Obiectivele:

1. Tipurile de acizi nucleici, funciile i repartizarea lor

n celul.
2. Constituienii acizilor nucleici; bazele azotate,
pentozele, acidul fosforic.
3. Nucleozidele i nucleotidele. 3, 5- cAMP
4. Structura primar, secundar i teriar a acizilor
dezoxiribonucleici Cromatina. Nucleosomul.
5. Structura acizilor ribonucleici (tRNA, mRNA, rRNA).
6. Denaturarea i hibridizarea acizilor nucleici.
Acizi nucleici
Acizi nucleici sunt polinucleotide,
alctuite din mononucleotide, unite
prin legturi 3, 5-fosfodiesterice.
1. ADN - acidul dezoxiribonucleic;
2. ARN - acidul ribonucleic.

ADN
Localizarea:
a. 97-99% - concentrat n nucleu
b. 1-3% - situat n mitocondrii.
Rolul: pstreaz i transmite
informaia genetic de la ADN
parental la ADN fiic sau ARN.


ARN
Localizarea:
11% - n nucleu
15% -n mitocondrii
50% - n ribosomi
24% - n hialoplasm
Deosebim:i:
1. ARN mesager
2. ARN ribozomal
3. ARN de transport
ARN cromosomial
ARN nuclear
ARN mesager (mARN) constituie 25% din
totalul ARN-lui.
Localizat -n nucleu i citozol.
Prezint copia sectorului de ADN i conine
informaia despre structura catenei
polipeptidice a proteinei.
Rolul:Transmite informaia de la ADN spre
ribozomi, sediul de sintez a proteinei.
ARN ribozomal (rARN) constituie 60% din
totalul ARN-ului.
Localizat- n ribozomii citoplasmei.
Rolul - formeaz scheletul ribozomilor.
Joac un rol auxiliar n procesul de
asamblare a proteinelor.
ARN de transport (tARN) constituie
15% din totalul ARN-lui.
Localizat: n citoplasm, ribosomi,
mitocondrii.
Rolul: particip la activarea i
transportul AA spre ribozomi i
asamblarea lor n polipeptide.
ARN cromosomial activarea genelor
ADN
ARN nuclear formarea scheletelor
particulei proteice care transport
ARN din nucleu n citoplasm

Structura chimic a AN
La hidroliz AN degradeaz n
mononucleotide, care la rndul lor, la
hidroliza complet degradeaz n BA,
pentoze i acid fosforic.
ADN----A; G; C; T+dR+H2PO3
ARN----A; G; C; U+ R+H2PO3
Bazele azotate
a. BA se clasific n :
1. majore: purinice: A, G i pirimidinice: C,T,U
2. minore:purinice (2metil A; 1 metilG) i
pirimidinice (5 metil C;5 hidroximetil C)
b. Sunt slab solubile n H2O
c. Prezint fenomenul de tautomerie (forme lactim-
lactam)
d. Sunt responsabile de informaia genetic
e. BA purinice- au structur plan; cele
pirimidinice- aproape plan, puin plat
j. Max capacitii de absorbie n ultraviolet este
ntre 260-280 nm

Bazele purinice
Bazele pirimidinice
Molecular Biology
Bicyclic
Purines:
Thymine (T) is a 5-methyluracil (U)
C1 Nucleic Acid Structure-1
Bases
Monocyclic
pyrimidine:
Structura BA minore
Molecular Biology
C1 Nucleic Acid Structure-2
Nucleosides
The structures of pentose sugar
Nucleozidul
const dintr-o BA ( purinic sau
Pirimidinic) +
o pentoz (riboza sau dezoxiriboza)
atomul C-1 al pentozei este unit cu N-
9 al purinei sau N-1 al pirimidinei -
leg. N glicozidic.

n funcie de pentoz: dezoxi i
ribonucleozide
BA purinice +R(dR) --- ozin
(adenozin, guanozin
sau dezoxiadenozin, dezoxiguanozin)
BA pirimidinice +R (dR) --- idin
(citidin, timidin, uridin sau dezoxicitidin) Unite ntre ele prin
legtura N glucozidic
Nucleozidele
Proprietile:
Mai solubile n H2O dect
BA
Mai stabile n soluii
alcaline
Uor se hidrolizeaz la
nclzire cu acid

NUCLEOTIDE - compui alctuii din nucleozide i rest de
acid fosforic
Nucleozid mono-; di-; trifosfafat

Rest al
acidului fosforic
Nucleozid
Nucleotide - Rolul
1. Element structural al AN
2. Intermediari energetici
(ATP- purttorul energiei
chimice n organism)
3. Intr n componena Co
4. Servesc ca activatori ai
unor molecule (UDP-Gl;
CDP-colina)
5. Servesc ca mesageri
secunzi intracelulari ai
hormonilor (AMPc;
GMPc)
Molecular Biology
A nucleotide is a nucleoside with one or more phosphate groups
bound covalently to the 3-, 5, or ( in ribonucleotides only) the 2-
position. In the case of 5-position, up to three phosphates may be
attached.
Deoxyribonucleotides
(containing deoxyribose)
Ribonucleotides
(containing ribose)
Phosphate ester bonds
C1 Nucleic Acid Structure-3
Nucleotides
Structura chimic
Structura primar a AN
Reprezint secvena
mononucleotidelor n lanul
polinucleotidic liniar, legate ntre ele
prin legturile 3' - 5' fosfodiesterice
Catenele au dou capete:
5 nucleozid tri fosfatul;
3 gr. OH liber
Structura secundar a ADN
Watson i Crick (1953) au
postulat modelul
structural al moleculei de
DNA - dublul helix
(spiral dubl)
Caracteristicile dublei
spirale:
1. 2 lanuri
polidezoxiribonucleotidice se
rsucesc helicoidal n jurul unui
ax comun, formnd o dubl
helice cu orientare spre
dreapta;
2. Cilindrul ce ncadreaz
dublul helix are d=2nm

Structura secundar a ADN
3. lanurile sunt antiparalele (unul are direcia
53, altul 35)
4. complimentaritatea (A i corespunde T; iar
G-C).
5. Stabilitatea dublului helix este asigurat
att de interaciunile hidrofobe dintre BA,
ct i de legturile de hidrogen ntre BA
(A=T formeaz 2 legturi de hidrogen, iar G
C trei legturi).
6. BA hidrofobe sunt situate n interiorul
spiralei duble i aranjate sub form de
stive, pe cnd complexul pentozofosfat este
situat la exteriorul spiralei duble, bine
interacioneaz cu apa, de aceia molecula
gigant de DNA se dizolva n ap.
7. Spiral este regulat (fiecare spir cuprinde
10 nucleotide). Distana dintre BA
nvecinate este de 0,34 nm, perioada de
identitate (pasul) 3,4 nm.
8. La pH=7 grupele fosfat sunt ionizate, poarta
sarcini negative, deaceia DNA prezint acid
puternic.
9. Dublul helix este de tip plectonemical, dar
nu paranemical
Legitile lui Chargaff
1. Coninutul adeninei este egal cu al timinei, iar al guaninei
cu al citozinei (A=T, iar G=C)
2. n orice preparat de DNA independent de specie suma
bazelor purinice este egal cu cea a bazelor pirimidinice
(A+G=T+C)
3. Preparatele de DNA separate din diferite esuturi a uneia
i aceeia specie de organisme sunt absolut identice
privind componena nucleotidic.
4. Componena nucleotidic a DNA la aceeai specie nu se
modific odat cu vrst, nu depinde de regimul
alimentar i modificrile mediului.
5. dac A+T este mai mare dect G+T avem DNA de tip AT
6. dac G+T este mai mare dect A+T avem DNA de tip GT
7. t de topire este mai mica cnd predomin perechile A-T
8. t de topire este mai mare cnd predomin perechile G-C
9. la eucariote DNA mitocondrial este circular

