Sunteți pe pagina 1din 133

1

Universitatea Academiei de tiine a Moldovei



OLEG BUDEANU i VICTOR CROITORU

TEHNICI AVANSATE n BIOLOGIA MOLECULAR

Chisinau, 2013
2

CUPRINS:

NTRODUCERE ............................................................................. 6
CAPITOLUL 1. ............................................................................... 7
Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor
n sistem procariot ........................................................................... 7
1.1. Amplificarea genei de interes. .............................................. 8
1.2. Enzime de restricie ................................................................ 14
1.3. Ligarea fragmentelor de ADN ................................................ 16
1.4. Vectori de clonare ................................................................... 17
1.5. Introducerea moleculelor recombinate n celule gazd .......... 22
1.6. Electroforeza acizilor nucleici ................................................ 24
1.7. Exprimarea genelor n sistem procariot .................................. 30
1.8. Purificarea proteinelor recombinate ....................................... 32
1.9. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine
recombinate n studii interdisciplinare .......................................... 34
CAPITOLUL 2. ............................................................................. 37
Tehnici moleculare utilizate in selecia asistat de markeri genetici
....................................................................................................... 37
2.1. TEHNICA PCR ..................................................................... 37
2.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR ........................................ 41
2.2.1. Tehnica RFLP ...................................................................... 41
2.2.2. Tehnica AFLP...................................................................... 44
2.2.3. Tehnicile MAAP.................................................................. 48
2.2.3.1. Tehnica RAPD .................................................................. 49
3

2.2.3.2. Tehnica DAF .................................................................... 52
2.2.3.3. Tehnica AP PCR ............................................................ 52
2.2.4. Tehnica RT PCR ............................................................... 53
2.2.5. Tehnica microsateliilor - SSR ............................................ 54
2.2.6. Tehnica EST ........................................................................ 55
2.2.7. Tehnica SCAR ..................................................................... 56
2.2.8. Tehnica SNP ........................................................................ 56
2.2.9. Tehnica STS ........................................................................ 57
2.2.10. Tehnica ARMS PCR ....................................................... 58
2.3. TEHNICA SSCP ................................................................... 59
2.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENIERE .............................. 60
CAPITOLUL 3. ............................................................................. 64
Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii
interdisciplinare ............................................................................. 64
3.1. Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze ................ 64
3.2. Producerea de proteine recombinate ....................................... 66
3.3. Msurarea activitii enzimatice a enzimelor ......................... 67
3.4. Sinteza de aminoacizi marcai cu
15
N ..................................... 69
3.5. Purificarea aminoacizilor sintetizai ....................................... 70
3.6. Analiza aminoacizilor sintetizai prin spectrometrie de mas 71
3.7. Sinteza de aminoacizi marcai ................................................ 72
3.8. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor................ 75
3.9. Aplicaii ale bionanotehnologiilor .......................................... 75
3.10. Diagnostic ............................................................................. 76
CAPITOLUL 4. CULTURI CELULARE ..................................... 81
4

4.1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale ..................... 81
4.2. Culturi primare ....................................................................... 83
4.3. Culturi secundare .................................................................... 83
4.4. Culturi de celule imortalizate ................................................. 84
4.5. Prezentarea informaiilor care se pot obine pe diferite sisteme
de studiu ......................................................................................... 84
4.6. Anticorpii monoclonali ........................................................... 85
4.7. Celule stem ............................................................................. 88
CAPITOLUL 5. ............................................................................. 92
Aparatajul disponibil i stabilirea parametrilor optimi de
funcionare pentru diverse tipuri de experimente .......................... 92
5.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare ............................. 92
5.2. Strategii de lucru ..................................................................... 95
5.3. Instruirea personalului ............................................................ 97
5.4. Asigurarea asepsiei i antisepsiei ........................................... 98
5.5. Cultivarea celulelor ................................................................. 99
5.6. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultur i
stabilirea viabilitii acestora ....................................................... 100
5.7. nghearea i dezghearea celuluor ....................................... 101
5.8. Subclonarea i tripsinizarea .................................................. 103
CAPITOLUL 6. Producerea i izolarea proteinelor recombinate din
celule mamifere ........................................................................... 104
6.1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizai ................. 105
6.2. Recomandri pentru abordarea de noi tipuri de experimente i
metodologii a culturilor celulare. ................................................. 111
CAPITOLUL 7. ........................................................................... 119
5

Cromatografia i cromatofocalizarea. Principii i metode .......... 119
7.1. Cromatografia de schimb ionic............................................. 119
7.2. Filtrare pe gel sau gel filtrarea. ............................................. 121
7.3. Interaciunea hidrofob ......................................................... 124
BIBLIOGRAFIA ......................................................................... 126













6


NTRODUCERE
Clonarea genelor a devenit o tehnic indispensabil n
laboratoarele de biologie molecular. Tehnica PCR sau reacia n lan a
polimerazei, dezvoltat la mijlocul anilor 80, a revoluionat genetica
molecular, fcnd posibil studierea i analiza genelor prin
metode mult mai accesibile i uneori foarte simple.
Una dintre aplicaiile clonrii genelor, importante nu numai
pentru biologie, dar i pentru studii interdisciplinare, este utilizarea
clonrii n scopul obinerii de proteine recombinate. Astfel, clonarea
genelor i exprimarea lor n celule gazd reprezint o surs foarte
preioas de proteine. Ulterior, aceste proteine recombinate pot fi
purificate prin metode cromatografice, unde biomoleculele sunt
etalonate folosind tehnici cromatografice care le separ potrivit
diferenelor n proprietile lor biochimice specifice. Se disting cateva
variaiuni ale tehnicilor cromatografice ca gel filtrarea, interaciunea
hidrofob, afinitatea cromatografic si faza cromatografic revers.
In aceasta ediie, in paralel cu biosinteza proteinelor la
procariote, prezentm producerea si izolarea proteinelor recombinate
din celule eucariote, cum ar fi culturile celulare primare, secundare,
producerea anticorpilor monoclonali si policlonali, utilizarea celulelor
stem in propagarea ADN-ului manipulat genetic.
In final, tendinele actuale n aplicarea bionanotehnologiilor sunt
prezentate, prin aplicaii in diagnosticul molecular, implicaii in
medcina legala, genetica umana, markerii genetici, si diverse aspecte
practice ale geneticii moleculare interdisciplinare.
Aceasta ediie are ca auditoriu-inta tineri specialiti in biologia
molecular si genetica aplicat cu aspiraii nalte spre realizri de
performana n domeniul ales.
7

CAPITOLUL 1.
Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor
n sistem procariot
ADN n sine are doar dou funcii importante i anume pstrarea
informaiei genetice i furnizarea acesteia pentru biosinteza de proteine.
Pstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o
generaie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN-ului i
mprirea egal a celor dou copii n timpul diviziunii celulare. A doua
funcie este legat de descifrarea informaiei pentru biosinteza de
proteine. Mesagerul informaiei ntre ADN i proteine este ARN-ul,
care este sintetizat n procesul de transcriere a ADN de ctre o enzim
numit ARN polimeraza. ARNm rezultat servete ca matri n procesul
de traducere a ADN-ului, prin biosinteza proteinelor, care are loc n
ribozomi. Practic ARN-ul este purtatorul informaiei din nucleu n
citoplasm unde are loc biosinteza proteinelor. Dogma central a
biologiei moleculare presupune transmiterea unidirecional a
informaiei de la ADN la proteine, prin intermediul ARN. Informaia
genetic nu poate fi transmis invers, de la proteine la ADN. Uneori,
informaia genetic poate fi transmis de la ARN la ADN n cazul
retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exist cazuri de
transmitere a informaiei de la ADN direct la proteine [2].
Clonarea genelor const n izolarea unei gene dintr-un genom i
introducerea ei n alte celule gazd pentru multiplicare i n unele cazuri
pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot
8

obine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonrii
const din urmtoarele etape:
amplificarea genei de interes
introducerea genei de interes ntr-un vector de clonare
introducerea moleculelor recombinate n celule gazd
selecia celulelor transformate (purttoare ale moleculei
recombinate)
verificarea moleculelor recombinate
1.1.Amplificarea genei de interes.
O gen este considerat orice fragment de ADN care se transcrie
ntr-o molecul de ARN. Moleculele de ARN rezultate n urma
transcrierii pot fi mprite n 2 categorii: ARN funcional si ARN
informaional.
ARN funcional este ARN care nu se traduce, ndeplinete
anumite funcii n celul (n cea mai mare parte particip la procesul de
traducere) i ocup cea mai mare parte din ARN total din celul: ARN
ribosomal (ARNr) i ARN de transport (ARNt). Pentru asamblare in
ribosomi maturi ARNr are nevoie de proteine ribosomale structurale si
de ARN chaperoni [18].
ARN informaional este ARN mesager (ARNm) care codific un
polipeptid i servete ca matri n procesul de traducere (biosintez a
proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul
clonrii codific un polipeptid. n alte cazuri scopul clonrii nu este
obligatoriu o gen, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat
dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mrime. Din
9

aceast cauz n continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN
de interes pentru a evita confuziile [2].
Deoarece fragmentul ADN de interes sau int se afl ntr-un
genom este necesar extragerea acestuia. Exist dou modaliti de a
obine fragmentul dorit, fie prin tierea acestuia din genom, fie prin
copierea acestuia. Tierea fragmentului din genom este mai dificil
deoarece necesit prezena unor situsuri (secvene specifice) la capetele
fragmentului, care necesit apoi o izolare din amestecul de fragmente
generate, iar numrul moleculelor deci i cantitatea de ADN este mic.
A doua opiune de copiere a fragmentului din genom este cea
mai des utilizat. n acest scop se utilizeaz tehnica PCR (Polymerase
Chain Reaction) [44]. Aceast tehnic poate fi considerat un adevrat
copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizat, este rapid i sensibil
deoarece necesit cantiti foarte mici de ADN matri. O condiie
obligatorie pentru o amplificare reuit este cunoaterea secvenei int,
n special la capetele acesteia. Dac secvena este necunoscut, atunci
se vor analiza cel puin secvene ADN omoloage de la alte specii sau
secvena de aminoacizi a proteinei dac este vorba despre o gen.
Principiul tehnicii PCR este o imitaie a procesului de replicare a ADN
care are loc n celule. Dac n celule pentru replicare se folosete o
ntreag serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii
factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN [2].
Denaturarea ADN presupune separarea celor dou catene.
Procesul este reversibil, catenele complementare formnd molecula
10

dublu catenar dup nlturarea agentului de denaturare. Reacia de
amplificare este una ciclic, fiecare ciclu fiind alctuit din 3 etape:
denaturarea ADN
alinierea amorselor
sinteza catenei complementare de ctre ADN polimeraza.
Denaturarea ADN este necesar pentru separarea celor 2 catene.
Ca agent denaturant se utilizeaz temperaturi nalte de 94-98C.
Denaturarea din primul ciclu dureaz cteva minute (2-6) deoarece
pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari,
e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare dup primul ciclu sunt
mai scurte, doar de 30-45 sec.
Amorsele (termenul englez este primer), denumite i
oligonucleotide, sunt secvene scurte de ADN monocatenar. Aceste
amorse sunt complementare cu extremitile secvenei int i
formeaz cu acestea poriuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea
amorselor la secvenele complementare, temperatura este cobort la
40-60C timp de cteva zeci de secunde. Aceast etap este numit de
aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se stabilete la cteva
grade (2-5C) mai puin dect temperatura de topire (Tm) a amorsei.
Temperatura de topire se calculeaz n dependen de lungimea amorsei
i de compoziia ei. Exist mai multe formule de calcul, cea mai simpl
formul de calcul pentru o amors de pn n 25 de nucleotide este:
Tm=4(G+C)+2(A+T),
unde G, C, A i T sunt numrul de nucleotide ce conin aceste baze
azotate. Numrul de G i C se nmulete dublu fa de A i T deoarece
11

ntre acestea exist trei legturi de hidrogen, n consecin moleculele
bogate n G i C au o temperatur mai mare de topire [2].
Exist cteva reguli pentru construirea amorselor i anume:
numrul de nucleotide este de 15-35,
temperatura de topire a amorselor trebuie s fie ntre 40 C i 70C,
coninutul de G i C nu trebuie s depeasc 50-55%,
la captul 3' al amorsei este de dorit s fie o G sau C, deoarece ofer o
stabilitate mai mare,
amorsele nu trebuie s prezinte complementaritate intern, n caz
contrar amorsa poate forma secvene interne dublu ca-tenare care au
aspect de stem sau bucl,
cele dou amorse sens (forward) i antisens (reverse) nu tre-buie sa
fie complementare ntre ele, altfel se vor forma pori-uni dublu catenare
sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica poriunile scurte
rmase monocatenare.
De la aceste poriuni dublu catenare formate ntre catena matri
i amorsa ADN, polimeraza poate iniia sinteza catenei complementare.
ADN polimeraza catalizeaz sinteza catenei complementare n direcia
5'3' (Figura 1.1). Amorsele servesc n primul rnd la delimitarea
fragmentului amplificat, dar i ca punct start pentru ADN polimeraz,
care nu poate porni sinteza de la zero i are nevoie de un capt liber 3'.
Iniial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza
izolat din bacteria Escherichia coli, care are activitatea optim de
sintez la 37C. Cel mai mare dezavantaj al utilizrii acestei enzime era
inactivarea termic n timpul denaturrii ADN. n acest fel tuburile de
12

reacie trebuiau schimbate de la o temperatur la alta i dup fiecare
ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimeraz.
Astfel, amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte
costisitoare. Salvarea acestei metode a venit dup descoperirea i
descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima
revoluionar n acest sens, pe larg utilizat i astzi este Taq
polimeraza. Aceast enzim este o ADN polimeraz, izolat din o
bacterie termofil Thermococcus aquaticus (de unde i denumirea ei),
care sintetizeaz polimerizarea nucleotidelor trifosfat ntr-un lan
polinucleotidic n direcia 53. Taq polimeraza are activitatea optim
la 72C i nu se denatureaz la temperaturi ridicate de peste 90C
foarte repede, astfel dup cteva ore la 95C pierderea de activitate este
nesemnificativ. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de
aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongrii necesare
sinte-zei va fi n dependen de mrimea fragmentului int. Pentru un
fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un
fragment de 2000 de nucleotide dou minute [2].
Prin implementarea tehnicilor de mai sus este posibil de generat
mutaii in ADN-ul genomic i plasmidic, deleii ale genelor eseniale si
caracterizarea mutanilor funcionali in gene eseniale pentru viabilitatea
prokariotelor [16].
13


Figura 1.1. Reprezentarea schematic a primelor cicluri de PCR.

Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere
invers. Acest tip este asemntor PCR obinuit, doar c folosete o
matri de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabil de
aceast sintez este transcriptaza invers, care este de fapt o ADN
polimeraz ARN-dependent. Taq polimeraza este o ADN polimeraz
deoarece sintetizeaz ADN i este ADN dependent deoarece utilizeaz
o matri ADN pentru sintez. Transcriptaza invers a fost izolat de la
virusurile care au material genetic ARN i n momentul intrrii n celul
necesit sinteza unei copii a materialului su genetic. RT-PCR se
utilizeaz pentru obinerea copiilor de gene eucariote care nu conin
introni i analiza exprimrii de gene. n ambele cazuri se pornete de la
ARNm, fiind ARN informaional care codific proteine.
14

1.2. Enzime de restricie
Enzimele de restricie sau restrictazele sunt enzime care taie
molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri
specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevrate foarfece de ADN.
Restrictazele recunosc doar anumite secvene scurte numite situsuri
specifice de recunoatere, se fixeaz de acestea i taie legturile
fosfoesterice ntre nucleotide.
Aceste enzime au fost descoperite la bacterii i se presupune c
funcia lor este de aprare contra bacteriofagilor (virusuri ale
bacteriilor). n momentul intrrii ADN fagic n bacterii, enzimele de
restricie diger aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat
contra enzimelor de restricie prin metilarea unor baze azotate, enzimele
de restricie, n general, nu taie ADN metilat. Pn acum au fost
descrise 4000 de enzime de restricie de la cteva sute de specii
bacteriene. Toate aceste enzime se mpart n 3 clase: I, II i III. Aceast
clasificare este n dependen de cofactorul utilizat i de secvena de
recunoatere. Enzimele cele mai utilizate n tehnicile moleculare sunt
cele de tip II, care au secvena de recunoatere un palindrom i
utilizeaz ioni de Mg
2+
ca i cofactor. Secvena palindrom este alctuit
din 4-6 nucleotide i citit pe ambele catene n direcia 53 este
identic.
Nomenclatura enzimelor de restricie pornete de la denumirea
bacteriei de la care a fost izolat. Astfel, HindIII este izolat de
Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli
tulpina RY13 [2].
15

Capetele libere dup tierea de ctre enzimele de restricie pot fi
de 2 tipuri: coezive sau drepte. Enzima BamHI i EcoRI genereaz
capete coezive dup tiere, iar enzimele SmaI i EcoRV genereaz
capete drepte sau netede (Figura 1.2).

Figura 1.2. Secvenele de recunoatere pentru enzimele EcoRI (A) i
SmaI (B) i capetele libere dup tiere. Locurile de restricie sunt
indicate cu sgei [2].

Cu ajutorul unor programe specializate se pot alctui hri de
restricie care reprezint situsurile de recunoatere pentru diferite
restrictaze ntr-o secven (Figura 1.3).
16


Figura 1.3. Harta de restricie a unei gene de la drojdia Saccharomyces
cerevisiae. Cu cifre n parantezesunt indicate situsurile enzimelor de
restricie [2].
1.3. Ligarea fragmentelor de ADN
Dei moleculele de ADN pot fi asemnate cu nite fire, acestea
nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu exist nici un lipici special.
Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizeaz o enzim numit
ADN ligaza. Aceast enzim reface legturile fosfoesterice ntre
gruparea hidroxil a unui nucleotid (captul 3) i gruparea fosfat de la
nucleotidul altui fragment (captul 5) (Figura 1.4). Funcia ligazei n
celule vii este legarea fragmentelor n timpul replicrii, recombinrii i
dup repararea ADN. Cea mai des utilizat este ADN ligaza T4 izolat
din bacteriofagul T4. In aciune, ADN ligaza T4 utilizeaz ATP-ul ca i
cofactor.

17

Figura 1.4. Reprezentarea schematic de legare de ctre ADN ligaz a
dou fragmente ADN care au capete netede [2].

1.4. Vectori de clonare
Prin vectori de clonare subnelegem molecule de ADN
transportatoare ale fragmentului de ADN strin n celulele gazd.
Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide i
vectori artificiali. Aceti vectori sunt utilizai n dependen de scopul
clonrii. Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. Un plasmid este o
molecul dublu catenar de ADN, care este circular, nchis i capabil
de replicare autonom n celule gazd. Plasmidele comerciale utilizate
pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost
modificate. Plasmidele au nite secvene specifice necesare replicrii,
clonrii, seleciei i uneori exprimrii genelor. Pentru replicarea
autonom n celule gazd plasmidele conin secvena ori, care este
originea de replicare. Nici o molecul de ADN nu poate fi replicat fr
o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei
de ADN de unde poate ncepe replicarea i care este recunoscut de
anumite proteine care iniiaz replicarea.
18

O regiune foarte important ntr-un vector de clonare este
Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning
Site). n aceast regiune se introduce fragmentul int de ADN cu
ajutorul enzimelor de restricie i a ligazei. Att vectorul ct i
fragmentul ADN sunt tiate cu aceleai enzime de restricie i legate
mpreun cu ajutorul ligazei. SMC conine secvenele de recunoatere
pentru mai multe enzime de restricie care nu se conin n alt regiune a
vectorului [2].
O alt component foarte important a plasmidelor sunt markerii
de selecie care sunt de obicei nite gene, a cror produs (enzim) fac
posibil selectarea celulelor cu plasmid de cele fr plasmid care sunt
mai numeroase. Cei mai frecveni markeri utilizai sunt genele ce
confer rezisten la antibiotice, mai corect spus produsul genei confer
rezisten. Spre exemplu, -lactamaza confer rezisten la ampicilin.
Plasmidele care conin gena pentru aceast enzim vor proteja celulele
bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dac un amestec de celule
transformate cu plasmide care vor conine att celule cu, ct i fr
plasmid, se nsmneaz pe un mediu cu ampicilin, vor supravieui
doar celulele care conin plasmidul.
Un alt fel de selecie este selecia celulelor transformate cu
plasmid recombinat adic cu insert de cele cu plasmid fr insert. Insert
se refer la fragmentul de ADN int clonat. n acest scop situsul
multiplu de clonare se afl ntr-o gen ce codific o enzim. Dac n
SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intact,
produsul ei este o protein activ. Dac n SMC a fost introdus un
19

fragment ADN atunci gena este modificat i produsul ei este inactiv.
Spre exemplu dac SMC se afl n gena lacZ care codific subunitatea
a enzimei -galactozidaz, atunci produsul acestei gene mpreun cu
subunitile codificate din genomul celulei gazd bacteriene vor forma o
enzim activ capabil s metabolizeze un derivat al galactozei numit
X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adugat n
mediu i este incolor. Dac -galactozidaza este activ atunci va
metaboliza acest substrat, iar produsul format n urma reaciei va avea o
culoare albastr. n acest fel coloniile rezultate dup transformare care
conin vectorul fr insert vor fi albastre, iar cele ce conin vector
recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzim activ capabil
de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecie utilizeaz o
enzim toxic pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid
fr insert au gena funcional care va provoca moartea celulelor.
Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena
nefuncional i vor supraveui [2].
Vectorii de clonare au de obicei mrime mic, doar de cteva
mii de pb i n care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb pn
la 2000-5000 pb (Figura 1.5). O caracteristic important pentru
plasmide este numrul de copii per celul. Vectorii de clonare mai mici
au de obicei un numr mai mare de copii per celul. Acest fapt permite
obinerea unei cantiti mari de ADN plasmidic dintr-o cultur mic de
bacterii (din 3-5 ml de cultur se pot obine cteva g de ADN
plasmidic). Pentru vectorii mai mari numrul copiilor per celul este
20

mai mic, n consecin i pentru a obine o cantitate mai mare de ADN
este necesar o cantitate mai mare de cultur.
Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar
care ofer n plus posibilitatea exprimrii genei clonate. Plasmidele de
exprimare trebuie s mai conin cteva elemente n plus fa de vectorii
de clonare. Aceste elemente sunt cele care se gsesc n genom i fac
parte dintr-o gen: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii
START i STOP care delimiteaz cadrul deschis de citire (termenul
englez este Open Reading Frame). Promotorul este o secven care se
afl n amonte de gen i este recunoscut de factorii de transcriere, care
se fixeaz la nivelul promotorului i iniiaz transcrierea. Numai n
prezena promotorului exprimarea va fi foarte sczut, de aceea situsul
de legare al ribozomilor (termenul englez este Ribosome Binding Site)
este o secven care se transcrie dar care nu se traduce i care este
recunoscut de ribosomi. Ribosomii se leag la acest situs i se
deplaseaz de-a lungul ARNm pn ntlnesc primul codon START de
unde ncepe traducerea. Codonul START la procariote este n cele mai
dese cazuri AUG, urmat de codonul +2, care este necesar sa nu fie cu
frecvena de decodare rara, pentru a nu ncetini miscarea in vivo a
ribosomilor pe mARN [17]. Aceti doi codoni sunt de obicei inclui n
situsul multiplu de clonare, sau se pot introduce n fragmentul int cu
ajutorul amorselor. In contrast, codonul STOP (UAA, UGA) este inclus
de obicei n situsul de clonare. Unerori UGA poate fi recodat in
selenocisteina [75]. n unele cazuri UAA este prezent dup regiuni care
codific anumite aa-zisele etichete. Acestea din urm faciliteaz
21

purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele
mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-
transferaza (GST) i proteina de legare a maltozei (Maltose Binding
Protein, MBP este termenul n englez). Aceste etichete vor fi parte
integrant a proteinelor la captul ei C-terminal sau N-terminal dac
secvena ce codific eticheta este prezent dup sau nainte de situsul de
clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate
afinitate fa de anumite rini cromatografice [2].

