Sunteți pe pagina 1din 17

Terapie genica: metode de terapie

genica, sisteme de transfer a genelor la


om
1
CUPRINS
Introducere 3
Capitolul 1: Terapia genica 4
1.1. etode de terapie genica 4
Capitolul !: Sisteme de transfer a genelor la om "
!.1. Sisteme #irale "
!.!. Sisteme ne#irale 11
Capitolul 3: Siguranta terapiei genie 14
Conclu$ii 1"
%i&liografie 1'
2
Introducere
Terapia genica este o tehnica care se refera la introducerea uneia sau a mai multor
gene intr-o celula pentru a corecta un defect. Acest lucru este destinat pentru a incetini
progresia unei boli si imbunatatirea calitatii vietii unui individ.
In viitor aceasta tehnica ar putea permite medicilor sa trateze o tulburarea celulara
prin introducerea unei gene in celulele unui pacient in loc de a folosi medicamente sau
interventii chirurgicale.
Desi terapia genica este o optiune promitatoare de tratament pentru un numar
mare de boli (inclusiv tulburari mostenite, anumite tipuri de cancer si infectii virale
tehnica ramane riscanta si este in curs de studiu pentru a-i pori siguranta si eficacitate.
Terapia genica momentan este folosita si testata in tratamentul bolilor care nu au leac.
!
Capitolul 1: Terapia genica
" data cu aparitia de noi cunostinte in domeniul biologiei moleculare, a devenit
un lucru evident faptul ca aparitia multe boli umane sunt legate de schimbari la nivelul
genelor. #enele reprezinta punctul de plecare pentru toate evenimentele care conduc
ulterior la shimbari in e$presia proteinelor din celule. %and genele sunt modificate in asa
fel incat proteinele codificate de acestea sunt in imposibilitatea de a indeplini functia lor
normala, poate aparea o tulburarea genetica.
&fectul cumulat determinat de gene atipice sau defecte intr-un organ conduce la
fenotipul bolii. Terapia genica este utilizata pentru a corecta defecte genice care pot
determina aparitia unor boli si consta in blocarea unei gene activate nedorite, corectarea
sau inlocuirea genei defecte cu o gena normala. 'olile in principal vizate de terapie
genica unama sunt bolile monogenice, care sunt cauzate de defecte ale unei singure gene.
1.1. etode de terapie genica
(rimul pas in terapia genica este de a identifica gena care cauzeaza problema.
Apoi materialul genetic adecvat este introdus in celulele tinta, cu scopul de a corecta
problema.
)e utilizeaza doua strategii principale*
terapia in vivo, in care materialul genetic este introdus direct in individ pe
o cale sistematica, sau atunci cand este posibil, la o locatie specifica+
terapia ex vivo, in care celulele tinta sunt tratate cu produsul genei inafara
individului, celulele sunt e$tinse si apoi transferate inapoi la pacient+
%heia pentru succes in terapia genica in vivo este transferul de material genetic la
celulele tinta sau tesuturi, si e$primarea efectiva a genei in cauza dar acest lucru este un
proces comple$ care necesita depasirea mai multor obstacole.
Terapia genica ex vivo implica trasferul de gene la celule mentinute in cultura,
ulterior vor fi transplantate la tesutul tinta. )e utilizeaza celule din sangele pacientului sau
maduva osoasa, care sunt recoltate si cultivate in laborator. %elulele sunt e$puse la
,
virusul care poarta gena dorita. -irusul intra in celula si insereaza gena dorita in AD.-ul
gazdei. %elulele cresc in laborator si sunt apoi returante pacientului prin in/ectarea intr-o
vena. %elulele transferate trebuie sa fie disponibile in cantitati mari, sa aiba o viata lunga
dupa trasfer in corpul pacientului, sa e$prime gena de interes pentru o perioada lunga de
timp si sa nu atraga nici un fel de raspuns imun.
Avanta/ele terapiei ex vivo includ posibilitatea caracterizarii populatiei de celule
modificate inainte de transfer. Acest lucru usureaza introducerea materialului genetic in
celule si se poate asigura ca populatia de celule clonate e$prima o cantitate mare de
produs codificat de catre transgene inainte de transferul inapoi la pacient.
0
Capitolul !: Sisteme de transfer a genelor la om
" gena care se introduce direct intr-o celula, de obicei nu functioneaza. In schimb
un transportator denumit vector, este modificat genetic pentru a livra gena. Dezvoltarea
acestor vectori a facut obiectul a numeroase studii. -ectorii utilizati pot fi impartiti in
doua categorii* vectori virali si vectori nevirali sau sintetici.
