Sunteți pe pagina 1din 251

Florin Stănică

Microînmulţirea plantelor horticole

Florin Stănică Microînmulţirea plantelor horticole Editura INVEL-Multimedia Bucureşti, 2004

Editura INVEL-Multimedia Bucureşti, 2004

Referenţi ştiinţifici:

Prof. univ. dr. Corneliu Petrescu Prof. univ. dr. Alexandru Teodorescu

© 2004 Versiune electronicã INVEL-Multimedia Toate drepturile rezervate.

Nici un fragment din această publicaţie nu poate fi reprodus, stocat într-un sistem de recuperare a informaţiilor sau transmis sub orice formă sau prin orice mijloace electronice, mecanice, fotocopiere, înregistrare sau de altă natură, fără permisiunea prealabilă, în scris, a editurii şi autorului.

INVEL-Multimedia din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL str. Fabrica de Chibrituri nr. 24-26, sector 5, Bucureşti Tel./Fax: 021/430.35.42, e-mail: invel_multimedia@pcnet.ro Colecţia www.teze_de_doctorat.ro

ISBN 973-7753-07-0

Dedic această lucrare studenţilor şi colaboratorilor mei

Cuvânt înainte

Într-o eră în care progresul ştiinţei şi tehnicii a dus omul în cosmos, în adâncurile oceanului, i-a permis să atingă viteze supersonice şi să dezvolte inteligenţa artificială, culturile in vitro de celule şi ţesuturi vegetale au apărut, au evoluat şi s-au dezvoltat în acelaşi ritm. Pătrunderea în universul celulei, în intimitatea proceselor fiziologice şi manipularea materialului genetic sunt realizări comparabile cu cele prezentate mai sus, având aceeaşi importanţă pentru umanitate. Suntem în prezent în plină revoluţie biotehnologică, materializată printr-un volum imens de aplicaţii practice ale culturilor in vitro în domeniul ştiinţelor agricole, biologice, medicale, în farmacologie şi industria alimentară, în industria cosmetică, a coloranţilor naturali

şi a substanţelor bioactive.

Cercetările în biotehnologie vizează rezolvarea unor probleme majore ale omenirii cum sunt: criza energetică, malnutriţia, valorificarea şi conservarea resurselor genetice, reciclarea materiei organice, luarea în cultură şi valorificarea terenurilor degradate, reducerea poluării mediului înconjurător. Apărută dintr-o necesitate obiectivă, lucrarea “Microînmulţirea plantelor horticole”, aflată la a doua ediţie, actualizată şi completată, tratează un domeniu care stă la baza oricărui tip de producţie agricolă: obţinerea de material săditor şi semincer cu înaltă valoare biologică. Concepută ca un instrument de lucru, “Microînmulţirea plantelor horticole” face în

prima parte, o prezentare amplă a dotărilor laboratorului de culturi in vitro., o trecere în revistă

a componentelor mediilor de cultură, pentru a insista în continuare, asupra modului de

preparare şi sterilizare a acestora. Un capitol aparte este destinat sterilizării şi asepsiei în culturile in vitro. Materialul abundă în informaţii utile, tabele ajutătoare, scheme de lucru şi fotografii sugestive, utile organizării activităţii în domeniul culturilor in vitro. În a doua parte a lucrării, sunt prezentate pe larg principalele tehnici folosite pentru microînmulţirea plantelor in vitro. Sunt prezentate, în tabele sintetice, rezultatele cercetărilor pe tipuri de culturi, la principalele specii horticole.

4

Sunt prezentate, de asemenea alte tehnici de cultură in vitro cu aplicabilitate în ameliorarea plantelor horticole, conservarea resurselor genetice, fitopatologie. O noutate în literatura de specialitate românească este capitolul referitor la baby plant, o gamă de produse decorative obţinute in vitro şi deosebit de apreciate pe piaţă. Lucrarea se înscrie pe linia continuării tradiţiei învăţământului horticol bucureştean în domeniul biotehnologiilor aplicate în horticultură şi este un instrument util la îndemâna specialiştilor, cadrelor didactice, studenţilor, cercetătorilor şi tuturor celor care activează în acest domeniu de vârf al ştiinţei. Adresez cu această ocazie mulţumiri, colaboratorilor mei, şef lucrări dr. Monica Dumitraşcu, şef lucrări dr. Adrian Peticilă, drd. ing. Oana Diaconescu şi drd. ing. Ruxandra Gâlă, referenţilor ştiinţifici şi Editurii INVEL-Multimedia. Tuturor celor care se vor apleca asupra acestei lucrări, o vor studia şi analiza critic, le adresez mulţumirile mele şi invitaţia de a ne transmite opiniile lor la adresa flstanica@yahoo.co.uk, ajutându-ne astfel, să îmbunătăţim ediţiile viitoare.

Bucureşti, august 2004

Conf. univ. dr. Florin STĂNICĂ

5

CUPRINS

CAPITOLUL 1. Istoricul culturilor in vitro

CAPITOLUL 2. Laboratorul de culturi in vitro

2.1. Aspecte generale

2.2. Zona nesterilă

2.2.1. Camera de păstrare şi pregătire a materialului vegetal

2.2.2. Magazia de materiale

2.2.3. Magazia de substanţe chimice

2.2.4. Camera pentru pregătirea mediilor de cultură

2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultură şi presterilizarea materialului vegetal

2.2.6. Magazia pentru medii de cultură

2.2.7. Camera de creştere

2.2.8. Camera (spaţiile) de aclimatizare

2.2.9. Sera şi solariile

2.2.10. Spălătorul

2.3. Zona sterilă

CAPITOLUL 3. Mediile de cultură şi prepararea lor.

3.1. Constituenţi cu rol nutritiv

3.1.1. Constituenţi minerali

3.1.1.1. Macroelementele

3.1.1.2. Microelementele

3.1.2. Constituenţi organici

3.1.2.1. Carbohidraţii

3.1.2.2. Aminoacizii

3.1.2.3. Vitaminele

3.2. Constituenţi cu rol fitoregulator.

3.2.1. Auxinele

3.2.2. Citochininele

3.2.3. Giberelinele

3.2.4. Alte substanţe cu rol fitoregulator

3.3. Constituenţi cu rol stabilizator.

3.3.1. Apa

3.3.2. Agenţii de solidificare

3.3.3. Stabilizatorii osmotici şi de pH

3.3.4. Substanţele antioxidante şi absorbante

3.4. Concentraţii. Prepararea soluţiilor stoc.

3.5. Prepararea mediului de cultură

3.6. Probleme care apar la pregătirea şi folosirea mediilor de cultură.

CAPITOLUL 4. Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro.

4.1. Agenţi sterilizanţi

4.2. Sterilizarea vaselor de cultură şi a instrumentarului folosit

4.2.1. Închiderea vaselor de cultură

4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultură

4.2.3. Sterilizarea instrumentarului

6

4.3.

Sterilizarea mediului de cultură şi a apei

4.4. Dezinfectarea materialului vegetal

4.5. Contaminările şi detectarea lor

CAPITOLUL 5. Microînmulţirea plantelor horticole

5.1. Consideraţii generale

5.2. Fazele microînmulţirii in vitro

5.2.1. Pregătirea materialului vegetal

5.2.2. Iniţierea şi stabilizarea

5.2.3. Multiplicarea

5.2.4. Înrădăcinarea

5.2.5. Aclimatizarea

5.3. Cultura de meristeme şi apexuri

5.3.1. Clasificarea meristemelor

5.3.2. Cultura de meristeme

5.3.3. Cultura de apexuri

5.4. Cultura de fragmente uninodale

5.5. Cultura de lăstari axilari

CAPITOLUL 6. Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro

6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme

6.2. Microaltoirea

6.2.1. Microaltoirea in vitro

6.2.2. Microaltoirea in vivo

6.2.3. Microaltoirea ex vitro

6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro

CAPITOLUL 7. Organogeneza in vitro

7.1. Organogeneza directă

7.1.1. Organogeneza adventivă de lăstari

7.1.2. Organogeneza adventivă de rădăcini

7.2. Organogeneza indirectă

CAPITOLUL 8. Embriogeneza somatică

8.1. Formarea embrionilor somatici

8.2. Embriogeneza somatică directă

8.3. Embriogeneza indirectă

8.4. Poliembrionia nucelară

8.5. Încapsularea materialului vegetal in vitro

8.5.1. Sămânţa sintetică

8.5.2. Încapsularea unor organe şi ţesuturi in vitro

CAPITOLUL 9. Embriocultura in vitro la plantele horticole

CAPITOLUL 10. Producerea haploizilor

10.1. Aspecte generale

10.2. Androgeneza in vitro

10.3. Fecundarea in vitro

7

CAPITOLUL 11. Cultura de calus in vitro.

11.1. Cultura de calus

11.2. Cultura de protoplaşti şi hibridarea somatică

11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singură celulă

CAPITOLUL 12. Baby plant

12.1. Consideraţii generale

12.2. Tipuri de produse şi materiale folosite la producerea de baby plant

12.2.1. Vase din sticlă

12.2.2. Alte materiale

12.3. Folosirea mediilor de cultură colorate

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

8

CONTENTS

CHAPTER 1. History of in vitro cultures

CHAPTER 2. In vitro culture laboratory

2.1. General aspects

2.2. Unsterile area

2.2.1. Biological material preparation room

2.2.2. Materials storage room

2.2.3. Chemical storage room

2.2.4. Culture media preparation room

2.2.5. Culture media and biological material sterilization room

2.2.6. Culture media storage room

2.2.7. Growth chamber

2.2.8. Acclimation room

2.2.9. Greenhouse and tunnels

2.2.10. Washing room

2.3. Sterile area

CHAPTER 3. Culture media and their preparation

3.1. Nutrients

3.1.1. Mineral compounds

3.1.1.1. Macro elements

3.1.1.2. Microelements

3.1.2. Organic compounds

3.1.2.1. Carbohydrates

3.1.2.2. Amino acids

3.1.2.3. Vitamins

3.2. Growth regulators

3.2.1. Auxins

3.2.2. Cytokinins

3.2.3. Giberellins

3.2.4. Other growth regulators

3.3. Stabilization compounds

3.3.1. Water

3.3.2. Gelling compounds

3.3.3. Osmotic and pH stabilizers

3.3.4. Antioxidants and absorbents

3.4. Concentrations. Preparation of stock solution.

3.5. Culture medium preparation

3.6. Problems connected to the culture media preparation and use

CHAPTER 4. Sterilisation and asepsis for in vitro cultures

4.1. Sterilising agents

4.2. Culture vessels and tools sterilisation

4.2.1. Culture vessels closure

4.2.2. Culture vessels sterilisation

4.2.3. Tools sterilisation

4.3. Culture medium and water sterilisation

9

4.4.

Biological material disinfection

4.5. Contamination and their detection

CHAPTER 5. Horticulture plants micropropagation

5.1. General aspects

5.2. In vitro micropropagation stages

5.2.1. Biological material preparation

5.2.2. Initiation and stabilisation

5.2.3. Multiplication

5.2.4. Rooting

5.2.5. Acclimatisation

5.3. Meristem and apex culture

5.3.1. Meristem classification

5.3.2. Meristem culture

5.3.3. Apex culture

5.4. Single node culture

5.5. Axillary shoots culture

CHAPTER 6. Horticultural plants virus elimination using in vitro cultures

6.1. Virus elimination using meristem cultures

6.2. Micrografting

6.2.1. In vitro micrografting

6.2.2. In vivo micrografting

6.2.3. Ex vitro micrografting

6.3. Virus free plant obtaining using other in vitro techniques

CHAPTER 7. In vitro organogenesis

7.1. Direct organogenesis

7.1.1. Adventitious shoot organogenesis

7.1.2. Adventitious root organogenesis

7.2. Indirect organogenesis

CHAPTER 8. Somatic embryogenesis

8.1. Somatic embryo formation

8.2. Direct somatic embryogenesis

8.3. Indirect somatic embryogenesis

8.4. Nucellar poliembriony

8.5. In vitro encapsulation of biological material

8.5.1. Synthetic seed

8.5.2. In vitro encapsulation of tissues and organs

CHAPTER 9. In vitro embrioculture in horticultural plants

CHAPTER 10. Haploid production

10.1. General aspects

10.2. In vitro androgenesis

10.3. Test-tube fertilisation

10

CHAPTER 11. In vitro callus culture

11.1. Callus culture

11.2. Protoplast culture and somatic hybridisation

11.3. Plant regeneration from a single cell

CHAPTER 12. Baby plant

12.1. General considerations

12.2. Products and materials used for baby plant production

12.2.1. Glass ware

12.2.2. Other materials

12.3. Use of coloured culture media

SELECTIVE REFERENCES

11

Capitolul 1 Istoricul culturilor in vitro Cultivarea in vitro a unor celule şi ţesuturi vegetale

Capitolul 1 Istoricul culturilor in vitro

Cultivarea in vitro a unor celule şi ţesuturi vegetale este o ramură a ştiinţelor biologice ale căror începuturi corespunde cu începutul secolului XX. Evoluţia sa de-a lungul timpului a fost demnă de secolul “vitezei” astfel încât, în aceşti ultimi ani, vorbim de un ansamblu de tehnici şi metode in vitro grupate generic sub numele de biotehnologii vegetale. Teoria care a stat la baza acestei ştiinţe a fost lansată însă cu mult timp înainte. În 1838, Schleiden şi Schwan au afirmat că celulele vegetale sunt, într-o oarecare măsură, autonome şi capabile să regenereze părţi din plante sau plante întregi. Această proprietate a fost numită totipotenţă şi a reprezentat o adevărată provocare pentru un mare număr de oameni de ştiinţă. Primele încercări nereuşite de a cultiva ţesuturi vegetale in vitro s-au datorat lui Haberlandt (1902). Au urmat apoi numeroase tentative care au deschis calea spre tot atâtea domenii noi de cercetare. Abia în 1939, după descoperirea rolului hormonilor în creşterea şi dezvoltarea plantelor, Nobecourt, Gautheret şi White au obţinut primele succese reale prin cultivarea in vitro timp de mai multe subculturi a calusului. După al doilea război mondial, culturile in vitro s-au dezvoltat rapid datorită multiplelor domenii de aplicabilitate: înmulţirea industrială a plantelor, genetică, ameliorarea plantelor, inginerie genetică, conservarea resurselor genetice, producţia industrială de substanţe utile. Trebuie adăugat şi rolul avut în dezvoltarea unor studii de anatomie şi fiziologia vegetală, fitopatologie, etc. Stadiul atins în prezent deschide perspective ample în zorii mileniului III în ceea ce priveşte manipularea materialului genetic şi dirijarea proceselor de înmulţire, creştere şi dezvoltare a plantelor în vederea obţinerii unor noi forme productive. Speranţele umanităţii se îndreaptă spre găsirea unor soluţii pe termen lung pentru asigurarea necesarului de hrană pentru o populaţie aflată în creştere rapidă. Aceste soluţii pot fi căutate în multitudinea de posibilităţi pe care biotehnologiile in vitro le au în ceea ce priveşte valorificarea superioară a resurselor genetice şi modelarea

12

acestora în folosul omului. Pe lângă obiectivul creşterii productivităţii ecosistemelor agricole, se urmăreşte obţinerea unor plante de cultură care să poată valorifica zonele neproductive, deşertice, sărăturate, etc. În acelaşi timp se are în vedere extinderea şi perfecţionarea tehnologiilor de obţinere a unor noi produse de biosinteză, cu aplicabilitate în industria alimentară, farmaceutică, în industria coloranţilor, zootehnie. Cineva spunea parafrazându-l pe Malraux, că: ”Secolul XXI va fi un secol al biotehnologiei sau nu va fi deloc”. În tabelul 1.1. sunt prezentate cele mai importante etape din evoluţia biotehnologiilor vegetale.

Tabelul 1.1.

Istoricul culturilor vegetale in vitro

Anul

Ipoteze, teorii, încercări, realizări

Autorii

0

1

2

1838

Teoria totipotenţei celulare

Schleiden şi

Schwan

1892

Plantele sintetizează substanţe care sunt distribuite polar

Sachs

1902

Primele încercări de culturi de ţesuturi vegetale

Haberlandt

1904

Prima încercare de embriocultură la crucifere

Hönnig

1909

Prima fuziune de protoplaşti nereuşită

Kuster

1922

Germinarea seminţelor de orhidee in vitro în absenţa simbionţilor

Kundson

1922

Cultura in vitro a apexurilor de rădăcină

Robbins

1925

Embriocultura aplicată în încrucişările interspecifice la Linum

Laibach

1929

Folosirea embrioculturii pentru înlăturarea incompatibilităţii la încrucişare

Laibach

1934

Primele încercări nereuşite de cultivare a ţesutului cambial la arbori şi arbuşti

Gautheret

1934

Cultivarea in vitro a rădăcinilor de tomate

White

1936

Embriocultura la diferite gimnosperme

La Rue

13

Continuare tabelul 1.1.

0

1

2

1939

Creşterea timp de mai multe subculturi a calusului obţinut din ţesuturi vegetale

Nobecourt, Gautheret, White

1940

Cultivarea ţesutului cambial de Ulmus şi studierea formării lăstarilor adventivi

Gautheret

1941

Folosirea pentru prima dată a laptelui de cocos pentru cultivarea embrionilor de Datura

Van Overbeek

1944

Prima cultură de Nicotiana tabacum pentru studierea formării de lăstari adventivi (organogeneza directă)

Skoog

1945

Cultura unor specii de Asparagus in vitro

Loo

1946

Obţinerea primelor plante de Lupinus şi Tropaeolum

Ball

1948

Organogeneza directă de lăstari şi rădăcini la tutun sub influenţa raportului auxină/adenină

Skoog şi Tsui

1950

Regenerarea unor organe din calus la Sequoia sempervirens

Ball

1952

Obţinerea de plante de Dhalia devirozate prin culturi de meristeme

Morel şi Martin

1952

Realizarea primelor microaltoiri

Morel şi Martin

1953

Obţinerea calusului haploid la Gingko biloba din polen

Tulecke

1954

Obţinerea unei plante întregi dintr-o singură celulă

Muir şi colab.

1955

Descoperirea chinetinei

Miller şi colab.

1956

Realizarea primelor culturi celulare în suspensie pentru obţinerea de produşi secundari

Tulecke şi Nickell

1957

Descoperirea influenţei raportului citochinine/auxine asupra proceselor de organogeneză

Skoog şi Miller

1958

Regenerarea in vitro a unor embrioni somatici din nucelă la Citrus

Maheshwari şi

Rangaswamy

1958

Regenerarea de pro-embrioni din calus şi suspensii celulare la Daucus carota

Reinert şi Steward

1959

Publicarea primei cărţi privind cultura de celule şi ţesuturi vegetale

Gautheret

1960

Prima polenizare in vitro la Papaver rhoeas

Kanta

14

Continuare tabelul 1.1.

0

1

2

1960

Degradarea pereţilor celulari pentru obţinerea protoplaştilor

Cocking

1960

Înmulţirea vegetativă a orhideelor prin culturi de meristeme

Morel

1962

Formularea şi publicarea reţetei mediului de cultură Murashige & Skoog

Murashige & Skoog

1964

Obţinerea primei plante haploide din grăunciori de polen la Datura

Guha şi Maheswari

1964

Regenerarea de lăstari şi rădăcini din calus de Populus tremuloides

Mathes

1965

Inducerea înfloririi în ţesutul de tutun cultivat in vitro

Aghion-Prot

1967

Inducţia florală la Lunaria annua prin vernalizare in vitro

Pierik

1969

Obţinerea plantelor haploide de tutun din grăunciori de polen

Bourgin şi Nitsch

1969

Prima izolare reuşită de protoplaşti din suspensii celulare la Hapopappus gracilis

Eriksson şi Jonassen

1970

Selecţia de mutanţi obţinuţi cu agenţi chimici in vitro

Carlson

1970

Obţinerea haploizilor la ovăz prin embriocultură

Kasha şi Kao

1970

Realizarea cu succes a fuziunii de protoplaşti

Power şi colab.

1971

Regenerarea primei plante din protoplaşti

Takebe şi colab.

1972

Realizarea hibridării interspecifice prin fuziunea de protoplaşti la două specii de Nicotiana

Carlson şi colab.

1973

Folosirea citochininelor pentru întreruperea dormansului la explante de capitul la Gerbera

Pierik şi colab.

1974

Inducerea lăstăririi axilare prin folosirea citochininelor în cultura de apexuri la Gerbera

Murashige şi colab.

1974

Regenerarea de haploizi din protoplaşti la Petunia hybrida

Binding

1974

Obţinerea de hibrizi prin fuziunea protoplaştilor haploizi

Melchers şi Labib

1974

Transformarea genetică în cultura de ţesuturi vegetale

Reinhard

15

Continuare tabelul 1.1.

0

1

2

1974

Descoperirea rolului plasmei Ti în formarea tumorilor la Agrobacterium tumefaciens

Zaenen şi colab. Larebeke şi colab.

1975

Selecţia pozitivă în culturi de calus rezistente la Helminthosporium maydis

Gengenbach şi Green

1976

Iniţierea culturilor din apexuri de lăstari crioconservaţi la garoafă

Seibert

1976

Hibridarea somatică interspecifică prin fuziunea de protoplaşti între Petunia hybrida şi Petunia parodii

Power şi colab.

1977

Integrarea plasmidei Ti de la Agrobacterium tumefaciens în genomul plantelor

Chilton şi colab.

1978

Hibridarea somatică între tomate şi cartof

Melchers şi colab.

1979

Folosirea co-cultivării pentru transformarea genetică a protoplaştilor vegetali cu Agrobacterium tumefaciens

Marton şi colab.

1981

Introducerea termenului de variaţie somaclonală

Larkin şi Scowcroft

1982

Introducerea de ADN pur în protoplaşti. Transformarea cu ADN izolat devine posibilă

Krens şi colab.

1982

Fuziune de protoplaşti prin electrostimulare

Zimmermann

1983

Hibridarea citoplasmatică intergenerică între ridiche şi rapiţă

Pelletier şi colab.

1984

Transformarea celulelor vegetale cu plasmida ADN

Paszkowski şi colab.

1985

Infecţia şi transformarea discurilor foliare cu Agrobacterium tumefaciens şi regenerarea de plante transformate

Horsch şi colab.

După

Începe Era Organismelor Modificate Genetic

 

1985

(OMG)

16

Capitolul 2 Laboratorul de culturi in vitro 2.1. Generalităţi Activitatea în domeniul culturilor in vitro

Capitolul 2 Laboratorul de culturi in vitro

2.1. Generalităţi Activitatea în domeniul culturilor in vitro se desfăşoară în laboratoare cu structură şi dotare specifică. Mărimea acestor laboratoare variază de la câţiva zeci de metri pătraţi, în cazul structurilor cu finalitate didactică sau de cercetare, până la suprafeţe de mii de metri pătraţi în cazul complexelor industriale de microînmulţire (foto 2.1.).

complex elor industriale de micro înmulţire (foto 2.1.). Foto 2.1. Complexul industrial de microînmulţire

Foto 2.1. Complexul industrial de microînmulţire Vitroplant, Cesena, Italia

Dotarea laboratoarelor diferă în funcţie de volumul de material biologic care este inoculat şi crescut in vitro. Diferenţele se referă în primul rând la capacitatea unei anumite structuri din dotare şi nu la funcţiile acesteia. Una din condiţiile esenţiale ale realizării unui laborator este asigurarea curăţeniei impecabile. Acest lucru nu se referă doar la pardoseli şi pereţi, dar şi la aer. Acesta trebuie să fie lipsit pe cât posibil de particule de praf şi bine-nţeles de spori de ciuperci sau particule bacteriene care pot constitui surse de infecţie.

17

Pentru realizarea unei “curăţiri” a aerului se recomandă folosirea unor instalaţii de condiţionare prevăzute cu filtre de aer eficiente (ex. filtru HEPA). O soluţie alternativă ar fi folosirea unor instalaţii de condiţionare a aerului cu presiune pozitivă care sunt însă ceva mai costisitoare.

O altă grupă de facilităţi se referă la controlul temperaturii în laborator. Acest

lucru se realizează, pentru spaţiile comune, prin folosirea instalaţiilor de încălzire controlată cu diferite tipuri de agent termic.

O atenţie deosebită se va acorda însă dirijării temperaturii în camerele de creştere,

în camerele de aclimatizare şi în seră. Sistemele care se vor folosi vor fi prevăzute cu

senzori şi sisteme de alarmare în caz de avarie pentru o reducere la minimum posibil riscul pierderilor. Laboratoarele industriale trebuie prevăzute şi cu grupuri electrogene care să facă faţă rapid penelor de curent. Nu vor lipsi în orice laborator sistemele de dublă protecţie, senzori de gaz, senzori de temperatură (pentru depistarea incendiilor) şi sistemele de alarmare corespunzătoare, lămpi de avarie, hidranţi, extinctoare etc. Laboratoarele vor fi dotate cu truse de prim ajutor şi cu instrucţiuni precise privind acordarea acestuia în caz de arsuri, intoxicaţii şi alte accidente posibile. Nu în ultimul rând se vor prevedea sisteme de protecţie antiefracţie şi de protecţie a datelor, informaţiilor şi tehnologiilor folosite. Laboratoarele de tip industrial (figura 2.2.) au suprafeţe de lucru mult mai ample, faţă de laboratoarele de cercetare sau didactice şi bine-nţeles, câteva structuri caracteristice.

În toate cazurile suprafaţa unui laborator este împărţită în două zone:

- zona nesterilă;

- zona sterilă.

18

cameră repaos camere aclimatizare cameră transfer "în vivo" sală de şedinţă cameră autoclave
cameră
repaos
camere
aclimatizare
cameră
transfer
"în vivo"
sală de
şedinţă
cameră
autoclave
medii
spălător
magazie
cameră
sterilă
seră
cameră rece
laborator
biochimie
virusologie
cameră
culturi
microscopie
birou
birou
cameră ambalare
birou
rampă livrare

Figura 2.2. Structura unui laborator industrial de microînmulţire (modificat după Gamborg, 1995)

2.2. Zona nesterilă Zona nesterilă este reprezentată de totalitatea spaţiilor în care asepsia nu este obligatorie. Această zonă este împărţită în mai multe încăperi care vor fi prezentate în continuare. 2.2.1. Camera de păstrare şi pregătire a materialului vegetal Pentru pregătirea materialului vegetal în vederea inoculării este nevoie de o încăpere curată, cu pereţi faianţaţi şi pardosiţi cu gresie. Dotările obligatorii se referă la apa curentă, canalizare şi curent electric (220 V, 50 Hz), iar cele opţionale la frigidere, dulapuri, mese, etc. În această încăpere, materialul vegetal iniţial provenit din câmp sau seră, este sortat, curăţat (prin spălare), fasonat, parafinat, eventual sterilizat superficial prin folosirea unor fungicide şi bactericide.

19

În cazul păstrării mai îndelungate a materialului vegetal (bulbi, rizomi, tubero- bulbi, tuberculi, sâmburi, seminţe, ramuri etc.) acesta este ambalat corespunzător şi trecut în frigider la 3-4° C.

2.2.2. Magazia de materiale

În funcţie de amploarea activităţii desfăşurate în laborator este necesară existenţa,

în anumite situaţii, a unei magazii de materiale.

În această magazie se va păstra o gamă largă de materiale cum ar fi: sticlăria nouă,

folii din aluminiu, din polietilenă, ghivece noi, blocuri de repicat, tifon, vată, ambalaje pentru livrarea materialului vegetal, etichete etc.

2.2.3. Magazia de substanţe chimice

Substanţele chimice folosite pentru prepararea mediilor de cultură, pentru

sterilizarea materialului vegetal, spaţiilor şi instrumentarului se vor păstra într-o magazie special amenajată în acest scop.

O astfel de încăpere este dotată cu:

- rafturi pentru substanţele care se păstrează la temperatura camerei;

- dulapuri pentru păstrarea substanţelor la întuneric;

- frigidere şi congelatoare pentru păstrarea unor hormoni, vitamine, soluţii stoc etc.

- balanţe şi inventar specific: scafe, spatule, vase pentru cântărire etc.

Foarte important este ca fiecare recipient cu substanţe să fie bine închis, corect etichetat şi asigurat împotriva răsturnării, spargerii, deteriorării, etc. Pentru a uşura căutarea unei anumite substanţe se recomandă numerotarea recipienţilor şi anexarea pe uşa fiecărui dulap sau frigider a unui opis cu numerele de identificare şi conţinutul acestora. În acelaşi timp, substanţele puternic toxice, corozive, cancerigene, inflamabile, într-un cuvânt, periculoase, vor fi amplasate separat în locuri marcate corespunzător cu indicatoare de avertizare. Acidul clorhidric concentrat (HCl) şi hidroxidul de amoniu (NH 4 OH) nu trebuie păstrate în acelaşi loc, datorită riscului formării de NH 4 Cl toxic, prin combinarea vaporilor

de clor şi amoniac.

20

Substanţele higroscopice trebuie păstrate în recipiente ermetic închise şi uneori în esicatore. Pentru a putea fi folosite substanţele păstrate în congelator se vor introduce de asemenea în esicatoare până vor atinge temperatura camerei. Măsura este obligatorie pentru enzime şi alte proteine şi are ca efect eliminarea condensării apei şi reducerea pierderilor de substanţă activă. Pentru cazurile când se lucrează cu substanţe volatile sau care emană gaze iritante sau toxice se recomandă ca în această magazie să existe şi o nişă cu ventilaţie forţată a aerului.

2.2.4. Camera pentru pregătirea mediilor de cultură Pregătirea mediilor de cultură este o operaţie foarte importantă care presupune existenţa unei camere prevăzută cu dotări specifice (Foto 2.3.)

unei camere prevăzută cu dotări specifice (Foto 2.3.) Foto 2.3. Camera pentru prepara rea mediilor de

Foto 2.3. Camera pentru prepararea mediilor de cultură la Vitroplant Cesena

În ceea ce priveşte dotările şi instalaţiile de bază, trebuie precizat că încăperea trebuie să fie faianţată şi pardosită cu gresie sau materiale uşor lavabile. Mesele, de regulă una aşezată central şi celelalte lângă pereţi, trebuie să fie faianţate şi prevăzute cu minirafturi pentru sticlărie, etc. În cameră vor mai exista dulapuri pentru păstrarea sticlăriei curate.

21

Camera trebuie prevăzută cu instalaţii de apă curentă rece şi caldă (eventual cu un boiler), chiuvete antiacid, canalizare, instalaţie de gaz natural sau butelie, instalaţie de curent electric (220 V, 50 Hz). Toate instalaţiile de mai sus trebuie prevăzute cu sisteme de protecţie, robinete suplimentare, vane, circuite de împământare, tablouri cu siguranţe fuzibile, etc. conform normelor în vigoare. Din inventarul camerei pentru pregătirea mediilor de cultură nu trebuie să lipsească un aparat pentru distilat apă, un deionizator, plite cu agitator magnetic, plite diverse, eventual becuri cu gaze, cuptor de microunde, sisteme de filtrare (Millipore etc.), balanţă analitică cu patru zecimale, balanţă cu două zecimale, mixere, micropipete, pH- metru, distribuitoare de mediu, cronometru de laborator etc. Distribuitoarele de mediu pot fi simple de tipul unor seringi cu limitator gradat, pentru volume de mediu cuprinse între 1 şi 10-15 ml (foto 2.4. şi 2.5.), sau de dimensiuni mai mari de tipul unor cuve încălzite electric prevăzute cu pompe aspiro-respingătoare, pentru volume de mediu cuprinse între 25-200 ml (foto 2.6.).

volume de mediu cuprinse între 25-200 ml (foto 2.6.). Foto 2.4. Distribuitor-dozator pe ntru mediul de

Foto 2.4. Distribuitor-dozator pentru mediul de cultură (volume reduse)

pe ntru mediul de cultură (volume reduse) Foto 2.5. Serin gă pentru repartizarea mediului de cultură

Foto 2.5. Seringă pentru repartizarea mediului de cultură

22

Foto 2.6. Repartizarea mediulu i de cultură în vase mari, în flux industrial (Vitroplant) De

Foto 2.6. Repartizarea mediului de cultură în vase mari, în flux industrial (Vitroplant)

De asemenea, se foloseşte sticlărie specifică; pahare Berzelius, pahare Erlenmayer, baloane cotate, cilindri gradaţi, pipete, biurete, vase pentru apă distilată. După preparare mediul se repartizează în diferite tipuri de recipiente din sticlă sau mase plastice speciale. Pentru volume reduse de mediu se folosesc fie eprubetele, fie vasele Petri. Pentru cantităţi mai mari de mediu se folosesc recipiente din sticlă sau material plastic de forme şi mărimi diferite. Închiderea lor se face folosind diferite materiale şi soluţii tehnice (vezi subcapitolul 4.2.1.).

2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultură şi presterilizarea materialului vegetal După prepararea mediului de cultură şi repartizarea în vase acesta este trecut în camera de autoclavare. Această încăpere este dotată cu instalaţie de curent electric (recomandabil 380 V), instalaţie de gaz, instalaţie de alimentare cu apă şi autoclave.

23

Autoclavele sunt instalaţii complexe, prevăzute cu instrumente pentru controlul

temperaturii şi presiunii, temporizatoare şi dispozitive de siguranţă folosite pentru

sterilizare în mediu umed (autoclavare).

Parametrii de lucru a unui autoclav sunt în general 121°C, pentru temperatură şi

1,1 atmosfere, pentru presiune.

După sursa de energie autoclavele sunt de două feluri: electrice şi cu gaz, iar după

tipul constructiv sunt verticale sau orizontale (foto 2.7. şi 2.8.). Volumul util al unui

autoclav variază de la câţiva litri până la câteva sute de litri, în funcţie de cantitatea de

mediu care se autoclavează în mod uzual.

de cantitatea de mediu care se autoclavează în mod uzual. Foto 2.7. Autocl av orizontal de

Foto 2.7. Autoclav orizontal de capacitate redusă

uzual. Foto 2.7. Autocl av orizontal de capacitate redusă Foto 2.8. Autoclav vertical de capacitate medie

Foto 2.8. Autoclav vertical de capacitate medie

În complexele industriale de microînmulţire se folosesc autoclave orizontale de

mare capacitate prevăzute cu două uşi:

- una pentru umplere din camera pentru pregătirea mediului de cultură;

- una pentru golire din camera pentru păstrarea mediului sau din zona sterilă.

În autoclave, vasele cu mediu se introduc în coşuri speciale sau în pupinele.

În anumite situaţii în camera de autoclavare care se află în vecinătatea zonei

sterile se face şi o presterilizare a materialului vegetal pregătit pentru inoculare.

Presterilizarea se face prin imersarea acestuia în soluţii de fungicide şi/sau

bactericide urmând apoi sterilizarea propriu-zisă sub hota cu filtru laminar.

24

2.2.6. Magazia pentru medii de cultură

După autoclavare, mediile de cultură trebuie să fie păstrate cel puţin 24 de ore înainte de a fi folosite. Acest lucru se poate face într-o încăpere perfect curată situată în vecinătatea camerei de inoculare. Păstrarea trebuie făcută la întuneric pentru a preveni degradarea compuşilor fotolabili sub influenţa luminii. În acelaşi timp, temperatura de păstrare se recomandă să fie cât mai scăzută (ideal 3-4°C). Unele laboratoare industriale folosesc camere frigorifice special amenajate pentru păstrarea mediului de cultură, dar şi pentru păstrarea vaselor cu explante pentru eşalonarea producţiei de material vegetal în funcţie de cerinţe, comenzi, anotimp, etc. În laboratoarele mici păstrarea vaselor cu mediul de cultură se poate face în dulapuri bine închise în apropierea camerei sterile. Păstrarea mediului de cultură nu trebuie făcută pe o perioadă mai mare de 14 zile întru-cât creşte riscul deteriorării caracteristicilor acestuia.

2.2.7. Camera de creştere

După inocularea explantelor pe mediul de cultură vasele sunt trecute în camera de creştere. Ca şi celelalte încăperi ale laboratorului, aceasta trebuie să fie perfect curată, faianţată şi să fie totodată dotată cu instalaţii specifice (Foto 2.9.).

totodată dotat ă cu instalaţii specifice (Fo to 2.9.). Foto 2.9. Una din camerele de cul

Foto 2.9. Una din camerele de culturi ale firmei Vitroplant Cesena, Italia

25

Întreaga cameră este ocupată cu rafturi pe care se aşează vasele de cultură. Distanţa dintre două poliţe pe verticală este de minimum 40-50 cm, iar înălţimea totală în jur de 2 m. Lăţimea unei poliţe este de 1-2 m. Poliţele se realizează din materiale care să permită circulaţia aerului printre vase evitându-se astfel supraîncălzirea mediului de cultură. Pentru aşezarea eprubetelor pe rafturi se folosesc suporţi, de regulă înclinaţi, care permit o mai bună iluminare a explantelor. Un alt element important în camera de creştere este reprezentat de instalaţia de iluminat. Realizată în general din tuburi fluorescente distanţate la 15-20 cm unele de altele, această instalaţie trebuie să aibă nişte caracteristici tehnice bine stabilite. Astfel, intensitatea luminoasă trebuie să fie de 3000-4000 de lucşi. Se cunosc situaţii când se recurge la intensităţi mai reduse sau chiar la lipsa totală a luminii:

- timp de 3-4 zile după inocularea meristemelor pentru reducerea oxidărilor;

- în anumite culturi de calus;

- în embriogeneza somatică la conifere;

- în faza de inducţie înaintea fazei de organogeneză directă din limb foliar; Frecvent este nevoie de lumină diferit colorată pentru obţinerea unor rezultate mai bune la diverse tipuri de culturi. Interesează apoi lungimea ciclurilor lumină-întuneric. De regulă durata “zilei” este stabilită la 6-12 ore, restul până la 24 fiind ocupate de întuneric. Rezultatele obţinute de Teodorescu Al. şi colab. (1994, 1995) la ICPP Piteşti-Mărăcineni au dovedit că prin reducerea lungimii ciclurilor de lumină se realizează importante economii de energie. Pe baza rezultatelor obţinute, autorii recomandă reducerea duratei de iluminare cu 4-6 ore pe zi, respectiv realizarea unui fotoperiodism de 12-10 ore. Un alt parametru care trebuie controlat este nivelul temperaturii în camera de creştere. În general, temperatura folosită este 22-24°C±1°C, Trebuie precizat că în funcţie de specie, tipul de cultură şi scopul urmărit temperatura poate să varieze între 10 şi 32°C. În general, speciile provenite din zonele calde cresc bine la temperaturi mai ridicate (26-

28°C).

Umiditatea este un alt factor esenţial. Valoarea optimă a umidităţii aerului în camere de creştere este de 80-85%, Scăderea umidităţii sub această valoare duce la deshidratarea rapidă a mediului de cultură cu consecinţe grave asupra explantelor.

26

Controlul factorilor de mediu în camera de creştere trebuie să fie făcut riguros, acest lucru influenţând direct mersul culturilor. Pentru a urmări evoluţia temperaturii şi umidităţii în camerele de creştere acestea sunt prevăzute cu termohigrometre. Orice avarie trebuie semnalată imediat prin intermediul unor sisteme de avertizare luminoase şi sonore.

2.2.8. Camera (spaţiile) de aclimatizare Aclimatizarea este etapa cea mai dificilă în desfăşurarea procesului de microînmulţire. Pentru reuşita acestei operaţii trebuie să se dispună de spaţii prevăzute cu instalaţii eficiente de iluminare, încălzire şi umidificare a aerului. În mod frecvent, în complexele industriale, aclimatizarea se face în solarii sau sere speciale (Foto 2.10.).

se fa ce în solarii sau sere speciale (Foto 2.10.). Foto 2.10. Sera cu dubla protecţie,

Foto 2.10. Sera cu dubla protecţie, folosită la aclimatizarea materialului microînmulţit (Vitroplant)

Cu cât controlul factorilor de mediu este mai bun, cu atât se reduc riscurile pierderii de material în procesul aclimatizării. Dirijarea factorilor de mediu pe parcursul fazei de aclimatizare este prezentată în subcapitolul 5.2.5.

27

2.2.9. Sera şi solariile Materialul aclimatizat este trecut apoi în solarii sau sere pentru a-şi desfăşura primele faze de creştere înainte de livrare sau înainte de a fi folosit în câmp. Acest proces, numit fortificare, are loc în structuri prevăzute cu sisteme de control al factorilor de vegetaţie, în special umiditate şi temperatură (foto 2.11. şi 2.12.). Mărimea suprafeţelor ocupate cu sere şi solarii depinde de cantitatea de material

înmulţit.

şi solarii depinde de cant itatea de material înmulţit. Foto 2.11. Seră folosită pentru fortificarea materialului

Foto 2.11. Seră folosită pentru fortificarea materialului aclimatizat (Vitroplant)

pentru fortificarea materialului aclimatizat (Vitroplant) Foto 2.11. Viţă de vie în container fortificată într-un

Foto 2.11. Viţă de vie în container fortificată într-un solar (Vitroplant)

28

O soluţie economică de realizare a unei sere de dimensiuni mai reduse este

amplasarea acestei pe partea de sud a construcţiei care găzduieşte laboratorul. Acoperişul se poate construi cu o singură pantă, unul din pereţi fiind reprezentaţi de peretele clădirii (figura 2.2.).

2.2.10. Spălătorul Spălătorul este o încăpere prezentă în orice fel de laborator de microînmulţire. Aşa cum spuneam mai devreme de gardul de curăţenie depinde în bună măsură sănătatea culturilor şi bunul mers al activităţii.

În spaţiul reprezentat de spălător se curăţă sticlăria şi celelalte componente ale

instrumentarului folosit pentru realizarea culturilor in vitro.

Încăperea trebuie să fie faianţată şi prevăzută cu instalaţii specifice de alimentare cu apă, canalizare, alimentare cu curent electric şi eventual gaze.

În spălător trebuie să existe mai multe chiuvete (unele cu scurgător) alimentate cu

apă caldă sau rece. În lipsa unei instalaţii de apă caldă aceasta se poate obţine cu ajutorul unui boiler electric sau cu gaze (tip Vaillant). Pentru spălarea sticlăriei mai sunt necesare vase din plastic de diferite dimensiuni, perii şi detergenţi. Din spălător sunt nelipsite scurgătoarele de tot felul pentru vase mari, pentru vase de cultură, pentru eprubete. Vor fi prezente şi recipiente cu amestec cromic folosit la spălarea sticlăriei (atenţie, este puternic toxic şi coroziv, vezi subcapitolul 4.2.) şi recipiente cu apă distilată folosită la clătire.

În laboratoarele de mari dimensiuni se folosesc perii electrice pentru uşurarea

spălării, sau chiar maşini şi instalaţii pentru spălat care efectuează toate operaţiile de

spălare, clătire şi uscare a sticlăriei. După înlăturarea mediului de cultură din vase acestea se spală superficial în curent de apă fierbinte şi se trec apoi într-un vas cu apă caldă cu detergenţi.

În cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea să fie autoclavate înainte

de a fi deschise pentru a se evita răspândirea infecţiei în laborator. Vasele folosite pentru topirea mediului sau pentru distribuirea mediului cu agar vor fi spălate imediat cu apă fierbinte pentru a se evita răcirea agarului şi fixarea pe pereţii acestuia.

29

Tehnologia modernă presupune şi existenţa unor maşini de spălat cu ultrasunete, extrem de eficiente (foto 2.12.).

spălat cu ultrasunete, extrem de eficiente (foto 2.12.). Foto 2.12. Maşină de spălat cu ultrasunete După

Foto 2.12. Maşină de spălat cu ultrasunete

După spălarea propriu-zisă, sticlăria se clăteşte în apă curentă şi este trecută într- un alt vas cu apă distilată unde va fi lăsată timp de mai mult ore. Urmează apoi zvântarea pe scurgătoare şi depozitarea în dulapuri speciale destinate acestui scop, până în momentul folosirii.

Mediul de cultură şi celelalte resturi se vor colecta în pungi din plastic care se vor lega şi duce în spaţii de colectare a gunoiului. Pentru laboratoarele mici uneori spălătorul face parte integrată din camera de pregătire a mediului de cultură În aceleaşi situaţii, în spălător se poate face şi pregătirea materialului vegetal pentru inoculare. Este vorba, în special de operaţiile de spălare, presterilizare şi eventual fasonare a materialului. În ceea ce priveşte organizarea activităţii de spălare a sticlăriei şi instrumentarului în laborator trebuie precizat că în micile laboratoare nu există personal angajat special pentru acest scop. De aceea trebuie instituită regula potrivit căreia fiecare din cei care lucrează în laborator trebuie să lase în urma sa aşa cum a găsit, adică curat. Fiecare îşi va spăla sticlăria folosită, o va depozita în locurile special destinate, în ordine şi va curăţa spălătorul la terminarea activităţii.

30

Tot în ansamblul de reguli după care trebuie organizată activitatea în laboratoarele didactice şi de cercetare se înscrie şi planificarea acţiunilor pe zile şi persoane, realizându- se astfel un flux continuu fără suprapuneri sau goluri.

2.3. Zona sterilă "Inima" laboratorul de culturi in vitro este reprezentată de camera sterilă. În acest spaţiu se execută toate operaţiile de sterilizare, inoculare şi transferuri pe mediul de cultură în condiţii sterile. Camera sterilă trebuie să fie ferită de orice sursă de praf şi murdărie. În acest sens ferestrele vor fi prevăzute cu un sistem de filtrare iar dacă este posibil încăperea va avea la intrare o cameră tampon. Laboratoarele mai sofisticate au instalaţii de climatizare cu presiune pozitivă de aer steril care împiedică pătrunderea prafului, sporilor sau altor forme ale agenţilor patogeni din exterior. În trecut sterilizarea spaţiului interior se realiza cu ajutorul unor lămpi cu ultraviolete. Era apoi obligatorie aerisirea încăperii pentru eliminarea ozonului care se formează. Cu această ocazie era posibil ca în încăpere să pătrundă din nou spori de ciuperci, bacterii şi alte microorganisme, iar operaţia era ineficientă. În plus, ozonul este toxic şi puternic mutagen şi creşte astfel riscurile expunerii personalului la accidente. Componenta de bază a camerei sterile este hota (nişa) sterilă. Folosind un sistem de filtrare complex hota creează, într-un spaţiu închis, un flux de aer steril care se deplasează cu o anumită viteză spre operator. Există mai multe tipuri constructive de hote care funcţionează pe acelaşi principiu:

împingerea cu ajutorul unor ventilatoare a aerului printr-o baterie de filtre, reţinerea particulelor de praf şi a microorganismelor şi formarea unui flux de aer steril care iese din incinta sterilă, "împiedicând în acelaşi timp pătrunderea aerului nesteril din exterior. Cele mai folosite hote sterile sunt hotele cu flux laminar orizontal. Ele pot avea un post de lucru, două sau mai multe (foto 2.13.)

31

Foto 2.13. Hota sterilă cu flux laminar orizontal Pentru lucrări în care se folos esc

Foto 2.13. Hota sterilă cu flux laminar orizontal

Pentru lucrări în care se folosesc agenţi patogeni sau transformări cu Agrobacterium tumefaciens se recomandă să se folosească hote sterile cu flux vertical care împiedică răspândirea acestor microorganisme în exterior (foto 2.14.).

acestor mi croorganisme în e xterior (foto 2.14.). Foto 2.14. Hota sterilă cu flux vertical În

Foto 2.14. Hota sterilă cu flux vertical

În general, o hotă este alcătuită dintr-o baterie de ventilatoare în partea din spate, prefiltre care reţin particulele de praf mai grosiere şi bateria de filtre bacteriologice care reţine particule mai mari de 0,2 µm. În partea din faţă hota prezintă o minicameră cu un perete liber alcătuit dintr-o masă de lucru, acoperită cu tablă din inox, doi pereţi laterali transparenţi şi un sistem de iluminare cu tuburi din neon în partea de sus. Hotele de construcţie mai veche erau prevăzute şi cu lămpi de U.V. folosite pentru sterilizare.

32

În acelaşi timp hota prezintă una sau mai multe prize electrice pentru a asigura sursa de curent pentru microscoape, lupe binocular, minibalanţe, incineratoare (Bacti- Cinerator) sau sterilizatoare electrice pentru instrumentar (foto 2.15.).

sterilizatoare el ectrice pentru instrumentar (fo to 2.15.). Foto 2.15. Hotă modernă pentru l ucrări de

Foto 2.15. Hotă modernă pentru lucrări de cercetare (Vitroplant)

Acolo unde există instalaţie cu gaz la hotă se ataşează 1-2 becuri Münsen cu gaz pentru flambarea instrumentarului (foto 2.16.). Hota mai este dotată cu întrerupătoare precum şi eventual cu un regulator de turaţie a ventilatorului care modifică viteza fluxului de aer.

În timpul lucrului în hotă se vor găsi de asemenea, suporţi pentru instrumentar steril, (ace, spatule, pense, bisturie etc.), un pulverizator cu alcool pentru dezinfecţia exteriorului vaselor de cultură, a masei şi a mâinilor operatorului precum şi materiale pentru închiderea vaselor de cultură (folie de aluminiu, folie autosigilantă, etc.).

cultură (folie de aluminiu, folie autosigilantă, etc.). Foto 2.16. Dotare minimală într-o hotă cu flux laminar

Foto 2.16. Dotare minimală într-o hotă cu flux laminar steril

33

În camera sterilă trebuie să mai existe scaune (eventual rotative, ergonomice, etc.) măsuţe pentru depunerea vaselor cu medii, a vaselor folosite la sterilizarea materialului, a sticlelor cu agenţi sterilizanţi şi apă, a materialului vegetal pregătit pentru sterilizare). Foarte practice sunt măsuţele multietajate cu rotile care se pot deplasa uşor dintr-un loc în altul (foto 2.17). Foarte importante sunt lucrările de întreţinere a hotei. Acestea constau în primul rând în curăţirea prefiltrelor cu ajutorul unor aspiratoare. Cele mai eficiente sunt cele care funcţionează fără sac de praf, cu colectarea impurităţilor în apă (tip Rainbow). În cazul folosirii intense, bateria de filtre trebuie schimbată anual.

int ense, bateria de fi ltre trebuie schimbat ă anual. Foto 2.17. Mă suţă multietajată cu

Foto 2.17. Măsuţă multietajată cu rotile

În acelaşi timp, se va acorda o atenţie deosebită curăţeniei în camera sterilă. Zilnic se va spăla podeaua cu apă şi detergenţi specifici, se vor şterge pereţii şi în general, se vor înlătura orice surse posibile de praf. La intrarea în camera sterilă se va schimba îmbrăcămintea şi încălţămintea, aceasta din urmă fiind principala sursă de praf şi agenţi contaminanţi. Înainte de începerea lucrului cu cel puţin 20-30 de minute, hota se porneşte pentru a se steriliza interiorul incintei. De asemenea, se pulverizează alcool de 96% pe partea interioară a acesteia şi pe vasele cu medii sau celelalte materiale care se introduc sub hotă.

34

Capitolul 3 Mediile de cultură şi prepararea lor Mediul de cultură reprezintă suportul fizic şi

Capitolul 3 Mediile de cultură şi prepararea lor

Mediul de cultură reprezintă suportul fizic şi chimic necesar pentru creşterea şi dezvoltarea explantelor in vitro. Graţie unor cercetări minuţioase efectuate de-a lungul timpului un mare număr de cercetători au formulat diferite reţete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturi in vitro la marea majoritate a speciilor vegetale. Momentul de răscruce în acest domeniu l-a reprezentat anul 1962, când T. Murashige şi F. Skoog au publicat reţeta de mediu care le poartă numele, realizată iniţial pentru culturi de ţesuturi de tutun. Acest mediu a fost apoi preluat cu succes în nenumărate situaţii, la cele mai diferite specii, fiind în prezent cea mai folosită reţetă de mediu, alături de varianta modificată Linsmaier&Skoog (LS, 1965). Diferenţa dintre cele două reţete constă în nefolosirea

acidului nicotinic, piridoxinei, glicinei şi creşterea concentraţiei de tiamină la 0,4 mg/l, în cazul variantei modificate, LS. Alte reţete de medii larg folosite sunt B5 (Gamborg şi colab. 1968), N6 (Chu, 1978), Nitsch&Nitsch (NN, 1969). Pentru cultura in vitro a speciilor pomicole dar şi a altor plante lemnoase se folosesc mediile Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW (Driver&Kuniyuki, 1984) şi WPM Lloyd and McCown, 1980). Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură sunt:

- să corespundă cerinţelor nutritive şi hormonale ale speciei cultivate pentru faza în care se găseşte (stabilizare, proliferare, calogeneză, înrădăcinare, etc.);

- să asigure condiţii optime de creştere şi dezvoltare în ceea ce priveşte presiunea osmotică, pH-ul, umiditatea, etc.

- să fie echilibrat din punct de vedere ionic;

- să nu conţină ioni sau substanţe toxice;

- să fie uşor de preparat şi reproductibil;

- să fie stabil după autoclavare (să-şi menţină neschimbată compoziţia şi caracteristicile fizico-chimice;

35

- să fie ieftin şi să conţină cât mai puţini constituenţi naturali costisitori şi neomogeni;

- eventual, să poată fi reciclat.

Mediile folosite la cultura in vitro a explantelor vegetale au în general o structură complexă, fiind alcătuite dintr-un mare număr de constituenţi de natură diversă şi cu rol diferit.

Aceşti constituenţi pot să fie grupaţi în:

- constituenţi cu rol nutritiv: elemente minerale: macro şi microelemente şi

elemente organice: zaharuri (ca sursă de carbon), aminoacizi (ca sursă de azot organic) şi vitamine;

- constituenţi cu rol hormonal fitoregulator al creşterii şi dezvoltării explantelor in

vitro: auxine, citochinine, gibereline şi alte substanţe cu rol stimulator sau inhibitor: acid abscisic, etilenă, colchicină, paclobutrazol, etc.

- constituenţi cu rol în stabilizarea mediului de cultură: apa, agenţi de solidificare, stabilizatori osmotici şi de pH, antioxidanţi şi substanţe absorbante.

3.1. Constituenţi cu rol nutritiv

3.1.1. Constituenţi minerali Substanţele minerale care intră în componenţa mediilor de cultură sunt săruri care conţin cele 6 macroelemente fundamentale: azotul (N), fosforul (P), potasiul (K), calciul (Ca), magneziul (Mg) şi sulful (S) precum şi un mare număr de microelemente: fier (Fe), mangan (Mn), zinc (Zn), aluminiu (Al), bor (B), cupru (Cu), molibden (Mo), sodiu (Na), cobalt (Co) şi iod (I). 3.1.1.1. Macroelementele Concentraţia macroelementelor folosite variază în limite destul de largi, în mod obişnuit, folosindu-se cantităţi de 1-40 mM, respectiv, 300-19.000 mg/l. Microelementele se folosesc în concentraţii mult mai reduse de ordinul micromolilor, respectiv 0,0025-0,5 mg/l. În funcţie de concentraţia molară totală mediile de cultură se împart în trei categorii:

- medii concentrate (36-50 mM): Murashige & Skoog, Quoirin & Lepoivre, Eriksson, etc.;

- medii cu concentraţie mijlocie (27-35 mM): Nitsch&Nitsch;

- medii cu concentraţie scăzută (7-26 mM): White, Heller;

36

Foarte importantă este compoziţia ionică a mediilor de cultură ştiindu-se că în soluţie sărurile disociază în ionii componenţi. Trebuie avut în vedere echilibrul acestor ioni şi posibilitatea de a se combina şi de a forma compuşi toxici greu solubili sau insolubili. În general toate mediile de cultură conţin următorii ioni: NH 4 + , K + , Ca 2+ , Mg 2+ , Na + , NO 3 - , PO 4 3- , SO 4 2- , Cl - . Prin folosirea preponderentă a sărurilor sub formă de cloruri creşte concentraţia ionului Cl - care nefiind folosit în nutriţie, are efect toxic asupra explantelor determinând clorozarea şi ulterior moartea acestora. Efecte similare are şi excesul de sodiu (Na + ) din mediul de cultură. Dintre macroelemente un rol important este jucat de azot. Acesta este furnizat în mediul de cultură prin folosirea azotaţilor de amoniu, potasiu, calciu, sodiu, etc. În soluţie se găseşte atât azot sub formă nitrică (NO 3 - ) cât şi sub formă amoniacală

(NH 4 + ).

Rolul celor două forme de azot este diferit şi uneori cercetările efectuate au scos în evidenţă rezultate contradictorii. Astfel, într-o primă fază, s.a afirmat că ionul amoniu (NH 4 + ) ar induce formarea embrionilor somatici la morcov spre deosebire de ionul nitrat (NO 3 - ) care nu ar avea acest efect (Halperin şi Wetherell 1967, citaţi de Cachiţă, 1987). Totuşi experienţele lui Reinert şi colab. (1966), au dovedit că este posibilă obţinerea de embrioni din ţesut de morcov pe un mediu care conţinea numai ioni nitrat (NO 3 - ).

Important este raportul în care se găsesc cei doi ioni în mediul de cultură. În marea majoritate a reţelelor folosite, raportul NH 4 + /NO 3 - este de 1/2-1/3, putând să ajungă la 1/5. Azotul are un rol fiziologic deosebit de important, fiind indispensabil în metabolismul proteic şi glucidic. Lipsa azotului sau carenţa acestuia determină acumularea antocianilor în vacuole şi moartea rapidă a celulelor. La salată, absenţa azotatului de amoniu din mediul de cultură a determinat formarea calusului din cotiledoane fără a se obţine nici un fel de tip de regenerare. Fosforul are şi el un rol important în metabolismul general al explantelor prin formarea compuşilor nucleotizi cu valoare energetică ridicată (ADP şi ATP) care realizează captarea, păstrarea şi eliberarea energiei chimice şi care sunt determinanţi în biosinteza acizilor nucleici (Neamţiu şi colab. 1989).

37

După azot, cea mai mare pondere o deţine potasiul (K). Acesta s-a dovedit a fi de neînlocuit datorită rolului pe care-l are în reglarea permeabilităţii membranei celulare şi a vâscozităţii protoplasmei. Este deosebit de activ în cadrul schimburilor de ioni la nivelul membranelor celulare şi este cerut în cantităţi mai mari de către explantele tinere la nivelul cărora determină activarea diviziunii celulare. Carenţa potasiului se concretizează prin reducerea creşterii sau chiar involuţia explantelor de tutun. La aceeaşi specie şi la viţa de vie, cultivarea pe medii bogate în potasiu a avut ca efect stimularea creşterii explantelor (Heller 1947-1953, citat de Cachiţă,

1987).

Calciul este prezent în majoritatea mediilor de cultură sub formă de clorură de calciu (CaCl 2 . 2H 2 O) sau azotatul de calciu (Ca(NO 3 ) 2 . 4H 2 O). Alături de potasiu, calciul are un rol important în reglarea permeabilităţii membranelor la nivel celular. Este cunoscut, de asemenea şi rolul antitoxic al calciului. Având în vedere faptul că este solicitat în cantităţi mai mari în metabolismul ţesuturilor senescente datorită acumulării în membrane, la culturile meristematice in vitro nevoile de calciu sunt mult mai reduse. Totuşi carenţa calciului determină necrozarea apexurilor la lăstarii cultivaţi in vitro iar lipsa lui duce la moartea celulelor. Mărirea concentraţiei de calciu din mediu prin adăugarea clorurii de calciu (CaCl 2 ) trebuie făcută cu discernământ pentru că peste anumite limite se manifestă toxicitatea ionilor de clor (Cl - ). La cultivarea gutuiului pe un mediu Quiorin & Lepoivre (1977) bogat în calciu apar uneori simptome de cloroză datorită blocării fierului (Stănică, 1996). Magneziul intră în compoziţia clorofilei şi carenţa sa determină perturbări importante în funcţionarea frunzei, ducând în final la moartea explantului. Relaţia Ca-Mg este foarte strânsă, cele două macroelemente putându-se chiar substitui în anumite reacţii metabolice. Sulful intră în compoziţia multor aminoacizi esenţiali şi este nelipsit din mediile de cultură unde se află în componenţa ionului sulfat (SO 4 2- ). Reducerea conţinutului de clor din mediul de cultură prin înlocuirea clorurilor cu sulfaţi are ca efect o creştere a concentraţiei sulfului.

38

Anumite medii de cultură sunt foarte bogate în sulf: DKW pentru nuc (Driver şi Kuniyuki, 1984), Litvay pentru conifere (Litvay şi Johnson, 1981).

3.1.1.2. Microelementele Microelementele folosite în culturile in vitro sunt în număr mai redus faţă de cele folosite în soluţiile nutritive complexe iar concentraţiile uzuale sunt asemănătoare pentru majoritatea mediilor de cultură. Dintre microelemente, fierul se administrează în cantităţi mai mari. Pentru a fi uşor asimilabil se foloseşte chelatul de fier (NaFeEDTA) care se pregăteşte din sulfat feros (FeSO 4 . 7H 2 O) şi sare disodică a acidului etilen- diamino-tetraacetic (Na 2 EDTA . 2H 2 O). Raportul dintre cei doi compuşi trebuie să fie de 1:2 adică, pentru 100 µM FeSO 4 . 7H 2 O,

trebuie să se dizolve 200 µM de Na 2 EDTA . 2H 2 O. Concentraţia uzuală a ionului Fe 2+ este

în jur 100 µeq. Excesul de fier bivalent (Fe 2+ ) determină oxidarea acestuia la fier trivalent (Fe 3+ ) şi formarea de fosfat feric care precipită şi creşte turbiditatea mediului de cultură. Fierul este catalizatorul multor procese redox şi are rol esenţial în fotosinteză, în activitatea citocromilor respiratori şi în sinteza proteică. Carenţa fierului se manifestă prin clorozarea ţesuturilor verzi şi blocarea diviziunilor celulare în ţesuturile meristematice. Manganul participă la o serie de activităţi enzimatice iar la conifere s-a dovedit că poate înlocui într-o anumită proporţie, magneziul (Clarkson şi colab., 1980, citat de Enescu V. şi colab. 1994). Are de asemenea un rol important în sinteza proteică. Carenţa manganului determină blocarea sintezei ARN-ului în rădăcinile de mazăre. Zincul este implicat în sinteza auxinei, a ARN-polimerazei şi a unor dehidrogenaze. Lipsa acestuia determină dereglări în sinteza triptofanului (precursor al auxinei endogene), îngălbenirea şi necroza ţesuturilor tinere. Aluminiul folosit numai în anumite medii de cultură (Heller) în cantităţi foarte mici are rol de catalizator al unor reacţii biochimice. Borul este utilizat sub formă de acid boric (H 3 BO 3 ) în concentraţii relativ ridicate (1-10 mg/l). Rolul său preponderent se referă la reglarea proceselor de diviziune celulară şi creştere. Carenţa de bor se manifestă prin brunificarea şi necrozarea ţesuturilor.

39

Cuprul participă la multe reacţii redox şi este foarte important în embriogeneză. Se foloseşte sub formă de sulfat de cupru (CuSO 4 . 5 H 2 O) în concentraţii de 0,025 mg/l (0,1 mM).

Molibdenul se pare că are un rol important în activitatea nitrat-reductazei. Alături de iod intră în componenţa unor enzime şi participă la procesele nutriţionale ale explantelor. Cobaltul este folosit în concentraţii foarte scăzute sub formă de clorură de cobalt (CoCl 2 . 6H 2 O). Rolul său în metabolismul ţesuturilor vegetale in vitro este necunoscut, ca de altfel cel al nichelului.

3.1.2. Constituenţi organici 3.1.2.1. Carbohidraţii Carbohidraţii (zaharurile) sunt folosite în culturile in vitro ca sursă de carbon şi energie, dat fiind faptul că explantele cultivate în astfel de condiţii au o nutriţie preponderent heterotrofă. Prin hidrolizarea carbohidraţilor celulele vegetale îşi procură cantitatea de energie necesară desfăşurării proceselor vitale. Trebuie spus că glucidele produse prin fotosinteză in vitro de către ţesuturile verzi nu satisfac nici pe departe nevoile energetice globale ale acestora şi nevoia de componenţi structurali cum ar fi unele polizaharide (celuloza şi amidonul). Dintre zaharuri cel mai mult folosită este zaharoza în concentraţie de 2-3%. La unele specii (Malus robusta) s-a folosit cu rezultate bune sorbitolul, în timp ce glucoza a fost folosită tot la specii lemnoase în concentraţie de 3%. În diferite experimente s-au folosit şi alte glucide cum ar fi: fructoza, maltoza, rafinoza sau chiar dextrina şi amidonul. În cantităţi crescânde de la 1% la 3%, zaharoza a stimulat creşterea explantelor de morcov (Gautheret, 1959), iar reducerea concentraţiei la 2-3%, a determinat alungirea lăstarilor la pin, molid şi larice (Aitken, J. şi colab. 1981, citaţi de Enescu V. şi colab.

1994).

Trebuie precizat şi rolul important pe care îl au carbohidraţii în echilibrarea presiunii osmotice a mediului de cultură. Creşterea concentraţiei de zaharoză peste anumite limite are ca efect creşterea presiunii osmotice şi plasmolizarea celulelor explantelor.

40

O serie de cercetători au pus problema faptului că mediile de cultură artificiale prin concentraţia ridicată de carbohidraţi exercită o presiune osmotică "nenaturală" asupra explantelor. De aici necesitatea unor studii privind posibilităţile de reducere a cantităţilor de carbohidraţi din mediile de cultură precum şi găsirea altor substanţe cu rol similar (ESNA WG4, Buşteni, 1996).

3.1.2.2. Aminoacizii Aminoacizii sunt folosiţi în mediile de cultură şi ca surse suplimentare de azot organic. Pe lângă aceasta s-a dovedit că ei au rol în diferite procese inductive. Dintre aminoacizi, glicina este cel mai des folosită. Încă din 1939, White a subliniat că glicina stimulează creşterea rădăcinilor de tomate (Cachiţă, 1987). Gautheret (1959), de asemenea, subliniază rolul aminoacizilor în formarea calusului. Alţi aminoacizi ca glutamina, arginina şi prolina stimulează proliferarea calusului la pin (David H. şi colab. 1984). S-a constatat că în cazul folosirii aminoacizilor, izomerii levogiri (L) sunt mai eficienţi decât cei dextrogiri (D). Dozele de folosire a aminoacizilor variază de la 2 mg/l pentru glicină, la 10 mg/l pentru L-arginină şi cisteină şi până la 100 mg/l pentru asparagină şi L-tirozină.

3.1.2.3. Vitaminele Vitaminele sunt substanţe organice cu rol catalitic indispensabile creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro. Termenul de vitamină - amină vitală, a fost introdus pentru prima dată de către Casimir Funk în 1911 şi ilustrează plastic importanţa deosebită pe care acest grup de substanţe o are pentru organismele vii. Spre deosebire de plantele din natură, ţesuturile şi organele cultivate in vitro nu au capacitatea de a-şi sintetiza întreaga gamă de vitamine necesare desfăşurării în bune condiţiuni a metabolismului. La începuturile culturilor in vitro s-a constat că prin adăugarea în mediul de cultură a unor substanţe naturale bogate în vitamine (lapte de cocos, sucuri de tomate şi banane, extract de endosperm de cereale, lapte de porumb, extracte de drojdie)are loc stimularea creşterii explantelor.

41

Ulterior o serie de cercetători au realizat reţete proprii de vitamine prin combinarea în diferite proporţii a vitaminelor cunoscute. Trebuie precizat că majoritatea vitaminelor folosite sunt termosolubile iar prin autoclavare are loc descompunerea acestora. Uneori produşii rezultaţi au la rândul lor un efect favorabil asupra culturilor (Hoza D., 1996). Ideal ar fi ca amestecurile de vitamine să se poate adăuga după autoclavarea mediului folosind filtrarea sterilă. Pentru mediile solide acest lucru este însă neaplicabil, fiind greu să se obţină difuzia vitaminelor în masa mediului. Principalele vitamine folosite la prepararea mediilor de cultură sunt folosite solitare sau, mai frecvent, în combinaţii mai mult sau mai puţin complexe. Tiamina (vitamina B 1 , aneurina) este nelipsită din majoritatea reţetelor de vitamine în concentraţii care variază de la 0,1 mg/l la amestecul de vitamine MS (Murashige&Skoog), la 0,4 mg/l la amestecul Walkey 1 şi 2 până la 5 mg/l la amestecul SH (Shenk şi Hidelbrandt), respectiv 10 mg/l la amestecul B 5 (Gamborg). În toate cazurile, agentul solubilizant al tiaminei este acidul clorhidric. Acţiunea fiziologică a tiaminei constă în stimularea creşterilor vegetative şi deci sporirea biomasei produse in vitro. Piridoxina (vitamina B 6 ) este de asemenea prezentă în marea majoritate a mediilor de cultură. Concentraţiile folosite variază în general între 0,1-1 mg/l, folosindu-se şi de această dată, ca agent de dizolvare acidul clorhidric. Se ştie că piridoxina este precursorul unor coenzime importante catalizând reacţii de bază în metabolismul aminoacizilor. Riboflavina (vitamina B 2 ) este folosită doar în amestecurile de vitamine mai complexe (ex. Jacquillot) în concentraţii de 0,1-1,0 mg/l. Este rezistentă la temperaturile ridicate (se descompune la 280°C) şi la oxidanţi dar este sensibilă la radiaţiile U.V. Se pare că acţionează ca inhibitor al creşterii rădăcinilor şi are rol important în metabolismul celular.

Acidul pantotenic (vitamina B 5 ) este mai puţin utilizat ca atare. Gautheret (1945) precizează că acidul pantotenic stimulează creşterea calusului la salcie. O serie de cercetători au folosit însă cu succes pantotenatul de calciu în concentraţii de 0,5-2,5 mg/l. Acesta, este stabil termic până la temperaturi de 200°C şi nu este fotolabil.

42

Cobalamina (vitamina B 12 ) este mai rar folosită. În epoca de pionierat a culturilor in vitro Reinert şi White (1956) citaţi de Gautheret (1959) au folosit-o cu bune rezultate la creşterea ţesuturilor tumorale. Vitamina B 12 stimulează sinteza nucleoproteidelor. Acidul nicotinic (vitamina B 3 , niacina) aproape nelipsit din mediile de cultură, este rezistent la temperaturi înalte (punct de topire 234-237°C). Este solubil în apă şi se foloseşte în concentraţii de 0,5-5,0 mg/l. Are rol esenţial în metabolismul intermediar, în reacţiile de oxido-reducere fiind component al dehidrogenazelor (NAD + şi NADP + ). Biotina (vitamina H) este folosită în concentraţii reduse (0,1 mg/l). În soluţii acide sau neutre este stabilă dar se descompune prin încălzire. Are rol de coenzimă intervenind în numeroase procese metabolice. Stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi proliferarea celulelor. Acidul folic, folosit în concentraţii mici (0,01 mg/l în amestecul Jacquiot) are efect stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină. Acest lucru s-ar datora descompunerii sale

în acid para amino-benzoic. La întuneric acidul folic are efect toxic.

Acidul para aminobenzoic, întâlnit în câteva amestecuri complexe de vitamine, se foloseşte în concentraţii de 1,0 mg/l. Este coenzima tirozinazei şi stimulează biosinteza acidului pantotenic şi a biotinei. Acidul ascorbic (vitamina C) se foloseşte în concentraţii ridicate (1,0-100,0

mg/l) de regulă ca agent antioxidant al polifenolilor eliminaţi de anumite specii la cultura in vitro: stejar, măr, dafin (Stănică şi colab. 1994), fistic, etc. Prin autoclavare, vitamina C se distruge în bună parte. Rolul fiziologic al vitaminei

C este complex, fiind un activator general al metabolismului celular.

Vitamina E (tocoferolul) favorizează reacţiile de fosforilare şi formare a compuşilor macroergici, participând la numeroase sinteze enzimatice. În culturile in vitro, vitamina E măreşte sensibilitatea celulelor la auxine (Enescu V. şi colab., 1994).

Inozitolul (mio-inozitol, mezo-inozitol, m-inozitol, hexahidroxi-ciclohexan) este un aditiv esenţial al mediilor de cultură fiind considerat de unii autori, vitamină, iar de către alţii, glucid. Se foloseşte de regulă în concentraţii de 100 mg/l dar se cunosc şi situaţii când a fost folosit în concentraţii de până la 1000 mg/l. Deşi nu se cunoaşte prea bine rolul fiziologic al inozitolului, se pare că acesta ar stimula diviziunea celulară. Folosit în concentraţii mari (250 mg/l) a stimulat creşterea

43

calusului de Fraxinus pensylvanica (Wolter K.E. şi Skoog F. 1966, citaţi de Enescu V şi colab. 1994). Aditivii naturali, folosiţi la început ca substanţe complexe stimulatoare în culturile in vitro (lapte de cocos, malţ, extracte din fructe, drojdie, endosperm, etc.), au fost abandonaţi între timp. Acest lucru se datorează faptului că era imposibil de a se obţine o compoziţie constantă a produselor respective, care să permită repetabilitatea mediilor de cultură.

Un alt aditiv natural este cazeina hidrolizată, care nu este altceva decât un complex de aminoacizi, putând fi încadrată în rândul substanţelor folosite ca sursă de azot organic. Este folosită în concentraţii de 250 mg/l.

3.2. Constituenţi cu rol fitoregulator Hormonii vegetali, regulatorii de creştere, stimulatorii sau substanţele de creştere sunt compuşi organici, sintetizaţi de către plante în cantităţi foarte mici. Aceşti compuşi stimulează, inhibă sau modifică creşterea şi dezvoltarea unor organe. La plantele in vitro fitohormonii endogeni produşi de către explante sunt completaţi şi complexaţi cu hormoni exogeni introduşi în mediul de cultură. În funcţie de scopul urmărit se aleg tipurile de hormoni şi concentraţia optimă şi se determină astfel, sensul evoluţiei explantului respectiv, ca rezultantă a acţiunii concertate a acestora. Istoria descoperirii hormonilor de creştere este oarecum paralelă cu cea a culturilor in vitro. Descoperirea hormonilor şi studierea efectului lor asupra creşterii şi dezvoltării plantelor a modificat radical evoluţia cercetărilor in vitro. Primul care a intuit faptul că în plante ar exista substanţe care să controleze metabolismul acestora a fost Charles Darwin. Abia în anul 1931 Kögl şi Haagen-Smit au izolat din urina umană o substanţă pe care au denumit-o “auxina A”. Aceeaşi cercetători şi folosind aceeaşi sursă au purificat apoi (1934) o altă substanţă denumită hetero-auxina, care s-a dovedit a fi de fapt acidul α indolil acetic (AIA). Ulterior, la sfârşitul anilor ‘30, Gautheret, Nobecourt şi White au studiat rolul pe care îl are auxina în creşterea ţesuturilor in vitro. Prima citochinină izolată a fost chinetina (6 furfurilaminopurina) obţinută din spermă de heringi de către Miller şi colab. (1955). Doi ani mai târziu, Skoog şi Miller au

44

publicat date despre efectul raportului citochinină/auxină asupra proceselor de organogeneză. După descoperirea şi izolarea primilor hormoni de creştere s-a trecut la etapa următoare de sinteză a noi compuşi cu structură şi efect fiziologic asemănător. În prezent, se cunosc cinci grupe mari de hormoni de creştere: auxine, citochinine, gibereline, acid abscisic şi etilena.

3.2.1. Auxinele Auxinele sunt, în marea lor majoritate, compuşi naturali sintetizaţi de către plante şi acumulaţi în diferite organe, în concentraţii reduse. Auxinele sunt prezente mai ales în mugurii terminali, frunze tinere şi vârfuri de lăstari. Paralel cu izolarea compuşilor auxinici naturali s-au realizat compuşi de sinteză cu acţiune asemănătoare ca derivaţi ai iodului, naftalenului, acidului fenoxiacetic şi acidului benzoic. Acţiunea auxinelor este deosebit de complexă:

- intervin în procesele de diviziune şi elongaţie a celulelor, în concentraţii mici stimulând diviziunea celulară, iar în concentraţii mari, alungirea;

- modifică permeabilitatea membranelor celulare modificându-le în acelaşi timp, alte caracteristici fizice şi chimice;

- influenţează pozitiv sinteza proteică prin stimularea sintezei ARN-ului ribozomal;

- controlează procesele de dominanţă apicală, determinând inhibarea activităţii mugurilor axilari;

- stimulează procesele de calusare şi ulterior determină formarea rădăcinilor.

- în doze ridicate determină apariţia de hipertrofii (simple deformări) sau hiperplastii (tumori) Principalele auxine folosite în culturile in vitro sunt prezentate în tabelul 3.2.1. Sunt prezentate de asemenea, substanţele folosite pentru dizolvarea şi diluarea acestora, temperaturile de păstrare şi limitele concentraţiilor uzuale.

45

Tabelul 3.2.1.

Principalele auxine folosite în culturile in vitro

 

Masă

   

Păstrare

Păstrare

Conc.

Specificaţie

molec.

Solvent

Diluant

produs

soluţie

mg/l

AIA

 

etanol

       

Acid β

175,2

NaOH

0°C

0°C

0,01-3,0

indolilacetic

1N

apă

AIA-L- Acid

290,3

NaOH

apă

0°C

0°C

0,01-5,0

aspartic

0,5N

AIA-L- Alanină

246,3

NaOH

apă

0°C

0°C

0,01-5,0

0,5N

AIA-L- Fenil-

322,4

NaOH

apă

0°C

0°C

0,01-5,0

alanină

0,5N

AIA-L- Glicină

232,2

NaOH

apă

0°C

0°C

0,01-5,0

0,5N

IBA

 

etanol

       

Acid

203,2

NaOH

apă

-

-0°C

0,1-10,0

indolilbutiric

1N

K-IBA Acid indolil- butiric, sare de K

241,3

apă

-

0-5°C

0-5°C

0,1-10,0

ANA Acid α naftilacetic

 

NaOH

       

186,2

1N

apă

temp.

0-5°C

0,1-10,0

 

cam.

4-CPA

           

Acid 4 clor- fenoxiacetic

186,6

etanol

apă

temp.

0-5°C

0,1-10,0

cam.

Dicamba Acid 2 metoxi-

221,0

etanol/

apă

0-5°C

0-5°C

0,01-10,0

3,6-diclorbenzoic

apă

2,4-D

 

etanol

       

Acid 2,4 diclor- fenoxiacetic

221,0

NaOH

apă

temp.

0-5°C

0,01-5,0

1N

cam.

2,4,5 T Acid 2,4,5 triclor- fenoxiacetic

255,5

etanol

apă

temp.

0-5°C

0,01-5,0

cam.

Picloram

           

Acid 4-amino-

241,5

DMSO*

apă

temp.

0-5°C

0,01-10,0

3,5,6-tricloro-

cam.

picolinic

* DMSO – dimetilsulfoxid

Aşa cum rezultă din tabelul 3.2.1. solvenţii folosiţi pentru dizolvarea auxinelor sunt etanolul şi hidroxidul de sodiu (NaOH) 0,5-1,0 N. Temperaturile de păstrare a substanţelor şi respectiv a soluţiilor stoc sunt prezentate în acelaşi tabel. Stabilitatea auxinelor variază destul de mult. Astfel, AIA şi o bună parte din restul auxinelor, sunt fotolabile, în timp ce ANA şi 2,4 D sunt mai stabile.

46

3.2.2. Citochininele Citochininele sunt substanţe deosebit de active, cu rol fitoregulator al proceselor de creştere şi dezvoltare la plante. Prima citochinină descoperită (Skoog, 1956) a fost izolată din spermă de heringi şi denumită chinetină (6-furfuril-amino-purină). Aproximativ în aceeaşi perioadă s-a descoperit rolul stimulator al laptelui de cocos asupra formării de noi plantule in vitro. Ulterior s-a constatat că acest lucru se datorează faptului că laptele de cocos era bogat în citochinine naturale. Efectele citochininelor asupra explantelor cultivate in vitro sunt multiple:

- stimulează diviziunea celulară;

- au rol esenţial în formarea şi creşterea lăstarilor;

- au rol important în procesele de regenerare adventivă a lăstarilor (organogeneză directă);

- formarea rădăcinilor este în general inhibată sub acţiunea citochininelor;

- stimulează de asemenea formarea lăstarilor axilari şi creşterea ratei de multiplicare;

- întârzie procesele de senescenţă şi determină creşterea conţinutului de clorofilă în explante. Acţiunea citochininelor se corelează cu cantitatea de auxine prezente în mediu. Astfel spus, este esenţial raportul auxine:citochinine în determinarea şi reglarea unor procese vitale de creştere şi dezvoltare a explantelor. Principalele citochinine şi substanţe cu efect similar folosite în culturile in vitro sunt prezentate în tabelul 3.2.2. Dintre acestea BAP (6 benzil-amino-purină) sau BA (benziladenina) este cel mai mult folosită. Zeatina, produs bioactiv izolat din porumb, are o activitate fitoregulatoare importantă. La actinidia a stimulat formarea unui număr mare de lăstari adventivi din explante de rădăcină, internod, frunză (organogeneză directă) şi calus (organogeneză indirectă). Efecte asemănătoare are şi 2 iP (2 izopentiladenina), DPU (difenil ureea), tidiazuronul (1 fenil-3-(1,2,3, tiadiazolpentil) uree), CPPU (N-2-cloro 4 piridil N-fenil- urea), care la fel ca şi zeatina sunt substanţe foarte costisitoare.

47

Toţi aceşti derivaţi ai fenil-ureei determină lăstărirea adventivă puternică la diferite tipuri de explante şi specii, efectul fiind mult mai puternic decât al citochininelor “clasice”, chiar la concentraţii inferioare. Datorită efectelor spectaculoase a devenit chiar o modă folosirea tidiazuronului în cercetări cât se poate de diverse. Există şi autori (Horgan, 1986) citat de Pierik (1987) care susţin că derivaţii fenil- ureei (DPU) inhibă de fapt activitatea citochinin oxidazei şi în acest fel concentraţia citochininelor rămâne ridicată iar activitatea este mai intensă. Adenina a fost folosită pentru prima dată de Skoog şi Tsui în 1948, observându-se efectul de stimulare a formării lăstarilor adventivi pe explante de tulpină de tutun. Concentraţia la care este folosită variază destul de mult între 2-120 mg/l. Frecvent adenina este înlocuită cu hemisulfatul de adenină care este mult mai solubil în apă. Sunt prezentate de asemenea, substanţele folosite pentru dizolvarea şi diluarea acestora, temperaturile de păstrare şi limitele concentraţiilor uzuale.

Tabelul 3.2.2.

Principalele citochinine folosite în culturile in vitro

 

Masă

   

Păstrare

Păstrare

Conc.

Specificaţie

molec.

Solvent

Diluant

produs

soluţie

mg/l

Adenină

135,1

apă

Na

temp.

0-5°C

50-250

cam.

Adenină

184,2

apă

Na

temp.

0-5°C

50-250

sulfat

cam.

BAP (BA)

           

6-Benzil-

225,3

NaOH

apă

temp.

0-5°C

0,1-5,0

aminopurină

1N

cam.

(Benziladenină)

BAR

           

Benzilamino-

357,4

NaOH

apă

0°C

0°C

0,01-5,0

purină ribozid

1N

BPA

           

N-benzil-9-

309,4

NaOH

apă

0°C

0°C

0,1-5,0

(2-tetrahidro-

1N

piranil)-adenină

Chinetină

           

6 furfuril-

215,2

NaOH

apă

0°C

0°C

0,1-5,0

aminopurină

1N

KR

347,3

NaOH

apă

0-5°C

0-5°C

0,01-5,0

Chinetină ribozid

1N

4 CPPU

           

N-2-clor-4-

247,7

DMSO*

apă

0-5°C

0-5°C

0,001-0,1

piridil-N-

feniluree

DPU

212,3

DMSO

apă

temp.

0-5°C

0,1-1,0

Difeniluree

cam.

48

Tabelul 3.2.2. continuare

Specificaţie

Masă

Solvent

Diluant

Păstrare

Păstrare

Conc.

molec.

produs

soluţie

mg/l

 

2 iP

           

2

izopentil-

203,2

NaOH

apă

0°C

0°C

1,0-30,0

adenină

1N

 

2 iPR

           

2

izopentil-

335,4

NaOH

apă

0°C

0°C

0,01-10,0

adenină ribozid

1N

Specificaţie

Masă

Solvent

Diluant

Păstrare

Păstrare

Conc.

molec.

produs

soluţie

mg/l

Tidiazuron

           

1 fenil-3-(1,2,3-

220,2

DMSO

apă

temp.

0-5°C

0,001-

tidiazolpentil)

cam.

0,05

 

uree

 

Zeatină

219,2

NaOH

apă

0°C

0°C

0,01-5,0

 

1N

* DMSO – dimetilsulfoxid

3.2.3. Giberelinele Giberelinele sunt substanţe hormonale mai puţin folosite în culturile in vitro. Prima giberelină a fost descoperită în 1926 de către Kurosawa ca produs al ciupercii Giberella fujikuroi. În prezent se cunosc un număr mare de gibereline (aproximativ 50) notate cu GA 1 …….GA n . Dintre acestea cel mai mult folosit este acidul giberelic – GA 3 (tabelul 3.2.3). Prin autoclavare, 90% din activitatea biologică a GA 3 se pierde, motiv pentru care este nevoie ca sterilizarea acestuia să se facă prin filtrare. Rolul fiziologic al giberelinelor nu este pe deplin cunoscut. Se ştie că ele au ca

efect:

- stimularea alungirii lăstarilor, fiind recomandate în acest sens după stabilizarea culturii de meristeme pentru formarea noilor lăstari;

- înlăturarea dormansului la seminţe şi embrioni şi stimularea germinării;

- reglarea formării auxinelor endogene;

- controlul proceselor de formare a florilor dar şi a fructelor partenocarpice etc.;

- inhibarea formării lăstarilor şi rădăcinilor adventive.

49

Tabelul 3.2.3.

Gibereline şi alţi fitoregulatori folosiţi în culturile in vitro

 

Masă

   

Păstrare

Păstrare

Conc.

Specificaţie

molec.

Solvent

Diluant

produs

soluţie

mg/l

GA 3 - Acid giberelic

246,4

etanol

apă

temp.

0-5°C

0,01-5,0

cam.

ABA - Acid abscisic

264,3

NaOH

apă

0°C

0°C

0,1-10,0

1N

Acid t-cinamic

148,2

etanol/ac

apă

temp.

0-5°C

0,1-10,0

etonă

cam.

Acid succinic

160,2

apă

Na

0-5°C

0-5°C

0,1-10,0

Floro-glucinol

126,1

apă

Na

temp.

0-5°C

<162,0

cam.

Triacontanol

438,8

eter/

apă

0-5°C

0-5°C

 

benzen

Colchicină

399,4

apă

Na

temp.

0-5°C

 

cam.

3.2.4. Alte substanţe cu rol fitoregulator Pe lângă auxine, citochinine şi gibereline se cunosc o gamă largă de substanţe cu rol fitoregulator, dintre care o bună parte sunt folosite şi în culturile in vitro. În tabelul 3.2.3. se prezintă câteva dintre aceste substanţe. Acidul abscisic este cunoscut ca inhibitor al creşterii şi dezvoltării plantelor, determinând intrarea acestora în repaus. Folosirea lui la culturile in vitro este limitată datorită efectelor negative pe care le are. Există totuşi situaţii când, utilizat în concentraţii reduse, poate regla creşterea şi dezvoltarea explantelor în primele faze ale embriogenezei somatice. Etilena este produsă de celulele, ţesuturile şi organele cultivate in vitro. În mod

normal nu se folosesc tehnici prin care acest gaz (C 2 H 4 ) să fie introdus din exterior în vasele de cultură. Problema care se pune însă este tocmai reducerea cantităţii de etilenă care se acumulează în atmosfera vaselor de cultură prin folosirea unor sisteme de închidere care să permită difuzia acesteia în exterior. Efectele etilenei în cele mai multe situaţii sunt negative:

- determină oprirea creşterii explantelor;

- induce fenomenul de senescenţă şi determină căderea frunzelor;

- determină inhibarea procesului de embriogeneză somatică.

Există totuşi numeroase studii care au dovedit că etilena poate stimula anumite procese biologice sau că, creşterea concentraţiei de etilenă din vasele de cultură a coincis

50

cu inducţia sau stimularea acestora. Astfel, se ştie că după divizarea calusului cantitatea de etilenă produsă este mai mare. La calusul de tutun odată cu creşterea concentraţiei de etilenă la lumină, a avut loc şi formarea de lăstari adventivi (organogeneza indirectă). La explantele de bulbi de crin prin creşterea concentraţiei de etilenă s-a stimulat diferenţierea de bulbi adventivi (organogeneza directă). De asemenea, prin mărirea concentraţiei de CO 2 şi etilenă s-a constatat o creştere a numărului de lăstari adventivi pe cotiledoane de Pinus radiata. Se pare că o anumită concentraţie de etilenă este necesară şi pentru inducţia diviziunii în suspensiile celulare la Acer. Se cunoaşte că etilena este implicată în transportul auxinelor. Totodată, 2,4 D induce formarea etilenei în timp ce azotatul de argint, poate fi folosit pentru inhibarea sintezei de etilenă. Acidul 2 cloretilfosfonic (ACEP) se descompune în etilenă şi acid fosforic. În horticultură este folosit sub denumirea comercială de Ethrel sau Ethephon cu 40% substanţă activă. Cercetările privind efectele ACEP asupra culturilor in vitro sunt numeroase (Cachiţă, 1987). În general această substanţă este folosită în mediul de cultură pentru rolul de precursor de etilenă pe care îl are. Folosind ACEP în culturile de meristeme la garoafe în concentraţii de 0,1 şi 1,0 mg/l s-a observat formarea unui mare număr de muguri dintr-un singur meristem (Cahiţă, 1987). Efecte stimulatoare au fost observate de către aceeaşi autoare la minibutaşii de crizanteme, gerbera, cartof şi protocormul de Cymbidium. Floroglucinolul este un compus fenolic folosit de regulă ca inhibitor al auxin oxidazei (AIA-oxidazei). Aplicat împreună cu auxinele determină stimularea formării rădăcinilor adventive datorită efectului sinergic care apare. În lipsa auxinelor, floroglucinolul stimulează formarea lăstarilor adventivi. Colchicina se foloseşte în special atunci când se urmăreşte mărirea gradului de ploidie prin dublarea numărului de cromozomi. Amestecurile de substanţe de origine vegetală au fost folosite mai frecvent la începuturile perioadei moderne a culturilor in vitro. Amestecuri ca: laptele de cocos, sucul de tomate, portocale, ananas, seva de mesteacăn, piureul (praful) de banane, extractele de drojdie, de endosperm de cereale etc.,

51

au dovedit efecte stimulatoare asupra creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro datorită compoziţiei complexe pe care le au. Principalul inconvenient pe care îl prezintă aceste amestecuri este compoziţia variabilă de la caz la caz, fapt care face ca rezultatele obţinute să nu fie repetabile în alte condiţii.

Firmele producătoare oferă astfel de amestecuri condiţionate sub formă de praf, suspensii sau soluţii. De exemplu, pudra de banane poate fi folosită în concentraţii de 40 g/l, în timp ce laptele de cocos în concentraţii de 5-20%. Laptele de cocos poate fi obţinut şi în laborator printr-o pregătire sumară după extragerea din nuci. Astfel, după o prealabilă filtrare se face sterilizarea acestuia prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C. Se lasă apoi să se răcească şi a doua zi este din nou filtrat şi păstrat, până în momentul folosirii, în congelator la –20°C. Eventualele proteine care precipită sunt îndepărtate ulterior prin filtrare.

3.3. Constituenţi cu rol stabilizator 3.3.1. Apa Apa este unul dintre componenţii cei mai importanţi ai mediilor de cultură, ea reprezentând în jur de 95% din volumul acestora. Element vital, apa mediază majoritatea proceselor metabolice care au loc în explantele cultivate in vitro. În vasele de cultură, apa urmează un circuit relativ închis, în sensul că este preluată de către explante, eliminată prin transpiraţie în atmosferă, se condensează în bună parte pe pereţii vaselor sau la suprafaţa mediului şi reintră în circuit. Condensarea apei pe capace şi pe pereţii vaselor de cultură este mai accentuată în camerele de creştere în care poliţele rafturilor sunt încălzite de lămpile fluorescente aflate dedesubt (în caz de izolare necorespunzătoare). Pierderile de apă din vasele de cultură sunt ceva mai mari în camerele de creştere neclimatizate şi cu umiditatea aerului redusă. În acest caz, se constată în timp o deshidratare a mediului vizibilă prin scăderea pronunţată de volum şi apariţia de crăpături în mediu.

52

Foto 3.1. Aparat din sticlă pentru bidistilarea apei

Foto 3.1. Aparat din sticlă pentru bidistilarea apei

Acest lucru este cu atât mai periculos cu cât, în

paralel, are loc creşterea concentraţiei în săruri şi zaharuri

a mediului şi deci creşterea presiunii osmotice a

mediului.

Apa folosită pentru prepararea mediilor de

cultură trebuie să fie în mod obligatoriu distilată. Mai

mult, se recomandă folosirea apei bidistilate care prezintă

un grad de puritate superior. Distilarea trebuie făcută în

distilatoare din sticlă (tip Pyrex) întru-cât distilatoarele

metalice pot elibera diferiţi ioni (Cu 2+ , Pb 2+ ) în procesul

de distilare (foto 3.1.).

Chiar distilatoarele din sticlă trebuie spălate

foarte bine când sunt noi şi de regulă, apa rezultată din

primele 2-3 distilări nu se foloseşte.

În timpul exploatării, periodic, se va proceda la

spălarea cu acurateţe a distilatorului cu apă deionizată.

Apa deionizată se obţine cu ajutorul unor aparate speciale numite