Exist diferite forme de DNA
- care sunt determinate de gradul de
dehidratare a acizilor nucleici: A,B i Z.
Modificrile n dublul helix sunt
dependente de anturajul extern ai
moleculei de DNA.
Dublul helix posed dinamism.
forma A:
- conine 11 resturi la o spir,
- este rsucit spre dreapta.
forma clasica B:
- conine 10 mononucleotide la o spir.
- este rsucit spre dreapta.
- 10 nucleotide ocup 34 A (3,4 nm).
- o nucleotid cuprinde 3,4A (0,34 nm).
conformatia Z spre deosebire de A
i B este rsucit spre stnga.
Structura teriar
Reprezint superspiralizarea dublului helix la care
particip proteinele histonice i formeaz cromatina
Unitatea structural a cromatinei este nucleosomul
Nucleosomul este un octamer histonic (2H2A;
2H2b; 2H3; 2H4) nfurat de aproximativ de 2 ori
de dublul helix cu o lungime de 146 perechi de
nucleotide.
ntre 2 nucleosmi se conin poriuni de ADN alctuit
din 20-60 perechi de nucleotide asociate cu H1
Lanul polinucleosomic formeaz un superhelix
(solenoid), fiecare spir are 10 nucleosomi,
d=30nm i pasul de 10nm






30 nm Solenoid ~40 / 50
DNA
Firul de
cromatin?
~ 1,000
Cromosoma metafazic/
cromatina interfazic
~ 10,000
Compactizarea
cromatinei
Nucleosoma
= ctamer de
histone
H2a, H2b, H3, H4
146 / 200 bp DNA
Compactizare
~10 ori
Structura secundar i teriar a
ARNm
ARNm fiecrei gene i corespunde
molecula sa de ARNm, de aceea el este
foarte heterogen
Elementul de codificare al ARNm este
tripletul nucleotidic numit codon. Fiecare
codon corespunde unui anumit AA
Structura secundar a ARNm o caten
curbat
Structura teriar se aseamn cu un fir
nfurat pe bobin, rolul creia l
ndeplinete o protein de transport
numit informer

Structura secundar a t-RNA
are infiarea unei "frunze de trifoi" - se formeaz n
urma imperecherii complementare intracatenare a
nucleotidelor anumitor sectoare.
Sectoarele, care nu sunt ncadrate n formarea legturilor
de H formeaz lanuri sau bucle
1. Sectorul de acceptare (4 nucleotide, 3 din care au
aceeai succesiune- CCA cu hidroxilul 3OH liber la care
se fixeaz grupa COOH al AA.
2. Bucla anticodonic - format din 7 nucleotide. Conine
un triplet nucleotidic specific pentru fiecare t-RNA numit
anticodon. Anticodonul t-RNA dup principiul
complementarittii se mperecheaz cu codonul respectiv
din RNAm. Interaciunea codon-anticodon determin
ordinea aranjrii aminoacizilor n catena polipeptidic.
3. Bucla pseudouridilic - const din 7 nucleotide (restul
acidului pseudouridilic este obligatoriu), particip la
interaciunea cu ribozomii.
4. Bucla dihidrouridinic - const din 8-12 resturi
nucleotidice ( resturi de dihidrouridin ), interactiuneaz
cu E- aminoacil-RNAt-sintetaza, care contribuie la
recunoaterea de ctre aminoacid a ARN-t specific.

Structura teriar a tRNA
Are forma L
Include 2 segmente de dublu helix
situate perpendicular (fiecare helix-
10 perechi de baze)
n afara spiralei bazele formeaz
legturi de hidrogen. Interaciuni
apar ntre bazele necomplementare
(A-A; A-C).Multe baze sunt aranjate
n stive (hidrofobe)
Structura teriar a tRNA
Are forma L
Include 2 segmente de dublu helix
situate perpendicular (fiecare helix-
10 perechi de baze)
n afara spiralei bazele formeaz
legturi de hidrogen. Interaciuni
apar ntre bazele necomplementare
(A-A; A-C).Multe baze sunt aranjate
n stive (hidrofobe)
ARNr
Structura secundar e prezentat
prin sectoare spiralate unite ntre ele
cu ajutorul unei catene curbate
Structura teriar prezint
scheletul ribosomului. Are forma unui
bastona sau ghem pe suprafaa
cruia sunt nfurate proteinele
ribosomului.
Proprietile fizico-chimice ale
acizilor nucleici
- masa molecular mare.
- proprietatile coloidale si osmotice, tipice
pentru toi compuii macromoleculari.
- Proprietile lor hidrofile depind de fosfai.
- viscozitatea i densitatea nalt a
soluiilor,
- capacitatea de denaturare.
- la pH fiziologic toti AN sunt polianioni (-)
Denaturarea i renaturarea
Denaturarea sub aciunea temperaturii, mediului
PH, substanelor chimice are loc ruperea
legturilor de hidrogen i forelor hidrofobe ce
stabilizeaz structura secundar i teriar a
DNA.
La denaturare DNA i pierde proprietile
biologice. Ex. nclzirea DNA-duce la desfacerea
spiralei duble n dou catene ( are loc
transformarea spiral - ghem).
Degradarea unei jumti de structur de ADN
are loc la temperatura de topire. ADN bogat n C
i G au o t mai nalt dect cele bogate n A i T.
La rcirea treptat catenele din nou se reunesc
dup principiul complementarittii, formnd
spirala dubl nativ. Acest fenomen se numete
renaturare (atunci cnd t e mai mic dect cea de
topire).
La racirea brusc renaturarea nu are loc.
Denaturarea i renaturarea acizilor nucieici este
nsoit de schimbarea activittii lor optice.
Hibridizarea AN
Pe capacitatea de renaturare a AN este bazat
metoda de determinare a gradului de nrudire a
AN, care poart denumirea de hibridizare
molecular.
La baza ei st mperecherea complementar a
sectoarelor unicatenare ale AN cu formarea unui
heteroduplex
Hibridizarea se efectueaz n felul urmtor:
1. AN se denatureaz separat;
2. se incubeaz mpreun ambele tipuri de DNA (ori
DNA i RNA).
3. n condiiile unui grad relativ crescut de
complementaritate a acestora se formeaz
moleculele hibride (DNA-DNA sau DNA-RNA).
Aceste molecule constau din sectoare spiralate i
nespiralate. Cu ct gradul de nrudire este mai
nalt, cu att hibridizarea este mai complect.