Figura.1.5 Reprezentarea a plasmidei pTN48 [9].

22

1.5. Introducerea moleculelor recombinate n celule gazd
Introducerea plasmidelor recombinate n celule gazd se
numete transformare dac sunt utilizate celule bacteriene sau
transfecie dac sunt utilizate celule eucariote. n continuare se va
detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea avnd cea mai
mare aplicabilitate i simplitate n scopul obinerii clonelor i
proteinelor recombinate. Exist dou tipuri de transformare a celulelor
bacteriene pe larg utilizate n laboratoarele de biologie molecular:
transformarea chimic
transformare sub influena cmpului electric.
Ambele tipuri de transformare necesit inducerea unei
competene de transformare, deoarece E. coli nu are proprieti de
transformare natural. Aceast competen n cazul transformrii
chimice este indus cu CaCl
2
. n acest scop se realizeaz o cultur de E.
coli i prin tratarea celulelor cu clorur de calciu la rece se poate induce
transformarea celulelor bacteriene (Figura 1.6A). Apoi celulele sunt
ocate termic foarte scurt, timp de maxim dou minute, la 42C. Acest
timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate n celulele
bacteriene.
Transformarea n cmp electric este mai eficient dect
transformarea chimic. Prepararea celulelor competente presupune doar
creterea lor pn n faza logaritmic (D
600nm
=0,6 - 0,8) i nlturarea
prin splri repetate a mediului de cultur. Aceste splri repetate vor
asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip
de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va
23

crea cmpul electric ntre doi electrozi. Amestecul de celule competente
i plasmide recombinate vor fi depuse ntr-o cuv special de
electroporare, ai crei perei laterali sunt electrozii. Transformarea are
loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de cteva msec (Figura
1.6B). Dup transformare celulele ocate sunt preluate n mediu de
cultur i apoi nsmnate pe mediu selectiv cu antibiotice [2].
Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare
parte dintre ele fiind netransformate, adic fr plasmid. Eficiena de
transformare a celulelor se poate msura efectund o transformare cu o
cantitate de 1 ng de ADN plasmidic i apoi numrnd coloniile
rezultate. Numrul de colonii va corespunde numrului de celulele
transformate deoarece fiecare colonie ia natere dintr-o singur celul.
Numrul obinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se
raporteaz la 1 g de ADN (nmulind valoarea la 1000). O eficien
bun de transformare este 10
6
, ceea ce nseamn ca la transformarea
unui g de plasmid s-ar obine 1 milion de colonii, o valoare foarte
mare innd cont de faptul c avem nevoie de o singur colonie sau de
cteva cnd avem un amestec eterogen de molecule int. Desigur n
amestecul de ligare numrul de molecule recombinate este mic i din
aceas-t cauz este recomandat o eficien ct mai mare a celulelor
competente.
Fiecare dintre cele dou metode de transformare prezint
avantaje i dezavantaje legate de eficiena de transformare i de costuri.
Transformarea chimic este mai puin eficient dect electroporarea, dar
mai ieftin deoarece nu necesit aparataj i cuve costisitoare.
24


Figura 1.6. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic [2].
A transformarea chimic cu CaCl
2
;
B electroporarea celulelor bacteriene.

1.6. Electroforeza acizilor nucleici
Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcin
ntr-un cmp electric. Migrarea moleculelor se realizeaz printr-o
matrice specific. Metoda este aplicat pentru analiza proteinelor i a
acizilor nucleici. Pentru proteine se aplic cel mai des electroforeza
proteinelor n condiii denaturante n gel de poliacrilamid (termenul
englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice i
pentru electroforeza acizilor nucleici care ofer o rezoluie foarte bun a
separrii fragmentelor de ADN, mai ales n cazul fragmentelor mici.
Aceast matrice este folosit mai rar n laboratoarele de analize
genetice, deoarece este mai laborioas. Primul loc n utilizarea
vizualizrii acizilor nucleici aparine electroforezei n gel de agaroz.
25

Dei metoda ofer o rezoluie inferioar celei din poliacrilamid, ea este
utilizat cu succes deoarece este mai simpl.
Moleculele de acizi nucleici sunt ncrcate negativ datorit
gruprilor fosfat. Aceast sarcin face posibil migrarea moleculelor de
ADN i ARN ntr-un cmp electric de la catod la anod. Amestecul de
molecule nu se va deplasa n cmp electric cu aceeai vitez.
Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele
mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi n
dependen de masa lor molecular. Pentru estimarea aproximativ a
mrimii fragmentelor n acelai gel, dar n godeu separat se va migra un
amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest
amestec de molecule se numete marker molecular ADN.
Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roii. Gelurile
de agaroz se realizeaz prin nclzirea agarozei ntr-un tampon
specific. Concentraia agarozei n gel poate fi ntre 1% i 3% n
dependen de scopul urmrit. Cu ct concentraia agarozei este mai
mare, cu att mrimea porilor va fi mai mic. La concentraii mai mici
de agaroz, porii vor fi mai mari i migrarea moleculelor mai rapid. n
concluzie concentraii mai mici se folosesc pentru fragmente mari
(cteva mii de pb), iar concentraii mari pentru fragmente mici. Gelurile
de agaroz de 1% sunt cel mai des utilizate, oferind separarea
moleculelor ntre 0,1 i 10 kpb. Gelurile de agaroz sunt plasate ntre
cei doi electrozi n cuve speciale care conin tampon de migrare. Acest
tampon este acelai folosit i pentru realizarea gelului. Cele mai folosite
tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) i TBE (Tris/Borat/EDTA).
26

Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este
necesar utilizarea unui colorant. Cel mai des folosit n acest scop este
bromura de etidiu, care fixat de ADN n lumin ultraviolet devine
fluorescent i are o culoare portocalie (Figura 1.7). Bromura de etidiu
se intercaleaz ntre bazele azotate din molecula dublu catenar de
ADN. Lungimea de und a luminii ultraviolete la care este expus gelul
trebuie s fie cuprins ntre 260 i 300 nm.

Figura 1.7. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei
n gel de agaroz.
Electroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru vizualizarea
i purificarea ADN. Vizualizarea ne ofer informaii despre integritatea
ADN (ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor
enzimatice, estimarea cantitii de ADN obinut n reaciile PCR sau de
extracie. ADN poate fi purificat din gel de agaroz dup migrare prin
27

excizarea fragmentului int i purificarea din gel cu kituri special
predestinate acestui tip de purificri [2].

Verificarea moleculelor recombinate
Rezultatul ligrii i transformrii se poate vedea doar dup 12-
18 ore de la transformare cnd apar coloniile de E. coli pe mediu
selectiv. Apariia coloniilor nu indic neaprat i o reuit deplin a
clonrii, deoarece acestea pot conine un amestec de colonii pozitive i
colonii cu plasmid fr insert. Chiar dac se folosete un sistem alb-
albastru de selecie a coloniilor pozitive, acestea necesit totui o
dovad n plus a prezenei plasmidului recombinat. n acest scop se va
efectua o cultur lichid de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va
nsmna cu o singur colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu
agitare la 37C. Ziua urmtoare din bacteriile rezultate se va purifica
ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor
kituri speciale. ADN plasmidic urmeaz a fi analizat iniial prin digestie
enzimatic i apoi prin secvenializare. Digestia ADN plasmidic se va
realiza cu enzimele de restricie cu care acesta a fost introdus n vector
sau care se afl la extremele situsului multiplu de clonare. Aceast
digestie va confirma prezena insertului n plasmid i aproximativ
mrimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaie despre secvena
fragmentului clonat.
Secvenierea fragmentului int este verificarea definitiv a
clonrii. Aceast verificare este necesar deoarece ADN polimeraza
utilizat pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori
28

de sintez. Pentru a evita erorile n produii PCR se poate utiliza o ADN
polimeraz care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de
ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza
. a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigur
de obicei randamente de sintez mai mari. n unele cazuri se utilizeaz
un amestec de 2 polimeraze (3 pri de Taq polimeraz i o parte Pfu
polimeraz) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate
crescut [2].
Analizatoarele genetice din seria ABI Prism, produse de Applied
Biosystems (SUA), au laser cu detecie pentru 5 fluorocromi, i n
actiunea sa utilizeaz principiul Sanger de secveniere. Acest principiu
presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secveniere. Matria
ADN ce urmeaz a fi secveniat este denaturat, apoi la unul din
capetele sale are loc ataarea unei amorse de la care ADN polimeraza
va porni sinteza catenei complementare. Amestecul PCR conine
dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar i di-dezoxiribonucleozide
trifosfat (ddNTP) care nu conin gruparea OH n poziia 3' a
dezoxiribozei. Lipsa acestei grupri va face imposibil continuarea
sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate aduga urmtorul
nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare
(deoarece se folosete o singur amors) de diferite mrimi. Numrul de
cicluri este de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se
opresc n toate punctele matriei de ADN. Pentru detecia fragmentelor,
fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente
rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care
29

presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinul
micrometrilor. O cantitate de civa microlitri vor fi separai n gelul din
capilar. Migrarea fragmentelor n gel este n dependen de mrimea
lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. n ultima
parte a capilarului exist o fereastr transparent prin care un fascicol
laser va excita fluorocromii, iar fluorescena emis va fi captat i
prezentat sub forma unei electroforegrame (Figura 1.8).
Electroforegramele sunt apoi analizate i comparate cu secvena
existent n bazele de date. Mrimea fragmentelor de ADN care pot fi
secvenializate variaz ntre 600 i 800 pb. Pentru fragmente mai mari
sau pentru matrie dificile (cu secvene repetitive) este necesar
utilzarea unor kituri speciale [2].


Figura 1.8. Electroforegrama unei secvene obinut cu ajutorul
analizorului ABI Prism 310.
30

1.7. Exprimarea genelor n sistem procariot
Clonarea genelor vizeaz n principal dou obiective posibile:
multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate.
Clonarea n scopul multiplicrii fragmentului este utilizat atunci cnd
ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi
separate cu ajutorul electroforezei i la care se urmrete cunoaterea
secvenei. n acest scop amestecul de fragmente se cloneaz ntr-un
vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenializate.
Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg n obinerea de proteine
recombinate. Ele pot fi numite adevrate fabrici de proteine la comand,
care ns cteodat refuz s sintetizeze proteinele comandate i de ce
cele mai dese ori strine celulei bacteriene. Clonarea n scopul
exprimrii genei i obinerii de protein recombinat include cteva
aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate
fi clonat direct n vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare
conin neaprat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei
gazd, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START (AUG) i
unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important n
acest caz este pstrarea cadrului deschis de citire, adic mprirea
exact pe codoni a genei de la primul codon tradus pn la ultimul.
Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai
des utilizat inductor este IPTG (isopropyl--D-thiogalactopyranosid),
care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de
la Novagen asigur de obicei o supraexprimare a genelor clonate.
Plasmidul pET21 conine promotorul de la fagul T7, situsul de
31

recunoatere a ribosomilor, codonul START n situsul multiplu de
clonare i codonul STOP dup o etichet de 6 histidine. Dac se opteaz
pentru prezena unei etichete 6His la captul C-terminal a proteinei
pentru facilitarea purificrii, atunci din gen se va nltura codonul
STOP. Dac aceast etichet nu este necesar, atunci n gen se va
pstra codonul STOP i traducerea se va opri nainte de etichet.
Promotorul T7 nu este recunoscut de ctre ARN polimeraza de la E.
coli i simpla prezen a plasmidului n celulele bacteriene nu va sigura
o exprimare a genei. Vectorii pET necesit tulpini de E. coli care conin
gena pentru ARN polimeraz de la fagul T7. Aceast gen se afl sub
controlul promotorului lac UV5 i a operatorului lac.
Operatorul lac este o secven recunoscut de ctre o protein
numit represorul lac. Atunci cnd n mediu nu exist lactoz (sau
analogi ai lactozei) represorul lac se fixeaz la operatorul lac i
mpiedic transcrierea genei pe care o regleaz, care n acest caz este
gena pentru T7 ARN polimeraz. n absena T7 ARN polimerazei nu va
exista nici transcrierea genei int din plasmid. Represorul lac este
codificat de gena lacI care se afl att n genomul bacteriei gazd ct i
n plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un
analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixeaz de represorul
lac i cauzeaz disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel
promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care
va transcrie gena pentru T7 ARN polimeraz. Aceasta din urm va
recunoate promotorul T7 din plamsid i va transcrie gena int. Acest
sistem de exprimare este unul foarte puternic i care poate asigura o
32

producie de protein care va alctui pn la 50% din proteinele totale
bacteriene.
Operatorul lac este o secven recunoscut de ctre o protein
numit represorul lac. Atunci cnd n mediu nu exist lactoz (sau
analogi ai lactozei) represorul lac se fixeaz la operatorul lac i
mpiedic transcrierea genei pe care o regleaz, care n acest caz este
gena pentru T7 ARN polimeraz. n absena T7 ARN polimerazei nu va
exista nici transcrierea genei int din plasmid. Represorul lac este
codificat de gena lacI care se afl att n genomul bacteriei gazd ct i
n plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un
analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixeaz de represorul
lac i cauzeaz disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel
promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care
va transcrie gena pentru T7 ARN polimeraz. Aceasta din urm va
recunoate promotorul T7 din plamsid i va transcrie gena int. Acest
sistem de exprimare este unul foarte puternic i care poate asigura o
producie de protein care va alctui pn la 50% din proteinele totale
bacteriene [2].
1.8. Purificarea proteinelor recombinate
Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode
cromatografice. Pentru o purificare ct mai bun din amestecul total de
proteine este necesar purificarea n cel puin dou etape prin metode
cromatografice diferite.
Ataarea unor etichete la proteinele recombinate asigur
purificarea proteinelor ntr-o singur etap, ceea ce reduce timpul
33

necesar i asigur randamente de purificare mai mari (Figura 1.9). Dac
eticheta deranjeaz n analiza ulterioar a proteinei, atunci se poate
recurge la nlturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. n acest scop
pentru clonare i exprimare se va alege un plasmid care conine situsul
pentru peptidaz, cum este spre exemplu situsul pentru trombin n
cazul plasmidului pET28 [2].


Figura 1.9. Reprezentarea schematic a purificrii de proteine
recombinate prin cromatografie de afinitate.


34

1.9. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine
recombinate n studii interdisciplinare
Clonarea genelor n ultimii ani a devenit o tehnic
indispensabil n laboratoarele de biologie molecular. Una dintre
aplicaiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar i
pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei n scopul obinerii de
proteine recombinate. Clonarea genelor i exprimarea lor n celule
gazd reprezint o surs foarte preioas de proteine. n cele mai multe
cazuri purificarea unei proteine din celulele n care aceasta se exprim
n mod firesc natural prezint mai multe dificulti:
cantitatea de proteine n esuturi este foarte mic, spre
exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesar o
cantitate de zeci de litri de cultur bacterian, iar rezultatul purificrilor
n cteva etape pot fi sub 100 mg de protein;
obinerea unei cantiti mari de esut pentru purificare este
aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu
putem s le cultivm n condiii de laborator;
obinerea materialului pentru purificare implic probleme
etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obinerea de
proteine din celule umane ar fi imposibil;
purificarea se face n mai multe etape care necesit timp,
consumabile i are randamente mai mici.
Aceste dezavantaje ale purificrii direct din material biologic
sunt eliminate n cazul exprimrii genelor n celule gazd. Un mare
avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaii care
pot dezvlui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari n activitatea
35

proteinei. Prin intermediul tehnicilor de mutagenez pot fi introduse
mai multe tipuri de mutaii:
mutaii missens care schimb un aminoacid cu altul;
deleii n care poriuni ntregi din lanul polipeptidic pot fi
nlturate;
inserii care constau n introducerea de fragmente noi n gena
codificatoare i respectiv n proteina recombinat;
fuzionrii, se pot fuziona proteine ntre ele sau regiuni ale unei
proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea
N-terminal a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu captul
C-terminal al aceleiai proteine de la o specie nrudit;
proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate
cu anumite molecule care sunt introduse n proteine n procesul lor de
sintez sau pot fi fuziuni. Un exemplu n acest sens este marcarea
proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, n mod specific sau
randomizat. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor
cu proteine fluorescente, care apoi faciliteaz detecia lor.
Clonarea genelor i exprimarea lor n sistem procariot este
tehnica la care se apeleaz cel mai des, deoarece este mai rapid i mai
puin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de
organizare, astfel o protein are structur: primar, secundar, teriar i
cuaternar. Exprimarea genelor i sinteza proteinelor n celulele
procariote asigur doar structura primar exact a polipeptidului
sintetizat. n unele cazuri proteinele adopt structura secundar
independent dup sintez, n alte cazuri este nevoie de condiii speciale
36

i alte proteine care contribuie la adoptarea conformaiei proteinei
active. Unele proteine att de la eucariote ct i de la procariote
sintetizate n celule gazd de E. coli nu reuesc s adopte o structur
secundar corect, iar ca rezultat polipeptidele acumulate n citoplasm
formeaz corpi de incluziune. Exist cazuri cnd acumularea proteinei
sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune
ofer posibilitatea unei purificri printr-o singur etap n condiii
denaturante.
Proteinele denaturate purificate n acest mod pot fi utilizate
pentru imunizarea de animale n scopul producerii de anticorpi. Cel mai
important aspect pentru imunizare este secvena de aminoacizi a
proteinei i nu structura ei secundar sau teriar. Exprimarea
proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezis pe baza
apartenenei genei sau pe baza analizei structurii primare. O alt
problem care poate aprea este neexprimarea genei. Cauzele
neexprimrii pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazd. Un alt
dezavantaj (dei n unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificrilor
post-traducere a polipeptidelor sintetizate n celule bacteriene.
Majoritatea proteinelor de la eucariote necesit nu numai adaptri
conformaionale dar i modificri post-traducere cum ar fi fosforilri,
glicozilri . a. Dac prezena acestor modificri este absolut necesar,
atunci se va recurge la clonarea genei n sistem procariot i exprimarea
ei n celule gazd eucariote. Lipsa modificrilor post-traducere este un
avantaj atunci cnd este cunoscut funcia proteinei active i se dorete
s se cunoasc rolul gruprilor care sunt adugate dup sintez. n acest
37

fel proteina recombinat nu va fi modificat i se va putea deduce rolul
acestor grupri n activitatea proteinei [2].
CAPITOLUL 2.
Tehnici moleculare utilizate in selecia asistat de markeri genetici
2.1. TEHNICA PCR
Tehnica PCR sau reacia n lan a polimerazei, dezvoltat la
mijlocul anilor 80, a revoluionat genetica molecular, fcnd
posibil studierea i analizarea genelor prin metode mult mai
accesibile i foarte simple. Aceast tehnic a fost descoperit de Kary
Mullis n anul 1983, plecnd de la caracteristicile replicrii ADN i
anume, cu ajutorul enzimei ADN polimeraza care utilizeaz o caten a
ADN ca matri pentru sinteza unei noi catene complementare. Prin
aceast tehnic se produc un numr enorm de copii a unor
secvene de ADN (gene) fr a se apela la clonare [44].
Tehnica PCR exploateaz unele caracteristici ale replicrii
ADN, unde pentru amplificarea secvenei de ADN dorite se utilizeaz
o secven de oligonucleotide numit primer sau amors. Primerii sunt
secvene scurte de 15 35 nucleotide, complementare capetelor 3
ale secvenei de ADN ce se dorete a fi amplificat; ei sunt specifici
fiecrei gene i sunt sintetizai cu ajutorul unor sintetizatoare
automate de ADN. Pentru amplificarea secvenelor specifice de
ADN, prin tehnica PCR, se folosete o soluie tampon (PCR
buffer) n care se introduce ADN ce conine gena de interes, primerii
38

sintetizai, Taq polimeraza i cele patru tipuri de deoxinucleotid-
trifosfai (dATP, dGTP, dCTP i dTTP).
Tehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape principale, ntr-un
aparat n care realizarea ciclurilor termice este controlat automat de
Termocycler:
- Denaturarea ADN, presupune nclzirea soluiei n care se
afl ADN la 940 C timp de 5 minute, efectul fiind ruperea
legturilor de hidrogen i separarea celor dou catene.
- Ataarea primerilor se realizeaz prin rcirea pn la 40C
60

C a soluiei n care se afl secvena de amplificat.


Primerii se leag la capetele 3a celor dou catene de
ADN ale genei pe care dorim s o amplificm. De
obicei, este nevoie de doi primeri numii sens i antisens,
dar amplificarea se poate realiza i cu un singur primer, n
cazul tehnicii PCR ancorat.
- Elongaia se produce la temperatura de circa 72C,
temperatur la care Taq-polimeraza funcioneaz optim, n
faza de extensie, iar ciclul se repet de 25 40 ori.
Amplificarea este aproximativ exponenial, realizndu-
se dup 3 cicluri 2 copii, dup 10 cicluri 256 copii, iar
dup 32 cicluri 1,73 miliarde copii ale secvenei supuse
amplificrii [2]. Dup amplificare, gena de interes se
vizualizeaz n lumin ultraviolet, la nivelul gelului de
agaroz n care fragmentele au fost colorate cu bromur de
39

etidiu. Dac amplificarea s-a produs, n gel se vor
observa una sau mai multe benzi, corespunztoare
secvenei specifice de ADN.
n tehnica PCR, alegerea primerilor este primordial i putnd fi
utilizai dou tipuri de primeri:
- primeri specifici - sunt dirijai spre un situs foarte precis al
ADN, reprezentat de genele sau fragmentele de gene
cunoscute. Prin primer specific se nelege o secven
cunoscut de ADN utilizat pentru nceperea sintezei unei
anumite gene, cu structur cel puin parial cunoscut. Primeri
specifici pot fi dirijai i spre regiunile situate n amonte sau
aval de secvenele unice, la nivelul secvenelor minisatelit sau
microsatelit. Secvenele de tip satelit, specifice fiecrui
individ sunt astfel amplificate. Evidenierea acestor
polimorfisme se utilizeaz n momentul de fa n
medicina criminalistic pentru identificarea suspecilor,
pornind de la diferite mostre de esut (snge, sperm, bulbi de
pr etc.), pentru marcarea crnii, sau altfel spus, urmrirea ei
pe parcursul filierei de distribuie i consum.
- primeri aleatori - sunt de dimensiuni reduse (n medie 10
20 nucleotide ). Alegerea secvenelor care constituie aceti
primeri este complet arbitrar. n cursul reaciei PCR aceti
primeri se vor hibrida de fiecare dat cnd n ADN se vor gsi
secvene care le sunt complementare i de orientare opus.

