1

2.7. METODE ANALITICE UTILIZATE N CADRUL TESTRII OMG

Tipurile de metode utilizate n mod curent pentru testarea OMG, precum si avantajele si
dezavantajele celor mai utilizate dintre acestea sunt prezentate in tabelele de mai jos.
Caracteristicile metodelor bazate pe analiza ADN-ului si proteinelor
Caracteristica Met. bazate pe analiza proteinelor Met. bazate pe analiza ADN-
ului
Usurin| n utilizare Medie pentru ELISA
Testele rapide sunt extrem de
expeditive
Metodele bazate pe PCR
prezint o dificultate mai mare
pentru operator
Complexitate tehnologic Medie pentu ELISA
Foarte simpl pentru testele rapide
nalt, mai ales pentru real-time
PCR si microarray
Durat 1-2 zile pentru ELISA; n cazul
kiturilor comerciale timpul de
execu|ie este de doar cteva ore
Cteva minute pentru testele rapide
1-2 zile, n func|ie de modul n
care este conceput protocolul
integrat de testare
Cost/prob Redus Ridicat, n special pentru real-
time PCR si microarray
Versatilitate Anticorpii specifici sunt dificil de
sintetizat
n cazul ELISA se utilizeaz
aporape exclusiv kituri comerciale
n cazul testelor rapide se
utilizeaz exclusiv kituri comerciale
Primeri si sondele sunt foarte
usor de ob|inut
Ponderea cea mai mare o au
probabil protocoalele concepute
n laborator
Sunt disponibile kituri
comerciale ns protocolale de
lucru pot fi foarte usor modificate
sau adaptate
Utilizare pentru det.
cantitative
ELISA poate fi utilizat ca metod
cantitativ
Testele rapide au fost considerate
metode calitaitve; recent a fost
introdus primul sistem cantitativ
bazat pe utilizarea stripurilor
Real-time PCR este cea mai
performant metod pentru
testarea cantitativ
Utilizare pe teren Posibil n cazul testelor rapide. Nu este posibil
Aplicabilitate Poate fi analizat o gam larg de
proteine, dar metodele pot fi aplicate,
n general, n cazul produselor
proaspete si mai pu|in n cazul celor
procesate.
Poate fi aplicat chiar si
produselor intens procesate,
moleculele de ADN fiind mult
mai stabile dect proteinele
Specificitate Bun Mai mare dect la cealalt
2
O mare parte dintre probele care fac obiectul testrilor OMG este reprezentat de matrici
alimentare. Acestea se caracterizeaz de obicei printr-un intens grad de procesare, n special sub influen|a
temperaturilor ridicate (Endres, 2001). Datorit faptului c termostabilitatea ADN-ului este mai bun
dect a proteinelor (Anklamet al., 2002, n Tavernierset al., 2005; Gachet et al., 1999), reac|ia PCR este
cea mai potivit tehnic pentru detec|ia, identificarea si cuantificarea OMG-urilor (Anklamet al., 2002, n
Angonesi Brodet al., 2007; Tavernierset al., 2005; Berdal si Holst-J ensen, 2001).
Aceast tehnologie prezint deci o sensibilitate, specificitate si eficien| mai mare dect n cazul
tehnicilor bazate pe analiza proteinelor (Holst-Jensenet al., 2003, n Smith si Maxwell, 2007; Anklamet
al., 2002, n Tavernierset al., 2005; Gachet et al., 1999).
Metode disponibile pentru testrile OMG
Surse: Siseaet al. (2008); Tripathi (2005); Zafar et al. (2004); Ahmed (2002).
C
a
t
e
g
o
r
i
i

d
e

m
e
t
o
d
e

b
a
z
a
t
e

p
e
:
analiza fenotipica: biotestele
analiza proteinelor (testele imunologice) Western blot
ELISA
lateral flow strips
analiza ARN-ului (ex. NASBA)
analiza AND-ului tehnici de hibridare Southern blot
microarray
tehnici de amplificare PCR clasic
nested PCR
consensus PCR
PCR multiplex
real-time PCR
tehnici de secventiere
tehnici combinate(ex. PCR multiplex+microarray)
alte principii cromatografie
spectroscopie
biochipuri
2.7.1. Detecia OMG-urilor cu ajutorul biotestelor
Detec|ia OMG-urilor pe baza biotestelor este posibil doar n cazul diferitelor tipuri de rezisten|
(ex. la erbicide, insecte sau antibiotice) (Zafar et al., 2004).
Testele de germinare presupun folosirea unor medii simple care con|in erbicidul sau antibioticul
pentru care se testeaz rezisten|a. n cazul n care erbicidul nu se adaug n mediu, acesta va fi aplicat prin
pulverizare asupra plntu|elor. n condi|iile descrise, indivizii rezisten|i se vor dezvolta normal, fiind
considera|i pozitivi din punct de vedere al prezen|ei transgenei.
n cazul testrii rezisten|ei la atacul insectelor, larvele speciilor |int sunt lsate libere pentru a se
hrni cu plantele provenite din lotul de semin|e testate. Se poate concluziona c plantele sunt transgenice
n cazul n care larvele nu supravie|uiesc testului.
categorie
Sensibilitate Mai redus dect cea a tehnicilor
bazate pe analiza ADN-ului, n
special n cazul matricilor procesate
Cea mai mare sensibilitate o
prezint real-time PCR-ul
3
Aceste teste sunt usor de aplicat, nu necesit dotare special, sunt relativ ieftine, dar necesit timp
si se pot folosi doar n cazul loturilor de semin|e germinabile sau plantelor care produc astfel de semin|e.
Trebuie de asemenea s se aib n vedere c propriet|ile germinative pot determina ob|inerea unor
rezultate eronate, iar zigo|ia caracterului transgenic nu poate fi stabilit.
2.7.2. Detecia OMG-urilor prin analiza proteinelor
Dintre metodele bazate pe analiza proteinelor, doar cele imunologice sunt folosite n practica
testrii OMG. Acestea au la baz interac|iunea anticorp-antigen, proteina rezultat n urma expresiei
transgenei n organismul gazd reprezentnd antigenul.
Teoretic, testele imunologice pot fi utilizate pentru o larg varietate de molecule |int. n practic
ns, exist trei limite majore ale acestor metode:
necesitatea prezen|ei n proba analizat a proteinelor cu structuri ter|iare si cuaternare intacte; de obicei,
n cazul matricilor procesate intervine denaturarea proteinelor, condi|ia neputnd fi astfel satisfcut;
disponibilitatea anticorpilor specifici; acestia sunt mult mai greu de sintetizat comparativ cu primerii
utiliza|i n cadrul metodelor bazate pe analiza ADN-ului;
posibilitatea ca ADN-ul transgenic prezent n prob s nu fie exprimat uniform n timp si n toate
organele plantei.
Datorit primului dezavantaj men|ionat, metodele de testare imunologice se pot utiliza, n
general, doar n cazul probelor proaspete sau cu grad redus de procesare (Zafar et al., 2004), iar n
analizele de rutin se utilizeaz exclusiv kituri comerciale.
Exist dou formate ale imunotestelor, ELISA si teste rapide de tipul stripurilor (lateral flow
strips), care difer n principal prin gradul de complexitate si performan|a rezultatelor, cele dou
caracteristici fiind invers propor|ionale.
Tehnica ELISA este utilizat, n general, pentru detec|ie calitativ sau stabilirea nivelului de
expresie proteic. Principiul ELISA cu cea mai larg aplicabilitate n testarea OMG, sandwich ELISA,
utilizeaz un anticorp de captur, imobilizat pe o suprafa| solid, si un anticorp de detec|ie marcat. Dac
proteina de interes (antigenul) este prezent n extractul testat, aceasta va fi legat de anticorpii care
cptusesc pere|ii godeului de analiz. Urmeaz apoi legarea la protein a celui de-al doilea set de
anticorpi.
n urma unei reac|ii enzimatice de culoare, anticorpii marca|i coloreaz mediul de reac|ie, fiind
astfel indicat si prezen|a proteinei transgenice. Desi ELISA poate fi utilizat pentru cuantificare
(Corbisier et al., 2005; Querci et al., 2005), n practic, aplica|iile n aceast direc|ie sunt foarte restrnse.
Corbisier et al. (2005), Querci et al. (2005) si Eyquem (2004) au descris si demonstrat modul de utilizare
a kitului GMO Food Ingredient Testing (noua denumire GMOChek RUR Soya Test) produs de Strategic
Diagnostics (http://www.sdix.com) si validat de J RC pentru cuantificarea proteinei EPSPS n diferite
frac|iuni alimentare de soia (Lippet al., 2002, n Corbisier et al., 2005, si Strategic Diagnostics, 2004) si
alimente usor procesate, dar nerecomndat pentru detec|ia proteinei de interes n stare denaturat. Acesta
este probail si motivul pentru care rezultatele au fost negative n cazul probelor tratate termic la
temperaturi ridicate (Corbisier et al., 2005).
Stave (1999) afirm c detec|ia proteinelor denaturate este posibil utiliznd anticorpii
monoclonali, dar cuantificarea rmne n continuare foarte dificil n cazul alimentelor procesate (Debode
et al., 2007).
Sandwich ELISA
Principiul metodei sandwich ELISA.
Stripurile reprezint o form simplificat a testului ELISA, care nlocuieste godeurile cu
membrane nitrocelulozice (stripul propriu-zis) n care sunt ncorpora|i anticorpi dubli, specifici proteinei
analizate si marca|i cu un reactiv colorat.
Testarea se face prin introducerea stripului ntr-un recipient ce con|ine extract din planta
analizat. Dac proteina de interes este prezent, aceasta va fi legat de anticorpii specifici marca|i.
4
Complexul migreaz apoi, prin capilaritate, de-a lungul membranei nitrocelulozice poroase. Pe direc|ia de
migrare sunt plasate dou zone de captur, una pentru structurile anticorp-antigen, iar cealalt pentru
anticorpii marca|i liberi. Prezen|a celei de a doua linii (controlul pozitiv) pe membran indic o prob
negativ, iar prezen|a ambelor linii indic un rezultat pozitiv. Acest sistem ofer rezultate calitative n
doar cteva minute, testele fiind considerate ieftine, usor de efectuat si foarte potrivite pentru etapa de
screening (Van Duijn et al., 2002, n Van den Bulcke et al., 2005), domeniu n care si-au gsit o larg
aplicabilitate, spre deosebire de ELISA. Dup cum s-a men|ionat mai sus, EnviroLogix a introdus recent
sistemul QuickScan care, n combina|ie cu stripurile clasice, poate oferi rezultate cantitative n cazul
analizei loturilor de boabe/semin|e (Envirologix, 2009).
Principalii productori de kituri imunologice destinate testrii OMG sunt:
EviroLogix (http://envirologix.com/artman/publish/index.shtml), Strategic Diagnostics, Romer Labs
(http://www.romerlabs.com/romer.htm) si Agdia (http://www.agdia.com).
2.7.3. Testarea OMG bazat pe analiza ADN-ului
Reacia PCR clasic i real-time
Reac|ia PCR permite amplificarea selectiv, ntr-un numr foarte mare de copii, a unei secven|e
ADN prezent ntr-o propor|ie relativ redus n cadrul unui amestec complex de fragmente ADN (Zafar et
al., 2004). Analiza produsilor rezulta|i prin amplificare, n cadrul unei reac|ii PCR clasie, permite
formularea unei concluzii calitative (da sau nu) asupra prezen|ei OMG-urilor n proba testat. n
practic, evaluarea ampliconilor se face, n general, prin separare electroforetic n gel de agaroz,
marcare cu EtBr, vizualizare n preze|a luminii UV si compararea cu probe standard. Pentru ob|inerea
informa|iilor cantitative referitoare la con|inutul de acizi nucleici este utilizat tehnica real-time PCR.
Caracteristicile acestor dou metode, precum si particularit|ile care trebuie avute n vedere n contextul
analizelor OMG, vor fi prezentate n subcapitolele urmtoare.
Microarray
Numrul evenimentelor de transformare la plantele de cultur este n continu crestere,
diversificndu-se totodat si elementele genetice utilizate. Ca urmare, metodologia de detec|ie si
identificare folosit n prezent se va confrunta cu o serie de probleme esen|iale. Spre exemplu,
screeningul nu va mai fi posibil utiliznd doar un numr redus (1-3) de reac|ii PCR (Xuet al., 2006). n
acest context, o metodologie care s permit identificarea rapid a tuturor elementelor necesare este
amplificarea PCR multiplex. Un inconvenient care apare ns n acest caz este faptul c metoda
conven|ional de confirmare a produsilor PCR (i.e. electroforeza) este mai dificil de aplicat (Demekeaet
al., 2002, n Xuet al., 2006; Permingeat et al., 2002; Matsuokaet al., 2002), alternativa fiind reprezentat
de microarray. Astfel, amplificarea PCR multiplex amplificarea concomitent a mai multor secven|e
|int combinat cu detec|ia microarray reprezint cel mai bun candidat pentru o strategie eficient,
capabil s acopere o gam ct mai larg de secven|e |int si care s permit identificarea usoar a
secven|elor amplificate.
Un sistem microarray include mai multe zone de reac|ie (spoturi) alctuite din sonde (fragmente)
oligonucleotidice specifice, fiind astfel posibil detec|ia simultan a unui numr foarte mare de secven|e
de interes. Majoritatea aplica|iilor microarray sunt destinate analizelor de expresie genic, identifcrii
polimorfismelor si genotiprii.
Tehnologia microarray, inclus n clasa microsistemelor analitice, deriv din blottinguri si
utilizeaz principiul clasic al hibridrii moleculare ntre dou fragmente complementare. ADN-ul
genomic este izolat din proba analizat si amplificat prin PCR, iar ulterior ampliconii hibrideaz sonde
oligonucleotidice (Xuet al., 2006) atasate pe suporturile microscopice solide (cipuri) de sticl, material
plastic sau silicon (Deisingh si Badrie, 2005). n sistemul clasic, numrul sondelor este foarte mare, chiar
de ordinul zecilor de mii, determinarea se face n urma unor reac|ii fluorimetrice sau colorimetrice, iar
analiza datelor este foarte complex. Acest sistem permite realizarea unor economii de timp, men|innd
ns ridicate precizia, specificitatea si reproductibilitatea (Deisingh si Badrie, 2005).
5
Reac|iile multiplex combinate cu detec|ia microarray permit determinarea simultan a prezen|ei
sau absen|ei unui set mare de secven|e de interes (Xu et al., 2006; Lauter, 2001, n Deisingh si Badrie
2005), oferind posibilitatea realizrii ntr-o singur etap, a detec|iei taxonilor, screeningului, precum si
identificarea evenimentelor de transformare. Cipurile ADN reprezint probabil si cea mai eficient
modalitate de identificare precis a evenimentelor de transformare care includ mai multe inserturi
(stacked events) datorit posibilit|ii de detec|ie concomitente a unui mare numr de secven|e genice.
Primul kit de detec|ie a OMG-urilor cu ajutorul cipurilor a fost creat de GeneScan
(http://www.genescan.de/en.aspx). Un alt exemplu din aceast categorie este DualChip GMO Kit V2.0,
produs de Eppendorf (http://www.eppendorf.com/ int/?l=1&action=start). Acest kit permite testarea
calitativ simultan pentru mai multe elemente genetice comune sau specifice diferitelor PMG-uri
(Eppendorf, 2008). Aplica|ia presupune executarea a trei seturi de amplificri PCR multiplex (un set
pentru identificarea taxonilor, care include sapte reac|ii; un set pentru screening OMG, care include
detec|ia a 12 elemente; un set pentru identificarea OMG-urilor, care include detec|ia a 11 elemente) si o
reac|ie de control a contaminrii cu CaMV, urmat de hibridarea ampliconilor marca|i (primerii utiliza|i
pentru amplificare sunt biotinila|i) pe un singur cip ADN care con|ine sonde complementare acestora.
Ampliconii sunt detecta|i colorimetric utiliznd principiul Silverquant, patentat de Eppendorf.
Alte modele pentu detec|ia OMG-urilor utiliznd tehnica microarray au fost
descrise de Engel et al. (2006), Moenset al. (2005), Xuet al. (2006), Germini et al. (2004) si Rudi et al.
(2003).
PCR-ELISA
O alt metodologie cu capacitate mare de procesare si poten|ial pentru automatizare este PCR-
ELISA (Brunnert et al., 2001, n Deisingh si Badrie, 2005), tehnic ce are la baz hibridarea specific cu
o sond marcat cu digoxigenin (format ELISA) a unui produs PCR biotinilat si imobilizat. Detec|ia are
loc dup reac|ia colorimetric n care este implicat digoxigenina.
Aplica|iile de acest fel sunt ns reduse ca numr, fiind potrivite doar pentru etapa de screening din cadrul
testrii OMG (ex. Vollenhofer et al., 1999, n Deisingh si Badrie, 2005, sau Petit et al., 2003). R-Biofarm
(http://www.r-biopharm.com/index.php?) ofer un astfel de kit comercial pentru detec|ia promotorului
35S si a terminatorului nos (SureFood GMO 35S/NOS Screening) n diferite tipuri de probe (vezi R-
Biofarm, 2009).
