Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
LUCRARI PRACTICE
CUPRINS
1. Ciclul celular mitotic
2. Metode de studiu a cromosomilor in mitoza
2.1. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare
2.1.1. Metoda rapid Feulgen de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n =
16)
2.1.2. Metoda rapid de colorare a cromosomilor la ceap Allium cepa L. (2n=16) n
mitoz cu soluie carmin-acetic
2.1.. Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale
. Meioza
!. Metode de studiu a cromosomilor in meioza
!.1. Metode de studiu a cromosomilor meiotici la plante
". Cariotip si idiograma
".1. #e$inirea termenilor% nomenclatur
6. &loidia la plante
'. Metode pentru determinarea gradului de ploidie la plante
(. Mutageneza si implicatiile sale la unele plante de cultura
(.1. )tudiul a*eraiilor cromosomiale n ana-telo$aza mitozei la unele plante de cultur
+. #rosop,ila melanogaster - o*iect de studiu in genetica
+.1. Cromosomii uriasi si cromosomii somatici la Drosophila melanogaster
(.1.1. Cromosomii uria.i
(.1.2. Cromosomii somatici
/i*liogra$ie
1. Ciclul celular mitotic
0n di1iziunea celular se disting dou categorii de e1enimente2 evenimente reproductive%
prin care sunt du*late structurile $uncionale ale celulei% esenial $iind du*larea cromosomilor% .i
evenimente distributive% prin care materialul rezultat n urma replicaiei este repartizat celulelor $iice
(Tudose, 1992).
Mitoa (gr. mitosis = $ir) sau di!iiu"ea ec!a#io"al$% este modalitatea de di1iziune celular
prin care% dintr-o celul somatic rezult dou celule $iice cu numr egal de cromosomi% at3t ntre
ele% c3t .i cu celula mam. Mitoza este di1iziunea celular care are loc n celule somatice .i
asigur transmiterea $idel a caracterelor la celulele $iice4 ea poate su$eri ns% di$erite in$luene
care adaug aparentei sta*iliti a caracterelor% noi 1alene. Ciclul celular mitotic% la plante .i
animale% cuprinde n principal urmtoarele procese2 duplicarea cromosomilor unicromatidici (.i a
centrozomului la animale) .i deplasarea spre poli a cromosomilor fii% dup care% urmeaz
diviziunea citoplasmei. 0n procesul mitozei se organizeaz aparatul mitotic alctuit din structuri
cromatice .i acromatice% care este complet n meta$az. &entru realizarea acestuia% sunt necesare
proteine speci$ice% a cror sintez necesit un mare consum de energie.
5otalitatea proceselor prin care trece celula somatic de la $ormare .i p3n la scindarea ei
n dou celule $iice% cu numr de cromosomi egal cu numrul de cromosomi al celulei din care au
pro1enit% alctuiesc ciclul celular.
Ciclul mitotic (%i&.1) cuprinde2 interfaza (perioada dintre dou di1iziuni succesi1e) .i cele
patru $aze ale di1iziunii mitotice propriu-zise - profaza% metafaza% anafaza .i telofaza a13nd o
durat 1aria*il% n $uncie de specie% tipul de celule% temperatur etc.% de la c3te1a ore% la zeci .i
sute de ore.
Interfaza
6nter$aza are cea mai mare durat n timp n ciclul mitotic .i este caracterizat de procese
de *iosintez. #urata inter$azei este 1aria*il% de la c3te1a ore p3n la zile. 7a plante% la un ciclu
tipic de 28-2! de ore% mitoza dureaz '8-118 minute (pro$aza = 8 - !" min.% meta$aza = " - 18
min.% ana$aza = 1" - 28 min. .i telo$aza = 28 - 8 min.) (Toma .i Ni#$, 199'). 7a celula animal% un
ciclu tipic dureaz 1( - 2! de ore% din care durata $azei 91 este de apro:imati1 6 ore (n general
1ariaz cel mai mult)% $aza ) (timpul necesar replicrii genomului) dureaz 6 - ( ore% iar $aza 92
este% de regul% cea mai scurt (mai ales c3nd mitozele se succed rapid). Mitoza% de o*icei
dureaz mai puin de o or (Le(i", 199)).
Cercetrile micro$otogra$ice .i microradiogra$ice au demonstrat c inter$aza este $oarte
puin acti1 din punct de 1edere mor$ologic% dar este cea mai acti1 din punct de 1edere meta*olic4
cantitatea de ;#< se du*leaz de la 2C la !C. &e *aza acestor o*ser1aii% *o(ard .i Pelc% n
19'+ au mprit inter$aza n trei perioade2
- perioada 91 (engl. gap = gol) - perioad presintetic% n care nu are loc sinteza de ;#<%
ci doar o acti1are a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici4 se sintetizeaz ;=< (n special
;=<m) .i proteine4
- perioada ) (engl. s>nt,esis = sintez) - perioada de sintez a ;#<4 p3n la s$3r.itul $azei
) toat cantitatea de ;#< se replic (pe parcursul $azei ) cantitatea total de ;#< cre.te de la 2C
la !C). 7a s$3r.itul acestei perioade% cromosomii sunt alctuii din dou cromatide $oarte lungi .i
su*iri4
- perioada 92 - perioad postsintetic% c3nd sinteza ;#< se opre.te4 are loc *iosinteza
proteinelor .i a ;=<% care se des$.oar .i n celelalte perioade ale inter$azei. Celula conine
cromosomi *icromatidici.
