Sunteți pe pagina 1din 12

ACTIVITATE EXPERIMENTAL

DETERMINAREA ACTIVITII ENZIMELOR CU IMPORTAN N EXPLORAREA


HEPATIC

GENERALI TATI
Datele de laborator care exploreaza afectarea hepatica sunt denumite in mod obisnuit
teste functionale hepatice (TFH). Acestea cuprind o baterie de analize biochimice care susin
diagnosticul de hepatopatie. Ficatul este sediul unor multitudini impresionanate de procese
biochimice, astfel ncat nu exist nici un test care sa poata fi considerat indicator unic pentru
disfunctia hepatic.
Astfel n cadrul testelor funcionale hepatice un posibil profil biochimic ar avea
urmtoarea structur:
A. enzime hepatice: ALAT (alanin amino transferaza), ASAT(aspartat
aminotransferaza), ALP (fosfataza alcalin) , GGT (gamma glutamiltranspeptidaza), LDH (lactat
dehidrogenaza) etc.
B. bilirubin seric
C. proteine totale
D. albumin
E. uree
ENZI ME HEPATI CE CU ROL N DI AGNOSTI C

DETERMINAREA ACTIVITII ALANIN AMINOTRANSFERAZEI (ALAT) (GPT)
Principiul metodei:
Alanin aminotransferaza (ALAT) catalizeaz urmtoarea reacie:
COOH
CH
2
CH
2
COOH
COOH
C=O
CH
2
CH
2
COOH
ALAT
C NH
3
COOH
C=O
COOH
CH
3
CH NH
2
COOH

Acid
-cetoglutaric Alanin Acid glutamic Acid piruvic
Piruvatul format este transformat n lactat de ctre NADH+H
+
n reacia catalizata de
LDH (lactat dehidrogenaz) conform reaciei:
CH
3
C COOH
O OH
LDH
NAD
CH
3
COOH CH
NADH+H
+

Acid piruvic Acid lactic
Se msoar viteza de diminuare a concentraiei NADH+H
+
pe msur ce trece n NAD
+
,
prin scderea absorbiei n UV. Ea este direct proporional cu activitatea ALAT.
Aparatur:
Spectrofotometru
Cronometru
Reactivi:
1. Soluie substrat; L-alanina 800 mM in tampon fosfat 100 mM i pH=7,4
2. Amestec de: -cetoglutarat 10 mM, NADH
+
+H
+
0,2 mM, LDH 10mg/l n tampon
fosfat 100 mM, pH=7,4
Mod de lucru:
n momentul nceperii determinrilor se amestec soluia 1 cu 2 (4 pri reactiv 1 cu 1
parte reactiv 2 ).
Amestec de reactivi 1+2 (l)
l)
1000
Ser (l)
k3CI f syy) C
250
Se agit bine i se citesc extinciile la lungimea de unda de 366 nm n cuve de l cm.
Citirea se face din minut n minut timp de 3 minute la 25 C

Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire i se mparte la numrul de minute citite. Se
noteaz cu ( A/min).
Concentraia ALAT n UI/l = ( A/min) x 1520
Observaii: dac valoarea ( A/min) crete mai mult de 0,08 se recomand diluarea a 0,1
ml prob cu 0,9 ml ser i se nmulete rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua i la 30 C i 37
C.

Intervale de referin:
25 C 30 C 37 C
Brbai pn la 22 UI/l pn la 29 UI/l pn la 40 UI/l
Femei pn la 17 UI/l pn la 22 UI/l pn la 31 UI/l

DETERMINAREA ACTIVITII ASPARTAT AMINOTRANSFERAZEI (ASAT)-
(GOT)
Principiul metodei:
Alanin aminotransferaza (ASAT) catalizeaz urmtoarea reacie:
COOH
CH
2
CH
2
COOH
COOH
C=O
CH
2
CH
2
COOH
C=O
COOH
COOH
COOH
CH NH
2
CH
2
ASAT
NH
3
HC
COOH
CH
2

Acid Acid Acid Acid
cetoglutaric aspartic glutamic oxalacetic
Oxalacetatul format este transformat n malat de ctre NADH
+
+ H
+
n reacia catalizat
de MDH (malat dehidrogenaz) conform reaciei:
COOH
CH
2
COOH
HC OH
COOH
C=O
CH
2
COOH
NAD
MDH
NADH+H
+

Acid oxalacetic Acid malic

Se msoar viteza de diminuare a cantitii de NADH+H
+
pe msur ce trece n NAD
+
,
prin scderea absorbiei n UV. Ea este direct proporional cu activitatea enzimei ASAT.
Aparatur:
Spectrofotometru
Cronometru


