Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
"I FARMACIE
IULIU HA#IEGANU
CATEDRA DE MICROBIOLOGIE
CRISTIAN HODRN!U
CECILIA BOBO" PETRIC! CIOBANCA
LAURA SIMON
MICROBIOLOGIE
CAIET DE LUCR!RI PRACTICE
PENTRU UZUL
STUDEN#ILOR FACULT!#II DE MEDICINA DENTARA
EDITURA RISOPRINT
2010
1
LUCRAREA NUM!RUL 1. M!SURI DE PROTEC"IE N LABORATORUL
DE MICROBIOLOGIE. STERILIZAREA #I DEZINFEC"IA
M!SURI DE PROTEC#IE N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
1. n laboratorul de microbiologie este obligatorie purtarea echipamentului de protec%ie: halate
albe, dar n anumite situa%ii &i m'nu&i, m'&ti, ochelari, pantaloni &i pantofi, destina%i utiliz'rii
doar n boxa de lucru.
2. n laboratorul de microbiologie nu se m'nnc',nu se bea &i nu se fumeaz'.
3. Nu se duc la fa%' nici minile &i nici diferite obiecte (manipularea batistei se
va face doar dup' sp'larea minilor cu ap' &i s'pun).
4. Materialele contaminate &i cele sterile se manipuleaz' cu mult' aten%ie n condi%ii aseptice
pentru a evita contaminarea suprafe%elor de lucru,a mediilor de cultur', sau infectarea
persoanelor care lucreaz' n laborator. Se lucreaz' n apropierea becului de gaz, flac'ra acestuia
fiind necesar' pentru sterilizarea ansei bacteriologice sau a orificiului de deschidere al diferi%ilor
recipien%i.
5. Ansa bacteriologic', instrument indispensabil n laboratorul de microbiologie se sterilizeaz'
nainte &i dup' ntrebuin%are prin nc'lzire pn' la incandescen%'.
6. Pipetele gradate &i pipetele Pasteur vor fi sterilizate prin flambare numai nainte de
ntrebuin%are, dup' utilizare acestea vor fi puse n vase cilindrice care con%in solu%ie
sulfocromic'.
7. Baloanele, eprubetele &i pl'cile Petri cu produse patologice sau culturi bacteriene care nu mai
sunt utilizate, vor fi puse n recipiente speciale pentru infecte n vederea steriliz'rii.
8. n cazul n care masa de lucru este contaminat' cu bacterii, aceasta va fi acoperit' cu o solu%ie
dezinfectant', care va fi l'sat' 24 de ore.
9. Minile se spal' frecvent cu ap' &i s'pun, aceast' opera%iune fiind obligatorie &i la terminarea
lucrului.
10. nainte de p'r'sirea laboratorului se vor nchide toate sursele de ap', gaz &i curent electric.
2
STERILIZAREA "I DEZINFEC#IA
Sterilizarea const' n distrugerea &i/sau ndep'rtarea tuturor microorganismelor de pe
suprafa%a &i din interiorul unor obiecte.
Dezinfec$ia const' n distrugerea &i/ sau ndep'rtarea anumitor microorganisme (n special
patogene) de pe suprafa%a &i din interiorul unor obiecte.
Asepsia reprezint' ansamblul de m'suri &i mijloace prin care este prevenit' contaminarea
cu microorganisme a materialelor dar &i a organismelor vii.
Sterilizarea se poate face - prin c'ldur'
- cu substan%e chimice
- cu radia%ii ionizante
- prin filtrare
1. Sterilizarea prin c%ldur% folose&te ( c'ldura uscat'
( c'ldura umed'
Materialele (reutilizabile) ce urmeaz' s' fie sterilizate prin c'ldur' vor fi supuse unui
procedeu de preg'tire n vederea steriliz'rii. Dup' cur'%are, sp'lare &i uscare, obiectele sunt
mpachetate n hrtie. Obiectele cu deschidere mic', nainte de a fi mpachetate vor fi ndopate cu
dop de vat' (baloane, eprubete, cilindri). Pipetele (att cele gradate, ct &i pipetele Pasteur) vor fi
prev'zute la cap't cu dop de vat'. Dac' obiectele au con%inut material infec%ios, nainte de
prelucrarea preliminar', vor fi sterilizate prin autoclavare pentru distrugerea microorganismelor.
Sterilizarea prin c'ldur' uscat' ( nc'lzirea la incandescen%'
( sterilizarea cu aer supranc'lzit
nc!lzirea la incandescen"! se aplic' ansei bacteriologice, nainte &i dup' fiecare
utilizare; prin men%inerea ansei n flac'r' pn' la incandescen%' microorganismele sunt carbonizate.
Sterilizarea cu aer supranc!lzit (n cuptorul Pasteur) se aplic' obiectelor din sticl' sau
por%elan, dup' ce au fost preg'tite corespunz'tor.
Cuptorul Pasteur sau Poupinelul este un dul'pior metalic cu pere%i dubli ntre care circul' aerul
cald), iar n interior este prev'zut cu rafturi pe care sunt a&ezate obiectele ce urmeaz' s' fie
sterilizate. Este nc'lzit electric &i este prev'zut cu un termoreglator, termometru &i ceas.
Condi$iile de sterilizare la Poupinel sunt:
( temperatura 180C
& timp 1 or%
Temperatura de 180 C este necesar' deoarece puterea de p'trundere a c'ldurii uscate este mai
mic', iar la temperaturi inferioare, sterilizarea este incomplet'.
! Nu se pot steriliza prin acest procedeu: obiecte metalice, obiecte din cauciuc sau care au garnituri
din cauciuc &i nici lichidele.
Controlul sterilizarii se face prin :
- urm'rirea temperaturii &i a timpului;
3
- procedeu suplimentar- urm'rirea aspectului ambalajelor de hrtie &i a
dopurilor de vat' (la 170C hrtia &i vata r'mn albe, sterilizarea fiind
incomplet' iar la 200C hrtia &i vata se carbonizeaz' &i nu mai ofer'
protec%ie).
Obiectele sterilizate sunt p'strate pn' la utilizare n dulapuri pentru sticl'rie steril'.
Dac' nu au fost utilizate n timp de o s'pt'mn', trebuie sterilizate din nou nainte de
utilizare.
Sterilizarea prin c'ldur' umed'
(sterilizarea cu vapori de ap' sub presiune
(autoclavarea)
- este cea mai sigur' metod' de sterilizare &i este practicat' ori de cte
ori o permite materialul.
- n autoclave se sterilizeaz' medii de cultur', material infec%ios,
obiecte metalice, obiecte de cauciuc, aparatele pentru filtrare,
materiale textile etc.
- ! NU se pot steriliza medii de cultur' care au n compozi%ia lor
ingrediente denaturabile termic.
Condi$iile de sterilizare la autoclav sunt:
( presiune 1 atm echivaleaz' cu temperatura de
120C, timp de 30 de minute.
( la 2 atm temperatura vaporilor de ap% atinge
134C (se indic' pentru materialul infec%ios ).
Autoclavul este un cazan nc'lzit electric (cu gaz la modelele vechi) cu pere%i dublii, grei &i
rezisten%i, prev'zut cu un capac care se nchide ermetic. n interior se g'se&te un gr'tar pe care sunt
a&ezate obiectele ce urmeaz' s' fie sterilizate. Cazanul este prev'zut cu manometru, robinet de
admisie a apei, robinet de evacuare a apei din cazan, robinet de vapori pentru evacuarea aerului &i a
vaporilor &i supap' de siguran%' care se deschide automat dac' presiunea din cazan cre&te peste un
nivel critic.
Controlul steriliz%rii la autoclave se face prin:
- procedee fizice;
- procedee chimice;
- procedee biologice.
Procedee fizice se urm're&te timpul &i presiunea din autoclav.
Procedee chimice se folosesc substan%e cu punct de topire apropiat de 120 C, substan%a se
introduce n cazan odat' cu obiectele &i se sterilizeaz' la terminarea autoclav'rii. Dac' sterilizarea a
fost corect', substan%a se reg'se&te topit' &i solidificat'.
Procedeele biologice- folosesc fiole de Stearotest 120 (suspensie sporulat' de Bacillus
stearotermophylus n mediu nutritiv &i cu indicator de pH culoare violet &i apect limpede) care se
4
introduc n autoclav cu obiectele pentru sterilizat &i se recupereaz' la terminarea autoclav'rii, se
pun la 37C &i apoi se citesc rezultatele (controlul): men%inerea aspectului nemodificat denot' o
sterilizare corect' n timp ce virajul n galben ( acidifiere ) &i o u&oar' opalescen%' indic' sterilizare
incomplet' (au r'mas spori viabili).
2. Sterilizarea cu substan$e chimice:
Substan%ele folosite pot fi
(glutaraldehid' 2%
( peroxid de hidrogen stabilizat (6%)
( acidul peracetic (concentra%ii diferite )
Timpul de contact al substan%ei cu substratul tratat difer' n func%ie de produs; vor trebui
respectate recomand'rile produc'torului privitoare la condi%iile de lucru, att pentru o sterilizare
corect', ct &i pentru evitarea accidentelor.
Sterilizarea cu oxid de etilen'
- se folose&te numai atunci cnd nu exist' un alt mijloc de sterilizare
adecvat;
- metoda este delicat', iar erorile de procedur' pot s' conduc' fie la o
sterilizare ineficient', fie la accidente (toxice ), la personalul care
realizeaz' sterilizarea sau la bolnavii la care se utilizeaz' materialul
astfel sterilizat;
- dup' sterilizare materialul trebuie supus tratamentului de desorb%ie;
- oxidul de etilen' este toxic prin: inhalare, contact, pe cale
parenteral', prin reac%ia cu diferi%i compu&i chimici (cu policlorura de
vinil elibereaz' etilenclorhidrin');
- !oxidul de etilen' este inflamabil &i exploziv!
Parametrii pentru sterilizare sunt:
( temperatur%-37C, presiune subatmosferic%,-
timp de 180 minute sau
& temperatur%-55C, presiune subatmosferic%
timp de 60 de minute
3. Sterilizarea prin radia$ii ionizante:
( razele gama sunt cele mai penetrante;
( ionizarea compu&ilor celulari prin expulzarea electronilor conduce la moartea
microorganismelor;
( razele gama pot fi ob%inute dintr-o surs' de: cobalt 60,cesiu 137;
( este o metod' de sterilizare la rece folosit' pentru: medicamente,instrumentar
confec%ionat din material degradabil termic;
radia%iile ultraviolete sunt utilizate pentru sterilizarea aerului din nc'peri &i a
suprafe%elor de lucru.
4. Filtrarea:
( metod' de sterilizare la rece;
( microorganismele sunt re%inute de o substan%' poroas';
( este aplicat' solu%iilor denaturabile termic;
5
( se poate face prin cre&terea presiunii sau prin aspirare realizat' de
pompa de vid sau trompa de ap'.
Pentru a fi evitat' colmatarea porilor filtrului, filtrarea se va face n maxim 20 de minute,
for%a de aspirare fiind mai mic' la nceput &i crescnd treptat pe m'sur' ce decurge filtrarea;
lichidele vscoase sunt diluate cu ser fiziologic; dup' filtrare este obligatoriu controlul sterilit'%ii
solu%iei (filtratul este ns'mn%at pe medii de cultur' adecvate, este termostatat &i poate fi considerat
steril dac' n 48-72 de ore nu se dezvolt' nici o colonie).
Tipuri de filtre folosite
( Filtre Chamberland (bujii/ lumn'ri) confec%ionate din
por%elan poros ars
- se noteaz' (n func%ie de dimensiunile porilor) de la L1- L13. Filtrele
L3- L13 re%in bacteriile.
- se folosesc adaptate la baloane Kitasato.
( Filtre de sticl'
- sunt discuri de sticl' neutr' &i poroas' turnate ntr-o plnie (suport de
sticl'),
- se noteaz' G0- G5,
- filtrele G5 (cu pori de cca 1) re%in bacteriile.
( Filtre Seitz
- sunt confec%ionate din azbest &i celuloz',
- se monteaz' ntr-o plnie metalic',
- se folosesc adaptate la baloane Kitasato,
- pot modifica pH-ul lichidului filtrat &i pot adsorbi principii activi.
( Membranele filtrante
- sunt confec%ionate din nitrat sau acetat de celuloz', policlorur' de
vinil,
- sunt montate n suporturi din plastic,
- se adapteaz' la seringi de construc%ie special',
- cre&terea presiunii se ob%ine prin ac%ionarea seringii,
- diametrul porilor variaz' ntre 10- 4000 nm.
