Metode de determinare a puritatii si concentratiei acizilor nucleici

Pentru a putea utiliza probele de acizi nucleici in diversele experimente, acestea trebuie
purificate si apoi determinate concentratia si gradul de puritate a acestora. Evaluarea puritatii si
a concentratiei de acizi nucleici din diferite probe se poate realiza prin mai multe metode, din
care le amintim pe urmatoarele:

1. Absorbtia razelor ultraviolet
Aceasta metoda este cea mai des utilizata, dar si cea mai simpla. Pentru a folosi aceasta
tehnica este nevoie de: un spectofotometru echipat cu lampa UV, cuve de cuart transparente
pentru razele UV si o solutie de ADN purificat. Citirea are loc la 260 nm, valoare la care ADN-ul
absoarbe lumina cel mai puternic, iar numarul generat permite sa se estimeze concentratia de
ADN. Masuratorile spectofotometrice sunt cele mai precise in gama 0.1-1.
Masurarea spectofotometrica a concentratiei de ADN genomic se bazeaza pe ecuatia
Beer-Lambert care defineste relatia liniara dintre absorbtie si concentratie. Probele sunt diluate
corespunzator, absorbtia este masurata cu ajutorul unui spectofotometru, iar ea este utilizata
apoi pentru a calcula concentratia ADN-ului din solutie.
Concentratia ADN-ului poate fi masurata prin ajustarea masuratorii la A260 cu
turbiditatea (masurarea de A320), inmultirea cu factorul de dilutie si folosind relatia urmatoare:
1.0 la A260= 50/ml.
Concentratia (g/ml)=(A260-A320)*factorul de dilutie*50g/ml
Concentratia totala este obtinuta prin multiplicarea concentratiei de ADN cu volumul
total al probei (in ml).
Concentratia ADN(g)= concentratia ADN* volum proba(ml)
Raportul A260/A280 poate fi utilizat ca o metoda de determinare a puritatii ADN-ului.
Un raport intre 1,7 si 2 este general acceptat ca un reprezentant al unui esantion de ADN de
inalta calitate. Raportul poate fi calculat dupa scaderea rezultatului obtinut la citirea la 320
nm, aceasta citire realizandu-se datorita faptului ca la aceasta valoare razele UV sunt absorbite
de substante care nu sunt acizi nucleici.
Puritatea ADN (A260/A280)= (citirea la 260 nm- citirea la 320 nm)/(citirea la 280 nm-
citirea la 320 nm)
Totusi, ADN-ul nu este singura molecula care poate absorbi razele UV la 260 nm. ARN-ul
absoarbe bine razele la 260 nm, iar aminoacizii aromatici prezenti in proteine absorb razele UV
la 280 nm, acestea putand contamina proba si contribuind la masuratorile ce au loc la 260 nm.
Mai mult decat atat, prezenta guanina in proba va mari absorbtia la 260 nm.
Pentru a evalua puritatea ADN-ului la spectofotometru se masoara absorbanta de la 230
nm pana la 320 nm pentru a detecta alti contaminanti prezenti in solutia de ADN.
In urma citirii la 260 nm si la 280 nm, un raport care sa indice o puritate buna trebuie sa
ia valori intre 1,7 si 2. Un raport cu o valoare de 1,6 nu face ca ADN-ul sa fie impropiu de utilizat
pentru orice aplicatie, dar raporturi mai mici indica faptul ca exista mai multi contaminanti.
O absorbtie puternica la 230 nm indica ca in solutia de ADN purificat exista substante
organice sau saruri. Raportul dintre absorbtia la 260 nm si la 230 nm poate ajuta la evaluarea
cantitatii de saruri din solutie. Cu cat raportul este mai mare, cu atat cantitatea de guanina este
mai mare, spre exemplu.
Procedeu:
1. Se dilueaza probele inainte de masurare (daca este necesar). Probele trebuie sa fie
diluate pentru a da o citire in intervalul linear al instrumentului utilizat. De obicei este
recomandata o dilutie de 1:10. Volumele masurate in spectofotometru vor depinde de
formatul si cerintele minime de volum al instrumentului utilizat. Cuantificarea poate fi
afectata de solventul utilizat pentru a dilua ADN-ul inainte de masurare, de aceea se
recomanda utilizarea tamponului TE( 10 mM Tris [ph 7,5], 1 mM EDTA [ph 8]).
2. Se mixeaza probele la vortex ori se pipeteaza de cateva ori.
3. Se pregateste spectofotometrul pentru citirea la 260 nm, 280 nm si 320 nm.
4. Se clateste o cuva de cuart cu apa distilata si se sterge pentru a inlatura excesul de apa.
5. Se adauga tamponul TE in cuva si se citeste la spectofotometru.
6. Se clateste cuva de 2-3 ori cu apa distilata si se usuca. Se citesc toate probele, clatindu-
se cuva dupa fiecare citire.

