IMUNOHISTOCHIMIE

Imunohistochimia (IHC) sau imunocitochimia este o

tehnic histologic de identificare a constituenilor celulari sau
tisulari prin folosirea interaciunii antigen-anticorp. Unii
autori folosesc termenul de imunohistochimie cnd utilizeaz
aceste tehnici n studiul histologic al esuturilor i de
imunocitochimie cnd utilizeaz tehnicile pentru preparatele
citologice (pentru studiul frotiurilor sau amprentelor). Cei mai
multi autori folosesc termenul de imunohistochimie pentru
ambele tipuri de studii.
Dezvoltat n ultimii 60 de ani, imunohistochimia a
devenit o metod calitativ foarte valoroas pentru studii de
citologie, embriologie, histologie, medicin legal i mai
ales pentru anatomie patologic. Imunohistochimia este la
ora actual o metod de diagnostic larg utilizat de majoritatea
laboratoarelor de cercetare i de diagnostic, fiind deseori
preferat microscopiei electronice, datorit eficacitii,
rapiditii, preciziei i costurilor nu prea ridicate.
Tehnicile actuale de IHC au aprut datorit efortului
susinut a mai multor cercettori i laboratoare care au dorit s
aprofundeze studiile de microscopie, biologie celular i
molecular. Pentru a putea vizualiza o anumit structur
biochimic (un antigen) ntr-un esut sau ntr-o celul este
necesar s se utilizeze anticorpi marcai, adic anticorpi
care s poat fi vizualizai la microscop.
Primele tehnici de imunohistochimie au utilizat anticorpi marcai
cu fluorocromi (izotiocianatul de fluorescein i rodamina). Cel mai
mare dezavantaj al acestei tehnici a fost necesitatea folosirii unui
microscop cu fluorescen, aparat greu de procurat i utilizat. n plus,
tehnica de imunofluorescen nu permitea evidenierea unor detalii
morfologice ale celulelor marcate.
Aceste inconveniente au fost eliminate prin marcarea enzimatic
a anticorpilor (ex. marcarea enzimatic a anticorpilor cu peroxidaz din
hrean) ataat de un amestec cromogen adecvat cum ar fi
diaminobenzidina (DAB)- metod propus de Nakane & Pierce n
1966. Aceast metod a permis att vizualizarea morfologiei celulelor ct
i demonstrarea antigenului prin cuplarea acestuia cu anticorpul specific
marcat cu peroxidaz i cromogen.
Din 1966 au fost imaginate mai multe tehnici enzimatice. n
1970 Sternberger a descris tehnica cu peroxidaz-
antiperoxidaz (PAP). Engvall i Perlman n 1971 au folosit
marcarea cu fosfataz alcalin, iar Geggeness i Ash (1977) au
propus folosirea pentru imunofluorescen a complexului
avidin-biotin. Cordell i colab. (1984) a descris sistemul
fosfataz alcalin - anti-fosfataz alcalin (APAAP) folosind
un produs de reacie rou. Aceast metod a ctigat teren acolo
unde blocarea endogen a peroxidazei sau prezena pigmentului
maro au fcut dificil interpretarea.
Prezenta unor antigene n cantitate foarte mic, chiar i prin
folosirea unei tehnici optimizate, face imposibil demonstrarea existenei
acestora. De aceea au fost imaginate diverse tehnici de amplificare a
reaciei de demascare a antigenelor. Adugarea imidazolului (Straus
1982) sau a metalelor grele (Hsu & Soban 1982) la substrat a adus n
multe cazuri beneficii. Totui Borow (1989) a raportat o cretere a
sensibilitii prin adugarea tiraminei (amin rezultat din decarboxilarea
tirozinei) cu peroxidaz din hrean. Reacia se bazeaz pe depunerea
tiraminei biotinilate (reacie catalizat de peroxidaz) pe situsurile de
imunoreactivitate. Aceasta permite legarea biotinei n cantitate mai mare
de situsurile complexelor antigen-anticorp i automat mai mult avidin-
peroxidaz poate fi ataat la locurile de desfurare a reaciilor
imunologice. Cnd substratul cu soluie DAB este aplicat, este atins o
sensibilitate mai mare. Totui, toate metodele ce folosesc sistemul
avidin-biotin au dezavantajul existenei biotinei endogene, n special n
esutul hepatic i cel renal.