Dezinfec$ia se poate face prin - c'ldur'
- radia%ii
- substan%e chimice
1. Dezinfec$ia prin c%ldur% folose&te ( c'ldur' uscat',
( c'ldur' umed'
Dezinfec%ia prin c'ldur' uscat' ( flambarea este utilizat' n laborator n timpul
lucrului &i const' n trecerea rapid' &i repetat' a obiectelor (din sticl' sau por%elan) prin flac'ra
becului de gaz nainte &i dup' ntrebuin%are.
Dezinfec%ia prin c'ldur' umed' ( fierberea
( pasteurizarea
( tindalizarea
6
Fierberea se realizeaz' n fierb'toare nc'lzite electric sau la flac'r':
- se face la 100C (adausul de carbonat de sodiu poate conduce la
cre&terea temperaturii spre 110 C) timp de 30 de minut,
7
- sunt distruse formele vegetative. Sporii bacterieni rezist' ns'
la fierbere,
- n laboratorul de microbiologie se folose&te pentru
instrumentarul de utilizare imediat' (foarfece, pense, etc.).
Pasteurizarea:
- folosit' mai mult n industrie (pasteurizarea laptelui, a berii),
- distruge formele vegetative prin distrugerea proteinelor
(ncepe de la 56C),
- produsul este nc'lzit n baia de ap'.
( 30 de minute la 60- 65C
sau
( 15 minute la 70- 75C
sau
( cteva secunde la 85- 90C
- dup' nc'lzire se r%ce'te brusc la 4C
Tindalizarea este un procedeu de dezinfec%ie frac%ionat':
- se adreseaz' solu%iilor care se denatureaz' la fierbere,
- temperatura folosit' este inferioar' celei de 100C (60- 80C),
- solu%ia se nc%lze'te n baia de ap% 1-3 ore pe zi, 3-8 zile
consecutive iar ntre nc%lziri se p'streaz' la temperatura
laboratorului (21C); dup% ultima nc%lzire se r%ce'te brusc
la 4C,
- la temperatura laboratorului, sporii (eventual prezen%i)
germineaz', iar formele vegetative vor fi distruse de o nou'
nc'lzire,
- controlul se realizeaz' prin inoculare pe medii de cultur' &i
termostatare n condi%ii adecvate.
Dezinfec"ia prin vapori curen"i de ap! se face n oala lui Koch sau autoclav cu
robinetul de vapori deschis &i distruge numai formele vegetative; se aplic' solu%iilor
denaturabile la temperaturi mai mari de 100C.
2.Dezinfec$ia cu radia$ii ultraviolete este indicat' pentru:
( suprafe%ele de lucru,
( aerul din boxele de lucru (laboratoare).
- este o metod' complementar' m'surilor de cur'%enie &i
dezinfec%ie chimic'
- condi%iile generale de eficacitate:
( sunt folosite l'mpi fixe sau mobile cu tuburi de UV ntre 15-
30W prev'zute s' func%ioneze n prezen%a omului (radia%ie indirect'- f'r'
emisie de ozon ),
2
( tuburile de raze UV trebuie s' fie permeabile selectiv
pentru radia%ia cu putere bactericid' maxim' (2537 ),
( spa%iul trebuie supus prealabil unei cur'%enii maxime,
temperatura mediului s' fie ntre 15-30 C, cu umiditate de maximum 60%.
- condi%iile speciale :
( pentru suprafe!e
- sunt utilizate aparate cu radia%ie direct',
- dezinfec%ia se face n absen%a omului,
- durata de expunere trebuie s' fie corect' (3-4 doze letale pe
suprafa%a tratat').
( pentru aer
- num'rul l'mpilor se calculeaz' n func%ie de aerul dezinfectat
de c'tre fiecare lamp' (debitul de aer, volumul nc'perii, viteza
de schimb a aerului),
- nu este admis' expunerea direct' a persoanelor la radia%ia
l'mpii de dezinfec%ie (pentru radia%ia direct' este obligatoriu
echipamentul de protec%ie- ochelari, masc', m'nu&i de
cauciuc),
- ! aparatele achizi%ionate vor fi nso%ite de documenta%ia
tehnic' !
3. Dezinfec$ia chimic% poate fi clasificat' n:
- dezinfec%ie de nivel nalt
- dezinfec%ie de nivel mediu
- dezinfec%ie de nivel sc'zut
Dezinfec%ia de nivel nalt:
- distruge toate microorganismele, cu excep%ia unui num'r redus
de spori bacterieni,
- timpul de contact trebuie s' fie de cel pu%in 20 de minute,
- substan%ele utilizate:
( glutaraldehida (2%),
( peroxidul de hidrogen stabilizat
(6%),
( acidul peracetic ( concentra%ii
diferite),
( hipocloritul de sodiu( 5,25%).
Dezinfec%ia de nivel mediu:
- distruge Mycobacterium tuberculosis, forme vegetative ale
bacteriilor, fungi, virusuri,
- ! nu distruge sporii bacterieni,
- timpul de contact necesar este de 10 minute,
- substan%e utilizate:
( fenoli
3
( iodofori
( alcooli
( compu&i pe baz' de clor
Dezinfec%ia de nivel sc'zut:
- distruge majoritatea bacteriilor n form' vegetativ' unele
virusuri &i unii fungi,
- ! nu distruge sporii bacterieni,
- ! nu distruge Mycobacterium tuberculosis,
- timpul de contact necesar este de 10 minute,
- substan%e utilizabile ( fenoli
( iodofori
( s'ruri cuaternare de amoniu
( alcooli 70-90
( hipoclorit de sodiu (5, 25%)
Substan%e dezinfectante:
! fenolii
- au ac%iune bactericid' &i fungicid',
- ! nu ac%ioneaz' asupra sporilor,
- ac%iunea antiviral' este foarte sc'zut',
- se folosesc doar la dezinfec%ia suprafe%elor &i a
aerului.
! halogenii
- elibereaz' clor, brom, iod
- substan%e care elibereaz' clor
( dicloroizocianuratul de sodiu
( hipoclori%ii
Se folosesc pentru tratarea apei &i dezinfec%ia zonelor de preparare a alimentelor.
Stabilizarea solu%iilor se face cu substan%e alcaline.
- substan%e care elibereaz' iod
( iod- ac%iune neselectiv' cu instalare rapid'-vizeaz'
bacterii &i virusuri (Lugol-solu%ie apoas'; tinctur' de iod-solu%ie
hidroalcoolic'),
( iodoforii-distrug bacterii (inclusiv M. tuberculosis)
&i virusuri; ac%iunea antifungic' virusuri; ac%iunea antifungic' este
variabil', iar asupra sporului bacterian au ac%iune slab'.
! compu#ii cuaternari de amoniu:
- sunt detergen%i &i emulsionan%i,
- solubili n ap' &i alcool,
- stabili,
- f'r' miros &i nu p'teaz',
- ac%iune bactericid' (nu &i sporicid'),
- ! nu distrug M. tuberculosis!
4
- ac%iune selectiv' fungicid',
- ac%iunea asupra virusurilor este realizat' numai la concentra%ii de
peste 1% &i este selectiv'.
! clorhexidina
- biguanid care se prezint' sub form' de s'ruri
(acetat sau gluconat de clorhexidin'),
- ac%iune bactericid' ( minus M. tuberculosis),
- nu au ac%iune sporicid',
- ac%iune antiviral' variabil'.
! alcoolul etilic &i izopropilic
- se folosesc n solu%ie apoas' ( pentru adsorb%ia pe bacterii),
- concentra%ii biocide 30-50 % pentru alcoolul izopropilic 50-70%
pentru alcoolul etilic,
- distrug bacteriile (inclusiv BK), fungii,
- ac%iunea antiviral' vizeaz' predilect virusurile
nvelite,
- nu prezint' ac%iune sporicid'.
! aldehidele - formaldehida, glutaraldehida, succinaldehida
- pot fi folosite pentru dezinfec%ie nalt' sau
sterilizare
- formaldehida ( solu%ie apoas' 37% sau solu%ie alcoolic'
4,5%)
- are ac%iune bactericid' ( inclusiv BK),
sporicid', fungicid', virulicid'.
- glutaraldehida
- este un dezinfectant nalt &i sterilizant chimic
- solu%iile apoase sunt acide (activitate sporocid' redus') &i pot fi
activate la forma alcalin' (pH 7,5- 8,5), dar stabilitatea este doar de
14- 28 de zile (datorit' polimeriz'rii moleculelor de
glutaraldehid'),
- are spectru larg,
!a c t i v i t a t e a n u e s t e i n f l u e n ! a t " d e p r e z e n ! a
materialului organic.
! peroxidul de hidrogen #i compu#ii nrudi"i
- concentra!ia 3% se folose#te pentru dezinfec!ia de rutin" #i ca
antiseptic,
- peroxidul de hidrogen stabilizat (conc. 6%) este un
dezinfectant de nivel nalt,
- are un spectru larg - bactericid (inclusiv BK),
sporicid, fungicid, virulicid.
5
1. nc!lzirea la incandescen"! 2. Cuptorul Pasteur (Poupinel)
3. Autoclavul
6
NOTE PERSONALE
7
LUCRAREA NUM#RUL 2. PREPARATE MICROSCOPICE
PREPARATUL NATIV
COLORA$IA SIMPL#
COLORA$IA GRAM
Bacteriile au dimensiuni mici, de ordinul micrometrilor. Datorit" acestui fapt,
aprecierea propriet"!ilor lor morfologice (dar #i de colorabilitate) necesit" realizarea de
preparate microscopice.
Un preparat microscopic se poate face - direct din produsul patologic
- din cultur" bacterian"
Examenul microscopic direct din produsul patologic, de obicei are o valoare pur
orientativ", dar exist" #i excep!ii de exemplu:
- un frotiu dintr-o secre!ie uretral" care eviden!iaz" diplococi
reniformi Gram negativi n interiorul polimorfonuclearelor, ne ofer" practic
diagnosticul de uretrit" gonococic".
sau
- un preparat nativ examinat pe fond ntunecat care a fost efectuat
din serozitatea prelevat" de la nivelul unei leziuni (#ancru dur) situat" pe
mucoasa genital" #i care pune n eviden!" bacterii spiralate, foarte mobile
(executnd mi#c"ri caracteristice de rota!ie, transla!ie, flectare #i n#urubare)
ne ofer" n mod cert diagnosticul de sifilis primar.
Mult mai multe informa!ii ne ofer" ns" un preparat microscopic care a fost f"cut
dintr-o cultur" bacterian". Un astfel de preparat ne ofer" informa!ii privitoare la propriet"!ile
morfo-tinctoriale ale bacteriilor. Examinarea acestor propriet"!i constituie una din etapele
care trebuie parcurse pentru identificarea unei bacterii izolat" dintr-un produs patologic.
Propriet"!ile morfo-tinctoriale sunt:
- mobilitatea (prezent" numai la bacteriile ciliate #i poate fi
apreciat" numai n preparatul nativ care folose#te bacterii
viabile),
- dimensiunile bacteriilor,
- forma bacteriilor,
8
- a#ezarea n frotiu (frotiul sau preparatul colorat folose#te
bacterii omorte n cursul procesului de fixare),
- prezen!a (eventual") a unor structuri neobligatorii ( cum ar fi
capsula sau sporii),
- tinctoriabilitatea sau colorabilitatea bacteriilor- care poate fi
apreciat" strict n colora!iile combinate (Gram #i Ziehl-
Neelsen).
TIPURI DE PREPARATE MICROSCOPICE
1. preparatul nativ.
2. frotiul (preparatul colorat).
1. Preparatul nativ - se poate face- din produsul patologic
sau
- din cultura bacterian"
% preparatul nativ este singurul care ne ofer" informa!ii privitoare la
mobilitatea bacteriilor, deoarece folose#te bacterii viabile; pentru alte
elemente ns" frotiul este mult mai util.
% pentru realizarea unui preparat nativ se va depune cu ajutorul pipetei
Pasteur pe mijlocul unei lame de microscop o pic"tur" dintr-o cultur"
bacterian" ntr-un mediu lichid (sau din produsul patologic lichid) dup" care
se acoper" cu lamela #i se examineaz" la microscop folosind obiective uscate
(pot fi folosite obiective cu puterea de m"rire de 10, 20 sau 40).
n cazul culturilor bacteriene de pe medii solide, pe lama de microscop
se depune o pic"tur" de ser fiziologic n care se emulsioneaz" cu ansa
bacteriologic" o colonie bacterian"; n continuare se procedeaz" la fel ca #i la
preparatul din cultura bacterian" pe mediul lichid; pentru examenul
microscopic pe fond ntunecat se folose#te un condensator paraboloid.