40

Tehnica PCR i-a gsit aplicare n cele mai diverse domenii:
- n selecia animalelor: prin stabilirea genotipurilor la locii care
codific sinteza cazeinei, -lactoglobulinei, leptinei, factorului
de transcripie pituitar (Pit1) care este responsabil pentru
expresia hormonului de cretere la mamifere, este posibil
aplicarea seleciei timpurii, reinnd la reproducie numai
animalele a cror genotip se asociaz cu producii cantitative i
calitative mai ridicate.
- n alimentaie: se poate folosi pentru alegerea tulpinilor de levuri sau
mucegaiuri ce vor putea fi utilizate ca probiotice (aditivi
furajeri) n hrana animalelor.
- n reproducie: se folosete pentru identificarea sexului nc din
faza de embrion. Utiliznd primeri specifici pentru
amplificarea unor secvene de ADN de pe heterozomul Y, se
poate stabili sexul. Dac embrionul este de sex mascul (XY) se
va produce amplificarea secvenei specifice de pe
cromozomul Y i va putea fi vizualizat n gelul de
agaroz. Dac embrionul este de sex femel (XX) nu se va
produce amplificarea secvenei respective, n gelul de
agaroz lipsind banda caracteristic.
- n medicin: se folosete pentru identificarea unor gene mutante
(oncogene), care conduc la apariia unor tumori maligne, n
monitorizarea evoluiei i terapiei cancerului, n detectarea
infeciilor bacteriene i virale.
41

- n institutele medico - legale: se folosete pentru determinarea
paternitii, sau pentru identificarea persoanelor care s-au fcut
vinovate de delicte penale: crim, viol etc [38].

2.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR
2.2.1. Tehnica RFLP
Aceast tehnic se bazeaz pe proprietile de hibridare
care exist ntre dou fragmente de ADN, prezentnd un grad nalt de
omologie (RFLP- bazat pe hibridare) i tehnica PCR denumit PCR-
RFLP, n care se evideniaz polimorfismele existente la nivelul
situsurilor enzimelor de restricie.
a) Tehnica RFLP bazat pe hibridare cu o sond, implic
parcurgerea urmtoarelor etape:
- extracia ADN din organismele ce urmeaz s fie analizate;
- digestia ADN cu ajutorul enzimelor de restricie;
- separarea fragmentelor obinute n urma digestiei, n
funcie de mrimea lor, prin electroforez n gel de agaroz;
- transferul ADN sub form denaturat pe o membran de
nylon (Southern blotting) n care poziia relativ a diferitelor
fragmente de ADN din gel se pstreaz pe parcursul
transferului;
- hibridarea ADN cu sonda marcat prealabil, n regiunile n
care prezint omologie;
42

- vizualizarea regiunilor hibridate cu ajutorul unui film
sensibil la radiaii (autoradiografie) sau cu ajutorul unei reacii
enzimatice, care d o coloraie specific.
n tehnica RFLP pot fi utilizate diferite tipuri de sonde, care permit
evidenierea unor tipuri diferite de polimorfism. Sondele mono- sau
oligogenice pun n eviden unul sau mai muli loci; ele dau un profil
simplu care include cteva benzi. Utilizarea acestui tip de sonde
permite vizualizarea polimorfismelor de secven, localizate la
nivelul situsurilor de restricie, precum i a polimorfismelor de
inserie/deleie, situate ntre situsurile de restricie. Acest tip de sond a
fost utilizat pentru a alctui hri genetice la om, pentru a identifica
unele varieti de mr i pentru a pune la punct un test de
depistare a anemiei falciforme. Sondele poligenice sau multilocus
pot fi dirijate spre zonele care prezint ariabilitate foarte mare, cum
sunt secvenele de tip micro i minisatelit, alctuite de 2 pn la 16
perechi de baze, repetate n tandem. Cu ajutorul sondelor
multilocus, se observ, n general un grad ridicat de polimorfism ntre
genotipurile nrudite. Acest tip de sond a fost utilizat pentru prima dat
de Jeffreys i colaboratorii in 1985 [33] la hibridarea cu ADN genomic
uman digerat i amprentizarea genetic a fiecrui individ. Ulterior, au
fost descoperite alte secvene satelit i la alte mamifere, la insecte
i plante. Sondele multilocus permit evidenierea polimorfismului
de secven la nivelul situsurilor de restricie, polimorfismului de
inserie/deleie precum i polimorfismului determinat de numrul
unitilor repetitive, pentru fiecare individ n parte [33].
43


b) Tehnica RFLP, bazat pe PCR, utilizeaz o enzim de
restricie pentru digerarea unui produs de amplificare, obinut cu
primeri specifici, iar n gelul de agaroz se vor obine benzi de
dimensiuni diferite, corespunztoare celor trei genotipuri
(homozigoi pe una din cele dou alele i heterozigoi).

Markerii RFLP sunt markeri cu polimorfism limitat ce
identific variaiile secvenei de ADN la nivelul unui situs de
restricie, prin analiza RFLP. O surs abundent de markeri genetici,
utilizai n tehnicile de cartare a genomului animal au la baz
modificrile unor secvene de ADN care se produc la nivelul situsurilor
de restricie
De regul aceste variaii sunt cauzate de mutaii punctiforme
(substituia unei nucleotidecu o alta), inserii sau deleii, n
interiorul situsului de restricie i astfel, enzima de restricie, nu
mai recunoate situsul respectiv i nu mai taie. Aceasta va
determina obinerea unor fragmente de restricie de lungimi diferite
(polimorfice) care pot fi uor vizualizate i identificate n gelul de
agaroz datorit lungimii lor diferite. Din aceast cauz ele se vor
separa n gelul de electroforez sub forma unor benzi situate n diferite
regiuni. Greutatea molecular se apreciaz cu ajutorul unui ADN
standard de etalonare - ladder. n practic, mrimea unui fragment ce se
detecteaz prin Southern blotting este de 300 pb 15 kb cu
diferene detectabile mai mici de 50 pb.
44

Prin tehnica PCR se detecteaz produi ntre 60 pb-2kb, cu
diferene chiar de cteva baze. Indivizii diferii genetic pentru un anumit
locus, vor prezenta fragmente de restricie de lungimi diferite, ntr-un
numr diferit pentru un anumit cuplu format din sonda molecular
enzim de restricie. n acest context, fiecare sistem format din ADN
genomic enzim de restricie, poate defini un locus polimorf care are
cel mult dou alele diferite [38].
Cu ajutorul RFLP se pot identifica variaiile genetice dintre indivizi
doar la nivelul situsurilor de recunoatere a enzimelor de restricie,
respectiv dintre indivizii care posed unul din cele trei genotipuri
existente n locusul de interes (AA, Aa, aa) i nu se pot detecta
variaiile la nivelul ntregului genom, care la mamifere este de ordinul
3x 10
9
pb.
2.2.2. Tehnica AFLP
Tehnicile moleculare care permit obinerea amprentelor
genetice i vizualizarea polimorfismelor, a diferenelor dintre
eantioane la nivel de ADN, se bazeaz pe dou principii: hibridare cu
sonde sau amplificare prin reacia PCR. Polimorfismul bazat pe
numrul de repetiii n tandem, a motivelor de tip satelit, este azi
cel mai utilizat n studiul diversitii genetice a raselor de animale i a
soiurilor de plante.
AFLP este o tehnic bazat pe punerea n eviden a polimorfismelor
tot la nivelul situsurilor de restricie. Aceast tehnic a fost descris de
Vos i colaboratorii n anul 1995 i se bazeaz pe amplificarea
selectiv, cu ajutorul PCR, a unei categorii de fragmente obinute
45

printr-o restricie particular, care utilizeaz 2 enzime de restricie i
adaptori, marele avantaj al metodei este acela c nu necesit
informaii preliminare despre genom.
Tehnica AFLP se bazeaz pe amplificarea selectiv a fragmentelor
de restricie, obinute din ADN genomic total digerat i ea parcurge trei
etape:
- restricia ADN genomic i legarea adaptorilor
oligonucleotidici;
- amplificarea selectiv a seturilor de fragmente de restricie;
- analiza fragmentelor amplificate, n gel de poliacrilamid.
Pentru prepararea unei matrie AFLP, ADN genomic este izolat i
digerat simultan cu 2 enzime de restricie, de exemplu: EcoRI i MseI.
EcoRI are un situs de recunoatere de 6 pb (taie rar) iar, MseI are un
situs de recunoatere de 4 pb (taie frecvent).
Fragmentele obinute prin restricie pot fi grupate n 3 clase:
- marea majoritate (90%) prezint dou situsuri MseI la
extremitile lor;
- aproximativ 10% prezint un situs EcoRI i un situs MseI;
- cteva fragmente prezint 2 situsuri EcoRI.
Procedeul AFLP se bazeaz pe detecia predominant a
fragmentelor EcoRI - MseI care au o extremitate tiat cu o enzim care
taie rar i o extremitate tiat de o enzim care taie des. Succesul
tehnicii AFLP depinde de digestia complet a ADN genomic.
Pentru aceasta trebuie acordat o importan sporit izolrii ADN de
nalt calitate, intact i fr contaminri cu nucleaze sau inhibitori [39].
46

Legarea adaptorilor, dup inactivarea prin cldur a endonucleazelor de
restricie, de tip Eco RI i MseI, dublu catenari, se face la extremitile
fragmentelor de ADN.
Structura adaptorilor este urmtoarea:
- secven nou, care va servi ca situs int pentru ataarea
primerilor PCR n etapa urmtoare a AFLP;
- o secven care permite restaurarea situsului de restricie;
Sunt utilizate dou tipuri de adaptori: cei care restaureaz situsul
EcoRI i cei care restaureaz situsul MseI. Primerii care sunt utilizai n
reacia PCR nu se fixeaz pe ADN genomic, dar se vor fixa pe adaptori.
Dup digestia ADN genomic i legarea adaptorilor, fragmentele de
restricie vor fi amplificate prin PCR. n structura primerilor PCR vom
regsi de o parte secvena adaptorilor i un situs de restricie (este acela
la nivelul cruia se vor fixa primerii PCR n urmtoarea reacie PCR),
iar de cealalt parte o nucleotid selectiv, adugat la extremitatea 3 a
primerilor PCR.
Numrul nucleotidelor selective poate varia de la 0 la 3 pe primer.
Fixarea nucleotidelor specifice determin ca un singur subansamblu de
fragmente de restricie s fie recunoscut i amplificat. Condiiile de
reacie sunt alese de aa natur ca singurele fragmente de ADN care
corespund perfect cu primerul s fie amplificate. Dac se lucreaz cu
genoame complexe, cum sunt cele de la plante sau animale, PCR-ul este
realizat n dou etape consecutive. n prima reacie, numit
preamplificare, ADN genomic este amplificat cu doi primeri AFLP,
avnd cte o singur nucleotid selectiv i produsul PCR al
47

preamplificrii este diluat i utilizat ca matri pentru a 2-a
amplificare selectiv, iar n al doilea PCR se vor utiliza primeri AFLP,
ce conin cte trei nucleotide selective.
Aceast strategie, de amplificare n dou etape, permite obinerea
unei amprente genetice foarte clare, care poate fi analizat pentru
detectarea polimorfismelor i ntre indivizii strns nrudii. Unul din
marile avantaje ale tehnicii AFLP este permisivitatea modulrii
numrului de profiluri genetice. Este posibil creterea sau
reducerea complexitii profilului, adaptnd diferii parametrii, iar
factorul cel mai important pentru determinarea numrului de
fragmente, amplificate ntr-o reacie simpl AFLP, este numrul de
nucleotide selective din primerii selectivi. Numrul de fragmente
detectate n gel, pentru o amprent genetic, scade cnd numrul
nucleotidelor selective crete.
Alegerea numrului de nucleotide selective este strns legat de
mrimea genomului, cu ct mrimea genomului este mai redus cu
att numrul fragmentelor amplificate este mai restrns i amprenta
genetic mai simpl. Pentru organismele cu genoame mari (5x10
8
-
5x10
9
pb) se utilizeaz primeri selectivi cu cte trei nucleotide, astfel
nct s se amplifice n medie 50 fragmente pe prob i pe perechea de
primeri selectivi, acest numr poate varia ns ntre 10 i 100, n funcie
de secvena nucleotidic i complexitatea genomului. Al doilea factor,
ce determin numrul de fragmente amplificate, este compoziia n baze
G i C a nucleotidelor selective din primeri. n general, se amplific mai
puine fragmente cnd nucleotidele selective sunt G i C.
48

Tehnicile amprentelor genetice sunt multiple, fiecare are
caracteristici particulare de specificitate de locus, nivel de polimorfism,
tehnicitate. Alegerea unei metode trebuie ntotdeauna s fie luat n
considerare n funcie de obiectivul cercetrii:
- pentru studii de diversitate ca i pentru msurarea
variaiilor inter sau intrapopulaionale, distanei genetice,
pentru clasificarea n sistematic a populaiilor distincte genetic.
- pentru clonarea poziional ca i pentru obinerea unei
densiti mari de markeri moleculari, ntr-o regiune
precis din genom (hipervariabil), din vecintatea unei gene
care urmeaz s fie clonat;
- pentru stabilirea hrilor genetice la speciile puin studiate
sau acolo unde sondele i primerii PCR nu au fost nc
dezvoltai.
Marele avantaj al tehnicii AFLP este sensibilitatea n detectarea
polimorfismului la nivelul genomului total. Cu toate acestea, tehnica
AFLP a devenit un standard molecular pentru clasificarea n sistematic
a populaiilor distincte genetic. Polimorfismele identificate n ADN sunt
transmise mendelian i utilizate apoi pentru genotipizare,
identificarea markerilor moleculari i cartografierea genelor [2].

2.2.3. Tehnicile MAAP
Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon
Profiling) face parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic
49

DNA), alturi de tehnicile DAF (Amplification Fingerprinting ) i AP-
PCR (Arbitrary Primed PCR).

2.2.3.1. Tehnica RAPD
Tehnica RAPD se bazeaz pe determinarea polimorfismului la
nivel alelic n ceea ce privete producerea unor produi de amplificare
sau lipsa lor, n urma utilizrii unui primer oligonucleotidic, arbitrar,
ntr-o poziie care s-i permit realizarea amplificrii.
Aceast variant a tehnicii PCR nu necesit clonarea sau
secvenierea ADN i poate detecta mai muli loci simultan.
Principiul tehnicii este simplu: ADN izolat de la un individ este
supus unei reacii PCR utiliznd primeri oligonucleotidici, de
secven arbitrar, care vor hibrida la secvenele sale
complementare, n cazul n care acestea exist. Dac din ntmplare, doi
primeri consecutivi, aflai n vecintate, se ataeaz la matri n sensuri
opuse, fiecare pe una din cele dou catene, la o distan nu prea mare
unul de cellalt, fragmentul delimitat de ele va fi amplificat, iar dac
unul din cele dou situsuri este absent la unul din indivizi, la acesta
amplificarea nu va avea loc, evideniindu-se un polimorfism de
prezen/absen. Secvenele de primeri scuri, mperecheai aleator (8
12 perechi de baze) sunt folosii la amplificarea ADN de tip RAPD, de
obicei rezultnd un polimorfism de prezen/absen, n gel. O astfel de
situaie, care permite amplificarea randomizat, n mai multe puncte,
poate fi realizat la nivelul ntregului genom.
50

Deoarece RAPD este o tehnic bazat pe PCR, vom prezenta
cteva din particularitile definitorii ale acesteia. Modificarea unei
singure baze n genom este suficient pentru a mpiedica ataarea
primerului n acel loc i a mpiedica amplificarea fragmentului delimitat
de acel primer. Analiza RAPD poate detecta modificarea unei singure
baze n ADN genomic, n anumite condiii [39].

Polimorfismul detectat de RAPD poate rezulta din cteva tipuri de
modificri:
- inseria unei secvene mari de ADN, ntre secvenele de
ataare a primerilor, care fac fragmentul delimitat de aceste
secvene prea mare pentru a fi amplificat;
- deleia unui fragment de ADN ce conine unul din situsurile de
ataare a primerilor duce de asemenea la lipsa amplificrii
segmentului;
- substituia unui nucleotid poate afecta hibridarea
primerului la un anumit situs de ataare, putnd evidenia
sau nu un polimorfism (dispariia unei benzi);
- inseria sau deleia unui mic fragment de ADN poate duce la
modificarea mrimii unui fragment amplificat i a poziiei
benzii n gel.
Modificrile de mrime se observ rar, dar cel mai adesea
polimorfismul se manifest prin aceea c un fragment amplificat poate
fi prezent sau absent. Polimorfismul detectat prin RAPD este folosit ca
i marker molecular. Markerii RAPD se comport ca markeri dominani
51

cnd sunt urmrii n descenden. Acest comportament rezult din
faptul c un fragment amplificat este prezent n gel (ca o alel
dominant A) sau absent (ca alel recesiv a). n analiza
descendenilor, un fragment este observat n stare homozigot
(analog cu AA), fiind amplificat att ADN de la un printe, ct i de la
cellalt, sau n stare heterozigot (analog cu Aa), cnd este amplificat
numai ADN provenit de la unul din prini, cellalt prezentnd un
polimorfism reperezentat prin absena fragmentului.
n stare heterozigot, absena fragmentului de la unul din
prini este mascat de prezena benzii datorat fragmentului
amplificat de la cellalt printe. Prin urmare, analiza RAPD nu
poate discerne ntre starea homozigot (AA) i cea heterozigot (Aa).
n cazul markerilor codominani ns (n care fiecare printe
posed o band distinct, pe care cellalt nu o posed), starea
heterozigot (AB) n descenden (prezena ambelor benzi n hibridul
din F1) poate fi deosebit de strile homozigote (AA) i (BB). In anii
`90 s-a artat c 95% din fragmentele RAPD se comport ca markeri
dominani (un singur fragment amplificat distinctiv la unul sau ambii
prini i descendeni) i sub 5% se comport ca markeri codominani.
Calculul numrului de fragmente care poate fi ateptat teoretic la
folosirea unui primer care hibrideaz 100% cu matria, poate fi
calculat din lungimea primerului i din complexitatea genomului
int, presupunnd c nucleotidele sunt prezente n proporii egale.
Produii de amplificare se separ prin electroforez n gel de agaroz
i se evideniaz dup colorare n bromur de etidiu .
52

2.2.3.2. Tehnica DAF
In 1991, Caetano-Anolles i colaboratorii [13], au introdus o
metod numit DNA Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au
folosit primeri scuri, cel mai adesea de lungime ntre 5 8
nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumii parametrii PCR,
folosind pai att de joas ct i de nalt stringen, precum i un
program al ciclurilor cu numai dou temperaturi n loc de standardul
cu trei. Produii de amplificare au fost separai prin electroforez n
gel de poliacrilamid i vizualizai prin colorare cu argint. Nivelul
complexitii profilului benzilor poate fi predeterminat prin
manipularea condiiilor de reacie. Ca urmare a apariiei mai
multor variante de amprentare a ntregului genom, bazate pe PCR
cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles i colab., au propus n
(1994), denumirea acestor metode nrudite cu numele generic de
Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP) [13].
Totui, datorit simplitii i utilitii, numele i metoda
original RAPD, cunoate cea mai larg rspndire. Aceast tehnic
permite amplificarea unui numr mai mare de fragmente de dimensiuni
foarte mici, care ulterior vor fi separate ntr-un gel de poliacrilamid.

2.2.3.3. Tehnica AP PCR
Lungimea primerului utilizat, este un criteriu principal de
distincie ntre cele trei tehnici descrise anterior; astfel c pentru
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) sunt primerii
decameri (9-10 pb), pentru DAF (DNA Amplification Fingerprint)
53

primerii au 5-15 pb, iar pentru AP-PCR (Arbitrary Primed PCR)
primerii au lungimea de18-32 pb. Tehnicile AP-PCR i DAF pot releva
numeroase benzi (pn la 100) n timp ce RAPD-ul produce un numr
mic de benzi, pn la zece [56] .
Avantajele tehnicilor Multiple Arbitrary Amplicon Profiling
(MAAP) rezid din: simplitate, rapiditate, costuri sczute, i faptul c
nu necesit cunotine anterioare despre genom, nu necesit digestie
sau transfer pe o membran, marcare radioactiv sau fluorescent,
cu ajutorul lor fiind generai markeri moleculari utiliznd markerii
deja disponibili [52] . Tehnica RAPD fiind rapid, poate fi utilizat n
hibridri interspecifice, introgresia genelor, identificarea clonelor,
descoperirea markerilor sex-linkai, msurarea distanelor genetice la
plante, animale i om.
Dezavantajele tehnicii constau n reproductibilitatea sczut,
iar schimbrile de scurt durat a condiiilor de reacie pot cauza
benzi nereproductibile. O singur procedur cuprinde trei etape
importante. Tehnica AP-PCR utilizeaz primeri de 18 pb i a fost
dezvoltat i utilizat ca metod reprezentativ [32].

2.2.4. Tehnica RT PCR
Aceast tehnic este tot o variant a tehnicii PCR, n care
amplificarea pornete de la ARN mesager (ARNm). n prezena
enzimei revers transcriptaza, ARNm devine matri pentru sinteza
ADN complementar (ADNc), dup care procesul de amplificare
decurge n mod normal. Cuantificarea expresiei genice se bazeaz pe
54

presupunerea c se pstreaz o anumit proporionalitate ntre cantitatea
de ADN de la nceputul reaciei i cantitatea produsului de amplificare
[56].
Trebuie subliniat faptul c aplicarea reaciei PCR la moleculele de
ARN necesit o modificarea a reaciei PCR n prima etap. Pentru
c molecula de ARN nu poate fi copiat n prezena Taq
polimerazei, aceast etap este catalizat de revers transcriptaz, enzim
n prezena creia este sintetizat molecula de ADN de pe matria de
ARN. Copia de ADN este apoi amplificat n prezena Taq
polimerazei.
Descoperirea enzimelor termostabile (ex. ADN-polimeraza -
obinut din bacteria Thermus thermophilus) cu ajutorul crora pot fi
obinute copii termostabile de ADN att de pe matrie de ADN ct i de
pe matrie de ARN face posibil aplicarea RT PCR n
condiiile n care va fi necesar o singur reacie n prezena unei
singure enzime [11]. Aceast tehnic ofer o informaie mai detaliat
referitoare la detectarea cu sensibilitate ridicat a unor gene exprimate
n cantiti reduse, ntr-o anumit celul.

