deoarece unica diferen"! ntre substratele ADN #i
ARN este lipsa grup!rii 2-OH din structura ADN, se sugereaz! ideea c! aceste
grup!ri sunt importante pentru legarea/sau desf!#urarea reac"iei. Acest lucru
reprezint! un argument n sprijinul ipotezei c! splicingul este o proprietate a lumii
ARN, n care ARN constituia forma ini"ial! de material genetic.
Odat! cu modificarea IGS se schimb! #i specificitatea substrate binding site
fiind permis! utilizarea altor secven"e ARN "int! #i generarea unei activit!"i de tip
ligaz!. O molecul! ARN care posed! un cap!t 3-OH se poate lega la substrate
binding site, iar ARN care posed! un cap!t 5-G se leag! la G-binding site. Atacul
227
grup!rii hidroxil asupra grup!rii fosfat realizeaz! conectarea celor dou! molecule de
ARN #i eliberarea restului G.
Reac"ia fosfatazei nu este direct legat! de reac"iile de transfer ale splicingului
(matur!rii). O secven"! oligonucleotidic! care este complementar! cu IGS #i terminat!
n 3-fosfat poate fi atacat! de G414, fiind astfel eliberat un oligonucleotid care
posed! o extremitate 3-OH. Fosfatul poate fi transferat fie pe un oligonucleotid
terminat n 3-OH (realizarea efectiv! a reac"iei inverse) fie apei (eliberarea de fosfat
anorganic)
Reac"iile catalizate de ARN pot fi caracterizate la fel ca #i reac"iile enzimatice
clasice, n termenii cineticii Michaelis-Menten. n tabel sunt trecute n revist! reac"iile
catalizate de ARN. Valorile KM ale reac"iilor catalizate de ARN sunt sc!zute, ceea ce
implic! o legare foarte specific! a ARN la substratele asupra c!rora ac"ioneaz!.
Numerele de turnover sunt #i ele sc!zute reflectnd o vitez! catalitic! sc!zut!. De
fapt, moleculele de ARN, definite ca enzime la modul general, nu pot fi comparate cu
catalizatorii proteici unde num!rul de turnover tipic este de 103-106.
Cazul intronilor care codific$ pentru maturaz$
Studiul ADN din mitocondriile de om (#i bovine) au permis observa"ia c!
ADN din aceste mitocondrii este lipsit n ntregime de introni. Nu se poate spune
acela#i lucru despre drojdii care posed! introni n ADN mitocondrial. Echipa lui
Slonimski (Gif-sur Yvette) a demonstrat c! un anume intron (intronul 2 al genei
citocromului b din mitocondriile de drojdii) codific! pentru o protein!. Aceast!
protein! provine nu numai din traducerea intronului 2, ci mai precis a exonului 1 +
exon 2 +ORF a intronului 2 (open reading frame, partea f!r! codon stop, n faz! cu
exonul precedent). Aceast! protein! posed! curioasa proprietate de a exciza intronul 2
(care i d! na#tere). Din acest motiv, pn! nu demult, nu se putea pune n eviden"!
aceast! maturaz! matricid! care nu exist! dect n cantit!"i foarte mici deoarece
imediat format! aceasta distruge intronul din care provine (Tradus!, tr!d!toare a
modalitate clar! "i expeditiv! de a spune c! proteina tradus! este tr!d!toare
deoarece ea distruge chiar intronul care i-a dat na"tere).
Din contr!, se poate pune n eviden"! aceast! maturaz! utiliznd o su#! de
drojdie mutant! pentru care maturaza produs! este inactiv! fiziologic. n acest caz
intronul nu poate fi eliminat, #i deci el poate continua s! produc! maturaz!.
Aceea#i echip! a pus n eviden"! #i maturaza produs! prin expresia intronului
4. Aceast! maturaz! nu elimin! numai propriul s!u intron, dar #i un intron provenind
dintr-o gen! vecin! (care codific! o subunitate a citocrom-oxidazei). Se sper! c!
ace#ti introni au alte func"ii dect numai s! codifice proteinele cu rol de excizie
(eliminare) a intronilor.
Cu toate c! astfel s-a demonstrat, ntr-un mod foarte estetic, c! un intron poate
fi tradus n protein! n aceste cteva cazuri excep"ionale, nu se cunoa#te nc! bine
rolul intronilor. n plus, nu putem nc! generaliza aceste rezultate ob"inute pentru
genele mitocondriale de la drojdie.
Cazul intronilor care codific! pentru endonucleaz!
S-a observat, la anumite tulpini de S. cerevisiae, c! un intron situat n gena
ARNr codific! pentru o endonucleaz! care permite ca ADN din alte tulpini s! fie
decupat #i s! primeasc! un intron.
Anumi"i introni att din grupul I ct #i din II con"in faze de lectur! care pot fi
traduse n proteine. Sunt cunoscute mai bine func"iile proteinelor codificate de
anumi"i introni din grupa I. Rolul acestora este s! ajute intronul s! perpetueze singur
la hibrizi n care alelele genei relevante difer! ntre ele prin posesia acestor introni.
228
Polimorfismul prezen"ei sau absen"ei intronilor este destul de comun n
mitocondriile fungilor (ciupercilor). Aceasta este n concordan"! cu ipoteza c! ace#ti
introni sunt la origine inser"ii la nivelul genelor. Pu"in! lumin! n acest proces se
poate face prin analiza recombin!rii la hibrizi care privesc gena pentru molecula mare
ARNr de la mitocondriile de drojdie.
Aceast! gen! are un intron din grupa I care con"ine o secven"! codant!.
Intronul este prezent la anumite tulpini de drojdie (numite 1+) dar absent la altele (1).
Hibrizii genetici ntre 1+ #i 1- sunt polari: progeniturile sunt de obicei 1+.
Dac! ne gndim c! tulpina 1+. reprezint! donorul #i tulpina 1- este privit! ca
recipient (primitor), constat!m c! n hibrizii 1+ x 1- se genereaz! o nou! copie a
intronului n genomul 1-. Drept rezultat toate progeniturile sunt 1+.
Muta"ii pot s! apar! la oricare din p!rin"i #i s! elimine polaritatea. Mutan"ii
manifest! o segragare normal! cu un num!r egal de progenituri 1+ sau 1-. Muta"iile
indic! natura acestui proces. Muta"iile n tulpinile 1- apar lng! situsul unde intronul
trebuie s! se insereze. Muta"iile n tulpinile 1+ sunt prezente la nivelul fazei de
lectur! a intronului #i mpiedic! producerea proteinei. Aceasta sugereaz! modelul din
figur! n care proteina codificat! de intron n tulpina 1+ recunoa#te situsul la nivelul
c!ruia intronul trebuie inserat n tulpina 1- #i face ca acesta s! fie mo#tenit
preferen"ial.
Care este ac"iunea proteinei? Produsul intronului 1 este o endonucleaz! care
recunoa#te gena 1- drept "int! pentru o clivare dublu catenar!. Endonucleaza
recunoa#te o secven"! "int! de 18 pb care con"ine situsul unde intronul va fi inserat.
Secven"a "int! este clivat! pe fiecare catena ADN la 2 baze c!tre cap!tul 3 al situsului
de inser"ie. Deci situsul de clivare are 4 pb separate , #i genereaz! monocatene libere
(care atrn!). Acest tip de clivare este asem!n!tor cliv!rii caracteristice
transpozomilor cnd ace#tia migreaz! la situsuri noi. Ruperea dublei catene ini"iaz!
probabil un proces de conversie genic! n care secven"a genei 1+ este copiat! pentru a
nlocui secven"a genei 1-. De re"inut c! inserarea intronului ntrerupe secven"a
recunoscut! de c!tre endonucleaz!, asigurnd astfel stabilitatea procesului.
(i al"i introni care con"in faze deschise de lectur! sunt #i mobili. Seria
exemplelor de introni mitocondriali la fungi poate fi continuat!. Un alt caz este al
celor doi introni de la fagul T4 care sunt mo#teni"i preferen"ial asemenea intronului 1,
#i a unui intron prezent n gena nuclear! pentru ADNr de la Physarum care se
insereaz! n orice molecul! acceptor de la hibrizi adecva"i. n general mecanismul
perpetu!rii unui intron pare s! fie acela#i: intronul codific! pentru o endonucleaz!
care taie specific o secven"! "int! la nivelul c!reia va fi inserat. Exist! totu#i diferen"e
privind detaliile inser!rii: de exemplu, endonucleaza codificat! intronul fagului T4 td
taie o secven"! "int! situat! la 24 pb mai sus situsul (n amont) la nivelul c!ruia
intronul se va insera.
n ciuda mecanismului comun de mobilitate a intronului, nu exist! omologie
ntre secven"ele situsurilor "int! sau ale regiunilor codante ale intronului. Putem
considera c! intronii au avut o origine evolutiv! comun!, dar evident ei au suferi o
mare divergen"!. Secven"ele "int! sunt dintre cele mai lungi #i totodat! cele mai
specifice cunoscute pentru endonucleaze. Specificitatea asigur! perpetuarea intronului
numai prin inserare la un singur situs apar"innd secven"ei "int! #i nu oriunde n
genom.
Aceste descoperiri nt!resc punctul de vedere c! intronii care posed! secven"e
codante #i au originea n elemente independente care codific! pentru o func"ie
corelat! cu capacitatea de splicing a ARN sau de migrare ntre moleculele ADN. n
229
concordan"! cu aceast! idee, modul de utilizare al codonilor este diferit n regiunile
codificate de introni comparativ cu situa"ia existent! n exoni. n acela#i timp, intronii
de acest tip difer! probabil de intronii nucleari prin originea lor. Se pare c! ace#tia
sunt mai degrab! insera"i n gene pre-existente, n timp ce intronii nucleari par s!
reprezinte structuri remanente ale genelor primare.
ARN poate avea activitate ribonucleazic$
Una din primele demonstra"ii privind capacitatea ARN de a avea activit!"i
enzimatice a fost analiza ribonucleazei P, o endonucleaz! izolat! de la E. coli care
este responsabil! de procesarea ARNt. Ribonucleaza P poate fi disociat! n cele dou!
componente ale sale, o molecul! de ARN de 375 baze #i o polipeptid! de 20 000. n
condi"iile ini"iale folosite pentru a caracteriza activitatea enzimatic! in vitro, ambele
componente erau necesare pentru a realiza scindarea substratului.
Modificarea condi"iilor ionice, cre#terea concentra"iilor de Mg2+, fac
componenta proteic! inutil!. n aceste condi#ii singur ARN poate cataliza reac#ia.
Analiznd rezultatele considernd c! ARN este o enzim!, fiecare enzim!
catalizeaz! clivarea a cel pu"in patru substrate. De fapt, activitatea ARN nu este mult
mai mic! dect activitatea preparatelor crude de ribonucleaz! P.
Prin analiza diferitelor muta"ii prezente n gena ARN sau n gena care codific!
proteina #i care determin! inactivarea RN-azei P, se cunoa#te faptul c! in vivo ambele
componente sunt necesare pentru activitatea natural! a enzimei. Ini"ial s-a considerat
c! enzima asigur! activitatea catalitic! #i c! ARN are un rol secundar, de exemplu de
a coopera n legarea substratului (prin intermediul unor secven"e scurte
complementare cu regiuni expuse din ARNt). De fapt aceste roluri sunt inverse.