2. Frotiul ( preparatul colorat)- se poate face: - din produsul patologic,
- din cultura bacterian".
% frotiul folose#te bacterii omorte n cursul procesului de fixare, deci
pot fi urm"rite toate celelalte aspecte exceptnd mobilitatea.
% pentru realizarea unui frotiu dintr-o cultur" bacterian" pe mediu lichid
sau din produsul patologic lichid, pe mijlocul lamei de microscop se depune
cu pipeta Pasteur o pic"tur".
% pentru frotiurile din produse patologice semisolide sau din culturi
bacteriene pe medii solide, pe mijlocul lamei de microscop se depune o
pic"tur" de ser fiziologic n care se descarc" (cu emulsionare) ansa
bacteriologic" pe care s-a nc"rcat o colonie bacterian" (sau respectiv un mic
fragment din produsul patologic semisolid).
Timpii de execu!ie ai frotiului sunt: - etalarea
- uscarea
- fixarea
- colorarea
9
- prin etalare se n!elege ntinderea frotiului de-a lungul lamei
lamei de microscop (se face cu ajutorul ansei bacteriologice).
- uscarea se realizeaz" la temperatura laboratorului sau, pentru o uscare
rapid", preparatul se poate trece prin flac"ra becului de gaz, evitnd ns" nc"lzirea exagerat"
a acestuia.
- fixarea se poate face prin metode fizice care constau n trecerea frotiul
tangent la flac"r" sau chimice utilizate pentru anumite colora!ii speciale. Prin fixare:
- bacteriile sunt omorte (preparatul devenind astfel neinfec!ios),
- bacteriile ader" de lama de microscop #i nu se vor desprinde n
cursul opera!iunilor de colorare #i sp"lare,
- colorarea.
TIPURI DE COLORA&II FOLOSITE:
1. colora!ii simple,
2. colora!ii combinate,
3. colora!ii speciale.
1. Colora"ia simpl! are valoare limitat", de obicei strict orientativ".
- frotiul fixat se acoper" cu un singur colorant (oricare ar fi el- albastru
de metilen sau safranin") care se las" s" ac!ioneze timp de 2 minute,
- colorantul este ndep"rtat cu jet de ap",
- preparatul se usuc" (se prefer" uscarea rapid" la flac"r"),
- se pune pe preparat o pic"tur" de ulei de imersie (ulei de cedru),
- se examineaz" la microscop cu obiectivul de imersie dup" aducerea
condensatorului n pozi!ia cea mai n nalt".
Toate frotiurile sau preparatele colorate se examineaz" cu obiectivul de imersie, folosind ulei
de cedru
2. Colora"iile combinate: Gram,Ziehl-Neelsen, permit referiri la colorabilitatea
(tinctorialitatea) bacteriilor.
COLORA$IA GRAM- permite diferen!ierea bacteriilor n:
- Gram pozitive,
- Gram negative.
Timpii colora!iei Gram (se porne#te ca la oricare alt" colora!ie de la preparatul
fixat):
% violet de gen!ian" 2min,
% solu!ie Lugol 2 min (pentru mordansare),
% alcool- aceton" 20 sec. (pentru decolorare sau diferen!iere),
% safranin" sau fuxin" diluat"-2 min.
ntre to!i ace#ti timpi, preparatul se spal" la jet de ap". Dup" ce a fost ndep"rtat" #i
safranina, preparatul se usuc" #i apoi se examineaz" la microscopul optic cu obiectivul de
imersie.
Mecanismul colora!iei Gram are la baz" o reac!ie care se desf"#oar" ntre colorant
#i componentele peretelui celular bacterian.
10
La bacteriile Gram negative, lipidele din peretele celular se extrag n timpul
decolor"rii cu alcool- aceton". n felul acesta permeabilitatea peretelui bacterian cre#te, iar
complexul cristal violet-iod, p"r"se#te celula care se va putea recolora n ro#u cu safranin".
La bacteriile Gram pozitive (la care peretele difer" ca #i structura #i compozi!ie
chimic" de cel al bacteriilor Gram negative), n timpul decolor"rii cu alcool- aceton",
peretele se deshidrateaz", permeabilitatea sa scade, iar complexul cristal violet-iod r"mne n
celul" care p"streaz" culoarea violet.
Microscopul optic
Secre!ie uretral"-col.simpl"-albastru de metilen Streptococi-cultur"-col.Gram
11
Bacillus-cultur"-col.Gram Clostridium tetani-col.Gram
Col.Gram-bacili Gram negativi Pneumococi-prod.patol. Col.Gram-Sarcina
Col.Gram-amprent" de splin"-Bacillus anthracis Stafilococi-cultur"-col.Gram
12
NOTE PERSONALE
LUCRAREA NUM#RUL 3. PREPARATE MICROSCOPICE
COLORA$IA ZIEHL-NEELSEN. COLORA$II SPECIALE
COLORA$IA ZIEHL-NEELSEN- permite diferen!ierea direct n produsul
patologic a mycobacteriilor de alte bacterii (se bazeaz" pe proprietatea de acido-alcoolo
rezisten!" care este caracteristic" mycobacteriilor).
Timpii colora!iei Ziehl- Neelsen sunt :
13
agen"ii de solidificare
o Agar-agar (extract de alge) se prezint" sub form" de f#ii sau pulbere
de culoare g"lbuie-nc"lzit n ap" la 90C, se dizolv", iar solu!ia astfel
ob!inut", prin r"cire sub 45C se solidific"; agarul are proprietatea de
re!ine un volum foarte mare de ap", de 50 de ori volumul s"u. Pentru
prepararea mediilor solide se utilizeaz" agar 2%. Pentru mediile
semimoi agar 0,5-1%, iar n cazul anumitor medii pentru anaerobi agar
4%.
19
o al"i agen"i de solidificare gelatina, care este ns" solid" doar la
temperaturi mai mici de 25C; gelul de siliciu; oul coagulat-pentru
mediul Lwenstein-Yensen sau serul coagulat pentru mediul Lffler.
alte ingrediente:
o indicatorii colorimetrici de pH-albastru de bromtimol,ro#u fenol.
o
agen"ii selectivi-chimioterapice sau alte substan!e,colorante sau nu-
cristalul violet,verdele briliant,azida de sodiu.
o
agen"ii reduc!tori-la prepararea mediilor pentru bacterii anaerobe,ca
de exemplu tioglicolatul de sodiu.
o
substrate pentru teste biochimice- amino-acizi,zaharuri.
" CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR#:
Dup! compozi"ie:
o
Medii uzuale-lichide-apa peptonat" #i bulionul nutritiv,
-solide-agarul nutritiv.
o
Medii cu proteine native-lichide-bulion ser,bulion snge,
-solide-agar ser, agar snge, agar #ocolatiu.
o
Medii de mbog!"ire-sunt medii n faz" lichid"
-mediul Chapman lichid, cu 15% Nacl,pentru stafilococi,
-mediul OCST, pentru Corynebacterium diphteriae,
-mediul cu selenit acid de sodium,pentru salmonelle ,
-apa peptonat" cu pH bazic,8,5,pentru vibrioni.
o
Medii selective-con!in agen!i selectivi,care inhib" multiplicarea
anumitor grupe de bacterii.
-mediul Chapman solid, cu7,5% Nacl,pentru stafilococi,
-mediul Tinsdale, pentru Corynebacterium diphteriae,
-mediul Lwenstein Yensen,pentru Mycobacterium
tuberculosis,
-mediul Sabouiraud,pentru fungi,
-medii selective cu lactoz" pentru Enterobacteriaceae
Drigalski,Levin,Leiffson,Mac Conkey,Istrate Meitert,CLED.
o
Medii pentru bacterii anaerobe
-lichide bulion thioglicolat de sodium,Brewer,Tarozzi,
-semisolide Veillon,
-solide cultivarea se face dup" tehnjca Ott Nagler,Willis
Hobbs.
o
Medii pentru teste biochimice- con!in un singur substrat-zahar sau
amino-acid, la care se adaug" sau nu, indicator colorimetric de pH.
"NS#MN$AREA MEDIILOR DE CULTUR#
20
ns"mn!area se poate face n medii de cultur" lichide,pe suprafa!a mediilor solide sau
n profunzimea mediilor semisolide.
Produsele patologice pot frecvent s" con!in" mai multe specii bacteriene, care trebuie
izolate n cultur" pur". Acest deziderat poate fi atins prin utilizarea tehnicii de inoculare prin
epuizarea inoculului pe suprafa!a mediului din placa Petri. Inoculul se descarc" pe un sector
limitat al mediului, apoi cu ansa bacteriologic" se traseaz" 4-5 striuri paralele, se sterilizeaz"
ansa #i se repet" opera!iunea, pn" cnd sunt inoculate toate sectoarele din placa Petri. Pe
ultimele sectoare,dup" incubare se vor dezvolta colonii izolate a c"ror morfologie va putea fi
analizat".
Pentru realizarea antibiogramei prin metoda difuzimetric", dar #i n alte situa!ii cum
ar fi de exemplu urocultura cantitativ",se inoculeaz" n pnz" suprafa!a mediului, fie prin
inundare cu ajutorul pipetei Pasteur,fie cu ajutorul unui tampon mbibat cu cultur" bacterian"
cu care se #terge suprafa!a mediului pe cel pu!in dou" direc!ii perpendiculare.
Pentru inoculare n profunzimea mediilor semisolide se folose#te ansa dreapt", cu
care se n!eap" toat" coloana mediului.
Pentru inocul"ri n mediile lichide se poate folosii fie ansa bacteriologic",fie pipeta
Pasteur- n cazul culturilor sau a produselor patologice lichide.
CARACTERELE CULTURILOR BACTERIENE
"N MEDII LICHIDE
Se vor urm"rii elementele:
Metoda E-test
Este o metoda care mbin" avantajul metodei difuzimetrice- comoditatea (u#or de
utilizat n condi!iile unui rulaj mare de probe), cu avantajul pe care-l ofer" metoda dilu!iilor
(capacitatea de a stabili concentra!ia minim" inhibitorie- CMI).
Se lucreaz" pe medii de cultur" n pl"ci Petri (la fel ca #i metoda difuzimetric"), ns"
n locul microcomprimatelor de chimioterapice, folose#te benzi impregnate cu
chimioterapice. Concentra!ia de chimioterapice (notat" pe band") descre#te de la extremitatea
ce prezint" simbolul chimioterapicului spre extremitatea opus".
Se incubeaz" tot 18 ore la 37 C, iar la citirea rezultatelor se urm"re#te locul n care
zona de inhibi!ie ntlne#te banda. n punctul respectiv se cite#te CMI.
Pentru interpretarea rezultatelor se iau n considerare strict zonele de inhibi!ie pe care
nu s-a dezvoltat nici m"car o singur" colonie bacterian".
Alte metode
Pentru bacteriile anaerobe,se folose#te metoda difuzimetric" n dublu strat de agar.
Pentru Mycobacterium tuberculosis,antibiograma se lucreaz" direct pe mediul
Lwenstein Yensen.
Metoda difuzimetric! n pl!ci Petri
1. Pseudomonas aeruginosa 2. Pseudomonas aeruginosa
3. Klebsiella pneumoniae 4. Escherichia coli
33
5. Escherichia coli BLSE 6. Serratia marcescens
E-test : Streptococcus pneumoniae
NOTE PERSONALE
34
LUCRAREA NUM#RUL 6. REAC$II ANTIGEN-ANTICORP
ANTIGENUL = orice substan!" care este capabil" s" declan#eze n organism un
r"spuns imun, sau in vitro s" neutralizeze anticorpii specifici.
! R"spunsul imun poate fi de natur" umoral" (cu formarea de anticorpi specifici) sau
celular". R"spunsul imun celular se poate manifesta #i n sens negativ, ca #i toleran!"
imunologic".
35
! O substan!" poate fi recunoscut" drept proprie (self) de un organism sau drept str"in"
(non-self) de un lat organism; n consecin!", antigenul (in vivo) exist" numai n raport
cu organismul receptor.
! Atributele antigenului sunt :
Antigenicitatea = capacitatea substan!ei de a se combina cu anticorpii
respectivi, indiferent dac" are sau nu capacitatea de a stimula formarea lor.
Imunogenicitatea = capacitatea antigenului de a stimula formarea anticorpilor.
! Aglutinogenele sunt antigene particulate care particip" la reac!iile de aglutinare.
! Precipitogenele sunt macromolecule (n solu!ie) #i particip" la reac!iile de
precipitare.
