1

Preparate enzimatice i culturi starter

Curs nr. 1
PREPARATE ENZIMATICE I CULTURI STARTER
Industria alimentar este n fapt o biotehnologie. Materiile prime agroalimentare sunt
produse biologice i implicit conservarea lor pn la procesare sau pn la consum implic
controlul i monitorizarea riguroas a activitii enzimelor proprii esuturilor vegetale i
animale, sau a activitii enzimelor elaborate de microflora specific.
Biotehnologia este un domeniu de o vast interdisciplinaritate, situndu-se la
interferena dintre biologie, microbiologie, biochimie i inginerie genetic.
Enzimele proprii esuturilor vegetale i animale sunt eseniale n transformrile pe care
materiile prime folosite n industria alimentar le parcurg pn la produsul finit(ex: maturarea
fructelor i legumelor, germinarea seminelor folosite ca materii prime n industria
panificaiei sau a berii, maturarea brnzeturilor i a preparatelor din carne, maturarea vinurilor
i a buturilor distilate aromate).
Enzimele pot avea i un rol deteriorativ cu implicaii n modificarea caracterelor
senzoriale implicit cu pierderea valorii nutritive i tehnologice a materiilor prime
agroalimentare.
Alturi de enzimele existente n esuturile vegetale i animale netratate termic un rol
important l joac i microorganismele. Unele microorganisme fac parte din culturi
selecionate, se adaug ntr-un mediu de cultur n mod intenionat, iar activitatea lor este
exploatat i direcionat ctre obinerea unui produs alimentar cu valoare biologic ridicat
(produse lactate acide, vin, bere, oet, alcool etilic, brnzeturi, preparate din carne, produse
farmaceutice, etc).
Alt categorie de microorganisme pot determina alterarea materiilor prime sau a
produselor alimentare. Acest motiv st la baza impunerii unor norme de igien foarte
riguroase.
n ultima perioad, rolul biotehnologiilor a fost foarte bine conturat de tendine
moderne aplicate sub form de preparate enzimatice mixte ca adaosuri exogene n industria
brnzeturilor, preparatelor din carne, etc. n egal msur, i nu mai puin importante, n
conturarea tendinelor moderne sunt mocroorganismele. Ele se folosesc sub form de culturi
starter, singulare sau mixte, n industria laptelui, crnii, etc.
PREPARATE ENZI MATI CE
Enzimele se mai numesc i biocatalizatori de natur proteic, solubili, coloidali,
sensibili la aciunea cldurii i puternic dependeni de condiiile de mediu. Enzimele sunt
sintetizate de celule vii.
ntr-un metabolism desfurarea secvenial a fiecrei etape este posibil numai sub
aciunea biocatalizatorilor. Enzimele pot fi de natur vegetal, animal sau microbian
(fungic sau bacterian).







2
Preparate enzimatice i culturi starter
curs nr 2
Clasificarea enzimelor

Aceast clasificare a enzimelor este realizat de comisia de enzime a uniunii
internaionale de chimie pur i aplicat(IUPAC):
I. Oxido-reductazele catalizeaz reaciile de oxid reducere prin transfer de H
2
sau electroni
prin combinarea unui substrat de O
2
.

alcool etilic etanal+NADH+H
+


II. Transferaze: catalizeaz transferul unei grupri chimice, alta dect protonul de la un
substrat la altul.
Acetil-CoA+colin acetil colin+CoA

III. Hidrolaze: catalizeaz hidroliza legturilor peptidice, glucozilice, a esterilor din diferite
substraturi prin adiia apei
lactoz galactoz+glucoz


Maltoz 2 glucoz


IV. Liazele : catalizeaz scindarea legturilor din molecule pe alte ci dect n prezena apei

fructozodifosfat glicerinaldehid difosfat+fosfohidroxiaceton

V. Izomeraze: catalizeaz izomerizarea optic, geometric i n funcie de tipul de rearanjare
molecular racemaze, cistrans, izomeraze, etc

L-alanin D-alanin

VI. Ligaze: catalizeaz formarea legturilor covalente dintre molecule cu consum energetic
preluat din compui macroergici
glutamatNH
3
glutamin