O alt metod de amplificare, descoperit de Mangham &
Isaacson (1999), consta in folosirea anticorpilor complementari imagine
in oglind (MICA). Aceasta este de fapt o metod in cinci timpi care
confer o sensibilitate asemntoare aceleia oferite de tiramin, dar evit
dezavantajul falsei marcri datorate biotinei endogene.
Sistemele de marcare s-au dezvoltat n paralel cu producerea de
anticorpi. n 1975 Kohler & Milstein au descris o metod revoluionar
pentru producerea anticorpilor monoclonali. Tehnicile moleculare
moderne au permis sintetizarea unor peptide mpotriva crora se pot
produce att anticorpi monoclonali ct i policlonali (Lagunowich 1990).

Cu toate progresele fcute n domeniul sistemelor de marcare
i al anticorpilor, folosirea acestora n cadrul histopatologiei a fost
limitat de tehnicile de fixare n formol i includere la parafin. La
nceputurile imunocitochimiei s-a crezut ca aceste tehnici de
procesare distrug anumii epitopi.
Huang n 1976 a descris folosirea tripsinei asupra seciunilor la
parafin ca un mijloc de evideniere a unor antigene care erau
mascate de fixarea n formol i includerea la parafin.

Totui, cel mai mare progres n acest sens s-a fcut n 1991 cnd
Shi a descris pretratamentul cu cldur al preparatelor histologice. Acesta
a implicat la nceput folosirea microundelor pentru nclzirea seciunilor
incluse la parafin ntr-o soluie de metal greu ca un mijloc de recuperare
(demascare) a antigenelor din esuturile procesate prin fixare n formol.
Cattoretti n 1993 a propus soluii alternative care compensau problemele
de securitate asociate folosirii metalelor grele. Tamponarea cu citrat
soluie la pH 6 (0,01M) a devenit alegerea de baz pentru ca este ieftin,
foarte eficient i uor de preparat. n 1994 Norton a constatat c oala de
gtit sub presiune confecionat din inox este mai eficient dect cuptorul
cu microunde pentru recuperarea unor antigene, fapt confirmat i de
Miller n 1995. De asemenea, n 1994, Bankfalvi a descris o metod de
recuperare a antigenelor folosind autoclavul. Au fost propuse i multe
alte metode pentru pre-tratarea cu cldur cum ar fi nclzirea peste
noapte la temperaturi ntre 70C i 80C n citrat (Man & Tavossoli
1996), sau n Tris-EDTA sau acid boric la 60C (Bidolph & Jones 1998).
Alte noi metode au fost de asemenea propuse. Folosirea
ultrasunetelor ca o metod de demascare a antigenelor naintea
includerii a fost descris de Gimeno (1998).
Totui, folosirea crescut a recuperrii antigenelor pentru
imunocitochimie a condus la numeroase modificri aduse metodei, n
special la nivelul soluiilor de recuperare i al aparaturii de nclzire.
Toate aceste studii au concluzionat ca exist numeroi factori care
influeneaz calitatea recuperrii, cum ar fi pH-ul, timpul i
temperatura de nclzire.
Anumii epitopi, de exemplu antigenul de proliferare Ki67 i
antigenele celulelor T- CD5 i CD8- pot fi evideniate numai prin fixare
n formol, includere la parafin i pre-tratare cu cldur i evidentierea
numai cu anumii anticorpi monoclonali. Anticorpii, cum ar fi aceia
direcionai mpotriva antigenului comun leucocitar (CLA) (clonele
PD7/2B11) i antigenului CD20 (clona L26) produc o colorare puternic
dup tamponare cu citrat, nclzire i, surprinztor, pre-tratarea cu
cldur permite creterea considerabil a factorilor de diluie.