2.2.5. Tehnica microsateliilor - SSR
La organismele procariote i eucariote o parte din ADN genomic
este reprezentat de secvene de ADN nalt repetitive, de
complexitate mic i considerate noninformaionale. Microsateliii
sau SSR (Simple Sequence Repeats) sunt secvene nalt repetate,
care conin motive de 2 5 perechi de baze, repetate n tandem i care
55

flancheaz o secven unic de ADN. Se pare c acetia sunt
rezultatul crossing-overului inegal. Tehnica PCR este aceea care va
fi utilizat pentru relevarea profilurilor individuale, furniznd
markeri specifici de locus ce se transmit codominant.
Un microsatelit nu este specific la un locus particular, dar
regiunile flancatoare sunt specifice [19]. Aceti markeri bazai pe PCR
necesit investiii considerabile pentru a putea fi generai, dar sunt
nalt polimorfici pentru folosirea lor n aplicaiile MAS (selecia
asistat de markeri moleculari). Polimorfismul este determinat de
diferenele existente n lungimea produilor de amplificare. Acest
polimorfism va duce la evidenierea mai multor alele la acest locus.
Fiind o regiune nalt polimorfic se pot distinge foarte multe
alele, dar care pot determina diferenele chiar i ntre indivizi nrudii.
Motivele repetate n tandem pot fi utilizate i ca sonde, dirijate ctre
ADN genomic, unde s-i gseasc regiunile complementare.

2.2.6. Tehnica EST
Aceast reacie bazat pe PCR necesit att clonare ct i
informaii despre secven, utiliznd informaiile proiectului de
secveniere a genelor, cnd sunt generate clone de ADNc. Aceast
secven este folosit pentru designul unor primeri de 18 20 pb cu
care se vor amplifica secvene nvecinate.
Markerul EST este de obicei detectat dup mrime n produsul
de amplificare i este un marker codominant. Crearea acestor primeri se
realizeaz cu costuri foarte mari, dar acetia sunt foarte utili prin
56

diversele aplicaii n cartare, descoperirea genelor asociate cu locii
caracterelor cantitative - QTL (Quantitative Traits Loci) i ar trebui
s contribuie considerabil la nelegerea mecanismelor la aceti loci
[11].

2.2.7. Tehnica SCAR
n cadrul acestei tehnici, fragmentele de ADN amplificate
prin tehnica PCR-RAPD, sunt clonate i pe baza lor se construiesc
primeri specifici care vor avea lungime mai mare dect primerii RAPD.
Prin utilizarea primerilor SCAR n PCR, nu se rezolv problema
reproductibilitii reduse, deseori ntmpinat de markerii RAPD.
Obinerea unui marker codominant poate deveni un avantaj n plus,
n convertirea markerilor RAPD n markeri SCAR [11].
Totui, markerii SCAR pot manifesta dominan complet cnd
unul sau ambii primeri coincid parial cu variaia din secvena unui
anumit locus. Markerii SCAR dominani pot fi fcui deseori
codominani, prin digestia produsului PCR cu diferite enzime de
restricie.

2.2.8. Tehnica SNP
Aceast tehnic se caracterizeaz prin detectarea mutaiilor
punctiforme la un locus particular, mutaii determinate de substituia
unei singure nucleotide cu alta. Prin aceast tehnic pot fi evideniate
diferenele de secven existente ntre alele, cum ar fi substituia A n T
57

de exemplu AAGGCTAA n ATGGCTAA [23]. Pentru ca o variaie de
secven s fie considerat SNP ea trebuie s apar cu o frecven de
pn n 1% n populaie, ceea ce n populaia uman va detemina mai
mult de 90% din ntreaga variaie genetic [23].
Aceasta nseamn apariia mutaiei la fiecare 100 pn la 300
perechi de baze din totalul de 3 miliarde. Dou din trei polimorfisme
SNP sunt determinate de nlocuirea citozinei cu timina, ce apar
att n regiunile codificatoare ct i necodificatoare, polimorfisme de
tip citozin timin au fost descrise i de Schenkel F.S. i colaboratorii
n anul 2005 [63].

2.2.9. Tehnica STS
Aceast tehnic bazat pe PCR, detecteaz o secven unic ntr-
un punct definit din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertii
markerii genetici RAPD n markeri STS, pentru acelai locus. Tehnica
nu necesit clonare dac exist informaii anterioare despre secven,
pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 20 pb, poate fi
conceput dup secvena fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a
amplifica ulterior fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi
secvena unui produs PCR - RAPD sau a sondelor RFLP).
Polimorfismul este n general detectat ca o diferen de mrime
n produsul de amplificare STS fa de produsul RAPD, de la
acelai locus. Dac nu exist nici o diferen de mrime, se
apeleaz la restricia enzimatic pentru a tia produii de
amplificare i pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi
58

astfel detectat un polimorfism de cteva nucleotide. Din moment
ce primerii STS sunt mai lungi dect primerii RAPD i bazai pe
o secven specific, aceast metod detecteaz polimorfismul de la
acelai locus, fiind potrivit pentru studii de cartare genic.
Dezavantajul metodei este c proiectarea i crearea primerilor poate
implica o investiie important [11].

2.2.10. Tehnica ARMS PCR
O modificare a metodei PCR, care permite detecia
mutaiilor punctiforme cunoscute, prin amplificare cu primeri
specifici de alel, este metoda ARMS-PCR. Aceasta este o metod
care nu implic utilizarea izotopilor radioactivi, iar genotipizarea este
posibil prin simpla examinare a migrrii produsului PCR prin
elecroforez n gel de agaroz. Tehnica este cunoscut ca detectarea
mutaiilor prin amplificare refractar, descris pentru prima dat de
Newton C.R. i colab., 1989. Metoda const n utilizarea a doi
primeri care prezint aceeai secven de nucleotide cu excepia
nucleotidei terminale 3 unul complementar cu alela normal, iar
cellat cu alela mutant.
Pentru amplificarea enzimatic se folosete Taq-polimeraza,
enzim care nu are activitate exonucleazic 3-5, ceea ce implic
necesitatea unei perfecte complementariti a primerului cu capatul
3 al matriei ADN. Rezultatul se obine n urma electroforezei n gel
de agaroz prin prezena sau absena produsului de amplificare
respectiv.
59

Specificitatea este obinut dac primerul oligonucleotidic este
complementar cu secvena alelei dorite, dar nu este complementar cu
cealalt alel la captul 3, sau n imediata vecintate a captului 3'
al primerului specific de alel. Neamplificarea este rezultatul
nepotrivirii dintre ADN matri i oligonucleotidul din primer. Pentru
c Taq-polimeraza nu are activitate exonucleoazic n direcia 3'-5',
aceast nepotrivire mpiedic eficient elongarea la capatul 3' cu
ajutorul Taq polimerazei. Metoda este aplicabil, n general, n
detecia mutaiilor punctiforme cunoscute, mici deleii i inserii,
polimorfisme i alte variaii n secvena ADN.
De aceea, o mutaie (sau un polimorfism) poate fi detectat prin
utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat, care permite o
elongare eficient, n cazul unui cromozom mutant i o elongare
ineficient, n cazul unui cromozom normal [11].

2.3. TEHNICA SSCP
Aceast tehnic este util n detectarea polimorfismului
determinat de cel puin o nucleotid. Evidenierea polimorfismului se
face n timpul electroforezei n gel de poliacrilamid. Acest
polimorfism se bazeaz pe diferenele de conformaie ale unei
singure catene (mutant) ce difer de cealalt ntr-un singur punct,
datorit unei substituii, deleii sau inserii [6]. n anumite condiii,
acizii nucleici dintr-o caten de ADN formeaz n soluie o
structur secundar. Structura secundar depinde de compoziia n
baze, structur care poate fi alterat i de substituia unei singure
60

nucleotide. Aceast diferen va determina o mobilitate
electroforetic diferit n condiiile unui gel nedenaturat (gel de
poliacrilamid nedenaturat). Vizualizarea fragmentelor ce urmeaz a fi
detectate se face dup o prealabil colorare cu argint sau dup marcarea
radioactiv [1].

2.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENIERE
Prima secven descifrat a fost ARNt-ul purtator de alanina
publicat de ctre Robert Holley i colegii si de la Universitatea
Cornell in 1964 [26]. Acetia au utilizat enzime specifice care au rupt
molecula de ARNt n segmente mici pn cnd s-a reuit secvenierea
direct prin metode de degradare enzimatic. Abia n 1976 a fost
descifrat secvena complet a ARN monocatenar de la fagul MS2,
de ctre Walter Fiers n laboratorul su din Ghent. S-a stabilit atunci
structura complet a genomului viral i organizarea acestuia,
corespondena dintre codoni i cele trei proteine codificate de genele
fagului MS2 i c un codon stop cauzeaz terminarea transcripiei
[58].
Secvenierea ADN poate fi fcut prin procedee chimice
- metoda Maxam i Gilbert sau cu ajutorul terminatorilor de lan
- metoda dideoxi sau Sanger, aceasta din urma fiind astzi utilizat mai
mult. Prima metod a fost pus la punct de ctre Maxam si Gilbert n
1977 i este de fapt o clivare chimic [40]. Cea de-a doua, metoda
dideoxi sau Sanger, a fost pus la punct n acelai an de ctre Sanger i
61

se bazeaz pe ntreruperea controlat a sintezei enzimatice a ADN,
amplificat prin PCR [62].
n ambele cazuri, fragmentele obinute sunt supuse marcrii
radioactive (cu
32
P, de exemplu) naintea separrii pe baza greutii
moleculare ntr-un gel de poliacrilamid. Vizualizarea i analizarea
produilor rezultai se face prin autoradiografie.
O metod mult mai convenabil i mai precis este marcarea
fluorescent a fragmentelor i secvenierea automat. Fragmentele de
ADN sunt migrate ntr-un gel de poliacrilamid iar aparatul
(secveniatorul), prevzut cu un fascicul laser, excit fiecare
molecul marcat fluorescent i transform valorile fluorescente n
secvena n nucleotidice a fragmentului analizat. Un astfel de aparat
(ALFexpress Auto Read) poate detecta 200 pb pe or. Fiecrei secvene
de acizi nucleici i corespunde o diagram a succesiunii de baze
numit electroforegram. n aceast diagram fiecrei baze i
corespunde un vrf i o coloraie caracteristic.
O alt tehnic este secvenierea automat, n cazul creia, catena
de ADN care va intra n reacia de secveniere depinde de primerul
utilizat, putnd fi supus secvenierii att catena sens ct i cea
antisens. n studiile de secveniere a genelor, pentru precizia
rezultatelor obinute sau atunci cnd sunt cutate mutaii
punctiforme, se recomand secvenierea ambelor catene i
compararea rezultatelor obinute. n acest caz, este necesar
cunoaterea ambilor primeri, care s iniieze sinteza genei ce urmeaz
s fie descifrat.
62

n cazul n care se dorete descifrarea structurii unui fragment
de ADN, sau a unei gene, de la specii a cror genom nu este saturat n
hri genetice, pentru amplificare se utilizeaz primeri universali, cum
este cel de la fagul M13 [72]. Pentru fragmente de dimensiuni diferite
se aleg vectori corespunztori pentru clonare, de exemplu: plasmide
(0,1-10 kb), fagi (8-20 kb), cosmide (35-50 kb), BAC (cromozom
artificial bacterian 75-300 kb) i YAC (cromozom artificial de drojdie
100-1000 kb) la care genomul este complet descifrat i sunt ntocmite
hrile de restricie.
Etapele secvenierii:
1. Izolarea ADN genomic sau a fragmentului (genei) de interes ce
urmeaz s fi clonat sau secveniat;
2. Purificarea ADN izolat;
3. Amplificarea prin PCR a fragmentului de analizat cu ajutorul
primerilor specifici sau a primerilor universali, n prezena celor
patru dNTP marcai florescent, fiecare cu alt culoare - (adenina n
verde, timina n rou, guanina n negru i citozina n albastru) i a
polimerazei ;
4. Vizualizarea produilor de amplificare prin migrarea n gel de
agaroz (procedeu care face posibil att identificarea produilor
de amplificare, determinarea lungimii fragmentelor amplificate i a
calitii produsului de amplificare;
5. Purificarea produilor de amplificare; pentru ca produii de
amplificare s poat fi utilizai n reacii de secveniere trebuie s
63

aib un grad nalt de puritate (evitndu-se contaminarea cu inhibitori
i prezena rezultatelor eronate) ;
6. Secvenierea automat;
7. Citirea secvenelor pe catena analizat;
8. Alinierea secvenelor de pe cele dou catene sens i antisens;
Reacia de secveniere ncepe ntotdeauna dup ce ADN supus
secvenierii a fost iniial amplificat prin PCR, purificat i cuantificat
[2].












64

CAPITOLUL 3.
Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii
interdisciplinare

3.1. Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze
Genele ce codific leucin dehidrogenaza de la Bacillus
sterothermophilus, alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz
dehidrogenaza de la Bacillus subtilis i aspartaza de la Escherichia coli
au fost amplificate prin metoda PCR utiliznd amorse specifice. n
secvena amorselor au fost incluse situsurile pentru enzime de restricie
necesare inserrii genei n vectorul de exprimare. Pentru clonarea
genelor ce codific leucin dehidrogenaza, alanin dehidrogenaza i
aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare pET21b (Novagen). Acest
vector ofer posibilitatea exprimrii genelor la inducere cu IPTG.
Produii PCR au fost purificai din gel i digerai cu enzimele de
restricie corespunztoare (Tabel 3.1). Vectorii de exprimare au fost
digerai cu aceleai enzime de restricie. Produii de digestie (produii
PCR i vectorii) au fost separai cu ajutorul electroforezei n gel de
agaroz.



65

Tabelul 3.1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a
genelor.
Enzima Amorsele utilizate Organism surs Enzime
de
restricie
Vector
utilizat

AlaDH
Q08352

5-GAGGGATCCGATGAT
CATAGGGGTTCCTAAAG-3
5-GGTCTCGAGTATAGCA
CCCGCCACAGATGATT-3
Bacillus subtilis BamHI
XhoI
pET21b

LeuDH
P13154

5-GGTGGATCCGATGGAA
TTGTTCAAATATATGG-3
5-TATTCTCGAGTATTGC
CGAAGCACCTGC-3
Bacillus
stearothermo -
philus

BamHI
XhoI
pET21b

ALL
P0AC38

5' GGTAGGATCCGATGTCA
AACAACATTCGTATCG 3'
5' GCTACTCGAGTTACTGT
TCGCTTTCATCAGTA 3'
Escherichia coli NdeI
BamHI
pET21b
GalM

GalM
P0A9C3
5'-GGAATTCCATATGCTGA
ACGAAACTCCCGCAC-3'
5'-CGCGGATCCTCACTCAG
CAATAAACTGATATTCCG-3'
Escherichia coli NdeI
BamHI
pET24a

GlucDH
P12310

5-GGAATTCCATATGTATC
CGGATTTAAAAGGAAAAG-3
5-CGCGGATCCTCAAC
CGCGGCCTGCCTGG-3
Bacillus subtilis NdeI
BamHI
pET24a


Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroz. Pentru inserea
genelor n vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a
66

reface legturile fosfoesterice. Moleculele recombinate rezultate dup
ligare (vector +gena) au fost introduse prin transformare n tulpina de
Escherchia coli DH5. Secvenele genelor clonate au fost verificate
prin secvenializare cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer
utiliznd kitul de secvenializare BigDye Terminator v3.1 (Applied
Biosystems).
3.2. Producerea de proteine recombinate
Pentru exprimarea genelor, moleculele corect recombinate au
fost introduse prin transformare n tulpina de Escherichia coli
BL21(DE3). Pentru obinerea de proteine recombinate s-au realizat
culturi mai mari (0,5-1L). Dup ce densitatea optic (DO) la 600 nm a
atins valorile de ~1, s-a indus exprimarea genelor cu izopropil- D-
tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM [2]. Dup cteva ore de la inducere
(3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate i pstrate la -80C pn la
utilizare. Sintezele enzimatice au fost realizate cu extracte celulare
bacteriene. O purificare a proteinelor recombinate ar implica costuri i
timp suplimentar, iar orice proces biotehnologic este cu att mai valoros
cu ct implic mai puine costuri. Celulele bacteriene au fost preluate n
tampon Tris HCl pH=8,0 50 mM. Pereii celulelor bacteriene au fost
distruse prin sonicare. Dup sonicare extractul bacterian a fost
centrifugat (20 min la 21 000g la 4C), iar supernatantul cu proteinele
solubile a fost utilizat pentru msurarea activitii enzimatice. Analiza
exprimrii genelor i sintezei de proteine recombinate n celulele de E.
coli a fost urmrit cu ajutorul electroforezei n gel de poliacrilamid n
condiii denaturante n prezen de SDS (Figura 3.1).
67





Figura 3.1. Sinteza de proteine recombinate n celulele gazd de E. coli.
Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul
molecular, preum i masele moleculare ale proteinelor recombinate. Se
poate observa cantitatea mare de proteine recombinate raportat la
cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene [2].

3.3. Msurarea activitii enzimatice a enzimelor
Msurtorile de activitate enzimatic a dehidrogenazelor s-au
efectuat la 30C cu un spectrofotometru urmrindu-se scderea
absorbanei NADH (reacia de aminare a cetoacizilor) sau formarea
acestuia (reacia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. La aceast
lungime de und NADH prezint maximul de absorban i are un
coeficient molar de extincie de 6,22 103 M
-1
cm
-1
. Activitatea
enzimatic s-a calculat dup formula:
A=[(DO/min)/6,22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l
DO/min variaia densitii optice pe minut la 340 nm
Vr volumul reaciei
Vp volumul probei
FD factorul de diluie
O unitate enzimatic (1U) corespunde formrii unui mol de
produs ntr-un minut. Mediile de reacie pentru enzime au fost
urmtoarele:
Ala DH LeuDH AAL
68

a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM, NADH
0,15 mM, NH
4
Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare;
L-leucin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de
dezaminare
b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM, NADH 0,15
mM, NH
4
Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L-
alanin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de
dezaminare
c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM,
Tris HCl 50 mM pH 8,0
d) GalM (galacto mutarotaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM,
Tris HCl 50 mM pH 8,0, GDH 1 U
e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM, NADH 0,15 mM,
Tris HCl 50 mM pH 8,0
f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM, Tris
HCl 50 mM pH8,5, MgCl
2
6 mM Pentru msurarea activitii
enzimatice a aspartzei s-a urmrit formarea acidului fumaric la 240 nm,
care are un coeficient molar de extincie la aceas lungime de und egal
cu 2,54 103 M
-1
cm
-1
.
Pentru msurarea activitii enzimatice s-au folosit civa l de
enzim purificat sau extract brut bacterian, astfel nct valorile
DO/min s fie cuprinse ntre 0,05 i 0,3. S-a ales poriunea dreptei cu
activitatea cea mai mare.

69

3.4. Sinteza de aminoacizi marcai cu
15
N
Mediul de reacie pentru sintezele de aminoacizi marcai cu
15
N
a coninut:
cetoacid 100 mM

15
NH
4
Cl 100 mM
NADH 1 mM
glucoz 670 mM
Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacia
s-a declanat prin adugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcai
au fost efectuate la 30C cu urmrirea pH-lui i agitare. Pe parcursul
sintezei s-a urmrit consumul de NH
4
Cl prin metoda Berthelot. Aceast
metod const n formarea unui compus de culoare, la interaciunea
ionului de amoniu, a fenolnitroprusiatului i a cloraminei. Probele s-au
preparat dup urmtoarea procedur: 10 l de prob diluat de 20 ori,
200 l de fenolnitroprusiat, 200 l de hipoclorit de sodiu i 590 l ap.
Developarea culorii s-a fcut prin incubarea probelor timp de 2-3 min la
100C. S-a msurat absorbana la 623 nm. nainte de declanarea
sintezelor s-a preluat o prob care a servit la alctuirea unei curbe
etalon. Ca martor a servit amestecul de sintez fr clorur de amoniu
(din care cauz se aduga la sfrit). n Figura 3.2 este prezentat curba
etalon de la sinteza de [
15
N]-L-metionin. Pe baza curbelor etalon s-a
calculat cantitatea de ion de amoniu rmas n mediul de sintez.
Sintezele au fost oprite prin denaturarea termic a enzimelor, timp de 15
min la 85C.
70


Figura 3.2. Curba etalon de la sinteza [
15
N] L-Metionin [2].

3.5. Purificarea aminoacizilor sintetizai
Aminoacizii sintetizai au fost purificai pe o coloan cu rin
schimbtoare de ioni Dowex 50W x 8, n forma H
+
. Activarea
umpluturii s-a fcut prin tratare cu HCl
2
N, dup care s-a splat pn la
un pH neutru. Amestecul de sintez filtrat s-a ncrcat pe coloan i
apoi s-a splat cu ap (10 volume). Aminoacidul s-a eluat cu NH
4
OH
1M. Controlul elurii s-a fcut cu ninhidrin pentru aminoacizi.
Fraciunea cu aminoacid s-a concentrat pe baia de ap, dup care s-a
precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lsat peste noapte, iar
precipitatul obinut s-a filtrat i uscat. n continuare, aminoacizii astfel
obinui au fost supui determinrii structurii, puritii i concentraiei
izotopice.
71

3.6. Analiza aminoacizilor sintetizai prin spectrometrie de mas
Pentru analiza calitativ prin metoda spectrometriei de mas a
aminoacizilor este necesar o derivatizare a produsului de reacie.
Derivatizarea, care trebuie facut la ambele funciuni polare ale
moleculei de aminoacid, la carboxil i amin, s-a facut prin sililare,
utiliznd metoda Das Neves i Vasconcelos, care introduce la fiecare
funciune polar din molecul cte o grupare ter-butil-dimetilsilil
(TBDMS). Acest tip de derivatizare are avantajul c, datorit
substituentului ter-butil voluminos, la amin se introduce o singur
grupare silil, i nu una sau dou n mod statistic, cum se ntmpl n
cazul derivatizrii cu grupri trimetilsilil. Derivatizarea s-a fcut
utiliznd ca reactiv N-metil-N-(ter-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida
(MTBSTFA) n calitate de donor al gruprii silil, reactivul avnd i un
coninut de 1% ter-butil-dimetil-clorsilan, n calitate de catalizator.
Derivatizarea s-a fcut pe cantitai de prob de ordinul 0.5-1 mg de
prob, cu 150 l de acetonitril ca solvent i 50 l reactiv MTBSTFA, la
120C timp de 20 minute.
Separarea gaz-cromatografic a produilor de sintez sub form
de TBDMS-derivai s-a fcut pe o coloan capilar cu faz staionar
DB5 de 30 m lungime, cu hidrogen ca i gaz purttor i cu temperatur
programat ntre 55 i 250C. La ionizarea cu impact de electroni,
aminoacizii sub form de TBDMS-derivai se produc n cea mai mare
parte sub form de ioni prin fragmentarea moleculelor. Masele ionilor
fragment fiind caracteristice fiecrui aminoacid. Prin ruperea n diferite
poziii din gruparea tert-butil-dimetilsilil se formeaz ioni cu masele M-
72

43, M-57 i M-85, iar prin ruperea legturii dintre carboxil i atomul de
carbon alfa, adiacent, ia natere un fragment cu masa M-159. Pentru
analize s-a utilizat un cromatograf de gaze Hewlett Packard 5840 A, iar
spectrele s-au nregistrat cu un spectrometru de mas cuadrupolar HP
5985.