ANTICORPII (Imunoglobulinele) = glicoproteine sintetizate ca #i r"spuns la un
stimul antigenic. Limfocitul B activat de stimulul antigenic trece printr-o serie de etape pn"
la stadiul de plasmocit, principala celul" care secret" imunoglobulinele-anticorpi.
! Aglutininele apar!in clasei de imunoglobuline M #i particip" la reac!iile de aglutinare.
! Precipitinele apar!in clasei de imunoglobuline G #i particip" la reac!iile de precipitare.
! Ca atare pentru ob!inerea de aglutinine se practic" imuniz"ri de scurt" durat", iar
pentru precipitine imuniz"ri de lung" durat".
REAC$IILE ANTIGEN-ANTICORP
Cnd un antigen #i anticorpul s"u specific se apropie de latul n mediul apos, cei doi
reactan!i intr" sub influen!a unor for!e de atrac!ie. Leg"tura care se formeaz" este o leg"tur"
de tip van der Waals.
Pentru formarea complexului antigen-anticorp este necesar ca cei doi reactan!i s" se
apropie la o distan!" de 0,1-0,2 nm.
Reac"ia de aglutinare bacterian!
Aglutinarea bacterian" este o reac!ie antigen-anticorp de agregare, n care antigenul
este reprezentat de celule bacteriene sau fragmente de celule bacteriene n suspensie (antigen
particulat). Sub ac!iunea anticorpilor specifici, complexele imune antigen-anticorp, formeaz"
re!ele tridimensionale n prezen!a unor electroli!i din mediu #i n anumite condi!ii de
temperatur" #i pH, constituind agregate vizibile. Reac!ia de aglutinare se folose#te att n
identificarea unor bacterii pe baza propriet"!ilor antigenice, ct #i pentru eviden!ierea
anticorpilor aglutinan!i din serul de bolnav.
Tehnici de efectuare a reac!iei de aglutinare
Aglutinarea pe lam". Se folose#te preponderent n diagnosticul bacteriologic, pentru
identificarea rapid" pe baza propriet"!ilor antigenice a unor tulpini izolate din produsul
patologic #i mai pu!in n diagnosticul serologic.
Se depune pe o lam" curat" #i degresat" o pic"tur" de ser imun #i al"turi o pic"tur" de
solu!ie salin" fiziologic". Din cultura bacterian" de 18-24 de ore pe geloz" nutritiv", ob!inut"
pornind de la o colonie izolat", se ia cu ansa o cantitate mic" care se suspend" omogen n
pic"tura de ser imun, apoi se repet" opera!ia n pic"tura de solu!ie salin" fiziologic". n cazul
unei coresponden!e antigen-anticorp, n pic"tura de ser imun, bacteriile vor fi aglutinate sub
36
form" de grunji fini, albi, vizibili cu ochiul liber. n pic"tura de solu!ie salin" fiziologic"
(aglutinare martor) bacteriile r"mn n suspensie omogen"; n cazul n care apare aglutinare,
aceasta este nespecific", spontan", dat" de obicei de culturi n faza R.
Aglutinarea pe lam" se poate folosi #i n diagnosticul serologic, n scop de triaj. Dac"
o astfel de reac!ie se pozitiveaz", se va continua obligatoriu cu reac!ia de aglutinare n tuburi
(cantitativ").
Aglutinarea n tuburi este o reac!ie cantitativ", care se folose#te predilect pentru
diagnosticul serologic; se efectueaz" n 6 epubete n care se realizeaz" dilu!ii cresc"toare (n
ser fiziologic) din serul de cercetat, la care se adaug" aceea#i cantitate de antigen standard.
Titrul reac!iei este reprezentat de dilu!ia cea mai mare de ser la care se mai observ"
aglutinarea, cu caracteristicile sale, de aglutinare somatic", sau respectiv flagelar".
Schema reac!iei de aglutinare n tuburi.
n aglutinarea bacterian", dup" natura #i localizarea antigenului care particip" la
reac!ie, exist" dou" tipuri principale de aglutinare: somatic" sau aglutinare O #i ciliar" sau
aglutinare H.
Aglutinarea O sau somatic" este data de antigenul O, somatic, care intr" n
constitu!ia peretelui celular. Antigenul O este de natur" glucido-lipido-polipeptidic",
termostabil, alcoolo-rezistent #i distrus de formol.
Aglutinarea O apare sub forma unor grunji fini, care nu disociaz" la o agitare
brutal": apare mai lent, necesitnd incubare de 2 ore la 52 C n baia-marin", urmat" de 20 de
ore la temperatura camerei. n aglutinarea O bacteriile se unesc ntre ele prin alipirea cap la
cap (aglutinare polar").
Aglutinarea H, flagelar" este dat" de antigenul H, prezent la bacteriile mobile,
antigen de natur" proteic", termolabil, distrus de alcool, rezistent la formol. Aglutinarea H
apare sub forma unor flocoane care formeaz" un sediment abundent lax, care dispare la
agitare brutal"; aglutinarea H apare mai rapid, fiind suficient" o incubare de 2 ore la 52 C
n baia-marin". n aglutinarea H bacteriile se unesc prin flageli.
Cele mai importante reac!ii de aglutinare folosite n diagnosticul serologic al bolilor
infec!ioase sunt: reac!ia Widal n febra tifoid" #i febrele paratifoide, reac!ia Wright n
Epr ube t a
nr.
1 2 3 4 5 6( martor)
Sol.salin"
fiziologic"
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
S e r d e
c e r c e t a t
dil.1/10
0,5 dilu!ii succesive
Antigen
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
D i l u ! i i
finale ale
serului
1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 -
37
bruceloz" #i reac!ia Weil-Felix n tifosul exantematic #i alte rickettsioze. n reac!ia Widal se
folosesc att antigenele O ct #i H de la Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A #i
Salmonella paratyphi B pentru a eviden!ia anticorpii corespunz"tori din serul de bolnav.
Reac!ia de aglutinare pasiv" sau aglutinarea pe suport se utilizeaz" atunci cnd
antigenul este o solu!ie molecular". n urma fix"rii pe un suport particulat acesta devine
aglutinabil n prezen!a serului imun. Astfel de reac!ii se pot executa dupa tehnici variate, care
sunt n func!ie de natura particulelor utilizate ca suport #i de modul n care se face leg"tura
antigenului de particulele respective. Reac!iile se pot folosi att la identificarea unui antigen,
ct #i la cercetarea anticorpilor corespunz"tori folosind un antigen cunoscut.
Particulele folosite sunt fie inerte ca: latex, polistiren, bentonit", colodiu, fie se
folosesc hematii umane de grup O sau hematii de animal- n acest caz vorbim de
hemaglutinare pasiv". Dac" antigenul este polizaharidic, el poate fi u#or adsorbit pe hematii
native. Dac" antigenul este de natur" proteic", adsorb!ia lui pe hematii se face numai dup" ce
n prealabil acestea au fost tratate cu acid tanic (hematii tanate) sau cu al!i fixatori
(glutaraldehida).
Exemple de reac!ii de aglutinare pasiv" n care antigenul este adsorbit de particule
inerte de latex polistiren.
- n eviden!ierea factorului reumatoid (FR= imunoglobuline anticorp care
apare fa!" de Ig G proprii, constituite majoritar din Ig M.)
Testul latex mai poate fi utilizat:
- pentru a detecta antigene de Haemophylus, pneumococ sau antigen de
meningococ n LCR, ser, secre!ie faringian".
- pentru cercetarea anticorpilor anti-ADN n diagnosticul de lupus eritematos
diseminat, atunci cnd particulele de latex sunt acoperite de ADN.
Exemple de aglutinare pasiv" n care antigenul este adsorbit pe hematii:
- pentru testarea anticorpilor antitoxici #i a anticorpilor ce apar fa!" de
diferite antigene bacteriene ( antigene O, antigene polizaharidice, etc.)
- n diagnosticul tiroiditei Hashimoto (boal" autoimun") folosind hematii
tanate sensibilizate cu extract tiroidian.
- n diagnosticul poliartritei reumatoide, reac!ia de hemaglutinare pasiv"
Waaler-Rose. Principiul acestui test const" n proprietatea (capacitatea) pe
care o au eritrocitele de berbec sensibilizate cu hemolizin" (anticorpi
antihematii de berbec) de a fi aglutinate de seruri care con!in factor
reumatoid.
Ca o reac!ie derivat" din hemaglutinarea pasiv", se folose#te ast"zi tot mai mult
reac!ia de inhibare a hemaglutin"rii pasive. O astfel de reac!ie se folose#te n diagnosticul
imunologic al sarcinii pentru cercetarea gonadotrofinei corionice. ntr-un prim timp urina
femeii este pus" n contact cu un ser imun antigonadotrofin". n caz de sarcin", gonadotrofina
corionic" este prezent" n urin" #i n consecin!" va avea loc reac!ia cu anticorpii
corespunz"tori din serul imun. ntr-un al doilea timp, amestecul este ad"ugat unei suspensii
de hematii tanate, sensibilizate la gonadotrofin". Dac" anticorpii antigonadotrofin" din serul
imun utilizat n primul timp au r"mas liberi, vor aglutina hematiile #i reac!ia va demonstra
absen!a gonadotrofinei n urin"- deci diagnostic negativ de sarcin". Dac", din contr",
anticorpii antigonadotrofin" din serul imun au fost satura!i de gonadotrofina prezent" n urina
38
femeii ns"rcinate, aglutinarea hematiilor sensibilizate cu gonadotrofin" nu va mai avea loc
(inhibarea hemaglutin"rii), diagnosticul de sarcin" fiind n acest caz pozitiv.
n imunologia bacterian" reac!ia se folose#te mai ales pentru a preciza punctul
dominant dintr-o grupare determinat" de un antigen.
Reac"ia de precipitare
Este o reac!ie antigen-anticorp de agregare, n care antigenul este reprezentat de
macromolecule n solu!ie coloidal". Punerea n contact a antigenului cu anticorpul
corespunz"tor duce la formarea unor coplexe antigen-anticorp care precipit" atunci cnd
elementele ce particip" n reac!ie se g"sesc n propor!ie optim". Are mai multe variante n
func!ie de mediul n care se desf"#oar" reac!ia. &innd cont de faptul c" n reac!ia de
precipitare, antigenul, ca solu!ie coloidal", poate fi bine caracterizat chimic (polizaharizi
bacterieni purifica!i, proteine bacteriene, antigene sintetice #i semisintetice), aceasta confer"
reac!iei un mare grad de specificitate #i sensibilitate, pretndu-se foarte bine #i la analize
imunochimice de fine!e.
Tehnici de efectuare a reac!iei de precipitare:
1. Precipitarea inelar"-antigenul #i serul imun sunt puse n contact n tuburi cu
diametrul mic, tuburi capilare, n a#a fel nct s" nu se amestece, ci s" formeze o interfa!" de
contact la nivelul c"reia, prin creerea unei zone de concentra!ie optim" de antigen-anticorp,
s" par" un inel de precipitare (are caracter istoric, nu se mai folose#te n prezent).
n diagnosticul bolilor infec!ioase, pot fi men!ionate:
- reac!ia Ascoli- se utilizeaz" n diagnosticul retrospectiv al anthraxului.
- reac!ia Vincent-Bellot- n diagnosticul meningitei cerebro-spinale epidemice.
- identificarea de grup a streptococilor.
2. Reac!ia de floculare este o reac!ie n care precipitarea apare prin amestecul
antigenului cu serul imun (n toat" masa amestecului) sub form" de flocoane. Aceast" reac!ie
se utilizeaz" n principal pentru titrarea toxinelor bacteriene #i a serurilor antitoxice pornindu-
se de la observa!ia c" flocularea apare prima dat" n eprubeta n care exist" o propor!ie
optim" de antigen #i anticorp (reac!ia de floculare Ramon). n felul acesta, cunoscnd titrul
serului se determin" cu u#urin!" valoarea antigenic" a toxinei #i invers.
Tehnica de lucru const" n repartizarea ntr-o serie de eprubete a unor cantit"!i crescnde de
ser antitoxic (Ac) peste care se adaug" o cantitate constant" de toxin" (Ag).
39
Eprubetele se pun n baia marin" la 52 C #i se urm"re#te (la intervale de 5 minute) care
este prima eprubet" n care apare flocularea. Aceasta va reprezenta practic unirea unor
cantit"!i echivalente de antigen #i anticorp.
S" lu"m ca exemplu titrarea valorii antigenice a toxinei difterice: se lucreaz" dup" schema de
mai sus cu un ser antidifteric care are un titru cunoscut de 100/ UA/ml.