2.7.4. Alte principii de analiz a OMG-urilor
n cazul n care compozi|ia sau structura ingredientelor derivate din PMG-uri (ex. acizi grasi sau
trigliceride) este modificat, metode bazate pe cromatografie pot fi utilizate pentru detec|ia diferen|elor
din profilul compozi|iei chimice (Anklamet al., 2002, n Huang si Pan, 2005; Zafar et al., 2004). Aceast
posibilitate a fost demonstrat prin analiza uleiurilor ob|inute din rapi|a MG. Asfel, pentru investigarea
amprentei trigliceridelor a fost utilizat cromatografia lichid de nalt performan| (high performance
liquid cromatography/HPLC) si ionizarea chimic la presiune atmosferic combinat cu spectrometria de
mas (atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry/APCI-MS), iar cuantificarea s-a fcut
cu un detector cu ionizare n flacr (flame ionization detector/FID).
Utiliznd spectroscopia NIR (near infrared), se pot detecta anumite modificri genetice care
altereaz structura morfologic a plantelor, fr ns a modifica n mod semnificativ con|inutul de
proteine si uleiuri (ex. soia RR) (Anklamet al., 2002, n Huang si Pan, 2005; Zafar et al., 2004).
Posibilitatea identificrii unui con|inut redus de OMG-uri este ns limitat, ca si n cazul metodelor
cromatografice.
Alte metode de analiz OMG, majoritatea aflate n faz experimental sau utilizate la scar foarte
redus, sunt descrise de Obeidet al. (2004) si Garcia-Canaset al. (2004) (electroforeza capilar cuplat
cu fluorescen| indus de laser), J astrzebska et al. (2003) (wavelength-dispersive X-ray
fluorescence/WDXRF), Moenset al. (2005), Mannelli et al. (2003a; 2003b) si Feriottoet al. (2003; 2002)
(biosenzori/biocipuri) (Deisingh si Badrie, 2005; Huang si Pan, 2005).
6
2.8. TESTAREA OMG CALITATIV BAZAT PE TEHNICA PCR
2.8.1. Utilizarea reaciei PCR n cadrul testrii OMG
Crearea reac|iei n lan| a polimerazei, de ctre Mullis si colaboratorii si, n 1983, a revolu|ionat
ramurile moleculare ale biologiei si medicinei (Saiki et al. 1988, n Somma si Querci, 2004b), nainte de
apari|ia acestei tehnici putnd fi ob|inute doar cantit|i infime dintr-un fragment |int de ADN. Reac|ia
PCR permite amplificarea enzimatic in vitro a unei regiuni specifice de ADN, localizat ntre dou
secven|e ADN cunoscute, fcnd astfel posibil multiplicarea unei singure copii a fragmentului de interes
n peste un milion de copii, n doar cteva ore. Tehnica PCR este esen|ial pentru multe procedee de
analiz molecular: clonarea unor fragmente specifice de ADN, detec|ia si identificarea genelor n
vederea diagnosticrii sau investigrii criminalistice, analiza modelelor de expresie genic. n ultimii ani,
reac|ia PCR a fcut posibil ini|ierea cercetrilor n domenii noi ca: controlul autenticit|ii produselor
alimentare, monitorizarea OMG-urilor, evaluarea comtaminrii microbiologice.
Testele calitative ofer informa|ii referitoare la prezen|a/absen|a ADN-ului de interes din proba
analizat. Testarea OMG calitativ const, de obicei, n parcurgerea mai multor etape analitice, fiecare
corespunznd unei amplificri PCR. Prima dintre acestea presupune detec|ia ADN-ului specific taxonului
din care deriv OMG-ul analizat, secven|a |int apar|innd n acest caz unei gene caracteristice speciei
(gen de referin|) respective. Aceast analiz are rolul de
a elimina posibilitatea ob|inerii unor rezultate fals negative ce pot apare n cazul n care extractul de ADN
nu are parametri corespunztori pentru amplificare. Conceptual, etapa trebuie inclus n metodologia de
evaluare a caracteristicilor ADN-ului, alturi de alte analize specifice.
Urmeaz apoi screeningul, etap n care se realizeaz identificarea probelor ce con|in material
MG. Se face astfel o triere a probelor, fiind eliminate din etapele ulterioare ale procesului analitic cele
Ir con|inut transgenic. Screeningul este necesar mai ales n cazul probelor despre care nu exist
informa|ii suficiente referitoare la con|inut (i.e. taxoni/ingrediente, evenimente de transformare). Chiar
dac aceste informa|ii sunt disponibile, efectuarea screeningului poate fi totusi benefic, putnd oferi
indicii referitoare la prezen|a unor evenimente de transformare neasteptate. |intele pentru amplificare
corespund secven|elor celor mai frecvent utilizate elemente transgenice (ex. promotorul 35S, ternimatorul
nos sau gene marker pentru selec|ie).
n final, probele identificate pozitiv n cea de-a doua etap vor fi testate n vederea determinrii
precise a OMG-urilor pe care acestea le con|in, amplificnd regiuni specifice fiecrui eveniment de
transformare.
n continuare vor fi prezentate caracteristicile metodologiei PCR si va fi descris
modul n care aceasta este utilizat pentru testarea calitativ a con|inutului MG.
2.8.2. Structura i modul de replicare a ADN-ului
Pentru o mai bun n|elegere a principiilor si aplica|iilor PCR, structura si modul de replicare al
acidului dezoxiribonucleic (ADN) sunt descrise n continuare, dup Somma si Querci (2004b). Molecula
de ADN este constituit din dou catene complementare, rsucite si antiparalele. Fiecare dintre cele dou
catene este alctuit din unit|i denumite nucleotide, unite ntre ele prin legturi de hidrogen. Structura
are un aspect helical cu rsucire spre dreapta si este purttoarea informa|iei genetice codificat n secven|a
nucleotidelor. n celulele eucariote, nucleul con|ine cea mai mare parte a ADN-ului care reprezint ADN-
ul nuclear sau cromozomal. ADN-ul cromozomal este separat de restul celulei (citoplasma) printr-o
membran nuclear dubl. Pe lng acest tip de ADN, n celulele eucariote se gseste si ADN
extracromozomal, localizat la nivelul unora dintre organitele celulare (ex. mitocondrii sau cloroplaste).
Nucleotidele, considerate elementele structurale esen|iale ale ADN-ului, sunt denumite si
dezoxinucleozid trifosfa|i (deoxynucleosid thriphpsphates/dNTPs) si sunt de patru feluri:
dezoxiadenozin trifosfat (deoxyadenosin triphosphate/dATP) sau adenina;
dezoxiguanozin trifosfat (deoxyguanosin triphosphate/dGTP) sau guanina;
dezoxitimidin trifosfat (deoxytimidin triphosphate/dTTP) sau timina;
dezoxicitidin trifosfat (deoxycitidin triphosphate/dCTP) sau citozina.
7
O nucleotid este alctuit din trei componente principale: o baz azotat purinic (adenin/A
sau guanin/G) sau pirimidinic (citozin/C sau timin/T), o molecul de zahar (dezoxiriboz) si o
grupare fosfat. Baza azotat este legat de atomul de carbon 1 al moleculei de zahar printr-o legtur
glicozidic, iar gruparea fosfat este legat de atomul de carbon 5 printr-o legtur diesteric.
Nucleotidele formeaz o caten de ADN prin legarea gruprii fosfat a unei nucleotide cu gruparea
hidroxil a nucleotidei precedente. Aceasta nseamn c nucleotidele noi sunt atasate ntotdeauna la captul
3 al lan|ului.
Exceptnd unele virusuri, ADN-ul este dublu-catenar, iar cele dou catene sunt perfect
complementare, alipindu-se foarte precis una la cealalt. Fiecare baz din cadrul unei catene este
complementar unui singur tip de baz de pe catena opus, formnd astfel o pereche de baze (pb): A este
ntotdeauna complementar cu T, unindu-se prin dou legturi de hidrogen; C este ntotdeaun legat de
G prin intermediul a trei legturi de hidrogen. Astfel, cele dou lan|uri nucleotidice sunt complementare,
fiecare putnd servi ca matri| pentru sinteza celuilalt. Bazele azotate formeaz un nucleu hidrofob n
interiorul dublului helix, zaharurile si gruprile fosfat (n form anionic) constituind stratul extern,
hidrofil, al moleculei.
Informa|ia genetic complet care defineste structura si func|ia unui organism este codificat sub
forma (macro)moleculei de ADN. Cele trei procese responsabile de transmiterea informa|iei genetice n
descenden| sunt:
replicarea ADN-ul dublu-catenar este duplicat pentru ob|inerea a dou molecule identice;
transcrip|ia un segment de ADN care constituie o gen este citit si transcris ntr-o secven|
monocatenar de ARN, denumit ARN mesager (ARNm); aceste molecule trec apoi din nucleu n
citoplasm, suferind o serie de transformri;
transla|ia sintetizarea unei secven|e de aminoacizi pe baza moleculei de ARNm; secven|a de
aminoacizi astfel constituit reprezint o protein.
Replicarea ADN-ului in vivo este procesul care st la baza amplificrii PCR. n timpul replicrii,
molecula de ADN se despiralizeaz, cele dou catene se separ si fiecare dintre acestea devine o matri|
pentru sinteza unei catene complementare noi. La finalul procesului de replicare, fiecare molecul dublu-
catenar, compus dintr-o caten de ADN nou si una veche, constituie o copie exact a moleculei dublu-
catenare ini|iale.
n cadrul acestui proces sunt implicate mai multe enzime, ca: topoizomeraza si helicaza,
(responsabile pentru despiralizarea ADN-ului), ADN polimeraza III (direct responsabil de sinteza noii
catene ADN), primaza (sintetizeaz o structur oligonucleotidic primerul ARN pe catena matri|),
RNaza H (ndeprteaz primerul ARN), ADN polimeraza I (completeaz por|iunea rmas liber n urma
primerului ARN). ADN polimeraza III si desfsoar activitatea de-a lungul catenei matri|, alipind
nucleotide libere la nucleotidele deja existente, pe baz de complementaritate. Nucleotidele adugate
formeaz legturi covalente (fosfodiesterice) cu nucleotidele aceleiasi catene, iar unirea cu nucleotidele
complementare ale celeilalte catene este asigurat prin intermediul unor legturi de hidrogen.
ADN polimeraza are capacitatea de a aduga nucleotide libere doar la captul 3 al unei catene
ADN. De aceea, n mod conven|ional, ADN polimeraza ac|ioneaz de la captul 5 spre captul 3 al
catenei matri|. n func|ie de direc|ia de replicare a moleculei de ADN (i.e. direc|ia de despiralizare si
denaturare a dublului helix), una dintre catene (denumit leading) este sintetizat continuu, iar cealalt
(denumit lagging) este sintetizat n fragmente (denumite Okazaki). Ulterior sintezei noilor catene,
ligazele catalizez formarea unei legturi ntre eventualele grupri adiacente de nucleotide (ex.
fragmentele Okazaki, n cazul moleculei formate pe baza catenei lagging, sau secven|ele ob|inute dup
eliminarea primerului ARN si umplerea golului rmas n urma acestuia, n cazul moleculelor formate pe
baza ambelor catene ini|iale).
2.8.3. Principiul reaciei PCR
Reac|ia PCR are la baz mecanismul de replicare in vivo a ADN-ului si este utilizat pentru
amplificarea unei secven|e |int de ADN ntr-un numr mare de copii (Kubista et al., 2006), fiind
8
considerat un fotocopiator molecular (Dalgleish, 2007) sau o metodologie de xeroxare a ADN-ului
(NCHGR,1992).
Pentru ca amplificarea s aib loc, sunt necesare urmtoarele componente principale: doi primeri
oligonucleotidici care flancheaz secven|a ADN |int, nucleotide libere, o polimeraz termostabil, ioni
de magneziu, o solu|ie tampon ce are rol de mediu de reac|ie. Reac|ia se desfsoar n cadrul unui ciclu
repetitiv de temperaturi.
In prima etap a amplificrii PCR, temperatura nalt are rolul de a separa cateneledublului helix
de ADN. Temperatura este apoi cobort pentru a facilita alipirea (hibridarea molecular) primerilor
oligonucleotidici la secven|a |int. n ultima etap, temperatura are o valoare optim pentru activitatea
polimerazei care extinde primerii prin alipirea unor noi nucleotide, n prezen|a ionilor de Mg. n contextul
amplificrii PCR, cele trei etape constituie un ciclu individual denumit, de obicei, ciclu/pas PCR (PCR
cycle/step). Dup fiecare ciclu, catenele de ADN nou sintetizate servesc ca matri|e n ciclul urmtor.
Principalul produs al acestei reac|ii exponen|iale este un segment dublu catenar de ADN a crui termina|ii
corespund capetelor 5 ale primerilor oligonucleotidici.
Lungimea produsului de amplificare (amplicon) este dat de distan|a dintre cei doi primeri.
Produsii ciclului ini|ial de amplificare sunt ns reprezenta|i de molecule de ADN de mrimi diferite, a
cror lungimi pot depsi pe cea determinat de siturile de alipire a celor doi primeri. n ciclul doi, aceste
molecule (produsii primului ciclu de amplificare) genereaz catene de ADN de lungime definit care se
vor acumula exponen|ial n continuare, formnd produsii de reac|ie dominan|i. Numrul final de copii (N)
ale secven|ei |int, rezultat n urma amplificrii poate fi exprimat prin urmtoarea rela|ie:
N =(2
n
- 2n)xN
0
(1)
unde n reprezint numrul de cicluri, 2n exprim produsul ob|inut dup primul ciclu si produsii cu
lungime nedefinit ob|inu|i dup al doilea ciclu, care pot fi neglija|i, iar N
0
numrul ini|ial de copii ale
secven|ei |int (Somma si Querci, 2004b). Teoretic, dup 20 cicluri PCR vom avea o amplificare de 2
20
ori a ADN |int, dac eficien|a de amplificare este de 100% n fiecare ciclu.
n practica ns, eficien|a de amplificare variaz. Astfel, cantitatea teoretic de produs ob|inut se
poate exprima prin ecua|ia:
N =(1+E)
n
xN
0
(2)
undeE reprezint eficien|a de amplificare (Kubistaet al., 2006).
n continuare sunt descrise cele trei etape ale reac|iei PCR, dup Sambrooket al. (1989) cita|i de
Somma si Querci (2004b).
n prima etap, catena dubl este denaturat dnd nastere ADN-ului monocatenar.
Procesul trebuie s fie complet deoarece catenele separate doar par|ial se vor realipi odat cu
scderea temperaturii, iar primerii nu vor putea ac|iona (Kubistaet al., 2006).
Separarea catenelor complementare se face odat cu cresterea temperaturii, prin ruperea
legturilor de hidrogen. Pragul de temperatur maxim este de 92-96 C, nivel la care se consider c
reac|ia este complet si ntreg ADN-ul dublu-catenar s-a denaturat. Nivelul temperaturii la care jumtate
din ADN-ul dublu-catenar se gseste sub form monocatenar se numeste temperatur de denaturare
(melting temperature/Tm) si este un parametru utilizat la designul primerilor si al protocoalelor de
amplificare. Tipul de solvent, concentra|ia srurilor si pH-ul influen|eaz procesul de denaturare. De
exemplu, n mediu de reac|ie cu con|inut redus de sruri, pH ridicat si n prezen|a solven|ilor organici (ex.
formaldehid), Tm are valoare mai redus. Propor|ia C/G este un alt factor important care influen|eaz
Tm, aceast valoare fiind mai mare n cazul structurilor de ADN cu con|inut mai mare de C/G.
Temperatura ridicat corespunztoare etapei de denaturare asigur de asemenea stoparea
reac|iilor enzimatice (ex. cele ini|iate n ciclul anterior).
Alipirea (hibridarea) catenelor de ADN are loc odat cu scderea treptat a nivelului de
temperatur. Acest principiu st si la baza atasrii primerilor la siturile complementare care flancheaz
secven|a |int. n aceast etap, ntre primerii prezen|i n mediul de reac|ie si ADN-ul matri|
monocatenar legturile se formeaz si se rup n mod constant. Cu ct aceste legturi sunt mai stabile (ex.
primerii care se potrivesc perfect pe secven|a matri| de ADN), cu att vor rezista mai mult, permi|nd
9
ADN polimerazei s si desfsoare mai usor activitatea. Dup atasarea ctorva nucleotide, legturile devin
foarte puternice.
Temperatura necesar pentru alipirea primerilor depinde n principal de caracteristicile acestora.
Teoretic, aceasta este cu cteva grade mai mic dect Tm, ceea ce asigur formarea unor structuri stabile
doar ntre primeri si fragmentele |int ntre care exist un grad mare de omologie (complementaritate)
(Kubistaet al., 2006).
