Determinarea microorganismelor din produsele

alimentare
Determinarea microorganismelor din produsele alimentare se poate face in mai multe
moduri; pentru diferite cazuri se utilizeaza anumite metode, in functie de tipul
microorganismului, al matricei (tipul produsului alimentar, rapiditatea , sensibilitatea
metodei si alte cerinte)
Sunt prezentate mai jos principalele tipuri de metode de determinare a
microorganismelor, avand la baza diferite principii si tehnici de lucru.
1. Determinarea numarului total de germeni
Se face in general prin urmatoarele tehnici de determinare:
- Standard plate count (SPC) numararea de colonii in placa Petri pentru
determinarea celulelor viabile
- Determinarea numarului cel mai probabil (most probable number-MPN) este o
metoda pentru determinarea statistica a celulelor viabile
- Reducerea colorantilor pentru estimarea germenilor cu proprietati reducatoare
- Numararea directa la microscop (DMC-direct microscop count) pentru cellule vii
si nevii
Numararea directa in placa (conventional standard plate count)
-portiuni din proba prelevate, omogenizate si diluate serial cu un diluent adecvat sunt
puse in placi Petri cu mediu corespunzator si incubate. Se determina numarul de unitati
formatoare de colonii UFC/ml sau gram proba. Trebuie avute in vedere:
- metoda de prelevare a probei
-distributia microorganismelor in proba
-natura biotei din aliment
-natura materialului alimentar
-adecvarea nutritionala a mediului utilizat
-temperatura de incubare si timpul
-pH, aw, potential ul redox al mediului
-tipul lichidului de dilutie
-numarul microorganismelor din proba
-existenta microorganismelor antagoniste
Mediul se poate turna cand este inca lichid peste proba si apoi se omogenizeaza sau se
poate pune proba pe suprafata mediului (ca de ex pentru stafilococul auriu cand se
pipeteaza 0,1 ml proba peste mediul solidificat in cutia Petri, uscat in prealabil) Se fac
probe replicate. Se pot utiliza medii de cultura selective (care permit cresterea unui
singur microorganism sau medii de cultura de diferentiere care determina cresterea
diferita a speciilor inrudite).
O etapa principala a acestui tip de metoda este omogenizarea probei. Pana in 1970
omogenizarea se facea cu blenderul steril. In 1971 Sharpe si Jakson au pus la punct
dispozitivul de omogenizare numit Stomacher, un aparat simplu in care proba se
introduce in pungi de plastic impreuna eventual cu lichidul de dilutie si se omogenizeaza
cu ajutorul a 2 palete exterioare, care lovesc punga cu proba si au eficienta unui
blender cu viteza mare. Acest tip de omogenizare are avantajul ca nu necesita
curatarea containerelor, pungile fiind sterile si de unica folosinta, nu incalzeste proba si
are un nivel scazut de zgomot.
Spiral Plater
Este un echipament mecanic care distribuie lichidul de inoculare pe suprafata unei placi
rotative continand un mediu agarizat, tare, adecvat. Bratul de dispersie se misca din
apropierea centrului placii spre margine, depunand proba in spirala. Seringa speciala
atasata disperseaza un volum continuu descrescator de proba astfel incat, pe o singura
placa se poate efectua o dilutie de 1:10 000. Dupa incubare, in centru exista o densitate
mai mare de colonii, descrescand progresiv spre capatul spiralei. Enumerarea coloniilor
se face cu un caroiaj (retea) special. Avantaje: mai putin mediu de cultura, mai putine
placi Petri, diluanti, pipette, proba. Dezavantajul principal este ca particule din proba pot
bloca sistemul de dispersie. Este o metoda folosita deci mai adesea pentru alimente
lichide. Deoarece este un echipament scump, este rentabil pentru laboratoare care
efectueaza multe analize.
Filtrare pe membrane
Membranele cu pori de 0,45sau 0,22 micrometri retin bacteriile dar permit apei sau
diluantului sa treaca. Se folosesc o serie de astfel de membrane din diferite material
pentru determinarea microorganismelor din apa de obicei , montate pe un dispozitiv de
filtrare, la baza unei palnii sterile din metal sau plastic. Dupa filtrare, filtrele se depun cu
penseta sterile pe suprafata mediului de cultura din placa Petri sau pe suprafata unui
material absorbant saturat cu mediul de cultura si se incubeaza. Coloniile care apar pe
suprafata membrane sunt numerate iar rezultatul se exprima ca UFC/ml.
Direct Epifluorescent Filter Technique
Aceasta tehnica cu filtru de membrana este o modificare a celei de mai sus si utilizeaza
coloranti fluorescent si un microscop cu fluorescenta, fiind o metoda rapida de
numarare. Proba omogenizata si diluata este filtrata pe un filtru de nylon cu pori de 5
micrometri iar filtratul este colectat si tratat cu 2 ml de Triton X-100 si 0,5 ml de tripsina,
pentru a liza celulele somatice si a preveni colmatarea filtrelor. Apoi filtratul este pe alt
filtru de 0,6 micrometri Nucleopore polycarbonate membrane si colorat cu acridin
orange, iar celulele sunt numarate la microscopul cu fluorescenta. Este o metoda
adaptata pentru lapte.
Microcolony DEFT
DEFT permite numararea directa la microscop, fiind o metoda prin care se determina
numarul de colonii viabile. Omogenatul alimentar este filtrate pe membrane DEFT care
sunt aplicate pe suprafata mediilor de cultura corespunzatoare si incubate pentru
dezvoltarea coloniilor (3 ore pentru bacteriile Gram negative si 6 ore pentru bacteriile
gram positive). Coloniile dezvoltate pot fi vazute la microscop sau prin colorare cu
acridin orange.
Hydrophobic Grid Membrane Filter (HGMF)
Aceasta metoda utilizeaza un filtru special care are 1600 de patratele pe o singura
membrana, putand fi detectate cel putin 10 celule/gram.
Pentru detectia fungilor se utilizeaza un mediu special continand 2 antibiotice
antibacteriene si colorantul trypan blue care da coloniilor o culoare albastra.
Microscope colony counts
Metoda are la baza numararea coloniilor care se dezvolta pe lame de microscop
acoperite cu mediu agarizat. De ex se imprastie 0,1 ml de lapte amestecat cu agar pe o
suprafata de 4 cm
2
pe o lama de sticla si dupa incubare se numara coloniile.
Metoda picaturilor de agar (metoda lui Sharpe si Kilsby)
Omogenatul este diluat in tuburi cu agar topit (45C), realizandu-se pentru fiecare proba
cate 3 tuburi. Dupa omogenizare, cu o pipeta sterile cu capilar (ideal avand cate
0,033ml pe picatura) se transfera 5x0,1ml picaturi pe fundul unei cutii Petri goale. Cu
aceeasi pipeta 3 picaturi (0,1ml) din primul tub se transfera in al doilea tub si dupa
omogenizare la fel in placa Petri. Se continua si cu al treilea tub . Placile Petri se
incubeaza 24 ore, sunt numarate coloniile cu obiectivul x10.

