Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
C, timp de 24 - 48 ore.
Inocularea diluiilor zecimale prin ncorporare n mediu solid,
pentru determinri cantitative
2. TEHNICI DE CULTIVARE A RICKETTSIILOR, CHLAMIDIILOR,
VIRUSURILOR
Virusurile sunt entiti infecioase acelulare, care nu se pot replica dect n celule vii.
Cultivarea lor se face pe medii celulare, de tipul oulor embrionate, animalelor de laborator,
culturilor de celule.
Rickettssiile i chlamidiile sunt bacterii de dimensiuni mici, cu structur celular de tip
procariot, care produc mbolnviri la om i animale. Datorit parazitismului lor obligatoriu
intracelular, dei au metabolism propriu i propriul echipament enzimatic, bacteriile de tipul
rickettssiilor i chlamidiilor se cultiv pe medii celulare, asemntor virusurilor.
FI DE LUCRU
Cultivarea virusurilor pe ou embrionate
A. STRUCTURA OULUI EMBRIONAT DE GIN
La unul dintre poli, oul prezint o camer cu aer, mrginit de o membran proprie a
oului. Embrionul este nconjurat de o membran amniotic ce delimiteaz o cavitate amniotic,
plin cu aproximativ 5 ml. de lichid amniotic incolor. n faa embrionului se gsete sacul vitelin
de culoare galben, continuat cu sacul albuminic. Coaja oului i restul embrionului sunt nvelite de
membrana corioalantoidian, ce delimiteaz o cavitate alantoidian, plin cu un lichid
alantoidian de culoare glbuie.
Structura oului embrionat
(http://www.virology.ws/2009/12/10/influenza-virus-growth-in-eggs/)
B. INOCULAREA VIRUSURILOR PE OUL EMBRIONAT DE GIN
nainte de orice tip de inoculare se noteaz sub control la ovoscop locul camerei cu aer i
locul unde embrionul este mai aproape de coaj, se badijoneaz cu iod zonele n care urmeaz a fi
practicate orificii i se lucreaz n manier aseptic.
1. Inocularea n cavitatea alantoidian (intraalantoidian)
Este calea de inoculare pentru virusul urlian i pentru virusul gripal (dup ce a fost cultivat
n prealabil, pentru adaptare, n cavitatea amniotic). Se folosesc ou embrionate n vrst de 9 - 10
zile, examinate la ovoscop pentru controlul viabilitii embrionilor.
a)- se aaz oul n poziie orizontal, cu partea notat n sus; se execut cte un orificiu (cu un
perforator) n coaja oului n zona notat i n zona camerei cu aer;
- prin orificiul lateral se introduce acul seringii 3 - 4 mm i se injecteaz aproximativ 0,1 - 0,2 ml
de suspensie viral; orificiile executate se parafineaz.
b)- se aaz oul n poziie vertical, cu camera de aer n sus; se practic un orificiu punctiform cu
ajutorul perforatorului;
- se introduce prin acest orificiu acul seringii, orientndu-l spre zona unde embrionul este mai
aproape de coaj; se inoculeaz n cavitatea alantoidian 0,1 - 0,2 ml suspensie viral; orificiul
executat se parafineaz dup inoculare.
Oule inoculate se pun la incubator n poziie orizontal, la 35 - 37
0
C.
2. Inocularea pe membrana corioalantoidian
Este calea de inoculare pentru izolarea virusurilor pox (smallpox, cowpox), a virusului
herpetic, a virusului sarcomului Rous.
a) metoda Burnet
- se aaz oul n poziie orizontal, cu partea notat n sus i se practic un orificiu punctiform la
nivelul camerei cu aer;
- se delimiteaz n dreptul embrionului o fereastr triunghiular cu laturile de 0,5 - 0,8 cm i se
decupeaz coaja oului cu o foarfec steril; se perforeaz membrana proprie a oului la acest nivel;
- cu ajutorul unei pompe mici de cauciuc se aspir aerul din dreptul camerei cu aer; se creeaz
astfel o camer cu aer artificial, n partea lateral a oului, prin ndeprtarea membranei
corioalantoidiene de membrana proprie a oului;
- prin orificiul triunghiular se ndeprteaz membrana proprie a oului, descoperindu-se membrana
corioalantoidian la acest nivel i se pun cteva picturi din suspensia viral direct pe membrana
corioalantoidian;
- dup inoculare se pune parafin de jur-mprejurul ferestrei triunghiulare i se aaz deasupra o
lamel de sticl steril nclzit; se parafineaz i orificiul punctiform de la nivelul camerei cu aer.