Aceast metod a permis
descoperirea particularitilor
structurii primare a DNA. S-a stabilit,
c n componena DNA a animalelor
se afl sectoare cu o succesiune
nucleotidic identic, care de multe
ori se repet. Hibridizarea decurge
foarte repede. Restul DNA este
prezentat printr-o succesiune unical
a nucleotidelor, care nu se dubleaz.


Obiectivele:
Dogma central a geneticii moleculare. Concepia: o
gen - un polipeptid.
Replicarea ADN- mecanismul, substratele, matricea,
enzimele i factori proteici, etapele biosintezei ADN.
Telomeraza. Rolul i structura..
Reparaia ADN.
Transcripia sau biosinteza ARN: matricea,
substratele, enzimele, mecanismul
Trsanscripia invers.
Biosinteza ARN pe matrice de ARN
Modificrile posttranscripionale (processing)
Inhibitorii sintezei acizilor nucleici.
Ingeneria genetic i semnificaia ei practic. Sinteza
anticorpilor



Dogma central a geneticei
moleculare
Postulatul de baz a geneticei moleculare a fost
formulat de Watson i Crick (Meselson, Stahl):
este transmiterea informaiei genetice de la ADN la
protein. Snt ncluse trei procese:
replicarea;
transcripia;
translaia.
Primele dou procese au loc n nucleu, iar al treilea n
citozol.
Procesul de transcripie este reversibil. Enzima care
catalizeaz transcripia invers se numete revertaza
(reverstranscriptaza) i a fost descoperit la oncovirui.
Sinteza ARN-ului pe baza ARN se numete replicarea ARN,
ea are loc la virui, care nu au ADN. Procesul de translaie
este ireversibil i se numete biosinteza proteinei.
Dogma central a geneticii moleculare
DNA
RNA
Protein
Structura genelor- dimensiuni, GS; GR
Gene- poriunile ADN ce conin informaia genetic cu
privire la sinteza unei proteine
Fiecrei gene i corespunde un lan polipeptidic- de aici i
conceptul: o gen un lan polipeptidic
GS- genele ce codeaz polipeptide i ARN. Poriunile GS
ce conin informaie (transductibile) exoni; iar
secvenele ce nu sunt traduse n ARNm introni
GR segmente de ADN, repetabile, relativ mici ce au un
rol reglator.
Rolul lor:
1. Pot fi semnale ce ne arat nceputul i sfritul GS
2. Particip n iniierea i terminarea transcripiei GS
Dimensiunile genelor f. variabile. Ex. Proteina ce
conine 350 AA--- 350X3=1050 nucleotide. tiind c BA
sunt localizate la 0,34 nm_----
0,34 nm X 1050=357 nm =0,36m

Replicarea

Replicarea transmiterea informaiei genetice de la ADN
parental la ADN fiic.
Caracteristicile:
1. Se petrece n nucleu
2. Proces semiconservativ
3. se desfoar n trei etape : iniiere, elongare, terminare
4. prezena praimerului este obligatorie
5. replicarea este cuplat cu desfurarea DNA parental
(necesit energie)
6. replicarea decurge n ambele direcii cu aceeai vitez.
7. Pe catena ntrziat se sintetizeaz fragmentele Okazaki.
8. Este bazat pe mpachetarea complementar a BA
9. Catena-fiic este antiparalel cu catena parental dar nu
identic dup secvena nucleotidic
10. Fora motrice a procesului este hidroliza pirofosfatului
11. angajeaza simultan intregul cromozom.



Componentele necesare replicrii:

1. Matri - ADN bicatenar
2. Substrat: dATP, dTTP, dGTP, dCTP; ATP, GTP, CTP,
UTP
3. prezena ionilor de Mg, Mn; Zn
4. Sistemul multienzimatic complex:
a. Helicaza-desfacerea dublului helix, treptat, pe
poriuni mici. Cele 2 catene rmn separate ca
urmare a interveniei proteinelor de stabilizare
(SSB).
b. Topoizomerazele I i II nltur supertorsiunile
ADN, rezolv problemele topologice aprute n
cursul desfacerii lui. (I introduce supertorsiuni
negative; II scindeaz o leg. fosfodiesteric pe
una din catene i permite celor 2 catene s se
roteasc una fa de alta)
c. ARN primaz - sintetizeaz primerul n direcia 5'-
3 .

d. ADN polimeraza ( ADNp I, II, III)-
sinteza catenei fiice n direcia 5'3' .
ADN p III:
aciune polimerazic (5'- 3) -
sintetizeaz n direcia 5- 3' lanul
polidezoxiribonucleotidic, prelund
instrucii de la ADN-matri,
- aciune exonucleazic (3'- 5)
- ADN pII - rol neclar.
ADN pI - posed activitate 5'- 3
exonucleazic, nltur primerul i-l
nlocuiete cu fragmente de ADN
e. ADN ligaza- unete fragmentele Okazaki
de pe catena ntrziat. Catalizeaz
formarea unei legturi fosfat diesterice
ntre 3'-OH a unui fragment de ADN i
extremitatea 5' monofosfat al altuia.
Mecanismul replicrii
3 etape: iniierea, elongarea, terminarea
Originea replicrii este reprezentat de o secven specific
de nucleotide secvena ori.
Replisoma (complex proteic) recunoate punctul de
origine.
Iniierea parcurge dou etape:
a. Formarea furcii de replicaie- ataarea replisomului la
punctul de origine al replicrii i sub aciunea helicazelor are
loc desfacerea duplexului parental pe anumite poriuni
replicatori (la scindarea leg. de H dintre BA - se utilizeaz
min 2 mol. de ATP). La desfacerea duplexului parental apar
regiuni superhelicoidale, care se regleaz cu ajutorul girazei
(topoizomerazei).
Topoizomeraza efectueaz rupturi monocatenare apoi
sudeaz legtura fosfodiesteric i favorizeaz relaxarea
structurii DNA

b. Sinteza primerului -
sub aciunea primazei
se sintetizeaz o
poriune mic de ARN
n direcia 5'- 3'.
Primerul este format
din 5-10
ribonucleotide.
Cruparea 3OH e un
iniiator al sintezei de
ADN.
Elongarea
ADN polimeraza III unindu-se la
captul 3' OH al primerului ncepe
sinteza ADN fiic. Reacia decurge
prin atacul nucleofil al grupei 3' OH al
primerului asupra unui dRNTP
complementar catenei de ADN
matri. Se formeaz legtura
fosfodiesteric i se elibereaz PP;
hidroliza PP determin polimerizarea
propriu zis.
Elongarea decurge n direcia 5' 3,
i parcurge cu aceeai vitez pe
ambele catene
Catena de baz se va sintetiza
continuu, iar cea ntrziat -
discontinuu: va fi format din
fragmente Okazaki (dimensiuni de
1000 2000 nucleotide la procariote
i 150-200 la eucariote).
ADN polimeraza I exclude primerii i
sintetizeaz complementar ADN.
Fragmentele snt unite cu enzima
ADN ligaza (necesit ATP la eucariote
i NAD la procariote).
Terminarea
Terminarea replicrii are loc atunci,
cnd cele dou bifurcaii de replicare
se ntlnesc ntr-o regiune opus
regiunii "ori". Proteinele speciale
semnalizeaz oprirea repilcrii
prevenind aciunea helicazelor.