Cum se poate demonstra c! ARN con"ine centrul catalitic? Aceast! capacitate
pare rezonabil! dac! consider!m existen"a unui centru activ ca o regiune (suprafa"!)
care expune o serie de grup!ri active ntr-o rela"ie fix!. Pentru protein!, grup!rile
active sunt furnizate de lan"urile laterale ale aminoacizilor, care posed! o apreciabil!
varietate, incluznd grup!ri ionice pozitive #i negative #i grup!ri hidrofobe. ntr-o
molecul! de ARN, p!r"ile disponibile sunt mult mai restrnse, constnd n principal n
grup!rile expuse ale bazelor. Putem presupune c! scurte regiuni sunt dispuse ntr-o
conforma"ie molecular! secundar! sau ter"iar!, furniznd o suprafa"! de grup!ri active
capabil! s! men"in! un mediu n care leg!turile pot fi rupte #i ref!cute ntr-o alt!
molecul!. Pare inevitabil ca interac"iile ntre ARN cu func"ie catalitic! #i ARN
substrat s! se bazeze pe crearea unui micromediu rezultat din mperecherea bazelor.
Implica"iile evolutive ale acestor descoperiri sunt curioase. Personalitatea
debordant! a aparatului genetic, n care ARN este prezent la nivelul tuturor
componentelor, dar proteinele realizeaz! reac"iile catalitice, a fost sf!rmat!. Pare
pu"in probabil ca cele mai ndep!rtate evolutiv sisteme de replicare s! fi avut n
compozi"ia lor att acizi nucleici ct #i proteine.
Se poate considera (emite ipoteza) c! primele sisteme con"ineau numai acizi
nucleici cu capacitate de autoreplicare #i cu activit!"i catalitice primitive, exact cele
care s! realizeze ruperea leg!turilor fosfodiester. Dac! presupunem c! implicarea
leg!turilor 2 n reac"iile curente de splicing este derivat! din aceste reac"ii catalitice
primitive, putem argumenta c! acidul nucleic original (ancestral) a fost ARN, atta
timp ct ADN care nu posed! grup!ri 2-OH nu poate realiza aceste reac"ii. Proteinele
au putut fi ad!ugate (cooptate) datorit! capacit!"ii lor de a stabiliza structura ARN,
care erau precar men"inut! f!r! existen"a unui astfel de suport. Se poate considera c!
versatilitatea (capacitatea de a ndeplini mai multe func"ii, multilateral) proteinelor
le-a permis s! preia (o parte din) cataliza reac"iilor chimice, conducnd eventual la un
complex #i la un aparat sofisticat al expresiei moderne a genelor.
230
Activitatea catalitic! a RN-azei P necesit! ARN pentru a func"iona drept
catalizator al unui substrat extern. Un alt exemplu pentru capacitatea ARN de a
func"iona ca o endonucleaz! este furnizat de cteva molecule mici de ARN de la
plante (aprox 350 baze) care realizeaz! o reac"ie de auto-clivare. Ca #i n cazul
intronilor din grupa I este posibil! realizarea unor construc"ii care s! func"ioneaz! cu
substrate externe.
Trei tipuri de molecule mici de la plante se ncadreaz! n dou! grupuri
generale: viroizii #i virusoizii.
Viroizii sunt molecule de ARN infec"ioase care func"ioneaz! independent f!r!
ncapsidare cu orice protein!.
Virusoizii sunt similari ca organizare, dar sunt ncapsida"i de c!tre virusurile
plantelor, fiind mpacheta"i mpreun! cu genomul viral. Ace#ti virusoizi nu se pot
replica independent #i necesit! asisten"! de la virus (viral!). Virusoizii sunt numi"i
adesea ARNs sateli#i.
Att viroizii #i virusoizii par s! se replice dup! modelul cercului rotativ.
Catena ARN care este mpachetat! n virus este denumit! catena plus. Catena
complementar!. generat! n timpul replic!rii ARN este denumit! catena minus. Au
fost detecta"i multimeri ai celor dou! forme. Ambele tipuri de monomeri sunt probabil
generate prin clivarea cozii unui cerc rotitor: catena circular! plus este generat! prin
legarea capetelor monomerului linear.
Ambele catene plus #i minus ale viroizilor sufer! auto-clivare in vitro: Reac"ia
de clivare este promovat! de c!tre cationi metalici divalen"i; ace#tia genereaz! capete
5-OH #i 2-3-fosdiester ciclic. Unele dintre moleculele ARNs cliveaz! in vitro n
condi"ii fiziologice. Altele sufer! procesul numai dup! un ciclu de nc!lzire #i r!cire;
aceasta sugereaz! c! moleculele izolate de ARN au o conforma"ie inadecvat!, dar c!
se poate genera o conforma"ie activ! cnd sunt supuse procesului de denaturare-
renaturare.
S-a demonstrat c! majoritatea viroizilor #i virusoizilor care sufer! auto-clivare
au, n principiu, o structur! secundar! sub form! de ciocan. Secven"a acestei
structuri este suficient! pentru clivare. Cnd secven"ele nconjur!toare sunt eliberate
nu mai este necesar ciclul de nc!lzire-r!cire, #i micile molecule de ARN auto-
cliveaz! spontan. Aceasta sugereaz! c! secven"ele apar"innd structurii cap de
ciocan interfer! cu formarea sa.
Situsul activ este o secven"! de numai 58 nucleotide. Capul de ciocan
(hammerhead) con"ine 3 regiuni stem-loop (bucle) ale c!ror pozi"ie #i m!rime sunt
constante, #i 13 nucleotide conservate, marea majoritate n regiunile care conecteaz!
(leag!) centrul structurii. Bazele conservate #i duplexul stem genereaz! o conforma"ie
a moleculei de ARN (un ARN) cu o capacitate intrinsec! de clivare.
Nu este necesar ca structura s! se formeze prin mperechere intramolecular! a
bazelor. O structur! activ! cap de ciocan poate fi generat! prin mperecherea unui
ARN care reprezint! o parte a structurii cu un ARN care reprezint! cealalt! parte. n
partea de jos a figurii este dat un exemplu de cap de ciocan generat prin
hibridizarea a 19 baze ale unei molecule cu 24 de baze ale altei molecule. Hibridul
mimeaz! structura cap de ciocan, cu omiterea buclelor (loops) I #i III. Cnd
mperecherea dintre cele 19 #i baze se realizeaz! clivarea ntr-o pozi"ie adecvat! de la
nivelul structurii.
Putem s! privim partea de sus a structurii ca reprezentnd substratul #i
partea de jos ca reprezentnd enzima. Cnd moleculele ARN care con"in regiunea
de 19 baze sunt puse n contact cu un exces de molecule ARN de 24 baze, mai multe
copii de 24 baze sunt clivate. Aceasta sugereaz! c! exist! un ciclu al mperecherii
231
fragmentelor de 19 #i 24 baze, clivare, disocierea fragmentelor clivate de molecula
ARN de 19 baze, #i re-mperecherea acesteia cu un nou substrat de 24 baze. Astfel
molecula de ARN de 19 baze este o ribozim! cu activitate endonucleazic!. Parametrii
reac"iei sunt similari cu cei ai altor reac"ii catalizate de ARN.
S-a demonstrat c! este posibil! desemnarea unor combina"ii emzim!-substrat
care s! formeze structuri cap de ciocan, #i acestea s! poat! fi folosite pentru a
demonstra c! introducerea n mediu a unor molecule adecvate de ARN permite
apari"ia reac"iei de clivare in vivo. O ribozim! proiectat! astfel furnizeaz! o activitate
de restric"ie specific! orientat! c!tre o "int! ARN. Prin plasarea ribozimei sub
controlul unui promotor reglator, aceasta poate fi folosit! n acela#i fel ca (de
exemplu) construc"iile antisens construite special pentru a modifica expresia unei
gene "int! n anumite circumstan"e.

Silde 72. Concluzii
Asemeni moleculelor pre-ARNm, transcrip"ii primari produ#i din genele pre-
ARNr #i ARNt sufer! proces!ri extensive;
Sinteza unui precursorului pre-ARNr (45S n eucariotele superioare) de c!tre
ARN polimeraza I #i procesarea acestuia apare n nucleol;
Clivarea, digestia exonucleotidic!, #i modificarea bazelor pre-ARNr 45S
conduce la molecule mature 28S, 18S #i 5,8S ARNr, care se asociaz! cu proteinele
rizozomale n subunit!"ile ribozomale. O serie de snoARN (small nucleolar RNA)
particip! la procesarea ARNr;
ARNr 5S, care este sintetizat n nucleoplasm! de c!tre ARN polimeraza III, nu
este produs extensiv naintea asambl!rii cu alte molecule de ARNr #i proteine pentru a
forma subunitatea ribozomal!;
Primele molecule de ARNr catalitic (ribozime) descoperite au fost intronii de
grup I din ARNr de la Tetrahymena. Auto-splicingul intronilor de grup I #i II, #i
splicingul pre-ARNm la nivelul spliceozomilor se realizeaz! prin intermediul a dou!
reac"ii de transesterificare;
Transcrip"ia genelor ARNt de c!tre ARN polimeraza III #i procesarea
transcrip"ilor primari apare n nucleoplasm!. n toate moleculele de pre-ARNt,
secven"a cap!tului 5 este ndep!rtat! de RN-aza P, o ribonucleoprotein! care con"in
un ARN catalitic; CCA este ad!ugat la cap!tul 3; o serie de baze interne sunt
modificate;
Unele molecule de pre-ARNt con"in un intron scurt n interiorul buclei
anticodon. Acesta este nl!turat de enzime printr-un mecanism distinct de mecanismul
de splicing al pre-ARNm #i auto-splicingul intronilor;











232
NOTE DE CURS BM5

TRADUCEREA

Produ#ii transcrip"iei (ARNt, ARNr #i ARNm) particip! to"i la transferul
informa"iei genetice n proteine, dar numai ARNm este depozitarul (cel care
depoziteaza informa"ia) informa"iei. Termenul de traducere desemneaz! ansamblul
mecanismelor care transforma informa"ia secven"ei ARNm n proteine. Transferul
informa"iei de la secven"a nucleotidica la secven"a proteica presupune existen"a unui
sistem de codificare ntre cele dou! tipuri de secven"e, numit cod genetic. Ribozomii
#i ARNt sunt celelalte dou! componente implicte puternic n masinaria de traducere
(in mecanismul de traducere). Pe langa acestea, intervin mai multe zeci de alte
proteine #i molecule diferite (aminoacil-ARNt transferazele, nucleozid trifosfatii
(ATP#i GTP), proteinele de ini"iere (IF), de alungire (EF)#i de oprire (RF).