Dry film (Petrifilm)
Metoda utilizeaza un film uscat, rehidratabil. Dispozitivul consta in 2 filme din plastic sau
hartie lipite, unul din ele fiind acoperit cu un mediu de cultura uscat, continand un agent
de gelifiere solubil in apa rece. Intre cele 2 filme se pune 1 ml din proba diluata si se
inchide prin presare. Datorita utilizarii diferitilor coloranti, coloniile crescute dupa
incubare apar colorate si se poate determina numarul de ufc/ml. Este o metoda foarte
buna pentru microorganismele psihrotrofe.
Most probable number
Se prepara dilutii ale probelor, de obicei 3 serii de dilutii din care se pipeteaza in 9 sau
15 tuburi continand un mediu adecvat. In aceste tuburi, datorita multiplicarii celulelor are
loc o modificare a mediul care poate fi observata. In tuburile in care nu sunt cellule care
sa se dezvolte, mediul ramane in forma initiala. Numarul de cellule se afla utilizand
tabelul MPN (tabelul lui Mc Crady, care a introdus metoda in 1915). Este o metoda
statistica, improbabila. Avantaje: este simpla, pot fi numarate grupe specifice de
microorganisme, cel mai adesea fiind folosita pentru bacterii coliforme.
Reducerea colorantilor
Se introduce supernatantul din produsul alimentar peste solutia standard de colorant si
se observa modificare culorii. De ex, daca se utilizeaza albastrul de metilen, se observa
modificarea culorii de la albastru la incolor, timpul de reducere a colorantului fiind invers
proportional cu numarul de microorganism din proba. Se mai poate folosi resazurin
pentru probele de lapte, care isi modifica culoarea de la albastru-roz la incolor.
Principalul dezavantaj este acela ca nu toate microorganismele reduc colorantul in mod
egal.
Direct microscopic count (numaratoarea directa la microscop)
Se foloseste la examinarea starii de igiena a suprafetelor care vin in contact cu
alimentele. Principala problema este recoltarea unui procent semnificativ a microflorei
rezidente. Pentru numarare se folosesc o serie de dispositive cu caroiaj, cum este
camera Thoma.
Metoda prin utilizarea tamponului de sters
Recoltarea microorganismelor de pe suprafete cu un tampon este cea mai veche si mai
raspandita metoda atat pentru alimente, industria produselor lactate cat si pentru spitale
si restaurante. Se utilizeaza un tampon din bumbac, alginate de calciu sau alt material
cu care se sterge o suprafata cunoscuta de 1 cm
2
sau mai mult (10cm2). Suprafata se
poate sterge cu un tampon umed sau se pune pe suprafata un lichid steril si apoi se
sterge. Tamponul este apoi introdus in tubul lui continand un diluant corespunzator si
pastrat la frigider pana la analiza. Cand se utilizeaza tampoane de bumbac,
microorganismele trebuie dislocate dintre fibre. Daca se utilizeaza tampoane din
alginate de Ca, acesta este dizolvat cu hexa metafosfat de sodium. Microorganismele
se numara uzual, in placa.
Contact Plate
Utilizeaza placi petri special cu o suprafata ridicata acoperita cu agar, care este pusa in
contact cu suprafata. Dupa incubare se numara coloniile crescute. Metoda se preteaza
pentru suprafete netede, tari, neporoase. Nu se poate utilize pentru suprafete puternic
contaminate.
Metode fizice, chimice, moleculare si imunologice
Aceste metode au aparut dupa 1960, pentru estimarea numarului de celule sau a
cantitatii de produsi (metaboliti) celulari. Majoritatea metodelor se bazeaza pe
activitatea metabolica a microorganismelor pe anumite substrate, masurarea cresterii,
a unor parti ale celulelor (acizi nucleici).
Metode fizice
Metode bazate pe masurarea impedantei
Desi conceptul masurarii impedantei datorate cresterii microorganismelor a fost
imaginat inca din 1899 de G.N.Stewart, metoda a putut fi aplicata dupa 1970.
Impedanta este rezistenta intr-un circuit alternative, corespunzatoare rezistentei din
circuitul in current continuu. Cand microorganismele cresc in mediul de cultura, ele
metabolizeaza substrate cu conductivitate scazuta in produsi cu conductivitate
