Sunteți pe pagina 1din 55

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE SPECIALA

L1 Protecia muncii. Prezentare lucrri


L2 Tehnici de eantionare, recoltare i pregtire a probelor
pentru analiza microbiologic
Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de
microorganisme de alterare din alimente
Determinarea numrului total de bacterii aerobe mezofile
L3 Determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri
Determinarea microorganismelor osmofile
L4 Determinarea bacteriilor sporulate aerobe i anaerobe
Determinarea bacteriilor de putrefacie
L5 Metode rapide, clasice i moderne de evaluare a calitii
microbiologice a alimentelor
Proba reductazei
Metode bazate pe utilizarea Petrifilmelor
L6 Tehnici de evaluare a microorganismelor indicatori
sanitari
Bacterii coliforme. Coliformi fecali si Escherichia coli
L7 Colocviu de laborator

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Pag 1


TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR
PENTRU ANALIZA MICROBIOLOGIC

1. Eantionarea probelor
Pentru efectuarea analizelor microbiologice, probele de analizat trebuie s reflecte
condiiile microbiologice existente n momentul recoltrii i s reprezinte fidel lotul din care
provine. De modul n .care se face recoltarea i transportuI probelor la laborator depinde
de multe ori rezultatul analizei. De aceea, o etap foarte important const n stabilirea
eantioanelor, a condiiilor de recoltare a probelor i de transport n condiii
corespunztoare la laboratorul de analize.
n activitatea de prelevare a probelor exist o terminologie general, i anume:
! lotul - reprezint cantitatea de produse cu aceleai caracteristici, realizate n
condiii tehnologice uniforme, ntr-o arj, schimb de producie sau ntr-o perioada
limitat de timp;
! elementul - este partea indivizibil a lotului;
! eantionul global - reprezint prob format prin mai multe prelevri din acelai lot;
! eantionul redus - este fraciunea reprezentativ dintr-un eantion global;
! eantionul de laborator - este fraciunea din eantionul global sau redus destinat
analizelor de laborator;
! prelevarea (recoltarea) - reprezint tehnica de recoltare a unui eantion elementar
dintr-un lot sau a unui element indivizibil.
Sunt posibile dou tipuri de recoltare a eantioanelor:
prelevarea elementelor cu defecte pentru a evidenia cauza producerii
acestora;
prelevarea la ntmplare a unor elemente care aparin unor condiii normale
de producie, pentru controlul calitii microbiologice. n acest caz sunt aplicate
metode statistice, astfel nct eantionul s fie statistic semnificativ.
Eantioanele se aleg prin tragere la sori, dup scheme prestabilite, pe baza tabelelor de
recoltare ce conin numere echivalente numrului de probe din lot, dar dispuse la
ntmplare (tabelul 1). Dup numerotarea elementelor lotului, se coreleaz aceste numere
cu cele din tabel, i, apoi, se preleveaz probele corespunztoare numerelor din tabel n
succesiunea stabilit de echipa de control. Astfel, pornind de la un punct i ntr-o ordine
arbitrar aleas se compune eantionul cu elementele corespunztoare. De exemplu, dac
se dorete ca dintr-un lot de 80 buci s se preleveze la ntmplare 5 probe, se vor
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Pag 2

preleva elementele corespunztoare numerelor primei linii din tabel: 07; 59; 66; 63; 46
(valoarea 97 este exclus pentru c nu exist).
Tabelul 1. Exemplu de ordonare aleatorie a elementelor unui lot n vederea eantionrii
07 59 66 97 63 46 18 42 62 56 68 93 43 12 48 68 87
45 01 64 32 48 85 43 84 10 24 32 26 62 65 90 57 06
32 36 52 26 54 28 95 13 08 32 92 24 87 91 13 18 72
62 44 03 61 09 37 48 42 28 49 58 54 36 07 15 68 12
84 88 65 64 14 01 20 79 16 11 22 54 46 39 79 14 89
96 44 92 77 26 52 29 34 45 04 45 37 23 66 02 05 92
74 50 33 45 66 25 42 27 25 09 39 18 08 90 72 75 26
54 41 90 46 51 73 98 35 84 59 78 96 05 59 89 61 38
80 95 01 67 22 84 05 97 09 46 62 73 17 63 46 45 83
96 47 23 51 45 37 83 09 17 71 96 79 58 92 78 70 80
53 62 97 78 95 08 84 61 71 59 49 20 83 56 61 85 88
52 50 28 59 26 29 62 89 83 10 13 25 32 72 83 58 75
45 53 94 02 22 22 08 91 36 76 59 69 05 89 14 98 14
98 26 99 26 14 91 52 01 85 24 45 52 95 27 25 94 63
89 39 07 26 11 26 45 52 63 65 79 03 12 93 28 37 45

Alegerea elementelor pentru analiz (x) se poate stabili pe baza formulelor:
n
N
x =
sau N x =
n care: N = numrul elementelor unui lot;
n = numrul eantioanelor de prelevat.

Dup stabilirea valorii x se numeroteaz i se asociaz n grupe diferite elemente ale
lotului notate de la 1 la x. Se extrage din fiecare grup elementul notat cu x.
Aceste tehnici sunt aplicabile att loturilor de produse finite din depozite, ct i pe fluxul de
fabricaie sau n momentul livrrii. Pe fluxul de fabricaie prelevarea se efectueaz, de
obicei, dup terminarea unei etape de procesare.
Pentru a fi semnificativ, eantionarea trebuie s fie realizat n timp, deoarece un
eantion constituit exclusiv din elemente succesive este puin reprezentativ pentru
ansamblul unei producii sau al unui lot.
Frecvena prelevrilor i a controlului depinde n general de nivelul produciei, riscurile de
contaminare, sau de apariia defectelor de fabricaie. n cazul unei producii mari, frecvena
prelevrilor va fi mai mare. Este de asemenea important s se efectueze analize ori de
cte ori au loc variaii la nivelul fabricaiei, generate de:
- schimbarea lotului de materie prim;
- fluctuaiile generate de modificarea schimbului;
- modificri sau reparaii ale utilajelor, .a.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Pag 3

Prelevrile se efectueaz pe elemente indivizibile (produse de dimensiuni mici, pachete
mici, cutii, .a.), din produse ambalate n vrac, sau pri dintr-un element de dimensiuni
mari.
Pentru acest domeniu se recomand analize n cadrul unui plan cu 2 sau 3 clase, fiecare
prelevare trebuie s fie compus din 5 probe (n=5).

2. Tehnici de prelevare
De cele mai multe ori prelevrile se efectueaz pe elemente indivizibile (cutii de conserve,
sticle, produse de dimensiuni mici, pachete mici .a.). n alte cazuri, probele se recolteaz
din produse n vrac sau pari dintr-un element de dimensiuni mari.
Prelevrile ce corespund primului caz sunt simple i nu necesit masuri de precauie
suplimentare.
Condiii generale de prelevare (recoltare)
Cantitatea de prob recoltat depinde de natura analizei i de planul de eantionare.
Omogenizarea
Repartizarea microorganismelor n produsul analizat nu este ntotdeauna omogen, mai
ales n cazul produselor voluminoase sau cu structuri eterogene. n asemenea cazuri se
recomand ca prelevrile s se realizeze din mai multe zone. De aceea este foarte
important s se cunoasc zonele cu riscuri mari de contaminare, sau se impune
omogenizarea produselor vrac nainte de prelevarea probelor.
Msuri aseptice
Este absolut necesar s se evite contaminarea suplimentar a probelor n timpul recoltrii
sau dup aceast etap. Pentru aceasta recipientele utilizate i instrumentele de recoltare
trebuie s fie sterile i protejate n ambalaje sterile.
Unele instrumente trebuie sterilizate la locul de recoltare.
Recoltarea produselor lichide
Se realizeaz apelnd la diferite tehnici, n funcie de natura produsului, de forma i
volumul recipientului. nainte de recoltare se recomand omogenizarea probei, care se
poate realiza manual, cu ajutorul unei baghete, sau cu ajutorul unui agitator mecanic steril,
precum i prin utilizarea sistemelor de omogenizare mecanic cu care sunt prevzute
recipientele. n funcie de volumul de produs ce trebuie recoltat se pot utiliza pipete sterile
sau instrumente speciale de recoltare (polonic steril sau flacon special). n cazul n care
recoltarea se face de la reea, se flambeaz gura robinetului, se las s curg o parte din
produs pentru a elimina microorganismele stagnante pe conduct i apoi se face
recoltarea propriu-zis.
Recoltarea produselor solide
n funcie de natura produsului, pentru recoltare se folosete scalpelul, sonda (de exemplu,
pentru brnz), pipeta tip harpon, etc.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Pag 4

Instrumentele trebuie s fie sterilizate.
n general, microorganismele de la suprafaa produsului,.expus contactului cu aerul, se
analizeaz prin metoda tamponului, iar cele din profunzime se analizeaz prin recoltare de
probe dup ce s-a ndeprtat o poriune de produs de la suprafa sau s-a cauterizat
suprafaa cu ajutorul unei spatule nclzite la rou. n cazul n care structura produselor
este neomogena semisolida sau semilichid este absolut necesar omogenizarea
probelor.

3. Pregtirea probelor pentru analiz
Prepararea eantionului presupune deschiderea aseptic a recipientelor nchise (produse
ambalate, sticle, cutii de conserve), omogenizarea i pregtirea extractelor lichide (n cazul
produselor solide).
Etichetarea
O mare atenie trebuie s se acorde etichetrii eantioanelor. Eticheta trebuie s cuprind
toate elementele necesare, i anume: numrul lotului, numrul de ordine, data, ora, locul
exact de unde s-a realizat recoltarea, modalitatea de recoltare (metoda eantioanelor,
tehnica de recoltare .a.).
Stabilitatea eantioanelor
Calitatea microbiologic a eantionului nu trebuie s se modifice n intervalul de timp de la
recoltare pn n momentul analizei. Principalii factori care influeneaz stabilitatea sunt:
temperatura i durata de pstrare, protecia fata de contaminrile externe.
Omogenizarea i mcinarea
n cazul produselor lichide proba ca atare reprezint suspensia iniial . Pentru produsele
solide este necesar obinerea i standardizarea suspensiei iniiale, prin stabilirea
raportului de diluie (n general 1:10 sau 1:5) ntre proba de analizat i lichidul de extracie
(diluare). Astfel, n cazul produselor dense se procedeaz n dou moduri:
- se cntrete n condiii aseptice o cantitatea de produs (de exemplu 10g), direct
n sistemul de mrunire, apoi se adaug un volum cunoscut de lichid de diluie (40
ml pentru diluia 1/5; 90 ml pentru diluia 1/10);
- se introduc n recipientul de mrunire o cantitate aproximativ de prob i se
cntrete tot ansamblul (tara recipientului fiind cunoscut), apoi se adaug lichidul
de diluie, n funcie de cantitatea de prob.
n ambele cazuri concentraia suspensiei iniiale este perfect definit n raport cu produsul
de analizat. Astfel, x ml suspensie corespund la y g produs analizat. Rezultatele analizei
se raporteaz la 1 ml suspensie sau 1 g produs.
Dup cntrire n condiii aseptice, probele constituite din produse solide sau eterogene
sunt omogenizate, n paralel cu extracia microorganismelor n lichidul de diluie, aplicnd
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Pag 5