-ectorii virali utilizeaza capacitatea virusurilor de a livra noua gena prin
infectarea celulei. -irusurile sunt modificate astfel incat sa nu poata provoca boala atunci
cand sunt utilizate la oameni.
-ectorii sintetici depind de transferul direct de informatii genetice in celule tinta.
Ambele sisteme au avanta/e si dezavanta/e, care trebuie luate in considerare, in functie de
tratamentul destinat.

!.1.Sisteme #irale
%onceptul de vectori virali este bazat pe capacitatea innascuta a virusurilor pentru
a elibera materialul lor genetic in celula infectata. -ectorii virali sunt utilizati pe scara
larga in cele mai multe protocoale preclinice si clinice, pentru terapi in care se doreste o
transfectie foarte stabila. %u toate acestea, cea mai mare ingri/orare in utilizarea
virusurilor ca vectori pentru terapie este ca infectia virala poate conduce la efecte
nedorite, cum ar fi distrugerea tesutului gazda. Alte dezavanta/e includ limitarea
dimensiunii genei pe care virusurile o pot trasnsporta, dificultatea de standardizare a
producerii de particule virale prin culturi de celule si cost mai mare in comparatie cu
producerea plasmidului AD..
(entru utilizarea virusurilor ca vectori este necesara utilizarea unor informatii de
baza cum ar fi*
identificarea secventei virale necesare pentru replicare+
constructia de particule virale+
ambalarea genomului viral+
eliberarea genei heteroloage in celula gazda+
1
(rintre virusurile utilizate pe scara larga pentru terapie geica sunt folosite pentru
obtinerea proteinelor heterogene din celule de animal, in special virusuri A2.
(retrovirusuri si lentivirusuri si virusuri AD. (adenovirusuri, virusuri adeno-asociate si
herpesvirus.
(deno#irusurile sunt distribuite pe scara larga in natura, si infecteaza pasari si
multe mamifere, inclusiv omul. Acestea provoaca infectii respiratorii superioare la copii
si la adulti. Adenovirusurile sunt neincapsulate, cu genomul liniar compus din AD.
dublu catenar. #enomul virusului nu se integreaza in genomul celulei gazdei, eliminand
astfel riscurile de mutageneza datorita insertiei genormice. )ubtipurile 2 sau 0 sunt
utilizate preponderent ca vectori de terapie genica.
Acest sistem vector a avut rezultate promitatoare in tratarea cancerului si intra-
adevar primul produs licentiat pentru terapia genica, este un adenovirus folosit pentru
tratarea cancerului.
3
4igure 1* #ene therap5 using an Adenovirus vector
)irusuri adeno*asociate +((), sunt virusui mici, non-patogene, fac parte din
familia parvovirusurilor. Aplicarea acestor virusuri depind de un virus au$iliar, de obicei,
un adenovirus. AA- sunt capabili de a infecta diviziunea celulelor, si in absenta unui
virus au$iliar ele se pot integra intr-un sit specific in genomul celulei gazde. #enomul
AA- este compus dintr-o molecula de AD. monocatenar. )pre deosebire de
adenovirusuri, cei mai multi pacienti tratati cu AA- nu au prezentat un raspuns imun de a
elimina virusul si celulele au fost tratate cu succes.
&$ista cateva dezavanta/e la folosirea AA- si se refera la cantitatea mica de AD.
care se poate transporta si la dificultatea in realizarea procesului.
6ai multe studii cu AA- sunt in curs de desfasurare sau in pregatire, in special se
incearca tratare bolilor la nivelul muschilor si a ochilor, deasemenea vectorii AA- sunt
utilizati si pentru a transporta gene la nivelul creierului.

7
4igure 2* (roducing recombinant AA- vectors
)irusul -erpes simple. +/S), este un virus uman, utilizat ca un vector pentru
transferul de gene in sistemul nervos. #enomul 8)- este relativ mare, liniar compus
dintr-o molecula de AD. dublu catenar, invelit intr-o cusca proteica denumita capsida,
care este invelita intr-un strat lipidic denumit anvelopa. #enomul virusurilor herpetice
codifica intre 199-299 de gene. Aceste gene codifica o varietate de proteine implicate in
formarea capsidei, tegumentului si a anvelopei virusului, precum si controlul replicarii si
functia de infectie a virusului.