Uniti de msur ale activitii enzimatice
Practic activitatea enzimatic se poate determina n trei variante:
- msurarea cineticii de reacie ntr-un anumit interval de timp
- msurarea gradului de consumare a substratului
- determinarea concentraiei produsului/produilor de reacie
Unitile de msur admise n activitatea evalurii enzimatice sunt:
- unitatea de de activitate enzimatic(u) reprezint cantitatea de enzime care catalizeaz
transformarea a 1 substrat n timp de 1min n condiii standard (T=5
0
C, p= valoarea optim
pentru categoria de enzime testate)
H
2
O
lactaz
Colin acetil transferaza
ADPP
2
Glutamin sintetaz
Alanin racemaza
aldolaza
H
2
O
maltaz
Alcool dehidrogenaz
ATP
3
- Katal- reprezint cantitatea de enzime ce catalizeaz transformarea a 1 substrat n timp de
1sec n condiii standard
Activitatea enzimatic poate fi caracterizat prin dou noiuni:
- activitatea enzimatic specific- reprezint numrul de uniti enzimatice coninute ntr-un
protein.
-activitatea enzimatic molar- reprezint numrul de molecule de substrat transformate de
ctre o molecul de enzim n unitatea de timp
Sursa de obinere a preparatelor
I. esturi animale: ficat, pancreas, inim, rinichi, creier, mucoase recoltate de la nivelul
stomacului sau a intestinelor
II. esuturi vegetale: cereale germinate, rdcini, semine, frunze, sev(latex)
III. Microorganisme: bacterii, mucegaiuri, drojdii
Microorganismele reprezin cea mai bun surs de preparate enzimatice deoarece:
-ciclul de dezvoltare(via) este mult mai scurt dect n cazul plantelor sau a animalelor
-se pot obine n cantiti mari denumite i biomase prin cultivare n instalaii cu un principiu
constructiv simplu i folosind medii de cultur relativ ieftine cum ar fi: tre, zer, irot de
semine de floarea soarelui sau soia, extracte de porumb, melas
- producia de enzime generat de microorganisme poate fi mult mai optimatizat cu folosirea
unor tulpini mutante, nalt performante, obinute n urma dorinei de a eficientiza parametrii
procesului fermantativ
- preparate enzimatice obinute, n unele cazuri, prezint stabiliti mai bune la temperaturi
ridicate, acest avantaj vizeaz transferuri enzimatice care se impun ca desfurare la
temperaturi situate la 75-90
0
C(industria spirtului)
n cazul adoptrii ca surs a microorganismelor se impun cteva condiii :
-preparatele enzimatice de origine microbian trebuie s fie libere de toxine sau de substane
cu efect antibiotic, prin urmare trebuie s fie produse de microorganisme nepatogene fr
potenial alergent, toxicogen, antibiotic.






















4




Preparate enzimatice i culturi starter
curs nr 3
SCHEMA TEHNOLOGIC GENERAL DE OBINERE A
PREPARATELOR ENZIMATICE DIN DIVERSE SURSE

Avantajele prelucrrii surselor de enzime de origine animal i vegetal: sunt
sigure din punct de vedere a inocuitii i permit obinerea cert a enzimelor singulare (a unui
singur tip de enzim).
Dezavantaje:
- vegetalele i animalele prezint un ciclu de via lung, prin urmare obinerea enzimelor este
limitat din punct de vedere cantitativ;
- preparatele enzimatice obinute din aceste surse sunt mai termosensibile.

Tehnologia de obinere a preparatelor enzimatice
Implic operaiile schiate n figur, iar tehnicile de prelucrare indicate conduc n special la
trei categorii de preparate enzimatice:
preparatul enzimatic brut este caracterizat de o umiditate sczut, de o conservabilitate mai
ridicat n timp; preparate enzimatice lichide concentrate sunt amestecuri de enzime n
form apoas ce sunt caracterizate de o conservabilitate mai sczut; pentru obinerea celui
de-al treilea tip de preparat enzimatic se parcurge etapa de fracionare care presupune
separarea enzimelor din preparate mixte i foarte adesea concentrarea i/sau uscarea. Aceste
esuturi vegetale
esuturi animale
Microorganisme
(+enzime extracelulare)
Preparat enzimatic
de uz industrial
Condiionare
Standardizare
Concentrarea
Uscarea
Liza pereilor celulari
(omogenizare)
Extracia Fracionare
Preparate parial
purificate
Preparat
enzimatic
Preparat brut
5
preparate enzimatice sunt performante, se folosesc n etape biochimice care necesit o dozare
foarte riguroas, condiionate de aciunea, n cele mai multe cazuri, a unei singure enzime. n
form uscat aceste preparate au aciune foarte precis i posibilitate de dozare foarte
riguroas.
n cazul preparatelor enzimatice de origine microbian nainte de etapa de liz a
pereilor celulari att n cazul obinerii enzimelor intracelulare, ct i a celor extracelulare, se
impune n prealabil o cultivare avansat. Aceast cultivare avansat are ca obiectiv principal
obinerea unei cantiti masive de biomas. n acest scop se recurge la dou tehnici de
fermentare:
- fermentaia de suprafa care se bazeaz pe popularea unui mediu solid cu un
microorganism aerob (mucegaiuri);
- fermentaia n profunzime care se realizeaz ntr-un mediu lichid, plasat ntr-un reactor, la
care toi parametrii de funcionare sunt riguros monitorizai.
Aspecte privind obinerea preparatelor enzimatice din surs microbian:
Microorganismul ales n vederea cultivrii i obinerii preparatelor enzimatice trebuie
atent selecionat dup anumite criterii. Dintre speciile preferate pentru obinerea
microorganismelor amintim: Aspergillius niger, Aspergillius orizae, Mucor miehei,
Saccharomyces cerevisiae, Penicillium emersoni, Kluyveromyces lactic, Bacillus
amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophillus.
Microorganismul selectat trebuie s fie recunoscut din punct de vedere al inocuitii. La
sfritul fermentaiei tehnicile curente presupun inactivarea microorganismului cu pstrarea
intact a activitii enzimatice.
Trebuie aleas tehnica care s presupun productivitate maxim n condiii industriale.
n acest scop se prefer o tulpin care s nu modifice n foarte mare msur vscozitatea
mediului n cursul dezvoltrii celulare n aa fel nct s se poat realiza la nivelul reactorului
o omogenizare ct mai riguroas n vederea asigurrii parametrilor de cultivare n toat masa
supus fermentaiei.
n cazul selectrii unor tulpini nalt productive pstrarea n stare pur, n vederea
recultivrii, trebuie s se desfoare n condiiile meninerii puritii genetice. n cazul
pstrrii pe perioade mai lungi a tulpinilor selecionate se recurge la tehnici ale ingineriei
genetice care s identifice eventualele mutaii la nivel celular. n condiii controlate se poate
recurge la hibridizri n scopul ameliorrii potenialului enzimatic celular.



Preparate enzimatice i culturi starter
curs nr 4
ASPECTE BIOLOGICE ALE FERMENTAIEI PRINCIPALE

n cursul fermentaiei microorganismului utilizat ca surs se va dezvolta i va produce
enzim, cele dou procese putnd se desfoare simultan sau uneori complet difereniate n
timp.
n acest sens se caracterizeaz trei situaii:
creterea n biomas i producia de enzime sunt asociate, se desfoar simultan.
producia de enzime ncepe s fie mai consistent dup o perioad de dezvoltare a biomasei i
continu uneori dup ce biomasa a ajuns la mas constant.
exist un interval de laten ntre peroiada de cretere i perioada de elaborare a enzimei.
6


Aspecte biochimice ale fermentaiei principale:
Celulele microbiene utilizeaz foarte mult O
2
pentru producia de biomas i respectiv
de enzime (3-10 tone de O
2
pentru un fermentator de 100m
3
), precum i substane nutritive
din mediu. Rezultatul acestor consumuri const n producia de biomas, de CO
2
i cldur.
Cantitatea de cldur elaborat este situat ntre 2*10
6
i 6,5*10
6
KJ/h, iar cantitatea de
metabolii, respectiv de enzime elaborate, este de 0,1 pn la 40 g/l. Nu n puine situaii
microorganismele elaboreaz enzime intracelulare care impun tehnici specifice de extracie.
Ca materii prime pentru medii de fermentaie se pot folosi:
- surs de C: amidon, celuloz, pulp de sfecl, maltodextrine, glucoz, fructoz.
- surs de N: proteine, hidrolizate proteice, extracte de drojdie.
- surse minerale: sruri de Mg, Fe, Ca, P, K, Mn, Zn.
Alegerea materiei prime este deosebit de important pentru obinerea unui randament
maxim n cazul fermentaiilor industriale. n mod particular pentru obinerea enzimelor
destinate ndustriei alimentare un element determinant const uurina de a controla gradul de
puritate a unui lot de materii prime. n anumite situaii se impune un pretratament termic sau
enzimatic de aducere a mediului industrial la caracteristicile optime.
Procedeul nealimentar de conducere a fermentaiei:
n acest caz toate ingredientele din mediu sunt transferate n fermentator (reactor), iar
nainte de a se introduce inoculul (cltura de celule de producie de puritate absolut) mediul
se corecteaz din punct de vedere a valorii de pH i se aduce la temperatura optim de
nsmnare. Pe parcursul fermentaiei se recurge la prelevare de probe n mod steril, probe
care vor indica:
- evoluia vscozitii mediului
- creterea cantitii de biomas
- consumul nutrienilor de baz din mediu (glucide, proteine)
- evoluia coninutului de O
2
de la nivelul mediului
- coninutul de enzime, respectiv activitatea enzimatic a mediului.
Prin construcia reactorului, acesta permite ataare de:
- senzori care pot s indice valoarea pH-ului i respectiv s o regleze prin adaos de acid sau
baz;
- senzori de temperatur care s comande reglarea temperaturii mediului prin reglarea
debitului de circulaie a apei reci prin mantaua sau serpentina de rcire cu care este dotat
reactorul;
- senzori de reglare a presiunii care s comande deschiderea unor supape de evacuare a CO
2

n aa fel nct la nivelul reactorului s se menin o presiune situat ntre 1 i 3 barri;
- senzor de dozare a coninutul de CO
2
care poate s indice coeficientul de respiraie, notat cu
QR, care indic corelaia ntre cantitatea de O
2
asimilat i cantitatea de CO
2
dezvoltat.
1)



2)


3)
7
Procedeul alimentar de conducere a fermentaiei:
n acest procedeu se umple fermentatorul doar cu 30% din volumul util de mediu
nutritiv, apoi se introduce inoculul de producie i restul de mediu de fermentare. Se
consider finalizat fermentaia dup un timp stabilit experimental. Acest procedeu se aplic
n cazul n care sinteza enzimelor este dependent de concentraii ridicate ale unuia dintre
componenii mediului sau n cazul n care creterea microorganismelor ar putea induce i
creterea vscozitii mediului. n cazul acestui procedeu alimentarea cu mediu proaspt
(70%) poate fi repetat efectundu-se n schimb evacuri programate cu condiia ca n
fermentator s rmn dup fiecare evacuare 30% mediu fermentat care va constitui inoculul
de producie pentru arje succesive.
Procedeul continuu de conducere a fermentaiei:
Acest procedeu necesit alimentarea continu a fermentatorului cu mediu i folosirea
unei unei culturi concentrate de microorganisme. n acest caz bioreactorul const ntr-o
instalaie alctuit din fermentator cuplat la o unitate de ultrafiltrare. Aceast unitate de
ultrafiltrare are rolul de a recicla biomasa produs. Tipul constructiv al unui astfel de
bioreactor i implicita opiune de a evacua la debit constant mediul fermentat prezint
urmtoarele avantaje:
- detoxifierea mediului de cultur prin eliminarea permanent a metaboliilor formai;
- dozarea exact a cantitii de mediu proaspt n funcie de cantitatea de permeat care
strbate membrana de ultrafiltrare;
- celulele au posibilitatea biologic de a se multiplica pn la concentraii relativ mari (n
cazul drojdiilor 300g substan uscat/l biomas). Aceste concentraii permit ndeplinirea
condiiei de barier biologic la contaminri externe.
- permeatul rezultat conine enzime extracelulare, nu conine celule i poate fi dirijat direct
ctre pasul urmtor, i anume acela de purificare sau concentrare.
Dezavantajele acestui procedeu sunt urmtoarele:
- membranele folosite la unitatea de ultrafiltrare trebuie s fie rezistente la tratamente de
sterilizare cu aburi sub presiune i la tratamente cu dezinfectani chimici.
- costurile energetice ale unei astfel de instalaii sunt destul de ridicate.
- membrana de ultrafiltrare se poate colmata i atunci funcionarea bioreactorului este
ntrerupt.
- chiar la densiti mari de celule la nivelul membranei se poate produce o liz celular,
fenomen care impune necesitatea unei purjri a bioreactorului i implicit scade vrsta medie a
celulelor care rmn n sistem.
Extracia se difereniaz n funcie de procedeu. n principiu dup terminarea
fermentaiei se separ partea solid, insolubil (celule microbine i precipitate) de partea
lichid care conine enzimele extracelulare. Separarea se poate realiza prin centrifugare,
filtrare sau ultrafiltrare, iar soluia steril obinut se supune apoi unui procedeu de
concentrare. Dac enzimele obinute se vor comercializa n forma unor preparate lichide
atunci concentratul se va stabiliza fie prin adaos de polioli (sorbitol sau glicerol), fie prin
adaos de sruri (NaCl sau MgSO
4
). De asemenea n scopul stabilizrii biologice se opteaz i
pentru adaosuri de bacteriostatici de origine alimentar sau folosii i n alimentaie cum ar fi
benzoatul, sorbatul sau ascorbatul. n cazul n care enzimele se vor comercializa n forma
unor preparate enzimatice pulbere atunci concentratele se suplimenteaz cu un suport de
natura amidonului sau dextrinelor, se supun din nou unui tratament de filtrare sterilizant,
dup care se usuc prin atomizare.