Demonstrarea antigenelor cum ar fi ciclina D1 (clona DCS-6) se
realizeaz preferenial n soluii cu pH mai nalt (Tris-EDTA, pH =10).
Diferitele metode de recuperare pot genera confuzii, n special
datorit faptului c nu exist standardizare.
Imunohistochimia (IHC) sau imunocitochimia este o tehnic
histologic de identificare a constituenilor celulari sau tisulari prin
folosirea interaciunii antigen-anticorp.
Antigenul este substan (molecul) strin care, ptruns n
organism, determin apariia anticorpilor; (gr. anti = mpotriva, gennan =
a nate). Antigenele cele mai cunoscute sunt proteinele cu mas
molecular relativ mare (peste 10 000 daltoni) dar pot funciona ca
antigene i molecule polipeptidice de mici dimensiuni cu g.m. mai mic
de 1000 daltoni, moleculele polizaharidice, lipidice, lipoproteice, acizii
nucleici, proteine nucleare, etc.
Pentru a avea proprieti antigenice molecula respectiv trebuie
s aib o anumit mrime, o anumit structur care s-i permit
meninerea unei configuraii spaiale tridimesionale necesar pentru
recunoaterea antigenic. n plus, antigenele trebuie s aib capacitate
imunogen (capacitatea de a induce formarea de anticorpi) i de
reactivitate specific (capacitatea de a forma complexe imune cu
anticorpul a crei formare a indus-o). Pentru a obine anticorpi cu o
specificitate ct mai bun, trebuie ca antigenul obinut sa fie ct mai pur.
Obinerea unor antigene de bun calitate este o munc extrem de
laborioas, care necesit multiple tehnici biologice i biochimice de
extracie i purificare.
Trebuie notat c nu toat molecula antigenic se leag de
anticorpul specific ci numai anumite regiuni topografice, formate dintr-
un numr mai mare sau mai mic de aminoacizi sau uniti
monozaharidice, regiuni cunoscute sub numele de epitopi sau
determinani antigenici.
Exist dou categorii de epitopi proteici:
- secveniali;
- conformaionali.
Epitopii secveniali sunt formai dintr-o secven de aminoacizi
prezeni pe un lan polipeptidic; epitopii conformaionali sunt formai din
secvene de aminoacizi (de mrimi varibile) situate la distan unele de
altele pe acelai lan polipeptidic sau pe lanuri diferite, dar care, datorit
structurii secundare i teriare a proteinelor (pliate, contorsionate), sunt
aduse unele lng altele.
Nu toi epitopii determin un rspuns imun de aceeai intensitate.
n structura unui antigen pot s existe epitopi imunodominani care
determin rspunsuri imune mai puternice i epitopi care determin
rspunsuri imune slabe.
Anticorpii. Sunt glicoproteine plasmatice aparinnd
imunoglobulinelor, capabile s recunoasc specific un anumit antigen. Ei
sunt sintetizai n sistemul imunitar de ctre plasmocite, celulele finale
ale transformrii limfocitului B dup recunoaterea unui antigen, dar n
cantiti mici i de limfocitele B. Exist cinci tipuri de anticorpi
(imunoglobuline) n snge: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM.
Producerea de anticorpi. La un prim contact cu un antigen,
limfocitul B se transform n imunoblast sau limfocit activat. Aceast
transformare const n creterea volumului celular, diametrul celulei
depind 10 m, sporirea citoplasmei prin creterea cantitii de
hialoplasm i de organite, accentuarea bazofiliei prin creterea cantitii
de ribozomi i reticul endoplasmic rugos, creterea nucleului i a
cantitii de eucromatin i apariia a 2-4 nucleoli. Aceste limfocite
activate se divid de mai multe ori prin mitoze, dnd natere la clone
celulare, din care unele celule se vor diferenia n plasmocite (celule
secretoare de imunoglobuline), iar altele vor forma limfocitele cu
memorie (celule capabile la un nou contact cu acelai antigen s-l
recunoasc mai uor i s declaneze un rspun imun secundar mult mai
rapid).