2. Electroforeza cu gel de agaroza
Electroforeza cu gel de agaroza a acizilor nucleici elimina problemele acociate citirii la
spectofotometru. Pentru a utiliza aceasta metoda sunt necesare: un rezervor orizontal cu gel de
electoforeza cu sursa de alimentare externa, o agaroza cu un grad analitic, un tampon adecvat
(ex: 1*TAE) si un colorant. Colorantul trebuie sa aiba standarde de dimensiune pentru ADN.
ADN-ul purificat este pus in gelul de agaroza, apoi este expus unui camp electric.
Fragmentele de ADN incarcate negativ migreaza catre anod. Fragmentele mici migreaza repede,
astfel incat ADN-ul este separate dupa dimensiune. Procentul de agaroza din gel va determina
gama de dimensiuni care vor fi vizibile cu cea mai mare claritate. ARN-ul, nucleotidele si
proteinele din proba vor migra diferit fata de ADN , astfel incat benzile de ADN vor fi pure.
Concentratia si puritatea pot fi determinate prin compararea intensitatii probelor de ADN
cu o cuantificare standard. De exemplu, daca o proba de 2 l de ADN nediluat incarcat in gel de
agaroza are aproximativ aceeasi intensitate ca 100 mg standard, atunci concentratia solutiei
este de 50 ng/l. Standardele utilizate pentru stabilirea concentratiei trebuie sa aiba aceeasi
dimensiune ca esantionul utilizat.
Pentru a vizualiza ADN-ul in gelul de agaroza este necesara colorarea acestuia cu un
colorant, ca de exemplu bromura de etidiu. Deoarece bromura de etidiu este un factor
mutagen, trebuie luate masuri de precautie pentru utilizarea corecta a acestuia si apoi pentru
eliminarea lui din proba.
Se recomanda separarea ADN-ului genomic intr-un gel de agaroza cu concentratia 0,4-0,5%
la 1,5V/cm pentru 12-24 ore. Gelul trebuie manuit cu grija,deoarece un procent mic de agaroza
formeaza un gel moale. Pentru a reduce aceste problem, un strat subtire de gel cu o
concentratie de 0,8% poate fi pus ca suport si ofera gelului ce va fi pus deasupra o anumita
stabilitate. Pentru a vizualiza ADN-ul, bromura de etidiu poate fi adaugata direct in gel sau gelul
poate fi colorat dupa electoforeza ADN-ului cu bromura de etidiu sau albastru de metil.




3. Electroforeza cu geluri poliacrilamidice
Gelurile poliacrilamidice sunt geluri formate prin reactia acrilamidei cu un agent de
reticulare bifunctional, cum ar fi N, N metilenbiacrilamida (BIS). Compozitia acestui gel este
data de T% (concentratia totala de acrilamida si agent de reticulare (w/v)) si C% (procentul de
agent de reticulare din T%). Aceste geluri sunt polidisperse in structura, deoarece BIS se
polimerizeaza cu el insusi mai repede decat cu acrilamida. Din acest motiv gelurile
poliacrilamidice contin mai multi agenti de reticulare, nodurile bogate in BIS legandu-se slab
prin agenti de reticulare si relativ prin multe fibre acrilamidice.
Pentru a alege concentratia de acrilamida din gel putem utiliza urmatorul tabel:

Concentratia de acrilamida Rezolutia optima pentru ADN (bp=perechi de baze)
3,5 1000-2000 bp
5 80-500 bp
8 60-400 bp
12 40-200 bp
15 25-150 bp
20 6-100 bp

Procedura este utila pentru separarea fragmentelor mici, a unor cantitati mici de ADN sau
pentru aplicatii in care este necesara o mai mare rezolutie decat cea atinsa cu gelul de agaroza.
Deoarece este foarte dificil de extras ADN-ul din gelul de poliacrilamida, este recomandat ca
acest protocol sa se utilizeze doar pentru diagnosticare si nu pentru separarea pe marimi a
fragmentelor folositoare.

4. Folosirea colorantilor fluorescent
Colorantii fluorescenti care se leaga de ADN ajuta la compara esantionul necunoscut cu o
curba standardizata, ADN-ul genomic, fragmentele de ADN sau ADN-ul plasmidial necesitand
propriile curbe standard si nu pot fi utilizate alternative.
Daca proba de ADN a fost diluata, va trebui sa se tina cont de factorul de dilutie atunci cand
se va calcula concentratia finala.
Colorantii PicoGreen sau Hoechst leaga selective ADN-ul dublu catenar. Pentru a utiliza
aceasta metoda sunt necesare: un fluorometru care sa detecteze colorantii, solutia de ADN
diluata si standardele de ADN specifice. Totusi, exista anumite restrictii: ADN-ul trebuie sa aiba
cel putin 1000 baze in lungime pentru colorantii Hoechst sau cel putin 200 de perechi de baze
pentru PicoGreen pentru ca cuantificarea sa se realizeze cu success.
Gama de masurare este de 10-250 ng/ml pentru colorantii Hoechst si 25 pg/ml - 1g/ml
pentu PicoGreen.