%i&. 1. Ciclul celular mitotic ,du-$ Al.erts /i cola.., 199)0
&e parcursul inter$azei (%i&.2)% cromosomii sunt ,idratai% despiralizai .i nu se o*ser1 la
microscopul optic (1atso", 192)).
%i&. 2 As-ectul "ucleului 3" i"ter4a$, 3" celulele meristemului radicular la Allium cepa L. ,2"5160 ,du-$ *artl /i
7o"es, 19980
0n a$ar de celulele la care ciclul mitotic se des$.oar n mod normal% e:ist celule n
repaus sau n perioada 98% asemntoare $azei 91% dar di$erit prin $aptul c celulele nu pot intra n
$aza ). 0n $aza 98 intr celulele neproli$erati1e. ?neori% celulele se pot a$la n repaus n $aza !C
(e:emplu2 celulele em*rionare din semine)% ast$el nc3t% intr direct din 98 n 924 alteori% din 98 pot
intra n 91 timpuriu (Le(i", 199)).
0n e:plicarea cauzelor ce determin intrarea celulei n di1iziune mitotic (trecerea din 92 n
mitoz) e:ist di$erite ipoteze. )e pare c declan.area mitozei este determinat de modi$icarea
raportului nucleu @ citoplasm.
Profaza
0n pro$az au loc procesele2 mrirea volumului nucleului% condensarea cromosomilor%
stabilirea polilor pentru diviziune% dezorganizarea membranei nucleare% dispariia nucleolilor .i
formarea fusului acromatic.
7a nceputul acestei $aze% cromosomii se prezint su* $orm de $ilamente su*iri% lungi%
alctuind un spirem. 0n pro$aza timpurie (%i&.+) ei se dispun n tot spaiul nuclear (n celulele 1ii se
o*ser1 u.or% a13nd indicele de re$racie 1%"8 $a de cel al carioplasmei de 1%'). 0n pro$aza t3rzie
(%i&.))% gradul de spiralizare al cromosomilor cre.te .i ei de1in mai scuri .i mai compaci% apr3nd
$ormai din dou cromatide% $oarte apropiate ntre ele .i n$.urate una n Aurul celeilalte. 7a
nceputul pro$azei% are loc o prim spiralizare a cromosomilor denumit Bspiralizarea micC% ce se
realizeaz prin mic.orarea numrului de spire .i mrirea diametrului lor. )pre s$3r.itul pro$azei% are
di!iiu"ea
mitotic$
i"ter4aa
celule
4iice
2cA9N
2cA9N
2cA9N
)cA9N
loc a doua spiralizare denumit Bspiralizare somaticC% n care numrul de spire continu s scad%
ele apropiindu-se tot mai mult.
0n pro$az% distana dintre cromosomi cre.te treptat .i are loc dezorganizarea nucleului .i a
mem*ranei nucleare% dispariia nucleolilor .i $ormarea $usului mitotic. Centriolii migreaz spre polii
celulei% plas3ndu-se n dou puncte opuse. 0ntre centrioli se organizeaz fusul de diviziune ($us
acromatic% $us mitotic sau $us nuclear)% alctuit dintr-un numr mare de $ilamente% cu e:tremitile
inserate pe centrioli. Fusul nuclear este un organit tranzitoriu% cu aAutorul cruia se realizeaz
distri*uirea egal a cromosomilor n cele dou celule $iice. Filamentele $usului de di1iziune sunt de
dou tipuri2 filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul ce condiioneaz
structura $usului .i filamente cromosomiale (kinetice)% care sunt sintetizate .i pleac de la
centromerul $iecrui cromosom .i nainteaz simultan% cu aceea.i 1itez% spre cei doi poli ai celulei.
%i&. + As-ect al "ucleului u"ei celule di" meristemul radicular de la Allium ce-a L. ,2"5160, a4lat$ 3" -ro4a$
tim-urie ,du-$ *artl /i 7o"es, 19980
%i&. ) As-ect al "ucleului u"ei celule di" meristemul radicular de la Allium ce-a L. ,2"5160, a4lat$ 3" -ro4a$
t:rie ,du-$ *artl /i 7o"es, 19980
)tadiul $inal al pro$azei - -rometa4aa% se caracterizeaz prin totala dezorganizare a
mem*ranei nucleare% care se $ragmenteaz n poriuni relati1 mari% ce pstreaz in$rastructura de
mem*ran du*l .i rm3n% n parte% n interiorul $usului de di1iziune% particip3nd mai t3rziu la
$ormarea mem*ranelor nucleilor $ii. Cromosomii e:ercit mi.cri neregulate ntre polii celulei .i
planul ecuatorial al acesteia.