Retro#irusurile sunt virusuri care apartin familiei virale 2etroviridae. Tot
materialul genetic al retrovirusurilor este in forma de molecule de A2., in timp ce
materialul genetic al gazdelor este in forma de AD.. Atunci cand un retrovirus infecteaza
o celula gazda, se va introduce in celula A2.-ul sau impreuna cu unele enzime. Aceasta
molecula de A2. din retrovirus trebuie sa produca o copie a AD.-ului, inainte de a
putea fi considerata ca facand parte din materialul genetic al gazdei. (rocesul de
producere a unei copii de AD. de la o molecula de A2. este denumit reverstransciptie.
Aceasta se realizeaza cu a/utorul unei enzime transportate in virus, numita
reverstranscriptaza. Dupa aceasta copie AD.-ul este produs si este liber in nucleul
:
4igure !* 2eplication of 8erpes simple$ virus
celulei gazda si trebuie sa fie incorporat in genomul celulei., proces efectuat de o alta
enzima numita integraza.
Acuma ca materialul genetic al virusului este incorporat si a devenit o parte din
materialul genetic al celulei gazda, puteam spune ca celula gazda este acum modificata si
contine o noua gena. Daca aceasta celula gazda se divide mai tarziu, descendentii acesteia
va contine toate genele noi. ;neori genele de retrovirus nu e$prima imediat informatiile
lor.
2etrovirusurile sunt cele mai des utilizate in terapia genica pana in prezent si
avanta/ul lor este ca realizeaza transfectari stabile deoarece genomul virusului este
introdus in genomul celulei gazde. Dezavanta/ele sunt ca aceasta insertie se produce la
intamplare, si poate modifica genele intr-un mod daunator. (articula virusului este foarte
fragila ceea ce face ca manipularea si atingerea sa fie foarte dificila. In plus ei infecteaza
numai celulele care se divid.
19
4igure ,* Integration of retroviruses
0enti#irusurile sunt o subclasa de retrovirusuri care e$prima un comple$ care
controleaza functii nucleare importante in celulele infectate. <entivirusurile pot livra o
cantitate semnificativa de informatii genetice in AD.-ul celulei gazde, astfel incat ele
sunt una dintre cele mai eficiente metode vector de a transporta gene. <entivirusurile sunt
capabile de replicare in celulele care nu se divid, rezultand o infectie care dureaza
intreaga viata a gazdei.
!.!. Sisteme ne#irale sau sintetice
-ectorii sintetici depind de transferul direct a informatiei genetice in celula tinta,
si includ AD. plasmidic, AD. gol (na=ed AD. sau AD. asociat cu un anumit sistem
de eliberare. ;nele pot fi aplicate ca vaccinuri AD..
6etodele nevirale permit anumite avanta/e fata de metodele virale si anume
productia pe scara larga si imunogenitate scazuta din partea celulei gazda.
(1N plasmidic este un vector sintetic utilizat in terapia genica datorita
avanta/elor pe care le ofera si anume capacitatea sa de a transporta o cantitate mare de
material genetic, absenta riscului de infectie sau mutageneza si productia la scara larga a
celulelor bacteriene.
(lasmida este un AD. circular, care se reproduce independent fata de
cromozomul celulei. (lasmida folosita in terapia genica ar trebui sa aiba urmatoarele
proprietati*
origine de replicare in bacterii, pentru a permite replicarea eficienta a
plasmidelor care a/ung la sute de e$emplare per celula+
o gena de selectie, care ofera, de obicei, rezistenta la un antibiotic, pentru
a permite selectarea clonelor care transporta plasmida+
un sit de donare multiplu, care poate fi scindat cu enzime de restrictie,
permitand insertia genei de interes+
un promotor viral care sa permita transcriptia genei de interes in celulele
eucariote+
Dupa ce gena de interes este clonata, aceasta este transferata la o bacteria gazda,
de obicei &scherichia coli, prin procesul de transformare bacteriana, pentru a produce
11
plasmide pe o scara larga si pentru a obtine o cantitate suficienta de AD. pentru utilizare
terapeutica.
AD.-ul plasmidic poate fi administrat la mai multe specii de animale, inclusiv la
om prin mai multe cai. In plus fata de in/ectarea intramusculara, aceasta poate fi
administrata oral, intranazal (ca un spra5, sau printr-o cale intradermica prin
>bombardarea? cu microparticule din aur acoperite cu material genetic. Desi in/ectarea
intramusculara a plasmidei este o tehnica simpla si utilizata pe scara larga, e$ista unele
probleme, cum ar f prezenta enzimelor (nucleazelor capabile sa degradeze AD.-ul
plasmidic facandu-l ineficient. " conditie prealabila pentru utilizarea AD.-ului ca vaccin
in terapia genica este ca acidul nucleic sa fie eliberat in mod eficient in celula tinta. "
estimare este ca numai una din fiecare 1999 de molecule plasmidice administrate este
capabila sa a/unga la nucelu si sa e$prime mesa/ul pentru sinteza proteinei dorite, ceea ce
inseamna ca un tratament necesita de obicei administrarea de doze mari de AD.
plasmidial. (rintre strategiile utilizate vom mentiona metoda biobalistica, lipozomi,
lipoplecsi si poliplecsi, in plus fata de utilizarea microparticulelor polimerice
biodegradabile.