diverse tratamente precum: mojarare manual cu nisip steril sau bile de sticl sau
mrunire mecanic .
Pentru mojararea cu nisip steril sau bile de sticl se utilizeaz un mojar care conine 5-20
g nisip special, steril, sau bile din sticl (=0,5 mm). Mojararea se realizeaz manual n
apropierea becului Bunsen. Pe parcursul mrunirii se adaug 2-5 volume de ap steril.
Proba se las n repaus timp de 5 minute, apoi se colecteaz supernatantul ntr-un vas
steril. Aceast metod nu este ntotdeauna practic, dar este simpl i nu necesit
aparatur special.
Tehnicile moderne de omogenizare prevd utilizarea sistemelor performante, care permit
meninerea condiiilor aseptice i o bun eliberare a microorganismelor n lichidul de
extracie. Pentru acest scop sunt comercializate diferite tipuri de omogenizatoare
peristaltice: Stomacker (Stomacker / Seward-Bioblock-OSI-Prolabo), Digi-system,
Ultraturax, Waring Biender/ Bioblock-OSI-Prolabo, etc.
n cazul utilizrii omogenizatorului Stomacher proba de analizat (dimensionat, g) i un
volum corespunztor de lichid de extracie (diluie) sunt introduse ntr-o pung de plastic
steril (de unic folosin), care se nchide ermetic i se monteaz n aparat pentru
omogenizare, prin intermediul unor palete speciale. Pungile sterile din material plastic
trebuie s aib o capacitate suficient pentru a permite amestecarea corect a probei cu o
cantitate echivalent de lichid de diluare. n general, volumul recipientului trebuie s fie
egal cu aproape de dou ori volumul probei plus volumul soluiei de diluare.
Recent, a fost realizat un nou aparat, care funcioneaz dup un principiu similar cu
aparatul tip Stomacher, la care ns s-a mbuntit tehnica de omogenizare prin vibraii
(fig.1). Acest tratament (vitez vibratorie mare) ofer o eliberare a microorganismelor (n
general a bacteriilor) n lichidul de diluare similar cu cazul prelucrrii probei n stomacher
(grad de similaritate a rezultatelor de 96%), ns asigur obinerea unui extract clar cerin
impus de analizele moderne precum: evaluarea cantitativ a microbiotei prin ATP
bioluminiscen, teste imunologice i analize PCR (din limba englez Polymerase Chain
Reaction) (Fung 1999).

Figura 1. Sisteme de omogenizarea tip Pulsifier
Pentru unt i margarin protocolul de pregtire a probelor prevede o serie de etape
preliminare, particulare, n concordan prevederile impuse de unele normative (adaptare
dup Tofan i colab, 2002):
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Pag 6

1) Proba este topit pe baie de ap la 45
o
C i omogenizat. Se prepar diluia 1:10
prin prelevarea a 10 ml produs topit i transferare ntr-un flacon de 200 ml, care conine 90
ml soluie Ringer cu 0,1% geloz, pentru stabilizarea emulsiei. Diluantul i pipetele
trebuie s aib temperatura de 45
o
C. Alte diluii i analizele microbiologice trebuie
realizate n urmtoarele 10 minute.
2) Se preleveaz n condiii aseptice 2,5 g produs, care sunt apoi transferate ntr-o
eprubet de analiz coninnd 2,1 ml de soluie Ringer , i se termostateaz la 45
o
C
pn la topire. Dup omogenizare, amestecul este meninut pe baie de ap (la 45
o
C) pn
la separarea celor dou faze. Faza apoas este utilizat pentru analiza microbiologic .
3) O cantitate de 50 g de prob se suspend n 42 ml de soluie 0,1 M tampon fosfat
(pH=7,58,0), apoi se termostateaz la 4045
o
C pn la topire (timp de maximum 1 h, cu
agitare intermitent ). Separarea fazelor este realizat n final prin centrifugare n condiii
aseptice, timp de 110 minute, la 2000-3500 rpm. Faza apoas este utilizat pentru
examen microbiologic.
O alt mbuntire a vizat tehnica de realizare a diluiilor. Prin realizarea unui instrument
de dispersie (dispersor) este posibil transferul automat i aseptic a unui volum cunoscut de
lichid de diluare pentru realizarea suspensiei iniiale sau a diluiilor decimale.
Astfel, cu ajutorul unui dispozitiv denumit DILUFLO pot transfera volume variabile de lichid
de diluie, cuprinse ntre 0,1 ml i 100 ml, direct n pungi sau vase sterile, n care s-a
introdus n prealabil aseptic proba de analiz .
Instrumentul poate fi programat pentru a realiza diluii 1:10, 1:50, 1:100 sau orice raport de
diluie, realiznd transferul automat a unui volum corespunztor de lichid, n funcie de
greutatea probei solide sau volumul probei lichide luate n analiz (fig. 2).

Figura 2. Sistem automat de realizare a suspensiei iniiale
n general, condiiile particulare de eantionare i pregtire a probelor de analiz sunt
precizate n standardele specifice pentru evaluarea calitii microbiologie a fiecrui produs.
n absena unor standarde specifice disponibile, sau n cazuri speciale, metodologia se
adapteaz la condiiile specifice din laborator, cu respectarea regulilor generale de
analiz.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 1

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE
MEZOFILE

DEFINIII
Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt la suprafaa
lichidelor, a mediilor solide.
Bacteriile mezofile reprezint grupul majoritar cu temperaturi minime la 15-20C,
temperaturi optime n intervalul 30 - 40C i maximum la temperaturi peste 45C

PRINCIPIUL DE DETERMINARE A NUMRULUI DE BACTERII AEROBE MEZOFILE
Numrul de bacterii aerobe mezofile se apreciaz indirect, pe baza numrului de colonii
generate de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat, care se
formeaz cnd proba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv, dup
termostatare la 37C, timp de 48 de ore.
Numrul de bacterii aerobe mezofile reprezint un indicator valoros pentru aprecierea
calitii generale i a stabilitii la pstrare a produselor alimentare.

MODUL DE LUCRU
Se iau dou cutii Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc, n fiecare cutie, cte 1 cm
2
prob de analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 cm
2
diluie iniial, n cazul altor
produse. Se realizeaz apoi prima diluie decimal a probei de analizat (10
-1
). Se repet
aceste operaii cu diluiile urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare
diluie decimal.
Se toarn n fiecare cutie Petri cte cca. 15 cm
2
mediu PCA (Plate Count Agar) cu
temperatura de 455C.
Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt
lsate n repaus pn se produce solidificarea lor.
Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat,
temperatura la care se va face termostatarea.
Plcile ce conin mediul solidificat se plaseaz cu capacul n jos, pentru 48 de ore, n
termostat cu temperatura de 37C.

PARTICULARITI PRIVIND NUMRAREA COLONIILOR
Dup termostatare, se aleg pentru numrare plcile care conin un numr colonii cuprins
ntre 25 i 250, acestea trebuie s fie repartizate pe o suprafa mai mare de 25% din
suprafaa total a mediului de cultur. Pentru numrare se poate adopta:
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 2

numrarea manual, cu ajutorul unui numrtor electronic (care la atingerea fiecrei
colonii o contabilizeaz n memoria sa), pentru a evita erorile de numrare;
numrare automatizat, utiliznd instrumente speciale de numrare, cnd se consum
numai 10% din timp, comparativ cu numrarea manual. Exist totui i unele limitri ale
acestui procedeu i anume: pot s apar erori de numrare n cazul prezenei n mediu a
unor impuriti solide sau bule de gaz; nu se obin rezultate bune cnd coloniile au
diametru mare i sunt rspndite pe o suprafa mare etc.
La numrare pot fi ntlnite urmtoarele tipuri de colonii:
lanuri de colonii, care aparin unei singure surse (celule asociate, n perechi, lanuri,
pachete etc.). n acest caz se va numra ntregul lan ca o singur colonie;
colonii dezvoltate n filmul de ap dintre baza mediului de cultur i suprafaa capacului
inferior;
colonii dezvoltate n filmul de ap de la suprafaa mediului cu agar.
Rezultatele se exprim, dup caz, n uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml
produs, astfel:
1) Plcile din dou diluii succesive conin 25250 colonii pe plac:
( )
d n n
C
ml g ufc
+
=

) 1 , 0 (
/
2 1

n care:

C = suma coloniilor numrate n toate plcile reinute;


n
1
= numrul de plci reinute din prima diluie;
n
2
= numrul de plci reinute din a doua diluie succesiv;
d = factor de diluie corespunztor primei diluii
Rezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10
x
, unde x este puterea
atribuit numrului 10.
Exemplu: Dac la numrare au fost alese cte 2 plci corespunztoare diluiilor a doua i
a treia, iar numrul de colonii din cele 4 plci reinute este:
la prima diluie reinut, 10
-2
: 232 i 244 colonii;
la a doua diluie reinut, 10
-3
: 33 i 28 colonii.

( )
( ) [ ]
4
2
2 1
10 4 , 2 24409
022 , 0
537
10 2 1 , 0 2
28 33 244 232
) 1 , 0 (
/ = =
+
+ + +
=
+
=

d n n
C
ml g ufc
(prin rotunjire la dou cifre semnificative*)


MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 3

* Exemplu:
ufc calculat ufc
estimat
12700 13000
12400 12000
15500 16000
14500 14000
Prin analiz statistic s-a stabilit c n 95% din cazuri limitele de ncredere ale acestei
metode variaz de 12% la 37% (pentru numrul total de microorganisme aerobe) i
ntre 16% la 52%. n practic ns se pot obine variaii mai mari ce deriv din condiiile
de analiz aplicate i experiena analistului.
2) Plcile inoculate din dou diluii succesive conin mai puin 25 colonii. Se aplic
modul de calcul prezentat mai sus. Plcile inoculate n paralel din proba de analizat (d = 1,
produse lichide) sau suspensia iniial (d =10
-1
, produse solide), conin mai puin de 25
colonii:
( )
d
C
ml g ufc

2
/
Conform SR ISO 4833, pentru o abatere medie ptratic r
2
=0,95, intervalele de variaie a
numrului posibil de ufc, pentru plcile n care se dezvolt mai puin de 15 colonii, sunt
prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Limite de ncredere pentru estimri n cazul unui numr de colonii sub baremul
minim
Numr de
colonii/plac
Interval posibil de
variaie a ufc
Numr de
colonii/plac
Interval posibil de
variaie a ufc
1 <12 9 414
2 <14 10 416
3 <15 11 518
4 16 12 619
5 29 13 720
6 210 14 721
7 212 15 823
8 313

3) n plcile inoculate n paralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau
suspensia iniial (d =10
-1
, produse solide) nu s-a dezvoltat nici o colonie:
ufc/ml < 1 (produse lichide)
ufc/g < 1 10
-1
(produse solide)
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 4

4) Cnd plcile conin mai mult de 250 (sau 300) de colonii, numrarea se poate
realiza:
pe anumite sectoare delimitate ale suprafeei plcii =
tor
n
n
sec
nr. sectoare
delimitate (4, 8 sau 16)
pe o suprafa delimitat (ptrat) de 1 cm
2
, astfel: cnd numrul de colonii pe un ptrat
este mai mare de 10 se numr la ntmplare coloniile de pe 4 zone reprezentative, se
determin media aritmetic, apoi se raporteaz la suprafaa total a plcii Petri; cnd
numrul de colonii distribuite pe un ptrat este mai mic dect se numr coloniile de pe 12
ptrele reprezentative, se determin media aritmetic, apoi se raporteaz la suprafaa
total a plcii Petri.
5) Cnd numrul de colonii pe plac este foarte mare rezoluia este imposibil
numrarea, concentraie de celule mult mai mare dect diluia estimat.
6) Cnd se produce contaminarea accidental sau se obin rezultate neconcludente
rezoluia este analiz efectuat necorespunztor.


MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
REZULTATE LUCRARE nr. __________
Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE
MEZOFILE

1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n
plcile selectate pentru numrare)
Proba
Diluia
Nr. colonii/plac

1
2
3
4



2. Stabilii gradul de contaminare exprimat n uniti formatoare
de colonii (ufc) per gram sau ml produs:
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
Proba 3 _______________
Proba 4 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 1


DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE DROJDII SI MUCEGAIURI

DEFINIII
Drojdii microorganisme eucariote, mono sau pluricelulare, care se reproduc asexuat
prin nmugurire sau, mai rar, prin sciziune. Unele drojdii se pot reproduce si sexuat
(meioz). Majoritatea drojdiilor sunt saprofite i multe dintre ele au activitate
fermentativ.
Mucegaiuri microorganisme eucariote, care prezint organe de reproducere
difereniate. Sunt agenii mucegirii.
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza (Anexa 1)

PRINCIPIUL METODEI
Prin aceast metod, numrul de drojdii i mucegaiuri se apreciaz indirect, pe baza
coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat,
care se formeaz cnd proba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu
nutritiv gelozat, dup termostatare la 25C timp de 72 de ore.

ECHIPAMENTE
Omogenizator
Balan analitic
Termostat reglat la 25C
Baie de ap pentru fluidificarea mediului de cultur reglat la 45C

MATERIALE I STICLRIE
25g produs alimentar
225 ml 0.1% apa peptonat
Cutii Petri 10 cm sterile
Pipete de 1 cm
3
i 10 cm
3
sterile
Eprubete cu ser fiziologic steril, cte 9 cm
3
per eprubet
Baloane cu ser fiziologic steril
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 2

Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide
Numrtor de colonii
Reactivi pentru determinare
Mediu de diluare: Soluie ser fiziologic
Mediu de cultur: Anexa 2

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
Se cntresc 25 g proba produs alimentar, peste care se adaug 225 ml apa
peptonat. Se omogenizeaz timp de 1 min.
Pentru diluarea probei se aplic schema de diluie din figura 1.

Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea diluiilor si inocularea probelor
*Toate probele se realizeaz in duplicat.
Cu o pipet steril se transfer n fiecare cutie Petri sterila, cte 1 cm
2
prob de
analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 cm
2
diluie iniial, n cazul altor produse.
Se realizeaz apoi prima diluie decimal a probei de analizat (10
-1
). Se repet aceste
operaii cu diluiile urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare diluie
decimal (Fig.1).
Se toarn n fiecare cutie Petri cte cca. 15 cm
2
mediu PCA (Plate Count Agar) cu
temperatura de 455C.
Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt
lsate n repaus pn se produce solidificarea lor.
* Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat, temperatura la
care se va face termostatarea.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 3

Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, pentru 3-5 zile la
temperatura de 25-28C.

REZULTATE
Se rein cutiile care conin 15300 de colonii. Numrul de ufc de drojdii i mucegaiuri
per ml sau gram de produs se calculeaz ca medie ponderat, cu formula urmtoare:
d n n
C
ml g ufc
+
=

) 1 , 0 (
) ( /
2 1

unde
C suma coloniilor numrate n toate cutiile reinute;
n
1
numrul de cutii reinute dintr-o diluie
n
2
numrul de cutii reinute din diluia succesiv
d factorul de diluie corespunztor primei diluii din care s-a realizat reinerea
plcilor.
Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative.
Se exprima gradul de contaminare printr-un numr cuprins ntre 1,0 i 9,9 multiplicat cu
10
x
, unde x este puterea atribuit lui 10.
Dac cele dou cutii Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluiei
iniiale (alte produse) conin mai puin de 15 colonii, se face media aritmetic, m, a
coloniilor numrate n cele dou cutii.
Rezultatul se exprima sub forma:
- numr de ufc de drojdii i mucegaiuri estimat per ml:
N
E
=m (produse lichide)
- numr de ufc de drojdii i mucegaiuri estimat per gram
N
E
=md
-1
(alte produse), n care d este factorul de diluie al diluiei iniiale (alte produse).
Dac cele dou cutii Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluiei
iniiale (alte produse) nu conin nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma:
- mai puin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide);
- mai puin de 1d
-1
ufc de

drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)


MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 4


ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA
ANALIZA


Nr.crt. Grupe de produse
1. Pine i produse de panificaie
2. Produse lactate acide si brnzeturi
3. Carne i produse din carne
4. Uleiuri, grsimi i semine oleaginoase
5. Fructe. Legume i produse prelucrate
6. Buturi alcoolice
7. Buturi nealcoolice
8. Finuri proteice, furaje , roturi
9. Zahr i produse zaharoase
10. Cereale i produse din cereale
11. Produse de cofetrie i patiserie
12. Condimente, supe, sosuri, salate





MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 5

ANEXA 2

CONDIII DE CULTIVARE I COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU
NUMRAREA MICROORGANISMELOR

Condiiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele romneti
adaptate la condiiile ISO (SR ISO) sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Condiii de cultivare pentru numrarea microorganismelor impuse de normativele
ISO
Grup de microorganisme Medii de cultur Condiii de termostatare
Temperatur/timp
Numr total de microorganisme
aerobe, care se dezvolt la
30C (bacterii, drojdii i
mucegaiuri)
- PCA 30C/72h 3h
Drojdii i mucegaiuri - YGC
- OGA (OGYE)
25C/5 zile

Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii
de microorganisme este prezentat n tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru determinarea i confirmarea
numrului de uniti formatoare de colonii
Indicator microbiologic Compoziie medii de cultur, gl
-1
Numr total de microorganisme PCA
(engl. Plate count agar
1)
;
SMA- Standard methods agar
2)
)
Tripton ..................... 5,0g
Extract de drojdie ...... 2,5g
Glucoz anhidr .......... 1,0
Agar-agar ........ 12,0-18,0g
Ap pn la .......... 1000ml
pH=7,2
Mediul este disponibil comercial.
Drojdii i mucegaiuri YGC
(Extract de drojdie, glucoz, cloramfenicol agar )
Extract de drojdie ......... 5g
Glucoz ...................... 20g
Cloramfenicol ............ 0,1g
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 6

Agar-agar ................... 15g
Ap pn la .......... 1000 ml
pH=6,6

OGA (OGYE)
(Oxitetraciclina glucoz agar)
Extract de drojdie ......... 5g
Glucoz ...................... 20g
Agar-agar ................... 16g
Ap pn la ........... 1000ml
pH=7,2
n momentul utilizrii, n mediul fluidificat se
adaug 100 ml soluie 1mg/ml oxitetraciclin.
Geloz nutritiv (geloz alba)
Agar-agar ......................... 1218g
Ap pn la ...................... 1000 ml





MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
REZULTATE LUCRARE __________
Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE DROJDII I
MUCEGAIURI

1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n
plcile selectate pentru numrare)
Proba
Diluia
Nr. colonii/plac

1
2
3

2. Stabilii gradul de contaminare exprimat n uniti formatoare
de colonii (ufc) per gram sau ml produs
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
Proba 3 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 1

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE I
ANAEROBE

DEFINIII
Bacteriile sporulate aerobe sunt bacterii care aparin genului Bacillus. Sunt bacterii
Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica, cu dimensiuni diferite, cu capetele
drepte sau rotunjite, singulare sau asociate in unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanuri.
Sporii nu se coloreaz prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic
sau egal dect al celulei, fiind poziionai central sau terminal.
Bacteriile sporulate anaerobe sunt bacterii care aparin genului Clostridium. Sunt
bacterii Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica cu dimensiuni mai mari dect
cele din genul Bacillus, singure sau in lanuri, care formeaz endospori dispui
central sau terminal, care dau celulelor forma de suveic sau paleta.
Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n
Anexa 1.

PRINCIPIUL METODEI
Determinarea microorganismelor sporulate aerobe i anaerobe estimeaz numrul
microorganisme in stare sporulata prezente per g sau ml de produs.
Proba de analizat sau diluii succesive se supun pasteurizrii la 80C timp de 10
minute, pentru a distruge toate formele vegetative , apoi se rcete si se inoculeaz
in medii specifice, cultivarea realizndu-se in condiii particulare in condiii aerobe
sau anaerobe.

MATERIALE I ECHIPAMENTE SPECIALE
1. Baie de ap reglabil la 45C i la 80C
2. Stomacher pH-metru.
3. Plci Petri.
4. Termostat reglabil la 37C
5. Anaerostat sau Recipient pentru cultivare in anaerobioza
6. Numrtor de colonii
7. Reactivi si medii de cultura: mediu de diluare (ap peptonat), medii de
cultur: (Anexa 2),.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
Testul se efectueaz n conformitate cu instruciunile de mai jos:
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 2

Manipularea eantioanelor
n laborator, nainte de analiz, cu excepia produselor alimentare care nu necesit
condiii speciale de depozitare, probele se pstreaz fie la frigider la temperatura de
0-5C, fie congelate, n funcie de natura produsului.
Prepararea mediilor de cultur
Se pregtete mediul Trypticase Soy Agar n cantiti corespunztoare i se
sterilizeaz.
Se tempereaz mediul de cultur ntr-o baie de ap la temperatura de 45C,
asigurndu-se c nivelul apei este de 1 cm peste nivelul de mediu din eprubete.
Se cur zona de lucru cu un dezinfectant adecvat.
Se marcheaz n mod clar plcile Petri cu numrul probei, diluia i data
termostatrii.
Pregtirea diluiilor
Se prepar un raport de diluie de 1:10 a produsului alimentar, prin suspensionare a
de 10g (ml) produs n 90 ml ap peptonat. Probele se omogenizeaz:
- timpul de amestecare nu trebuie s depeasc 2.5 min, n scopul prevenirii
supranclzirii.
- n cazul produsele alimentare care au tendina de a spuma, este indicat
agitarea moderata.
- diluiile se omogenizeaz prin meninere pe vortex ( de 25 de ori, printr-un arc
de 30 cm, n aproximativ 7 sec).
Pentru fiecare prob de analizat, se pipeteaz 20-25 ml din diluia 10
-1
ntr-o
eprubet steril. Se plaseaz eprubetele n baia de ap la 80

C. si se menin timp de
20 de minute. Dup rcire se prepar diluii (diluii recomandate sunt de 10
-1
,10
-2
, i
10
-3
).
Inocularea si termostatarea probelor
Cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 ml prob de
analizat.
Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 ml mediu de cultur cu temperatura de
455C.
Mediile se uniformizeaz rapid, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate
n repaus pn se produce solidificarea.
Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos.
Pentru bacteriile aerobe sporulate, plcile se termostateaz la 35
o
C 0.5
o
C timp
de 48 2 ore.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 3

Pentru bacteriile anaerobe sporulate, plcile se termostateaz 35
o
C 0.5
o
C timp
de 48 2 ore. ntr-un sistem anaerob de cultivare cum ar fi sistemul BBL Gaspack
(Anexa 3).
Numrarea coloniilor
Coloniile se numr imediat dup perioada de termostatare.
Dac este posibil, se selecteaz plcile cu 20-200 colonii.

REZULTATE
Numrul de bacterii formatoare de spori per ml sau gram de produs se calculeaz cu
urmtoarea formula:
Plcile din dou diluii succesive conin 25250 colonii pe plac:
( )
d n n
C
ml g ufc
+
=

) 1 , 0 (
/
2 1

n care:

C
= suma coloniilor numrate n toate plcile reinute;
n1 = numrul de plci reinute din prima diluie;
n2 = numrul de plci reinute din a doua diluie succesiv;
d = factor de diluie corespunztor primei diluii
Rezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10x, unde x este puterea
atribuit numrului 10.













MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 4


PROCEDURI PARTICULARE DE ANALIZA PENTRU ANUMITE GRUPE DE
PRODUSE ALIMENTARE

Bacterii sporulate aerobe mezofile din zahr
Din proba de analizat se executa in condiii aseptice diluia 1/5 prin cntrire a 20g
zahr i dizolvarea n 80 ml ap steril.
Pentru inactivarea termic a formelor vegetative se face pasteurizarea prin
meninerea diluiei 1/5 pe baie de ap la 80C, timp de 20 minute i rcire n jet de
ap rece.
Din proba pasteurizat si rcit, cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri
steril, cte 1 ml prob de analizat. Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 ml
mediu de cultur cu temperatura de 455C.
Plcile se termostateaz la 32
o
C 1
o
C timp de 48 3 ore.
Numrul de bacterii sporulate aerobe mezofile se raporteaz la 10 g zahr.
Bacterii anaerobe sporulate din lapte
Se execut prin metoda Weinyirl n probe de lapte destinat fabricrii brnzeturilor.
n 5 eprubete sterile ce conin parafin (cca. 1ml in stare fluida) se introduc cte 5 ml
proba de analizat (lapte destinat fabricrii brnzeturilor). Dup pasteurizare
(meninere 10 minute la 80C) i termostatare 48 ore la 24-48C se apreciaz
eprubetele pozitive, n care s-a produs deplasarea dopului de parafin.
Interpretarea rezultatelor
Lapte calitate buna - Toate eprubetele sunt negative
Lapte calitate satisfctoare 1 eprubeta pozitiva din 5
Lapte de calitate nesatisfctoare 2 pn la 5 eprubete pozitive.








MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 5


ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA



Nr.crt. Grupe de produse
1. Finuri
2. Lapte
3. Produse lactate acide i brnzeturi
4. Carne i produse din carne
5. Conserve alimentare
6. Zahr i produse zaharoase
7. Produse deshidratate
8. Condimente i plante aromate












MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 6


ANEXA 2
CONDIII DE CULTIVARE I COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU
NUMRAREA MICROORGANISMELOR

Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de
microorganisme este prezentat n tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru determinarea i confirmarea
numrului de uniti formatoare de colonii
Indicator microbiologic Compoziie medii de cultur, g/l

Bacterii sporulate aerobe BD Trypticase Soy Agar
Extract pancreatic de cazein.15,0 g Clorur de sodiu 5,0
Extract papaic de soia ..5,0 Agar .15,0
pH 7,3 0,2*Ajustat i/sau completat n funcie de necesiti
pentru a corespunde criteriilor de performan.
Bacillus cereus MYP
Mediu de baz ................. 90 ml
Soluie polimixin B ......... 1,0ml
Emulsie de glbenu de ou10,0ml
Se lichefiaz mediul de baz, se tempereaz la 50C, apoi se adaug
aseptic celelalte componente.
Mediul de baz Soluie de polimixin B
Extract de carne ..................1,0g
Pepton ............................10,0g
D-manitol ..........................10,0g
Clorur de sodiu ..............10,0g
Rou de fenol ................. 0,025g
Agar-agar .................. 12g-18g
3)
Ap pn la ................... 900 ml
pH=7,2, la 25C
Sulfat de polimixin B ...... 10
6
UI
Ap pn la ..................... 100 ml

Agar glucozat
Tripton ............................10,0g
Extract de drojdie ...............1,5g
Glucoz .............................10,0g
Clorur de sodiu .................5,0g
Purpur de bromcrezol .... 0,015g
Agar-agar ................... 12g-18g
3)

Ap pn la .................. 1000 ml
pH=7,0 (la 25C, dup sterilizare)
Mediul Voges-Proskauer (VP)
Pepton ..............................7,0g
Glucoz ...............................5,0g
Clorur de sodiu .................5,0g
K
2
HPO
4
................................ 5,0g
Ap pn la .................. 1000 ml
pH=7,0 (la 25C, dup sterilizare)
Mediul cu nitrat
Pepton ..............................5,0g
Extract de carne ..................3,0g
Azotat de potasiu................1,0g
Ap pn la .................. 1000 ml
pH=7,0 (la 25C, dup sterilizare)


MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
Pag 7

ANEXA 3
SISTEME DE CULTIVARE IN ANAEROBIOZA


1. Sistemele GasPak sunt sisteme utilizate pentru crearea atmosferei
controlate (anaerobioza, microaerofilie, mbogita in CO
2
).

Figura a. Sisteme anaerobioza (GASPACK)
Containerele sunt rezistente la ocuri si sistemul perfect de etaneizare transforma
sistemele GasPak EZ in condiii ideale de stocare si transport. Noua tehnologie,
bazata pe un sistem rectangular de termostatare, etaneizare uoar si rezisten la
ocuri, minimizeaz riscul apariiei condensului, asigurnd astfel o vizibilitate
perfecta a coloniilor bacteriene. Structura sistemului anaerob si indicatorii CO
2

asigura metoda optima de obinere a condiiilor anaerobe.

2. Anaerostate sunt sisteme din care oxigenul a fost ndeprtat sau
nlocuit cu un amestec controlat de alte gaze.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
REZULTATE LUCRARE __________
Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE I
ANAEROBE

1. nregistrai in tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n
plcile selectate pentru numrare)
Proba
Diluia
Nr. colonii/plac

1
Stabilii gradul de contaminare exprimat in uniti formatoare de colonii
(ufc) per gram sau ml produs
Proba 1 _______________

2. nregistrai in tabelul de mai jos eprubete pozitive i negative,
stabilind in funcie de rezultatele obinute calitatea probei
analizate
Proba Eprubetele testate
1 2 3 4 5
1

Proba 1 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 1

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE

PRINCIPIUL METODEI
Drojdiile, mucegaiurile i bacteriile osmofile sunt microorganisme capabile s se
creasc ntr-un mediu cu concentraii ridicate de zahr sau sare producnd alterri care
conduc la modificarea calitii senzoriale i a valorii nutritive a alimentelor (Anexa 1).
Prin aceast metod, numrul de microorganisme osmofile se apreciaz prin examen
cultural indirect, pe baza coloniilor formate microorganismele prezente n proba de
analizat, sau o diluie a acesteia, prin cultivare pe medii specifice solidificate,
suplimentate cu 10% zahar sau sare, dup termostatare optim.
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza: zahr i produse
derivate, produse conservate prin adaos de zahar, lapte condensat, amestecuri de
srare, saramuri i produse conservate prin srare.

MATERIALE I ECHIPAMENTE
1. Mediu de baza (Anexa 2):
Pentru bacterii: dextroz, 110 g; Plate Count Agar 23.5 g, ap distilat,
1.000 ml.
Pentru drojdii i mucegaiuri: mediu hiperglucidic
2. Mediul de diluare:zaharoz sau NaCl 400 g; ap distilat 1000 ml.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
Pentru obinerea diluiilor decimale pot fi folosite dou tehnici pentru orice tip de prob
luat n analiz. Numrul de diluii depinde de calitatea microbiologica a probei luate in
analiza, i anume:
Din proba de analizat se executa in condiii aseptice diluia 1/5, prin
transferul a 20g prob n 80 ml mediu de diluare. Aceasta reprezint diluia iniial -
1:5 (proba martor). Se transfer aseptic 20 ml din proba martor n 80 ml mediu de
diluare, proba este astfel diluata cu un factor de diluare de 25.
Se cntresc in condiii aseptice 10 g prob de analiza i se transfera n
90 ml mediu de diluare, obinnd diluia nti, din care se obin alte diluii decimale
prin diluare succesiva.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 2

Cu o pipet steril se transfer n 2 placi Petri in paralel, cte 1ml prob de analizat. Se
repartizeaz n fiecare cutie Petri cte cca. 15ml mediu de cultur fluidificat i temperat
la temperatura de 455C.
Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt
lsate n repaus pn se produce solidificarea lor
1.

Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos in urmtoarele
condiii:

A. Bacterii osmofile
Plcile Petri se termostateaz la 35-37C timp de 48 3 ore (2 zile). Se rein plcile
care conin 25250 de colonii. Se numr colonii formate, realizndu-se media
aritmetic a plcilor realizate n dublu exemplar i se stabilete numrul de uniti
formatoare de colonii per ml sau gram de produs.
B. Drojdii i mucegaiuri osmofile
Plcile Petri se termostateaz la 25-30C timp de 72 h (3 zile). Daca coloniile formate
sunt de dimensiuni mici, se extinde perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile). Se
numr colonii formate, realizndu-se media aritmetic a plcilor realizate n dublu
exemplar i se stabilete numrul de uniti formatoare de colonii per ml sau gram de
produs.
Se nregistreaz numrul de drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs

REZULTATE
Numrul de microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculeaz cu
urmtoarea formula:
ufc/g(ml) = nd
unde
n este numrul mediu de colonii/plac
d este factorul de diluie.
Se aplica aceeai formula de calcul ca i la bacterii aerobe mezofile sau drojdii i
mucegaiuri


1
Pe capacul plcilor Petri se noteaz: denumirea i numrul probei, mediul de cultura, diluia din care se realizeaz
inocularea, temperatura la care se realizeaz termostatarea.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 3


ANEXA 1
MICROORGANISME OSMOFILE CONTAMINATE ALE PRODUSELOR
ALIMENTARE


Microorganism
Drojdii
a
W min

Saccharomyces rouxii 0.62
Saccharomyces bailii 0.80
Saccharomyces cerevisiae 0.90
Debaryomyces 0.83

Bacterii
Genul Hallobacterium (H. salinarium, H. morrhnae)
Genul Hallococcus











MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 4

ANEXA 2

COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR


Tabelul 1. Compoziia mediilor de cultur recomandate

Mediu de cultura/Denumire Compoziie medii de cultur, gl
-1
PCA
(engl. Plate Count agar)
Tripton ......................... 5,0g
Extract de drojdie .......... 2,5g
Glucoz anhidr ............... 1,0
Agar-agar ............. 12,0-18,0g
Ap pn la .............. 1000ml
pH=7,2
Mediul este disponibil comercial.
Mediu hiperglucidic Extract de drojdie ........... 10g
Glucoz ......................200,0 g
Uree .............................. 1,0 g
Agar-agar ............. 12,0-18,0g
Ap pn la .............. 1000ml



MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE
REZULTATE LUCRARE __________
Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE


1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n
plcile selectate pentru numrare)
Proba
Diluia
Nr. colonii/plac

1
2

2. Stabilii gradul de contaminare exprimat n uniti formatoare
de colonii (ufc) per gram sau ml produs:
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 1

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACIE

PRINCIPIUL METODEI
Bacteriile de putrefacie sunt microorganisme care produc hidroliza proteinelor de
origine animal pn la produi simpli, gaze, NH
3
, H
2
S, amine biogene, compui indolici.
Primele semne ale alterrii prin putrefacie sunt formarea de mucus, apariia mirosului
neplcut i modificarea gustului.
Bacteriile de putrefacie aparin urmtoarelor genuri: Pseudomonas, Bacillus,
Enterobacter, Escherichia, Proteus, Clostridium etc.
Determinarea lor are la baz dou principii:
I. Evidenierea hidrolizei substratului de natur proteic, astfel se determin
bacteriile cazeinolitice (produc hidroliza cazeinei).
II. Evidenierea produilor finali ai hidrolizei proteinelor prin realizarea de teste
biochimice reunite in testul HIL (H - evidenierea producerii de hidrogen
sulfurat; I - evidenierea producerii de indol; L- capacitatea de a lichefia
gelatina)
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: carnea,
preparatele din carne sau pete, brnzeturile.

MATERIALE I ECHIPAMENTE
1

1. Mediul de baza:Plate Count Agar cu 1% cazein sau 10% lapte;
2. Mediul de diluare: ap peptonat;
3. Reactivi pentru testele biochimice: reactiv Erlich sau Kovacs, acetat de plumb.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
Se pregtete suspensia iniial prin cntrirea a 10 g prob, peste care se adaug 90
ml ap peptonat. Se omogenizeaz timp de 1 min.
a. determinarea bacteriilor cazeinolitice
Se realizeaz diluii decimale. Prin tehnica cultural Koch se fac inoculri in mediu PCA
suplimentat cu 1% cazein sau 10% lapte.

1
Anexa 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 2

Mediile se uniformizeaz rapid n plci Petri sterile, prin rotirea plcilor n plan orizontal,
apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor
2
.
Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, timp de 48h, la
temperatura de 37C.
Bacteriile care prezint capacitatea de a hidroliza cazeina vor prezenta n jurul coloniilor
o zon clar incolor comparativ cu restul mediului care este opac. Aceasta deoarece,
bacteriile cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare care difuzeaz n
exteriorul coloniilor i hidrolizeaz cazeina.

b. determinarea produilor finali ai hidrolizei proteinelor - testul HIL
Testul H evideniaz prezena hidrogenului sulfurat, rezultat din proteoliza proteinelor
Se transfer 1ml suspensie iniial ntr-o eprubet cu 9 ml ap peptonat steril. Se
plaseaz deasupra lichidului o hrtie steril mbibat n acetat de plumb. Proba se
termostateaz la temperatura de 37C, timp de 48h. Proba este pozitiv dac hrtia se
nnegrete, ca urmare a formarii de sulfura de plumb, prin reacia dintre acetatul de plumb
si H
2
S care se degaja.
Testul I evideniaz prezena indolului
Se transfer 1ml suspensie iniial ntr-o eprubet cu 9 ml ap peptonat steril. Proba se
termostateaz la temperatura de 37C, timp de 48h, apoi se adug 1 ml reactiv Kovacs
sau Erlich. Proba se consider pozitiv prin apariia unui inel de culoare roie la interfaa
mediu-reactiv, care indic prezena indolului.
Testul L evideniaz bacteriile care lichefiaz gelatina
Se recolteaz cu ansa celule din suspensia iniial i se neap un tub de gelatin ntr-o
eprubet sterila. Se termostateaz la temperatura de 20C, timp de 7 zile
3
.
Proba este pozitiv dac se produce lichefierea parial sau total a tubului de gelatin.
REZULTATE
Stabilirea numrului de bacterii cu activitate cazeinolitic se aplica aceeai formula de
calcul utilizata pentru stabilirea numrului de unitatea formatoare de colonii (metoda
indirecta de numrare)



2
Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat, temperatura la care se va face termostatarea.
3nainte de analiza, probele se menin timp de 30 min la frigider
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 3


ANEXA 1

COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR SI A REACTIVILOR UTILIZATI

Tabelul 1. Compoziia mediilor de cultur recomandate

Mediu de cultura/Denumire Compoziie medii de cultur, gl
-1
PCA
(engl. Plate count agar)

Tripton ......................... 5,0g
Extract de drojdie .......... 2,5g
Glucoz anhidr ............... 1,0
Agar-agar ............. 12,0-18,0g
Ap pn la .............. 1000ml
pH=7,2
Mediul este disponibil comercial.

Tabelul 2. Compoziia soluiilor si a reactivilor utilizai
Reactiv - Soluie/Denumire Compoziie medii de cultur, gl
-1
Ap peptonat Pepton ....................... 10,0g
Ap pn la .............. 1000ml
Soluie de acetat de plumb Acetat de plumb .......... 10,0g
Ap pn la ................ 100ml
Reactiv Kovacs p dimetilnanobenzaldehida..10,0g
HCl.25,0ml
Alcool amilic pn la .100ml

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________
Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACIE

1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n
plcile selectate pentru numrare)
Proba
Diluia
Nr. colonii/plac

1
2
Stabilii gradul de contaminare exprimat in uniti formatoare de colonii
(ufc) per gram sau ml produs
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
2. nregistrai in tabelul de mai jos probele pozitive i negative, prin
aplicarea testului HIL
Proba Testul HIL
Testul H Testul I Testul L
1
2
Proba 1 _______________
Proba 2 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 1

PROBA REDUCTAZEI

PRINCIPIUL METODEI
Proba reductazei este o metod indirect de apreciere a numrului de microorganisme
vii dintr-un produs, in funcie de corelaia dintre gradul de contaminare si durata n care
se produce modificarea culorii unor indicatori redox (albastru de metilen i resazurina),
sub aciunea enzimelor din categoria reductaze sintetizate de celulele vii prezente n
produs. Indicatorii redox au in forma oxidata culoare albastru (in cazul albastrului de
metilen) si albastru violet (in cazul resazurinei), iar prin reducere (in prezenta
reductazelor) se transforma in leucoderivai incolori. Analiza se preteaz cel mai bine
pentru evaluarea calitii microbiologice a laptelui materie prima.
In funcie de tipul indicatorului si concentraia acestuia variaz durata analizei si
culoarea probei, parametrii in funcie de care se poate aprecia gradul de contaminare si
calitatea microbiologica a produsului. Astfel, in cazul utilizrii albastrului de metilen,
iniial, proba are culoarea albastru care in timp se transforma in incolor. Resazurina i
schimb culoarea de la albastru la violet spre roz i apoi incolor.

MATERIALE I ECHIPAMENTE
1. Soluie de albastru de metilen 1%
2. Soluie de resazurin 0,05%

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU
a. Proba reductazei cu albastru de metilen
Pentru analiza laptelui, se transfer 20 ml lapte ntr-o eprubeta steril peste care se
adaug 1 ml soluie de albastru de metilen. Eprubeta se menine n baie de apa
termostatat la temperatura de 38-40C, astfel nct nivelul apei s fie superior probei.
Se fac notaii asupra modificrii culorii la intervale de 20, 60, 120, 180, 330 minute.
Exist i varianta rapida a acestei metode cnd se utilizeaz aceeai tehnic de lucru
utiliznd urmtoarele cantiti: 10 ml lapte i 1 ml soluie albastru de metilen, diluie 1/10.
b. Proba reductazei cu resazurina
n eprubete sterile se transfera 10 ml lapte de analizat peste care se adaug 1 ml
soluie de resazurina 0,05%, apoi proba se termostateaz la temperatura de 38-40C,
urmrindu-se modificarea culorii in intervalul 20 i 60 minute.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 2

REZULTATE
a. Proba reductazei cu albastru de metilen
Aprecierea calitii laptelui se face in conformitate cu specificaiile din tabelul 1.
Tabelul 1. Aprecierea calitii laptelui n proba reductazic cu albastru de metilen
Durata decolorrii probei, minute Numr bacterii per ml Calitatea laptelui Categoria

Metoda clasica Metoda rapida
330 180 510
5
Buna I
120-330 60-180 510
5
- 410
6
Satisfctoare II
20-120 8-60 410
6
2010
6
Slaba III
20 8 2010
6
Foarte slaba IV

b. Proba cu resazurina
In proba cu resazurina aprecierea calitii laptelui si a gradului de contaminare se face
realizeaz in conformitate cu datele nscrise n tabelul 2.
Se apreciaz c la temperaturi de 38-40C, o capacitatea reductazic superioar o au
lactobacilii, streptococii i bacteriile coliforme. Dac probele se menin la temperatura
de 22C la reducere particip i bacterii din genurile Achromobacter, Bacillus,
Enterococcus.

Tabelul 2 Aprecierea numrului de bacterii din proba de lapte
Timp de modificare a
culorii
Culoare
proba
Numr de bacterii per
ml
Calitatea
laptelui
Categoria
Dup 1h Albastru 510
5
Buna I
Dup 1h Albastru violet 510
5
- 410
6
Satisfctoare II
Dup 1h Rou-alb 410
6
2010
6
Slaba III
Dup 20 min. Alb 2010
6
Foarte slaba IV

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


REZULTATE LUCRARE __________
Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

PROBA REDUCTAZEI


1. nregistrai n tabelele de mai jos variaia culorii probelor
analizate, stabilind n funcie de rezultatele obinute calitatea
acestora
1.1. Proba reductazei cu albastru de metilen
PROBA
Durata decolorrii
probei, minute
Metoda rapida
Numr bacterii per ml Calitatea laptelui
1.

2.

1.2. Proba reductazei cu resazurin
PROBA
Timp de
modificare a
culorii
Culoare
proba
Numr bacterii per
ml
Calitatea
laptelui
1.

2.


MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 1

METODE BAZATE PE UTILIZAREA PETRIFILMELOR

Metodele culturale sunt n prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme
comerciale, denumite Petrifilme (n limba englez, Petrifilms), n care mediul de cultur
specific (n general, un mediu selectiv), deshidratat, dar uor rehidratabil este fixat sub
forma unui film (cu diametru i grosime variabil) pe un suport din carton plastifiat i
acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidrateaz
mediul i prin termostatare este posibil dezvoltarea microorganismelor.
Petrifilmele au fost concepute n vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP
(analiza hazardului, punctele critice de control), care prevd aplicarea unor msuri
corective, pe tot parcursul procesului de producie, fr ca acesta s stagneze, ceea ce
impune analiza unui numr mare de probe, cu obinerea unor rezultate prompte i n
scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control
microbiologic (Bahrim, 2003).
Practica a demonstrat c Petrifilmele constituie sisteme eficiente de analiz
microbiologic, aplicabile mai ales pentru evaluarea calitii materiilor prime i controlul
n punctele critice pe parcursul procesrii acestora, oferind numeroase avantaje, care
se regsesc n reducerea timpului de analiz, reducerea costului analizei per prob,
creterea numrului de probe analizate, asigurarea inocuitii alimentelor i
mbuntirea substanial a productivitii (Jordano i Medina, 1999).

Tehnica de utilizare a Petrifilmelor n analiza microbiologic este extrem de simpl i
presupune parcurgerea urmtoarelor etape:
Se pregtete proba, conform metodologiei clasice, i se dilueaz prin tehnica
diluiilor decimale, pn la o concentraie de celule de aproximativ 10
4
celule per ml.
Se ridic filmul superior.

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 2

Se inoculeaz 1 ml suspensie dintr-o diluie corespunztoare n centrul Petrifilmului
aezat pe un suport special.

Se elibereaz filmul superior, care se las s cad liber.
Cu ajutorul dispozitivului de rspndire se preseaz uor deasupra zonei inoculate
pentru distribuia uniform a celulelor din suspensie pe toat suprafaa circular a
mediului de cultur.

Se ndeprteaz dispozitivul de rspndire i se ateapt un minut pentru
solidificarea mediului.
Se termostateaz (pachete de pn la 20 Petrifilme) n condiii optime, specifice
pentru dezvoltarea microorganismelor analizate, n funcie de recomandrile din
instruciunile de utilizare a Petrifilmului.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 3


Se realizeaz numrarea coloniilor (pragul optim de detecie 25-250 colonii/petrifilm);
faptul ca pe suportul pentru mediu este imprimat un caroiaj care mparte suprafaa
mediului n ptrate cu suprafaa de 1cm
2
, uureaz mult numrarea.

Se calculeaz ufc/g (ml), similar cu metodele clasice.

Eficiena oferit de utilizarea Petrifilmelor a condus la extinderea utilizrii acestora
pentru evaluarea calitii microbiologice a numeroase alimente, inclusiv n industria de
panificaie pentru analiza finii, a pastelor finoase, a cerealelor i a cerealelor pentru
micul dejun.
n tabelul 1 sunt prezentate tipurile de Petrifilme comerciale, existente pe pia i
principalele lor caracteristici.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 4

Tabelul 1. Tipuri de Petrifilme comerciale (Bahrim, 2003b)
1

Tip Petrifilm Grup de
microorganisme
analizate
Condiii de
termostatare
Particulariti
PYM
(Petrifilm
yeast/mould)
Drojdii i
mucegaiuri
72-120 ore,
25C
determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri;
nu necesit adugarea de antibiotice sau acid tartric.
PAC
(Petrifilm aerobic
count)
Bacterii aerobe
mezofile
48 2 ore, 30
1C
determinarea numrului total de bacterii aerobe;
analiza este eficient prin prezena unui indicator care
coloreaz coloniile n rou.
PCC
(Petrifilm coliforms
count)
Bacterii coliforme 24 2 ore, 35
1C sau 37
1C
evidenierea coliformilor totali;
analiza este nlesnit de prezena unui indicator ce
coloreaz coloniile n rou;
filmul superior reine gazele rezultate prin fermentaia
substratului lactoz, cu apariia specific a bulelor de gaz
n jurul coloniilor.
PHSCC
(Petrifilm high
sensivity coliforms
count)
Bacterii coliforme 24 2 ore,
32...35C
evidenierea bacteriilor coliforme la diluii mari n
probele de analizat (1-2 celule g-1);
permite inocularea a 5 ml prob, sau diluii ale
acesteia;
evaluare similar ca i n cazul utilizrii Petrifilmelor
tip PCC.
P 2000 CC
(Petrifilm rapid
coliforms count)
Bacterii coliforme 24 2 ore, 35
1C
dezvoltarea rapid a bacteriilor coliforme;
indicator de pH foarte sensibil, cu evidenierea
producerii de acid, chiar de la nceputul formrii coloniilor;
reducerea timpului de analiz prin asigurarea unei
creteri accelerate;
rezultate test prezumtiv n 6-14 h, cu confirmare n 18
-24 h.
PEC
(Petrifilm E. coli)
Escherichia coli 48 2 ore, 35
1C
sau

24 2 ore, 42
1C
dou teste n unul singur: evaluarea cantitativ a
coliformilor fecali i a lui E. coli;
conine indicator -glucuronidaz pentru evidenierea
selectiv a tulpinilor de E. coli;
rezultate pozitive n 24 - 48 ore;
nalt selectivitate.
Petrifilm Kit HEC Escherichia coli
tip
enterohemoragic
48 2 ore, 35
1C
sau
24 2 ore, 42
1C
evidenierea serotipurilor E. coli enteropatogene
(O157: H7), care produc glucuronaze;
se bazeaz pe utilizarea membranei active ELISA,
care se menine 2 minute n contact cu Petrifilmul, iar
dup 18 ore de termostatare testul pozitiv se evideniaz
prin apariia unor pete gri pe membran.
Petrifilm
Enterobacteriaceae
Enterobacterii 24 2 ore, 30
1C sau 37
1C
evidenierea bacteriilor din familia
Enterobacteriaceae;
producerea de acid este pus n eviden cu ajutorul
unui indicator de pH, ce vireaz n galben n mediu acid;
evidenierea formrii de gaz prin fermentaia
heterolactic a lactozei.
Petrifilm Staph
Express Count
System (Petrifilm
Staph Express
Count Plate +
Petrifilm Staph
Express Disk)
Staphylococcus
aureus
24 2 ore, 37
15C
evidenierea selectiv a tulpinilor de Staphylococcus
aureus prin formarea de colonii de culoare rou-violet;
confirmarea prezenei lui Staphylococcus aureus, cu
ajutorul discului, care conine albastru-toluidin-O, ce
faciliteaz developarea unei zone de culoare roz (reacie
DN-az pozitiv), n jurul coloniilor specifice.

1
|Anexa 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 5

Garania utilizrii Petrifilmelor este validat oficial de numeroase asociaii de renume din
ntreaga lume (tabelul 2). Validarea s-a realizat pe trei criterii de baz: reproductibilitate,
repetabilitate i precizie.
Tabelul 2. Validarea oficial a utilizrii Petrifilmelor pentru evaluarea calitii microbiologice a
alimentelor
Organizaia
internaional*
Produse pentru care s-a
realizat validarea
Indicator microbiologic
AOAC Majoritatea alimentelor Drojdii i mucegaiuri
Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme i Escherichia coli
Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru
determinarea rapid a bacteriilor coliforme
ANFOR Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme i Escherichia coli Petrifilm seria
2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapid a
bacteriilor coliforme
Enterobacterii
NMKL Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme i Escherichia coli
VDIA Lapte i produse lactate Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme
HPB Lapte i produse lactate

Alte alimente
Evaluarea calitii mediului
Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme
Drojdii i mucegaiuri
Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme i Escherichia coli
Test Kit HEC
* AOAC Association of Official Analytical Chemists (SUA); AFNOR French Standardization Association (Frana);
NMKL Nordic Committee of Food Analysis; VDIA Victorian Dairy Industry Authority (Australia);
HPB Health Protection Branch, Compendium of Analytical
Analiza comparativ a fidelitii evalurilor cantitative, pentru patru indicatori
microbiologici: drojdii i mucegaiuri, bacterii aerobe mezofile, bacterii coliforme i
Escherichia coli, realizat pentru tipuri diferite de produse alimentare prin utilizarea
Petrifilmelor, n paralel cu tehnicile culturale clasice ce utilizeaz medii selective
(OGYE, PCA, VRBL, EMB), a evideniat c evalurile privind numrul total de drojdii i
mucegaiuri au condus la rezultate inferioare, n variantele analizelor realizate cu
Petrifilme, comparativ cu metodele convenionale.
Explicaia const probabil n existena unei suprafee insuficiente pentru creterea
extins a coloniilor de mucegai, ceea ce conduce n multe cazuri la suprapunerea
coloniilor, genernd erori n evaluarea corect a unitilor formatoare de colonii (ufc). De
remarcat este faptul c la Petrifilmele destinate evalurii drojdiilor i mucegaiurilor,
suprafaa mediului de cultur este de 30 cm
2
, comparativ cu 20 cm
2
, n cazul majoritii
Petrifilmelor concepute pentru studiul bacteriilor (Jordano i colab., 1995).
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 6

Evalurile statistice, realizate pe baza coeficienilor de corelaie i a pantei ecuaiilor de
regresie liniar, ofer certitudini privind fidelitatea rezultatelor pentru principalii indicatori
microbiologici i recomand utilizarea Petrifilmelor ca o alternativ la metodele
microbiologice convenionale pentru controlul microbiologic, realizat att pe faze de
fabricaie, ct i n cazul materiilor prime i al produselor finite (tabelul 3).

Tabelul 3. Evaluri statistice privind acurateea analizelor microbiologice realizate cu Petrifilme,
comparativ cu metodele convenionale (Jordano 1995, 1999)
Parametrul statistic Indicatorul microbiologic Petrifilme/ Metode culturale
clasice*
Coeficient de corelaie Bacterii aerobe mezofile 0,897
Bacterii coliforme 0,861
Drojdii i mucegaiuri 0,981
Panta ecuaiei de
regresie
Bacterii aerobe mezofile 0,599
Bacterii coliforme 1,051
Drojdii i mucegaiuri 0,998
* Valori medii pentru 5 probe n paralel (n = 5)
Datele obinute, exprimate ca valori medii, stabilite prin calcul statistic (P > 0,05), pentru
cinci probe n paralel (n = 5), certific fidelitatea i acurateea analizelor realizate cu
Petrifilme, amplificarea preciziei realizndu-se prin asigurarea condiiilor selective de
cultivare i interpretare a rezultatelor, ceea ce permite evaluarea corect i distinctiv a
speciilor analizate (fig. 5).

1 2
3 4

Fig. 5. Dezvoltarea selectiv a microorganismelor n funcie de natura Petrifilmelor
1 drojdii i mucegaiuri; 2 bacterii aerobe mezofile; 3 enterobacterii; 4 bacterii coliforme/
Escherichia coli
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 7

n concluzie, implementarea utilizrii Petrifilmelor n controlul calitii microbiologice a
alimentelor ofer numeroase faciliti care se reflect n:
uurina n exploatare; analiza presupune parcurgerea a numai trei etape: inoculare,
termostatare i evaluare cantitativ i calitativ;
simplitate n utilizare i n interpretarea cu acuratee a rezultatelor, prin crearea unor
condiii selective de cretere i de evaluare a microorganismelor testate. Evalurile
cantitative sunt facilitate, chiar n cazul dezvoltrii unui numr mare de colonii, prin
caroiajul tiprit pe filmul inferior, care delimiteaz suprafee de 1 ml;
reducerea semnificativ a costului manoperei per analiz;
reducerea la jumtate a timpului necesar pentru realizarea analizelor
microbiologice, cu impact pozitiv asupra: controlului eficient al punctelor critice,
optimizrii strategiilor de control, creterii numrului de analize efectuate, eficientizrii
procesrii, mbuntirii calitii i asigurrii inocuitii produselor finite;
impact pozitiv asupra organizrii laboratorului de microbiologie, prin eliminarea
operaiilor de pregtire i sterilizare a mediilor de cultur i a ustensilelor de laborator,
impuse de metodele convenionale de analiz microbiologic;
riscuri reduse pentru mediul nconjurtor dup utilizare; volum redus de produse
reziduale la finalul analizei care pot fi uor anihilate pin incinerare;
economie de spaiu la transport, pstrare i termostatare (un pachet de 50 de
Petrifilme ocup un spaiu similar cu cel ocupat de 2 plci Petri clasice);
valabilitate prelungit (mai mult de un an, prin meninere la 4C).
Practica a demonstrat c exist i unele limitri n utilizarea Petrifilmelor generate de
(Williams i Busta, 1999b):
capacitatea unor microorganisme de a produce hidroliza agentului de
solidificare, ceea ce conduce la rspndirea i suprapunerea coloniilor;
unii compui din alimente (acizi, sruri etc.) pot exercita efect inhibitor asupra
dezvoltrii coloniilor n cazul utilizrii Petrifilmelor, comparativ cu tehnicile clasice.
Studii efectuate n 85 de companii productoare de alimente, privind eficiena
economic a tehnicilor de evaluare a calitii microbiologice, au demonstrat c
manopera se reflect n proporie de 70,7 % n costul tot al analizelor, iar prin utilizarea
Petrifilmelor se pot economisi anual 99-400 ore, timp ce poate fi valorificat pentru
elaborarea de programe eficiente pentru evaluarea calitii i creterea numrului de
analize (Jordano, 1999).

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR


Pag 8


ANEXA 1
Tipuri de Petrifilme comerciale
Tip Petrifilm/ Grup de
microorganisme analizate
Exemple Tip Petrifilm/ Grup
de microorganisme
analizate
Exemple
Petrifilm yeast/mould
Drojdii i mucegaiuri

Petrifilm high
sensivity coliforms
count)
Bacterii coliforme

Petrifilm aerobic count
Bacterii aerobe mezofile

Petrifilm rapid
coliforms count
Bacterii coliforme

Petrifilm coliforms count
Bacterii coliforme

Petrifilm E. coli
Escherichia coli

Petrifilm E. coli / Coliform
count plate
Bacterii coliforme i E. coli


Petrifilm
Enterobacteriaceae
Enterobacterii

Petrifilm Staph Express
Count System (Petrifilm
Staph Express Count Plate
+ Petrifilm Staph Express
Disk)
Staphylococcus aureus

Petrifilm
Environmental
Listeria plate
Listeria

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI


Pag 1

BACTERII COLIFORME.
COLIFORMI FECALI SI ESCHERICHIA COLI

Bacteriile coliforme conform definiiei ISO sunt bacterii Gram negative nesporulate,
oxidazo-negative, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot s se nmuleasc n prezena
srurilor biliare (care inhib dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor ageni cu
proprieti echivalente), capabile de a produce fermentaia heterolactic a lactozei cu
producere de acid lactic i gaze, in timp de 48 ore si la temperaturi de 35-37C.
Grupul bacteriilor coliforme cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter
freundii, Citrobacter diversum, Citrobacter amalonatica
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: lapte i
produse lactate, carne i produse din carne, pete i produse din pete, buturi
alcoolice, buturi nealcoolice, produse de cofetrie i patiserie

PRINCIPIU METODEI
Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include trei etape diferite de analiza
concretizate in: testul prezumtiv, testul de confirmare i testul complet, bazate pe
capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO
2
, H
2
, n
timp de 48 ore la 35C.
Testul prezumtiv const in inocularea probei n mediu nutritiv cu lactoz. Aprecierea
probelor pozitive se face fie n funcie de prezena gazelor acumulate n tubul Durham,
fie ca urmare a scderii pH-ului prin acumularea de acid lactic.
Testul de confirmare const in transferul si inocularea din eprubetele pozitive ale
testului prezumtiv in medii selective care favorizeaz dezvoltarea bacteriilor coliforme
de origine fecala.
Testul complet permite identificarea speciilor grupului bacteriilor coliforme i se bazeaz
pe testarea unor proprieti biochimice caracteristice.
Din grupul bacteriilor coliforme specia Escherichia coli, este indicatorul care certifica o
contaminare fecal recent.

MODUL DE LUCRU
DETECTIA COLIFORMILOR TOTALI
Analiza se efectueaz n dou etape, dup cum urmeaz:
1. Etapa de mbogire (testul prezumtiv) are rolul de a previziona prezena
bacteriilor coliforme i multiplicarea acestora, dac sunt n concentraii reduse, n
vederea evidenierii lor facile n etapa urmtoare.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI


Pag 2

2. Etapa de confirmare certific prezena bacteriilor coliforme prin cultivare n
condiii selective specifice.
Pornind direct de la eantionul de analiz (n cazul unui produs lichid) sau de la
suspensia iniial (10
-1
) (n cazul unui produs solid), n funcie de gradul de contaminare
presupus se pot adopta dou modaliti de evaluare. Astfel, se pot folosi pentru
inoculare cte 10 ml de prob (pentru probele cu grad de contaminare mai redus)
utiliznd mediu selectiv de mbogire dublu concentrat, sau cte 1 ml de prob prin
inoculare n mediu selectiv de mbogire simplu concentrat. Pentru acest din urm caz,
se inoculeaz serii de cte trei eprubete n paralel pentru i pentru urmtoarele diluii
succesive: 10
-1
, 10
-2
,...a.
Probele inoculate se termostateaz la temperatura de 37C, timp de 24-48 h. Se
nregistreaz eprubetele pozitive (mediu tulbure, bule de gaz n plutitor), iar eprubetele
negative sunt din nou termostatate timp de 24 h i se nregistreaz din nou eprubetele
pozitive.
Pentru confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz cte o ans i se inoculeaz
eprubete cu bulion lactoz bil verde briliant; dup termostatare la temperatura de
37C, timp de 48 h, n condiiile n care se produc gaze n plutitor, tulburare, si virajul
culorii indicatorului verde briliant de la verde la galben, se confirma ca n produsul
analizat sunt prezente bacteriile coliforme (fig. 1).
EVIDENTIEREA PREZENTEI BACTERIILE COLIFORME DE ORIGINE
FECALA
Testul const n transferul cu o ans a probelor din eprubetele pozitive ale testului
prezumtiv, n eprubete cu mediu E.C. i termostatare la temperatura de 45.5C, timp de
24 de ore.
CERTIFICAREA PREZENTEI SPECIEI Escherichia coli
Din eprubetele pozitive ce conin mediu E.C., dup termostatare la temperatura de
45.5C, timp de 24 de ore, se fac trasri aplicnd metode scarificate pe suprafaa
mediului Levine cu agar, repartizat n plci pentru a obine colonii distincte. Se
termostateaz apoi la temperatura de 35C, timp de 18-24 de ore.
Din coloniile caracteristice se fac inoculri pentru testele biochimice denumite generic
IMViC*, care permit diferenierea a lui E. coli de Enterobacter aerogenes.
*I producere de indol din triptofan
M reacia fa de rou de metil
V reacia Vages Proskauer de producere a acetoinei
C utilizarea citratului.
Difereniere intre specii se face pe baza proprietarilor dopa cum urmeaz :
Specii I M V C Mobilitate
Escherichia coli + + - - +
Enterobacter
aerogenes
- - + + -
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI


Pag 3

Suspensie iniial (produs solid)
Eantion de analiz (produs lichid)

Etapa de
mbogire



10
-
1
/10
-2
10
-2
/10
-3

10 ml 10 ml 10
ml
1 ml 1 ml 1 ml Idem Idem
+ + + + + +
10 ml
M
dc
1)
10 ml
M
dc
1)
10
ml
M
dc
1)
10
ml
M
sc
2)

10 ml
M
sc
2)

10
ml
M
sc
2)






Termostatare 24h Termostatare 48h
4)
Idem Idem

Etapa de
confirmare


+
*
+ -





10 ml
BLBV
3)

10 ml
BLBV
10
ml
BLBV
10
ml
BLBV
10 ml
BLBV

Idem Idem




Termostatare 48h
2h
4)

Termostatare
48h 2h
4)





Interpretarea
rezultatelor
+
**
+ -

+
**
-
Idem Idem
Calculul MPN


Fig. 1. Schema de lucru pentru evaluarea cantitativ a bacteriilor coliforme prin tehnica
numrului probabil
Legend:
1)
Mediu selectiv de mbogire dublu concentrat (Mdc) + tub Durham
2)
Mediu selectiv de mbogire simplu concentrat (Msc) + tub Durham
3)
Mediu selectiv de confirmare + tub Durham
4)
Temperatura de termostatare poate fi 30C, 35C sau 37C i este stabilit n funcie de scopul analizei i anume: scop
tehnologic sau evaluarea riscului privind sigurana alimentar; n anumite cazuri testul pozitiv poate fi evideniat i dup o
perioad de termostatare de 24 h 2h
* Prob pozitiv: modificarea turbiditii; reducerea pH-ului; acumularea de gaz n tubul Durham
** Prob pozitiv: modificarea turbiditii; virajul culorii mediului din verde n galben; acumularea de gaz n tubul Durham
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI


Pag 4

CALCULUL I INTERPRETAREA REZULTATELOR
Folosind, metoda titrului, in funcie de numrul eprubetelor pozitive se stabilete cifra
caracteristica si din tabelul lui Mac Cready (tabel 1), corespunztor cifrei caracteristice
si numrul de eprubete inoculate in paralel, se determina numrul probabil de coliformi
(MPN)
Pentru a calcula numrul probabil de coliformi/cm
3
prob, valoarea din tabel se
nmulete cu factorul de diluie corespunztor primei cifre din cifra caracteristic.
Tabel Mac Cready
Cifra
caracteristica
Numr probabil
de
microorganisme
Cifra
caracteristic
Numr probabil
de
microorganisme
Cifra
caracteristica
Numr probabil
de
microorganisme
000 0.0 201 1.4 302 6.5
001 0.3 202 2.0 310 4.5
010 0.3 210 1.5 311 7.5
011 0.6 211 2.0 312 11.5
020 0.6 212 3.0 313 16.0
100 0.4 220 2.0 320 9.5
101 0.7 221 3.0 321 15.0
102 1.1 222 3.5 322 20.0
110 0.7 223 4.0 323 30.0
111 1.1 230 3.0 330 25.0
120 1.1 231 3.5 331 45.0
121 1.5 232 4.0 332 110
130 1.6 300 2.5 333 140
200 0.9 301 4.0
Interpretarea rezultatelor
Pentru fiecare eantion examinat se rein trei diluii consecutive, care, dup caz,
corespund uneia dintre situaiile urmtoare:
1) Cel puin o diluie prezint trei eprubete pozitive. Se alege diluia cea mai mare
(adic cea care corespunde celei mai mici concentraii de eantion inoculat) care
prezint trei eprubete pozitive, i nc dou diluii succesive. Dac schema de diluie
adoptat este necorespunztoare, adic nu exist diluii la care s se fi nregistrat i
probe negative, se aleg cele mai mari trei diluii succesive din serie (adic cele care au
cea mai sczut concentraie de prob inoculat).
2) Nu exist cazuri e s prezinte trei eprubete pozitive. Cazul 1 nu poate fi aplicat.
Se aleg cele mai mari trei diluii succesive din serie (adic cele care au cea mai
sczut concentraie de prob inoculat), care conin cel puin un rspuns pozitiv.
3) Cazuri particulare. n toate cazurile n care mai mult de una dintre cele trei diluii
de la pct. 1) i 2) nu prezint eprubete pozitive (adic cea n care s-a inoculat cea mai
mare cantitate de prob) i cele dou diluii consecutive mai mici (adic cele n care
concentraiile de prob inoculat sunt de 10 i respectiv 100 de ori mai mici dect n
prima diluie aleas), excluznd cazul n care se nregistreaz probe pozitive, doar la
prima diluie preparat, pornind de la eantion. n acest ultim caz, se vor reine primele
trei diluii, chiar dac seria include dou diluii care nu prezint nici o prob pozitiv.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI


Pag 5


Calcul MPN
1

Pentru a stabili MPN/g sau ml prob se recomand utilizarea aproximaiei
propus de Thomas, stabilit prin formula:

( )
2
1
) ( /
T N
P
ml g MPN
+
=

n care: P numrul de eprubete pozitive;
N cantitatea de prob inoculat n probele negative, g sau ml
T cantitatea total de prob luat n analiz (inoculat n toate seturile de
probe realizate n paralel), g sau ml
Pentru fiecare analiz trebuie s se decid categoria de rezultate acceptat,
adic 1, 1 i 2, sau 1, 2 i 3. Astfel, gradul de contaminare va corespunde cu MPN
calculat, conform specificaiilor din tabelul 1.
Tabelul 1. Msuri privind interpretarea i acceptabilitatea rezultatelor analizei
Categoria Definiie
1 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mare ans de a fi obinute.
ansa de a obine acest rezultat (care este mai puin probabil dect cel mai puin
probabil) este de cel mult 5% n aceast categorie.
2 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mic ans de a fi obinute, chiar
dect cel mai puin probabil din categoria 1.
Exist ansa de cel mult 1% de a obine un rezultat mai puin probabil dect cel mai
puin probabil n aceast categorie.
3 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mic ans de a fi obinute, chiar
dect cel mai puin probabil din categoria 2.
Exist ansa de cel mult 0,1% de a obine un rezultat care este mai puin probabil
dect cel mai puin probabil n aceast categorie.
0 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mic ans de a fi obinute, chiar
dect cel mai puin probabil din categoria 3.
Nu exist dect o ans de 0,1% de a obine un rezultat n aceast categorie, fr
erori de analiz
Dup alegerea setului de trei diluii reprezentative pentru stabilirea MPN, care,
conform uneia din situaiile de mai sus, sunt acceptabile din punct de vedere statistic.
Acceptabilitatea depinde totodat de numrul de eantioane analizate i de decizia de a
accepta sau refuza rezultatele din categoria 2.
Un exemplu de alegere a diluiilor pentru calculul valorii MPN este prezentat n
tabelul 2.
Acceptarea rezultatelor va ine seama de categoria impus. Astfel, atunci cnd
sunt acceptate numai rezultate numai din categoria 1, combinaia 221 nu poate fi

1
numrul cel mai probabil (MPN)
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI


Pag 6

reinut dect dac au fost examinate 10 probe n paralel (din lotul considerat). n cazul
cnd sunt acceptate mai puin probabile (din categoria 2), combinaia 221 va fi reinut
n cazul n care au fost examinate 2, 3 sau 5 probe n paralel. Dac combinaia 221 este
rezultatul unei singure analize, acesta nu poate constitui o baz pentru stabilirea MPN.


Tabelul 2. Stabilirea valorii MPN n funcie de diagrama probelor pozitive (adaptare dup SR
ISO 4831, 1992)
Exemplu Numrul de eprubete pozitive corespunztor seturilor de trei
eprubete termostatate, corespunznd urmtoarelor cantiti
de eantion inoculate n fiecare eprubet
1)
MPN
2)
Produs
lichid
10 ml 1ml 10
-1
ml 10
-2
ml

10
-3
ml MPN/ml MPN/g
Alt produs 1 g 10
-1
g 10
-2
g

10
-3
g 10
-4
g
1 3 3 2 1 0 1,510
1
1,510
2

2 3 3 3 0 2,410
1
2,410
2

3 2 2 1 1 0 7,4 7,410
4 3 3 0 0 0 2,4 2,410
5 2 2 0 1 1 2,110
-1
2,1
1)
Seria (combinaia) de eprubete aleas
2)
Conform datelor din tabelele ntocmite pe baze statistice


















MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI


Pag 7

ANEXA 1
COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR


Etapa
Denumirea
mediului
Compoziie Instruciuni de pregtire
Etapa de
mbogire
Bulion-
tripton
i lauril sulfat

(mediul
selectiv de
mbogire)

Mediu dublu concentrat:
Tripton ............................... 40,0g
Lactoz ................................ 10,0g
K
2
HPO
4
................................ 5,5 g
KH
2
HPO
4
............................. 5,5 g
NaCl..................................... 10,0g
Lauril sulfat de sodiu ............. 0,2g
Ap .................... pn la 1000 ml
pH=6,8; la temperatura de 25C
(dup sterilizare)
Se dizolv componentele sau mediul
comercial n ap, nclzind dac este
nevoie.
Se ajusteaz pH-ul dac este nevoie.
Se repartizeaz cte 10 ml de mediu
dublu concentrat n eprubete mari
(20mm x 200mm), fr tub Durham.
Se repartizeaz cte 10 ml de mediu
simplu concentrat n eprubete mici
(16mm x 160mm), cu tub Durham.
Se sterilizeaz n autoclav la 121C,
timp de 15 minute.
Tuburile Durham nu trebuie s conin
bule de aer dup sterilizare.
Mediu simplu concentrat
Tripton ............................... 20,0g
Lactoz .................................. 5,0g
K
2
HPO
4
............................... 2,75g
KH
2
HPO
4
............................ 2,75g
NaCl....................................... 5,0g
Lauril sulfat de sodiu ............. 0,1g
Ap .................... pn la 1000 ml
pH=6,8; la temperatura de 25C
(dup sterilizare)
Etapa de
confirmare
Bulion
lactozat cu
bil i verde
briliant
(BLBV)

(mediul de
confirmare)
Pepton ............................... 10,0g
Lactoz ................................ 10,0g
Bil....................................... 20,0g
Verde briliant ................... 0,0133g
Ap ...................... pn la 1000ml
pH=7,2; la temperatura de 25C
(dup sterilizare)

Se dizolv componentele sau mediul
comercial n ap, nclzind dac este
nevoie.
Se ajusteaz pH-ul dac este nevoie.
Se repartizeaz cte 10 ml de mediu
n eprubete mici (16mm x 160mm), cu
tub Durham. Se sterilizeaz n
autoclav la 121C, timp de 15 minute.
Tuburile Durham nu trebuie s conin
bule de aer dup sterilizare.
Mediu Levine Pepton ............................... 10,0g
Lactoz ................................ 10,0g
K
2
HPO
4
.................................. 2,0g
Eozin .................................. 0,4g
Albastru de metilen ........... 65,0mg
Geloz ................................ 15,0g
Ap ...................... pn la 1000ml
pH=7.1;
Se sterilizeaz n autoclav la 121C,
timp de 15 minute.
Mediu EC
(mediul
selectiv
confirmare)
Triptoz .............................. 20,0g
Lactoz .................................. 5,0g
Sruri biliare .......................... 1,5g
Fosfat dipotasic ..................... 4,0g
Fosfat monopotasic ............... 1,5g
Clorur de sodiu .................... 5,0g
Ap ...................... pn la 1000ml
pH=6.9;
Se sterilizeaz n autoclav la 121C,
timp de 15 minute.
Se repartizeaz cte 10 ml de mediu
n eprubete mici, cu tub Durham.

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI


REZULTATE LUCRARE __________
Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

BACTERII COLIFORME.
COLIFORMI FECALI SI Escherichia coli

1. nregistrai in tabelul de mai jos probele pozitive:
a. Etapa de mbogire (testul prezumtiv)
Proba
Diluia

1
2

b. Etapa de confirmare
Proba
Diluia

1
2

Stabilii gradul de contaminare exprimat in numrul probabil de bacterii coliforme/cm
3

prob:
Proba 1 _______________________
Proba 2 _______________________