Metafaza
0n aceast $az are loc des13r.irea aparatului mitotic% iar cromosomii% spiralizai la ma:im%
se dispun n placa ecuatorial meta$azic (%i&.'). Mi.carea de dispunere a cromosomilor n placa
ecuatorial% la distan egal de polii $usului de di1iziune prezint trei componente2
adunarea cromosomilor ntr-o poziie de ec,ili*ru ntre cei doi poli% mi.care datorat
interaciunii ntre polii $usului .i centromeri4
orientarea cromosomilor n placa ecuatorial ast$el ca% centromerii s $ie situai n a:ul
longitudinal al $usului de di1iziune% cromatidele $iind orientate lateral4
distri*uirea cromosomilor n placa meta$azic se realizeaz n Aurul unui $us central gol
(n seciune trans1ersal apare ca un ,alo)% cromosomii $iind dispu.i la peri$eria $usului% cu *raele
orientate n a$ar.
Mor$ologia cromosomilor se studiaz n meta$az% deoarece n aceast $az ei sunt
condensai n cel mai nalt grad. Fiecare cromosom este alctuit din dou cromatide .i prezint n
lungul acestora% spre s$3r.itul meta$azei% o $isur longitudinal% care reprezint spaiul dintre cele
dou cromatide surori. 7a s$3r.itul meta$azei (%i&.6)% cromatidele surori ncep s se separe
(cli1area longitudinal)% $c3ndu-se trecerea spre ana$az.
%i&. ' As-ect al cromosomilor u"ei celule di" meristemul radicular de la Allium ce-a L. ,2"5160, a4lat$ 3"
meta4a$ tim-urie ,du-$ *artl /i 7o"es, 19980
%i&. 6 As-ect al cromosomilor u"ei celule di" meristemul radicular de la Allium ce-a L. ,2"5160, a4lat$ 3"
meta4a$ t:rie,du-$ *artl /i 7o"es, 19980
Anafaza
;na$aza se caracterizeaz prin $ormarea% din cromatidele surori% a cromosomilor $ii .i
migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor $ii de*uteaz n ana$aza timpurie%
c3nd are loc cli1area centromerilor% cromatidele rm3n3nd nc apropiate unele de altele. D dat
terminat cli1area centromerilor% ncepe separarea cromatidelor n lungul $isurii longitudinale
e1ideniate n meta$az (%i&.2). #up Le(i" (199))% la celulele animale% n ana$az% centromerul
este duplicat $uncional. C3nd .i acest proces se nc,eie% cromatidele $iice% $iecare cu c3te un
centromer propriu% ncep migrarea spre poli (%i&.8)% de1enind cromosomi $ii.
)e admite c mi.carea cromosomilor spre poli este o consecin a scurtrii $ilamentelor
$usoriale de spriAin% care leag polii $usului (prin pierderea sau adiia de tu*ulin din microtu*uli).
;lungirea determin sta*ilitatea $usului% iar scurtarea este mecanismul implicat n mi.carea
cromosomilor spre poli. ;ceast mi.care este posi*il datorit e:istenei n structura $usului mitotic
a unor proteine de natur actinic. 0n cazul n care setul de cromosomi migreaz aproape per$ect
sincron% se $ormeaz Bplaca anafazic sau Bdublul asterC. C,iar dac mi.carea cromosomilor nu
este sincron% ea nu ncepe dec3t dup ce toi cromosomii sunt plasai n placa ecuatorial.
0n celulele animale% de regul% autosomii migreaz concomitent% iar ,eterosomii au o 1itez
de migrare di$erit. 0n celulele plantelor% spre s$3r.itul ana$azei% $usul mitotic se mre.te n 1olum n
regiunea ecuatorial .i ia $orm de *utoia.% $orm3nd ulterior fragmoplastul.
%i&. 2 As-ect al cromosomilor u"ei celule di" meristemul radicular de la Allium ce-a L. ,2"5160, a4lat$ 3" a"a4a$
tim-urie ,du-$ *artl /i 7o"es, 19980
%i&.8 As-ect al cromosomilor u"ei celule di" meristemul radicular de la Allium ce-a L. ,2"5160, a4lat$ 3" a"a4a$
t:rie ,du-$ *artl /i 7o"es, 19980
Telofaza
5elo$aza este ultima $az a mitozei% caracterizat prin prezena $enomenelor opuse celor
din pro$az. Cromosomii su$er un proces de despiralizare .i re1in la aspectul inter$azic.