Dac" reac!ia apare ini!ial n tubul 3 care con!ine 0,3 ml ser antitoxic, deci 30 unit"!i
antitoxice, !innd cont de faptul c" o limit" floculant" este neutralizat" de o unitate antitoxic",
nseamn" c" 30 unit"!i antitoxice au neutralizat 30 de limite floculante; toxina titrat" are
valoare de 30 de limite floculante (limita floculant" este unitatea de m"sur" in vitro pentru
toxina difteric").
3. Precipitarea n gel utilizeaz" gel de agar sau agaroz" (agar hidrolizat #i purificat)
ca mediu n care unul sau ambele elemente care ntr" n reac!ie (antigen - anticorp) difuzeaz",
diametrul moleculelor de antigen #i anticorp fiind mai mic dect diametrul porilor gelului.
ntlnirea celor dou" elemente n propor!ie optim" duce la apari!ia unei linii sau zone opace
de precipitare, vizibile n gelul transparent.
Se poate realiza dup" urm"toarele tehnici:
a) difuzia simpl" ( difuzeaz" numai unul dintre reactan!i, cel"lalt g"sindu-se nglobat
n mediul de difuzie).
- metoda Oudin: ntr-o eprubet" se pune o coloan" de gel n a c"rei mas" este
inclus serul precipitant: la suprafa!" se toarn" solu!ie de antigen care
difuzeaz" n mediu #i n raport cu capacitatea de difuziune a fiec"rei
frac!iuni antigenice se formeaz" la ntlnirea cu anticorpii benzi de
precipitare.
- metoda difuziei radiale Mancini: se utilizeaz", de exemplu, pentru
determinarea cantitativ" din serul de bolnav a unor frac!iuni proteice, cum ar
fi IgG, IgM, IgA (imunograma) sau a C3, transferinei, etc. Imunograma
reprezint" cea mai frecvent" utilizare a difuziei radiale n laboratorul clinic.
Reac!ia este realizat" prin nglobarea anticorpilor n mediul de difuzie.
b) dubla difuzie (difuzeaz" ambii reactan!i)
- metoda Ouchterlony: pe o plac" de sticl" se toarn" agaroz" 1% n solu!ie
tampon, n care dup" solidificare, se fac godeuri. n godeul central, se
pune serul imun (Ac), iar n celelalte godeuri, se pun diferite Ag. Se
incubeaz" n camera umed" cteva zile. Dac" exist" coresponden!" ntre
Ag #i Ac se formeaz" linii de precipitare, num"rul lor fiind n func!ie de
Epr ube t a
nr.
1 2 3 4 5
S e r
antidifteric
100 U.A/
ml
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Sol.sal.fiz.
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Toxina de
cercetat
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
40
complexitatea antigenului. Metoda poate fi aplicat" pentru identificarea
unor antigene bacteriene, virale, proteine patologice care apar n serul
bolnavilor (proteina C reactiv", )-fetoproteina) #i alte proteine de diverse
provenien!e. Un tip particular de dubl" difuzie l reprezint" metoda Elek
pentru eviden!ierea tulpinilor toxigene de bacil difteric.
c) difuzia n cmp electric
% imunoelectroforeza (IEF) este o metod" care asociaz" principiul
electroforezei (EF) cu principiul difuziunii n gel. Astfel, ntr-un prim timp, se
efectueaz" o EF n gel de agaroz" prin care, datorit" mobilit"!ilor electroforetice
diferite, componentele unui amestec antigenic complex (a#a cum sunt n mod
obi#nuit antigenele naturale) se separ" foarte bine. n al doilea timp, se adaug" un ser
imun corespunz"tor #i se las" s" reac!ioneze, n dubl" difuzie, cu antigenele separate.
Cnd are loc ntlnirea antigenului cu anticorpul corespunz"tor n propor!ii
convenabile, apare un arc de precipitare. Fiecare frac!iune proteic" are un arc
carcteristic ca pozi!ie #i morfologie. IEF poate fi asociat" cu colora!ii speciale pentru
a identifica mai bine frac!iunile antigenice. Aceast" metod", permi!nd o analiz"
am"nun!it" a constituien!ilor antigenici, este foarte util" n:
- determinarea num"rului de frac!iuni prezente ntr-un antigen complex;
- determinarea clasei de Ig #i a altor proteine din plasma sangvin", cu ajutorul
unui ser imun anti ser de om.
- controlul purific"rii unor preparate antigenice:
% contraimunelectroforeza (CIEF): datorit" nc"rc"rii electrice diferite,
antigenul #i anticorpul migreaz" n sens contrar ntr-un cmp electric, #i la locul de
ntlnire cu anticorpul corespunz"tor (care se deplaseaz" prin electroendosmoz"), se
produce n gel o linie de precipitare. Metoda se folose#te pentru determinarea unor
antigene a c"ror migrare n cmp electric se face spre anod (antigenele virusului
hepatitei B-HBs, )-fetoproteina, polizaharide #i alte antigene polimicrobiene). Pe o
lam" pe care s-a turnat gel de agaroz", se taie 3-4 #iruri de perechi de godeuri egale la
distan!" de 0,3-0,5 cm ntre ele. Lama este pus" n cuva de electroforez" #i n
godeurile fiec"rui #ir plasate spre catod se introduc probele de cercetat (Ag), n timp
ce, n godeurile plasate c"tre anod se introduce serul imun corespunz"tor. La
ntlnirea celor 2 elemente se formeaz" o linie sau un arc de precipitare. Durata
migr"rii este de aproximativ o or".
Reac"ii antigen-anticorp cu participarea complementului
Participarea complementului (C) n reac!iile imune a fost ini!ial detectat" prin
capacitatea de a induce liza bacteriilor sensibilizate de anticorpi (bacterioliza respectiv
imunohemoliza).
Reac!ia de bacterioliz"
n cazul n care antigenul care intr" n reac!ie este o celul" bacterian", sub ac!iunea
anticorpului specific #i a C, bacteria sufer" o serie de modific"ri, care n final duc la liza
celulei. Prima observa!ie de acest fel a fost f"cut" pentru vibrionul holeric #i i s-a dat
41
denumirea de fenomenul de bacterioliz" sau de vibrioliz" a lui Pfeiffer, putnd fi eviden!iat in
vivo sau in vitro.
Fenomenul de bacterioliz" a mai fost demonstrat #i pentru al!i bacili Gram negativi:
bacil piocianic, bacil dizenteric, etc.
Bacterioliza, ca orice fenomen de citoliz", necesit" participarea tuturor
componentelor complementului.
Efectul bactericid al complementului
n prezen!a anticorpilor specifici, complementul poate exercita un efect bactericid asupra
unor bacterii Gram negative. n vivo acest efect, care poate fi declan#at #i pe cale alternativ",
se pare c" rezult" din ac!iunea combinat" a complementului #i lizozimului asupra peretelui
celular bacterian.
Fenomenul de imunhemoliz"
n prezen!a anticorpilor specifici antihematie (hemolizina sau ser hemolitic) #i a C,
hematiile sunt lizate. Acest fenomen de hemoliz" imun" st" la baza determin"rii activit"!ii C
prezent n ser, plasm", lichide extravasculare.
n titrarea activit"!ii hemolitice a C se ia n considera!ie dilu!ia cea mai mare de C,
care lizeaz" 50% din hematii n prezen!a unei cantit"!i optime de anticorpi antihematie,
notndu-se DH50 ( doza hemolitic" pentru 50% dintre hematii).
Fenomenul de imunhemoliz" este utilizat, cu rol de indicator, n RFC.
Reac!ia de fixare a complementului (RFC)
n cazul n care reac!iile antigen anticorp au loc n prezen!a C, acesta se fixeaz"
numai pe complexul imun format. Fixarea C pe complexul antigen-anticorp poate fi indirect
eviden!iat", prin fenomenul de imunhemoliz", utiliznd sistemul hemolitic drept indicator.
La RFC particip" dou" sisteme antigen-anticorp:
a)primul sistem Ag-Ac (sistemul de cercetat) este format din serul de cercetat care con!ine
anticorpii (diagnostic serologic) #i antigenul standard.
b)al doilea sistem Ag-Ac (sistemul de referin!" sau sistemul hemolitic) are rolul de a
eviden!ia fixarea complementului pe primul sistem Ag-Ac. Este format din eritrocite de
oaie #i hemolizin" (anticorpi antieritrocite).
ntre cele dou" sisteme oscileaz" C.
n prezen!a anticorpilor n serul de cercetat, se formeaz" complexe antigen-anticorp pe
care se fixeaz" complementul, care se consum" din mediul de reac!ie. Pentru partea a duoa a
reac!iei (cnd se adaug" sistemul hemolitic) nu mai r"mne complement liber, astfel nct
hematiile r"mn intacte (nelizate), reac!ia fiind interpretat" ca #i pozitiv".
Dac" n serul de cercetat nu se g"sesc anticorpi specifici pentru antigenul standard,
complementul nu are unde s" se fixeze #i r"mne liber n mediul de reac!ie, astfel nct n
partea a doua a reac!iei se poate fixa pe sistemul hemolitic, #i determin" liza eritrocitelor;
reac!ia este interpretat" ca #i negativ".
RFC se execut" n doi timpi:
42
1. Se pun n reac!ie serul de cercetat, antigenul #i C, incubndu-se la 37C timp de
o or", sau la +4C timp de 20 de ore, conform procedeului utilizat.
2. Se adaug" apoi sistemul indicator ( sistemul hemolitic) cu o nou" incubare la
37C, dup" care reac!ia se cite#te apreciind prezen!a sau absen!a hemolizei
( reac!ie negativ", sau respectiv pozitiv").
RFC se poate utiliza pentru identificarea unui antigen necunoscut, cu ajutorul
serurilor standard cunoscute, dar mai ales n scopul test"rii anticorpilor necunoscu!i (ser de
bolnav) folosind antigene standard cunoscute.
Materialele necesare reac!iei sunt:
1. Ser de bolnav inactivat 30 de minute la 56C nainte de reac!ie pentru distrugerea
complementului propriu.
Serurile standard utilizate pentru identific"ri de antigene se trateaz" la fel.
2. Antigene cunoscute sau de cercetat, pot fi reprezentate de suspensii bacteriene,
extracte bacteriene, suspensii virale, extracte de !esuturi, etc.
Antigenele trebuie titrate pentru a stabili valoarea antigenic" sau titrul (cantitatea
minim" de antigen, care n prezen!a anticorpilor specifici fixeaz" complementul).
3. Complementul: n mod obi#nuit se folose#te serul de cobai (care con!ine cantit"!i mari
#i n general uniforme de complement), fie proasp"t recoltat, fie conservat prin
diverse procedee. Pentru a alege cantitatea optim" care trebuie pus" n reac!ie,
complementul se titreaz" n prealabil, ori de cte ori se execut" RFC.
Exist" mai multe procedee de titrare a complementului, din care exemplific"m o
tehnic" folosit" n serologia sifilisului.
ntr-o serie de tuburi se pun cantit"!i crescnde de complement diluat 1/10, ncepnd
de la 0,1 pn" la 0,5. Se adaug" solu!ie salin" fiziologic" pn" la cantitatea de 1,5 ml
pe tub #i apoi cte 1 ml sistem hemolitic. Se agit" #i se incubeaz" 30 de minute la
termostat, dup" care se cite#te. Cantitatea minim" de complement care produce liza
complet" a hematiilor reprezint" titrul complementului, sau 1 unitate complement. n
reac!ia de fixare se folose#te cantitatea din tubul imediat urm"tor; de exemplu dac"
liza total" a hematiilor a avut loc n tubul 4, titrul complementului este 0,25, iar n
reac!ie se lucreaz" cu 0,3ml.
4. Hematii de oaie: se recolteaz" steril n balon cu perle de sticl" #i se defibrineaz"
mecanic prin agitare. Se spal" cu solu!ie salin" fiziologic" prin 3-4 centrifug"ri
repetate, dup" care se face o suspensie n solu!ie salin" fiziologic", la concentra!ia
necesar".
5. Serul hemolitic anti-oaie (hemolizina) se prepar" prin injectare repetat" la iepure a
unei suspensii de hematii de oaie. El este titrat de institutul produc"tor, titrul fiind
indicat pe eticheta fiolelor.
Pentru a prepara sistemul hemolitic necesar reac!iei se amestec" cantit"!i egale de
suspensie de hematii n concentra!ia necesar", conform procedeului utilizat #i
hemolizina diluat" conform titrului. Amestecul se !ine 30 de minute la 37C nainte de
repartizare n reac!ie.