Reactivi:
1. Soluie substrat: aspartat 200 mM n tampon fosfat 100 mM i pH =7,4
2. Amestec de: -cetoglutarat 12 mM, NADH
+
+H
+
0,2 mM, LDH 10mg/l, MDH 10
mg/l n tampon fosfat 100 mM pH=7,4
Mod de lucru:
n momentul nceperii determinrilor se amesteca soluia 1 cu 2 (4 pri reactiv 1 cu 1
parte reactiv 2 ).
Amestec de reactivi 1+2 (l) 1000
Ser (l) 250
Se agit bine i se citesc extinciile la lungimea de und de 366 nm n cuve de 1 cm.
Citirea se face din minut n minut timp de 3 minute la 25 C
Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire i se mparte la numrul de minute
citite. Se noteaz cu ( A/min). Concentraia ALAT n U/l = ( A/min) x 1520.
Observaii:
Dac valoarea ( A/min) crete mai mult de 0,08 se recomand diluarea a 0,1 ml prob cu
0,9 ml ser i se nmulete rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua i la 30 C i 37 C.
Intervale de referin:
25

C 30 C

37 C
Brbai pn la 18 U/l pn la 25 U/l pn la 37 U/l
Femei pn la 15 U/l pn la 21 U/l pn la 31 U/l

Interpretarea rezultatelor:
Permeabilitatea membranei celulare hepatice crete gradat funcie de suferin.
Investigaiile biochimice evideniaz creteri n ser a unor enzime celulare (ALAT, ASAT, LDH,
etc.).Nivelul seric al acestor enzime de leziune, variaz n funcie denumrul de hepatocite
afectate, de gravitatea lezrii fiecrei celule, de viteza cu care s-a produs leziunea i de viteza de
eliminare din ser (t 1/2) a enzimelor respective.
Dozarea ALAT i ASAT rmne cea mai util i sensibil investigaie biochimic n caz
de afectare hepatocelular acut (viral, toxic, medicamentoas), valori 500 U/l sugernd acest
diagnostic.

Valori crescute:
cele mai mari creteri 100-2000 U/l apar n hepatitele virale, intoxicaia cu tetraclorur
de carbon, n leziuni induse de medicamente.
creterea rapid i marcant a ASAT i ALAT (>600 U/l i adesea >2000 U/l) urmat de
o scdere brusc n primele 12-72 de ore de la debut este considerat specific pentru
obstrucia acut a ductelor biliare.
creteri importante ale ASAT i ALAT asociate cu creteri ale fosfatazei alcaline indic
icter hepatocelular.
ASAT crescut (300 U/l) i ALAT (200 U/l) se nregistreaz n obstrucia biliar
complet. Enzimele revin la normal n decurs de o sptmn de la ndeprtarea
obstruciei.
o stare patologic particular caracterizat prin creterea marcant a enzimelor hepatice
(ALAT, ASAT,OTC), a celor musculare (creatinkinaza CK), precum i a -amilazei i
lipazei pancreatice se ntlnete n sindromul Reye.
creteri moderate al ALAT i ASAT, asociate cu creteri ale fosfatazei alcaline
sugereaz icter colestatic.
valori mai ridicatede 150 U/l apar n hepatitele alcoolice (mai ales dac pacientul are i
delirum tremens).
valori 100 UI/l apar n ciroza alcoolic, nivelul ALAT este normal n 50 % din cazuri,
iar ASAT n 25% din cazuri.
creteri abia schiate ale ALAT i ASAT apar n procesele neoplazice ale ficatului, cnd
leziunile celulare hepatice se produc pe arii limitate n jurul infiltratului
malign.(ASAT>ALAT).
ALAT i ASAT cresc n urma transplantului hepatic, dup reperfuzia alogrefei (de 4-5 ori
limita superioar a intervalului de referin).
Creterile persistente sau tardive se pot datora rejeciei, infeciilor virale, abcesului
hepatic sau ocluzia arterei hepatice.
creteri moderate ale ALAT i ASAT se evideniaz n infeciile cu virus Epstein-Barr,
precum i n mononucleoza seric.
Alturi de creterile individuale ale enzimelor celulare se produc i modificri ale
raportului dintre ele. Astfel raportul ASAT/ALAT (raport de Ritis) la subiecii normali
este 1,3, dar poate fi modificat n funcie de afeciune.
ASAT/ALAT<1 apare n hepatitele virale.
ASAT/ALAT >2, cu ALAT <300 U/l sugereaz hepatit alcoolic.
ASAT/ALAT 3 la pacieni cu ciroz hepatic sau cu hipertensiune portal sugereaz
ciroz biliar primar.