3.7. Sinteza de aminoacizi marcai
Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin
sinteze chimice i enzimatice. n primele etape de marcare a acizilor
aminai cu izotopi stabili s-au folosit metode de sintez chimic. Aceste
metode prezint un ir ntreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei
cantiti mari de amoniac, randamente sczute datorit mai multor etape
de sintez, obinerea racemicului.
Folosirea enzimelor n sinteze de aminoacizi marcai cu izotopi
stabili prezint mai multe avantaje fa de metodele chimice, datorit
faptului c decurg stereoselectiv i au randamente superioare. O metod
relativ simpl i mai utilizat pentru obinerea de aminoacizi marcai cu
15
N este sinteza enzimatic pornind de la cetoacizi i sruri de amoniu
(
15
N). Reaciile de sintez sunt cuplate cu reacii de regenerare a
cofactorilor costisitori.
Majoritatea enzimelor utilizate n sinteza diverilor compui
necesit coenzime (NADH sau NADP). Din cauza preului mare a
acestora utilizarea lor n cantiti stoichiometrice nu este eficient.
Pentru a evita acest fenomen exist cteva ci de regenerare continu a
coenzimelor pe parcursul sintezelor:
73

regenerarea n vivo, cu utilizare de celule n cretere. Aceast
metod prezint dezavantajul manipulrii laborioase a celulelor i
caracterul enantioselectiv sczut al reaciei;
regenerarea enzimatic n vitro, cele mai utilizate enzime
pentru regenerarea coenzimelor n sinteze fiind alcool dehidrogenaza i
formiat dehidrogenaza [27];
regenerarea electrochimic, care const n oxidarea unui
mediator i transferul electronului la NAD(P)
+
. Un dezavantaj al
metodei l prezint specificitatea i viteza de regenerare reduse.
Modalitatea cea mai eficient pentru regenerarea coenzimelor
rmne metoda enzimatic. Sursele enzimelor utilizate n regenerarea
coenzimelor sunt destul de variate, marea majoritate provenind de la
bacterii. Piridin nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas
fluorescens a fost utilizat n regenerarea att a NAD ct i a NADP
pentru producerea de hidromorfon [10]. Schema de sintez a
aminocizilor marcai cu
15
N utilizat n prezenta lucrare este
reprezentat n Figura 3.3.








74











Figura 3.3. Schema de sintez a acizilor aminai cu 15N. AADH
aminoacid dehidrogenz

Aminoacid dehidrogenazele catalizeaz reacia de formare a
aminoacizilor pornind de la
15
NH
4
Cl i cetoacizii corespunztori.
Sinteza de aminoacizi a fost cuplat cu reacia catalizat de glucozo-
dehidrogenaza (GlucDH) de la B. subtilis. GlucDH a servit la
regenerarea NADH, utiliznd ca sub-strat glucoza cu formare de acid
gluconic. n unele sinteze s-a folosit galac-tozo-mutarotaza pentru
transformarea -glucozei n -glucoz. Enzimele utilizate n sintezele
de aminoacizi marcai nu au fost purificate. Enzimele recombinate,
exprimate n celule de E. coli, reprezint aproximativ 50% din
proteinele totale existente n lizatul bacterian. Purificarea acestora este
o etap suplimentar care, n general, nu conduce la mrirea
randamentului reaciei. Honorat i colaboratorii [24] au testat sinteza de



15
NH
4
Cl
Cetoacid
L-(
15
N)-
Aminoacid
AADH
NAD
+

NADH
GDH
GalM
- glucoz
Acid gluconic
- glucoz
75

L-alanin i L-valin cu enzime (alanin dehidrogenaz i valin
dehidrogenaz) purificate i n lizat bacterian. Acest fapt nu a influenat
randamentul sintezelor.

3.8. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor
Bionanotehnologiile moderne se inspir din organizarea celular
a lumii vii. Astfel, structurile nano la fel ca i structurile vii, sunt
alctuite din componente de natur organic i anorganic. Aceste
structuri sunt sperana pentru tratarea a numeroase cancere, existnd n
prezent deja aplicaii ale nanoparticulelor n tratamentul unor cancere.
Nanoparticulele sunt o speran nu numai pentru tratamentul
numeroaselor boli, dar i pentru stabilirea unor diagnostice. Utilizarea
nanoparticulelor n medicin este axa prioritar n aplicarea
bionanotehnologiilor.
Limitrile bionanotehnologiilor sunt: incapacitatea de a sintetiza
particule de aceleai dimensiuni cu aceeai suprafa, controlul
organizrii lor. esuturile tari, cum ar fi esutul osos, cochiliile la
molute, conin una sau mai multe componente organice de natur
proteic care controleaz organizarea structural .

3.9. Aplicaii ale bionanotehnologiilor
Nanoparticulele de aur (NP-Au) sunt o adevrat speran n
diagnosticul i tratamentul cancerelor.
76

Au a fost utilzat timp de cteva decenii n diverse aplicaii n
medicin (implanturi dentare) datorit caractersticilor sale neutre.
Nanoparticulele de Au au nceput s fie din ce n ce mai des utilizate n
depistarea i chiar tratamentul unor celule canceroase datorit faptului
c acestea sunt inerte, non-toxice, au stabilitate mare, dimensiuni mici i
capacitate de legare mare. NP-Au sunt capabile de a aciona asupra unor
anumite tipuri de celule chiar n absena oricror grupe funcionalizate.
NP-Au induc moartea celular liniei de celule de carcinom pulmonar
A549 de la om, dar nu au nici un efect asupra altor linii de celule
HepG2 (carcinom hepatic hepatocelular uman) i BHK21 (celule
juvenile din rinichi de hamster) [57].

3.10. Diagnostic
Diagnosticul nanomolecular al cancerului poate asigura
depistarea celulelor canceroase n faze incipiente ale bolii.
Nanoparticule de aur derivatizate cu nucleotide tiolate au fost utilizate
pentru depistarea celulelor canceroase [15]. NP-Au la care s-au ataat
oligonucleotide de ADN au fost utilizate pentru diagnosticul timpuriu al
leucemiilor mieloide acute. Oligonucleotidele ADN utilizate n acest
scop reprezentau un fragment din jonciunea care rezult n urma
translocaiiei t(9;22)(q34;q11). Un fragment dintr-un cromozom este
translocat la un alt cromozom, n acest caz fragmentul de la
cromozomul 9 este transferat pe cromozomul 22, cromozomul find
cunoscut sub denumirea de cromozom Philadelphia. Aceast
77

translocaie este cauza leucemiilor mieloide cronice i care sunt cauzate
de fuziunea a 2 gene BCR(22)-Abl(9) (Figura 3.14).









Figura 3.14. Formarea cromozomului Philadelphia translocaia
reciproc ntre cromozomul 9 i 22.

Produsul acestei gene este o protein himer cu activitate
tirozin-kinazic. Metoda de detecie cu ajutorul nanoparticulelor se
bazeaz pe formarea de poriuni hibride ADN:ARN (ADN sonda:
ARNm din celulele canceroase) dublu catenare, care vor mpiedica
agregarea nanoparticulelor de Au odat cu creterea concentraiei de
sruri. Metoda nanosondelor pentru diagnosticul acestui tip particular
de cancer ofer avantaje fa de metodele utilizate actual n diagnostic
BCR
Translocaie
reciproc
Abi
Comozomul 9
Comozomul 22 Comozomul 9
Comozomul
Philadelphia
Abi
BCR

78

(FISH, transcrierea invers a ARNm i amplificarea prin PCR) prin
faptul c este mai ieftin i mai rapid (~30 min) i necesit cantiti
mici de ARNm (10 ng/l). Diagnosticul timpuriu n asemenea cazuri
este foarte important, n fazele ulterioare celulele canceroase devenind
rezistente la chemoterapice.
Nanoparticulele de argint (NP-Ag) au devenit atractive n
domeniul bionanotehnologic dup descoperirea efectului lor
antibactericid [66]. Acest efect este unul de importan major datorit
faptului c bacteriile capt din ce n ce mai mult rezisten la
antibiotice. Nanoparticulele de argint par a avea o influen nu numai
asupra bacteriilor, dar i asupra virusurilor. Astfel NP-Ag la
concentraii non-toxice pentru celule inhib replicarea viral (sinteza
materialului genetic ai virusului) atunci cnd nanoparticulele sunt
administrate nainte de infectare sau ime-diat dup (2-4 ore) aceasta
[67].
Unele substane chimice s-au dovedit a avea un efect inhibitor
asupra proliferrii celulare, angiogenezei i rol antiinflamator. Un astfel
de exem-plu este colorantul DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) care
induce apoptoza (moartea celular) n celule umane de melanom A375
i G361 [12]. DCPIP s-a dovedit a avea aciune antiangiogenez i
antiinflamatoare asupra celulelor canceroase umane de colon HCT116.
Efectul acestuia este mai intens dac este ncapsulat n particule de
polia-cizi (lactic i glicolic). Concentraiile de 6 g/ml de colorant
(DCPIP) induc moartea celular prin apoptoz [41].
79

Nanobiotehnologiile urmresc nu numai crearea de nano-
vehicule pen-tru transportarea diferitor substane, dar i crearea i
manipularea unor adevrate nano-motoare, utile n nanomanipulare
celular. F1-ATP-aza este un veritabil nano-motor rotativ, a crei
micri pot fi controlate cu ajutorul unor stimuli optici i chimici [60].
Sisteme particulare capabile de transport intit i eficient a
diferitor substane, cu puine efecte adverse, se datoreaz probabil
endocitozei transportorilor. Nanoparticule cationice formate din lipide
cationice i polielectrolii s-au dovedit a fi crui exceleni pentru
transportul amfotericinei B un antifungicid pentru Candida albicans
[71].
Nanodiscurile de HDL (High Density Lipoprotein) sunt un strat
bifosfolipidic cu aspect de disc (ND-HDL). Este cunoscut faptul c
HDL este numit colesterolul bun deoarece este implicat n transportul
molecu-lelor hidrofobe (colesterol) n fluxul sangvin care este un
mediu hidrofil. Structura HDL (liporoteine cu densitate mare) este una
simpl, fiind alctu-it din fosfolipide i apolipoprotein (apo). Cea mai
abundent form de lipoprotein din plasma sanguin uman este apoA-
I, care este alctuit din 243 de aminoacizi, este bine caracterizat i la
incubarea cu vezicule de fosfolipide n vitro formeaz HDL revers,
capabil de transportul molecule-lor hidrofobe [61]. Fosfolipidele cele
mai frecvent utilizate pentru asamblarea veziculelor sunt DMPC
(dimirisstoil-fosfatidil colina) i DMPG (dimirisstoil-fosfatidil glicerol).
Incubarea acestor vezicule cu apoA-I se autoasambleaz ND-HDL.
Aceste nano-discuri se pot autoasambla chiar dac nu este utilizat
80

enzima integral, ci numai fragmente de apolipoproteine [73]. ND-HDL
reprezint astfel un mediu favorabil pentru studierea proteinelor
transmembranare, transportul unor substane hidrofobe.
Stratul bilipidic este un mediu natural pentru proteinele
transmembranare care i pstreaz proprietile sale conformaionale i
activitatea. Suprafaa unui nanodisc cu diametrul de 20nm este de ~300
nm
2
, o suprafa suficient pentru integrarea ctorva molecule proteice.
Avantajul utilizrii acestor structuri comparativ cu miceliile de
detergeni, este c asigur un mediu natural apropiat, fr prezena
detergenilor care pot schimba conformaiile proteinelor. ND-HDL au
fost utilizate n studierea a numeroase proteine transmembranare cum ar
fi bacteriorodopsina [7,8], citoromul p450 3A4 [3], toxina antraxului
[35], hidrogenaze enzime de membran produse de Pyrococcus furiosus
care pot sintetiza H
2
[5]. ND-HDL au fost testate n utilizarea lor pentru
transportul diferitor substane hidrofobe, care sunt insolubile n mediu
sangvin hidrofil. Un exemplu n acest sens este transportul de ctre ND-
HDL a amfotericinei B un potenial antifungicid care inhib creterea
Saccharomyces cerevisiae i a altor fungi patogene, care administrat
sub aceast form nu mai este toxic la anumite concentraii [51]. ND-
HDL ce conineau cucurmin (un polifenol hidrofob natural obinut din
Curcuma longa) au inhibat creterea liniei celulare hepatice HepG2
comparativ cu administrarea curcuminei libere [22]. O alt aplicaie a
nanodiscurilor de HDL a fost ncorporarea de lipide cu ioni bivaleni de
Ni
2+
, care au capacitatea de a fixa proteinele cu etichet de 6-His
(histidine). Proteina din nveliul virusului West Nile [28].
81

CAPITOLUL 4. CULTURI CELULARE
4.1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale
Multe dintre tehnicile introduse la un moment dat n diferite
tiine au revoluionat felul n care acea tiin a fost perceput ulterior.
Culturile celulare sunt un asemenea exemplu n biologie. Introducerea
acestei tehnici n urm cu aproximativ 100 de ani a permis practic
importul naturii n laborator, ceea ce a dus la standardizarea tehnicilor
i generalizarea strategiilor de studiu ntre cercettorii din diverse
instituii, urmat de o explozie informaional n lumea biologic.
Avansarea cunoaterii biomedicale din ultimele decenii nu ar fi fost
posibil fr dezvoltarea printre altele a metodelor de lucru cu celulele.
Cercetarea biomedical actual folosete tehnicile de lucru cu celulele
pentru investigarea unor probleme din domenii ca: biofizica, biochimie,
biologie celular i molecular, genetica, biologia dezvoltrii
organismelor, evolutionism, medici-na molecular, farmacologia,
bionano-tehnologia, inteligent drug design etc. Este practic de
neimaginat desfurarea activitii ntr-un centru de cercetare
biomedical lipsit de laboratorul de culturi celulare. Aplicaii curente
sunt legate de: folosirea culturilor celulare pentru elaborarea
vaccinurilor, producia glicoproteinelor recombinante (cytokine,
hormoni, anticorpi monoclonali folosii n cercetare i clinica medical,
interferoni, eritropoietina), testarea agenilor anticanceroi, studii de
genomic, metabolism, apoptoz. ntr-un sens mai larg, cultura celular
poate cuprinde cultura esuturilor i organelor. Pe de alt parte, celulele
pot fi folosite ca i model pentru studiul rspunsurilor fiziologice la
82

diferii factori de stres din mediu. Avansarea cercetrii din domeniul
celulelor stem i lucrul cu celulele embrionare face posibil,
deocamdat teoretic, cultivarea organelor i esuturilor cu aplicaii n
bolile cronice degenerative, cancere i altele. Din punct de vedere al
tipului de cultur se poate vorbi despre:
- cultura de organe - presupune prelevarea i cultivarea unui organ n
totalitate. Aceasta include i cultivarea unor embrioni ntregi;
- cultura de esuturi - presupune prelevarea unor fragmente de esuturi i
cultivarea lor;
- cultura de celule - presupune prelevarea unor esuturi i digestia lor
pentru obinerea unei suspensii unicelulare care este apoi cultivat mai
departe.
Dac ne referim la cultura de celule, exist trei tipuri de celule
animale care sunt cultivate n laborator: primare, secundare i
imortalizate (tabel 4.1).
Proprieti primare secundare imortale/canceroase
Inhibiia de contact
1

Da Da Unele/nu
Fenotipul fa de situaia in
vivo
Identic Asemntor Asemntor/ rotunde
Genotipul fa de situaia in
vivo
Identic Identic Asemntor/ diferit
Necesarul factorilor de
cretere
Crescut Crescut Crescut/limitat
Difereniate
Da Da Da/nedifereniate
Numr de diviziuni
2-3 <100 Nelimitat
Timp necesar cultivrii
Crescut Sczut Sczut
Reproductibilitatea
rezultatelor
Sczut crescut crescut
83

Tabel 4.1. Caracteristicile celulelor primare, secundare i
imortale/canceroase [2].
1
n mod normal, celulele cresc n vasul de cultur pn cnd stabilesc contact cu
vecinele lor, moment n care i opresc creterea. Celulele canceroase pierd aceast
caracteristic fenotipic i dup ce ajung s fie confluente ncep s creasc una peste
cealalt formnd ghemuri de celule uor de distins la microscopul optic.

4.2. Culturi primare
Majoritatea celulelor din culturile primare necesit ancoraj.
Cultivarea celulelor provenite din piele (keratinocite, fibroblaste) se
face prin biopsierea esutului i formarea unei suspensii unicelulare.
Aceste celule vor crete aderente de suprafaa vasului de cultur. Pentru
a le separa de acesta i pentru separarea celulelor unele de altele se
folosesc de obicei enzime proteolitice (tripsina). Pe de alt parte,
cultivarea celulelor prelevate din sngele periferic se face ntr-o manier
care nu necesit ancorarea acestora de pereii vasului de cultur. Este
posibil ca celulele s formeze aderene ntre ele dar de obicei acestea
sunt de o mic intensitate. Diferite substane (factori de cretere ai
diferitelor populaii leucocitare i/sau mitogeni substane care
stimuleaz mitoza) pot fi utilizate pentru diferenierea i nmulirea
celulelor n cultur [2].

4.3. Culturi secundare
Prin subcultivarea celulelor dintr-o cultur primar se pot obine
aa-numitele culturi secundare. Celulele dintr-o cultur secundar pot
parcurge pn la 100 de diviziuni nainte de a-i pierde potenialul
84

proliferativ. Dei nu prezint alterri ale setului de cromozomi
(karyotipului), aceste celule acumuleaz anumite caracteristici
fenotipice care le fac s devin o linie celular distinct. Pe lng
derivarea culturilor secundare, subcultura are ca scop meninerea
celulelor n faza logaritmic de cretere, evitarea confluenei care poate
avea ca rezultat inhibarea creterii, ndeprtarea celulelor moarte i a
produilor de metabolism celular i adugarea substanelor nutritive [2].

4.4. Culturi de celule imortalizate
Este posibil ca unele celule din culturile secundare s sufere
anumite transformri care le confer caracterul de imortalitate adic
posibilitatea de a se divide la nesfrit. Aceste celule pot aprea ca
urmare a unor modificri (transformri) la nivelul cromozomului prin
factori chimici, fizici (radiaii) sau biologici (virusurile oncogene).
Unele dintre aceste celule imortale (transformate) pot avea caracter
oncogenic; cu alte cuvinte transplantarea lor la animalele de laborator
este urmat de apariia tumorilor la acestea. Dup cum se poate observa
din tabelul 4.1, celulele canceroase au unele proprieti care le
difereniaz de celelalte celule imortale necancreoase: nu mai prezint
inhibiia de contact; pot crete cu mai puini nutrieni etc [2].

4.5. Prezentarea informaiilor care se pot obine pe diferite sisteme
de studiu
Aplicaiile culturilor celulare i gsesc utilitatea n producerea:
vaccinurilor (antirubeolic, antiparotidita epidemic, antivaricela,
85

antirabic); hormonilor i factorilor de cretere (insulina,
eritropoietina), factorilor de coagulare, enzimelor, anticorpilor
monoclonali i altor substane imunomodulatoare (interferoni,
interleukine), agenilor anticanceroi etc. Mai mult, dezvoltarea n
ultimii ani a cunotinelor i tehnologiei de lucru cu celulele stem
constituie una dintre temele cele mai actuale n domeniul biomedical.
Este de ateptat ca acest domeniu s revoluioneze tratamentul
diferitelor afeciuni. n plus, celulele animale sunt deosebit de utile n
testarea citotoxicitii diferitelor substane incluznd noile terapii
anticanceroase. Nu n ultimul rnd, prin folosirea tehnologiei AND-ului
recombinat este posibil crearea celulelor transgene care constituie per
se un model de studiu pentru investigarea metabolismului energetic,
traficului de membran, ciclului celular, diferenierii, mbtrnirii i
apoptozei [2].

4.6. Anticorpii monoclonali
Una dintre aplicatiile culturilor celulare cu cel mai mare impact
pentru societate la ora actual este reprezentat de tehnologia de
obinere a anticorpilor monoclonali prin folosirea hibridoamelor.
Aceast tehnologie a fost inventat de ctre Milstein i Koehler n urma
cu aproape patru decenii. n 1975 cei doi cercettori au publicat
rezultatele prin care pot fi obtinui anticorpii monoclonali. Pe scurt
tehnica presupune imunizarea unui animal de experien cu un antigen
i recoltarea celulelor B (cele care produc anticorpii) la un anumit
interval de timp dup imunizare (figura 4.3). Aceste celule sunt
86

fuzionate apoi n prezena polietilenglicolului (PEG) cu o linie celular
canceroas de mielom (cancer al plasmocitelor). n urma acestei
fuziuni, se formeaz celule hibrid (de unde i numele de hibridoame)
dintre care unele produc anticorpii cu specificitatea dorit (caracter
dobndit de la celula B a animalului imunizat) ntr-o manier continu
(dobndind caracterul imortal de la celulele de mielom). Prin diferite
metode de screening se pot gsi aceste celule care sunt ulterior
subclonate dnd natere astfel unor linii celulare pure i stabile are
produc anticorpii monoclonali.
Datorit specificitii deosebit de mari (se consider c un
anticorp poate distinge antigenul pereche ntre 10
8
molecule), anticorpii
monoclonali i-au gsit foarte rapid aplicaii n domenii variate cum ar
fi: diagnosticul i trata mentul clinic, cercetare fundamental [59] i cea
aplicat prin metode de izolare a diferitelor substane recunoscute,
anticorpi catalizatori ai reaciilor chimice (abzymes).
Folosirea terapeutic a anticorpilor monoclonali n diferite
afeciuni umane urmeaz dou direcii: markeri diagnostici care pot
identifica diferite tipuri de antigene din populaii celulare in vivo i
terapia intit a diferite-lor afeciuni n care anticorpului monoclonal i
sunt ataate substane chimice toxice sau radioactive [2].