43
Tehnici RFC:
1.Tehnica Wassermann: utilizat" n diagnosticul serologic al sifilisului (reac!ia Bordet-
Wassermann), n bruceloz", tuse convulsiv", etc.
2.Tehnica Ida Bengston: folosit" n diagnosticul leptospirozelor, rickettsiozelor, a
infec!iilor cu chlamydii, etc, are avantajul c" stabile#te cantitatea anticorpilor (titrul serului)
lucrndu-se cu dilu!ii succesive de ser de bolnav.
Se lucreaz" pe probe perechi de seruri (prima recoltat" la debutul bolii, a doua n
convalescen!"), urm"rindu-se cre#terea titrului de anticorpi de cel pu!in 4 ori n proba a
doua. Titrul reac!iei este dat de dilu!ia cea mai mare de ser de bolnav care mai fixeaz"
complementul, n prezen!a antigenului specific.
3.Tehnica Breadstreet #i Taylor care se folose#te n infec!iile virale, infec!ii cu
mycoplasme, febra Q, etc. Utilizeaz" o titrare special" a complementului n prezen!a
dilu!iilor de hemolizin", procedeu numit n tabl" de #ah. RFC este efectuat" pe pl"ci sau
micropl"ci cu godeuri, incubarea f"cndu-se dup" tehnica la rece.
Reactii Antigen Anticorp cu reactanti marcati
Sensibilitatea reac!iilor antigen-anticorp poate fi m"rit" legnd de anticorp ( mai rar
de antigen) un marker u#or de identificat, care s" nu interfereze cu propriet"!ile imunologice
ale reactan!ilor. Acest marker poate fi:
a) o substan!" fluorescent" (izocianat de fluorescein"), n tehnica imunofluorescen!ei;
b) izotopi radioactivi (de obicei I
125
), n metoda radioimunotest"rii;
c) o enzim" (peroxidaza, *-galactozidaza, fosfataza alcalin") n testele imunoenzimatice.
Reac"ia de imunofluorescen"! (IF)
Prin cuplarea unei substan!e fluorescente cu anticorpii se ob!in anticorpi fluorescen!i,
care, fixndu-se pe antigenul omolog, conduc la formarea de complexe antigen-anticorp
fluorescente, observabile prin examinarea la microscop n lumin" ultraviolet".
a) metoda direct": anticorpii monospecifici sunt conjuga!i cu substan!a fluorescent".
Materialul testat pentru prezen!a antigenului se etaleaz" pe lam", dup" care se
incubeaz" cu anticorpii marca!i. Excesul de anticorpi se ndep"rteaz" prin
sp"lare, preparatul uscat fiind apoi examinat n lumin" ultraviolet". Complexele
antigen-anticorp marcat, apar ca zone fluorescente, u#or vizibile.
IF direct" este o metod" rapid" de diagnostic n unele infec!ii bacteriene #i mai
ales virale, permi!nd eviden!ierea diverselor antigene n !esuturi.
Dezavantajul procedeului direct const" n necesitatea unui num"r mare de seruri
marcate, fiecare ser cu o singur" specificitate.
b) metoda indirect": comport" doi timpi:
44
- preparatul care con!ine antigen se incubeaz" cu anticorpii specifici,
nemarca!i;
- vizualizarea complexului imun format se face prin prin ad"ugarea unui
indicator fluorescent, care este serul antiimunglobulin" marcat.
Rezult" c" n IF indirect" anticorpul specific nemarcat, pe lng" func!ia de anticorp
fa!" de antigenul c"utat, ndepline#te totodat" rolul de antigen fa!" de anticorpul marcat cu
substanta fluorescenta (serul antiimunglobulinic).
IF indirect" are avantajul c" un singur ser imun antiglobulinic marcat, serul
antiimunglobulin" uman", serve#te la detectarea diverselor sisteme antigen-anticorp.
IF indirect" are o larg" aplicare permi!nd:
- eviden!ierea antigenelor .
- detectarea anticorpilor .
IF este o metod" foarte sensibil", cu condi!ia ca reactivii utiliza!i s" fie purifica!i #i
riguros controla!i, pentru a se exclude erorile cauzate de fluorescen!a nespecific".
IF se aplic" n bacteriologie pentru identificarea streptococilor de grup A, n
diagnosticul infec!iilor cauzate de neiseerii, mycoplasme, hemofili, bordetelle, n sifilis, etc.
IF n diagnosticul rapid al infec!iilor virale - pentru diagnosticul rabiei, IF este
metoda de elec!ie.
Radioimunotestarea (RIA)
Ini!ial aplicat" pentru test"ri de hormoni #i enzime, RIA s-a extins #i n diagnosticul
bolilor infec!ioase, fiind una din cele mai sensibile #i precise metode de detectare #i dozare a
antigenelor #i anticorpilor.
Se practic" fie marcarea cu I
125
(mai rar C
14
, H
3
) a unuia din reactan!i (antigen sau
anticorp), fie radiomarcarea unui indicator (serul antiglobulinic), care reac!ioneaz" cu
complexul imun primar, dup" care se m"soar" radioactivitatea complexului format. RIA
combin" specificitatea imunologic" cu sensibilitatea radiochimiei.
Reac!iile se pot lucra fie n faza lichid", fie n faza solid", cnd unul din reactan!i este
fixat pe un suport solid inert (tuburi, discuri sau pl"ci din polistiren).
RIA se folose#te pentru detectarea enterotoxinei stafilococice, a toxinei botulinice tip
A, pentru eviden!ierea polizaharidului capsular la pneumococi, a P. aeruginosa n
infec!ii urinare, etc.
n infec!iile virale : diagnosticul gripei, a infec!iilor herpetice, sau cu poxvirusuri #i
n deosebi n diagnosticul hepatitelor cu virus B.
Teste imunenzimatice
Antigenul sau anticorpul se cupleaz" cu enzime cu o mare activitate: peroxidaza din
hrean (frecvent folosit"), fosfataza alcalin", etc., rezultnd complexe care re!in att activitatea
imunologic", ct #i cea enzimatic". Complexul imun va fi detectat prin aprecierea activit"!ii
enzimei fa!" de un substrat specific.
Se cunosc diverse tehnici, n diagnosticul bolilor infec!ioase aplicndu-se preferen!ial
ELISA (enzyme-linked-immunosorbant-assay) cu diferite variante.
a) tehnica indirect", des folosit" pentru detectarea anticorpilor, executat" pe un suport
solid inert de obicei tuburi sau pl"ci din polistiren.
- antigenul cunoscut este adsorbit pe suport. Dup" incubare antigenul nelegat
e ndep"rtat prin sp"lare.
45
- ad"ugarea serului de cercetat ,incubare, sp"lare.
- ad"ugarea serului antiglobulin", marcat enzimatic, incubare, sp"lare.
- ad"ugarea substratului pentru enzim".
Reac!ia se cite#te dup" apari!ia reac!iei de culoare ce poate fi m"surat"
spectrofotometric, sau citit" cu ochiul liber.
b) tehnica sandwich pentru detectarea antigenelor, se practic" tot pe suport solid:
- anticorpii cunoscu!i se adsorb pe un suport, incubare, sp"lare;
- ad"ugarea probei cu antigen de cercetat, incubare, sp"lare;
- ad"ugarea anticorpilor specifici marca!i, incubare, sp"lare;
- ad"ugarea substratului pentru enzim".
Citirea reac!iei de culoare ce apare se face cu ochiul liber, sau spectrofotometric.
Tehnica ELISA este folosit" pentru:
- detect"ri de antigene, bacteriene, sau virale (toxina difteric", toxinele E.coli,
toxinele stafilococice, brucelle, yersinii, treponeme, rickettsii,
herpesvirusuri, virusuri hepatice, etc),
- mai ales pentru detect"ri de anticorpi antibacterieni (n salmoneloze,
bruceloza, rickettsioze, etc.) sau antivirali (n hepatitele B, C, #i n infec!ia
cu virusul HIV).
Principiul reac!iei de aglutinare pe lam" Reac!ie de aglutinare pe lam" - pozitiv"
46
Principiul reac!iei de fixare a complementului
Testul Elek
47
Reac!ia de imunelectroforez"
Reac!ia de contraimunelectroforez"
48
Principiul reac!iei de imunofluorescen!"
Reac!ia direct" Reac!ia indirect"
Tehnica ELISA
ELISA indirect" ELISA sandwich
Imagini de imunofluorescen!"
Candida Chlamydia trachomatis
49
Boala Lyme Treponema
NOTE PERSONALE
50
LUCRAREA NUM#RUL 7. SCHEMA DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC
N INFEC$IILE BACTERIENE. RECOLTAREA PROBELOR
PATOLOGICE
Schema diagnosticului de laborator in infectiile bacteriene
I. Diagnosticul direct (bacteriologic)
1. Recoltarea probelor patologice
2. Examenul microscopic direct
- preparat nativ
- frotiu
3. Izolarea pe medii de cultura
51
4. Identificarea :
a. Cercetarea propriet"!ilor morfotinctoriale (preparate microscopice)
b. Cercetarea caracterelor de cultur" (n medii lichide #i pe medii
solide)
c. Cercetarea propriet"!ilor biochimice
d. Cercetarea propriet"!ilor antigenice
e. Cercetarea propriet"!ilor de patogenitate
f. Lizotipia fagic" n cazul n care este necesar"
5. Antibiograma
II. Diagnosticul indirect
- serologic
- biologic
Recoltarea probelor patologice
Probele patologice pot fi produse biologice prezente n mod normal n organism #i care
prezint" modific"ri n cursul mboln"virilor (snge, lcr, urin", materii fecale) sau produse ce
apar numai n cursul mboln"virilor (puroi, lichid pleural, sput", lichid articular).
Se mai pot recolta: apa potabil", apa de canal, ap" de mb"iere, alimente, tampoane de
nc"rc"tur" bacterian" de pe suprafe!e, aeromicroflor".
Reguli de baz" pentru recoltarea probelor patologice:
- prelevarea probei se face steril,
- se va evita contaminarea probelor patologice cu agen!i infec!io#i din mediul extern,
- pentru recoltarea probelor patologice trebuie cunoscut:
1. De unde se pot recolta probele patologice. Selectarea probei se face n raport cu
patogenia infec!iei (poarta de intrare, c"ile de dieminare, c"ile de eliminare).
2. Cnd este momentul potrivit pentru recoltare, n raport cu evolu!ia bolii. Se va
recolta naintea tratamentului chimioterapic.
3. Cum trebuie recoltat, adic" care este tehnica corect" pentru prelevare.
4. Ct trebuie recoltat, deci care este cantitatea minim" necesar" pentru a putea face
diagnosticul de laborator.
Conservarea prelevatelor:
52
- se prefer" ns"mn!area pe medii de cultur" ct mai repede posibil,
- dac" condi!iile nu permit ns"mn!area:
! se utilizeaz" medii de conservare #i transport
! se va respecta temperatura de conservare
! 4 C, aceast" temperatur" nu permite multiplicarea bacteriilor - pentru
urina, materii fecale, sputa, puroi
! 37 C- pentru unele bacterii (Neisseria meningithidis)- LCR, snge
Etichetarea probei este obligatorie. Se vor men!iona:
infec!ii ale tractului respirator superior, infec!ii cutanate, infec!ii genitale, artrite
purulente, meningite.
! Infec!ii cu Streptococcus pneumoniae:
pe agar #ocolatiu (sau agar snge), cu incubare n atmosfer" cu 10% CO2, pentru
pneumococi.
Identificarea
! propriet!"i morfotinctoriale: coci Gram pozitivi, n lan!uri de lungimi
variabile;pentru Streptococcus pyogenes aspectul frotiului este caracteristic din
culturile dezvoltate n bulion glucozat.
! propriet!"i de cultur!:Streptococcus pyogenes formeaz" pe agar snge colonii de tip
S, punctiforme, nconjurate de o zon" de hemoliz" complet" (betahemoliz");n bulion
glucozat las" mediul limpede #i formeaz" un sediment grunjos.
Streptococcus pneumoniae formeaz" colonii de tip S
(tulpinile capsulate), nconjurate de o zon" de hemoliz" ) de culoare verzuie pe geloza
snge #i respectiv galben-verzuie pe geloza #ocolatie.
Enterococii formeaz" colonii de tip S nehemolitice pe geloza
snge, n timp ce pe mediul bil"-esculin" apar negre ca urmare a hidrolizei esculinei.