Valori sczute :
deficit de piridoxal fosfat ce apare n sarcin, afeciuni hepatice secundare
consumului de alcool.
neoplazii
infecii urinare
n majoritatea afeciunilor hepatice sunt necesare dozri seriate ale enzimelor, valoarea
acestora indicnd evoluia clinic .

DETERMINAREA ACTIVITII GAMMA-GT ( -GT) (metoda cinetic)

Principiul metodei:
Determinarea activitii -GT se face folosind ca substrat L- - glutamil-3-carboxi-4-
nitroanilida. Reacia este urmtoarea:
NH
2
HOOC CH
2
CH
NH NO
2
C=O CH
2
H
2
N C=O CH
2
CH
2
COOH
HN


L-Gama-glutamil p-nitro-anilida Glicil-glicina

NH
2
HOOC CH
2
CH
C=O CH
2
NH C=O CH
2
CH
2
COOH
HN
H
2
N NO
2


L-Gama-glutamil glicil-glicina p-nitro-anilina
Creterea absorbanei pe msur ce se formeaz 4-nitroanilina este direct proporional
cu activitatea -GT. Citirile se efectueaz la 405 nm.

Aparatur:
Spectrofotometru
Cronometru
Cronometru
Reactivi:
1. Soluie glicilglicina in tampon TRIS pH=8,25, 100 mmol
2. Soluie substrat L--glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida, de concentraie 2,9 mmol/1
Mod de lucru:
1. Prepararea soluiei de lucru:
Se amestec 5 pri reactivul 1 cu o parte reactiv 2. Aceast soluie este stabil 7 zile la
temperatur de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.
2. Dozarea propriu-zis:
Soluie de lucru ( l) 500
Ser ( l) 50
Se agit i citesc absorbantele la 1, 2 i 3 minute
la
1,
2 si 3
minute

Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire i se mparte la numrul de minute citite. Se
noteaz cu ( A/min). Concentraia -GT (U/l) = ( A/min) x 1152.
Intervale de referin:
25 C 30 C 37 C
Brbai 6-28 U/l 8-38 U/l 11-50 U/l
Femei 4-18 U/l 5-25 U/l 7-32 U/l

Observaii:
Serul folosit trebuie s fie proaspt i nehemolizat, iar recoltarea se face pe citrat, oxalat
sau EDTA.
Linearitatea reaciei se menine pn la valori de 280 U/l. Peste aceste valori se
recomand diluarea a 0,1 ml prob cu 0,9 ml ser i se nmulete rezultatul cu 10.




Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:
Dozarea -GT este cel mai sensibil indicator i un test de screening folosit uzual
pentru determinarea alcoolismului. n acest caz creterea -GT o depete pe cea a
celorlalte enzime hepatice dozate n mod curent. Gradul de cretere a -GT la un
alcoolic variaz de la caz la caz i depinde mai mult de persistena ndelungat a
consumului dect de cantitatea ingerat. S-a demonstrat c o ncrcare suplimentar
cu alcool la un caz de alcoolism cronic produce n decurs de 24 de ore o cretere mult
mai accentuat a activitii serice a -GT (3,5x LSN), comparativ cu o acceai
ncrcare cu alcool la un subiect sntos consumator ocazional de alcool.
Pacienii alcoolici tratai cu anticonvulsivante au valori ale -GT de 50 de ori
valoarea normal. La pacienii tratai cu anticonvulsivante, dar care nu consum
alcool creterile pentru -GT sunt modeste.
n icterul obstructiv creterile pentru -GT sunt mai rapide i mai importante dect
cele pentru ALP i LAP.
n colestaza mecanic i viral -GT crete cam n aceeai proporie cu ALP i LAP,
pe cnd n colestaza medicamentoas creterea pentru -GT este mult mai mare.
n neoplasmul hepatic nivelul -GT crete progresiv de la o examinare la alta.
n ciroza biliar primar valorile pentru -GT sunt de aproximativ 13x LSN (limita
superioar normal).
n hepatita acut creterile sunt mai puin marcante dect a celorlalte enzime hepatice,
dar este ultima care revine la normal, indicnd covalescena.
n hepatita cronic activ valorile pot atinge 7x LSN. n stadiul asimptomatic al bolii
poate fi singura enzim hepatic ce prezint valori serice crescute.
-GT reprezint markerul cel mai sensibil al rejectului (dup transplant hepatic),
nivelul enzimei crete precoce naintea ALP i bilirubinei.
-GT prezint creteri importante alturi de cele ale ALP n leptospiroza
icterohemoragic (boala Weil).
Valori crescute se nregistreaz n tumori primitive sau metastatice ale ficatului
n intoxicaia cu clorpromazin valorile pentru -GT cresc semnificativ.