Replicarea la eucariote
Particulariti:
ADN polimerazele:
- implicat n replicarea ADN nuclear- responsabil de
sinteza catenei ntrziat sinteza primerilor
rspunde de sinteza catenei lider. Ea manifest
aciune exonucleazic
implicat n reparaia ADN
- implicat n replicarea ADN mitocondrial, aciune
exonucleazic
Bifurcaia replicii este de 3000 baze pe minut comparativ
cu 16.000 la procariote
Pe o molecul de ADN exist mai multe origini de
replicare (3X104 - 3X105 separate prin perechi de
baze). n aceste origini multiple de replicare se
organizeaz bifurcaii- ce se deplaseaz biderecional pe
cromosomul eucariot n curs de replicare.
Fragmentele Okazaki 150-200 nucleotide
Telomer Telomeraza
Replicarea capetelor 5 ale
catenelor este incomplet (teoria
lui Olovnicov, 1971), deoarece
dup nlturarea primerului
ultimului fragment Okazaki, ADN p
I nu e e capabil s completeze
aceste goluri. Astfel la fiecare
replicare, capetele ADN se
scurteaz.
Aceasta nu afecteaz informaia
genetic deoarece catenele conin
fragmente repetitive neinformative
telomere.
Telomerele sunt replicate de o E
specific telomeraza
Telomeraza - reprezint o
ribonucleoproteid: ARN i protein
Subunitatea proteic TRT
(telomeraze revers transcriptase)
posed activitate catalitic
Telomeraza fiind o revertaz (ADN
polimeraza ARN dependent)
folosete ca matri propria coenzim
un fragment de ARN.
I etap are loc asocierea
telomerazei la captul 3 al catenei
lider din regiunea telomeric-
TTAGGG
II E extinde catena, utiliznd ca
matri ARN telomeric (se repet)
III Catena complementar a ADN
telomeric e sintetizat dup principiul
catenei ntrziate de ADNp
Mecanismul elongrii capetelor
cromozomului la eucariote

Mecanismul elongrii capetelor
cromozomului la eucariote

cromozoma GGGTTAG 3
AUCCCAAUC 5
Fixarea telomerei TTAGGG
elongarea GGGTTAGGGTTAG
5 AUCCCAAUC


translocarea GGGTTAGGGTTAG
5 AUCCCAAUC


Structura i funcia RNA
telomerazice.
Structura primar: la majoritatea
RNA telomerice, regiunea matricial
se afl la deprtarea de 50
nucleotide de la captul 5, i are
urmtoarea succesiune de nucleotide
5-CUAACCCUA-3.
Structura secundar e compus
din 4 bucle i un fragment
unicatenar, ce conine matria pentru
sinteza DNA telomerice.
Inhibitorii telomerazei
oligonucleotidele modificate,
complementare regiunii matrice a RNA
telomerazice. Aa nucleotide specific se
fixeaz de matria RNA telo a omului,
inhibnd activitatea telomerazic in vitro.
In vivo apare problema transportului
inhibitorilor prin membrana celular i
micarea dirijat n nucleul celular.
Ca inhibitori au fost testai i inhibitorii
reverstranscriptazelor azidotimidina,
didezoxiguanozina.
La om telomeraza e activ numai n
celulele embrionale, n epiteliul
intestinului, spermatozoizi i celule
canceroase.
Numrul telomerilor determin
durata vieii fiecrei celule i
condiioneaz reducerea critic a
numrului lor, induce moartea
programat a celulei deci pierderea
motivelor telomerice este cauza
imbtrnirii (telomera conine mii de
motive TTAGGG).
lungimea telomerei este marcherul
biologic al mbtrnirii.
Reparaia ADN
Erorile n timpul replicrii sunt reduse la
minimum datorit DNA polimerazei ce
posed funcie endonucleazic
Tipuri de deteriorri:
1. Formarea de bree
2. Modificarea BA
3. Pierderea de BA
4. Formarea dimerilor de pirimidin sub
aciunea razelor ultraviolete
Reparaia ADN
Incizia dimerului
sub aciunea
endonucleazelor
Peticirea sub
aciunea ADN
polimerazei I
Excizia
fragmentului lezat
sub aciunea
exonucleazei
Sudarea sub
aciunea ADN ligazei
Reparaia prin
excizia dimerului
Reparaie prin fotoreactivare
Reparaie prin recombinare
Transcripia
biosinteza ARN pe matri de ADN
Particulariti:
Matri - DNA dublu helicoidal (prezena
catenei anticodogene de ADN) (catena+),
Substrat - ribonucleozidtrifosfai (ATP, GTP,
CTP, UTP)
Sinteza are loc n direcia 53
Este asimetric copierea catenei
necodifictoare
Este incomplet are loc copierea doar a
unei poriuni de ADN (transcripton:
promotor, operator, GS, terminator)
Fora motrice a procesului e hidroliza PP
Enzima - ARN polimeraza
ARN polimeraza

1. este o holoenzim
2. la procariote - este oligomer din 5 protomeri
(2, , 1 i sigma ).
subunitile centre catalitice;
- fixeaz substratul;
1 se leag de ADN,
- are rol n recunoaterea secvenelor
matriei numit promotor, unde ader enzima
la eucariote:
1. RNApI sintetizeaza RNA ribozomal (28S si 18S)
2. RNApII sintetizeaza RNAm
3. RNApIII sintetizeaza RNAt, RNAr 5S i molecule mai mici

3. Nu necesit prezena primerului
4. Nu posed funcie nucleazic, doar polimerazic
5. ADN polimeraza conine Zn2+ i necesit
prezena n mediu a ionilir de Mg2+, Mn2+

Etapele transcripiei
Sinteza decurge n 3 etape: iniierea, elongarea,
terminarea.
Iniierea ncepe n anumite secvene de ADN numite
promotor (P 40 nucleotide).
Pe P deosebim 2 locusuri: de recunoatere (depistat cu
ajutorul sigmei) i locusul de legare lax a ARN
polimerazei. Locusul de recunoatere e situat la o distan
de 25 nucleotide de locusul de legare i 10 nucleotide de la
punctul de iniiere (+1)
Toi P bacterieni au 2 secvene consens situate pe catena
codifictoare:
Caseta Pribnow (-10) 5 TATAAT 3 responsabil de
iniierea denaturrii locale a ADN
Caseta -35 5 TTGACA 3 - la care are loc asocierea
primar a ARN polimerazei
subunitatea recunoate caseta -35 i se leag la ea. E.
alunec de-a lungul ADN i n jurul casetei -10 (Pribnow)
deschide dublul helix formnd complexul deschis de
iniiere
ARN p catalizeaz formarea primei leg. fosfodiesterice ntre
nucleotidul +1 i +2 - disociaz, iar E-cor continu sinteza.
Fig. 5.4
Etapele transcripiei
Sinteza decurge n 3 etape: iniierea, elongarea, terminarea.
Iniierea ncepe n anumite secvene de ADN numite promotor (P 40
nucleotide). ARN polimeraza recunoate cu ajutorul sigma
Toi P bacterieni au 2 secvene consens situate pe catena codifictoare:
1. Caseta Pribnow 5 TATAAT 3
2. Caseta 35 5 TTGACA 3
P la eucariote:
1. GC casete GGGCG
2. CAAT casete CCAAT
3. Caseta Hogness TATAT/AT
Primele 2 sunt responsabile de frecvena transcripiei (cnd ncepe), a 3 - -
implicat n iniiere semnal (unde). Toate sunt responsabile de exacitatea
iniierii
Pe P deosebim 2 locusuri: de recunoatere (depistat cu ajutorul sigmei) i
locusul de legare lax a ARN polimerazei. Locusul de recunoatere e
situat la o distan de 25 nucleotide de locusul de legare i 10 nucleotide de
la punctul de iniiere (+1)