Fragmentele de mem*ran nuclear migreaz spre peri$eria $usului de di1iziune4 numrul lor
cre.te printr-o sintez suplimentar. ;ceste 1ezicule se agreg n Aurul masei cromosomiale% se
turtesc% nconAoar nucleul inter$azic .i $ormeaz noua mem*ran nuclear. D parte din 1eziculele
mem*ranoase aAung la ni1elul liniei de demarcaie dintre cele dou celule $iice. ;re loc .i
reorganizarea nucleolilor la ni1elul regiunilor ce ndeplinesc $uncia de organizatori nucleolari (%i&.9
.i %i&.1;).
%i&.9 Celul$ di" meristemul radicular de la Allium ce-a L. ,2"5160, a4lat$ 3" telo4a$ tim-urie ,du-$ *artl /i
7o"es, 19980
%i&.1; As-ect al "ucleilor 4ii, a-ar#i":"d u"ei celule di" meristemul radicular de la Allium ce-a L. ,2"5160, a4lat$
3" telo4a$ t:rie ,du-$ *artl /i 7o"es, 19980
Citochineza
0n mod o*i.nuit% di1iziunea nuclear este urmat de citochinez (plasmodierez%
citodierez sau plasmotomie).
Citoc,ineza poate a1ea loc centripet - la plantele in$erioare (Cladophora, Spirogyra)%
c3nd mem*rana ce separ cele dou celule $iice apare su* $orma unui inel ce cre.te centripetal%
asemntor unei dia$ragme (Toma /i Ni#$, 199'). 7a plantele superioare% citoc,ineza are loc
centrifug. #up <u!at% n zona ecuatorial a $ragmoplastului% se dispun 1ezicule proteice% printre
care se intercaleaz $ragmente ale reticulului endoplasmic% ce migreaz n aceast regiune dinspre
poli. 0mpreun cu elementele microtu*ulare% se $ormeaz o structur $i*rilar. 0n Aurul $i*relor
microtu*ulare se aglomereaz 1ezicule mici golgiene (%i&.11a,.). Eeziculele se mresc% se
contopesc .i 1in n contact cu pereii celulei mame% $orm3nd lamela median (%i&.11c). Celulele
$iice $ormate% ela*oreaz mem*rana primar% str*tut de plasmodesme (%i&.11d,e). 7a animale%
separarea celulelor $iice se $ace prin $ormarea unui inel contractil% deci prin .trangulare(%i&.12 a,
.).
%i&. 11 %ormarea -eretelui des-$r#itor, 3"tre celulele=4iice, co"secuti! di!iiu"ii mitotice la -la"tele su-erioare
,du-$ 9e Ro.ertis /i 9e Ro.ertis,198+0
%i&.12 Se-ararea celulelor=4iice, -ri" i"termediul 4orm$rii inelului contractil, co"secuti! di!iiu"ii mitotice, la
or&a"ismele a"imale ,du-$ 9e Ro.ertis /i 9e Ro.ertis,198+0
0n celulele normale% mitoza .i citoc,ineza sunt riguros coordonate. #ac are loc *locarea
citoc,inezei% mitoza se des$.oar normal% produc3ndu-se o celul *inucleat.
Ddat cu replicarea cromosomilor% are loc .i replicarea organitelor citoplasmatice sau
separarea lor din celula mam n celulele $iice% dup care acestea .i completeaz% prin noi
sinteze% setul de organite intracitoplasmatice. 0n pro$az% reticulul endoplasmic este trans$ormat
ntr-un sistem discontinuu de 1ezicule s$erice% dispuse n special n regiunile peri$erice ale
citoplasmei. 0n meta$az% mitocondriile se adun n Aurul $usului4 n ana$az% ele se grupeaz n
Aurul regiunii ecuatoriale% odat cu separarea celulelor $iice a13nd loc .i repartizarea acestora. 0n
inter$aza celulelor $iice% el re1ine la $orma tipic.
0n di1iziunea mitotic% meta$aza .i ana$aza sunt $azele cele mai scurte ale di1iziunii% n timp
ce pro$aza% uneori .i telo$aza% sunt cele mai lungi. #es$.urarea n timp a mitozei depinde .i de
tipul celulei% 13rst% starea $iziologic% condiii de mediu (mai ales temperatura). Mitoza poate $i
*locat prin aciunea .ocurilor de temperatur% narcoticelor% otr1urilor etc. (Raicu /i cola..,
192+).
2. Metode de studiu a cromosomilor i" mitoa
2.1. Metode cito&e"etice -e"tru studiul cromosomilor mitotici la -la"tele su-erioare
Cromosomii la plantele superioare se e1ideniaz n celulele a$late n di1iziune mitotic din
esuturile meristematice% din zonele de cre.tere ale organelor 1egetati1e (ape: radicular% ape:
caulinar)% sau n celulele meristemoide din calus.