Oule inoculate se pun la incubator n poziie orizontal, la 35 - 37
0
C.
b) metoda Tanaka
- se aaz oul n poziie vertical, cu camera de aer n sus i se practic o fereastr triunghiular la
acest nivel; se ndeprteaz coaja oului i membrana proprie a oului;
- se pun cteva picturi din suspensia viral direct pe membrana corioalantoidian;
- dup inoculare se pune parafin de jur-mprejurul ferestrei triunghiulare i se aaz deasupra o
lamel de sticl steril nclzit prrrin flllammmbare.
Oule inoculate se pun la incubator n poziie vertical, la 35 - 37
0
C.
3. Inocularea intraamniotic
Este calea de inoculare pentru izolarea virusurilor urlian i gripal din produsele patologice.
a)- oul se aeaz la ovoscop n poziie vertical i se practic un orificiu punctiform la nivelul
camerei cu aer;
- se introduce acul seringii prin camera cu aer spre embrion, oprindu-se naintarea acului atunci
cnd embrionul este atins i se mic puin;
- se inoculeaz 0,1 - 0,2 ml inocul viral n cavitatea amniotic, iar orificiul executat se
parafineaz.
a
1
)- oul se aeaz la ovoscop i se practic un orificiu punctiform la nivelul prii laterale notate;
- se introduce acul seringii prin orificiul creat, oprindu-se naintarea acului atunci cnd
embrionul este atins i se mic puin;
- se inoculeaz 0,1 - 0,2 ml inocul viral n cavitatea amniotic, iar orificiul executat se
parafineaz.
b) metoda Taylor - Chialvo
- se practic o fereastr triunghiular la nivelul camerei cu aer i se ndeprteaz coaja oului;
- cu o pens steril se ndeprteaz membrana proprie a oului, se prinde sacul amniotic i se ridic
puin;
- se inoculeaz suspensia viral direct n cavitatea amniotic i se las napoi n ou sacul amniotic;
- dup inoculare se pune parafin de jur-mprejurul ferestrei triunghiulare i se aaz deasupra o
lamel de sticl steril nclzit.
Oule inoculate se pun la incubator n poziie vertical, la 35 - 37
0
C.
4. Inocularea intravitelin
Este calea de inoculare pentru izolarea i cultivarea rickettsiilor i chlamidiilor. Se folosesc
ou embrionate de 5 - 7 zile.
- se aaz oul n poziie vertical i se practic un orificiu punctiform la nivelul camerei cu aer;
- se introduce acul seringii prin orificiul creat, orientndu-l spre partea lateral opus celei notate;
- se inoculeaz 0,1 - 0,2 ml de suspensie viral, iar orificiul executat se parafineaz.
Oule inoculate se pun la incubator n poziie orizontal, la 35 - 37
0
C.
Oule inoculate se incubeaz la temperatura adecvat un interval de timp corespunztor
tipului de virus inoculat: pentru virusul gripal 48 ore; pentru virusul urlian 6 -7 zile; pentru
rickettsii 5 zile.
C. RECOLTAREA PRODUSELOR CARE CONIN VIRUSUL
Se face nti sacrificarea oului, care const n meninerea lui dou ore la -30
0
C sau 24 de
ore la 4
0
C, pentru a se evita spargerea vaselor de snge din membrana corioalantoidian i
adsorbia virusurilor pe hematii, virusuri ce nu s-ar mai regsi n produsul recoltat.