Sigma subunitatea gsete punctul de iniiere i:
1. Activeaz identificarea secvenelor de RNA
polimeraz
2. Ia parte la desfacerea dublului helix de ADN
3. Ia parte la formarea primei legturi
fosfosiesterice
Astfel complexul de iniiere este format, sigma
subunitatea e disociat de la holoenzim i ia
parte la iniierea unui alt ciclu de transcriere.

Elongarea i Terminarea
Elongarea - alunecarea ARN polimerazei pe
matra de ADN sinteza transcriptului (50
nucleotide pe secund) . RNAp nu controleaz
catena sintetizat erorile sunt mai multe fa
de replicare. Pe msur naintrii ARNp are loc
desprinderea ARN de la ADN i refacerea dublului
helix
Terminarea RNAp recunoate secvenele
nucleotidice specifice de pe ADN, ce conin un
numr mare de G, C . Proteina - se asociaz
la E i se mic mpreun cu ea, ns la
identificarea semnalelor de terminare coboar de
pe matri i ncetinete aciunea E,producnd
transcriptul cu folosirea energiei ATP


Transcripia la eucariote
1. RNA p alctuit din 9-11 subuniti
2. Folosesc mai multe tipuri de ARN p:
a. ARN polimeraza I ARNr (18S, 28S, 5,8S; 45S) n nucleoli;
b. ARN polimeraza II ARNm;
c. ARN polimeraza III ARNt i ARNr (5S)
d. ARN polimeraza IV (mitocondrial)- toate tipurile de ARN
mitocondrial
P la eucariote:
GC casete GGGCG (-90)
CAAT casete 5-GGCCAATCT -3 (-75)
Caseta Hogness TATAT/AT (-35)
Primele 2 sunt responsabile de frecvena transcripiei (cnd ncepe),
a 3 - - implicat n iniiere semnal (unde). Toate sunt
responsabile de exacitatea iniierii
Secvenele alctuite din 10-20 nucleotide enhancers i silencers
cresc i scad respectiv V transcrierii; pot fi situate la distane
mari de gena transcris.


Procesingul
Toi precursorii de ARN n nucleu trec etapa de
maturizare posttranscripional. Pe parcursul
procesingului - pre-ARN se transform n ARN
matur.
Procesingul nclude:
1. Modificarea fragmentelor terminale 5 i 3
ale ARN:
a. Cap-area: la captul 5 -este adiionat
guanozina metilat (5- 5 trifosfat - protejarea
mARN de atacul 5-exonucleazelor i pentru
recunoaterea de ctre ribosomi ca semnal de
iniiere);
b. la captul 3 se adaug o secven mare de
poli A (200 A -coad). Ea servete la exportul
moleculelor de ARN din nucleu n citoplasm.

Fig. 5.11
2.Splisingul - excizia intronilor i
sudarea exonilor. Aa numitul splising
are loc n nucleul celulei.
a.ARN nuclear (ARN U) identific secvenele
de baze la jonciunea intron exon,
b. se fixeaz complementar la ele, bucleaz
intronul, astfel apropiind capetele exonilor.
c. Are loc scindarea legturilor
fosfodiesterice dintre exoni i introni,
capetele exonilor sunt juxtapuse, apoi
sudate de RNA ligazele

Fig. 5.13
e.g., Fig. 5.13
Transcripia invers
sinteza ADN pe catena de ARN
Matria ARN
Substrat dRNTP:dATP, dGTP, dCTP, TTP
Enzima revers transcriptaza
Caracteristic viruilor oncogeni
Mecanismul:
a. Revers transcriptaza sintetizeaz pe ARN viral
catena de ADN- hibrid: ADN_ARN
b. Scindarea ARN viral de o nucleaz
c. Autoreplicarea ADN cu formarea unui duplex de
ADN

Codul genetic
Translaia
Reglarea sintezei
proteinei
Obiectivele:
Codul genetic. Proprietile.
Ribozomii - sediul sintezei proteinelor, structura lor.
Procesul de translare (sinteza proteinelor). Modificrile
posttranslaionare ale proteinelor.
Reglarea biosintezei proteinelor. Inducia i represia
enzimelor.
Inhibitorii sintezei proteice.
Polimorfismul proteinelor (variantele hemoglobinei,
enzimelor, grupelor sanguine).
Bolile ereditare i diagnosticul lor biochimic.
Codul genetic
Informaia genetic referitor la
biosinteza proteinelor se transmite cu
ajutorul codului genetic - dicionar
ce traduce secvena nucleotidelor din
ADN n succesiunea AA din lanul
polipeptidic.
Proprietile codului genetic
Este triplet -64 codoni: 3 nonsens:UAG; UGA;
UAA; 61 codific AA corespunztori
- este degenerat - unui AA poate s-i corespunda
mai muli codoni (Ex. Arg, Leu, Ser - codificate
de 6 codoni; Met- i Trp - un codon). Codonii
unui aminoacid sint sinonime. Specificitatea
codonului e determinat de primele dou litere.
Degenerarea se refer la nivelul nucleotidului 3
din codon sau 1 din anticodon care oscileaza.
- nu este ambiguu- acelai triplet nu semnific 2
AA diferii
- Are o structur liniar (colinear) o
concordan liniar ntre gen i proteina
codifictoare
- Nu se suprapune (excepie- viruii)
- Este universal toate veuitoarele utilizeaz
acelai mecanism de traducere (abatere prezint
codul genetic al mitocondriilor);
- nu are virgule, semne de punctuatie - ce ar indica
nceputul i sfritul fiecarui codon.
1. AUG - este codonul de initiere
2. UAG, UAA,UGA - codoni stop (non sens)
3. Toi codonii cu U (n pozitia 2) codifica AA hidrofobi
4. codonii cu A n pozitia -2 codific AA polari
5. Uracilul n poziia 1 prezint codonul nonsens
6. dac n anticodon n directia (5'->3') prima baz
nucleotidic e:
a) Citozina sau Adenina, el va citi un singur codon;
b) Uracilul sau Guanina el va citi 2 codoni;
c) inozina - respectiv va citi 3 codoni

Ribozomii
Reprezint sediul de traducere a ARNm i sinteza
proteinelor.
Structura- complexe ribonucleoproteice i sunt formai
din dou subuniti de mrime inegal (mare i mic)
Structura ribozomilor procariotici:
subunitatea 30 S conine ARNr 16S i 21 proteine.
subunitatea 50S ARN r 5S, 23S i 31 proteine.
Sinteza ARNr i formarea subunitilor are loc n
citoplasm.
Structura ribosomilor eucariotici:
subunitatea 40S ARNr 18S i 33 proteine.
subunitatea 60S ARN r 5S, 5,8S, 28S i 49 proteine.
ARNr se formeaz n nucleol.
Ribozomul va avea constanta de sedimentare 70S la
procariote si 80S la eucariote.
S este coeficientul de sedimentare Svedberg, care
depinde de forma, densitatea i dimensiunea
particulelor.

