Sunteți pe pagina 1din 251

Florin Stnic

Micronmulirea
plantelor horticole






Editura INVEL-Multimedia
Bucureti, 2004

Refereni tiinifici: Prof. univ. dr. Corneliu Petrescu
Prof. univ. dr. Alexandru Teodorescu





2004 Versiune electronic INVEL-Multimedia
Toate drepturile rezervate.

Nici un fragment din aceast publicaie nu poate fi reprodus, stocat ntr-un
sistem de recuperare a informaiilor sau transmis sub orice form sau prin
orice mijloace electronice, mecanice, fotocopiere, nregistrare sau de alt
natur, fr permisiunea prealabil, n scris, a editurii i autorului.




INVEL-Multimedia din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL
str. Fabrica de Chibrituri nr. 24-26, sector 5, Bucureti
Tel./Fax: 021/430.35.42, e-mail: invel_multimedia@pcnet.ro
Colecia www.teze_de_doctorat.ro

















ISBN 973-7753-07-0













Dedic aceast lucrare
studenilor i colaboratorilor mei
4
Cuvnt nainte

ntr-o er n care progresul tiinei i tehnicii a dus omul n cosmos, n adncurile
oceanului, i-a permis s ating viteze supersonice i s dezvolte inteligena artificial, culturile
in vitro de celule i esuturi vegetale au aprut, au evoluat i s-au dezvoltat n acelai ritm.
Ptrunderea n universul celulei, n intimitatea proceselor fiziologice i manipularea
materialului genetic sunt realizri comparabile cu cele prezentate mai sus, avnd aceeai
importan pentru umanitate.
Suntem n prezent n plin revoluie biotehnologic, materializat printr-un volum
imens de aplicaii practice ale culturilor in vitro n domeniul tiinelor agricole, biologice,
medicale, n farmacologie i industria alimentar, n industria cosmetic, a coloranilor naturali
i a substanelor bioactive.
Cercetrile n biotehnologie vizeaz rezolvarea unor probleme majore ale omenirii cum
sunt: criza energetic, malnutriia, valorificarea i conservarea resurselor genetice, reciclarea
materiei organice, luarea n cultur i valorificarea terenurilor degradate, reducerea polurii
mediului nconjurtor.
Aprut dintr-o necesitate obiectiv, lucrarea Micronmulirea plantelor horticole,
aflat la a doua ediie, actualizat i completat, trateaz un domeniu care st la baza oricrui
tip de producie agricol: obinerea de material sditor i semincer cu nalt valoare biologic.
Conceput ca un instrument de lucru, Micronmulirea plantelor horticole face n
prima parte, o prezentare ampl a dotrilor laboratorului de culturi in vitro., o trecere n revist
a componentelor mediilor de cultur, pentru a insista n continuare, asupra modului de
preparare i sterilizare a acestora.
Un capitol aparte este destinat sterilizrii i asepsiei n culturile in vitro.
Materialul abund n informaii utile, tabele ajuttoare, scheme de lucru i fotografii
sugestive, utile organizrii activitii n domeniul culturilor in vitro.
n a doua parte a lucrrii, sunt prezentate pe larg principalele tehnici folosite pentru
micronmulirea plantelor in vitro. Sunt prezentate, n tabele sintetice, rezultatele cercetrilor
pe tipuri de culturi, la principalele specii horticole.
5
Sunt prezentate, de asemenea alte tehnici de cultur in vitro cu aplicabilitate n
ameliorarea plantelor horticole, conservarea resurselor genetice, fitopatologie. O noutate n
literatura de specialitate romneasc este capitolul referitor la baby plant, o gam de produse
decorative obinute in vitro i deosebit de apreciate pe pia.
Lucrarea se nscrie pe linia continurii tradiiei nvmntului horticol bucuretean n
domeniul biotehnologiilor aplicate n horticultur i este un instrument util la ndemna
specialitilor, cadrelor didactice, studenilor, cercettorilor i tuturor celor care activeaz n
acest domeniu de vrf al tiinei.
Adresez cu aceast ocazie mulumiri, colaboratorilor mei, ef lucrri dr. Monica
Dumitracu, ef lucrri dr. Adrian Peticil, drd. ing. Oana Diaconescu i drd. ing. Ruxandra
Gl, referenilor tiinifici i Editurii INVEL-Multimedia.
Tuturor celor care se vor apleca asupra acestei lucrri, o vor studia i analiza critic, le
adresez mulumirile mele i invitaia de a ne transmite opiniile lor la adresa
flstanica@yahoo.co.uk, ajutndu-ne astfel, s mbuntim ediiile viitoare.

Bucureti, august 2004


Conf. univ. dr. Florin STNIC
6
CUPRINS

CAPITOLUL 1. Istoricul culturilor in vitro

CAPITOLUL 2. Laboratorul de culturi in vitro
2.1. Aspecte generale
2.2. Zona nesteril
2.2.1. Camera de pstrare i pregtire a materialului vegetal
2.2.2. Magazia de materiale
2.2.3. Magazia de substane chimice
2.2.4. Camera pentru pregtirea mediilor de cultur
2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultur i
presterilizarea materialului vegetal
2.2.6. Magazia pentru medii de cultur
2.2.7. Camera de cretere
2.2.8. Camera (spaiile) de aclimatizare
2.2.9. Sera i solariile
2.2.10. Spltorul
2.3. Zona steril

CAPITOLUL 3. Mediile de cultur i prepararea lor.
3.1. Constitueni cu rol nutritiv
3.1.1. Constitueni minerali
3.1.1.1. Macroelementele
3.1.1.2. Microelementele
3.1.2. Constitueni organici
3.1.2.1. Carbohidraii
3.1.2.2. Aminoacizii
3.1.2.3. Vitaminele
3.2. Constitueni cu rol fitoregulator.
3.2.1. Auxinele
3.2.2. Citochininele
3.2.3. Giberelinele
3.2.4. Alte substane cu rol fitoregulator
3.3. Constitueni cu rol stabilizator.
3.3.1. Apa
3.3.2. Agenii de solidificare
3.3.3. Stabilizatorii osmotici i de pH
3.3.4. Substanele antioxidante i absorbante
3.4. Concentraii. Prepararea soluiilor stoc.
3.5. Prepararea mediului de cultur
3.6. Probleme care apar la pregtirea i folosirea mediilor de cultur.

CAPITOLUL 4. Sterilizarea i asepsia n culturile in vitro.
4.1. Ageni sterilizani
4.2. Sterilizarea vaselor de cultur i a instrumentarului folosit
4.2.1. nchiderea vaselor de cultur
4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultur
4.2.3. Sterilizarea instrumentarului
7
4.3. Sterilizarea mediului de cultur i a apei
4.4. Dezinfectarea materialului vegetal
4.5. Contaminrile i detectarea lor

CAPITOLUL 5. Micronmulirea plantelor horticole
5.1. Consideraii generale
5.2. Fazele micronmulirii in vitro
5.2.1. Pregtirea materialului vegetal
5.2.2. Iniierea i stabilizarea
5.2.3. Multiplicarea
5.2.4. nrdcinarea
5.2.5. Aclimatizarea
5.3. Cultura de meristeme i apexuri
5.3.1. Clasificarea meristemelor
5.3.2. Cultura de meristeme
5.3.3. Cultura de apexuri
5.4. Cultura de fragmente uninodale
5.5. Cultura de lstari axilari

CAPITOLUL 6. Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro
6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme
6.2. Microaltoirea
6.2.1. Microaltoirea in vitro
6.2.2. Microaltoirea in vivo
6.2.3. Microaltoirea ex vitro
6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro

CAPITOLUL 7. Organogeneza in vitro
7.1. Organogeneza direct
7.1.1. Organogeneza adventiv de lstari
7.1.2. Organogeneza adventiv de rdcini
7.2. Organogeneza indirect

CAPITOLUL 8. Embriogeneza somatic
8.1. Formarea embrionilor somatici
8.2. Embriogeneza somatic direct
8.3. Embriogeneza indirect
8.4. Poliembrionia nucelar
8.5. ncapsularea materialului vegetal in vitro
8.5.1. Smna sintetic
8.5.2. ncapsularea unor organe i esuturi in vitro

CAPITOLUL 9. Embriocultura in vitro la plantele horticole

CAPITOLUL 10. Producerea haploizilor
10.1. Aspecte generale
10.2. Androgeneza in vitro
10.3. Fecundarea in vitro
8
CAPITOLUL 11. Cultura de calus in vitro.
11.1. Cultura de calus
11.2. Cultura de protoplati i hibridarea somatic
11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singur celul

CAPITOLUL 12. Baby plant
12.1. Consideraii generale
12.2. Tipuri de produse i materiale folosite la producerea de baby plant
12.2.1. Vase din sticl
12.2.2. Alte materiale
12.3. Folosirea mediilor de cultur colorate

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
9
CONTENTS

CHAPTER 1. History of in vitro cultures

CHAPTER 2. In vitro culture laboratory
2.1. General aspects
2.2. Unsterile area
2.2.1. Biological material preparation room
2.2.2. Materials storage room
2.2.3. Chemical storage room
2.2.4. Culture media preparation room
2.2.5. Culture media and biological material sterilization room
2.2.6. Culture media storage room
2.2.7. Growth chamber
2.2.8. Acclimation room
2.2.9. Greenhouse and tunnels
2.2.10. Washing room
2.3. Sterile area

CHAPTER 3. Culture media and their preparation
3.1. Nutrients
3.1.1. Mineral compounds
3.1.1.1. Macro elements
3.1.1.2. Microelements
3.1.2. Organic compounds
3.1.2.1. Carbohydrates
3.1.2.2. Amino acids
3.1.2.3. Vitamins
3.2. Growth regulators
3.2.1. Auxins
3.2.2. Cytokinins
3.2.3. Giberellins
3.2.4. Other growth regulators
3.3. Stabilization compounds
3.3.1. Water
3.3.2. Gelling compounds
3.3.3. Osmotic and pH stabilizers
3.3.4. Antioxidants and absorbents
3.4. Concentrations. Preparation of stock solution.
3.5. Culture medium preparation
3.6. Problems connected to the culture media preparation and use

CHAPTER 4. Sterilisation and asepsis for in vitro cultures
4.1. Sterilising agents
4.2. Culture vessels and tools sterilisation
4.2.1. Culture vessels closure
4.2.2. Culture vessels sterilisation
4.2.3. Tools sterilisation
4.3. Culture medium and water sterilisation
10
4.4. Biological material disinfection
4.5. Contamination and their detection

CHAPTER 5. Horticulture plants micropropagation
5.1. General aspects
5.2. In vitro micropropagation stages
5.2.1. Biological material preparation
5.2.2. Initiation and stabilisation
5.2.3. Multiplication
5.2.4. Rooting
5.2.5. Acclimatisation
5.3. Meristem and apex culture
5.3.1. Meristem classification
5.3.2. Meristem culture
5.3.3. Apex culture
5.4. Single node culture
5.5. Axillary shoots culture

CHAPTER 6. Horticultural plants virus elimination using in vitro cultures
6.1. Virus elimination using meristem cultures
6.2. Micrografting
6.2.1. In vitro micrografting
6.2.2. In vivo micrografting
6.2.3. Ex vitro micrografting
6.3. Virus free plant obtaining using other in vitro techniques

CHAPTER 7. In vitro organogenesis
7.1. Direct organogenesis
7.1.1. Adventitious shoot organogenesis
7.1.2. Adventitious root organogenesis
7.2. Indirect organogenesis

CHAPTER 8. Somatic embryogenesis
8.1. Somatic embryo formation
8.2. Direct somatic embryogenesis
8.3. Indirect somatic embryogenesis
8.4. Nucellar poliembriony
8.5. In vitro encapsulation of biological material
8.5.1. Synthetic seed
8.5.2. In vitro encapsulation of tissues and organs

CHAPTER 9. In vitro embrioculture in horticultural plants

CHAPTER 10. Haploid production
10.1. General aspects
10.2. In vitro androgenesis
10.3. Test-tube fertilisation

11
CHAPTER 11. In vitro callus culture
11.1. Callus culture
11.2. Protoplast culture and somatic hybridisation
11.3. Plant regeneration from a single cell

CHAPTER 12. Baby plant
12.1. General considerations
12.2. Products and materials used for baby plant production
12.2.1. Glass ware
12.2.2. Other materials
12.3. Use of coloured culture media

SELECTIVE REFERENCES

12
Capitolul 1
Istoricul culturilor in vitro

Cultivarea in vitro a unor celule i esuturi vegetale este o ramur a tiinelor
biologice ale cror nceputuri corespunde cu nceputul secolului XX.
Evoluia sa de-a lungul timpului a fost demn de secolul vitezei astfel nct, n
aceti ultimi ani, vorbim de un ansamblu de tehnici i metode in vitro grupate generic sub
numele de biotehnologii vegetale.
Teoria care a stat la baza acestei tiine a fost lansat ns cu mult timp nainte. n
1838, Schleiden i Schwan au afirmat c celulele vegetale sunt, ntr-o oarecare msur,
autonome i capabile s regenereze pri din plante sau plante ntregi. Aceast proprietate a
fost numit totipoten i a reprezentat o adevrat provocare pentru un mare numr de
oameni de tiin.
Primele ncercri nereuite de a cultiva esuturi vegetale in vitro s-au datorat lui
Haberlandt (1902). Au urmat apoi numeroase tentative care au deschis calea spre tot attea
domenii noi de cercetare.
Abia n 1939, dup descoperirea rolului hormonilor n creterea i dezvoltarea
plantelor, Nobecourt, Gautheret i White au obinut primele succese reale prin cultivarea in
vitro timp de mai multe subculturi a calusului.
Dup al doilea rzboi mondial, culturile in vitro s-au dezvoltat rapid datorit
multiplelor domenii de aplicabilitate: nmulirea industrial a plantelor, genetic,
ameliorarea plantelor, inginerie genetic, conservarea resurselor genetice, producia
industrial de substane utile. Trebuie adugat i rolul avut n dezvoltarea unor studii de
anatomie i fiziologia vegetal, fitopatologie, etc.
Stadiul atins n prezent deschide perspective ample n zorii mileniului III n ceea ce
privete manipularea materialului genetic i dirijarea proceselor de nmulire, cretere i
dezvoltare a plantelor n vederea obinerii unor noi forme productive.
Speranele umanitii se ndreapt spre gsirea unor soluii pe termen lung pentru
asigurarea necesarului de hran pentru o populaie aflat n cretere rapid.
Aceste soluii pot fi cutate n multitudinea de posibiliti pe care biotehnologiile in
vitro le au n ceea ce privete valorificarea superioar a resurselor genetice i modelarea

13
acestora n folosul omului. Pe lng obiectivul creterii productivitii ecosistemelor
agricole, se urmrete obinerea unor plante de cultur care s poat valorifica zonele
neproductive, deertice, srturate, etc.
n acelai timp se are n vedere extinderea i perfecionarea tehnologiilor de
obinere a unor noi produse de biosintez, cu aplicabilitate n industria alimentar,
farmaceutic, n industria coloranilor, zootehnie.
Cineva spunea parafrazndu-l pe Malraux, c: Secolul XXI va fi un secol al
biotehnologiei sau nu va fi deloc.
n tabelul 1.1. sunt prezentate cele mai importante etape din evoluia
biotehnologiilor vegetale.
Tabelul 1.1.
Istoricul culturilor vegetale in vitro
Anul Ipoteze, teorii, ncercri, realizri Autorii
0 1 2
1838 Teoria totipotenei celulare Schleiden i
Schwan
1892 Plantele sintetizeaz substane care sunt distribuite polar Sachs
1902 Primele ncercri de culturi de esuturi vegetale Haberlandt
1904 Prima ncercare de embriocultur la crucifere Hnnig
1909 Prima fuziune de protoplati nereuit Kuster
1922 Germinarea seminelor de orhidee in vitro n absena
simbionilor
Kundson
1922 Cultura in vitro a apexurilor de rdcin Robbins
1925 Embriocultura aplicat n ncrucirile interspecifice la
Linum
Laibach
1929 Folosirea embrioculturii pentru nlturarea
incompatibilitii la ncruciare
Laibach
1934 Primele ncercri nereuite de cultivare a esutului
cambial la arbori i arbuti
Gautheret
1934 Cultivarea in vitro a rdcinilor de tomate White
1936 Embriocultura la diferite gimnosperme La Rue

14
Continuare tabelul 1.1.
0 1 2
1939 Creterea timp de mai multe subculturi a calusului
obinut din esuturi vegetale
Nobecourt,
Gautheret, White
1940 Cultivarea esutului cambial de Ulmus i studierea
formrii lstarilor adventivi
Gautheret
1941 Folosirea pentru prima dat a laptelui de cocos pentru
cultivarea embrionilor de Datura
Van Overbeek
1944 Prima cultur de Nicotiana tabacum pentru studierea
formrii de lstari adventivi (organogeneza direct)
Skoog
1945 Cultura unor specii de Asparagus in vitro Loo
1946 Obinerea primelor plante de Lupinus i Tropaeolum Ball
1948 Organogeneza direct de lstari i rdcini la tutun sub
influena raportului auxin/adenin
Skoog i Tsui
1950 Regenerarea unor organe din calus la Sequoia
sempervirens
Ball
1952 Obinerea de plante de Dhalia devirozate prin culturi de
meristeme
Morel i Martin
1952 Realizarea primelor microaltoiri Morel i Martin
1953 Obinerea calusului haploid la Gingko biloba din polen Tulecke
1954 Obinerea unei plante ntregi dintr-o singur celul Muir i colab.
1955 Descoperirea chinetinei Miller i colab.
1956 Realizarea primelor culturi celulare n suspensie pentru
obinerea de produi secundari
Tulecke i Nickell
1957 Descoperirea influenei raportului citochinine/auxine
asupra proceselor de organogenez
Skoog i Miller
1958 Regenerarea in vitro a unor embrioni somatici din nucel
la Citrus
Maheshwari i
Rangaswamy
1958 Regenerarea de pro-embrioni din calus i suspensii
celulare la Daucus carota
Reinert i Steward
1959 Publicarea primei cri privind cultura de celule i
esuturi vegetale
Gautheret
1960 Prima polenizare in vitro la Papaver rhoeas Kanta

15
Continuare tabelul 1.1.
0 1 2
1960 Degradarea pereilor celulari pentru obinerea
protoplatilor
Cocking
1960 nmulirea vegetativ a orhideelor prin culturi de
meristeme
Morel
1962 Formularea i publicarea reetei mediului de cultur
Murashige & Skoog
Murashige & Skoog
1964 Obinerea primei plante haploide din grunciori de polen
la Datura
Guha i Maheswari
1964 Regenerarea de lstari i rdcini din calus de Populus
tremuloides
Mathes
1965 Inducerea nfloririi n esutul de tutun cultivat in vitro Aghion-Prot
1967 Inducia floral la Lunaria annua prin vernalizare in vitro Pierik
1969 Obinerea plantelor haploide de tutun din grunciori de
polen
Bourgin i Nitsch
1969 Prima izolare reuit de protoplati din suspensii celulare
la Hapopappus gracilis
Eriksson i Jonassen
1970 Selecia de mutani obinui cu ageni chimici in vitro Carlson
1970 Obinerea haploizilor la ovz prin embriocultur Kasha i Kao
1970 Realizarea cu succes a fuziunii de protoplati Power i colab.
1971 Regenerarea primei plante din protoplati Takebe i colab.
1972 Realizarea hibridrii interspecifice prin fuziunea de
protoplati la dou specii de Nicotiana
Carlson i colab.
1973 Folosirea citochininelor pentru ntreruperea dormansului
la explante de capitul la Gerbera
Pierik i colab.
1974 Inducerea lstririi axilare prin folosirea citochininelor n
cultura de apexuri la Gerbera
Murashige i colab.
1974 Regenerarea de haploizi din protoplati la Petunia
hybrida
Binding
1974 Obinerea de hibrizi prin fuziunea protoplatilor haploizi Melchers i Labib
1974 Transformarea genetic n cultura de esuturi vegetale Reinhard

16
Continuare tabelul 1.1.
0 1 2
1974 Descoperirea rolului plasmei Ti n formarea tumorilor la
Agrobacterium tumefaciens
Zaenen i colab.
Larebeke i colab.
1975 Selecia pozitiv n culturi de calus rezistente la
Helminthosporium maydis
Gengenbach i Green
1976 Iniierea culturilor din apexuri de lstari crioconservai
la garoaf
Seibert
1976 Hibridarea somatic interspecific prin fuziunea de
protoplati ntre Petunia hybrida i Petunia parodii
Power i colab.
1977 Integrarea plasmidei Ti de la Agrobacterium
tumefaciens n genomul plantelor
Chilton i colab.
1978 Hibridarea somatic ntre tomate i cartof Melchers i colab.
1979 Folosirea co-cultivrii pentru transformarea genetic a
protoplatilor vegetali cu Agrobacterium tumefaciens
Marton i colab.
1981 Introducerea termenului de variaie somaclonal Larkin i Scowcroft
1982 Introducerea de ADN pur n protoplati. Transformarea
cu ADN izolat devine posibil
Krens i colab.
1982 Fuziune de protoplati prin electrostimulare Zimmermann
1983 Hibridarea citoplasmatic intergeneric ntre ridiche i
rapi
Pelletier i colab.
1984 Transformarea celulelor vegetale cu plasmida ADN Paszkowski i colab.
1985 Infecia i transformarea discurilor foliare cu
Agrobacterium tumefaciens i regenerarea de plante
transformate
Horsch i colab.
Dup
1985
ncepe Era Organismelor Modificate Genetic
(OMG)



17
Capitolul 2
Laboratorul de culturi in vitro

2.1. Generaliti
Activitatea n domeniul culturilor in vitro se desfoar n laboratoare cu structur
i dotare specific.
Mrimea acestor laboratoare variaz de la civa zeci de metri ptrai, n cazul
structurilor cu finalitate didactic sau de cercetare, pn la suprafee de mii de metri ptrai
n cazul complexelor industriale de micronmulire (foto 2.1.).


Foto 2.1. Complexul industrial de micronmulire Vitroplant, Cesena, Italia

Dotarea laboratoarelor difer n funcie de volumul de material biologic care este
inoculat i crescut in vitro. Diferenele se refer n primul rnd la capacitatea unei anumite
structuri din dotare i nu la funciile acesteia.
Una din condiiile eseniale ale realizrii unui laborator este asigurarea cureniei
impecabile. Acest lucru nu se refer doar la pardoseli i perei, dar i la aer. Acesta trebuie
s fie lipsit pe ct posibil de particule de praf i bine-neles de spori de ciuperci sau
particule bacteriene care pot constitui surse de infecie.

18
Pentru realizarea unei curiri a aerului se recomand folosirea unor instalaii de
condiionare prevzute cu filtre de aer eficiente (ex. filtru HEPA). O soluie alternativ ar fi
folosirea unor instalaii de condiionare a aerului cu presiune pozitiv care sunt ns ceva
mai costisitoare.
O alt grup de faciliti se refer la controlul temperaturii n laborator. Acest
lucru se realizeaz, pentru spaiile comune, prin folosirea instalaiilor de nclzire
controlat cu diferite tipuri de agent termic.
O atenie deosebit se va acorda ns dirijrii temperaturii n camerele de cretere,
n camerele de aclimatizare i n ser. Sistemele care se vor folosi vor fi prevzute cu
senzori i sisteme de alarmare n caz de avarie pentru o reducere la minimum posibil riscul
pierderilor.
Laboratoarele industriale trebuie prevzute i cu grupuri electrogene care s fac
fa rapid penelor de curent.
Nu vor lipsi n orice laborator sistemele de dubl protecie, senzori de gaz, senzori
de temperatur (pentru depistarea incendiilor) i sistemele de alarmare corespunztoare,
lmpi de avarie, hidrani, extinctoare etc.
Laboratoarele vor fi dotate cu truse de prim ajutor i cu instruciuni precise
privind acordarea acestuia n caz de arsuri, intoxicaii i alte accidente posibile.
Nu n ultimul rnd se vor prevedea sisteme de protecie antiefracie i de protecie
a datelor, informaiilor i tehnologiilor folosite.
Laboratoarele de tip industrial (figura 2.2.) au suprafee de lucru mult mai ample,
fa de laboratoarele de cercetare sau didactice i bine-neles, cteva structuri
caracteristice.
n toate cazurile suprafaa unui laborator este mprit n dou zone:
- zona nesteril;
- zona steril.

19
camere
aclimatizare camer
transfer
" " n vivo
camer
repaos
sal de
edin
camer
medii
camer
steril
camer
culturi
autoclave
magazie
spltor
camer rece
birou
birou
mi croscopie
laborator
biochimie
virusologie
camer ambalare
ramp livrare
birou
ser

Figura 2.2. Structura unui laborator industrial de micronmulire
(modificat dup Gamborg, 1995)

2.2. Zona nesteril
Zona nesteril este reprezentat de totalitatea spaiilor n care asepsia nu este
obligatorie. Aceast zon este mprit n mai multe ncperi care vor fi prezentate n
continuare.
2.2.1. Camera de pstrare i pregtire a materialului vegetal
Pentru pregtirea materialului vegetal n vederea inoculrii este nevoie de o
ncpere curat, cu perei faianai i pardosii cu gresie. Dotrile obligatorii se refer la apa
curent, canalizare i curent electric (220 V, 50 Hz), iar cele opionale la frigidere,
dulapuri, mese, etc.
n aceast ncpere, materialul vegetal iniial provenit din cmp sau ser, este
sortat, curat (prin splare), fasonat, parafinat, eventual sterilizat superficial prin folosirea
unor fungicide i bactericide.

20
n cazul pstrrii mai ndelungate a materialului vegetal (bulbi, rizomi, tubero-
bulbi, tuberculi, smburi, semine, ramuri etc.) acesta este ambalat corespunztor i trecut
n frigider la 3-4 C.

2.2.2. Magazia de materiale
n funcie de amploarea activitii desfurate n laborator este necesar existena,
n anumite situaii, a unei magazii de materiale.
n aceast magazie se va pstra o gam larg de materiale cum ar fi: sticlria nou,
folii din aluminiu, din polietilen, ghivece noi, blocuri de repicat, tifon, vat, ambalaje
pentru livrarea materialului vegetal, etichete etc.

2.2.3. Magazia de substane chimice
Substanele chimice folosite pentru prepararea mediilor de cultur, pentru
sterilizarea materialului vegetal, spaiilor i instrumentarului se vor pstra ntr-o magazie
special amenajat n acest scop.
O astfel de ncpere este dotat cu:
- rafturi pentru substanele care se pstreaz la temperatura camerei;
- dulapuri pentru pstrarea substanelor la ntuneric;
- frigidere i congelatoare pentru pstrarea unor hormoni, vitamine, soluii stoc
etc.
- balane i inventar specific: scafe, spatule, vase pentru cntrire etc.
Foarte important este ca fiecare recipient cu substane s fie bine nchis, corect
etichetat i asigurat mpotriva rsturnrii, spargerii, deteriorrii, etc.
Pentru a uura cutarea unei anumite substane se recomand numerotarea
recipienilor i anexarea pe ua fiecrui dulap sau frigider a unui opis cu numerele de
identificare i coninutul acestora.
n acelai timp, substanele puternic toxice, corozive, cancerigene, inflamabile,
ntr-un cuvnt, periculoase, vor fi amplasate separat n locuri marcate corespunztor cu
indicatoare de avertizare.
Acidul clorhidric concentrat (HCl) i hidroxidul de amoniu (NH
4
OH) nu trebuie
pstrate n acelai loc, datorit riscului formrii de NH
4
Cl toxic, prin combinarea vaporilor
de clor i amoniac.

21
Substanele higroscopice trebuie pstrate n recipiente ermetic nchise i uneori n
esicatore.
Pentru a putea fi folosite substanele pstrate n congelator se vor introduce de
asemenea n esicatoare pn vor atinge temperatura camerei. Msura este obligatorie
pentru enzime i alte proteine i are ca efect eliminarea condensrii apei i reducerea
pierderilor de substan activ.
Pentru cazurile cnd se lucreaz cu substane volatile sau care eman gaze iritante
sau toxice se recomand ca n aceast magazie s existe i o ni cu ventilaie forat a
aerului.

2.2.4. Camera pentru pregtirea mediilor de cultur
Pregtirea mediilor de cultur este o operaie foarte important care presupune
existena unei camere prevzut cu dotri specifice (Foto 2.3.)


Foto 2.3. Camera pentru prepararea mediilor de cultur la Vitroplant Cesena

n ceea ce privete dotrile i instalaiile de baz, trebuie precizat c ncperea
trebuie s fie faianat i pardosit cu gresie sau materiale uor lavabile. Mesele, de regul
una aezat central i celelalte lng perei, trebuie s fie faianate i prevzute cu
minirafturi pentru sticlrie, etc. n camer vor mai exista dulapuri pentru pstrarea sticlriei
curate.

22
Camera trebuie prevzut cu instalaii de ap curent rece i cald (eventual cu un
boiler), chiuvete antiacid, canalizare, instalaie de gaz natural sau butelie, instalaie de
curent electric (220 V, 50 Hz). Toate instalaiile de mai sus trebuie prevzute cu sisteme de
protecie, robinete suplimentare, vane, circuite de mpmntare, tablouri cu sigurane
fuzibile, etc. conform normelor n vigoare.
Din inventarul camerei pentru pregtirea mediilor de cultur nu trebuie s
lipseasc un aparat pentru distilat ap, un deionizator, plite cu agitator magnetic, plite
diverse, eventual becuri cu gaze, cuptor de microunde, sisteme de filtrare (Millipore etc.),
balan analitic cu patru zecimale, balan cu dou zecimale, mixere, micropipete, pH-
metru, distribuitoare de mediu, cronometru de laborator etc.
Distribuitoarele de mediu pot fi simple de tipul unor seringi cu limitator gradat,
pentru volume de mediu cuprinse ntre 1 i 10-15 ml (foto 2.4. i 2.5.), sau de dimensiuni
mai mari de tipul unor cuve nclzite electric prevzute cu pompe aspiro-respingtoare,
pentru volume de mediu cuprinse ntre 25-200 ml (foto 2.6.).

Foto 2.4. Distribuitor-dozator pentru mediul de cultur (volume reduse)

Foto 2.5. Sering pentru repartizarea mediului de cultur

23


Foto 2.6. Repartizarea mediului de cultur n vase mari,
n flux industrial (Vitroplant)

De asemenea, se folosete sticlrie specific; pahare Berzelius, pahare
Erlenmayer, baloane cotate, cilindri gradai, pipete, biurete, vase pentru ap distilat.
Dup preparare mediul se repartizeaz n diferite tipuri de recipiente din sticl sau
mase plastice speciale. Pentru volume reduse de mediu se folosesc fie eprubetele, fie
vasele Petri.
Pentru cantiti mai mari de mediu se folosesc recipiente din sticl sau material
plastic de forme i mrimi diferite. nchiderea lor se face folosind diferite materiale i
soluii tehnice (vezi subcapitolul 4.2.1.).

2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultur i presterilizarea
materialului vegetal
Dup prepararea mediului de cultur i repartizarea n vase acesta este trecut n
camera de autoclavare. Aceast ncpere este dotat cu instalaie de curent electric
(recomandabil 380 V), instalaie de gaz, instalaie de alimentare cu ap i autoclave.

24
Autoclavele sunt instalaii complexe, prevzute cu instrumente pentru controlul
temperaturii i presiunii, temporizatoare i dispozitive de siguran folosite pentru
sterilizare n mediu umed (autoclavare).
Parametrii de lucru a unui autoclav sunt n general 121C, pentru temperatur i
1,1 atmosfere, pentru presiune.
Dup sursa de energie autoclavele sunt de dou feluri: electrice i cu gaz, iar dup
tipul constructiv sunt verticale sau orizontale (foto 2.7. i 2.8.). Volumul util al unui
autoclav variaz de la civa litri pn la cteva sute de litri, n funcie de cantitatea de
mediu care se autoclaveaz n mod uzual.


Foto 2.7. Autoclav orizontal
de capacitate redus
Foto 2.8. Autoclav vertical
de capacitate medie

n complexele industriale de micronmulire se folosesc autoclave orizontale de
mare capacitate prevzute cu dou ui:
- una pentru umplere din camera pentru pregtirea mediului de cultur;
- una pentru golire din camera pentru pstrarea mediului sau din zona steril.
n autoclave, vasele cu mediu se introduc n couri speciale sau n pupinele.
n anumite situaii n camera de autoclavare care se afl n vecintatea zonei
sterile se face i o presterilizare a materialului vegetal pregtit pentru inoculare.
Presterilizarea se face prin imersarea acestuia n soluii de fungicide i/sau
bactericide urmnd apoi sterilizarea propriu-zis sub hota cu filtru laminar.

25
2.2.6. Magazia pentru medii de cultur
Dup autoclavare, mediile de cultur trebuie s fie pstrate cel puin 24 de ore
nainte de a fi folosite. Acest lucru se poate face ntr-o ncpere perfect curat situat n
vecintatea camerei de inoculare.
Pstrarea trebuie fcut la ntuneric pentru a preveni degradarea compuilor
fotolabili sub influena luminii. n acelai timp, temperatura de pstrare se recomand s
fie ct mai sczut (ideal 3-4C). Unele laboratoare industriale folosesc camere frigorifice
special amenajate pentru pstrarea mediului de cultur, dar i pentru pstrarea vaselor cu
explante pentru ealonarea produciei de material vegetal n funcie de cerine, comenzi,
anotimp, etc.
n laboratoarele mici pstrarea vaselor cu mediul de cultur se poate face n
dulapuri bine nchise n apropierea camerei sterile.
Pstrarea mediului de cultur nu trebuie fcut pe o perioad mai mare de 14 zile
ntru-ct crete riscul deteriorrii caracteristicilor acestuia.

2.2.7. Camera de cretere
Dup inocularea explantelor pe mediul de cultur vasele sunt trecute n camera de
cretere. Ca i celelalte ncperi ale laboratorului, aceasta trebuie s fie perfect curat,
faianat i s fie totodat dotat cu instalaii specifice (Foto 2.9.).

Foto 2.9. Una din camerele de culturi ale firmei Vitroplant Cesena, Italia

26
ntreaga camer este ocupat cu rafturi pe care se aeaz vasele de cultur.
Distana dintre dou polie pe vertical este de minimum 40-50 cm, iar nlimea total n
jur de 2 m. Limea unei polie este de 1-2 m.
Poliele se realizeaz din materiale care s permit circulaia aerului printre vase
evitndu-se astfel supranclzirea mediului de cultur.
Pentru aezarea eprubetelor pe rafturi se folosesc supori, de regul nclinai, care
permit o mai bun iluminare a explantelor.
Un alt element important n camera de cretere este reprezentat de instalaia de
iluminat. Realizat n general din tuburi fluorescente distanate la 15-20 cm unele de altele,
aceast instalaie trebuie s aib nite caracteristici tehnice bine stabilite.
Astfel, intensitatea luminoas trebuie s fie de 3000-4000 de luci. Se cunosc
situaii cnd se recurge la intensiti mai reduse sau chiar la lipsa total a luminii:
- timp de 3-4 zile dup inocularea meristemelor pentru reducerea oxidrilor;
- n anumite culturi de calus;
- n embriogeneza somatic la conifere;
- n faza de inducie naintea fazei de organogenez direct din limb foliar;
Frecvent este nevoie de lumin diferit colorat pentru obinerea unor rezultate mai
bune la diverse tipuri de culturi.
Intereseaz apoi lungimea ciclurilor lumin-ntuneric. De regul durata zilei
este stabilit la 6-12 ore, restul pn la 24 fiind ocupate de ntuneric. Rezultatele obinute
de Teodorescu Al. i colab. (1994, 1995) la ICPP Piteti-Mrcineni au dovedit c prin
reducerea lungimii ciclurilor de lumin se realizeaz importante economii de energie. Pe
baza rezultatelor obinute, autorii recomand reducerea duratei de iluminare cu 4-6 ore pe
zi, respectiv realizarea unui fotoperiodism de 12-10 ore.
Un alt parametru care trebuie controlat este nivelul temperaturii n camera de
cretere. n general, temperatura folosit este 22-24C1C, Trebuie precizat c n funcie
de specie, tipul de cultur i scopul urmrit temperatura poate s varieze ntre 10 i 32C.
n general, speciile provenite din zonele calde cresc bine la temperaturi mai ridicate (26-
28C).
Umiditatea este un alt factor esenial. Valoarea optim a umiditii aerului n
camere de cretere este de 80-85%, Scderea umiditii sub aceast valoare duce la
deshidratarea rapid a mediului de cultur cu consecine grave asupra explantelor.

27
Controlul factorilor de mediu n camera de cretere trebuie s fie fcut riguros,
acest lucru influennd direct mersul culturilor. Pentru a urmri evoluia temperaturii i
umiditii n camerele de cretere acestea sunt prevzute cu termohigrometre.
Orice avarie trebuie semnalat imediat prin intermediul unor sisteme de avertizare
luminoase i sonore.

2.2.8. Camera (spaiile) de aclimatizare
Aclimatizarea este etapa cea mai dificil n desfurarea procesului de
micronmulire. Pentru reuita acestei operaii trebuie s se dispun de spaii prevzute cu
instalaii eficiente de iluminare, nclzire i umidificare a aerului.
n mod frecvent, n complexele industriale, aclimatizarea se face n solarii sau sere
speciale (Foto 2.10.).

Foto 2.10. Sera cu dubla protecie, folosit la aclimatizarea
materialului micronmulit (Vitroplant)

Cu ct controlul factorilor de mediu este mai bun, cu att se reduc riscurile
pierderii de material n procesul aclimatizrii. Dirijarea factorilor de mediu pe parcursul
fazei de aclimatizare este prezentat n subcapitolul 5.2.5.


28
2.2.9. Sera i solariile
Materialul aclimatizat este trecut apoi n solarii sau sere pentru a-i desfura
primele faze de cretere nainte de livrare sau nainte de a fi folosit n cmp. Acest proces,
numit fortificare, are loc n structuri prevzute cu sisteme de control al factorilor de
vegetaie, n special umiditate i temperatur (foto 2.11. i 2.12.).
Mrimea suprafeelor ocupate cu sere i solarii depinde de cantitatea de material
nmulit.

Foto 2.11. Ser folosit pentru fortificarea materialului aclimatizat (Vitroplant)


Foto 2.11. Vi de vie n container fortificat ntr-un solar (Vitroplant)

29
O soluie economic de realizare a unei sere de dimensiuni mai reduse este
amplasarea acestei pe partea de sud a construciei care gzduiete laboratorul. Acoperiul
se poate construi cu o singur pant, unul din perei fiind reprezentai de peretele cldirii
(figura 2.2.).

2.2.10. Spltorul
Spltorul este o ncpere prezent n orice fel de laborator de micronmulire.
Aa cum spuneam mai devreme de gardul de curenie depinde n bun msur
sntatea culturilor i bunul mers al activitii.
n spaiul reprezentat de spltor se cur sticlria i celelalte componente ale
instrumentarului folosit pentru realizarea culturilor in vitro.
ncperea trebuie s fie faianat i prevzut cu instalaii specifice de alimentare
cu ap, canalizare, alimentare cu curent electric i eventual gaze.
n spltor trebuie s existe mai multe chiuvete (unele cu scurgtor) alimentate cu
ap cald sau rece. n lipsa unei instalaii de ap cald aceasta se poate obine cu ajutorul
unui boiler electric sau cu gaze (tip Vaillant).
Pentru splarea sticlriei mai sunt necesare vase din plastic de diferite dimensiuni,
perii i detergeni.
Din spltor sunt nelipsite scurgtoarele de tot felul pentru vase mari, pentru vase
de cultur, pentru eprubete. Vor fi prezente i recipiente cu amestec cromic folosit la
splarea sticlriei (atenie, este puternic toxic i coroziv, vezi subcapitolul 4.2.) i
recipiente cu ap distilat folosit la cltire.
n laboratoarele de mari dimensiuni se folosesc perii electrice pentru uurarea
splrii, sau chiar maini i instalaii pentru splat care efectueaz toate operaiile de
splare, cltire i uscare a sticlriei.
Dup nlturarea mediului de cultur din vase acestea se spal superficial n curent
de ap fierbinte i se trec apoi ntr-un vas cu ap cald cu detergeni.
n cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea s fie autoclavate nainte
de a fi deschise pentru a se evita rspndirea infeciei n laborator.
Vasele folosite pentru topirea mediului sau pentru distribuirea mediului cu agar
vor fi splate imediat cu ap fierbinte pentru a se evita rcirea agarului i fixarea pe pereii
acestuia.

30
Tehnologia modern presupune i existena unor maini de splat cu ultrasunete,
extrem de eficiente (foto 2.12.).

Foto 2.12. Main de splat cu ultrasunete

Dup splarea propriu-zis, sticlria se cltete n ap curent i este trecut ntr-
un alt vas cu ap distilat unde va fi lsat timp de mai mult ore. Urmeaz apoi zvntarea
pe scurgtoare i depozitarea n dulapuri speciale destinate acestui scop, pn n momentul
folosirii.
Mediul de cultur i celelalte resturi se vor colecta n pungi din plastic care se vor
lega i duce n spaii de colectare a gunoiului.
Pentru laboratoarele mici uneori spltorul face parte integrat din camera de
pregtire a mediului de cultur
n aceleai situaii, n spltor se poate face i pregtirea materialului vegetal
pentru inoculare. Este vorba, n special de operaiile de splare, presterilizare i eventual
fasonare a materialului.
n ceea ce privete organizarea activitii de splare a sticlriei i instrumentarului
n laborator trebuie precizat c n micile laboratoare nu exist personal angajat special
pentru acest scop. De aceea trebuie instituit regula potrivit creia fiecare din cei care
lucreaz n laborator trebuie s lase n urma sa aa cum a gsit, adic curat.
Fiecare i va spla sticlria folosit, o va depozita n locurile special destinate, n
ordine i va cura spltorul la terminarea activitii.

31
Tot n ansamblul de reguli dup care trebuie organizat activitatea n laboratoarele
didactice i de cercetare se nscrie i planificarea aciunilor pe zile i persoane, realizndu-
se astfel un flux continuu fr suprapuneri sau goluri.

2.3. Zona steril
"Inima" laboratorul de culturi in vitro este reprezentat de camera steril. n acest
spaiu se execut toate operaiile de sterilizare, inoculare i transferuri pe mediul de cultur
n condiii sterile.
Camera steril trebuie s fie ferit de orice surs de praf i murdrie. n acest sens
ferestrele vor fi prevzute cu un sistem de filtrare iar dac este posibil ncperea va avea la
intrare o camer tampon.
Laboratoarele mai sofisticate au instalaii de climatizare cu presiune pozitiv de
aer steril care mpiedic ptrunderea prafului, sporilor sau altor forme ale agenilor
patogeni din exterior.
n trecut sterilizarea spaiului interior se realiza cu ajutorul unor lmpi cu
ultraviolete. Era apoi obligatorie aerisirea ncperii pentru eliminarea ozonului care se
formeaz. Cu aceast ocazie era posibil ca n ncpere s ptrund din nou spori de
ciuperci, bacterii i alte microorganisme, iar operaia era ineficient. n plus, ozonul este
toxic i puternic mutagen i crete astfel riscurile expunerii personalului la accidente.
Componenta de baz a camerei sterile este hota (nia) steril. Folosind un sistem
de filtrare complex hota creeaz, ntr-un spaiu nchis, un flux de aer steril care se
deplaseaz cu o anumit vitez spre operator.
Exist mai multe tipuri constructive de hote care funcioneaz pe acelai principiu:
mpingerea cu ajutorul unor ventilatoare a aerului printr-o baterie de filtre, reinerea
particulelor de praf i a microorganismelor i formarea unui flux de aer steril care iese din
incinta steril, "mpiedicnd n acelai timp ptrunderea aerului nesteril din exterior.
Cele mai folosite hote sterile sunt hotele cu flux laminar orizontal. Ele pot avea un
post de lucru, dou sau mai multe (foto 2.13.)

32

Foto 2.13. Hota steril cu flux laminar orizontal

Pentru lucrri n care se folosesc ageni patogeni sau transformri cu
Agrobacterium tumefaciens se recomand s se foloseasc hote sterile cu flux vertical care
mpiedic rspndirea acestor microorganisme n exterior (foto 2.14.).


Foto 2.14. Hota steril cu flux vertical

n general, o hot este alctuit dintr-o baterie de ventilatoare n partea din spate,
prefiltre care rein particulele de praf mai grosiere i bateria de filtre bacteriologice care
reine particule mai mari de 0,2 m.
n partea din fa hota prezint o minicamer cu un perete liber alctuit dintr-o
mas de lucru, acoperit cu tabl din inox, doi perei laterali transpareni i un sistem de
iluminare cu tuburi din neon n partea de sus.
Hotele de construcie mai veche erau prevzute i cu lmpi de U.V. folosite pentru
sterilizare.

33
n acelai timp hota prezint una sau mai multe prize electrice pentru a asigura
sursa de curent pentru microscoape, lupe binocular, minibalane, incineratoare (Bacti-
Cinerator) sau sterilizatoare electrice pentru instrumentar (foto 2.15.).

Foto 2.15. Hot modern pentru lucrri de cercetare (Vitroplant)
Acolo unde exist instalaie cu gaz la hot se ataeaz 1-2 becuri Mnsen cu gaz
pentru flambarea instrumentarului (foto 2.16.). Hota mai este dotat cu ntreruptoare
precum i eventual cu un regulator de turaie a ventilatorului care modific viteza fluxului
de aer.
n timpul lucrului n hot se vor gsi de asemenea, supori pentru instrumentar
steril, (ace, spatule, pense, bisturie etc.), un pulverizator cu alcool pentru dezinfecia
exteriorului vaselor de cultur, a masei i a minilor operatorului precum i materiale
pentru nchiderea vaselor de cultur (folie de aluminiu, folie autosigilant, etc.).

Foto 2.16. Dotare minimal ntr-o hot cu flux laminar steril

34
n camera steril trebuie s mai existe scaune (eventual rotative, ergonomice, etc.)
msue pentru depunerea vaselor cu medii, a vaselor folosite la sterilizarea materialului, a
sticlelor cu ageni sterilizani i ap, a materialului vegetal pregtit pentru sterilizare).
Foarte practice sunt msuele multietajate cu rotile care se pot deplasa uor dintr-un loc n
altul (foto 2.17).
Foarte importante sunt lucrrile de ntreinere a hotei. Acestea constau n primul
rnd n curirea prefiltrelor cu ajutorul unor aspiratoare. Cele mai eficiente sunt cele care
funcioneaz fr sac de praf, cu colectarea impuritilor n ap (tip Rainbow).
n cazul folosirii intense, bateria de filtre trebuie schimbat anual.


Foto 2.17. Msu multietajat cu rotile

n acelai timp, se va acorda o atenie deosebit cureniei n camera steril. Zilnic
se va spla podeaua cu ap i detergeni specifici, se vor terge pereii i n general, se vor
nltura orice surse posibile de praf.
La intrarea n camera steril se va schimba mbrcmintea i nclmintea,
aceasta din urm fiind principala surs de praf i ageni contaminani.
nainte de nceperea lucrului cu cel puin 20-30 de minute, hota se pornete pentru
a se steriliza interiorul incintei. De asemenea, se pulverizeaz alcool de 96% pe partea
interioar a acesteia i pe vasele cu medii sau celelalte materiale care se introduc sub hot.
35
Capitolul 3
Mediile de cultur i prepararea lor

Mediul de cultur reprezint suportul fizic i chimic necesar pentru creterea i
dezvoltarea explantelor in vitro.
Graie unor cercetri minuioase efectuate de-a lungul timpului un mare numr de
cercettori au formulat diferite reete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturi in
vitro la marea majoritate a speciilor vegetale.
Momentul de rscruce n acest domeniu l-a reprezentat anul 1962, cnd
T. Murashige i F. Skoog au publicat reeta de mediu care le poart numele, realizat iniial
pentru culturi de esuturi de tutun.
Acest mediu a fost apoi preluat cu succes n nenumrate situaii, la cele mai diferite
specii, fiind n prezent cea mai folosit reet de mediu, alturi de varianta modificat
Linsmaier&Skoog (LS, 1965). Diferena dintre cele dou reete const n nefolosirea
acidului nicotinic, piridoxinei, glicinei i creterea concentraiei de tiamin la 0,4 mg/l, n
cazul variantei modificate, LS.
Alte reete de medii larg folosite sunt B5 (Gamborg i colab. 1968), N6 (Chu,
1978), Nitsch&Nitsch (NN, 1969). Pentru cultura in vitro a speciilor pomicole dar i a
altor plante lemnoase se folosesc mediile Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW
(Driver&Kuniyuki, 1984) i WPM Lloyd and McCown, 1980).
Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un mediu de cultur sunt:
- s corespund cerinelor nutritive i hormonale ale speciei cultivate pentru faza n
care se gsete (stabilizare, proliferare, calogenez, nrdcinare, etc.);
- s asigure condiii optime de cretere i dezvoltare n ceea ce privete presiunea
osmotic, pH-ul, umiditatea, etc.
- s fie echilibrat din punct de vedere ionic;
- s nu conin ioni sau substane toxice;
- s fie uor de preparat i reproductibil;
- s fie stabil dup autoclavare (s-i menin neschimbat compoziia i
caracteristicile fizico-chimice;
36
- s fie ieftin i s conin ct mai puini constitueni naturali costisitori i
neomogeni;
- eventual, s poat fi reciclat.
Mediile folosite la cultura in vitro a explantelor vegetale au n general o structur
complex, fiind alctuite dintr-un mare numr de constitueni de natur divers i cu rol
diferit.
Aceti constitueni pot s fie grupai n:
- constitueni cu rol nutritiv: elemente minerale: macro i microelemente i
elemente organice: zaharuri (ca surs de carbon), aminoacizi (ca surs de azot organic) i
vitamine;
- constitueni cu rol hormonal fitoregulator al creterii i dezvoltrii explantelor in
vitro: auxine, citochinine, gibereline i alte substane cu rol stimulator sau inhibitor: acid
abscisic, etilen, colchicin, paclobutrazol, etc.
- constitueni cu rol n stabilizarea mediului de cultur: apa, ageni de solidificare,
stabilizatori osmotici i de pH, antioxidani i substane absorbante.

3.1. Constitueni cu rol nutritiv
3.1.1. Constitueni minerali
Substanele minerale care intr n componena mediilor de cultur sunt sruri care
conin cele 6 macroelemente fundamentale: azotul (N), fosforul (P), potasiul (K), calciul
(Ca), magneziul (Mg) i sulful (S) precum i un mare numr de microelemente: fier (Fe),
mangan (Mn), zinc (Zn), aluminiu (Al), bor (B), cupru (Cu), molibden (Mo), sodiu (Na),
cobalt (Co) i iod (I).
3.1.1.1. Macroelementele
Concentraia macroelementelor folosite variaz n limite destul de largi, n mod
obinuit, folosindu-se cantiti de 1-40 mM, respectiv, 300-19.000 mg/l.
Microelementele se folosesc n concentraii mult mai reduse de ordinul
micromolilor, respectiv 0,0025-0,5 mg/l.
n funcie de concentraia molar total mediile de cultur se mpart n trei
categorii:
- medii concentrate (36-50 mM): Murashige & Skoog, Quoirin & Lepoivre, Eriksson, etc.;
- medii cu concentraie mijlocie (27-35 mM): Nitsch&Nitsch;
- medii cu concentraie sczut (7-26 mM): White, Heller;
37
Foarte important este compoziia ionic a mediilor de cultur tiindu-se c n
soluie srurile disociaz n ionii componeni. Trebuie avut n vedere echilibrul acestor ioni
i posibilitatea de a se combina i de a forma compui toxici greu solubili sau insolubili.
n general toate mediile de cultur conin urmtorii ioni: NH
4
+
, K
+
, Ca
2+
, Mg
2+
,
Na
+
, NO
3
-
, PO
4
3-
, SO
4
2-
, Cl
-
.
Prin folosirea preponderent a srurilor sub form de cloruri crete concentraia
ionului Cl
-
care nefiind folosit n nutriie, are efect toxic asupra explantelor determinnd
clorozarea i ulterior moartea acestora. Efecte similare are i excesul de sodiu (Na
+
) din
mediul de cultur.
Dintre macroelemente un rol important este jucat de azot. Acesta este furnizat n
mediul de cultur prin folosirea azotailor de amoniu, potasiu, calciu, sodiu, etc.
n soluie se gsete att azot sub form nitric (NO
3
-
) ct i sub form amoniacal
(NH
4
+
).
Rolul celor dou forme de azot este diferit i uneori cercetrile efectuate au scos n
eviden rezultate contradictorii. Astfel, ntr-o prim faz, s.a afirmat c ionul amoniu
(NH
4
+
) ar induce formarea embrionilor somatici la morcov spre deosebire de ionul nitrat
(NO
3
-
) care nu ar avea acest efect (Halperin i Wetherell 1967, citai de Cachi, 1987).
Totui experienele lui Reinert i colab. (1966), au dovedit c este posibil
obinerea de embrioni din esut de morcov pe un mediu care coninea numai ioni nitrat
(NO
3
-
).
Important este raportul n care se gsesc cei doi ioni n mediul de cultur. n marea
majoritate a reelelor folosite, raportul NH
4
+
/NO
3
-
este de 1/2-1/3, putnd s ajung la 1/5.
Azotul are un rol fiziologic deosebit de important, fiind indispensabil n
metabolismul proteic i glucidic. Lipsa azotului sau carena acestuia determin acumularea
antocianilor n vacuole i moartea rapid a celulelor.
La salat, absena azotatului de amoniu din mediul de cultur a determinat formarea
calusului din cotiledoane fr a se obine nici un fel de tip de regenerare.
Fosforul are i el un rol important n metabolismul general al explantelor prin
formarea compuilor nucleotizi cu valoare energetic ridicat (ADP i ATP) care
realizeaz captarea, pstrarea i eliberarea energiei chimice i care sunt determinani n
biosinteza acizilor nucleici (Neamiu i colab. 1989).
38
Dup azot, cea mai mare pondere o deine potasiul (K). Acesta s-a dovedit a fi de
nenlocuit datorit rolului pe care-l are n reglarea permeabilitii membranei celulare i a
vscozitii protoplasmei. Este deosebit de activ n cadrul schimburilor de ioni la nivelul
membranelor celulare i este cerut n cantiti mai mari de ctre explantele tinere la nivelul
crora determin activarea diviziunii celulare.
Carena potasiului se concretizeaz prin reducerea creterii sau chiar involuia
explantelor de tutun. La aceeai specie i la via de vie, cultivarea pe medii bogate n
potasiu a avut ca efect stimularea creterii explantelor (Heller 1947-1953, citat de Cachi,
1987).
Calciul este prezent n majoritatea mediilor de cultur sub form de clorur de
calciu (CaCl
2

.
2H
2
O) sau azotatul de calciu (Ca(NO
3
)
2

.
4H
2
O).
Alturi de potasiu, calciul are un rol important n reglarea permeabilitii
membranelor la nivel celular. Este cunoscut, de asemenea i rolul antitoxic al calciului.
Avnd n vedere faptul c este solicitat n cantiti mai mari n metabolismul
esuturilor senescente datorit acumulrii n membrane, la culturile meristematice in vitro
nevoile de calciu sunt mult mai reduse.
Totui carena calciului determin necrozarea apexurilor la lstarii cultivai in vitro
iar lipsa lui duce la moartea celulelor.
Mrirea concentraiei de calciu din mediu prin adugarea clorurii de calciu (CaCl
2
)
trebuie fcut cu discernmnt pentru c peste anumite limite se manifest toxicitatea
ionilor de clor (Cl
-
).
La cultivarea gutuiului pe un mediu Quiorin & Lepoivre (1977) bogat n calciu
apar uneori simptome de cloroz datorit blocrii fierului (Stnic, 1996).
Magneziul intr n compoziia clorofilei i carena sa determin perturbri
importante n funcionarea frunzei, ducnd n final la moartea explantului.
Relaia Ca-Mg este foarte strns, cele dou macroelemente putndu-se chiar
substitui n anumite reacii metabolice.
Sulful intr n compoziia multor aminoacizi eseniali i este nelipsit din mediile de
cultur unde se afl n componena ionului sulfat (SO
4
2-
). Reducerea coninutului de clor
din mediul de cultur prin nlocuirea clorurilor cu sulfai are ca efect o cretere a
concentraiei sulfului.
39
Anumite medii de cultur sunt foarte bogate n sulf: DKW pentru nuc (Driver i
Kuniyuki, 1984), Litvay pentru conifere (Litvay i Johnson, 1981).