ridicata,sis cad astfel impedanta mediului. Prin masurarea impedantei se poate trasa o
curba de crestere reproductibila pentru anumite specii si tulpini si din culture mixte prin
utilizarea unor inhibitori specifici. Se pot detecta cel putin 10-100 celule, optim populatii
de 10
5
-10
6
celule in 3-5 ore.
Microcalorimetria
Aceasta metoda studiaza modificarile foarte mici de temperature din culture, eliberarea
de caldura masurata fiind in stransa legatura cu activitatile catabolice celulare. Exista 2
tipuri de microcalorimetrie: batch si flow (in flux). Rezultatele difera in functie de tipul de
microorganism, cantitatea de inocul, substratul fermentabil si altele.. Este o metoda
utilizata in special pentru drojdii, bacterii lactice (Lactobacillus, Leuconostoc,
Enterococcus). Se utilizeaza pentru studierea contaminarii in mancarea gatita, pentru a
detecta prezenta Staphilococcus aureus, pentru a estima bacteriile in carnea toccata.
Flow Citometria
Este tehnica de masurare a componentelor = cellule si proprietatile celulelor individuale
in suspensii lichide In esenta, celulele suspendate, una cate una sunt detectate la
trecerea in flux printr-un canal. La trecere se poate detecta fluorescent, absorbanta si
dispersia luminii. Celulele pot fi differentiate individual pe baza proprietatilor lor si pot fi
masurate de la 1 la 3 caracteristici celulare. Flow citometria utilizeaza mai multe surse
de excitare reprezentate de laseri cu argon, krypton sau heliu-neon si unul sau 2
coloranti fluorescent pentru a masura si caracteriza cateva mii de cellule pe secunda.
Cand se utilizeaza un colorant, spectrul spectrul sau in laser (spectru de emisie) trebuie
sa se potriveasca cu lungimea de unda a sursei de excitatie. Se pot utilize 2 coloranti
pentru a masura o combinative de AND-proteine. In acest caz, ambii coloranti trebuie
sa sufere o excitatie la aceeasi lungime de unda dar sa emita la lungimi de unda
diferite, astfel incat radiatia emisa sa fie masurata separate.
Prin aceasta tehnica au fost efectuate studii asupra celulelor mamiferelor, drojdiilor si
altele.
Metode chimice
Metoda cu nucleaza stabila
Se utilizeaza pentru detectarea Staphilococcus aureus coagulazo-pozitiv in numar
semnificativ in alimente (10
6
/gram) cu DNA-za termostabila. Acest lucru este posibil din
cauza corelatiei intre productia de coagulaza si nucleaza termostabila la S aureus, in
special la tulpinile producatoare de endotoxine.
Masurarea ATP
Adenozin trifosfatul este sursa primara de energie in toate organismele vii. El dispare
dupa 2 ore de la moartea celulelor, iar cantitatea pe celula este in general constanta,
avand valori de 10
-18
-10
-17
moli/celula bacteriana, ceea ce corespunde la 4x10
4
M
ATP/10
5
ufc bacterii. La PK, ATP in cresterea exponential este de regula 2-6nmoli
ATP/mg substanta uscata, in functie de modul de nutritie. O metoda simpla pentru
masurarea ATP este utilizarea sistemului luciferina-luciferaza. In prezenta ATP,
luciferaza emite lumina care este masurata cu un spectrometru de scintilatie in lichide
sau cu un luminometru. Cantitatea de lumina produsa este direct proportionala cu ATP.
Metode radiometrice
Detectia radiometrica a microorganismelor se bazeaza pe incorporarea unui compus
marcat
14
C pe care acestea il utilizeaza, de ex
14
CO
2
care este eliberat si poate fi
masurat. Pentru microorganismele care utilizeaza glucoza se utilizeaza
14
C-glucoza. De
asemenea se mai folosesc
14
C-glutamatul,
14
C-formiatul. Metoda a fost aplicata la
detectia S. aureus, Salmonella typhimurium, Clostridium botulinum.
Metode bazate pe utilizarea de substrate fluorogenice si cromogenice
Cele mai utilizate substrate care se introduc in mediile de cultura sunt:
-4-metil umberiferil-beta-D-glucuronid (MUG)
-4-metil umberiferil0beta-D-galactozud (MUGal)
-o-nitrofenil-beta-D-galactopiranozid (ONPG)
-L-alanina-p-nitroanilida (LAPN) si altele

