BIOCHIMIE GENERAL

LUCRRI PRACTICE

Biochimie I
2012/2013
Aminoacizi si proteine/ Glucide
-aminoacid
1. Carbon central (carbon );
2. Grupare amino;
3. Grupare carboxil;
4. Atom de hidrogen;
5. Grupare R.


Aminoacizii din structura
proteinelor sunt -aminoacizi.

Excepie: Prolina (Pro) (iminoacid)
Proprieti
n soluie la pH neutru amfiioni gruparea
amino = protonat / gruparea carboxil = disociat;

Majoritatea punct de topire ~300 C;


Solubilitate crescut n solveni polari
comparativ cu solvenii nepolari.




LP 1
Reacii de identificare a
aminoacizilor
Aminoacizi
testai in
cadrul L.P.

Reacii de
identificare
a aa.


Reacii de identificare a aminoacizilor
Reacia cu acid azotos;


Reacia cu ninhidrin;

Reacia xantoproteic;

Reacia Millon;

Reacia cu nitroprusiat.
Reacii de culoare
Reacia cu acidul azotos

Metoda van Slyke- aa. reacioneaz cu acidul azotos la
temperatura camerei cu degajare de azot.
Cantitativ- un mol de aa. degaj 22,4 l azot.

Reactivi: - HCl 2M;
- NaNO
2
10%
- aminoacizi de testat: Gly, Tyr
Gly
HCl 2M
Tyr
HCl 2M
HCl 2M
+ NaNO
2
10%
degajare de N
2
n
primele 2 eprubete
Denumirea reaciei Reactivul folosit Culoarea
rezultat
Tipul de aminoacid
identificat
Ninhidrinei
ninhidrin albastru -
violet
caracteristic att
pentru aminoacizi,
ct i pentru
proteine
Xantoproteic
acid
azotic,hidroxid de
amoniu
galben/
portocalie
aminoacizii
aromatici (formeaz
nitroderivai)
Millon
azotat de mercur
n acid azotic (acid
sulfuric)/azotit de
Na
coloraie
roie
aminoacizi ciclici cu
grupare hidroxil
(tirozina)
Nitroprusiatului
de sodiu
nitroprusiat de
sodiu n soluie
amoniacal
roie aminoacizi cu
grupre tiol (-SH)
liber
Reacia cu ninhidrin



LP 2
Determinarea proteinelor serice
cu reactiv Weichselbaum

Principiul metodei:

Compuii cu legturi peptidice reacioneaz cu
ionii de Cu
2+
n mediu alcalin, rezultnd un
compus de culoare albastru-violet a crui
intensitate este direct proporional cu
numrul de legturi peptidice.

Metoda poate fi folosit pentru determinarea
concentraiei proteinelor din serul sanguin.

Reactivi:

soluie de NaOH 10%;

reactiv Weichselbaum: tartrat dublu de Na +
Na OH + sulfat de cupru cristalizat CuSO
4
x 5
H
2
O;

soluie standard proteic cu concentraia
cunoscut (10 mg/ml) de albumin seric
bovin (BSA);

proba de analizat reprezentat de ser
sanguin diluat corespunztor.

Pt. curba etalon:



BSA (10 mg/ml) + A.D.
Diferite volume BSA si AD
concentratie proteica diferita
Pt. proba
Ser sanguin
+ NaOH 10% + reactiv Weichselbaum

Repaus 15-20 de minute. Citire la spectrofotometru n cuva cu
drum optic de 1 cm la lungimea de und 546nm.

Spectrofotometrie generalitati

Metoda spectrofotometric se bazeaz pe proprietatea
substanelor de a absorbi selectiv radiaiile
electromagnetice i este folosit pentru identificare,
determinarea puritii i dozare.