! propriet!"i biochimice:sunt lipsite de importan!" pentru identificarea streptococilor
piogeni; sunt utile pentru identificarea enterococilor #i pneumococilor.
enterococii (#i streptococii fecali) se dezvolt" la temperaturi ntre 10-40C, n timp ce
pneumococii necesit" temperatura de 37C (cu incubare n atmosfera cu 10% CO2).
enterococii se dezvolt" pe medii cu: 6,5% NaCl, 40% bil" #i 0,1% albastru de
metilen; pneumococii nu se dezvolt" pe astfel de medii #i n plus se lizeaz" n
prezen!a bilei.
pneumococii sunt extrem de sensibili la ac!iunea optochinului.
! propriet!"i antigenice:
grupele antigenice importante pentru patologia uman" sunt: A, B, C, D, F, G.
apartenen!a la grupul antigenic se poate face prin:
- testul la Bacitracin" care permite ncadrarea n grupul antigenic A.
- testul CAMP pentru ncadrarea n grupul antigenic B (tulpinile streptococice din
acest grup produc factorul CAMP #i m"resc zona de hemoliz" produs" de o
tulpin" de stafilococ utilizat" la realizarea testului).
- coaglutinarea
- latex-aglutinarea folose#te anticorpi antigrup streptococic fixa!i pe particule de
latex.
la femeie recoltarea se face la nivelul colului uterin, din fundul de sac vaginal
posterior #i de la nivelul orificiului de deschidere al glandelor Bartholin.
Examenul microscopic direct este util numai din secre!ia uretral". Se poate face fie
n colora!ia simpl" cu albastru de metilen, fie n colora!ia Gram. Se pun n eviden!" diplococi
reniformi, Gram negativi (n colora!ia Gram) #i numeroase polimorfonucleare. n infec!iile
subacute diplococii apar fagocita!i, iar n infec!iile cronice lipsesc polinuclearele, #i cu
destul" dificultate se pot pune n eviden!" diplococii care colonizeaz" celule sau fragmente de
celule epiteliale.
Izolarea se realizeaz" pe geloz" #ocolatie, sau pe geloz" Muller-Hinton suplimentate
cu hidrolizat de lactalbumin"; se incubeaz" 48 h la 36C n atmosfer" cu 10% CO2.
Identificarea se bazeaz" pe propriet"!ile morfotinctoriale (diplococi reniformi Gram
negativi), caracterele de cultur" (colonii mici, de tip S, gri, transparente), propriet"!ile
biochimice (produce oxidaz", catalaz", degradeaz" glucoza dar nu #i maltoza), propriet"!ile
de patogenitate (cu prezen!a endotoxinei, a pililor care asigur" colonizarea mucoaselor, a
capsulei polizaharidice).
71
Antibiograma este obligatorie pentru conturarea schemei terapeutice.
Neisseria meningithidis este un agent etiologic specific uman, izolabil din
rinofaringele purt"torilor s"n"to#i, iar n cazul bolii clinic manifeste de la nivelul lichidului
cefalorahidian.
Meningococii p"trund n organismul uman pe cale aerogen" #i determin" ini!ial o
rinofaringit" subclinic" sau clinic manifest". Dac" dep"#esc bariera mucoas" p"trund n snge
#i determin" bacteriemie. Sub ac!iunea factorilor de ap"rare nespecific" interferoniii, sau
specific" anticorpii antimeningocici infec!ia se poate opri n acest stadiu. n condi!ii de
sc"dere a rezisten!ei generale organismului, meningococii dep"#esc bariera hemato-
encefalic" #i se localizeaz" la nivelul nveli#urilor meningeale, determinnd meningita
meningococic".
Diagnosticul de laborator se face pe baza examenului direct bacteriologic.
Recoltarea probelor patologice:
testul VDRL ( Venelar Disease Research Laboratory), este o reac!ie de floculare care
folose#te antigenul cardiolipinic. Microcristalele de colesterol nc"rcate cu
cardiolipin" ntr" n reac!ie cu anticorpii din serul bolnavilor, iar pozitivarea reac!iei
se traduce prin apari!ia unor flocoane, concomitent cu limpezirea mediului de reac!ie.
Reac!ii cu antigene treponemice: sunt sensibile #i specifice:
reac!ia de imunoaderen!",
Imunoelectrotransfer (western-blot).
% Imunoelectronomicroscopia: ex: infec!ii cu rotavirusuri sau cu virusul hepatitei A
(HAV) etc.
Reac"ia de hemaglutino-inhibare
Se poate folosi ca #i celelalte reac!ii #i n diagnosticul direct #i n diagnosticul
serologic.
Pentru diagnosticul direct se ncepe cu titrarea antigenului printr-o reac!ie de
hemaglutinare, iar n reac!ia de hemaglutino-inhibare se va folosi antigenul la valoarea de 4
UHA (unit"!i hemaglutinante).
Reac!ia de hemaglutinare (titrarea antigenului)
Godeu nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S e r
f i z i ol ogi c
(ml)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
A n t i g e n
viral (ml)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Suspensi e
h e m a t i i
(ml)
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
115
Reac!ia de hemaglutino-inhibare se lucreaz" conform schemei:
Citirea reac!iei urm"re#te s" stabileasc" care dintre serurile antivirale are capacitatea de a
inhiba fenomenul de hemaglutinare care este caracteristic virusului izolat, indicnd astfel
diagnosticul.
Exemplu (identificarea virusurilor gripale):
RHA , - 1/8 1/16 1 /32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
D i l u " i i
ob"inute
) * 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
Godeu nr.
1 2 3 4 5 6 7 8
Ser fiziologic
(ml)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Ser antiviral
(ml)
Se fac dilu"ii
binare n ser
fiziologic
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Antigen viral
4 UHA ( ml)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Se incubeaz! 60 de minute la 22 C
Suspensie de
hematii 0,5 %
( ml)
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Se incubeaz! 60 de minute la 22 C. Se cite'te reac"ia
116
RHI
Ser standard anti AH1N1
Ser standard anti AH2N2
Ser standard anti AH3N2
= absen!a hemaglutin"rii (la titrarea prin reac!ia de hemaglutinare), respectiv inhibarea
hemaglutin"rii (n reac!ia de hemaglutino-inhibare).
= hemaglutinare.
Diagnosticul serologic
Se lucreaz" pe probe perechi de seruri #i urm"re#te cre#terea n dinamic" a titrului de
anticorpi, de cel pu!in 4 ori n proba a doua fa!" de prima prob".
Reac"ia de seroneutralizare (RSN)
Este o reac!ie sensibil" #i specific" util" n diagnosticul infec!iilor virale.
n RSN anticorpii se fixeaz" pe virionii corespunz"tori #i neutralizeaz" capacitatea lor
infectant" pentru celula gazd".
Dilu!iile de ser antiviral (standard n diagnosticul direct, de cercetat n diagnosticul
serologic) se pun n contact cu cantit"!i egale de virus (de identificat n diagnosticul direct,
standard n diagnosticul serologic), pentru 30-60 minute la temperatura laboratorului
(20-22C) dup" care amestecul se inoculeaz" ntr-un sistem celular susceptibil, urm"rind
infectivitatea viral" pentru acesta. n culturile de celule reac!ia de seroneutralizare este
pozitiv" cnd efectul citopatogen nu apare. n prezen!a efectului citopatogen caracteristici
virusului inoculat RSN se interpreteaz" ca #i negativ".
Reac"ia de inhibare a hemadsorb"iei
Este important" pentru identificarea virusurilor care nu produc un ECP evident
(exemplu: virusurile gripale).
Prin hemadsorb!ie se n!elege capacitatea unor virusuri de a induce modific"ri ale
suprafe!elor celulelor infectate care s" antreneze dup" sine posibilitatea ca aceste celule s"
fixeze pe suprafa!a lor eritrocite.
n reac!ia de inhibare a hemadsorb!iei se urm"re#te neutralizarea prin anticorpi
specifici a capacit"!ii hemadsorbante produs" de virusul replicat (omologia reactan!ilor
antigen-anticorp = diagnostic pozitiv, se traduce prin lipsa de instalare a fenomenului de
hemadsorb!ie caracteristic virusului).
117
Imunoelectronotransfer (western-blot)
Proteinele virale sunt separate prin electroforez" pe gel de poliacrilamid". Acestea
sunt ulterior transferate #i fixate pe un suport de nitroceluloz". Banda cu proteinele virale este
incubat" cu serul de cercetat. Fixarea anticorpilor se eviden!iaz" cu ajutorul imunglobulinelor
(anti Ig uman") marcate enzimatic. Se adaug" substratul pentru enzim" #i se cite#te reac!ia de
culoare.
DETECTAREA GENOMULUI VIRAL
1. Electroforeza n gel de poliacrilamid!, a ARN-ului (RNA-PAGE),
2. Hibridizarea genomic!,
3. Amplificarea enzimatic! a genomului.
Electroforeza n gel de poliacrilamid" a ARN , este o tehnic" util" pentru depistarea direct" a
rotavirusurilor #i este realizabil" numai n condi!iile unei excre!ii masive n materiile fecale
precum #i a structurii duble catenare a ARN-ului genomic.
Hibridizarea genomic"
Aceast" metod" se bazeaz" pe capacitatea ARN sau ADN viral de a se lega n mod
specific (hibridizare) de catene complementare de ADN (sonde nucleotidice), generate
artificial sau pornind de la genomul viral clonat. Legarea poate fi detectat" cu ajutorul
marcajului radioactiv sau enzimatic al sondei. Marcajul radioactiv este eviden!iat pe un film
sensibil la razele X n general prin dot blot. Aceast" modalitate de detec!ie este deosebit de
sensibil", ns" necesit" un timp de expunere lung #i condi!ii de lucru (radioactivitate).
Utilizarea enzimelor, cum ar fi peroxidaza sau fosfataza alcalin", permite detectarea prin
reac!ii de tip ELISA. Este n egal" m"sur" posibil s" se fac" hibridizarea in situ a cupelor
histologice pentru depistarea infec!iei.
DOT BLOT = tehnic" pentru detectarea, analizarea #i identificarea proteinelor similar" cu
western-blot, dar diferit" prin faptul c" proba de protein" nu este separat" electroforetic, ci
depus" punctiform pe un suport membranar sau pe hrtie.Concentra!ia proteinelor poate fi
estimat" semicantitativ, cu ajutorul anticorpilor specifici.
Amplificarea enzimatic" a genomului
Au fost propuse mai multe metode, ns" cel mai frecvent se folose#te reac!ia n lan! a
polimerazei (PCR=polymerase chain reaction). Aceast" metod" const" n separarea la cald a
celor dou" catene de ADN, ce con!in regiunea pentru amplificat. E#antionul este apoi
amestecat cu amorse (n jur de 20 de nucleotide), complementare secven!elor nucleotidice,
care flancheaz" regiunea pentru amplificat. Aceste amorse sunt alese n a#a fel nct s" fie
situate la extremit"!ile unei secven!e de 50-1000 baze. Dup" r"cirea ADN-ului, amorsele n
exces se fixeaz" cu secven!a complementar" pe ADN-ul !int", iar apoi nucleotidele sunt
incorporate secven!ial de o ADN-polimeraz" termostabil" (Taq-polimeraza); se produc astfel,
dou" copii de ADN !int".
118
Amestecul este din nou nc"lzit pentru separarea ADN-ului dublu catenar, dup" care
se r"ce#te pentru a permite fixarea amorselor #i incorporarea de nucleotide. Taq-polimeraza
(Thermus aquaticus) este utilizat" datorit" faptului c" ea nu se denatureaz" prin nc"lziri #i
r"ciri repetate. Dup" 30 pn" la 80 de cicluri efectuate n mod automat, ADN-ul amplificat
poate fi detectat prin electroforez" n gel de agaroz". Este foarte important de verificat ca
fragmentul amplificat s" corespund" perfect secven!ei !int", fie cu ajutorul unei endonucleaze
de restric!ie, fie prin hibridizare cu ajutorul unei sonde ADN. Metoda poate fi modificat"
pentru detectarea virusurilor cu ARN, prin ad"ugarea unei etape de transcrip!ie invers",
nainte de a ncepe PCR. Din punct de vedere teoretic, se poate detecta o singur" copie a
genomului viral. n practic", ns", cantit"!ile necesare sunt mult mai mari. E#antionul poate
de asemenea s" con!in" inhibitori din reac!ie, ce vor determina rezultate fals negative.
Metoda este deosebit de sensibil", iar reac!iile fals pozitive survin n urma contamin"rii
e#antionului printr-o !int" exogen". Din acest motiv, este indicat s" se foloseasc" loca!ii
distincte pentru prepararea e#antioanelor, amplificare #i detectarea produselor amplificate.
