UNIVERSITATEA DE STIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINARA

CLUJ-NAPOCA
INTRODUCERE
Antibiotice i antibactericide
Termenul de antibiotic este folosit pentru o gam larg de compui att naturali ct i
semi-sintetici, care au efect antibacterian.
Antibioticele se impart n cinci clase: peniciline, tetracicline, macrolide, aminoglicoze i
amfenicoli. ulfoaminele, nitrofuranii si c!inolonele nu sunt antibiotice n ade"ratul sens al
cu"ntului pentru c sunt sintetice.
Aceti compui sunt utilizate de mul#i ani n tratementul bolilor animalelor productoare
de carne, lapte i ou. $e asemenea au mai fost folosi#i i pentru pre"inerea anumitor boli, dar
i pentru accelerarea creterii.
%egisla#ia &niunii 'uropene pri"ind utilizarea antibioticelor
(entru prote)area snt#ii consumatorilor &niunea 'uropean a stabilit limite ma*ime
pentru rezidurile de produse medicamentoase n #esuturile animaliere pro"enite. Aceste limite
au se ncadreaz ntre factori de +,-+,, pentru a asigura o !ran lipsit de reziduri noci"e.
Anumite antibiotice au fost interzise pentru animalele productoare de carne, lapte i
ou.
trategii analitice pentru determinarea rezidurilor de antibiotice
%a ora actual e*ist pu#ine metode capabile s msoare concentra#iile de antibiotice la
limitele impuse de &' pentru c unele antibiotice nu sunt solubile n sol"en#i organici, ceea ce
a ngreunat e*tragerea rezidurilor #i stabilitrea concenta#iilor lor din #esuturi. Alte antibiotice
nu sunt suficient de "olatile sau sunt prea instabile la temperaturi nalte pentru a permite
analiza lor folosinr -. sau -.-/. Astfel multe din metodele de msurare a rezidurilor de
antibiotice se bazeaz pe 0(%.. .u toate acestea 0(%. nu este o metode suficient de
specific pentrua fi utilizat ca referin# n &'.
PENICILINE
(enicilinele 1fig +,2-acidul 3-aminoampicilinic sunt administrat animalelor productoare
de carne, lapte i ou din moti"e terapeutice dar i prolifice. /anipularea catenei laterale fost
4
a modificat spectrul antibacterian al penicilinei pentru a include att bacteriile gram-poziti"e,
ct i cele gram-negati"e.
5 gam larg de procedee %.-/ a fost aplicat pentru analiza penicilinei n #esuturi,
dar i n lapte. -au nregistrat metode care folosesc att ioni poziti"i, ct i ioni negati"i.
.ompara#ia acestor metode n ceea ce pri"ete sensibilitatea este dependent de instrumentele
folosite, dar i de te!nicile de ionizare.
&n numr mare de cercettori au folosit metoda cu ioni poziti"i. /ecanismul de
fragmentare presupune desc!iderea inelului 6-lactam, urmat de !idratarea i pierderea
dio*idului de carbon.
7n +898 T:cz;o<s;a et al. a aplicat %.-/ la penicilina - n laptele de bo"in. %aptele
a fost diluat cu un "olum ec!i"alent de acetonitril-metanol-ap 1 =,:4,:4,, ">">"2 pentru ca
proteina s precipite. $up aceea a fost centrifugat. (entru msurare s-a folosit un
spectrometru de mas ?innigan /at =9,,. istemul %. consista dintr-un cartu @ro<nlee
(!en:l p!eri-A cu faz mobil de izopropanol ,.4/, acetat de amoniu i acid acetic
1 +4.A:9A.A:4, ">">"2. %5$-ul a fost +,, Bg>l bazat pe monitorarea ionului C/D0E
D
la m>z FFA
i C/D0D0
4
5-.5
4
E
D
la m>z F,8.
Go:;sner et al. a dez"oltat aceast metod aplicnd-o i pentru clo*acilin, ampicilin i
amo*acilin n laptele de bo"in. (entru a optimiza sensibilitatea metodei pentru amo*icilin
s-au monitorizat ionii C/D0E
D
la m>z F33 i C?D0E
D
la m>z 4,H datorit abundan#ei de ioni
C/D0D0
4
5D.5
4
E
D
la F=,. %5$-urile au fost estimate la +,,, 4,,, 4,, Bg>l. n timp ce al#i
cercettori au folosit %.-/ pentru confirmare, linearitatea a fost ob#inut cu coeficien#ii de
corela#ie de ,.8883. .ompara#ia fcut ntre ni"elele de clo*acilin din lapte determinate cu
%.-&G i %.-/ a demonstrat apropierea rezultatelor.