Centrele catalitice ale ribosomilor
Situsul A - aminoacil responsabil de unirea
complexului aminoacil- ARNt
Situsul P peptidil gzduiete ARNt legat de
un lan polipeptidic deja sintetizat
Situsul E e responsabil de eliminarea ARNt
Procesul de sintez proteic poate fi schiat
sumar prin interaciunea celor 3 tipuri de ARN -
informaia din ARNm este citit in ribozom si
transpus n proteine, AA necesari fiind adui de
ARNt.
n starea complet nedisociat ribozomii sunt
activi.
Deplasarea lber a ribozomilor n diferite sectoare
ale celulei, sau combinarea lor n diferite locuri cu
membranele reticulului endoplasmatic ofer
posibilitatea de asamblare a proteinei n celul.

Mai muli ribozomi
pot citi simultan
acela ARN mesager
pe care il parcurg in
acela sens. Se
constituie astfel un
poliribozom,
structur ce permite
accelerarea sintezei
proteice.
Translaia
Translaia sau biosinteza proteinelor propriu
zis.
Bazele moleculare ale translaiei:
1. m-RNA ca matri genetic, programul creia
determin succesiunea AA n protein;
2. aminoacil tRNA;
3. ribozomii ca maini moleculare pentru unirea
succesiv a AA n catena polipeptidic conform
programului mRNA;
4. GTP ca surs de energie;
5. factorii proteici care vin n ajutor n diferite
etape ale asamblrii proteinei n ribozomi;
6. unii ioni ca cofactori (Mg 2+, K+).
Etapele
se realizeaza in 5 etape:
Activarea AA.
Iniierea lanului polipeptidic.
Elongarea lanului polipeptidic.
Terminarea lanului polipeptidic si
eliberarea acestuia.
Prelucrri post traducere ale
proteinei sintetizate.
Activarea AA
are loc n citozol
Sunt necesare:
1. AA (procariote Nformil-Met; la eucariote Met)
2. ARNt
3. ATP, Mg, K
4. E aminoacil ARNt sintetaza (exist nu mai puin de 20
indentificate 32 de tipuri de ARNt):
a. Posed 4 centre: pentru AA, ATP, ARNt, H2O
b. Specificitatea E e determinat de structura ARNt
c. Fidelitatea e asigurat de capacitatea de autocontrol
d. Conine grupri libere sulfhidrilice
e. sunt ligazele, care au o specificitate absolut.




Se desfoar n dou etape:
ATP PPi
1. NH
2
-CH-COOH NH
2
-CH-CO O-AMP

I I
R

R Aminoacil Adenilat


2. NH
2
-CH-CO O-AMP+ARNt NH
2
-CH-CO O-RNAt +AMP

I I
R R


Aminoacil RNAt
I etap - AA reacioneaz cu ATP rezultnd aminoacil-AMP. PP
eliberat este hidrolizat i in acest fel reacia ireversibil.
II etap - complexul cedeaz AA moleculei de ARNt, specific acelui
AA

Activarea AA
Aminoiacil ARNt
sintetaza
Activarea AA
Parcurge n 2 etape:


Activarea AA
Esena procesului de activare este
fixarea AA la ARNt propriu acestui AA, n
zona acceptorie la 3' CCA OH (sau 2'
OH) al ribozei restului adenilic
Enzima poate recunoaste daca un AA
gresit s-a fixat pe ARNt, situatie in
care il elimina si il inlocuieste cu AA
corespunzator deoarece prezinta si
un locus hidrolitic.
Activarea AA
Activarea AA consum 2 legturi
macroergice
ARNt pe calea difuziunii simple
transfer AA adiionat la el - la
ribozomi, unde are loc asamblarea
proteinei din AA.


Translaia propriu zis
Citirea ARNm se face n direcia 5- 3'
iar proteina se sintetizeaz de la
captul Nterminal la C terminal
se desting trei etape:
Iniierea
Elongarea
terminarea.

Iniierea
Necesar:
1. ARNm (AUG)
2. Ribosomul cu subunitile
disociate
3. ARNt f-met (Met)
4. GTP, Mg
5. IF1, IF2, IF3
Scopul: formarea
complexului de iniiere
Formarea complexului de iniiere:
Subunitatea mic leag IF3 i
previne reasocierea ribosomilor
La subunitate adiioneaz
ARNm (AUG) fixarea
codonului e determinat de un
fragment de pe ARNm compus
din 6-8 resturi de A-G i este
complementar cu succesiunea
OH al ARNr
La complex adiioneaz IF1,
mai apoi IF2 legat de GTP i
formil Met-ARNt
ndat cum are loc fixarea
anticodonului fMet-ARNt cu
codonul AUG (ARNm), are loc
hidroliza GTP, eliberarea FI i
unirea subunitilor
Formil Met-ARNt e fixat n
centrul P
30S
FI3
P 50S A
FI1
FI2
Elongarea
Necesar:
1. ARNm cu urmtorul codon
2. ARNt cu urmtorul AA
3. GTP
4. FE: Tu, Ts, G
Elongarea translaiei include trei etape:
1. Legarea aminoacil ARNt;
2. Transpeptidarea- formarea legturii peptidice,
3. Translocarea (deplasarea ARNm cu un codon).
1. Adaptarea (legarea)AA
are loc dup principiul codon-
anticodon n centrul A
a. Aminoacil-ARNt se fixeaz
cu Tu+GTP adiioneaz la
complexul de iniiere.
b. AA se fixeaz n centrul A.
Simultan are loc hidroliza GTP
n GDP i P
Tu-GDP+GTP-Ts------Tu-GTP




2. Transpeptidarea
este formarea legturii peptidice
ntre doi aminoacizi.
AA din centrul P sub aciunea
peptidiltransferazei trece n centrul
A.
Se formeaz dipeptida
n centrul P rmne ARNt liber
3. Translocarea
deplasarea ARNm cu un triplet n
direcia 5- 3' .
Dipeptida din centrul A trece n
centrul P sub aciunea factorului G
(translocazei) i GTP
ARNt din P prsete ribosomul