Plasmocitele sintetizeaz anticorpii sau imunoglobulinele
specifice care vor fi exocitate n mediul intern, realiznd forma de
imunitate umoral sau imediat.
- IgG formeaz circa 75% din totalul imunoglobulinelor
serice. Molecula de IgG este format din dou lanturi similare
de aminoacizi, unite prin legturi bisulfidice. Fiecare
subunitate conine dou lanuri polipeptidice: unul lung, lanul
greu (H) i unul scurt, lanul uor (L). Lanul H se unete de
lanul L printr-o legtur bisulfidic. n ansamblu, molecula de
IgG prezint dou zone funcionale notate Fc, zona care se
leag cu un receptor specific prezent pe suprafaa unor celule
(limfocite, macrofage, mastocite) i respectiv, Fab care se
leag de antigen. Moleculele de IgG au greutate molecular de
circa 150.000 daltoni.
- IgM reprezint aproximativ 10% din imunoglobulinele serice.
Sunt imunoglobulinele dominante n rspunsul imun primar. Ele apar sub
forma unui pentamer (cu greutatea molecular de 900 000 daltoni). Sunt
prezente n cantitate mare pe suprafaa limfocitului B.
- IgA se gsesc n cantitate mic n plasma sanguin, dar se
gsesc n cantitate mare n secreia lacrimal, colostru, saliv, secreia
nazal, bronic, intestinal, uterin sau prostatic sub form de IgA
secretori (la monomerul IgA produs de limfocite i plasmocite se adaug
un lan polipeptidic denumit proteina J sintetizat de celulele mucoaselor,
care-i sporete aciunea i i faciliteaz transportul prin epiteliile de
acoperire).
- IgE se prezint sub forma unui monomer cu greutatea
molecular de 180 000 daltoni. n snge se gsesc n cantitate foarte
mic, de 3-5 g/100 ml. Aceste imunoglobuline au o afinitate crescut
pentru receptorii membranari ai mastocitelor i polimorfonucleare
bazofile.
- IgD sunt mai puin cunoscute din punct de vedere al efectelor
biologice. Se prezint sub forma unui monomer cu greutatea molecular
de 180 000 daltoni. Ca i IgE se gsesc n cantitate foarte mic n snge
(0,2% din totalul imunoglobulinelor). n cantiti mai mari se gsesc pe
suprafaa limfocitelor B.
IgG sunt cel mai frecvent folosite n imunohistochimie.
Specificitatea pentru antigene a IgG se afl n partea distal (variabil) a
lanurilor H i L, formnd cele dou brae ale Y-ului. Fiecare bra este
capabil de combinare cu un determinant antigenic i de aceea se numete
fragment de anticorp sau Fab. Regiunile terminale ale fiecrui bra
prezint variaii ale secvenelor de amino-acizi i sunt cunoscute sub
numele de domenii variabile. Variabilitatea amino-acizilor produce o
specificitate pentru un anumit epitop i permite legarea specific a
anticorpului de antigenul mpotriva cruia a fost produs.

Din punct de vedere imunohistochimic, molecula de IgG are 3
trsturi importante:
- capetele fragmentelor Fab sunt capabile s se lege de cte un
determinant antigenic (au doua locusuri de legare);
- fragmentul Fc, comun tuturor anticorpilor speciei de animal nu
este implicat n combinarea cu antigenele;
- imunoglobulinele sunt ele nsele macromolecule i se pot
comporta ca antigene cnd sunt injectate la specii diferite de animale. Ca
i antigen, molecula de IgG poate s aib cteva locuri antigenice i
poate s lege mai multe molecule de anticorpi. Aceast proprietate este
folosit n tehnicile de amplificare a reaciei imunohistochimice.