Se aaz oul n poziie vertical i se aseptizeaz coaja la nivelul camerei cu aer; cu o
foarfec steril se ndeprteaz calota oului. Recoltarea diferitelor produse ce conin virusul se face
n funcie de tipul de inoculare care a fost folosit.
1. Recoltarea lichidului alantoidian
- se ndeprteaz membrana proprie a oului cu o pens steril, iar cu vrful pensei se ndeprteaz
embrionul de coaja oului; e perforeaz membrana corioalantoidian;
- se recolteaz cu pipeta Pasteur orientat oblic spre partea lateral notat 6 - 7 ml de lichid
alantoidian de culoare glbuie, care se distribuie n eprubete sterile.
2. Recoltarea lichidului amniotic
- cu o pens steril se ndeprteaz membrana proprie a oului i se prinde embrionul, care se scoate
uor n afar;
- cu o pipet Pasteur steril se recolteaz din sacul amniotic 2 - 3 ml lichid amniotic incolor, clar,
care se repartizeaz n eprubete sterile.
3. Recoltarea membranei viteline
- se vars coninutul oului ntr-o cutie Petri steril
- se recolteaz cu o pens membrana sacului vitelin, care se spal ntr-un vas steril cu TFS;
- membrana se mojareaz i se centrifugheaz la 4000 rpm; supernatantul reprezint suspensia de
virusuri, de rickettsii sau de chlamidii i se preia din cupa de centrifug n eprubete sterile.
FI DE LUCRU
Cultivarea virusurilor pe animale de laborator
Alegerea animalelor de laborator pentru inocularea de virusuri se face n funcie de
sensibilitatea fa de virusul inoculat. Inocularea trebuie fcut pe calea cea mai eficient. Se pot
utiliza: oareci aduli sau nou - nscui, cobai, obolani, iepuri, maimue, cocoi.
nainte de inoculare animalele se in aproximativ 12 zile n carantin, pentru a se nltura
cele bolnave.
TEHNICI DE INOCULARE
1. Inocularea intraperitoneal
- animalul se prinde de coad cu mna dreapt i se pune pe sita metalic a borcanului, care se afl
lng acesta; el se prinde cu lbuele de sit, astfel nct poate fi prins de pielea cefei cu policele i
indexul minii stngi i poate fi imobilizat: cu degetul mic se imobilizeaz coada i cu inelarul
membrul inferior stng, corpul fiind sprijinit n podul palmei;
- animalul se ine cu capul n jos, pentru ca ansele intestinale s se deplaseze spre diafragm;
- inocularea se face cu ajutorul acului unei seringi, dup aseptizarea pielii cu iod, paramedian
stnga, la jumtatea distanei dintre apendicele xifoid i pubis; cantitatea de inocul nu depete 1
ml.
2. Inocularea subcutanat
- animalul se prinde de pielea cefei cu o pens Kocher, care se aga ntr-un cui al mesei de lucru;
cu mna stng se prind coada animalului i membrele posterioare, iar cu mna dreapt se
aseptizeaz pielea cu iod n regiunea dorsal;
- se inoculeaz n regiunea aseptizat, sub piele, cantitatea dorit de inocul.
3. Inocularea intramuscular
- animalul se prinde de pielea cefei cu o pens Kocher, care se aga ntr-un cui al mesei de lucru;
cu mna stng se prind coada animalului i membrele posterioare, iar cu mna dreapt se
aseptizeaz pielea cu iod n regiunea coapsei;
- se inoculeaz n muchii coapsei cantitatea dorit de inocul.
4. Inocularea intravenoas
- se pune oarecele sub o plnie de sticl, a crei margine realizeaz o uoar staz la baza cozii,
devenind astfel vizibile cele dou vene caudale; staza se va ntrerupe dup introducerea acului n
ven; se aseptizeaz pielea la baza cozii;
- coada se prinde cu mna stng, iar cu dreapta se realizeaz inocularea intravenoas.