87













Figura 4.3. Producerea anticorpilor monoclonali [2].
Splina este izolat la cteva saptmni (timp necesar pentru
mbogi-rea repertoriului de celule B specifice) dup imunizarea
animalului cu anti-genul fa de care se dorete producerea anticorpilor
monoclonali. Celulele B sunt izolate i combinate cu mieloamele
(partea stng) n prezena PEG care mediaz fuziunea celulelor.
Celulele hibrid sunt singurele care vor supravieui n mediul
suplimentat cu Hypoxanthine Aminopterin Thymidine (HAT).
Screeningul face posibil identificarea coloniilor care produc anticorpi
fa de antigenul dorit. Urmeaz apoi subclonarea realizat prin diluarea











Screening
Subclonare
Linie celular productoare de
anticorpi monoclonali





PEG
HAT
Antigen
88

celulelor din coloniile productoare n aa fel nct fiecare recipient s
conin teoretic o singur celul. Se obin n acest fel colonii n care
toate celule provin dintr-o singur celul mam i deci vor produce
acelai anticorp ca i aceasta.
Aceast abordare a permis medicilor oncologi s obin rezultate
spectaculoase n diferite forme de cancere. Se poate vorbi la ora actual
de cancere tratate cu anticorpi monoclonali n care pacienii
supravieuiesc fr recidiv la 30 de ani de la administrarea terapiei.
Dei nu sunt toxici, anticorpii monoclonali produi n oarece
prezint neajunsul de a fi strini organismului uman. Ajuni n
organism aceti anticorpi ca orice alt substan strin iniiaz un
rspuns imun din partea gazdei care se poate manifesta prin secreia de
anticorpi umani anti-anticorpi monoclonali de oarece. Cu timpul
anticorpii umani pot neutraliza i distruge anticorpii monoclonali
injectai anulndu-le efectele terapeutice. Din acest motiv, n ultimii ani,
anticorpii de oarece au fost umanizai. Tehnologia ADN-ului
recombinat a fcut posibil ataarea prii specifice (cea care recunoate
antigenul) derivat de la oarece cu un bra constant (care constituie
cea mai mare parte) de la om. Exist la ora actual i peste 30 de
anticorpi monoclonali folosii ca i ageni terapeutici n diferite
afeciuni umane; numrul celor aflai n diferite stadii de testare
depete 100.
4.7. Celule stem
Urmtorul pas n revoluia din domeniul biomedical a fost
reprezentat de posibilitatea cultivrii celulelor stem n laborator. Prin
89

definiie celulele stem sunt acele celule care prin diviziune dau natere
unei celule fiic identic i unei alte celule care poate fi diferit. Dup
sursa de provenien exist dou tipuri de celule stem: celule stem
embrionare i celule stem adulte. Dup numrul de precursori ai liniilor
difereniate pe care le poate produce, celule stem pot fi clasificate n:
totipotente, pluripotente, multipotente, oligopotente. Dup cum implic
numele, celulele totipotente sunt capabile s formeze un organism n
totalitate. Aceste celule sunt reprezentate de ctre ovulul fertilizat i
celulele obinute din primele diviziuni ale acestuia. O schi a
diferenierii celulare se gsete n figura 4.4. Cele mai bine studiate
celule stem sunt cele derivate din mduva osoas i care constituie
precursorii tuturor celulelor din snge. Interesul major pentru biologia
celulelor stem este explicat de potenialul de difereniere al acestora n
orice tip de esuturi i organele dintr-un organism. Dei cercetarea n
acest domeniu este relativ la nceput, cercettorii au reuit s izoleze i
cultive cu succes anumite celule stem din diferite surse unele dintre ele
fiind apoi difereniate n numeroase celule finale. Pe lng potenialul
terapeutic enorm, celulele stem prezint i aplicaii diagnostice. Este
posibil ca una dintre cele opt celule ale embrionului rezultat n urma
fertilizrii in vitro a unui ovul s fie ndeprtat i analizat din punct de
vedere genetic (celula este dispensabil deoarece restul celulelor rmase
refac embrionul). n urma analizelor care pot s depisteze diferite
defecte genetice se poate decide neimplantarea embrionului n uterul
viitoarei mame.
90

Folosirea acestor celule face posibil i obinerea animalelor
modificate genetic prin introducerea unor gene n embrionul tnr. Se
pot produce astfel animale chimera care exprim genele implantate n
diferite organe. Dac aceste organe sunt chiar gonadele, atunci urmaii
unei mperecheri dintre doi astfel de oareci chimera pot produce un
knock-out/knock-in pentru acea gen. Dei deosebit de atractiv,
tehnologia cultivrii celulelor stem embrionare este puternic ngrdit
de normele actuale ale eticii cercetrii.


Figura 4.4 Celulele stem pot da nastere unui numar mare de celule
diferentiate final [2].

Disputele asupra aspectelor etice ale lucrului cu celule stem
embrionare au ncurajat dezvoltarea tehnicilor de lucru cu celulele stem
91

adulte. Rmne de vzut dac potenialul unor astfel de celule stem
adulte este la fel de nelimitat ca i al celor embrionare. Recent au fost
descrise i celule stem canceroase. Aceast nou descoperire pune sub
semnul ntrebrii principiile actuale care stau la baza tratamentului
cancerului. Existena acestor celule canceroase stem poate explica
apariia recidivelor prin participarea unui numr redus de celule care nu
pot fi distinse/distruse prin tehnicile actuale. Experimental s-a dovedit
c un numr de doar 200 de celule considerate ca fiind celule stem
canceroase este suficient pentru a transfera cancerul de la un animal la
un altul n timp ce un numr de cteva sute de ori mai mare de celule
canceroase care nu prezint caracteristicile celulelor stem sunt
incapabile s transfere boala.
Succesul n lucrul cu celule depinde de factori variai cum ar fi:
utilarea laboratorului, calitatea celulelor i a reactivilor, tehnica
asepteic (prezentate n cele ce urmeaz) i experiena personal a
operatorului care contribuie decisiv la primele trei [2].







92

CAPITOLUL 5.
Aparatajul disponibil i stabilirea parametrilor optimi de
funcionare pentru diverse tipuri de experimente

5.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare
Organizarea general a laboratorului de culturi celulare include
urmtoarele echipamente de baz:
a. Hota cu flux laminar
Servete lucrului efectiv cu celulele; aranjarea spaiului de lucru este
descris n figura 4;
este prevazut n mod obligatoriu cu o lamp de UV care va fi pornit
5-10 minute nainte de nceperea lucrului i repornit pentru
5-10 minute dup ncheierea lucrului;
tipul de hot folosit pe scar larg n cultura celulelor animale este
hota cu flux de aer vertical care ofer o protecie bun att pentru
celule ct i pentru operator.
b. Incubator cu sursa de CO
2

creterea celulelor; n funcie de tipul de celulp, concentraia de CO2
este n general ajustat ntre 5% i 7% pentru a obine un sistem
tampon optimal n combinaie cu substanele din mediul de cultur;
responsabil pentru meninerea unei atmosfere sterile (filtre HEPA -
high efficiency particulate air), umede i cu temperatura constant.
c. Microscop optic inversat cu contrast de faz (opional aparat
foto)
servete la observarea celulelor;
93

deoarece n cultura de celule animale, celulele sunt n general situate
pe suprafaa bazei recipientului se folosete microscopul inversat;
contrastul de faz mbuntete vizualizarea specimenelor transpa-
rente (celulelor).
d. Centrifuga de mas cu rcire
centrifugarea suspensiilor de celule n diverse scopuri.
e. Recipient cu azot lichid
stocarea celulelor pe termen lung; de obicei se gsete ntr-o incint
anexat;
o precauie deosebit trebuie acordat faptului c recipientul este
extrem de rece (-196 grade Celsisus) i azotul poate produce arsuri
n urma contactului cu pielea sau mucoasele; de aceea este necesar
utilizarea echipamentului de protecie (ochelari/masc facial,
manui, halat).
f. Frigider/congelator
stocarea reactivilor (medii cultur, stocuri de antibiotice, L-glutamina
etc.)
g. Alte componente
Baie de ap
pstrarea mediilor i altor reactivi la temperatura de 37C;
o alternativ este nlocuirea apei cu perle metalice care
prezint urmtoarele avantaje: reducerea contaminrii
reactivilor cu care vin n contact, igienizare uoar,
economisirea consumului de energie, stabilitate n timp.
Autoclav i sterilzor cu aer uscat
94

Folosite pentru sterilizarea diferitelor soluii i recipiente
folosite.
Pompa de vid i sisteme de sterilfiltrare
pentru lichidele instabile la autoclavare (de ex. DMSO) se
poate folosi i ca sistem de aspirare a mediilor folosite.
h. Consumabile
pipete serologice, pot fi din plastic (de unic folosin) sau din sticl
(refolosibile dup sterilizare);
vase de cultur - codate n funcie de aria util de cultivare i de vo-
lumul maxim de mediu care poate fi coninut;
medii de cultur (multe celule pot fi cultivate n
DMEM/RPMI+10%FBS la care se adaug diferite concentraii de L-
glutamina i antibiotice).
Cronologic se poate vorbi de existena a dou categorii de medii;
cele na-turale care includ serul sanguin i alte secreii de origine
animal i medii sintetice n care componentele de baz sunt produse
separat i apoi amestecate de obicei de ctre firme specializate. Chiar
dac este vorba de un mediu sintetic, cu unele excepii serul este
considerat un component de baz. La ora actual, serul provine de la
animale mari, n gene-ral de la vac - de unde i numele de fetal bovine
serum (FBS). Mediile de cultur sunt soluii saline tamponate.
Compoziia mediilor de cultur este complex incluznd: aminoacizi,
acizi grai, carbohidrai, sruri, microelemente, vitamine, hormoni,
factori de cretere i alte componente. Cele mai multe medii conin i
phenol red, un indicator al pH-ului care trebuie s rmn ntre 7 i 7,4.
95

Dac acesta vireaz spre galben indicnd un mediu acid este cazul ca
mediul s fie schimbat.
suplimente pentru mediile de cultur: antibiotice uzual se folosete
un amestec de penicilin/streptomicin, L-glutamin, Na-piruvat,
bicarbonat, glucoz i altele n funcie de particularitile
experimentului [2].

5.2. Strategii de lucru
Din punct de vedere tehnic, exist cteva principii de baz ale
lucrului cu celulele:
culturile celulare vor fi fcute ntr-o camer dedicat acestui scop.
Este de dorit ca aceast ncpere s fie oarecum izolat fa de restul
laboratoarelor pentru a limita riscul de contaminare. Tot din acest
motiv, accesul personalului n aceast camer va fi restricionat pe
ct posibil; de aceea se va permite doar accesul celor care sunt direct
implicai n procesul de lucru cu celulele;
personalul care urmeaz s lucreze cu celulele va fi instruit
corespunztor (vezi mai jos);
acele ncperi care sunt dedicate lucrului cu celule prezint risc
infecios pentru cei implicai; de aceea ncperile vor fi semnalizate
corespunztor;
toate mediile i suplimentele care urmeaz a fi folosite n cultura
celular trebuie s fie certificate pentru lucrul pe culturi de celule
(indicaia cell culture certified/approved trebuie s apar pe
96

ambalaj/descrierea produsului); toate acestea trebuie adaptate liniilor
celulare cu care urmeaz a se lucra n laborator;
spre deosebire de celulele vegetale i bacterii, celulele animale sunt
pretenioase n ceea ce privete condiiile n care pot sa creasc; exist
riscul contaminrii cu diferite microorganisme care datorit ratei de
cretere mult superioar celulelor animale vor deveni majoritare n scurt
timp; n plus factori ca spre exemplu temperatura (37
o
C pentru celule
mamifere), pH-ul, osmolaritatea (290-310mOsm), i o concentraie a
CO2 ntre 5 i 7% condiioneaz cultura celulelor animale (sistemul de
tampon cel mai frecvent utilizat este cel cu bicarbonat de sodiu sau
potasiu din mediul de cultur + CO2 din incubatorul folosit);
celulele animale sunt limitate n ceea ce privete numrul de generaii
pe care le produc. Chiar i n condiii optime, celulele animale se vor
opri din cretere dup un numr de generaii care depinde de sursa
primar a celulelor;
creterea celulelor animale urmeaz o curb cu trei faze:
o faza de echilibrare (primele 24h) n care celulele se acomodeaz
cu noul mediu n care sunt introduse;
o faza de cretere exponenial care dureaz n jur de 7-10 zile;
o faza de inhibare a creterii datorit inhibiiei de contact, creterii
densitii peste un nivel critic, scderii potenialului de metabolizare a
mediului;
substanele pot fi prenclzite fie la 22, fie la 37 grade Celsius (10-20
min e suficient; se poate porni un cronometru pentru a evita uitarea
97

mediilor pentru un timp ndelungat i degradarea lor (L-glutamina,
tripsina).;
lucrul bine organizat i desfurat fr grab este esenial pentru o
eficien maxim:
o micrile vor fi msurate i sigure;
o imediat dup adugarea suplimentelor n mediile de cultur se
noteaz acest fapt pe recipientul respectiv;
o nimic din ceea ce vine n contact direct cu celulele nu se deschide n
afara hotei sterile; nainte de scoaterea din hot se verific etaneitatea
nchiderii [2].

5.3. Instruirea personalului
Cultivarea celulelor este un lucru care se poate nva repede. Cu
alte cuvinte, oricine poate nva s menin culturile de celule dup
doar cteva zile petrecute n laborator dac respect protocoalele i are
la dispoziie echipamentul necesar. Singurul lucru care este i mai uor
i nici mcar nu necesit nvare este s contaminezi celulele. De aceea
desfurarea activitii n linite este esenial n laboratorul de culturi
celulare. Odat aprut, contaminarea se poate propaga din aproape n
aproape i duce n final la compromiterea nu doar a celulelor la care
contaminarea a fost iniial semnalat ci a ntregului stoc de celule. Pe
lng considerentele financiare, contaminarea recipientelor cu coninut
original (celule produse n laborator i care nu pot fi achiziionate de la
companiile specializate sau transferate de
98

la ali investigatori) reprezint cel mai neplcut aspect care poate afecta
un laborator de culturi celulare. Toi cei care urmeaz s lucreze cu
celule vor fi n prealabil instruii teoretic nainte de a ptrunde pentru
prima dat n laborator. Practic, ei vor ncepe prin a observa manoperele
de lucru i a le discuta cu un coleg familiarizat deja cu tehnicile. Doar
dup aceast perioad este permis lucrul direct, mai nti sub
supravegherea direct a celor familiarizai i mai apoi n mod
independent. Chiar i dup ctigarea in-dependenei n lucru, cel
proaspt iniiat va fi supravegheat din umbr de ctre un coleg cu
experien care ar putea observa anumite manopere executate
neconform cu normele curente [2].

5.4. Asigurarea asepsiei i antisepsiei
Exist anumite msuri care asigur igiena n lucrul cu celulele:
Utilizarea echipamentului de protecie - pentru evitarea contaminrii
celulelor i operatorului:
halat cu mneci lungi
pantofi nchii
mnui de unic folosin
Splatul pe mini nainte i dup lucrul cu celulele;
O soluie antimicrobian de etanol 70% trebuie s fie n permanen
la ndemn;
Instrumentele de lucru trebuie igienizate la intervale regulate. Orice
obiect (pipeta, recipient etc.) care urmeaz s fie introdus n hota pentru
lucrul steril trebuie dezinfectat nainte sau imediat dup introducere;
99

Orice pipet trebuie folosit o singur dat; nu este permis pstrarea
pipetei n mediu sau folosirea unei pipete pentru a transfera
mediu de la un recipient la altul;
Orice mediu sau obiect contaminat din greeal va fi aruncat;
Orice lichid care ajunge n contact cu suprafaa de lucru steril va fi
ndeprtat imediat cu ajutorul unui prosop de hrtie mbibat n
etanol 70%;
Este necesar investigarea strii de sntate a celulelor n fiecare zi.
Se pot astfel observa caracteristicile normale sau abateri de la acestea.
Se pot de asemenea observa contaminri cu alte celule sau
microorganisme. Se pot lua probe care sunt analizate pentru stabilirea
prin diferite tehnici a gradului de puritate/contaminare [2].

5.5. Cultivarea celulelor
dup felul n care cresc n flacoanele de cultur, celulele eucariote pot
fi mprite n dou mari categorii: cele care cresc aderent pe vasul de
cultur i cele care cresc n suspensie. Modul de lucru este asemntor
pentru toate celulele dar exist anumite particulariti de care trebuie
inut cont n cazul fiecrei grupe;
evaluarea celulelor se face n mod normal n fiecare zi prin
vizualizarea lor sub microscopul optic; celulele care cresc aderent
trebuie s apar distribuite pe suprafaa de contact cu vasul n care cresc
i de cele mai multe ori capt o form poligonal, iar celulele care
cresc n suspensie rmn rotunde i uneori (n funcie de linia cultivat)
100

pot forma aglomerri de celule (asemntor cu o ciorchin de struguri);
starea de sntate a celulelor este confirmat i de creterea numrului
de la o zi la alta; o evaluare de prim instan a celulelor se realizeaz
prin vizualizarea macroscopic a culorii mediului din sticlele de cultur;
culoarea standard a mediilor este rou-orange; o culoare care virea z
spre galben indic necesitatea schimbrii mediului;
subcultivarea celulelor: deoarece aglomerarea celular poate influena
negativ vitalitatea celulelor (a se vedea mai sus), se recomand ca
celulele s fie subcultivate; aceast procedur care se aplic n faza
logaritmic de cretere a celulelor permite obinerea unor cantiti
crescute de celule prin mprirea/transferul acestora dintr-un recipient
de cultur n mai multe recipiente fiecare reprezentnd o nou surs de
celule; exist anumite formule de calcul care permit aflarea cu precizie
a combinaiilor optime; de asemenea se pot planifica n acest fel
anumite experimente pentru anumite date; n anumite situaii este
nevoie de utilizarea unor soluii de tripsina/EDTA pentru crearea
suspensiilor unicelulare (vezi Tripsinizarea) [2].
5.6. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultur i
stabilirea viabilitii acestora
Pentru a subcultiva celulele/folosi celulele ntr-un anumit
protocol este nevoie de stabilirea numrului de celule pe unitatea de
volum. Mediul de cultur coninnd celulele este transferat unor tuburi
n care se centrifugheaz (centrifuga trebuie echilibrat n prealabil -
dac avem un singur tub cu celule va trebui s folosim un al doilea tub
101

cu aceeai greutate care poate s conin ap distilat sau orice alt lichid
cu densitate asemntoare). Pentru o separare bun este nevoie de 10
minute la 200-250g/min (ntr-o centrifug de mas cu rotor standard
1000rpm). Dup centrifugare celulele se resuspend n mediu proaspt
i apoi 10 microlitri sunt combinai cu 10 microlitri de soluie Trypan
blue 0,5% i pipetate n camera de numrat. Sub microscopul optic,
leucocitele apar ca i celule glbui/transparente cu o membran brun.
Soluia de trypan blue va ptrunde n celulele moarte care apar albastre.
n funcie de tipul camerei de numrat, exist formule de calcul dup
care putem s aflm numrul total de celule. O viabilitate de peste 90-
95% este n general acceptat pentru toate manipulrile ulterioare [2].
5.7. nghearea i dezghearea celuluor
Doi pai critici ai lucrului cu celulele sunt constituii de ctre
nghearea i dezghearea celulelor. nghearea este indispensabil din
urmtoarele considerente:
Celulele sunt supuse n permanen variaiilor n compoziia
cromozomilor. De aceea cea mai sigur metod de prezervare a liniilor
celulare este cryoprezervarea care oprete procesele metabolice
nelsnd astfel loc modificrilor genotipului.
n plus, cryoconservarea este o metod practic din punct de
vedere economic: este mult mai simplu s pstrezi un tub cu celule
ngheate care nu au nevoie dect de o completare periodic a rezervei
de azot dect s cultivi n mod repetat celulele n laborator; de
102

asemenea transportul ntre laboratoare este mai uor dac celulele sunt
ngheate.
Nu n ultimul rnd, metoda face posibil revenirea la celule cu
un numr mai mic de pasaje.
Este esenial ca nainte de nceperea procedurii respective s
notm urmtoarele detalii pe fiecare tub: tipul de celul, numrul de
celule, numrul de pasaj i data la care a fost creat stocul.
nghearea va fi lent i constant pentru a minimaliza efectele
adverse asupra viabilitii celulelor. Mediul de ngheare cel mai
frecvent folosit conine mediul de cultur recomandat pentru linia
celular + 20% FCS + 5-10% cryoprotector -Dimethyl sulfoxid
(DMSO) sau 10-15% glicerol care are rolul de a scdea temperatura de
nghe permind apei s ias din celul i mpiedicnd astfel formarea
cristalelor de ghea care ar putea distruge membrana. Dup
centrifugarea i verificarea vitalitii (se recomand folosirea celulelor
vitale n proporie de >90-95% la colorarea cu trypan blue), celulele vor
fi resuspendate direct n mediul de ngheare rcit n prealabil la 4 grade
la o concentraie de 1x10
6
-1x10
7
/ml
6
i transferate imediat la -20
o
C
pentru 1-2 ore. Urmeaz apoi transferul peste noapte la -80
o
C i apoi
stocarea de lung durat n azot lichid.
Dezghearea celulelor trebuie fcut extrem de rapid (ideal n
mai puin de un minut) prin transferul acestora din recipientul cu azot,
pe gheaa uscat, direct n baia de ap la 37 de grade Celsius. Odat ce
103

dezghearea permite pipetarea suspensiei (>75% dezgheat) aceasta se
transfer ntr-un tub de 15ml peste care se adaug pictur cu pictur8
o cantitate de mediu prenclzit echivalent cu de dou-trei ori
cantitatea suspensiei, dup care se poate aduga mai rapid mediu pn
la 10ml. Se centrifugheaz n general la 200rpm timp de 2-5 min pentru
a elimina urmele mediului de ngheare. Se resuspend n 10 ml de
mediu i se transfera n sticlele de cultur etichetate. Prin micri fine
se distribuie celulele. Dup cteva ore (cel trziu a doua zi dimineaa) se
verific starea celulelor prin vizualizarea la microscop. Mediul va fi
schimbat pentru a nltura celulele moarte i resturile de cryoprotector
(DMSO sterilfiltrat sau glycelor - autoclavat).
5.8. Subclonarea i tripsinizarea
Celulele formeaz aderene ntre ele i suprafaa vasului de
cultur (celule aderente) i/sau ntre ele (celulele aderente, unele celule
care cresc n suspensie). Pentru cele mai multe protocoale/manopere
este necesar obinerea unei suspensii unicelulare. Cea mai frecvent
combinaie folosit n acest scop este tripsina/EDTA.
Dac este vorba de celule aderente protocolul de lucru
presupune ndeprtarea mediului, splarea cu o soluie salin tampon
fr calciu i magneziu i adugarea unei cantiti de trispin/EDTA
care s acopere stratul de celule. Celulele nu trebuie lsate neacoperite
timp ndelungat. Pentru a ajuta separarea este posibil uoara btaie a
sticlei de podul palmei. Urmrind sub microscop separarea celulelor
(dureaz cteva minute) se poate evita efectul nociv al unei incubri
104

prea ndelungate. Celulele devin rotunde odat ce pierd aderenele.
Imediat, aciunea trispinei este antagonizat prin adugarea de ser
urmat de transferul ntr-un tub adecvat i centrifugarea. Dup
centrifugare celulele sunt resuspendate n mediu pentru a obine o
suspensie unicelular i apoi numrate/investigate la microscop prin
colorarea cu trypan blue (proporia celulelor moarte). Dac tripsinizarea
s-a fcut n cadrul protocolului de subcultivare, celulele sunt apoi
transferate vaselor noi de cultur i incubate pn a doua zi. A doua zi
se recomand schimbarea mediului care permite nlturarea celulelor
moarte i a resturilor de tripsin/EDTA. Dac manopera s-a fcut n alt
scop, se urmeaz paii din protocolul respectiv.
La celulele neaderente nu se face tripsinizarea; celule pot fi
direct numrate iar densitatea lor este ajustat prin adugarea mediului
proaspt. La fiecare 2-4 sptmni se centrifugheaz i resuspend
celulele neaderente n mediu proaspt [2].