Surse de anticorpi
Anticorpii sunt produi prin imunizarea unui animal de
experien cu un antigen. Injectarea antigenului se face de mai multe ori.
Animalul va dezvolta rspuns umoral i anticorpii astfel produi pot fi
extrai din sngele animalului. Este puin probabil ca animalul s
produc numeroase clone de plasmocite (celule care sintetizeaz
anicorpii specifici) ca reacie imun la injectarea antigenului. Fiecare
clon de plasmocite va produce un anticorp cu o specificitate uor
diferit fa de epitopii prezeni pe imunogen. n plus, animalul poate
avea n mod natural muli ali anticorpi i proteine prezente n ser, care
pot genera probleme de reactivitate ncruciat sau colorare nespecific.

Serul imun conine aproximativ 10 mg/ml imunoglobiuline, din
care numai 0,1-1 mg reprezint anticorpul de interes. O parte din aceti
anticorpi vor reaciona ncruciat cu alte molecule i, de aici, necesitatea
de a fi ndeprtai din ser prin diverse metode biologice i biochimice.
Cel mai adesea se utilizeaz reacia de precipitatre a imunoglobulinelor
cu sulfat de amoniu, urmat de cromatografie sau alte tehnici de
purificare. Dac anticorpul de interes este prezent n concentraii mari,
multe dintre reaciile nedorite pot fi eliminate prin diluarea anticorpului
obinut.
Cu toate acestea nu se poate obine doar un singur tip de anticorp
pentru antigenul injectat animalului, i din acest motiv, acestia se numesc
anticporpi policlonali. Anticorpii policlonali pot da reacii ncruciate
cu alte molecule (antigene) din celule sau esuturi. De aceea se consider
c un ser policlonal, orict de purificat ar fi, nu poate fi lipsit de reacii
ncrucisate nedorite.
Pentru a crete acurateea examenului imunohistochimic, s-a
reuit obinerea unor anticorpi monoclonali n culturi de celule, prin
tehnica hibridomului, prin combinarea unor limfocite B cu celule de
mielom. S-a izolat astfel o singur clon imun de limfocite B sau
plasmocite care produc un singur anticorp, specific pentru un antigen.
Aceti anticorpi se numesc anticorpi monoclonali.
Reaciile ncruciate nu sunt n totalitate eliminate nici prin
utilizarea anticorpilor monoclonali deoarece aceti anticorpi pot
recunoaste si ali epitopi prezeni n alte celule sau esuturi, normale sau
patologice. Totui este o proprietate a tuturor anticorpilor de a forma
complexe numai cu antigenele care le stimuleaz producia. n plus, un
antigen mare, format din mai multe macromolecule diferite, va avea
muli determinani antigenici (mai muli epitropi) i va determina sinteza
mai multor specii diferite de anticorpi, toate capabile s se combine cu
acelai antigen.
Dei fiecare molecul de antigen se leag numai de epitopul su
specific, dou proteine aproape similare pot interaciona cu un anticorp
determinat numai de una din ele. Asemenea reactivitate ncruciat apare
cnd locul determinantului antigenic este o secven scurt de
aminoacizi, comun ambelor antigene. Aceast reactivitatea ncruciat
este uneori o surs de confuzie n interpretarea preparatelor colorate
imunohistochimic.
La ora actual exist mii de substane antigenice i antiserice sunt
disponibile n laboratoarele de diagnostic i cercetare din ntreaga lume,
producerea anticorpilor n laborator fiind azi o activitate de cercetare dar
i comercial.

CD3
Limfocite T
CD3
Limfocite T
CD3
Limfocite T
CD 20
Limfocite B
CD68
CD 20
Limfocite B
PCNA
PCNA