Tehnici moderne de estimare direct a numrului de microorganisme

Estimarea electronic a numrului de microorganisme (Principiul de funcionare a

aparatului Coulter i a citometrului n flux)

Aparatul de tip Coulter funcioneaz dup urmtorul principiu:
De o parte i de alta a unui tub prevzut cu un orificiu calibrat sunt dispui doi electrozi
de platin imersai ntr-un electrolit, ale cror borne sunt conectate la tensiune continu.
Prin aspiraia provocat la partea superioar a tubului, celulele aflate n exteriorul tubului
trec pe rnd prin orificiu i deplaseaz o dat cu fiecare pasaj un volum de electrolit egal cu
cel al celulei. Aceasta provoac o cretere tranzitorie a rezistenei circuitului, ceea ce
genereaz un impuls electric a crui amplitudine este proporional cu volumul celulei.
Impulsurile fiind de foarte scurt durat, aparatul permite numrarea unui numr mare de
celule, una cte una, ntr-un timp foarte scurt.
Este posibil i o clasificare a celulelor n funcie de de volumul lor.
Aceast tehnic, dei sofisticat, este considerat extrem de interesant i se aplic cu
succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realiznd simultan cu numrarea i
dimensionarea celulelor.
Rezultatele sunt reproductibile cnd se utilizeaz suspensii diluate de celule;
Sarcina electric a celulelor poate influena analiza conducnd la obinerea de rezultate
eronate;
Aceast tehnic nu se poate aplica n cazul culturilor ce conin n suspensie, alturi de
celulele microorganismului cultivat, i particule solide.

Citometrie n flux
Permite numrarea i aprecierea strii fiziologice a celulelor, cnd detecia se face prin
msurarea fluorescentei emise de celulele n prealabil marcate cu un colorant (fluorocrom).
Dup colorare, celulele sunt antrenate printr-un orificiu ngust i trec una cte una prin
faa unei surse luminoase.
Fluorescenta emis de fiecare microorganism este captat printr-un fotomultiplicator i
analizat. Rezultatele sunt traduse pe o histogram care red numrul de evenimente n
funcie de intensitatea fluorescentei. Aceast histogram traduce deci un profil al populaiei.
Principiul de funcionare al citometrului n flux:
a, b exemple de sisteme de detecie c diagram de repartiie a dimensiunilor

Adesea markerii colorani utilizai pot oferi diferite tipuri de rspunsuri:
Dac colorantul este un marker de viabilitate, din histogram se deduce numrul de
celule viabile i starea fiziologic a populaiei.
Dac histograma cuprinde net dou picuri este posibil numrarea separat a
microorganismelor dintr-o cultur mixt (de exemplu, streptococi i lactobacili).
Dac markerul este un anticorp se pot numra specific anumite microorganisme dintr-o
populaie heterogen.