3.1.1.2. Microelementele
Microelementele folosite n culturile in vitro sunt n numr mai redus fa de cele
folosite n soluiile nutritive complexe iar concentraiile uzuale sunt asemntoare pentru
majoritatea mediilor de cultur.
Dintre microelemente, fierul se administreaz n cantiti mai mari. Pentru a fi uor
asimilabil se folosete chelatul de fier (NaFeEDTA) care se pregtete din sulfat feros
(FeSO
4

.
7H
2
O) i sare disodic a acidului etilen- diamino-tetraacetic (Na
2
EDTA
.
2H
2
O).
Raportul dintre cei doi compui trebuie s fie de 1:2 adic, pentru 100 M FeSO
4
.
7H
2
O,
trebuie s se dizolve 200 M de Na
2
EDTA
.
2H
2
O. Concentraia uzual a ionului Fe
2+
este
n jur 100 eq.
Excesul de fier bivalent (Fe
2+
) determin oxidarea acestuia la fier trivalent (Fe
3+
) i
formarea de fosfat feric care precipit i crete turbiditatea mediului de cultur.
Fierul este catalizatorul multor procese redox i are rol esenial n fotosintez, n
activitatea citocromilor respiratori i n sinteza proteic.
Carena fierului se manifest prin clorozarea esuturilor verzi i blocarea
diviziunilor celulare n esuturile meristematice.
Manganul particip la o serie de activiti enzimatice iar la conifere s-a dovedit c
poate nlocui ntr-o anumit proporie, magneziul (Clarkson i colab., 1980, citat de Enescu
V. i colab. 1994). Are de asemenea un rol important n sinteza proteic.
Carena manganului determin blocarea sintezei ARN-ului n rdcinile de mazre.
Zincul este implicat n sinteza auxinei, a ARN-polimerazei i a unor
dehidrogenaze. Lipsa acestuia determin dereglri n sinteza triptofanului (precursor al
auxinei endogene), nglbenirea i necroza esuturilor tinere.
Aluminiul folosit numai n anumite medii de cultur (Heller) n cantiti foarte
mici are rol de catalizator al unor reacii biochimice.
Borul este utilizat sub form de acid boric (H
3
BO
3
) n concentraii relativ ridicate
(1-10 mg/l). Rolul su preponderent se refer la reglarea proceselor de diviziune celular i
cretere.
Carena de bor se manifest prin brunificarea i necrozarea esuturilor.
40
Cuprul particip la multe reacii redox i este foarte important n embriogenez. Se
folosete sub form de sulfat de cupru (CuSO
4

.
5 H
2
O) n concentraii de 0,025 mg/l (0,1
mM).
Molibdenul se pare c are un rol important n activitatea nitrat-reductazei. Alturi
de iod intr n componena unor enzime i particip la procesele nutriionale ale
explantelor.
Cobaltul este folosit n concentraii foarte sczute sub form de clorur de cobalt
(CoCl
2

.
6H
2
O). Rolul su n metabolismul esuturilor vegetale in vitro este necunoscut, ca
de altfel cel al nichelului.

3.1.2. Constitueni organici
3.1.2.1. Carbohidraii
Carbohidraii (zaharurile) sunt folosite n culturile in vitro ca surs de carbon i
energie, dat fiind faptul c explantele cultivate n astfel de condiii au o nutriie
preponderent heterotrof.
Prin hidrolizarea carbohidrailor celulele vegetale i procur cantitatea de energie
necesar desfurrii proceselor vitale. Trebuie spus c glucidele produse prin fotosintez
in vitro de ctre esuturile verzi nu satisfac nici pe departe nevoile energetice globale ale
acestora i nevoia de componeni structurali cum ar fi unele polizaharide (celuloza i
amidonul).
Dintre zaharuri cel mai mult folosit este zaharoza n concentraie de 2-3%. La
unele specii (Malus robusta) s-a folosit cu rezultate bune sorbitolul, n timp ce glucoza a
fost folosit tot la specii lemnoase n concentraie de 3%. n diferite experimente s-au
folosit i alte glucide cum ar fi: fructoza, maltoza, rafinoza sau chiar dextrina i amidonul.
n cantiti crescnde de la 1% la 3%, zaharoza a stimulat creterea explantelor de
morcov (Gautheret, 1959), iar reducerea concentraiei la 2-3%, a determinat alungirea
lstarilor la pin, molid i larice (Aitken, J. i colab. 1981, citai de Enescu V. i colab.
1994).
Trebuie precizat i rolul important pe care l au carbohidraii n echilibrarea
presiunii osmotice a mediului de cultur. Creterea concentraiei de zaharoz peste anumite
limite are ca efect creterea presiunii osmotice i plasmolizarea celulelor explantelor.
41
O serie de cercettori au pus problema faptului c mediile de cultur artificiale prin
concentraia ridicat de carbohidrai exercit o presiune osmotic "nenatural" asupra
explantelor. De aici necesitatea unor studii privind posibilitile de reducere a cantitilor
de carbohidrai din mediile de cultur precum i gsirea altor substane cu rol similar
(ESNA WG4, Buteni, 1996).

3.1.2.2. Aminoacizii
Aminoacizii sunt folosii n mediile de cultur i ca surse suplimentare de azot
organic. Pe lng aceasta s-a dovedit c ei au rol n diferite procese inductive.
Dintre aminoacizi, glicina este cel mai des folosit. nc din 1939, White a subliniat
c glicina stimuleaz creterea rdcinilor de tomate (Cachi, 1987).
Gautheret (1959), de asemenea, subliniaz rolul aminoacizilor n formarea
calusului. Ali aminoacizi ca glutamina, arginina i prolina stimuleaz proliferarea
calusului la pin (David H. i colab. 1984).
S-a constatat c n cazul folosirii aminoacizilor, izomerii levogiri (L) sunt mai
eficieni dect cei dextrogiri (D).
Dozele de folosire a aminoacizilor variaz de la 2 mg/l pentru glicin, la 10 mg/l
pentru L-arginin i cistein i pn la 100 mg/l pentru asparagin i L-tirozin.

3.1.2.3. Vitaminele
Vitaminele sunt substane organice cu rol catalitic indispensabile creterii i
dezvoltrii explantelor in vitro.
Termenul de vitamin - amin vital, a fost introdus pentru prima dat de ctre
Casimir Funk n 1911 i ilustreaz plastic importana deosebit pe care acest grup de
substane o are pentru organismele vii.
Spre deosebire de plantele din natur, esuturile i organele cultivate in vitro nu au
capacitatea de a-i sintetiza ntreaga gam de vitamine necesare desfurrii n bune
condiiuni a metabolismului.
La nceputurile culturilor in vitro s-a constat c prin adugarea n mediul de cultur
a unor substane naturale bogate n vitamine (lapte de cocos, sucuri de tomate i banane,
extract de endosperm de cereale, lapte de porumb, extracte de drojdie)are loc stimularea
creterii explantelor.
42
Ulterior o serie de cercettori au realizat reete proprii de vitamine prin combinarea
n diferite proporii a vitaminelor cunoscute.
Trebuie precizat c majoritatea vitaminelor folosite sunt termosolubile iar prin
autoclavare are loc descompunerea acestora. Uneori produii rezultai au la rndul lor un
efect favorabil asupra culturilor (Hoza D., 1996).
Ideal ar fi ca amestecurile de vitamine s se poate aduga dup autoclavarea
mediului folosind filtrarea steril. Pentru mediile solide acest lucru este ns neaplicabil,
fiind greu s se obin difuzia vitaminelor n masa mediului.
Principalele vitamine folosite la prepararea mediilor de cultur sunt folosite solitare
sau, mai frecvent, n combinaii mai mult sau mai puin complexe.
Tiamina (vitamina B
1
, aneurina) este nelipsit din majoritatea reetelor de vitamine
n concentraii care variaz de la 0,1 mg/l la amestecul de vitamine MS
(Murashige&Skoog), la 0,4 mg/l la amestecul Walkey 1 i 2 pn la 5 mg/l la amestecul
SH (Shenk i Hidelbrandt), respectiv 10 mg/l la amestecul B
5
(Gamborg).
n toate cazurile, agentul solubilizant al tiaminei este acidul clorhidric.
Aciunea fiziologic a tiaminei const n stimularea creterilor vegetative i deci
sporirea biomasei produse in vitro.
Piridoxina (vitamina B
6
) este de asemenea prezent n marea majoritate a mediilor
de cultur. Concentraiile folosite variaz n general ntre 0,1-1 mg/l, folosindu-se i de
aceast dat, ca agent de dizolvare acidul clorhidric. Se tie c piridoxina este precursorul
unor coenzime importante cataliznd reacii de baz n metabolismul aminoacizilor.
Riboflavina (vitamina B
2
) este folosit doar n amestecurile de vitamine mai
complexe (ex. Jacquillot) n concentraii de 0,1-1,0 mg/l. Este rezistent la temperaturile
ridicate (se descompune la 280C) i la oxidani dar este sensibil la radiaiile U.V. Se
pare c acioneaz ca inhibitor al creterii rdcinilor i are rol important n metabolismul
celular.
Acidul pantotenic (vitamina B
5
) este mai puin utilizat ca atare. Gautheret (1945)
precizeaz c acidul pantotenic stimuleaz creterea calusului la salcie. O serie de
cercettori au folosit ns cu succes pantotenatul de calciu n concentraii de 0,5-2,5 mg/l.
Acesta, este stabil termic pn la temperaturi de 200C i nu este fotolabil.
43
Cobalamina (vitamina B
12
) este mai rar folosit. n epoca de pionierat a culturilor
in vitro Reinert i White (1956) citai de Gautheret (1959) au folosit-o cu bune rezultate la
creterea esuturilor tumorale. Vitamina B
12
stimuleaz sinteza nucleoproteidelor.
Acidul nicotinic (vitamina B
3
, niacina) aproape nelipsit din mediile de cultur,
este rezistent la temperaturi nalte (punct de topire 234-237C). Este solubil n ap i se
folosete n concentraii de 0,5-5,0 mg/l. Are rol esenial n metabolismul intermediar, n
reaciile de oxido-reducere fiind component al dehidrogenazelor (NAD
+
i NADP
+
).
Biotina (vitamina H) este folosit n concentraii reduse (0,1 mg/l). n soluii acide
sau neutre este stabil dar se descompune prin nclzire. Are rol de coenzim intervenind
n numeroase procese metabolice. Stimuleaz creterea esuturilor meristematice i
proliferarea celulelor.
Acidul folic, folosit n concentraii mici (0,01 mg/l n amestecul Jacquiot) are efect
stimulator asupra creterii esuturilor la lumin. Acest lucru s-ar datora descompunerii sale
n acid para amino-benzoic. La ntuneric acidul folic are efect toxic.
Acidul para aminobenzoic, ntlnit n cteva amestecuri complexe de vitamine, se
folosete n concentraii de 1,0 mg/l. Este coenzima tirozinazei i stimuleaz biosinteza
acidului pantotenic i a biotinei.
Acidul ascorbic (vitamina C) se folosete n concentraii ridicate (1,0-100,0
mg/l) de regul ca agent antioxidant al polifenolilor eliminai de anumite specii la cultura
in vitro: stejar, mr, dafin (Stnic i colab. 1994), fistic, etc.
Prin autoclavare, vitamina C se distruge n bun parte. Rolul fiziologic al vitaminei
C este complex, fiind un activator general al metabolismului celular.
Vitamina E (tocoferolul) favorizeaz reaciile de fosforilare i formare a
compuilor macroergici, participnd la numeroase sinteze enzimatice. n culturile in vitro,
vitamina E mrete sensibilitatea celulelor la auxine (Enescu V. i colab., 1994).
Inozitolul (mio-inozitol, mezo-inozitol, m-inozitol, hexahidroxi-ciclohexan) este
un aditiv esenial al mediilor de cultur fiind considerat de unii autori, vitamin, iar de
ctre alii, glucid.
Se folosete de regul n concentraii de 100 mg/l dar se cunosc i situaii cnd a
fost folosit n concentraii de pn la 1000 mg/l.
Dei nu se cunoate prea bine rolul fiziologic al inozitolului, se pare c acesta ar
stimula diviziunea celular. Folosit n concentraii mari (250 mg/l) a stimulat creterea
44
calusului de Fraxinus pensylvanica (Wolter K.E. i Skoog F. 1966, citai de Enescu V i
colab. 1994).
Aditivii naturali, folosii la nceput ca substane complexe stimulatoare n culturile
in vitro (lapte de cocos, mal, extracte din fructe, drojdie, endosperm, etc.), au fost
abandonai ntre timp. Acest lucru se datoreaz faptului c era imposibil de a se obine o
compoziie constant a produselor respective, care s permit repetabilitatea mediilor de
cultur.
Un alt aditiv natural este cazeina hidrolizat, care nu este altceva dect un
complex de aminoacizi, putnd fi ncadrat n rndul substanelor folosite ca surs de azot
organic. Este folosit n concentraii de 250 mg/l.

3.2. Constitueni cu rol fitoregulator
Hormonii vegetali, regulatorii de cretere, stimulatorii sau substanele de cretere
sunt compui organici, sintetizai de ctre plante n cantiti foarte mici. Aceti compui
stimuleaz, inhib sau modific creterea i dezvoltarea unor organe.
La plantele in vitro fitohormonii endogeni produi de ctre explante sunt completai
i complexai cu hormoni exogeni introdui n mediul de cultur.
n funcie de scopul urmrit se aleg tipurile de hormoni i concentraia optim i se
determin astfel, sensul evoluiei explantului respectiv, ca rezultant a aciunii concertate a
acestora.
Istoria descoperirii hormonilor de cretere este oarecum paralel cu cea a culturilor
in vitro. Descoperirea hormonilor i studierea efectului lor asupra creterii i dezvoltrii
plantelor a modificat radical evoluia cercetrilor in vitro.
Primul care a intuit faptul c n plante ar exista substane care s controleze
metabolismul acestora a fost Charles Darwin. Abia n anul 1931 Kgl i Haagen-Smit au
izolat din urina uman o substan pe care au denumit-o auxina A. Aceeai cercettori i
folosind aceeai surs au purificat apoi (1934) o alt substan denumit hetero-auxina,
care s-a dovedit a fi de fapt acidul indolil acetic (AIA).
Ulterior, la sfritul anilor 30, Gautheret, Nobecourt i White au studiat rolul pe
care l are auxina n creterea esuturilor in vitro.
Prima citochinin izolat a fost chinetina (6 furfurilaminopurina) obinut din
sperm de heringi de ctre Miller i colab. (1955). Doi ani mai trziu, Skoog i Miller au
45
publicat date despre efectul raportului citochinin/auxin asupra proceselor de
organogenez.
Dup descoperirea i izolarea primilor hormoni de cretere s-a trecut la etapa
urmtoare de sintez a noi compui cu structur i efect fiziologic asemntor.
n prezent, se cunosc cinci grupe mari de hormoni de cretere: auxine, citochinine,
gibereline, acid abscisic i etilena.

3.2.1. Auxinele
Auxinele sunt, n marea lor majoritate, compui naturali sintetizai de ctre plante i
acumulai n diferite organe, n concentraii reduse. Auxinele sunt prezente mai ales n
mugurii terminali, frunze tinere i vrfuri de lstari. Paralel cu izolarea compuilor auxinici
naturali s-au realizat compui de sintez cu aciune asemntoare ca derivai ai iodului,
naftalenului, acidului fenoxiacetic i acidului benzoic.
Aciunea auxinelor este deosebit de complex:
- intervin n procesele de diviziune i elongaie a celulelor, n concentraii mici
stimulnd diviziunea celular, iar n concentraii mari, alungirea;
- modific permeabilitatea membranelor celulare modificndu-le n acelai timp,
alte caracteristici fizice i chimice;
- influeneaz pozitiv sinteza proteic prin stimularea sintezei ARN-ului ribozomal;
- controleaz procesele de dominan apical, determinnd inhibarea activitii
mugurilor axilari;
- stimuleaz procesele de calusare i ulterior determin formarea rdcinilor.
- n doze ridicate determin apariia de hipertrofii (simple deformri) sau
hiperplastii (tumori)
Principalele auxine folosite n culturile in vitro sunt prezentate n tabelul 3.2.1.
Sunt prezentate de asemenea, substanele folosite pentru dizolvarea i diluarea acestora,
temperaturile de pstrare i limitele concentraiilor uzuale.
46
Tabelul 3.2.1.
Principalele auxine folosite n culturile in vitro
Specificaie
Mas
molec.
Solvent Diluant
Pstrare
produs
Pstrare
soluie
Conc.
mg/l
AIA
Acid
indolilacetic

175,2
etanol
NaOH
1N


ap

0C

0C

0,01-3,0
AIA-L- Acid
aspartic
290,3 NaOH
0,5N
ap 0C 0C 0,01-5,0
AIA-L- Alanin 246,3 NaOH
0,5N
ap 0C 0C 0,01-5,0
AIA-L- Fenil-
alanin
322,4 NaOH
0,5N
ap 0C 0C 0,01-5,0
AIA-L- Glicin 232,2 NaOH
0,5N
ap 0C 0C 0,01-5,0
IBA
Acid
indolilbutiric

203,2
etanol
NaOH
1N

ap

-

-0C

0,1-10,0
K-IBA
Acid indolil-
butiric, sare de K

241,3

ap

-

0-5C

0-5C

0,1-10,0
ANA
Acid naftilacetic

186,2
NaOH
1N

ap

temp.
cam.

0-5C

0,1-10,0
4-CPA
Acid 4 clor-
fenoxiacetic

186,6

etanol

ap

temp.
cam.

0-5C

0,1-10,0
Dicamba
Acid 2 metoxi-
3,6-diclorbenzoic

221,0

etanol/
ap

ap

0-5C

0-5C

0,01-10,0
2,4-D
Acid 2,4 diclor-
fenoxiacetic

221,0
etanol
NaOH
1N

ap

temp.
cam.

0-5C

0,01-5,0
2,4,5 T
Acid 2,4,5 triclor-
fenoxiacetic

255,5

etanol

ap

temp.
cam.

0-5C

0,01-5,0
Picloram
Acid 4-amino-
3,5,6-tricloro-
picolinic

241,5

DMSO*

ap


temp.
cam.

0-5C

0,01-10,0
* DMSO dimetilsulfoxid

Aa cum rezult din tabelul 3.2.1. solvenii folosii pentru dizolvarea auxinelor sunt
etanolul i hidroxidul de sodiu (NaOH) 0,5-1,0 N. Temperaturile de pstrare a substanelor
i respectiv a soluiilor stoc sunt prezentate n acelai tabel.
Stabilitatea auxinelor variaz destul de mult. Astfel, AIA i o bun parte din restul
auxinelor, sunt fotolabile, n timp ce ANA i 2,4 D sunt mai stabile.

47
3.2.2. Citochininele
Citochininele sunt substane deosebit de active, cu rol fitoregulator al proceselor de
cretere i dezvoltare la plante.
Prima citochinin descoperit (Skoog, 1956) a fost izolat din sperm de heringi i
denumit chinetin (6-furfuril-amino-purin). Aproximativ n aceeai perioad s-a
descoperit rolul stimulator al laptelui de cocos asupra formrii de noi plantule in vitro.
Ulterior s-a constatat c acest lucru se datoreaz faptului c laptele de cocos era bogat n
citochinine naturale.
Efectele citochininelor asupra explantelor cultivate in vitro sunt multiple:
- stimuleaz diviziunea celular;
- au rol esenial n formarea i creterea lstarilor;
- au rol important n procesele de regenerare adventiv a lstarilor (organogenez
direct);
- formarea rdcinilor este n general inhibat sub aciunea citochininelor;
- stimuleaz de asemenea formarea lstarilor axilari i creterea ratei de
multiplicare;
- ntrzie procesele de senescen i determin creterea coninutului de clorofil n
explante.
Aciunea citochininelor se coreleaz cu cantitatea de auxine prezente n mediu.
Astfel spus, este esenial raportul auxine:citochinine n determinarea i reglarea unor
procese vitale de cretere i dezvoltare a explantelor.
Principalele citochinine i substane cu efect similar folosite n culturile in vitro
sunt prezentate n tabelul 3.2.2.
Dintre acestea BAP (6 benzil-amino-purin) sau BA (benziladenina) este cel mai
mult folosit.
Zeatina, produs bioactiv izolat din porumb, are o activitate fitoregulatoare
important. La actinidia a stimulat formarea unui numr mare de lstari adventivi din
explante de rdcin, internod, frunz (organogenez direct) i calus (organogenez
indirect).
Efecte asemntoare are i 2 iP (2 izopentiladenina), DPU (difenil ureea),
tidiazuronul (1 fenil-3-(1,2,3, tiadiazolpentil) uree), CPPU (N-2-cloro 4 piridil N-fenil-
urea), care la fel ca i zeatina sunt substane foarte costisitoare.
48
Toi aceti derivai ai fenil-ureei determin lstrirea adventiv puternic la diferite
tipuri de explante i specii, efectul fiind mult mai puternic dect al citochininelor clasice,
chiar la concentraii inferioare.
Datorit efectelor spectaculoase a devenit chiar o mod folosirea tidiazuronului n
cercetri ct se poate de diverse.
Exist i autori (Horgan, 1986) citat de Pierik (1987) care susin c derivaii fenil-
ureei (DPU) inhib de fapt activitatea citochinin oxidazei i n acest fel concentraia
citochininelor rmne ridicat iar activitatea este mai intens.
Adenina a fost folosit pentru prima dat de Skoog i Tsui n 1948, observndu-se
efectul de stimulare a formrii lstarilor adventivi pe explante de tulpin de tutun.
Concentraia la care este folosit variaz destul de mult ntre 2-120 mg/l. Frecvent adenina
este nlocuit cu hemisulfatul de adenin care este mult mai solubil n ap.
Sunt prezentate de asemenea, substanele folosite pentru dizolvarea i diluarea
acestora, temperaturile de pstrare i limitele concentraiilor uzuale.
Tabelul 3.2.2.
Principalele citochinine folosite n culturile in vitro
Specificaie
Mas
molec.
Solvent Diluant
Pstrare
produs
Pstrare
soluie
Conc.
mg/l
Adenin 135,1 ap Na temp.
cam.
0-5C 50-250
Adenin
sulfat
184,2 ap Na temp.
cam.
0-5C 50-250
BAP (BA)
6-Benzil-
aminopurin
(Benziladenin)

225,3

NaOH
1N

ap

temp.
cam.

0-5C

0,1-5,0
BAR
Benzilamino-
purin ribozid

357,4

NaOH
1N

ap

0C

0C

0,01-5,0
BPA
N-benzil-9-
(2-tetrahidro-
piranil)-adenin

309,4

NaOH
1N

ap

0C

0C

0,1-5,0
Chinetin
6 furfuril-
aminopurin

215,2

NaOH
1N

ap

0C

0C

0,1-5,0
KR
Chinetin ribozid
347,3 NaOH
1N
ap 0-5C 0-5C 0,01-5,0
4 CPPU
N-2-clor-4-
piridil-N-
feniluree

247,7

DMSO*

ap

0-5C

0-5C

0,001-0,1
DPU
Difeniluree
212,3 DMSO ap temp.
cam.
0-5C 0,1-1,0
49
Tabelul 3.2.2. continuare
Specificaie Mas
molec.
Solvent Diluant Pstrare
produs
Pstrare
soluie
Conc.
mg/l
2 iP
2 izopentil-
adenin

203,2

NaOH
1N

ap

0C

0C

1,0-30,0
2 iPR
2 izopentil-
adenin ribozid

335,4

NaOH
1N

ap

0C

0C

0,01-10,0
Specificaie Mas
molec.
Solvent Diluant Pstrare
produs
Pstrare
soluie
Conc.
mg/l
Tidiazuron
1 fenil-3-(1,2,3-
tidiazolpentil)
uree

220,2

DMSO

ap

temp.
cam.

0-5C

0,001-
0,05
Zeatin 219,2 NaOH
1N
ap 0C 0C 0,01-5,0
* DMSO dimetilsulfoxid

3.2.3. Giberelinele
Giberelinele sunt substane hormonale mai puin folosite n culturile in vitro.
Prima giberelin a fost descoperit n 1926 de ctre Kurosawa ca produs al
ciupercii Giberella fujikuroi. n prezent se cunosc un numr mare de gibereline
(aproximativ 50) notate cu GA
1
.GA
n
.
Dintre acestea cel mai mult folosit este acidul giberelic GA
3
(tabelul 3.2.3). Prin
autoclavare, 90% din activitatea biologic a GA
3
se pierde, motiv pentru care este nevoie
ca sterilizarea acestuia s se fac prin filtrare.
Rolul fiziologic al giberelinelor nu este pe deplin cunoscut. Se tie c ele au ca
efect:
- stimularea alungirii lstarilor, fiind recomandate n acest sens dup stabilizarea
culturii de meristeme pentru formarea noilor lstari;
- nlturarea dormansului la semine i embrioni i stimularea germinrii;
- reglarea formrii auxinelor endogene;
- controlul proceselor de formare a florilor dar i a fructelor partenocarpice etc.;
- inhibarea formrii lstarilor i rdcinilor adventive.
50
Tabelul 3.2.3.
Gibereline i ali fitoregulatori folosii n culturile in vitro
Specificaie
Mas
molec.
Solvent Diluant
Pstrare
produs
Pstrare
soluie
Conc.
mg/l
GA
3
-

Acid
giberelic
246,4 etanol ap temp.
cam.
0-5C 0,01-5,0
ABA - Acid
abscisic
264,3 NaOH
1N
ap 0C 0C 0,1-10,0
Acid t-cinamic 148,2 etanol/ac
eton
ap temp.
cam.
0-5C 0,1-10,0
Acid succinic 160,2 ap Na 0-5C 0-5C 0,1-10,0
Floro-glucinol 126,1 ap Na temp.
cam.
0-5C <162,0
Triacontanol 438,8 eter/
benzen
ap 0-5C 0-5C
Colchicin 399,4 ap Na temp.
cam.
0-5C

3.2.4. Alte substane cu rol fitoregulator
Pe lng auxine, citochinine i gibereline se cunosc o gam larg de substane cu
rol fitoregulator, dintre care o bun parte sunt folosite i n culturile in vitro.
n tabelul 3.2.3. se prezint cteva dintre aceste substane.
Acidul abscisic este cunoscut ca inhibitor al creterii i dezvoltrii plantelor,
determinnd intrarea acestora n repaus.
Folosirea lui la culturile in vitro este limitat datorit efectelor negative pe care le
are. Exist totui situaii cnd, utilizat n concentraii reduse, poate regla creterea i
dezvoltarea explantelor n primele faze ale embriogenezei somatice.
Etilena este produs de celulele, esuturile i organele cultivate in vitro. n mod
normal nu se folosesc tehnici prin care acest gaz (C
2
H
4
) s fie introdus din exterior n
vasele de cultur.
Problema care se pune ns este tocmai reducerea cantitii de etilen care se
acumuleaz n atmosfera vaselor de cultur prin folosirea unor sisteme de nchidere care s
permit difuzia acesteia n exterior.
Efectele etilenei n cele mai multe situaii sunt negative:
- determin oprirea creterii explantelor;
- induce fenomenul de senescen i determin cderea frunzelor;
- determin inhibarea procesului de embriogenez somatic.
Exist totui numeroase studii care au dovedit c etilena poate stimula anumite
procese biologice sau c, creterea concentraiei de etilen din vasele de cultur a coincis
51
cu inducia sau stimularea acestora. Astfel, se tie c dup divizarea calusului cantitatea de
etilen produs este mai mare.
La calusul de tutun odat cu creterea concentraiei de etilen la lumin, a avut loc
i formarea de lstari adventivi (organogeneza indirect).
La explantele de bulbi de crin prin creterea concentraiei de etilen s-a stimulat
diferenierea de bulbi adventivi (organogeneza direct). De asemenea, prin mrirea
concentraiei de CO
2
i etilen s-a constatat o cretere a numrului de lstari adventivi pe
cotiledoane de Pinus radiata.
Se pare c o anumit concentraie de etilen este necesar i pentru inducia
diviziunii n suspensiile celulare la Acer. Se cunoate c etilena este implicat n
transportul auxinelor. Totodat, 2,4 D induce formarea etilenei n timp ce azotatul de
argint, poate fi folosit pentru inhibarea sintezei de etilen.
Acidul 2 cloretilfosfonic (ACEP) se descompune n etilen i acid fosforic. n
horticultur este folosit sub denumirea comercial de Ethrel sau Ethephon cu 40%
substan activ.
Cercetrile privind efectele ACEP asupra culturilor in vitro sunt numeroase
(Cachi, 1987). n general aceast substan este folosit n mediul de cultur pentru rolul
de precursor de etilen pe care l are.
Folosind ACEP n culturile de meristeme la garoafe n concentraii de 0,1 i 1,0
mg/l s-a observat formarea unui mare numr de muguri dintr-un singur meristem (Cahi,
1987). Efecte stimulatoare au fost observate de ctre aceeai autoare la minibutaii de
crizanteme, gerbera, cartof i protocormul de Cymbidium.
Floroglucinolul este un compus fenolic folosit de regul ca inhibitor al auxin
oxidazei (AIA-oxidazei). Aplicat mpreun cu auxinele determin stimularea formrii
rdcinilor adventive datorit efectului sinergic care apare. n lipsa auxinelor,
floroglucinolul stimuleaz formarea lstarilor adventivi.
Colchicina se folosete n special atunci cnd se urmrete mrirea gradului de
ploidie prin dublarea numrului de cromozomi.
Amestecurile de substane de origine vegetal au fost folosite mai frecvent la
nceputurile perioadei moderne a culturilor in vitro.
Amestecuri ca: laptele de cocos, sucul de tomate, portocale, ananas, seva de
mesteacn, piureul (praful) de banane, extractele de drojdie, de endosperm de cereale etc.,
52
au dovedit efecte stimulatoare asupra creterii i dezvoltrii explantelor in vitro datorit
compoziiei complexe pe care le au.
Principalul inconvenient pe care l prezint aceste amestecuri este compoziia
variabil de la caz la caz, fapt care face ca rezultatele obinute s nu fie repetabile n alte
condiii.
Firmele productoare ofer astfel de amestecuri condiionate sub form de praf,
suspensii sau soluii. De exemplu, pudra de banane poate fi folosit n concentraii de 40
g/l, n timp ce laptele de cocos n concentraii de 5-20%.
Laptele de cocos poate fi obinut i n laborator printr-o pregtire sumar dup
extragerea din nuci. Astfel, dup o prealabil filtrare se face sterilizarea acestuia prin
autoclavare timp de 15 minute la 121C. Se las apoi s se rceasc i a doua zi este din
nou filtrat i pstrat, pn n momentul folosirii, n congelator la 20C. Eventualele
proteine care precipit sunt ndeprtate ulterior prin filtrare.

3.3. Constitueni cu rol stabilizator
3.3.1. Apa
Apa este unul dintre componenii cei mai importani ai mediilor de cultur, ea
reprezentnd n jur de 95% din volumul acestora. Element vital, apa mediaz majoritatea
proceselor metabolice care au loc n explantele cultivate in vitro.
n vasele de cultur, apa urmeaz un circuit relativ nchis, n sensul c este
preluat de ctre explante, eliminat prin transpiraie n atmosfer, se condenseaz n bun
parte pe pereii vaselor sau la suprafaa mediului i reintr n circuit.
Condensarea apei pe capace i pe pereii vaselor de cultur este mai accentuat n
camerele de cretere n care poliele rafturilor sunt nclzite de lmpile fluorescente aflate
dedesubt (n caz de izolare necorespunztoare).
Pierderile de ap din vasele de cultur sunt ceva mai mari n camerele de cretere
neclimatizate i cu umiditatea aerului redus. n acest caz, se constat n timp o
deshidratare a mediului vizibil prin scderea pronunat de volum i apariia de crpturi
n mediu.
53
Acest lucru este cu att mai periculos cu ct, n
paralel, are loc creterea concentraiei n sruri i zaharuri
a mediului i deci creterea presiunii osmotice a
mediului.
Apa folosit pentru prepararea mediilor de
cultur trebuie s fie n mod obligatoriu distilat. Mai
mult, se recomand folosirea apei bidistilate care prezint
un grad de puritate superior. Distilarea trebuie fcut n
distilatoare din sticl (tip Pyrex) ntru-ct distilatoarele
metalice pot elibera diferii ioni (Cu
2+
, Pb
2+
) n procesul
de distilare (foto 3.1.).
Chiar distilatoarele din sticl trebuie splate
foarte bine cnd sunt noi i de regul, apa rezultat din
primele 2-3 distilri nu se folosete.
n timpul exploatrii, periodic, se va proceda la
splarea cu acuratee a distilatorului cu ap deionizat.
Apa deionizat se obine cu ajutorul unor aparate speciale numite deionizatoare,
prevzute cu cartuuri filtrante speciale care rein ioni existeni n apa de robinet.
Pentru o deionizare mai eficient debitul de ap lsat s treac prin deionizator
trebuie s fie ct mai mic posibil. Se impune, de asemenea, nlocuirea periodic a filtrelor.
Trebuie spus c pe lng deionizare i distilare, exist i alte procedee de
purificare a apei, cum ar fi de exemplu, osmoza invers. Ideal este ns s se combine toate
cele trei proceduri.
Atunci cnd se tie c apa de la reea este ncrcat cu ioni de tot felul (Pb
2+
, Ca
2+
,
Mg
2+
etc.), chiar cu germeni, sau c ea provine din foraje i este bogat n sruri, se
recomand ca la intrarea n laborator s se monteze o instalaie de filtrare. O astfel de
instalaie presupune montarea unei baterii de cartue filtrante alese n funcie de
compoziia chimic a apei i coninutul acesteia n suspensii, germeni etc. Exist filtre
pentru sruri de Ca, de Mg, filtre cu crbune pentru germeni, etc.
Pe lng faptul c intr n componena mediilor de cultur, apa mai este folosit n
procesul de sterilizare a materialului vegetal nainte de inoculare.
n acest scop se folosete apa bidistilat care se autoclaveaz n prealabil i care se
folosete la cltirea materialului vegetal dup dezinfecia cu diferii ageni sterilizani.

Foto 3.1. Aparat din sticl
pentru bidistilarea apei
54
De asemenea dup cltire, explantele rmn n recipiente cu ap distilat sub hot
pn n momentul inoculrii.
Atunci cnd se lucreaz cu explante provenite de la specii care emit uor fenoli se
recomand dizolvarea n ap distilat steril a unor substane antioxidante. Frecvent se
folosete polivinilpirolidona (PVP) n concentraie de 0,1%.
n ncheiere trebuie precizat c apa deioniozat i bidistilat produs n laborator
trebuie pstrat n recipiente din plastic etichetate i nchise. Sticla obinuit nu se
recomand pentru c ea elimin ioni nedorii de plumb, sodiu, arsenic, etc.

3.3.2. Agenii de solidificare
Mediile de cultur folosite pentru creterea explantelor in vitro se pot realiza sub
form lichid sau solid (de fapt semisolid).
Mediile solide necesit adugarea unor ageni de solidificare care leag apa i
absorb celelalte componente ale mediului.
Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un bun agent de solidificare sunt:
- s fie inert i s nu fie contaminat; s permit circulaia (difuzia) substanelor
minerale, apei, gazelor; s fie stabil dup autoclavare; s aib un punct de
solidificare sczut; s fie ieftin; eventual, s poat fi recuperat i refolosit.
Dintre agenii de solidificare, agarul este cel mai larg folosit la culturile in vitro i
nu numai.
Agarul este un polizaharid obinut din alga roie Gelidium amansii care triete n
Oceanul Indian i Marea Chinei.
Se prezint sub form unei pulberi galben murdar care se topete n ap la o
temperatur apropiat de 100C, soluia devenind translucid i se ntrete la o
temperatur de 32-35C. Se folosete n concentraie de 0,6-1,0%. Cel mai bun agar este
cel produs de firma Difco Bacto (Noble agar). Exist i sortimente speciale cum ar fi
agarul bacteriologic, agarul tip A, E, M, agarul purificat, agarul splat, folosite n lucrri
speciale de microbiologie, culturi de celule i protoplati.
n lipsa agarului pulvis se poate folosi i agarul sub form de solzi sau plci care
trebuie nmuiat n ap i splat repetat cu ap bidistilat, ntru-ct este mai puin pur.
Agaroza este format tot din coloizi marini, prezint un grad nalt de purificare i
este folosit pentru culturi de protoplati sau de celule. Gelific la mai puin de 30C (26-
30C) fiind utilizat la prepararea mediilor cu compui termolabili.
55
Acidul alginic este un acid poliuronic (acidul anhidro -D-manuronic) care are
capacitatea de a se gelifica. Este ideal pentru culturi de protoplati i suspensii celulare dar
i pentru ncapsularea embrionilor somatici sau a explantelor de diferite feluri n vederea
obinerii seminelor artificiale. Soluiile apoase de acid alginic se gelific la temperatura
camerei n prezena unor cationi (n special a calciului). Lichefierea mediului gelificat se
poate realiza prin adugarea unor ageni de chelatare (ex. citraii).
Formarea capsulelor de alginat pentru ncapsularea protoplatilor sau embrionilor
somatici se face prin adugarea n prealabil a acidului alginic (1,75-4,00%) ntr-o soluie
cu concentraie sczut de calciu (2mM). Dup amestecare se face sterilizarea prin filtrare
(0,45 m) sau autoclavarea.
Odat obinut alginatul, se introduc explantele timp de 1-2 secunde, dup care una
cte una acestea sunt trecute ntr-o soluie de CaCl
2
(50 mM) unde vor rmne timp de 45
de minute pentru formarea capsulei.
Phytagelul (Gelrite) este un heteropolizaharid natural obinut prin purificare dintr-
un substrat bacterian i format din acid glucuronic, ramnoz i glucoz. Este cunoscut i
sub numele de gum Gellan. Produce un gel dens, perfect limpede, la o concentraie de
doar 1,5-2,0%. Se gelific n soluie apoas la 27-31C. Uneori determin apariia
vitrificrii
Agargelul este un amestec agar + phytagel care mbin calitile celor doi
componeni. n concentraie de 0,35-0,50% produce un gel semitransparent mult folosit
pentru detectarea contaminrilor. n acelai timp este cunoscut pentru reducerea
vitrificrilor. Este mai ieftin ca agarul normal. Se gelific la 26-28C.
Transfergelul conine hidroxietilceluloz i se obine prin sintez. Este folosit n
concentraie de 2,5% pentru ncapsularea embrionilor somatici, a minibutailor i
apexurilor precum i n tehnicile de seed drilling (semnare n flux lichid). mpreun cu
soluiile nutritive cu care se amestec formeaz un amestec vscos care se autoclaveaz.
Prin autoclavare pH-ul soluiei scade cu 0,5-1 uniti. Pentru autoclavare trebuie folosite
recipiente cu volum de 4 ori mai mare dect cel al soluiei care conine Transfergel.
Pe lng substanele prezentate mai sus se mai pot folosi i ali ageni solidificani
de tipul gelatinei (10%), biogelurilor (Biogel P 200), silicagelurilor sau gelurilor de
poliacrilamid folosite n tehnicile de electroforez a proteinelor. Nici unul din aceste
56
produse nu pot concura ns agarul. Compoziia chimic a ctorva ageni solidificani este
prezentat n tabelul 3.3.1. (Sigma Plant Culture, 1994, Catalogue).
Tabelul 3.3.1.
Compoziia chimic a ctorva ageni solidificani (%)
Cenu Ca Mg K P Na
Agar 2-5 0,30 0,10 0,01 0,01 0,5
Agar bacteriologic
3-7 0,17 0,09 0,80 - 3,1
Agar tip A 5-6 0,01 0,01 0,1 0,17 1,8
Agar tip E 3-4 0,02 0,02 0,07 0,13 1,2
Agar tip M 3-6 0,09 0,14 0,07 0,01 1,4
Agar consistent 3-4 0,03 0,00 0,07 0,09 0,72
Agar purificat 2,0 0,02 0,01 0,01 0,01 0,35
Agar splat 2,2 0,15 0,08 - - 0,38
Agaroz <1 - - - - -
Acid alginic - 0,17 0,01 2,3 - 10,1
Agargel
TM
4-5 0,25 0,06 0,04 0,08 1,05
Phytagel
TM
9,5 0,85 0,35 1,70 0,15 0,45

3.3.3. Stabilizatorii osmotici i de pH
Prin combinarea unor cantiti diferite de substane minerale i organice (n
special zaharuri) se obin medii de cultur care au poteniale osmotice diferite.
Calcularea potenialului osmotic al unui mediu de cultur este destul de dificil
fiind nevoie de o cunoatere exact a maselor moleculare i gradului de disociere a
srurilor folosite. Mult mai simpl este ns msurarea potenialului osmotic i eventual
corectarea acestuia.
Zaharurile au n general o pondere mai mare n determinarea potenialului osmotic
al unui mediu fa de srurile minerale.
Yoshida i colab. (1973), citat de Pierik (1987), a demonstrat ct de diferit este
contribuia celor dou grupe de compui la formarea potenialului osmotic al mediului de
cultur (tabelul 3.3.2.).



57
Tabelul 3.3.2.
Ponderea srurilor minerale i zaharurilor n realizarea
potenialului osmotic al mediului de cultur
Potenialul osmotic
Sruri minerale Zaharuri
Mediul de cultur
bari % din total bari
% din
total
White 0,43 22,75 1,46 77,25
Hildebrandt 0,67 31,45 1,46 68,55
Heller 0,96 19,16 4,05 80,84
Murashige&Skoog 2,27 50,78 2,20 49,21

Dac potenialul osmotic depete valoarea de 3 bari, activitatea explantului
nceteaz datorit imposibilitii folosirii apei din mediu.
Creterea potenialului osmotic al mediului, atunci cnd este necesar, poate fi
fcut prin adugarea de manitol, iar mai nou, de polietilenglicol (PEG), pn la atingerea
valorii dorite.
Un alt element important al mediului de cultur este pH-ul acestuia. n mod
obinuit pH-ul mediului de cultur trebuie s aib valoarea 5,5. Oricum se pot folosi i
medii de cultur cu valori ale pH-ului cuprinse ntre 5,0-6,5.
Scderea valorii pH-ului sub 5,0 aduce dup sine o serie de probleme:
- mediul nu se solidific;
- AIA i GA
3
devin instabile;
- vitamina B
1
i acidul pantotenic se descompun;
- anumite sruri precipit.
Nici pH-ul prea ridicat (peste 7,0) nu este admisibil datorit blocrii fierului,
apariiei clorozei i altor dezechilibre fiziologice.
Oricum rolul valorii pH asupra creterii i dezvoltrii explantelor in vitro este mai
puin cunoscut. ntr-o experien de calogenez i organogenez indirect la specii i
hibrizi din genul Actinidia s-au obinut rezultate superioare pe mediul cu pH-7 fa de
varianta cu pH 5,5 (Stnic F. i colab., 1994, Stnic F., 1998).
Se tie c n urma autoclavrii valoarea pH a mediului scade cu 0,3-0,5 uniti. De
asemenea, valoarea pH poate scdea n timpul unei subculturi cu 0,5 uniti (Skirvin i
colab. 1986, citat de Pierik 1987).
58
innd cont de aceste modificri la prepararea mediului de cultur valoarea pH
trebuie corectat prin titrare cu soluii de baze (NaOH, KOH 0,1N) sau de acizi (HCl sau
acizi organici 0,1N) pn la valoarea dorit.
Corectarea valorii pH se va face dup aducerea la volum cu ap distilat a
mediului naintea adugrii agarului i zaharozei. Unii autori recomand corectarea pH-
ului dup introducerea zaharozei i nainte de introducerea agarului.

3.3.4. Substanele antioxidante i absorbante
Una din problemele care apar n timpul cultivrii in vitro a explantelor vegetale
este emisia de fenoli i oxidarea rapid a acestora avnd ca efect brunificarea mediului de
cultur i blocarea creterii.
Pentru prevenirea acestui fenomen la speciile cu predispoziie, se recurge la
folosirea unor substane antioxidante, fie pentru tratarea explantelor nainte de inoculare,
fie chiar pentru introducerea n mediul de cultur.
Acidul ascorbic (vitamina C) intr mai rar n compoziia unor amestecuri de
vitamine, fiind ns folosit ca antioxidant n doz de 1-100 mg/l. Prin autoclavare acidul
ascorbic se descompune i de aceea el se va steriliza numai prin filtrare (0,22 m).
Acidul citric se folosete frecvent ca antioxidant n cantitate de 150 mg/l n
amestec cu acidul ascorbic. Soluia astfel obinut poate fi folosit pentru mbierea
explantelor timp de 5-30 minute dup secionare i nainte de inoculare.
Polivinilpirolidona (PVP) este un antioxidant larg folosit n culturile in vitro.
Acest polimer are capacitatea de a absorbi substanele din grupa fenolilor reducnd astfel
oxidarea acestora. PVP se poate introduce n mediul de cultur n cantitate de 250-1000
mg/l sau poate fi adugat n apa distilat steril la cltirea explantelor n procesul
sterilizrii i la pstrarea acestora pn la inoculare (0,1%).
DIECA (dietil-ditiocarbonat) este folosit de asemenea n apa de cltire a
explantelor n concentraii de 2 g/l pentru reducerea oxidrii. DIECA este nelipsit de la
protejarea mpotriva oxidrii a zonelor secionate la realizarea microaltoirii in vitro sau ex
vitro (vezi subcapitolul 6.2.).
Efect antioxidant au i alte substane cum ar fi tioureea i diferii aminoacizi: L-
cisteina, glutamina, arginina i aspargina care ns sunt mai puin folosite n acest scop.
59
Crbunele activ este obinut prin carbonizarea la temperaturi ridicate a lemnului
n prezena aburului. Se obine astfel o structur microporoas caracterizat printr-o
capacitate foarte mare de a absorbi o serie de compui din mediul de cultur. Crbunele
vegetal are o mare capacitate de reinere a 5 hidroximetilfurfurolului (inhibitor de cretere
care apare datorit descompunerii zaharozei n timpul autoclavrii), a unor fenoli sau
tanini (care sunt responsabili de procesul de brunificare), a unor auxine, citochinine, a
etilenei, a unor vitamine i a chelailor de Fe i Zn.
Aciunea pozitiv a crbunelui activ a fost observat n special la conifere n
procesele de alungire a lstarilor la pinul maritim, Sequoia, dar i la Clematis (Gl i
colab. 2003) (foto 3.2.). De asemenea, s-au obinut rezultate superioare la folosirea
crbunelui activ, n embriogeneza somatic la Anemone i Nicotiana.
Foarte frecvent, crbunele activ este folosit n faza de nrdcinare a explantelor
pe medii fr hormoni, n concentraie de 0,2-0,3%, datorit efectului benefic materializat
prin absorbia unor produi de secreie dar mai ales prin crearea ntunericului n zona
formrii noilor rdcini.

Foto 3.2. Mediu de cultur cu crbune activ la Clematis

60
3.4. Concentraii. Prepararea soluiilor stoc
Aa cum am afirmat pn aici mediile de cultur au o compoziie complex care se
modific n funcie de specii, tipul de explant (organ), vrsta explantului, scopul urmrit
etc.
Coninutul n elemente nutritive, fitoregulatoare i cu rol stabilizator este mult
diferit de la caz la caz.
Fiecare component are o anumit pondere n realizarea mediului final. De aceea,
compoziia mediului este dat de tipul substanelor i de concentraia acestora.
De la caz la caz, concentraia unui component poate fi exprimat n:
- % de volume: ex. 5% reprezint 50 ml din produsul respectiv adugai la 950 ml ap;
- % de mas: pentru agar, zahr sau alte componente solide: ex. 2%, reprezint 2 g n 100
ml de mediu sau 20 g n 1000 ml mediu preparat. Acest mod de exprimare a concentraiei
este notat n literatura de specialitate de limb englez w/v, adic: weight/volume;
- miligram/litru (mg/l; mg
.
l
-1
) reprezint 0,001 g/litru. Frecvent pentru acest tip de
concentraie se folosete exprimarea cu ajutorul puterilor, astfel:
1 g/l= 1
.
10
-3

1 mg/l = 1
.
10
-6

- microgram/litru (g/l; (g
.
l
-1
) reprezint 0,001 mg/l sau 1
.
10
-9
;
- pri pe milion (ppm). 1 ppm reprezint o parte dizolvat ntr-un milion de pri de
acelai ordin de mrime, de ex. 1 mg n 1000 ml (1.000.000 l) este echivalent cu 1 ppm.
n concluzie:
1 mg/l = 1
.
10
-6
= 1 ppm i 1 g/l = 1
.
10
-3
= 1000 ppm
- moli. Conform Asociaiei Internaionale de Fiziologia plantelor, cel mai corect mod de
exprimare a concentraiilor ntr-un mediu de cultur o reprezint concentraia molar.
Acest lucru permite o comparare corect a dou substane diferite.
tiind c 1 mol este reprezentat de o cantitate de substan egal cu masa
molecular, este mai corect s se compare de exemplu, efectul unui mol de IBA (203,2) cu
al unui mol de ANA (186,2) dect s se compare efectul unei cantiti de cte 1 mg/l din
fiecare hormon de mai sus. Acelai lucru este valabil atunci cnd se compar concentraiile
totale ale srurilor din dou medii diferite.
Cunoscnd masa molecular a unei substane (de exemplu 225,3 pentru BAP)
concentraia molar se poate exprima astfel:
61
- 1 mol de BAP este echivalent cu o concentraie de 225,3 g/litru;
- 1 mM de BAP este echivalent cu o concentraie de 0,2253 g/litru;
- 1 M de BAP este echivalent cu o concentraie de 0,0002253 g/litru = 0,2253 mg/l;
Transformarea din concentraie molar (M) n concentraie exprimat n uniti de
mas (g/l) se face folosind urmtoarea formul:
concentraia molar (M)
.
masa molecular = X g/l.
concentraia molar (mM)
.
masa molecular = X mg/l.
De exemplu, dac concentraia dat de BAP este de 2,2 M, concentraia
echivalent exprimat n mg/l va fi:
2,2 M
.
225,3 = 495,66 g/l 0,5 mg/l
Invers, dac iniial concentraia a fost exprimat n uniti de mas se poate afla
concentraia molar mprind valoarea respectiv la masa molecular.
n tabelul 3.4.1. sunt prezentate masele moleculare ale substanelor folosite la
prepararea mediilor de cultur.
Tabelul 3.4.1.
Masele moleculare ale substanelor folosite la prepararea
mediilor de cultur
Substana
Formula
chimic
Masa
molecular
Macroelemente
Azotat de amoniu NH
4
NO
3
80,04
Sulfat de amoniu (NH
4
)
2
SO
4
132,15
Clorur de calciu CaCl
2
.
2H
2
O 147,02
Azotat de calciu Ca(NO
3
)
2
.
4H
2
O 236,16
Sulfat de magneziu MgSO
4
.
7H
2
O 246,47
Clorur de potasiu KCl 74,55
Azotat de potasiu KNO
3
101,11
Difosfat de potasiu KH
2
PO
4
136,09
Difosfat de sodiu NaH
2
PO
4
.
2H
2
O 156,01
Microelemente
Acid boric H
3
BO
3
61,83
Clorur de cobalt CoCl
2
.
6H
2
O 237,93
Sulfat de cupru CuSO
4
.
5H
2
O 249,68
Sulfat de mangan MnSO
4
.
4H
2
O 223,01
Iodur de potasiu KI 166,01
Molibdat de sodiu Na
2
MoO
4
.
2H
2
O 241,95
Sulfat de zinc ZnSO
4
.
7H
2
O 287,54
Sodiu EDTA Na
2
EDTA
.
2H
2
O 372,25
Sulfat de fier (feros) FeSO
4
.
7H
2
O 278,03
62
Tabelul 3.4.1. continuare
Substana
Formula
chimic
Masa
molecular
Zaharuri
Fructoz C
6
H
12
O
6
180,15
Glucoz C
6
H
12
O
6
180,15
Manitol C
6
H
14
O
6
182,17
Sorbitol C
6
H
14
O
6
182,17
Zaharoz C
6
H
22
O
11
342,31
Vitamine i aminoacizi
Acid para-aminobenzoic 137,0
Acid ascorbic (C) C
6
H
12
O
6
176,12
Acid folic (vit. B
c
, vit. M) C
19
H
19
N
7
O
6
441,40
Acid nicotinic (B
3
) C
6
H
5
NO
2
123,11
Biotin (H) C
10
H
16
N
2
O
3
S 244,31
Cianocobalamin (B
12
) C
63
H
90
CoN
14
O
14
P 1357,64
Glicin C
2
H
5
NO
3
75,07
Inozitol C
6
H
12
O
6
4180,16
L-Cistein HCl C
3
H
7
NO
2
S
.
HCl 157,63
L-Glutamin C
5
H
10
N
2
O
3
146,15
Pantotenat de calciu (C
9
H
16
NO
5
)
2
Ca 476,53
Piridoxin (B
6
) C
6
H
11
NO
3
.
HCl 205,64
Riboflavin 376,37
Tiamin (B
1
) C
12
H
17
ClN
4
OS
.
HCl 337,29
Auxine
2,4-D- acid 2,4 diclorfenoxiacetic C
8
H
6
O
3
Cl
2
221,04
AIA- acid 3 indolil acetic C
10
H
9
NO
2
175,18
ANA- acid naftil acetic C
12
H
10
O
2
186,20
ANOA- Acid naftoxiacetic C
12
H
10
O
2
202,20
IBA- acid 3 indolil butiric C
12
H
13
NO
2
203,23
PCAA- Acid paraclorfenoxiacetic C
8
H
7
O
3
Cl

186,59
Citochinine
AD Adenin C
5
H
5
N
5
.
3HO 189,13
AdSO
4
- Sulfat de adenin (C
5
H
5
N
5
)
2
.
H
2
SO
4
.
2H
2
O 404,37
BA sau BAP (6-benziladenin
sau 6 benzilaminopurin
C
12
H
11
N
5
225,20
6 Furfurilaminopurin C
10
H
9
N
5
O 215,21
SD 8339 - C
17
H
19
N
5
O 309,40
Zeatin C
10
H
13
N
5
O 219,20
Gibereline
GA
3
-Acid giberelic C
19
H
22
O
6
346,37
Alte componente
Acid abscisic C
15
H
20
O
4
264,31
Colchicin C
22
H
25
NO
6
399,43
Floroglucinol C
6
H
6
O
3
126,11
63
Pentru substane mai complexe a cror mas molecular nu este cunoscut,
aceasta se calculeaz prin adunarea maselor atomice ale elementelor care o compun
(Tabelul 3.4.2.). Se va ine cont dac substana respectiv se afl n stare hidratat sau nu
(sic) pentru a aduga valoarea masei moleculare a apei.
n tabelul 3.4.2. este prezentat coninutul n sruri minerale a mediilor
Murashige&Skoog i Gamborg (B5) avnd concentraia exprimat n mg/l, respectiv mM,
pentru macroelemente i g/l, respectiv M, pentru microelemente.
Tabelul 3.4.2.
Coninutul n sruri minerale a mediilor de cultur
Murashige&Skoog i Gamborg (B5)


Se observ, n final, c cele dou medii difer att n ceea ce privete compoziia
ct i n ceea ce privete concentraia total.
Revenind la necesitatea folosirii concentraiilor molare, printr-un calcul simplu se
observ c n cazul concentraiei exprimate n mg/l, mediul MS este doar cu 142,5% mai
concentrat dect mediul B
5
. Ct despre concentraia molar, se constat c de fapt diferena
este de 157,46%.
Aa cum reiese din tabelul de mai sus pentru prepararea unui mediu este nevoie, n
medie, de 4-5 sruri coninnd macroelemente, de 7-8 sruri cu microelemente, de chelat
de fier, de amestecuri de 2 sau mai multe vitamine, de aminoacizi i de un numr mai mare
Substana Murashige & Skoog Gamborg B5
Macroelemente mg/l mM mg/l mM
NH
4
NO
3
1.650 20,6 - -
(NH
4
)
2
SO
4
- - 134 1,0
KNO
3
1.900 18,8 2500 24,7
CaCl
2
.
2H
2
O 440 3,0 150 1,0
MgSO
4

.
7H
2
O 370 1,5 250 1,0
KH
2
PO
4
170 1,25 - -
NaH
2
PO
4
- - 150 1,0
Total 4.530 45,15 3.184 28,7
Microelemente g/L M g/L M
KI 830 5,0 750 4,5
H
3
BO
4
6.200 100,0 3.000 48,8
MnSO
4
.
H
2
O 16.000 94,6 10.000 59,1
ZnSO
4
.
7H
2
O 8.600 30,0 2.000 7,0
Na
2
MoO
4
.
2H
2
O 250 1,0 250 1,0
CuSO
4
.
5H
2
O 25 0,1 25 0,1
CoCl
2
.
6H
2
O 25 0,1 25 0,1
Total 31.930 230,8 16.050 120,6
Total general 4.561,93 45,38 3.200,05 28,82
64
sau mai mic de hormoni de cretere. La toate acestea se adaug zaharoza, agarul i
eventual crbunele activ.
Pentru prepararea unui litru de mediu ar fi nevoie n jur de 20-25 de cntriri i tot
attea dizolvri, diluri etc. ceea ce nseamn un volum considerabil de munc. Lucrurile
s-ar complica i mai mult atunci cnd este vorba de microelemente care s-ar cntri n
cantiti de ordinul microgramelor. Crete n plus, riscul de apariie a unor erori i de
nerespectarea reetelor.
Pentru nlturarea acestor neajunsuri se recurge la prepararea unor soluii stoc
concentrate formate din amestecuri de macro i microelemente, vitamine care n momentul
preparrii mediilor se dilueaz corespunztor concentraiei i reetei de mediu folosite.
Diveri autori recomand s se foloseasc 5-6 soluii stoc diferite pentru prepararea
unui mediu:
- soluie stoc de macroelemente;
- soluie stoc de microelemente;
- soluie stoc de chelat de fier;
- soluie stoc de vitamine;
- soluie stoc de aminoacizi;
- soluie stoc de hormoni.
Concentraia acestor soluii stoc variaz ntre 10 X i 1000 X (cu X se noteaz
concentraia normal). De exemplu, o soluie stoc de macroelemente Murashige&Skoog cu
o concentraie 10 X va conine de 10 ori mai mult azotat de amoniu (16.500 mg/l) dect o
soluie cu concentraia normal X (1.650 mg/l). Acelai lucru este valabil i pentru
celelalte sruri care alctuiesc soluia de macroelemente.
Atunci cnd compuii sunt mai stabili i n laborator se prepar cantiti mari de
mediu, se folosesc soluii stoc cu concentraii ceva mai mari (100 X, 1000 X). Frecvent
soluia stoc de macroelemente are concentraia 10 X, iar celelalte (microelemente i
vitamine) concentraia de 100 X.
65
Pentru a afla ce cantitate din soluia stoc se va folosi pentru a prepara un anumit
volum de mediu se aplic formula:
volumul de soluie stoc
=
concentraia cerut
.
volumul de mediu
concentraia soluiei stoc
De exemplu, pentru a afla ce cantitate din soluia stoc de vitamine, care are o
concentraie 100 X este necesar pentru a prepara 2 l de mediu calculul este:

Y ml de soluie stoc
=
X
.
2 l
=
0,02 l = 20 ml
100 X

Tabelul nr. 3.4.3. este un tabel ajuttor pentru a afla cantitatea de soluie stoc
necesar pentru a prepara un anumit volum de mediu cu concentraia cunoscut (X).

Tabelul 3.4.3.
Calculul diluiei pentru trecerea de la o anumit soluie stoc la
soluia normal
Nr. ml din soluia stoc necesari pentru un mediu cu
concentraia normal X
Concentraia
soluiei stoc
0,250 l 0,500 l 1 l 2 l 3 l 10 l
1 X
250 500 1.000 2.000 3.000 10.000
10 X 25 50 100 200 300 1.000
100 X 2,5 5 10 20 30 100
200 X 1,25 2,5 5 10 15 50
1000 X 0,25 0,5 1 2 3 10

Prepararea soluiilor stoc
Cunoscnd concentraiile finale (normale) n diferite componente ale unui mediu de
cultur se poate trece la prepararea soluiilor stoc.
Acest lucru este posibil prin mai multe ci. Una dintre ele ar fi cntrirea pentru
fiecare tip de mediu i component a unor cantiti de 10, 100 sau 1000 de ori mai mari
dect concentraia normal, dizolvarea, amestecarea soluiilor i adugarea de ap
bidistilat pn la volumul de 1 litru. S-ar obine astfel o soluie stoc de 10, 100 sau 1000
de ori mai concentrat de macro i microelemente sau vitamine.
Atunci cnd ns, ntr-un laborator se folosesc frecvent 4-5 medii de cultur diferite
i se prepar zilnic cantiti mari de mediu se poate apela la o soluie mai practic i mai
66
puin laborioas. Aceasta const n primul rnd n simplificarea operaiilor de cntrire i
permite o folosire mai judicioas a substanelor, evitndu-se nvechirea soluiilor stoc.
Metoda presupune existena a dou tipuri de soluii stoc:
- soluiile mam;
- soluiile stoc propriu-zise.
Soluiile mam se obin prin cntrirea, pentru fiecare sare n parte, a unei cantiti
constante (de exemplu 100 g pentru macroelemente i 10 g sau 1 g pentru microelemente).
Dup dizolvare volumul soluiei se aduce la un litru obinndu-se astfel o soluie cu
concentraia 100 g/l, respectiv 10g/l, sau 1 g/l.
Soluiile obinute se pstreaz n sticle etichetate aezate n ordine. Soluiile stoc
propriu-zise de concentraie 10 X, 100 X sau 1000 X se obin prin diluarea unui anumit
volum din fiecare soluie mam corespunztoare srurilor care intr n componena
soluiilor stoc respective.
Calculul volumului de soluie mam necesar pentru a obine 1 l de soluie stoc este
urmtorul:
Y ml soluie mam
=
concentr.soluiei normale (mg/l)
.
concentr.soluiei stoc
concentraia soluiei mam (g/l)

Exemplu: Dac soluia normal a mediului Murashige&Skoog conine 1650 mg/l
NH
4
NO
3
i concentraia soluiei mam de NH
4
NO
3
este de 100 g/l, s se calculeze ci ml
de soluie mam vor fi necesari pentru a obine un litru de soluie stoc de macroelemente
cu concentraia 10 X.
Y ml de soluie mam NH
4
NO
3

=
1650 mg/l NH
4
NO
3

.
10(X)
=
165 ml
100 g/l NH
4
NO
3

n tabelele 3.4.4. i 3.4.5. sunt prezentate cantitile (ml) de soluii mam necesare
pentru prepararea unui litru de soluie stoc de macroelemente (10X) i respectiv, de
microelemente (100X), la cteva dintre mediile de cultur cele mai folosite.
O problem care poate aprea la prepararea soluiilor stoc din soluii mam este
apariia precipitailor insolubili. Principala cauz este formarea unor compui insolubili n
calciu, ionul fosfat i magneziu.
Pentru a evita acest lucru este indicat s se respecte o anumit ordine la adugarea
soluiilor. Astfel se vor introduce prima fat soluiile cu azot apoi cele cu magneziu,
67
urmeaz cele cu calciu i n final cele cu fosfor. Este de la sine neles c fiecare sare
trebuie n prealabil integral dizolvat n soluia mam.
Riscul apariiei precipitaiilor se poate evita i prin prepararea unor soluii stoc de
concentraie mai redus (10X).
Un alt compus de baz al mediului de cultur este chelatul de fier. Fierul nu este
accesibil plantelor dect dac este legat de un agent de chelatare. n cazul mediilor pentru
culturile in vitro, agentul de chelatare folosit este Na
2
EDTA, sarea disodic a acidului
etilendiaminotetraacetic (C
10
H
14
N
2
O
8
Na
2
.
2H
2
O).
Ca surs de fier se folosete sulfatul feros hidratat cu 7 molecule de ap
(FeSO
4
.
2H
2
O).
De regul se folosete o soluie stoc 200X de chelat de fier care se prepar astfel:
- se cntresc 7,45 g de Na
2
EDTA
.
2H
2
O i se dizolv n 900 ml de ap distilat pn
devine perfect limpede. La nevoie se nclzete uor;
- se cntresc 5,52 g sulfat feros i se dizolv n restul de ap;
- se amestec cele dou soluii obinndu-se 1 l de soluie 200x de chelat de fier de
culoare galben.
La prepararea unui litru de mediu de cultur din soluia stoc de chelat de fier se vor
lua 5 ml (pentru 1 l de mediu) cantitate care conine 27,8 mg de sulfat feros (100 M) i
respectiv 37,25 mg Na
2
EDTA (200 M).
68
Tabelul 3.4.4.

Prepararea unui litru de soluie stoc de macroelemente (10X) din soluiile mam la cteva medii de cultur
Murashige &
Skoog
Gamborg B
5
Quoirin &
Lepoivre
Schenk &
Hildebrandt
Nitsch & Nitsch
Substana
Conc.
sol.
mam
(g/l)
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
NH
4
NO
3
100 1650 165 - - 400 40 - - 720 72,0
KNO
3
100 1900 190 2500 250 1800 180 2500 250 950 95,0
CaCl
2
2H
2
O 100 440 44 150 15 - - 200 20 166 16,6
MgSO
4
7H
2
O 100 370 37 250 25 360 36 400 40 90,3 9,03
KH
2
PO
4
100 170 17 - - 270 27 - - 68 6,8
Ca(NO
3
)
2
4H
2
O 100 - - - - 1200 120 - - - -
(NH
4
)
2
SO
4
100 - - 134 13,4 - - - - - -
NaH
2
PO
4
H
2
O

100 - - 150 15 - - - - - -
NH
4
H
2
PO
4
100 - - - - - - - - - -

69
Tabelul 3.4.5.
Prepararea unui litru de soluie stoc de microelemente (100X) din soluiile mam la cteva medii de cultur
Murashige &
Skoog
Gamborg B
5
Quoirin &
Lepoivre
Schenk &
Hildebrandt
Nitsch & Nitsch
Substana
Conc.
sol.
mam
(g/l)
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
Conc.sol.
normale
mg/l
Soluie
mam
ml.
KI 10 0,83 8,3 0,75 7,5 0,08 0,80 1,0 10,0 - -
H
3
BO
3
10 6,20 62,0 3,00 30,0 6,20 62,0 5,0 50,0 10,0 100,0
MnSO
4
H
2
O 10 16,00 160,0 10,00 100,0 0,76 7,60 10,0 100,0 18,9 189,0
ZnSO
4
7H
2
O 10 8,60 86,0 2,00 20,0 8,60 86,0 1,0 10,0 10,0 100,0
Na
2
MoO
4
2H
2
O 1 0,25 25,0 0,25 25,0 0,250 25,0 0,1 10,0 0,25 2,5
CuSO
4
5H
2
O 1 0,025 2,5 0,025 2,5 0,025 2,50 0,2 20,0 0,025 2,5
CoCl
2
6H
2
O

1 0,025 2,5 0,025 2,5 0,025 2,50 0,1 10,0 - -
70
Tabelul 3.4.6.
Amestecuri de vitamine folosite frecvent la prepararea mediilor de cultur
Concentraia normal (X)
Necesar pt. 100 ml
soluie 100 X
Amestec
mg/l M mg
Murashige&Skoog
Acid nicotinic 0,5 4,0 5,0
Piridoxin - HCl 0,5 2,4 5,0
Glicin 2,0 26,6 20,0
Tiamina - HCl 0,1 0,3 1,0
Walkey 1
Acid nicotinic 0,5 4,0 5,0
Piridoxin - HCl 0,5 2,4 5,0
Glicin 5,0 66,6 50,0
Tiamina - HCl 0,4 1,2 4,0
Walkey 2
Inozitol 100,0 560,0 1000,0
Tiamina - HCl 0,4 1,2 4,0
Jacquillot
Acid nicotinic 1,0 8,1 10
Acid folic 0,01 0,02 0,1
Acid p-aminobenzoic 1,0 7,3 10,0
Biotina 0,1 0,4 1,0
Pantotenat de calciu 0,5 1,0 5,0
Riboflavina 0,1 0,26 1,0
Tiamina - HCl 1,0 3,0 10,0
Gamborg B5
Acid nicotinic 0,1 8,1 10,0
Piridoxin - HCl 1,0 4,9 10,0
Tiamina - HCl 10,0 29,6 100,0

Aa cum se poate observa, raportul dintre cele dou componente trebuie s fie de
1:2 pentru ca soluia s fie stabil. Orice exces de fier bivalent (Fe
2+
) duce la oxidarea
acestuia n Fe trivalent (Fe
3+
) urmat de formarea fosfatului feric care precipit.
Soluiile de vitamine care se folosesc la prepararea mediilor de cultur sunt
amestecuri mai mult sau mai puin complexe, diveri autori propunnd reeta proprie.
Concentraiile soluiilor stoc variaz n general ntre 100x i 1000x. Pstrarea
acestor soluii se face de regul n frigider la 0-5C, uneori fiind necesar pstrarea n
congelator (amestecul Kao&Michayluk cod Sigma K-3129).
n tabelul 3.4.6. sunt prezentate reetele ctorva amestecuri de vitamine folosite mai
frecvent la prepararea mediilor de cultur.
71
Mai trebuie reinut c piridoxina i tiamina se dizolv cu cteva picturi de acid
clorhidric n timp ce acidul folic, bistina i acidul nicotinic se dizolv mai uor la cald (nu
se vor depi 35-37C).
Cum marea majoritate a vitaminelor sunt termolabile nu s-ar recomanda
introducerea lor n mediu nainte de autoclavare. Soluia este sterilizat prin filtrare,
folosind filtre bacteriologice de 0,2 m i introducerea n mediul autoclavat nainte de
rcirea acestuia.

Soluiile de hormoni
Aa cum am precizat n capitolul 3.2. mediul de cultur trebuie s conin i o serie
de substane fitoregulatoare care practic determin sensul evoluiei explantelor.
n funcie de tipul de explant, de tipul de cultur i de scopurile urmrite se
apeleaz la o anumit combinaie de hormoni. De regul, se urmrete realizarea unui
raport auxine: citochinine optimal dar n acelai timp pot fi adugai i ali hormoni cu
aciune stimulatoare.
Pentru fiecare tip de hormon se prepar soluii stoc concentrate care n momentul
folosirii se dilueaz pn la concentraia precizat n protocol. Date despre solvenii
folosii, modul de diluare i temperatura de pstrare a soluiilor stoc se regsesc n tabelele
3.2.1; 3.2.2.; 3.2.3 i 3.2.4.
Cel mai frecvent se prepar soluii stoc care conin 1 mg din hormonul respectiv
ntr-un ml de soluie. n acest sens, se dizolv 100 mg de hormon folosind civa ml de
solvent dup care se dizolv n apa distilat pn se ajunge la volumul de 100 ml. Dup
etichetare soluia stoc se pstreaz aa cum am precizat mai devreme.
1 mg/ml = 1000 mg/l = 1
.
10
-3

n mediile de cultur concentraia hormonilor variaz, n general, ntre 0,1 i 10,0
mg/l.
Pentru a prepara un anumit mediu se aplic formula de mai jos sau se face un
raionament simplu:
Volum de soluie stoc necesar
=
Concentraia hormonului n mediul normal
.
Volum de mediu
Concentraia soluiei stoc

Volum de soluie stoc de BAP necesar
=
0,5mg/l
.
3 l
=
1,5 l
=
1,5 ml soluiei stoc BAP
1000 mg/l 1000

72
n tabelul 3.4.5. sunt calculate cteva diluii n funcie de concentraia dorit de
hormoni, volumul de mediu de preparat i concentraia soluiei stoc.
Tabelul 3.4.5.
Cantitatea de soluie stoc necesar pentru a prepara un anumit volum de mediu
cu concentraia hormonilor cunoscut

Concentraia dorit (final) - mg/l Soluia stoc de hormoni
250 ml 500 ml 1000 ml 2 litri 10 litri
Concentraia
mg/l
Necesar
ml
0,004 0,002 0,001 0,0005 0,0001 0,01 0,1
0,02 0,01 0,005 0,0025 0,0005 0,5
0,04 0,02 0,01 0,005 0,001 1,0
0,4 0,2 0,1 0,05 0,01 10,0
0,04 0,02 0,01 0,005 0,001 0,10 0,1
0,2 0,1 0,05 0,025 0,005 0,5
0,4 0,2 0,1 0,05 0,01 1,0
4,0 2,0 1,0 0,5 0,01 10,0
0,4 0,2 0,1 0,05 0,1 1,0 0,1
2,0 1,0 0,5 0,25 0,05 0,5
4,0 2,0 1,0 0,5 0,1 1,0
40,0 20,0 10,0 5,0 1,0 10,0
4,0 2,0 1,0 0,5 0,1 10,0 0,1
20,0 10,0 5,0 2,5 0,5 0,5
40,0 20,0 10,0 5,0 1,0 1,0
400,0 200,0 100,0 50,0 10,0 10,0

Atunci cnd concentraia soluiei hormonale se exprim cu ajutorul puterilor,
raionamentul este acelai: 1 mg/l = 1
.
10
-6

Dac concentraia dorit de hormoni este, de exemplu 0,5
.
10
-6
i se prepar 3 l de
mediu avnd o soluie stoc cu concentraia de 1
.
10
-3
se vor folosi 1,5 ml de soluie stoc.
Volumul de soluie stoc necesar = 0,5
.
10
-6

.
3 l = 1,5
.
10
-3
l = 1,5 ml soluie stoc
1
.
10
-3

Frecvent se prepar soluii stoc hormonale cu concentraia 1
.
10
-4
i mai rar 1
.
10
-3
.

3.5. Prepararea mediului de cultur
Prepararea mediului de cultur const dintr-o suit de etape.
Dup analizarea reetei care se va folosi, se scot sticlele cu soluiile stoc din frigider
sau alte locuri de pstrare i se aliniaz n ordinea de pe reet.
Alturat propunem spre exemplificare modelul de reet de la Facultatea de
Agricultur din Perugia, Italia (Standardi, A.), care conine mediul folosit pentru faza de
meninere a actinidiei (tabelul 3.5.1.).
73
ntr-un pahar Berzelius de dimensiuni corespunztoare se pun aproximativ 400 ml
de ap bidistilat dup care se adaug pe rnd cantitile (volumele) stabilite pentru fiecare
soluie stoc n parte, msurate cu cilindri gradai sau pipete.
Este indicat ca vasul cu mediu s fie plasat pe o plit cu agitator magnetic,
uurndu-se astfel dizolvarea i amestecarea componentelor.
Fiecare substan introdus se marcheaz pe reet pentru a evita omisiunile sau
folosirea de dou ori.
Dup ce s-au introdus toate substanele cu excepia agarului se aduce la semn cu
ap bidistilat i se trece la corectarea pH-ului amestecnd continuu. n funcie de valoarea
pH msurat se titreaz cu soluie 0,1 N de KOH (NaOH) sau respectiv HCI, pn la
valoarea dorit.
Se adaug apoi agentul gelificant cntrit n prealabil i se pregtete mediul pentru
autoclavare.
Din acest moment, se cunosc dou practici diferite. Una dintre ele presupune
autoclavarea mediului n vase de mare capacitate (1-2 l), urmat de repartizarea mediului
topit n vasele de cultur sub hota steril. Vasele de cultur au fost n acest caz, sterilizate
n prealabil prin autoclavare, n etuv, sau la productor (n cazul vaselor de unic
folosin).
Avantajul acestei metode ar fi c necesit volume de spaiu mai mici pentru
autoclavare dar, dup prerea noastr, este mai laborioas ntruct necesit sterilizarea
prealabil a vaselor de cultur, crete riscul infectrii mediului n timpul distribuirii i nu
este aplicabil la cantiti mari de mediu (pe scar industrial).
A doua posibilitate const n topirea agarului n vasul iniial cu mediu prin agitare
pe o plit electric sau baie marin. Agarul este topit cnd mediul devine limpede i are
culoare alb glbuie. Acest lucru are loc cnd ncepe s apar primele bule de aer pe
fundul vasului, semn c n scurt timp mediul d n clocot.
74
U..A.M.V. Bucureti Tabelul 3.5.1.
Facultatea de Horticultur


FIA DE PREPARARE A MEDIULUI DE CULTUR


Mediul (nr./sigla): S 2,5 , preparat n 25/08 , pentru faza: multiplicare ,
specia: actinidia , ml de mediu necesari: 100, recipiente: vase sticl ,
ml/recipient: 100 , pH msurat: 4,32 , pH dorit: 5,5 , pH corectat cu 2,5 ml
de NaOH 0,1 N.
Componente Conc.
dorit
Conc.
sol. mam
Cant. total
ml (g)/l
ml (g) ptr.
ml
Sruri minerale
Macroelemente Quoirin&Lepoivre X 10X 100
Microelemente Quoirin&Lepoivre X 1000 X 1
Chelat de fier X 200 X 5
Vitamine / Aminoacizi
Amestec Walkey 2 X 100 X 10
Inozitol
Gibereline
GA-3 10-6 10-6 1
Altele
Auxine
ANA; AIA; IBA
Altele
Citochinine
Benziladenina (BAP) 10-6 10-7 10
Altele
Diverse


Zaharuri
Zaharoza 2,5 % 25
Altele
Substane gelificante
Agar 0,7 % 7
Altele
Cantitatea total de soluii mam ml: 127
Apa distilat pentru aducere la volum ml: 850
Substrat preparat de: ..............................................
75
n continuare, mediul este repartizat n vasele de cultur fie direct, fie cu ajutorul
unor dispozitive care msoar repetitiv i debiteaz acelai volum de mediu. n eprubete se
introduc n general 5-8 ml de mediu.
n laboratoarele industriale, mediul este topit n cuve din inox prevzute cu pompe
aspiro-respingtoare cu debit reglabil.
Dup repartizare vasele de cultur se nchid (vezi subcapitolul 4.2.1.), se
eticheteaz, preciznd pe fiecare sigla mediului (eventual varianta) i data preparrii.
Urmeaz apoi sterilizarea prin autoclavare.
Atunci cnd se folosesc substane termolabile a cror sterilizare se face prin filtrare
(0,2 m), acestea se vor introduce n mediu dup autoclavare, nainte de solidificarea
acestuia. Mediul trebuie s fie cald dar nu fierbinte (35-37C). Se va amesteca continuu
pentru o ct mai bun omogenizare.
O alt situaie se ntlnete la folosirea mediului de cultur n dublu strat. Acest tip
de mediu prezint un strat solid (cam 75-80% din volum) iar la suprafa are un strat de
mediu lipsit de agentul gelificant.
Pentru prepararea acestui mediu care prezint multe avantaje (Stnic i colab.,
1996) nainte de introducerea agarului se separ cam 20-25% din volumul total i se
autoclaveaz separat. Mediul lichid se va repartiza dup autoclavare i rcirea
(solidificarea) stratului bazal, sub hot, n condiii sterile.
Pentru a reduce numrul de manipulri i riscul infeciilor, acest lucru se poate face
i n momentul inoculrii, practic, dup inocularea explantelor pe mediul solid.

3.6. Probleme care apar la pregtirea i folosirea mediilor de cultur
Prima problem care poate aprea la prepararea mediilor de cultur este formarea
unor precipitate insolubile. Aa cum am mai precizat, cauza este nerespectarea ordinii la
amestecarea unor compui, iar efectul este formarea fosfailor insolubili.
Frecvent srurile cu calciu se dizolv i se folosesc pentru prepararea unor soluii
stoc, separate de cele de macroelemente i se adaug doar n momentul preparrii
mediului.
S-a mai observat formarea de precipitat atunci cnd se adaug calciul i fosforul i
mediul are pH-ul n jur de 5,6. Pentru reducerea riscului precipitrii se recomand folosirea
unor soluii stoc mai diluate de macroelemente (10X).
76
O alt problem este nesolidificarea mediului de cultur dup rcirea acestuia.
Dintre cauze amintim:
- cantitate prea mic de agar, sub 5-6 g/l;
- depirea temperaturii la autoclavare;
- ph-ul prea mic al mediului de cultur (sub 5,5);
- agar foarte vechi.
Mediile de cultur sunt amestecuri nutritive complexe i constituie un suport ideal
pentru instalarea i dezvoltarea rapid a unor microorganisme de tipul bacteriilor i
ciupercilor.
Sursele de infecii i cauzele apariiei acestora n mediile de cultur sunt multiple:
- soluii stoc nvechite, infectate cu bacterii i ciuperci;
- vase de cultur provenite din culturi infectate puternic, nesplate i
nedezinfectate corespunztor;
- curenie deficitar n laborator;
- autoclavare necorespunztoare fie prin nerespectarea timpului, fie a
temperaturii i presiunii recomandate;
- nchiderea necorespunztoare a vaselor de cultur i infectarea dup
autoclavare;
- hot necorespunztoare care nu asigur sterilizarea total a aerului n timpul
inoculrilor;
- tehnic de lucru deficitar, operatorul putnd fi principalul vector al unor ageni
contaminani;
- material biologic infectat i deci sterilizat necorespunztor;
- condiii de curenie necorepunztoare n camera de cretere;
- o serie de acarieni, tripi etc. pot ptrunde n vasele de cultur i transporta
ageni contaminani.
n general n mediile de cultur se ntlnesc dou tipuri de infecii. Cele de origine
bacterian se caracterizeaz prin apariia n jurul explantelor, la suprafaa mediului sau n
interior, a unui halou translucid de culoare alb-glbuie sau divers colorat (foto 3.3. a). n
mediile lichide crete turbiditatea acestora. Infeciile bacteriene sunt nsoite frecvent de un
miros puternic, neplcut.
77
Infeciile micotice se recunosc prin formarea unor reele miceliene pe care pot
aprea fructificaii de diferite culori (negre la Aspergillus sp., verzi-albstrui la Penicillium
etc.) (foto 3.3. b). Prezena fructificaiilor crete riscul rspndirii infeciei n vasul de
cultur dar i n afara lui.


a b
Foto 3.3. Infecii mixte cu bacterii i ciuperci n faza de iniiere-stabilizare in vitro

Dac o infecie este depistat n faz incipient i ea a afectat un singur explant
dintr-un vas se poate ncerca salvarea celorlalte explante, mai ales dac este vorba de un
material valoros.
n acest sens, se vor repasa de urgen explantele aparent sntoase n eprubete i se
va urmri evoluia lor. O alt soluie este sterilizarea explantelor aparent sntoase i
repasarea lor, individual, pe un mediu nou.


a b
Foto 3.4. Infecii n faza de multiplicare in vitro (a bacterii, b-Penicillium)

Mediul poate de asemenea s-i schimbe culoarea devenind brun ca urmare a
emiterii de fenoli de ctre explante (foto 3.5.); prin oxidare aceti fenoli determin
78
brunificarea mediului. ntruct schimburile explantelor cu mediul se reduc drastic, se
impune de urgen nlturarea zonelor brunificate i pasarea pe un mediu nou.

Foto 3.5. Emisie de fenoli n faza de iniiere la mesteacn (Betula pendula Laciniata)

Pentru reducerea brunificrilor n continuare se poate apela la introducerea n
mediu a unor substane antioxidante:
- PVP (250-1000 mg/l); crbune activ (0,2-3,0%); acid citric, acid ascorbic,
tiouree, etc.; aminoacizi: L-cistein, glutamin, arginin i asparagin.
Atunci cnd mediul este pstrat timp ndelungat nainte de a fi folosit sau
nchiderea vaselor de cultur este defectuoas i/sau umiditatea din camera de cultur este
foarte sczut, se constat deshidratarea mediului. Acest lucru este sesizat printr-o scdere
puternic de volum i eventual, prin apariia de crpturi n mediu (foto 3.6.) .

Foto 3.6. Deshidratarea i crparea mediului la Gasteria sp.
Explantele, n aceste condiii, sufer datorit lipsei apei i concentrrii srurilor i
zaharurilor (crete mult presiunea osmotic). Se impune de urgen pasarea pe un alt
mediu.
79
n anumite situaii, la cultivarea unor explante pe mediu se observ c esuturile
acestora cresc neuniform i au un aspect vitros. Fenomenul denumit vitrificare sau
sticlozitate este determinat de un ansamblu de factori care in n primul rnd de mediul de
cultur dar, uneori i de materialul biologic nmulit.
Transformrile pe care le sufer explantele vitrificate sunt multiple i ele afecteaz
cloroplastele, membranele i mezofilul frunzelor, meristemele etc. Se constat o reducere a
coninutului n clorofil i o cretere a cantitii de ap din frunz (aceasta ocup pn i
esuturile lacunare, Cachi, 1987) (foto 3.3.).


Foto 3.7. Lstari vitrificai, regenerai din peiol de kiwi (Actinidia sp.)

Cauzele producerii acestui fenomen sunt legate de deficitul de agar, excesul de
etilen, excesul ionilor de NH
4
+
, excesul de citochinine, n special BAP etc.
Pentru salvarea explantelor vitrificate se impun o serie de msuri:
- reducerea concentraiei de sruri a mediului;
- creterea coninutului de agar (determin reducerea capacitii proliferative);
- folosirea agarului hidrolizat reduce la minimum riscul apariiei vitrificrii;
- folosirea unor inhibitori ai producerii de etilen: ioni de argint, CaCl
2
,
dinitrifenolul;
- creterea dozei de zaharoz.
Vitrificarea rmne o problem controversat i se impun noi cercetri pentru
elucidarea tuturor faetelor acestui fenomen negativ.
80
Capitolul 4
Sterilizarea i asepsia n culturile in vitro

4.1. Ageni sterilizani
Sterilizarea i asepsia n culturile in vitro se realizeaz prin folosirea unor mijloace
fizice i chimice. Mijloacele chimice sunt reprezentate de un numr mare de ageni
sterilizani cu origine i compoziie divers.
Alcoolul etilic este folosit de regul n concentraie de 70%, deoarece alcoolul
absolut (96%) determin deshidratarea rapid a materialul vegetal.
Calculul diluiei alcoolului de 96% se face dup schema de mai jos:



Cunoscnd concentraia iniial a alcoolului (96% volume alcool) se scade
concentraia dorit (70% volume alcool) i se obine, pe linia apei, cantitatea n ml, sau
numrul de pri de ap folosite la diluie.
Repetnd apoi acelai lucru pe a doua diagonal, se obine pe linia alcoolului
cantitatea de alcool concentrat care va fi folosit, exprimat n ml sau pri.
n general, timpul de sterilizare n alcool este scurt (30-60 de secunde) ns se poate
prelungi atunci cnd explantele sunt protejate de solzi, catafile etc. Dup introducerea n
alcool, explantul se va spla rapid prin plonjare n apa distilat.
Sterilizarea n alcool este urmat frecvent de o sterilizare cu hipoclorit de sodiu sau
calciu.
Pentru fructe uscate, smburii, seminele de orhidee sau unele plante puternic
contaminate (mucat), sterilizarea se face prin introducerea explantelor n alcool de 96%,
flambarea rapid i rcirea n ap distilat steril.
alcool 96% 70 ml alcool

70%

ap 0% 26 ml ap
81
Hipocloritul de sodiu (NaClO, apa de Javel) este folosit ca agent nlbitor pentru
rufe. Majoritatea produselor comerciale conin 10-20% substan activ. Pentru sterilizare
se folosete ns o soluie cu o concentraie de 1,0-2,0%. Rareori concentraia ajunge la
8,0%.
Trebuie reinut c hipocloritul de sodiu se descompune uor i nu poate fi pstrat o
perioad ndelungat.
Hipocloritul de calciu (Ca(ClO)
2
) se folosete n situaiile n care hipocloritul de
sodiu se dovedete a fi toxic. Hipocloritul de calciu este condiionat sub form de pudr
care se dizolv destul de dificil n ap.
Pentru prepararea soluiei dezinfectante se dizolv 35-100 g hipoclorit ntr-un litru
de ap. Se face apoi filtrarea soluiei prin vat sau hrtie de filtru cu pori mari pentru a
nltura particulele nedizolvate. Acestea, provoac de regul necrozarea esuturilor.
Timpul de sterilizare variaz ntre 5 i 30 de minute, n funcie de tipul de explant.
Dup dezinfectarea cu hipoclorit de calciu, care este puternic alcalin, se recomand
introducerea n prima ap de splare a unei cantiti reduse de acid clorhidric pentru
extragerea ionilor toxici de Cl
-
. Operaia este urmat de 4-5 splri succesive cu ap
distilat.
Trebuie precizat c suprafeele secionate ale explantelor se nlbesc sub aciunea
clorului. Aceste zone vor fi eliminate n momentul pregtirii explantului pentru inoculare
ntruct celulele sunt moarte.
Hipocloritul de calciu n soluie este ceva mai stabil i poate fi pstrat o perioad
ndelungat.
Clorura mercuric (sublimatul, HgCl
2
) este o otrav puternic care se folosete
sub form de soluie n concentraie de (0,01-0,1%) timp de 2-15 minute. Concentraia i
timpul de sterilizare se vor reduce n cazul organelor i esuturilor tinere. Efectul sterilizant
este puternic i dup folosire, sunt necesare 2-3 cltiri cu ap distilat steril.
Apa oxigenat (perhidrolul) se poate folosi cu succes la sterilizarea materialului
vegetal n concentraie de 10-12%. De regul, este folosit pentru prima sterilizare timp de
5-15 minute.
Are avantajul c ptrunde n profunzime i cur materialul vegetal prin
efervescena pe care o produce. Apa oxigenat nu se recomand s fie folosit la
dezinfectarea explantelor provenite de la speciile cu coninut ridicat de polifenoli deoarece
determin oxidarea rapid a acestora i deci, brunificarea esuturilor.
82
Apa bromat (1-2%) se folosete timp de 2-10 minute i are un efect sterilizant
foarte bun.
Azotatul de argint (1%) se folosete timp de 4-30 minute.
Antibioticele preparate n soluii de 4-100 mg/l pot fi folosite ca ageni sterilizani
mrind eficacitatea sterilizrii. Pentru amestecul penicilin + streptomicin (1 mg/l) durata
sterilizrii este de 2 ore.
n tabelul 4.1.1. sunt prezentate cteva dintre antibioticele i substanele
antimicotice folosite mai frecvent ca ageni sterilizani la dezinfectarea explantelor sau
mediului de cultur. Prezena antibioticelor n mediu poate s determine apariia unor
mutaii mai ales la culturile susceptibile n acest sens: culturi de calus, culturi de celule,
etc. Din acest motiv, folosirea lor este relativ limitat.
n anumite situaii, se apeleaz ns la antibiotice pentru nlturarea unor infecii
latente periculoase, dac acestea au afectat un material biologic valoros.
Pregtirea soluiilor de antibiotice este relativ simpl. n marea lor majoritate
antibioticele se prezint sub form de pulberi solubile n ap sau n civa solveni (DMSO,
DMF, etanol, HCl, NaOH etc.). Fiecare preparat are marcat pe etichet i activitatea
biologic exprimat n g/mg sau uniti/mg. n funcie de aceasta se va calcula
concentraia soluiei care se va prepara, respectiv cantitatea de antibiotic care se va folosi,
astfel:
cantitatea de antibiotic
=
volumul de mediu x concentraia dorit
activitate

Dup solubilizarea n solventul corespunztor, antibioticul se va dilua cu ap
distilat pn la volumul dorit. Pstrarea soluiei se face de regul n frigider la 0-5C, iar
perioada de pstrare variaz de la o zi pn la trei luni sau chiar la un an.
Majoritatea antibioticelor sunt termolabile motiv pentru care se recomand
sterilizarea lor prin filtrare prin membrane speciale (acetat de celuloz).
Alte substane care pot fi folosite pentru sterilizare sunt clorura de var (de uz
sanitar), cloramina, formolul, permanganatul de potasiu, etc.
83
Tabelul 4.1.1.
Principalele antibiotice i antimicotice folosite n culturile in vitro
Specificaie
Mas
molec.
Solvent Diluant
Pstrare
produs
Concentraia
folosit
Amfotericin B 924,1 DMSO, DMF ap 0-5C 2,5 mg/l
Ampicilin 371,3 ap ap 0-5C 100 mg/l
Cicloheximid 281,4 etanol ap 0-5C 10 g/l
Cloramfenicol 264,3 ap + NaOH ap temp. cam. 5 g/l
Eritromicin 148,2 HCl, etanol ap temp. cam. 100 mg/l
Gentamicin sulfat 160,2 ap ap 0-5C 50 mg/l
Kanamicin 582,6 ap ap temp. cam. 100 mg/l
Neomicin sulfat 908,9 ap ap temp. cam. 50 mg/l
Nistatin 926,1 suspensie/ap ap -0C 50 mg/l
Penicilin G 372,5 ap ap temp. cam. 100.000 U/l
Streptomicin sulfat 1457,4 ap ap 0-5C 100 mg/l
Tetraciclin 444,4 ap Na -0C 10 mg/l

4.2. Sterilizarea vaselor de cultur i a instrumentarului folosit
4.2.1. nchiderea vaselor de cultur
Vasele de cultur trebuie prevzute cu dopuri i capace adecvate care s previn
deshidratarea mediului de cultur, ptrunderea unor ageni contaminai din exterior i
acumularea unor gaze nocive n atmosfera vasului (CO
2
, etilen etc.). n acelai timp,
acestea trebuie s permit aprovizionarea cu oxigen din exterior.
Principalele mijloace i materiale folosite pentru nchiderea vaselor de cultur sunt:
- dopurile din vat. De regul, se realizeaz prin nvelirea vatei cu tifon dup o
prealabil presare a acesteia. Aceste dopuri au dezavantajul c nu pot fi sterilizate prin
flambare n momentul folosirii.
O alt variant este reprezentat de dopurile din vat nvelite ntr-o folie de
aluminiu care nltur n bun msur dezavantajele primelor.
Avnd n vedere c la prima sterilizare dopurile de vat elimin o substan toxic,
nainte de folosirea dopurilor noi, se va face autoclavarea acestora. Periodic, este necesar
ca aceast autoclavare de siguran s se repete.
- dopurile din plut pot fi folosite pentru eprubete, vase Erlenmayer i alte vase de
cultur cu deschiderea ngust. Este necesar de asemenea autoclavarea lor, iar n cazul n
care provin de la vase cu mediu infectat, se vor lua msuri suplimentare de sterilizare (foto
4.1.).
- dopurile din cauciuc, sunt practice pentru c se pot spla i dezinfecta uor n
alcool. Sterilizarea prin flambare n momentul inoculrii este contraindicat i trebuie
84
realizat rapid pentru a evita aprinderea cauciucului i degajarea gazelor toxice n
atmosfera vasului de cultur (foto 4.2.).


Foto 4.1. Dopuri din plut

Foto 4.2. Dopuri din cauciuc

- dopurile din steristop sunt realizate dintr-o celuloz poroas. Acestea trebuie de
asemenea, protejate cu folie de aluminiu pentru a le face mai practice.
- capacele metalice trebuie s aib un sistem adecvat de fixare la gura vasului de
cultur. Sunt opace i necesit pentru etanare folosirea foliei de aluminiu sau a foliei de
plastic autosigilante. n acelai fel, se pot utiliza capace din plastic rezistent la autoclavare.
n cazul capacelor prevzute cu filet se va avea grij ca la nchidere s nu se
nurubeze prea tare, pentru a se evita vidarea interiorului prin autoclavare i pentru a
permite circulaia aerului dup inoculare.
- capacele din sticl au avantajul c permit ptrunderea luminii pe la partea
superioar a vasului de cultur. Necesit sisteme suplimentare pentru fixare i etanare. n
anumite situaii, pentru acoperirea vaselor de cultur se pot folosi vase Petri.
- folia de aluminiu este mult folosit la nchiderea vaselor de cultur. Poate fi
refolosit dar are dezavantajul c uneori permite ptrunderea agenilor patogeni din
exterior i infectarea mediului de cultur.
- folia din material plastic (Parafilm, Vitafilm, folia din PVC, folia din
polipropilen) poate fi folosit ca atare sau de regul este folosit pentru etanarea
corespunztoare a altor sisteme de nchidere prezentate anterior. Etanarea trebuie s evite
deshidratarea mediului de cultur dar s permit schimbul activ de gaze ntre atmosfera
interioar i exterior.
La alegerea sistemului i materialului pentru nchiderea vaselor de cultur (Pierik,
1987), trebuie inut cont de faptul c:
85
- dac vasul este nchis ermetic nu este posibil schimbarea de CO
2
, O
2
i etilen cu
exteriorul. Acumularea CO
2
i etilenei n interior precum i lipsa oxigenului au consecine
nefaste. De regul, polipropilena i folia de aluminiu subire etaneaz perfect nepermind
realizarea acestor schimburi gazoase.
Cultivarea explantelor de Magnolia soulangeana n vase de cultur ermetic nchise
a determinat clorozarea plantelor datorit acumulrii excesive de CO
2
i etilen. n aceste
situaii se impune folosirea unor substane speciale absorbante ale etilenei (Ethy-sorb).
n prezent se realizeaz capace din polipropilen prevzute cu membrane
semipermeabile care nltur aceste neajunsuri.
- anumite materiale sintetice folosite pentru realizarea vaselor de cultur, a
dopurilor sau capacelor elimin etilena care se poate acumula astfel n atmosfera interioar
i poate declana simptome de toxicitate.
- n cazul unui vas de cultur nchis etan, evaporarea apei din interior este blocat.
n acest caz, umiditatea foarte ridicat determin apariia vitrificrii.
- sistemele de nchidere opace reduc accesul luminii n interiorul vasului de cultur.
Pentru eprubete situaia se poate rezolva prin aezarea acestora n camera de cultur, n
poziie nclinat, pe supori speciali. Prin rcirea mediului innd eprubetele nclinate, se
realizeaz n plus mrirea suprafeei de contact a acestuia cu atmosfera vasului i uurarea
schimburilor gazoase.

4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultur
Recipientele din sticl trebuie supuse unei sterilizri prealabile. Dup splarea
acestora se autoclaveaz pentru eliminarea unor compui toxici nainte de folosire pentru
cultur.
Vasele de cultur folosite trebuie splate cu atenie cu ap cald i detergent, cltite
repetat cu ap distilat sau ap deionizat i zvntate cu grij.
Splarea se face manual sau mecanic, folosind dispozitive simple cu perii rotative
sau maini de splat performante. Exist i dispozitive speciale de splat cu ultrasunete
(foto 2.7.).
Pentru vasele care se cur greu se recomand folosirea amestecului cromic n
care vasele se menin timp de patru ore.
Amestecul cromic se obine din bicromat de potasiu i acid sulfuric. Pentru nceput
se prepar 100 ml de soluie saturat de bicromat de potasiu prin dizolvarea la cald a 30 g
86
de bicromat de potasiu n 70 ml ap distilat. Se adaug apoi treptat (agitnd balonul n ap
rece), 300 ml de acid sulfuric concentrat.
Preparatul are o culoare brun-portocalie, este foarte toxic, coroziv i oxidant. Dup
folosire se recupereaz i se poate refolosi. Cnd se uzeaz culoarea devine verde. Vasele
splate cu amestec cromic se vor clti cu atenie, fr a face stropi care bine-neles sunt
corozivi.
n cazul vaselor de cultur cu medii puternic infectate, dup o splare
corespunztoare se impune sterilizarea acestora n etuv la 160C, timp de cel puin 3 ore.
Se va evita depirea temperaturii de 180C pentru a se evita deteriorarea calitii
sticlei.
Celelalte obiecte de sticlrie care se folosesc, se ambaleaz n hrtie sau folie de
aluminiu i se sterilizeaz n etuv la 120C, timp de 1-2 ore.
Sterilizarea se poate face i la umed n autoclav la 120-121C, reducnd timpul de
autoclavare la 30-40 de minute. n acest caz, se recomand folosirea foliei de aluminiu, a
foliei autosigilante sau a unor pupinele speciale pentru autoclavare.
Dopurile i capacele, n funcie din materialul din care sunt confecionate, se spal
i se sterilizeaz prin autoclavare.
n cazul n care culturile sunt sntoase, pentru reducerea cheltuielilor i a
pierderilor de timp se va face sterilizarea vaselor de cultur i a mediului prin autoclavare,
dup repartizarea acestuia.
n prezent, se folosesc o serie de recipiente de cultur sau auxiliare de diferite
forme i mrimi de unic folosin. Acestea se livreaz n pungi din polietilen etane care
se deschid n momentul folosirii, sub hota cu flux laminar.
La productor, recipientele din plastic se sterilizeaz prin radiaii gamma (2000 r)
sau mai frecvent, cu oxid de propilen.

4.2.3. Sterilizarea instrumentarului
Instrumentarul metalic folosit la secionarea explantelor i la pasarea lor pe mediu
(bisturie, ace spatulate, pense etc.) trebuie sterilizat frecvent. Acest lucru se face de regul,
naintea i n timpul lucrului, prin flambare. n acest sens sub hot va exista un recipient cu
spirt (96% vol. alcool) n care instrumentele respective se introduc. Se face apoi flambarea
propriu-zis la flacra unui bec de gaz sau a unei spirtiere i aezarea pe un suport pentru a
87
se rci. Se recomand ca, dup fiecare explant manipulat, s se fac sterilizarea prin
flambare a instrumentelor i schimbarea acestora cu altele sterile.
Foarte important este nlocuirea periodic a alcoolului folosit pentru flambare,
deoarece prin evaporare, concentraia sa scade, arderea este necorespunztoare. Exist
astfel riscul ca sterilizarea s fie ineficient, infecia transmindu-se prin intermediul
instrumentelor.
Un alt mijloc folosit pentru sterilizarea instrumentelor este sterilizatorul
(incineratorul) electric (foto 4.3.). Acesta prezint un corp gurit din crmid refractar n
interiorul cruia, cu ajutorul unor rezistene electrice, temperatura crete pn la
aproximativ 871C. Timpul de sterilizare este de 1 minut.

Foto 4.3. Sterilizator electric pentru instrumentar

O alt variant o reprezint sterilizatorul cu bile din sticl (foto 4.4.) ntre care se
introduc instrumentele de sterilizat. i n acest caz, temperatura de sterilizare este n jur de
250C, iar timpul de sterilizare de 10-15 secunde. n nici un caz instrumentele nu se vor
lsa n interior mai mult de 1 minut, chiar dac sterilizatorul este prevzut cu un termostat.
Timpul de rcire este de aproximativ 30-60 de secunde.

Foto 4.4. Sterilizator electric cu bile din sticl
88

Sterilizatoarele prezentate sunt foarte eficiente mpotriva germenilor rezisteni la
cldur (flambare) i la alcool. Este vorba de bacterii din genul Bacillus, aa-numitele
bacterii curate, care supravieuiesc sterilizrii obinuite prin flambare.
Pe lng instrumentele cu care se lucreaz, este nevoie s se sterilizeze la
introducerea sub hota steril, lupele binocular, microscoapele, vasele cu mediu proaspt
sau cele provenite din camera de culturi i n general, orice obiect care se introduce din
afar.
Sterilizarea se face n acest caz prin pulverizarea obiectelor respective cu alcool
(96% vol. alcool) i prin tergere cu vat mbibat n alcool.

4.3. Sterilizarea mediului de cultur i a apei
ntruct mediul de cultur reprezint un suport ideal pentru creterea unor bacterii
i ciuperci nedorite se impune sterilizarea acestuia nainte de folosire.
n cazul n care se poate face autoclavarea mediului n aceeai zi, dup corectarea
pH-ului, acesta se va pstra n frigider, urmnd ca zaharoza i agarul s fie adugate nainte
de autoclavare.
Pentru a repartiza mediul de cultur n vase, dup ce s-a fcut corectarea pH-ului i
s-au adugat agarul, zaharoza i eventual crbunele activ, se aeaz recipientul cu mediu pe
o plit electric cu agitator magnetic pentru solubilizarea agarului.


Foto 4.5. Plit electric cu agitator magnetic

89
Operaia este ncheiat cnd mediul devine perfect transparent i dispar particulele
de agar aflate n suspensie. Acest lucru este marcat i de apariia primelor bule de aer la
fundul vasului, indicnd nceputul fierberii.
Pentru dizolvarea agarului n mediul de cultur se folosesc i recipieni speciali din
oel inoxidabil, prevzui cu rezistene electrice i agitare magnetic.
Pentru repartizarea mediului de cultur n vase se pot folosi seringi dozatoare de
mic capacitate (1-10 ml) care permit reglarea volumului de mediu distribuit (foto 2.4. i
2.5.) precum i dozatoare cu pompe aspiro-respingtoare pentru volume mai mari de mediu
(50-100 ml/vas) (foto 2.6.).
Dup repartizarea mediului vasele de cultur se nchid i se eticheteaz preciznd
sigla mediului i data preparrii.
Autoclavarea se face n autoclave speciale electrice sau cu gaz, prevzute cu
instrumente pentru controlul temperaturii i presiunii, temporizatoare i dispozitive de
siguran.
Timpul de sterilizare este corelat cu volumul de mediu existent n vasele de cultur
variind n general de la 15 minute la 30-40 de minute.
Timpul minim de autoclavare este compus de fapt din timpul necesar mediului de
cultur pentru a ajunge la temperatura de 121C, la care se adaug 15 minute de sterilizare
propriu-zis la aceeai temperatur.
Temperatura optim pentru autoclavare este de 121C n prezena aburilor ceea ce
corespunde cu o presiune de 1 atm (1,05 kg/cm
2
). Ali autori (Gautheret, 1959)
recomandau autoclavarea mediilor la 115C timp de o or (volume de 3-5 litri) i repetarea
autoclavrii dup 24 ore. Aceast tehnic ar reduce degradarea unor componeni
termolabili.
n lipsa unor autoclave speciale, sterilizarea mediului se poate face i n oale de
gtit sub presiune (tip Kukta). i n acest caz se va face sterilizarea mediului introducnd n
oal un strat corespunztor de ap pentru formarea aburilor.
Timpul de sterilizare se va msura din momentul n care ies primii aburi din supapa
de siguran.
90
Tabelul 4.3.1.
Corelaia dintre timpul minim de sterilizare i volumul de mediu existent
n vasul de cultur
Volumul de mediu din vas
ml
Timpul minim de autoclavare
min
25 20
50 25
100 28
250 31
500 35
1000 40
2000 48
4000 63

n toate cazurile, pentru a se realiza rcirea rapid a mediului, autoclavele vor fi
deschise numai dup ce s-a realizat depresurizarea incintei.
Substanele termolabile: giberelinele, zeatina, ureea, piridoxina, tiamina, glutamina,
etc. se vor steriliza prin filtrare, dup autoclavarea mediului de baz.
Sterilizarea prin filtrare se poate realiza i pentru ntreaga cantitate de mediu (fr
agar). Acest lucru este posibil folosind nuci filtrante din sticl cu porozitate de 1 micron
(filtru Jena tip F i Pyrex tip 5H) sau filtre de unic folosin tip Millipor (foto 4.6.) cu
porozitate de 0,5-0,2 microni.
n primul caz se folosesc seringi i vase din sticl n timp ce sistemul Millipor
presupune folosirea unor seringi de unic folosin. Filtrele Millipor trebuie splate nainte
de folosire cu ap distilat steril pentru a ndeprta urmele de detergent pe care le conin.
Sterilizarea prin folosirea la rece este o metod greoaie i poate fi aplicat doar
pentru mediile lichide.
Uneori pentru uurarea filtrrii se folosesc dispozitive de filtrare care se racordeaz
la pompa de vid (foto 4.7.).

Foto 4.6. Filtre de unic folosin

Foto 4.7. Sistem de filtrare sub vid
91
Sterilizarea la rece a unor substane termolabile, se poate face i prin amestecarea
acestora (dizolvarea) cu alcool etilic, eter etilic, aceton n incintele sterile. Dup
evaporarea substanelor sterilizante, substana termolabil se repartizeaz n mediu.
O alt practic folosit, este introducerea unor substane sterilizante n mediul de
cultur. Aceste substane mpiedic dezvoltarea ciupercilor i bacteriilor. Ca ageni
sterilizani se folosete o gam larg de antibiotice (penicilin, streptomicin,
cloranfenicol), conservani alimentari (salicilat, etc.) sulfamide, oxid de propilen (1 ml, la
20 ml mediu).
Apa folosit pentru diferite faze ale culturilor in vitro, dar mai ales pentru cltirea
explantelor dup sterilizare, trebuie s treac i ea printr-un proces de sterilizare.
Acest lucru se realizeaz prin autoclavare n recipiente din sticl. nchiderea vaselor
nu se va face etan, pentru a se permite aburilor sub presiune s intre n interior.
Frecvent, n apa folosit pentru sterilizare se introduc substane antioxidante (PVP,
0,1%).

4.4. Dezinfectarea materialului vegetal
naintea folosirii pentru culturile in vitro, materialul vegetal trebuie pregtit cu
minuiozitate. Aceast pregtire difer n funcie de proveniena materialului respectiv:
cmp sau spaii protejate.
Materialul vegetal provenit din cmp are un grad de infecie sporit, motiv pentru
care nainte de a fi folosit trebuie supus unor operaii suplimentare de pregtire:
- mugurii se vor folosi nainte de a se deschide i cnd sunt nc protejai de catafile;
- dac materialul este reprezentat de ramuri cu muguri acestea se vor parafina la vrf i
vor fi puse n vase cu ap pentru forare. n prealabil, se recomand mbierea lor ntr-o
soluie de fungicid (Topsin 0,1%; Ronilan, Rovral, Benlate);
- dintre lstari se vor alege ntotdeauna lstarii cei mai tineri i poriunile finale ale
lstarilor;
- dac este posibil, plantele se vor transfera din cmp n containere, n sere sau camere
de cretere i se vor folosi numai prile crescute ulterior.
Reducerea gradului de infecie a materialului iniial provenit din spaii nchise (sere,
solarii) se poate face prin:
- reducerea atacului de insecte vectoare care pot transporta ageni patogeni;
92
- prevenirea atacului de bacterii i ciuperci prin aplicarea tratamentului cu fungicide
sistemice i de contact;
- irigarea plantelor folosind sisteme de udare la sol: picurare, scurgerea la suprafa etc.
- pstrarea la valori sczute a umiditii n sere;
- zvntarea plantelor nainte de dezinfectare.
Tipul de organ folosit pentru inoculare este de asemenea determinant pentru alegerea
modului de dezinfectare i a agentului sterilizant.
n general, bulbii, tuberculii, rdcinile tuberizate i alte organe subterane, au un
grad ridicat de infecie. Dac este posibil, aceste organe vor fi puse n prealabil la forare
pentru a obine noi creteri (lstari) care vor fi folosite apoi pentru inoculare. Dac ns se
urmrete inocularea unor muguri, fragmente de disc, catafile etc., se va spla foarte bine
materialul i se vor lua msuri suplimentare de dezinfectare.
Mugurii pubesceni, ramurile cu lentile numeroase, tulpinile, lstarii sau frunzele
pubescente se dezinfecteaz greu datorit fixrii germenilor pe formaiunile respective i
datorit dificultii cu care agentul sterilizant ptrunde la suprafaa organului respectiv.
Reducerea tensiunii superficiale a lichidului dezinfectant se face prin adugarea
ctorva picturi de detergent lichid (Tween 20 sau 80).
Pentru a favoriza ptrunderea dezinfectantului n profunzime, sub solzi sau printre
periori, se poate face i dezinfectarea sub vid folosind un vas ataat la o pomp de vid
(foto 4.7.).
Metoda de dezinfectare folosit va ine seama ntotdeauna de natura suprafeelor
care urmeaz s fie dezinfectate. Se va lua n calcul de asemenea, permeabilitatea
epidermelor sau nveliurilor pentru agentul sterilizant i se va ine cont de modul n care
acesta poate afecta viabilitatea esutului int.
La dezinfectarea unor explante aflate n organe de rezerv, rizomi, bulbi,
tuberculi, a unor muguri (atunci cnd se urmrete prelevarea meristemelor, a unor smburi
i semine protejate de endocarp sau tegumente puternice, a unor fructe uscate etc., se pot
folosi concentraii ridicate i timpi de dezinfecie mari.
Pentru mbuntirea efectului dezinfectant se recomand cteva msuri:
- nlturarea prilor exterioare ale organelor: solzi protectori, catafile, etc.
- splarea intens cu ap a materialului vegetal nainte de dezinfectare;
93
- scufundarea explantelor pentru cteva secunde n alcool de 70% naintea
dezinfectrii chimice. Operaia are ca scop eliminarea bulelor de aer de la suprafaa
explantului i uurarea ptrunderii agentului chimic;
- adugarea unor detergeni (Tween 20 sau 80) n soluia de dezinfectat n
concentraie de 0,08-0,12% pentru reducerea tensiunii superficiale a acesteia;
- agitarea n timpul dezinfectrii, manual, sau cu un agitator magnetic;
- folosirea dezinfectrii sub vid pentru o mai bun impregnare a explantului cu
agentul dezinfectant.

4.5. Contaminrile i detectarea lor
Cauzele apariiei infeciilor n vasele de cultur pot fi multiple:
- dezinfectarea ineficient a inoculilor iniiali;
- infecii interne;
- tehnic de lucru necorespunztoare: mini murdare, mas de lucru nesterilizat, unelte
nesterilizate, mbrcminte murdar, instrumentar nesterilizat corespunztor etc.
- hot improprie: filtre mbcsite cu praf, flux de aer necorespunztor ca uniformitate i
vitez, orificii n filtre sau la locurile de mbinare etc.
- alcool pentru flambarea instrumentarului contaminat. Prin folosirea ndelungat sub
hot alcoolul se evapor i scade concentraia;
- vasele de cultur au pe pereii exteriori ageni patogeni (pstrare n spaii neadecvate);
- camera de inoculare murdar, nesplat i nedezinfectat periodic;
- camera de inoculri nu este steril;
- accesul persoanelor strine neechipate corespunztor;
- ptrunderea n vasele de cultur a unor vectori (acarieni etc.) etc.
n anumite situaii culturile sunt aparent sterile dar n momentul divizrii explantelor i
trecerii pe un alt mediu, sau prin pasarea pe un mediu bogat, se constat o infecie
masiv.
Acest lucru se datoreaz faptului c agentul patogen se afl n esuturi sau nu se
dezvolt pe un mediu srac.
Infeciile latente (interne) reprezint o problem serioas pentru culturile in vitro.
Ele se datoreaz unor ageni patogeni aflai n interiorul plantei i care nu pot fi distrui
prin dezinfecie exterioar.
94
Pentru rezolvarea acestei probleme ar fi posibil cultura de meristeme i folosirea
antibioticelor n mediul de cultur. Acestea din urm ns, au deseori efecte fitotoxice.
n mod normal, se folosesc combinaii de antibiotice diferite pentru a obine un
efect acceptabil. Unii autori afirm c folosirea antibioticelor stimuleaz creterea
explantelor.
Pentru identificarea infeciilor latente se recomand cultivarea unor explante pe
medii bogate care conin peptone sau triptone (2-3%) sau folosirea unor soluii pentru
incubat care devin tulburi n prezena bacteriilor.
Exist bacterii Bacillus licheniformis, B. subtilis rezistente la mijloacele comune
de sterilizare care terorizeaz laboratoare ntregi (n laboratoarele din S.U.A. au fost
denumite Fantoma alb - White ghost).
Tabelul 4.5.1.
Medii folosite pentru identificarea infeciilor bacteriene latente

Substana A
g/l
B
g/l
C
g/l
D
g/l
PPLO (Difco) 21,0 - - -
Triptone 10,0 - 15,0 -
Glucoz 1,0 1,0 - 24,0
Fructoz 1,0 - - -
Zaharoz 10,0 - - -
Sorbitol 70,0 - - -
Extract de drojdie
(soluie 25%)
100,0
(ml)
5,0 - 2,4
Ser de cal 200,0 - - -
Rou de fenol 25,0 - - -
Peptone de cazein - 5,0 - -
Peptone de soia - - 5,0 -
Agar - 15,0 15,0 -
NaCl - - 5,0 1,2
NH
3
PO
4
- - - 1,2
K
2
HPO
4
- 1,0 - 1,2
MgSO
4
. 7H
2
O - - - 0,48


95
Capitolul 5
Micronmulirea plantelor horticole

5.1. Consideraii generale
Micronmulirea plantelor in vitro prezint o serie de avantaje (Pierik, 1987) care
au impus-o n faa celorlalte metode de nmulire: generativ i vegetativ clasic:
- nmulirea in vitro este mult mai rapid dect in vivo, ntr-un an dintr-un explant fiind
posibil s se obin peste 1 milion de exemplare;
- multe specii care nu pot fi nmulite in vivo sau care se nmulesc greu, pot fi
nmulite in vitro n urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;
- creterea plantelor nmulite in vitro este mai puternic fapt datorat juvenilizrii i
devirozrii. La cpun, Cameron i colab. (1986) a observat c, creterea mai puternic a
explantelor obinute in vitro se datoreaz modificrilor survenite n schimburile gazoase
ale acestora;
- este posibil obinerea i nmulirea plantelor libere de virusuri cu toate avantajele
care decurg de aici;
- plantele cultivate in vitro pot fi transportate n condiii de siguran fitosanitar
desvrite putnd fi schimbate, exportate sau importate;
- pentru iniierea unui culturi in vitro este nevoie de o cantitate redus de material
biologic. Pentru amelioratori acest lucru este foarte important nct se poate realiza o
selecie drastic a materialului biologic i n plus, se pot nmuli indivizi deosebii obinui
prin hibridri sau mutante aprute;
- se realizeaz importante economii de teren, spaiu, energie i combustibil;
- ofer posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la creterea
productivitii i eficienei culturilor i la nlturarea periodicitii produciei determinat
de anotimpuri. Se poate, de asemenea planifica producia de plante obinute in vitro n
funcie de necesitile concrete ale pieii;
- nmulirea in vitro permite obinerea plantelor pe rdcini proprii, nlturnd altoirea
cu toate dezavantajele pe care aceasta le presupune;
- materialul produs in vitro poate s fie conservat prin diferite metode i folosit n
momentul n care este cerut;
96
- pentru ameliorarea plantelor micronmulirea in vitro ofer avantaje suplimentare:
se scurteaz timpul necesar producerii i lansrii unui soi;
se pot obine i nmuli clone homozigote care s fie folosite pentru producerea
hibrizilor F
1
;
prin utilizarea agenilor mutageni n diferite faze i tipuri de culturi in vitro se pot obine
i seleciona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus i la
regenerarea de lstari adventivi din mezofil;
prin cultura explantelor in vitro n condiii extreme, se poate realiza stres-selecia
genotipurilor noi (ex. rezistena la srturi);
manipulrile genetice de tipul hibridrilor somatice nu se pot concepe fr folosirea
culturilor de celule i protoplati in vitro;
anumite plante necesit nmulire vegetativ exclusiv: haploizii, mutantele sterile,
liniile mascule sterile folosite la hibridri, aneuploizii sau heterozigoii deosebii;
materialul genetic valoros poate fi conservat n bnci de gene sub form de explante in
vitro.
Folosirea micronmulirii in vitro este limitat uneori de anumite dezavantaje:
- n anumite situaii, stabilitatea genetic a materialului nmulit in vitro este redus;
- plantele nmulite in vitro prezint uneori defecte caracteristice i dup ce sunt
trecute in vivo: juvenilitate accentuat manifestat prin frunze necaracteristice, prezena
spinilor etc., lstrire adventiv, fructificare ntrziat, vigoare exagerat, pierderea
caracterului dominant;
- uneori nrdcinarea explantelor nmulite in vitro este greoaie sau imposibil. De
regul, rdcinile formate in vitro au o funcionalitate redus, ele fiind nlocuite de alte
rdcini n faza de aclimatizare;
- aclimatizarea plantelor obinute in vitro este foarte dificil datorit unor modificri
morfo-anatomice i fiziologice care apar pe durata cultivrii in vitro. Pentru realizarea
aclimatizrii trebuie construite structuri speciale, sere, solarii dotate cu dispozitive de
control al factorilor de mediu;
- clonarea exagerat favorizeaz creterea riscurilor de distrugere n mas a unor clone
de ctre rase virulente de boli i duntori aprute ulterior. Pentru evitarea acestor situaii
se va opta pentru varianta nmulirii i plantrii multiclonale;
- capacitatea regenerativ a explantelor poate s se reduc sau s se piard prin culturi
repetate, dup un numr mare de subculturi;
97
- n anumite situaii, sterilizarea total a materialului iniial este dificil sau imposibil;
- micronmulirea in vitro presupune existena unor structuri specializate i a unei fore
de munc calificate.

5.2. Fazele micronmulirii in vitro
5.2.1. Pregtirea materialului vegetal
Prima faz a micronmulirii in vitro este o faz important mai ales pentru speciile
lemnoase care trebuie s treac printr-o faz de juvenilizare. Juvenilizarea materialului
biologic ce urmeaz s fie nmulit in vitro, se poate realiza prin:
- tieri repetate, puternice, fiind stimulate astfel creterile noi;
- prin butire;
- prin altoiri repetate sau microaltoire.
Materialul biologic juvenil se poate obine i prin germinarea smburilor i
seminelor atunci cnd este posibil.
n acelai timp, faza de pregtire presupune cultivarea plantelor destinate prelevrii
de explante, n spaii nchise pentru prevenirea sau reducerea contaminrilor sau pentru
efectuarea unor tratamente fitosanitare eficiente. Se recomand cultivarea plantelor n
sistem hidroponic sau alte sisteme hors sol.
Pentru iniierea culturii, n perioada de repaus, ramurile sunt forate n camera de
cretere n vederea umflrii mugurilor i pornirii n cretere a lstarilor (foto 5.1.)

Foto 5.1. Ramuri anuale de fag puse la forare
98
5.2.2. Iniierea i stabilizarea
Faza de iniiere i stabilizare a culturilor in vitro presupune, sterilizarea materialului
vegetal, izolarea explantelor (meristeme, apexuri, fragmente uninodale, semine, frunze
etc.) i inocularea acestora pe un mediu de iniiere (foto 5.2., 5.3.).


Foto 5.2. Apexuri de lstari de fag n faza de iniiere i stabilizare

Mediile de iniiere sunt n general variante ale mediilor obinuite, recomandate
pentru specia respectiv, avnd ns concentraia de sruri redus la jumtate. Frecvent n
aceast faz, se folosesc reete de medii lipsite de hormoni.


Foto 5.3. Plantul de cicoare (Cichorium intybus) obinut prin germinare in vitro
(Diaconescu O., 2002)
99
De asemenea, este important realizarea culturii aseptice i nceperea creterii
explantelor. Pentru depistarea infeciilor latente sunt necesare teste suplimentare pe medii
bogate n zaharuri, peptone, etc.

5.2.3. Multiplicarea
Faza de nmulire (multiplicare) se ntinde pe mai multe subculturi cu o durat de 3-
4 sptmni. n aceast faz, scopul principal este creterea ratei de multiplicare n
condiiile meninerii stabilitii genetice a materialului. Creterea ratei de multiplicare se
poate obine prin stimularea lstrii axilare (foto 5.4.), prin stimularea alungirii lstarilor,
sau prin ambele metode simultan (foto 5.5., 5.6.).


a b
Foto 5.4. Multiplicarea prin lstrire axilar la cicoare (a) i hosta (b)


Foto 5.5. nceperea multiplicrii la
Hakonechloa aureola-graminee
ornamental
Foto 5.6. Multiplicarea la mr soiul Fuji
100
Acest deziderat se realizeaz, n general, prin creterea cantitii de citochinine din
mediu sau, prin realizarea unui balane hormonale nclinate n favoarea citochininelor.
Numrul de subculturi trebuie s fie limitat (variaz cu specia) i orice prelungire a
fazei respective necesit verificri suplimentare a stabilitii genetice a materialului.

5.2.4. nrdcinarea
Faza de nrdcinare sau de pregtire a materialului pentru trecerea in vivo este o
faz important care const n reducerea lstririi axilare, stimularea alungirii lstarilor,
inducerea formrii rdcinilor sau chiar formarea rdcinilor (foto 5.7.).


Foto 5.7. Rozete de Gasteria nrdcinate in vitro

Frecvent n aceast faz, se folosesc medii de cultur adiionate cu crbune vegetal,
lipsite de hormoni sau cu concentraii mai ridicate n auxine (Stnic i colab. 2003).
O alt variant const din cultivarea pe un mediu cu concentraie ridicat de auxine
o anumit perioad urmat de cultivarea pe un mediu fr hormoni.
Din raiuni economice, ns, tot mai multe laboratoare industriale opteaz pentru
realizarea nrdcinrii simultan cu aclima-tizarea (foto 5.8.).
101













Foto 5.8. nrdcinarea in vivo a lstarilor de smochin, simultan cu aclimatizarea

5.2.5. Aclimatizarea
Faza de aclimatizare este cea mai dificil etap n producerea materialului
micronmulit. Lstarii nrdcinai sau cu primordii de rdcini sunt trecui n amestecuri
de pmnt (foto 5.9.) i apoi meninui ntr-un spaiu caracterizat prin umiditate relativ
ridicat i temperatur controlat (foto 5.10.).


Foto 5.9. Transferul plantelor obinute
in vitro pentru nrdcinare i
aclimatizare in vivo la firma Vitroplant,
Italia
Foto 5.10. Solar pentru aclimatizarea
plantelor obinute in vitro la firma
Vitroplant, Italia

102
nainte de a fi folosit pentru producie materialul sditor de pomi i vi de vie
trebuie s fie plantat n cmp sau solar, pentru cretere i fortificare (foto 5.11., 5.12.,
5.13.).

Foto 5.11. Plant de smochin aclimatizat naintea fortificrii


Foto 5.12. coal pentru fortificarea materialului sditor micronmulit de actinidia
la firma Vitroplant Cesena, Italia

103

Foto 5.13. Plante de mslin nmulite in vitro la ncheierea procesului de fortificare
n solar (Vitroplant, Cesena, Italia)

5.3. Cultura de meristeme i apexuri
Plantele superioare dein esuturi cu o mare capacitate de proliferare care au ca rol
creterea n lungime a unor organe, ngroarea altora i chiar generarea de noi organe att
la nivelul tulpinii ct i al rdcinii.
Aceste esuturi denumite meristeme de cretere, sau simplu, meristeme, sunt
alctuite din celule bogate n citoplasm, cu numeroase mitocondrii, cu nucleu mare i cu
vacuole reduse ca dimensiuni. Pereii celulari sunt subiri, celulozici iar forma celulelor
variaz de la poligonal la tabular.

5.3.1. Clasificarea meristemelor
Meristemele se pot clasifica dup mai multe criterii, astfel:
1. Dup tipul structurilor pe care le formeaz meristemele sunt clasificate n
meristeme organogene i meristeme histogene. Din acest punct de vedere se cunosc
meristemele primare, meristemele secundare i cele speciale.
Meristemele primare sunt de mai multe feluri:
- meristeme terminale (apicale) sunt situate n vrful ramificaiilor tulpinii i
rdcinii asigurnd creterea acestora n lungime. Aceste meristeme se formeaz n
momentul n care ia natere embrionul i rmn active o perioad ndelungat. n decursul
104
anului exist perioade de diviziune intens a celulelor meristematice (perioada vegetativ)
i perioada de repaus relativ (n timpul sezonului rece).
n perioadele de inactivitate relativ meristemele sunt protejate n structuri de tipul
mugurilor. Se cunoate procesul de inhibiie corelativ pe care meristemele apicale l
manifest n raport cu cele axilare, fapt explicat prin coninutul ridicat n auxine al celor
dinti.
- meristeme axilare (laterale) - se formeaz la subsuoara frunzelor pe lstarii n
cretere. Formarea lor este legat de evoluia meristemului apical.
Prin diviziunea rapid a celulelor meristematice existente la nivelul meristemului
terminal se formeaz spre exteriorul conului de cretere primordiile foliare iar la subsuoara
acestora, primordiile mugurilor laterali (axilari). Primordiile mugurilor axilari sunt
alctuite la rndul lor, din celule de tip meristematic cu rol n dezvoltarea viitorilor muguri.
n acelai timp, spre baza conului de cretere n zona central, se formeaz vasele
conductoare i esut parenchimatic.
La plantele perene, formarea meristemelor laterale are loc deci, cu un an naintea
pornirii lor n activitate.
- meristeme adventive - sunt n general meristeme profunde situate att pe tulpin
ct i pe rdcin, n zona periciclului. Activarea acestor meristeme se face frecvent la
speciile care emit drajoni sau n situaia n care planta pierde din diferite cauze, organe sau
pri importante. n acest caz, meristemul adventiv va genera organe sau structuri similare
pentru compensarea pierderilor.
- meristemele intercalare se gsesc la monocotiledonate, fiind situate la baza
internodiilor.
- meristemele foliare sunt meristeme de tip adventiv care prezint importan n
generarea unor organe noi, lstari sau rdcini, la speciile cu nmulire vegetativ, prin
frunze sau fragmente de frunze. Aceste meristeme au un rol esenial n regenerarea unor
structuri noi n cazul organogenezei directe i a embriogenezei somatice.
Meristemele secundare se ntlnesc la speciile lemnoase, care prezint cretere n
grosime la nivelul tulpinii sau rdcinii. Dintre meristemele caulinare cambiul, genereaz
elemente conductoare liberiene spre exterior i vase lemnoase spre interior. n culturile in
vitro cambiul este folosit frecvent ca esut regenerativ.
Felogenul, denumit i strat regenerator subero-felodermic, produce suber spre
exterior i feloderm spre interiorul organului.
105
Meristemele speciale (Hoza D., 1996) sunt caracteristice organelor i esuturilor
cultivate in vitro. Ele au proprieti similare meristemelor primare i dau natere la
structuri noi de tipul lstarilor, rdcinilor sau embrionilor somatici.
Promeristemul apare la nivelul calusului sau a esuturilor care au suferit procese
de dedifereniere. Fiind un esut meristematic n faz incipient, evoluia sa ulterioar este
influenat de condiiile de cultur.
Meristemoidul este folosit ca termen tot pentru a defini o structur asemntoare
promeristemului i care poate evolua diferit.
Unii autori (Margara 1982, citat de Cachi Cozma, 1984) consider c
meristemoidul este difereniat deja funcional fiind de tip proliferativ, cnd d natere la
calus, rizogen i caulogen, cnd formeaz rdcini respectiv lstari.
Cu toate c se afirm c meristemul radicular la angiosperme este diferit de cel
caulinar, cele dou nefiind interconvertibile, cercetrile proprii au dovedit contrariul
(Stnic, 1998).
Astfel, cultivate pe un mediu bogat n citochinine rdcinile de kiwi au generat
lstari, n timp ce limbul foliar cultivat pe un mediu cu coninut ridicat de auxine (Stnic,
1994) a dat natere la rdcini (foto 5.14.).
Embrioidul este o structur evoluat care este capabil s genereze elemente
bipolare de tipul embrionilor somatici.


Foto 5.14. Formarea rdcinilor direct din limbul foliar la kiwi

106
Formarea embrioizilor are loc prin procese de difereniere n masa celular a
calusului sau direct prin embriogenez adventiv la nivelul altor organe (limb foliar,
cotiledoane, etc.).
Meristemului apical la angiosperme este alctuit din dou pri principale: tunica i
corpusul.
Tunica este format din 1-3 straturi de celule care se divid anticlinal pe un plan
perpendicular pe suprafa. Ea asigur alungirea conului de cretere.
Corpus - corpul meristemului este format din celule care se divid n toate sensurile.
Aceste celule dau natere primordiilor foliare i primordiilor de muguri spre exterior iar
spre baz din zona axial iau natere vasele conductoare i esuturile paranchimatice.
2. Dup zona n care se gsesc meristemele, acestea pot fi meristeme
radiculare sau meristeme caulinare.
Meristemele radiculare au o structur mai simpl i funcii limitate. n cadrul
meristemelor radiculare ntlnim:
- meristeme apicale - situate n vrful rdcinilor sub piloriz (scufie), care au rolul
de a asigura creterea n lungime a acestora;
- meristeme laterale - situate pe rdcinile principale cu rol n formarea de noi
ramificaii;
- meristeme adventive - situate n periciclu avnd rolul de a natere la lstari
(drajoni) sau alte rdcini.
Meristemele caulinare sunt mult mai complexe din punct de vedere structural i
funcional.
La nivelul tulpinii se ntlnesc toate tipurile de meristeme a cror evoluie este
diferit n funcie de o serie de factori: nutriionali, hormonali, de mediu, tehnologic, etc.

5.3.2. Cultura de meristeme
Meristemele caulinare sunt folosite n mod normal pentru a fi cultivate pe medii
aseptice in vitro.
Datorit totipotenei de care dau dovad meristemele caulinare, ele vor fi capabile
s genereze organe diferite, deci, n final, plante ntregi.
n general, se folosesc pentru iniierea de culturi meristematice terminale i cele
axilare (laterale). Acestea sunt capabile s genereze in vitro plntue, care sunt folosite apoi
pentru nmulirea rapid.
107
Primele ncercri de cultivare a meristemelor caulinare i radiculare in vitro au fost
fcute n 1922 de ctre Kotte la mazre i de ctre Robbins la porumb. Abia n 1946, Ball a
reuit s obin plante din apexuri meristematice de Lupinus albus i Tropaellum majus.
Ulterior, Wetmore i Morel, citai de Cachi-Cozma (1984) au studiat comportarea
meristemelor provenite de la diferite specii, n diferite condiii de cultur.
Epoca optim pentru prelevarea meristemelor variaz de la caz la caz. De regul se
evit perioadele de laten a organelor cnd activitatea meristematic este redus.
La garoafe, cel mai mare procent de supravieuire 1-au avut meristemele recoltate
primvara sau toamna devreme, n timp ce cele recoltate iarna au nrdcinat mai uor, iar
cele recoltate vara au prezentat cel mai ridicat grad de devirozare.
La cartof, meristemele recoltate primvara i vara formeaz plante care
nrdcineaz mai bine dect cele recoltate n a doua parte a anului.
Prelevarea meristemelor se face dup sterilizarea prealabil a materialului vegetal.
n cazul garoafelor, avnd n vedere c meristemele sunt bine protejate de primordiile
frunzelor se poate renuna la sterilizare.
La speciile lemnoase care prezint meristeme protejate de catafilele mugurilor,
sterilizarea poate s se fac la concentraii mai ridicate ale agenilor sterilizani.
Ulterior prelevarea meristemelor se face la hot sub o lup binocular. Se nltur
treptat catafilele i primordiile frunzelor cu ajutorul bisturiului i a unor ace spatulate pn
se ajunge la domul meristematic. Excizarea acestuia se face prin una sau dou tieturi
urmrind detaarea unei cantiti ct mai reduse din esutul aflat dedesubt.
Pentru uurarea lucrului, la muguri vegetativi provenii de la speciile lemnoase
nainte de "dezvelirea" domului meristematic sub lup, se poate recurge la eliminarea prin
patru tieturi paralele cu marginile mugurilor a aproximativ 50% din volumul acestora.
Tierea se va face antrennd i scoara adiacent de pe ramur i nlturnd astfel i
eventualele riscuri de infecie.
Se ajunge astfel n vecintatea meristemului i se continu operaia sub lupa
binocular.
Dup detaare, meristemul este aezat uor de pe lama bisturiului pe mediul de
cultur. Eventual cu ajutorul vrfului bisturiului se face o mic incizie n masa mediului n
care se va aeza meristemul.
O alt variant este aceea prin care se cultiv pe mediu meristemul nsoit de mai
multe primordii foliare. n acest caz, dup dezinfecia mugurilor se nltur numai
108
catafilele exterioare ale acestora. Mugurele dezbrcat n acest fel este inoculat pe mediu
i va porni n cretere n aproximativ dou sptmni. Metoda poate fi folosit pentru
iniierea culturilor in vitro la speciile lemnoase (foto 5.15. a i b)

a b
Foto 5.15. Iniierea culturii cu meristeme i primordii foliare
a Acer platanoides Drumondi, b Carpinus betulus Fastigiata

Mediul de cultur folosit este de regul mediul solid, putndu-se ns folosi i medii
lichide (foto 5.16), meristemele sau apexurile, aezndu-se n acest caz, pe puni de hrtie.
Frecvent se recomand reducerea coninutului de macroelemente la 1/2 (Standardi,
1982). pH-ul mediului variaz ntre 5,5-5,8.

Foto 5.16. Explante de kiwi (Actinidia deliciosa) provenite din apexuri
i cultivate pe mediu lichid
109
Concentraiile de hormoni sunt reduse 0,1-,5 m/1, auxinele i citochininele fiind
indicate pentru stimularea diviziunii celulare, iar giberelinele (GA
3
) pentru stimularea
alungirii lstarilor.
Intensitatea luminoas variaz de la caz la caz, n general recomandndu-se 2400-
2600 luci, cu o perioad de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric. La unele specii, inerea
meristemelor la ntuneric timp de 3-7 zile, are ca efect reducerea brunificrilor (Stnic i
colab., 1992).
Exist situaii cnd intensitatea luminoas trebuie s ating valori de 3000-4000
luci sau chiar de 10000 luci la conifere. Uneori se recomand suplimentarea luminii
fluorescente, cu lumin roie.
Temperatura optim este de 22-25C. Sunt situaii n care cultivarea meristemelor
la temperaturi mai ridicate are un efect mai drastic n eradicarea virusurilor (via de vie).
Dup nceperea formrii lstarilor din meristeme se trece la nmulirea acestora
folosind un procedeu adecvat.
Astfel, se poate realiza minibutirea lstarului prin secionarea lui n fragmente
uninodale sau stimularea lstririi axilare i izolarea lstarilor formai.
Avantajele folosirii meristemelor (dup Cachi-Cozma, 1984) sunt multiple:
posibilitatea nmulirii clonale a materialului biologic valoros; eliminarea bolilor i
duntorilor periculoi; obinerea unui material juvenilizat cu capacitate mare de
multiplicare; conservarea prin frig a inoculilor valoroi pn n momentul folosirii;
realizarea bncilor de gene.

5.3.3. Cultura de apexuri
Pe lng folosirea meristemelor, iniierea culturilor in vitro se poate face i prin
folosirea unor apexuri de lstari. Vrful de cretere al lstarului, nsoit de 1-2 frunze n
formare, este detaat dup o prealabil sterilizare i inoculat pe mediul de cultur. Cel mai
bun moment pentru inoculare este perioada de cretere intens a lstarilor.
Lstarii pot proveni de la plante cultivate n cmp sau n ser. n acest caz ns,
gradul de infectare a materialului este ridicat.
O soluie mult mai practic este obinerea lstarilor n laborator prin punerea la
forare a unor ramuri anuale. n acest scop, ramurile se fasoneaz n butai de 10-15 cm, se
parafineaz la vrf i eventual se dezinfecteaz prin mbiere ntr-o soluie de fungicide. Se
pun apoi n vase cu ap la temperatur ridicat (n camera de culturi) urmnd ca n 10-14
110
zile mugurii s se deschid i s se formeze lstarii care vor fi folosii pentru prelevarea
apexurilor (foto 5.17., 5.18.).


Foto 5.17. Ramuri de kiwi (Actinidia arguta) puse la forat


Foto 5.18. Coarde de vi de vie puse la forat n vederea prelevrii apexurilor

111
n tabelele urmtoare, sunt prezentate cteva din realizrile obinute prin cultura de
meristeme i apexuri la plantele horticole: legume (5.3.1.), flori (5.3.2.), pomi i arbuti
fructiferi (5.3.3.), arbori i arbuti ornamentali (5.3.4.) i vi de vie (5.3.5.). Sunt indicate
mediile de cultur folosite, rezultatul cercetrilor i bineneles, autorii.

112
Tabelul 5.3.1.
Cteva realizri privind cultura de meristeme si apexuri la plantele legumicole
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Plantul nrd. Havel & Novak (1985) 5,6 30 8 (0,1)BAP+/- ANA Havel&Novak 1985
Apium graveolens Plantule via
calus
Murashige&Skoog
(1962)
- 30,8 agar (1)2,4-D+(1)BAP Rappaport et al.
(1980)
Lstari Dor (1975) CMI 5,6 20 6 (1) ANA Dor (1975)
Calus Reuther (1984) 5,8 30 agar (1) ANA + (1) Kin Reuther (1984)
Lstar unic Murashige & Skoog
(1962)
5,8 20 6 (0,5) ANA Revire & Mller
(1974)
Lstari
nrdcinai
Tenedille & Lecerf (1974)
KNO
3

5,6 20 6 (1) ANA+(0,1) Kin+(0,1)
GA3

Tenedille & Lecerf
(1974)
Lstari axilari si
nrdcinare
Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 7 (0,1-0,3) ANA + (0,05-
0,1) Kin
Yang & Clore
(1973)
Plantule libere
de virusuri
Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang & Clore
(1976)
Lstari multipli Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang (1976)
Asparagus
officinalis
Creterea
lstarilor
Yang (1977) 5,7 30 7 (0,05 - 0,1)ANA +
(0,05) Kin
Yang (1977)
Brassica oleracea
capitata
Regenerarea
lstarilor
Murashige & Skoog
(1962)
- 30 agar (12,9) Kin Walkey et al (1980)
Cichorium intybus Regenerare lstari Quoirin&Lepoivre (1977) 5,8 (0,1)GA3 + (0,05) BAP Pieron et al (1992)
Cucumis sativus Lstar unic,
nrdcinat
Handley&Chambliss
(1979)
30 agar (0,1)ANA+(0,1) Kin Handley&Chambliss
(1979)
Dezvoltare pana
la 5 mm
Tran Than Van (1973) 5,8 30 lichid (8)AIA+ (2,56)Kin Pink & Walkey
(1984)
Cucurbita pepo
Proliferare
lstari
Tran Than Van (1973) 5,8 30 10 (1)BAP Pink & Walkey
(1984)
113
Tabelul 5.3.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
lstari Elliot(1969)M-S 5,8 30 lichid (1)AIA Elliot(1969)
calus Murashige & Skoog
(1962)
5,6-5,8 30 7 (0,1)2,4-D Jarret et al. (1984)
Lstari multipli Kartha et al.(1974a) 5,7 30 6 (0,2-1)ANA sau AIA +
[(0,2-1)BAP/Z/Kin]
Kartha (1982b)
Caulogenez Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (1)BAP sau
[(1)AIA+(1)Kin]
Litz&Conover(197
8b)
Lstar unic Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 agar BAP Moyer&Collins(19
82)
Ipomoea batatas
Lstar unic
devirozat
Nielsen(1960) 30 10 - Nielsen(1960)
Dezvoltare
lstari
Kartha et al.(1974a) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,5)BAP Bloksberg&Saltveit
(1985)
Lactuca sativa
Lstari cu
rdcini
Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Koevary et al
(1978)
Lycopersicon
esculentum
Lstari cu
rdcini
Gresshoff&Doy
(1972a,b)DBM2
5,8 -6,4 20 8 (8)ANA+(0,1 ) Kin Gresshoff&Doy
(1972b)
Phaseolus
vulgaris
Lstari multipli Kartha et al (1974 a) 5,7 30 6 (1,9) ANA + (1,1) BAP Kartha (1982 b)
Proliferare
lstari
Kartha et al (1974 a) 5,6 30 8 (0,02) ANA + (4,5)
BAP
Griga et al (1986)
Regenerare
plant
Gamborg et al (1968) B
5
8 (0,11) BAP Haskins & Kartha
(1980)
Pisum sativum
Dezvoltare
lstari
Gamborg et al (1968) B
5
5,7 20 6 (0,19) ANA + (0,1)
BAP
Kartha et al (1974b;
1979)
Lstar unic Murashige & Skoog
(1962)
20 lichid (2) AIA + (2) Kin Dodds & Roberts
(1982)
Alungire lstari Goodwin (1966) 30 lichid (0,01) AIA + (1) Kin Goodwin (1966)
Solanum
tuberosum
Plante
devirozate
Morel & Martin (1955) 20 agar Morel & Martin
(1955)

114
Tabelul 5.3.2.
Cteva realizri privind cultura de meristeme si apexuri la plantele floricole
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Anthurium
andraeanum
Dezvoltare
lstari
Kunisaki (1975) 5,8 20 0 15% CM Kunisaki (1980)
Begonia rex Dezvoltare
lstari +
nrdcinare
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 6 Cassells & Morrish
(1985)
Calus Lindemann et al (1970)
1
5,5 50 0 (0,1) ANA + (0,1) Kin
+ 15% CM
Lindemann et al
(1970)
Protocorm Knudson (1946) C 5,2 20 Agar (1) AIA sau (1) ANA Morel (1965 b)
Cattleya sp,
Protocorm Reinert & Mohr (1967)
2
5 6 (1,75) ANA + (1,75 )
IBA + (1) Kin
Reinert & Mohr
(1967)
Chrysanthemum
sp,
Lstari adventivi
i axilari
Linsmaier & Skoog
(1965)
30 5 (0,02) ANA + (2) Kin Bush et al (1975)
Cultura de
meristeme
Hollings (1965) 40 0 (1) ANA Hollings (1965)
Calus friabil Nitsch & Nitsch (1965)
S
5,5 20 6 (2) ANA + (2-5) Kin Sangwan & Harada
(1977)
Lstar
nrdcinat
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 10 (1) ANA + (0,001) Kin Smith & Murashige
(1970)
Coleus blumei
Planta ntreag Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 10 (1) AIA + (0,003) Kin Smith & Murashige
(1970)
Colocasia
esculenta
Proliferare
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 0 (0,15 1,5) AIA + (1)
Kin
Jackson et al (1977)
Cordyline
terminalis
Proliferare
lstari
Evaldsson & Welander
(1985)
5,8 30 6 (0,1) ANA + (2) BAP Evaldsson &
Welander (1985)

115
Tabelul 5.3.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Propagare Morell (1965 a) 5,2 20 Agar Morell (1965 a)
Protocorm Knudsom (1946) C 5,2 20 Agar Morell (1965 b)
Calus Reinert & Mohr (1967) 1 0 (1,75) ANA + (1,75)
IBA
Reinert & Mohr
(1967)
Protocorm Reinert & Mohr (1967) 2 6 (1,75) ANA + (1,75)
IBA +(1) Kin
Reinert & Mohr
(1967)
Cymbidium sp,
Organogenez Vacin & Went (1949) 6 20 8-9 10 % CM Sagawa & Kunisaki
(1982)
Protocorm Morell (1965a) 5,2 20 Agar Morell (1965 a) Dendrobium sp
Difereniere Vacin & Went (1949) 6 20 8-9 10 % CM Sagawa & Kunisaki
(1982)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
30 Agar (1) ANA Hackett &
Anderson (1967)
Dianthus
caryophyllus
Muguri axilari Hempel (1979) 5,8 20 0 (1,35) BAP Hemplel (1979)
Freesia
superfreesia
Rizogenez Petru et al (1976)
meristem
30 Agar (2,5) Kin Petru et al (1976)
Gladiolus sp, Plantul Murashige &
Skoog(1962)
5,9 30 7 (0,1)ANA + (2-5)Kin
+15% CM
Sutton (1978)
Iris spp, Cultur
meristeme
Hollings (1965) 40 glucoz 0 (1)ANA Hollings (1965)
Lilium sp, Cultur
meristeme
Hollings (1965) 40 glucoz 0 (1)ANA Hollings (1965)
Mammillaria
carmenae
Lstrire Vyskot & Bezdek
(1984)1 sau 2
5,5 30 agar (1)ANA + (2)BAP Vyskot &Jara
(1984)
Mammillaria
prolifera
Lstrire Vyskot & Bezdek
(1984)1 sau 2
5,5 30 agar (0,5-1)ANA +
(0,5-1)BAP
Vyskot &Jara
(1984)
Oncidium
lanceanum
Iniiere Lim-Ho (1982) VW 0 0 15% CM Lim-Ho (1982)
Oncidium spp, Difereniere Vacin & Went (1949) 20 8-9 Thompson (1975)
Pelargonium sp, Lstar unic Murashige&Skoog(1962) 20 0 (2)AIA + (2)Kin Dodds&Roberts(1982)
116
Tabelul 5.3.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Pelargonium spp, Cultur
meristeme
Beauchesne et al (1977)
I sau II
30 glucoz 6-7 (0,25)AIA + (0,1)2iP +
(1)GA3 +/- (2)Ad
Beauchesne et al
(1977)
Petunia hybrida Lstari adventivi
via calus
Sharma & Mitra (1976)
C
20 7 (0,5)BAP Sharma & Mitra
(1976)
Tulipa gesneriana Bulbili Riviere & Muller
(1979)
5,5 50 glucoz 6 (0,1)ANA + (0,1)BAP Riviere & Muller
(1979)

Tabelul 5.3.3.
Cteva realizri privind cultura de meristeme si apexuri la plantele pomicole
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari axilari Murashige & Skoog
(1962)
30 0
(agar)
(1,8)ANA+ (2)IBA
+(2)Kin
Matheus & Rangan
(1979)
Ananas comosus
Lstar unic Murashige & Skoog
(1962)
30 0 25% CM Zepeda & Sagawa
(1981)
Lstar unic Rodriguez (1982b)
K(h)
5,5 30 6 (1)IBA Rodriguez (1982c)
Lstari Rodriguez (1982b) K(h) 5,5 30 6 (0,01)IBA+(1)BAP Rodriguez (1982c)
Castanea sativa
Proliferare
lstari
Vieitez &
Vieitez(1980b)
5,5 30 7 (0,1)BAP Vieitez &
Vieitez(1980b)
Citrus sp, Lstari axilari si
adventivi
Bouzid (1975) A 5,8 30 8 (1)ANA + (1)Kin Bouzid (1975)
Cocos nucifera Rizogeneza DSouza (1982) BM 68,4 agar (1-2)ANA+12%CM DSouza (1982)
Mullin et al, (1974)B 5,7-5,8 30 glucoz 0 (2,5)AIA + (0,1)Kin Mullin et al, (1974)
White (1954)-saruri 20 7 10%CM Miller&Belkengren
(1963)
Fragaria Lstari
devirozati
Adams (1972) 5,2 30 0 (1)IBA+(0,1)BAP Adams (1972)
117
Tabelul 5.3.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Proliferare
lstari
Boxus (1974a) 5,6 22 glucoz 7 (1)BAP Boxus et al, (1974) Fragaria
Lstari Mullin et al (191974)A 4,5 30 glucoz 0 (1)AIA Mullin & Schlegel
(1976)
Proliferare
lstari
Murashige & Skoog
(1962)
5,3 20 7 (1,1)BAP Lane (1979) Malus x domestica
Proliferare
lstari
Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(1)BAP+
(0,1)GA3
Snir & Erez (1980)
Musa cavendishii calus Murashige & Skoog
(1962)
30 agar (0,3)AIA+(1)Kin sau
[(2)BAP+20%CM]
Ma et al (1978)
Musa textilis Lstari axilari si
adventivi
Mante & Tepper (1983)
I
5,7 30 5-8 (10)BAP+(80-160)AdS Mante & Tepper
(1983)
Prunus cerasifera Proliferare
lstari axilari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 7 (0,5)BAP Norton &
Norton(1986a)
Rubus idaeus Cretere lstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 0 Donnelly et al,
(1980)
Rubus sp, Lstari axilari Skirvin & Chu
1978a,b)0
5,8 30 10 (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin et al
(1981a)
Proliferare
lstari
Goldy & Lyrene (1984) 5,7 30 4 (10)2iP+(80)AdS Goldy & Lyrene
(1984)
Vaccinium sp,
Lstari axilari Smagula & Lyrene
(1984) WPM
5,7 30 0 (5)2iP Smagula & Lyrene
(1984)

118
Tabelul 5.3.4.
Cteva realizri privind cultura de meristeme i apexuri la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
nrdcinare
(sub lumin
puternic)
Hackett (1970) 5,8 20 (5-10)ANA sau
(10)AIA+(5,5) catechol
Hackett (1970)
nrdcinare
(sub lumin
slab)
Hackett (1970) 5,8 20 (10)AIA+(5,5) catechol Hackett (1970)
Hedera helix
Lstari Polito & Alliata
(1981)
5,6 20 8 (0,5)ANA + (2)BAP Polito & Alliata
(1981)
Lavandula
augustifolia & sp,
Calus Kartha et al, (1974a) 5,5 20 7 (1)ANA + (4)BAP +
10%CM
Quazi (1980)
Pinus sylvestris nmugurire Bornman & Janson
(1980)
5,6-5,8 50,5 6-7 (1,1-2,2) BAP + (1-2)
2iP
Bornman & Janson
(1980)
Syringa vulgaris Dezvoltare
lstari
Wetmore (1954) 2 20 10 15% CM Wetmore (1954)
Weigela florida 4 lstari/expl, Murashige & Skoog
(1962)
30 agar (2,25) BAP Calvert & Stephens
(1986)

119
Tabelul 5.3.5.
Cteva realizri privind cultura de meristeme si apexuri la via de vie
Denumirea
speciei
Explant Rezultat Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de
cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis rupestris Apex lstar Dezvoltare
lstar unic
Gazly (1964) 6,5 15 8 Gazly (1972)
Vitis rupestris Apex lstar Lstar
nrdcinat
Gazly (1964) 6,5 15 8 (0,02)ANA Gazly (1972)
Vitis vinifera Apexuri lstari Alungire lstari Webb & Street
(1977)CI
30 agar (1,48)BAP Aldwinckle &
Buturac (1981)
Vitis vinifera Apexuri lstari nrdcinare
lstari
Webb & Street
(1977)CI
30 agar (0,023)BAP Aldwinckle &
Buturac (1981)
Vitis vinifera Apexuri lstari Lstari Murashige &
Skoog (1962)
5,8 30 0 (2,2)BAP Barlass et al (1982)
Vitis vinifera Apexuri lstari Lstari
nrdcinai
White (1943a)A 5,8 30 0 (2,2)BAP Barlass et al (1982)
Vitis vinifera Meristeme Proliferare
lstari axilari
Jona & Webb
(1979)BG
5,7-5,8 20 3-5,5 (2,25)BAP Jona & Webb
(1979)
Vitis vinifera Apexuri lstari nrdcinare Jona & Webb
(1979)C
5,7-5,8 20 3-5,5 (0,23)BAP Jona & Webb
(1979)
Vitis vinifera Meristeme Lstar unic,
nrdcinat
Jona & Webb
(1979)C
5,7-5,8 20 3-5,5 (0,023-0,23)BAP Jona & Webb
(1979)
Vitis vinifera Apexuri lstari nrdcinare Stevenson &
Monette (1983)R
5 30 0 (0,1)AIA Stevenson &
Monette (1983)

120
5.4. Cultura de fragmente uninodale
Metoda const n secionarea lstarilor crescui in vitro n poriuni uninodale urmat
de cultivarea acestora pe un nou mediu de cultur.
Din mugurii axilari vor lua natere noi lstari care dup o anumit perioad de timp
vor fi secionai din nou.
Primele experiene privind cultura de fragmente uninodale, obinerea de lstari i
nrdcinarea acestora au fost efectuate de Galston 1947, 1948 i Gorter 1965, la asparagus.
Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniiale meristeme, vrfuri de
lstari (apexuri), muguri aflai la subsuoara bracteelor la unele tipuri de inflorescene, precum
i alte organe capabile s genereze lstari in vitro.
Lstari se pot obine prin folosirea unor primordii de muguri florali care se transform
apoi n structuri vegetative (conopid - Crisp i Walkey, 1974).
De regul n mediul de cultur nu se adaug citochinine care s anuleze efectul
dominanei apicale. Se urmrete, n fapt alungirea lstarilor pentru a obine un numr ct mai
mare de noduri.
Iniierea culturii este foarte important. n vederea stabilizrii trebuie realizat
juvenilizarea materialului iniial.
La speciile lemnoase un alt aspect important l reprezint necesitatea ruperii
dormansului mugurilor dup inoculare. Acest lucru este posibil prin tratamente cu temperaturi
sczute (0-5C), mrirea duratei zilei (16 h) asociat cu temperaturi sczute, urmate apoi de
creterea temperaturii.
Uneori se recomand creterea concentraiei de citochinine i gibereline.
La speciile erbacee dormansul se poate ntrerupe prin etiolarea materialului.
Rata multiplicrii este direct proporional cu viteza de cretere a lstarilor, respectiv
cu numrul de frunze care se formeaz.
De regul lstarii formai din apexuri cresc i se alungesc mai rapid dect cei formai
din muguri axilari. De aceea ei sunt trecui n vase de cultur separate.
Folosirea mediului de cultur n dublu strat, solid + lichid, a avut ca efect creterea
vitezei de cretere a lstarilor de gutui BA-29 (Stnic F. i colab., 1996).
De asemenea, folosirea apei structurate i a unor glico-steroizi naturali (Ecostim) a
determinat creterea lstarilor de mr (Svulescu Anca i Stnic F., 1996).
Folosirea apei la prepararea mediului pentru faza de multiplicare la mr (foto 5.19.) i la
smochin a avut ca efect o stimulare a creterii explantelor i sporirea proporional a ratei de
multiplicare (Stnic F. i colab. 2002, Gl R. i colab. 2003).
121



Foto 5.19. Efectul apei asupra multiplicrii in vitro la trei soiuri de mr

La liliac (Syringa vulgaris) stimularea creterii lstarilor este posibil prin folosirea
zeatinei sau a 2ip (Pierik i colab. 1986).
La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981) la realizarea regenerrii pot fi folosii
numai lstari ortotropi. La cafea, n schimb (Pierik, 1987) are loc o transformare a lstarilor
plagiotropi n ortotropi.
Metoda de fa se folosete cu succes la foarte multe specii (cartof, manioc, pomi
fructiferi (foto 5.20.a), vi de vie (foto 5.20.b), trandafir, ieder, clematit (foto 5.21), salcie
pletoas etc.) (tabelele 5.4.1., 5.4.2., 5.4.3., 5.4.4., 5.4.5.) .
La tomate, castravei i vinete (Pierik, 1987) a regenerat lstari din semine, ca apoi
s-i foloseasc pentru cultura de fragmente uninodale.
Dup mai multe cicluri de multiplicare este necesar inducerea nrdcinrii lstarilor
obinui (foto 5.22.). Acest lucru este realizabil prin folosirea unor tratamente cu auxine
combinate sau nu cu tratamente cu ntuneric.
n faza de alungire a rdcinilor, concentraia de auxine trebuie redus.

122

a b
Foto 5.20. Cultura de fragmente uninodale la mslin (a)
i la portaltoiul de vi de vie Richter 110 (b) Vitroplant


Foto 5.21. Multiplicarea la Clematis sp.
prin stimularea alungirii lstarilor
Foto 5.22. Formarea rdcinilor la ncheierea
ciclului de multiplicare la Sequoia sempervirens
123
Tabelul 5.4.1.
Cercetri privind cultura de fragmente uninodale la plantele legumicole
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari n 4
sptmni
Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 7 (0,09) ANA +
(0,11)Kin
Chin (1982) Asparagus
officinalis
Lstari axilari Pelletier et al, (1972)
Tosaruri
- 20 5 Dor (1974)
Brassica oleracea
botrytis
Lstari via calus De Fossard et al (1974
a) HMHH
5,5 41,1 8 6 auxine + 2 citochinine Trimboli et al
(1977)
Capsicum annuum Muguri
adventivi
Phillips & Hubstenb
(1984, 1985)
5,8 30
glucoz
8 (0,05) AIA + (50 ) BAP Phillips&Hubstenb
(1984, 1985)
Plntue
nrdcinate
Murashige i Skoog
(1962)
5,8
GA, BA, ANA Grazia i co (1985)
Cichorium intybus
Calus, muguri,
flori
Linsmaier i
Skoog(1965)
5,8
- Harada (1966)
Cucumis sativus Lstar unic Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 agar (0,023)BAP Aziz&McCown(19
85)
Lstar unic Hussey & Stacey
(1981)
5,9 30 7 Hussey & Stacey
(1981)
Lstar unic cu
rdcini
Hussey & Stacey
(1981)
5,9 30 lichid Hussey & Stacey
(1981)
Lstari Murashige & Skoog
(19620
5,8 30 12 Levy (1985)
Lstari via calus Murashige & Skoog
(1962)
5,7 20 7 (1) BAP + (1) GA3 Marani & Pisi
(1977)
Solanum
tuberosum
Lstari n 3-5
sptmni
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 6 (0,5) BAP Thomas (1981)

124
Tabelul 5.4.2.
Cercetri privind cultura de fragmente uninodale la plantele floricole
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Anthurium
andraeanum
Lstari multipli Kunisaki (1975) 5,8 20 8 (0,2 1) BAP Kunisaki (1980)
Camellia japonica Iniiere
caulogenez
Carlisi & Torres (1985;
1986)
5 30 8 (0,5-1) BAP Carlisi & Torres
(1985; 1986)
Dendrobium sp, Muguri axilari Ball & Arditti (1976) S 20 13 (2) BAP Ball & Arditti
(1976)
Dianthus
caryophyllus
Lstari axilari si
adventivi
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (0,1) AIA + (1) BAP Roest &
Bokelmann (1981)
Dracaena
deremensis
Lstari Debergh (1975) 5,8 20 6 Debergh (1975);
1976)
Protocormi Koch (1974) A 20 5 (0,5-3)ANA + (2)BAP Koch (1974) Phalenopsis sp,
55% Lstari Reisinger et al (1976) 5-5,5 20 13 (2)BAP Reisinger et al
(1976)

125
Tabelul 5.4.3.
Cteva realizri privind cultura de fragmente uninodale la plantele pomicole
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Actinidia delicosa Lstari
nrdcinai
Harada (1975) 5,5 20 7 (0,1)ANA+ (40) Ad Harada (1975)
Armeniaca
vulgaris
70% lstari Lloyd&McCOWN
(1981)
WPM
5,2 20 6 (2)2iP Snir (1984)
Castanea
mollissima
Proliferare
lstari axilari
Yang et al,(1986) 5,5 20 6,5 (0,1)BAP Yang et al,(1986)
Proliferare
lstari axilari
San Jose et al, (1984) L
sau Ha
30 6 (0,1)BAP San Jose et al,
(1984)
Castanea sativa
Proliferare lstari Heinz & Mee (1969) 5,5 30 6 (1)BAP Vieitez&Vieitez(1980
b)
Citrus sp, Proliferare lstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 30 10 (1)BAP+(100)AdS Navarro et al (1975)
Corylus avellana Embriogenez
direct
0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 (0,1-1)IBA Prez et al (1986)
Juglans hindisii x
J. regia
Multiplicare
lstari
Driver & Kuniykuhi
(1984)DKW
5,5 30 2
gelrite
(0,001)IBA+(1)BAP Driver &
Kuniykuhi (1984)
Juglans regia Lstari Chalupa (1981a)A 30 6 (0,15)ANA+(0,1)BAP
+(20)AdS
Chalupa (1981a)
Olea europaea Proliferare
lstari
Rugini&Fontanazza
(1981)Shoot
5,8 30 6 (0,5)IBA+(0,5)GA3+
(10)Zr
Rugini&Fontanazza
(1981)
Pyrus communis Lstar unic Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (0,45)BAP Shen&Mullins(1984)
Rubus idaeus Lstar unic Snir (1981)B 5 20 agar (0,22)2,4-D
+(1)BAP+(0,1)GA3
Snir (1981)
Theobroma cacao Proliferare
lstari axilari
Passey & Jones (1983) 5,2 30 7 (0,2)BAP Passey & Jones
(1983)
126
Tabelul 5.4.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari axilari Cohen & Elliot(1979) 5,7 30 6 (5)2iP Cohen&Elliot(1979) Vaccinium
corymbosum 1-2 lstari/expl, Lloyd & McCown
(1981) WPM
5,2 30 6 (5)2iP Wolfe et al
(1983;1986)
Vaccinium sp Lstari axilari Smagula & Lyrene
(1984)WPM
5,7 30 4 (5)2iP Smagula & Lyrene
(1984)

Tabelul 5.4.4.
Cercetri privind cultura de fragmente uninodale la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Acer negundo Calus Murashige&Skoog(1962) 20 6 (3)ANA + 15%CM Radojevic et al(1980)
Betula verrucosa Calus Chalupa (1981b) 1 30 6 (0,05)IBA+ (0,6)BAP +
(20)AdS
Chalupa (1981b)
Paulownia
tomentosa
Muguri axilari Ben-Jaacov & Dax
(1981)
5,6 30 agar (0,1)ANA + (1)BAP Burger et al (1985)
Ouercus robur Lstari Chalupa (1984 a,b)
BTM sau WPM
20 6 (0,2-1) BAP Chalupa (1984a)
Lstari Morel & Martin (1955) 15 glucoz 8 Daguin&Letouze(198
6)
Salix babylonica
Lstari Daguin&Letouze(1986)B 15 glucoz 8 Daguin&Letouze(198
6)
Salix madsudana Lstari adventivi
i axilari
Whitehed & Giles
(1976)
5,8 20 agar (0,01) ANA + (0,05)
BAP + (20) AdSs
Bhojwani (1980)
Tilia cordata Lstari axilari Chalupa (1984
a,b)WPM
20 6 (0,2-1) BAP + [(0-0,1)
ANA sau IBA]
Chalupa (1984 a,b)
Vinca minor Proliferare lstari Stapfer & Heuser (1985) 5,6-5,8 30 7 (0,018-0,18) ANA +
(14,4) BAP
Stapfer & Heuser
(1985)

127
Tabelul 5.4.5.
Cercetri privind cultura de fragmente uninodale la via de vie
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Vitis berlandieri x
V. cardinalis
Proliferare
lstari axilari
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (2,25)BAP Novak&Jujova
(1983)
Vitis berlandieri x
V. cardinalis
Plantule
nrdcinate
0,5 x Murashige &
Skoog (1962)
5,8 20 7 (0,02)IBA sau ANA Novak&Jujova
(1983)
Vitis hybrid Baco Proliferare
lstari
Miller & Murashige
(1976)II
5 30 0 (2-4)BAP+(80)AdS Harris & Mason
(1983)
Vitis rupestris Lstar unic Gazly (1964) 6,5 15 8 Gazly (1964)
Vitis spp. Lstari multipli Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0,09)ANA + (1,1)BAP Chee&Pool
(1982a,b)
Vitis spp. Lstari
nrdcinai
Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0,02)ANA Chee&Pool
(1982a,b)
Vitis vinifera Proliferare
lstari axilari
Webb & Street
(1977)CI
30 agar (2,25)BAP Aldwinckle &
Buturac (1981)
Vitis vinifera Calus Jona & Webb (1979)C 5,7-
5,8
20 3-5,5 (1)ANA+(0,2)Kin Jona & Webb
(1979
Vitis vinifera Proliferare
lstari axilari
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (2,25)BAP Novak&Jujova
(1983)
Vitis vinifera Proliferare
lstari
Murashige (1974) 5 30 0 (0,03) IBA+(2)BAP+
(80)AdS
Stevenson &
Monette (1983)&


128
5.5. Cultura de lstari axilari
Aceast metod presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale,
stimularea creterii lstarilor axilari prin creterea concentraiei de citochinine, fr
stimularea alungirii lstarului mam.
Creterea concentraiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanei apicale a
mugurelui. Acest lucru este posibil i prin eliminarea apexului lstarului iniial.
Principiile acestei metode sunt cunoscute nc din 1925. Ea a fost aplicat pentru
prima dat de ctre Hackett i Anderson (1967) la garoafe, de ctre Adams (1972) i Boxus
(1973; 1974) la cpun i de Pierik (1973; 1974; 1975a) i Murashige (1974) la gerbera.
Dup descoperirea kinetinei, eliminarea dominanei apicale a fost posibil prin folosirea
acesteia i apoi a altor citochinine.
Frecvent aceast metod de micronmulire este folosit n tandem cu cultura de
fragmente uninodale. Astfel, n prima etap dintr-un explant uninodal se obine un lstar,
apoi acest lstar este trecut pe un mediu cu un coninut ridicat n citochinine i este
stimulat formarea lstarilor axilari.
Cultura de lstari axilari are o serie de avantaje:
- este simpl;
- rata de multiplicare este relativ ridicat;
- stabilitatea genetic este asigurat;
- este unica metod de multiplicare eficient la plantele care cresc n rozet: cpun,
gerbera, bromelia etc.).
Necesarul de citochinine este variabil cu specia. Astfel, plantele de Bromelia
obinute din semine au generat lstari axilari fr citochinine. La multe specii s-a observat
scderea necesarului de citochinine odat cu creterea numrului de subculturi datorit
acumulrii acestora dar, mai ales datorit juvenilizrii lstarilor.
Concentraia citochininelor trebuie corelat i cu stadiul de dezvoltare al
materialului biologic. Astfel, materialul juvenil necesit o cantitate mai redus de
citochinine dect cel provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982).
Frecvent se recomand s se foloseasc medii cu concentraii sczute de auxine i
concentraii ridicate de citochinine. Raportul citochinine: auxine cel mai recomandat este
de 10:1.
129
Felul citochininelor folosite este i el important. Cele mai multe specii reacioneaz
bine la folosirea BAP i mai puin bine la kinetin sau 2-iP. Pentru Rhododendron ns, se
recomand folosirea 2-iP.
Tidiazuronul i compuii de substituie ai piridilfenilureei stimuleaz uneori mai
mult lstrirea axilar dect citochininele (Read i colab. 1986).
n multe situaii se recomand distrugerea mugurelui apical i asocierea acestei
msuri cu aplicarea citochininelor. Pentru creterea eficienei metodei, citochininele
trebuie aplicate dup ce lstarul s-a alungit.
Creterea concentraiei de citochinine aduce uneori dup sine formarea calusului.
Acest lucru trebuie evitat pentru reducerea riscului apariiei unor mutaii.
Uneori formarea lstarilor axilari este stimulat de folosirea mediului de cultur
lichid (Bromeliaceae).
De regul, capacitatea de proliferare scade odat cu creterea numrului de
subculturi, acest fenomen fiind frecvent nsoit i de formarea calusului.
La cpun, de exemplu, depirea unui numr de 12 subculturi a avut ca efect
apariia unor modificri fiziologice majore.
Metoda lstririi axilare poate fi folosit att pentru plantele care cresc n rozete
(foto 5.23. a i b i 5.24. a i b), ct i pentru plantele care formeaz lstari obinuii.


Foto 5.23. Rozet de Drossera sp. nainte de multiplicare (a) i dup (b)
130

a b
Foto 5.24. Cultur de lstari axilari al Cichorium intybus (a) i Drosera sp. (b)

Uneori stimularea lstririi axilare prin mrirea concentraiei de citochinine are ca
efect apariia fenomenului de "tuf". Astfel i dup trecerea explantelor pe medii lipsite de
citochinine, pentru alungire sau nrdcinare acestea continu s formeze lstari axilari
numeroi (foto 5.25.).

Foto 5.25. Lstrire axilar puternic la explantele de Sequoia sempervirens

n cmp fenomenul se manifest prin formarea unui numr mare de flori/fructe de
dimensiuni reduse (cpun).
131
Alte efecte negative ale concentraiei ridicate de citochinine ar fi apariia unor
frunze de form anormal, apariia calusului (foto 5.26.) sau formarea lstarilor adventivi
susceptibili la mutaii.

Foto 5.26. Formarea calusului n exces la concentraii ridicate de citochinine
la dafin (Laurus nobilis) n faza de multiplicare

n prezent metoda este mult folosit la micronmulirea materialului sditor pomicol
n multe ri fiind generalizat: Italia, Frana, Anglia, etc.


Foto 5.27. Cultur de lstari axilari la smochin (Ficus carica)

n tabelele 5.5.1., 5.5.2., 5.5.3, sunt prezentate cteva cercetri privind cultura de
lstari axilari la plantele horticole.
132
Tabelul 5.5.1.
Cercetri privind cultura de lstari axilari la plantele legumicole
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari
nrdcinai
Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5)IBA+(0,12)BAP Hussey&Falavigna
(1980)
Proliferare lstari
adv, i axil,
Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5-4)BAP Hussey (1978a)&
Allium cepa
Proliferare si
cretere lstari
Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,12)ANA+ (2)BAP Hussey (1978a)&
Cretere lstari i
nrdcinare
Gorter (1965) - 40 20 Gorter (1965) Asparagus
officinalis
Cretere lstari i
nrdcinare
Reuther (1984) 5,8 30 agar (0,5) AIA Reuther (1984)
Brassica oleracea
botrytis
Lstari axilari si
adventivi
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 lichid (8) AIA + (2,6) Kin Walkey & Woolfitt
(1970)
Regenerare lstari Qoirin&Lepoivre (1977) 5,8 20 5 (0,1)GA3 + (0,05) BAP Pieron et al (1992) Cichorium intybus
Regenerare lstari Murashige&Skoog(1962) (0,1) AIA + (2) BAP Park & Lim (1999)
Cucumis melo Lstari axilari i
adventivi
Moreno et
al,(1984)MEL
5,8 40 8 (2,5)ANA+(1)BAP Moreno et al,
(1984)
Proliferare lstari Linsmaier&Skoog(1965) 30 agar (4)AIA+(4)kin Herman&Haas(1978)
Proliferare lstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 7 (5) BAP Schnap&Preece-1986
Cretere lstari Shahin (1985) TM 1 5,8 30 6 Shahin (1985)
Lycopersicon
esculentum
Plantule
nrdcinate
Shahin (1985) TM 5 5,8 30 6 (0,1) IBA Shahin (1985)
Phaseolus vulgaris Lstari
nrdcinai
Kartha et al (1974a) 5,7 30 6 (0,19) ANA Kartha (1982 b)
Lstari
nrdcinai
Kartha et al (1974 a) 5,6 30 8 (0,93) ANA Griga et al (1986) Pisum sativum
Lstari
nrdcinai
0,5 x Gamborg et al
(1968) B 5
5,7 10 6 (0,19) ANA Kartha et al (1974
b; 1979)
133
Tabelul 5.5.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Plantule
nrdcinate
Murashige&Skoog
(1962)
30 agar Gleddie et al (1982)
Lstari
nrdcinai
Pelletier et al (1972)
Tosaruri
5,8 20 7,5 Isouard et al (1979)
Solanum
melongena
Dezvoltare
lstari
White (1954) 20 agar (2) GA3 Yamada et al
(1967)
Lstari
nrdcinai
0,5 x Murashige &
Skoog (1962)
5,8 15 7 (0,1) AIA + (0,01) Kin Austin & Cassells
(1983)
Multiplicare
lstari
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 lichid (0,1) GA3 + (0,5) Kin Goodwin et al
(1980a)
Solanum
tuberosum
20% lstari n 1
luna
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 10 4 (0,5)Z Thomas (1981)

Tabelul 5.5.2.
Cteva realizri privind cultura de lstari axilari la plantele pomicole
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Actinidia delicosa Lstari
nrdcinai
Harada (1975) 5,5 20 7 (0,1)ANA+ (40) Ad Harada (1975)
Plantule Lakshmi Sita et al
(1974)
5,8-6 20 9 (1)ANA Lakshmi Sita et al
(1974)
Plantule Murashige&Skoog
(1962)
30 agar Mapes (1973)
Ananas comosus
Lstari multipli Murashige & Skoog
(1962)
30 0
(agar)
(1,8)ANA+ (2)IBA
+(2)Kin
Matheus & Rangan
(1979)
Ananas comosus Cretere lstari 0,5 xMurashige&Skoog
(1962)
30 0 25% CM Zepeda & Sagawa
(1981)
134
Tabelul 5.5.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Castanea sativa Proliferare
lstari
Vieitez &
Vieitez(1980a) 2
5,5 30 6 (1-2)BAP Vieitez &
Vieitez(1980a)
Lstar unic Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (0,18)ANA+(0,1)BAP
+(0,03) GA3
Muriithi et al,
(1982)
Ficus carica
Proliferare
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,2 30 7 (0,5)BAP+(0,1)IBA+(0
,1)GA3+(89)PG
Pontikis & Melas
(1986)
Cretere lstari
si rdcini
Jones & Vine (1968)B 5,6-5,8 40 glucoza 0 Jones & Vine
(1968)
Glossularia
redinata
Dezvoltare
lstari
Jones & Vine (1968)B 5,6-5,8 40 glucoza 0 (1)IBA+(0,2)BAP
+(1)GA3
Jones & Vine
(1968)
Malus x domestica 8 lstari/
explant
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,2 29,9 7 (0,1)IBA+(0,99)BAP
+(0,48)GA3
Van Nieuwkirk et
al (1986)
Musa spp. Lstari unic Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (5)BAP Cronauer &
Krikorian (1984)
Rubus idaeus Proliferare
lstari
Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,1)IBA+(4)BAP Anderson (1979)

135
Tabelul 5.5.3.
Cercetri privind cultura de lstari axilari la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Clematis sp. Lstari multipli Linsmaier & Skoog
(1965)
30 6 (10)BAP Kratz &
Langhans(1978)
Cotoneaster
dammeri
Lstari multipli Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe
(1982)
Crataegus
rachyacantha
Lstari multipli Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe
(1982)
Fraxinus
americana
Lstari multipli Lloyd & McCown
(1981) WPM
5,2 20 lichid (5-10)BAP Heiman & Preece
(1983)
6 lstari/ explant Gamborg et al,
(1968)B5
5,5 20 2
gelrite
(1,8)BAP Bailey et al, (1986) Hydrangea
macrophylla
Proliferare
lstari
Miller & Murashige
(1976) II
5,7-5,8 20 7 (1)BAP Stoltz (1984)
Lavandula
augustifolia & sp.
Plantule Kartha et al, (1974a) 5,5 20 7 (2) 2,4-D+ (4)BAP +
10%CM
Quazi (1980)
Picea glauca Proliferare
lstari
Rumary & Thorpe
(1984)
5,9 30 8 Rumary & Thorpe
(1984)




136
Capitolul 6
Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro

6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme
Un alt scop al nmulirii prin meristeme este acela de a obine plante sntoase,
libere de virusuri, micoplasme i chiar ali ageni patogeni. nmulirea vegetativ aduce
dup sine i transmiterea agenilor patogeni menionai n descendena clonal.
nmulirea generativ, prin semine nltur n parte transmiterea virusurilor. Ea nu
poate fi folosit ns la toate speciile deoarece:
- nu toate speciile formeaz semine, sau numrul seminelor este insuficient;
- descendena obinut prin semine la plantele alogame este neuniform;
- nflorirea sau fructificarea descendenilor obinui din smn sunt ntrziate
datorit perioadei juvenile lungi;
- o serie de viroze se transmit prin polen sau prin smn (prin polen la pomii
fructiferi i prin smn la leguminoase: mazre, fasole, soia etc.).
Avnd n vedere c o serie de genotipuri se nmulesc numai vegetativ apare riscul
degenerrii acestora sub influena atacului de virusuri.
n perioada anilor (1949-1950) Limasset i Cornuet (citai de Martin, 1977) au
constatat c intensitatea virozrii organelor vegetative crete proporional cu distana
zonei analizate fa de apex. Astfel, cei doi au aezat esut meristemal apical (calota +
cteva primordii foliare) pe rana existent pe o frunz de tutun. Dup un timp s-a
constatat virozarea frunzelor de tutun n proporie de 60%. Atunci cnd s-au folosit ca
inoculi zone mai deprtate de meristem, infectarea s-a produs n proporie de 100%.
Plecnd de la aceste observaii, Morel (1952) reuete s obin plante sntoase,
devirozate, prin cultivarea unor apexuri meristematice de dimensiuni reduse (75-100 m
lime i 150-200 m nlime) cu 1-2 primordii foliare, provenite de la plante bolnave.
Morel i Martin au obinut primele rezultate prin devirozarea daliilor i n
continuare au extins metoda la cartof i orhidee.
Quak (1957) a aplicat devirozarea prin culturi de meristeme la garoafe.
Din acest moment s-au pus bazele tehnologiilor industriale de devirozare a
materialului biologic vegetal. Plantele devirozate obinute sunt n continuare nmulite in
vitro pentru a obine o descenden suficient de numeroas.


137
Ulterior ele se pstreaz n izolatoare speciale (depozitare) i constituie capetele de
clon furniznd materialul iniial pentru nmulirea n condiii de cmp.
Folosirea culturilor de meristeme pentru devirozarea materialului biologic a fcut
posibil eradicarea i a altor boli produse de ciuperci sau bacterii.
Astfel, la garoafe s-a nlturat infecia de Fusarium roseum i F. oxysporum f.
dianthi, n timp ce la Dieffenbachia s-au eliminat bacteriozele sistemice (Pseudomonas
caryophylli i Pectobacterium parthemi).
n ceea ce privete motivaia faptului c celulele meristematice sunt libere de
virusuri exist o serie de ipoteze:
- s-ar prea c datorit diviziunii intense a celulelor n meristem, exist o competiie
ntre acestea i particula viral, pentru folosirea acizilor nucleici sintetizai. Acizii nucleici
se pare c sunt pui la dispoziia diviziunii celulare n detrimentul multiplicrii virale
(Quak, 1966);
- o alt ipotez se refer la faptul c absena plasmodesmei i a structurilor
vasculare n meristem mpiedic rspndirea virusului;
- alte explicaii precizeaz c datorit concentraiilor ridicate de auxine i
citochinine din apexurile meristematice penetrarea particulelor virale este oprit sau chiar,
are loc inactivarea acestora (Quak, 1977);
- ali autori afirm c dezvoltarea virusurilor este mpiedicat n apexurile
meristematice datorit lipsei unor enzime specifice de care acestea au nevoie pentru
multiplicare sau, datorit prezenei unor substane inhibitoare;
- o explicaie plauzibil este i aceea c ritmul diviziunilor celulare n meristeme
este mult mai mare dect ritmul replicrii virusului. Acest lucru este evident n special
atunci cnd plantele bolnave sunt crescute n condiii foarte favorabile fapt ce duce la
alungirea rapid a lstarilor.
- o alt explicaie ar fi faptul c meristemul excizat sufer un traumatism puternic
(cu att mai mare cu ct el este de dimensiuni mai mici) prin secionare, fapt care duce la
eliminarea virusurilor. Acest lucru a fost remarcat de Hollings i Stone (1964) la garoafa i
de Walkey i colab. La cire (1969).
Din pcate nu toate virozele pot fi nlturate prin cultura de meristeme. La cartof
virusul X a putut fi nlturat doar n proporie de 1%.
n acest caz se recomand combinarea micronmulirii prin culturi de meristeme cu
termoterapia.


138
Aceast metod const din cultivarea plantelor supuse devirozrii timp de 5-10
sptmni la temperatura de 35-39C, fapt care determin o inactivare a virusului. Acest
efect se obine prin pstrarea organelor furnizoare de meristeme la temperaturi ridicate (ex.
tuberculii de cartof la 37-38C).
Urmeaz apoi excizarea meristemelor i inocularea lor pe mediu (foto 6.1.).


Foto 6.1. Excizarea apexului meristematic la via de vie dup ncheierea
tratamentului de termoterapie (Vitroplant, Cesena)

n acest sens se face sterilizarea vrfurilor de lstari n alcool 70% urmat de
imersia n hipoclorit de sodiu sau calciu. Se nltur apoi frunzele inclusiv cele tinere din
vrf i se repet sterilizarea cu alcool (70%) fr s se mai fac cltirea cu ap, deoarece
picturile de ap ngreuneaz detaarea meristemelor.
Meristemul izolat este apoi detaat i inoculat pe mediul de cultur. Dimensiunile
explantului trebuie s fie reduse (0,1 mm diametru i 0,2-0,4 mm nlime).
Creterea numrului de primordii foliare cu care se detaeaz meristemul determin
scderea ratei de devirozare. n sens contrar, n multe situaii detaarea meristemului fr
cele 2 primordii foliare duce la moartea acestuia.
Pentru cultivarea meristemelor se folosete apoi, tehnica descris n subcapitolul
5.3., avnd ca scop final, multiplicarea rapid a materialului devirozat.


139
nainte de nceperea multiplicrii propriu-zise este esenial s se fac testarea
gradului de devirozare a materialului biologic apelnd la tehnici serologice de tipul testului
ELISA.
n anumite situaii lstarii obinui nu nrdcineaz. n acest caz se recomand
altoirea in vitro a lstarului devirozat pe un portaltoi obinut din semine in vitro (Morel,
1964 - la dalia). Tehnica poart denumirea de microaltoire i va fi prezentat n continuare.

6.2. Microaltoirea
Obinerea plantelor libere de virusuri se poate realiza prin diferite metode
microaltoire.
Microaltoirea plantelor horticole poate fi definit ca un ansamblu de tehnici
moderne, prin care se realizeaz mbinarea ntre un explant de dimensiuni mici (crescut i
multiplicat in vitro) i un portaltoi adecvat, micropropagat sau obinut prin metode
tradiionale.
Gndit pentru prima dat de Morel i Martin (1952) ca metod pentru devirozarea
daliei, microaltoirea a fost folosit cu succes de ctre Murashige i colab. (1972) i apoi de
ctre Navarro i colab. (1975).
Datorit faptului c n urma termoterapiei meristemul izolat are o capacitate redus
de cretere, sau c, uneori lstarii regenerai din meristeme nu formeaz rdcini, se
recurge la altoirea acestora pe portaltoi stabilizai, provenii de la plante sntoase.
De la caz la caz, microaltoirea se realizeaz n condiii aseptice, concreterea
partenerilor urmnd a fi fcut n prima faz in vitro, sau n condiii septice, "la mas",
cnd prinderea are loc n ser.
Microaltoirea ofer cercettorului i pepinieristului un cmp larg de posibiliti
pentru rezolvarea unor probleme existeniale la culturile in vitro i pentru nlturarea unor
neajunsuri ale nmulirii clasice prin altoire.
Principalele ctiguri pe care le aduce microaltoirea sunt:
- se rezolv problema producerii unei mari cantiti de plante altoite ntr-un timp relativ
scurt;
- se folosete pentru devirozarea materialului genetic virozat n urmtoarele cazuri:
cnd acesta nu suport tratamentele de termoterapie; cnd exist pericolul apariiei unor
mutaii n urma termoterapiei; la specii care se nmulesc greu in vitro;


140
- se poate folosi pentru specii care, dei se multiplic foarte bine in vitro, nu
nrdcineaz;
- este un instrument util pentru studiul afinitii la altoire a noilor soiuri i portaltoi
obinui n lucrrile de ameliorare. Se pot studia mecanismele de declanare a lipsei de
afinitate;
- are avantajul c altoiul nu vine n contact cu mediul de cultur i astfel nu este supus
riscului mutaiilor sau influenei directe a hormonilor;
- exist posibilitatea juvenilizrii materialului mbtrnit prin microaltoire repetat pe
portaltoi juvenili;
- condiiile de cultur i de mediu sunt mai bine controlate.

6.2.1. Microaltoirea in vitro
Const n altoirea n condiii aseptice in vitro a unui apex meristematic pe un
portaltoi obinut din semine sau din minibutai.
Portaltoii folosii trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
- s aib semine cu bun germinabilitate i cretere pe mediile artificiale de
cultur;
- minibutaul s aib esuturi elastice i turgescente;
- minipuietul s aib cambiu activ uor depistabil;
- s aib esuturi rezistente la oxidare i care se nverzesc dup trecerea la
lumin;
- s aib un aparat radicular bine format, capabil s creasc i s triasc n
mediu lichid de cultur.
n cazul folosirii nmulirii vegetative a portaltoiului (minibutire), n plus, aceasta
trebuie s aib o rat de multiplicare ridicat, s nrdcineze uor i s nu aib probleme
de aclimatizare.
1. Obinerea portaltoiului se poate face din semine. n acest sens, pentru nceput, seminele
sunt scoase din starea de dormans prin una din metodele cunoscute: stratificare; tratamente
cu citochinine i gibereline (benzil-aminopurin 20 mg/1, respectiv acid giberelic GA
3
100
mg/1); tratamente cu frig (4C), etc.
Se nltur apoi endocarpul pstrnd tegumentele seminale.


141
n continuare, se face verificarea viabilitii seminelor prin scufundarea timp de 20
de ore a unor probe ntr-o soluie 1% de clorur de 2,3,5 trifeniltetrazoliu. Seminele cu
esuturi colorate rou-intens sunt viabile.
Materialul este supus apoi, la 1-2 sterilizri cu etanol 70%, 1 min., hipoclorit de
sodiu (0,7% clor activ) + Tween 20 0,3% timp de 20 minute, dup care se fac splri
repetate cu ap distilat steril. Dup caz, se face o a doua sterilizare.
Seminele sterilizate se pun la germinat pe mediu Murashige&Skoog + 10 g/1 agar,
n termostat la 20C, la ntuneric. Dup 10-20 de zile seminele germineaz i puieii se
alungesc.
Portaltoii se pot obine i din minibutai. Minibutaii (fragmente uninodale) se
preleveaz de la plante libere de virui. Se sterilizeaz apoi cu hipoclorit de calciu (0,7%
clor activ) + Tween 20 (0,3%) i se trec pe mediu adecvat.
Pentru obinerea portaltoilor se pot folosi i meristeme apicale sau laterale. Dup
mai multe multiplicri, lstarii se trec pe un mediu de nrdcinare, de exemplu, la
smburoase cu 1 mg/1 IBA.
2. Pregtirea altoiului. Altoiul const dintr-un apex meristematic provenit fie de la lstari
crescui in vitro, fie de la lstari sau ramuri in vivo. n al doilea caz nainte de prelevare se
execut un protocol pentru sterilizarea explantelor.
3. Altoirea propriu-zis se face prin nlturarea cotiledoanelor de la portaltoii obinui din
semine care apoi sunt secionai transversal. Se secioneaz de asemenea transversal
portaltoii vegetativi.
Apexul meristematic de dimensiuni foarte reduse (0,3 mm) se detaeaz i se
aeaz pe zona cambial a portaltoiului secionat.
Planta altoit se trece apoi ntr-o eprubet steril pe mediu de cultur lichid pentru a
se asigura o atmosfer saturat n umiditate, necesar prinderii.
4. Aclimatizarea se realizeaz cnd mini-altoiul atinge 1,5-2 cm lungime prin
transplantarea plantei altoite ntr-un vas in vivo. Se trece apoi gradat la realizarea
aclimatizrii n condiii "blnde" cu umiditatea relativ a aerului, ridicat.
Dezavantajele acestei metode ar consta n folosirea unui personal calificat i n
tehnica de lucru pretenioas.



142
6.2.2. Microaltoirea in vivo
Microaltoirea in vivo se execut n condiii normale folosind ca altoi un meristem
apical crescut in vitro iar ca portaltoi, un puiet sau un buta nrdcinat de dimensiuni
reduse.
1. Pregtirea altoiului se face prin prelevarea apexului meristematic (0,5 mm) dup
sterilizarea materialului i creterea pe mediu pentru a-i mri dimensiunile. Se recomand
ca acesta s nu fie n contact direct cu mediul ci s fie aezat pe o bucat de hrtie de filtru
(punte).
Cnd apexul atinge 0,5-1 cm lungime se fasoneaz n form de pan dubl
punndu-se pe seciuni cte o pictur de DIECA (antioxidant).
2. Pentru altoirea propriu-zis se folosesc portaltoi obinui prin metode tradiionale, aflai
n ghivece. Acetia trebuie s aib dimensiuni reduse (pentru puiei 40-160 zile de via).
n momentul altoirii, portaltoiul se reteaz i apoi se execut o incizie diametral.
Pentru prevenirea brunificrilor pe suprafeele secionate se aplic un antioxidant: dietil
diticarbonat de sodiu 2 g/1 (DIECA). Pot fi folosii ali oxidani cum ar fi: acidul ascorbic,
polivinil pirolidona (PVP), tiourea, cisteina. Pentru stimularea creterii altoiului se adaug
o citochinin.
Altoiul se introduce n incizia de pe portaltoi i apoi se leag strns (foto 6.2.)


Foto 6.2. Microaltoirea la piersic folosind altoi i portaltoi obinui in vitro


143

3. Aclimatizarea se execut n sere n condiii de umiditate relativ ridicat pentru a se
realiza sudura punctului de altoire.

6.2.3. Microaltoirea ex vitro
Este o tehnic care permite folosirea ca altoi a lstarilor produi in vitro, acetia
altoindu-se pe portaltoi obinui prin metode tradiionale, sau in vitro.
Altoirea se face la mas n condiii normale. Se mbin astfel avantajele
multiplicrii in vitro cu simplitatea metodei tradiionale de altoire.
1. Obinerea portaltoilor se face fie plecnd de la semine i smburi, fie prin butire n
uscat sau verde. Materialul nrdcinat este trecut apoi la ghivece. Portaltoii pot fi obinui
i in vitro, aclimatizai i fortificai (foto 6.3.).

Foto 6.3. Portaltoi de vi de vie fortificai, pregtii pentru altoirea ex vitro
(Vitroplant)

2. Obinerea altoilor este relativ simpl, pornindu-se fie de la meristeme, fie de la
fragmente uninodale sau chiar de la alte organe (frunze etc.). Dup mai multe multiplicri,
lstarii avnd o lungime de 3-5 cm se folosesc 1a altoire.


144
3. Altoirea propriu-zis const n retezarea portaltoiului transversal i despicarea
longitudinal pe 1-2 cm lungime.
Lstarul altoit, preluat din cultura in vitro se fasoneaz sub form de pan dubl i
se introduce n incizia de pe portaltoi. Punctul de altoire se leag apoi strns cu folie de
aluminiu, o band de cauciuc (foto 6.4.), sau se protejeaz cu un dispozitiv cu arc (tip
crlig de rufe).

Foto 6.4. Plant de vi de vie microaltoit ex vitro (Vitroplant)

4. Aclimatizarea se face n spaii protejate, cu umiditatea relativ ridicat n prima faz,
urmat apoi de o clire treptat (foto 6.5.). Plantele sunt trecute apoi n cmp, n pepinier,
unde, dup un sezon de vegetaie, ating dimensiunile optime pentru plantare.
Altoirea ex vitro este o metod economic, cu aplicabilitate larg, fiind uor de
efectuat i pe cale industrial n complexele de micronmulire.


145

Foto 6.5. Vi de vie microaltoit, pregtit pentru livrare i plantare (Vitroplant)

6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro
Pe lng cultura de meristeme, nsoit sau nu de termoterapie, s-au studiat i alte
posibiliti pentru eliminarea virusurilor sau micoplasmelor din plantele de cultur.
Una din tehnicile folosite este obinerea de bulbili adventivi sntoi pe solzi de
Lilium longiflorum cultivai in vitro (Brierley, 1962). Rezultate similare au fost obinute de
Hildebrandt (1971) la gladiole.
Button i Bornman (1971), au regenerat plante libere de virusuri la Citrus folosind
embrionii somatici obinui din esut nucelar.
La conopid, devirozarea se poate realiza prin cultivarea meristemelor provenite de
la mugurii floriferi din inflorescen (Walkey i colab., 1974).
Mai multe cercetri experimentale au demonstrat posibilitatea devirozrii
materialului biologic prin regenerarea in vitro a unor lstari adventivi pe frunze, solzi
(tunici) de bulbi sau alte organe infectate.
Astfel, Mori i colab. (1982) au obinut lstari adventivi sntoi prin organogenez
direct din frunze de tutun infectate cu VMT. Acelai lucru a fost reuit i la via de vie.
La crin i zambil s-a reuit regenerarea de lstari devirozai din tunici de bulbi
infectai (Allen, 1974; Asjes i colab., 1974). Dup diferenierea meristemelor pe
fragmentele de tunici cultivate in vitro, acestea au fost detaate i inoculate pe un alt mediu
pentru alungire i formarea lstarilor.


146
Combinnd cultura de meristeme cu obinerea de lstari adventivi Hakkaart i
colab. (1983) au reuit s devirozeze soiul de Kalanchoe Yucatan.
Bazndu-se pe faptul c la o serie de specii (petunia, tutun, varz) frunzele prezint
zone cu o densitate redus a virusurilor sau lipsite de virusuri, n timp ce celelalte pri ale
plantei sunt puternic infectate, regenerarea lstarilor adventivi prin organogenez direct
din limb a fost principala metod de devirozare.
La plantele cu frunze variegate (himere) aceast metod duce la pierderea
caracterului variegat, datorit faptului c fiecare lstar regenerat se formeaz dintr-o
singur celul (Cassells i colab., 1980; Pelargonium).
Cultura de calus poate s fie folosit de asemenea pentru realizarea devirozrii. S-a
observat c prin subcultivarea repetat a calusului de tutun infectat cu VMT acesta devine
liber de virusuri. Eliminarea virusului s-ar datora prezenei celulelor meristematice tinere
dotate cu o mare capacitate de multiplicare. Aceste celule sunt mult mai rezistente la
ptrunderea i multiplicarea virusului (Cooper, 1962, citat de Hildebrandt, 1977).
inndu-se cont de aceste observaii, s-a reuit regenerarea de plante sntoase din
calus de cartof infectat cu virusul X.
Supunnd calusul de Nicotiana rustica unui tratament termic, Walkey (1978) a
reuit devirozarea complet a acestuia.
Mori i colab. (1982) au obinut plante libere de virusuri din protoplati izolai din
frunze infectate cu virusul mozaicului tutunului.
147
Capitolul 7
Organogeneza in vitro

Organele i esuturile cultivate in vitro n anumite condiii au capacitatea de a
diferenia centri meristematici (foto 7.1.) care ulterior dau natere la lstari sau rdcini, iar
uneori la structuri de tip embrioid.

Foto 7.1. Centri meristematici formai pe limbul foliar de kiwi (Actinidia deliciosa)

Formarea adventiv a lstarilor i rdcinilor poart denumirea de organogenez.
Aceasta poate fi de dou feluri: direct sau indirect, dup cum organele respective se
formeaz, direct sau se trece printr-o faz intermediar de calus.

7.1. Organogeneza direct
7.1.1. Organogeneza adventiv de lstari
Organogeneza adventiv de lstari const n regenerarea direct a unor lstari
adventivi pornind de la diferite tipuri de organe i esuturi. Metoda este folosit pe scar
larg la specii care regenereaz uor: Saintpaulia, Begonia, Achimenes Streptocarpus,
Lilium, Hyacinthus, Nerine etc.
148
Factorii care influeneaz pozitiv organogeneza i formarea lstarilor adventivi sunt
numeroi:
- plantele juvenile au o capacitate organogenetic ridicat; la gimnosperme
regenerarea de lstari adventivi este posibil doar folosind embrioni, puiei tineri sau pri
ale acestora (David, 1982).
- zaharurile stimuleaz organogeneza direct cu formarea de lstari;
- giberelinele i acidul abscisic inhib organogeneza;
- lumina stimuleaz n general procesul de organogenez.
Exist ns o serie de plante care necesit o perioad de ntuneric: muguri floriferi
de Freesia (Pierik i Steegmans, 1975b) pedunculi de Nerine bowdenii (Pierik i
Steegmans, 1986a). Rezultatele obinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stnic F, au
dovedit importana ntunericului n faza de inducie pentru stimularea organogenezei
adventive din limb foliar la portaltoiul de mr M-27 (1996).
- culoarea roie are efect stimulativ la regenerarea lstarilor adventivi de Petunia
hybrida (Economou i Read, 1986).
- temperatura ridicat stimuleaz formarea de lstari adventivi la marea majoritate a
speciilor horticole. Face excepie Begonia (Heide, 1965) Streptocarpus (Appelgren i
Heide, 1972).
- poziia explantului, important. n cazul limbului foliar la majoritatea speciilor,
acesta trebuie aezat cu pagina inferioar pe mediu. Uneori se recomand crestarea
nervurilor frunzei nainte de inoculare.
Cercetrile lui Pierik, 1987 au demonstrat creterea numrului de lstari inoculai
la Kalanchoe forinacea prin aezarea explantelor n poziie vertical.
- hormonii de cretere influeneaz organozeneza n mod diferit; exist specii care
nu necesit aport suplimentar de auxine sau citochinine pentru declanarea organogenezei
chiar dac aceste substane stimuleaz apoi procesul respectiv: honesty (Pierik, 1967),
cicoarea (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren i Heide, 1972).
- marea majoritate a speciilor formeaz lstari adventivi n prezena citochininelor
n timp ce auxinele inhib procesul. Uneori acest lucru este posibil i atunci cnd este
vorba de explante de tipul peiolului, rdcinilor sau internodurilor (Stnic, F., 1995).
- puine specii au nevoie de auxine: crinul (van Aartrijk, 1984), zambila (Pierik i
Steegmans, 1975d)
149
- raportul citochinine:auxine trebuie s ncline n favoarea primelor, fapt
demonstrat la Begonia (Heide, 1965), hrean (Wurm, 1960), conopid (Margara, 1969),
cicoare (Diaconescu, 2002).
Cicoarea witloof (Cichorium intybus L.) are capacitatea de a forma in vitro noduli
meristematici pe explantele foliare aezate cu partea superioar n contact cu mediul de
cultur (foto 7.2.). Cea mai mare rat de regenerare s-a observat la o balan hormonal
alctuit din 0,1 mg/l AIB i 1,0 mg/l BAP.

Foto 7.2. Regenerare de noduli meristematici din limb foliar la Cichorium intybus L.

- cea mai folosit citochinin este BAP iar pentru gimnosperme este singura
recomandat. Celelalte citochinine sunt mai puin folosite.
- concentraii ridicate de citochinine (BAP) pot determina dereglarea procesului de
organogenez. Se recomand n aceast situaie alternarea culturii pe dou medii cu
concentraii diferite de BAP.
- zeatina a avut un rol important n procesele de organogenez la kiwi folosind
diferite tipuri de explante (Stnic, F. i colab. 1995, 1998) (foto 7.3. a, b i c).
- tidiazuronul (TDZ) i 2 izopentiladenina (2iP) au determinat efecte spectaculoase
de stimulare a lstririi adventive. Din acest motiv cele trei substane sunt mult folosite n
lucrrile de cercetare n ultimii ani n ciuda preurilor de cost ridicate.
- adenina sulfat poate stimula organogeneza adventiv la Begonia (Ringe i Hitsch,
1968), tutun (Skoog i Tsui, 1948), ulm (Jacquiot, 1951). n combinaie cu citochininele,
adenina sulfat a stimulat formarea lstarilor adventivi (Skoog i Miller, 1957; Nitsch i
colab. 1969a).
150

a b

c
Foto 7.3. Organogenez direct de lstari din rdcini (a), peiol (b) i limb foliar (c)
la kiwi (Actinidia sp.)

- acidul abscisic inhib formarea lstarilor adventivi la marea majoritate a speciilor,
excepie fcnd batatul (Yamanguchi i Nakajima, 1974)
- etilena are i ea un rol important n formarea bulbilor adeventivi la arin (van
Aartrijk, 1984).
- substanele antiauxinice, cele care inhib transportul auxinelor (TIBA) au ca efect
stimularea organogenezei adventive.
- vitaminele stimuleaz formarea lstarilor adventivi la ciclamen (Mayer 1956),
ulm (Jacquiot, 1951), hrean (Wurm, 1960).
- infectarea materialului iniial cu A. tumefaciens rasa C58, stimuleaz
organogeneza adventiv la cartof, plop, tutun (Ooms i colab., 1983, Steffen i colab.
1986). Efectul s-ar datora i juvenilizrii materialului iniial datorit aciunii bacteriei.
Datorit multiplelor aplicabiliti ale acestei tehnici, dintre care amintim n primul
rnd folosirea n transformarea genetic, numrul lucrrilor de cercetare privind
organogeneza direct de lstari la speciile horticole este mare.
n tabelele 7.1.1, 7.1.2., 7.1.3., 7.1.4. sunt prezentate cteva din rezultatele
cercetrii n acest domeniu.
151
Tabelul 7.1.1.
Cercetri privind organogeneza de lstari la plantele legumicole
Denumirea
speciei
Explant iniial Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Lstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0-2)ANA+(4) BAP Hussey&Falavigna
1980
Calus Nitsch et al, (1969a) 30 6 (0,09-
0,43)AIA+(0,9)BAP
Bui Dang Ha et al,
(1975)
Calus Pelletier et al, (1972) To - 20 5 Dor (1974)
Calus Pelletier et al, (1972) To - 20 5 (0,2)BAP (g/l) Pelletier et al (1972)
Calus Murashige & Skoog
(1962)
- 30 - Steward & Mapes (1971
b)
Calus Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 8 Wilmar & Hellendoorn
(1968)
Asparagus
officinalis
Lstar cu un
mugure
Yang (1977) 5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang (1977)
Brassica oleracea
botrytis
Calus Gamborg et al, (1968) B5 5,5 20 8 (0,5)BAP Bagga et al (1982)
Brassica oleracea
capitata
Calus Shahin (1985) TM-4 5,8 10 7 (0,99) BAP +(0,1) GA3 Lillo & Shahin
(1986)
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 7 (2)AIA + (0,043) Kin + 15%
CM
Dietert et al (1982) Brassica oleracea
gemmifera
Lstari Gamborg et al (1968) B5 - 20 8 (0,3) 2iP Ockendon (1984,
1985)
Capsicum annuum Cotiledon +
hipocotil
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 6,8 (1)AIA + (1) BAP sau
(1) PBA
Gunay & Rao
(1978)
Cichorium intybus Fragmente de, frunze
etiolate (16 mm )
Knop Kin, AIA Vasseur (1978a)
152
Tabelul 7.1.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente de frunze,
cotiledon sau frunze
cotiledonare
Reynolds et al, (1980) 5,7 40 glucoz 8 (0,1)NOA+(20)
2iP+(0,1)CCC
Blackmon&
Reynolds (1982)
calus Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (0,1)BAP Moreno et al,(1984)
Cucumis melo
Calus si lstari Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (0,1)AIA Moreno et al,(1984)
Cucumis sativus Calus din
cotiledon
Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (1)ANA+(1)BAP Wehner&Locy
(1981)
Daucus carota Lstari Thorpe&Murashige(1968;
1970)Sf
5,8 30 10 (2)AIA+(2)Kin+(160)A
dS
Smith&Murashige
(1970)
Ipomoea batatas Fragmente de
rdcini
Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (1)ANA+( 0,1)BAP Carswell&Locy(198
4)
Cotiledon Doerschung & Miller
(1967)
30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Doerschung & Miller
(1967)
Calus Engler & Grogan
(1983)DM
5,8 17,1 15 (0,01) 2,4-D+(0,2)Z Engler & Grogan
(1983)
Lactuca sativa
Calus Murashige&Skoog (1962) 5,7-5,9 20 6 (10)AIA+(0,04)Kin Vasil & Hildebrandt
(1966c)
Cotiledon Yang&Chang(1979) 5,7 30 2 gelrite (0,5)AIA+(2)BAP Ammati et al,(1984)
Calus Murashige&Skoog (1962) 30 8 [(7)ANA+(2)Z] sau
[(1)ANA+(2)BAP]
Behki & Lesley
(1980)
Hipocotil Nitsch et al,(1967)S 5,5 30 8 (0-3,5)AIA + (0,2-2)2iP Bigot et al,(1977)
esut medular Murashige&Skoog (1962) 5,8 3 6 (2)Z+(0,01)TIBA Cassells (1979)
Hipocotil Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,5)AIA+(2)BAP Gunay&Rao (1980)
Fragmente de
frunze
Pence & Caruso (1984) - 30 8 (1,75) AIA + (2) BAP Pence & Caruso
(1984)
Lycopersicon
esculentum
Calus Shahin (1985) TM 4 5,8 30 6 (0,2) GA3 + (1) Zr Shahin (1985)
Petroselinum
hortense
Calus Murashige&Skoog (1962) 5,7-5,9 30 10 (10) AIA + (0,04) Kin Vasil & Hildebrandt (1966
b,c)
153
Tabelul 7.1.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente
frunze
Murashige&Skoog
(1962)
30 agar (0,5 10) Kin Gleddie et al (1982)
Calus Pelletier et al (1972) To 5,8 20 7,5 (0,2) BAP Isouard et al (1979)
Fragmente
hipocotil
Matsuoka& Hinata
(1979)
5,5 20 8 (0,0225) BAP + (10)
AdS
Matsuoka& Hinata
(1979)
Calus White (1954) 20 agar (2-4) AIA + (4-) Kin Yamada et al (1967)
Solanum
melongena
3 cm rdcin Murashige&Skoog (1962) 30 0 (agar) Zelcer et al (1983)
Calus Shepard & Totten
(1977) D
5,7 3 10 (0,1 ) AIA + (0,5) Z Austin & Cassells
(1983)
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 10 7 (1)AIA + (1) BAP +
(10) GA3
Austin & Cassells
(1983)
Fragmente
tuberculi
Ratnamba & Chopra
(1974)
5,8 30 agar (0,4) AIA + (0,8) Kin +
(0,4) BAP
Bragdo Aas
(1977)
Calus Ratnamba & Chopra
(1974)
5,8 30 agar (0,4) AIA + (0,8) Kin +
(0,4) BAP
Bragdo Aas
(1977)
Fragmente
tuberculi
Jarret et al (1980 a, b) 5,7 30 9 (0,03) ANA + (0,3-1)
BAP
Jarret et al (1980 a,
b)
Fragmente
tuberculi
Lam (1975) 20 9 (0,4) AIA + (0,8) Kin +
(0,4) GA3 + (0,4) BAP
Lam (1975)
Fragmente lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,7 20 7 (1) BAP Marani & Pisi
(1977)
Fragmente lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 agar (0,01) ANA + (1) BAP
+ (0,1) GA3
Resende & Paiva
(1985)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 agar (0,01) ANA + (1) Kin +
(0,1) GA3
Resende & Paiva
(1985)
Solanum
tuberosum
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 agar (3,63) Zr Sopory & Tan
(1979)

154
Tabelul 7.1.2.
Cercetri privind organogeneza de lstari la plantele floricole
Denumirea
speciei
Explant iniial Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Calus Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 8 (0,2) 2,4-D+(1)Kin Groenewald et al,
(1977)
Agave sp,
Calus Groenewald et al,
(1975)
5,8 30 8 (0,2) 2,4-D+(1)Kin Groenewald et al,
(1977)
Amaryllis sp, Calus Bapat &
Narayanaswamy (1976)
5,8 20 8 (0,5) 2,4-D + (1) Kin +
10% CM
Bapat &
Narayanaswamy
(1976)
Anemone
coronaria
Fragmente
Lstari
0,5 x Linsmayer &
Skoog (1965)
(0,2) AIA + (2) BAP Sutter & Langhans
(1978 a,b)
Anthurium
scherzerianum
Calus Pierik et al (1974) 40 agar (0,23) BAP Fersing & Lutz
(1977)
Antirrhinum majus Lstari Sangwan & Harada
(1975)
5,5 20 6 (0,25) NOA +10 % CM Pfister & Widholm
(1984)
Petiol Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 6 (00,1) ANA + (0,1)
BAP
Cassells & Morrish
(1985)
Begonia rex
Fragmente
frunze
Schott & Scraudolf
(1967)
20 agar Schott & Scraudolf
(1967)
Frunze sau petiol Ranga Swamy (1961) I 5,8 20 8 (10-20) Ad Sehgal (1975) Begonia
semperflorens Frunze Bourgin & Nitsch
(1967) H
5,8 20 7 (0,23) BAP sau (0,31
3,1) PBA
Thakur (1973)
Begonia spp, Frunze si petioli Ringe & Nitsch (1968) 5 20 8 (1)AIA + (2,3)BAP Ringe & Nitsch
(1968)
Begonia
tuberhybrida
Fragmente
frunze
Peck & Cumming (1984
a) 1
5,8 30 6,5 (1) ANA + (5) BAP +
(125) Ad
Peck & Cumming
(1984 a)

155
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Camellia japonica Lstari Samartin et al ( 1984) 1 5,5-
5,6
30 6 (1) BAP + (0,1) ANA +
(20) AdS
Samartin et al
(1984)
Calus Hill (1967) B2 5,6 20 10 (1) Kin Hill (1968)
Fragmente lstar Kaul & Staba (1968) 6 30 10 (9) AIA + (2,25) BAP Grewald & Sharma
(1978)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 10 (20) BAP Staba et al (1984)
Fragmente
lstari
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 10 (0,203) BAP Wambugu &
Rangan (1981)
Chrysanthemum sp.
Calus Linsmaier & Skoog
(1965)
30 5 (0,2) ANA + (2) Kin +
(10) GA3
Bush et al (1975)
Calus Nitsch & Nitsch (1965)
S
5,5 20 6 (1) 2,4 -D Sangwan & Harada
(1977)
Fragmente
frunze
Robbins & Hervey
(1969) BRVS 2
4,5 20 0 (0,01) ANA + (0,05)
BAP
Hervey & Robbins
(1978)
Lstari Robbins & Hervey
(1969) BRVS 2
4,5 20 0 (0,005) ANA + (0,0025)
BAP
Hervey & Robbins
(1978)
Coleus blumei
esut medular Thorpe & Murashige
(1968; 1970) Sf
5,8 30 10 (2) AIA + (2) Kin +
(160) AdS
Smith & Murashige
(1970)
Calus Abo El Nil & Zettler
(1976) A Z
5,8 20 6 (2) Kin + (0,09-0,93)
ANA
Abo El Nil &
Zettler (1976)
Colocasia
esculenta
Calus Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 0 (1) Kin Jackson et al (1977)
a
esut medular Kunisaki (1975) 5,8 30 9 (0,5) BAP Kunisaki (1975)
Calus Heinz & Mee (1969) 5,6 20 9 10% CM Mee (1978)
Cordyline
terminalis
Fragmente
lstari
Miller & Murashige
(1976)
5 30 8 (1) AIA + (3) Kin +
(80)AdS
Miller & Murashige
(1976)
156
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente
lstari
Davis et al (1977)MS-
3X
5 50 6 (0,19)ANA + (2,15)Kin Davis et al (1977)
Fragmente
lstari
Davis et al (1977)MS-
3X
5 50 6 (0,05)ANA + (0,54)Kin Davis et al (1977)
Fragmente
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,7 30 6 (0,1)ANA+(0,5)Kin Earle & Langhans
(1975)
Fragmente lstari Murashige&Skoog(1962) 30 0 (1) Kin Gukasyan et al(1977)
Dianthus
caryophyllus
Calus Hackett & Anderson
(1967)
30 agar (1) ANA Hackett &
Anderson (1967)
Dracaena
deremensis
esut medular Debergh (1975) 5,8 20 6 (0,1) ANA + (5) Kin Debergh (1975);
1976)
Dracaena
gosetfiana
Fragmente
lstari
Miller & Murahige
(1976) II
5 30 0 (1) AIA + (3) Kin +
(120) AdS
Miller & Murashige
(1976)
Dracaena
marginata
Calus Murahige & Skoog
(1962)
30 8 (1) Kin + 15% CM Choa et al (1981)
Ficus benjamina Fragmente
lstari
Miller & Murahige
(1976) II
5,8 30 agar (0,3) AIA + (30) 2iP +
(80) AdSh
Makino et al (1977)
Ficus lyrata Frunze Debelgh & De Waiel
(1977) Shoots
5,8 20 6 (2,5) IBA + (5) BAP Debelgh & De
Waiel (1977)
Freesia sp, Calus Bajaj & Pierik (1974) 5,8 30 8 (5) Kin Bajaj & Pierik
(1974)
Freesia hybrida Calus Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6 30 6 (5) Kin Stimart & Ascher
(1978 b, 1982)
Fragmente
lstari
Miller & Murashige
(1976) II
5 30 7 (2-4)BAP+(80)AdS Harris&Mason
(1983)
Fuchsia hybrida
Fragmente
lstari
Gamborg et al, (1968)
B5
5 30 0 (3)BAP Stevenson&Harris
(1980)
Gardenia
jasminoides
Fragmente
lstari
Economou & Read
(1984)
5 20 6 (5-10)2iP Economou &
Spanoudaki (1985)
157
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente
frunze
Hedtrich (1979)A 10 8 (0,1)AIA +(10)BAP Hedtrich (1979)
Fragmente
Lstari
Hedtrich (1979)A 10 8 (1)BAP+(0,1)GA3 Hedtrich (1979)
Calus Meynet & Sibi (1984) 1 5,8 20 8 (0,25)AIA + (1)BAP Meynet & Sibi
(1984)
Fragmente
Lstari
Murashige et al (1974) 5,7 45 10 (0,5)AIA + (10)Kin +
(80) AdS
Murashige et al
(1974)
Gerbera jamesonii
Calus Sitbon (1981)1 5,7 45 8 (0,5)AIA + (2)BAP +
(2)Kin
Sitbon (1981)
Gladiolus
grandiflorus
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 agar (0,1)ANA + (2)Kin Bajaj et al (1983)
Lilium sp, Calus Simmonds & Cumming
(1976)
5,7 30 6 (1,1)2,4-D sau BAP Simmonds &
Cumming (1976)
Mammillaria
elongata
Tuberculi Johnson & Emino
(1979)
5,6 45 10 (1)IBA+(10)2iP Johnson & Emino
(1979)
Mammillaria
voodsi
esut medular Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (2)AIA + (2)Kin Kolar et al (1976)
Monstera
deliciosa
Fragmente
Lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,7 30 8 (2)AiA + (10)PBA Fonnesbech &
Fonnesbech (1980)
Bulbili sau
plantule
Heinz & Mee (1969) 20 7 (0,03-5)ANA + (2-
8)BAP
Hussey
(1976c;1977a)
Lstari Heinz & Mee (1969) 20 7 (0,03-5)ANA +
(1-2)BAP
Hussey
(1976c;1977a)
Narcissus sp,
Fragmente
frunze
Hussey (1977a)1 sau 2
sau (1982)
20-30 7 (0,25-4)ANA + (2-
16)BAP + (150)AdS
Hussey (1982)
Nephrolepsis
falcata
Fragmente
Lstari
Miller & Murashige
(1976)III
30 8 (1,1-11)Kin +/-
(0,93)ANA
Beck & Caponetti
(1983)
158
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Stoloni 0,5x Murashige &
Skoog (1962)
5,6 30 8 Henson (1979) Nephrolepsis spp
Rizom Miller & Murashige
(1976)III
5,8 30 8 (2)AIA+(0,04)Kin+
(1,13) BAP
Beck & Caponetti
(1983)
Pelargonium
peltatum
Fragmente
Lstari
Theiler (1977) 5,6-
5,8
30 0 (1)IBA + (0,2)Z Theiler (1977)
Pelargonium spp, Lstari Beauchesne et al (1977)
III sau IV
10 glucoz 6-7 (0,25)AIA + (0,1)2iP +
(1)GA3 +/- (2)Ad
Beauchesne et al
(1977)
Fragmente
frunze
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,7-
5,8
30 5 (0,2)BAP Daykin et al (1976) Petunia hybrida
Calus Sangwan & Norreel
(1975)
5,6 20 agar (0,1)ANA + (1)BAP Sangwan & Norreel
(1975)
Phalenopsis sp, Muguri
adventivi
Knudson (1946)C 30 agar (2)ANA Hackett et al (1972)
Phalenopsis sp, Muguri dorminzi Koch (1974) A 20 5 (0,3)ANA Pipper & Zimmer
(1976)
Peiol Murashige & Skoog
(1962)
5,8 25 8 (0,1)ANA + (0,01-
0,5)BAP
Bilkey et al (1978)
Frunze tinere Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 6 (1)ANA + (1)BAP Cassells & Plunkett
(1984)
Fragmente frunze Cooke (1977) 5,7 30 9 (2)AIA + (0,08)BAP Cooke (1977)
Peiol Grunewaldt (1976) 5,8 30 8 (0,2)AIA+(0,1)2,4-D
+(0,4) BAP + 19 % CM
Grunewaldt (1976)
Peiol Grunewaldt (1977) 5,8 30 8 (0,8)AIA+(0,5)Kin Grunewaldt (1977)
Peiol Harney & Knap (1979) 30 6 (0,5)ANA + (0,5)Kin Harney&Knap (1979)
Saintpaulia
ionantha
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (1)ANA+(0,5)BAP Weatherhead et
al(1982)
Sansevieria
trifasciata
Meristemoizi Murashige & Skoog
(1962)
6,3 20 8 (0,3) Kin Blazich & Novitzky
(1984)
159
Tabelul 7.1.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Muguri Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (1)AIA + (3)BAP Kothari & Chandra
(1984a)
Fragmente
Lstari
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (5)AIA + (3)BAP+
(0,5)GA3
Kothari & Chandra
(1984b)
Tagetes erecta
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (5)AIA + (7)BAP Kothari&Chandra
(1984b)
Tulipa gesneriana Bulbili Riviere & Muller
(1979)
5,5 50 glucoz 6 Riviere & Muller
(1979)

Tabelul 7.1.3.
Cercetri privind organogeneza de lstari la plantele pomicole
Denumirea
speciei
Explant iniial Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente
rdcini
Harada (1975) 5,5 20 7 (1) Z + (40) Ad Harada (1975)
Fragmente lstari Murashige&Skoog(1962) 30 Agar (1) Z Kwei et al (1980)
Actinidia deliciosa
Fragmente
lstari
Monette (1986 a) I 5,7 22,5 0,7 (0,023) IBA + (2) BAP
+ (60) AdS
Monette (1986 a)
Lstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,0225) BAP Hisajima (1982 a)
Lstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,0225)BAP+(0,005)
IBA
Hisajima (1982 a)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 9 (0,1) ANA + (0,7) BAP Ruginii & Verma
(1982;1983)
Amygdalus
communis
Calus Matheus&Rangan (1981) 30 agar 5%CM Matheus&Rangan(1981)
Ananas comosus Lstari 0,5xMurashige &
Skoog (1962)
30 0 (0,5-1)IBA Zepeda & Sagawa
(1981)
160
Tabelul 7.1.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Armeniaca
vulgaris
Fragmente
lstari
Skirvin et al,(1980) 5,7 20 agar Nu sunt mentionate Skirvin et al,(1980)
Castanea sativa Epicotil San Jose et al, (1984) L
sau Ha
30 6 [(0,1)NAN sau IBA]
+(2)BAP
San Jose et al,
(1984)
Cerasus avium Fragmente
lstari
Jones et al (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP+
(0,1)GA3
Seirlis et al, (1979)
Fragmente
lstari
Skirvin et al (1980) 5,7 20 agar Skirvin et al (1980) Cerasus vulgaris
Lstari Skirvin &
Chu(1978a,b)
5,7 30 agar (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin et
al,(1981b)
Fragmente
rdcini
Hoagland&Snyder
(1933)
0 0 Murashige et al
(1972a)
Citrus sp,
Fragmente
lstari (5mm)
Kitto& Young (1981)S 5,6-
5,8
30-40 10 (5)BAP+(80)AdS Kitto& Young
(1981)
Calus Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)Kin+(2)Ad Radojevic et
al,(1975)
Corylus avellana
Calus Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)Kin+(2)Ad+(1)GA3 Radojevic et
al,(1975)
Diospyros kaki calus Yokoyama&Takeuchi
(1976)
5,6-
5,8
30 7 (1)ANA + (0,1-1)Kin Yokoyama&Takeu
chi (1976)
Fragaria Fragmente
lstari
Murashige & Skoog
(1962)
5,6 30 7 (0,2-1)IBA + (1,1)BAP
+ (1)GA3 sau (0,02-
0,2)IBA+(1,1)BAP
Anderson et al,
(1982)
Glossularia
redinata
Fragmente
lstari
Murashige & Skoog
(1962)
5,5 30 6 (0,1)IBA + (0,49)BAP Welander (1985a)
Juglans hindisii x
J, regia
Lstari Extra vitrum Driver &
Kuniykuhi (1984)
161
Tabelul 7.1.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari Chalupa (1981a)A 30 6 (0,1-0,3)ANA+(0,1-
0,6)BAP +(20)AdS
Chalupa (1981a) Juglans regia
Semine 0,5 x Rodriguez
(1982b)K(h)
5,5 30 6 (9)BAP Rodriguez (1982b)
Juglans regia Lstari Rodriguez (1982b)K(h) 5,5 30 6 (0,4)IBA+(0,4)BAP Rodriguez (1982b)
Fragmente
lstari
Jones et al (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP
+(0,1)GA3+(162)PG
Jones et al (1979)
Cotiledon Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,3)BAP Liu et al (1983a)
Calus Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (1)BAP Liu et al (1983a)
Calus din cotiled.,
sau tesut med.
White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin
+(1)GA3 + 15% CM
Mehra & Sachdeva
(1979)
Calus din embr.
sau lstari
White (1943a)A 20 agar (2)ANA+(2)BAP +
15% CM
Mehra & Sachdeva
(1979)
Lstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(1)BAP+
(0,1)GA3
Snir & Erez (1980)
Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,2 29,9 7 (0,1)IBA+(0,48)GA3 Van Nieuwkirk et
al (1986)
Malus x domestica
Muguri dorminzi
/ lstari
Zimmerman
(1984a)Lep
20 7 (0,01)IBA + (0,09
BAp)
Zimmerman
(1984a)
Fragmente
lstari
Lakshmi-Sita et al
(1976)
5,6 30 8 (1)BAP Oka & Ohyama
(1981)
Fragmente
lstari
Lakshmi-Sita et al
(1976)
5,6 30 8 (10)BAP Oka & Ohyama
(1981)
Morus alba
Muguri Murashige&Skoog(1962) 5,6 30 8 (10)BAP Oka&Ohyama(1981)
Lstari Krikorian & Cronauer
(1984)
5,8 41 0 (4,95)BAP+10%CM Cronauer &
Krikorian (1985a)
Lstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 7 (5)BAP + 10% CM Cronauer &
Krikorian (1985b)
Musa acuminata
Fragmente lstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 20 8 (10)BAP+15%CM Dore Swamy & al (1983)
162
Tabelul 7.1.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Musa cavendishii Calus Murashige & Skoog
(1962)
30 agar (0,3)AIA+(1)Kin sau
[(2)BAP+20%CM]
Ma et al (1978)
Musa spp, Lstari Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (5)BAP Cronauer &
Krikorian (1984)
Musa textilis Lstari Mante & Tepper (1983)
I
5,7 30 5-8 (0,1)IBA+(3-5)BAP
+(160)AdS
Mante & Tepper
(1983)
Lstari Miller et al (1982)A 20 8 (0,1)ANA+(2)BAP Miller et al (1982) Persica vulgaris
Lstari Skirvin &Chu
(1978a,b)
5,7 30 agar (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin &Chu
(1978a,b)
Fragmente
lstari
Linsmaier&Skoog
(1965)
5,7 30 8 [(0-1)2,4-D sau
ANA]+(3)2iP +(40)AdS
Tisserat et al (1979)
Calus Thompson & Gordon
(1977)
5,6-
5,8
30 8 Tisserat (1982)
Phoenix
dactylifera
Fragmente lstari Tisserat (1984a) 5,6-5,8 30 8 (10)2,4-D Tisserat (1984a)
Semine 0,5xMurashige &
Skoog (1962)
5,8 0 0 Barghchi&Alderso
n (1983)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 0 7 (4)BAP Barghchi&Alderso
n (1983)
Pistacia vera
5-8 mm lstari Murashige & Skoog
(1962)
30 7 (4)BAP Barghchi&Alderso
n (1985)
Fragmente
lstari
Miller&Murashige
(1976)II
5,6 30 7 (10)2iP+(162) PG Garland&Stoltz
(1981)
Fragmente
lstari
Kim et al, (1981) 5,8 20 0 (0,01)IBA+(1)BAP Hammerschlag
(1982b)
Prunus cerasifera
Fragmente
lstari
Linsmaier&Skoog
(1965)
5,8 30 7 (0,5)BAP Norton & Boe
(1982)
Fragmente
lstari (5-15mm)
Pietropaolo & Reisch
(1984)
5,8 30 7 (1,1)BAP Pietropaolo &
Reisch (1984)
Prunus domestica
Fragmente lstari Skirvin et al (1980) 5,7 20 agar Nu sunt menionate Skirvin et al (1980)
163
Tabelul 7.1.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Prunus insititia Fragmente
lstari
Jones et al, (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP+
(0,1)GA3 +(162)PG
Jones & Hopgood
(19790
Fragmente
lstari
Lane (1979b) 5,2 30 7 (1,13)BAP Lane (1979b)
Fragmente
lstari
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (1,36-2,25)BAP+(1,1)Z
+(1,02)2iP
Shen&Mullins
(1984)
Pyrus communis
Fragmente
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,7-
5,8
30 6 (2)BAP Singha (1982a,c)
Fragmente
lstari
Murashige & Skoog
(1962)
5,7 20 6 (1,35)BAP Flegmann&
Wainwright(1981)
Ribes nigrum
Fragmente
lstari
Jones &Vine (1968)B 5,6-
5,8
40 glucoz 0 Jones &Vine
(1968)
Lstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 agar (0,1)IBA+(1)BAP Donnelly et al,
(1980)
Lstari Snir (1981)a 5 20 agar (0,22)2,4-D
+(1)BAP+(0,1)GA3
Snir (1981)
Rubus idaeus
Lstari cu noduri Welander (1985c) 5,2 30 6 (1)BAP Welander (1985c0
Fragmente
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6-
5,8
30 7 (1)IBA+(1)BAP
+(0,1)GA3
Broome &
Zimmerman (1978)
Rubus sp,
Fragmente
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6-
5,8
30 0 (0,1)IBA+(1)BAP Donnely et al
(1986)
Vaccinium sp, Fragmente
lstari
Zimmerman & B
(1980)Z-2
30 5,5 (4)AIA+(15)2iP
+(80)AdSh
Zimmerman &
Broome (1980)

164
Tabelul 7.1.4.
Cercetri privind organogeneza de lstari la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Explant Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Acer rubrum x
Acer saccharum
Fragmente
lstari
Murashige&Skoog
(1962)
5,7 30 10 (0,1-0,5)Thidiazuron Kerns & Meyer
(1985)
Calus Simola (1985)N7 5,6 20 6 [(5/10)Z/Zr] +
[(0,1/0,2)ANA/NOA]
Simola (1985)
Calus Srivastava&Steinhauer
(1981a)2
5,8 40 6 (2)AIA + (6)Kin +
(40)Ad
Srivastava&Steinha
uer (1981a)
Frunze Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (2)AIA + (5)Z +
(2)GA3
Srivastava et al
(1985)
Betula pendula
Fragmente
rdcini
Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (0,5)ANA + (5)2iP +
(30)Ad
Srivastava et al
(1985)
Betula verrucosa Calus Chalupa (1981b) 1 30 6 (0,05)IBA+ (0,2-
0,3)BAP + (20)AdS
Chalupa (1981b)
Biota orientalis
(thuja)
Hipocotil Thomas & Tranvan
(1982)
5,4 30 8 (0,1) IBA + (1,1)BAP Thomas & Tranvan
(1982)
Chaenomeles
japonica
Fragmente
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 7 (2,5)BAP Norton & Boe
(1982)
Crataegus
rachyacantha
Fragmente
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 7 (0,1-10)BAP Norton & Norton
(1986b)
Crataegus cv,
TOBA
Fragmente
lstari
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe
(1982)
Fraxinus
americana
Fragmente
lstari
Lloyd & McCown
(1981) WPM
5,2 20 6 (0,5-1)BAP Heiman & Preece
(1983)
Fraxinus
pennsylvanica
Fragmente
lstari
Lloyd & McCown
(1981) WPM
5,2 20 6 (0,5-1)BAP Heiman & Preece
(1983)
165
Tabelul 7.1.4. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Hedera helix Cotiledon/
hipocotil
Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (0,5)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979)
Calus Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (0,5)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979) Hedera helix
esut medular Banks(1979) 1, 5,7 30 5 (2)ANA + (0,5)BAP Banks (1979)
Hydrangea
macrophylla
Fragmente
lstari
Gamborg et al,
(1968)B5
5,5 20 6 (1,8)BAP Bailey et al, (1985)
Larix decidua Fragmente
frunze
Bonga (1984) LM 5,6 30 8 (2,25)BAP Bonga (1984)
Hipocotil Murashige & Skoog
(1962)
30 8 (3)AIA + (3)Kin Marcortriginiano &
Stimart (1983)
Paulownia
tomentosa
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
30 8 (0,1)IBA + (1)BAP +
(0,1)GA3
Marcortriginiano &
Stimart (1983)
Frunze
cotiledonare
Murashige & Skoog
(1962) a:DIT
5,8 30 agar (1,3) BAP Bornman &
Vogelmann (1984)
Frunze
cotiledonare
Bornman (1981)
MCMa:B
5,5 30,8 7 (1,1) BAP Bornman (1983)
Ace Bornman (1981)
MCMa:B
5,5 30,8 7 Bornman (1983)
Hipocotil Chalupa (1974) WS 5,6 30 7 (0,01) AIA + (2) BAP Chalupa (1977)
Picea abies
Muguri Chalupa (1974) WS 5,6 30 7 Chalupa (1977)
Hipocotil Campbell & Durzam
(1975)
30 7 (2,25) BAP Campbell &
Durzam (1975)
Picea glauca
Epicotil Rumary & Thorpe
(1984)
5,9 30 8 (1,13) BAP + (1,02) 2iP Rumary & Thorpe
(1984)
Picea pungens Muguri dorminzi Von Arnold & Eriksson
(1977) LP
5,8 34 8 (2,2) BAP Misson et al (1982)
Picea mugo Muguri Champbell&Durzan(1975) 30 7 (0,19)ANA + (2,25) BAP Stiff et al (1985)
Pinus sylvestris Ace Bornman & Janson
(1980)
5,6-
5,8
50,5 6-7 (4,5) BAP Bornman & Janson
(1980)
166
Tabelul 7.1.4. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Muguri Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6 30 7 Chalupa (1977)
Cotiledon Cheng (1977; 1978) 5,5 30 6 (0,001) ANA + (1,125)
BAP
Cheah & Cheng
(1978)
Pseudotsuga
menziesii
Lstari Thompson (1981) 30 agar (22,5) BAP +/- (0,019)
ANA
Thompson (1981)
Pyracantha
coccinea
Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 7 (2,5) BAP Norton & Boe
(1982)
Quercus robur Fragmente
lstari
Vieitez et al (1985) H +
SO4
30 6 (0,1) BAP Vieitez et al (1985)
Lstari Ma & Wang (1977) 2 5,7 20 7 (5) Kin Ma & Wang (1977)
Lstari Economou & Read
(1984)
5 20 6 (5-20) 2 iP Economou & Read
(1984)
Rhododendron sp,
Fragmente
tulpin
Lloyd & McCown
(1981) WPM
5,8 lichid (1,6) 2 iP McCown & Lloyd
(1981)
Fragmente
lstari
Hasegawa (1979) 5,7 30 8 (0,3) AIA + (3) BAP Bressan et al (1982) Rosa hybrida
Fragmente
lstari
Skirvin & Chu (1979 a) 5,7 30 10 (0,1) ANA + (2) BAP Skirvin & Chu
(1979 a)
Rosa sp, Lstari Murashige & Skoog
(1962)
40 agar (0,004) ANA + (2)
BAP + (0,1) GA3
Davies (1980)
Salix madsudana Lstari Whitehed & Giles (1976) 5,8 20 agar (0,2) ANA + (0,1) BAP Bhojwani (1980)
Syringa vulgaris Lstari Start & Cumming
(1976)S
4,5 30 7 (0,25) AIA + (0,1)
ANA
Hildebrandt &
Harney (1983)
Cotiledon Coleman & Thorpe
(1977) S
5,2 30 agar (0,02) ANA + (0,2)
BAP
Coleman & Thorpe
(1977)
Thuja plicata
Fragmente
lstari
Coleman & Thorpe
(1977) S
5,2 30 agar (0,02) ANA + (1,1)
BAP
Coleman & Thorpe
(1977)

167

7.1.2. Organogeneza adventiv de rdcini
Formarea adventiv a rdcinilor in vitro este determinat de un numr mare de
factori care influeneaz intensitatea i desfurarea procesului:
- vrsta i stadiul de dezvoltare al explantului. n general, explantele tinere, baza
lstarilor, cotiledoanele au capacitate mrit de a diferenia rdcini la marea majoritate a
speciilor. Fac excepie de la aceast regul Freesia, Lunaria, Nicotiana, Phoenix, Musa i
altele.
- poziia pe plant a explantului regenerator, n principiu, nu influeneaz hotrtor
formarea i creterea rdcinilor adventive. Totui se tie c explantele bazale i solzii de
bulbi au randamente mai mari n acest sens. La pomi i arbuti fructiferi i n general la
speciile lemnoase, este important att poziia pe plant a explantului ct i poziia fa de
soare.
- specia i soiul au rol hotrtor. Se tie c plantele erbacee au o capacitate mai
mare de a emite rdcini, acest lucru fiind influenat i de prezena sau absena unor bariere
anatomice.
- sexul plantei de la care se recolteaz materialul biologic este i el important. S-a
observat c la speciile dioice (actinidia, plop, etc.), plantele mascule au o vigoare de
cretere superioar i o capacitate rizogenetic pe msur.
- influena mrimii explantului este contradictorie. Cu toate c aparent, explantele
de dimensiuni mari ar avea o capacitate mai mare de a forma rdcini (foto 7.4.), s-a
observat c cele de dimensiuni mai mici au format un numr comparabil de rdcini,
datorit, se pare, suprafeei mai mari de contact cu mediul (foto 7.5.).
- orientarea explantelor este esenial. n mod paradoxal cele mai multe rdcini s-
au obinut la cultivarea lstarilor (explantelor) cu vrful n jos. Fenomenul se explic prin
mai buna oxigenare a esuturilor care se afl n afara mediului.
- numrul de subculturi influeneaz diferit formarea rdcinilor adventive. Efectul
este diferit ns, n funcie de specie i citochinina folosit. Astfel la Rosaceae n general,
numrul de rdcini scade cu creterea numrului de subculturi (ex. Chaenomeles). Face
excepie soiul Jonathan la care se petrece fenomenul invers, datorit probabil, creterii
gradului de juvenilizare n timp.


168

Foto 7.4. Volum mare de rdcini la un explant mare de Hakonechloa aureola


Foto 7.5. Rdcini lungi la un explant de dimensiuni reduse
de curmal chinezesc Ziziphus jujuba

n prezena 2iP procesul de reducere a capacitii rizogenetice evolueaz rapid, n
timp ce BAP-ul atenueaz acest fenomen.
- prezena oxigenului determin formarea rapid a explantelor dup trecerea in vivo.
De asemenea, pe mediile lichide trebuie luate obligatoriu msuri de aerare prin barbotare
sau alte mijloace. O variant bun este i folosirea mediului de cultur n dublu strat.
- lumina influeneaz n mod diferit formarea rdcinilor adventive. Pentru
reducerea acestui fenomen se recomand folosirea crbunelui activ n mediile de
nrdcinare. La majoritatea speciilor i n special la Prunus cersifera, efectul negativ este
169
evident. Totui, la Helianthus tubeosus i la crin lumina stimuleaz formarea rdcinilor.
Acelai efect se constat la Petunia cnd explantele sunt expuse la lumina roie.
- temperatura ridicat influeneaz pozitiv procesele de rizogenez. Fac excepie
Lunaria annuna i speciile lemnoase care reacioneaz mai bine la temperaturi sczute.
- agarul n concentraie mai sczut stimuleaz formarea rdcinilor.
- creterea coninutului mediului de cultur n zaharoz, stimuleaz formarea
rdcinilor la speciile lemnoase. Face excepie Pseudotsuga menziesii, la care se petrece
fenomenul invers.
n tabelele 7.2.1, 7.2.2., 7.2.3., 7.2.4., 7.2.5. sunt prezentate cteva rezultate ale
cercetrilor privind organogeneza de rdcini la plantele horticole.

7.2. Organogeneza indirect
Regenerarea unor organe in vitro (lstari, rdcini, bulbili, etc.) trecnd printr-o
faz intermediar de calus, poart denumirea de organogenez indirect.


Foto 7.6. Formarea lstarilor prin organogenez indirect din calus
de frunz de kiwi (Actinidia deliciosa)

n mod normal calusul formeaz mai uor rdcini dect lstari (Thomas i Dovey,
1975). Acest lucru este mai evident pe medii cu coninut ridicat de auxine i mai cobort
de citochinine.
170
Ca i n cazul organogenezei directe auxinele sunt necesare n concentraie mai
ridicat n faza de inducie.
n acelai timp pe calus se pot forma independent rdcini sau lstari.
La concentraii ridicate de citochinine i sczute de auxine are loc formarea
lstarilor adventivi. Ctochinina cea mai folosit este benzilaminopurina (BAP).
Uneori la baza lstarilor formai se formeaz simultan i rdcini.
Formarea lstarilor din calus este condiionat de un numr mare de factori:
- concentraia de sruri ridicat (care reduce creterea) stimuleaz organogeneza
indirect de lstari. n acest sens, creterea concentraiei de NH
4
NO
3
n cultura de calus
stimuleaz formarea lstarilor adventivi. (Pierik i colab., 1976) a demonstrat ns
contrariul la Anthurium andreanum, la care, reducerea concentraiei de NH
4
NO
3
determin
creterea numrului de lstari adventivi formai din calus.
- curentul electric 1-2 A stimuleaz organogeneza din calus la Nicotiana tabacum.
171
Tabelul 7.2.1.
Cercetri privind organogeneza adventiv de rdcini la plantele legumicole
Denumirea speciei Explant iniial Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5)IBA+(0,12)BAP Hussey&Falavigna
1980
Calus Dunstan&Short
(1977a)BDS
5,5 30 8 (0,05-2)ANA+(2-8)2iP Dunstan&Short
1977b
Allium cepa
Fragmente
rdcini
White (1937a) - 20 lichid White (1938a)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 7 (0,09) ANA + (0,11)Kin Chin (1982)
Lstari Gorter (1965) - 40 20 Gorter (1965)
Lstari Murashige et al (1972 b) 5,7 25 6 (0,3) ANA + (0,1) Kin +
(40) AdS
Murashige et
al.(1972b)
Lstari Pelletier et al. (1972) To - 20 5 Pelletier et al (1972)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
- 30 agar (0,1) AIA Steward&Mapes(19
71b)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 7 (0,05-0,1)ANA+(0-
0,05)Kin
Yang & Clore
(1973)
Lstari Murashige&Skoog (1962) 5,7 30 7 (0,01-0,1) ANA Yang&Clore(1974a,b)
Asparagus
officinalis
Lstari Yang (1977) 5,7 30 7 (0,1)ANA Yang (1977)
Brassica alba Lstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar AIA Leelavahti et al(1984)
Calus sub lumin
roie
Gamborg et al (1968) B5 5,5 20 agar (2) ANA + (0,5)BAP Tejovathi & Anwar
(1984)
Lstari De Fossard et al (1974a)
H-ZH
5,5 41,1 8 Concentraie ridicat de
IBA
Trimboli et al (1977)
Brassica oleracea
botrytis
Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 lichid (8) AIA + (0-0,25) Kin Walkey & Woolfitt
(1970)
172
Tabelul 7.2.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Brassica oleracea
capitata
Lstari Shahin (1985) TM-4 5,8 10 7 Lillo & Shahin
(1986)
Brassica oleracea
gemmifera
Lstari Gamborg et al (1968) B5 - 20 8 Ockendon (1984,
1985)
Capsicum annuum Muguri Phillips & Hubstenb (1984,
1985)
5,8 30 glucoz 8 (0,05) AIA + (0,05) BAP Phillips & Hubstenb
(1984, 1985)
Cichorium intybus Fragmente rdcini
cilindrice (6/2mm)
Heller ANA, kin, GA
Vasseur i co.
(1986)
Cucumis melo Lstari Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 +/-(0,01-0,1)AIA sau ANA Moreno et al.(1984)
Hipocotil Jelaska et al. (1985) 30 9 (1-32) AIA Jelaska et al. (1985) Cucurbita pepo
Lstari Tran Than Van (1973) 5,8 30 10 (8)AIA Pink & Walkey
(1984)
Fragmente
rdcini
Bonner (1940b)C 20/40 lichid Bonner (1940b)
Calus Halperin (1966)B 5,6 20 lichid Halperin (1966)
Daucus carota
Lstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 10 (0,1)AIA Smith&Murashige(1970)
Lstari Elliot(1969)M-S 5,8 30 agar (1)ANA Elliot(1969)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (1)BAP sau
[(1)AIA+(1)Kin]
Litz&Conover(1978
b)
Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,1)BAP Carswell&Locy(1984)
Ipomoea batatas
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (1)ANA+(0,1)BAP Carswell&Locy
(1984)
Lstari Kartha et al.(1974a) 5,8 30 8 Bloksberg&Saltveit
(1985)
Lstari adventivi Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 Brown et al (1986)
Lstari Shepard (1982)T 5,6 58,2 5 (40)AdS Engler & Grogan
(1983)
Lactuca sativa
Lstari Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (1)IBA Koevary et al (1978)
173
Tabelul 7.2.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari Yang&Chang(1979) 5,7 30 2 gelrite Ammati et al.(1984)
Fragmente
rdcini
Boll&Street(1951) 20 lichid Boll&Street(1951)
Fragmente
rdcini
Bonner&Devirian
(1939) C
20 lichid Bonner&Devirian
(1939)
Lstari 0.5xMurashige&Skoog
(1962)
5,8 3 vermiculit (0,01)ANA Cassells (1979)
Fragmente
rdcini
Sheat et al. (1959)B 30 7,5 Chin et al. (1981)
Hipocotil Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 agar (2)Kin Gunay&Rao (1980)
Lstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,5)AIA Gunay&Rao (1980)
Fragmente de
frunze
Pence & Caruso (1984) - 30 8 (17,5) AIA/ (25) IA, Ala/
(23,4) IA, Gly
Pence & Caruso
(1984)
Lycopersicon
esculentum
Fragmente de
rdcini
White (1937 a) - 20 lichid White (1937)
Fragmente de
rdcini
Bonner & Addicott (1937) 1
sau 2
- 40 lichid Bonner & Addicott
(1937)
Fragmente de
rdcini
Bonner & Devirian
(1939) A
- 40 lichid Bonner & Devirian
(1939)
Fragmente de
rdcini
Robbins (1922 a) - 20 glucoz lichid Robbins (1922 a)
Pisum sativum
Fragm. rdcini Torrey (1956) 6-6,4 40 lichid (1,75) AIA + (42) Ad Torrey (1956)
Fragmente de
rdcini
Bonner & Devirian
(1939) A
- 40 lichid Bonner & Devirian
(1939)
Fragmente de
rdcini
White (1937 a) - 20 lichid - White (1938 a)
Raphanus sativus
Fragmente de
rdcini
White (1943 a) B - 20 lichid - White (1943 a)
174
Tabelul 7.2.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Solanum
melongena
Fragmente de
hipocotil
Matsuoka& Hinata
(1979)
5,5 20 8 (0,016)ANA + (10)AdS Matsuoka& Hinata
(1979)
Lstari Ratnamba & Chopra
(1974)
5,8 30 agar Bragdo Aas (1977)
Lstari Murashige & Skoog (1962)
Supl
5,8 10 lichid (0,1) AIA Goodwin et al (1980
b)
Solanum tuberosum
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,7 20 7 (1) IBA Marani & Pisi
(1977)


Tabelul 7.2.2.
Cercetri privind organogeneza adventiv de rdcini la plantele floricole
Denumirea speciei Explant iniial Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Amaryllis sp, Lstari White (1943 a) A 10 agar Bapat &
Narayanaswamy
(1976)
Anthurium
andraeanum
Calus Pierik et al (1974) 40 agar (0,23) BAP Fersing & Lutz
(1977)
Lstari Pierik et al (1974) 10 agar (0,002 0,02) 2,4-D Fersing & Lutz
(1977)
Anthurium
scherzerianum
Lstari Pierik et al (1974) 30 7 (0,1) AIA Pierik & Steegmas
(1976 a)
Antirrhinum majus Lstari Bourgin & Nitsch (1967) 5,5 10 8 Pfister & Widholm
(1984)
Begonia
semperflorens
Frunze Bourgin & Nitsch (1967)
H
5,8 20 7 (0,18)AIA sau (0,2)
IBA sau (0,19) ANA
Thakur (1973)
175
Tabelul 7.2.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Caladium bicolor Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (1) ANA +(1) BAP Sahavacharin (1982)
Camellia japonica Lstari Samartin et al ( 1984) 2 5,5 30 6 Samartin et al (1984)
Cattleya sp, Protocorm Knudson (1946) C 20 agar Lindemann et al
(1970)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 10 (0,205) ANA Wambugu &
Rangan (1981)
Chrysanthemum sp,
Lstari Linsmaier&Skoog (1965) 30 5 (0,02) ANA Bush et al (1975)
Coleus blumei Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 10 (0,1)AIA Smith & Murashige
(1970)
Colocasia
esculenta
Lstari Abo El Nil & Zettler
(1976) A Z
5,8 20 6 (1,9) ANA + (0,09) 2iP Abo El Nil &
Zettler (1976)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 6 Evaldsson &
Welander (1985)
Cordyline
terminalis
Lstari Kunisaki (1975) 5,8 30 9 Kunisaki (1975)
Lstari Ball & Arditti (1976) S 5,8 30 13 (0,1) AIA Ball&Arditti (1976) Dendrobium sp,
Protocorm Morell (1974)B 5,5 20 8 (1) ANA Morell (1974)
Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,7 30 6 Earle & Langhans
(1975)
Calus Engvild (1972) 30 10 Engvild (1972)
Lstari Gukasyan et al (1977) 0,2 7 (1)ANA Gukasyan et al (1977)
Lstari Vieitez&Vieitez (1980 b) 5,8 30 7 Leshem (1986)
Lstari Petru & Landa (1974) A 30 Petru&Landa (1974) A
Lstari Petru & Landa (1974) A 20 (0,4) AIA + (5) Ad Petru & Landa (1974) A
Dianthus
caryophyllus
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (0,1) AIA Roest & Bokelmann
(1981)
Dracaena fragrans Internod Linsmaier&Skoo(1965) 30 6 (1) 2,4-D + (0,3) BAP Hunault (1976)
Dracaena
gosetfiana
Lstari Miller & Murahige
(1976) II
5 30 0 (10) AIA Miller & Murashige
(1976)

176
Tabelul 7.2.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Dracaena
marginata
Lstari Murahige & Skoog
(1962)
6 30 8 (1) ANA + 15% CM Choa et al (1981)
Ficus benjamina Lstari Miller & Murahige
(1976) II
5,8 30 Agar Makino et al (1977)
Lstari Debelgh & De Waiel
(1977) Roots
5,8 20 6 Debelgh & De
Waiel (1977)
Ficus lyrata
Lstari Gamborg et al, (1968)
B5
5 30 0 Stevenson&Harris
(1980)
Lstari Extra Vitrum Economou &
Spanoudaki (1985)
Gardenia
jasminoides
Lstari 0,25xMurashige &
Skoog (19620
5,8 20 8 Beyl & Sharma
(1983)
Lstari Murashige et al (1974) 5,7 45 10 (10)AIA Murashige&al (1974)
Lstari Pierik & Woets (1971)A 30 6 (1)AIA Pierik et al (1973)
Lstari Pierik et al (1975) 30 6 (10)AIA Pierik et al (1975)
Gerbera jamesonii
Lstari Sitbon (1981)1 5,7 45 8 (1)IBA Sitbon (1981)
Hyacinthus
orientalis
Bulbili Kim et al (1981) 5,7 30 8 (0,1)ANA Kim et al (1981)
Iris sp, Calus Meyer et al (1975) 5,8 30 6 Meyer et al (1975)
Mammillaria
carmenae
Lstari Vyskot & Bezdek
(1984)1 sau 2
5,5 30 agar (1)ANA Vyskot &Jara (1984)
Mammillaria
elongata
Tuberculi Johnson & Emino (1979) 5,6 45 10 (60)[ANA sai IBA] + (1-
2) (Kin sau 2iP)
Johnson & Emino
(1979)
Mammillaria
prolifera
Lstari Vyskot & Bezdek
(1984)1 sau 2
5,5 30 agar (1)AIA Vyskot &Jara (1984)
Monstera deliciosa Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,7 30 8 (2)AiA Fonnesbech &
Fonnesbech (1980)
177
Tabelul 7.2.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Narcissus sp, Lstari 0,5xMurashige & Skoog
(1962)
5,4-5,6 15 6 Seabrook et al (1976)
Nephrolepsis
cordifolia
Calus Steeves et al (1955)2 20 agar Sulklyan & Mehra
(1977)
Nephrolepsis falcata Lstari Miller & Murashige
(1976)III
30 8 Beck & Caponetti
(1983)
Oncidium lanceanum Protocorm Lim-Ho (1982) VW 20 10 7,5% CM Lim-Ho (1982)
Oncidium varicosum Lstari Dalla Rosa & Laneri
(1977) KO7
5,5 20 8 Kerbauy (1984b)
Lstari Linsmaier& Skoog (1965) 5,7-5,8 30 5 Daykin et al (1976)
Lstari Sangwan & Norreel (1975) 5,6 20 agar (0,1)ANA Sangwan & Norreel
(1975)
Petunia hybrida
Lstari Sharma & Mitra (1976) R 10 agar (0,5-1)AIA Sharma Mitra (1976)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 6 Cassells & Plunkett
(1984)
Lstari Cooke (1977) 5,7 30 9 Cooke (1977)
Lstari Grunewaldt (1976) 5,8 30 8 (2)AIA Grunewaldt (1976)
Lstari Harney & Knap (1979) 15 6 Harney&Knap (1979)
Saintpaulia ionantha
Lstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 Weatherhead et al (1982)
Sansevieria
trifasciata
Lstari Murashige&Skoog (1962) 6,3 20 8 (1)IBA Blazich & Novitzky (1984)
Lstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (0,5)IBA +(0,5)GA3 Kothari & Chandra (1984a)
Fragmente frunze Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (1)AIA + (1)Kin Kothari & Chandra
(1984a)
Tagetes erecta
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 0 (0,5)IBA + (0,5)GA3 Kothari & Chandra
(1984b)

178
Tabelul 7.2.3.
Cercetri privind organogeneza adventiv de rdcini la plantele pomicole
Denumirea
speciei
Explant Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente lstari 0,5 x Murashige &
Skoog (1962)
10 agar Kwei et al (1980) Actinidia deliciosa
Lstari Extra vitrum Monette (1986 a)
Lstari 0,25 x Hisajima (1982
a)
5,5 30 6 (1) IBA Hisajima (1982 a) Amygdalus
communis
lstari Ruginii & Verma
(1982) R
5,8 30 Verm (0,1) ANA + (0,7) BAP Ruginii & Verma
(1982;1983)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
30 0
(agar)
(0,18)ANA+ (0,4)IBA Matheus & Rangan
(1979)
Lstari Ranga Swamy (1961)I 30 agar (0,05)ANA+(0,4)IBA+(
2)Kin
Matheus & Rangan
(1981)
Ananas comosus
Lstari 0,5xMurashige &
Skoog (1962)
30 agar Zepeda & Sagawa
(1981)
Lstari 0,13 x
Murashige&Skoog(196
2)
5,7 3, 5-6 (0,1-2)ANA Skirvin et al,(1980) Armeniaca
vulgaris
Lstari Snir & Erez (1980)R 5,3 20 7 (0,5)ANA Snir (1984)
Castanea
mollissima
Lstari Yang et al, (1986) 5,5 20 6,5 Yang et al,(1986)
Lstari 0,5 x Rodriguez
(1982b) K(h)
5,5 30 6 (1)IBA Rodriguez (1982c)
Lstari Vieitez et al
(!983)MS(N/2)/2
30 6 (0,5-1)BAP San Jose et al
(1984)
Castanea sativa
Lstari Vieitez &
Vieitez(1980a) 2
5,5 30 6 (1)IBA Vieitez &
Vieitez(1980a)
179
Tabelul 7.2.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,3 30 0 (1)ANA+[(1)IBA sau
(1)ABA]
Feucht & Dausend
(1976)
Cerasus avium
Lstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(0,1)GA3 Seirlis et al, (1979)
Lstari 0,13xMurashige&Skoog
(1962)
5,7 30 5-6 (0,1-2ANA) Skirvin et al,(1980) Cerasus vulgaris
Lstari Skirvin et al, (1981)
MS-H2
5,7 20 6 (3)IBA+(1)ANA+
(0,04)Kin+(0,01)BAP+(
0,1)GA3
Skirvin et al,
(1981b)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (0,15)ANA+(0,5)IBA Muriithi et al,
(1982)
Ficus carica
Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,2 30 7 (1)IBA+(0,1)GA3+
(89)PG
Pontikis & Melas
(1986)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,6 30 7 (0,4-1)IBA Anderson et al,
(1982)
Fragaria
Lstari Boxus (1974a) 5,6 22 glucoz 7 Boxus et al, (1974)
Glossularia
redinata
Lstari Welander (1985a) 5,5 30 6 Welander (1985a)
Lstari 0,5 x Chalupa (1981a)A 5-10 6 (0,3)ANA+(0,3)IBA Chalupa (1981a) Juglans regia
Cotiledon 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 (7,4)ANA+[(0,45)BAP
sau (0,43)Kin]
Rodriguez (1982a)
Lstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (03)IBA+(0,1)GA3+
(162)PG apoi (0,1)GA3
Jones et al (1979)
Lstari Murashige&Skoog (1962) 5,3 20 7 (1,9)ANA Lane (1979)
Lstari Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (0,03-0,3)AIA+
(0,01)ANA
Liu et al (1983a)
Calus din smn,
cotiledon sau frunz
White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin
+(1)GA3 + 15% CM
Mehra & Sachdeva
(1979)
Lstari Snir & Erez (1980) 5,8 20 7 (1)IBA Snir & Erez (1980)
Malus x domestica
Lstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,2 15 0 (0,3)IBA Nieuwkirk&al(1986)
180
Tabelul 7.2.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Mangifera indica Cotiledon Murashige & Skoog
(1962)
40 agar (5)ANA+(2,5)Kin
+15%CM
Rao et al, (1982)
Morus alba Frunze, peiol,
lstari
Lakshmi-Sita et al
(1976)
5,6 30 8 (0,1)ANA Oka & Ohyama
(1981)
Lstari Krikorian & Cronauer
(1984)
5,8 41 0 (1)ANA+10%CM Cronauer &
Krikorian (1985a)
Lstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 7 (1)ANA + 10% CM Cronauer &
Krikorian (1985b)
Musa acuminata
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 20 8 (5)IBA Dore Swamy et al
(1983)
Lstari Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (1)ANA, AIA sau IBA Cronauer &
Krikorian (1984)
Calus Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6 30 3 Jarret et al (1985b)
Musa spp,
Lstari Wong (1986) 5,7 20 7 (5)BAP Wong (1986)
Musa textilis Lstari Mante & Tepper (1983)
I
5,7 30 5-8 (0,1-1)ANA sau
(2-10)IBA
Mante & Tepper
(1983)
Olea europaea Lstari Colomas (1971) 5,8 30 6 (2-4)ANA Rugini&Fontanazza
(1981)
Lstari Miller et al (1982)A 20 8 (0,1)ANA Miller et al (1982)
Lstari 0,13xMurashige &
Skoog (1962)
5,7 30 5-6 (0,1-2)ANA Skirvin et al (1980)
Persica vulgaris
Lstari Skirvin et al (1981)
MS-H
5,7 20 6 (3)IBA+(1)ANA+
(0,1)GA3+(0,04)Kin
1+(0,01)BAP
Skirvin et al (1981)
Plantule Thompson & Gordon
(1977)
5,6-5,8 30 8 (0,1)ANA Tisserat (1982) Phoenix
dactylifera
Lstari Tisserat (1984a) 5,6-5,8 30 8 (0,1)ANA Tisserat (1984a)
181
Tabelul 7.2.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 0 7 Barghchi&Alderson
(1983)
Pistacia vera
Lstari Pierik et al (1974) 30 7 (2,5)IBA Barghchi&Alderson
(1985)
Lstari 0,5 x Murashige &
Skoog (1962)
5,7-
5,8
30 7 (2)IBA Garland&Stoltz
(1981)
Lstari 0,5 x Kim et al, (1981) 5,8 20 agar [(2,5)AIA+(0,1)GA3]
sau (5)AIA
Hammerschlag
(1982b)
Prunus cerasifera
Lstari Linsmaier&Skoog
(1965)
5,8 30 7 (0,5-2,5)IBA Norton & Boe
(1982)
Fragmente lstari
(7-12 mm)
Pietropaolo & Reisch
(1984)
5,8 30 7 (0,5-2,5)IBA/5 spt
sau
(2-6,1)IBA/3 spt
Pietropaolo &
Reisch (1984)
Prunus domestica
Lstari 0,13 x
Murashige&Skoog
(1962)
5,7 30 5,6 (0,1-2)ANA Skirvin et al (1980)
Prunus insititia Lstari Jones et al, (1977) 5,2 30 7 (3)IBA+(0,1)GA3
+(162)PG
Jones & Hopgood
(1979)
Pyrus communis Lstari Lane (1979b) 5,2 30 7 Auxina Lane (1979b)
Fragmente lstari Jones &Vine (1968)B 5,6-
5,8
40 glucoza 0 (1)IBA+(0,2)BAP
+(1)GA3
Jones &Vine (1968) Ribes nigrum
Calus Harvey (1967)Basal 6 30 10 (1)AIA+(1)Kin Harvey&Grasham (1977)
Lstari Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,1)IBA Anderson (1979)
Lstari Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (1)IBA Borgman & Mudge
(1986)
Fragmente
rdcini
Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,5)IBA+(80)AdS Borgman & Mudge
(1986)
Lstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 0 (0,5)BAP Donnelly et al, (1980)
Rubus idaeus
Lstari Hedtrich(1979)B 5,7 20 0 (0,5)AIA Gebhardt(1985)
182
Tabelul 7.2.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari (7-15
mm)
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6-
5,8
30 7 (1)IBA Broome &
Zimmerman (1978)
Rubus sp,
Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6-
5,8
30 0 (0,5)IBA Donnely et al
(1986)
Fragmente
frunze
Hall & Collin (1975) 5,7 30 10 (2)AIA+(0,1)Kin
+10%CM
Pence&Janick
(1978)
Theobroma cacao
Lstari Passey & Jones (1983) 5,2 30 7 (0,5)IBA+(0,5)ANA
+(162)PG
Passey & Jones
(1983)
Lstari Extra vitrum Cohen &
Elliot(1979)
Vaccinium
corymbosum
Lstari Extra vitrum Wolfe et al
(1983;1986)
Lstari Extra vitrum Zimmerman&Broo
me (1980)
Vaccinium sp,
Lstari Extra vitrum Smagula & Lyrene
(1984)

183
Tabelul 7.2.4.
Cercetri privind organogeneza adventiv de rdcini la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Rezultatul Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari Simola (1985)N7 5,6 20 6 Simola (1985)
Lstari Srivastava&Steinhauer
(1981b)MMS
5,8 40 6 (2)AIA + (6)Kin +
(40)Ad
Srivastava&Steinha
uer (1981b)
Betula pendula
Calus+ lstari Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (1)ANA Srivastava&al (1985)
Lstari Chalupa (1981b) 2 15 6 (0,1)IBA sau (0,1)ANA Chalupa (1981b) Betula verrucosa
Calus Jacquiot (1955) 30 agar (1)ANA Jacquiot (1955)
Biota orientalis
(thuja)
Lstari Thomas & Tranvan
(1982)
5,4 30 8 (0,1) IBA + (1,1)BAP Thomas & Tranvan
(1982)
Chaenomeles
japonica
Lstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (10-20)IBA Norton & Boe (1982)
Cotoneaster
dammeri
Lstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (1-5)IBA Norton & Boe (1982)
Crataegus
rachyacantha
Lstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (0,5-5)IBA Norton & Boe (1982)
Crataegus cv, TOBA Lstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (5-10)IBA Norton & Boe (1982)
Fraxinus
americana
Lstari Lloyd & McCown
(1981) WPM
5,2 20 6 nespecificat Heiman & Preece
(1983)
Fraxinus
pennsylvanica
Lstari Lloyd & McCown
(1981) WPM
5,2 20 6 nespecificat Heiman & Preece
(1983)
Lstari Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (1)ANA Banks et al, (1979) Hedera helix
Lstari Banks(1979) 1, 5,7 30 5 (1)ANA Banks (1979)
Hydrangea
macrophylla
Lstari
2-3cm
0,5 x Murashige&Skoog
(1962)
5,7-
5,8
20 7

Stoltz (1984)
184
Tabelul 7.2.4. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lavandula
augustifolia & sp,
Lstari Kartha et al, (1974a) 5,5 20 lichid (5)AIA + (0,5)BAP +
(5)GA3
Quazi (1980)
Lstari Ben-Jaacov & Dax (1981) 5,6 30 agar (0,5-1)IBA Burger et al (1985) Paulownia
tomentosa Lstari Murashige & Skoog
(1962)
30 8 (1)IBA Marcortriginiano &
Stimart (1983)
Picea abies Lstari 0,5 x Linsmaier &
Skoog (1965)
5,6 5 7 (0,02) ANA Chalupa (1977)
Pinus sylvestris Lstari Bornman & Janson
(1980)
5,6-
5,8
50,5 6-7 (1,46) Cumarina Bornman & Janson
(1980)
Pseudiotsuga
menziesii
Lstari 0,5 x Linsmaier &
Skoog (1965)
5,6 5 7 (0,02) ANA Chalupa (1977)
Pyracantha
coccinea
Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 7 (5-10) IBA Norton & Boe
(1982)
Lstari Chalupa (1984 a,b)
WPMR
10 6 (0,1) ANA + (0,3) IBA Chalupa (1984a) Quercus robur
Fragmente lstari Vieitez et al (1985) H +
SO4
30 6 Vieitez et al (1985)
Lstari Extra Vitrum Economou & Read
(1984)
Rhododendron spp
Lstari Kyte & Briggs (1979) R 30 6 Kyte & Briggs
(1979)
Lstari Hasegawa (1979) 5,7 60 6 (1) AIA Bressan et al (1982)
Lstari Hyndman et al (1982a, b) 5,7 70 8 Hyndman et al (1982 a, b)
Rosa hybrida
Lstari 0,25 x Skirvin & Chu
(1979 a)
5,7 30 10 Skirvin & Chu
(1979 a)
Rosa sp, Lstari Murashige & Skoog
(1962)
40 6 +/- (0,05-0,1) ANA Davies (1980)
Salix madsudana Lstari Whitehed & Giles
(1976)
5,8 20 agar (0,2) ANA Bhojwani (1980)
185
Tabelul 7.2.4. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Thuja plicata Lstari Coleman & Thorpe
(1977) S
5,2 30 agar (10) IBA Coleman & Thorpe
(1977)
Tilia cordata Lstari Chalupa (1984 a,b)
BTMRsau WPMR
10 6 (0,1) ANA + (0,3) IBA Chalupa (1984 a, b)
Weigela florida Lstari Murashige&Skoog(1962) 30 agar (0,88) AIA Calvert&Stephens(1986)

]
Tabelul 7.2.5.
Cercetri privind organogeneza adventiv de rdcini la via de vie
Denumirea
speciei
Explant Rezultat Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de
cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis berlandieri
x V. cardinalis
Fragmente
lstari
Plantule
nrdcinate
0.5 x Murashige &
Skoog (1962)
5,8 20 7 (0.02)IBA sau ANA Novak&Jujova
(1983)
Vitis riparia x V.
rupestris
Rdcini
adventive
Favre (1977) P7 5,8 20 (20)AIA
+(0.1)BAP
Favre (1977)
Vitis rupestris
Internod,
frunze, petiol
Lstar Lstar nrdcinat Gazly (1964) 6,5 15 8 (0.02)ANA Gazly (1972)
Vitis spp Fragmente lstari Lstari nrdcinai Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0.02)ANA Chee&Pool (1982a,b)
Vitis vinifera Apexuri lstari nrdcinare
lstari
Webb & Street
(1977)CI
30 agar (0.023)BAP Aldwinckle &
Buturac (1981)
Vitis vinifera Apexuri lstari Lstari nrdcinai White (1943a)A 5,8 30 0 (2.2)BAP Barlass et al (1982)
Vitis vinifera Apexuri lstari nrdcinare Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8 20 3-5,5 (0.23)BAP Jona & Webb (1979)
Vitis vinifera Meristeme Lstar unic,
nrdcinat
Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8 20 3-5,5 (0.023-0.23)BAP Jona & Webb (1979)
Vitis vinifera Apexuri lstari nrdcinare Stevenson & Monette
(1983)R
5 30 0 (0.1)AIA Stevenson &
Monette (1983)


186
Capitolul 8
Embriogeneza somatic

8.1. Formarea embrionilor somatici
Embriogeneza somatic a fost realizat pentru prima dat n 1958 de Reinert i
Steward la morcov, din calus i suspensie de celule. Tot ei au realizat o paralel ntre
formarea embrionilor zigotici i a celor somatici fapt uurat de folosirea laptelui de cocos
n mediul de cultur.
i ali reprezentani din Fam. Umbeliferae produc uor embrioni somatici (Thomas
i colab. 1979, elin). Formarea embrionilor somatici parcurge mai multe etape:
- dediferenierea celulelor difereniate i nceperea diviziunii;
- formarea celulelor parenchimatice, nceperea diviziunii i creterea coninutului
de citoplasm sub influena auxinelor. n urma acestor procese, celulele parenchimatice se
transform n celule embriogenice. Acestea sunt mici, cu coninut citoplasmatic dens,
vacuol mic, nuclei mari cu nucleoli mari, coninut mare de grunciori de amidon. Au
activitate metabolic intens i o sintez intens de ARN;
- formarea embrionilor din celule embriogenice n absena auxinelor din mediu.
Formarea embrionilor somatici se poate face n interiorul calusului, (endogen) sau
la exteriorul acestuia (exogen). Embrionii somatici se mai pot forma n esutul nucelar i
hipocotil, sau pe organe florale, antere, grunciori de polen, enndosperm, embrioni
zigotici.
Embrionii somatic se formeaz dintr-o singur celul care se divide i formeaz o
structur embrioid.
Embriogeneza somatic a fost realizat la 132 de specii din 81 de genuri din
familiile: Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbeliferae. Graminae etc. (Tisserat,
colab., 1979, citai de Pierik, 1987).


187
8.2. Embriogeneza somatic direct
Embriogeneza direct reprezint formarea embrionilor somatici sau a esuturilor
embrionare direct din explantul iniial. Embrionii somatici se pot forma din celule
somatice, din celule nucelare la Citrus, din celule epidermice, din hipocotil de morcov,
Ranunculus, Brassica napus.
Pentru inducerea i studierea embriogenezei somatice, cel mai adesea se recurge la
culturi de embrioni zigotici imaturi. esutul acestora are un pronunat caracter
embriogenic. Momentul oprim pentru izolarea embrionilor i inocularea lor in vitro este la
aproximativ 14 zile dup polenizare.
Mediile de cultur folosite conin cantiti variabile de auxine, n special 2,4 C i
ANA.
Dup sterilizarea de suprafa se face excizarea embrionului imatur i inocularea lui
pe mediu. Dup aproximativ o sptmn, la o parte dintre explante ncep s se
diferenieze embrioni somatici n diferite stadii de dezvoltare. Fazele de evoluie ale
embrionilor somatici sunt: globular, cordiform, de torpil i cotiledonar (forma de
ru). De remarcat dezvoltarea asincron a embrionilor, fapt care determin suprapunerea
diferitelor faze de evoluie. Acest lucru ngreuneaz mult orice tentativ de automatizare a
culturilor i sporete cheltuielile cu manopera.

8.3. Embriogeneza somatic indirect
Regenerarea unor embrioni somatici din calus poart denumirea de embriogenez
indirect. Dup obinerea i multiplicarea calusului (subcapitolul 11.1.) acesta este trecut
pe un mediu pe care se realizeaz inducia i formarea embrionilor somatici. Dup
realizarea induciei are loc formarea celulelor embriogenice care vor da natere
embrionilor somatici.
Capacitatea de regenerare depinde de specie, felul explantului iniial (floem
secundar la morcov, fragmente de frunze la cafea, kiwi, Petunia, Asparagus, cotiledoane,
embrioni zigotici la conifere, citrice), vrsta explantului iniial (gradul de juvenilizare),
numrul de subculturi, etc. Unele specii regenereaz numai organe i embrioni somatici.
Inducia embrionilor somatici este condiionat de un numr nsemnat de factori:
- concentraia ridicat de auxine i n special 2,4 D, determin inducia embrionilor
somatici;

188
- acidul abscisic stimuleaz formarea embrionilor somatici n culturile de calus i
suspensii celulare;
- giberelinele i etilena inhib procesele de inducie;
- ansa formrii embrionilor somatici crete la esuturile juvenile. La speciile
aparinnd genului Citrus, acetia se formeaz numai n nucel;
- azotul redus sub form de ioni de amoniu, potasiul i concentraia ridicat de
sruri stimuleaz formarea celulelor embriogenice n masa calusului; n acelai timp, ionii
de calciu influeneaz negativ acest proces;
- lumina este un factor stimulator al embriogenezei somatice cu toate c, anumite
specii reacioneaz mai bine la ntuneric;
- temperatura ridicat stimuleaz formarea embrionilor somatici. Atunci cnd
materialul iniial este reprezentat de antere, acesta necesit la nceput un oc cu temperaturi
sczute.
- concentraia de zaharoz de 2-3% i prezena laptelui de cocos au un efect pozitiv
asupra induciei procesului de embriogenez somatic.
Embriogeneza somatic indirect rmne o tehnic mai puin folosit n practic
datorit unor neajunsuri pe care le prezint:
- materialul genetic este relativ instabil n timpul proceselor de embriogenez, iar
riscul apariiei mutaiilor face ca metoda s nu fie recomandat la nmulirea materialului
clonal;
- este o metod dificil pentru c multe specii nu formeaz embrioni somatici;
- prin culturi repetate scade capacitatea de regenerare a calusului;
- frecvent formarea embrionilor somatici este asociat cu apariia fenomenului de
dormans care face dificil sau imposibil pornirea acestora n vegetaie i regenerarea
unor plante ntregi;
- formarea scalar a embrionilor face ca procesul s fie destul de greu de gestionat.
n tabelele 8.1., 8.2., 8.3. i 8.4. sunt prezentate principalele realizri n domeniul
embriogenezei somatice la plantele horticole.

189
Tabelul 8.1.
Cercetri privind embriogeneza somatic la plantele legumicole
Denumirea speciei Explant iniial Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Calus Murashige&Skoog
(1962)
- 30 lichid Al-Abta&Collin
(1978)
Calus Murashige&Skoog
(1962)
5,6 30 10 (0,1)ANA+(3)Kin Chen (1976)
Peiol Murashige&Skoog
(1962)
- 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Williams&Collin
(1976)&
Apium graveolens
Calus Murashige&Skoog
(1962)
- 30 lichid (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Williams&Collin
(1976)&
Calus Nitsch et al. (1969a) - 30 6 Bui Dang Ha et al.
(1975)
Calus Murashige & Skoog
(1962)
- 30 lichid (5) ANA Steward & Mapes
(1971 b)
Asparagus
officinalis
Celule din cultura
n suspensie
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 8 (0,01) 2,4-D + (0,1) Kin Wilmar &
Hellendoorn (1968)
Brassica alba Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 agar (0,1)ANA+(0,1) 2,4-D Leelavahti et al
(1984)
Frunze tinere Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 agar (1) AIA + (0,5)Kin Pareek & Chandra
(1978 a)
Brassica oleracea
botrytis
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 agar (0,01-0,1)AIA +(0,5)Kin Pareek & Chandra
(1978 a)
Segmente de
nervur foliar (2
mm gros)
Murashige&Skoog (1962)
Gamborg & co. (1968)

Kin, BA, AIA, ANA,
2,4-D, picloram
Mix (1985)
Cichorium intybus
Fragmente rdcini
5x5x5 mm
Murashige i Skoog
(1962)
BA, 2,4-D, 2,4,5-T Van Dick (1986)

190
Tabelul 8.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Cucumis melo Hipocotil Reynolds et al (1980) 5,7 40 glucoza 8 (0,5)2,4-D+(0,5)2,4,5-
T+(0,5)NOA+(0,5)IBA+
(0,5)2,4,5-TP+
(0,5)CPA+(0,5)pic+
(0,5)MCPP+(0,1)CCC+
(30)Ad
Blackmon et
al.(1981b)
Cucumis sativus Calus Lazarte&Sasser (1982)L 0 agar +/-(1)Kin Lazarte&Sasser(1982)
Cucurbita pepo Fragmente
hipocotil
Murashige & Skoog
(1962)
30 glucoza 9 (10)IBA apoi (1)IBA in
urmatoarele subculturi
Jaleska (1974)
Suspensie Eriksson(1965)1. 5,8 40 lichid (0,9)ANA+(0,02 )Kin Fridborg et al.(1978)
Calus Halperin&Wetherell
(1965)B
20 agar (0,0005)2,4-D
+(0,001)Kin
Halperin&Wetherell
(1965)
Segmente peiol Halperin (1964) 6 20 agar (0,1)2,4-D+(2)Ad Halperin (1964)
Daucus carota
calus Gamborg et al.(1968)B5 lichid Hari (1980)
Fragmente
rdcin
Skirvin&Chu(1979a) 5,8 30 10 (0,1)ANA+(2)BAP Hwang et al.(1980) Ipomoea batatus
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,6-
5,8
30 7 (0,1-3)2,4-D-depinzand
de genotip
Jarret et al. (1984)
Lycopersicon
esculentum
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 20 8 (0,5) AIA + (0,25) Z Zamir et all (1980;
1981)
Petroselinum
hortense
Calus Murashige&Skoog
(1962)
- 30 10 (10) AIA + (0,04) Kin + (15-
20) AdS
Vasil & Hildebrandt
(1966 b,c)
Pisum sativum Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 lichid (0,06) pic + (0,1) BAP Jacobsen & Kysely (1984)
Fragmente frunze Murashige&Skoog (1962) 30 agar (10) ANA Gleddie et al (1982)
Calus Murashige&Skoog (1962) 30 lichid (10) ANA Gleddie et al (1982)
Solanum
melongena
Fragmente
hipocotil
Matsuoka& Hinata
(1979)
5,5 20 8 (8)ANA + (10) AdS Matsuoka& Hinata
(1979)
Solanum
tuberosum
Fragmente
tuberculi
Lam (1975) 20 9 (0,4) AIA + (0,8) Kin +
(0,4) GA3
Lam (1975)

191
Tabelul 8.2.
Cercetri privind embriogeneza somatic la plantele pomicole
Denumirea
speciei
Explant Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Actinidia deliciosa Fragmente de
rdcini
Harada (1975) 5,5 20 7 [(0,1-1)2,4-D sau
NOA] + (40) Ad
Harada (1975)
Semine imature Litz et al (1984) 5,7 30 0 Litzet al, (1984b) Mangifera indica
Fructe imature Litz (1984a) 5,7 60 8 (1)2,4-D Litz(1984b)
Fragmente
lstari
Linsmaier&Skoog
(1965)
5,7 30 8 (10-100)2,4-D+(3)2iP
+(40)AdS
Tisserat et al (1979)
Muguri laterali Thompson & Gordon
(1977)
5,6-
5,8
30 8 (100)2,4-D+(3)2iP Tisserat (1982)
Phoenix
dactylifera
Calus Tisserat (1984a) 5,6-
5,8
30 8 Tisserat (1984a)

Tabelul 8.3.
Cercetri privind cultura embriogeneza somatic la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Explant iniial Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Hedera helix Calus Banks(1979) 2, 5,7 30 5 (1)ANA + (0,5)BAP Banks (1979)
Ilex aquifolium Embrioni Linsmaier&Skoog (1965) 5,6 40 10 Hu & Sussex (1972)
Larix decidua Calus Nagmani&Bonga (1985) 5,8 20 8 (2)BAP Nagmani&Bonga(1985)
Calus Von Arnold & Erikson
(1981) LPm
5,8 34,2 5 (2,2) 2,4-D + (1,1) BAP Hakman et al
(1985)
Picea abies
Embrioni maturi Von Arnold & Erikson
(1981) LPm
10 3
gelrite
(2,21) 2,4-D + (1,13)
BAP
Von Arnold &
Hakman (1986)
Quercus rubra Internod Murashige&Skoog(1962) 30 agar (5) ANA + (0,1) BAP Seckinger&al(1979)


192
Tabelul 8.4.
Cercetri privind embriogeneza somatic la via de vie
Denumirea
speciei
Explant Rezultatul Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de
cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis vinifera Calus Calus
embriogen
Mullins&Srinivasan
(1976)N
5.6 20 0 (1)NOA+(1.1)BAP Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Embrioizi Dezvoltare
embrioni
Mullins&Srinivasan
(1976)N
5.6 20 agar (1)2iP+(0.35)GA3 Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Embrioizi Plantul White (1954) 5.6 20 agar Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera x
Vitis rupestris
Calus 2500
embrioizi/flacon
Bourgin & Nitsch
(18670 H
20 0 Rajakeran &
Mullins (1979)
Vitis vinifera x
Vitis rupestris
Embrioizi 83% plante
haploide
Bourgin & Nitsch
(18670 H
20 agar (1.11)2,4-D +
(0.225)BAP
Rajakeran &
Mullins (1979)



193
8.4. Poliembrionia nucelar
O serie de specii din genul Citrus formeaz n mod natural, n aceeai smn, pe
lng embrionul zigotic i unul sau mai muli embrioni somatici. Aceti embrioni iau
natere din celule somatice (diploide ale esutului nucelar). esutul nucelar este un esut
juvenil caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare.
Prin cultivarea esutului nucelar in vitro i inducerea formrii calusului s-au obinut
un mare numr de embrioni somatici la genul Citrus (Rangaswamy, 1981).
Formarea embrionilor somatici prin embriogenez direct sau indirect a fost
posibil prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz i
colab. 1985).
ANA, citochinina i compuii compleci (lapte de cocos, extractul de drojdie de
mal) stimuleaz formarea embrionilor somatici.
Embriogeneza somatic din esut nucelar este prezent la mango (Mangifera
indica) i la alte specii pomicole tropicale. La fel ca n cazul genului Citrus, la speciile cu
tendin de poliembrionie in vivo capacitatea o de regenerare a embrionilor somatici in
vitro este mai ridicat dect la plantele monoembrionare.
Utilizarea poliembrioniei nucelare prezint o serie de avantaje: permite nmulirea
n mas rapid a speciilor monoembrionare; procesele de embriogenez somatic sunt
nsoite i de devirozarea materialului vegetal obinut; n paralel, se pot induce mutaii i se
pot seleciona mutantele utile; se realizeaz juvenilizarea materialului obinut.
n toate cazurile, folosirea pentru nmulire a embrionilor somatici care conserv
caracteristicile genetice ale plantelor mam, deschide mari perspective n domeniul
seminelor sintetice (Standardi, 1997).

8.5. ncapsularea materialului vegetal in vitro
8.5.1. Smna sintetic
Pentru utilizarea n producie a embrionilor somatici s-a imaginat i realizat
smna sintetic prin crearea unui endosperm artificial, care s protejeze i eventual s
hrneasc embrionul.
Folosirea embrionilor somatici presupune apelarea la dou sisteme pentru
meninerea viabilitii acestora:
- ncapsularea n substane speciale de tipul gelurilor care conin substane nutritive,
regulatori osmotici i eventual pesticide;

194
- semnatul embrionilor n flux lichid (fluid drilling) folosind sistemele puse la
punct pentru semnatul seminelor prencolite de legume sau flori.
Avantajele folosirii seminelor artificiale sunt multiple:
- permite obinerea i folosirea seminelor la specii care n mod normal nu produc
semine;
- elimin procedurile greoaie i costisitoare de obinere a seminelor hibride cu
toate avantajele care decurg de aici:
- se nltur liniile parentale meninute pentru hibridri;
- se elimin cercetrile pentru obinerea liniilor androsterile;
- se elimin polenizarea artificial an de an, hibrizii fiind meninui prin
nmulire vegetativ in vitro.
- permite obinerea de sporuri substaniale de recolt prin folosirea unor super-
genotipuri;
- aduce mari avantaje lucrrilor de ameliorare.
Folosirea pe scar larg a seminelor artificiale este limitat datorit unor greuti
care apar:
- seminele artificiale trebuie protejate mpotriva deshidratrii prin folosirea unor
nveliuri care s reziste pe timpul pstrrii, transportului i semnatului;
- pstrarea seminelor artificiale presupune folosirea unor substane chimice sau
ageni fizici care s menin embrionul n stare de repaus;
- n momentul semnatului trebuie gsite soluii pentru scoaterea embrionului din
repaus i nceperea dezvoltrii acestuia;
- procentul de plante viabile obinute este relativ redus datorit unor cauze multiple:
- embrionii au grade de dezvoltare diferit;
- pstrarea viabilitii embrionilor este diferit;
- crearea condiiilor optime pentru dezvoltarea embrionilor dup semnat
este greu de realizat.
- embrionul necesit i o protecie antipatogen realizabil prin nglobarea unor
substane pesticide. Efectul acesta trebuie s fie de scurt durat, pentru a nu mpiedica
ulterior procesele de micorizare.
Cea mai rspndit metod pentru ncapsularea embrionilor prin schimb ionic este
cea n care se folosete alginatul de sodiu.

195
Embrionii sunt scufundai n alginat de sodiu 2-4% apoi sunt trecui individual n
soluie de clorur de calciu 50 M, la pH 7. Dup 20-30 de minute, capsulele de alginat se
ntresc (0,5 - 2 kg/cm
2
) i pot fi manipulate.
Pstrarea se poate face n vase nchise ermetic la frigider la (3-6C) n condiii
aseptice.
Alginatul de calciu are avantajul c este ieftin, se gelific uor i nu este toxic.
Are ns i dezavantaje (Hoza, 1996).
- permeabilitate mare pentru elementele solubile;
- creterea rdcinilor lstarilor este mai lent;
- capsulele sunt lipicioase i se ngreuneaz manipularea i semnatul.

8.5.2. ncapsularea unor organe i esuturi in vitro
Ca o extindere a folosirii capsulelor de alginat s-a recurs la ncapsularea altor
organe, n afara de embrionii somatici.
Astfel, multiplele cercetri efectuate de Standardi, A., i colab., (1994-1998), au
dovedit c pot fi ncapsulai bulbili, obinui in vitro precum i minibutai sau rozete de
diferite dimensiuni provenite de la un mare numr de specii: crin, mr, zmeur, kiwi etc.
Dup nglobarea explantelor respective n alginat, acestea au fost pstrate n
frigidere la 3-4C timp ndelungat 6-12 luni, dup care s-au trecut din nou pe un mediu de
cretere i multiplicare.
Metoda vine s simplifice tehnologia conservrii materialului genetic in vitro i
aduce o serie de avantaje:
- se reduc substanial cheltuielile pentru pstrarea materialului vegetal in vitro;
- se face economie de spaiu i de mediu de cultur;
- se realizeaz economie de for de munc, energie etc.

196
Capitolul 9
Embriocultura in vitro la plantele horticole

Cultura embrionilor zigotici a aprut ca necesitate pentru rezolvarea unor probleme
aprute n procesul ameliorrii plantelor horticole.
n pomicultur, apare posibil cultivarea pe medii aseptice a unor embrioni imaturi
care provin prin ncruciri de la soiuri extratimpurii i timpurii de smburoase.
n mod natural, aceti embrioni nu ajung la maturitate datorit unor dereglri
fiziologice care apar n procesul de cretere al seminei i fructului (foto 9.1.).
n mod similar, n cazul unor hibridri interspecifice are loc avortarea embrionilor
naintea ajungerii lor la maturitate (Ion L. i colab., 1997).
La via de vie nu este posibil obinerea unor descendeni hibrizi atunci cnd se
folosete ca genitor matern un soi apiren, n acest caz, embrionul avortnd timpuriu.
Situaii oarecum similare se ntlnesc i la realizarea unor combinaii hibride sau
ncruciri ntre soiuri, specii sau genuri incompatibile la majoritatea speciilor horticole.
Prin extragerea embrionului abia format cu o poriune de esut nucelar, sau prin
cultivarea ovulului fecundat, se reuete depirea barierelor incompatibilitii.
Un alt caz particular este reprezentat de cultivarea embrionilor maturi. Metoda se
folosete pentru scurtarea procesului de ameliorare prin eliminarea perioadelor de repaus
relativ al seminelor.
Un avantaj important al embrioculturii este acela al nmulirii clonale pornind de la
seminele hibride ale unor plante anuale, legume i flori. Plecnd de la ideea c indivizii
regenerai ulterior vor pstra efectul heterozis al hibrizilor valoroi, se poate realiza apoi
nmulirea clonal in vitro. La Cichorium intybus L. s-a reuit iniierea unei culturi in vitro
cu un procent de 100% explante sntoase prin germinarea seminelor hibride (Diaconescu
O., 2002) (foto 9.2.).
De asemenea, n cazul unor combinaii hibride valoroase, se face nmulirea
materialului genetic nainte de realizarea seleciei, sau materialul hibrid este supus unor
procese de stres selecie in vitro nainte de a fi aclimatizat i trecut n cmp.


197

a b

c

d e

Foto 9.1. Fazele embrioculturii la hibrizii extratimpurii de nectarin:
a extragerea embrionilor din smburi, b cultivarea embrionilor imaturi in vitro,
c puieii hibrizi obinui prin germinare in vitro, d plantarea hibrizilor pentru
fortificare, e hibrizi de nectarin fortificai

198

Foto 9.2. Plant hibrid de cicoare (Cichorium intybus L.)
obinut prin germinare in vitro

Momentul nceperii culturii variaz de la specie la specie, n funcie de scopul
urmrit. Astfel, la cire, inocularea se face la 28-35 de zile de la nflorire, la viin, la 29-41
zile i piersic, la 81-97 zile.
Un alt indiciu folosit este reprezentat de mrimea cotiledoanelor. La piersic
momentul optim fiind atunci cnd acestea ating 4-5 mm n diametru.
La cire, se mai recomand iniierea culturii n momentul ntririi smburelui, dup
aceea viabilitatea embrionilor scade pn la momentul intrrii n prg.
Stabilizarea culturilor de embrioni este relativ uoar datorit faptului c smburii
sau seminele protejate de endocarp sau tegumente, pot fi sterilizate la concentraii ridicate.
Compoziia mediului de cultur este cu att mai complex cu ct embrionii se afl
ntr-un stadiu de dezvoltare mai incipient.
Dup inoculare, embrionii se las la ntuneric timp de 30-60 de zile la temperatura
camerei pentru germinare dup care sunt trecui la lumin.
n tabelele 9.1., 9.2. i 9.3. sunt prezentate cteva din cercetrile privind folosirea
embrionilor zigotici imaturi la plantele horticole.




199
Tabelul 9.1.
Cercetri privind cultura de embrioni imaturi la plantele legumicole
Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Allium cepa Cultur embrioni Guha&Johri (1966) 5,8 50 7 (0,5)AIA-pentru formare
bulbili
Guha&Johri (1966)
Plantule Murashige&Skoog (1962) 5,6 30 10 Chen (1976)
Plantule Murashige&Skoog (1962) 30 agar Williams&Collin
(1976)&
Dezvoltare
embrioni
Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 lichid (0,6)Kin Zee&Wu(1979)
Apium graveolens
Plantule Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar Zee&Wu (1980)
Plante diploide Nitsch et al. (1969a) - 30 6 AIA + Z (nespecificat) Bui Dang HA et al
(1975)
Creterea
embrionilor
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 8 (1) 2,4-D + (0,315) Kin Wilmar &
Hellendoorn (1968)
Asparagus
officinalis
Creterea
plantelor
Knudson (1946) C - 30 8 Wilmar &
Hellendoorn (1968)
Brassica alba Lstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar Leelavahti et al (1984)
Plantule Gamborg et al. (1968) B5 5,5 20 8 (0,5)BAP Bagga et al (1982) Brassica oleracea
botrytis Plantule Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 agar Pareek & Chandra
(1978 a)
Capsicum annuum Plantule haploide
i diploide
Dumas De Vaulx et al
(1981) R
5,9 30 8 (2) Kin Dumas De Vaulx et
al (1981)
200
Tabelul 9.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Germinarea
embrionilor i plantule
Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 8 Norton (1981) Cucumis melo
Lstari i rdcini
adventive
Murashige&Skoog
(1962)
40 agar (5)ANA+(2,5)Kin+
15%CM
Rao et al. (1982)
Germinare Randolph&Cox(1943) 20 lichid Aalders (1958) Cucumis sativus
Lstari Lazarte&Sasser (1982)L 0 agar - Lazarte&Sasser
(1982)
Cucurbita pepo Plantule cu rdcini Murashige&Skoog
(1962)
30
glucoz
9 (0,3)2,4-D Jelaska (1972)
Hildebrandt et al
(1946)Tob
20 5 Zenkteler et al
(1961)
White (1942) 20 5 Zenkteler et al
(1961)
Zenkteler et al.
(1961)D1.
20 5 (6)2,4-D+(0,1)ANA+15%CM Zenkteler et al
(1961)
Zenkteler et al.
(1961)D2.
20 5 (6)2,4-D+(0,1)ANA+15%CM Zenkteler et al
(1961)
Daucus carota Dezvoltarea
embrionilor
Zenkteler et al.
(1961)D3.
10
glucoz
5 (0,2)Ad+15%CM Zenkteler et al
(1961)
Germinarea
embrionilor
Murashige & Skoog
(1962)
5,6-
5,8
30 7 Jarret et al. (1984) Ipomoes batatus
Lstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 16 agar (0,19-0,38)ANA Schultheis et al.
(1986)
Dezvoltare embrioni Bonner & Axtman (1937) - 40 Agar Bonner & Axtman
(1937)
Creterea lstarilor Bonner & Bonner (1938) - 40 10 Vitamina C Bonner & Bonner (1938)
2 rdcini Murashige&Skoog (1962) 5,8 15 10 Jacobsen&Kysely(1984)
Pisum sativum
Dezvoltare embrioni Stafford & Davies (1979) 5,8 10 Lichid Stafford & Davies
(1979)
201
Tabelul 9.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 Agar (0,005) ANA + (1-2) Kin Anon (1981 b)
Dezvoltare
plantule
Murashige&Skoog
(1962)
30 Agar Gleddie et al (1982)
Calus White (1954) 20 Agar (1) ANA Yamada et al (1967)
Calus i
embriogenez
White (1954) 20 Agar Auxina Yamada et al (1967)
Solanum
melongena
Plantule White (1954) 20 Agar Yamada et al (1967)

Tabelul 9.2.
Cercetri privind cultura de embrioni imaturi la plantele pomicole
Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de
cretere (mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Amygdalus
communis
Lstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,56) BAP Hisajima (1982 b)
Armeniaca vulgaris Dezvoltare i
germinare
Tukey (1933)I 5,5 5 glucoz 6,5 Tukey (1938)
Lstari axilari San Jose et al, (1984 L sau
H)
30 6 (2-5) BAP San Jose et al,
(1984)
Castanea sativa
Lstari axilari Vieitez & Vieitez(1980a) 1 5,5 30 6 (1-2) BAP Vieitez &
Vieitez(1980a)
Cerasus vulgaris Dezvoltare
germinare
Tukey (1933)I 5,5 5 glucoz 6,5 Tukey (1938)
Germinare Van Overbeek et al (1941) 10 7 (0,2) AdS+33%CM Ozsan&Cameron
(1963)
Plantule Dubey&Rishi (1976) 5,7 20 7 Dubey&Rishi (1976)
Citrus sp,
Plantule Murashige&Tucker (1969) 5,7 30 8 (1) GA3 Gmitter&Moore
(1986)
202
Tabelul 9.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Cretere embrioni Cutter&Wilson (1954) 5 20 agar Cutter&Wilson(1954)
Calus Eeuwens (1976) Y3 6 45 8 (50)2,4-D+(2)Kin Kumar et al (1985)
Cocos nucifera
Cretere embrioni Murashige&Skoog(1962) 40
glucoz
8 (10)AIA Nurita-Toruan (1978)
Proliferare embrioizi 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 +/-(0,11)BAP Prez et al (1986) Corylus
avellana Calus i
embriogenez
Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)2,4-
D+(1)Kin+(2)Ad
Radojevic et al,(1975)
esut embriogen Wang D, et al, (1984) 5,8 50 8 (5)2,4-D + (0,5)BAP Wang D, et al, (1984) Fragaria
Regenerare plantule Wang D, et al, (1984) 5,8 50 8 (1)GA3 sau
[(0,5)BAP+ (0,1)ANA
Wang D, et al, (1984)
Juglans regia Lstari Cassio&Minotta
(1983)1,2&3
5,7 30 10 (0,2)ANA Cassio&Minotta
(1983)
Malus x
domestica
Proliferare embrioizi Murashige & Skoog
(1962)
5,6-5,8 30 8 Eichholtz et al (1979)
Proliferare embrioni Litz et al (1984) 5,7 30 8 (1-2)BAP Litz et al, (1984b) Mangifera
indica Germinare limitat Litz (1984a 5,7 60 0 Litz (1984b)
Germinare Brooks & Hough (1958) 20 6,8 Brooks & Hough
(1958)
Persica
vulgaris
Dezvoltare embrioni Monet (1968) 5,8 20 8 2-3 ml CM pe
suprafata agarului
Monet (1968)
Phoenix
dactylifera
Calus, embriogenez Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 30 8 (10-100)2,4-D+(3)2iP
+(40)AdS
Tisserat et al (1979)
Maturare Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 Kononowikz & Janik
(1984b)
Embriogenez Murashige & Skoog
(1962)
30 10 (1,5)ANA+10%CM Pence et al
(1979;1980)
Dezvoltare embrioni
i germinare
Murashige & Skoog
(1962)
30 0 (1,5)ANA+10%CM Pence et al
(1979;1980)
Theobroma
cacao
Germinare precoce Ben-Jaacov & Dax (1981) 5,7 30 0 Pasare la 10 zile Wang & Janich (1984)
203
Tabelul 9.3.
Cercetri privind cultura de embrioni imaturi la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Rezultat Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Fraxinus
americana
Dezvoltare
embrioni
Bulard & Monin (1960) 5 30 glucoz 8 +/- (1)GA3 Bulard & Monin
(1963)
Calus Linsmaier&Skoog(1965) 20 8 Arias et al (1982)
Lstar Tukey (1933) I 20 10 Ball (1956a,b)
Gingko biloba
Lstar Ball (1959)A sau B 40 glucoz 10 30% CM Ball (1959)
Hedera helix Calus Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (2)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979)
Ilex aquifolium Germinare i
cretere
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6 40 10 Hu & Sussex
(1972)
Magnolia
grandiflora
Germinare Heller (1953;1955) 20 8 Le Page-Degivry
(1970)
Magnolia
soulangeana
Germinare Heller (1953;1955) 20 8 Le Page-Degivry
(1970)
Calus i
embriogenez
Von Arnold & Eriksson
(1981) LPm
5,8 34,2 5 (2,2) 2,4-D + (1,1) BAP Hakman et al
(1985)
Lstari adventivi 0,5 x Schenk &
Hildebrandt (1972)
15 5 (1) Kin + (1,1) BAP Von Arnold &
Eriksson (1984)
Picea abies
Lstari adventivi Von Arnold (1982) 17,1 (2,1) Kin Von Arnold (1982)
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 [(0,01-2) ANA, 2,4-D
sau IBA] + (0,1-5) Z,
BAP sau 2iP
Minocha (1980) Pinus strobus
Lstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (1-5) IBA + (0,1-1)Z Minocha (1980)
Pseudiotsuga
menziesii
Calus i muguri Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6 30 7 (1-2) ANA + (1) BAP Chalupa (1977)
Ouercus robur Lstari Vieitez & Vieitez
(1983) QL
30 6 (1) BAP Vieitez et al (1985)

204
Capitolul 10
Producerea haploizilor

10.1. Generaliti
n urma diviziunilor celulare care se ncheie cu formarea gameilor se obin celule
haploide cu numr simplu de cromozomi (n).
Plecnd de la aceste celule se pot regenera prin diferite metode plante haploide sau
prin diploidizare, plante homozigote care prezint o importan practic deosebit pentru
activitatea de ameliorare.
In vivo, plantele haploide se pot obine relativ uor cunoscndu-se peste 100 de
specii la care s-au obinut haploizi pe cale spontan.
Cea mai comun metod n acest sens este obinerea de plante din semine cu doi
embrioni (duble). Acestea pot avea 2 embrioni n-n sau 2 embrioni 2n-n.
Avantajele folosirii haploizilor:
- prin dublarea cromozomilor se obin rapid plante homozigote - procesul are mare
importan la speciile la care acestea nu pot fi obinute in vivo (ex. plante dioice i
autoincompatibile). Se reduce durata procesului de obinere a liniilor homozigote care
presupune autopolenizri timp de 5-7 generaii;
- obinerea plantelor homozigote la speciile cu perioada juvenil lung este dificil
i ndelungat;
- producerea de hibrizi F1 este uurat;
- la speciile poliploide prin obinerea de haploizi se poate lucra mai uor cu niveluri
de ploidie inferioare;
- mutantele recesive sunt rapid puse n eviden la plantele haploide;
- folosirea plantelor haploide permite obinerea de plante mascule normale prin
dublarea garniturii cromozomale. Acestea sunt deosebit de utile pentru Asparagus
officinalis la care producia este mai ridicat i mai timpurie dect la cele femele;
X X x Y Y (super mascul)

X Y

205
- in vitro haploizii i dubleaz spontan garnitura cromozomal sau necesit
cantiti mici de colchicin. Aceasta determin apariia de probleme secundare atunci cnd
este folosit n mod normal in vivo;
- fuziunea protoplatilor haploizi este mai indicat pentru c se realizeaz mai uor
i hibridul somatic va fi diploid, dect n cazul protoplatilor diplozi care formeaz hibrizi
somatici tetraploizi.
Producerea haplozilor in vitro presupune dou procese:
- cultivarea unor gamei femeli (ovule) sau sinergide-ginogeneza;
- cultivarea unor gamei masculi (gruncior de polen) androgeneza.

10.2. Androgeneza in vitro
Cel mai mult s-au studiat produsele de androgenez in vitro cu rezultate pozitive la
speciile din fam. Solanaceae, Cruciferae, Gramineae i Ranunculaceae.
Peste 247 de specii i hibrizi de 88 de genuri i 34 de familii au produs haploizi in
vitro (Maheshwari i coalb. 1983).
Rezultate mai puin promitoare s-au obinut la arbori i arbuti.
Primele cercetri n urma crora s-au obinut haploizi din antere de Datura innoxia
au fost realizate de Guba i Maheshwari (1964 i 1966). n 1967 Borgin i Nitsch au
obinut acelai lucru din antere de Nicotiana.
Materialul iniial pentru obinerea haploizilor:
- anterele sunt cele mai folosite fiind cultivate pe mediu lichid sau solid.
Izolarea se face folosind antere provenite din mugurii nchii sau flori deschise.
- grunciori de polen se folosesc mai puin;
- inflorescene care cresc uor pe mediu lichid (la specii de ierburi care au
flori de dimensiuni reduse).
- embriocultur - cultivarea unor embrioni rezultai din ncruciri
interspecifice sau intergenerice la care unul din genitori este eliminat. Ex. Hordeum
vulgare x H. bulbosum, acesta din urm este eliminat, idem T. aestivum x H. bulbosum.
- pseudofecundare - Hess i Wagner (1974) au polenizat Mimulus luteus cu
polen de Torenia fournieri in vitro. Gameii femeli de Mimulus au generat plante haploide.
- ovule nefecundate - avantaj majoritatea plantelor regenerate sunt verzi, la
cereale la orz celulele sacului embrionar haploide, la gru, orez i porumb ovule. La
206
gerbera prin cultur de capitul, s-au obinut plante haploide clorofilo-deficitare, galbene
(Preil i colab, 1977); ovule + placent la Petunia axillaris (Keller 1986).
Producerea haploizilor din antere se poate realiza pe dou ci:
- direct - embrionul haploid se formeaz direct din grunciorul de polen;
- indirect - pentru nceput din grunciorul de polen se obine calus dar apoi se
formeaz un embrion sau un lstar adventiv. Prezint dezavantaje datorit existenei n
masa calusului a unor celule diploide i haploide.
Momentul izolrii anterelor este esenial: muli autori (Debergh 1978; Reinert i
Bajaj, 1977a etc.) opteaz pentru momentul de dinaintea primei diviziuni a grunciorilor de
polen.
Dunwell (1985) precizeaz c momentul optim este ntre diviziunea microsporilor
din tetrad i prima mitoz.
La tutun se folosesc mugurii florali la care petalele sunt abia vizibile.
Prin cultura de antere se formeaz frecvent un numr mare de haploizi, himere i
plante cu diferite niveluri de ploidie.
Factori care influeneaz producerea haploizilor din antere:
- pretratamente la plantele mam: temperatura sczut, centrifugarea anterelor, incizia
vrfului inflorescenelor, tierea peretelui anterei;
- tipul de material iniial: - plante sntoase, viguroase;
- vrsta plantei, vrsta florii;
- poziia explantului - la cereale se izoleaz flori din vrful spicului;
- compoziia mediului, MS ori Nitsch, se modific n fiecare de faz;
- pH-ul mediului recomandat este 5,8, coninutul n zaharoz de 2-4%;
- prezena agarului nu este obligatorie. Se poate folosi un mediu lichid n care anterele
plutesc, sau un mediu cu dublu strat;
- crbunele activ absoarbe metaboliii din mediul de cultur i are efect pozitiv.
Androgeneza in vitro se confrunt cu o serie de probleme:
- uneori cretere dificil - avortarea embrionilor;
- se formeaz simultan diploizi sau tetraploizi; diviziunea celular trebuie s se
realizeze n haploid i nu n celule diploide adiacente;
- se formeaz frecvent plante albinotice care nu triesc;
- costuri ridicate, uneori se recurge la obinerea de haploizi in vivo, care este mai
ieftin (Solanum tuberosum x S. phureja);
207
- formarea calusului este nedorit;
- este greu s se izoleze haploizi dintr-un amestec n care exist i celule cu diferite
grade de ploidie, deoarece acestea cresc mai puternic.
- selecia plantelor diploide este dificil i de lung durat prin metoda citogenetic
i presupune folosirea metodelor cu marcatori genetici.
- nu ntotdeauna dublarea garniturii cromozonale are ca efect producia de plante
homozigote, ntruct n descenden poate aprea segregarea.

10.3. Fecundarea in vitro
n anumite situaii, realizarea hibridrii sexuate este imposibil datorit mai multor
factori cu influen negativ :
- polenul nu germineaz pe stigmat;
- creterea tubului polinic este parial;
- fecundarea nu se produce;
- zigotul nu se dezvolt;
- ovarul mbtrnete prematur, etc.
Dup 1962 s-a pus problema rezolvrii cazurilor de incompatibilitate prin realizarea
polenizrii i fecundrii in vitro.
Tipuri de polenizare i fecundare:
a) polenizarea stigmatului - se realizeaz castrarea (emascularea) florii provenite
de la genitorul matern, sterilizarea acesteia i inocularea pe un mediu in vitro.
Polenul provenit de la antere mature este sterilizat i el i amplasat pe stigmat.
Metoda a fost folosit cu succes la Nicotiana rustica, N. tabacum, Petunia violacea,
Antirhinum majus, Pisum sativum, Lathyrus odoratus, Zea mays (Pierik,. 1979; Zenkteler,
1980) i Glycine sp. (Silvoy i alii, 1984).
b) polenizarea placentei - dup sterilizarea florii femele se extrage sub lup
binocular placenta cu ovulele proprii i se inoculeaz pe un mediu nutritiv. n acelai timp,
anterele ajunse aproape de maturitate, se sterilizeaz i se deschid sub hot, depunnd apoi
grunciorii de polen pe ovule. Grunciorii de polen germineaz, strpung sacul embrionar
i se realizeaz fecundarea.
Rezultate bune s-au obinut la specii din familia Caryophyllaceae, Gossypium
precum i la Zea mays.
208
c) polenizarea ovulelor izolate - dup izolarea ovulelor fr placent se face
polenizarea ca n metodele precedente, i are loc fecundarea.
Metoda este mai puin folosit deoarece embrionul se dezvolt greu n acest caz.
Totui polenizarea in vitro se poate folosi:
- n cazuri de incompatibilitate in vivo ex. Petunia axilaris (Rangaswarny i
Shivanna, 1967) i hibrizii de Petunia (Numi, 1970).
- n cazuri de incompatibilitate la realizarea polenizrii ncruciate interspecifice
sau intergenerice. Ex. :
- Nicotiana alata x Nicotiana tabacum;
- la genuri din Familia Caryophyllaceae se folosete metoda polenizrii
placentei;
- producerea de haploizi prin partenogenez. Hess i Wagner (1974) au obinut un
haploid de Mimulus luteus prin polenizarea cu polen de Torenia fournieri.
- cnd are loc cderea prematur a florii sau ovulului se poate recurge la
polenizarea stigmatului in vitro
- realizarea studiilor de fiziologia fecundrii i a studiilor fenomenului de
incompatibilitate.
Pentru reuita fecundrii in vitro trebuie ndeplinite mai multe condiii:
- gameii s fie n faza optim de dezvoltare pentru realizarea fecundrii;
- mediul de cultur s asigure condiii optime pentru fecundare, creterea
embrionului i obinerea de noi plante. Se folosesc de regul soluii foarte complexe;
- operaiile de stabilizare a materialului vegetal trebuie s fie executate rapid
pentru a nu determina splarea lichidului de pe stigmat sau crparea anterelor;
- cnd se recurge la metoda polenizrii stigmatelor nu se nltur sepalele,
deoarece acestea stimuleaz creterea i dezvoltarea ovarului.
- temperatura influeneaz direct procesul de fecundare. Speciile din genul
Narcissus necesit temperaturi mai sczute, inferioare temperaturii de 25C (Balatkova i
colab. 1977), n timp ce Papaver somniferum are nevoie de temperaturi ridicate.
Tabelele 10.1., 10.2., 10.3. i 10.4. prezint rezultatele unor lucrri de cercetare
privind androgeneza i ginogeneza in vitro la plantele horticole.
209
Tabelul 10.1.
Cercetri privind androgeneza i ginogeneza la plantele legumicole
Denumirea
speciei
Explant iniial Rezultat Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de
cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Primordii
florale
Lstari multipli Dunstan&Short
(1977a)BDS
5.5 30 8 (1) BAP Dunstan&Short
(1979a)
Flori fertilizate Cultura de
ovare/fruct
Nitsch (1951)1 5.8 50 7 (0.5)AIA+(0.5-1) Kin
+(4)GA3
Guha&Johri (1966)
Allium cepa
Ovule
fertilizate
Rsad Johri&Guha (1963) - 50 7 (1)AIA+(0.5)
Kin+(4)GA3
Johri&Guha (1963)
Antere Calus Pelletier et al. (1972)
Tosauri
- 20 5 (0,1) ANA +(0,5) 2,4-
D +(0,5) BAP
Dor (1974) Asparagus
officinalis
Antere Calus Pelletier et al. (1972)
Tosauri
- 20 5 (0,1) ANA +(1) 2,4-D
+(0,2) BAP
Pelletier et al (1972 b)
Brassica alba Antere Calus Leelavahti et al
(1984)
5.6 20 agar (2) 2,4-D Leelavahti et al (1984)
Antere
uninucleate
Calus Bagga et al (1982) 1 5.5 20 8 (0.22)2,4-D + (0.22)
Kin
Bagga et al (1982)
Antere
uninucleate
42% calus
8% embrioizi
Gamborg et al.
(1968) B5
5.5 20 8 (0.5)BAP Bagga et al (1982)
Fragmente
petale
Lstari Linsmaier & Skoog
(1965)
- 30 lichid (8) AIA + (2,56) Kin Crisp & Walkey
(1974)
Fragmente
pedunculi
florali
Lstari Margara (1969a,b) C - 45 8 (2.3) BAP Margara (1969 a,b)

Brassica oleracea
botrytis
Fragm. pedunc.
florali
Lstari Margara (1977;
1978) N 30 NH4
- 30 8 (1) IBA + (0,93) ANA Margara (1978)

Brassica oleracea
gemmifera
Antere Embriogenez Keller et al (1975) - 100 8 (0.1) 2,4-D + (0,1)
ANA
Ockendon (1984,
1985)
210
Tabelul 10.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Antere Embriogenez Dumas De Vaulx et al
(1981) R
5.9 30 8 (0.1) Kin Dumas De Vaulx et
al (1981)
Antere Plante haploide George &
Narayanaswamy
(1973)
5.8 20 8 (0.5)AIA George &
Narayanaswamy
(1973)
Antere (48h, 4C) Embrioizi Sibi et al (1979) Cm 5.9 30 8 (2) 2,4 D + (2) Kin Sibi et al (1979)
Capsicum
annuum
Antere Embrioizi i
plantule
Sibi et al (1979) Cm 5.9 30 8 (0.1) Kin Sibi et al (1979)
Antere Calus
Murashige & Skoog
(1962)
BA, AIA, ANA, 2,4-D Smets (1983)
Cichorium
intybus
Semine, muguri
florali, flori,
fragm. foliare
(0,1-1cm2)
Calus, muguri,
lstari, rdcini
Murashige & Skoog
(1962)
BA, AIA Dabin (1985)
Cucumis sativus antere calus Lazarte&Sasser
(1982)L
0 agar - Lazarte&Sasser
(1982)
Lactuca sativa polen 40% germinare Eenik (1983) 40 lichid - Eenik (1983)
Polen/antere torpedo Bourgin & Nitsch
(1967)H
5.5 20 lichid (0.1)ANA+(0.1)BAP Debergh&Nitsch
(1973)
Antere Calus haploid Gresshoff&Doy
(1972a,b)DBM1
5.8-
6.4
20 8 (2)ANA+(1.5 )Kin Gresshoff&Doy
(1972b)
Antere Calus Gresshoff&Doy
(1972a,b)DBM2
5.8 20 8 (2)ANA+(1)Kin Gulshan&Sharma
(1981)
Ovare 8-10 zile Semine viabile Uralets (1980) 1 5.8 20 agar Uralets (1980)
Lycopersicon
esculentum
Antere Calus Murashige & Skoog
(1962)
5.8 20 8 (0.5) AIA + (0.25) Z Zamir et all (1980;
1981)
Phaseolus
vulgaris
Antere Calus haploid
i diploid
Veliky & Martin
(1970) 67-V
20 8 (1) 2,4-D Peters et al (1977)
211
Tabelul 10.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Muguri florali Calus i
embriogenez
Konar et al (1972 a) - 0 7 (1) AIA + 10% CM Konar et al (1972
a)
Raphanus
sativus
Sepale, petale,
antere
Calus i
embriogenez
Ranga Swamy (1962)
I
5.8 20 7 (1) 2,4 D + 10 %
CM
Nataraja & Konar
(1970)
Antere Calus i
embriogenez
Murashige & Skoog
(1962)
5.8 30 agar (0.25 - 2) 2,4-D +
(0.25-1)Kin + (0.2)
Rac
Anon (1981 b) Solanum
melongena
Antere Calus i
embriogenez
Pelletier et al (1972)
Tosauri
5.8 20 7.5 (0.1) ANA + (0.2)
BAP
Isouard et al
(1979)
Antere Embrioizi Bourgin & Nitsch
(1967) H
5.5 20 8 (0.22) Kin Kohlenbach &
Geier (1972)
Antere Calus Murashige & Skoog
(1962)
5.8 30 agar (1.9) ANA + (0.39)
Kin
Sopory & Tan
(1979)
Antere Calus Murashige & Skoog
(1962)
5.8 30 agar (1.86) ANA + (0.23)
BAP
Sopory & Tan
(1979)
Antere Embrioizi Bourgin & Nitsch
(1967) H
5.8 20 8 (0.23) BAP + (1.86)
ANA
Sopory (1977a )
Antere Embriogenez
direct
Murashige & Skoog
(1962)
5.8 60 agar (1.1)AIA + (0.9) BAP Sopory et al
(1978)&
Solanum
tuberosum
Polen Embrioizi
globulari
Murashige & Skoog
(1962)
5.8 30 lichid (1.4) 2,4-D + (0.4)
Kin
Sopory (1977)

212
Tabelul 10.2.
Cercetri privind androgeneza i ginogeneza la plantele pomicole
Denumirea
speciei
Explant Rezultat Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de
cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Armeniaca
vulgaris
Antere Calus Murashige & Skoog
(19620
30 agar (2)ANA+(2)Kin Harn & Kim
(1972)
Cerasus avium Antere Calus Seirlis et al, (1979)A 30 9 (0,5)2,4-D+(0,5-
1)BAP
Seirlis et al, (1979)
Antere Calus Murashige & Tucker
(1969)
50 agar (3)2,4-D+(1)Kin Murashige&Tucke
r
(1969)
Ovule
nedezvoltate
Formarea i
creterea
embrionilor
Murashige & Tucker
(1969)
5,7 30 8 (0,01)2,4-
D+(0,1)daminozide
Gmitter & Moore
(1986)
Kochba et al, (1972) 5,7 30 8 Gmitter & Moore
(1986)
Citrus sp,
Inflorescene Rizogenez Eeuwens&Blake(1977) 5,5-5,8 68,5 3,9 (0,022)2,4-D+(1,13)BAP Eeuwens (1978)
Cocos nucifera Antere Torpedo Thanh-Tuyen&De
Gz,(1983)1
5,8 60 7 (2)ANA+/-(0,25)2,4-
D+15%CM
Thanh-Tuyen&De
Gz,(1983)1
Juglans regia Polen 80%
germinaie
Luza & Polito (1985) 20 6,5 Luza & Polito
(1985)
Muguri florali Lstari Krikorian & Cronauer
(1984)
5,8 41 0 (4,95)BAP+10%CM Cronauer &
Krikorian (1985a)
Musa acuminata
Muguri florali Lstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 0 (5)Bap + 10% CM Cronauer &
Krikorian (1985b)

213
Tabelul 10.3.
Cercetri privind cultura embriogeneza somatic la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Explant Rezultat Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Antere Calus Ranga Swamy (1961)I 5,8 20 7 (1)AIA + 10%CM Nataraja (1971) Clematis gouriana
Antere Embriogenez Nitsch & Nitsch (1969) 5,8 20 lichid Johansson et al
(1982)
Polen Calus Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6)2,4-D +10-
40%CM
Lamport (1964)
Polen Calus Tulecke (1960) A 6 20 10 (0,1)ANA + 20% CM Tulecke (1960)
Ginkgo biloba
Gametofit Calus haploid White (1943a) A 20 agar (6)2,4-D + 18%CM Tulecke (1964)
Larix decidua Gametofit Calus Nagmani & Bonga
(1985)
5,8 20 8 (2)BAP Nagmani & Bonga
(1985)
Paulownia
tomentosa
Ovule Plantule via
calus
Radojevic et al, (1975) 20 7 (1)2,4-D + (1)Kin +
(2)Ad
Radojevic (1979)
Megagametofit Calus haploid &
lstari adventivi
Huhtinen (1976) 30 (1-10) 2,4-D + (0,1-1)
Kin
Huhtinen (1976) Picea abies
Megagametofit Calus Simola & Honkanen
(1983)
5,6 20 6 (2) 2-4-D +(0,5) Kin Simola & Honkanen
(1983)
Pinus mugo Polen Germinare polen Nygaard (1970) B, Nf
sau C
5,2 3,4 lichid Nygaard (1970)
Pinus mugo
mughus
Megagametofit Calus haploid Brown & Lawrence
(1968)
5,6-
5,8
20 8 (5) 2,4-D Bonga (1974)
Pinus nigra
austriaca
Megagametofit Calus haploid Brown & Lawrence
(1968)
5,6-
5,8
20 8 (5) 2,4-D Bonga (1974)
Embrioni
zigotici
Dezvoltare
embrioni
Mapes & Zaerr (1981) 5,8 30 agar Mapes & Zaerr
(1981)
Pseudotsuga
menziesii
Polen Germinare polen Muren et al (1979) 5,2 lichid Muren et al (1979)
Rosa hybrida Antere Calus haploid Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 agar (7,5) AIA +(0,8) Kin Tabaeezadeh &
Khosh K, (1981)
214

Tabelul 10.4.
Cercetri privind androgeneza i ginogeneza la via de vie
Denumirea
speciei
Explant iniial Rezultat Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de
cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis thunbergii Antere Lstari Nitsch (1971)1 5.5 20 8 (1.86) ANA+(0.225)
BAP
Hirabayashi et al
(19760
Vitis vinifera Antere Calus Gresshoff & Doy
(1974)1
5.8 20 8 (2) ANA+(2) AIA+(1.5)
Kin

Vitis vinifera Lstari Dezvoltare Favre & Grenan
(1979)S
20
glucoz
agar Favre & Grenan
(1979)
Vitis vinifera Ovule Calus Mullins & Srinivasan
(1976) HDVM
5.6 20 0 (2.8)CPA + 10-15%
CM
Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Ovule Calus Mullins&Srinivasan(1
976)N
5.6 20 0 (1.1) BAP Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera x
Vitis rupestris
Antere Calus Bourgin & Nitsch
(18670 H
20 0 (1.11) 2,4-D +
(0.225) BAP
Rajakeran &
Mullins (1979)



215
Capitolul 11
Cultura de calus in vitro

11.1. Cultura de calus
Calusul reprezint o aglomerare de celule mai mult sau mai puin difereniate care au o
capacitate diferit de multiplicare.
Formarea calusului are loc pe diferite tipuri de explante cultivate in vitro pe zonele
rnite, sub influena unor substane specifice.
Cultura calusului presupune trei etape:
- inducerea formrii calusului;
- nmulirea calusului;
- regenerarea de organe adventive de calus.
Inducerea calusului
Pentru iniierea unei culturi de calus pot fi folosite diferite tipuri de organe: rdcini,
tulpini, frunze, flori i esuturi. Cnd este nevoie de material juvenil, de regul se apeleaz la
cotiledoane, embrioni imaturi, puiei etc.
Stimularea formrii calusului pe explantele iniiale se face prin folosirea unor hormoni
specifici. Pentru monocotiledonate sunt recomandate auxinele. Unele specii necesit
citochinine n timp ce altele au nevoie att de citochinine ct i de auxine.
La nceput, la explantele de morcov se folosea 2,4 D i lapte de cocos pentru obinerea
calusului. Ulterior s-a demonstrat c laptele de cocos are un coninut ridicat de citochinine
care stimuleaz procesul de calogenez.
Ali factori care intervin n formarea calusului sunt: genotipul, compoziia mediului de
cultur, pH-ul, factorii fizici de cretere.
Pe lng mediul de cultur MS, n reeta de baz se mai folosete zaharoza n
concentraie de 2-4% i alte substane auxiliare cum ar fi: caseina hidrolizat, extractul de
mal, de drojdie, laptele de cocos.
pH-ul ridicat (7) a stimulat formarea i creterea produciei de calus la actinidia
(Stnic i colab., 1995).

216

a) b)
Foto 11.1. Formare calusului la kiwi (Actinidia deliciosa) din peiol (a) i lim foliar (b)

Temperatura ridicat (22-28C) stimuleaz procesul de calogenez n timp ce lumina
are efect diferit.
Sub influena factorilor amintii, celulele esuturilor difereniate sufer un proces de
dedifereniere. n timpul acestuia celulele parenchimatice se convertesc n celule juvenile cu
capacitate mare de diviziune.
esuturile meristematice nu au nevoie de procese de dedifereniere, ele fiind capabile
de diviziune rapid i formare de calus. n masa de calus pot s coexiste celule cu grade
diferite de difereniere.
Cultura de calus
Dup obinerea calusului, acesta este cultivat pe un alt mediu, de regul solid n prima
faz de cultur i lichid dup aceea.
Compoziia mediilor este similar cu cea din faza de inducie cu excepia concentraiei
auxinelor i citochininelor care este mai redus. Dac creterea calusului este mai redus
atunci se recomand i pstrarea unei poriuni din explantul iniial n timpul primei subculturi.
Calusul format are culori, grade de compactare i consisten (duritate) diferite n
funcie de specie, tipul de explant din care provine i condiiile de cultur (Stnic, 1995,
1998). La kiwi, calusul cel mai consistent a fost produs de ctre limbul foliar, indiferent de
mediul de cultur folosit. De asemenea, pH-ul 7, a avut ca efect producerea unui calus mai
dens i de culoare verde intens, fa de cel obinut pe un mediu cu pH- ul de 5.5.
Trebuie remarcat calusul cu aspect sticlos deosebit de consistent, de culoare verde, cu
infiltraii roz care a avut i o mare capacitate organogenetic. Odat cu scderea consistenei,
culoarea calusului trece de la verde nchis strlucitor la verde deschis, verde albicios, brun i
alb glbui.


217
n acelai timp, culoarea i duritatea calusului, numrul de subculturi i pH-ul
mediului de cultur, s-a dovedit c influeneaz radical viteza acestuia de cretere i
capacitatea organogenetic (Stnic F. i Armeanu I. 2004).
S-a observat de asemenea, o corelaie invers ntre cantitatea de calus produs i
procentul de organogenez indirect, respectiv ntre cantitatea de calus produs i numrul de
lstari formai din calus. Dup o subcultur cu o cretere important a calusului, urmeaz o
subcultur cu formarea unui numr mare de lstari pe calusul respectiv.
n funcie de specie, provenien i compoziia mediului de cultur, calusul va
continua s creasc sau va ncepe s diferenieze centri meristematici din care se vor forma
apoi diferite organe prin organogenez indirect (foto 11.2.).


Foto 11.2. Calus cu capacitatea organogenetic ridicat obinut din frunz de cicoare

n trecut, se practica cultura calusului pe mediu solid, ns viteza de cretere a acestuia
era mai redus deoarece: suprafaa de contact cu mediul era mai redus, fapt care influena
negativ absorbia substanelor nutritive; cantitatea de oxigen era limitat; o serie de factori
prezeni n mediul solid stimulau diferenierea i regenerarea unor organe i reduceau
creterea calusului.
Cultura calusului pe mediul lichid se realizeaz pe agitatoare n vase Erlenmeyer. n
aceast situaie, se folosesc agitatoare rotative cu o frecven de rotire de 80-100 rotaii/minut.
Cantitatea de mediu trebuie s reprezinte 20-30% din volumul vasului.
n funcie de specie calusul rmne agregat (Anthurium andreanum) sau se separ n
celule formnd o suspensie celular (la morcov).
Tabelele 11.1., 11.2., 11.3., i 11.4. prezint cteva rezultate ale lucrrilor de cercetare
privind cultura de calus la speciile horticole.

218
Tabelul 11.1.
Cercetri privind cultura de calus la plantele legumicole
Denumirea speciei Explant iniial Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
esut medular Dunstan&Short (1977a)
BDS
5,5 30 8 (0,28)2,4-D Dunstan&Short
(1977a)
Radicele Dunstan&Short 1977a
BDS
5,5 30 8 (0,138) 2,4-
D+(0,05)ANA
Dunstan&Short
(1977b)
Fragmente rdcini Mullin (1970) 5,5-6,0 20 6 (6)2,4-D+15%CM Mullin 1970
Allium cepa
Radicele Mullin 1970 5,5-6,0 40 6 (0,6)2,4-D+15%CM Mullin 1970
Peiol Murashige&Skoog(1962) - 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Al-Abta & Collin (1978)
Calus Murashige&Skoog(1962) - 30 agar (5)2,4-D Al-Abta & Collin (1978)
Peiol tnr sau
frunze
Murashige&Skoog(1962) - 30 9 (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Browers&Orton
(1982)
Peiol 3-5cm Murashige&Skoog(1962) 5,6 30 10 (1)ANA+(0,1)Kin Chen (1976)
Apium graveolens
Fragmente de
frunz
Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6) Kin Zee&Wu (1980)
Internod Linsmaier&Skoog(1965) - 30 6 Hunault (1976)
Calus Reuther (1984) 5,8 30 agar (1) AIA + [(0,1) BAP
sau (0,5) 2iP]
Reuther (1984)
esut medular White (1943 a)A - 30 agar (5) ANA + 10% CM Steward & Mapes
(1971 b)
Calus Murashige & Skoog
(1962)
- 30 lichid (5) 2,4 -D +10% CM Steward & Mapes
(1971 b)
Asparagus
officinalis
Fragmente de
hipocotil
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,8 30 8 (1) 2,4-D + (0,315) Kin Wilmar &
Hellendoorn (1968)


219
Tabelul 11.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente de
frunze
Bagga et al. (1982) 1 5,5 20 8 (0,22)2,4-D +(0,22) Kin Bagga et al (1982)
esut medular Gamborg et al. (1968)
B5
5,5 20 8 (2) ANA + (0,5)BAP Bagga et al (1982)
Hipocotil Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 8 (1,1)2,4-D+(0,11) Kin
+10% CM
Dietert et al (1982)
Brassica oleracea
botrytis
Calus Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 8 (8) IBA + (0,04) Kin
+15% CM
Dietert et al (1982)
Brassica oleracea
capitata
Minicalus Lillo & Shahin (1986) 5,6 30 7 (1) 2,4-D + (0,5) BAP +
(0,1) ANA + (40) AdS
Lillo & Shahin
(1986)
Brassica oleracea
gemmifera
Fragmente de
peiol
Clare & Collin (1973) 5,7 30 7 (1) IBA + (2) AIA +
(0,05) Kin
Clare & Collin
(1974)
Cichorium intybus Fragm. foliare
obinute in vitro
Murashige & Skoog
(1962)
ANA, BA
Saksi i co. (1986)
Fragmente de
frunz sau
cotiledon
Bourgin&Nitsch
(1967)H
5,7 40 glucoz 8 - Blachmon &
Reymonds (1982)
Cucumis melo
Cotiledon Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (6)Kin+(1,5)AIA Moreno et al.(1984)
Internod Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,19)ANA+(0,023)BAP Aziz&McCown(1985)
Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (6,75)BAP Aziz&McCown(1985)
Calus Lazarte&Sasser
(1982)MS
20 8 (0,1)IBA+(1)BAP+
(0,1)GA3 + (162)PG
Lazarte&Sasser
(1982)
Fragmente de hipocotil
sau cotiledon
Murashige&Skoog
(1962)
30 agar (0,37)ANA+(0,23)BAP Sekioka&Tanaka
(1981)
Cucumis sativus
Cotiledon sau
hipocotil
Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 agar (1)ANA+(1)BAP Wehner&Locy
(1981)

220
Tabelul 11.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente
rdcini
Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2)AIA+(6)2,4-D+
(0,3)Kin+(4)AdS
Abou-Mandour
(1977a)
Calus Gamborg et al.(1968) 20 lichid (1,1)2,4-D+(0,1)Kin Baldwin&Gresshoff
(1978)
Cambiu-rdcin Butcher&Ingram
(1976)C
5,5 20 7 (0,15)2,4-D+(0,15)Kin Butcher&Ingram
(1976)
Fragmente
rdcin
Caplin&Steward(1948) 5,6 20 8 (0,1)ANA+15%CM Caplin&Steward(19
48)
Fragmente
rdcin
Murashige & Skoog
(1962)
5,7-5,8 30 8 (10) 2,4-D+[(2)BAP sau
10%CM]
Dodds&Roberts
(1982)
Peiol Halperin (1966)A 5,6 20 agar (0,1-1)2,4-D Halperin (1964)
Daucus carota
Rdcini Lamport 1964 20 lichid (0,6-6)2,4-D+10-40%CM Lamport (1964)
Fragmente
rdcin
Murashige & Skoog
(1962)
5,7-5,8 30 8 (10) 2,4-D+[(2)BAP sau
10%CM]
Dodds&
Roberts(1982)
Fragmente
rdcin
Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (0,25) 2,4-D Handley&Locy
(1984)
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,8 30 8 (0,5) 2,4-D+(3)Kin Handley&Locy
(1984)
Fragmente
tuberculi
Henderson et al.(1984)1. 20 8 (3)2,4-D Henderson et
al.(1984)
Ipomoea batatas
Calus Henderson et al.(1984)2. 20 8 (1)2,4D+(1)ANA+(0,25)
2iP+ (2)ABA
Henderson et
al.(1984)
Cotiledon sau
frunze cotiledonare
Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 8 (0,05)ANA+(0,5)BAP Brown et al (1986)
Peiol Vasil&Hildebrand
(1966c) C
5,7-5,9 20 6 (0,1)ANA+15%CM Fukami&Hildebrandt(19
67)
Calus Fukamil&Hildebrand
(1966c) THS
5,7-5,9 0 6 (0,1)ANA+15%CM Fukami&Hildebrandt
(1967)
Lactuca sativa
Fragmente de
frunz
Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Koevary et al (1978)

221
Tabelul 11.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Fragmente de
frunz
Vasil&Hildebrand
(1966c)C
5,7-5,9 20 6 (6)2,4-D+
(0,1)ANA+15%CM
Vasil & Hildebrandt
(1966c)
Lactuca sativa
Calus Vasil&Hildebrand
(1966c)C
5,7-5,9 20 6 (0,1)ANA+15%CM Vasil & Hildebrandt
(1966c)
Frunze Murashige&Skoog
(1962)
30 8 (0,5)2,4-D+(1)BAP Behki&Lesley
(1980)
esut medular Murashige&Skoog
(1962)
5,8 3 6 (2)Z Cassells (1979)
Calus Murashige&Skoog
(1962)
5,8 3 6 (2)Z Cassells (1979)
Calus Gresshoff&Doy
(1972a,b)DBM3
5,8-6,4 20 8 (5)ANA+(0,01 )Kin Gresshoff&Doy
(1972b)
Hipocotil Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 agar (2)BAP Gunay&Rao (1980)
Fragmente frunze Linsmaier&Skoog
(1965)
30 agar (0,4)AIA+(4)Kin Herman&Haas(1978
)
Fragmente frunze Kartha et al. (1974a) 5,8 30 8 [(1,1-2,3)BAP+/-(0,02-
1,8)AIA] sau [(0,22-
1,1)+/-(0,18-1,8)AIA]
Kartha et al. (1976)
Lycopersicon
esculentum
Fragmente de
frunze
Pence & Caruso (1984) - 30 8 [(2,5) IA, Ala/ (2-3) IA,
Gly] + (0,2) BAP
Pence & Caruso
(1984)
Pastinaca sativa Fragmente de
frunze
Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2) AIA + (6) 2,4-D
+(0,3) Kin + (4)AdS
Abou-Mandour
(1977a)
Petroselinum
hortense
Peiol Vasil & Hildebrandt
(1966c)C
5,7-5,9 20 6 (6) 2,4-D +(0,1) ANA +
15% CM
Vasil & Hildebrandt
(1966 b,c)
Fragmente de
frunza/ rdcini
Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2) AIA + (6) 2,4-D
+(0,3) Kin + (4)AdS
Abou-Mandour
(1977a)
Phaseolus vulgaris
Fragmente de
frunze
Veliky & Martin (1970)
67-V
4,5 20 10 (1) AIA + (10) Kin Crocomo et al
(1976)
Pisum sativum Fragmente de
frunze
Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 10 (0,06) pic + (1) Kin Jacobsen & Kysely
(1984)

222
Tabelul 11.1. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Solanum
melongena
Fragmente
hipocotil
Matsuoka& Hinata
(1979)
5,5 20 8 (0,8)ANA + (0,225)
BAP + (10) AdS
Matsuoka& Hinata
(1979)
Fragmente lstari Murashige&Skoog
(1962)
5,8 30 7 (5)ANA Austin & Cassells
(1983)
Calus Austin & Cassells
(1983)4
5,7 10 10 (0,2)ANA + (0,1) AIA +
(0,5) BAP + (0,1) Kin +
(0,2) GA3
Austin & Cassells
(1983)
Fragmente
tuberculi
Engvild (1973) MSN 5,8 30 agar (8) ANA + (0,5) Kin Bragdo Aas
(1977)
Fragmente
tuberculi
Gamborg (1966) PRL
4 C
5,8 20 agar (2) 2,4 -D Gamborg (1966)
Solanum
tuberosum
Fragmente frunze Ratnamba & Chopra
(1974)
5,8 20 7 (3) 2,4-D + (0,3)Kin +
(0,4) GA3 + (40 ) AdS
Gavinlertvatana & Li
(1980)
Calus din peiol Vasil& Hildebrandt
(1966 c)C
5,7-5,9 20 6 (0,1) ANA + 15% CM Fukami & Hildebrandt
(1967)
Spinacia oleracea
Calus Fukami & Hildebrandt
(1967) THS
5,7-5,9 0 6 (0,05) Kin + 15% CM Fukami & Hildebrandt
(1967)


223
Tabelul 11.2.
Cercetri privind cultura de calus la plantele pomicole
Denumirea
speciei
Explant iniial Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Amygdalus
communis
Fragmente
lstari
Wu & Kuniyuki (1985)
CS
5 0 8 (0,1)ANA +(0,45) BAP Wu & Kuniyuki
(1985)
Fragmente
lstari
Murashige&Skoog
(1962)
30 0 (20)Ad sau
(30)adenosine
Mapes (1973)
Lstari Murashige & Skoog
(1962)
30 0
(agar)
(5,4)ANA+ (5,2)AIA
+(2,1)Kin
Matheus &
Rangan (1981)
Ananas comosus
Calus Matheus & Rangan
(1981)
30 0
(agar)
(10)ANA+ 15%CM Matheus &
Rangan (1981)
internod Murashige&Skoog(1962) 5,3 30 0 (10)IBA+(1)ABA Feucht&Dausend(1976) Cerasus avium
Fragmente
frunze
Pierik et al (1974) 20 0 (1)ANA+(1)BAP Hedtrich (1977)
internod Murashige & Skoog
(1962)
5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976) Cerasus mahaleb
Fragmente
frunze
Pierik et al (1974) 20 0 (4)ANA+(1)BAP Hedtrich (1977)
Cerasus vulgaris Internod Murashige & Skoog
(1962)
5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
Cocos nucifera esut medular Eeuwens(1976) Y3 5,5 45 agar (0,022)ANA+(0,05)Kin
+(0,22)GA3
Eeuwens (1976)
Hipocotil din
embrioni imaturi
Yokoyama&Takeuchi
(1976)
5,6-5,8 30 7 (3)ANA+(0,1)Kin Yokoyama&Take
uchi (1976)
Diospyrus kaki
esut medular Fujii & Nito (1972) 20 agar (5)Ad Fujii & Nito
(1972)

224
Tabelul 11.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,6-
5,8
0 5,5 (2)ANA+(0,2)Kin Chong & Taper
(1974)
Internod Murashige & Skoog
(1962)
5,6-
5,8
0 5,5 (0,25)2,4-d+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
Fragmente
frunze tinere
Hurwitz & Agrios
(1984)CS
5,7 30 8 (1)2,4-D+(2)ANA
+(0,2)Kin
Hurwitz & Agrios
(1984)
Frunze
cotiledonare
Schenk &
Hildebrandt(1972)
5,8 30 8 (0,5)2,4-D+(2)CPA
+(0,1)Kin
Liu et al (1983a)
Malus x domestica
Diferite surse White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin
+(1)GA3 + 15% CM
Mehra & Sachdeva
(1979)
Mangifera indica Semine imature Litz et al (1984) 5,7 30 8 (2)2,4-D Litz et al, (1984b)
Musa cavendishii Calus Murashige & Skoog
(1962)
30 0 (5)IBA Ma et al (1978)
Musa spp, Fragmente
frunze
Linsmaier & Skoog
(1965)
5,6 30 3 (20)Dicamba Jarret et al (1985b)
Olea europaea Calus Lavee (1963)21-MW 6,6 20 10 (2)AIA+suc de piersici Lavee (1963)
Mezocarp Bradley & Dahmen
(1972)
6,5 20 8 Bradley&Dahmen
(1972)
Persica vulgaris
Internod Murashige & Skoog
(1962)
5,6-
5,8
30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
Phoenix
dactylifera
Calus Linsmaier&Skoog
(1965)
5,7 30 8 (3)2iP +(40)AdS Tisserat et al (1979)
Prunus domestica Internod Murashige & Skoog
(1962)
5,6-
5,8
30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)
Internod Murashige & Skoog
(1962)
5,6-
5,8
30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976) Pyrus communis
Semine Schenk & Hildebrandt
(1972)
5,9 30 6 (0,5)2,4-D+(2)CPA
+(0,1)Kin
Schenk &
Hildebrandt (1972)
Phoenix
dactylifera
esut medular Eeuwens (1976)Y3 5,5 45 agar (0,022)2,4-D+(0,05)Kin
+(0,22)GA3
Eeuwens (1976)
Ribes nigrum esut medular Harvey (1967)Basal 6 30 10 (0,15)2,4-D+(1)Kin Harvey&Grasham (1977)

225
Tabelul 11.2. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Pericarp Dublin (1984) 30 agar (0,5-1)2,4-D+[(1)BAP
sau Z]
Dublin (1984)
Hipocotil Hall & Collin (1975) 5,7 30 10 (2)AIA+(2)IBA+(0,1)K
in +10%CM
Hall & Collin
(1975)
Hipocotil Jalal & Collin (1979) 5,7 30 10 (1)IBA+(0,05)Z Jalal & Collin
(1979)
Fragmente
frunze
Maraffa & Sharp
(1979)
5,5 30 10 2,4-D Maraffa & Sharp
(1979)
Cotiledon Gamborg et al (1968)
B5 a:G
5,5 20 7 (1)2,4-D+(0,2)Kin Tsai & Kinsella
(1981)
Theobroma cacao
Calus Murashige & Skoog
(1962)
5,7 30 7 (1)2,4-D+10%CM Tsai & Kinsella
(1981)

Tabelul 11.3.
Cercetri privind cultura de calus la arborii i arbutii ornamentali
Denumirea
speciei
Explant Mediul de cultur pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8
Acer negundo Calus Radojevic et al (1980) 20 6 (3)ANA + (1)Kin +
(2)Ad
Radojevic et al
(1980)
esut cambial Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6)2,4-D+10-40%CM Lamport (1964)
Cambiu Sunderland (1966) 5,4 20 agar (0,1)ANA+10%CM Sunderland (1966)
Acer
pseudoplatanus
Calus Sunderland (1966) 5,4 20 agar [(1)2,4-D sau
(10)ANA] +10%CM
Sunderland (1966)
Acer rubrum Cambium 0,5 x Linsmaier&Skoog (1965) 5,6 20 Agar (5)AIA + (0,2)Kin Mathes et al (1973)
Fragmente
frunz
Simola (1985)N7 Supl 5,6 20 6 [(2)2,4-D+(0,5)Kin] sau
[(5)2,4-D+(1)Kin]
Simola (1985) Betula pendula
Calus Simola (1985)N7 5,6 20 6 [(2)2,4-D / ANA] +
(0,5)Kin
Simola (1985)

226
Tabelul 11.3. continuare
1 2 3 4 5 6 7 8
Betula verrucosa Cambiu Jacquiot (1955) 30 agar (1)ANA Jacquiot (1955)
Crataegus x
mordensis
Internod Murashige&Skoog (1962) 5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D + (0,2)Kin Coffin et al (1976)
esut medular Reinert & White (1956) 5,6-5,8 30 10 (0,05)2,4-D + (1)Kin Wolter&Skoog(1966) Fraxinus
pennsylvanica Calus Wolter & Skoog (1966)
Standard
5,6-
5,8
30 10 (0,04)2,4-D + (1)Kin Wolter & Skoog
(1966)
Gingko biloba Calus Tulecke (1964) 5,5 20 10 (1)ANA + (0,5)Kin +
(10)AdS
Tulecke (1964)
esut medular Murashige&Skoog(1962) 5,7 30 5 (2)ANA + (0,5)BAP Banks (1979) Hedera helix
esut medular Stoutemyer & Britt
(1965)
5,6 20 8 (1)ANA + 10%CM Stoutemyer & Britt
(1965)
Picea abies esut medular Harvey & Grasham
(1969) 1
10 glucoza 8 (0,5) AIA + (0,5) Kin Harvey & Grasham
(1969)
esut De Torok & Thimann
(1961)
5,6 20 agar De Torok &
Thimann (1961)
Picea glauca
Hipocotil Durzan et al (1973) 35 5 (2,5) ANA + (1) Kin Durzan et al (1973)
Picea pungens esut medular Harvey & Grasham
(1969) 1
10 glucoza 8 (0,5) AIA + (0,5) Kin Harvey & Grasham
(1969)
Pinus nigra esut medular Harvey & Grasham
(1969) 1
10 glucoza 8 (1) ANA + (0,5) Kin Harvey & Grasham
(1969)
Lstari Kasperbauer & Reinert
(1967)
6 20 6 (0,2) ANA + (2) BAP Kaul (1986) Pinus strobus
Calus Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (0,1) 2,4 D + (0,1) Z Minocha (1980)
Pseudotsuga
menziesii
Cotiledoane Cheng (1977; 1978) 5,5 30 6 (0,9) ANA + (1,13) BAP Cheah & Cheng
(1978)
Rosa sp. esut medular Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6) 2,4-D + 10-40%
CM
Lamport (1964)
Syringa vulgaris Cambiu Wetmore&Sorokin(1955) 5,5 40 8 (1) 2,4-D + 15% CM Wetmore&Rier(1963)

227
Tabelul 11.3. continuare

1 2 3 4 5 6 7 8
Thuja plicata esut medular Harvey & Grasham
(1969)3
25 glucoza 8 (1) ANA Harvey & Grasham
(1969)
Vinca rosea esut din
smn
Schenk & Hildebrandt
(1972)
5,9 30 6 (0,5) 2,4-D + (2) CPA
+ (0,1) Kin
Schenk &
Hildebrandt (1972)



Tabelul 11.4.
Cercetri privind cultura de calus la via de vie
Denumirea
speciei
Explant iniial Rezultatul Mediu pH
Zaharoz
(g/l)
Agar
(g/l)
Regulatori de
cretere
(mg/l)
Autori
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Vitis vinifera Antere Calus Gresshoff & Doy
(1974)1
5,8 20 8 (2)ANA+(2)AIA+
(1,5)Kin

Vitis vinifera Lstari tineri
sau peiol
Calus Jona & Webb
(1979)C
5,7-
5,8
20 3-5,5 (1)ANA+(0,2)Kin Jona & Webb
(1979
Vitis vinifera Frunze Calus Gamborg (1966)
PRL-4-C
5,5 20 agar (0,1)ANA+(0,2)Kin+
15%CM
Lai & Yye (1980)
Vitis vinifera Calus Lstrire Gamborg (1966)
PRL-4-C
5,5 20 agar (0,1)ANA+(0,2)Kin+
15%CM
Lai & Yye (1980)
Vitis vinifera Ovule Calus Mullins & Srinivasan
(1976) HDVM
5,6 20 0 (2,8)CPA + 10-15%
CM
Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Ovule Calus Mullins&Srinivasan(1
976)N
5,6 20 0 (1,1)BAP Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera Calus Calus
embriogen
Mullins&Srinivasan
(1976)N
5,6 20 0 (1)NOA+(1,1)BAP Mullins &
Srinivasan (1976)
Vitis vinifera x
Vitis rupestris
Antere Calus Bourgin & Nitsch
(18670 H
20 0 (1,11)2,4-D +
(0,225)BAP
Rajakeran &
Mullins (1979)

228
11.2. Cultura de protoplati i hibridarea somatic
Protoplatii sunt celule lipsite de peretele celular, care au capacitatea de a fuziona, de a
se divide n continuare i de a da natere la plante noi.
Hibridarea somatic, cunoscut sub numele de hibridare parasexuat, const din
fuzionarea (contopirea) a doi protoplati realizat prin contopirea nucleilor i citoplasmei
acestora.
Celula obinut este un hibrid somatic i ea poate da natere unei plante ntregi.
n anumite situaii, schimbul de material genetic este parial. Se poate ntmpla ca n
urma fuziunii protoplatilor nucleii s nu fuzioneze i s se realizeze numai o hibridare a
citoplasmei. n acest caz vorbim de hibridare citoplasmatic, plantele obinute fiind numite
hibrizi citoplasmatici sau cibrizi.
Realizarea unor astfel de hibrizi este important pentru transmiterea unor caractere
controlate de ereditate citoplasmatic. Este cazul transmiterii sterilitii mascule care este
controlat de gene existente n mitocondrii.
Etapele hibridrii somatice (Pierik, 1987):
1- Alegerea i creterea materialului iniial.
Alegerea genotipurilor este esenial ntruct nu toate se comport la fel. Astfel la
tomate, Evans i Bravon,1983 a, au obinut rezultate pozitive cu un singur genotip din cele 14
ncercate.
Condiiile de cretere a materialului vegetal sunt i ele importante. Se recomand ca
ultimele faze de cretere s se desfoare n condiii controlate (ser, fitotron, etc.) pentru a
oferi plantelor condiii optime (Evans i Bravon 1983 a).
Se prefer folosirea materialului vegetal cultivat in vitro care, pe lng juvenilitate,
prezint avantajul c nu trebuie sterilizat.
Cel mai frecvent, pentru obinerea protoplatilor se folosete mezofilul frunzei.
Alte organe folosite pentru izolarea protoplatilor sunt vrfurile de lstari (Binding i
colab., 1981), puieii n primele faze de cretere, cotiledoanele i hipocotile (Potrykus i
colab., 1983).
Datorit instabilitii genetice, calusul sau suspensiile celulare sunt mai puin folosite.
2. Dezinfectarea materialului vegetal se face urmrind tehnica i metodologia folosit
la iniierea culturilor in vitro.
Datorit faptului c esuturile folosite sunt juvenile, trebuie acordat o atenie
deosebit timpilor i concentraiilor folosite pentru a nu afecta viabilitatea celulelor.

229
Din acest punct de vedere, tratamentele aplicate mezofilului trebuie s fie ct se poate
de "blnde".
3. Izolarea protoplatilor se face prin macerarea enzimatic a peretelui celular.
De regul, se folosete un amestec de enzime ca celuloza, pectinoza i uneori
hemiceluloza. Aceste enzime dizolv celuloza, pectina (lamela median) i stratul de
hemiceluloz. n urma procesului de macerare celula rmne doar cu plasmalema intact.
n timpul tratamentului enzimatic trebuie asigurat n soluie o presiune osmotic
superioar pentru a preveni plasmoliza celulelor. Acest lucru este realizat prin adugarea de
glucoz, manitol i sorbitol.
Datorit efectului negativ al agenilor osmotici asupra protoplatilor, durata
tratamentului enzimatic trebuie redus la minimum posibil.
Macerarea enzimatic a celulelor se efectueaz de regul la ntuneric, fiind importante
i celelalte condiii de lucru: temperatur, pH, viteza de agitare etc.
Dup obinerea protoplatilor acetia se purific prin filtrare prin site metalice sau de
nylon pentru nlturarea impuritilor de tipul pereilor celulari etc.
Urmeaz apoi o centrifugare la turaie redus ntr-o soluie cu zaharoz (15-20%)
pentru a separa protoplatii.
4. Fuziunea protoplatilor se realizeaz prin inoculare ntr-o soluie concentrat de
polietilenglicol (PEG), care are i o mare concentraie de ioni de Ca
2+
i un pH ridicat
(Menczel, 1983).
Acest tratament are ca scop nlturarea sarcinii negative a protoplatilor. Dup
realizarea fuziunii polietilenglicolul i ioni de Ca
2+
sunt splai.
Zimmermann (1982) a propus i realizat electrofuziunea protoplatilor (fuziunea ntr-
un cmp electric), aceast tehnic determinnd creterea viabilitii lor.
Kameya (1984) a realizat, n schimb, fuziunea protoplatilor prin folosirea dextranului
i a stimulrii electrice.
Dup fuzionarea protoplatilor are loc fuzionarea nucleilor.
Atunci cnd se urmrete fuzionarea protoplatilor provenii de la dou genotipuri
diverse A i B, apare problema seleciei hibrizilor somatici din suspensia celular.
n populaia de celule vor fi ntlnii protoplati nefuzionai A, B, celule AA, BB
(monocarion) i hibrizi somatici AB (heterocarion) care trebuie selectai.
Hibridarea somatic s-a realizat cu succes la plante din familia Solanaceae.
Un aspect interesant l reprezint hibridarea somatic interspecific i mai ales,
intergeneric.

230
Au fost astfel realizai hibrizi ntre Solanum tuberosum i Lycospersicon esculentum,
sau ntre Brassica i Arabidopsis, ntre Daucus i Aegopodium podagraria (Vasil 1978,
Thomas i colab. 1979)
Frecvent ns hibrizii realizai sunt inutilizabili, fiind sterili.
Cercetrile continu pentru obinerea unor hibrizi utili din punct de vedere agronomic
la un numr de specii, vrzoase, lucern, tomate, cartof, trifoi, morcov, tutun, petunii etc.
5. Cultura protoplatilor, regenerarea peretelui celular, diviziunea celular
Cultura de protoplati presupune asigurarea unor condiii deosebite.
Astfel, n timpul regenerrii peretelui celular potenialul osmotic al mediului de
cultur trebuie s fie redus i concentraia ionilor de Ca
2+
ridicat. Dup regenerarea peretelui
celular (cteva zile) potenialul osmotic trebuie s creasc treptat (Burgess, 1983).
Dup 2-7 zile de la izolarea protoplatilor, are loc prima diviziune celular.
Cultura de protoplati se poate realiza n diferite moduri:
- ntr-un strat subire de mediu lichid, n vase Petri;
- pe mediu solid dup tehnica Bergmann (1960);
- n microcamere de sticl;
- n picturi de mediu lichid (metoda micropicturii) n vase Petri;
- cultura n cre (nurse culture) - protoplatii sunt crescui pe o punte de hrtie
de filtru sau celofan aezate pe un strat de celule mam.
- cultura n dublu strat lichid + solid
- cultura pe pat de agar i discuri de agar (Shillito i colab., 1983; Dons i Bouwer,
1986).
Dup formarea peretelui celular condiiile de cretere sunt similare celor folosite la
cultura de celule izolate, att n ceea ce privete compoziia mediului de cultur ct i factorii
de cretere.
Cele mai bune condiii de cretere a protoplatilor se realizeaz la ntuneric sau lumin
de slab intensitate.
Dup formarea aglomerrilor de celule (microcalus) se trece la faza urmtoare, de
regenerare a noilor plante.
6. Regenerarea de noi plante
Posibilitatea regenerrii de noi plante este nc redus (Evans i Bravo, 1983; Binding
i colab., 1982).
Acest lucru a fost posibil pn n 1983 la 66 de specii din care 38, sunt din Familia
Solanaceae.

231
Factorii de care depinde regenerarea sunt:
- familia, specia i genotipul;
- nivelul de difereniere a materialului iniial;
- condiiile de cretere a materialului iniial;
- folosirea mediilor de cultur bogate: Kao i Michayluk pentru calus (1975), B5,
suplimentat cu 5-10% lapte de cocos, pentru embrioni i organe (Gamborg i colab., 1982) i
MS (Murashige & Skoog, 1962).
Avantajele hibridrii somatice sunt multiple:
- realizarea tetraploizilor, a amfidiploizilor i fuzionarea protoplatilor haploizi;
- hibrizi la plante cu probleme sexuale: organe incomplet/ insuficient dezvoltate,
sterilitate masculin etc.
- hibridare ntre plante juvenile nainte de primul nflorit;
- hibridare parial pentru obinerea hibrizilor asimetrici la care nu toi cromozomii
se combin dup fuziunea nuclear.
- realizarea transmiterii caracterelor citoplasmatice de la partenerul mascul
ereditatea citoplasmatic hibrizi citoplasmatici sterilitate masculin, rezisten la boli i
erbicide etc.
Problemele i dezavantajele hibridrii somatice sunt redate n continuare:
- lipsa unei metode eficiente de selecie a hibrizilor somatici;
- produii obinui sunt frecvent necorespunztori, neviabili, sterili, instabili etc.
- poate aprea formarea unui calus himeric n locul plantelor;
- apar amfidiploizi, care de regul sunt nedorii (4n);
- produii obinui au o variabilitate accentuat;
- nu se poate asigura transmiterea unui caracter dorit, datorit stabilitii genetice reduse;
- frecvent, la combinaii necompatibile, apare eliminarea cromozomilor strini;
- producia de cibrizi este nc slab dezvoltat;


232
11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singur celul
Dup izolarea unor celule, s-a pus problema stimulrii fiecreia dintre ele de a se
divide i eventual de a da natere unor lstari sau plante ntregi.
Primele rezultate pozitive au fost obinute de Muir i colab. (1954, 1958) care au
cultivat o celul pe o punte din hrtie de filtru, care a fost aezat apoi pe o bucat de calus
din care celula respectiv a provenit.
Extrgnd substanele hormonale i nutritive formate de calus prin puntea de filtru,
celula a nceput s creasc i s se divid.
Bergmann (1960), dup ce a filtrat o suspensie de celule de tutun i mazre, le-a
amestecat ntr-un mediu de cultur cu agar care era pe cale s se solidifice.
Dup dispersarea celulelor i ntrirea mediului de cultur, acestea au nceput
diviziunea i formarea calusului. Pentru stimularea proliferrii la acea dat se folosea 2,4 D i
laptele de cocos.
Alte ncercri reuite de inducere i de realizare a diviziunii unor celule izolate au
constat n cultivarea unor celule n micro-camere pe agar n vecintatea unor "celule-mam"
de calus (Strat, 1973).
Pentru obinerea celulelor izolate exist mai multe metode:
- filtrarea suspensiilor celulare prin site din diferite materiale;
- dezintegrarea calusului pe cale mecanic sau chimic prin adugarea de pectinoz;
- macerarea peretelui celular cu ajutorul unor enzime, urmat de separarea protoplatilor.
Ulterior acetia i refac membrana celular i ncep diviziunea;
- folosirea grunciorilor de polen pentru obinerea unor celule izolate;
- centrifugarea suspensiilor de celule i separarea acestora pe baza diferenelor de mas etc.
Obinerea unei culturi monocelulare este dependent de: genotip, densitatea celular,
rata diviziunii celulare n material iniial, vrsta materialului iniial, prezena calusului iniial,
compoziia mediului de cultur (Pierik, 1987).
Dup separarea celulelor, fiecare dintre ele se divid formnd calus din care vor lua
natere apoi lstarii sau embrionii somatici.
Culturile monocelulare au fost realizate cu succes la Nicotiana tabacum, Daucus
carota, Cichorium endivia, Asparagus officinalis, Brassica napus, Citrus sinensis, etc.




233
Capitolul 12
Baby plant

12.1. Consideraii generale
O aplicaie comercial a culturilor in vitro, destul de rspndit dup anii 80, este
baby plant. Acest nou produs se obine prin cultivarea unor specii horticole pe medii
colorate n vase din sticl decorative. Astfel realizat, este destinat valorificrii ca obiect
decorativ care poate tri 6- 12 luni sau chiar mai mult.
n momentul n care explantele au ocupat volumul interior al vasului n care au
crescut i mediul de cultur s-a epuizat, acestea se pot scoate n condiii in vivo, se pot
aclimatiza i trece la ghivece.
Crearea de baby plants a fost posibil prin mbinarea tehnicilor de micronmulire,
cu diverse modele de sticlrie i medii colorate. La baza acestor combinaii st bunul gust,
imaginaia i plcerea de a crea frumosul.
Produsele Baby plant pot nfrumusea orice spaiu interior, conferind prospeime i
culoare. Ele pot fi aezate pe mobila din sufragerie, pe consola din baie, pe noptiera din
dormitor, pe birou sau n apropierea unei ferestre.
Cnd sticluele cu baby plant sunt comercializate, ele sunt ntotdeauna nsoite de
cteva sfaturi practice de ntreinere:
- niciodat s nu se ndeprteze dopul;
- sticluele nu se expun direct la soare;
- se evit rsturnarea sau agitarea recipientului;
- se in la distan de orice surs de cldur.
Pentru realizarea produselor baby plant se folosesc plante care n principiu, trebuie
s rspund la urmtoarele cerine:
- s fie decorative;
- s aib cretere redus n timp pentru a nu ocupa rapid vasul de prezentare;
- s aib talii asemntoare;
- s aib cerine asemntoare fa de mediul de cultur i, n general s nu fie mari
consumatoare de substane nutritive;
- s nu-i modifice aspectul la cultivarea pe medii colorate;
234
- s nu aib cerine deosebite fa de factorii de mediu i s creasc bine la
temperatura camerei;
- s se aclimatizeze uor;
Dintre speciile cele mai folosite pentru realizarea de produse baby plant amintim:
Syngonium, Phylodendron, Vriestea, Spathiphylium, Aechemea, Cordyline, cactui i alte
specii de suculente etc.

12.2. Tipuri de produse i materiale folosite la producerea de baby plant
12.2.1. Vase din sticl
Varietatea gamei de modele i dimensiuni de vase n care se pot realiza baby plants
este impresionant. n aceast situaie, cel mai important rol l joac imaginaia fiecruia.
Se pot folosi vase de laborator de tip Erlenmeyer (100 ml), sticlrie destinat ambalrii
produselor alimentare (50ml,150ml, 250ml, 400ml), sticlue de parfum, vase pentru
servirea vinului, bomboniere, vase din cristal, etc.
Detaliind departamentul formelor recipientelor, putem vorbi despre vase cilindrice,
conice, tronconice, rotunde, ptrate, piramidale, prismatice, hexagonale, octogonale, de tip
par, turtite, bombate, cu sau fr mner, cu gt lung sau scurt, cu deschidere mai mult sau
mai puin larg, etc. Recipiente aparent banale, pot cpta o imagine deosebit folosindu-le
pentru baby plant.
n funcie de ocazia cu care sunt oferite produsele baby plants se pot alege forme
adecvate ale vaselor. De exemplu, pentru perioada Crciunului exist recipiente cu forma
unui brad sau a unui sfenic.
Este foarte important ca sticla s fie alb i perfect transpsrent pentru a nu
mpiedica n nici un fel captarea luminii i pentru a nu ngreuna vizibilitatea ctre
interiorul vasului.
Dimensiunea recipientului se coreleaz cu specia pentru a asigura acesteia spaiul
necesar dezvoltrii timp de mai multe luni.
12.2.2. Alte materiale
Deoarece produsele baby plant se realizeaz n condiii aseptice, trebuie alese
materiale cu care putem realiza acest lucru. Se pot utiliza dopuri de plastic, sticl, cauciuc
sau plut, capace metalice sau de plastic, iar pentru izolare silicon transparent, folie pentru
alimente, chip band sau band izolatoare.
235
Pentru a conferii produselor o valoare estetic deosebit se folosesc accesorii
adecvate fiecrei ocazii, de exemplu: panglici i nururi de diferite culori, dimensiuni i
combinaii, hrtie creponat sau pnz, ciucuri, flori artificiale i multe altele n funcie de
imaginaia fiecruia.

12.3. Folosirea mediilor de cultur colorate
Pentru colorarea mediilor de cultur, se pot folosi mai multe tipuri de substane care
trebuie s rspund la urmtoarele cerine:
- s nu fie toxice pentru plante;
- s nu determine colorarea esuturilor plantelor;
- s nu formeze compui toxici, prin descompunere sau prin reacie cu celelalte
componente ale mediului;
- s fi stabile i s nu se decoloreze prin autoclavare;
- s-i pstreze culoarea n timp, n condiii de iluminare natural i artificial.
n general este recomandat s se foloseasc colorani alimentari. n acelai timp, se
pot folosi colorani naturali, dar trebuie testat n prealabil persistena culorii n timp i
influena asupra explantelor (Groza I., 2004).
n tabelul 12.1. i graficul aferent, este ilustrat influena tipului de colorant asupra
ratei de multiplicare i creterii lstarilor de Sequoia sempervirens, dup o lun de cultur
pe mediu colorat.
236
Tabelul 12.1.
Comportarea explantelor de Sequoia sempervirens
pe medii de cultur colorate

Culoarea
mediului Colorantul
Cantitate/
100 ml mediu
Rata de
multiplicare
Lungimea
lstarilor (cm)
albastr
colorant
alimentar praf 0,02 g 11,00 2,95
galben
colorant
alimentar lichid 1 ml 16,00 5,91
violet
amestec colorant
albastru i rou 0,01 g+0,01 g 15,20 5,47
verde
amestec colorant
albastru i galben 0,01 g+0,01 g 8,00 6,46
roie
colorant
alimentar praf 0,02 g 7,80 3,35
]









S-a observat c pe mediile de cultur colorate mai nchis este stimulat formarea i
creterea rdcinilor.
237


a b


c
Foto 12.1. Testarea culorilor i unor specii de plante:
a Gasteria sp. b - Sequoia sempervirens, c - Drosera rotundifolia

238

a


b
Foto 12.2. Produse baby plant pregtite pentru livrare


239
Bibliografie selectiv

Al-Abta S. & Collin H.A. Control of embryoid development in tissue culture of celery.
Plant Sci. Lett. 16. 773-782, 1978
Austin S. & Cassells A.C. Variation between plants regenerated from individual calli
produced from separated potato stem callus cells. Plant Sci. Lett. 31, 107-114, 1983.
Aziz H.A. & Mccown B.H. Hormonal response curves of shoot and callus culture of
cucumber (Cucumis sativus L.). Hortscience 20, 540, 1985
Bagga S., Bhalla-Sarin N., Sopory S.K. & Guha-Mukhrenjee S. Comparison of in vitro
plant formation from somatic tissue and pollen grains in Brassica olearacea var.
botrytis. Phytomorph. 32, 152-156, 1982
Barba, M., Cupidi, A. - Il microinnesto del ciliegio e del pesco in vitro studio sull' idoneit dei
portinnesti. Frutticoltura 5, p: 37-41, 1989.
Barba, M., Cupidi, A., Ammirabile A. -Uso del microinnesto in vitro per il risanamento del
mandorlo. Frutticoltura 3, p:73-75, 1990.
Behki C., R.M. &Lesley S.M. Shoot regeneration from leaf callus of Lycopersicon
esculentum. Pflanzenphysiol. 90,83-87, 1980
Bigot C, Ohki S. & Mousseau J. Experimental data for a strategy for the improvement of the
shoot forming capacity in vitro. Acta Hort. 78, 125-132, 1977
Blackmon W.J., Reynolds B.D. In vitro shoot regeneration of Hibiscus acetosella,
muskmelon, watermenlon and winged bean. Horscience 17, 588-589, 1982
Blackmon W.J., Reynolds B.D. & Postek C.E. Production of somatic embryo from callused
cantaloupe hypocotyl explants. Hortscience 16, 451,1981b
Bloksberg L.N. & Saltveit M.E. Regenerating plants from axillary buds of field-grown
iceberg lettuce hearts. HortScience 20, 540, 1985
Bonner J. On the growth factor requirements of isolated tomato roots. Bull. Torrey Bot.
Club 70 184-189, 1940B
Bonner J. & Axtman G. The growth of plant embryos i vitro. Preliminary experiments on
the role of accessory substances. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 23, 453-457, 1937
Bonner J. & Bonner D. Ascorbic acid and the growth of plant embryos. Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. 24, 70-75, 1938
Bragdo Aas M. Regeneration of plants from, callus of potato tubers. Acta Hort. 78, 133-
137, 1977
240
Brezeanu A., Rou Ana, Mirancea D., Iordan M. (1983) - "Modificarea genetic a plantelor cu
ajutorul protoplatilor-perspective i limite". n: Lucr.celui de al II-lea Simp.Na. Cult.
Tes. Veg. Piteti, p. 61-64.
Browers M.A. & Orton T.J. A factorial study of chromosome variability in callus cultures
of celery (Apium graveolens). Plant Sci. Lett. 26, 65-73, 1982
Brown D.M. & Charlwood B.V. The control of callus formation and differentiation in
scented pelargoniums. J. Plant Physiol. 123 409-417, 1986
Bui Dang Ha D., Norreel B. & Masset T.A. Regeneration of Asparagus officinalis L.
through callus cultures derived from protoplasts. J. Exp. Bot. 26, 263-270, 1975
Butcher D.N. & Ingram D.S. Plant Tissue Culture. Inst. of Biology, Studies in Biology no
65. Edward Arnold, 1976
Cachi-Cosma, Dorina - Metode in vitro la plantele de cultur - baze teoretice i practice.
Editura Ceres, Bucureti, 1987.
Cachi-Cosma, Dorina, Petrescu C. - Curs practic de culturi de esuturi in vitro cu aplicaii n
legumicultur i floricultur. I.A.N.B., Atelierul de multiplicat cursuri, Bucureti,
1985.
Caplin S.M. & Steward F.C. Effect of coconut milk on the growth of explants from carrot
root. Science 108, 688-657, 1948
Capuano G., Piccioni E., Standardi A. Effect of different treatments on the conversion of
M.26 apple rootstock synthetic seeds obtained from encapsulated apical and axillary
micropropagated buds. Journal of Horticulture Science and Biotechnology, 73 (3),
299-305, 1998
Carswell G.K. & Locy R.D. Root and shoot initiation by leaf, stem and storage root
explants of Sweet potato. Plant Cell Tiss. Organ Cult.3, 299-236, 1984
Cepoiu, N.; Stnic, FI.; Dumitra, D.; Ioni-Mnzatu, Mirela; Mihila, Mariana; Cornea,
Cornelia - Carbon Dioxide Laser, as work technique in fruit tree biotechnology -
poster. 2nd International Symposium Biotehnos, "Biotechnology now& tomorow"
Lucrri, Volumul II, SP III, 1 pag., 29-30 septembrie, Bucureti 1994.
Chin C.K., Haas J.C. & Still C.C. Growth and sugar uptake of excised root and callus of
tomato. Plant Sci. Lett. 21, 229-234, 1981
Crisp P. & Walkey D.G.A. The use od aseptic meristem culture in cauliflower breeding.
Euphytica 23, 305-313, 1974
241
Crocomoco O.J., Sharp W.R. & Peters J.E. Plant morphogenesis and the control of callus
growth and root induction of Phaseolus vulgaris with the addition of bean seed
extract. Z. Pflanzenphysiol. 78, 456-460, 1976
Cupidi, A., Barba, M. - Produzione di materiale virus-essente esperienze di microinnesto in
vitro. Frutticoltura 5, p: 25-28, 1988.
Diaconescu Oana - Studiul influenei factorilor ecologici i a tehnologiei de cultur asupra
calitii andivelor, Lucrare de dizertaie, U.S.A.M.V.B., Facultatea de Horticultur,
2002
Diaconescu Oana, - The influence of culture medium on in vitro clonal regeneration on
witloof chicory (Cichorium intybus L.), Lucrri tiinifice U.S.A.M.V.B. Seria B, vol.
XLVI, 2003
Diaconescu Oana, Petrescu C. - Influena mediului de cultur asupra ratei de multiplicare in
vitro la cicoare (Cichorium intybus L.). Sesiunea tiinific a Facultii de
Horticultur, Iai, 2003
Diaconescu Oana, Petrescu C. - Research regarding the in vitro germination of some chicory
hybrids (Cichorium intybus L.), Lucrri tiinifice U.S.A.M.V.B. Seria B, vol. XLV,
2002
Dietert M.F., Barron S.A. & Yoder O.C. Effects of genotype on in vitro culture in the genus
Brassica. Plant Sci. Lett. 26, 233-240, 1982
Dodds J.H. & Roberts L.W. Experiments in plant tissue culture. Cambridge University
Press, Cambridge, London, New York, 1982
Doerschung M.R. & Miller C.O. Chemical control of adventious organ formation in
Lactuca sativa explants. Am. J. Bot. 54, 410-413, 1967
Dor C. Production de plantes homoyigotes mles et jemelles partir danthre dasperge,
cultives in vitro (Asparagus officinalis). Compt. Rend. Acad. Sci. Paris 278D, 2135-
2138, 1974
Dumas De Vaulx R., Chambonnet D. & Pochard E. Culture in vitro danthre de piment
(Capsicum annuum L.) : amlioration des taux dobtention de plantes chez diffrents
gnotipes des traitments +35C. Agronomie 1, 859-864, 1981
Dumitracu, Monica; Stnic, Fl.; Ion, Ligia. - Cercetri privind stabilirea protocolului de
nmulire in vitro a embrionilor imaturi la hibrizi interspecifici din genul Prunus.
Lucrrile celui de-al VII-lea Simpozion Naional de Culturi de esuturi i Celule
Vegetale, 58-62, Arad, 1997.
242
Dunstan D.I. & Short K.C. In vitro studies on organogenesis and growth in Allium cepa
tissue cultures. Acta Hort. 78, 139-148, 1977b
Eenik A.H. Preliminary results of research on storage and in vitro germination of lettuce
pollen as an aid in lettuce breeding. Euphytica 32, 521-526, 1983
Elliot R.F. Growth of excised meristem-tips of Rumara, Ipomoea batatas (Linn.) Poir in
axenic culture N.Z.J. Bot. 7, 158-166, 1969
Enescu, V., Ioni, Lucia, Palada-Nicolau, Magdalena - nmulirea vegetativ a arborilor
forestieri. Editura Ceres, Bucureti, 1994.
Engler D.E. & Grogan R.G. Isolation, culture and regeneration of lettuce leaf mesophyll
protoplasts. Plant Sci. Lett. 28, 223-229, 1983
Falcinelli M., Standardi A., Piccioni E. Il seme sintetico nelle piante agrarie: stato attuale
della ricerca. Riv. Sementi elette, XLII, nr. 1, 1997
Famiani, F., Ferradini, N., Standardi, A., Hoza, D. and Stnic, Fl. - In vitro regeneration of
different Actinidia species Acta Horticulturae No. 444, ISBN 9066058099 pp 133-138,
1997
Famiani, F.; Ferradini, N.; Hoza, D.; Standardi, A.; Stnic, Fl. - In vitro regeneration of
different Actinidia species. Proceedings of the III-Rd International Symposium on
Kiwifruit, Tessaloniki, 19-22 September 1995.
Ferradini, Nicoletta; Famiani, F.; Proietti, P.; Stnic, Fl. - Influence of growth regulators and
light on in vitro regeneration in M.26 apple rootstock. Journal of Horticultural Science
71 (5), 859-865, 1996.
Fridborg G., Pedersen M., Landstrom M. & Eriksson T. The effect of inhibiting
morphogenesis. Physiol. Plant. 43, 104-106, 1978
Fukami T. & Hildebrandt A.C. Growth and chlorophyll formation in edible green plant
callus tissues in vitro on media with limitated sugar supplements. Bot. Mag.: Tokyo
80, 199-212, 1967
Gl Ruxandra, Stnic Fl., Diaconescu Oana - Cercetri privind iniierea culturii in vitro de
Clematis vitalba, Lucrri tiinifice, Facultatea de Horticultur, UAMV Iai, 2003
Gl Ruxandra, Velcea M., Stnic Fl., Diaconescu Oana - Influena apei Pi asupra nmulirii
in vitro a smochinului (Ficus carica L.), Simpozionul internaional Apa un miracol
Ediia a III a, Bucureti 25-26 iunie, pp. 24-25, 2003
Gamborg O.L., Philips G.C. Plant Cell, Tissue and Organ Culture fundamental methods.
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1995
243
Gardi T., Piccioni E., Standardi A. - Effect of bead nutrient composition on regrowth of stored
vitro-derived encapsulated microcutting of diferent woody species, J.
Microencapsulation, vol. 16, nr. 1, 13-25, 1999;
Gavinlertvatana P. & Li P.H. The influence of 2,4 D and kinetin on leaf callus formation in
different potato species. Potato Res. 23, 115-120
George E.F., Puttock D.J.M., George H.J Plant Culture Media: Vol 1, Formulation and uses.
Exegetics Limited, Edington, 1987
George L. & Narayanaswamy S. Haploid Capsicum through experimental androgenesis.
Protoplasma 78, 467-470, 1973
Gleddie S., Keller W. & Setterfield G. In vitro morphogenesis from tissue, cells and
protoplasts of Solanum melongena L. Pp 139-140 in Fujiwara (ed), 1982
Goodwin P.B. An improved medium for the rapid growth of isolated potato buds. J. Exp.
Bot 17, 590-595, 1966
Gresshoff P.M. & Doy C.H. Development and differentiation of haploid Lycopersicon
esculentum (Tomato). Planta 107, 161-170, 1972b.
Griga M., Tejklova E., Novak F.J. & Kubalakova M. In vitro clonal propagation of Pisum
sativum L. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 6, 95-104, 1986
Grigore, Ana; Stnic, Fl. - Stabilirea metodologiei de micronmulire a unor specii i hibrizi
din genul Actinidia. Simpozionul omagial dedicat semicentenarului Universitii de
tiine Agricole a Banatului din Timioara, 1-3 iunie 1995.
Groza, Ioana, Stnic, Fl. - In vitro propagation of BA 29 quince rootstock, Abstracts 4th
International Symposium Biotehnos, Biotechnology now&tomorow, Bucureti, 26-27
Sept, SP 48/130, pp XLVIII-XLIX, 1996.
Groza Ioana Camelia, - Baby plant, o nou modalitate de promovare a culturilor in vitro la
plantele horticole. Lucrare de diplom, UAMV Bucureti, Facultatea de Horticultur,
2004.
Guha S. & Johri B.M. In vitro development of ovary and ovule of Allium cepa L.
Phytomorph. 16, 353-364, 1966
Gunay A.L. & Rao P.S. In vitro plant regeneration from hypocotyls and cotyledon explants
of red pepper. Plant Sci. Lett. 11, 365-372, 1978
Gunay A.L. & Rao P.S. In vitro propagation of hybrid tomato plants (Licopersicon
esculentum) using hypocotyls and cotyledon explants. Ann. Bot. 45, 205-207, 1980
Halperin W. Alternative morphogenetic events in cell suspesions. Am.J. Bot. 53, 443-453,
1966
244
Halperin W. & Wetherell D.F. Ammonium requirement for embryogenesis in vitro. Nature
205, 519-520, 1965
Handley L.W. & Chambliss O.L. In vitro propagation of Ciucumis sativus L. HortScience
14, 22-23, 1979
Hari V. Effect of cell density changes and conditioned media on carrot cell embryogenesis.
Z. Pflanzenphysiol. 96, 227-231, 1980
Havel L. & Novak F.J. Meristem tip culture of Allium cepa L. Scientia HOrt. 27, 209, 214,
1985
Herman E.B. & Haas G.J. Clonal propagation of Coffea Arabica L. from callus culture.
HortScience 10, 588-589, 1978
Hoza, D. - Culturi in vitro cu aplicaii n pomicultur. UAMV, Atelierul de multiplicat
cursuri, Bucureti, 1996.
Hoza, D.; Standardi, A; Stnic,. Fl.; Tudor, T.A. - Date preliminare privind cultura in vitro a
nucului (Juglans regia). Lucrri tiinifice USAB, seria B, vol. XXXV, 51-56, 1992.
Hunault G. Obtention de nouvelle souches de tissues partir de diverse espces de
Liliaces. Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 283D, 1401-1404, 1976
Hussey G. & Stacey N.J. In vitro propagation of potato (Solanum tuberosum L.) Ann. Bot.
48, 787-796, 1981
Ion, Ligia; Stnic, Fl.; Dumitracu, Monica; Peticil, A. - Cercetri privind cultura in vitro a
unor embrioni imaturi din genul Prunus. Sesiunea tiinific anual a cadrelor
didactice i studenilor, Bucureti, 11 decembrie 1997.
Iordan M., Rou Ana, Enescu V., Brezeanu A., Grigorescu A., Coman I. (1983) -
"Regenerarea de plante prin cultura in vitro la Quercus". n:Lucr. II-lea Simp. Na.
Cult. es. Veg.. Piteti, p.10-26.
Isouard G., Raquin C. & Demarly Y. Obtention de plantes haploids par culture in vitro
danthres dAubergine (Solanum melongena L.). Compt. Rend. Acad. Sci., Paris
288D, 987-989, 1979
Jarret R.L., Hasegawa P.M. & Erickson H.T. Factors affecting shoot initiation from tuber
discs of potato (Solanum tuberosum). Physiol. Plant. 49, 177-184, 1980 B
Jelaska S. Embroyd formation by fragments of cotyledons and hypocotyls in Cucurbita
pepo. Planta 103, 278-280, 1972
Johri B.M. & Guha S. - In vitro development of onion plants from flowers. Pp 215-223 in
Maheswari & Ranga Swamy (eds.), 1963
Kartha K.K. Meristem culture. Pp 19-24 in Wetter and Costabel (eds.), 1982
245
Kartha K.K., Gamborg O.L. & Constable F. Regeneration of pea (Pisum sativum) plants
from shoot apical meristems. Z. Pflanzenphysiol. 72, 172-176, 1974b
Koevary K., Rappaport L. &Morris L.L. Tissue culture propagation of head lettuce.
HortScience 13, 39-41, 1978
Lakon, G.- Tho topografical tetrasolium method for determined the germinating capacity of
seeds. Plant Phys., 24. p:389-994, 1949.
Lamport D.T.A. Cell suspension cultures of higher plants: isolation and growth energetics.
Exp. Cell Res. 33, 195-206, 1964
Lazarte J.E. & Sasser C.C. Asexual embryogenesis and plantlet development in anther
culture of Cucumis sativus HortScience 17, 88, 1982
Leelavahti S., Reddy V.S. & Sen S.K. Somatic cell genetic studies in Brassica sp. I High
Frequency production of haploid plants in Brassica alba (L.) H.f. & T. Plant Cell Rep.
3, 102-105, 1984
Marani F. & Pisi A. Meristem-tip culture and vegetative propagation in potato. Acta Hort.
78, 415-422, 1977
Morel G. & Martin C. Curing potatoes infected with vitus. C.R. hebd. Sance. Acad. Agric.
Fr. 41, 472-473, 1955
Murashige, T. - A technique of shoot apex grafting and its utilization toward recovering virus
citrus clones. Hortic. Science 7, p:118-119, 1972
Neculae Luminia, Teodorescu A. Rezultate privind micronmulirea portaltoiului de mr
MM 106 n condiii diferite de iluminare. Abstracts 3
rd
International Symposium
Biotehnos, Biotechnology now & tomorrow 19-20 octombrie, B 12, Bucureti, 1995
Neri, D.- Tecniche da innesto con materiale proveniente da colture in vitro. Frutticoltura 3, p:
69-72, 1990.
Nielsen L.V. In vitro bulbet formation from leaf segments of lilies, especially Lilium
rubellum. Scientia Hort. 11, 379-390, 1960
Pelletier G., Raquin C. & Simon G. La culure in vitro danthres dAsperge (Asparagus
officinalis). Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 274D, 848-851, 1972
Pence V.C. & Caruso J.L. Effects of IAA and four IAA conjugates on morphogenesis and
callus growth from tomato leaf discs. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 3, 101-110, 1984
Piccioni E., Standardi A., uuianu V.C. Storage of M 26 apple rootstock encapsulates
microcuttings. Adv. HortScience, 10, 185-190, 1996
Pierik R.L.M. In vitro culture of higher plants Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht,
1987
246
Pink D.A.C. & Walkey D.G.A. Rapid propagation of Cucurbita pepo L. by culture of
meristem tips. Scientia Hort. 24, 107-114, 1984
Pliego-Alfaro, F., Murashighe, T.- Possible rejuvenation of adult avocado by greffage onto
juvenile roctstock in vitro. Hortscience, Vol.22 (6),p: 1321-1324, 1987.
Quoirin M., Lepoivre P. Etudes de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus. Acta
Horticulturae, 78: 437-442. 1977
Raicu Petre, Badea, Elena Marcela - Cultura de celule i biotehnologiile moderne. Editura
tiinific i Enciclopedic, Bucureti, 1986.
Raicu Petre i colab. - Culturi de celule i esuturi vegetale aplicaii n agricultur, Ed.
Ceres, Bucureti, 1984;
Resende R.O. & Paiva M. Eradication of potato viruses X and S by meristem-tip culture.
hortScience 20, 525, 1985
Reuther G. Chapter 8 Asparagus. Pp 211-242 in Sharp et al (eds.), 1984
Rou Ana - An efficient method for rooting of in vitro propagated roses-XXV-th Annual
Meeting of ESNA, Piacenza, Italy, 1995
Rou Ana - Elemente de biotehnologii vegetale aplicaii n ameliorare, Ed. Ametist 92,
Bucureti, 1999
Rou Ana, Brezeanu A., Iordan M. - Micropropagation in Vitis vinifera L. III: Studies
regarding in vitro stimulation of multiple axillary shoot development in some
grapevine cultivars for clonal multiplication. Rev. Roum. Biol., Biol. veg., 28 (2).,
1983
Rou Ana, Grigorescu A. -Multiplicarea clonal prin tehnicile de culturi de esuturi la
Paulownia tomentosa. Studii Cerc.Biol., Biol. Veg., 1, 1984
Rou Ana, Indrea A., Sfetcu D. (1992) - A method of in vitro rescue of hybrid embryos from
crosses between seeded x seedless table varieties in grapevine (Vitis vinifera L.).
Abstract published in: Proceed. of NATO ASI Seminar Plant Morphogenesis-
Molecular Approaches, Heraclio, Crete., 1992
Rou Ana, Iordan M., Brezeanu A., Volosciuc E. - Cercetri privind utilizarea calusului de
Daucus carota n scopul obinerii de produi secundari de importan farmaceutic.
Studii i Cercetri de Biologie, Biol. Veget. 34 (1)., 1982
Rou Ana, Skirvin R. M., Bein A., Norton M.A., Kushad M., Otterba Cher A.G. - The
development of putative adventitious shoots from a chimeral thornless rose (Rosa
multiflora) in vitro. Journal of Horticultural Science (1995) 70 (6), 1995
247
Rou Ana, Skirvin R.M. - In vitro culture of plant chimeras. Implications in horticulture -
Book of Abstract - XXIV.th Annual Meeting of ESNA, Varna, Bulgaria , 1994
Rou, Ana Elemente de biotehnologii vegetale-aplicaii n ameliorare. Editura Ametist 92,
Bucureti, 1999.
Svulescu, Anca, Buliga, A., Stnic Fl. - Influence of X structured waters on in vitro
organogenesis of apple varieties and mother plant, Abstracts 4th International
Symposium Biotehnos, Biotechnology now&tomorow, Bucureti 26-27 Sept., B2, 3/7,
pp XII, 1996
Smith R.H. & Murashige T. In vitro development of the isolated shoot apical meristems of
angiosperms. Am.J.Bot. 57, 5623-568, 1970
Sopory S.K. & Tan B.H. Regeneration and cytological studies and anther and pollen calli of
dihaploid of Solanum tuberosum. Z. Pflanzenzcht. 82, 31-35, 1979
Standardi A., Micheli M., Piccioni E. Propagazione in vitro dellolivo: acquisizioni e
prospettive. Riv. Frutticoltura Nr. 7/8, 1998
Standardi A., Piccioni E. - Recent perspectives on synthetic seed technology using
nonembryogenanic n vitro-derived explants, Int. J. Plant Sci. 159(6):968-978, 1998
Standardi A., Piccioni E. - Rooting induction n encapsulated buds of M.26 apple rootstock
for synthetic seed, biology of root formation and development, Plenum press, New
York, 1997;
Stnic Fl. Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro. Editura
Grand, Bucureti, 1999
Stnic Fl., Armeanu Ileana - Influence quantification of some factors implied in the kiwifruit
in vitro organogenesis Scientifical Papers UAMV Bucureti, Serie B, Vol. XLVII,
ISBN 973-7753-04-6, Invel Multimedia, 2004
Stnic Fl., Dumitracu M., Davidescu V., Madjar R., Peticil A. - nmulirea plantelor
horticole lemnoase, Format electronic, Editura Invel Multimedia, Bucureti, ISBN
973-86341-4-8, 2003
Stnic Fl., Dumitracu M., Davidescu V., Madjar R., Peticil A. - nmulirea plantelor
horticole lemnoase, Editura Ceres, Bucureti, ISBN 973-40-0558-8, 431 pg., 2002
Stnic Fl., Gl Ruxandra, Diaconescu Oana - Cercetri privind nmulirea in vitro a
smochinului (Ficus carica L.), Lucrri tiinifice, Facultatea de Horticultur, UAMV
Iai, 2003
248
Stnic Fl., Gl Ruxandra, Velcea M., Diaconescu Oana - Rezultate preliminare privind
folosirea apei Pi la micronmulirea in vitro a unor soiuri de mr - Simpozionul
Internaional Apa un miracol Ediia a II a, Bucureti, 25-26.06, pp. 12 , 2002
Stnic Fl.; Hoza, D.; Lzureanu, C. - The micro-grafting of fruit-growing plants
(Microaltoirea plantelor pomicole). Bioterra 1: 33-38, Bulletin of Scientific
Information, Athenaeum Academic University, Faculty of Horticultural. Sciences and
Bioengineering, Bucureti, 1992.
Stnic, Fl. - Organogenesis via callus in kiwifruit hybrid plants (Actinidia deliciosa Chev. x
Actinidia arguta Sieb. e Zucch.). European Society for New Methods in Agricultural
Research (ESNA) XXVIII-th Annual Meeting, WG. 4, 151, Brno, 25-29 august, 1998.
Stnic, Fl. Rezultate preliminare privind micronmulirea in vitro a curmalului chinezesc
(Ziziphus jujuba Mill.). Lucrrile Simpozionului "Horticultura Clujean XX", Cluj-
Napoca, 236-238, 19-20 iunie 1997.
Stnic, Fl., Cepoiu N., Standardi A., Zuccherelli G.- Aspects of in vitro organogenesis in
Actinidia plants. 2nd International Symposium Biotehnos, "Biotechnology
now&tomorow", Lucrri, Volumul I, B10, 13 pag., 29-30 septembrie, Bucureti 1994.
Stnic, Fl.; Cepoiu, N.; Dumitracu, Monica - Double layer and culture medium composition
on in vitro propagation of BA 29 and EM-C quince rootstocks. European Society for
New Methods in Agricultural Research (ESNA) XXVI-th Annual Meeting, 145, 12-16
septembrie, Buteni, 1996.
Stnic, Fl.; Groza, Ioana; Cepoiu, N.; Standardi, A. - Influence of inductive factors on M.26
apple rootstocks organogenesis from leaf blade. Abstracts 3rd International
Symposium Biotehnos, "Biotechnology now & tomorow" 19-20 octombrie, B 11,
Bucureti, 1995.
Stnic, Fl.; Hoza, D.; Cepoiu, N. - Organogeneza in vitro la plantele hibride de kiwi
(Actinidia deliciosa Chev. x Actinidia arguta Sieb. e Zuch.). Lucrrile Simpozionului
omagial dedicat semicentenarului Universitii de tiine Agricole a Banatului din
Timioara, 1-3 iunie 1995.
Stnic, Fl.; Standardi, A; Hoza, D.; Tudor, T.A. - Cercetri privind micronmulirea dafinului
(Laurus nobilis L.). Lucrri tiinifice USAB, seria B, vol. XXXV, 83-90, 1992.
Teodorescu A., Neculae Luminia Cercetri pentru stabilirea biotehnologiilor de nmulire a
unor specii pomicole i dendrologice i stadiul aplicrii acestora n producie. 2
nd

International Symposium Biotehnos, Biotechnology now & tomorrow, Lucrri, Vol.
I, B10, 13 pag., 29-30 sept., Bucureti, 1994
249
Teodorescu A., Neculae Luminia Rezultate privind nrdcinarea n condiii septice a
minibutailor unor specii horticole nmulite in vitro. Abstracts 4
th
International
Symposium Biotehnos, Biotechnology now & tomorrow, 26-27 sept., SP 50,
Bucureti, 1996
Walkey D.G.A., Neeley H.A. & Crisp P. Rapid propagation of whitw cabbage by tissue
culture. Scientia Hort. 12, 99-107, 1980
Yan R.L., G.R. Liu, L. Zhang, Z.X. Wang, E.Q. Yang, - Effect of exogenous plant hormones
on rapid multiplication of Ziziphus jujuba test-tube plants, Journal of Fruit Science, 7,
4, 231-233, 1990.
Yang H.J. & Clore W.J. Obtaining virus-free plants from Asparagus officinalis L. by
culturing shoot tips and apical meristems. HortScience 11, 474-475, 1976.
Zucherelli G.- Metodologie nelle moltiplicazione, industriale in vitro dei portinnesti clonali
del pesco. Pescomandorlo GF 677, Susino GF 43, Damasco 1869, San Giuliene 655/2.
Atti Convegno Tecniche di coltura in vitro per la propagazione su vasta scala delle
specie ortoflorofrutticole p: 147-154, 1979.
Zucherelli G.- Moltiplicazione in vitro di cinque varieta di nocciolo e loro micorizazione con
Tuber melanosporum. LInformatore Agrario, Verona, XLVI (41), 1990
Zucherelli G., Capaccio V. Micorrizazione del castagno con simbionti a carpoforo edule.
Pianfei-Cuneo, 9 novembre 1990
Zucherelli G., Zucherelli S., Capaccio V. Production in vitro of two hazelnut varieties and
results about inoculum of Tuber magnatum pico on a mass scale. Acta Horticulture
351
*** - Colecia revistei Frutticoltura. Edagricole, Bologna, 1990-1995
*** - Colecia revistei Plant Cell Tissue and Organ Culture, Martinus Nijhoff Publishers,
1990-1997
*** - Sigma Plant Culture Catalg, 1994
*** - Tehnici moderne de producere a materialului sditor pomicol. I.C.P.P. Mrcineni,
Piteti 1983
*** Abstracts VIIth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture Amsterdam,
June 24-29 1990.

Editur de Carte Electronic

din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL
str. Belizarie nr 1, bl. 21/5, sc. 1, ap. 2, sector 1 - Bucureti, PO Box 63-110
tel.: 0723.20.50.48; fax: 021/430.35.42; e-mail: invel_multimedia@pcnet.ro
Avem tehnologia ...
dar i uneltele, pentru a v oferi:

carte electronic CD personalizat
CD multimedia paper to digital text
desen proiectiv digital 2D CD film
DTP consultan birotic/office/IT

OFERT SPECIAL
GRATUIT
n primul trimestru
al anului 2005
prelucrm
teze de doctorat n
format electronic
ing. Florin STNIC
Co
Acad. David DAVIDESCU
ordonator tiinific
TEZ DE DOCTORAT
Cercetri
experimentale
privind
fertilizarea
n livezi
1996



Evaluarea
mainilor i
echipamentelor
American Society of Appraisers
CD carte CD carte CD carte CD carte CD carte


SCIENTIFICALLY PAPERS
HORTICULTURE
MINISTRY OF EDUCATION AND RESEARCH
UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES
AND VETERINARY MEDICINE BUCHAREST
SERIA B - XLV - 2002
SERI A B - XLVI - 2003

CD curs universitar CD lucrri tiinifice CD colecie reviste 2 CD carte + film 2 CD carte + film


CD film CD film CD film CD film CD film
























ISBN 973-7753-07-0