%.-/ a fost folosit mpreun cu detectarea &G de @oison et Al. pentru a confirma
prezen#a penicilinei n lapte. $up precipitarea proteinei probele au fost aplicate unui cartu
@ond 'lut .
+9
(' din care penicilinele au fost eluate cu aceto-nitril ,.,+4A / i acetat de
amoniu 13,:=,, ">"2. epararea %. a fost ob#inut folosind o coloan Io"a-(a; .
+9
cu faz
mobil de acetonitril ,.+A / i acetat de amoniu 1+,:8,, ">"2. s-a folosit un spectrometru de
mas G- Trio JJ. .ercettorii au declarat c rspunsul penicilinei - m>z FA4 cu concentra#ie
de A Bg>;g a fost slab.
Go:;sner i (ac; au studiat fragmentarea folosind te!nici electrospra: i ionspra: cu
.id pentru a reproduce informa#ia structural a penicilinei - i clo*acilinei. ?ragmente din
ionii de C/D0D0
4
5-.5
4
E
D
nu au fost detectate la electrospra:. .um s-a crescut poten#ialul, s-
au format fragmente de ioni pro"enite de la inelul 6-lactam. %a diferem#e mai mari depoten#al
s-au format ioni a"nd "alori de m>z sub +,,.
tudii ec!i"alente asupra spectrului de ioni negati"i folosind Anal:tica electrospra: /
/odel +,,A=H-F conectat la un spectometru de mas 0a<lett K(ac;ard A898A. 7n general
metoda cu ioni negati"i a produs semnale cu intensit#i mai mici comparati" cu metoda ioni
poziti"i. ?ragmentarea rezultat din decarboilarea i desfacerea inelului 6-lactam, a format
ioni C/-0-.5
4
E
-
6-lactam la m>z 498 i C?-0-0
4
5E
-
la m>z +84 pentru penicilina -.
7n concluzie folosirea metodelor %.-/ pentru confirmarea penicilinelor poziti"e la
%.-&G nu a dat rezultatele corespunztoare pentru c nu a ntrunit standardele %od-urilor.
TERTACICLINE
Tetraciclinele 1fig +2, deri" din Streptomyces i sunt acti"e mpotri"a unei game largi
de microorganisme gram-poziti"e i gram-negati"e. Ac#ioneaz prin in!ibarea biosintezei
F
proteice. Tetraciclinele nu au "olatilitatea necesar pentru -.-/. %.-/ a fost ns aplicat
cu succes pentru analiza acestor compui.
Li)a; et al. a dez"oltat o metod pentru determinarea tetraciclinei, o*itetraciclinei,
clortetraciclinei n lapte folosind %.-/. &n filtrat de lapte a fost pus ntr-un cartu .
+9
(',
care a fost splat cu ap i metanol. Mezidul de tetracilin a fost eluat n acid o*alic. Au fost
folosite un 0a<lett-(ac;ard 0(A889,A i un spectometru 0( A899A. ?aza mobil consista
dintr acetonitril ,.,A/, acid o*alic i metanol. /etanul a fost folosit ca gaz reacti". $atele au
fost prezentate n concentra #ie normal +,,Bg>l.
7n +88H a fost descoperit o metod pentru determinarea tetraciclinei, o*itetraciclinei,
clortetraciclinei n muc!i i rinic!i folosind ionizarea c!imic la presiune atmosferic %.-
/. (robele au fost e*trase n glicin. $up adi#ionarea de sulfat de amoniu, e*tractul a fost
centrifugat, iar supernatanul a fost cur#at folosind cartue de ciclo!e*il care au fost splate cu
ap i metanol. Tetraciclinele au fost eluate n metanol, uscate i reconstiuite n faza mobil
care consta din 4, m/ de acid o*alic +, Bg>l i acetonitril. (robele au fost analizate folosind
spectrometrul de mas G- (latform JJ. (entru fiecare compus ionii monitoriza#i corespundeau
la C/DIE
D
, C/DI-I0
F
E
D
i C/DI-0
4
5E
D
. ?aza mobil a permis rezolu#ia tetraciclinelor.