5. Inocularea intracaudal
- se pune oarecele sub o plnie de sticl, a crei margine realizeaz o uoar staz la baza cozii,
devenind astfel vizibile cele dou vene caudale; se aseptizeaz pielea la baza cozii;
- coada se prinde cu mna stng, iar cu dreapta se realizeaz inocularea intracaudal.
6. Inocularea intranazal
- se introduce oarecele sub o plnie de sticl cu captul acoperit cu un dop de vat, sub care se
introduce i un dop de vat mbibat cu eter;
- cnd animalul este bine anesteziat (ca s nu strnute) este prins cu mna stng i inut n poziie
vertical; cu o pipet Pasteur se pune cte o pictur de inocul n fiecare nar; animalul respir
profund i aspir inocului.
7. Inocularea intracerebral
- se imobilizeaz animalul cu indexul i policele minii stngi prin apsarea pe zona occipital,
napoia urechilor, iar cu podul palmei se acoper corpul animalului;
- inocularea se practic paramedian deasupra arcadei, folosindu-se ace speciale de 1,5 mm lungime;
la oarece acul se introduce direct n cavitatea cranian; la iepure, obolan sau alte animale se
practic nti o trepanaie, deoarece craniul este foarte dur.
Dup inoculare animalele sunt supravegheate o perioad de timp de 3 - 4 sptmni. De la
animalul inoculat se preleveaz apoi diferite organe, n funcie de calea de inoculare folosit:
pulmonul - pentru virusurile gripale; creierul - pentru virusurile neurotrope; snge; exsudat
peritoneal.
Nr.
crt.
Virusul
inoculat
Specia de
animal
inoculat
Calea de inoculare Efectele inoculrii
1. Arbovirusuri oarece
oarece sugar
intracerebral,
intraperitoneal
intracerebral
encefalit
2. Virusul
febrei
galbene
maimu intraperitoneal necroz hepatic
3. Virusul
herpetic
iepure
oarece sugar
intraconjunctival
intracerebral,
intraperitoneal
cheratoconjunctivit,
encefalit
encefalit,
necroz hepatic
4. Virusul rabic oarece
oarece nou-
nscut
intracerebral convulsii moarte
encefalit moarte
5. Virus
citomegalic
oarece
cobai
intracerebral
intraperitoneal
encefalit moarte
pneumonie, infiltrat hepatic
6. Virus gripal oarece
dihor
intranazal
intranazal
pneumonie moarte
pneumonie
7. Virus urlian maimu intraparotidian parotidit epidemic
FI DE LUCRU
Cultivarea virusurilor n culturi de celule
Culturile de esut sau celulare reprezint explante in vitro ale unor fragmente de
organe, de esuturi sau celule dispersate obinute din esuturi, introduse ntr-un mediu nutritiv
capabil s le asigure supravieuirea i proliferarea.
Culturile celulare sunt mediile cel mai frecvent utilizate pentru cultivarea virusurilor. Exist
mai multe tehnici de culturi de esuturi i celule:
culturi iniiate cu fragmente de esut fragmente de esut cultivate in vitro n suspensie sau
nglobate ntr-un substrat cu dublu rol (de fixare mecanic i de furnizare a elementelor nutritive);
culturi de fragmente de organe fragmentele de organe se manipuleaz astfel nct s se menin
arhitectura original a esutului o perioad mai lung de timp; se realizeaz culturi de epiteliu respirator
ciliat (pentru virusuri respiratorii) sau culturi de epiteliu intestinal (pentru enterovirusuri);
culturi de celule dispersate se pot realiza pe suport solid sau n suspensie n mediu lichid; materialul
iniial este reprezentat de celule libere, obinute ca atare din organism (limfocite din sngele periferic)
sau prin tripsinizare din esuturi prelevate anterior.