CAPITOLUL 6.
Producerea i izolarea proteinelor recombinate din celule mamifere
Tehnica de baz pentru producerea acestor proteine implic mai
multe etape care sunt menionate n tabelul 3. Dup ntocmirea
strategiei de lucru, fragmentele de interes sunt amplificate prin tehnica
PCR. Pe scurt, esutul care conine antigenul int este prelevat de la
sursa de interes dup care ARN-ul mesager obinut n urma extraciei
este folosit ca i matri pentru sinteza ADN-ului complementar [2]. Cu
105

ajutorul amorselor specifice, folosind acest ADN complementar pot fi
amplificate secvenele de interes prin reacia de PCR. Dup clonarea
acestor fragmente n celule, urmeaz exprimarea proteinelor codate i
purificarea acestora [2]. Apoi n funcie de aplicaia dorit, acestea vor
fi utilizate fie la imunizarea pentru modelul activ de boal fie pentru cel
pasiv.
6.1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizai
Terapia biologic cu ajutorul anticorpilor este considerat la ora
actual ca fiind cea mai activ bran a industriei biotehnologice [57].
Din punct de vedere istoric, prevenia/terapia cu ajutorul anticorpilor
este o procedur folosit de cteva mii de ani. Chinezii i indienii sunt
cei crora li se atribuie folosirea terapeutic a serurilor (fraciunea
sngelui n care se gsesc anticorpii alturi de alte proteine) nc
naintea erei noastre. n urm cu cteva secole, este semnalat folosirea
serurilor pentru protejarea persoanelor n Turcia i apoi odat cu
experimentele doctorului Edward J enner de la sfritul secolului al
XVIII i n Anglia. Totusi folosirea pe scar mai larg a anticorpilor n
scop terapeutic a nceput s fie practicat ncepnd cu secolul XX. n
ciuda efectelor terapeutice extraordinare, folosirea anticorpilor a fost
ns limitat de anumite aspecte dintre care cele mai neconvenabile au
fost:
lipsa unei surse constante de anticorpi omogeni;
anumite aspecte adverse (apriia unui rspuns imun fa de
nsui anticorpii) datorit utilizrii anticorpilor de la alte specii;
106

dificultilor tehnice n izolarea/producerea lor i
necunoaterea posibilelor inte terapeutice eseniale pentru
diferite afeciuni.
Descoperirea antibioticelor n anii 30-40 ai secolului trecut
alturi de celelalte inconveniente amintite au dus la intrarea anticorpilor
ntr-un con de umbr. ncepnd cu 1975 situaia avea ns s se
schimbe. ntr-o lucrare de referin pentru literatura biomedical, doi
cercettori anun n revista Nature o metod prin care se pot obine
cantiti teoretic nelimitate de anticorpi cu specificitatea dorit.
Diferena ntre anticorpii policlonali (cei care erau la acea or n uz
medical) i noii anticorpi (numii monoclonali) poate fi comparat,
chiar i numai pentru a face lucrurile mai uor de neles, cu diferena
dintre dou persoane, prima purtnd haine de diferite mrimi, forme i
culori i a doua purtnd haine personalizate de ctre un croi-tor
profesionist, ncepnd de la lenjerie i pn la ultimul nasture al
paltonului. Chiar dac uor exagerat i poate nu cea mai potrivit din
punct de vedere biomedical, folosirea acesteia are un substrat uor de
neles i anume n literatura de specialitate de limba englez termenii
tailor made antibodies sunt folosii pentru a descrie producerea de
anticorpi monoclonali specifici pentru diferite situaii [57]. Dezvoltarea
acestei noi tehnici, a dus la nlturarea primului din cele dou mari
dezavantaje ale folosirii anticorpilor policlonali, i anume lipsa unei
surse constante de anticorpi cu caracteristici omogene; de asemenea, cu
timpul, noua tehnologie a permis obinerea lor prin tehnici relativ
107

simple i cu costuri substanial diminuate nlturnd astfel cel de-al
treilea dintre dezavantajele amintite anterior. Anticorpii monoclonali
produi iniial au pstrat neajunsul de a fi produi n alte specii ducnd
la declanarea unui rspuns imun masiv din partea primitorului (cel de-
al doilea neajuns). Cel mai probabil din acest motiv, lumea biomedical
i industria farmaceutic a fost n prima instan rezervat la posibila
utilizare a acestora pe scar larg. Aceast temere a fost dublat i de
avansarea tehnicilor industriale de producere a molecule-lor cu mas
molecular mic care preau s fi rezolvat n sfrit problema
inexistenei unor medicamente perfecte. n ciuda acestor piedici,
entuziatii au continuat ns lucrul la producerea anticorpilor
monoclonali ducnd la aprobarea utilizrii primului anticorp produs n
acest fel nu ns mai repede de un deceniu de la publicarea
metodologiei de ctre Koehler i Milstein [37]. Totui n anii care au
urmat, potenialul imens al noii tehnologii a incitat att curiozitatea
comunitii tiinifice (interesat n definirea noilor aplicaii pentru care
anticorpii monoclonali reprezentau unealta mult-cutat, cel de-al
patrulea neajuns amintit mai sus) ct i de ctre pragmatismul
industriei farmaceutice (care gsea o nou min de aur n
comercializarea noilor gloane magice aa cum le numea Paul
Ehrlich, printele hematologiei i chemoterapiei, acesta din urm fiind
un termen pe care l-a introdus chiar el, cu mai bine de un secol n urm
[69]. Dup unii, dezvoltarea tehnologiei producerii anticorpilor
monoclonali reprezint inovaia secolului trecut n ceea ce priveste
importana terapeutic, diagnostic i preventiv a mbolnvirilor
108

umane. Dac n anul 2000, n topul primelor zece produse folosite n
tratamentul diverselor afeciuni existau, cu o singur excepie, doar
substane cu greutate molecular mic, se estimeaz c cinci din cele
zece substane vor fi reprezentate de anticorpi n viitor [57, 66]. Desigur
aceast turnur a fost posibil prin mbuntirea permanent a
protocoalelor de lucru i obinerea unor anticorpi modificai prin
tehnologia ADN recombinat, tehnici care au cunoscut o dezvoltare
extraordinar n ultimele dou trei decenii. La ora actual, anticorpii
sunt n aproape toate situaiile luai n calcul la stabilirea strategiei
terapeutice alternative sau cteodat constituie chiar terapia de prim
alegere. Dintre cei peste 25 de anticorpi monoclonali aflai la ora
actual pe lista medicamentelor aprobate pentru tratamentul afeciunilor
umane, majoritatea sunt destinai tratrii cancerelor. De asemenea dintr-
un total de 1500 de studii clinice n care sunt testai noi anticorpi
monoclonali peste75% sunt axate pe folosirea acestora n tratarea
cancerelor. Majoritatea sunt folosii ca atare (neconjugati), urmai de cei
conjugai cu material radioactiv i o mic proporie sunt reprezentai de
cei conjugai cu toxine. Aceste date au menirea de a sublinia interesul
major al comunitii biomedicale i al guvernelor statelor
industrializate (din moment ce majoritatea studiilor sunt finanate din
bani publici) pentru gsirea unor strategii terapeutice specifice pentru
tratarea acestei maladii.
Dup cum aminteam anterior la 11 ani de la publicarea lucrrii
lui Koehler i Milstein [37], n 1986 este aprobat utilizarea primului
anticorp monoclonal pentru prevenirea rejetului de transplant. Folosirea
109

pe scar larg a Orthoclone OKT3 (muronomab CD3) a fost ns
limitat de faptul c acest anticorp de origine murin (produs n celule
de oarece care difer suficient de celulele umane) induce un rspuns
imun amplu n organismul uman [68]. Mai mult, administrarea acestui
anticorp a dus la apariia sindromului eliberrii sistemice de cytokine
datorit interaciunii OKT3 cu receptorii pentru poriunea Fc a IgG.
Datorit eecului relativ al utilizrii acestui medicament i datorit
timpului ndelungat necesar dezvoltrii unui nou medicament, timpul
scurs pn la aprobarea celui de-al doilea anticorp monoclonal a fost de
nc opt ani de la aprobarea OKT3. n 1997, rituxan (rituximab), un
anticorp monoclonal mpotriva CD20 de pe celulele B devine cel de-al
treilea medicament admis pe piaa din SUA pentru tumori ale celulelor
B. ntre timp acest medicament este folosit i n tratamentul unor boli
autoimune cum ar fi artrita reumatoid, bolile buloase (pemfigusul,
pemfigoidul), diabetul zaharat de tip I, anemia hemolitic autoimun,
vasculita autoimun etc. Acest anticorp chimer (combinaie ntre uman
i murin) are multiple mecanisme de aciune dintre care merit amintite:
inducerea toxicitii celulare indus de anticorpi (ADCC) i
citotoxicitatea mediat de complement (CDC), alturi de un mecanism
de inducere a apoptozei celulelor care exprim CD20 pe suprafa. n
general, anticorpii sunt substane care interacioneaz cu structuri
extracelulare sau de pe suprafaa celulelor. Mare parte dintre eforturile
actuale au menirea de a crete penetrana acestor glicoproteine pentru
inte din interiorul celulelor. n plus dac anticorpii iniiali aparineau
clasei IgG1, investigaii actuale sunt concentrate asupra diversificrii
110

activitii prin schimbarea clasei i deci a paletei de efecte posibile. Mai
mult, exist cteva direcii prin care se urmrete creterea posibilelor
interaciuni terapeutice. Dintre acestea amintim:
- o modificarea poriunii Fc a anticorpilor pentru:
- mbuntirea interaciunii cu receptorii Fc sau Fc de tip
neonatal (FcRn) de pe celulele efectoare;
- mbuntirea proprietilor efectoare prin optimizarea in-
teraciunii cu sistemul complement;
o prelungirea duratei de injumtire cu efecte favorabile
datorate reducerii dozajului fie prin PEG-ylarea fragmentelor (scFv,
Fab) fie prin fuzionarea lor pe domenii de Ig;
o multispecificitatea, adic adugarea unei alte specificiti n
zona de recunoatere a Fab.
Pe scurt, anticorpul pstreaz specificitatea pentru care a fost
creat pe unul dintre fragmentele Fab cu care se va lega de inta dorit
urmnd ca pe celalalt fragment Fab s lege un receptor de pe o celul
efectoare (spre exemplu CD3 de pe celula T) care are proprietatea de a
distruge celula recunoscut specific.
111

6.2. Recomandri pentru abordarea de noi tipuri de experimente i
metodologii a culturilor celulare.
Una dintre direciile de cercetare care vor fi abordate n viitor se
va concentra pe producerea de fragmente recombinate ale diferitelor
protei-ne autoantigen cu ajutorul culturilor celulare eucariote. Atenia
va fi concentrat pe producerea acelor autoantigene a cror patogenitate
este nc incomplet elucidat, contribuind astfel ntr-un mod inovativ la
definirea naturii autoimune a diferitelor entiti clinice. Un exemplu n
acest sens l constituie clonarea fragmentelor de integrine. Integrinele
sunt o clas heterogen de proteine implicate n diverse procese de la
asigurarea contac-telor dintre celule i mediul nconjurtor, la funcii de
recrutare i transducerea semnalului. Un interes primar pentru
preocuprile noastre l constituie producerea fragmentelor recombinate
ale proteinelor care asigu-r adeziunea keratinocitelor de stratul dermal.
Defecte ale acestor integrine sunt considerate a fi implicate n
patogeneza bolilor autoimune. Nu este deocamdat clar n ce fel i n ce
msur autoanticorpii fa de aceste mole-cule sunt implicai n
patogeneza autoimun. De aceea, odat produse aceste fragmente ar
putea fi folosite n diferite combinaii pentru a reproduce caracteristicile
bolii umane n animalele de experien. Ca i metodologie de lucru,
producerea unui model de boal i modularea acestuia n scop
preventiv/terapeutic implic mai multe etape (Tabelul 6.1).

112

Tabelul 6.1. Etape recomandate pentru modelare n scop
preventiv/terapeutic a unei boli autoimune n animalele de
experien
Denumire etap activiti
Obinerea
fragmentelor
recombinate ale
autoantigenului
Stabilirea planului de clonare
Designul i producerea de amorse specifice Izolarea
ARN-ului mesager
RT-PCR Clonarea produilor obinui prin PCR
Exprimarea proteinelor recombinate
Producerea
modelului activ de
boal
Imunizarea animalelor de experien cu diferite
combinaii de proteine recombinate Evaluarea clinic
i paraclinic a inducerii bolii Dezvoltarea unor
strategii de prevenie, diagnostic i tratament a bolii
induse:
- folosirea diverselor ci de administrare, adjuvani,
cantiti variabile de autoanitgen, folosirea
autoantigilor modificai
- folosirea anticorpilor monoclonali cruzi sau
funcionalizai cu nanosfere
- folosirea nanosferelor direcionate specific
mpotriva celulelor imune autoreactive

Producerea
modelului
pasiv de boal
Imunizarea unor animale intermediare cu diferite
combinaii de proteine recombinate i izolarea
anticorpilor specifici produi
Transferul pasiv al acestor anticorpi n oarecii de
113

laborator
Dezvoltarea strategiilor de prevenie, diagnostic i
tratament:
- folosirea anticorpilor din diferite surse i
evaluarea mecanismelor patogenetice
specifice fiecruia (sistem complement,
granulocite prin FcR etc.)
- izolarea claselor i subclaselor din sursa de
anticorpi policlonali i investigarea meca-
nismelor efectoare prin care acetia produc
boala
- modificarea anticorpilor prin tehnica
ADN-ului recombinat (se urmrete n acest
fel modularea interaciunii cu diferite
mecanisme efectoare prin modificarea spre
exemplu a poriunii Fc a anticorpului)

n ultimii ani, un accent deosebit a fost pus pe studierea
interaciunilor dintre poriunea Fc a anticorpilor i alte proteine
efectoare din sistemul imun (receptorii pentru Fc de la nivelul celulelor
imuniti nnscute, sistemul complement). Cercetri recente au artat
c exist diferene eseniale ntre aciunea diverilor anticorpi care la
prima vedere sunt identici. Explicaia propus a fost c diferena este
datorat unor modificri postranslaionale aprute n poriunea Fc a
anticorpilor. Este vorba despre adugarea diferitelor lanuri glucidice
care fac anticorpii entiti glicoproteice. Dei acest lucru era cunoscut
114

de mai mult vreme, semnifica-ia funcional a acestui detaliu
structural a rmas un mister pn de cu-rnd. S-a dovedit recent c o
scdere a syalilarii lanului glucidic din aceas-t poriune duce la
creterea activrii celulelor efectoare cu receptror Fcgamma. De
asemenea structura primar a lanului polipeptidic care formeaz
poriunea Fc a anticorpilor este implicat n reactivitile diferite
observate la folosirea diverselor preparaii de anticorpi. De altfel
interesul tot mai mare n explicarea la nivel molecular a susceptibilitii
la anumite afeciuni a dus din ce n ce mai frecvent la obinerea
secvenelor de nucleotide care codeaz pentru anticorpi. S-a dovedit
astfel existena unei concordane ntre aceste secvene i capacitatea
lanurilor codate de a activa anumite mecanisme efectoare. Tendina
actual este de a grupa aceste polimorfisme de la nivelul ADN n
funcie de capacitatea anticorpilor de a activa/inhiba o anumit clas de
celule efectoare cu implicare n terapia afeciunilor autoimune i
cancerelor. Astfel, interesul extraordinar n gsirea combinaiilor optime
de anticorpi care s identifice celulele tumorale int i n acelai timp
s angajeze un rspuns prin modificare celui de-al doilea fragment Fab
a nceput s fie balansat de interesul pentru modifica-rea poriunii Fc
n vederea creterii efectivitii. Ideea de baz este c un sistem imun
acordat perfect reuete s distrug celulele nedorite prin implicarea
la timpul i momentul potrivit a potenialului uria pe care celu-lele
imunitii il posed. Se vorbete n acest sens despre anticorpi
trispecifici/multispecifici n care pe lng specificitatea poriunii Fab
pen-tru inta dorit, cea de-a doua poriune Fab poart specificitatea
115

agentului terapeutic (nanosfera radioactiv sau toxina; specificitate
pentru un alt re-ceptor de pe o celul citotoxic spre exemplu), iar o a
treia, patra etc. speci-ficitate este adus de
ctremodificarea/modificrile din poriunea Fc astfel nct acestea s
poat activa cu succes diverse mecanisme imune (Figura 6.1).
Figura 6.1. Mecanisme de aciune ale anticorpilor multispecifici.
Pe lng specificitatea pentru celula tumoral int i cea
pentru nanoparticule, anticorpii multispecifici posed i alte specificiti
care s le creasc capacitatea funcional benefic. Spre exemplu, prin
modificarea poriunii Fc pe partea stng a figurii, anticorpul capt
116

proprieti sporite de activare a sistemului complement care fie direct
(2) fie indirect (3) duce la distrugerea celulei canceroase/autoimune. n
plus, folosirea unei duble specificiti a poriunii variabile a
fragmentului Fab face posibil recrutarea n vecintatea tumorii a
celulelor T citotoxice (4). De asemenea, prin personalizarea
interaciunii fragmentului Fc cu celulele care poart receptori pentru
acesta (partea dreapta jos) sunt transduse semnale puternice care pot
avea ca rezultat o activare crescut a acestor celule cu producerea
speciilor reactive de oxigen i eliberarea proteazelor efectoare (5,6).
n prezent se urmrete lrgirea paletei de experimente i
metodologii care pot fi oferite la nivelul laboratorului. Numeroi
membri ai acestuia se afl n prezent n diverse laboratoare partenere
unde deprind metode i tehnici noi pe care dorim s le implementm
odat cu reintegrarea acestora n laboratorul de origine.
Dintre avantajele folosirii anticorpilor ca i ageni biologici n
tratamentul cancerului amintim:
- timpul de njumtire crescut fa de moleculele cu greutate
molecular mic ceea ce face posibil scderea dozei utilizate
- specificitatea i afinitatea mare
- multiple mecanisme de aciune care pot fi combinate (vezi anticorpi
multispecifici pentru ADCC i CDC)
- posibilitatea folosirii acestora ca i terapie complementar/alternativ
oricrei forme de terapie anti-canceroas tradiional
117

- utilizarea lor ca i vehicul specific pentru transportul diverselor
substane anticanceroase spre diverse destinaii (vezi anticorpi
bispecifici)
- utilizarea lor ca i markeri de diagnostic/prognostic pentru
diferite afeciuni.
- n anumite cazuri anticorpii pot per se s controleze creterea
tumorii prin interferarea cu cile de semnalizare celular, fie prin
inducerea apoptozei fie prin antagonizarea efectelor factorilor de
cretere [49].
Tabelul 6.2. Diferite mecanisme de aciune ale anticorpilor
monoclonali
Mecanism de aciune propus Reprezentant
ADCC Anti-CD20
CDC Anti-CD20
Inducerea apoptozei Anti-CD20
Blocarea interaciunii factorilor de cretere
cu receptorii specifici
Anti-EGFR
Blocarea fizic a dimerizrii receptorilor
pentru factorii de cretere
Anti-EGFR
Anti-Her2/neu
Inhibarea neoformrii vaselor sangvine Anti-VEGF-A
Anti-EGFR
Blocarea factorilor de cretere n forma solubil Anti-EGFR
Funcionalizarea/conjugarea cu radioizo-topi, toxine,
enzime sau cytokine
Diveri

118

Majoritatea anticorpilor monoclonali utilizai acioneaz asupra
intelor specifice prin acest mecanism; legarea concomitent a Fv
(partea a Fab) de antigenul int i a Fc de o celul cum ar fi
macrofagul sau celula NK care posed receptori pentru aceast poriune
duce la activarea celulei imune urmat de distrugerea celulei intit
specific. Cercetri recente au artat c ADCC este mai eficient la acei
indivizi care prezint anumite polimorfisme n poriunea Fc
(respondeni cu grad nalt)

119

CAPITOLUL 7.
Cromatografia i cromatofocalizarea. Principii i metode
Biomoleculele sunt purificate folosind tehnici cromatografice
care le separ potrivit diferenelor n proprietile lor specifice, astfel
cum se arat n figura 7.1.
7.1. Cromatografia de schimb ionic (Ion exchange
chromatography - IEX) separ biomolecule in funcie de variaia
suprafeei moleculare (figura 7.1.).


Gel filtrare Interaciune
hidrofob
Schimb de
ioni
Afinitate Faza revers

Figura 7.1. Principii de separare n purificarea cromatografic
IEX pentru separarea biomoleculelor a fost introdus n 1960 i
continu s joace un rol important n separarea i purificare. Astzi, IEX
este una dint tehnicile cele mai frecvent utilizate pentru purificarea de
proteine, peptide, acizi nucleici i alte biomolecule, oferind o nalt
rezoluie de separare de grup i cu ncrcri de mare capacitate. Tehnica
120

este capabil de a separa specii moleculare, care au cele mai minore
diferene de sarcin, de exemplu dou proteine care difer prin un
aminoacid. Aceste caracteristici fac IEX bine potrivit pentru captarea,
purificare intermediar ntr-un protocol de purificare tehnic i este
utilizat la purificarea microcantitilor i purificarea pentru analize a
cantitilor de ordinul kilogramelor de produs.
IEX separa moleculele pe baza diferenelor de sarcin pe
suprafa. Molecule variaz considerabil n proprietile lor de ncrcare
i expun diferite grade de interaciune cu faza fix a cromatografiei n
funcie de diferenele n sarcina lor, densitatea i distribuia sarcinii pe
suprafa. Grupurile intramoleculare care posed diferite valori pKa, n
funcie de structura acestora i micromediul chimic.
Deoarece toate moleculele cu grupri ionizabile poate fi titrate,
sarcina lor extern depinde de pH. n cazul proteinelor, care sunt
construite din mai muli aminoacizi coninnd grupri acide i bazice
slabe. Fiecare protein are propria sa ncrcare unic fa de relaia pH
care poate fi vizualizat ca o curb de titrare. Aceast curb reflect
modul de ncrcare general al modificrilor de proteine n funcie de
pH-ul mediului. Figura 7.2 ilustreaz mai multe curbe teoretice titrare
proteice (aceste curbe pot fi generate folosind o combinaie de
focalizarea izoelectric i electroforeza). Cromatografia IEX are un
avantaj deoarece relaia dintre pH i sarcina molecular extern este
specific fiecrei substane [48].