6eoda biobalistica sau >gena arma? consta in transfectia celulelor individuale
folosind AD. absorbit pe particulele de aur. (entru transfectie, particulele sunt plasate
intr-un dispozitiv cunoscut ca un >pistol gena?, care prin intermediul unui proces de
accelerae folosind evacuarea gazelor de heliu sub presiune ridicata, particulele a/ung in
apiderma individului. Aceasta tehnica de introducere a unui vector, desi eficace pentru
multe procedurei, necesita un dispozitiv special pentru realizarea ei. %u toate acestea
rezultatele studiilor clinice fiind promitatoare au motivat companiile sa investeasca in
imbunatatirea acestei tehnologii.
" alta alternativa pentru introducerea unui vector AD. plamidic, este de a folosi
lipozomi. Deoarece acestea sunt compuse din vezicule apoase incon/urate de un bistrat
fosfolipidic, lipozomi permit incapsularea si transportul numeroaselor substante atata
hidrofile cat si lipofile impreuna cu plasmida. Acestia permit, pentru a fi incorporate in
suprafata lor, si molecule cum ar fi anticorpi, proteine si zaharuri si le directioneaza la
anumite situri. Datorita versatilitatii structurale a acestor aceste sisteme, sansele ca
12
transfectarea sa se realizeze cat mai eficient pot creste, prin schimbarea compozitiei
lipidelor, care ar putea modifica dimensiunea veziculei.
<ipoplecsi si poliplecsi sunt comple$e moleculare de AD.-cationici, formate prin
interactiunea cu lipide respectiv polimeri, a AD.-ului. (roprietatea principala a acestor
comple$e este de a permite trecerea mai usoara a AD.-ului prin membrana celulelor
plasmatice, prin doua mecanisme* neutralizarea AD.-ului si condensarea plasmidei , care
reduce dimensiunea sa. "data aflate in interiorul celulei, comple$ele care contin AD.
sunt eliberate din vezicula endocitotica si sunt raspnadite prin citosol deplasandu-se spre
nucleu. %ea mai comuna utilizare a lipoplecsilor a fost in transferul de gene in celule
canceroase, unde genele furnizate au activat genele supresoare tumorale de control din
celula si au redus activitatea oncogenelor. )tudii recente au aratat ca lipoplecsii sunt utili
in transfectia celulelor epiteliale respiratorii, astfel incat acestia pot fi utilizati pentru
tratarea bolilor respiratorii genetice cum ar fi fibroza chistica.
(1N gol +na2ed (1N, este cea mai simpla metoda de transfectie nevirala.
)tudiile clinice efectuate asupra in/ectarii musculare a unui AD. plasmidic gol, s-au
produs cu un oarecare succes, cu toate acestea, e$presia a fost foarte scazuta in
comparatie cu alte metode de transfectie. In plus fata de studiile cu plasmide, au fost
realizate e$perimente si cu (%2 gol, care au avut succes similar sau mai mare. Dar acest
succes nu se compara cu al altor metode ceea ce duce la cercetarea unor metode mai
eficiente de livrare a AD.-ului gol, cum ar fi utilizarea unui >pistol gena?.
1!
Capitolul 3: Siguranta terapiei genice
Terapia genica este intr-o continua cercetare pentru a determina daca aceasta ar
putea fi utiliza pentru tratarea bolilor dar si pentru a evalua cat de sigura este pentru
sanatatea omului. 6ai multe studii au aratata de/a ca aceasta abordare poate avea riscuri
pentru sanatate foarte grave cum ar fi to$icitate, inflamatie, cancer si pentru ca aceste
tehnici sunt relativ noi, la unele dintre ele riscurile pot fi imprevizibile.
<egile federale, regulamentele si directivele a/uta la prote/area oamenilor care
pariticpa la studiile de cercetare. ;) 4ood and Drug Administration (4DA
reglementeaza toate produsele de terapie genica in )tatele ;nite si supravegheaza acest
domeniu de cercetare. %ercetatorii care doresc sa realizeze un studiu clinic trebuie sa
obtina mai intai permisiunea 4DA. 4DA are autoritatea de a respinge sau de a suspenda
studiile clinice care sunt suspectate ca fiind nesigure pentru pacienti.