Metode de analiza a ADN
TEHNOLOGIA PCR
PCR=Polymerase Chain Reaction=Reactia de polimerizare in lant, este o metoda de
amplificare enzimatica in vitro a unei anumite secvente ADN. Se utilizeaza in biologia
moleculara, mediu, criminalistica, medicina si epidemiologie, biotehnologie,
microbiologie, industria alimentara etc.
Reactia PCR este constituita din cicluri succesuve de replicare a ADN in vitro. Tehnica
foloseste 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaza cu cele 2 catene ale secventei
originale utilizata ca matrita. Reactiile de desfacere a dublului helix si cea de atasare a
primerilor nu sunt catalizate enzimatic (ca in vivo) ci prin parcurgerea unor trepte de
temperatura.
ADN dublu catenar matrita
! denaturare termica
ADN monocatenar
!
Atasarea primerilor
! polimerizare ADN polimeraza termostabila
2 molecule ADN d.c. identice cu molecula matrita
Pentru reactia PCR sunt necesare:
-ADN matrita
-ADN polimeraza termostabila
-primeri oligonucleotidici
-deoxi nucleotid trifosfat (dNTP)
-tamponul de reactie
-Ioni Mg
2+

Au loc 25-40 de cicluri, fiecare cu cate 3 etape:-denaturarea termica a ADN
-atasarea primerilor
-polimerizarea
Numarul de copii =y x 2
n