Spectrele de absorbie se obin la trecerea unui fascicul de
radiaii continue prin substana de analizat care poate
absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie
absorbit depindede structura i de numrul moleculelor i
al atomilor substanei cu care interacioneaz fascicululde
radiaii.

n funcie de domeniile spectrale n care are loc absorbia
luminii se deosebesc: metodespectrofotometrice n
ultraviolet (185-400nm), metode spectrofotometrice n
vizibil (400-800nm)i metode spectrofotometrice n
infrarou (peste 800nm).



Spectrofotometrie - generalitati

Principiul spectrofotometriei se bazeaz pe determinarea
concentraiei soluiilor colorate latrecerea unui fascicul emis
de o surs luminoas printr-o soluie omogen constituit
din substanade analizat.

Astfel se determin absorbia radiaiei luminoase, care este
direct proporional cuconcentraia substanei absorbante
n conformitate cu legea Lambert-Beer: A= lg I0/I = -lg
T = L C

A = absorbana;I0 = intensitatea luminii incidente;I =
intensitatea luminii transmise;T = transmitana;L =
grosimea stratului de absorbie (cm);C = concentraia
soluiei absorbante (moli/l); = absorbtivitatea molar
(constant caracteristic fiecrei substane absorbante).

Lungimea de und a luminii incidente este cea a culorii
complementare a soluiei de analizat.


Spectrofotometru UV-VIS
Curba etalon
Reprezentarea grafica a relatiei dintre doi parametri. In cazul
nostrua absorbantei (determinata prin citire la
spectrofotometru) fata de concentratie. Sunt utilizate dilutii
ale unei solutii de concentratie cunoscuta pentru
determinarea unei concentratii necunoscute.



LP 3

Metoda biuretului
Reacia este utilizat pentru determinarea
cantitativ a proteinelor. Asemntor compusului
numit biuret, peptidele i proteinele conin grupri
CO-NH- care reacionaez cu o soluie alcalin de
sulfat Cu (II) i determin apariia unei coloraii
albastru-violet.
Intensitatea culorii este o msur a numrului de
legturi peptidice prezente ntr-o protein.


Reacia nu este specific pentru legaturile
peptidice compusii cu doua grupari
carbonil legate printr-un atom de C sau N
dau reactie pozitiva.

Metoda este utilizata pt. determinarea unor
cantitati mari de proteine (1-20 mg).
Reactivi:

Reactiv biuret;

soluie standard proteic cu concentraia
cunoscut (5 mg/ml) de albumin seric
bovin (BSA);

proba de analizat reprezentat extract proteic
total.

Pt. curba etalon:



BSA (5 mg/ml) + A.D.
Diferite volume BSA si AD
concentratie proteica diferita
Pt. proba
EPT diluat
corespunzator
+ reactiv biuret

Incubare 10/ 37C. Citire la spectrofotometru n cuva cu drum optic
de 1 cm la lungimea de und 540nm. Citirea se face fata de A.D.




LP 4
Reacii de identificare a
glucidelor
Glucide
testate in
cadrul L.P.

Reacii de
identificare
a glucidelor


Glucoza
Fructoza
Glucide
testate in
cadrul L.P.

Reacii de
identificare
a glucidelor


Zaharoza
Reacii de identificare a glucidelor
Reacia Molisch;

Reacia cu iodul;

Reacia Benedict;

Reacia Seliwanoff;

Reacia Fehling.
Reacii de culoare
Denumirea reaciei Reactivul folosit Culoarea
rezultat
Specificitate
Molisch
Alfa-naftol 5%
Acid sulfuric conc.
Rosu-
purpuriu.
Monozaharide,
oligozaharide,
polizaharide.
R. cu iodul
Sol de iod 0,005 M
HCl 1M
Albastru pt.
amidon, rosu
brun pt.
glicogen si
amidon partial
hidrolizat
Amidon
glicogen
Benedict
r. Benedict (citrat
de Na+ carbonat
de Na + sulfat de
Cu)
coloraie
roie
Glucide cu caracter
reducator
Denumirea reaciei Reactivul folosit Culoarea
rezultat
Specificitate
Seliwanoff
r. Seliwanoff
(rezorcina in HCl
3M).
rosu Cetoze
Fehling
Reactiv F I
Reactiv FII
rosu Glucide cu caracter
reducator
Glucide cu caracter reducator -
glucoza
Echilibrul intre forma
piranozica si cea cu lant
deschis este directionat catre
aceasta din urma pentru a se
produce reactia de oxidare.