.ational Institutes of 8ealth (.I8 /oaca deasemenea un rol important in
asigurarea sigurantei de cercetare in terapia genica. .I8 ofera linii directoare, pentru
anchetatori si institutii (cum ar fi universitati sau spitale, de urmat in realizarea studiilor
cu terapia genica. Aceste linii directoare de stat primesc finantare de la .I8 pentru
realizarea acetor cercetari si trebuie sa fie inregistrate la .I8 "ffice of 'iotechnolog5
Activities. (rotocolul sau planul pentru fiecare studiu clinic este apoi realizat de catre
.I8 2ecombinant D.A Advisor5 %ommittee (2A% pentru a stabili daca aceste
cercetari ridica probleme medicale, etice, sau de siguranta pentu om.
In ciuda tuturor acestor probleme legate de siguranta terapiei genice, inca se fac
eforturi in cercetare pentru a elimina problemele e$istente. Aceste eforturi au atins
punctul culminant pentru aprobarea primului produs de terapie genica, care se bazeaza pe
un vector adenoviral. &ste #endicine1, un medicament produs de o companie chineza,
)henzhen )ibiono #eneTech. Acest medicament este destinat pentru cap si tratarea
carcinomului gatului si a fost aprobat pentru comercializare in anul 299! de catre agentia
de reglementare din %hina (%hina@s )tate 4ood and Drug Administration- )4DA.
Adenovirusul recombinant sub forma de particule de :9 nm, contine gena p0! pentru
suprimarea tumorii. #ena p0! sufera mutatii in apro$imativ 09-39A din tumorile umane.
#enele mutante nu sunt neaparat inactive dar pot avea functii oncogenice si pot contribui
la geneza tumorii. Introducerea e$ogena a genei p0! si e$primarea ulterioara a proteinei
1,
p0! duce la controlul si eliminarea tumorii. ;n efect sinergic poate fi deasemenea
obtinut, prin asocierea terapiei genice cu radioterapia si chimioterapia.
%olectarea de date to$icologice este impotanta pentru a permite clarificarea
nivelului de risc la diferite clase de vectori virali. Aprobarea primului medicament
destinat pentru terapia genetica, deschide noi perspective obtinerea acestor date esentiale,
atat de necesare si valoroase pentru agentiile de reglementare. Disponibilitatea tot mai
mare de noi date, vor constitui baza de orientare pentru producerea, comercializarea,
realizarea studiilor clinice si siguranta acestor produse.
%unoa terea detaliatB a genomului uman, oferB un instrument de dezvoltare
rapida si obiectiva pentru terapia genica. ;n mare impact este de asteptat in domeniul
asistentei medicale umane cu aceste cunostinte noi, creand asteptari mari in ceea ce
priveste geneza de noi produse destinate pentru tratamentul bolilor infectioase si a
tumorilor, care nu au tratamente alternative.
10
C3NC0U4II
1. Terapia genica este utilizata pentru a corecta defecte genice
care pot determina aparitia unor boli, si consta in blocarea unei
gene activate nedorite, corectarea sau inlocuirea genei defecte
cu o gena normala.
2. )istemele utilizate pentru transferarea genelor la om sunt de
doua feluri* sisteme virale (virusi si nevirale (sintetice.
!. Terapia genica este intr-o continua cercetare pentru a determina
daca aceasta ar putea fi utiliza pentru tratarea bolilor dar si
pentru a evalua cat de sigura este pentru sanatatea omului.
,. Terapia genica se afla inca in fazele incipiente, va provoca un
impact mare asupra sanatatii umane in urmatoarele cateva
decenii, mai mult, o scara mai mare de biomanufacture de
produse pentru uz clinic si de tehnologii pentru culturi de celule
animale, va fi un pas important in aplicarea terapiei genice.
11
%I%0I35R(6I7
1. <eda 2. %astilho, Angela 6aria 6oraes, &lisabeth 4.(. Augusto, 6ichael
'utler, 2997, Animal %ell Technolog5* 4rom 'iopharmaceuticals to #ene
Therap5.
2. .ational Institutes of 8ealth, Department of 8ealth C 8uman )ervices,
6a5 10, 299:, 8andboo= .
!. Tudose %ristian, 6aniu 6arilena, 6aniu %alina, #enetica umana,
&ditura %orson Iasi, 2999.
,. http*DDEEE.genetherap5net.com
13