/etoda a fost "alidat la A,-4,, Bg>;g din muc!i i F,,-+4,, Bg>;g din rinic!i. -a do"edit
c adi#ia de acid o*alic este necesar pentru a mri rezolu#ia i forma picurilor.
5;a i colaboratorii au folosit n +88= ?A@ 1?ast Atom @ombardment2 %.-/ pentru
analiza tetraciclinei, do*acilinei, o*itetraciclinei, clortetracicli-nei n miere i a tetraciclinei,
o*itetraciclinei, clortetraciclinei n ficat, rinic!i i muc!i de bo"in folosind ioniza#ia
electrospra: %.-/-/ cu disocia#ia cu coliziune indus. /etoda lor presupunea amestecul
probei cu solu#ie tampon de '$TA-/cJl"aine de p0 =.,. amestecul a fost centrifugat i filtrat
prin faza solid folosind ubn cartu @ond 'lut .
+9
care a fost precondi#ionat cu solu#ie apoas
de '$TA. Mezidul de tetracilin a fost eluat folosind acetat de etil i metanol. Apoi a fost
uscat dizol"at n ap. epararea a fost fcut folosind o coloan TL uper 5ct:l, faz
mobil fiind acetonitril 4AN n solu#ie apoas ,.,AN de acid triofloroacetic. pectrometrul de
mas folosit a fost ?innigan TO H,,,. metoda a fost "alidat pentru cele patru tetraciline la o
concentra#ie de +,, Bg>;g.
7n concluzie folosirea %.-/ n analiza rezidurilor de tetracicline a produ trei metode
"alidate la concentra#ii rele"ante. %.-/ pare s ofere i o metod de a msura i studia
izomerii structurali ai clortetraciclinei care sunt imprtan#i n determinare con#inutului de
reziduri n alimente.
MACROLIDE
/acrolidele sunt un grup de compui care con#in +4, +=, +3 inele macrociclice la care
sunt ataa#i amnioglucide sau glucide neutre. 1fig F2.
&n singur test %.-/ pentru determinarea rezidurilor a fost dez"oltat pentru fiecare
membru din aceast grup, cu e*cep#ia )ozamicineiP i un test capabil s detecteze toa#i cei A
compui.
(leasance et al. a raportat metoda ionspra: %.-/ pentru confirmarea eritromicinei A
n #esut de somon. 5 prob din muc!i de somon a fost omogenizat de dou ori n acetonitril,
centrifugat i apoi fiftrat supernatantul. ?iltratele combinate au fost e*trase cu !e*an pentru
ndeprtarea grsimilor. Acetonitrilul a fost alcalinizat cu !idro*id de natriu. olu#ia a fost
apoi amestecat cu diclormetan. $up adi#ia de solu#ie apoas de Ia
4
0(5
=
amestecul a fost
agitat energic. .lorur de sodiu n stare solid a fost adi#ionat pentru a facilita separarea
stratelor apoase de cele organice. $iclormetanul a fost ndeprtat cu solu#ie de clorur de
sodiu, uscat i rezidurile reconstituite n metanol. %a 0(%. s-a folosit o coloan de Qorba*
=
M*-.
9
, folosind ca eluant solu#ie apoas de acetonitril con#innd i ,.4N acid formic. A fost
solosit spectometrul de mas cie* A(J JJJ. ?olosind %.-/ i %.-/-/ cu .J$,
eritromicina a putut fi detecdtat la ,.,+ i ,.,A B>;g. $e asemenea au putut fi detectate i un
mare numr de metabolite i produi de degradare.
.u toate acestea s-a cerut o metod de cur#are pentru c analiza a doar cte"a probe
cerea nlocuirea coloanei.