Sensibilitatea #i specificitatea PCR poate fi ameliorat" cu ajutorul unei a doua amplific"ri,
folosind amorse interne pentru primul fragment.
Titrarea antigenului prin RHA #i identificare prin RHI cu seruri antivirale standard.
119
Microscop reversat (folosit la examinarea monostratului celular)
Hemadsorb!ia eritrocitelor de pui pe celule infectate cu virus gripal.
Incluzii intracitoplasmatice acidofile = corpusculii Babe#-Negri caracteristici n infec!ia rabic".
120
Dup" Hart T. #i Shears P., Mdecine-Sciences/Flammarion, 1997.
ORTHOMYXOVIRIDAE
Familia Orthomyxoviridae, include virusurile gripale (Myxovirus influentzae) tip A,
B #i C.
Sunt virusuri cu ARN monocatenar, simetrie helicoidal", nvelite. Virionul este sferic.
Genomul viral este format din 8 segmente de ARN, fiecare dintre ele constituind o gen" care
codific" sinteza unei alte proteine. Sunt codificate 3 polimeraze (P1= ARN polimeraza ARN
dependent" care este implicat" n replicarea genomului viral; P2 #i P3 cu participare la
organizarea #i asamblarea nucleoproteinei), nucleoproteina, proteina matricei, proteina
nestructural", hemaglutinina #i neuraminidaza.
Ansamblul ARN- proteine formeaz" complexul ribonucleoproteinic. Moleculele de
ribonucleoprotein" sunt dublu spiralate, iar extremit"!ile r"mn monocatenare. Acest
complex este acoperit de c"tre proteina matricei peste care este dispus nveli#ul viral
Pe suprafa!" proemin" dou" tipuri de spiculi: hemaglutinina #i neuraminidaza.
Virusurile gripale au att antigene interne reprezentate de ribonucleoproteina, ARN-
polimeraza #i proteina matricei ct #i antigenele externe reprezentate de hemaglutinin" #i
neuraminidaz". Hemaglutinina intervine n adsorb!ia virionilor pe receptorii celulei gazd",
precum #i n procesul de nmugurire a membranei celulare n perioada de maturare a
virionului iar neuraminidaza particip" att la declan#area infec!iei, ct #i la eliberarea din
celul" a virionului matur. Hemaglutinina intervine #i n producerea reac!iei de
hemaglutinare.
La antigenele externe se descriu dou" tipuri de varia!ii:
a) minore: care constau n modific"ri mici n structura lor; se produc prin
muta!ie #i caracterizeaz" mutantele epidemice.
b) majore: constau n modific"ri bru#te #i extinse n structura acestor
antigene; se produc prin recombinare genetic" ntre virusuri care se
replic" concomitent #i caracterizeaz" mutantele pandemice.
Din punct de vedere clinic, infec!ia gripal" evolueaz" ca #i o pneumonie intersti!ial"
#i poate fi urmat" de complica!ii (fie suprainfec!ii bacteriene, fie complica!ii de alt" natur";
ex: miocardita). Profilaxia se face prin vaccinare.
Diagnosticul virusologic
Recoltarea produsului patologic:
! exudat faringian #i nazal,
! lichid de sp"l"tur" rinofaringian".
Examenul microscopic direct: folosind tehnica imunofluorescen!ei pot fi detectate
antigenele virale n celulele epiteliale.
Cultivarea: produsul patologic se inoculeaz" n cavitatea amniotic" sau alantoidian"
a oului embrionat de 9-11 zile (metod" veche) sau se folose#te inocularea n culturi de celule.
Eviden!ierea virusului se bazeaz" pe capacitatea acestuia de a aglutina hematii de
coco#, proprietate ce se eviden!iaz" prin reac!ia de hemaglutinare conform schemei de mai
jos.
121
Pentru identificarea virusurilor se folose#te reac!ia de hemaglutinoinhibare (dac" s-a
izolat n oul embrionat) dar poate fi folosit" #i reac!ia de inhibare a hemadsorb!iei (dac" s-a
izolat n culturi celulare).
PARAMYXOVIRIDAE
Cuprinde virusuri cu ARN, simetrie helicoidal", nveli# lipidic bistratificat, care
prezint" propriet"!i de mixofilie #i capacitate hemaglutinant", precum #i propriet"!i
hemolitice.
Familia include genurile:
$ Paramyxovirus cu virusurile paragripale (4 tipuri antigenice) #i virusul urlian
(Paramyxovirus parothidis).
$ Morbillivirus cu virusul rujeolic.
$ Pneumovirus cu virusul respirator sinci!ial (VRS).
Virusurile paragripale, produc la copiii mici bron#ite, bron#iolite #i pneumonii (tipul
3), precum #i laringotraheite sufocante (tipul 2). La copiii mari #i la adul!i infec!ia evolueaz"
frecvent ca #i o rinofaringit".
Virusul urlian este agentul etiologic al parotiditei epidemice caracterizat" prin
tumefierea uni sau bilateral" a glandei /glandelor parotide. Virusul manifest" un tropism
deosebit #i pentru alte !esuturi glandulare. Profilaxia se face prin vaccinare.
Virusul rujeolic este agentul etiologic al rujeolei, boal" infecto-contagioas" a
copil"riei care evolueaz" cu erup!ie tegumentar" maculo-papuloas" asociat" cu
simptomatologie respiratorie. Profilaxia se realizeaz" prin vaccinare.
Virusul respirator sinci!ial prezint" importan!" numai pentru patologia infec!ioas" a
copilului mic la care produce bron#iolite #i bronhopneumonii grave, n special n primele 6
luni de via!". La adult #i la copilul mare infec!ia evolueaz" ca o banal" rinofaringit".
Paramyxoviridaele sunt cultivabile pe culturi de celule unde produc efect citopatogen
de tip sinci!ial, ini!ial discret dar care se accentueaz" prin pasaje repetate.
RHABDOVIRIDAE
Pentru patologia uman" este important virusul rabic. Este un virus cu ARN
monocatenar liniar (nesegmentat), simetrie helicoidal", nvelit.
Virusul rabic infecteaz" att animalele s"lbatice ct #i domestice: transmiterea se
face prin mu#c"tur", virusul fiind prezent n saliva animalului bolnav.
Infec!ia se poate transmite #i la om, tot prin mu#c"tur".
Incuba!ia medie este de 30-40 de zile, dup" care se instaleaz" hiperestezie #i prurit n
zona pl"gii #i apar modific"rile de comportament #i anxietatea.
n perioada de stare, evolueaz" ca o encefalit" rabic" cu halucina!ii, agita!ie, spasme
dureroase ale musculaturii faringelui care determin" hidrofobie. Paraliziile #i starea
comatoas" preced exitusul.
Rabia, odat" instalat", nu se poate trata. Prevenirea rabiei se face prin administrarea
de ser antirabic asociat cu vaccin antirabic (obligatoriu n prezen!a unor pl"gi mu#cate).
122
Diagnosticul de laborator
La om se face numai la necropsie.
n cazul animalelor suspecte de rabie acestea sunt !inute sub observa!ie, prelevndu-
se probe de saliv" din care pot fi decelate antigenele virusului rabic prin metoda
imunofluorescen!ei.
Dac" animalul prezint" semne de boal" este sacrificat #i se practic" sec!iuni prin
substan!a nervoas" colorate cu hematoxilin" eozin". n astfel de preparate microscopice pot
fi puse n eviden!" n neuroplasm" incluzii acidofile. Acestea sunt corpusculii Babe#- Negri #i
sunt patognomonici pentru rabie.
Virusul rabic este cultivabil prin inoculare intracerebral" la #oarecele sugar, precum
#i prin inoculare pe culturi de celule diploide umane.
PICORNAVIRIDAE
Familia cuprinde virusuri cu ARN monocatenar liniar, simetrie cubic", nenvelite.
Capsida este un icosaedru cu 60 de capsomere, iar diametrul virionului este foarte mic
(22-30 nanometri)
Genul Enterovirus cuprinde: virusurile poliomielitice (tip 1, 2, 3),virusurile
Coxsackie A (23 de tipuri), Coxsackie B (6 tipuri), virusurile ECHO (32 de tipuri) precum #i
virusurile enterice umane 68- 71.
Aceste virusuri manifest" afinitate pentru tractul digestiv #i forma!iunile limfatice
ata#ate tubului digestiv (amigdale, ganglioni mezenterici, pl"ci Payer) nivele la care se
multiplic", dup" care prin viremie ating structurile !int".
Virusurile poliomielitice manifest" tropism pentru SNC, iar afectarea meningeal"
poate s" apar" n toate infec!iile cu enterovirusuri (meningite aseptice).
Infec!ia poliomielitic"
Perioada de incuba!ie are o durat" de 7- 14 zile, dup" care poate evolua: - infec!ie
subclinic"; - boal" minor" (cu febr", cefalee, mialgii, tulbur"ri digestive); - boal" paralitic"
(apare numai la 1% din cei care fac infec!ia poliomielitic") #i se caracterizeaz" prin
instalarea unei paralizii (flasc") ce intereseaz" un singur grup muscular. Paralizia este
datorat" localiz"rii virusului la neuronii motorii din coarnele medulare anterioare, sau din
cortexul motor cerebral.
Imunitatea n poliomielit" este specific" de tip.
Profilaxia se face prin vaccinare (vaccin cu virus viu atenuat tip Sabin).
Infec!ia cu virusurile Coxsackie
Coxsackie A poate produce:
$ herpangina, caracterizat" prin hiperemia faringelui fond pe care apar vezicule de
aspect cenu#iu,
$ boala mn"-picior-gur", caracterizat" prin leziuni ulcerative la nivelul faringelui
#i care asociaz" o erup!ie vezicular" palmo-plantar".
Coxsackie B poate produce:
$ pleurodinia (mialgia epidemic"), cu febr", cefalee #i dureri musculare generalizate,
dar mai intense la nivelul toracelui,
123
$ encefalomiocardita nou-n"scutului.
Infec!ia cu virusurile ECHO, evolueaz" ca #i meningit" cu lichid clar (aseptic").
Genul Heparnavirus- cuprinde virusul hepatitei A (HAV).
Genul Rhinovirus are peste 150 de tipuri antigenice. Sunt agen!i etiologici majori ai
guturaiului, boal" ce evolueaz" cu secre!ie oculo-nazal" abundent", tuse, str"nut #i cefalee.
Diagnosticul de laborator n infec!iile cu enterovirusuri
Toate Enterovirusurile pot fi izolate n culturi de celule n care induc un ECP de tip
degenerativ, iar identificarea #i diagnosticul serologic se bazeaz" pe utilizarea reac!iei de
seroneutralizare (RSN).
Diagnosticul de laborator n poliomielit".
Diagnosticul virusologic
Produsul patologic (materiile fecale) este inoculat n culturi de celule (se pot utiliza
celule diploide din rinichi uman, amnios uman sau rinichi de iepure, precum #i linia
stabilizat" Hela). Virusurile poliomielitice induc un ECP de tip degenerativ, cu rotunjirea #i
mic#orarea celulelor, nucleu picnotic, iar liza celular" este total" n 24- 72 de ore.
Identificare se bazeaz" pe practicarea reac!iei de seroneutralizare n culturi de
celule.
Pentru RSN, dilu!iile de ser sunt puse n contact cu volume egale de antigene virale,
se las" 30-60 de minute la temperatura laboratorului (22C) dup" care se inoculeaz" pe
sistemul celular (la culturile celulare se folosesc volume de 0,2 ml/ tub). Se utilizeaz" #i
culturi de celule neinoculate martor.
La intervale de timp culturile de celule inoculate sunt examinate.
Rezultatele: $RSN pozitiv"- n sistemul celular (culturile de celule) n care a
existat omologie ntre anticorpii din ser #i antigenele virale, nu mai apar modific"rile
caracteristice virusului inoculat.
$RSN negativ"- n sistemul celular (culturile de celule) n care
virusul nu a fost neutralizat prin anticorpi specifici, acesta produce modific"rile
caracteristice.
HERPETOVIRIDAE
Herpetoviridaele sunt virusuri cu AND dublu catenar, simetrie cubic", nvelite,
virionul are o form" sferic" #i diametrul de 130- 250 nanometri, iar capsida este un
icosaedru cu 162 de capsomere.
Se clasific" n subfamiliile :
1. Alfaherpesvirinae cu genurile:
Simplex virus:
o
virusurile herpes simplex tipul 1- oral
tipul 2- genital.
Varicella virus:
124
o
Virusul varicel"-zona zoster 1 tip antigenic.
2. Betaherpesvirinae cu genurile: