Tema lucrarii:

Determinarea carotenoidelor din legume si fructe cu ajutorul metodei cromatografice

Argument:
Am ales aceasta tema deoarece carotenoidele este una din cele mai importante clase de
pigmenti vegetali care prezinta efecte protectoare atat la nivelul tesuturilor vegetale cat si
a celor animale.

Pigmentii vegetali sunt substante naturale care determina culoarea florilor,
fructelor,frunzelor, polenului, tuberculilor si altor organe si tesuturi ale plantelor. Ei au
roluri biochimice si fiziologice foarte importante. Iau parte la numeroase procese
metabolice si formeaza sisteme de oxido,reducere.
Carotenoidele fac parte din clasa pigmentilor neazotati si datorita dublei legaturi
imprima tesuturilor in care apar o culoare rosie,galbena, portocalie sau chiar albastra,
intensitatea culorii crescand cu gradul de nesaturare.
Au rol in fotosinteza, respiratie, fototropism, in transferul energiei absorbite la
clorofile, fotoprotectie, s.a.
Pigmentii carotenoidici reprezinta sursa naturala din care omul si animalele pot
sintetiza vitaminele A, care au un rol important in formarea pigmentilor fotosensibili
implicati in procesul vederii, in cresterea si dezvoltarea organismelor, protectia si
refacerea tesuturilor epiteliale.
Clasificarea carotenoidelor:
In functie de structura lor chimica, carotenoidele se clasifica astfel
hidrocarburi carotenoidice, alcatuite numai din carbon si hidrogen ex alfa! , beta!
caroten, licopina, neurosporen, fitoen, fitofluen etc"#
derivati oxigenati ai carotenoidelor, numite si xantofile, ce cuprind esteri,
eteri,glicozizi, epoxizi, ceto, si aldocarotenoide, acizi carotenoidici, carotenoide
acetilenice, alenice, cu pentaciclu si cu cicluri aromatice.
In functie de numarul atomilor de carbon din molecula, se poate face o alta
clasificare, si anume$
cu %&,'& atomi de carbon in molecula apocarotenoide"#
cu (& atomi de carbon in molecula diapocarotenoide"#
cu '& atomi de carbon carotenoide C'&"#
cu mai mult de '& atomi de carbon C') si C)&*homocarotenoide sau
carotenoide superioare"
Structura chimica
Pigmentii carotenoidici sunt o clasa aparte de pigmenti vegetali, de culoare galben!
portocaliu cu structura generala de tip$

Carotenoidele cu '& atomi de carbon in molecula reprezinta cea mai importanta clasa a
acestor pigmenti. +iind alcatuite din unitati izoprenice, pot avea ,, -& sau -- duble
legaturi conjugate
.e cunosc aproximativ /&& carotenoizi, dintre care cel mai rasp0ndit este beta!
carotenul,pigmentul de culoare portocalie al morcovilor Daucus Carota". +oarte
rasp0nditi sunt si alfa! si gama!carotenul, criptoxantina, licopenul, zeaxantina si mai ales
luteina
Din totalul carotenoizilor morcovii contin 1& 2 beta!caroten, iar pepenii galbeni 3) 2
beta!caroten. El este 4n general rasp0ndit 4n frunzele si algele verzi, fiind 4nsotit
4ntotdeauna de luteina, zeaxantina si cantitati mici de alfa!caroten.
5icopenul se afla 4n cantitate mare 4n tomate 3) 2 din totalul carotenoizilor", 4n pepenii
verzi 3- 2", precum si 4n grapefruitele rosii, piersici si macese. carora le confera
culoarea rosie, ultimele av0nd si multa rubixantina. 6erdeturile si toate legumele verzi
sunt bogate 4n luteina, alaturi de alti carotenoizi. +oarte multa luteina se gaseste 4n varza
de frunze, 4n spanac -& mg 2", ardei 1 mg 2", c0t si 4n frunzele de patrunjel p0na l -&
mg 2".
Alfa!carotenul si criptoxantina se gasesc de asemenea 4n fructele de culoare oranj sau
galbena, cum sunt portocalele, mandarinele, porumbul, dovleacul si semintele de dovleac,
ardeiul rosu, dar 4n special 4n uleiul de palmier p0na la '& 2". Porumbul este bogat 4n
special 4n zeaxantina, iar faina de lucerna este bogata 4n carotenali. De obicei, vegetalele
verzi contin cu at0t mai multi carotenoizi, cu c0t sunt mai intens colorate 4n verde 4nchis.
.i intensitatea culorii fructelor si legumelor este corelata direct proportional cu proportia
de carotenoizi
Extractia din tesuturile plantelor superioare
Pentru tesuturile plantelor superioare se cunosc o multitudine de metode de extractie,
in continuare fiind prezentate doua, ce constituie variante simplificate ale metodei
generale de extractie
Metoda I
7aterialul vegetal este maruntit foarte fin din considerentele aratate mai sus" si
omogenizat cu acetona, timp de -,% minute, in atmosfera de azot. 8mogenatul este filtrat,
iar reziduul este supus extractiei ulterioare cu acetona, pana cand omogenatul devine
incolor.
Extractele acetonice se reunesc si se concentreaza la volum mic prin evaporare la
rotavapor. Peste extractul acetonic se adauga un volum egal de eter etilic proaspat distilat,
omogenizand amestecul si spalandu,l apoi cu o solutie de 9aCl pentru ca eterul etilic sa
se indeparteze usor si pentru a se evita emulsionarea amestecului", pana la indepartarea
completa a acetonei.
Metoda II
Aceasta metoda este utila in cazul in care se lucreaza cu cantitati mici de substanta.
:esutul este maruntit si triturat cu 9a%.8' anhidru, pana se obtine o pudra foarte
fina, care este apoi supusa extractiei cu acetona, urmata de eter etilic Extractul se
centrifugheaza,precipitatul obtinut extragandu,se in continuare pana la incolor, solutiile
supernatante reunindu,se si concentrandu,se, transferandu,se apoi intr,un volum egal de
eter etilic, ca si in cazul metodei I.
Pentru ambele metode este necesara saponificarea, care permite indepartarea
substantelor balast, mai ales a clorofilei, si hidroliza esterilor xantofilei.
.aponificarea se realizeaza prin adaugarea de ;8< -)2 peste extract -$-&, v=v".
Aceasta saponificare se poate realiza in doua moduri$, incalzirea amestecului alcalin timp
de -&,-) minute pe baie de apa, in atmosfera de azot,la intuneric#, pastrarea la
temperatura camerei sau la )&C, la intuneric, timp de -&,-) ore
Extractia din alge:
In cazul extractiei carotenoidelor din alge nu se mai aplica metoda generala
prezentata mai sus, datorita faptului ca, pentru o extractie eficienta, este necesara o
disruptie mecanica sau un pretratament. De asemenea, extractia carotenoidelor din
alge se realizeaza cu solventi mai polari decat acetona etanol sau amestec
acetona$etanol", datorita faptului ca au polaritate mare si permit efectuarea saponificarii
pe extractul initial. Pretratamentul poate consta in suspendarea algelor in apa distilata
si racirea timp de ),3 ore inaintea extractiei propriu,zise, apoi extractia cu metanol. >n
alt pretratament consta in decolorarea preliminara cu vapori de apa sau tratarea cu apa
fierbinte, timp de %,( minute, apoi racirea rapida cu gheata. Acest ultim procedeu
inlesneste extractia carotenoidelor, dar are si un inconvenient, si anume posibilitatea
distrugerii enzimelor care actioneaza asupra carotenoidelor si clorofilelor. Pentru o
izolare eficienta a carotenoidelor din alge, acestea pot fi supuse uscarii, desi, prin acest
procedeu, unii compusi pot suferi modificari, si pot exista diminuari ale randamentelor de
extractie
Metode de separare:
7etodele de separare se aleg in functie de proprietatile si fizice si chimice ale
substantelor ce urmeaza a fi separate.
>na dintre aceste metode ar fi$
Cromatografia
Cromatografia este o metoda fizica de separare bazata pe distributia componentelor
dintr!un amestec intre doua faze$ una fixa, denumita faza stationara, si alta mobila, ce
strabate faza stationara.
+aza stationara poate fi un adsorbant solid cromatografie de adsorbtie", un lichid
depus pe suprafata unui suport solid cromatografie de repartitie", un schimbator de ioni
cromatografie prin schimb ionic" sau un gel cromatografie prin excluziune sterica".
a. Cromatografia de adsorbtie
In cromatografia de adsorbtie un curent de lichid provoaca migrarea diferentiata pe
coloana a constituientilor unui amestec, pornind de la o zona initiala, intr!un mediu poros
care are proprietati de adsorbtie.
b. Cromatografia de repartitie
In cromatografia de repartitie, faza fixa poate fi$
!apa sau solutie tampon
!solvent organic mai putin polar decat apa
!solvent mai putin polar decat solventul fazei mobile