Codul genetic
Codul genetic gireaz! coresponden"a ntre secven"a nucleotidica a unui ARNm
#i secven"a aminoacizilor unei proteine. Secven"ele nucleotidice sunt citite secven"ial
sub forma de triplete. Fiecare triplet este numit codon nu exist! suprapunere n lectura
codonilor succesivi. Un nucleotid care a servit pentru lectura unui codon nu poate
servi pentru lectura altui codon. Astfel, primul codon al unei secven"e este foarte
important deoarece el define#te cadrul de lectura pentru restul secven"ei. Deoarece
nu exista suprapunere, sunt posibile doar trei cadre de lectura. n func"ie de cadrul de
lectura secven"a n aminoacizi va fi diferita.
Descifrarea codului genetic a fost realizat! (a fost permis!) de experien"ele in
vitro cu polinucleotide de sintez!. Nirenberg #i Matthaei (1961) au sintetizat
poliribonucleotide cum este poli U #i au furnizat (imaginat) condi"iile necesare pentru
traducerea lor. Polipeptida obtinuta este o polifenilalanina. Aceeasi experienta,
repetata cu polimeri de A #i C au dat polipeptidele poliLys #i poliPro. A #i CCC
codifica respectiv pentru lizina #i prolina.
Ceilal"i codoni au fost elucida"i prin traducerea poliribonucleotidelor cu
secven"e dinucleotidice sau trinucleotidice alternative. De exemplu, un poliAC poart!
doi codoni posibili ACA #i CAC indiferent de cadrul de lectur! adoptat. Traducerea
sa furnizeaz! un amestec echimolecular de histidin! #i de treonin!. Identificarea
codonilor acestor aminoacizi a fost realizat! printr-o alt! experien"!. Este vorba de
sinteza unui polimer format din A #i din C n rapoarte molare de 5:1. n acest polimer
codonul AAA va fi cel mai reprezentat statistic iar codonul CCC cel mai pu"in
reprezentat. Amestecurile codonilor (A
2
)C (AAC, ACA #i CAA) vor fi mult mai
frecvente dect A(C
2
) (CCA, CAC #i ACC). Analiza compozi"iei n aminoacizi, a
produ#ilor de traducere, indic! c! numai histidina poate fi codificat! de A(C
2
).
Rezult! c! CAC codific! histidina #i ACA treonina.
n alte experien"e, au fost utiliza"i, ntr-un sistem de traducere, polimeri
forma"i din trei sau patru nucleotide. Un polimer format din trei nucleotide ([UUG]n
de exemplu) furnizeaz! trei tipuri de peptide: poliLeu, poliCys #i poliVal, n func"ie
de cadrul de lectur! utilizat. Un polimer format din patru ([UUAC]n de exemplu)
furnizeaz! un tetrapeptid Leu-Leu-Thr-Tyr. n final, aceste experien"e #i altele au
permis stabilirea n ntregime a codului genetic.
Ini"ierea traducerii utilizeaz! adesea codonul AUG #i uneori codonii GUG #i
UUG. Aminoacidul ncorporat este n toate cazurile Met (sau formil-Met la bacterii).
233
Aceea#i codoni codific! pentru Met, Val #i Leu cnd nu sunt folosi"i ca semnal pentru
nceperea traducerii.
ncheierea (terminarea) traducerii se realizeaz! cnd ribozomul ntlne#te unul
dintre codonii non sense (UAA, UAG, UGA) indica"i n tabel prin Stop.
Aminoacizii sunt desemna"i prin trei litere #i respectiv o liter! de cod.
(tiind c! codonii sunt triplete #i c! exist! patru baze n structura ARN (G, A,
U, C), sunt posibile teoretic 4
3
adic! 64 de triplete diferite. 61 dintre acestea au sens,
adic! codific! pentru aminoacizi #i trei sunt numi"i non sens (f!r! sens) (UAA,
UGA, UAG) deoarece nu exist! ARNt care s! posede anticodoni complementari.
Ace#ti codoni f!r! sens sau Stop, sunt codonii care marcheaz! terminarea sintezei
proteice. Acela#i aminoacid poate s! fie codificat de mai mul"i codoni diferi"i (tabel
V). Astfel, histidina este codificata de doi codoni, CAU #i CAC, iar arginina de
codonii: CGU, CGC, CGA, CGC, AGA #i AGG. n medie, unui aminoacid i
corespund trei codoni. Din aceast! cauz! codul genetic este numit degenerat sau
redundant. Codul genetic este n acela#i timp numit universal deoarece aminoacizii
au aceea#i codoni indiferent de sistemul biologic care asigur! traducerea. Totu#i
exist! cteva excep"ii ale codului universal, mai ales n cazul sintezei proteice
mitocondriale. Astfel, la nivel mitocondrial, UGA nu are semnifica"ia de codon non
sens ci codon Trp. Metionina poate fi codificat! de AUG #i AUA. AGG #i AGA nu
mai reprezint! codoni pentru Arg ci codoni Stop la fel ca si AUA #i UAG.
Moleculele de ARNt izoacceptoare
Aminoacizii nu au afinitate specific! pentru ARNm. Ei se ata#eaz! matricelor
de ARNm prin intermediarul adaptatorilor, moleculele de ARN de transfer (ARNt).
Moleculele de ARNt sunt molecule de m!rime mic! (masa lor este de
aproximativ 25 000, 75 de baze). Ele prezint! particularitatea de a fi modificate dup!
sintez!. Astfel, anumite baze sunt metilate, altele transformate n baze rare (cum sunt
dihidrouridina, inozina), etc.
Moleculele de ARNt adopt! o configura"ie spa"ial! compact! n form! de L
inversat. Din comoditate, structura este frecvent reprezentat! depliat! sub forma unei
frunze de trefl! cu patru tije formate din baze mperecheate prin leg!turi de hidrogen
#i trei regiuni n form! de bucl! (limburile frunzei) ne-mperecheate. Extremitatea 5 a
ARNt este tot timpul ocupat! de c!tre G, n timp ce extremitatea 3OH se termin! prin
secven"a CCA a c!rei func"iune 3OH a adenozinei este esterificat! cu gruparea
COOH a aminoacidului.
Bucla anticodonului poart! o secven"! de trei baze, ncadrat! n 3de o purin!
#i n 5 de un U. Aceasta recunoa#te #i hibridizeaz! codonul complementar existent pe
ARNm. Astfel, exist! o coresponden"! specific! ntre aminoacidul fixat la ARNt #i
anticodon. Anumite molecule de ARNt con"in nucleotidul inozin$ (nucleotid a c!rui
baz! azotata este hipoxantina). Inozina poate forma leg!turi de hidrogen cu U, C #i A.
In concluzie, acela#i ARNt se poate mperechea cu trei codoni diferi"i care corespund
aceluia#i aminoacid.
nainte de a participa la traducerea ARNm, moleculele de ARNt fixeaz!
aminoacidul corespunz!tor anticodonului lor: Fiecare aminoacid este mai nti activat,
n prezen"! de ATP, de c!tre enzima aminoacil ARNt sintetaza care catalizeaz! ntr-
o prim! etap! formarea aminoacil-AMP:
Aminoacil-ARNt sintetaza
Aminoacid + ATP [Aminoacil-AMP] - Enzim! + PPi
Enzima r!mne legat! de complexul aminoacil-AMP pn! la ntlnirea unui
ARNt specific aminoacidului. n a dou! etap!, aminoacidul este transferat pe
extremitatea 3OH a ARNt #i formeaz! un aminoacil-ARNt numit #i ARNt nc$rcat:
234
[Aminoacil-AMP]-Enzima + ARNt Aminoacil-ARNt + AMP +
Enzim!
Asamblarea proteinelor se realizeaz! plecnd de la ace#ti aminoacil-ARNt. n
func"ie de aminoacidul transportat, aminoacil-ARNt va fi numit alanilARNt
Ala
(sau
Ala-ARNt
Ala
), Glicil ARNt
Gly
(sau Gly-ARNt
Gly
), etc.
Eviden"ierea rela"iilor codon: anticodon: aminoacid transportat de ARNt a fost
realizat! n urma experien"elor lui Nirenberg #i Leder (1964). Ribozomii incuba"i cu
ARNm poliU #i Phe-ARNt
Phe
fixeaz! cei doi acizi nucleici. Dac! Phe-ARNt
Phe
este
nlocuit! de c!tre un alt aminoacil-ARNt, nu are loc fixare de c!tre ribozomi. Deci,
Phe-ARNt
Phe
recunoa#te specific codonul UUU gra"ie anticodonului s!u. Prin
modificarea secven"ei ARNm, a fost posibil! determinarea speciilor (moleculelor) de
ARNt care recunosc diferi"ii codoni. Deci, ntr-o celul! se g!sesc dou!zeci de
aminoacizi diferi"i care sunt transporta"i de aproximativ #aizeci de molecule de ARNt
la nc!rcarea c!rora particip! acela#i num!r de ARNt sintetaze corespunz!toare. n
consecin"!, anumi"i codoni pot fi recunoscu"i de mai mul"i ARNt care transport!
acela#i aminoacid, ARNt izoacceptori, n timp ce al"ii, codonii Stop, nu sunt
recunoscu"i de nici unul.
Ribozomii
O dat! nc!rca"i, ARNt se combin! cu ribozomii pentru a asigura sinteza
proteic!. Ribozomii, particulele citoplasmatice constituite dintr-o subunitate mare #i o
subunitate mic!, ambele formate din ARNr #i proteine, au compozi"ii diferite la
procariote #i la eucariote. Ribozomii sunt constituen"i majori n celul!. Colibacilul
con"ine aproximativ 15 000 ribozomi reprezentnd aproximativ 25% din masa uscat!
a celulei. Compara"ia secven"elor proteinelor ribozomale de la mai multe organisme
relev! o foarte mare conservare n cursul evolu"iei. Moleculele de ARNr sunt #i ele la
fel de bine conservate. Cele dou! subunit!"i sunt adesea libere #i nu se asociaz! dect
n momentul traducerii ARNm. Func"ia principal! a ribozomilor este de a orienta
corect ansamblul aminoacil-ARNt n raport cu ARNm pentru a crea leg!turile
peptidice. Mai mul"i ribozomi pot ncepe traducerea succesiv! a aceleia#i molecule de
ARNm, ei g!sindu-se astfel lega"i sub forma unui #irag de m!rgele care constituie un
polizom sau un poliribozom.

Sinteza proteic$
Traducerea ARNm n proteine se realizeaz! ntotdeauna n sensul 5-3. La
procariote, traducerea ncepe chiar nainte de terminarea transcrip"iei. La eucariote,
transcrip"ia se realizeaz! n nucleu n timp ce traducerea are loc n citoplasm!. Deci,
moleculele de ARNm sunt transcrise #i apoi maturate n nucleu. Ele migreaz! apoi n
citoplasm! pentru a fi traduse n proteine.
Traducerea poate fi mp!r"it! n trei etape esen"iale: demararea sau ini#ierea,
alungirea sau elongarea #i oprirea sau terminarea.

Demararea sau ini#ierea
Ini"ierea traducerii corespunde leg!rii ribozomului la ARNm, c!ut!rii
codonului de ini"iere (orient!rii dup! codonul de ini"iere) #i fixarea primului
aminoacil-ARNt.
Demararea sintezei proteice la bacterii ncepe deci cu formarea unui complex
ntre subunitatea mic!, 30S, primul aminoacil-ARNt #i o molecul! de ARNm.