Prima oara tehnica PCR a fost realizata in 1985 de catre Kary Mullis.
Componentele reactiei
1. Matrita de ADN
2. Primerii oligonucleotidici contin intre 15-30 perechi de baze si sunt
complementari cu capetele 5 si 3 ale regiunii ce va fi amplificata. Se recomanda
ca cei 2 primeri sa aiba valori Tm (temperatura de denaturare) cat mai apropiate,
care sa permita temperaturi de atasare de 55-65 grade C. Primerii nu trebuie sa
fie complementari unii cu altii pentru a nu dimeriza. Un parametru important este
de asemenea temperatura de atasare (primer annealing temperature).
3. ADN polimeraza termostabila care este izolata din microorganisme termostabile,
fiind de mai multe tipuri, cea mai utilizata fiind ADN polimeraza din clasa Taq,
izolata din Thermus aquaticus (Taq pol).
4. Deoxi nucleotid trifosfati dATP, dGTP, dCTP, dTTP
5. Tamponul de reactie contine TRIS-hidroxi-aminometan si MgCl2 pentru
functionarea ADN polimeraza termostabila.
Reactia PCR are loc in mai multe etape:
1. Denaturarea ADN matrita. Pentru denaturarea completa este necesar ca ADN sa
fie mentinut 2 minute la 94-95 grade C. Rezulta matrita denaturata, adica ADN
separat in cele 2 catene complementare.
2. Atasarea primerilor . Temperatura de atasare a primerilor trebuie determinata si
optimizata fiind un factor critic. Daca temperatura este prea mare nu are loc
atasarea primerilor, iar daca este prea scazuta creste posibilitatea atasarilor
nespecifice.
3. Polimerizarea propriu-zisa are loc deci pornind de la primeri, in prezenta ADN
polimerazei, care leaga aproximativ 60 baze/secunda, la 72 grade C si a
nucleotid trifosfatilor. Acestia se leaga de matrita denaturata de ADN in prezenta
polimerazei. Se obtine un produs numit amplicon, detectabil prin electroforeza in
gel de agaroza. Numarul de cicluri pentru o rectie PCR obisnuita, pentru mai
putin de 10 molecule de matrita este mai mic de 40. La o crestere prea mare a
numarului de cicluri se pot acumula produsi de reactie nespecifici.
La sfarsitul unui ciclu, ambele catene ale ADN matrita vor fi copiate. Cand ciclul
din cele 3 etape se repeta rezulta 4 catene care vor fi apoi copiate rezultand 8
fragmente si apoi 16. Teoretic, 20 de cicluri vor produce aproximativ un milion de
copii ale ADN matrice. 30 de cicluri vor da un bilion de copii.




Electroforeza ADN
Dupa amplificarea ADN, fragmentele obtinute trebuie analizate printr-o metoda
adecvata, care sa permita si compararea lor cu alte fragmente de ADN, pentru a
stabili eventuale similitudini.
O tehnica folosita foarte frecvent este migrarea electroforetica a moleculelor de acizi
nucleici in gel de agaroza. Este o metoda standard pentru separarea, purificarea si
identificarea moleculelor de ADN.
Principiul metodei: la pH alcalin sau neutru acizii nucleici au sarcina electrica globala
negativa. Plasate in camp electric, moleculele de ADN migreaza la anod(+).
Protocol de lucru:
1.Tamponul de electroforeza care poate fi
TBE 1X continand TRIS 0,089M, acid boric 0,089, EDTA 0,002 pH
8,0-8,5 sau alte tipuri de tampon continand acid acetic sau acid fosforic.
2. Prepararea gelului gelul se distribuie intr-un strat de 3-4 mm grosime, cu o
concentratie de agaroza de 0,6-1%. Concentratia agarozei din gel variaza in
functie de marimea fragmentelor de ADN care trebuie separate. De obicei se
utilizeaza 1-3% agaroza sau 20% poliacrilamida.
3. Montarea electroforezei (in sistem submers, in placa verticala sau orizontala),
pregatirea si incarcarea probelor
4. Pornirea electroforezei.
In electroforeza moleculele de ADN se separa deoarece migreaza pe baza
diferentelor de sarcina si marime. In practica amestecul de fragmente de ADN
este plasat in niste orificii speciale din gel.
5. Colorarea gelului, de exemplu cu bromura de etidiu, care este un agent
fluorocrom determinand colorarea ADN in roz violet.