c. Cromatografia de schimb ionic
.chimbatorii de ioni sunt mase poroase fin divizate constituite din polimeri sintetici
sau naturali insolubili care au grupari ionizabile acide !C88<, !.8?< " sau bazice
amoniu cuaternar, amine tertiare, secundare sau uneori chiar primare ".
Separarea prin metode cromatografice
Pentru separarea carotenoidelor sunt foarte utilizate metodele cromatografice, atat
cea in strat subtire, cat si cea pe coloana.
Este cea mai importanta metoda de separare a carotenoidelor, si a fost inlocuita recent
cu cromatografia in strat subtire prin caracteristicile sale de adsorbtie.
Aceasta metoda este utilizata prin imbunatatirea ei odata cu descoperirea
cromatografiei in faza lichida de inalta performanta, metoda care prezinta avantajele
utilizarii cantitatilor mici de substanta si vitezei de separare mari, dar limitata la o
anumita scara, neputand fi utilizat@ in scopuri preparative
In functie de natura carotenoidului se vor alege adsorbantul si solventul de developare
adecvat.
Dintre adsorbantii utilizati in cromatografia pe coloana pentru separarea
carotenoidelor, pot fi amintiti$
celuloza,
Ca8<"%utilizat mai ales la separarea hidrocarburilor carotenoidice"
zaharoza,
Amidon
.ilicagel
Al%8( folosit la separarea monohidroxicarotenoidelor",
CaC8(
7g8 acestia fiind utilaizaAi la separarea carotenoidelor cu polaritate
intermediara, cum este cazul xantofilelor
.olventii utilizati in cromatografierea pe coloana a carotenoidelor sunt eluanti slabi.
De obicei se lucreaza cu amestec de solventi, cum ar fi$
acetona
eter etilic
etanol,eter etilic
acetat de etil
benzen
Adsorbantul trebuie sa fie foarte bine compactat in coloana, din acest motiv umplerea
coloanei realizandu,se cu portiuni mici de adsorbant ce trebuie apoi tasat. Extractul
carotenoidic trebuie sa fie foarte concentrat pentru a se putea adauga in coloana o singura
data. Dupa ce amestecul de pigmenti a fost introdus in coloana, se incepe developarea cu
solventi diferiti, incepand cu cel mai nepolar.
In cromatografia pe coloana se disting trei procedee de baza pentru separarea
carotenoidelor, si anume
a" cromatografia in zone#
b" b" cromatografia elutiei in trepte si
c" cromatografia elutiei in gradient.
Concluzii

In perioada actuala, cand pe plan national si international se pune un accent deosebit
pe valorificarea superioara a plantelor de cultura si a celor din flora spontana, a surselor
naturale in general, in functie de compozitia lor chimica, cunoasterea substantelor
biologic active se impune ca o cerinta de prima marime. 9umai prin cunoasterea
compozitiei chimice a plantelor, a mecanismelor biochimice ce stau la baza fenomenelor
biologice se vor putea obtine hibrizi noi de plante, cu continut ridicat in substante
biologic active, care maresc valoarea biologica a plantelor in care se gasesc.
Pentru stabilirea formulei moleculare, a structurii moleculare si a proprietatilor
fizico,chimice a unui compus biologic activ, este necesara mai intai izolarea lui din
amestecul de compusi naturali.
7etodele de extractie a compusilor biologic activi se aleg in functie de proprietatile
compusilor supusi extractiei. Extractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza
cu solventi organici nepolari eter etilic, cloroform", prin macerare, agitare mecanica sau
prin refluxare pe baia de apa in fierbere, impunandu,se un grad de maruntire avansat,
datorita faptului ca solventul nepolar nu patrunde prin membrana celulara pentru a
dizolva carotenoidele
7etodele de separare se aleg de asemenea in functie de proprietatile fizice si
chimice ale substantelor ce urmeaza a fi separate.
Dintre metodele utilizate frecvent la separarea carotenoidelor, o importanta
deosebita o prezinta metodele cromatografice, atat pe coloana cat si in strat subtire,
precum si separarile prin repartitia lichid,lichid si prin metoda distributiei contracurent.
Pentru identificarea carotenoidelor se pot utiliza atat metodele chimice cat si
metodele spectrale, care prezinta avantajele aplicabilitatii largi, sensibilitatii ridicate
reproductibilitatii perfecte a rezultatelor, conservarii integritatii probei si rapiditatii
determinarilor. Dintre metodele spectrale utilizate in detectarea carotenoidelor se pot
aminti spectroscopia in vizibil, IB, B79, spectrometria de masa.
Pentru dozarea carotenoidelor, metoda generala utilizata este metoda spectrofotometrica,
conditia esentiala fiind ca pigmentii sa fie de puritate analitica.