7n +88=, anders i $elepine, cel mai acti" grup n analiza / a macrolidelor, descriu o
metod %.-/ pentru analiza spiramicinei n muc!i de bo"in. piramicina a fost e*tras
din probe de muc!i n cloroform. '*tactul a fost aplicat intr-un cartu @ond 'lut $iol care a
fost mai nti splat cu cloroform. Mezidul de spiramicin a fost mai nti eluat cu acid formic
4N n acetat de amoniu ,.,A /, metanol 1FAN2 i acetonitril 1+AN2. Acest sol"ent fost n
0(%. pentru separarea spiramicinei. 'l a fost trecut printr-o coloana %i.!ristop!or M(
+9.
a
fost folosit un

spectometrul de mas 0a<lett-(ac;ard A898 A, folosind ca reacti" metan. Jonul
molecular nu a fost prezent din cauza labilit#ii spiromicinei, cea mai mare mas molecular a
fost cea a pierderii de ap C/D0-0
4
5E
-
. ?olosind ionii la m>z 39=, 39F, =HA, FF, i F,=
cercettorii au putut s "alideze concentratii de )umtate, aceleai i dublu fa# de cele cerute
de &' la A, B>;g de muc!i.
7n concluzie acest grup de compui este relati" bine acoperit, cu o metod capabil s
determine reziduuri amestecate con#innd to#i membii acestui grup la concentra#ii apropiate de
cele stabilite de &'.
AMINOGLICOZIDE
Streptomices i Micromonospora produc aminoglicozide. 'le sunt antibiotice cu
spectru larg de acti"itate i sunt formate dintr-un inel aminociclitol 14-deo*istrept amina n
cele mai multe cazuri2 legat de dou sau mai multe amninoglucide n legtur glicozidic 1fig
42. Analiza c!imic a aminoglicozidelor a fost ntotdeauna un punct slab al analitilor. Aceti
comui prezint toate propriet#ile fizicoc!imice care ngruneaz metodele de confirmare.
?iind foarte !irdofilice e*tragerea lor este foarte dificil. e descompun la temperaturi mari
facand analiza -. sau -.-/ aproape imposibil. .u toate c %.-/ ar terbui sa fie o
unelt ideal n analiza acestor compui, pn la data curent s-au raportat doar dou metode,
amndou folosind ionspra: %.-/.
/c%aug!lin i 0enion au dez"oltat o metod capabil s detecteze spectiomicina,
!igromicina @, streptomicina di!idrostreptomicina n rinic!i de bo"in. olubilitatea slab a
acestor compui n sol"en#i organici a fost depit folosind dispersia fazei solide. (roba de
rinic!i a fost omogenizat cu cianopropil. $up punerea ntr-un rezer"or de e*trc#ie de 9ml,
faza solid a fost splat cu !e*an, acetat de etil i metanol. (roba a fost eluat cu ap , apoi
cu acid supfuric ,.,A /. -a folosit o coloan p!erisorb 5$-4, cu o faz mobil consistnd
din 9N acetonitril cu +, sau 4, m/ de acid pentafloropanic ca reacti". (roba s-a introdus
ntr-un aparat cie* Taga 3,,, ' cu surs A(.J.
?olosind J/ la m>z FA+ pentru spectiomicin, m>z 43A pentru !irgomicina @, m>z
F,+ pentru streptomicin i m>z 48F pentru di!idrostrrptomicin, aceste antibiotice au putut fi
detectate n rinic!i de bo"in la concentra#ia de 4, ,,, B>;g.
A
7n concluzie, analiza rezidurilor de aminoglicozide folosind spectrometria de mas
este imposibil de realizat ntr-un laborator obinuit. .u toate acestea, combinarea %.-/-/
i dispersiei fazei solide d posibilitatea de confirmarea a tuturor acestor compui la
standardele impuse de &'.
BIBLIOGRAFIE
3
+2 R./.A Iiessen, A.@. Tin;e, S. .romatogr. A H,F 1+88A2
42 (.S. Li)a;, /.-. %eadbetter, /.0. T05/A, '.A. T!ompson, @iol. /ass
pect. 4, 1+88+2
F2 %.-. /c%aug!lin, S.$. 0enion, S. .!romatorg A8+ 1+8842
=2 . (leasance, (. @la:, /.A. Ouilliam, S. .romatogr. AA9 1+88+2
CUPRINS
H
UNIVERSITATEA DE STIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINARA. .1
.%&S-IA(5.A.............................................................................................................+
INTRODUCERE...........................................................................................................2
PENICILINE.................................................................................................................2
TERTACICLINE..........................................................................................................3
MACROLIDE...............................................................................................................4
AMINOGLICOZIDE...................................................................................................5
BIBLIOGRAFIE...........................................................................................................6
CUPRINS.......................................................................................................................7
9