1.Celulele din care se iniiaz cultura
- celule adulte - cultiv mai greu in vitro, au cretere mai nceat i o perioad de laten de 6-8 zile;
se prefer organisme adulte tinere, de la care se folosesc organe parenchimatoase (exemplu rinichi);
se obin frecvent culturi celulare de tip epitelial, cu celule poligonale care au tendina de a forma
placarde;
- celule embrionare - cultiv mai uor dect cele adulte, au o cretere rapid i o perioad de laten
mic; necesit medii nutritive mai puin complexe; formeaz de obicei culturi celulare de tip
fibroblastic, cu celule alungite, orientate paralel ntre ele;
n funcie de sursa de celule folosit, culturile celulare pot fi:
- culturi celulare primare, ale cror celule provin direct dintr-un esut sau organ, dup
dispersarea celulelor prin tripsinizare; majoritatea culturilor primare nu mai pot fi pasate n
laborator (se cultiv o singur dat); sunt culturi n monostrat, cresc direct pe suprafaa vasului
de sticl, un timp limitat in vitro; sunt culturi cu celule normale, care prezint o susceptibilitate
mrit la aciunea virusurilor;
Ex. : cultur de embrion de gin
- tulpini celulare, formate dintr-un singur tip de celule, n monostrat; pot fi cultivate un numr de
50 de generaii n laborator; sunt celule normale, epiteliale sau fibroblastice;
Ex. : tulpini celulare embrionare umane;
tulpini celulare renale de maimu.
Culturile celulare primare i tulpinile celulare pot fi utilizate pentru prepararea de vaccinuri.
- linii celulare, care sunt populaii de celule derivate din esuturi animale sau umane subcultivate
serial un timp nelimitat n laborator, cu numr de cromozomi modificat; sunt celule
heteroploide, tumorale, obinute fie direct din esuturi tumorale prin tripsinizare, fie din tulpini
celulare transformate n urma pasrilor repetate n laborator.
Ex.: HeLa celule din carcinom de col uterin
Hep 1, 2, 3 - celule din carcinom de nazofaringe sau laringe
Vero celule din rinichi de maimu Cercopithecus
2. Vasele de cultur adecvate, pregtite special
o din sticl neutr, transparent, fr neregulariti sau din plastic, de unic folosin
flacoane paralelipipedice de 250 ml
tuburi Barski, se pot pune lamele
flacoane Roux
o nchise cu dopuri de cauciuc, netoxice, de culoare deschis, sau cu capac cu filet
3. Mediul nutritiv pentru culturi de celule (Eagle, IC65)
o de cretere sau de meninere
substane nutritive
vitamine
antibiotice
indicator de viabilitate celular (rou neutru)
indicator de pH (rou fenol).
Cultivarea virusurilor n culturi celulare
Materiale necesare:
- vase cu culturi celulare (pentru probe i martor);
- suspensia viral de inoculat; mediu nutritiv de ntreinere pentru cultura de celule;
- pipete sterile;
- vas cu amestec oxidant.
Tehnica de lucru:
- se ndeprteaz din vasul de cultur cu pnza celular mediul nutritiv de cretere;
- se inoculeaz peste pnza celular 0,1 1 ml suspensie viral, n funcie de mrimea
vasului de cultur; se omogenizeaz suspensia viral peste celule i se las 20-30 min.
pentru adsorbia virusului pe celule;
- se introduce n vasele de cultur mediu nutritiv de ntreinere (2 ml n eprubete sau 15
20 ml n vasele de 250 ml);
- vasele se termostateaz la 37
0
C, examinndu-se zilnic la microscop; mediul trebuie s
acopere n permanen pnza celular;
- n paralel se observ o cultur celular martor, care a fost obinut n acelai timp i n
aceleai condiii ca i cultura inoculat, dar care nu va fi cultivat cu virus.
Interpretarea rezultatelor:
n urma multiplicrii virusului n culturile de celule apar o serie de modificri morfologice
ale patului celular, care constituie efectul citopatic (ECP); acesta presupune:
- zone de liz celular: celulele sunt distruse n urma multiplicrii virusului inoculat,
datorit eliminrii explozive din celule (de exemplu enterovirusurile);
- sinciii celulare: mase celulare cu mai muli nuclei (de exemplu virusul respirator
sinciial, virusul herpetic, unele virusuri paragripale);
- incluzii, mai ales la nivelul nucleului, datorit aglomerrii particulelor virale n urma
multiplicriilor (de exemplu adenovirusurile);
- desprinderea de pe substrat; formarea de celule gigant; rotunjirea celulelor.