121




Figura 7.2. Curba ipotetic de titrare a proteinelor, care arat modul n
care sarcina superficial a moleculei variaz n funcie de pH.

7.2. Filtrare pe gel sau gel filtrarea.
Filtrarea pe gel, mentionat ca cromatografia de excluziune
steric SEC, separ moleculele conform diferene n dimensiune ca
acestea trec printr-un mediu de filtrare n gel ambalat n o coloan. Spre
deosebire de schimbtori de ioni sau cromatografie de afinitate,
moleculele nu se leag de mediul pentru cromatografie. Prin urmare, un
avantaj semnificativ de filtrare pe gel este c condiiile pot fi variate
pentru a se potrivi tipului de prob sau cerinele pentru purificare
ulterioar, analiz sau de depozitare fr a modifica separarea.
Filtrarea pe gel este un procedeu foarte potrivit pentru
biomolecule care pot fi sensibile la modificarea pH-ului, concentraia
ionilor metalici sau co-factori i condiiile dure de mediu. Separarea
Sarcina
superfi
cial
122

poate fi realizat n prezena ionilor eseniali sau cofactori, detergeni,
uree, guanidina clorhidrat, la tria ionic ridicat sau sczut, la 37C
sau n camera frigorific conform cerinelor experimentului. Proteine
purificate pot fi colectate n orice soluie tampon.
Acest capitol ofer sfaturi generale aplicabile pentru orice
separare filtrare gel. Un pas cheie fa de separarea de succes este
selectarea mediului corect.
Pentru a realiza o separare, filtrare pe gel, mediul este ambalat
ntr-o coloan, pentru a forma un strat tasat. Mediul este o matrice
poroas de particule sferice cu stabilitatea chimic i fizic i Inert
(lipsit de reactivitate i proprieti de adsorbie). Stratul tasat este
echilibrat cu tampon care umple porii matricei i spaiul dintre particule.
Lichide n interiorul porilor, sau faza staionar, este n echilibru cu
lichidul din afara particulei, sau faz mobil. Eantioanele sunt eluai
izocratic deci nu este nevoie de a utiliza diferite tampoane n timpul
separare. Cu toate acestea, un pas de splare folosind tampon de rulare
este, de obicei, la sfritul unei separare a elimina molecule care poate
au fost pstrate la coloan i a pregti coloan pentru o nou centrare.
Filtrare pe gel poate fi folosit direct dup schimbul de ioni,
cromatofocalizare, interaciune hidrofob, sau afinitate, deoarece
compoziia tampon nu va afecta n general, separarea final. Figura 7.3
ilustreaz procedeul de separare de filtrare pe gel [47].
123



Figura 7.3. Procesul de gel filtrare.
(A) Schema unui irag de mrgele, cu o extindere de microscopie
electronic. (B) Schema desen de molecule de prob difuzarea n porii
irag de mrgele. (C) descrierea grafic a separrii I. Proba este aplicat
pe coloan, II. Cea mai mic molecul (galben) este mai ntrziat dect
cea mai mare molecula (rou). III. Cea mai mare molecula este eluat
prima din coloan. Banda lrgit produce diluarea semnificativ a
124

zonelor de proteine n timpul cromatografie. (D) cromatogram
schematic.
7.3. Interaciunea hidrofob
Apa este un bun solvent pentru substanele polare, i un solvent
slab pentru substanele nepolare. n ap lichid o majoritate a
moleculelor de ap apar in grupuri datorit legturi de hidrogen ntre ele
nsele (Figura 7.4). Dei timpul de semidezintegrare al clusterilor
aquatici este foarte scurt, efectul net este o coeziune foarte puternic
ntre moleculele de ap, reflectat, de exemplu, printr-un punct de
fierbere ridicat.

Figura 7.4. Proprietile de solubilizare ale apei aprute n capacitatea
sa de a interaciona cu dipoli i pentru a forma legturi de hidrogen.
La o interfa aer-apa, moleculele de apa se vor aranja ntr-o
structur foarte ordonat. Aici, posibilitatea de a forma legturi de
hidrogen nu mai este n echilibru, dar este dominat de partea lichid a
interfeei. Acest lucru d natere la o structur ordonat, care se
manifest ca o tensiune de suprafa puternic. Orice lucru care
influeneaz stabilitatea apei afecteaz i tensiunea superficial.
Atunci cnd o substan hidrofob, cum ar fi o protein sau un
ligand hidrofob este scufundat n ap se ntmpl ceva analog
125

fenomenului de tensiune superficial. Moleculele de ap nu pot umezi
suprafaa substanei hidrofobe. n schimb, se formeaza un nveli foarte
ordonat n jurul substanei, din cauza incapacitii lor de a forma
legturi de hidrogen n toate direciile (figura 7.5).

Figura 7.5. Ap structurat nconjoar suprafeele hidrofobe de
liganzi i proteine. Substane hidrofobe sunt forate s fuzioneze pentru
a minimiza suprafaa total a acestor structuri (maximizarea entropiei).
Srurile sporesc interaciunea hidrofob. B) echilibru de interaciune
hidrofob este controlat n special de concentraia de sare.

Per ansamblu, toate tehnicile cromatografice prezentate mai sus
sunt o modalitate foarte eficient de a separa molecule anorganice, ct si
macromoleculele organice de interes cercetatorilor preocupai de
genetica molecular, n studii biomedicale, aplicaii biotehnologice si
nanotehnologiile viitorului.
Aceasta editie are ca auditoriu-inta tineri specialiti n biologia
molecular si genetica aplicat cu aspiraii inalte spre realizri de
performanta n domeniul ales.




126

BIBLIOGRAFIA
1. Abba M.C., Gmez M.A., Golijow C.D., (2001). HLA-DQA1 allele
typing by nonisotopic PCR-LIS-SSCP. Braz. J . Med. Biol. Res.
J ul;34(7):867-9.
2. Alua M., Simon S., (2012). Metode experimentale avansate pentru
studiul si analiza bio-nano-sistemelor. Cluj-Napoca: Casa Crii de
tiin, ISBN 978-606-17-0115-5.
3. Baas B. J ., Denisov I. G., Sligar S. G., (2004). Homotropic
cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 n a nanoscale
native bilayer environment, Archives of Biochemistry and Biophysics,
430(2), 218-28.
4. Baker S. E., Hopkins R. C., Blanchette C. D., Walsworth V. L.,
Sumbad R., Fischer N. O., Kuhn E. A., Coleman M., Chromy B. A.,
Letant S. E., Hoeprich P. D., Adams M. W., Henderson P. T., (2009).
Hydrogen production by a hyperthermophilic membrane-bound
hydrogenase n water-soluble nanolipoprotein particles. J ournal of the
American Chemical Society, 131(22), 7508-7509.
5. Baker P., Sawa Y., Shibata H., Sedelnikova S., Rice D., (1998).
Analysis of the structure and substrate binding of Phormidium
lapideum alanine dehydrogenase. Nature Structural Biology, 5, 561-
67.
6. Barroso A, Dunner S, Can J ., (1998). Technical note: Detection of
bovine kappa-casein variants A, B, C, and E by means of polymerase
chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-
SSCP). J . Anim. Sci. J un;76(6):1535-8.
7. Bayburt T. H., Grinkova Y. V., Sligar S. G., (2006). Assembly of
single bacteriorhodopsin trimers n bilayer nanodiscs, Archives of
Biochemistry and Biophysics, 450(2), 215-22.
8. Blanchette C. D., Cappuccio J . A., Kuhn E. A., Segelke B. W., Benner
W. H., Chromy B. A., Coleman M. A., Bench G., Hoeprich P. D.,
Sulchek T. A., (2008). Atomic force microscopy differentiates
discrete size distributions between membrane protein containing and
empty nanolipoprotein particles, Biochimica et Biophysica Acta,
1788(3), 724-31.
9. Billard-Pomares T, Tenaillon O, Le Nagard H, Rouy Z, Cruveiller S,
Mdigue C, Arlet G, Denamur E, Branger C., (2011). Complete
127

nucleotide sequence of plasmid pTN48, encoding the CTX-M-14
extended-spectrum -lactamase from an Escherichia coli O102-
ST405 strain. Antimicrob. Agents Chemother.;55:1270-1273.
10. Boonstra B., Rathborne D. A., French C. E., Walker E. H., Bruce N.
C., (2000). Cofactor regeneration by a soluble pyridine nucleotide
transhydrogenase for biological production of hydromorphone.
Applied Enviromental Microbiology, 66, 5161-66.
11. Brown T.A., (2002). Genomes. 2nd edition. Oxford: Wiley-Liss.
12. Cabello C. M., Warner B. Bair W. B., Bause A. S., Wondrak G. T.,
(2009). Antimelanoma activity of the redox dye DCPIP (2,6-
Dichlorophenolindophenol) is antagonized by NQO1, Biochemical
Pharmacology, 78(4), 344-54.
13. Caetano-Anolls G, Bassam BJ , Gresshoff PM., (1991). DNA
amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide
primers. Biotechnology (NY). 1991 J un; 9(6):553-7.
14. Chibata I., Tosa T., Sato T., (1976). Production of L-aspartic acid by
microbial cells entrapped n polyacrylamide gels. Methods n
Enzymology, 44, 739-746.
15. Conde J ., de la Fuente J . M., Baptista P. V., (2010). RNA
quantification using gold nanoprobes - application to cancer
diagnostics. J ournal of Nanobiotechnology, 8:5.
16. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Hgg P., Abdulkarim F., Isaksson
L.A., (2004). Generation and characterization of functional mutants in
the translation initiation factor IF1 of Escherichia coli. Eur. J .
Biochem. Feb;271(3):534-44.
17. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Isaksson L.A., (2005). In vivo
involvement of mutated initiation factor IF1 in gene expression
control at the translational level. FEBS Lett. Feb 14;579(5):995-1000.
18. Croitoru V., Semrad K., Prenninger S., Rajkowitsch L., Vejen M.,
Laursen B.S., Sperling-Petersen H.U., Isaksson L.A., (2006). RNA
chaperone activity of translation initiation factor IF1. Biochimie.
Dec;88(12):1875-82
19. Dakin E.E., Avise J .C., (2004). Microsatellite null alleles in parentage
analysis. Heredity (Edinb). Nov;93(5):504-9.
20. Deconttignies-Le Marchal P., Calderon-Seguin R., Vandecasteele
J .,P., Azerad R., (1979). Synthesis of L-tryptophan by immobilized
128

Escherichia coli cells. European J ournal of Applied Microbiology
and Biotechnology, 7, 33-44.
21. Delforge D., Devreese B., Dieu M., Delaivre E., Beeumen J ., Remacle
J ., (1997). Identification of lysine 74 n pyruvate bineding of alanine
dehydrogenase from Bacillus subtilis. J ournal of Biological
Chemistry, 272, 2276-84.
22. Ghosh M., Singh A. T., Xu W., Sulchek T., Gordon L. I., Ryan R. O.,
(2010). Curcumin nanodisks: formulation and characterization,
Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine.
23. Heaton MP, Harhay GP, Bennett GL, Stone RT, Grosse WM, Casas
E, Keele J W, Smith TP, Chitko-McKown CG, Laegreid WW. (2002)
Selection and use of SNP markers for animal identification and
paternity analysis in U.S. beef cattle. Mamm. Genome.
May;13(5):272-81.
24. Honorat A., Monot F., Ballerini D., (1990). Synthesis of L-alanine
and L-valine by enzyme system from Bacillus megaterium. Enzyme
and Microbial Technology, 12, 515-20.
25. Honorat-Pascal A., Monot F., Ballerini D., (1990). Coparative stady
of the enzymatic synthesis of L-valine by purified enzymes, crude
extract or permeabilized cells from Bacillus megaterium. Applied
Microbiology and Biotechnology, 34, 236-41.
26. Holley R.W., Everett G.A., Madison J .T, Zamir A., (1965).
Nucleotide Sequences In The Yeast Alanine Transfer Ribonucleic
Acid. J . Biol. Chem. 240 (5): 21228.
27. Hummel W., Kula M-R., (1989). Dehydrogenases for the synthesis of
chiral compounds. European J ournal of Biochemistry, 184, 1-13.
28. Fischer N.O., Infante E., Ishikawa T., Blanchette C.D., Bourne N.,
Hoeprich P.D., Mason P.W., (2010). Conjugation to nickel-chelating
nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of
subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis, Bioconjugate
Chemistry, 21(6), 1018-22.
29. Fukui S., Ikeda S., Fujimura M., Yamada H., Kumagai H., (1974).
Production of L-tryptophan, L-tyrosine and their analogues by
immobilized tryptophanase and immobilized -tyrosinase. European
J ournal of Applied Microbiology, 1, 25-39.
129

30. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of
Escherichia coli cells containing aspartase activity with polyurethane
and its application for L-aspartic acid production. Applied
Enviromental Microbiology, 42, 672-76.
31. Fusee M., Weber J ., (1984). Immobilization by polyurethane of
Pseudomonas dacunhae cells containing L-aspartat -decarboxylase
activity and application to L-alanine production. Applied
Enviromental Microbiology, 48, 694-98.
32. Iacobazzi V, Castegna A, Infantino V, Andria G.(2013).
Mitochondrial DNA methylation as a next-generation biomarker and
diagnostic tool. Mol. Genet. Metab. Sep-Oct;110(1-2):25-34.
33. J effreys A.J ., Royle N.J ., Patel I., Armour J .A., MacLeod A., Collick
A., Gray I.C., Neumann R., Gibbs M., Crosier M., (1991). Principles
and recent advances in human DNA fingerprinting. EXS.;58:1-19
34. Karsten W.E., Viola R.E., (1991). Kinetic studies of L-aspartase from
Escherichia coli: pH-dependent activity changes. Archives of
Biochemistry and Biophysics, 287, 60-67.
35. Katayama H., Wang J ., Tama F., Chollet L., Gogol E. P., Collier R.
J ., Fisher M. T., (2010). Three-dimensional structure of the anthrax
toxin pore inserted into lipid nanodiscs and lipid vesicles,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 107(8),
3453-57
36. Katoh R., Nagata S., Ozawa A., Ohshima T., Kamekura M., Misono
H., (2003). Purification and characterization of leucine dehydrogenase
from an alkaliphilic halophile, Natronobacterium magadii MS-3.
J ournal of Molecular Catalysis, 23, 231-38.
37. Khler G, Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells
secreting antibody of predefined specificity. Nature. Aug
7;256(5517):495-7.
38. Landegren U., (1996). The challengers to PCR: a proliferation of
chain reactions. Curr Opin Biotechnol. 1996 Feb;7(1):95-7.
39. Liu Q., Liu A., Gao F., Weng S., Zhong G., Liu J ., Lin X., Lin J .H.,
Chen X., (2011) Coupling technique of random amplified
polymorphic DNA and nanoelectrochemical sensor for mapping
pancreatic cancer genetic fingerprint. Int. J . Nanomedicine.;6:2933-9.
130

40. Maxam A.M, Gilbert W., (1992). A new method for sequencing
DNA. 1977. Biotechnology.; 24:99-103.
41. Mondalek F. G., Ponnurangam S., Govind J ., Houchen C., Anant S.,
Pantazis P., Rama P Ramanujam R. P., (2010). Inhibition of
angiogenesis- and inflammation-inducing factors n human colon
cancer cells in vitro and in ovo by free and nanoparticle-encapsulated
redox dye, DCPIP, J ournal of Nanobiotechnology, 8:17, 1-9.
42. Monot F., Benoit Y., Lemal J ., Honorat A., Ballerini D., (1988).
Simultaneous production of amino acid dehydrogenase and glucose
dehydrogenase by Bacillus megaterium and their utilization for L-
valine synthesis with NADH regeneration. Biocatalysis, 2, 161-74.
43. Mueller U.G, Wolfenbarger L.L. (1999). AFLP genotyping and
fingerprinting. Trends Ecol. Evol. Oct;14(10):389-394.
44. Mullis K.B., (1990). Target amplification for DNA analysis by the
polymerase chain reaction. Ann. Biol. Clin. (Paris).;48(8):579-82.
45. Nagata S., Misono H., Nagasaki S., Esaki N., Tanaka H., Soda K.,
(1989). Thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus sp.DSM730:
gene cloning, purification, and characterization. Biochemistry, 71,
559-63.
46. Nagata S., Tanizawa K., Esaki N., Sakamoto Y., Ohshima T., Tanaka
H., Soda K., (1988). Gene cloning and sequence determination of
leucine dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus and
structural comparison with other NAD(P)+-dependent
dehydrogenases. Biochemistry, 27, 9056-62.
47. Nagore L.I., Nadeau R.J ., Guo Q., J adhav Y.L., J arrett H.W., Haskins
W.E. (2013). Purification and characterization of transcription factors.
Mass Spectrom. Rev. Sep;32(5):386-98
48. Nakatani N., Kozaki D., Mori M., Tanaka K. (2012). Recent progress
and applications of ion-exclusion/ion-exchange chromatography for
simultaneous determination of inorganic anions and cations. Anal.
Sci.;28(9):845-52
49. Nakamura T., Mizuno S. (2010). The discovery of hepatocyte growth
factor (HGF) and its significance for cell biology, life sciences and
clinical medicine. Proc. J pn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci.;86(6):588-
610
131

50. Norbert M., Brunhuber W., Blanchard J .S., (1994). The biochemistry
and enzymology of amino acids dehydrogenases. Critical Reviews in
Biochemistry and Molecular Biology, 29, 415-67.
51. Oda M. N., Hargreaves P. L., Beckstead J . A., Redmond K. A., van
Antwerpen R., Ryan R. O., (2006). Reconstituted high density
lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B,
J ournal of Lipid Research, 47(2), 260-67.
52. Ohshima T., Nishida N., Bakthavatsalam S., Kataoka K., Takada H.,
Yoshimura T., Esaki N., Soda K., (1994). The purification,
characterization, cloning and sequencing of the gene for a halostable
and thermostable leucine dehydrogenase from Thermoactinomyces
intermedius. European J ournal of Biochemistry, 222, 305-12.
53. Ohshima T., Wandrey C., Conrad D., (1988). Continous production of
3-fluoro-L-alanine with alanine dehydrogenase. Biotechnology and
Bioengineering, 34, 394-97.
54. Ohshima T., Wandrey C., Kula M-R., Soda K., (1985). Impovement
for L-leucine production n a continously operated enzyme membrane
reactor. Biotechnology and Bioengineering, 26, 1616-18.
55. Oka M., Yang Y.S., Nagata S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989).
Overproduction of thermostable leucine dehydrogenase of Bacillus
stearothermophilus and its one-step purification from recombinant
cells of Escherichia coli. Biotchnology and Applied Biochemestry,
11, 307-11.
56. Park D.J ., (2004). 3' RACE LaNe: a simple and rapid fully nested
PCR method to determine 3'-terminal cDNA sequence. Biotechniques.
Apr;36(4):586-8, 590.
57. Patra H.K., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A., (2007).
Cell selective response to gold nanoparticles, Nanomedicine:
Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3, 11119
58. Pierrel J . (2012). An RNA Phage Lab: MS2 in Walter Fiers' laboratory
of molecular biology in Ghent, from genetic code to gene and
genome, 1963-1976. J . Hist. Biol.;45(1):109-38
59. Rasmussen L.C., J ensen J .M., Croitoru V., Sperling-Petersen H.U.,
Mortensen K.K., (2007). Production and epitope characterization of
mAbs specific for translation factor IF1. Biochem. Biophys. Res.
Commun. Dec 7;364(1):72-8.
132

60. Ristic Z., Vitali M., Duci A., Goetze C., Kemnitz K., Zuschratter W.,
LillH., Bald D., (2009). Two-stimuli manipulation of a biological
motor, J ournal of Nanobiotechnology, 7:3.
61. Ryan R. O., (2010). Nanobiotechnology applications of reconstituted
high density lipoprotein, J ournal of Nanobiotechnology, 8:28.
62. Sanger F., Nicklen S., Coulson AR., (1977) DNA sequencing with
chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
Dec;74(12):5463-7.
63. Schenkel F.S., Miller S.P., Ye X., Moore S.S., Nkrumah J .D., Li C.,
Yu J ., Mandell I.B., Wilton J .W., Williams J .L., (2005). Association
of single nucleotide polymorphisms in the leptin gene with carcass
and meat quality traits of beef cattle. J . Anim. Sci. Sep;83(9):2009-20.
64. Schtte H., Flossdorf J ., Sahm H., Kul, M. R., (1976). Purification and
properties of formaldehyde dehydrogenase and fromate
dehydrogenase from Candida boidinii. European J ournal of
Biochemistry, 62, 151.
65. Siranosian J .K., Ireton, K., Grossamn D.A., (1993). Alanine
dehydrogenase (ald) is required for normal sporulation in Bacillus
subtilis. J ournal of Bacteriology. 175, 6789-96.
66. Sondi I., and Salopek-Sondi B., (2004). Silver nanoparticles as
antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-
negative bacteria, J ournal of Colloid and Interface Science, 275, 177
82.
67. Speshock J . L., Murdock R. C., Braydich-Stolle L. K., Schrand A. M.,
Hussain S. M., (2010). Interaction of silver nanoparticles with
Tacaribe virus, J ournal of Nanobiotechnology, 8:19.
68. Starzl T.E., Fung J .J ., (1986). ORTHOCLONE OKT3 in Treatment of
Allografts Rejected Under Cyclosporine-Steroid Therapy. Transplant
Proc. Aug;18(4):937-941.
69. Strebhardt K, Ullrich A. (2008) Paul Ehrlich's magic bullet concept:
100 years of progress. Nat. Rev. Cancer. J un;8(6):473-80.
70. Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for
continous production of L-aspartic acid by immobilized Escherichia
coli Cells. Applied Microbiology, 27, 886-89.
133

71. Vieira D. B., Carmona-Ribeiro A. M., (2008). Cationic nanoparticles
for delivery of amphotericin B: preparation, characterization and
activity in vitro, J ournal of Nanobiotechnology, 6:6.
72. Vieira J , Messing J . (1982). The pUC plasmids, an M13mp7-derived
system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic
universal primers. Gene. Oct;19(3):259-68.
73. Weers P. M., Narayanaswami V., Ryan R. O., (2001). Modulation of
the lipid binding properties of the N-terminal domain of human
apolipoprotein E3, European J ournal of Biochemistry, 268, 3728-35.
74. Welsh J ., McClelland M., (1991). Genomic fingerprinting using
arbitrarily primed PCR and a matrix of pairwise combinations of
primers. Nucleic Acids Res. Oct 11;19(19):5275-9
75. Xu J ., Croitoru V., Rutishauser D., Cheng Q., Arnr E.S., (2013).
Wobble decoding by the Escherichia coli selenocysteine insertion
machinery. Nucleic Acids Res. 2013 Aug 27. [Epub ahead of print].