Subunitatea mare, 50S, se leag! la acest complex pentru a forma ribozomul
70S func"ional. n cursul sintezei tuturor peptidelor bacteriene, primul aminoacid
incorporat este N-formil-metionina (metionin! modificat! care posed! o grupare
235
formil fixat! de radicalul amino-terminal) al c!rui codon principal este AUG, adesea
GUG. Datorit! faptului c! gruparea amino a formil-Met (fMet) este blocat!, un astfel
de aminoacid nu poate fi inserat dect la nceputul catenei (lan"ului).
Factorii denumi"i de ini#iere (IF pentru Initiation Factors) necesari sunt
proteinele IF1, IF2 #i IF3 (la eucariote au fost eviden"ia"i cinci astfel de factori).
Ace#ti factori se fixeaz! la subunitatea 30S n timpul primei etape de ini"iere, iar GTP
legat la IF2 este elementul stabilizator al acestei fix!ri. n acest stadiu, factorul IF3
mpiedic! asocierea subunit!"ilor 30S #i 50S. Cea de a dou! etap! este asocierea fMet-
ARNtf
Met
#i a ARNm la ansamblul IF-30S-GTP. Asocierea presupune interven"ia unei
secven"e mici din structura ARNm AGGAGGU, numit! situs de fixare la ribozom
sau rbs (ribosome binding site) sau secven#$ Shine-Dalgarno complementar! unei
secven"e prezent! n structura ARNr care particip! astfel direct la ini"iere selec"ionnd
situsul de demarare a traducerii: codonul AUG ini"iator este definit prin hibridizarea
dintre secven"a rbs #i o secven"! apropiat! de extremitatea 3 a ARNr 16s (fig. 3. 20).
Eliberarea IF3 permite asocierea celor dou! subunit!"i, hidroliza GTP #i
eliberarea altor doi factori de ini"iere. Complexul ob"inut este numit complex de
ini#iere 70S.
La eucariote, ribozomii recunosc coiful (capi#onul) metilat gra"ie unor factori
numi"i proteine de fixare a coifului (cap binding protein). Ace#tia alunec! apoi de-
a lungul ARNm plecnd de la extremitatea 5 pn! la ntlnirea primului codon AUG
ini"iator. Factorii adi"ionali de ini"iere favorizeaz!, n aceast! etap!, desfacerea
structurilor secundare susceptibile de oprirea procesului.
Alungire sau elongare
Elongarea implic! formarea unei leg!turi peptidice ntre aminoacizi #i
deplasarea ribozomului de-a lungul ARNm.
Lectura ARNm ncepe de la extremitatea 5 #i se realizeaz! n direc"ia 5-3.
Fiecare ribozom posed! dou! situsuri de fixare a ARNt. Acestea sunt situsurile P
(Peptidil) #i A (Aminoacil).
Fixarea ribozomului la ARNm se realizeaz! astfel nct fMet-ARN
fMet
s! fie
pozi"ionat n situsul P pentru a se putea mperechea cu codonul AUG de pe ARNm.
Situsul A disponibil poate astfel primi aminoacil-ARNt al c!rui anticodon corespunde
celui de al doilea codon din structura ARNm. O leg!tur! peptidic! se stabile#te ntre
gruparea COOH al primului aminoacid #i gruparea NH
2
a celui de al doilea gra"ie
enzimei numit! peptidil-transferaz!, component! a subunit!"ii 50S. Formarea leg!turii
peptidice transfer! gruparea COOH a aminoacidului din situsul P grup!rii amino a
aminoacidului care se g!se#te n situsul A. Astfel, extremitatea COOH a catenei n
formare se termin! ntotdeauna cu o molecul! de ARNt. Lan"ul peptidic este sintetizat
ncepnd de la extremitatea NH
2
c!tre extremitatea COOH. n urma form!rii leg!turii
peptidice ARNt
fMet
descarc! aminoacidul si p!r!se#te situsul P. n acest moment
(atunci) dipeptida se g!se#te legat! la ARNt care purta al doilea aminoacid #i este
pozi"ionat! (plasat!) n situsul A. n continuare, acest peptidil-ARNt se deplaseaz! n
situsul P prin mi#carea relativ! a ARNm cu o lungime de trei baze. n acest moment
situsul A liber poate primi un nou aminoacil-ARNt. O dat! ajuns n situsul A, o alt!
leg!tur! peptidic! asociaz! aminoacidul cu cel care l precede n situsul P. Elongarea
polipeptidului se realizeaz! prin repetarea acestor mi#c!ri.
Alungirea catenei polipeptidice necesit! dou! molecule de GTP care sunt
hidrolizate pentru fiecare aminoacid ad!ugat. Factorii de elongare (EF pentru
Elongation Factors) sunt #i ace#tia indispensabili. EF-Tu reac"ioneaz! cu GTP #i
ARNt nc!rcat pentru a forma complexul aminoacil-ARNt-GTP-EF-Tu care plaseaz!
aminoacil-ARNt n situsul A de pe ribozom folosind energia eliberat! prin hidroliza
236
GTP n GDP. Deplasarea peptidil-ARNt din situsul A n situsul P este dependent! de
factorul de elongare G (EF-G) numit #i translocaz!. EF-G reac"ioneaz! prin asocierea
GTP la ribozom. Acesta permite translocarea #i eliberarea ARNt din situsul P.
Reutilizarea acestui factor de elongare necesit! de asemenea hidroliza unei molecule
de GTP n GDP #i Pi.
Mecanismele de alungire (elongare) a catenei polipeptidice la eucariote s-au
dovedit similare cu participarea factorilor de elongare eEF-1 #i EF2 care au roluri
similare cu EF-Tu, EF-Ts #i EF-G.
Oprirea sau terminarea
Terminarea cuprinde detectarea codonului de oprire, ruperea leg!turii ester
dintre ultimul ARNt #i catena polipeptidic! #i eliberarea acesteia.
Sunt necesare dou! condi"ii:
- prezen"a unui codon care specific! (codific!) oprirea elong!rii;
- interven"ia unui factor de disociere (RF sau Release Factor) capabil s!
recunoasc! semnalul de terminare a catenei #i s! favorizeze ruperea leg!turii cu ARNt
#i eliberarea catenei.
n componen"a codului genetic exist! trei codoni de oprire recunoscu"i (citi"i)
de proteine specifice care la E. coli sunt RF1 (recunoa#te UAG #i U A) #i RF2
(recunoa#te UGA #i U A). Ace#tia favorizeaz! interac"ia catenei n formare cu o
molecul! de ap! #i eliberarea lan"ului.
Cnd m!rimea unei catene polipeptidice atinge dou!zeci #i cinci de
aminoacizi, codonul de ini"iere AUG de pe ARNm este complet liber #i se poate ini"ia
o nou! demarare. Fenomenul se reproduce de mai multe ori pn! cnd ARNm este
acoperit de ribozomi distan"a"i ntre ei prin aproximativ dou!zeci #i cinci de
nucleotide. Aceast! unitate de traducere mare, numit! poliribozom sau polizom,
permite celulei reproducerea mai multor copii ale unei proteine plecnd de la o
molecul! de ARNm.
Dac! ARNm este policistronic #i dac! al doilea codon de ini"iere nu este situat
(pozi"ionat) prea departe de primul codon de oprire (de terminare), ribozomul se
deplaseaz! alunecnd #i se leag! la codonul de ini"iere al cistronului urm!tor.
La eucariote, nu exist! reini"iere a sintezei proteice dup! ntlnirea codonului
de terminare.
TRADUCEREA INFORMA$IEI GENETICE LA EUCARIOTE
Sinteza proteica sau traducerea este activitatea de sintez! cea mai complex! din
celul!. n timp ce sinteza altor molecule celulare este rezultatul unor reac"ii
enzimatice relativ directe, asamblarea unei proteine necesit! prezen"a tuturor
moleculelor de ARNt #i a tuturor aminoacizilor corespunz!tori ata#a"i la ace#tia, de
ribozomi, de molecule de ARNm, de mai multe proteine cu func"ii diverse, de cationi
#i de GTP. Aceast! complexitate nu trebuie s! ne mire dac! "inem cont c! sinteza
proteic! necesit! incorporarea a peste 20 aminoacizi n func"ie de o secven"! precis!
dictat! de un mesaj codificat scris ntr-o limb! care folose#te simboluri diferite.
Procesul de traducere de la eucariote seam!n! remarcabil cu cel de la procariote.
Principal! diferen"! este c! n celula eucariot! traducerea implic! un mare num!r de
factori proteici solubili (neribozomici).
INITIEREA
Etapele fundamentale de ini"iere a traducerii depind de ata#area corect! a
ribozomului la o secven"! bine determinat! din structura ARNm pentru ca mesajul s!
poat! fi citit ntr-un cadru de lectur! corect. Aceasta se realizeaz! deoarece ribozomul
ncepe traducerea la nivelul unui situs specific de pe structura mesagerului numit
codon de ini#iere. ARNm nu se fixeaz! la ribozomii constitui"i (ntregi). Acesta se
237
une#te la cele dou! subunit!"i n momente diferite. Prima etap! esen"ial! este unirea
subunit!"ii ribozomale mici la prima (sau la una din primele) secven"e AUG ale
mesajului care func"ioneaz! ca un codon de ini"iere. Care este modalitatea prin care
subunitatea mic! alege codonul AUG ini"ial #i nu un alt codon intern. A#a cum am
ar!tat anterior, procariotele posed! o secven"! specific! de nucleotide numit! Shine-
Dalgarno care este complementar! cu o secven"! nucleotidic! apropiat! de
extremitatea 3 a ARN ribozomal 16S din subunitatea mic!.

ARNr _ _ACCUCCUUUA3
ARNm _ _ GGAGGA_ _ _5
Recunoa#terea codonului de ini"iere AUG este consecin"a unei interac"ii ntre
aceste secven"e complementare de pe ARNm #i de pe ARNr cnd subunitatea mic!
recunoa#te mai nti extremitatea 5 a mesajului , care poart! un capi#on de
metilguanozin!. Dup! aceast! subunitatea mic! baleiaz! secven"a ARNm pn! cnd
ntlne#te o secven"! de nucleotide (de obicei 5-CCACCAUGC-3) care aproximativ
90% din moleculele de ARNm eucariot, tripletul AUG este codonul de ini"iere.
Dac! "inem cont de atribuirea codonilor putem spune c! AUG este mai mult
dect un codon de ini"iere: este singurul codon pentru metionin!. De fapt metionina
este ntotdeauna primul aminoacid incorporat la extremitatea amino a catenei
polipeptidice n formare (la procariote metionina din pozi"ia 1 poart! ntotdeauna o
grupare formil). n cea mai mare parte a cazurilor metionina (sau formil-metionina)
este ulterior nl!turat! enzimatic, cu toate c! metionina r!mne aminoacidul terminal
n aproximativ 50% din catenele polipeptidice mature. Celulele posed! dou! molecule
de ARNt pentru metionin! (deux Met-ARNt): una este folosit! pentru ini"ierea
sintezei proteice (ARNi
Met
) iar cel!lalt (reprezentat de ARN
Met
) intervine n
incorporarea resturilor de metionin! n interiorul polipeptidului. Trebuie s! re"inem c!
mitocondriile #i cloroplastele celulelor eucariote folosesc N-formil-metionin! n locul
metioninei pentru a ini"ia traducerea, ceea ce d! cele mai bune argumente n favoarea
originii procariote a acestor organite.