Ultima etap presupune extinderea primerilor de-a lungul secven|ei |int prin adugarea unor
nucleotide libere de ctre ADN polimeraz (frecvent Taq AND polimeraza), n prezen|a Mg2+. Bazele
complementare secven|ei |int sunt atasate n continuarea primerului, la captul 3 al acestuia (reamintim
c polimeraza adaug nucleotide n direc|ia 5-3, citind secven|a |int de la 3 la 5). Temperatura optim
de func|ionare aTaq ADN polimerazei este de aproximativ 72 C, acest nivel fiind utilizat n majoritatea
protocoalelor PCR (Kubistaet al., 2006). De asemenea, pentru majoritatea experimentelor PCR, durata de
30-45 secunde a acestei etape asigur extensia complet a fragmentului de interes, fiind necesar un
interval de timp mai lung n cazul n care lungimea secven|ei |int depseste 1000 pb.
2.8.4. Instrumentele i componentele necesare reaciilor PCR
Dou mari inova|ii au permis automatizarea procesului de amplificare PCR (Somma si Querci,
2004b):
introducerea ADN polimerazelor termostabile, care nu sunt inactivate la temperaturi ridicate;
astfel, cantitatea de ADN polimeraz repartizat ini|ial poate ac|iona de-a lungul mai multor cicluri PCR;
crearea unor blocuri de temperatur a cror nivel termic poate fi crescut sau cobort rapid, n
mod automatizat; un astfel de instrument poart denumirea de thermal cycler sau masin PCR.
Parametrii ciclurilor de temperatur si reactivii utiliza|i sunt factori critici pentru succesul reac|iei
PCR, cele mai importante elemente care trebuie avute n vedere n acest context fiind secven|a |int de
ADN, primerii, polimeraza, solu|ia tampon, ionii de Mg, nucleotidele libere si numrul ciclurilor de
amplificare.
Secvena int
Teoretic, amplificarea PCR se poate desfsura dac exist cel pu|in o copie intact a secven|ei
|int (Kubistaet al., 2006), fiind ns necesar un numr mai mare de copii pentru ca detec|ia produsului
de amplificare s fie posibil. Mrimea acestei secven|e poate fi cuprins ntre 0,1 (sau chiar mai pu|in n
cazul amplificrilor real-time PCR) si pn la cteva kilobaze. Cantitatea total de ADN utilizat n mod
obisnuit pentru PCR este de 0,05-10 g. Desi o prob nu trebuie s fie nalt purificat, cum se impune n
cazul altor aplica|ii (ex. secven|iere), eliminarea unor contaminan|i, ca polizaharide, polifenoli, lipide,
heparin, agen|i de chelatizare ai Mg2+, formalin sau detergen|i, este esen|ial pentru buna desfsurare a
procesului de amplificare.
Primerii
O component foarte important a reac|iei PCR este reprezentat de primeri.
Secven|a acestora influen|eaz pozi|ia si lungimea produsului de amplificare, temperatura de
alipire si cantitatea de produs ob|inut (Innis si Gelfand, 1994, n Somma si Querci, 2004b). Proiectarea
necorespunztoare a primerilor determin ob|inerea unor cantit|i reduse de produs de amplificare dorit
sau chiar lipsa acestuia. Elementele importante pentru construierea primerilor sunt: lungimea, temperatura
de alipire, gradul de omologie cu alte secven|e dect cea pe care dorim s o amplificm, gradul de
complementaritate dintre secven|elor primerilor, con|inutul G/C, secven|ele polipirimidinice (T, C) sau
polipurinice (A, G), secven|a de la captul 3 (Somma si Querci, 2004b).
Lungimea primerilor este cuprins de obicei ntre 16 si 30 nucleotide, iar cu ct aceasta este mai
mare, cu att alipirea (hibridarea) se realizeaz mai greu (temperatura de alipire este mai ridicat),
specificitatea reac|iei creste (cu ct secven|a este mai lung, cu att probabilitatea existen|ei unor secven|e
similare scade), iar cantitatea de produs acumulat se reduce.
Temperatura de alipire O reac|ie PCR necesit utilizarea unor primeri cu temperaturi de alipire
(hibridare) similare. Dac cele dou temperaturi sunt foarte diferite, amplificarea nu se va desfsura
corespunztor deoarece primerul cu temperatur de hibridare mai ridicat se poate alipi nespecific dac
10
nivelul de temperatur este optim pentru cellalt primer, iar acesta din urm nu va rmne alipit la
temperatura specific primului primer, care este prea ridicat. n practic temperatura de alipire se
determin pornind de la temperatura de denaturare (Tm) men|ionat anterior. Aceasta se poate calcula
utiliznd diferite formule, cea mai simpl fiind cea conceput de Wallace:
T
m
=2(A+ T)+4(G+ C) (3)
unde: A, T, G, C reprezint numarul de baze ale primerului. Aceast formul ofer o valoare
aproximativ, dar destul de precis n cazul primerilor de 18-24 baze. Rela|ia existent ntre temperatura
de alipire si cea de denaturare reprezint una dintre asanumitele black boxes ale reac|iei PCR. Regula
general acceptat este utilizarea unei temperaturi ini|iale de alipire cu 5 C mai mic dect temperatura de
denaturare. De cele mai multe ori aceast valoare nu este ns optim, fiind necesar determinarea
empiric a temperaturii optime de alipire.
Secvena primerilor Primerii trebuie astfel alesi nct s aib o secven| complementar unic,
cel pu|in pentru taxonul analizat, ceea ce confer specificitate reac|iei. Dup cum s-a men|ionat anterior,
specificitatea primerilor este influen|at si de lungime, numrul siturilor de alipire fiind mult mai mic
pentru un primer de 24 baze comparativ cu unul de 15 baze.
Fiecare primer trebuie astfel proiectat nct s nu con|in secve|e omoloage mai lungi de trei
baze, aceastea putnd cauza apari|ia unor structuri dublu-catenare de tip ac de - pr ce mpiedic
alipirea corect. O alt eroare de proiectare este prezen|a regiunilor omoloage n cadrul primerilor utiliza|i
n aceeasi reac|ie, rezultatul fiind sporirea primer-dimerilor.
Alipirea captului 3 al primerilor este esen|ial deoarece aceasta este partea n care polimeraza
va aduga nucleotide libere pentru sinteza noii catene. Este recomandat includerea ct mai multor baze G
si C n aceast regiune, prezen|a lor favoriznd o hibridare mai stabil.
Regiunile poli-G sau poli-C cresc probabilitatea alipirii nespecifice, iar regiunile poli-T sau poli-
A sunt instabile din punct de vedere al legturilor complexului primer-secven| |int. Cu toate acestea,
trebuie evitat nln|uirea mai multor baze de acelasi fel.
Ideal, succesiunea nucleotidelor n cadul secven|ei primerilor trebuie s fie ntmpltoare, G/C s
reprezinte 50%, iar totalul bazelor s fie de aproximativ 20. n aceast situa|ie, Tm va fi cuprins ntre 56
si 62 C.
Designul primerilor se realizeaz cu software-uri speciale, ca Primer Express, distribuit de
Applied Biosystems, sau Primer3 care poate fi accesat liber (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Acestea
sunt astfel concepute nct s ia n considerare toate principiile amintite anterior, referitoare la
caracteristicile intrinseci ale primerului.
Specificitatea poate fi apoi evaluat teoretic prin determinarea omologiei secven|elor primerilor
cu secven|e genomice din diverse baze de date (ex. GenBank,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), utiliznd software-uri de tip BLAST (basic local
alignment search tool) (ex. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).
Concentraia primerilor Oligonucleotidele sunt utilizate de obicei n concentra|ii de 1 M,
suficiente pentru 30 cicluri de amplificare. Prezen|a unor concentra|ii mai mari poate cauza amplificarea
unor secven|e nedorite. Dac ns concentra|ia primerilor n mediul de reac|ie este redus, eficien|a
reac|iei PCR va scdea.
ADN polimeraza
Metoda conceput de Mullis utiliza o ADN polimeraz termosensibil, fiind necesar adugarea
enzimei n mediul de reac|ie naintea fiecrei etape de extensie.
Introducerea ADN polimerazelor stabile la temperaturi ridicate a usurat mult metodologia de
lucru, adugarea enzimei dup fiecare etap de denaturare nemaifiind necesar. Prima ADN polimeraz
termostabil utilizat a fost Taq ADN polimeraza, provenit de la bacteria Thermus aquaticus care
trieste n izvoarele termale din Yellowstone National Park, SUA, la temperaturi de aproximativ 85 C
(Saiki et al., 1988, n Somma si Querci, 2004b).
Datorit mediului din care provine, Taq ADN polimeraza func|ioneaz optim la o temperatur de
70-80 C si este, probabil, cea mai utilizat polimeraz n aplica|iile PCR.
11
Exist si alte tipuri disponibile (ex. Pfu ADN polimeraza, provenit de laPyrococcus furiosus) si
de asemenea diverse companii productoare pun la dispozi|ie o multitudine de versiuni ale aceleiasi
enzime, modificate si optimizate pentru diferite aplica|ii (ex. n cazul Taq ADN polimerazei: Taq DNA
Polymerase si HotStar Taq DNA Polymerase dela Qiagen, Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase de la
Fermentas, TaqDNA Polymerase nativ si recombinant, PlatinumTaqDNA Polymerase de la Invitrogen,
AmpliTaq DNA Polymerase si AmpliTaq Gold DNA Polymerase de la AppliedBiosystems, GoTaq Flexi
DNA Polymerase de la Promega).
Nucleotidele libere
Nucleotidele libere reprezint elementele de baz pentru sinteza ADN-ului.
Concentra|ia acestora trebuie s fie cuprins ntre 20 si 200 M pentru fiecare din cele patru
tipuri, n propor|ii echivalente, pentru a reduce erorile de ncorporare n moleculele nou sintetizate (Innis
et al., 1988, n Somma si Querci, 2004b). Nucleotide nalt purificate sunt furnizate si utilizate ca stocuri,
de obicei n amestec.
Soluia tampon i ionii de Mg
Desi nu particip direct la desfsurarea reac|iei de polimerizare, prezen|a unei solu|ii tampon n mediul de
amplificare este indispensabil, aceasta avnd rolul de a asigura un mediu optim, din punct de vedere
chimic, pentru activitatea si stabilitatea ADN polimerazei. Compozi|ia solu|iei tampon este optimizat
pentru enzima creia i este destinat, cei doi reactivi fiind comercializa|i sub form de pachet. Cele mai
utilizate solu|ii tampon con|in 10 mM Tris, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5-2,5 mM MgCl2. Acestor
componente li se mai pot aduga si alte substan|e, ca PVP, BSA sau glicerol, adjuvan|i ce au rolul de a
mbunt|i modul n care decurge amplificarea.
Prezen|a cationilor divalen|i de Mg este de asemenea esen|ial pentru desfsuarea amplificrii,
concentra|ia optim determinndu-se empiric pentru fiecare protocol n parte. Acestia se regsesc sub
form de sruri (de obicei MgCl2) concentra|ia final fiind cuprins, n general, ntre 0,5 si 5,0 mM. Ionii
de Mg ndeplinesc urmtoarele roluri:
formeaz un complex solubil cu nucleotidele, esen|ial pentru ncorporarea acestora n catena de ADN;
stimuleaz activitatea polimerazei;
ridic temperatura de denaturare a complexului primer-secven| |int, conferindu-i stabilitate.
n general, o concentra|ie redus de Mg2+are ca rezultat acumularea n cantit|i reduse a
produsului de reac|ie, n timp ce concentra|ia ridicat de Mg2+ favorizeaz acumularea produsilor
nespecifici. Pentru ca ionii de Mg s fie activi n timpul reac|iei, trebuie evitat prezen|a n solu|ia ADN a
unor cantit|i ridicate de agen|i de chelatizare (ex. EDTA) sau gupri ionice ncrcate negativ (ex. fosfa|i).
Numrul ciclurilor de amplificare
Numrul ciclurilor necesare pentru producerea unei cantit|i detectabile de amplicon depinde n
principal de concentra|ia ini|ial a secven|ei de ADN |int. Pentru amplificarea a 50 copii, Innis si
Gelfand (1990) recomand 40-45 cicluri PCR, n timp ce doar 25-30 cicluri sunt suficiente pentru
amplificarea a 3x105 molecule (Somma si Querci, 2004b). Aceast dispropor|ionalitate se datoreaz
efectului de plafonare (platou), care implic modificarea ratei de acumulare a produsului PCR n ultimele
cicluri ale amplificrii. Plafonarea este cauzat de degradarea reactivilor (ex. enzime sau nucleotide),
consumarea acestora (ex. primeri n cazul produsilor scur|i sau nucleotide n cazul produsilor lungi) sau
de concuren|a produsilor nespecifici pentru reactivi. Datorit acestui fenomen, mrirea numrului de
cicluri peste anumie valori nu reprezint o solu|ie.
De aceea, n cazul n care produsul de interes nu este ob|inut dup 30-40 cicluri PCR se
recomand efectuarea unei reamplificri, utiliznd o parte (i.e. aproximativ 1 l) din produsul de
amplificare si un nou amestec de reac|ie.
2.8.5. Reacii PCR specializate
Pe lng reac|ia PCR tipic, descris anterior, au fost create variante destinate unor aplica|ii
specifice: nested PCR, touch-down PCR, real-time PCR (rt-PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR),
consensus PCR, PCR multiplex, colony PCR, hot-start PCR, inverse PCR, PCR RAPD, PCR AFLP etc.
12
Unele metodologii de testare OMG calitativ sunt bazate pe protocoale nested PCR, n timp ce
real-time PCR este tehnica cea mai utilizat pentru cuantificarea acizilor nucleici. Reac|iile multiplex pot
fi utilizate att n etapa de analiz calitativ, ct si n cea de cuantificare.
n continuare sunt descrise principiile metodei nested PCR si a reac|iilor multiplex.
Nested PCR
Un experiment de tip nested PCR presupune utilizarea unui set de primeri localizat ntre al|i doi
primeri pereche, de-a lungul aceluiasi fragment de ADN. ntr-o prim reac|ie se realizeaz amplificarea
cu primerii externi, urmat de amplificarea cu ceilal|i doi primeri (Somma si Querci, 2004b). Deoarece
fragmentul mai lung, amplificat n prima etap, este utilizat ca matri| n cadrul celei de-a doua reac|ii,
metoda se caracterizeaz printr-o mare sensibilitate si specificitate (Zimmermann et al., 1998, n
Angonesi Brodet al., 2007; Somma si Querci, 2004b). Sensibilitatea creste datorit reamplificrii regiunii
de interes, iar sporirea specificit|ii se bazeaz pe probabilitatea extrem de redus ca eventualele
fragmente amplificate nespecific n prima etap s fie amplificate nespecific si n cea de-a doua reac|ie. A
doua reac|ie poate fi considerat o strategie de confirmare a identit|ii produsului PCR. Sensibilitatea
mrit a acestei tehnici este ns susceptibil poten|ialelor contaminri care pot apare n timpul executrii
protoculului. Trebuie deci acordat o aten|ie deosebit acestui aspect, mai ales n cazul laboratoarelor de
testare.
Aceast tehnic a fost foarte apreciat pentru avantajele pe care le prezint, majoritatea primerilor
concepu|i la sfrsitul anilor 1990 pentru detec|ia OMG-urilor fiind inclusi n astfel de protocoale. O mare
parte dintre acestia sunt utiliza|i si astzi n practica testrii OMG. Singurul neajuns al acestei abordri
este reprezentat de necesitatea executrii a dou reac|ii de amplificare, ceea ce nseamn un consum
suplimentar de timp si materiale.
PCR multiplex
PCR-ul clasic presupune utilizarea unei singure perechi de primeri n cadrul unei reac|ii, avnd ca
rezultat ob|inerea unui singur amplicon specific. n cadrul unei reac|ii PCR multiplex sunt utilizate mai
multe perechi de primeri, fiind amplificate simultan mai multe secve|e |int. Acest tip de aplica|ie s-a
dezvoltat n ultimii ani, mai ales dup introducerea unor noi tipuri de polimeraze (Germini et al., 2004).
Prezen|a mai multor perechi de primeri n acelasi mediu de reac|ie determin sporirea probabilit|ii de
apari|ie a hibridrilor nespecifice si a construc|iilor primer-dimer, amplificarea preferen|ial a
fragmentelor de ADN mai scurte (Atlas si Bey, 1994, n Somma si Querci, 2004b), precum si reducerea
limitelor de detec|ie (Germini et al., 2004), fcnd destul de dificil optimizarea protocoalelor de acest
tip. Cu toate aceastea, metoda genereaz mult mai mult informa|ie, ntr-un timp mai scurt si cu costuri
mai reduse dect amplificrile PCR clasice (singleplex) (Germini et al., 2004).