0n lucrrile practice de citogenetic 1egetal se $olosesc mai ales specii de plante cu
cromosomi de dimensiuni mari .i n numr relati1 mic. &entru e1idenierea cromosomilor% n
celulele a$late n di1iziune mitotic% se $olosesc esuturile meristematice din zona de cre.tere a
rdcinii de ceap - Allium cepa L. (2n = 16)% secar - Secale cereale L. (2n = 1!)% *o* - Vicia
faba L. (2n = 12) etc.
Materialul *iologic tipic% este reprezentat de esutul meristematic din ape:ul radicular al
rdcinii de ceap - Allium cepa L. (2n = 16).
=dcinile de ceap se o*in dup o perioad de 2- zile de la punerea ntr-un pa,ar cu
ap a *ul*ului de ceap% ast$el ca numai discul s ptrund n lic,id. 7a temperatura camerei%
rdcinile ating n 2- zile% lungimea de 18-1" mm .i pot $i deta.ate (%i&.1+).
a b c d e
b
a
%i&. 1+ Germi"area u"ui .ul. de cea-$, 3" la.orator
&entru o*inerea rdcinielor em*rionare% seminele se pun la germinat pe ,3rtie de $iltru%
umectat cu ap% n cutii &etri% la temperatura camerei. 9erminarea seminelor la unele specii de
plante se $ace n nisip umed % n condiii speciale. =ecoltarea rdcinilor se realizeaz c3nd
acestea ating lungimea de 18-1" mm. Momentul optim de recoltare - c3nd un numr mare de
celule se a$l n di1iziune - se determin prin tatonare. 5impul optim de recoltare pe parcursul unei
zile este ntre orele ' - 18% $uncie de durata ciclului celular la specia respecti1.
2.1.1. Metoda rapid !eulgen de colorare a cromo"omilor la ceap Allium cepa L. #$n % &'(
Metodele rapide de colorare sunt *azate pe ,idroliza su*stanelor pectice din pereii celulari
.i colorarea di$ereniat a constituenilor celulari.
Pri"ci-iul metodei>
0n celulele n di1iziune% doar ;#<-ul cromosomial este colorat selecti1 n ro.u 1iolaceu% de
ctre o soluie de $u:in *azic decolorat (reacti! Sc?i44). Metoda a $ost ela*orat de %eul&e" .i
Rosse".ec@ (192)) .i modi$icat de Tomasi (19+6)4 se aplic pentru e1idenierea cromosomilor
mitotici la di$erite specii de plante (Tudose, 1962).
Materiale "ecesare>
material *iologic (rdcini de ceap de 1-1%" cm)4
sticlrie (pa,are /erzelius% $lacoane% lame de microscop% lamele% pipete)4
instrumentar (pensete% lame% *ee de c,i*rit)4
aparatur (microscop optic% termostat% $rigider)4
,3rtie de $iltru
reacti1i
pre$i:atori2
soluie apoas de colc,icin (8%81 - 8%2F)4
sau
ap rece la 2-!C
$i:atori nucleari2
alcool etilic a*solut - acid acetic glacial ( 21)% sau4
$i:ator Carno> (6 pri alcool etilic a*solut 2 pri cloro$orm 2 1 parte acid acetic
glacial)% sau4
$i:ator /attaglia (" pri alcool etilic a*solut 2 1 parte acid acetic glacial 2 1 parte $ormol 2
1 parte cloro$orm)
colorani2
reacti1 )c,i$$ - preparat dup 9arli"&to" .i La Cour (196;) (c4. Tudose, 1962).
)oluia $olosit la colorare se recomand s nu se arunce% deoarece poate $i $olosit de
nenumrate ori% p3n c3nd capacitatea ei de colorare scade.
Eta-e de lucru>
Pre4iAarea
&re$i:area este necesar pentru a in,i*a $ormarea $usului de di1iziune% determin3nd
acumularea de celule n meta$az. ;ceast etap nu se recomand s se e:ecute c3nd se
urmre.te o*ser1area tuturor etapelor di1iziunii. &re$i:area este a*solut necesar ns% la
e$ectuarea preparatelor $olosite pentru studierea cariotipului% realiz3nd o scurtare prin spiralizare% a
cromosomilor.
Materialul *iologic (rdcinile de ceap de 1 - 1%" cm lungime) se introduce n $lacoane mici
de sticl% adug3ndu-se 2 - ml de pre$i:ator. #up trecerea timpului necesar pre$i:rii%
pre$i:atorul se ndeprteaz cu o pipet sau prin decantare. Ca pre$i:atori se $oloseste de
e:emplu% soluie apoas de colc,icin 8%81-8%2F sau ap rece la 2 - !
8
C% ! - 2! ore% la $rigider.
&entru studiul cromosomilor n mitoz la ceap% recomandm pre$i:area *ul*ilor de ceap
germinai% cu rdcini de 1 - 1%" cm% timp de 2! de ore la $rigider (-!
8
C)% sau pre$i:area cu soluie
de colc,icin% 8%2F% timp de 2 ore la temperatura camerei.
%iAarea
Fi:area are rolul de a omor celulele% n starea n care se a$l n acel moment .i de a
coagula constituenii celulari% $r a modi$ica structura intern .i e:tern a celulelor. &rin $i:are%
*iocoloizii celulei se coaguleaz% constituenii celulari put3ndu-se colora cu di$erii colorani.
Fi:area se realizeaz prin adugarea peste materialul *iologic a 2- ml de $i:ator% dup
ndeprtarea su*stanei de pre$i:are. 7a ceap% se prele1eaz rdcinile .i se plaseaz ntr-un
$lacon de sticl% n 1ederea e$ecturii $i:rii cu $i:ator /attaglia% timp de 12 min.% la temperatura
camerei. 0n general% timpul de $i:are 1ariaz n $uncie de soluia de $i:are .i de consistena
materialului $i:at.
#ac prelucrarea materialului *iologic nu se continu imediat% el se conser1 la $rigider (2 -
!
8
C)% n alcool etilic '8F.
S-$larea
=olul splrii este de a ndeprta urmele de $i:ator. )plarea se realizeaz cu soluie de
GCl 1<% la temperatura camerei% timp de " min. #in $lacoane% se ndeprteaz soluia de $i:are .i
se adaug soluia de splare.
*idrolia
=olul ,idrolizei este de a u.ura colorarea% prin dizol1area parial a su*stanelor pectice
intercelulare% distrugerea parial a pecto-celulozei parietale% precum .i u.urarea etalrii celulelor
ntre lam .i lamel.
#up ndeprtarea soluiei de $i:are% sau a alcoolului% se realizeaz ,idroliza la cald sau la
rece. Gidroliza la cald se realizeaz la temperatura de 68
8
C% prin adugarea de 2 - ml GCl 1<.
5impul este 1aria*il% $uncie de duritatea esuturilor4 se sta*ile.te prin tatonri (la ceap% ' - ( min.).
Gidroliza la rece se realizeaz prin adugarea de soluie GCl "8F% dup ndeprtarea soluiei de
splare. 7a ceap% ,idroliza se realizeaz timp de 18-1" min.% la temperatura camerei.
Colorarea
#up ndeprtarea soluiei de ,idroliz (cu aAutorul unei ,3rtii de $iltru se ndeprteaz
urmele de soluie de ,idroliz)% se adaug 2- ml de reacti1 )c,i$$% ast$el nc3t rdcinile s $ie
scu$undate n colorant% iar colorantul s rm3n incolor. #up 1"-28 de min.% zona meristematic
din 13r$ul rdcinii ncepe s se coloreze n ro.u-1iolaceu% apoi n 1iolet intens% deoarece aici se
a$l celule n di1iziune4 restul rdcinii% unde $rec1ena di1iziunilor este sczut% iar celulele sunt
mari .i alungite% rm3ne 1izi*il necolorat. &entru o *un colorare sunt necesare 8 min. - 1 or% la
temperatura camerei. D colorare intens% uni$orm% se o*ine dac materialul introdus n colorant
se pstreaz la $rigider% c3te1a ore. &entru mrirea contrastului ntre cromosomi .i citoplasm se
recomand meninerea rdcinilor scoase din colorant ntr-o soluie de acid acetic !"F% timp de 18
- 1" min. sau n ap% timp de 8 de min.% spl3nd ast$el e:cesul de colorant. 0n cazul n care nu s-a
realizat o colorare satis$ctoare% intensi$icarea ei se realizeaz prin e:ecutarea preparatului ntr-o
pictur de carmin acetic. 0n colorant% la $rigider% materialul se poate pstra ma:im 1-2 zile% dup
care se degradeaz% a13nd loc .i colorarea citoplasmei.
E4ectuarea -re-aratelor tem-orare ra-ide ,ti- sBuas?0
&reparatele microscopice rapide se o*in prin etalarea 13r$ului colorat al rdcinii (de
pre$erin o poriune de 1-2 mm)% pe o lam de microscop curat .i degresat (prin splarea
lamelor n amestecuri o:idante speciale $olosite n lucrrile de citologie% n alcool etilic +6F% sau n
spirt sanitar% urmate de o *un .tergere cu o *ucat de ti$on% naintea e$ecturii preparatului)% ntr-o
pictur de acid acetic !"F. 0n preala*il% 13r$ul colorat al rdcinii se poate trece printr-un
cristalizor cu ap. ;.ez3nd deasupra 13r$ului deta.at al rdcinii o lamel .i in3nd cu un deget o
latur a lamelei% se etaleaz preparatul prin *ti ritmice .i sistematice n lamel% cu un * de
c,i*rit% pentru dispunerea celulelor ntr-un singur strat .i dispersarea cromosomilor n celule.
Hliminarea e:cesului de soluie .i des13r.irea dispersrii celulelor .i a cromosomilor se
realizeaz cu aAutorul unei ,3rtii de $iltru% aps3nd cu degetul mare peste lamel% $r a o mi.ca.
&entru a mpiedica mpr.tierea cromosomilor .i pentru o *un $i:are a celulelor pe lam% se
recomand ungerea acesteia naintea e:ecutrii preparatului cu al*umin glicerinat. 7ama uns
este trecut cu partea uscat deasupra unei $lcri% e1it3nd coagularea al*uminei glicerinate.
Cu c3t etalarea se e$ectueaz mai *ine% cu at3t preparatul este mai *un% prezent3nd
cromosomii *ine dispersai .i indi1idualizai. 5re*uie e1itat deplasarea lamelei pe lam n timpul
etalrii% $apt ce duce la rostogolirea celulelor .i la compromiterea parial sau total a preparatului.
#up etalare% ntre lam .i lamel% tre*uie s se o*ser1e cu oc,iul li*er un strat $oarte $in de
material celular colorat n 1iolet.
&reparatele ast$el o*inute% se pot o*ser1a la microscop imediat dup e$ectuare% timp de
c3te1a ore% deoarece la lumin .i la temperatura camerei% colorantul 1a dispersa n citoplasm.
E4ectuarea -re-aratelor semi-erma"e"te
&entru studiul preparatelor .i n ziua urmtoare% acestea se e$ectueaz semipermanent%
pentru a e1ita e1aporarea acidului acetic !"F% ceea ce ar duce la des,idratarea celulelor. ;st$el de
preparate se realizeaz prin para$inarea marginilor lamelei% sau prin adugare de glicerin pe
marginile acesteia% la contactul cu lama .i ndeprtarea e:cesului de glicerin cu aAutorul unei ,3rtii
de $iltru. 7amele semipermanente se pot pstra la $rigider timp de 2! - !( de ore. #up o pstrare
ndelungat% colorarea se intensi$ic% cuprinz3nd .i citoplasma.
E4ectuarea -re-aratelor -erma"e"te -ri" i"cludere 3" .alsam de Ca"ada
&reparatele microscopice pe care dorim s le pstrm timp ndelungat% cu scopul de a ser1i
drept model% sau ca do1ad a unei cercetri .tiini$ice% se monteaz n *alsam de Canada (r.in
misci*il cu :ilenul sau toluenul). 0n Aurul lamelei se pune o pictur de alcool +6F .i cu aAutorul
unei lame de ras% se desprinde cu atenie lamela de pe lam% printr-o mi.care de ridicare a lamelei.
Materialul de studiu rm3ne prins de lam .i de lamel. ;t3t lama% c3t .i lamela% se trec prin dou
*i succesi1e de alcool etilic a*solut sau alcool *utilic .i dou *i de :ilen sau toluen% timp de 2-"
min.% pentru $iecare *aie.
=olul alcoolului este acela de a des,idrata esuturile .i de a le spla de acidul acetic4 :ilenul
1a nlocui apa din esuturi4 de asemenea% *alsamul de Canada este misci*il cu :ilenul.
7amele se introduc n pa,are /orel sau orice alt tip de pa,ar% iar lamelele n capsule de
sticl sau porelan% ntotdeauna cu preparatul *iologic plasat la $aa superioar. &e lama umed% n
regiunea unde sunt celule% se pune o pictur de *alsam de Canada% iar deasupra se aplic o
lamel curat .i degresat. &e aceea.i lam% alturi (n regiunea $r celule) se pune o alt
pictur de *alsam de Canada peste care se a.eaz lamela iniial% cu $aa ce conine celulele% n
Aos. )e ndeprteaz e:cesul de *alsam de Canada printr-o u.oar apsare pe lamele% cu o
*ucat de ,3rtie de $iltru% realiz3ndu-se ast$el% .i prinderea lamelelor de lam. &reparatul se usuc
la termostat% la !8
8
C% timp de c3te1a zile .i se etic,eteaz (se noteaz specia .i esutul din care s-
a e$ectuat preparatul% metoda de colorare% data% e1entual numele persoanei care a e$ectuat
preparatul etc.)% put3nd $i pstrat apoi timp ndelungat.
EAami"area -re-aratelor la microsco-ul o-tic
H:aminarea preparatelor se e$ectueaz n lumin puternic% cu $olosirea unui $iltru 1erde%
care mre.te contrastul ntre cromosomi .i citoplasm. )e recomand ca o*ser1area s nceap
cu o*iecti1ul 18:% apoi% se sc,im* o*iecti1ele 28:% !8: .i c,iar +8: (cu imersie n ulei de cedru).
#eoarece reacti1ul )c,i$$ coloreaz selecti1 numai ;#<-ul% la microscopul optic% se 1or
o*ser1a cromosomii colorai n ro.u-1iolet4 nucleolii% citoplasma .i organitele celulare rm3n3nd
incolore. &ereii celulari nu se coloreaz% $iind greu 1izi*ili% de culoare gl*uie4 uneori se o*ser1
doar cromosomii celulelor n di1iziune .i nucleii celulelor n inter$az. &entru a delimita celulele% se
poate realiza o u.oar colorare a citoplasmei% cu o soluie alcoolic $oarte sla* de 1erde de metil.
;ceast colorare se realizeaz naintea e$ecturii preparatului permanent% prin trecerea lamei .i a
lamelei pentru un timp $oarte scurt (c3te1a secunde)% prin soluie alcoolic de 1erde de metil.
;st$el% citoplasma se coloreaz n 1erde desc,is .i celulele pot $i u.or delimitate% iar cromosomii se
o*ser1 mai *ine% datorit contrastului de culoare.
7a microscopul optic se 1or o*ser1a celule n inter$az cu nuclei mici% colorai n ro.u-1iolet%
cu nucleoli incolori% ce apar ca ni.te corpusculi lumino.i de $orm mai mult sau mai puin rotund.
)e o*ser1 .i celule n di$erite $aze ale di1iziunii mitotice2
celule n pro$az timpurie% c3nd cromosomii ncep s de1in 1izi*ili la microscopul
optic .i au aspectul unor $ilamente $ine .i su*iri4 n pro$aza t3rzie% c3nd cromosomii se
indi1idualizeaz% $iind situai n nucleu. )pre s$3r.itul pro$azei se dezorganizeaz mem*rana
nuclear4
celule n meta$az ($az cu $rec1en ridicat n preparatele microscopice% n cazul
n care s-a e$ectuat pre$i:area)4 se pot numra .i o*ser1a mor$ologic cromosomii care au atins
ma:imul spiralizrii% $iind *ine indi1idualizai. 7a Allium ce-a L. (2n = 16) se pot o*ser1a cu
u.urin .i se pot numra 16 cromosomi% de $orma unor *astona.e% cu capetele mai mult sau mai
puin ndoite. &rin studiu mai amnunit cu o*iecti1ul de imersie se poate o*ser1a mor$ologia
$iecrui cromosom n parte% put3ndu-se e:ecuta micro$otogra$ii4
celule n ana$az - n ana$az timpurie% cu cromosomii $ii unicromatidici ce se
deplaseaz spre polii celulei .i ana$az t3rzie% cu cromosomii $ii la cei doi poli ai celulei% su* $orm
de stea - diaster4
celule n telo$az timpurie% c3nd cromosomii $ii au aAuns la polii celulei .i telo$az
t3rzie% caracterizat prin $ormarea nucleilor $ii .i apariia peretelui despritor ($ragmoplastul).
2.1.2. Metoda rapid de colorare a cromo"omilor la ceap Allium cepa L. #$n%&'( )n mitoz
cu "olu*ie carmin+acetic
Metoda a $ost ela*orat n 1926 de ctre <elli"& (c4. Tudose, 1962).i se *azeaz pe $aptul
c acidul carminic (din colorantul natural carmin% e:tras din $emelele ,omopterului Coccus cacti)%
se comport ca un colorant acid n soluie alcalin .i se ncarc negati1% iar n soluie acid% ca un
colorant *azic% ncrc3ndu-se poziti1. ;ceast metod este des $olosit n studiile de citogenetic
1egetal% deoarece este u.or de e$ectuat% necesit3nd un timp scurt.
Materialul *iologic% sticlria% instrumentarul .i reacti1ii utilizai sunt identici cu cei $olosii n
cazul metodei Feulgen.
Colorantul utilizat este soluia carmin acetic ("" cm
ap distilat la 188
8
C% !" cm
acid
acetic glacial .i 8%" g carmin). ;mestecul se pune ntr-un *alon de sticl% se agit .i se a.eaz n
*ain-marie% ls3ndu-se s $iar* c3te1a minute. )e agit din nou .i se las s se rceasc4 se
$iltreaz .i se adaug c3te1a cristale de acetat de $ier (cu rol de mordant)% ce se dizol1 ncet n
soluie% e:cesul depun3ndu-se la *aza 1asului. )e pstreaz la ntuneric .i la rece (la $rigider).
Eta-e de lucru>
Pre4iAarea
&re$i:area materialului *iologic lipse.te% sau poate $i e$ectuat la $el ca la metoda Feulgen.
%iAarea
Fi:area nu este necesar4 se poate realiza n $i:ator alcool 2 acid acetic ( 2 1)% timp de 2 -
12 ore% sau cu alt $i:ator. #ac nu se continu lucrul% materialul poate $i pstrat la rece% n $iole cu
alcool '8F% *ine nc,ise.
*idrolia /i colorarea
Gidroliza .i colorarea se e$ectueaz simultan% n soluia carmin-acetic. 0ntr-o sticl de ceas
sau o capsul de porelan% se pun - " cm