LP 5
Dozarea zaharurilor
reducatoare din extractul de
portocala cu o-toludina

Principiul metodei:

In prezenta acidului acetic, la cald, zaharurile
reducatoare formeaza cu o-toluidina un complex
colorat care prezinta un maxim de absorbtie la 630
nm.

Metoda poate fi folosit pentru determinarea
concentraiei glucozei din serul sanguin.

Reactivi:

Reactiv o-toluidina;

Solutie standrad de glucoza 100 mg%;


proba de analizat reprezentat de extract de
portocala diluat corespunztor.

Pt. curba etalon:



Sol. Standard de glucoza (100
mg%) + A.D.
Diferite volume sol. st. glucoza si AD
concentratie diferita
Pt. proba
Extract de
portocala
+ r. o-toluidina

Incubare 10/ baie de apa la fierbere. Citire la spectrofotometru n
cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de und 630 nm fata de
blanc.

Reactia glucozei cu o-toluidina



LP 5
Dozarea lactozei din lapte
Lactoza dizaharid cu caracter reducator, 4-6% din laptele de
vac i 2-3% din laptele uman.

Principiul metodei:

Concentraia lactozei poate fi determinat prin
orice metod caracteristic pentru zaharuri
reductoare, dup deproteinizarea laptelui.

n cazul acestui experiment, se realizeaz
deproteinizarea laptelui cu o soluie de wolframat
de sodiu, dozarea efectiv realizndu-se prin
metoda Nelson. n cazul acestei metode, ionii de
Cu (II) sunt redui la ioni de Cu (I), care la
rndul lor reduc acidul fosfomolibdenic la un
produs de reacie albastru.

Reactivi:

reactiv alcalin de cupru;

reactiv fosfomolibdenic;

soluie 10% de wolframat de sodiu;

soluie M/3 de H
2
SO
4
;

soluie stoc de lactoz 1%;


La 1 ml de lapte degresat prin centrifugare se adaug 2 ml de
soluie de wolframat de sodiu 10% i, ncet, sub agitare
constant, 2 ml M/3 soluie de acid sulfuric. Amestecul este adus
la un volum final de 100 ml, iar dup 5 minute de staionare este
filtrat printr-o hrtie de filtru.






E1 E2 E3
Filtrat 1 ml -
Apa distilata 1 ml - 2 ml
Soluie standard de lactoz* - 2ml -
Reactiv alcalin de cupru 2 ml 2 ml 2 ml
Se incubeaz timp de 8 minute pe baie
de ap la fierbere; ulterior eprubetele se
rcesc i se adug n fiecare eprubet
reactiv fosfomolibdenic.
Reactiv fosfomolibdenic 4 ml 4 ml 4 ml
Dupa 1 min. de staionare, amestecurile de reacie se dilueaz la un volum final de 25 ml
cu reactiv fosfomolibdenic diluat 1:4.
Se citete densitatea optic a probelor E1 i E2 fa de blanc E3, la 630 nm.
Calculul rezultatelor


Densitile optice fiind proporionale cu concentraiile este
valabil relaia:

D.O.
proba 1
/ D.O.
proba 2
= C1/C2, unde C1 este concentraia
lactozei din 0,01 ml lapte, iar C2 este concentraia lactozei dinm
standard (0,6 mg).

Concentraia lactozei din lapte, exprim n g/100 ml este dat
de relaia:

(D.O.
proba 1
/ D.O.
proba 2
) X ( 0,6/1000) X (100/0,01)