Mai multe dintre etapele de ini"iere necesit! prezen"a unor proteine solubile
numite factori de ini#iere (reprezentate de IF la procariote #i de eIF la eucariote). De
exemplu, la eucariote, se consider! c! eIF4E se ata#eaz! coifului la extremitatea 5 a
mesagerului #i nl!tur! regiunile bicatenare care interfer! cu deplasarea ribozomului
n c!utarea codonului de ini"iere. n plus, pe lng! factorii proteici este necesar! #i
prezen"a GTP pentru a realiza o ini"iere reu#it!. O molecul! de GTP se une#te cu
ARNti
Met
nainte de cuplarea sa cu subunitatea ribozomal! mic!.
Imediat ce ARNt ini"iator este ata#at, subunit!"ile mari care se anexeaz!
complexului, factorii solubili sunt elibera"i #i GTP este hidrolizat. Hidroliza GTP
poate fi cauza unei modific!ri a conforma"iei ribozomului necesar! ini"ierii traducerii.
Fiecare ribozom posed! dou! situsuri de asociere a moleculelor de ARNt. Aceste
dou! situsuri, situsul A (aminoacil) #i a situsului P (peptidil) joaca roluri diferite n
traducere. Aminoacil-ARNt intr! n complexul ribozom-ARNm la nivelul situsului A,
n timp ce la nivelul situsului P ARNt livreaz! aminoacizi catenei polipeptidice n
cre#tere. De fapt ARNt de ini"iere (ARNti
Met
) apare mai nti la nivelul P al
ribozomului.
ELONGAREA
O dat! ce ARNt de ini"iere este plasat n situsul P, ribozomul este gata pentru
fixarea celui de al doilea aminoacil-ARNt n situsul A vacant, prima etap! de elongare
(etapa 1). nainte ca cel de al doilea aminoacil-ARNt sau c! urm!torii s! se poat! uni
efectiv la situsul A de pe ARNm, acesta trebuie s! se combine cu unul dintre factorii
238
proteici de elongare (ace#ti factori de elongare particulari sunt numi"i Tu la procariote
#i eEF1 la eucariote) uni"i cu GTP.
Cu toate c! orice complex aminoacil-ARNt-Tu-GTP poate intra n situsul A,
va fi blocat la nivelul ARNm printr-o specific! numai cel al c!rui anticodon este
complementar codonului de pe ARNm situat n situsul A. Imediat ce complexul
aminoacil-ARNt-Tu-GTP adecvat recunoa#te codonul de pe ARNm, GTP este
hidrolizat #i se elibereaz! complexul Tu-GDP. Complexul ARNt-Tu-GTP este
regenerat.
Cea de a doua etap! a ciclului de elongare este formarea unei leg!turi
peptidice ntre aminoacizii ata#a"i la cele dou! molecule de ARNt. Reac"ia se
realizeaz! prin transferarea metioninei (sau a N-formil metioninei) de pe ARNt
ini"iator din situsul P pe aminoacidul ata#at la ARNt care este complementar celui de
al doilea codon prezent n situsul A. Reac"ia este catalizat! de c!tre peptidil
transferaz!, element au subunit!"ii mari a ribozomului. Mult timp s-a considerat c!
peptidil-transferaza era una dintre proteinele ribozomului. Mai trziu, cnd
capacitatea catalitic! a ARN a devenit evident!, aten"ia s-a ndreptat c!tre ARN
ribozomal ca fiind posibilul catalizator al leg!turii peptidice. n ultimul s-a demonstrat
c! activitatea peptidil-transferazic! este efectiv localizat! pe molecula mare de ARN
ribozomal din subunitatea mare a ribozomului. Cu alte cuvinte, peptidil transferaza
este o ribozim!.
Formarea primei leg!turi peptidice las! o extremitate a moleculei de ARNt n
situsul A nc! ata#at la codonul s!u complementar de pe ARNm n timp ce cealalt!
extremitate este ata#at! la o dipeptid!. ARNt prezent n situsul P nu mai posed! acum
un aminoacid ata#at. Cea de a treia etap! a ciclului de elongare implic! eliberarea
ARNt nenc!rcat prezent n situsul P #i deplasarea ribozomului cu trei nucleotide (un
codon) de-a lungul ARNm n direc"ia 3. Aceast! ultim! etap!, numit! translocare,
este nso"it! de deplasarea ARNt-dipeptidei, nc! unit! prin leg!turi de hidrogen la al
doilea codon al ARNm, n situsul P al ribozomului. Translocarea necesit! un factor de
elongare numit G la procariote #i eEF2 la eucariote #i hidroliza GTP. Pentru fiecare
ciclu de elongare sunt hidrolizate cel pu"in dou! molecule de GTP, una (sau mai
multe) n timpul selec"iei aminoacil-ARNt #i una n timpul transloc!rii.
ndat! ce peptidil-ARNt se deplaseaz! n situsul P, situsul A este din nou
disponibil unui nou aminoacil-ARNt al c!rui anticodon este complementar cu al
treilea codon. Cnd cel de al treilea ARNt nc!rcat este asociat la ARNm n situsul A,
dipeptida legat! de molecula de ARNt prezent! n situsul P este transferat!
aminoacidului ARNt din situsul A. ARNt din situsul P este din nou eliberat de
aminoacid. Formarea unei noi leg!turi peptidice este urmat! de eliberarea ARNt din
situsul P #i de translocarea ribozomului c!tre cel de al patrulea codon, #i ciclul este
gata s! re-nceap!.
PRECIZIA TRADUCERII
Interac"ia ntre tripletele din structura ARNm #i ARNt nu este una foarte
puternic! pentru a asigura ea ns!#i precizia bine cunoscut! a sintezei proteice (mai
pu"in de un aminoacid din 10 000 este incorect incorporat). Au fost propuse mai multe
ipoteze care s! explice frecven"a foarte sc!zut! a erorilor. O ipotez! sugereaz! c!
numai codonii #i anticodonii complementari sunt capabili s! se insereze la nivelul
fosei formate de c!tre ARN ribozomal. Leg!tura peptidic! se poate forma numai n
cazul n care fosa mare este ocupat!. O alt! ipotez! pune accent pe intervalul aparent
care separ! unirea complexului ARNt-Tu-GTP la ARNm #i momentul n care
aminoacidul este ad!ugat catenei polipeptidice n cre#tere. Cu ct codonul #i
anticodonul neadecvat (necomplementari) sunt mai mult n contact, cu att este mai
239
mare probabilitatea ca sa se produc! separarea celor dou! molecule de ARN. O alt!
ipotez! face apel la faptul c! hidroliza GTP poate asigura fidelitatea traducerii. Cu
toate c! pn! n prezent se presupunea c! pentru fiecare ciclu de elongare se
realizeaz! hidroliza a dou! molecule de GTP exist! din ce n ce mai multe argumente
n sprijinul ideii c! num!rul real de molecule de GTP hidrolizate este mult mai mare
(cel pu"in trei). Este posibil ca energia suplimentar! s! fie folosit! pentru eliberarea
moleculelor de ARNm ce nu sunt bine mperecheate.
Streptomicina, care este unul dintre cele mai prescrise antibiotice ac"ioneaz!
unindu-se selectiv la subunitatea ribozomal! mic! a celulelor bacteriene provocnd o
lectur! eronat! a anumitor codoni ai ARNm, crescnd sinteza proteinelor aberante.
Acest antibiotic nu ac"ioneaz! asupra ribozomilor de la eucariote si deci nu are efect
asupra traducerii din celulele gazd!. Se pare c! streptomicina se une#te cu proteina
ribozomal! numit! S12 care intervine care intervine ntr-un fel sau n altul n controlul
preciziei interac"iei dintre moleculele de ARNt specifice #i complexul ribozom-
ARNm. Rezisten"a bacteriilor la streptomicin! se poate explica prin modific!ri la
nivelul proteinelor ribozomale #i n particular la nivelul S12. Multe antibiotice
ac"ioneaz! interac"ionnd cu diferite etape ale sintezei proteice n celulele bacteriene
(tabel).
Eu, Pro: celule eucariote, procariote; G, P: subunitatea mare sau mic!; R:
recunoa#tere; P: transferul polipeptidului; T: translocare; I: ini"iere;
TERMINAREA
Cum s-a remarcat anterior trei din cei 64 codoni (de trei nucleotide) poten"iali
sunt codoni stop ale c!ror func"ie este semnalizarea opririi asambl!rii polipeptidelor.
Deci, nu exist! anticodoni n structura ARNt care s! fie complementare codonilor
stop. Cnd ribozomul ajunge la unul dintre ace#ti codoni, UAA; UAG sau UGA ,
semnalul opre#te orice nou! elongare #i elibereaz! polipeptidul asociat ultimului
ARNt. Terminarea necesit! prezen"a factorilor de eliberare care reac"ioneaz! direct cu
codonii stop; bacteriile posed! doi factori de eliberare (RF1 care recunoa#te UAA #i
UAG #i RF2 care recunoa#te UGA) n timp ce celule eucariote nu au dect un eRF.
Factorul de eliberare poart! un GTP legat care este apoi hidrolizat. Imediat ce
traducerea se opre#te, leg!tura polipeptidei la ARNt este scindat! #i factorul de
eliberare, ca #i ARNt dezacilat, sunt elibera"i de pe ribozom. Hidroliza leg!turii ntre
polipeptid #i ultimul ARNt poate fi realizat! de c!tre aceea#i regiune a ARNr care este
responsabil! de formarea leg!turii peptidice n timpul elong!rii. Imediat ce se
realizeaz! terminarea, ribozomul se separ! de mesager #i se disociaz! n subunit!"i
pn! la ini"ierea unui nou ciclu de traducere.
Cum cei trei codoni de terminare pot fi u#or ob"inu"i prin modificarea bazelor
plecnd de la al"i codoni, ne-am putea a#tepta la apari"ia unor muta"ii care dau codoni
stop la interiorul unei gene. Aceste muta"ii ar putea provoca o terminare prematur! a
catenei polipeptidice n cre#tere. Muta"iile de acest tip sau muta"iile non-sens, au fost
studiate timp de ani de zile #i se #tie c! acestea sunt responsabile de diferite maladii
ereditare la om. Muta"iile non-sens antreneaz! de obicei formele de maladii ereditare
cele mai severe deoarece se realizeaz! numai sinteza unei por"iuni a proteinei #i
aceasta este ntotdeauna nefunc"ional!. Terminarea prematur! a cre#terii catenei poate
fi determinat! #i de ad!ugarea unui antibiotic, cum este puromicina. Aceast! molecul!
seam!n! cu extremitatea 3 a unui ARNt nc!rcat #i poate intra n situsul A al
ribozomului (figura). Cnd aceasta se plaseaz! la acest nivel, polipeptida din situsul P
este transferat! puromicinei din situsul A cu formarea unei leg!turi covalente.
Transferul catenei polipeptidice., n formare, pe puromicin! determin! formarea unui
240
capi#on la extremitatea carboxil , astfel nct al"i aminoacizi nu se mai pot ata#a
complexului peptidil-puromicin! iar acesta se desprinde de pe ribozom.
FORMAREA DE POLIRIBOZOMI
Dac! observ!m la microscopul electronic o molecul! de ARNm n curs de
traducere vedem ntotdeauna un anumit num!r de ribozomi ata#a"i de-a lungul
fragmentului de ARNm. Acest complex format din ribozomi #i ARNm numit
poliribozomi. Mai nti, to"i ribozomii se asambleaz! din subunit!"ile lor la nivelul
situsului de ini"iere, apoi ei se deplaseaz! de la acest punct c!tre extremitatea 3 a
ARNm pn! cnd ating codonul de terminare. Imediat ce primul ribozomi se afl! la o
distan"! destul de mare de codonul de ini"iere, un al doilea ribozom se ata#eaz! la
ARNm #i demareaz! o alt! activitate de traducere. Traducerea simultan! a aceluia#i
ARNm de mai mul"i ribozomi cre#te puternic viteza de sintez! a proteinelor celulare.
Chiar dac! procesele se aseam!n! ele sunt diferen"iate la eucariote si la procariote
deoarece la eucariote procesul de transcrip"ie #i cel de traducere sunt compartimentate
#i se desf!#oar! fiind separate n citoplasm! #i n nucleu. n celulele bacteriene,
sinteza proteic! debuteaz! la nivelul moleculelor de ARNm chiar nainte de
terminarea transcrip"iei acestora. Sinteza unei molecule de ARNm progreseaz! n
acela#i sens ca #i deplasarea ribozomilor care traduc mesajul, adic! n direc"ia 5- 3.
n concluzie, o molecul! de ARNm la procariote va fi tradus! pentru traducere
imediat ce extremitatea sa 5 este disponibil! pentru fixarea ribozomilor. n figur! este
reprezentat filamentul de ADN pe care transcrip"ia este n curs. Se pot observa
molecule de ARNm din ce n ce mai lungi la nivelul c!rora sunt ata#a"i ribozomi
pentru a forma poliribozomii. Catenele proteinelor n formare nu sunt vizibile n
micrografiile realizate n cazul traducerii unor proteine normale dar se pot observa la
nivelul singurului poliribozom izolat dintr-o celul! a glandelor sericigene de la
viermele de m!tase. Proteina de m!tase n curs de sintez! este vizibil! din cauza
m!rimi sale #i a maturii sale fibroase. Posibilitatea vizualiz!rii transcrip"iei #i
traducerii, oferit! de Oscar Miller de la Ridge National Laboratory, a constituit o
etap! n vizualizarea unui proces care pn! n acel moment numai n termeni
biochimici.
Pornind de la discu"ia privind evolu"ia conceptului de gen! care la nceput a
fost considerat! o unitate ereditar! care controleaz! caracteristicile unei plante de
maz!re, gena a devenit apoi un locus pe cromozom, un segment de molecul! de ADN
#i, mai recent, o unitate de transcrip"ie. Este remarcabil c!, n ciuda schimb!rilor
intervenite n felul nostru de a vedea factorii ereditari, toate conceptele privind gena
au r!mas valabile, chiar dac! fiecare a fost adaptat pentru a r!spunde la noi criterii
citologice #i moleculare. Descoperirea secven"elor intermediare a modificat din nou
conceptul de gen!, ndep!rtndu-l de dogma care domina #i care considera c! o
secven"! linear! nentrerupt! de nucleotide genereaz! o secven"! corespunz!toare de
aminoacizi, revelnd #i complexitatea transferului informa"iei n celula eucariot!.
Cum este adesea cazul, descoperirea unei enigme ajut! la explicarea altora. n acest
caz, descoperirea n marea majoritate a genelor, a unui ansamblu de introni a c!ror
lungime dep!#e#te pe cea a segmentelor codante a permis realizarea unui pas
important #i a explicat de ce exist! atta ADN n genomul organismelor superioare #i
de ce transcrip"ii primari sunt mult mai lungi dect mesagerii produ#i n final.

(1) Reglarea expresiei genelor
Principii de reglare a activit$#ii genelor
Cantit!"ile de proteine sintetizate de c!tre o celul! nu sunt neap!rat fixe #i
variaz! n func"ie de necesit!"ile celulei. Colibacilul E. coli poate la fel de bine s!
241
sintetizeze metaboli"i ca triptofanul sau histidina sau s! le preia din mediul de cultur!.
Oricare dintre aceste mecanisme este declan#at n func"ie de necesit!"ile celulei #i n
func"ie de prezen"a sau absen"a metaboli"ilor respectivi n mediu. n general bacteria
nu sintetizeaz! metaboli"i dect n cazul n care nu i poate ob"ine (preleva) din mediu.
Ea realizeaz! (face) astfel economie de sinteze inutile. (Ea economise#te astfel
sintezele inutile). Diferitele niveluri de expresie a genelor sunt dovada (constituie
dovada) acestei ajust!ri permanente ntre nevoile celulare #i mecanismele moleculare
destinate asigur!rii acestora. Aceast! reglare este rezultatul diferen"elor de
recunoa#tere a diferi"ilor promotori (a promotorilor) de c!tre ARN polimeraz! #i de
diferen"ele n nceperea traducerii (demararea traducerii). De asemenea, exist! sisteme
de reglare tip care realizeaz! (determin!) expresia (exprimarea) la comand!. Alte
sisteme ajusteaz! concentra"ia unei proteine n celul! n func"ie de necesit!"ile impuse
de mediu. Toate aceste mecanisme poart! numele (au fost denumite) reglarea
expresiei genelor.
Mecanismele de reglare sunt diferite la procariote #i la eucariote. Mecanismele
de la bacterii #i de la fagi sunt cele mai bine cunoscute. (Sunt mai bine cunoscute
mecanismele de la bacterii #i de la fagi); acestea controleaz! n primul rnd
transcrip"ia (dac! este nevoie de protein!, transcrip"ia este activat!, dac! nu
transcrip"ia este ncetinit! dar nu se opre#te niciodat!). La eucariote, sistemele de
reglare se pot opri complet transcrip"ia unei gene, expresia n acest caz bazndu-se n
esen"! pe stimulare.
Mecanismele de reglare se pot mp!r"i n dou! categorii: reglare pozitiv$ #i
reglare negativ$.
ntr-un sistem de reglare negativ!, un inhibitor, prezent n celul!, blocheaz!
transcrip"ia. ntr-un sistem de reglare pozitiv!, o molecul! efectoare de natur! proteic!
sau de alt! natur! (molecul! mic!, complex molecular) activeaz! promotorul. Cele
dou! sisteme de reglare nu se exclud #i anumite gene sunt n acela#i timp reglate
pozitiv #i negativ.
ntr-un proces de degradare, reglarea se realizeaz! adesea implicnd ns!#i
molecula de degradat #i poate fi negativ! sau pozitiv! (exemplul operonului lactoz!).
Din contr!, ntr-un proces de biosintez!, produsul final realizeaz! reglarea #i de cele
mai multe ori n manier! negativ! (cazul operonului triptofan).
Reglarea se poate realiza fie asupra sintezei enzimelor implicate ntr-o cale de
biosintez! sau de degradare fie asupra activit!"ii enzimelor. n acest proces de
biosintez! produsul final n activeaz! frecvent enzima. Acest tip de reglare se nume#te
retroinhibi#ie. n afar! de produ#ii de reac"ie exist! #i ale molecule numite efectori
alosterici care pot inhiba o enzim!.
Reglarea la procariote
Expresia genelor depinde de ARN polimeraz! #i de un anumit num!r de
proteine de reglare (implicate n reglare). La bacterii, anumite molecule ac"ioneaz! ca
inductori #i drept co-represori determinnd astfel vitez! de biosintez! a proteinelor
controlnd sinteza ARNm corespunz!tori. Aceste molecule se combin! cu inhibitorul
transcrip"iei adesea desemnat ca represor, pentru a-l inactiva (molecula este n acest
caz inductoare a expresiei deoarece nl!tur! inhibi"ia) sau activa (molecula este
inhibitoare deoarece provoac! inhibi"ie). Reglarea expresiei genelor este esen"ial (n
esen"!) transcrip"ional! #i post-transacrip"ional!.

Reglarea transcrip#iei
Modelul operonului lactozei

242
Pentru a tr!i colibacilul trebuie s! dispun! de o surs! de carbon organic a c!rei
degradare furnizeaz! energie #i precursorii (scheletul carbon) necesar propriilor
sinteze. Aceast! surs! este constituit! preferen"ial din glucoz! (biomolecula cea mai
abundent! din biosfer!) dar #i din alte glucide cum sunt galactoza, lactoza #i
aminoacizii. Pentru a metaboliza lactoza, E. coli sintetizeaz! o permeaz!, pentru a
autoriza (pentru a permite) intrarea glucidului n celul!, #i o "-galactozidaz! care
degradeaz! lactoza n galactoz! #i glucoz!.
permeaz!
Lactoza extern! Lactoz! intern!
"-galactozidaz!
Lactoza ntern! galactoz! + glucoz!

Controlul negativ al operonului
Cnd E. coli este cultivat! ntr-un mediu de cultur! con"innd ca singur! surs!
de carbon lactoza (deci n absen"a glucozei), cantitatea intracelular! de "-
galactozidaz! cre#te brusc. De fapt, exist! un sistem de reglare care nu autorizeaz!
sinteza acestei enzime dect n prezen"a substratului. Acest mecanism de reglare,
eviden"iat de c!tre Jacob #i Monod n 1961, a fost dedus din urm!toarele observa"ii:
- n absen"a lactozei (sau a unei molecule din familia "-galactozidelor),
concentra"iile n permeaz! #i n "-galactozidaz! sunt foarte reduse n celul!. n
prezen"a lactozei, concentra"iile cresc de aproximativ 10
5
.
- Cnd lactoza este ad!ugat! n mediu de cultur! al unei culturi bacteriene
capabil! s! o utilizeze, sunt #intetizate permeazele #i "-galactozidaza aproape
simultan. nainte de ad!ugarea lactozei nu exist! ARNm care codific! pentru cele
dou! enzime (ARNm lac), astfel nct lactoza declan#eaz! sinteza ARNm lac.
Aceste observa"ii ne permit s! afirm!m c! sistemul de reglare al c!ii de
degradare a lactozei este inductibil, inductorul fiind lactoza. Cele trei enzime ale
operonului sunt numite inductibile, #i n absen"a lactozei se consider! c! operonul
este reprimat.
1) Sistemul de utilizare a lactozei presupune gene de structur$ #i gene ale
secven"elor de reglare. Ansamblul formeaz! operonul lactoz$.
2) Genele lacZ ("-galactozidaz!) #i lacY (permeaz!) sunt transcrise ntr-o
singur! molecul! de ARNm policistronic care con"ine #i transcriptul unei a dou! gene
LacA ce codific! enzima transacetilaz$ a c!rei func"ie este necunoscut!.
3) Promotorul care ni"iaz! transcrip"ia genelor lacZ, lacY #i lacA este situat n
amont de o secven"! reglatoare numit! operator.
4) Gena lacI situat! n amonte de promotor produce de manier! constitutiv!
(ntr-o concentra"ie aproape constant!) o protein!, represor care se fixeaz! cu foarte
mare afinitate la operator.
5) Fixarea represorului la operator blocheaz! promotorul #i mpiedic! astfel
ARN polimeraza s! se ata#eze #i s! ini"ieze transcrip"ia ARNm lac.
6) Inductorii (lactoz! #i "-galactozide) stimuleaz! sinteza ARNm lac
combinndu-se cu represorul ceea ce diminueaz! foarte tare afinitatea sa pentru
secven"a ADN a operatorului f!cndu-l astfel inactiv. Acest proces este numit
derepresie. Astfel inductorul decro#eaz! represorul #i elibereaz! promotorul, ceea ce
autorizeaz! nceperea transcrip"iei de c!tre ARN polimeraze.
Func"ionarea operonului lactoz! a fost confirmat! prin utilizarea de mutan"i
lacI
-
, lacI
s
#i lacO
c
. Mutan"ii lacI au pierdut capacitatea de a sintetiza
represorul;sistemul r!mne n permanen"! indus n absen"a lactozei. Mutan"ii lacI
s
sintetizeaz! un represor mutant care nu se mai poate combina cu inductorul. Acesta
243
r!mne deci fixat la ADN iar sistemul este reprimat n permanen"!. Mutan"ii lacO
c
au
un operator care a pierdut o parte din secven"a sa prin dele"ie #i care nu poate fixa
corect represorul astfel nct sistemul este indus chiar #i n absen"a inductorului.
Controlul pozitiv al operonului
Pentru a func"iona normal, chiar n prezen"a unui inductor care neutralizeaz!
represorul, operonul lactoz! trebuie s! primeasc! un semnal de control pozitiv. Acest
sistem de reglare a operonului lactoz! a fost descoperit studiind (cercetnd) maniera
(modalitatea) prin care glucoza inhib! func"ionarea anumitor operoni.
Dac! mediul con"ine glucoz! #i lactoz!, transcrip"ia operonului lactoz! nu este
necesar!. Glucoza este metabolizat! preferen"ial #i ea exercit! o represie, numit!
catabolic$, asupra operonului lactoz!. Deci, nu exist! sintez! de "-galactozidaz! att
timp ct n mediu exist! glucoz!. Astfel, n ciuda prezen"ei inductorului, lactoza, care
inactiveaz! precursorul, transcrip"ia genelor operonului lactoz! nu se produce.
Transcrip"ia are loc dac! operonul este reglat de manier! pozitiv! (n mod pozitiv).
Reglarea pozitiv$ implic! dou! gene, cea a adenilat ciclazei care produce AMP
ciclic (AMPc) #i cea a unei proteine receptoare de AMPc (cRP) sau proteina de
activare catabolic$ (CAP pentru Catabolite gene Activator Protein). Concentra"ia
AMPc n celul! este invers propor"ional! cu cea a glucozei. Cnd concentra"ia de
glucoz! este sc!zut!, AMPc devine abundent, se fixeaz! la proteina CAP #i activeaz!
astfel operonul lactoz!. Complexul AMPc-CAP se fixeaz! pe un situs particular al
operonului (situs CAP ntre pozi"iile 72 #i 52) #i activeaz! transcrip"ia genelor
adiacente favoriznd o mai bun! ata#are a ARN polimerazei la promotor. El
ac"ioneaz! ca un stimulator, regulator pozitiv al transcrip"iei operonului lactoz! #i al
multor altor operoni.

ROLUL CATALIZATOR AL ARN
Cercet!rile realizate n biochimie #i biologie molecular! n cursul anilor 70 au
nt!rit n"elegerea rolului proteinelor #i acizilor nucleici. Proteinele erau considerate
ca agen"i care permiteau func"ionarea celular! #i enzimele ca accelernd reac"iile
biochimice. Pe de alt! parte, acizii nucleici erau considerate moleculele care
stocheaz! informa"ia celular!, con"innd informa"iile genetice n structura lor
nucleotidic!. Reparti"ia sarcinilor ntre proteine #i enzime p!rea s! fie una dintre
diferen"ele cele mai bine definite n #tiin"ele biologice. Acest lucru a fost valabil pn!
n 1981 cnd a fost publicat un articol care a nceput s! umbreasc! aceast!
diferen"iere.
Thomas Cech #i colaboratorii s!i de la Universitatea din Colorado studiau
procesul de transformare n ARNr matur a precursorului ARN ribozomal sintetizat de
c!tre protozoarul ciliat Tetrahymena thermophila. Contrar moleculelor de pre-ARNr
de la mamifere, cel de la Tetrahymena thermophila con"inea o secven"! intermediar!
de aproximativ 400 de nucleotide care trebuiau ndep!rtate din transcriptul primar
nainte de reunirea (legarea) segmentelor.
Cech observase nainte c! nucleele izolate de celule erau capabile s!
sintetizeze precursorul pre-ARNr #i s! efectueze ntreaga reac"ie de maturare
(splicing/epissage). Nu se realizase nc! izolarea enzimelor de splicing/epissage de la
alte tipuri celulare #i Tetrahimena p!rea s! fie un sistem bun pentru studiul acestor
enzime. Prima etap! era izolarea precursorului pre-ARNr intact, apoi determinarea
num!rului minim de elemente nucleare care trebuiau ad!ugate amestecului de reac"ie
pentru ajunge la un splicing/epissage corect. Cnd nucleele izolate au fost incubate n
mediu care con"ine o concentra"ie sc!zut! de cationi monovalen"i (NH
4
+
5mM),
molecula de pre-ARNr era sintetizat! dar intronul nu era ndep!rtat. Acest lucru a
244
permis cercet!torilor s! purifice precursorul intact pe care doreau s! l foloseasc!
drept substrat pentru a testa activitatea de maturare a extractelor nucleare. Totu#i,
ace#tia au constatat c!, dac! precursorul purificat era incubat singur la concentra"ii
mai crescute n ioni de NH
4
+
, n prezen"! de Mg
2+
#i a unui derivat de guanozin! (cum
este GMP sau GTP), secven"a intermediar! era ob"inut! plecnd de la precursorul
matur. Analiza secven"elor nucleotidice a confirmat c! fragmentul mic de ARN care
era ndep!rtat din precursor era intronul care con"inea un nucleotid cu guanidin! n
plus la extremitatea 5. Nucleotidul ad!ugat provenea din GTP ad!ugat amestecului
de reac"ie.
Splicingul unui intron este o reac"ie complicat! care cere recunoa#terea
secven"elor care l flancheaz!, ruperea leg!turilor fosfodiester de o parte #i de alta a
intronului #i legarea fragmentelor nvecinate. Toate eforturile au fost f!cute pentru a
elimina orice protein! care ar putea fi fixat! la ARN nainte de a testa capacitatea de
splicing a acesteia. ARN a fost tratat cu un detergent fenolic, centrifugat ntr-un
gradient #i tratat cu o enzim! proteolitic!. n aceast! situa"ie nu existau dect dou!
explica"ii rezonabile: fie splicingul era datorat unei proteine legat! foarte intim la
ARN, fie unei molecule de ARN sau de pre-ARN capabile ea ns!#i de splicing.
Aceast! ultim! explica"ie nu a fost deloc u#or de admis.
Pentru a rezolva problema prezen"ei unui contaminant proteic, Cech #i
colaboratorii au utilizat un sistem artificial care nu putea s! con"in! proteine nucleare
de splicing. ADN care codific! precursorul ARNr a fost multiplicat prin clonare n
E. coli, apoi purificare #i folosire drept model pentru procesul de transcrip"ie in
vitro realizat de o ARN polimeraz! bacterian! purificat!.
Pre-ARNr sintetizat in vitro a fost apoi purificat #i incubat n prezen"! de ioni
monovalen"i #i bivalen"i #i un derivat de la guanozin!. ARN folosit nu poate fi
contaminat cu enzime de splicing celulare. Totu#i, pre-ARN suport! aceea#i reac"ie
de splicing care se produce n celula eucariot!. Deci, ARN trebuie s! fi realizat
singur propriul splicing.
Aceste experien"e au demonstrat c! ARN este capabil s! catalizeze o reac"ie
complex!, format! din mai multe etape. Calculele demonstreaz! c! reac"ia a fost
accelerat! de aproximativ zece milioane de ori n raport cu viteza de reac"ie ne-
catalizat!. Ca o enzim! proteic!, ARN era activ la concentra"ii sc!zute , nu era
modificat! n reac"ie #i era capabil! s! accelereze puternic o reac"ie chimic!. Singura
diferen"! ntre acest ARN #i enzimele clasice era c! ARN ac"iona asupra lui ns!#i
#i nu asupra unui substrat independent. Cech a desemnat acest ARN ca fiind o
ribozim!.
n 1983, s-a descoperit un al doilea exemplu de cataliz! realizat de c!tre un
ARN ne-nrudit. Sidney Altman de la Yale University #i Norman Pace, de la National
Jewish Hospital de Denver #i colegii lor, studiau n colaborare ribonucleaza P, enzim!
implicat! n maturarea unui precursor de ARN de transfer la bacterii. Enzima era
neobi#nuit!: ea era compus! dintr-o protein! #i ARN. n urma incub!rii cu tampoane
cu concentra"ii ridicate (60 mM) de Mg2+, subunitatea ARN purificat[ era capabil! s!
nl!ture extremitatea 5 a precursorului ARNt exact cum acest proces era realizat de
molecula ntreag! de ribonucleaz! P n celul!. Molecula de ARNt matur!,
transformat!, se g!sea printre produ#ii de reac"ie in vitro. Din contr!, subunitatea
proteic! izolat! din enzim! era lipsit! de activitate catalitic!.
Pentru a exclude posibilitatea ca un contaminant proteic catalizeaz! de fapt
reac"ia, por"iunea de ARN a ribonucleazei P a fost sintetizat! in vitro plecnd de la un
model de ADN recombinant. Ca #i ARN extras din celulele bacteriene, acest ARN
sintetizat artificial, f!r! nici o protein! suplimentar!, era capabil s! cliveze corect
245
precursorul ARNt. Contrar enzimei de maturare a ARN studiat! de Cech, ARN
ribonucleaza P ac"iona asupra unei alte molecule de substrat #i nu asupra ei ns!#i.
Deci, s-a dovedit c! ribozimele puteau avea ele ns!le propriet!"i catalitice asemeni
enzimelor formate din proteine. n figura este redat un model recent de interac"ie ntre
subunitatea ARN catalitic! a ribonucleazei P #i un precursor de ARNt care serve#te
drept substrat.
Dovada c! ARN putea cataliza reac"ii chimice a creat un mediu propice unor
noi cercet!ri asupra unei probleme vechi: care este elementul din subunitatea mare
ribozomal! cu activitate peptidil-transferazic!, #i care este cel care catalizeaz!
formarea leg!turii peptidice. n cursul anilor 1970 au fost f!cute mai multe descoperiri
independente care au sugerat c! ARN ribozomal ar putea avea un rol mult mai
important dect s! serveasc! de e#afodaj pentru men"inerea structurii proteinelor
ribozomale individuale ntr-o pozi"ie propice derul!rii unor activit!"i importante.
Printre aceste argumente enumer!m:
1. Anumite su#e de E. coli posed! gene care codific! proteine capabile s!
omoare bacterii, numite colicine. Se #tia c! una dintre aceste toxine, colicina E3
inhib! sinteza proteic! n celulele bacteriene sensibile. Ribozomii izola"i din celulele
tratate cu colicin! E3 par destul de normali pentru majoritatea criteriilor, dar nu
permit sinteza proteinelor in vitro. Un studiu mult mai aprofundat al acestor ribozomi
demonstreaz! c! deficienta era prezent! la nivelul ARNr #i nu n structura proteinelor
ribozomale. ARN 16S din subunitatea mic! era clivat! de colicin! la aproximativ 50
de nucleotide fa"! de cap!tul 3, ceea ce f!cea ntreaga subunitate incapabil! s!
realizeze sinteza proteic!.
2. S-a constatat c! tratamentul subunit!"ilor mari ribozomale cu ribonucleaza
T1, enzim! care cliveaz! leg!turile dintre nucleotidele continue din ARN #i fac
subunit!"ile incapabile s! realizeze reac"ia peptidil-transferazic!.
3. Diferite cercet!ri asupra antibioticelor care inhib! formarea leg!turii
peptidice, cum este cazul cloramfenicolului, carbomicina #i eritromicina, au sugerat
c! aceste substan"e ac"ioneaz! asupra ARN #i nu asupra propriet!"ilor ribozomale. De
exemplu, s-a constatat c! ribozomii devin rezisten"i la efectele cloramfenicolului ca
urmare a substituirii unor baze n structura ARN ribozomal.
4. S-a demonstrat c! moleculele de ARN ribozomal sunt foarte conservate la
nivelul secven"elor de baze, mult mai mult dect n secven"ele de aminoacizi ale
proteinelor ribozomale. Anumite regiuni din structura ARN ribozomal sunt practic
identice n ribozomi provenind din bacterii (archeobacterii ca eubacterii), ciuperci,
plante #i animale, ca #i n ribozomii izola"i din mitocondrii #i cloroplaste. Cea mai
mare parte a regiunilor foarte conservate sunt situate la suprafa"a ribozomului. O
astfel de conservare a secven"elor de ARNr ne las! s! credem c! aceste molecule au
un rol fundamental n func"ionarea ribozomului. n 1975, C.R. Woese concluziona:
deoarece nu exist! sau exist! pu"ine corela"ii ntre regiunile conservate #i de situsuri
cunoscute de fixare la proteinele ribozomale, exist! puternice presupuneri n favoarea
unei implic!ri directe a regiunilor importante ale ARN n func"ionarea ribozomului.
Ca urmare a descoperirii unor propriet!"i catalitice ale ARN n laboratoarele
conduse de Cech #i Altman, cercet!rile privind rolul ARN ribozomal au fost
intensificate. Multe cercet!ri realizate de Harry Noller #i colegii s!i de la
Universitatea din California, Santa Cruz, s-au focalizat pe situsul ARN ribozomic care
se g!se#te n apropierea centrului peptidil-transferazic. n cursul unui studiu, ei au
sintetizat o versiune modificat! a fenilalanil-ARNt care, atunci cnd se afl! n situsul
P al unui ribozom, se une#te el nsu#i la molecula de ARNr. Chiar dac! el este astfel
fixat, analogul ARNt r!mne capabil s! participe la formarea leg!turii peptidice:
246
aceasta demonstreaz! c! analogul trebuie s! fie situat la situsul P #i s! fie orientat
corect. Analiza ulterioar! a ARNr provenind din aceste experien"e indic! c!
nucleotidele din structura ARNr care sunt astfel fixate se g!sesc ntr-un situs
conservat care formeaz! o bucl! central! situat! n domeniul V al moleculei. Mai
precis aceast! regiune a ARNr care a fost nainte considerat! ca situsul muta"iilor care
confer! rezisten"! la cloramfenicol sau la eritromicin!. Luate mpreun!, aceste
descoperiri desemneaz! clar aceast! bucl! a ARN ca fiind unul dintre elementele care
fac parte din centrul peptidil-transferazic. n cursul altor experimente, s-a demonstrat
c! moleculele de ARNt fixate de ribozom protejeaz! bazele specifice ale ARNr din
subunitatea mare contra unui atac care poate fi realizat de c!tre agen"i chimici
specifici. Aceast! protec"ie demonstreaz! c! ARNt trebuie s! fie situat foarte aproape
de bazele de ARNr care sunt protejate. n func"ie de fixarea ARNt n situsul A sau n
situsul P, sunt protejate loturi diferite de baze, ns! n fiecare caz acestea se afl! n sau
n apropierea buclei centrale a domeniului V. Protec"ia dispare dac! extremitatea 3 a
ARNt (extremitatea CCA unit! la aminoacid) este nl!turat!. Este vorba de
extremitatea ARNt implicat! n formarea leg!turii peptidice, care trebuie s! se
g!seasc! foarte aproape de situsul peptidil-transferazic.
Tentativele f!cute pentru a atribui o func"ie particular! ARN ribozomal izolat
au e#uat ntotdeauna. S-a presupus c!, de#i proteinele ribozomale nu au func"ii
specifice, prezen"a lor este necesar! cel pu"in pentru a p!stra o conforma"ie adecvat! a
ARNr. Dac! "inem cont de faptul c! proteinele #i ARN ribozomal au co-evoluat timp
de miliarde de ani, puteam s! ne a#tept!m ca cele dou! molecule s! fie
interdependente. n ciuda acestui ra"ionament, puterea catalitic! a ARNr izolat a fost
n sfr#it dovedit! de c!tre Harry Noller #i colaboratorii s!i n 1992. Noller a lucrat pe
ribozomii de la Thermus aquaticus (cu o stabilitate particular!), o bacterie care
tr!ie#te la temperaturi crescute. Noller a tratat preparatele de subunit!"i ribozomale
mari cu un detergent destinat extrac"iei proteinelor (SDS), o enzim! proteolitic!
(proteinaza K) #i mai multe treceri n fenol pentru denaturarea proteinelor. Ansamblul
acestor agen"i nl!tur! cel pu"in 95% din proteinele subunit!"ii ribozomale #i asigur!
p!strarea ARNr. S-a demonstrat c! cea mai mare parte din propor"ia de 5% de
proteine care a r!mas asociat! la ARNr consta n peptide mici care reprezentau
fragmente de proteine ribozomale. Totu#i, n ciuda elimin!rii aproape totale a
proteinelor, ARNr conserv! aproape 80% din activitatea peptidil-transferazic! a
subunit!"ii intacte. Activitatea catalitic! era blocat! de c!tre cloramfenicol #i prin
tratament cu ribonucleaz!. Cnd ARN era supus unor tratamente suplimentare pentru
a elimina restul de proteine (cele 5%), preparatul pierdea activitatea sa catalitic!.
Deoarece este pu"in probabil ca micile fragmente peptidice s! fie responsabile pentru
activitatea catalitic!, consider!m c! acest eperiment dovede#te c! peptidil-transferaza
este o ribozim!.
Perspective pentru om
Ribozimele posed! dou! propriet!"i care fac din acestea agen"i importan"i n
lupta contra anumitor maladii cronice:
1. ele con"in segmente nucleotidice care le permit s! se mperecheze cu un
ARN complementar.
2. ele posed! un situs catalitic capabil s! cliveze scheletul ARN
complementar
Gra"ie acestor propriet!"i, ribozimele sunt un subiect de manipulare ideal n inginerie
genetic! deoarece ele pot fi fabricate la comand! pentru a recunoa#te #i distruge
orice "int! ARN specific!.
247
Ribozimele la comand! ncep a fi folosite n lupta contra maladiilor virale.
Pentru ca un virus s! provoace probleme ntr-o celul! infectat!, trebuie ca genomul
viral s! fie transcris n ARN #i apoi tradus n proteine. S! ne gndim la ceea ce se
poate ntmpla dac! o celul! infectat! posed! o gen! care codific! o ribozim! capabil!
s! se uneasc! specific la moleculele de ARN viral #i s! le distrug!. Ne-am putea
a#tepta ca celula s! fie protejat! de virus, chiar dac! genomul s!u este integrat n
ADN-ul celulei gazd!. Experien"e destul de recente realizate de Flossie Wong-Staal,
Universitatea din California, #i Arnold Hempel, de la Northern Illinois University, au
demonstrat c! este posibil! folosirea ribozimelor n acest mod.
n experien"a lor, Wong-Staal #i Hempel au izolat limfocite T de la pacien"ii
suferinzi de SIDA #i au transfectat celulele cu o secven"! de ADN modificat! genetic
care codific! o ribozim! capabil! s! recunoasc! #i s! scindeze ARNm al virusului
HIV. Gena ribozimei este plasat! n aval fa"! de un promotor puternic, care
garanteaz! transcrierea activ! genei. Testele indic! c! ribozima reduce de aproximativ
10. 000 ori cantitatea de virus produs! de celulele infectate de HIV n compara"ie cu
celulele ne-transfectate. Un punct la fel de important, este c! ribozima distruge
moleculele de ARN viral cu o eficacitate manifest!, f!r! a afecta moleculele de ARN
normale din celul!. Etapa urm!toare a proiectului o reprezint! punerea la punct #i n
practic! a unor teste clinice la scar! mic!, constnd n repunerea limfocitelor care
con"in o gen! pentru ribozim! n organismul pacientului din care provin celulele.
Speran"a pe care o avem este ca celulele transfectate s! fie rezistente la virus #i s!
protejeze sistemul imunitar al pacientului.
Scopul ultim al acestei terapii genice este introducerea unei ribozime care
distruge ARN n toate celulele organismului infectate de c!tre virus, #i s! nu se mai
limiteze la celulele care circul! n fluxul sanguin.
Ribozimele pot fi utile #i pentru a lupta contra anumitor tipuri de cancer care
au ap!rut ca urmare a inducerii unei muta"ii ntr-o gen! (sau o oncogen!) care codific!
pentru o protein! implicat! n reglarea diviziunii celulare. Aceste celule devin
maligne din cauza sintezei unui ARN diferit de cel pe care l produc celulele normale.
Este posibil! suprimarea st!rii maligne a celulei prin distrugerea ARN modificat,
sarcin! care poate fi realizat! de c!tre o ribozim!. S-a realizat izolarea celulelor
canceroase de vezic! de la om #i acestea au fost transfectate cu o gen! de aceea#i
m!rime care codific! pentru o ribozim! capabil! s! recunoasc! #i s! distrug!
moleculele de ARN transcrise de c!tre oncogena modificat!. n mod normal, celulele
maligne de vezic! sunt capabile s! produc! tumori cnd ele sunt injectate la #oareci de
laborator, dar celulele transfectate cu gena care codific! pentru ribozim! nu mai sunt
maligne #i nici capabile s! produc! tumori la animalul gazd!. Pentru a fi eficiente n
tratamentul cancerului, gena care codific! ribozima trebuie introdus! n toate celulele
unei tumori, ceea ce, a#a cum am ar!tat mai nainte, necesit! punerea la punct a
vectorului capabil s! elibereze gena n "esuturile interne ale organismului.