8
Preparate enzimatice i culturi starter
Curs nr 5

Extracia enzimelor intracelulare

Pentru a obine i enzime intracelulare biomasa din fermentator separat de faza lichid
este supus lizei. Liza peretelui celular poate fi realizat fie sub aciunea enzimelor proprii
microorganismelor, fie sub aciunea enzimelor exogene adugate n fermentator co scopul
precis de a elibera enzime intracelulare de peretele celular, sau de structurile cu rol de sintez.
n cazul n care enzima este periplasmic este suficient un oc osmotic pentru a elibera
citoplasma sau se poate recurge la tehnica unei lize mecanice ceea ce presupune ca biomasa
s suporte iniial o presiune foarte mare situat ntre 600- 1000 barri, presiune urmat apoi de
o detent brusc.
Modaliti de comercializare a preparatelor enzimatice:
Preparatele enzimatice se comercializeaz de regul sub form de pulbere. Aceste
pulberi au ca baz un suport care poate fi amidon, maltodextrine, zahr sau sare. La aceste
preparate se controleaz granulometria i, respectiv umiditatea. Din punct de vedere al
umiditii pulberile trebuie s aib o umiditate de max60%. Suportul folosit nu trebuie s fie
hidroscopic, pentru a se evita formarea de cocoloae la momentul ntrebuinrii.
n preparatele enzimatice pulbere i n preparatele enzimatice lichide coninutul de
enzim este raportat la suport i, de aceea cantitatea de preparat comercial este sesizabil mai
mare dect de enzim activ.
Preparatele comerciale microgranulate se obin din enzime extrase prin ultrafiltrare i,
n aceast situaie se folosesc suporturi, cantitatea de suport fiind calculat n aa fel nct s
se ajung la o valoare impus care poart denumirea de titru enzimatic. Amestecul respectiv
este pulverizat mpreun cu un agent de legtur numit liant, care reprezint cam 0,1-0,5%
din masa suportului. Picturile pulverizate i fixate pe suport sunt uscate apoi ntr-un tunel de
aer cu o temperatur situat ntre 70-90
o
C, valoare stabilit n funcie de termosensibilitatea
enzimelor.
Preparatele comerciale lichide sunt formulate n general cu polioli (sorbitol, glicerol)
care se folosesc cam n proporie de 20-50% fa de preparatul lichid?. Tot la preparatele
comerciale lichide se recomand folosirea unui agent cu efect bacteriostatic, n principiu se
folosete benzoatul de Na (C
7
H
5
O
2
Na) n proporie de 0,1-0,2%.