Sunt i virusuri care nu dau efect citopatic (de exemplu unele virusuri paragripale). n cazul
acestora, prezena lor n culturile celulare se poate pune n eviden prin:
- fenomenul de hemadsorbie: hematiile de cobai au proprietatea de a se adsorbi pe suprafaa
celulelor n care s-au multiplicat virusurile;
- se ndeprteaz mediul de cultur din cultura celular infectat cu un virus care nu d efect
citopatic;
- se adaug peste aceasta o suspensie 0,5% de hematii de cobai, care se distribuie pe
suprafaa pnzei celulare; se las 30 min. la 37
0
C;
- se spal pnza celular cu TFS steril, ndeprtndu-se hematiile;
- cultura splat se examineaz la microscop: dac pe suprafaa celulelor din cultur au rmas
fixate stabil hematii (nu au fost ndeprtate prin splare), n acele celule s-au multiplicat
virusurile; dac n urma splrii nici o celul din cultur nu are hematii pe suprafaa ei,
testul este negativ (celulele nu sunt infectate cu virus).
- folosirea culturilor de celule agarizate (acoperite cu un strat subire de agar i colorate) are
avantajul de a pune n eviden mai uor zonele de liz celular, sub forma unor plaje incolore
de liz pe fondul culturii colorate; aceste medii se pot pstra n laborator timp ndelungat;
- virarea culorii mediului de cultur are loc n culturile celulare normale, neinoculate cu virus,
datorit multiplicrii celulare, de la rou spre galben (culoarea roie a mediului se datoreaz
indicatorului de pH rou fenol, care n mediu neutru este rou-orange, iar n mediu acid este
galben); n culturile celulare inoculate cu virus celulele sunt distruse i nu mai modific pH-ul
mediului, iar culoarea nu se schimb.
- fenomenul de interferen replicarea n prealabil n cultura celular a unui virus care nu d
efect citopatic (de exemplu virusul rubeolei) poate inhiba replicarea ulterioar a unui virus care
d efect citopatic (de exemplu virusul Echo 11).
VI. TESTAREA SENSIBILITII BACTERIILOR LA ANTIBIOTICE I TEHNICI DE
LABORATOR PENTRU CONTROLUL ANTIBIOTICOTERAPIEI
Testarea microorganismelor la antibiotice i chimioterapice este necesar pentru stabilirea
unui tratament corect i datorit apariiei i extinderii rezistenei microorganismelor fa de aceste
categorii de substane.
O tulpin bacterian este considerat sensibil dac bacteriile sunt n mod eficient afectate
de antibiotic, obinndu-se n urma tratamentului efectul terapeutic dorit, cu dozele obinuite. Dac
tulpina este moderat sensibil, bacteriile sunt afectate ntr-o msur mai mic, necesitnd doze
terapeutice mai mari sau ci de administrare speciale pentru obinerea efectului terapeutic dorit.
Dac rezultatul testrii in vitro a tulpinii bacteriene este negativ, tulpina este considerat rezistent.
Antibiograma este tehnica de testare a bacteriilor fa de aciunea antibioticelor i
chimioterapicelor. Se poate realiza prin dou metode in vitro: metoda difuzimetric, ce are o
valoare calitativ i metoda diluiilor, cu valoare cantitativ. Sensibilitatea bacteriilor fa de
antibiotice se poate face i prin metode in vivo, n care se apreciaz eficiena terapeutic a
antibioticului prin teste de laborator, determinnd concentraia de antibiotic din snge, LCR sau
alte umori, ori nivelul de eficien inhibitorie (NEI) sau nivelul de eficien bactericid (NEB).