Masurarea concentratiei ADN si ARN cu lumina UV
Inelele aromatice ale bazelor azotate din ADN si ARN absorb lumina UV avand un
maxim la 260 nm. Daca o radiatie UV strabate o solutie continand acizi nucleici,
absorbanta depinde de concentratia acestora, fiind utilizata pentru masurarea
concentratiei. Proteinele absorb UV la 280 nm, datorita inelului aromatic al triptofanului.
Puritatea relativa a unui preparat continand ADN poate fi estimata prin masurarea
absorbantelor la 260 si 280 nm si facand raportul lor. ADN pur are acest raport de 1,8.
Daca sunt prezente proteine, raportul va fi mai mic, iar in prezenta ARN acest raport va
fi mai mare. ARN pur are raportul 2.
Marcarea radioactiva a acizilor nucleici
Diferite surse de ADN pot fi evidentiate prin adaugarea unui marker specific, de
exemplu prin incorporarea de radioizotopi. In biologia moleculara sunt utilizati mai des 2
izotopi radioactivi:
32
P si
35
S. Timpul de injumatatire pentru 32P este de 14 zile.
Cele mai utilizate 2 metode in biologia moleculara pentru masurarea radioactivitatii sunt
numaratorul cu scintilatie si autoradiografia.
Hibridizarea ADN
Dublul helix de ADN consta in doua lanturi de nucleotide incolacite impreuna si legate
prin legaturi de hidrogen intre bazele azotate. Daca o solutie de ADN este incalzita,
aportul de energie face ca moleculele sa vibreze iar legaturile de H se rup. La o anumita
temperatura cele 2 catene se separa complet. Procesul se numeste denaturare sau
melting. Temperatura de denaturare Tm a unei molecule de ADN este definita ca
temperatura corespunzatoare punctului de inflexiune de pe grafic. Denaturarea este
urmata de masurarea absorbantei in UV , avand in vedere ca gradul de dezordine
creste absorbanta in UV.



Daca ADN denaturat este apoi racit, catenele separate se vor uni pe baza de
complementaritate si vor forma ADN dublu catenar prin procesul numit annealing. ADN
trebuie sa fie racit lent pentru ca lantul polinucleotidic sa aiba timp sa se imperecheze
corect cu lantul complementar. Daca se utilizeaza 2 molecule diferite de ADN care se
amesteca, se denatureaza si sunt apoi racite, fiecare lant va recunoaste si se va
imperechea cu lantul complementar sau cu o portiune din acesta, care permite
imperecherea pe baza de complementaritate. Rezultatul va fi formarea de molecule de
ADN hibrid.


Southern blotting

Southern blotting este o tehnica in care proba de ADN este hibridizata cu o alta proba
de ADN. Daca se lucreaza cu o molecula mare de ADN cum este de exemplu
cromozomul, se poate alege o gena particulara, deci un anumit fragment din molecula
de ADN. Pentru inceput, fragmentul de ADN este taiat cu o enzima de restrictie si
separat prin gel electroforeza. Fragmentul dublu catenar este separat termic apoi in
cele 2 catene prin imersarea gelului intr-o solutie alcalina de hidroxid de sodiu.
Fragmentele de ADN sunt apoi transferate pe o membrana de nylon. In final aceasta
membrana este imersata intr-o solutie cu molecule de ADN marcate radioactiv. Proba
se va lega la fragmentele de ADN cu secvente similare in baze azotate. Daca proba se
hibridizeaza cu ADN de pe membrana de nylon, filtrul poate fi sau nu radioactiv si se
developeaza prin plasarea unui film fotografic peste membrana. Aparitia petelor negre
pe film reprezinta prezenta ADN hibrid. Tehnica este denumita dupa inventatorul ei,
Edward Southern

Northen bloting se refera la hibridizarea care utilizeaza ARN ca matrice si ADN ca
proba.
Western blotting nu utilizeaza hibridizarea acizilor nucleici ci a proteinelor. Proteinele
sunt separate pe gel, transferate pe o membrana si detectate prin cuplare cu anticorpii
corespunzatori sau alte metode.





PROTEOMICA
Intreaga colectie de proteine pe care un organism le produce este cunoscuta sub
numele de PROTEOM. PROTEOMICA se ocupa cu studiul proteomului sau al
proteinelor produse de un organism. Este o disciplina esentiala deoarece poate da
informatii despre functionarea genomului, altele decat cele obtinute din studiile ARN
mesager. Masuratorile nivelului de ARNm dau informatii despre dinamica expresiei
genelor, in timp ce proteomica prezinta ce are loc in momentul respectiv in celula.
Un amestec de proteine poate fi separat prin mai multe tehnici:

Separarea si purificarea proteinelor
Metode:
-fractionare cu sulfat de amoniu
-dializa
-separari cromatografice
-electroforeza
Electroforeza proteinelor

O tehnica importanta de separare a proteinelor este bazata pe migrarea proteinelor
incarcate in camp electric, proces numit electroforeza. Electroforeza este utilizata nu
atat pentru separarea proteinelor cat pentru analiza acestora, permitand estimarea
numarului diferitelor proteine dintr-un preparat proteic. De asemenea, electroforeza
permite determinarea unor proprietati ca punctul izoelectric si valoarea aproximativa a
masei moleculare.
Electroforeza proteinelor se realizeaza in general in gel de poliacrilamida care
actioneaza ca o sita moleculara, incetinind migratia proteinelor in functie de incarcarea
si masa lor moleculara. De asemenea, migrarea poate fi afectata si de forma proteinei.
Forta care determina migrarea proteinelor este potentialul electric E. Mobilitatea
electroforetica a moleculei este raportul =V/E=z/f, in care V este viteza, E potentialul
electric, z este sarcina electrica iar f coeficientul de frecare. Prin urmare, migrarea unei
proteine in gel este o functie a marimii si a formei acesteia.
O metoda electroforetica frecventa are la baza utilizarea detergentului dodecil sulfat de
sodiu (SDS=sodium dodecyl sulfate)

CH
3
(CH
2
)
11
-SO
4
-
Na
+
SDS leaga proteinele proportional cu masa lor moleculara, o molecula de SDS pentru
fiecare 2 resturi de aminoacizi. SDS determina deci o sarcina electrica negativa
proportionala cu masa proteinei, facand ca sarcina intrinseca a acesteia sa devina
neglijabila. In plus, conformatia nativa a proteinei este alterata, iar cele mai multe
proteine vor avea aceeasi forma. Prin urmare, electroforeza in prezenta SDS separa
proteinele numai pe baza masei lor moleculare. Polipeptidele cu masa mica migreaza
deci mai rapid. Dupa electroforeza proteinele vor fi vizualizate prin adaugarea unui
colorant cum este Coomassie blue, care se leaga de proteine dar nu si de gel. In gel
pot fi vizualizate proteinele separate sub forma de benzi colorate. Pozitia acestor benzi
da indicatii referitoare la masa moleculara a proteinei. Daca proteina are 2 sau mai
multe subunitati diferite, acestea sunt separate in general prin tratarea cu SDS si vor
aparea sub forma de benzi separate. Tehnica se numeste si SDSPAGE, de la initialele
SDS polyacrilamd gel electroforeza.











Focusarea izoelectrica (izoelectrofocusarea) este un procedeu folosit pentru
determinarea punctului izoelectric (pI) al unei proteine. De-a lungul gelului se stabileste
un gradient de pH cu ajutorul unui amestec de acizi si baze organice cu masa
moleculara mica (amfoliti) distribuiti in campul electric din gel. Cand se aplica amestecul
de proteine, fiecare proteina migreaza pana la un pH egal cu punctul sau izoelectric,
fiind astfel distribuite diferit in gel. Combinand focusarea izoelectrica cu electroforeza
SDS in procedeul numit electroforeza bi dimensionala, se pot separa amestecuri
complexe de proteine, aceasta fiind o metoda analitica mai sensibila decat electroforeza
simpla. Prin electroforeza bi dimensionala se separa proteine cu masa moleculara
identica ce difera prin pI sau proteine cu pI similar dar cu mase diferite.























Anticorpi fluorescenti si teste de imunofluorescenta
Proprietatea unor coloranti ca fluoresceina si rhodamina de a emite radiatie luminoasa ca raspuns la iradierea UV are
numeroase aplicatii in imunologia de diagnostic. Tehnica de imunofluorescenta utilizeaza anticorpi monoclonali
fluorescenti. In testarea directa, un specimen necunoscut de antigeni este expus la o solutie de anticorpi fluorescenti
cunoscuti. Daca anticorpii sunt complementari cu antigenii, ei se vor lega. Dupa clatirea placii pentru indepartarea
anticorpilor neatasati, preparatul se observa cu microscopul cu fluorescenta. Celulele fluorescente indica prezenta
complexelor Ab-Ag (anticorpi-antigeni) ca rezultat pozitiv. Tehnica este utilizata pentru detectia unor boli ca
sifilisul, legioneloza, meningita, listerioza etc.
Acest tip de metode sunt utilizate in testatrea sportivilor, in criminalistica si altele pentru determinarea urmelor de
substante ca hormoni, metaboliti si droguri.
Tehnica de radioimunodetectie anticorpii sau antigenii marcati cu un izotop radioactiv pot fi utilizati pentru
detectarea unor cantitati mici de antigeni si anticorpi corespunzatori cu care sunt complementari. Tehnica compara
radioactivitatea prezenta intr-o proba inainte si dupa incubarea cu un anticorp sau antigen cunoscut marcat
radioactiv. Radioactivitatea finala se masoara cu un contor de izotopi radioactivi sau cu ajutorul unei emulsii
fotografice (autoradiografie).

Tehnica ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Testul ELISA utilizeaza un complex enzima-anticorp care are rol de colorant in reactiile antigen anticorp. Cele mai utilizate
enzime sunt peroxidaza din hrean si fosfataza alcalina, a caror reactie de hidroliza a substratului determina producerea unui
compus colorat care poate fi detectat. Tehnica se bazeaza pe adsorbtia reactantilor pe suprafata unui suport din plastic. Tehnica
se poate aplica in testele directe sau in cele indirecte.


In tehnica ELISA directa, sau tip sandwich, un anticorp cunoscut este absorbit pe suprafata unei adancituri si apoi incubat cu o
solutie continand un antigen necunoscut. Dupa spalarea excesului de compusi nereactionati se adauga un indicator enzima-
anticorp care poate reactiona cu antigenul, daca acesta este prezent. Daca antigenul este prezent, el va atrage indicatorul ce
contine anticorpul si il va lega la locul respectiv. Apoi substratul enzimei va fi adaugat in adancitura si preparatul va fi incubat.
Reactia dintre enzima si substrat va elibera un compus colorat care va reprezenta rezultatul pozitiv. Absenta culorii inseamna ca
antigenul nu este prezent.

Testul ELISA indirect poate detecta anticorpi in probe de sange. Ca si in testul direct, anticorpul indicator este complexat cu o
enzima care produce o modificare de culoare in serul pozitiv. Reactivul de start este un antigen cunoscut care este absorbit pe
suprafata unei adancituri din placa de test. La acesta se adauga un ser sanguin necunoscut . Dupa clatire, se adauga un reactiv
enzima-anticorp si apoi substratul enzimatic. Se urmareste modificarea culorii din adancitura. Colorarea indica faptul ca reactia
antigen0anticorp are loc, deci anticorpii sunt prezenti in serul pacientului. Metoda se foloseste pentru testul HIV, detectia
diferitelor specii de rickettii, Salmonella, vibrionul holerei etc.