Elongarea
Decurge n 3 etape :1 fixarea
noului Aminoacil ARNt
complexul: aminoacil-ARNt,
factorul de elongare T (FE-T) i
GTP.
se fixeaz pe situsul A, dup
ce are loc hidroliza GTP la GDP
care se elibereaz mpreun cu
FE-T.
2. formarea legturii peptidice.
Enzima peptidil-transferaza
catalizeaz formarea legturii
peptidice ntre doi AA din
situsul A i P.Peptida rmne
ataat de RNAt de pe situsul
A.
translocaia
ribozomul se deplaseaz la
urmtorul codon de pe ARNm
i peptidilARNt trece de pe
situsul A pe P
aceast etap necesit factorul
de elongare G (FE-G) i GTP
(necesar pentru realizarea
modificrilor conformaionale
care deplaseaz ribozomul).
30S
P 50S A
FE-T
E-PT
FE-G
FE-T
Terminarea
are loc cnd sunt ntlnii codonii UAA,
UGA, UAG i factorii proteici de terminare:
R1, R2, S.
Nici un tRNA nu se poate lega cu codonii
de terminare.
Factorii de terminare:
elibereaz lanul polipeptidic
Elimin ARNt din centrul P
Disocierea ribosomului n subunitile
respective

La formarea unei legturi peptidice
se consum patru legturi
macroergice:
2 n etapa de activare a AA (ATP) i
2 n elongare: legare i translocare -
GTP.
Prelucrrile posttraducere
Modificarea captului N- i C-terminal; captul N se
acetileaz;
ndeprtarea secvenei semnalizante cu ajutorul unei
peptidaze;
modificarea unor AA:
1. hidroxilarea enzimatic a Pro, Lyz obinerea
hidroxiprolinei, hidroxilizinei .
2. Metilarea (Lyz n muchi)
3. Carboxilarea Glu - -carboxil-glutamatului (protrombin)
4. oxidarea reziduuriilor de Cis - cistinei;
5. iodurarea reziduurilor de Tir ale tireoglobulinei.
ataarea unor gr. funcionale: fosfat, glicozil, metalelor
pentru formarea fosfoproteinelor,glicoproteinelor,
metaloproteinelor .a.
Formarea punilor disulfurice
Proteina se autoasambleaz formnd conformaia nativ
structura tridimensional
Inhibitori ai sintezei proteinei

la nivelul replicrii:
1. Mitomicina mpiedica separarea
catenelor de ADN
2. Acid nalidixic inhiba ADN giraza
la nivelul transcriptiei:
- Actinomicina D - se fixeaza pe ADN
Rifampicina - inhiba ARN polimeraza

Inhibitorii sintezei proteinei
la nivelul translatiei:
Streptomicina inhiba legarea ARNt initiator la
subunitatea 30S
Cloramfenicol -inhiba peptidil transferaza
Tetraciclina - inhiba legarea ARNt la ribozomi
Eritromicina,Azitromicina blocheaza subunitatea
50S
Puromicina blocheaza elongarea inhibnd
competitiv ARNt
Streptomicina - interfer cu legarea formil-Met-
ARNt la locul de iniiere.
Neomicina, Kanamicin - erori n reproducerea
codului genetic
Toxina difteric - inhib translocaza

Reglarea sintezei proteinelor
Sinteza proteinelor nu e constant ea trebuie
s se adapteze cerinelor vitale
Celulel dispun de 3 tipuri de enzime :
1. Constitutive - se sintetizeaz n celul cu o vitez
constant.
2. Inductible - sunt E a cror concentraie depinde
de prezena sau absena din mediu a unui
compus denumit inductor. Sunt implicate n cile
catabolice,
3. Represible - sunt E a cror concentraie depinde
de prezena sau absena din mediu a unui
compus denumit corepresor. Sunt implicate n
cile anabolice.
n mod normal cantitatea de E inductibile n
celule este foarte mic,dar ea poate crete atunci
cnd apare necesitatea utilizrii substratului E
respective ( S care se comport ca inductor).
Teoria lac-operonului
Schema reglrii biosintezei proteinei la procariote a
fost descris n 1961 de ctre Jacob i Monod -
poart denumirea de teoria lac-operonului .
Modelul e bazat pe studiul reglrii mtabolismului
lactozei n Escheria coli.
Exprimarea GS (conin informaia cu privire la
biosinteza E impicate n utilizarea lactozei:-
galactozidaza, permeaza i transacetilaza 1,2,3) e
controlat de un fragment de ADN denumit gen
reglatoare (GR) - codific represorul (R). R se leag
de un fragment de ADN denumit operator (O).
Legarea R la O blocheaz accesul ARN polimerazei
la promotor avnd ca rezultat suprimarea transcrierii
GS.
Ce se ntmpl dac bacteria dispune
simultan de glucoz i lactoz?
Bacteria nu consum energie pentru
sinteza lac-operonului, atta timp ct
dispune de glucoz.
Bacteria crete pe seama glucozei - i
numai atunci cnd c% acesteea devine
minim ncepe s utilizeze lactoza.
Metabolizarea simultan a glucozei i
lactozei sunt excluse.
Cum se comut activitatea bacteriei pe
utilizarea lactozei cnd c% glucozei
scade?
Bacteria are ca surs glucoza

Reglarea sintezei proteinei prin inducie
n prezena lactozei:
Inductorul (n acest caz lactoza) se leag specific la R, ca
urmare are loc desprinderea acestuia de la operator. n
aceast situaie, ARN p se leag la promotor, iniiind
transcrierea GS, adc a ARNm care codific E implicate n
catabolismul lactozei.
Bacteria are ca surs lactoza

n lipsa glucozei se mrete c% AMPc ce reprezint semnalul
foamei la bacterii.
Ca urmare, AMPc se leag de o protein receptoare specific
(proteina activatoare a genei catabolice CAP) - formeaz
complex (CAP- AMPc), apt s se lege de promotor (p-locus)
Acest proces favorizeaz ptrunderea ARNp n locusul de
reglare. Dac lactoza este prezent n mediu, operatorul este
liber i ARNp efectueaz transcrierea genelor lac.
CAP dispune de 2 centre: pentru AMPc i pentru ADN
Reglarea lac-operonului ntr-un mediu
ce conine glucoz
Cu ct c% glucozei e mai mare, c%AMPc
e mai mic. Lipsete i complexul CAP-
AMPc. n final ARNp nu se leag de P i GS
nu sunt transcrise, indiferent dac exist
sau nu lactoz, indiferent de faptul dac
operatorul este sau nu ocupat de R.
Ilustrarea mecanismului de reglare a
sintezei proteinei prin represie
Teoria operonului explic i represia
prin produs final al biosintezei E
Ex: sinteza His: la c% mari de His
(corepresor) se leag de R,
modificndu-i conformaia
activndu-l n rezultat favorizeaz
legarea R la O.
His produs final, CoR- sisteaz
transcrierea genelor ce codific E
implicate n propria sa sintez
Ilustrarea mecanismului de reglare
a sintezei proteinei prin represie

REZUMM:
GR controleaz exprimarea anumitor GS prin
intermediul unei proteine R
Ra suprim sinteza de ARNm, deci de proteine;
R inactivat permite transcrierea GS i sinteza
proteinei
E inductibile Ra nu are loc transcrierea. Cnd
n mediul apare I R se inactiveaz are loc
sinteza ARNm- proteinei
E represibile R este inactiv are loc transcripia
i translaia. Cnd n mediu se acumuleaz
produsul final al cii anabolice (CoR)- R se
activeaz, formarea complexului R-CoR i
sistarea transcripiei i translaiei.
Reglarea sintezei la eucariote
Att la nivelul transcripiei ct i la nivelul
translaiei
Reglarea hormonal (cortizol- sinteza E
gluconeogenezei; estrogenii, androgenii, vitamina
D sintez de proteine specifice)
Reglarea exspresiei genetice prin moleculele
proteice legate de ADN (histonele) sinteza ARN
pe ADN e inhibat prin adaosul de histone
Reglarea proteinei la nivelul translaiei e
posibil prin aciunea factorilor proteici, care
contribuie iniierea, elongarea, terminarea.