METODA DIFUZIMETRIC A ANTIBIOGRAMEI
Aceast metod sepoate realiza n mai multe variante:
- antibiograma difuzimetric comun,
- antibiograma difuzimetric comparativ (metoda Stokes, Bal) care folosete pentru
comparaie o tulpin de referin din aceeai specie sau dintr-o specie nrudit,
- antibiograma difuzimetric standardizat (Bauer-Kirby), care permite obinerea unor
rezultate comparabile ntre diferite laboratoare,
- antibiograma difuzimetric rapid.
Principiul metodei Bauer-Kirby
Pentru etapa calitativ a antibiogramei sunt utilizate microcomprimate impregnate cu
cantiti fixe de antibiotic, ce se depun pe suprafaa unei plci cu geloz Mueller - Hinton,
nsmnat n prealabil "n pnz"cu germenele de testat. Antibioticul difuzeaz n mediu i se
creeaz un gradient de concentraie invers proporional cu distana fa de disc. Eficacitatea
antibioticului se apreciaz prin msurarea zonelor de inhibiie a creterii bacteriene n jurul
discurilor. Pentru standardizarea metodei s-au standardizat: mrimea discului de antibiotic, mediul
de cultur, tehnica de lucru, modalitatea de citire a rezultatelor. Aceast metod prezint
dezavantajul c nu se poate folosi pentru germeni cu vitez lent de cretere i nici pentru bacterii
anaerobe.
Materiale necesare:
- plci Petri cu geloz Mueller - Hinton n strat de 4 mm grosime (25 ml mediu pentru placa de 9
cm diametru), cu pH 7,2 7,4; suprafaa mediului trebuie s fie uscat (se pstreaz la frigider, iar
nainte de folosire se pot ine la termostat 20 min. sau la temperatura camerei cteva ore);
- inoculul, obinut de obicei din 5 colonii izolate, reprezentat de o cultur bacterian pur tnr, de
18 - 24 ore n bulion, e reprezentat de culturi aflate n faz logaritmic de cretere, care sunt n
general mai sensibile la aciunea antibioticelor i sensibilitatea lor este tipic pentru tulpina testat;
turbiditatea inoculului trebuie ajustat la o concentraie de 5 9 x 10
7
celule/ml., corespunztoare
standardului turbidimetric 0,5 McFarland;
- truse cu microcomprimate standardizate pentru antibiograme (de 6 mm diametru);
- pense tip iris;
- pipete Pasteur sterile sau tampoane sterile tip exsudat nazo-faringian;
- bec de gaz, amestec sulfocromic.
Standardul McFarland Nr. 0.5, 1 i 2
Standard McFarland 0.5 1 2 3 4
1.0% clorur de bariu (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
1.0% ac id sulfuric (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6
densitatea celular aproximativ
(1x10
8
CFU/mL)
1.5 3.0 6.0 9.0 12.0
% Transmitan la 600nm 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5
Absorban la 600nm 0.132 0.257 0.451 0.582 0.669
Standardul nefelometric McFarland se obine prin amestecul unor cantiti exacte de clorur
de bariu i acid sulfuric, formndu-se un precipitat de sulfat de bariu. Standardul 0,5 McFarland se
prepar din 0,05 ml clorur de bariu dihidrat 1,175% (BaCl
2
x2H
2
O) i 9,95 ml acid sulfuric 1%
(H
2
SO
4
). Standardul se prepar i din particule de latex, care au stabilitate n suspensie. Standardul
se compar cu suspensia bacterian n soluie salin sau n bulion nutritiv.
Tehnica de lucru:
- se aduc la temperatura camerei plcile Petri cu mediu solid, care au fost pstrate la frigider maxim
7 zile;
- se nsmneaz "n pnz" plcile respective cu inoculul diluat, cu ajutorul pipetei Pasteur prin
inundarea plcii, urmat de aspirarea excesului sau cu ajutorul unui tampon steril; cu tamponul se
traseaz striuri paralele dese n trei direcii ale plcii, cu un traseu circular pe marginea plcii la
final;
- plcile se introduc la termostat la 37