DETERMINAREA ACTIVITII FOSFATAZEI ALCALINE (ALP) (metoda cinetic)
Principiul metodei:
Fosfataza alcalina (ALP), n mediu alcalin (pH=8,6), catalizeaz hidroliza p-
nitrofenilfosfatului n p-nitrofenol i fosfat. Reacia este urmtoarea:
OH
NO
2
O P
H
2
O
NaOH
ALP
OH
O
NO
2
OH
HO
P OH
O
OH

p-nitrofenilfosfat Acid fosforic p-nitrofenol
Creterea absorbanei la 405 nm a p-nitrofenolului pe msur ce se formeaz este direct
proporional cu activitatea ALP.
Aparatura:
Spectrofotometru
Cronometru

Reactivi:
1. 2-amino-2-metil-1-propanol, pH 10,4; 0,90 mol/L
Acetat de magneziu 1,6 mmol/L
Sulfat de zinc 0,4 mmol/L
2. p-nitrofenilfosfat 16 mmol/L
3. Ser sau plasma (recoltate pe heparin)
4. Mod de lucru
a. Prepararea soluiei de lucru: se amestec 4 pri reactiv 1 cu o parte reactiv 2. Aceast
soluie este stabil 5 zile la temperatur de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.

b. Dozarea propriu-zisa:
Reactivi ( l) Prob ( l) Blanc ( l)
Soluie de lucru 100 100
Ser 20 -
Ap distilat - 20
Se agit i citesc absorbanele la 1, 2 i 3 minute

5. Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire att pentru prob ct i pentru blanc i se
mparte la numrul de minute cronometrate. Se noteaz cu ( A/min prob) i ( A/min
blanc). ( A/min)=( A/min prob)-( A/min blanc).
Activitatea ALP (U/l) = ( A/min) x 2757

6. Intervale de referin:
Aduli:
ALP (U/l)
Femei 20-50 ani 42-98
Brbai 20-50 ani 53-128
Femei > 60 ani 53-141
Brbai > 60 ani 56-119
Copii:
Fete Biei ALP (U/l)
1-30 zile 48-106 75-319
1 lun-1 an 124-341 82-383
1-3 ani 108-317 104-345
4-6 ani 96-297 93-309
7- 9 ani 69-325 86-315
10-12 ani 51-332 42-362
13-15 ani 50-162 74-390
16-18 ani 47-119 52-171

Observaii:
Testul este realizat pentru a determina activitile ALP care corespund unei A/min.,
maxime de 0.25. Peste aceasta valoare se recomand diluarea a 0,1 ml prob cu 0,9 ml ser i se
nmulete rezultatul cu 10.
Nu s-au observat interferene pentru urmtoarele substrate: acid ascorbic pn la 30
mg/dl, bilirubin conjugat pn la 60 mg/dl, bilirubin neconjugat pn la 25 mg/dl,
trigliceride pn la 2000 mg/dl. Limita minim de detecie este de 2 U/l.

Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:
obstrucie biliar (este considerat cel mai bun marker al obstruciei biliare, dar nu
difereniaz colestaza intrahepatic de obstrucia extrahepatic). n boala
hepatobiliar obstructiv nivelul seric al ALP crete n paralel cu cel al 5 -NT (5
nucleotidazei) i LAP (leucin aminopeptidazei).
creteri ale ALP n paralel cu -GT i 5 -NT apar n ciroza biliar primar.
raportul -GT/ALP 5 susine diagnosticul de boal hepatic alcoolic. Creteri ale -
GT determinate de alcool sau anticonvulsivante nu sunt nsoite de creterea ALP.
Stabilirea cauzei creterii ALP este extrem de util n vederea diferenierii
diagnosticului.
Enzima
seric
Obstrucie
biliar
Afeciune
osoas
Copilrie Sarcin
ALP C C C C
5 -NT C N N N
LAP C N N C
-GT C N N N

Unde: C = valori crescute; N = valori normale
nivelul ALP crete naintea apariiei icterului
nivele marcat crescute ale ALP apar la sugarii cu atrezie biliar intrahepatic, dar
mult mai sczute n caz de atrezie extrahepatic.
creteri modeste (cam de 3 ori valoarea normal) sunt specifice i pot fi ntlnite n
orice afeciune hepatic (hepatit viral, hepatit cronic, ciroz hepatic, afeciuni
hepatice infiltrative), dar i n alte boli cu interesare hepatic (ex. insuficiena
cardiac congestiv).
Valori sczute:
Scderi ale ALP apar n glicogenoza de tip I (deficit de glucozo-fosfataza).