Ingineria genetic

tiinta, preocupat de crearea noilor fenotipuri
prin transplantarea genei unui organism n
genomul altuia n scop de a lichida defectele
ereditare ale genomului, adic tratarea
afectiunilor ereditare (gena ntrodus nu
gureaz n patrimoniul ereditar al genomului -
gazd)
Se obtin molecule hibride (himerice)
n linii marl procedura include etapele:
1. Cptarea genei
2. Cptarea ADN-ului recombinat
3.Clonarea ADN-ului recombinat
Cptarea genei:Stiind structura primar a proteinei
n laborator se poate obline gena respectiv (se oblin
gene pn la 250 codoane)- mai greu e obtinerea
genei din genomul celulei (genele se despart prin
introni)- mai uor e cptarea genelor din virusuri cu
enzima revertaza.
Cptarea ADN-ului recombinat-
gena necesar se ntroduce n celul pentru a se integra cu
genomul acestuia. Pentru aceastan vitro gena se unete cu ADN-
vector(plasmide ce conin ADN inelar (cteva gene).
De regul se folosete E Coli, ce contine un cromozom i
plasmide, ce plutesc n citozol (plasmida este de 1000 ori mai
mica dect cromozomul). Plasmidele se replica
independent de replicarea materialului genetic. Unele plasmide se
pot include n cromozom i apoi din nou s-l prseasc.
Plasmidele pot trece dintr-o celul n alta n procesul deconjugare.
Plasmidele se separ din E.Coli i li se nltur o parte de ADN
inelar cu ajutorulenzimelor restrictaze, care recunosc i
taiediferite sectoare. Folosind restrictaze diferite se poate de tiat
ADN n locusurile necesare. Inrezultat se formeaz capete
lipicioase (sectoaremonocatenare, capabile de a uni nucleotide
complimentare. La fel se procedeaz i cu gena,care trebuie
ntrodus (se formeaz capete lipicioase complimentare capetelor
plasmidei). Dac se amestec gena i plasmida ele se vor uni cu
capetele lipicioase. Enzima ligaza va uni capetele i se va cpta
molecula ADN inelara, care contine gena menit pentru
transplantare.
3.Clonarea
ADN-ului recombinat- obtinerea cantitilor dorite
de protein codificat de gena eucariot
ntrodus n plasmid. Dac n cultura E.Coli se
ntroduc plasmide recombinate, se formeaz
bacterii recombinate. In celul plasmidele se
replic. Bacteriile nmulindu-se formeaz celule,
care conin aceste plasmide. Acum din masa
bacterian se poate de capatat cantitti
sufuciente de ADN recombine
Ranadamentul sintezei bacteriene
este impresionabil: Ex- 100 celule
E.Coli produc prin clonare 5 mg
somatostatin (cantitate, ce se obine prin
prelucrarea a 100 tone de creier de
bovine). Prin tehnica ingineriei genetice s-
au obtinut cantiti mari de insulin
(Humulun), Interferon, vaccine.
Diversitatea formelor n Iimita uneia
i aceai specie se datorete
mutaiilor i ntr-o msura mai mare
recombinrii genetice.
Mutaiile.

Modificrile genomului organismului, care se
pstreaz i se transmit prin ereditate
se transmit apoi de la o generaie la alta.
Modificrile pot interesa o pereche de baze
(mutatii punctiforme) sau un grup de baze pe
una sau pe ambele catene ale unei molecule de
DNA.
Mutatiile punctiforme: pot decurge prin:
l. substitutie (misens mutatii, unde deosebim 2 tipuri):
a. Tranzitie - o BA purinic este nlocuit
tot cu una purinc, una pirimidinic -tot cu una pirimidinic.
b.Transversie - o pereche de baze purinice
este nlocuit cu una pirimidinic sau invers.
2. Inserie - acest mecanism const n ntroducerea unei
perechi de baze suplimentare n catena de DNA.
3. Deleia const n excluderea unei perechi de baze n aa mod ca
ea nu mai poate f complementar i la replicare apare "golul" n
ambele catene. Unele modificri n secventa nucleotidic pot duce
la formarea codonului sinonim i succesiunea aminoacizilor nu se
va schimba (mutatii benigne).
La afectarea segmentelor mari de gen apar mutatii ntinse. In
dependent de consecinele modificrilor deosebim mutaie
benign, neutr, nociv.
Agenii mutageni pot provoca mutaiile spontane ct i mutaiile
induse.

Anticorpii sunt
i dou uoare (L-214AA),
constituiti din:- 2 lanturi polipeptidice
grele identice (H446 AA)
fiecare dintre ele
contin cite o poriune:
constant C"
varabil V".
i una
Secvena de AA n poriunea variabil este
diferit pentru fiecare anticorp. Lanurile sunt
unite ntre ele prin legturi disulfidice.
Genele ce corespund poriunilor V" i C ale
unui anumit tip de lan uor sunt foarte apropiate
n ADN al imunocitelor care produc acest tip de
lan uor, dar se gsesc departe una de alta n
ADN al celulelor ce produc alte tipuride anticorpi.
De aici reiese, c n imunocit se selecteaz un
anumit segment de ADN, ce codific poriunea
variabil a unui anumit lant uor, care se
transfer prin transpoziie n vecintatea
secvenei codificatoare a poriunii constante a
lantului uor. Deci ADN ce codific sectoarele V"
ale lanurilor H" i "L" const din cteva gene de
tip diferit care-i pot schimba locurile proprii i
asocia cu formarea imenselor combinaii.
Sinteza Anticorpilor

Fiecare dintre milioanele de anticorpi
produi leag unul dintre milioanele de
antigene posibile. Este greu de crezut c
organismul are n patrimoniul su
genetic cte o gen pentru fiecare
anticorp pe care-l produce ntruct
aceasta ar presupune o
supradimensionare a genomului
eucariot.

Gradul de diversificare n obinerea lanurilor
H" i L" este crescut prin faptul c o poriune
variabil este rezultatul asamblrii a 3 regiuni.
Deci ADN ce determin poriunea variabil a
anticorpului este constituit din:
1. Poriunea variabil (V) constituit din - 400 de
gene.
2. Poriunea de diversitate (D) ce cuprinde -12
gene
3. Portiunea de articulare sau jonciune (J) - 4
gene
Asamblarea acestor gene n diferite combinaii
permite construirea a 20000 de sectoare V -
fapt ce asigur extrema varietate a anticorpilor.