Perechile de primeri trebuie s aib temperaturi de alipire ct mai apropiate. Este de asemenea
necesar ca lungimea fragmentelor amplificate s fie similar, cele mai scurte fiind amplificate
preferen|ial. n ceea ce priveste validarea teoretic a secven|elor primerilor, aceast poate fi fcut cu
ajutorul unor software-uri ca Oligos (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm), iar
efectele eficien|elor diferite de amplificare pot fi compensate prin ajustarea empiric a concentra|iilor
primerilor. Utilizarea solu|iilor tampon cu aditivi speciali reduc de asemenea problemele generate de
prezen|a unui numr mai mare de primeri.
Alte surse reprezentative pentru aceast tem sunt Zhanget al. (2007), Engel et al., (2006), Foti
et al. (2006), Xu et al. (2006), Forteet al. (2005), Onishi et al. (2005), Hernndez et al. (2004a, 2004b,
2003) si Matsuokaet al. (2002).
2.8.6. Identificarea contaminrii, validarea i interpretarea rezultatelor
Reac|ia PCR are o larg aplicabilitate n practica stiin|ific, fiind utilizat ca tehnic analitic sau
pregtitoare. Datorit sensibilit|ii metodei, contaminarea cu ADN, chiar si n cantit|i foarte reduse,
poate duce la ob|inerea unor rezultate incorecte. Acest aspect trebuie s constituie ngrijorarea principal
n cadrul laboratoarelor de testare (Querci et al., 2005). Este de aceea necesar ca setarea reac|iei s se
desfsoare ntr-un mediu lipsit de ampliconi proveni|i din alte reac|ii PCR, ADN rezultat din pregtirea
probelor anterioare sau substan|e rezultate n urma proceselor de decontaminare (Somma si Querci,
13
2004b). Primele dou tipuri de agen|i produc contaminare de tip carry-over, determinnd apari|ia
rezultatelor fals pozitive, iar a treia categorie constituie substan|e inhibitoare ce favorizeaz ob|inerea
rezultatelor fals negative. Un alt tip de erori care trebuie evitat este contaminarea ntre probe analizate n
paralel (contaminare ncrucisat/cross-over contamination), care determin de asemenea apari|ia unor
rezultate fals pozitive.
Existen|a spa|iilor de lucru separate fizic, dotate cu echipament dedicat, reduce riscul
contaminrii, iar respectarea strict a normelor de decontaminare este o condi|ie esen|ial pentru
reducerea ratei de apari|ie a rezultatelor fals pozitive. Roth et al. (1997), cita|i de Somma si Querci
(2004b), recomand de asemenea ndeplinirea anumitor cerin|e de rutin referitoare la organizarea si
desfsurarea activit|ilor, menite s asigure men|inerea unui mediu adecvat de lucru pentru orice sistem
de analiz care are la baz reac|ia PCR, indiferent de numrul probelor procesate.
Sursele poten|iale de contaminare pot fi usor ntlnite n laborator (ex. probele analizate,
personalul, instala|ia de aer condi|ionat, echipamentele sau reactivii), motiv pentru care este necesar
utilizarea probelor de control, pozitive si negative. Acestea sunt necesare pentru a eviden|ia prezen|a
contaminan|ilor, dac acestia exist si pentru a evalua (valida) corectitudinea rezultatelor ob|inute.
Probele de control pentru analize OMG, specifice nc din etapa de pregtirea a probelor si pn la cea de
cuantificare, sunt prezentate n continuare conform SR EN ISO 24276:2006:
prob de control pentru mediul de lucru (environmental control/E); utilizarea acestui tip de control este
recomandat ncepnd cu etapa de pregtire (omogenizare) a probei si are rolul de a identifica prezen|a
contaminan|ilor n mediul de lucru (ex. aerul din labortor); proba const dintr-un tub con|innd ap liber
de acizi nucleici, care este lsat deschis n mediul de lucru pe tot parcusul procesului de analiz;
prob neutr de control a extrac|iei (extraction blank/B); controlul are caracter obligatoriu, ncepnd cu
etapa de extrac|ie a ADN-ului; n acest tip de prob, materialul biologic este nlocuit cu ap liber de acizi
nucleici, urmrindu-se evaluarea prezen|ei/absen|ei contaminrii ncrucisate n timpul etapei de extrac|ie;
n fiecare serie de extrac|ii trebuie inclus cel pu|in o astfel de prob de control;
prob pozitiv de control a extrac|iei (positive extraction control/P) este de asemenea obligatorie
ncepnd cu etapa de extrac|ie; indic dac reactivii utiliza|i pentru extrac|ie func|ioneaz corespunztor
si dac extrac|ia a fost executat n mod corect; n acest scop se utilizeaz o prob care con|ine n mod
sigur fragmentul de interes; aceast prob trebuie utilizat periodic, precum si la schimbarea stocului de
solu|ii de lucru;
prob pozitiv de control pentru ADN-ul |int (positive DNA target control/C+); controlul este
obligatoriu, ncepnd cu etapa PCR, pentru a verifica eficien|a procedurii de amplificare a secven|ei |int;
proba de control este constituit din ADN extras dintr-un MRC pentru secven|a de interes sau dintr-o
prob cunoscut pozitiv; acest tip de prob poate fi nlocuit sau poate nlocui proba pozitiv de control
a extrac|iei (P);
prob negativ de control pentru ADN-ul |int (negative DNA target control/C-); acest tip de control
are caracter obligatoriu ncepnd cu etapa de amplificare a ADN-ului; demonstreaz capacitatea
procedurii de a nu produce rezultate fals pozitive n lipsa secven|ei |int, utilizarea fiind ns justificat
doar n etapa de validare a metodei; proba se ob|ine dintr-un MRC care nu con|ine secven|a de interes sau
dintr-o prob cunoscut negativ;
prob de control a reactivilor (amplification reagent control/NTC); utilizarea acestei probe de control
este necesar din etapa PCR; are rolul de a verifica contaminarea cu acizi nucleici a reactivilor utiliza|i
pentru PCR; poate fi nlocuit de proba neutr de control a extrac|iei; proba de control include to|i
reactivii necesari, mai pu|in extractul de ADN care este nlocuit de un volum corespunztor de ap liber
de acizi nucleici;
prob de control a inhibi|iei reac|iei PCR (PCR inhibition control/I); se utilizeaz ncepnd cu etapa de
amplificare, avnd rolul de a confirma absen|a/prezen|a inhibitorilor ce pot afecta eficien|a amplificrii;
controlul inhibi|iei poate fi fcut prin analiza real-time PCR a unei dilu|ii seriale a extractului; o alt
strategie o reprezint utilizarea unui control extern, ntnlnit n literatura de specialitate sub denumirea
spike; n aceast situa|ie, extractul analizat este amestecat cu o solu|ie pozitiv pentru secven|a de
14
interes, care reprezint practic controlul pozitiv extern; uneori, controlul pozitiv extern poate fi adugat
naninte de extrac|ie, caz n care este reprezentat de o matrice (ex. fin).
Interpretarea rezultatelor testrii OMG calitative se face pe baza profilului ob|inut prin separarea
electroforetic a produsilor PCR. Mrimea ampliconilor separa|i este estimat cu ajutorul unei solu|ii de
ADN standard (DNA marker, DNA ladder) care con|ine fragmente de mrimi cunoscute. n cazul n care
profilul electroforetic al probei prezint o band a crei mrime este aproximativ cea asteptat, se poate
concluziona c banda este cea cutat, iar proba este pozitiv. Validarea rezultatelor presupune
ndeplinirea urmtoarelor condi|ii:
proba de control pentru mediul de lucru (E), proba neutr de control a extrac|iei (B), proba negativ de
control pentru ADN-ul |int (C-) si proba de control a reactivilor (NTC) nu trebuie s prezinte banda
specific corespunztoare ampliconului pe care dorim s-l detectm; pot fi prezente benzi scurte
corespunztoare structurilor primeri-dimer;
proba pozitiv de control a extrac|iei (P), proba pozitiv de control pentru ADN-ul |int (C+) si proba
de control a inhibi|iei reac|iei PCR (I) trebuie s prezinte banda corespunztoare secven|ei |int pe care
dorims o detectm;
repeti|iile corespunztoare aceleiasi probe trebuie s prezinte rezultate identice.
n cazul n care exist neconcordan|e ntre probele de control, analiza trebuie considerat
neconcludent (SR EN ISO 24276:2006).
Un aspect important, care reiese si din cele prezentate anterior, este faptul c o parte din probele
de control, n special cele pozitive, pot fi reprezentate de materiale de referin| (certificate). Utilizarea
materialelor de referin| constituie o parte esen|ial a procedurilor de control al calit|ii. Trebuie re|inut c
n scopul validrii rezultatelor nregistrate, utilizarea probelor de control si a materialelor de referin| este
indispensabil (el et al., 2006; Querci et al., 2005).
n cazul n care specificul experimentelor impune o confirmare foarte precis a rezultatelor
ob|inute prin electroforez, se pot aplica diferite metode, ca: analiza de restric|ie a produsilor PCR,
Southern blotting-ul, secven|ierea produsilor PCR cea mai sigur cale de confirmare a autenticit|ii
acestora.
2.9. TESTAREA OMG CANTITATIV BAZAT PE TEHNICA REAL-TIME
PCR
2.9.1. Introducerea analizei real-time PCR
Caracterul cantitativ al metodei real-time PCR este conferit de posibilitatea stabilirii unei corela|ii
directe ntre cantitatea produsului de amplificare acumulat si numrul ini|ial de copii ale moleculei |int
(Weighardt, 2004). Particularit|ile reac|iei PCR conven|ionale nu permit realizarea unei astfel de
corela|ii, principala cauz fiind eficien|a defectuoas a amplificrii, care nu este constant ntre diferitele
reac|ii, dar mai ales ntre ciclurile aceleiasi reac|ii (Kubistaet al., 2006; Weighardt, 2004). Aceast limit
a fost depsit n 1992, de ctre Higuchi si colaboratorii si, care au ini|iat analiza cineticii reac|iei de
amplificare prin crearea metodei real-time PCR, capabil s detecteze produsii de amplificare odat cu
formarea si acumularea acestora (Kubistaet al., 2006; Weighardt, 2004). Sistemul de analiz n timp real
folosea EtBr pentru detec|ia ADN-ului si un thermal cycler adaptat s iradieze mediul de reac|ie cu
lumin UV si s nregistreze fluorescen|a emis de fluorocrom. Excita|ia moleculelor de EtBr si
nregistrarea fluorescen|ei se realizau la sfrsitul fiecrui ciclu de amplificare, dup etapa de extensie.
Valoarea intensit|ii fluorescente nregistrate si numrul ciclurilor PCR au fost introduse ntr-un grafic
care a oferit o imagine a procesului de amplificare, prezentnd acumularea produsului de amplificare n
func|ie de timp.
Metodologia real-time PCR utilizat astzi este o mbunt|ire a tehnicii ini|iale create de Higuchi
et al. si reprezint cea mai performant strategie de cuantificare a acizilor nucleici (Cankar et al., 2006;
Miragliaet al., 2004, si Anklamet al., 2002, n Engel et al., 2006; Kubistaet al., 2006; Weighardt, 2004;
Alaryet al., 2002). Pe lng precizia cuantificrii, a crescut si capacitatea de analiz, iar inciden|a erorilor
si a rezultatelor fals pozitive este mult redus (Cankar et al., 2006; Alary et al., 2002). Deoarece
15
amplificarea si detec|ia sunt combinate ntr-o singur analiz (sistem nchis), riscul de contaminare este
de asemenea redus. Tehnica este utilizat n special pentru detec|ia patogenilor, analiza expresiei genice,
analiza polimorfismului determinat de o singur nucleotid (single nucleotide polymorphism/SNP),
analiza abera|iilor cromozomiale etc. Real-time PCR este de asemenea cea mai utilizat si mai precis
metod de cuantificare a con|inutului MG al diferitelor materii prime sau procesate de origine vegetal
destinate consumului alimentar al oamenilor sau animalelor (Cankar et al., 2006; SR EN SO 21570:2006,
Kubistaat al., 2006; Deisingh si Badrie, 2005).
2.9.2. Principiul real-time PCR
Tehnica real-time PCR utilizeaz primeri specifici pentru amplificarea secven|ei |int, iar n
tandem cu acestia, construc|ii oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de molecule incluse n mediul de
reac|ie indic acumularea produsului PCR (Burnset al., 2004). Astfel, de-a lungul mai multor cicluri de
amplificare, construc|iile oligonucleotidice care sunt de asemena specifice secven|ei |int, vor determina
modificarea semnificativ a semnalului fluorescent (Burns et al., 2004). Detaliile referitoare la aceste
molecule vor fi prezentate n subcapitolul 2.9.9.
Teoretic, n cadrul amplificrii, acumularea produsilor PCR se desfsoar exponen|ial. n practic
ns, reac|ia nu atinge niciodat eficien| maxim. Mai mult, dup 30-40 cicluri de amplificare intervine
fenomenul de plafonare (Ahmed, 2002) care afecteaz reac|iile n mod independent si diferit.
n cadrul reac|iei PCR conven|ionale, determinarea este fcut ntr-un singur punct la sfarsitul
amplificrii (determinare end-point). De aceea propor|ionalitatea ntre cantitatea final de ampliconi si
cea ini|ial de copii ale secven|ei |int este redus, nefiind posibil cuantificarea. S-a demonstrat totusi
empiric, c aceast propor|ionalitate exist n timpul fazei exponen|iale a amplificrii, nainte s intervin
plafonarea. Astfel, dac se cunoaste numrul de cicluri necesare pentru atingerea unei anumite
concentra|ii a moleculei |int, numrul ini|ial de copii ale acesteia poate fi determinat cu precizie. Pentru
calcularea concentra|iei moleculei de interes ntr-o prob necunoscut este necesar utilizarea unei curbe
de calibrare (denumit si curb standard) (Burns et al., 2004) ob|inut prin analiza unui set de
calibratori (probe standard) (Taverniers et al., 2005) reprezentat de probe al cror numr ini|ial de copii
ale secven|ei |int este cunoscut.
Att n cazul probelor standard, ct si al celor necunoscute, monitorizarea acumulrii produsilor
de reac|ie odat cu desfsurarea amplificrii se face prin nregistrarea emisiei fluorescente a unor
substan|e speciale aflate n mediul de reac|ie.
Este evident c ntre semnalul fluorescent si cantitatea de ampliconi forma|i exist o rela|ie de
propor|ionalitate direct, ambele crescnd odat cu numrul de cicluri de amplificare (Kubista et al.,
2006; Grove, 1999, n Burnset al., 2004). Concentra|iile ini|iale ale moleculei |int si numerele ciclurilor
PCR sunt apoi utilizate pentru construirea curbei standard care reprezint de fapt o regresie liniar
(concentra|ia moleculei |int reprezint varibila independent, iar valoarea numrul ciclurilor PCR este
variabila dependent). Trebuie remarcat c n ciclurile ini|iale semnalul generat este slab si nu poate fi
deosebit de semnalul de fond (background signal/fluorescence). Odat cu acumularea unei cantita|i mai
mari de produs semnalul creste semnificativ, ridicndu-se deasupra celui de fond. Din acest moment
acumularea produsului de amplificare este evident, putndu-se face colectarea datelor pentru analiza
cantitativ.
2.9.3. Eficiena amplificrii n analizele real-time PCR
Eficien|a reac|iei PCR este exprimat ca rat de amplificare a crei valoare teoretic este 2, ceea
ce nseamn c numrul de copii ale unui amplicon este dublat n fiecare ciclu PCR (Moenset al., 2005).
n cazul unei eficien|e de 100%, raportul dintre numrul ini|ial al copiilor secven|ei |int n dou probe
diferite este dat de formula:
N
0A
/N
0B
=2
(C
TB
-C
TA
)
(4)
undeN
0A
si N
0B
reprezint numerele ini|iale de molecule |int din probele A, respectiv B, iar C
TA
si C
TB
sunt valorileC
T
(cycle threshold) corespunztoare acestora. Deocamdat, valoareaC
T
trebuie n|eleas ca
un interval de timp ce reprezint un numr de cicluri de amplificare. Dup cum s-a men|ionat n
subcapitolele anterioare, semnalul fluorescent al unei probe este determinat de produsul de amplificare,
16
fiind direct propor|ional cu cantitatea acestuia. Astfel, presupunnd c proba A atinge acelasi nivel al
fluorescen|ei, respectiv pragul limit (threshold value), cu patru cicluri mai trziu dect proba B, adic are
nevoie de patru cicluri de amplificare adi|ionale, putem conchide c proba A con|inea ini|ial de 16 ori
(2x2x2x2) mai pu|ine molecule |int dect proba B.
Trebuie subliniat faptul c semnalul probei cu mai pu|ine molecule va atinge mai trziu valoarea pragului,
dup parcurgerea mai multor cicluri de amplificare. n practic ns, reac|ia PCR nu este perfect, fiind
necesar introducerea n ecua|ia 4 a eficien|ei de amplificare (E):
N
0A
/N
0B
=(1+E)
(C
TB
-C
TA
)
(5)
Presupunnd c reac|ia PCR are o eficien| de 90%, valoare tipic pentru probele biologice,
diferen|a de patru cicluri ntre dou curbe de amplificare reflect un raport de (1 +0,9)
4
=13 ntre valorile
ini|iale numrului de copii ale secven|ei |int din probele A si B.
n cazul unei singure probe, ecua|ia 5 devine:
N
n
/N
0
=(1+E)
n
(6)
undeN
0
si N
n
reprezint numrul ini|ial de molecule |int, respectiv numrul de molecule |int dup n
cicluri de amplificare.
Pentru estimarea eficien|ei amplificrii este utilizat tot curba standard, amintit n subcapitolul
anterior. Aceasta este construit ntr-un grafic n care sunt reprezentate valorile C
T
(ob|inute prin
amplificare) aferente probelor standard n func|ie de logaritmul concentra|iei numrului ini|ial de copii ale
secven|ei |int sau logaritmul factorului de dilu|ie (Applied Biosystems, 2001). Pentru fiecare curb
standard este calculat si ecua|ia de regresie asociat care descrie rela|ia dintre variabilele x (i.e.
logaritumul concentra|iei secven|ei |int) si y (i.e. C
T
):
y =M x +B (7)
undeM este panta curbei standard (dreapta de regresie), iar B reprezint intersec|ia dreptei de regresie cu
axa OY. Din ecua|ia de regresie reiese urmtoarea egalitate:
C
T
= M log(N
0
) +B (8)
n cazul unei probe cu o singur copie a moleculei |int ecua|ia (8) devine:
C
T
= M log(1) +B (9)
Logaritmul din 1 este 0 indiferent de baz, deci C
T
este egal cuB.
Panta unei reac|ii poate fi utilizat pentru a determina eficien|a reac|iei si exponentul/factorul
amplificrii (F):
F=10
-1/M
(10)
E=10
-1/M
-1 (11)
2.9.4. Cuantificarea OMG-urilor
Prin testarea OMG cantitativ materialul transgenic dintr-o prob nu poate fi exprimat dect
procentual, sub forma raportului dintre cantitatea de ADN MG si cea de ADN total corespunztor
taxonului analizat (Vatilingomet al., 1999). Pentru fiecare prob este astfel necesar cuantificarea ADN-
ului MG n paralel cu cea a ADN-ului specific taxonului (Burns et al., 2004; Hernndez et al., 2004b), al
doilea tip avnd rol de referin|. Strategia asigur normalizarea intern (normalizarea la nivelul probei),
precum si normalizarea intra- si interdeterminri, deoarece ia n calcul posibila degradare a ADN-ului sau
prezen|a inhibitorilor, factori care, teoretic, afecteaz n egal msur cele dou sisteme PCR. Totusi,
acest ipotez nu a fost demonstrat.
Secven|a de referin| corespunde unei gene (denumit endogen) care trebuie s ndeplineasc
urmtoarele condi|ii:
s fie specific taxonului;
s fie prezent print-o singur copie la nivelul genomului haploid;
s fie reprezentat stabil n diferite linii ale aceleiasi specii;
s aib aceiasi parametri de amplificare ca secven|a transgenic, cerin| care depinde ns foarte mult si
de modul n care este conceput experimentul.
Exist cteva aspecte referitoare la modul de exprimare a con|inutului procentual de OMG-uri,
care trebuie men|ionate. n primul rnd, prin Regulamentele 1829/2003 si 1830/2003 a fost stabilit pragul
17
con|inutului procentual de OMG-uri ce trebuie avut n vedere pentru aplicarea etichetrii, respectiv 0,9%,
la nivel de ingredient. Ini|ial, nu a fost ns indicat nicio unitate de msur pentru acest prag,
implementarea prevederilor legislative referitoare la etichetare fiind astfel problematic (Moens et al.,
2005). Iesirea din acest impas s-a fcut odat cu introducerea Recomandrii 2004/787/EC. Aceasta
defineste procentul de ADN MG ca fiind raportul dintre numrul copiilor de ADN MG si numrul
copiilor de ADN specific taxonului |int, calculat la nivel de genom haploid.
Se face de asemenea precizarea c procentul de ADN MG amintit anterior s fie utilizat pentru
exprimarea rezultatelor analizelor cantitative. n acest context, inconvenientul este determinat de natura
calibratorilor si a materialelor de referin| utilizate pentru cuantificare, elemente care intervin n
asigurarea trasabilit|ii si validarea metodelor. Mai multe considerente referitoare la toate aceste aspecte
vor fi prezentate ntr-unul dintre subcapitolele urmtoare (2.9.7).
2.9.5. Analiza grafic a datelor experimentale
Odat cu desfsurarea amplificrii n cadrul unui sistem real-time PCR, semnalul fluorescent din
mediul de reac|ie este msurat, iar pe baza acestor date se va realiza o reprezentare grafic a acumulrii
produsilor PCR n func|ie de numrul ciclurilor de amplificare. Scala pentru fluorescen| poate fi normal
sau logaritmic, cea de-a doua facilitnd distingerea celor trei faze ale amplificrii:
faza ini|ial, n care intensitatea fluorescen|ei variz foarte pu|in, corespunznd semnalului de fond;
faza liniar, n care reac|ia se desfsoar exponen|ial iar acumularea ampliconilor este evident;
stadiul de platou (plafonare), n care rata amplificrii se reduce considerabil.
Pragul limit reprezint punctul de echivalen| pentru toate reac|iile incluse ntr-o analiz. Dup
Vatilingomet al. (1999), pragul limit (definit de software) este punctul n care semnalul fluorescent
depseste de zece ori devia|ia standard a mediei intensit|ii msurate ntre al treilea si al 15-lea ciclu. n
acest moment, ntre valoareaC
T
si logaritmul concentra|iei moleculei |int exist o rela|ie liniar (Burns
et al., 2004).
n practic, alegerea pragului limit este fcut de ctre operator, reprezentnd unul dintre
elementele subiective al analizei real-time PCR. Punctul n care acesta este plasat trebuie ales foarte atent.
n primul rnd trebuie s fie situat n cadrul fazei exponen|iale si deasupra semnalului de fond. Pe
scal logaritmic, faza de crestere exponen|ial apare sub forma unei drepte, n timp ce pe o scal normal
corela|ia ntre rata de acumulare a ampliconilor si alura curbei este mai greu de fcut. De asemenea,
nivelul de pozi|ionare al pragului trebuie ales astfel nct, n acel punct, graficele probelor s fie liniare si
paralele, iar cele ale repeti|iilor s coincid ct mai mult.
Dup pozi|ionarea pragului limit, software-ul calculeaz automat valorileC
T
.
Ciclul pragului limit (C
T
) reprezint ciclul PCR n care semnalul fluorescent generat prin
amplificarea moleculei |int atinge pragul limit definit de software sau de ctre operator (Burns et al.,
2004; Rott et al. 2004). Practic, C
T
reprezint o valoare zecimal, ce exprim numrul de cicluri PCR la
care curba de amplificare generat de modificarea intensit|ii semnalului fluorescent intersecteaz pragul
limit (Corbett Research, 2004; Vatilingomet al., 1999). Corela|ia dintre numrul ini|ial de copii ale
secven|ei |int si valoareaCT este urmtoarea: cu ct cantitatea ini|ial de ADN |int este mai mare, cu
att produsul PCR se acumuleaz si este detectat mai repede, iar valoareaC
T
este mai mic.
n continuare este generat curba standard, n func|ie de datele atribuite probelor cunoscute
(standarde/calibratori) incluse n experiment si de valorileC
T
determinate experimental. Limitele curbei
trebuie s corespund unui interval ct mai larg. Una dintre condi|iile de validare a rezultatelor este ca
valorile C
T
corespunztoare probelor necunoscute s se ncadreze n intervalul dat de valorile C
T
ale
probelor standard.
Dup construirea curbei standard sunt calcula|i anumi|i parametri ai acesteia (ex. valoarea R
2
,
panta curbei standard sau eficien|a amplificrii) care ofer informa|ii despre experiment si permit
validarea rezultatelor ob|inute. n cazul n care parametri curbei standard sau celelalte elemente de
validare nu se ncadreaz n limitele optime, rezultatele analizei nu trebuie valorificate.
Valoarea R
2
, numit coeficient de corela|ie, exprim procentual msura n care rezultatele
corespund ipotezei statistice (Corbett Research, 2004). n contextul analizei cantitative, R
2
indic
18
propor|ia n care datele ob|inute corespund ipotezei conform creia valorile cunoscute introduse n
experiment formeaz o linie de regresie (curba standard/trend line). Cu ct valoarea R
2
este mai mare, cu
att standardele se vor ncadra mai bine pe aceeasi dreapt. Cu alte cuvinte, coeficientul exprim
corectitudinea rezultatelor ob|inute, n sensul coresponden|ei valorilor teoretice ale numrului ini|ial de
copii |int din probele standard, cu cele determinate experimental. n practica analizelor real-time PCR, o
valoare mai mare de 0,98 este considerat satisfctoare (ENGL, 2008; Rasmussen, 2001, n Tavernierset
al., 2005). Trebuie re|inut faptul c se pot ob|ine valori R
2
bune chiar si n cazul unor curbe standard
necorespunztoare, dac nu a fost analizat un numr suficient de puncte de calibrare. Cu alte cuvinte
valoarea R
2
va creste cu ct numrul punctelor ce formeaz curba standard este mai mic.
Valorile ideale pentru panta curbei standard, M, exponentul amplificri, F, si eficien|a reac|iei, E,
sunt -3,322, 2, respectiv 1. Acestea corespund dublrii numrului de produsi de amplificare n fiecare
ciclu, adic unei eficien|e de amplificare de 100%. De asemenea intercep|ia, B, trebuie s fie ct mai
apropiat de 40, valoare ce corespunde numrului teoretic de cicluri necesare pentru amplificarea unei
singure copii a secven|ei |int (Rasmussen, 2001, n Tavernierset al., 2005).
Ecua|iile:
conc =10
(M CT +B )
(12)
C
T
= M log(conc) +B (13)
reprezint dou moduri de eviden|iere a legturii dintre valorile C
T
si concentra|iile ini|iale ale
moleculelor |int (Corbett Research, 2004). Acestea sunt utilizate pentru determinarea concentra|iei
ini|iale a secven|ei |int dintr-o prob necunoscut pe baza valorii C
T
determinate pentru respectiva
prob.
Trebuie men|ionat c n cazul probelor analizate n mai multe repeti|ii (cel pu|in dou-trei fiind
recomandate), pentru calcularea concentra|iilor finale anumite softwareuri utilizeaz media geometric,
nu pe cea aritmetic (Corbett Research, 2004), datorit naturii exponen|iale a reac|iei real-time PCR.
Datele brute sunt exportate ntr-un fisier Excel, iar apoi, pentru determinarea procentului OMG, se aplic
formulele de calcul specifice metodei alese (metoda curbei standard sau metodaC
T
).
2.9.6. Metode de calcul
Cuantificarea relativ a con|inutului MG este bazat ntotdeauna pe analiza a dou secven|e |int,
una corespunztoare transgenei, iar cealalt specific unei gene de referin|. Amplificarea celor dou
secven|e |int trebuie fcut n paralel, fie n reac|ii diferite (reac|ii simplex) fie n acelasi mediu de
reac|ie (reac|ie duplex).
Ca si n cazul altor metode de msurare a concentra|iei analitului dintr-o prob, n cadrul testrilor
OMG este necesar utilizarea unor materiale cu propriet|i cunoscute, denumite standarde, materiale de
referin| sau calibratori, n vederea construirii curbelor standard (de calibrare) cu ajutorul crora va fi apoi
determinat con|inutul probelor necunoscute (Aberasturi et al., 2002, Liu, 2002, Rao et al., 2002, si
Prichard, 2001, n Burns et al., 2004). Curbele standard sunt construite ntr-un sistem de dou axe
ortogonale, axa 0Y corespunznd numrului ciclurilor de amplificare, iar axa 0X varia|iei con|inutului
ini|ial de molecule |int. Practic, pe axa OX vor fi reprezentate valorileC
T
/C
T
ob|inute n urma analizei,
iar pe cealalt logaritmul concentra|iei ini|iale a moleculei |int sau logaritmul factorului de dilu|ie.
Probele standard sunt analizate n paralel cu probele necunoscute si cu cele de control, pentru fiecare fiind
determinate valori C
T
sauC
T
, n func|ie de metoda de calcul utilizat. Determinarea con|inutului
ini|ial al probelor necunoscute este fcut prin extrapolare utiliznd ecua|ia de regresie asociat curbei
standard (Burns et al., 2004). Majoritatea modelelor de calcul utilizeaz metoda celor mai mici ptrate
pentru definirea rela|iei dintre variabila dependent si cea independent (Wikipedia, 2009n; Burnset al.,
2004).
Amplificarea probelor necunoscute si a calibratorilor trebuie s se desfsoare n paralel, n cadrul
aceluiasi experiment. n acest context este important evaluarea eficien|ei de amplificare a fiecrei probe
necunoscute, comparativ cu cea a standardelor, aspect care este adesea ignorat sau considerat neglijabil
(Rott et al., 2004). Cankar et al. (2006) afirm c pentru o precizie ct mai mare diferen|ele dintre cele
dou tipuri de eficien|e trebuie s fie ct mai reduse. Datele ob|inute de acesti autori au demonstrat c cele
19
dou eficien|e sunt de cele mai multe ori diferite, iar influen|a asupra rezultatului cuantificrii poate fi
semnificativ. Orice strategie aplicat cu scopul de a reduce aceste neajunsuri va determina n schimb
cresterea costurilor (Cankar et al., 2006), de aceea efectul eficien|elor de amplificare diferite este, n
general, trecut cu vederea.
n ceea ce priveste cuantificarea acizilor nucleici n general, modele matematice utlizate pentru
prelucrarea datelor sunt numeroase si variate, n cazul testrii OMG fiind aplicate ns doar dou metode
de calcul (Cankar et al., 2006; Deisingh si Badrie, 2005; Applied Biosystems, 2001):
metoda C
T
(AC
T
method/approach), bazat pe compararea valorilor C
T
n vederea detrminrii
con|inutului OMG (%);
metoda curbei standard (standard curve method/approach), care presupune msurarea cantit|ilor
absolute ale moleculelor |int, la nivel de echivalen|i genomici haploizi.
Metoda C
T
n cazul metodei C
T
, pentru fiecare prob inclus n analiz (standard, necunoscut, control) se
calculeaz o valoare C
T
care reprezint diferen|a ntre valoarea C
T
corespunztoare transgenei si
valoareaC
T
corespunztoare genei de referin| (C
T
=C
T
referin - C
T
transgen), ambele determinate n
urma amplificrii. Pentru construirea curbei de calibrare datele probelor standard sunt introduse ntr-un
grafic care exprim valorile C
T
n func|ie de logaritmul concentra|iei ini|iale a numrului de copii al
secven|ei |int (Applied Biosystem, 2001). Con|inutul OMG (%) al probei necunoscute este apoi calculat
cu ajutorul valorii C
T
, utiliznd ecua|ia de regresie asociat curbei standard. Trebuie remarcat c fiecrui
punct de calibrare i corespunde o prob standard separat, cu o anumit concentra|ie OMG. Metoda este
descris n detaliu de ctre Foti et al. (2006).
Aceast strategie de calcul implic desfsurarea reac|iilor de amplificare n sistem duplex.
Presupunerea inerent acestei strategii este c eficien|ele celor dou sisteme de amplificare (de referin|,
respectiv transgenic) sunt aceleasi, att n cazul unei probe date, ct si ntre diferitele tipuri de probe (ex.
MRC-uri si matrici compozite sau intens procesate). Deoarece exist diferen|e cel pu|in ntre tipurile de
probe analizate, aceast supozi|ie este considerat nepotrivit n majoritatea situa|iilor (Cankar et al.,
2006).
Totusi, o astfel de strategie este mai eficient din punct de vedere economic si de asemenea nu
este influen|at de erorile de pipetare (Alaryet al., 2002).
Metoda curbelor standard
Aceast metod presupune exprimarea con|inutului procentual de material MG cu ajutorul unor
valori absolute ob|inute n cadrul unui experiment real-time PCR. Cele dou molecule de interes vor fi
amplificate n sisteme simplex (Querci et al., 2005), fiecare prob fiind deci prezent n dou reac|ii
separate, una specific (primeri si sond) transgenei, iar cealalt genei de referin| (Rott et al. 2004).
Este astfel necesar construirea a dou curbe standard, cte una pentru fiecare secven| |int.
Spre deosebire de strategia (metoda) anterioar, n acest caz se utilizeaz un singur calibrator (solu|ie cu
concentra|ie cunoscut a moleculei de interes), punctele curbei standard reprezentnd dilu|ii seriale ale
acestuia (Cankar et al., 2006). n acest fel, diferen|a dintre eficien|ele celor dou reac|ii (sistemul
transgenic, respectiv cel de referin|) este luat n considerare nu se mai face presupunerea c acestea
sunt egale. Sunt considerate egale doar eficien|ele de amplificare ale standardului si probelor necunoscute
amplificate n paralel. Aceast presupunere poate duce de asemenea la supra- sau subestimarea
con|inutului MG deoarece, n majoritatea cazurilor, ntre cele dou tipuri de matrici (i.e.
standarde/calibratori si probe necunoscute) exist diferen|e (Cankar et al., 2006). n cele mai multe dintre
protocoalele studiate, standardul utilizat a fost reprezentat de un MRC cu 2% sau 5% material transgenic.
Cele dou curbe de calibrare care redau rela|ia dintre valorile C
T
si logaritmul numrului de copii al
moleculei |int, sunt construite pe baza rezultatelor amplificrii seriei de dilu|ii ob|inute din proba
standard. Curbele standard sunt utilizate apoi pentru determinarea numrului ini|ial de copii ale genei de
interes din proba necunoscut, prin extrapolare, introducnd valorile C
T
ob|inute n ecua|iile asociate
regresiei liniare a acestora (Tani et al., 2005; Corbett Research, 2004; Rott et al. 2004; Weighardt, 2004).
20
Valorile probelor analizate trebuie s se ncadreze ntre limitele curbei standard, cele care ies n afara
acestor valori fiind eliminate datorit erorilor care le pot fi asociate (Roche, 2006a; Weighardt, 2004).
Procentul de material MG este determinat prin raportarea numrului de copii ale transgenei la
numrul de copii ale endogenei (Rott et al. 2004). Aceast raportare permite normalizarea datelor,
depsindu-se eventulale neajunsuri determinate de calitatea diferit a extractelor. Valoarea ob|inut este
relativ si reprezint con|inutul OMG al probei necuoscute exprimat ca numr al copiilor de ADN MG
raportat la numrul copiilor de ADN specific taxonului |int, la nivelul genomului haploid.
Pentru determinarea final a con|inutului MG (%) au fost propuse si alte formule de calcul (ex.
Tani et al., 2005).
Un alt element men|ionat n literatura de specialitate (ex. Lee et al., 2006, sau Huang si Pan,
2005) ca fiind necesar pentru calcularea con|inutului de ADN MG, este factorul de corec|ie. Acesta
exprim raportul dintre numrul copiilor secven|ei transgenice si cel al endogenei, la nivelul genomului
haploid al liniei transgenice analizate. n cazul evenimentului de transformare GTS 40-3-2, factorul de
corec|ie are valoarea 1.
2.9.7. Materialele de referin certificate
Materialele de referin| certificate (MRC) reprezint o categorie de probe foarte importante n
cadrul testrii OMG, fiind utilizate pentru controlul calit|ii sau validarea metodelor (IRMM, 2008a;
Trapmannet al., 2007; Querci et al., 2005). n ceea ce priveste testrile cantitative, MRC-urile joac un
rol crucial, cel de calibratori ADN (Querci et al., 2005; Taverniers et al., 2005; Burns et al., 2004)
necesari construirii curbelor standard. n aceast situa|ie, variabila independent necesar construirii
acestor curbe cu ajutorul regresiei liniare, este reprezentat de valoarea pentru care MRC-urile sunt
certificate.
Conform SR EN ISO 24276:2006 si Regulamentului 641/2004, MR-ul este un material sau o
substan| ale crei propriet|i sunt suficient de omogene si stabile pentru a fi folosite la calibrarea unui
aparat, evaluarea unei metode sau atribuirea de valori altui material. MRC-urile reprezint o clas aparte
de MR-uri: MRC-ul este un MR nso|it de un certificat oficial care i atest propriet|ile. n contextul
testrii OMG, se certific o valoare ce reprezint con|inutul de material derivat dintr-un anumit eveniment
de transformare. Deoarece prin procedura de certificare se stabileste trasabilitatea materialului la o unitate
din Sistemul Interna|ional, certificatul include si incertitudinea valorii msurate, cu un anumit nivel de
ncredere care este de asemenea men|ionat (SR EN ISO 24276:2006; Regulamentul 641/2004).
Utilizarea acestor materiale n cadrul analizelor reprezint deci un element cheie pentru
asigurarea calit|ii si validarea rezultatelor (Ahmed, 2002).
Solu|iile de calibrare utilizate con|in fie ADN genomic (ADNg) fie secven|e de ADN plasmidial
(ADNp), ambele tipuri prezentnd avantaje si limite. Un al treilea tip de calibratori este bazat pe
ampliconi hibrizi, ce includ ambele secven| |int. Utilizarea acestora n cadrul testrilor OMG a fost
descris de Pardigol et al. (2003) (Debodeet al., 2007; Engel et al., 2005).
Calibratorii utiliza|i n mod tradi|ional n practica testrii OMG sunt cei pe baz de ADNg, toate
MRC-urile disponibile pn nu demult ncadrndu-se n aceast categorie.
n ultima perioad ns, o serie de studii au promovat utilizarea solu|iilor pe baz de ADNp (ex.
Burnset al., 2006, Kunert et al., 2006, Kuribaraet al., 2002, n Burnset al., 2006, Holst-J ensen si Berdal,
2006, Lee et al., 2006, Lin et al., 2006, Toyota et al., 2006, Huang si Pan, 2005, Moens et al., 2005,
Tavernierset al., 2005, Hernndezet al., 2004b, sau Tavernierset al., 2001), iar la sfrsitul anului 2007 a
fost introdus primul astfel de MRC. Principala diferen| ntre cele dou categorii este modul de exprimare
a con|inutului relativ de material transgenic, n primul caz acesta reprezentnd un raport de mase, iar n
cel de-al doilea un raport ntre numere de copii ale unor fragmente de ADN.
Reticen|a fa| de utilizarea moleculelor plasmidiale ca materiale de referin| a avut ca principal
argument lipsa comutabilit|ii (commutability). Aceast proprietate se refer la concordan|a dintre
rezultatele ob|inute pentru acelasi msurand n condi|ii diferite (i.e. secven|a |int n MRC-uri bazate pe
ADNg, MRC-uri bazate pe ADNp, respectiv probe obisnuite) (vezi ISO 17511, n Taverniers et al.,
21
2004). Cu alte cuvinte, s-a luat n calcul posibilitatea existen|ei unor diferen|e de amplificare ntre
calibratorii pe baz de ADNg si cei pe baz de ADNp, pe de o parte, precum si ntre calibratori si probele
obisnuite (necunoscute), pe de alt parte. Recent, mai mul|i autori (ex. Charels et al., 2007 si Mattarucchi
et al., 2005, n el et al., 2008, Terryet al., 2002, n Burns si Valdivia, 2007, Linet al., 2006, Moenset
al., 2005, Tavernierset al., 2005, sau Taverniers et al., 2001) au demonstrat c ntre cele dou tipuri de
calibratori nu exist diferen|e semnificative, n unele cazuri rezultatele ob|inute utiliznd MRC-urile pe
baz de ADNp fiind chiar superioare (ex. Burns et al., 2006). Lucrrile enumerate anterior prezint de
asemenea o serie de informa|ii referitoare la alte caracteristici si avantaje ale calibratorilor plasmidiali.
Singurele MRC-uri disponibile n prezent pentru analizele OMG sunt cele produse de IRMM, existnd
mai multe tipuri. Acestea sunt prezentate n continuare conform IRMM (2009):
MRC-uri al cror con|inut procentual OMG este exprimat ca frac|ie de mas; acestea sunt ob|inute prin
amestecul materialului MG cu material nemodificat, n propor|ii corespunztoare; n acest context prin
material se n|elege fin; astfel de MRC-uri sunt disponibile pentru evenimente de transformare la soia
(Roundup Ready), porumb (Bt176, Bt11, MON810, GA21 etc.) si sfecl de zahr (H7-1);
MRC-uri al cror con|inut procentual OMG este exprimat ca frac|ie din numrul de observa|ii; astfel de
MRC-uri sunt disponibile pentru evenimente de transformare la cartof (EH92-527-1), bumbac (281-24-
236 x 3006-210- 23) si soia (356043); n primul caz termenul observa|ii se refer la tuberculi, iar pentru
celelalte dou termenul observa|ii fce referire la semin|e; MRC-urile din aceast categorie sunt
ob|inute ca amestecuri de material OMG cu material nemodificat, n propor|ii corespunztoare; prin
material se n|elege pudr ob|inut n urma mcinrii tuberculilor, respectiv semin|elor;
MRC-uri ce includ un calibrator independent pentru cuantificarea prin real-time PCR (con|inutul OMG
procentual este exprimat ca frac|ie din numrul de copii ADNg), precum si o matrice separat, pentru
controlul calit|ii procedurii de msurare a aceluiasi OMG (con|inutul este exprimat ca frac|ie de mas)
(IRMM, 2008a); deocamdat, exist un singur MRC de acest fel ERM-BF413d pentru evenimentul
MON810;
MRC-uri al cror con|inut OMG (%) este exprimat ca frac|ie din numrul de copii ADNp; exist un
singur astfel de MRC ERM-AD413 pentru evenimentul MON810.
n continuare sunt abordate cteva probleme esen|iale n ceea ce priveste disponibilitatea MRC-urilor
pentru testarea OMG. n primul rnd, existen|a acestui tip de matrici pentru fiecare eveniment de
transformare autorizat n UE, precum si pentru cele neautorizate, este considerat de ENGL ca factor
esen|ial pentru procesul de testare. Desi comparativ cu celelalte probleme acest deziderat este mult mai
usor de realizat, MRCurile nu sunt nc disponibile dect pentru un numr redus de evenimente de
transformare (vezi IRMM, 2009).
Cel de-al doilea aspect se refer disponibilitatea MRC-urilor adecvate din punct de vedere al
caracteristicilor matricei analizate (i.e. modul si gradul de procesare, con|inut) (Burns si Valdivia, 2007;
Trapman si Emons, 2005). Pentru corectitudinea cuantificrii prin real-time PCR este necesar ca probele
analizate si standardele (calibratorii) s prezinte propriet|i intrinseci asemntoare, ceea ce faciliteaz
comportarea similar n timpul procesului PCR, din punct de vedere al ratelor de amplificare. Majoritatea
experimentelor cantitative consider aceast ipotez adevrat, fr ns a o testa (Cankar et al., 2006;
Rott et al., 2004). O serie de autori au eviden|iat diferen|e semnificative sub aspectul eficien|elor de
amplificare, ntre matricile neprocesate si cele intens procesate (Moreano et al., 2005, n Burns si
Valdivia, 2007; Corbisier et al., 2005; Hols-Jemsen si Berdal, 2004), care au influen|at negativ exactitatea
determinrilor (Cankar et al., 2006).
Cu toate acestea, n contextul testrii OMG, definirea caracteristicilor unei matrici alimentare
reprezint un exerci|iu dificil deoarece acelasi produs poate fi ob|inut prin procedee diferite, existnd
astfel deosebiri n privin|a substan|elor con|inute si deci a pretabilit|ii la analize (Cankar et al., 2006).
Dup Papazovaet al. (2005) n Blocket al. (2008), Allnut et al. (2006), Holst-J ensenet al. (2006), Moens
et al. (2005) si Yoshimuraet al. (2005a), modificat.
O alt problem referitoare la utilizarea MRC-urilor este reprezentat de exprimarea con|inutului
OMG (Allnutt et al., 2006). Dup cum s-a vzut mai sus, conform Recomandrii 2004/787/EC
22
exprimarea rezultatelor cantitative se face sub forma procentelor de ADN MG. Con|inutul MRC-urilor
este ns exprimat, n majoritatea cazurilor, ca frac|ie de mas sau numr de observa|ii. n prima situa|ie,
posibilitatea sporirii incertitudinii de msurare apare datorit ploidiei si zigo|iei diferite a |esuturilor
semin|elor cuare sunt utilizate la ob|inerea MRC-urilor. n cazul numrului de observa|ii (semin|e sau
tuberculi) apare si posibilitatea diferen|elor de mas dintre acestea. Datorit acestor considerente, noul tip
de calibratori (ADNp) este mai potrivit pentru exprimarea concentra|iilor OMG sub forma echivalen|ilor
genomici haploizi (el et al., 2008; Burnset al., 2006).
De asemenea, cel pu|in n cazul MRC-urilor reprezentate printr-un amestec de finuri ob|inute din
boabe uscate mcinate, utilizatorul este aten|ionat ctre productor (vezi IRMM, 2008b) c:
cele dou finuri folosite pentru producerea CRM-ului difer semnificativ n privin|a con|inutului de
ADN; acest diferen| semnificativ poate afecta determinrile;
n func|ie de compozi|ia matricei care constituie proba necunoscut, pot exista diferen|e de msurare
(cantitativ) ntre aceasta si MRC; diferen|ele se pot datora deosebirilor dintre fina MG si cea
nemodificat, utilizate la producerea MRC-ului, precum si metodei de extrac|ie.
Problematica referitoare la disponibilitatea unor MRC-uri adecvate este recunoscut de
comunitatea stiin|ific implicat n testarea OMG. Este ns clar si imposibilitatea crerii unei game de
MRC-uri care s acopere toate necesit|ile, n special n ceea ce priveste a doua problem eviden|iat mai
sus (Cankar et al., 2006).
2.9.8. Instrumentele real-time PCR
Un instrument real-time PCR are urmtoarele pr|i componente de baz: blocul termic ce asigur
desfsurarea ciclurilor de amplificare, dispozitivul pentru excitarea fluorocromilor, sistemul optic destinat
detectrii si nregistrrii semnalului fluorescent. Func|ionarea acestui instrument este controlat prin
intermediul unui software specific instalat pe un PC conectat la instrument.
n momentul de fa| este disponibil un numr considerabil de aparate destinate analizelor real-
time PCR. Principalele diferen|e de ordin tehnic dintre acestea sunt date de numrul canalelor pe care se
poate realiza detec|ia, viteza de analiz, numrul de reac|ii care se pot desfsura n paralel si op|iunile de
analiz ale software-ului. Cele mai utilizate instrumente real-time PCR sunt (Center for Medical Genetics,
2007; Kubistaet al., 2006; Querci et al., 2005):
7900HT (pn la 384 probe), 7700, 7500, 7500 si StepOnePlus, sisteme produse de Applied
Biosystems;
LightCycler 480 (pn la 384 probe), LightCycler 2.0 si LightCycler 1.5 produse de Roche;
Rotor-Gene 6000 (6 canale de detec|ie) si Rotor-Gene 3000 (4 canale de detec|ie) produse de Corbett
Research; ambele utilizeaz o platform rotativ pentru asigurarea uniformit|ii temperaturii;
Chromo4, DNAEngine Opticon, iCycler, iQ, MyiQ si iQ5 produse de BioRad;
Mastercycler si RealPlex (Eppendorf);
Mx3000p, Mx3005p si Mx4000 (Startagene);
SmartrCycler si GeneXpert (Cepheid);
InSyte (Biogene) care are sapte canale de detec|ie si este foarte rapid;
SuperConvector (AlphaHelix), realizeaz amplificri foarte rapide;
DT-322 (DNA Technology), se remarc prin dimensiuni foarte reduse;
Exicycler (Bioneer);
OpenArray NT Cycler (BioTrove);
Quantica (Techne).
Pe lng software-urile de control specifice instrumentelor, exist si pachete software create
pentru analiza datelor real-time PCR (ex. DANA, BestKeeper, Normfinder, Q-Gene, GenEx, qBasePlus
sau RDML), majoritatea neavnd ns o mare aplicabilitate n domeniul testrilor OMG (Bellocchi et al.,
2008; Center for Medical Genetics, 2007).
2.9.9. Sisteme de detecie
Exist dou categorii de sisteme ce pot fi utilizate pentru monitorizarea amplificrii:
care utilizeaz substan|e de intercalare (ex. EtBr, SYBR Green I, LC Green sau BOXTO)
23
care utilizeaz sonde/primeri marca|i cu fluorocromi (ex. TaqMan, FRET, Molecular Beacons,
Scorpions sau TaqMan MGB).
n cazul optimizrii corespunztoare a reac|iei de amplificare, sistemul de detec|ie utilizat nu este
important dect sub aspect economic, substan|ele de intercalare fiind mult mai ieftine. De cealalt parte,
sondele/primerii marca|i asigur optimizarea usoar a protocolului de amplificare, din perspectiva
specificit|ii, aceste sisteme fiind recomandate ndeosebi n cazul reac|iilor multiplex.
Substane de intercalare
Prima aplica|ie a tehnicii real-time PCR s-a desprins direct din experimentele lui Higuchi et al.,
EtBr fiind ns nlocuit cu SYBR Green I, substan| fluorescent de intercalare caracterizat printr-o
toxicitate mult mai redus si o specificitate mult mai mare (Haugland, 2002). SYBR Green I se
intercaleaz ADN-ului dublu-catenar, dar nu se poate lega si la ADN-ul monocatenar.
O consecin| a intercalrii este intensificarea fluorescen|ei, de 800-1000 ori, substan|a fiind
practic nefluorescent cnd se gseste liber n solu|ie. Apari|ia emisiei fluorescente se datoreaz unor
modificri ale structurii interne dup intercalarea ntre catenele moleculei de ADN (Kubistaet al., 2006).
Excitarea este produs de lumina albastr (max =488 nm), iar energia acumulat este disipat sub form
de lumin verde (max =422 nm) (Wikipedia, 2009q).
Principiul detec|iei si cuantificrii este urmtorul: odat cu nceperea reac|iei PCR, cantitatea n
crestere de ADN nou sintetizat leag o cantitate tot mai mare de SYBR Green I, rezultatul fiind
intensificarea semnalului fluorescent.
O limit a acestei strategii este reprezentat de recunoasterea nespecificic a ADN-ului dublu-
catenar. Toate moleculele de acest tip prezente n mediul de reac|ie, inclusiv produsii PCR nedori|i si
primer-dimerii, sunt intercalate de SYBR Green I si particip la formarea semnalului total. Pentru
depsirea acestei probleme, dup ncheierea amplificrii, se face analiza curbei de denaturare (melting
analysis) a produsilor de reac|ie. n cadrul acestei analize produsii rezulta|i (i.e. ADN dublu-catenar |int,
ADN dublu-catenar nespecific, primer-dimeri) sunt denatura|i treptat prin cresterea gradual a
temperaturii, n paralel fiind nregistrat modificarea semnalului fluorescent.
Aceast modificare este redat n func|ie de varia|ia temperaturii, sub forma unei curbe, ntr-un
grafic cu dou axe. Fluorescen|a se reduce treptat datorit efectelor pe care cresterea temperaturii le are
asupra propriet|ilor interne ale fluorocromilor lega|i la ADN-ul dublu-catenar (Nygren et al., 1998, n
Kubista et al., 2006). n momentul n care temperatura de denaturare a ADN-ului dublu-catenar este
atins, moleculele sunt puse n libertate si fluorescen|a scade brusc. Acest nivel de temperatur este apoi
calculat ca maxim al primei derivate negative a curbei de denaturare. Deoarece fiecare tip de molecul
dublu-catenar are o temperatur specific de denaturare este posibil discriminarea diferi|ilor produsi
PCR (specifici sau nespecifici).
Analiza curbei de denaturare reprezint de asemenea o alternativ simpl, ieftin, rapid si sigur
pentru metodele de identificare a OMG-urilor bazate pe PCR-ul conven|ional (Taverniers et al., 2005).
Identificarea si discriminarea ampliconilor se face pe baza temperaturilor de denaturare, determinate de
con|inutul GC, lungimea si secven|a acestora, precum si de concentra|ia substan|ei de intercalare, a
srurilor si a produsului |int din mediul de reac|ie (Li et al., 2003, Shepherdet al., 1998, si Ririeet al.,
1997, n Taverniers et al., 2005). Este astfel posibil efectuarea n bune condi|ii a reac|iilor multiplex
(Hernndez et al., 2004a, 2004b si 2003), diferi|i autori raportnd discriminarea unor ampliconi a cror
temperaturi de denaturare difereau doar prin 1,5-2C (Taverniers et al., 2005). Ca si n cazul tehnologiei
microarray, tehnica ofer un deosebit poten|ial pentru rezolvarea problemelor determinate de cresterea
numrului de evenimente de transformare comercializate (Hernndez et al., 2004a, 2004b si 2003).
Un incovenient al substan|ei SYBR Green I este faptul c inhib activitatea Taq ADN
polimerazei, motiv pentru care trebuie utilizat n concentra|ii reduse, ceea ce diminueaz semnificativ
capacitatea de a indica schimbri mici n gradul de hibridare al macromoleculei de ADN. Pentru
rezolvarea acestei probleme se pot utiliza al|i agen|i de intercalare (ex. LC Green sau EvaGreen). LC
Green de exemplu, nu inhib activitatea polimerazei si poate fi utilizat n concentra|ii suficient de mari
astfel nct s poat satura siturile dublu-catenare de intercalare care apar odat cu acumularea produsilor
24
elimin posibilitatea ca o molecul de fluorocrom s fie redistribuit din regiuni care au devenit
monocatenare n cele care sunt nc dublu-catenare, problem ntlnit la sistemele care utilizeaz SYBR
Green I. Utilizat n combina|ie cu instrumentul HR-1 (High Resolution Melter) (Idaho Technology), LC
Green faciliteaz detec|ia precis a unor varia|ii reduse ale semnalului fluorescent, care indic stadiul de
hibridare al produslui PCR. Sistemul a fost creat pentru identificarea muta|iilor, dar prezint un mare
poten|ial si pentru testele de cuatificare prin real-time PCR.
Sonde i primeri specifici marcai
Specifictatea detec|iei este o caracteristic esen|ial pentru analizele cantitative.
Pentru sporirea acesteia se pot utiliza diferite construc|ii oligonucleotidice marcate fluorescent,
care au capacitatea de a detecta doar secven|a |int, fr a influen|a negativ procesul PCR. Aceste
construc|ii oligonucleotidice sunt mpr|ite n dou mari grupe, sonde, respectiv primeri marca|i.
Diferen|a esen|ial dintre acestea este dat de rolul pe care l joac n cadrul experimentului. Astfel,
sondele au doar rol de detec|ie, pentru amplificarea fragmentului de interes fiind necesar utilizarea a doi
primeri conven|ionali.
n schimb, primerii marca|i func|ioneaz si ca amorse pentru reac|ia de polimerizare a uneia
dintre catenele moleculei |int, de aceea n aceste experimente se utilizeaz doar un primer obisnuit.
Urmtoarea clasificare a construc|iilor oligonucleotidice utilizate pentru detec|ie si cuantificare pe
baza nregistrrii emisiei fluorescente, este preluat de la Kubistaet al. (2006). Grupa sondelor include:
sondele hidrolizabile (hydrolysis probes), denumite si sonde TaqMan, descrise de Holland et al.
(1991);
balizele moleculare (molecular beacons), descrise de Tyagi si Kramer (1996) si Tyagi et al. (1998);
sondele de hibridare (hybridization probes), descrise de Caplinet al. (1999);
sondele Lion, produse de Biotools.
Aceste construc|ii sunt marcate cu doi fluorocromi ce formeaz o pereche donor-acceptor, n care
primul, n stare excitat, si transfer energia celui de-al doilea, aflat n proximitate. Acesta din urm
suprim astfel activitatea fluorescent a donorului, motiv pentru care este denumit si represor
(quencher). Molecula represoare poate fi fluorescent (fluorescent quencer), disipnd cea mai mare parte
din energia primit sub form de lumin, sau nefluorescent (dark quencher), caz n care energia primit
este eliberat sub form de cldur.
Primerii modifica|i sunt clasifica|i dup cum urmeaz (Kubistaet al., 2006):
primerii de tip Scorpion, descrisi de Whithcombeet al. (1999);
primerii LUX, descrisi de Nazarenkoet al. (2002);
primerii Ampliflour, descrisi de Ucharaet al. (1999);
sistemul Qzyme (Clonetech).
Fiecare dintre principiile de mai sus prezint avantaje si limite, cele mai utilizate n practic fiind
ns sondele, iar dintre acestea cele hidrolizabile. Avantajul principiului TaqMan este dat de usurin|a de
proiectare comparativ cu celelalte tipuri de sonde.
Construc|iile oligonucleotidice marcate pot fi constituite din nucleotidice normale sau molecule
sintetice similare acestora (ex. peptide nucleic acid/PNA sau locked nucleic acid/LNA), iar al doilea
element major care intr n alctuirea sunt sunt substan|ele fluorescente (reporter dyes), denumite si
fluorocromi sau cromofori.
FRET (fluorescence/Frster resonance energy transfer) reprezint mecanismul de transfer al
energiei ntre doi fluorocromi (Wikipedia, 2009h; Haugland, 2002) si st la baza principiului de
func|ionare al sondelor marcate. n continuare este descris acest principiu conform Roche (2006a).
Sursa de lumin a instrumentului excit molecula donoare prin intermediul unui filtru cu lungime
de und corespunztoare absorb|iei maxime a acesteia. n aceast stare, anumi|i electroni din molecula
donoare sunt excita|i, ajungnd de la nivelul de baz la un nivel energetic superior. n mod normal,
energia acumulat de donor este disipat sub form de emisie fluorescent cu lungime de und diferit,
mai mare dect cea de excita|ie. Pentru ca transferul de energie s aib loc este necesar ndeplinirea
urmtoarelor condi|ii: cele dou molecule (donor si acceptor) trebuie s fie apropiate n spa|iu (de obicei
25
10-100 ); suprapunerea spectrului de emisie a donorului cu spectrul de excitare a acceptorului. n aceste
condi|ii o mare parte din energia donorului este transferat acceptorului. n urma transferului energetic,
electronii donorului revin la nivelul de baz (emisia fluorescent a donorului este suprimat), n timp ce o
parte din electronii acceptorului trec ntr-o stare de excita|ie. Dup cum s-a men|ionat anterior, energia
nmagazinat va fi disipat sub form de radia|ie luminoas sau sub form de cldur, n func|ie de tipul
moleculei acceptoare (i.e. represorul).
Exist mai multe strategii de utilizare a acestui mecanism n vederea detec|iei specifice a
ampliconilor. Astfel, sondele hidrolizabile sunt bazate pe utilizarea unui acceptor de tipul dark
quencher, n timp ce sondele de hibridare utilizeaz molecule acceptoare cu emisie fluorescent.
Programele de amplificare pentru sondele TaqMan sunt constituite, n general, din cicluri de amplificare
cu dou trepte de temperatur (se foloseste un singur nivel pentru hibridare si extensie). Acest sistem
poate influen|a negativ eficien|a polimerazei, de aceea este necesar ca secven|ele |int s fie de lungimi
reduse (Kubista 2006). n cazul cuantificrii OMG-urilor condi|ia referitoare la lungimea ampliconilor
este ns necesar si datorit faptului c ADN-ul poate fi puternic degradat.
Sondele de hibridare. Pentru monitorizarea formrii produsilor PCR cu ajutorul acestui sistem,
pe lng primerii PCR, trebuie utilizate dou sonde oligonucleotidice specifice, marcate cu fluorocromii
corespunztori si denumite sonde de hibridare.
Sondele de hibridare sunt proiectate sub form de pereche, una fiind marcat la captul 3, cu
fluorocromul donor (ex. Fluoresceine), iar cealalt la captul 5, cu fluorocromul acceptor (ex. Red 640
sau Red 705. Deoarece FRET scade odat cu mrirea distan|ei dintre cei doi fluorocromi, sondele trebuie
concepute astfel nct s hibrideze regiuni adiacente ale moleculei de ADN |int (de obicei sunt despar|ite
de 1-5 nucleotide).
Datorit celor dou sonde, aceste sisteme de cuantificare sunt caracterizate printr-un nalt nivel al
specificit|ii detec|iei. De asemnea, sondele nu sunt degradate n timpul amplificrii, fiind astfel posibil
efectuarea analizei curbei de denaturare n vederea confirmrii specificit|ii reac|iei PCR.
Sondele de degradare (sondele hidrolizabile/TaqMan sau principiul TaqMan) se bazeaz pe
activitatea exonucleatic 5-3 aTaq ADN polimerazei, respectiv capacitatea de a dezintegra (hidroliza),
n timpul extensiei, orice segment oligonucleotidic alipit moleculei matri| (Lie si Petropoulos, 1998, n
Weighardt, 2004). n general, sondaTaqMan/hidrolizabil are o lungime de 20-30 baze, iar temperatura
de alipire este cuaproximativ 10 C mai mare dect a primerilor. Nucleotida de la captul 5 are atasat un
fluorocrom reporter (de obicei FAM), iar cea de la captul 3 unul represor (TAMRA). De asemenea,
captul 3 este blocat, fiind mpiedicat extensia sondei asemntor primerilor.
Ct timp sonda este intact, apropierea reporterului fa| de represor face posibil trasferul de
energie ntre cele dou molecule, determinnd suprimarea emisiei fluorescente. n timpul reac|iei PCR, n
prezen|a unei molecule |int, sonda se alipeste specific ntre siturile complementare primerilor. Apoi, n
etapa de extensie a primerilor, Taq ADN polimeraza se deplaseaz de-a lungul moleculei |int sintetiznd
noua caten, proces n care hidrolizeaz sonda TaqMan. Degradarea ntrerupe transferul de energie de la
reporter ctre represor, semnalul fluorescent propagndu-se n mediul de reac|ie si fiind nregistrat. n
acest mod este indicat acumularea produsului PCR. Degradarea unor noi sonde n ciclurile succesive va
determina sporirea numrului de fluorocromi liberi si implicit cresterea semnalului fluorescent. Cresterea
intensit|ii semnalului fluorescent, ca rezultat al degradrii sondelor odat cu acumularea produsului de
amplificare, are loc n fiecare ciclu PCR si nu influen|eaz desfsurarea reac|iei.
Deoarece semnalul reporterului apare doar dac primerii PCR si sonda TaqMan se alipesc
secven|ei |int, specificitatea acestui sistem este semnificativ mai mare dect a sistemelor PCR clasice sau
a sistemelor real-time PCR care utilizaez SYBR Green I.
Hagen si Beneke (2002) cita|i de Ahmed (2002) precizeaz c 179 de produse alimentare pe baz
de soia (inclusiv produse pentru nou-nscu|i, produse de slbit, buturi, fulgi, tofu, ti|ei, uleiuri si
condimente) au fost analizate utiliznd sistemul TaqMan, acesta fiind destul de sensibil nct s permit
detec|ia moleculelor |int. ADN-ul de soia nu a putut fi ns detectat n matricile intens procesate ca
uleiuri si condimente.
26
2.10. INTERPRETAREA I RAPORTAREA REZULTATELOR OBINUTE N URMA
TESTRII OMG
Trebuie n primul rnd avut n vedere c laboratorul recep|ioneaz direct proba de laborator,
ob|inut sau nu printr-un proces de esantionare, iar rezultatele produse n urma analizelor se vor referi
strict la acest esantion. Modul de utilizare a rezultatelor (i.e. extrapolarea la ntregul lot din care provine
proba analizat) rmne la latitudinea beneficiarului.
Conform SR EN ISO 24276:2006, buletinul de analiz trebuie s men|ioneze clar cantitatea
secven|ei transgenice raportat la cea a taxonului, sub forma procentelor de ADN MG.
Trebuie de asemenea s se specifice valoarea incertitudinii de msurare, precum si limitele de
detec|ie si cuantificare absolute si practice.
Trapmann et al. (2007) recomand urmtorul mod de raportare a rezultatelor testrii OMG
cantitative:
dac c >LOQ se raporteaz Concentra|ia =(c U); c reprezin rezultatul msurtorii; incertitudinea
raportat n acest caz este cea extins, calculat cu ajutorul incertitudinii standard si utiliznd un factor de
acoperirek =2 (nivelul de ncredere de aproximativ 95%);
n cazul n careLC <c <LOQ se raporteaz Concentra|ia =(c U), dac nu este posibil estimarea
concentra|iilor sub LOQ; dac estimarea este posibil sub LOQ, se raporteaz Concentra|ia _ (LOQ +
ULOQ), ULOQ reprezentnd incertitudinea extins a valorii LOQ;
dac c <LC se raporteaz Concentra|ia <LC. AND-ul MG nu a fost detectat n aceast prob.
Modul de raportare a rezultatelor obinute n urma testrii
Rezultatele testrii Raportarea rezultatelor
Secven|a |int specific taxonului nu a fost
detectat
Pentru proba analizat nu s-a detectat ADN.
Secven|a |int specific taxonului a fost detectat;
secven|a |int specific OMG-ului nu a fost
detectat
Pentru proba analizat nu s-a detectat ADN
specific evenimentului de transformare X.
Ambele secven|e |int au fost detectate, dar n cel
pu|in unul dintre cazuri secven|a |int este sub
LOQ
S-a detectat ADN specific evenimentului de
transformare X.
Ambele secven|e |int au fost detectate, iar n
ambele cazuri cantit|ile sunt peste LOQ
Con|inutul de ADN specific evenimentului de
transformare X este Y. Incertitudinea de msurare a
metodei este Z.
Dup SR EN ISO 24276:2006, modificat.
2.11. EVALUAREA I VALIDAREA METODELOR ANALITICE
2.11.1. Importana metodelor analitice validate
Furnizarea unor rezultate analitice corecte, care ndeplinesc anumite cerin|e de calitate, reprezint
elementul esen|ial n cadrul activit|ii de testare a produselor alimentare. De aceea, laboratorul trebuie s
fie capabil s si desfsoare activitatea n conformitate cu toate standardele na|ionale sau interna|ionale n
domeniu (SR EN ISO/CEI 17025:2005), cel mai important aspect tehnic fiind reprezentat de utilizarea
unor metode analitice adecvate. Prin aceasta se n|elege necesitatea ca laboratorul s foloseasc metode
validate oficial, dac acestea sunt disponibile, sau cel pu|in metode n cazul crora s-a demonstrat
capacitatea ob|inerii unor rezultate sigure si repetabile (Querci et al., 2005). Ambele categorii sunt
indispensabile n toate domeniile de analiz (Thompsonet al., 2002).
27
Alte activit|i pe care laboratorul trebuie s le implementeze n vederea ob|inerii unor rezultate de
calitate sunt:
asigurarea trasabilit|ii; n acest scop echipamentele vor fi verificate metrologic (i.e. etalonate/calibrate
n func|ie de specificul fiecruia) sau n cadrul controlului intern de calitate; tot n acest context, este
necesar asigurarea si monitorizarea condi|iilor de mediu pentru a exista certitudinea c parametri
mediului ambiant n care se efectueaz analizele nu afecteaz stabilitatea reactivilor, a materialelor de
control, a probelor biologice si buna func|ionare a echipamentelor;
efectuarea controlului intern al calit|ii (internal quality control/IQC sauinhouse
quality assurance); IQC reprezint un set de proceduri aplicate continuu n cadul laboratorului n vederea
evalurii activit|ilor desfsurate si a rezultatelor furnizate; se demonstreaz, practic, c metoda
func|ioneaz n limitele prestabilite, iar rezultatele sunt destul de sigure pentru a fi oferite beneficiarilor;
n cadrul acestui proces se utilizeaz MR-uri, n situa|ia ideal acestea fiind si certificate; materialele de
control vor parcurge ntregul proces analitic la care sunt supuse probele necunoscute, sau doar o parte a
acestuia; rezultatele ob|inute n cadrul acestei activit|i pot fi utilizate si pentru procesul de validare si
estimare a incertitudinii de msurare;
participarea la comparri/studii de comparare interlaboratoare (interlaboratory studies sau
collaborative/ring trials), denumite si experimente de evaluare prin cooperare (SR ISO 5725-1:1997);
acest tip de activitate constituie un control extern al calit|ii sau un mod de evaluare a competen|ei
laboratorului (proficiency testing/PT);
acreditarea conform unui standard adecvat (ENGL, 2008); n cazul laboratoarelor de testare OMG,
acreditarea se face n conformitate cu standardul ISO/CEI 17025, recunoscut la nivel interna|ional ca
document esen|ial pentru ndeplinirea condi|iilor de asigurare a calit|ii activit|ilor de testare (el et al.,
2008).
Utilizarea unor metode precise si exacte si implementarea msurilor de asigurare a calit|ii vor
permite laboratoarelor s furnizeze rezultate corecte, de ncredere si comparabile la nivel interna|ional,
acestea constituind premisele pentru desfsurarea controlului oficial al OMG-urilor comercializate
(Morisset et al., 2009; el et al., 2008; Thompsonet al., 2002).
2.11.2. Validarea i acreditarea metodelor analitice
2.11.2.1. Validarea
Toate msurile enumerate n subcapitolul anterior sunt interconenctate cu validarea care
reprezint astfel componenta esen|ial a strategiei utilizate de ctre laborator pentru asigurarea calit|ii,
precum si pentru evaluarea performan|elor tehnice n vederea ob|inerii unor rezultate precise si exacte
(ENGL, 2008; el et al., 2008).
Validarea reprezint confirmarea prin examinare si furnizarea unor dovezi obiective care
demonstreaz ndeplinirea cerin|elor specifice unui anumit mod de utilizare inten|ionat (SR EN ISO/CEI
17025:2005). A valida o metod nseamn a investiga dac scopul acesteia, reprezentat de ob|inerea unor
rezultate analitice cu un nivel acceptabil de incertitudine, este atins (Thompsonet al., 2002).
n contextul testrii OMG, validarea metodelor este legat de:
procedura de autorizare de ctre Comisia European a comercializrii evenimentelor de transformare;
acreditarea de ctre laboratoarele de testare a metodelor utilizate.
n primul caz, conform legisla|iei europene privitoare la autorizarea OMG-urilor (ex.
Regulamentele 1981/2006, 641/2004 sau 1829/2003), notificatorul este obligat s includ n dosarul
pentru autorizare o metodologie de testare a evenimentului de transformare, care cuprinde proceduri de
esantionare, identificare si detec|ie (CRLGMFF, 2009a; Mazzara et al., 2008). CRL-GMFF, prin
intermediul laboratoarelor din cadrul ENGL, va evalua si valida metodele analitice transmise de ctre
notificator (Mazzara et al., 2008; Regulamentele 1981/2006 si 1829/2003), iar concluziile vor fi
prezentate Comisiei Europene pentru a fi utilizate n procesul decizional (GMO Compass, 2006a). n
acest context, procesul de evaluare de ctre CRL-GMFF a performan|ei metodelor propuse de notificatori
se desfsoar n dou faze (ENGL, 2008; Mazzaraet al., 2008):
28
prima faz presupune evaluarea datelor si materialelor incluse de notificator n dosarul oficial; prin
materiale se n|elege matrici derivate din OMGuri ce con|in evenimentul de transformare pentru care se
solicit autorizarea;
faza a doua corespunde procesului de validare deplin a metodei printr-un studiu de comparare
interlaboratoare; probele testate n cadrul studiului sunt reprezentate de materialele men|ionate anterior.
Ini|ial, notificatorul realizeaz o validarein-house a metodei pe care o propune.
Ca n cazul oricrui proces de validare, este necesar n primul rnd specificarea criteriilor de
performan| a metodei sau a criteriilor de acceptabilitate pe care aceasta trebuie s le ndeplineasc pentru
a putea fi inclus ntr-un proces de validare deplin (full validation) (faza a doua). Definirea criteriilor de
performan| trebuie fcut n conformitate cu recomandrile ENGL (vezi ENGL, 2008) (Regulamentul
641/2004).
Datele validrii efectuate n cadrul laboratorului sunt incluse n dosarul de autorizare si vor fi
examinate de CRL-GMFF ( Mazzaraet al., 2008). Practic, notificatorul trebuie s demonstreze c metoda
ndeplineste condi|iile generale enun|ate n Regulamentul 641/2004 si criteriile de acceptabilitate indicate
de ENGL. nainte de compararea interlaboratoare se va realiza si o testare experimental a metodei
utiliznd materialele (probele) trimise de ctre notificator.
n cea de-a doua faz, transferabilitatea si performan|ele metodei sunt evaluate n cadrul unui
studiu de comparare interlaboratoare desfsurat n conformitate cu principiile descrise de Uniunea
Interna|ional de Chimie Pur si Aplicat (International Union of Pure and Applied Chemistry/IUPAC) si
ISO (ex. ISO 5725). Studiul va include cel pu|in 12 laboratoare na|ionale de referin| din cadrul UE (vezi
Anexa II a Regulamentului 1981/2006), iar evaluarea rezultatelor se va face conform criteriilor ENGL
(vezi ENGL, 2008).
La sfrsitul procesului de validare metodele sunt publicate pe site-ul CRL-GMFF (vezi CRL-
GMFF, 2009b), fiind disponibile pentru alte laboratoare de testare (el et al., 2008).
Mai multe informa|ii referitoare la procedura de validare utilizat de CRL-GMFF sunt prezentate
de ENGL (2008) si el et al. (2008), iar rezultate ale unor astfel de comparri au fost publicate si de ISO
(vezi SR EN ISO 21570:2006, SR EN ISO 21571:2006 si SR EN ISO 21569:2006).
n cea de-a doua situa|ie (i.e. acreditarea laboratorului), necesitatea acreditrii este impus de
prevederile legislative din domeniul controlului oficial al alimentelor, iar pentru parcurgerea acestui
proces este n primul rnd necesar utilizarea unor metode performante, capabile s furnizeze rezultate
precise si sigure. SR EN ISO/CEI 17025:2005 men|ioneaz c laboratoarele de testare care doresc s
parcurg procesul de acreditare trebuie s utilizeze cu precdere metodele analitice publicate n
standardele interna|ionale, regionale sau na|ionale. Aceast cerin| a fost introdus deoarece metodele
standardizate au fost n prealabil deplin validate, ceea ce nseamn c performan|ele lor au fost investigate
prin studii de comparare interlaboratoare. Exemple n acest sens sunt metodele incluse n standardele SR
EN ISO 21570:2006, SR EN ISO 21571:2006 si SR EN ISO 21569:2006 care servesc ca documente
verticale de referin| pentru testarea OMG. n cazul implementrii acestor metode, laboratorul trebuie
doar s demonstreze c este capabil s ating performan|ele ob|inute n urma studiului interlaboratoare
(Thompson et al., 2002). Aceasta se face printr-o validare n cadrul laboratorului, nefiind necesar
testarea tuturor parametrilor de performan| (el et al., 2008).
Cerin|a referitoare la implementarea cu precdere a metodelor analitice validate a fost enun|at si
de legisla|ia UE n domeniul testrii OMG (vezi Recomandarea 2004/787/EC).
n cazul n care metodele deplin validate si standardizate nu sunt disponibile sau nu pot fi
implementate, se va opta pentru alte tipuri de metode: metode standardizate folosite n afara domeniului
lor de aplicare, metode standardizate extinse sau modificate, metode nestandardizate, metode
proiectate/dezvoltate de laborator (SR EN ISO/CEI 17025:2005). n aceste situa|ii este necesar s se
demonstreze c metodele sunt adecvate pentru utilizarea inten|ionat (SR EN ISO/CEI 17025:2005), iar
aceasta va fi fcut printr-o validare in-house efectuat n conformitate cu criteriile acceptate la
nivelinterna|ional (ex. ISO 5725) (Recomandarea 2004/787/EC), testarea tuturor parametrilor de
performan| fiind necesar cel pu|in n cazul metodelor dezvoltate de laborator (el et al., 2008).
29
Ca si n cazul validrii depline, vor fi specificate cerin|ele si apoi se va efectua determinarea
performan|elor. n acest context, cerin|ele de performan| sunt definite n SR EN ISO 24276:2006 care
serveste ca document orizontal pentru testarea OMG.
Pe baza celor discutate anterior conchidem c o metod de testare poate parcurge urmtoarele
etape: crearea (proiectarea si testarea), validarea n cadul unui laborator sau a unui numr mic de
laboratoare, validarea deplin printr-o comparare interlaboratoare, adoptarea de ctre un organism de
standardizare (recunoscut la nivel interna|ional). n cele din urm, nainte de implementarea metodei n
cadrul unui laborator, este necesar parcurgerea unei proceduri de confirmare a faptului c vor fi
ndeplinite caracteristicile de performan| atribuite metodei (el et al., 2008).
Procedurile analitice pentru testarea OMG sunt alctuite din etape succesive ce pot fi tratate ca un
ntreg sau ca module separate (Holst-J ensen si Berdal, 2004, n Holst-J ensen, 2007). Aceast modalitate
de organizare este recunoscut si de legisla|ia european, Regulamentul 641/2004 descriind metode
pentru esantionarea, detec|ia si identificarea evenimentelor de transformare. n acest context, validarea
ntregului protocol integrat de testare este privit ca o abordare clasic, fiind denumit abordare global.
O alt strategie a fost propus de Holst-J ensen si Berdal (2004), aceasta presupunnd validarea separat,
sub form de module, a fiecrei etape din cadrul procedurii analitice (el et al., 2008; Burns si Valdivia,
2007; Holst-J ensen, 2007; Reiting et al., 2007; Cankar et al. 2006). Se realizeaz practic validarea
individual a metodei de extrac|ie a ADN-ului, a celei de detec|ie, respectiv a celei de cuantificare.
Comparativ cu abordarea clasic, cea modular permite simplificarea estimrii IM si reducerea costurilor,
oferind n acelasi timp o mare flexibilitate n adaptarea protocoalelor de lucru n func|ie de specificul
fiecrei situa|ii, determinat n principal de caracteristicile probei analizate (Reitinget al., 2007; Cankar et
al. 2006).
Att metodele publicate n standardele ISO, ct si cele de pe site-ul CRL-GMFF, corespund
abordrii modulare, ceea ce nseamn c etapele analitice (i.e. extrac|ia, cuantificarea) au fost validate
individual si pot fi combinate n func|ie de necesit|i. Din punct de vedere al procesului de validare, va fi
necesar n primul rnd calcularea IM asociate utilizrii protocolului integrat n cazul unei matrici date.
Abordarea modular
Elemente ca gena de referin|, procedura de extrac|ie, reactivii si platforma real-time PCR sunt
clar definite n cazul fiecrei metode validate. Este ns neclar dac schimbarea unuia dintre aceste
elemente (de obicei reactivii sau instrumentul PCR difer ntre laboratoare) poate fi considerat o
modificare a metodei. Aceast situa|ie constituie o provocare n plus pentru laboratorul care doreste
implementarea unei metode deja validate (standardizate). n acest context, modificarea unor caracteristici
neesen|iale va necesita probabil doar verificarea parametrilor critici (ex. limitele de detec|ie si cuantificare
sau repetabilitatea), n cadrul laboratorului, iar n cazul unor modificri substan|iale va fi necesar o nou
evaluare a tuturor parametrilor de performan|.
Un caz similar este reprezentat de utilizarea metodei pentru o matrice nou, iar n contextul n
care laboratorul doreste testarea unui numr mare de evenimente de trasnformare, implementarea unor
metode ce necesit reactivi, platforme sau protocoale de extrac|ie diferite va fi costisitoare si ineficient
(el et al., 2008). Toate acestea reprezint exemple n care abordarea modular permite o eficientizare
substan|ial a activit|ilor.
2.11.2.2. Acreditarea
Dintre instrumentele de asigurare a calit|ii n cadrul laboratoarelor de testare, acreditarea este
considerat ca fiind cea mai detaliat si important (Querci et al., 2005).
ISO defineste acreditarea ca fiind procesul prin care o institu|ie abilitat recunoaste formal faptul
c laboratorul opereaz conform unui sistem de calitate si este competent si capabil, din punct de vedere
tehnic, s furnizeze rezultate valide. Aceasta nu garanteaz ns corectitudinea rezultatului ob|inut, dar
asigur ndeplinirea anumitor cerin|e esen|iale de calitate precum si un cadru care s permit identificarea
neconformit|ilor (Querci et al., 2005). Acreditarea laboratoarelor de testare se desfsoar n conformitate
cu SR EN ISO/CEI 17025:2005, recunoscut la nivel interna|ional ca stadard esen|ial n definirea
cerin|elor generale pentru competen|a tehnic a laboratoarelor de testare si calibrare (el et al., 2008).
30
Aceste cerin|e includ:
demonstrarea competen|ei tehnice a operatorilor;
utilizarea unor metodologii de testare bine definite;
utilizarea MRC-urilor;
testarea competen|ei prin intermediul unor comparri interlaboratoare;
intre|inerea, verificarea, calibrarea si etalonarea aparatelor;
controlul documentelor;
controlul nregistrrilor;
furnizarea unor rapoarte adecvate; elementele cheie ale acestora sunt rezultatele ob|inute prin testare si
IM estimat n cadrul activit|ii de validare.
Domeniul de acreditare reprezint enun|area oficial si precis a activit|ilor pentru care
laboratorul este acreditat (ILAC, 2002). Majoritatea proceselor de acreditare au la baz un domeniu fix,
ceea ce nseamn c laboratorul este acreditat pentru anumite materiale/produse testate, metode utilizate si
teste efectuate (el et al., 2008). n cazul domeniului de acreditare fix, modificarea listei metodelor
acreditate nu poate fi fcut dect odat cu evaluarea de ctre organismul de acreditare (Leclercq, 2002, si
EAEurloab- EurachemPermanent Liaison Group, 2001, n el et al., 2008). n acest caz, domeniul
acreditrii reflect situa|ia n momentul efecturii ultimei evaluri. Acreditarea unui domeniu fix este
potrivit laboratoarelor care desfsoar o activitate de rutin, utiliznd metode standard (el et al., 2008).
n ultimii ani s-a fcut tot mai des sim|it oportunitatea domeniilor de acreditare flexibile (Holmgren
2006, si Leclercq, 2002, n el et al., 2008). Un astfel de domeniu ar permite laboratorului ce a
demonstrat c posed o competen| tehnic corespunztoare s introduc metode noi sau s le modifice
pe cele deja acreditate fr a parcurge o nou etap de evaluare (Steffen, 2002, si EA- Eurloab-Eurachem
Permanent Liaison Group, 2001, n el et al., 2008).
Necesitatea introducerii si validrii ct mai rapide a unor metode noi de testare este determinat
de numrul n crestere al evenimentelor de transformare autorizate precum si de ptrunderea tot mai
frecvent a celor neautorizate. Va fi astfel posibil reac|ia prompt la schimbrile n acest domeniu, fr
ntreruperea schimburilor comerciale (el et al., 2008). Acreditarea unui domeniu flexibil prezint o serie
de avantaje si confer laboratoarelor o flexibilitate sporit, dar include si cerin|e adi|ionale referitoare la
capabilit|ile tehnice si cele ale sistemului de management.